РЕКОМБИНАНТНЫЕ СВЯЗЫВАЮЩИЕ БЕЛКИ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2022 года по МПК C07K14/415 A61K38/00 C07K14/47 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка испрашивает преимущество и приоритет Европейской патентной заявки ЕР 15162502, зарегистрированной 2 апреля 2015 года Европейским патентным ведомством. Настоящая заявка также испрашивает преимущество и приоритет Европейской патентной заявки ЕР 15162511, зарегистрированной 2 апреля 2015 года Европейским патентным ведомством. Содержание Европейских патентных заявок ЕР 15162502 и ЕР 15162511 включено в настоящий документ посредством ссылки для всех целей во всей полноте, включая все таблицы, фигуры и патентную формулу, а также включая любой элемент или часть описания, патентной формулы или рисунков, не содержащихся в настоящем документе и упомянутых в Правиле 20.5 (а) РСТ, в соответствии с Правилом 4.18 РСТ.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Представлен новый сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью по отношению к сывороточному альбумину, демонстрирующий улучшенные свойства устойчивости при хранении. Также представлены рекомбинантные связывающие белки, содержащие по меньшей мере два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, которые демонстрируют улучшенные фармакокинетические свойства по сравнению с рекомбинантными связывающими белками, содержащими только один конструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину. В частности, представлены рекомбинантные связывающие белки, содержащие по меньшей мере один сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к фактору роста гепатоцитов (HGF), содержащий по меньшей мере один сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к фактору роста эндотелия сосудов A (VEGF-A) и содержащий по меньшей мере два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину. Кроме того, представлены нуклеиновые кислоты, кодирующие такие сконструированные анкириновые повторяющиеся домены и/или рекомбинантные связывающие белки, фармацевтические композиции, содержащие такие сконструированные анкириновые повторяющиеся домены, рекомбинантные связывающие белки или нуклеиновые кислоты, а также применение таких сконструированных анкириновых повторяющихся доменов, рекомбинантных связывающих белков, нуклеиновых кислот или фармацевтических композиций для лечения заболевания.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Следующее обсуждение предпосылок создания изобретения приводится только для того, чтобы помочь читателю понять изобретение и не предполагается для описания или представления прототипа настоящего изобретения.

Существуют, помимо антител, новые связывающие белки или связывающие домены, которые могут использоваться для специфического связывания с молекулой-мишенью (например, Binz, HK, Amstutz, P., , A., Nat. Biotechnol, 23, 1257-1268, 2005). Один такой новый класс связывающих белков или связывающих доменов, не обладающих Fc, основан на сконструированных повторяющихся белках или сконструированных повторяющихся доменах, таких как сконструированные анкириновые повторяющиеся белки или сконструированные анкириновые повторяющиеся домены (WO 2002/020565, Binz, HK, Amstutz, Р., Kohl, A., Stumpp, МТ, Briand, С, Forrer, P., , MG, , A., Nat. Biotechnol, 22, 575-582, 2004). В WO 2002/020565 описано, как можно построить большие библиотеки повторяющихся белков, таких как анкириновые повторяющиеся белки, и их общее применение. В WO 2012/069654 описаны рекомбинантные связывающие белки, содержащие сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину. В WO 2010/060748 описаны рекомбинантные связывающие белки, содержащие сконструированные анкириновые повторяющиеся домены со связывающей специфичностью к VEGF-A, а в WO 2011/135067 описаны модифицированные версии таких рекомбинантных связывающих белков, специфичных к связыванию с VEGF-A. В WO 2014/191574 описаны рекомбинантные связывающие белки, содержащие сконструированные анкириновые повторяющиеся домены со связывающей специфичностью к HGF. Ни в одной из этих патентных заявок не предлагается рекомбинантный связывающий белок, содержащий сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к VEGF-A и сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к HGF.

В отличие, например, от IgG-антител, которые демонстрируют длительные системные периоды полувыведения, опосредованные рециркуляцией FcRn, белки, содержащие сконструированные анкириновые повторяющиеся домены, обычно демонстрируют быстрый фармакокинетический клиренс и короткие конечные периоды полувыведения, если только белок не содержит элементы, которые улучшают фармакокинетические свойства, такие как, например, сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, описанный в WO 2012/069654. Использование связывания с сывороточным альбумином для улучшения фармакокинетических свойств белков является хорошо известным в данной области способом (см., например, WO 9101743, Frejd FY, 2012 (в Kontermann, R (Ed.) "Therapeutic proteins: strategies to modulate their plasma half-lives", Wiley-VCH Verlag GmbH, 2012, ISBN 978-3-527-32849-9); Nguyen, A., Reyes, A.E.II., Zhang, M., McDonald, P., Wong, W.L., Damico, L.A., Dennis, M.S. Protein Eng. Des. Sel. 19, 291-297, 2006; WO 2008/096158; WO 2006/122787; WO 2011/095545; and WO 2012/069654). Для возможности использования сконструированных анкириновых повторяющихся доменов со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину в клинических препаратах-кандидатах, необходимо улучшить устойчивость при хранении известных сконструированных анкириновых повторяющихся доменов со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину. В данном документе описаны сконструированные анкириновые повторяющиеся домены со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину с улучшенными свойствами.

Влияние валентности сконструированных анкириновых повторяющихся доменов со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину на фармакокинетические свойства рекомбинантных связывающих белков не исследовалось. Основываясь на данных по связывающемуся с альбумином домену (Норр, J., Horning, N., Zettlitz, K.А., Schwarz, A., Fuss, N., , D., Kontermann, R.E. Protein Eng. Des. Sel. 23, 827-834, 2010), специалист в данной области должен ожидать, что рекомбинантный связывающий белок, содержащий два альбумин-связывающих домена белка, таких как сконструированные анкириновые повторяющиеся домены со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, не имеет улучшенных фармакокинетических свойств по сравнению с рекомбинантным связывающим белком, содержащим только один сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину. Как ни удивительно, но авторы обнаружили, что это не так. Таким образом, предлагаются рекомбинантные связывающие белки, содержащие по меньшей мере два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, которые демонстрируют улучшенные фармакокинетические свойства (т.е. длительные конечные периоды полувыведения, увеличенную экспозицию, сниженный клиренс и/или повышенное процентное содержание вводимой дозы) по сравнению с рекомбинантными связывающими белками, содержащими только один сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину.

Широко известно, что неоваскуляризация (новообразование кровеносных сосудов) играет важную роль в развитии и поддержании опухолей (Ferrera, N., and Kerbel, R.S., Nature 438, 967-974, 2005). Соответственно, ингибирование ангиогенеза стало основным краеугольным камнем современной клинической онкологии; в частности, нацеливание на фактор роста васкулярного эндотелия (VEGF) и его рецепторы (Hurwitz, Н., Clin. Colorectal Cancer, Suppl. 2, 62-68, 2004; Escudier, В., Clin. Adv. Hematol. Oncol. 5, 530-531, 2007). Семейство VEGF млекопитающих состоит из пяти гликопротеинов, называемых VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D (также известных как FIGF) и фактора роста плаценты (PlGF, также известного как PGF). Было показано, что VEGF-A является эффективной мишенью для антиангиогенной терапии (Weis, S.M., and Cheresh, D.A., Nat. Med. 17, 1359-1370, 2011). Лиганды VEGF-A связываются с и активируют три структурно сходные тирозинкиназы рецептора типа III, обозначенные как VEGFR-1 (также известная как FLT1), VEGFR-2 (также известная как KDR) и VEGFR-3 (также известная как FLT4). До настоящего времени официальное утверждение получили несколько ингибиторов ангиогенеза, показывающее длительную выживаемость без прогрессирования (PFS) и/или общую выживаемость при различных типах рака в сочетании с химиотерапией. К сожалению, неизбежно возникает резистентность во время лечения ингибиторами VEGF/VEGFR, такими как ингибитор VEGF-А бевацизумаб (Avastin®), что приводит к предположению, что для достижения самых высоких клинических результатов может понадобиться сопутствующее ингибирование дополнительных мишеней и путей резистентности (Kerbel, R.S., N. Engl. J. Med. 358, 2039-2049, 2008; Hurwitz, 2004, loc. cit; Escudier, 2007, loc. cit.).

Тирозинкиназа cMet является рецептором клеточной поверхности для фактора роста гепатоцитов (HGF, также известный как фактор рассеяния, SF), прежде всего экспрессируемый на эпителиальных клетках (Comoglio, P.M., Giordano, S., and Trusolino, L., Nat. Rev. Drug Discov. 7, 504-516, 2008). В то время как cMet и HGF экспрессируются на низких уровнях в нормальных тканях взрослых особей, их экспрессия часто повышающе регулируется в широком диапазоне опухолей человека, которая коррелирует в доклинических моделях с выживаемостью, ростом, ангиогенезом, инвазией и метастазами опухолевых клеток (Rong, S., Segal, S., Anver, M., Resau, J.H., Vande Woude, G.F., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 4731-4735, 1994; Michieli, P., Mazzone, M., Basilico, C., Cavassa, S., Sottile, A., Naldini, L., Comoglio, P.M., Cancer Cell 6, 61-73, 2004). Было установлено, что повышающая регуляция экспрессии и сигнализации HGF и/или cMet ассоциируется с плохим прогнозом и лекарственной устойчивостью во многих типах опухолей в клинике (Fasolo, A., Sessa, С., Gianni, L., Broggini, М., Ann. Oncol. 24, 14-20, 2013). Вцелом это указывает на то, что ось HGF-cMet является важной мишенью для терапевтического вмешательства (Comoglio, 2008 loc. cit.; Fasolo et al., 2013, loc. cit.). За счет связывания со своим рецептором HGF опосредует ряд клеточных ответов, включая рассеяние различных типов клеток, образование канальцев и люменов, эпителиально-мезенхимальный переход, ангиогенез, регенерацию печени, заживление ран и эмбриологическое развитие. Было показано, что сигнальный путь HGF/c-Met играет некоторую роль в различных заболеваниях, включая многие солидные опухоли человека, где он участвует в развитии, инвазии и метастазировании опухолей. Существующие ингибиторы пути HGF/cMet в клинических разработках фазы II или III содержат моноклональные антитела (mAb), нацеленные на внеклеточный домен cMet (т.е. MetMab от Genentech-Roche) или ингибиторы малых молекул его внутриклеточного киназного домена. Ингибиторы малых молекул, такие как тивантиниб (ArQule®) и кабозантиниб (Cometriq®), очень эффективны, но менее специфичны, чем mAb, и обладают потенциалом к более высокой токсичности. Биологические агенты против HGF/SF включают рилотумумаб (AMG102), гуманизированный mAb против HGF и фиклатузумаб (AV-299), гуманизированный анти-HGF IgGl. Применение ингибиторов HGF/cMet в комбинации с другими целевыми агентами является активным полем для исследования, целью которого является одновременное ингибирование различных сигнальных путей, которые имеют избыточные или синергетические функции опухоли. HGF/cMet запускает сильные ангиогенные сигналы, которые действуют синергически с VEGF в индуцировании новых кровеносных сосудов опухоли и могут индуцировать устойчивость к антиангиогенной терапии, как например Avastin® и Sutent® (сунитиниб) при глиобластоме (Jahangiri, A., De Lay, М, Miller, L.M., Carbonell, W.S., Ни, Y.L., Lu, K., Tom, M.W., Paquette, J., Tokuyasu, T.A., Tsao, S., Marshall, R., Perry, A., Bjorgan, K.M., Chaumeil, M.M., Ronen, S.M., Bergers, G., Aghi, M.K., Clin. Cancer Res. 19, 1773-1783, 2013) и раке почек, соответственно.

В настоящее время проводится исследование ряда анти-HGF/cMet соединений в комбинации с другими целевыми агентами, такими как ингибиторы анти-VEGF рецептора, которые продемонстрировали благоприятный профиль безопасности в различных типах опухолей (Sharma, P.S., Sharma, R., Tyagi, Т. Curr. Cancer Drug Targets. 11, 624-653, 2011). Однако такие подходы комбинированной терапии подразумевают, что пациент должен получить два отдельных вида лечения, каждый из которых имеет другой профиль безопасности, что может привести к увеличению нежелательной токсичности, что, в свою очередь, может ограничивать медицинские опции лечения. Кроме того, разные виды лечения могут иметь разные схемы введения, что может сделать дозирование более обременительным для пациента. И последнее, но не менее важное, дозирование различных агентов одновременно может значительно увеличить затраты, связанные с лечением пациентов и уходом за ними.

Одним коммерчески доступным лекарственным средством с двойной ингибирующей активностью в отношении cMet и VEGF является кабозантиниб (Cometriq®, лекарственное средство на основе малых молекул), пероральный мультиспецифический ингибитор тирозинкиназы, нацеленный на cMet и VEGFR 1-3 (в дополнение к RET, KIT, AXL и FLT3). Кабозантиниб подтвердил правильность клинического подхода одновременного ингибирования HGF и VEGF в опухолях с помощью одного агента (Yakes, F.M., Chen, J., Tan, J., Yamaguchi, K., Shi, Y., Yu, P., Qian, F., Chu, F., Bentzien, F., Cancilla, В., Orf, J., You, A., Laird, A.D., Engst, S., Lee, L., Lesch, J., Chou, Y.C., Joly, A.H., Mol. Cancer Ther. 10, 2298-2308, 2011; Castellone, M.D., Carlomagno, F., Salvatore, G., Santoro, M., Best Pract. Res. Clin. Endocrinol. Metab. 22, 1023-1038, 2008). Например, при кастрационно-резистентном раке предстательной железы показание, где анти-HGF mAb рилотумумаб не продемонстрировал эффективность в качестве одного агента в исследованиях фазы II, кабозантиниб продемонстрировал противоопухолевую активность у большого процента пациентов в фазе II (Smith, D.C., Smith, M.R., Sweeney, С, Elfiky, А.А., Logothetis, С., Corn, P.G., Vogelzang, N.J., Small, E.J., Harzstark, A.L., Gordon, M.S., Vaishampayan, U.N., Haas, N.B., Spira, A.I., Lara, P.N. Jr., Lin, C.C., Srinivas, S., Sella, A., P., Scheffold, С, Weitzman, A.L., Hussain, M., J. Clin. Oncol. 31, 412-419, 2013). Однако параллельно с активностью наблюдалась высокая инцидентность нежелательных явлений, что привело к снижению дозы у 62% пациентов, вызывая сомнения в безопасности и переносимости таких плейотропных способов действия.

Одновременное нацеливание на VEGF-A и HGF/cMet может эффективно прервать ангиогенез и прогрессирование опухоли. Как описано выше, существующие виды терапии, действующие одновременно на VEGF-A/VEGFR-2 и HGF/cMet-пути, либо основаны на отдельных терапевтических средствах, которые неспецифичны и приводят к данным по безопасности, либо включают в себя несколько конкретных терапевтических средств, которые необходимо объединить, в результате чего требуется совместное введение или несколько введений. Кроме того, некоторые из существующих лекарственных средств демонстрируют короткие системные периоды полувыведения. Таким образом, существует потребность в предоставлении улучшенных лекарственных средств, блокирующих пути VEGF-A/VEGFR-2 и HGF/cMet. Это технически трудно достичь с помощью лекарственных средств на основе антител, которые кроме того страдают от необходимости трудоемкого получения в клетках млекопитающих. В данном документе предлагаются рекомбинантные связывающие белки, которые направлены на решение этих проблем. В некоторых вариантах осуществления представленный здесь рекомбинантный связывающий белок содержит по меньшей мере один сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к VEGF-A, по меньшей мере один сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к HGF, и для улучшения фармакокинетического свойства по меньшей мере два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к новому сконструированному анкириновому повторяющемуся домену со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, содержащему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 50, который демонстрирует улучшенную устойчивость при хранении по сравнению с известными сконструированными анкириновыми повторяющимися доменами со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину. В одном варианте осуществления изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему по меньшей мере два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, причем указанные сконструированные анкириновые повторяющиеся домены со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину содержат SEQ ID NO: 50. В одном варианте осуществления изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему первый, второй, третий и четвертый сконструированные анкириновые повторяющиеся домены, в котором указанный первый сконструированный анкириновый повторяющийся домен имеет связывающую специфичность к VEGF-A, указанный второй сконструированный анкириновый повторяющийся домен имеет связывающую специфичность к HGF, а указанные третий и четвертый сконструированные анкириновые повторяющиеся домены имеют, каждый, связывающую специфичность к сывороточному альбумину и содержат аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 50. В одном варианте осуществления указанные первый, второй, третий и четвертый сконструированные анкириновые повторяющиеся домены указанного рекомбинантного связывающего белка находятся в следующем порядке: третий-второй-первый-четвертый от N-конца к С-концу. В одном варианте осуществления указанный первый сконструированный анкириновый повторяющийся домен указанного рекомбинантного связывающего белка содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 12-21 и аминокислотных последовательностей, в которых до 10 аминокислот из SEQ ID NO: 12-21 замещаются любой аминокислотой, а второй сконструированный анкириновый повторяющийся домен указанного рекомбинантного связывающего белка содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 23-37 и аминокислотных последовательностей, в которых до 10 аминокислот из SEQ ID NO: 23-37 замещаются любой аминокислотой, а указанные третий и четвертый сконструированные анкириновые повторяющиеся домены указанного рекомбинантного связывающего белка, каждый, содержат аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 50, указанные сконструированные анкириновые повторяющиеся домены связаны полипептидными линкерами, содержащими аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 2-9 и аминокислотных последовательностей, в которых до 4 аминокислот из SEQ ID NO: 2-9 замещаются любой аминокислотой. В одном варианте осуществления указанный первый сконструированный анкириновый повторяющийся домен указанного рекомбинантного связывающего белка содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 18, второй сконструированный анкириновый повторяющийся домен указанного рекомбинантного связывающего белка содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, а указанные третий и четвертый сконструированные анкириновые повторяющиеся домены указанного рекомбинантного связывающего белка, каждый, содержат аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 50, указанные сконструированные анкириновые повторяющиеся домены связаны полипептидными линкерами, состоящими из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9. В одном варианте осуществления изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере 90% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 134. В одном варианте осуществления изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 134. В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, состоящему из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 134.

Изобретение также относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей аминокислотную последовательность сконструированного анкиринового повторяющегося домена или рекомбинантного связывающего белка в соответствии с изобретением.

Изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей рекомбинантный связывающий белок и/или сконструированный анкириновый повторяющийся домен или нуклеиновую кислоту в соответствии с настоящим изобретением и необязательно фармацевтически приемлемый носитель и/или разбавитель.

Изобретение также относится к применению фармацевтической композиции в соответствии с изобретением для лечения заболевания. В одном варианте осуществления изобретение относится к применению фармацевтической композиции в соответствии с изобретением для лечения рака, рака желудка или рака почки.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фигура 1. Иллюстрация рекомбинантных связывающих белков, содержащих сконструированные анкириновые повторяющиеся домены со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину.

(a) Иллюстрация сконструированного анкиринового повторяющегося домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину. Примерами таких анкириновых повторяющихся доменов являются сконструированные анкириновые повторяющиеся домены с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 40-56, в частности сконструированный анкириновый повторяющийся домен с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 50. (b) Иллюстрация сконструированного анкиринового повторяющегося домена со связывающей специфичностью к другой мишени, исключая сывороточный альбумин. Примерами таких анкириновых повторяющихся доменов являются сконструированные анкириновые повторяющиеся домены с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 12-39. (с) Иллюстрация полипептидного линкера (например, полипептида с аминокислотной последовательностью, соответствующей любой из SEQ ID NO: 2-9). (d) Иллюстрация N-концевой аминокислотной последовательности. Примерами таких N-концевых аминокислотных последовательностей являются, например, последовательности MGS или GS, или полипептидные метки, примером которых является аминокислотная последовательность, соответствующая SEQ ID NO: 1. (е) Иллюстрация биологически активного соединения. Такой компонент может представлять собой, например, белок или домен белка, например, с агонистической (например, гормон или фермент), антагонистической (например, домен рецептора или фрагмент антитела) или токсической (например, токсин) активностью. Такой компонент может быть, например, также маломолекулярным соединением, демонстрирующим, например, агонистическую, антагонистическую или токсическую активность, (f) Иллюстрация представленного здесь рекомбинантного связывающего белка, содержащего два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину и один сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к другой мишени, исключая сывороточный альбумин, связанный полипептидными линкерами и имеющий N-концевую аминокислотную последовательность. Например, рекомбинантный связывающий белок с аминокислотной последовательностью, соответствующей любой из SEQ ID NO: 73-81, состоит из таких трех сконструированных анкириновых повторяющихся доменов, в которых SEQ ID NO: 73, 75, 78 и 80 имеют два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, фланкирующие соответствующий третий сконструированный анкириновый повторяющийся домен, как показано в иллюстрации. (g) Иллюстрация представленного здесь рекомбинантного связывающего белка, содержащего два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину и два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к другим мишеням, исключая сывороточный альбумин, связанные полипептидными линкерами и имеющие N-концевую аминокислотную последовательность. Два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину фланкируют два сконструированных анкириновых повторяющихся домена. Например, рекомбинантный связывающий белок с аминокислотной последовательностью, соответствующей любой из SEQ ID NO: 95-107, 110, 116, 122, 129-131, 134-144, 149-172 и 175-179, в частности, SEQ ID NO: 134 соответствует этой иллюстрации, (h) Иллюстрация представленного здесь рекомбинантного связывающего белка, содержащего два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину и два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к другим мишеням, исключая сывороточный альбумин, связанные полипептидными линкерами и имеющие N-концевую аминокислотную последовательность. Два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину являются N-концевыми к двум другим сконструированным анкириновым повторяющимся доменам. Например, рекомбинантный связывающий белок с аминокислотной последовательностью, соответствующей любой из SEQ ID NO: 112, 119, 124, 128, 132 и 133, соответствует этой иллюстрации, (i) Иллюстрация фармацевтического соединения, содержащего два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину и биологически активное соединение. Билогически активное соединение может быть ковалентно связано с двумя сконструированными анкириновыми повторяющимися доменами со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину посредством химического взаимодействия или, в случае полипептидов, слияния белка.

Фигура 2. Улучшенная устойчивость при хранении рекомбинантных связывающих белков, содержащих SEQ ID NO: 50. Анализ SDS 15% PAGE Белков #49 и #50 (соответствующих последовательностям SEQ ID NO: 49 и 50 соответственно, дополнительно имеющих SEQ ID NO: 1 на N-конце; получены, как описано в Примере 4), хранившихся при 10 мг/мл в PBS в течение 1 недели при 4°С (1), 25°С (2), 40°С (3) и 60°С (4), соответственно. М: маркер (нижняя полоса: 6,5 кДа, полоса на уровне Белка #50: 14,4 кДа; верхняя полоса в случае PAGE Белка #50: 21,5 кДа).

Фигура 3. Фармакокинетические исследования на мышах, иллюстрирующие преимущество наличия двух сконструированных анкириновых повторяющихся доменов со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину в рекомбинантном связывающем белке. Фармакокинетические исследования на мышах проводили с использованием ^m99Tc-меченных белков, как описано в Примере 5. Процент вводимой дозы (% ID), соотнесенная к начальному моменту времени измерения (а: 4 часа; b-d: 1 ч), показана с течением времени (t; часы). Используемые белки содержали N-концевую His-метку (SEQ ID NO: 1) в дополнение к указанной последовательности, если не было указано иное, (а) Сравнение фармакокинетического профиля Белка #57 (один анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, SEQ ID NO: 57, который содержит последовательность SEQ ID NO: 51, закрашенные круги) с Белками #62 и #63 (белки, содержащие два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину (двойная SEQ ID NO: 51), связанные с помощью GS- (SEQ ID NO: 63, закрашенные ромбы) или РТ-богатых (SEQ ID NO: 62; заполненные квадраты) полинуклеотидными линкерами). Наличие двух сконструированных анкириновых повторяющихся доменов со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину приводит к более высокой % ID, например, через 24 ч (+57% GS; +59% РТ), 48 ч (+76% GS; +82% РТ) или 72 ч (+79% GS; +94% РТ) после инъекции, и дает улучшенный конечный период полувыведения (+38% GS, +48% РТ) по сравнению с белком, содержащим только один сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину. (b) Сравнение фармакокинетического профиля Белка #64 (заполненные круги), содержащего SEQ ID NO: 22 (сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к другой мишени, исключая сывороточный альбумин) и 51 (сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину), с Белками #73 (заполненные квадраты) и #74 (заполненные ромбы), каждый содержащий SEQ ID NO: 22 и двойную 51. Белок #73 имеет SEQ ID NO: 51, фланкирующую SEQ ID NO: 22, а Белок #74 имеет двойную SEQ ID NO: 51 на N-конце SEQ ID NO: 22. Наличие двух сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину дает более высокую % ID, например, через 24 ч (+2% N-концевая, +89% фланкирующая) или 48 ч (+136% N-концевая, +175% фланкирующая) после инъекции, и дает улучшенный конечный период полувыведения (+> 63% как для N-концевой, так и для фланкирующей) по сравнению с белком, содержащим только один сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, (с) Сравнение фармакокинетического профиля Белка #82 (заполненные круги), содержащего SEQ ID NO: 11 (двойная; сконструированный анкириновый повторяющийся домен без известной связывающей специфичности) и 51 (сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину), с Белком #109 (заполненные квадраты), содержащим SEQ ID NO: 11 (двойная) и 51 (двойная; N-концевая). Наличие двух сконструированных анкириновых повторяющихся доменов со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину дает более высокую % ID, например, через 24 ч (+12%) или 48 ч (+35%) после инъекции и дает улучшенный конечный период полувыведения (+71%) по сравнению с белком, содержащим только один сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину. (d) Сравнение фармакокинетического профиля Белка #83 (заполненные круги), содержащего SEQ ID NO: 38 и 39 (сконструированный анкириновый повторяющийся домен, каждый имеет связывающую специфичность к другой мишени, исключая сывороточный альбумин) и 50 (сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину), с Белками #110 (заполненные квадраты), каждый содержащий SEQ ID NO: 38, 39 и 50 (двойные; фланкирующие SEQ ID NO: 38 и 39). Наличие двух сконструированных анкириновых повторяющихся доменов со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину дает более высокую % ID, например, через 24 ч (+198%), 48 ч (+198%) или 72 ч (+228%) после инъекции, и дает улучшенный конечный период полувыведения (+19%) по сравнению с белком, содержащим только один сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину. Следует обратить внимание на то, что измерение Белка #83 было близким к нижнему пределу количественного определения.

Фигура 4. Фармакокинетические исследования намакаках-крабоедах, иллюстрирующие преимущество наличия двух сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину в рекомбинантном связывающем белке. Фармакокинетические исследования на макаках-крабоедахпроводили, как описано в Примере 6. Концентрация соответствующего белка показана в нМ (а) или как относительная величина, соотносящаяся к точке измерения через 10 минут после инъекции (b), с течением времени, указанного в днях (а) или часах (b). Используемые белки содержали N-концевую His-метку (SEQ ID NO: 1) в дополнение к указанной последовательности, если не было указано иное, (а) Сравнение фармакокинетического профиля Белка #57 (0,5 мг/кг; 27,7 нмоль/кг; один сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину; SEQ ID NO: 57, которая содержит последовательность SEQ ID NO: 51; заполненные круги) с Белком #62 (1,04 мг/кг; 34,5 нмоль/кг); белок, содержащий два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину (двойная SEQ ID NO: 51), связанный РТ-богатым политептидным линкером). Наличие двух сконструированных анкириновых повторяющихся доменов со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину дает более высокую экспозицию (2138 д*нмоль/л против 4676 д*нмоль/л, т.е. +119%, расчет вплоть до дня 7), дает уменьшенный клиренс (0,0108 л/(д*кг) против 0,0031 л/(д*кг), т.е. -71%) и дает улучшенный конечный период полувыведения (4,57 d против 9,00 д, т.е. +97%, расчет с дня 1 по день 7) по сравнению с белком, содержащим только один сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину. (b) Показаны фармакокинетический профиль Белка #97 (рекомбинантный связывающий белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 97; закрашенные квадраты) и Белка #134 (рекомбинантный связывающий белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 134, без дополнительной метки последовательности; заполненные круги), вводимых в дозе 1 мг/кг внутривенно макакам-крабоедам. Белок #134 имеет улучшенный фармакокинетический профиль по сравнению с Белком #97.

Фигура 5. Эксклюзионная хроматография в сочетании со статическим светорассеянием рекомбинантного связывающего белка (Белок #134), содержащего два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину. Эксперимент проводили, как описано в Примере 7, используя Белок #134 (рекомбинантный связывающий белок, состоящий из SEQ ID NO: 134; сплошная линия), человеческий сывороточный альбумин (пунктирная линия) и смесь указанных двух (штрих-пунктирная линия). Эксперимент показывает, что Белок #134, содержащий два сконструированных анкириновых повторяющихся домена (двойная SEQ ID NO: 50) со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, способен связывать одновременно две молекулы человеческого альбумина.

Фигура 6. Анализ ELISA рекомбинантных связывающих белков. Анализ Белка #134 (рекомбинантный связывающий белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 134) в различных анализах ELISA на связывание, как описано в Примере 10. Белок #134 содержит один сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к VEGF-A, один сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к HGF и два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину и, соответственно, предполагается взаимодействие Белка #134 с этими белками-мишенями, (а) Анализ ELISA в отношении VEGF-A. Сигнал связывания различных концентраций Белка #134 с иммобилизованным VEGF-A человека (заполненные круги), крысы (заполненные квадраты) и мыши (заполненные ромбы), а также человеческого VEGF-C (открытые перевернутые треугольники) и человеческого PDGF-AB (открытые круги) и соответствующие аппроксимирующие кривые ингибирования. Белок #134 связывается с VEGF-A этих видов с высокой аффинностью и не связывается с VEGF-C и PDGF-AB. (b) Анализ ELISA в отношении HGF. Показаны сигнал связывания различных концентраций Белка #134 с иммобилизованным HGF человека (заполненные круги), макака-крабоеда (заполненные треугольники) и мыши (заполненные ромбы) и соответствующие аппроксимирующие кривые ингибирования. Белок #134 связывается с HGF этих видов с высокой аффинностью, (с) Анализ ELISA по отношению к сывороточному альбумину. Показан сигнал связывания различных концентраций Белка #134 с иммобилизованным сывороточным альбумином человека (заполненные круги), макака-крабоеда (открытый перевернутый треугольник), крысы (открытый треугольник), мыши (открытые квадраты) и собаки (открытые ромбы) и соответствующие аппроксимирующие кривые ингибирования. Белок #134 связывается с сывороточным альбумином этих видов с высокой аффинностью. OD, оптическая плотность при 450 нм минус OD при 620 нм; с [пМ], концентрация рекомбинантного связывающего белка в пМ по логарифмической шкале.

Фигура 7. Конкурентные анализы рецепторов VEGF-A/VEGF-R2 и HGF/cMet Анализ Белка #134 (рекомбинантный связывающий белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 134) в различных конкурентных анализах, как описано в Примере 11. (а) Конкурентный анализ методом HTRF на связывание с VEGF-A/VEGFR-2. Белок #134 ингибирует взаимодействие VEGF-A/VEGFR-2. Базовая линия указывается штрих-пунктирной линией, отсутствие сигнала конкуренции обозначается круговым символом. R: отношение сигнала 665 нм к сигналу 620 нм, с: концентрация Белка #134 в нМ. (b) Анализ конкурентного связывания HGF/cMet. Белок #134 ингибирует взаимодействие HGF/cMet. OD: OD при 450 нм минус OD при 620 нм, с: концентрация Белка #134 в нМ. (с) Конкурентный анализ ELISA на связывание с VEGF-A. Белок #134 связывается с VEGF-А при значении IC₅₀ лучше, чем 10 пМ. OD: OD при 450 нм минус OD при 620 нм, с: концентрация Белка # 134 в пМ.

Фигура 8. SPR-анализ рекомбинантных связывающих белков. Анализ связывания VEGF-A, HGF и HSA Белком #134 (рекомбинантный связывающий белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 134) с помощью прибора ProteOn, как описано в Примере 12. Человеческий HGF иммобилизован на биосенсорном чипе и Белок #134, человеческий VEGF-А или человеческий сывороточный альбумин инъецировали в соответствии со следующими схемами инъекций: (1) Белок #134 - hVEGF-A - HSA, (2) Белок #134 - hVEGF-A - PBST, (3; пунктирная линия) Белок 134 - PBST - HSA, (4) PBST - PBST - PBST, (5) PBST - hVEGF-A - PBST, (6) PBST - PBST - HSA. Кривые 1 и 2 показывают, что Белок #134 может связываться с человеческим HGF и человеческим VEGF-A одновременно. Кроме того, поскольку связывание с VEGF-A достигает насыщения на кривой 1, кривая 1 указывает, что Белок #134 может одновременно связываться с человеческим HGF, человеческим VEGF-А и человеческим сывороточным альбумином. Контрольные инъекции показывают, что неспецифическое взаимодействие не происходит. RU: резонансные единицы; t: время в секундах.

Фигура 9. Действие клеточной пролиферации и клеточной миграции рекомбинантных связывающих белков. Влияние Белка #134 (рекомбинантный связывающий белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 134) в различных клеточных анализах оценивали, как описано в Примере 13. (а) Ингибирование пролиферации клеток HUVEC Белком #134. Клетки HUVEC (3×10³ клеток/лунку) стимулировали с помощью 8 нг/мл человеческого VEGF-A. Пролиферативный статус HUVEC анализировали в отсутствие (открытый круг) или в присутствии возрастающих концентраций Белка #134 (заполненные круги). После 3 дней культивирования при 37°С и 5% СО₂ ингибирование количественно определяли добавлением BrdU в течение последних 24 часов инкубации. Белок #134 демонстрирует IC₅₀ в диапазоне 100-150 пМ. Планки погрешностей отражают стандартное отклонение независимых дубликатов. OD: OD при 450 нм минус OD при 620 нм, с: концентрация Белка #134 в нг/мл. Ось X показана в логарифмическом масштабе. (b) Действие Белка #134 в анализе миграции клеток Oris с клетками А549. Белок #134 существенно ингибирует HGF-индуцированную клеточную миграцию. Клетки высевали за 24 часа до стимуляции с помощью HGF (500 пМ; Н и D) или PBS (N) в присутствии (D) и в отсутствие (Н, N) Белка #134 (5 μМ). Пробки удаляли и миграцию регистрировали и определяли количественно через 48 часов после окрашивания клеток кальцеином. Были сделаны снимки и непокрытую область в лунках планшета клеточной культуры определяли количественно. U: Непокрытая зона в 8 независимых лунках в μм², Н: HGF, без Белка #134, N: без HGF, без Белка #134, D: HGF & Белок #134. (с) Ингибирование фосфорилирования cMet в клетках А549 Белком #134. Клетки А549 голодали в течение ночи, их стимулировали 1 нМ человеческого HGF (HGF отсутствует для отрицательного контроля) в присутствии PBS или возрастающих концентраций Белка #134 в течение 10 минут. P-cMet был обнаружен в клеточных лизатах с помощью ELISA при измерении OD450-620. Соответственные сигналы (% фосфорилирования) рассчитывали с использованием максимального сигнала (HGF, без Белка #134) и минимального сигнала (без HGF, без Белка #134). Белок #134 ингибирует фосфорилирование cMet при IC₅₀ лучше, чем 1 нМ. %Р: % фосфорилирования, с: концентрация Белка #134 в нМ.

Фигура 10. Действие рекомбинантных связывающих белков на рост опухоли in vivo. Эффективность Белка #134 (рекомбинантный связывающий белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 134; содержит (i) один сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к VEGF-A, (ii) сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к HGF, и (iii) два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину; см. Фиг. 1) и других рекомбинантных связывающих белков оценивали на мышиных моделях ксенотрансплантата опухоли, как описано в Примере 14. (а) Количественная оценка пролиферативных клеток и средней сосудистой области в опухолевой ткани мышиной модели U87M, обработанной Белком #134, Белком #60 (рекомбинантный связывающий белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 60 и дополнительно имеющий SEQ ID NO: 1 на N-конце; содержит один сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к HGF (идентичной имеющейся у Белка #134) и один сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину (идентичной имеющейся у Белка #134)) или Белок #61 (рекомбинантный связывающий белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 61 и дополнительно имеющий SEQ ID NO: 1 на N-конце; содержит один сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к VEGF-A (идентичной имеющейся у Белка #134) и один сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину (идентичной имеющейся у Белка #134)), как описано в Примере 14. Что касается ингибирования пролиферации клеток ксенотрансплантата опухоли U87M (Р; измерено как процент пролиферирующих клеток, %рс), Белок #60 демонстрирует незначительное ингибирование, аналогично Белку #61, тогда как Белок #134 имеет значительно более сильный эффект. Аналогично, в отношении ингибирования сосудистого роста (А; измерено как средний процент сосудистой зоны, % mva), Белок #60 демонстрирует небольшое ингибирование, Белок #61 демонстрирует среднее ингибирование, а Белок #134 демонстрирует самый сильный эффект. PBS (белые прямоугольники), Белок #60 (горизонтальные полосатые прямоугольники), Белок #61 (вертикальные прямоугольники в полоску), Белок #134 (черные прямоугольники). (b) Действие Белка #134 на рост опухоли в мышиной модели ксенотрансплантата на взятой у больного опухоли почек по сравнению с сорафенибом и PBS. Подробная информация о модели описана в Примере 14. Сорафениб подавляет рост опухоли, как ожидалось. Интересно, что Белок #134 подавляет рост опухоли за пределами уровня сорафениба, контролируя объем опухоли на ее начальных уровнях. V: объем опухоли в мм³, д: дни лечения, открытые круги: носитель, закрытые круги: Белок #134 (4 мг/кг), открытый квадрат: сорафениб (200 мг/кг). (с) Влияние Белка #134 на рост опухоли в мышиной модели ксенотрансплантата опухоли желудка, взятой у пациента, по сравнению с паклитакселом и комбинацией Белка #134 и паклитаксела. Подробная информация о модели описана в Примере 14. Паклитаксел и Белок #134 подавляют рост опухоли примерно до одного и того же уровня. Комбинация паклитаксела и Белка #134 еще в большей степени подавляет рост опухоли, контролируя объем опухоли на ее начальных уровнях. V: объем опухоли в мм³, д: дни после лечения, открытые круги: носитель, закрытые круги: Белок #134 (4 мг/кг внутривенно), отерытый квадрат: паклитаксел (15 мг/кг внутривенно), открытые треугольники: Белок #134 (4 мг/кг) и паклитаксел (15 мг/кг).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

В контексте настоящего изобретения термин «белок» относится к полипептиду, в котором по меньшей мере часть полипептида имеет или способна приобрести определенное трехмерное расположение за счет образования вторичных, третичных или четвертичных структур внутри одной полипептидной цепи и/или между несколькими полипептидными цепями. Если белок содержит две или более полипептидных цепей, индивидуальные полипептидные цепи могут быть связаны нековалентно или ковалентно, например, дисульфидной связью между двумя полипептидами. Часть белка, которая индивидуально имеет или способна приобрести определенное трехмерное расположение за счет образования вторичной или третичной структуры, называется «доменом белка». Такие домены белка хорошо известны специалистам в данной области.

Термин «рекомбинантный», используемый в терминах рекомбинантный белок, рекомбинантный домен белка, рекомбинантный связывающий белок и тому подобное, означает, что указанные полипептиды получают с использованием технологий рекомбинантных ДНК, хорошо известных специалистам в данной области. Например, молекула рекомбинантной ДНК (например, полученная путем генного синтеза), кодирующая полипептид, может быть клонирована в бактериальную экспрессионную плазмиду (например, pQE30, QIAgen), экспрессионную плазмиду дрожжей, экспрессионную плазмиду млекопитающих или экспрессионную плазмиду растений, или ДНК, способной к экспрессии in vitro. Если, например, такая рекомбинантная бактериальная экспрессионная плазмида вводится в соответствующие бактерии (например, Escherichia coli), эти бактерии могут продуцировать полипептид, кодируемый этой рекомбинантной ДНК. Полученный соответствующим образом полипептид называется рекомбинантным полипептидом или рекомбинантным белком.

В контексте настоящего изобретения термин «связывающий белок» относится к белку, содержащему два или более, предпочтительно три или более, более предпочтительно четыре или более связывающих домена. Предпочтительно, указанный связывающий белок представляет собой рекомбинантный связывающий белок. Предпочтительно, указанный связывающий белок содержит два или более повторяющихся домена. Более предпочтительно, указанный связывающий белок содержит три повторяющихся домена. Более предпочтительно, указанный связывающий белок содержит четыре повторяющихся домена. Также предпочтительно, указанный связывающий белок содержит три или более сконструированных анкириновых повторяющихся домена. Кроме того, предпочтительно, указанный связывающий белок содержит четыре или более сконструированных анкириновых повторяющихся домена. Более предпочтительно, указанный связывающий белок содержит четыре сконструированных анкириновых повторяющихся домена. Необязательно, указанный связывающий белок содержит одно или несколько биологически активных соединений. Указанные связывающие домены указанного связывающего белка обладают таргетной специфичностью. Предпочтительно, два или более указанных связывающих домена указанного связывающего белка обладают таргетной специфичностью к сывороточному альбумину. Предпочтительно, указанный связывающий белок содержит по меньшей мере три связывающих домена, связывающихся по меньшей мере с двумя разными мишенями. Более предпочтительно, указанный связывающий белок содержит по меньшей мере четыре связывающих домена, связывающихся по меньшей мере с тремя разными мишенями.

Кроме того, любой такой связывающий белок может содержать дополнительные полипептиды (такие как, например, полипептидные метки или полипептидные линкеры, хорошо известные специалистам в данной области).

Термин «биологически активное соединение» относится к соединению, смягчающему заболевание при назначении млекопитающему, имеющему указанное заболевание. Биологически активное соединение может иметь антагонистические или агонистические свойства и может быть белковым биологически активным соединением или небелковым биологически активным соединением. Такие белковые биологически активные соединения могут ковалентно присоединяться, например, к связывающему домену в соответствии с изобретением путем генерации генетически слитых полипептидов с использованием стандартных технологий клонирования ДНК с их последующей стандартной экспрессией и очисткой. Небелковые биологически активные соединения могут ковалентно присоединяться, например, к связывающему домену в соответствии с изобретением с помощью химических средств, например, путем соединения с цистеин тиолом с помощью малеимидного линкера, причем цистеин соединяется с помощью полипептидного линкера с N или С концом связывающего домена, как описано выше. Примерами белковых биологически активных соединений являются связывающие домены, обладающие определенной таргетной специфичностью (например, нейтрализация фактора роста за счет связывания с ним), цитокины (например, интерлейкины), факторы роста (например, человеческий гормон роста), антитела и их фрагменты, гормоны (например, GLP-1) или белковое лекарственное средство. Примерами небелковых биологически активных соединений являются токсины (например, DM1 от ImmunoGen), малые молекулы, нацеленные на GPCR, антибиотики или небелковое лекарственное средство.

Термин «связывающий домен» означает домен белка, демонстрирующий такой же «фолд» (то есть вторичную, третичную и/или четвертичную структуру), что и каркас белка, и имеющий заданное свойство, как определено ниже. Такой связывающий домен может быть получен с помощью рациональных или, наиболее часто, комбинаторных методов белковой инженерии, навыков, известных в данной области (Binz et al., 2005, loc. cit.). Например, связывающий домен, имеющий заданное свойство, может быть получен способом, включающим этапы: (а) обеспечение разнообразного набора доменов белка, демонстрирующих такой же фолд, что и каркас белка, как определено ниже; и (b) скрининг указанного разнообразного набора и/или отбор из указанного разнообразного набора для получения по меньшей мере одного домена белка, имеющего указанное заданное свойство. Разнообразный набор доменов белка может быть получен несколькими способами в соответствии с используемой системой скрининга и/или отбора и может содержать использование способов, хорошо известных специалистам в данной области, таких как фаговый дисплей или рибосомный дисплей. Предпочтительно, указанный связывающий домен является рекомбинантным связывающим доменом.

Термин «каркас белка» означает белок с зонами открытой поверхности, в которых аминокислотные вставки, замещения или делеции являются высокоустойчивыми. Примерами белковых каркасов, которые могут быть использованы для создания связывающих доменов по настоящему изобретению, являются антитела или их фрагменты, такие как одноцепочечные фрагменты Fv или Fab, белок А из Staphylococcus aureus, белин-связывающий белок из Pieris brassicae или другие липокалины, анкириновые повторяющиеся белки или другие повторяющиеся белки, а также человеческий фибронектин. Белковые каркасы известны специалистам в данной области (Binz et al., 2005, loc. cit.; Binz et al., 2004, loc. cit.).

Термин «мишень» относится к индивидуальной молекуле, такой как молекула нуклеиновой кислоты, полипептид или белок, углевод или любая другая встречающаяся в природе молекула, включая любую часть такой индивидуальной молекулы, или комплексы двух или более таких молекул. Мишень может представлять собой целую клетку или образец ткани, или это может быть любое неприродное соединение. Предпочтительно мишень представляет собой природный или неприродный полипептид или полипептид, содержащий химические модификации, например, модифицированные естественным или искусственным фосфорилированием, ацетилированием или метилированием. В конкретном применении настоящего изобретения мишенями являются сывороточный альбумин, HGF и VEGF-A.

Термин «заданное свойство» относится к свойству, такому как связывание с мишенью, блокирование мишени, активация опосредованной мишенью реакции, ферментативная активность и связанные с этим дополнительные свойства. В зависимости от типа требуемого свойства любой обычный специалист сможет определить формат и необходимые шаги для выполнения скрининга и/или отбора связывающего домена с требуемым свойством. Предпочтительно, указанное заданное свойство представляет собой специфическое связывание с мишенью.

В контексте настоящего изобретения термин «полипептид» относится к молекуле, состоящей из цепи нескольких, т.е. двух или более аминокислот, связанных пептидными связями. Предпочтительно, полипептид состоит из более чем восьми аминокислот, связанных пептидными связями. Термин «полипептид» также включает ряд цепей аминокислот, соединенных вместе мостиками S-S цистеинов. Полипептиды хорошо известны специалистам в данной области.

Термин «полипептидная метка» относится к аминокислотной последовательности, присоединенной к полипептиду/белку, причем указанная аминокислотная последовательность пригодна для очистки, обнаружения или «нацеливания» (т.е. локализации на сайт мишени) указанного полипептида/белка или указанная аминокислотная последовательность улучшает физико-химическое поведение полипептида/белка, или указанная аминокислотная последовательность обладает эффекторной функцией. Отдельные полипептидные метки связывающего белка могут быть связаны с другими частями связывающего белка непосредственно или полипептидными линкерами. Все эти полипептидные метки хорошо известны в данной области и в полной мере доступны специалисту в данной области. Примерами полипептидных меток являются малые полипептидные последовательности, например, His (например, His-метка SEQ ID NO: 1), myc, FLAG или Strep-метки, или полипептиды, такие как ферменты (например, щелочная фосфатаза), которые позволяют обнаруживать указанный полипептид/белок или полипептиды, которые могут быть использованы для нацеливания (как например, иммуноглобулины или их фрагменты) и/или в качестве эффекторных молекул.

Термин «полипептидный линкер» относится к аминокислотной последовательности, которая способна соединять, например, два домена белка, полипептидную метку и домен белка, домен белка и небелковое соединение или полимер, такой как полиэтиленгликоль, или две метки последовательности. Такие дополнительные домены, метки, небелковые соединения или полимеры и линкеры известны специалистам в данной области. Перечень примеров приведен в описании заявки на патент WO 2002/020565. Конкретными примерами таких линкеров являются глицин-серин-линкеры и пролин-треонин-линкеры переменной длины; предпочтительно, указанные линкеры имеют длину от 2 до 30 аминокислот; более предпочтительно указанные линкеры имеют длину от 2 до 24 аминокислот. Примерами глицин-серин-линкеров являются GS и аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 2-6, а примеры пролин-треонин-линкеров представлены в аминокислотных последовательностях SEQ ID NO: 7-9.

В патентной заявке WO 2002/020565 и Forrer et al., 2003 (loc. cit.) содержится общее описание признаков повторяющегося белка и признаков повторяющегося домена, методов и применений. Термин «повторяющийся белок» относится к белку, содержащему один или несколько повторяющихся доменов. Предпочтительно, повторяющийся белок содержит до шести повторяющихся доменов. Более предпочтительно, повторяющийся белок содержит до пяти повторяющихся доменов. Более предпочтительно, повторяющийся белок содержит до четырех повторяющихся доменов. Кроме того, указанный повторяющийся белок может содержать дополнительные не повторяющиеся домены белка, полипептидные метки и/или полипептидные линкеры. Повторяющиеся домены могут быть связывающими доменами, как описано выше.

Термин «повторяющийся домен» относится к домену белка, содержащему два или более последовательных повторяющихся модуля в качестве структурных единиц, причем указанные структурные единицы имеют одинаковый фолд и плотно сворачиваются, образуя суперспиральную структуру, имеющую общее гидрофобное ядро. Помимо структурной гомологии, такие повторяющиеся модули также имеют гомологию последовательностей. Предпочтительно, повторяющийся домен дополнительно содержит N-концевой и/или С-концевой кэпирующий повтор. Для ясности, кэпирующий повтор может быть повторяющимся модулем. Такие повторяющиеся домены, повторяющиеся модули и кэпирующие повторы, мотивы последовательности, а также структурная гомология и гомология последовательности хорошо известны практикующему специалисту в данной области из примеров сконструированных анкириновых повторяющихся доменов (WO 2002/020565), богатых лейцином повторяющихся доменов (WO 2002/020565), тетратрикопептидных повторяющихся доменов (Main, E.R., Xiong, Y., Соссо, M.J., D'Andrea, L., Regan, L., Structure 11(5), 497-508, 2003) и повторяющихся доменов армадилл (WO 2009/040338). Практикующему специалисту в данной области также известно, что такие повторяющиеся домены отличаются от белков, содержащих повторяющиеся аминокислотные последовательности, где каждая повторяющаяся аминокислотная последовательность способна образовывать индивидуальный домен (например, FN3-домены фибронектина) или где повторяющиеся аминокислотные последовательности не являются структурными единицами, т.е. указанные повторяющиеся аминокислотные последовательности не складываются плотно, чтобы создать суперспиральную структуру с общим гидрофобным ядром. Способы идентификации и определения повторяющихся модулей или повторяющихся мотивов последовательности или идентификации семейств родственных белков, содержащих такие повторяющиеся единицы или мотивы, такие как поиск гомологии (BLAST и проч.), хорошо известны в области биоинформатики и хорошо известны практикующим специалистам в данной области.

Термин «сконструированный повторяющийся белок» и «сконструированный повторяющийся домен» относится к повторяющемуся белку или повторяющемуся домену, соответственно, полученным в результате изобретательской методики, например, как описано в заявке на патент WO 2002/020565. Термин «сконструированный» относится к свойству, указывающему на то, что такие повторяющиеся белки и повторяющиеся домены, соответственно, являются искусственными, синтетическими, а не природными. Сконструированные повторяющиеся белки или сконструированные повторяющиеся домены согласно WO 2002/020565 включают сконструированные анкириновые повторяющиеся белки или сконструированные анкириновые повторяющиеся домены соответственно. Следовательно, сконструированный анкириновый повторяющийся белок здесь соответствует белку в соответствии с изобретением, содержащему по меньшей мере один сконструированный анкириновый повторяющийся домен. Кроме того, термин «неприродный» означает, что последовательность указанного связывающего белка или указанного связывающего домена отсутствует, не записана как неискусственная последовательность в базе данных последовательностей, например, в GenBank, EMBL-Bank или Swiss-Prot. Эти базы данных и другие аналогичные базы данных последовательностей хорошо известны специалистам в данной области. Рекомбинантные связывающие белки или сконструированные анкириновые повторяющиеся домены по изобретению не имеют природного происхождения.

Термины «повторяющийся модуль», «повторяющаяся единица», «кэпирующий повтор», «кэпирующий модуль» и другие термины, относящиеся к повторяющимся белкам и повторяющимся доменам, определены в WO 2002/020565, и эти определения включены посредством ссылки.

Термин «обладает связывающей специфичностью к мишени», «специфически связывается с мишенью», «связывание с мишенью с высокой специфичностью», «специфический к мишени» или «таргетная специфичность» и т.п. означает, что связывающий белок или связывающий домен связывается в PBS с мишенью с более низкой константой диссоциации (т.е. связывается с более высокой аффинностью), чем связывается с не родственным белком, таким как связывающийся с E. coli мальтозой белок (МВР). Предпочтительно, константа диссоциации («Kd») в PBS для мишени составляет по меньшей мере в 10²; более предпочтительно по меньшей мере в 10³; более предпочтительно по меньшей мере в 10⁴; или более предпочтительно по меньшей мере в 10⁵ раз ниже, чем соответствующая константа диссоциации для МВР.

Способы определения констант диссоциации взаимодействий белок-белок, как например, технологии на основе поверхностного плазмонного резонанса (SPR) (например, анализ равновесия SPR) или изотермическая калориметрия титрования (ITC), хорошо известны специалистам в данной области. Измеренные значения Kd конкретного взаимодействия белок-белок могут варьироваться, если они измеряются в разных условиях (например, концентрация соли, рН). Таким образом, измерения значений Kd предпочтительно производятся стандартизованными растворами белка и стандартизованным буфером, таким как PBS.

Термин «PBS» означает фосфатный буферный водный раствор, содержащий 137 мМ NaCl, 10 мМ фосфата и 2,7 мМ KCl и имеющий рН 7,4.

Термин «ингибирует связывание» в контексте связывающих доменов по настоящему изобретению относится к способности указанных связывающих доменов предотвращать связывание его мишени с другим белком, обычно природным лигандом мишени или другим антагонистом. Сила ингибирования обычно измеряется путем оценки концентрации полумаксимального ингибирования (IC₅₀). Термины ингибирование и оценка значений IC₅₀ хорошо подтверждены в данной области. Например, сконструированный анкириновый повторяющийся домен SEQ ID NO: 18 ингибирует связывание VEGF-А с его природным лигандом VEGFR-2.

Изобретение относится к сконструированным анкириновым повторяющимся доменам со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, а также к рекомбинантным связывающим белкам, содержащим по меньшей мере два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину и к рекомбинантным связывающим белкам, содержащим по меньшей мере первый, второй, третий и четвертый сконструированные анкириновые повторяющиеся домены, причем указанный первый сконструированный анкириновый повторяющийся домен имеет связывающую специфичность к VEGF-A, указанный второй сконструированный анкириновый повторяющийся домен имеет связывающую специфичность к HGF, а указанные третий и четвертый сконструированные анкириновые повторяющиеся домены, каждый, имеют связывающую специфичность к сывороточному альбумину.

В одном варианте осуществления изобретение относится к сконструированным анкириновым повторяющимся доменам со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину. Примеры сконструированных анкириновых повторяющихся доменов со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину приведены в SEQ ID NO: 40-56 (см. также Примеры), а другие примеры описаны в WO 2012/069654. В частности, изобретение относится к сконструированным анкириновым повторяющимся доменам со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, выбранным из группы SEQ ID NO: 48-50, более предпочтительно SEQ ID NO: 49 и 50, более предпочтительно SEQ ID NO: 50, в которой до 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 или 0 аминокислот замещаются любой аминокислотой. В одном варианте осуществления изобретение относится к сконструированным анкириновым повторяющимся доменам со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, которые имеют 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность последовательности с сконструированным анкириновым повторяющимся доменом, выбранным из группы SEQ ID NO: 48-50, более предпочтительно SEQ ID NO: 49 и 50, более предпочтительно SEQ ID NO: 50. В одном варианте осуществления изобретение относится к сконструированным анкириновым повторяющимся доменам со связывающей специфичностью к сыворотке, содержащим аминокислотную последовательность, выбранную из группы SEQ ID NO: 48-50, более предпочтительно SEQ ID NO: 49 и 50, более предпочтительно SEQ ID NO: 50. В одном варианте осуществления изобретение относится к сконструированным анкириновым повторяющимся доменам со связывающей специфичностью к выбранной сыворотке, состоящим из аминокислотной последовательности, выбранной из группы SEQ ID NO: 48-50, более предпочтительно SEQ ID NO: 49 и 50, более предпочтительно SEQ ID NO: 50. В одном варианте осуществления изобретение относится к сконструированному анкириновому повторяющемуся домену со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, содержащему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 50. Предпочтительный сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину в соответствии с изобретением представляет собой SEQ ID NO: 50. Предпочтительно, указанный сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину связывается с сывороточным альбумином мыши, крысы, собаки, макака-крабоеда или человека, более предпочтительно сывороточным альбумином мыши, макака-крабоеда или человека, более предпочтительно сывороточным альбумином макака-крабоеда или человеческим сывороточным альбумином, более предпочтительно человеческим сывороточным альбумином в PBS с константой диссоциации (Kd) ниже 10^-5 М; предпочтительно ниже 10^-6 М; или более предпочтительно ниже 10^-7 М. Термин «сывороточный альбумин мыши» относится к номеру доступа Р07724 в UniProt, термин «сывороточный альбумин макака-крабоеда» (т.е. macaca fascicularis) относится к номеру доступа A2V9Z4 в UniProt, а термин «человеческий сывороточный альбумин» относится к номеру доступа Р02768 в UniProt. В одном варианте осуществления изобретение относится к сконструированному анкириновому повторяющемуся домену со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, содержащему аминокислотную последовательность, более предпочтительно, состоящему из аминокислотной последовательности, выбранной из группы SEQ ID NO: 48-50, более предпочтительно SEQ ID NO: 49 и 50, более предпочтительно SEQ ID NO: 50, которые демонстрируют улучшенную устойчивость при хранении по сравнению с SEQ ID NO: 51. «Улучшенная устойчивость при хранении» в контексте настоящего изобретения означает улучшенную среднюю точку температуры денатурирования (т.е. среднюю точку совместного разворачивания при повышении температуры) на 0,5°С, 1°С, 1,5°С, 2°С, 2,5°С, 3°С, 3,5°С или 4°С и/или уменьшение количества полосы деградации, предпочтительно уменьшение количества продуктов деградации, как определено с помощью SDS-PAGE с окрашиванием Кумасси, происходящем после хранения при 40°С в течение 1 месяца при 10 мг/мл в PBS, по меньшей мере на 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% или 50%. Способы оценки устойчивости при хранении с помощью SDS-PAGE и способы определения средней точки денатурации с использованием флуориметрических методов или кругового дихроизма хорошо известны специалистам в данной области. В одном варианте осуществления изобретение относится к сконструированному анкириновому повторяющемуся домену со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, содержащему аминокислотную последовательность, более предпочтительно, состоящему из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 50, которая демонстрирует улучшенную устойчивость при хранении по сравнению с SEQ ID NO: 49, предпочтительно, которая демонстрирует уменьшение количества продуктов деградации, как определено с помощью SDS-PAGE, происходящее после хранения при 40°С в течение 1 месяца при 10 мг/мл в PBS, по меньшей мере на 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% или 50% по сравнению с SEQ ID NO: 49. Примеры сконструированных анкириновых повторяющихся доменов и рекомбинантных связывающих белков с улучшенными свойствами устойчивости при хранении приведены в Примере 9.

В одном варианте осуществления изобретение относится к сконструированному анкириновому повторяющемуся домену со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, выбранному из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 44-49, 51 и 52, более предпочтительно 48, 49, 51 и 52, более предпочтительно 48 и 49, более предпочтительно 49, содержащих глутамат в позиции 78. В одном варианте осуществления изобретение относится к SEQ ID NO: 49, в которой аспартат в позиции 78 замещен на глутамат, соответствующий SEQ ID NO: 50. SEQ ID NO: 49 содержит большое число потенциальных участков деградации. Деградация может происходить, например, рядом с любым из 5 аспарагинов (включая дипептиды аспарагин-глицина), 13 аспартатов или 10 глицинов из SEQ ID NO: 49, из дополнительных потенциальных участков деградации. SEQ ID NO: 49 дополнительно содержит ряд потенциальных участков окисления. Как ни удивительно, основной эффект на устойчивость при хранении может быть достигнут за счет видоизменения только позиции 78 SEQ ID NO: 49. Кроме того, функциональность сконструированного анкиринового повтора со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину может быть сохранена за счет видоизменения позиции 78 в SEQ ID NO: 49 с аспартата на глутамин. Сконструированный анкириновый повторяющийся домен, состоящий из SEQ ID NO: 49, содержащей глутамат в позиции 78, демонстрирует более высокую устойчивость при хранении по сравнению с сконструированным анкириновым повторяющимся доменом, содержащим аспартат в этой позиции.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему по меньшей мере два, предпочтительно содержащему два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину. Предпочтительный рекомбинантный связывающий белок в соответствии с изобретением содержит два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину. Примеры таких рекомбинантных связывающих белков приведены в аминокислотных последовательностях SEQ ID NO: 62, 63, 73-81 и 95-179.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему по меньшей мере два, более предпочтительно содержащему два анкириновых сконструированных повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, причем указанный рекомбинантный связывающий белок демонстрирует улучшенные фармакокинетические свойства по сравнению с рекомбинантным связывающим белком, содержащим только один сконструированный повторяющийся домен со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину. В примерах настоящего изобретения описаны такие рекомбинантные связывающие белки.

Выражение «рекомбинантный связывающий белок, содержащий только один сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину», означает рекомбинантное связывание, которое имеет композицию рекомбинантного связывающего белка по настоящему изобретению, в которой количество сконструированных анкириновых повторяющихся доменов со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину уменьшено до одного, путем удаления всех сконструированных анкириновых повторяющихся доменов со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, кроме одного, и соответствующих полипептидных линкеров. Предпочтительно, указанный оставшийся один сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину находится в позиции в рекомбинантном связывающем белке, соответствующей позиции, в которой содержался сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину в рекомбинантном связывающем белке по настоящему изобретению, и оставшийся один анкириновый сконструированный повторяющийся домен со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину идентичен сконструированному анкириновому повторяющемуся домену со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, который находился в соответствующей позиции в рекомбинантном связывающем белке в соответствии с настоящим изобретением. Например, рекомбинантный связывающий белок, состоящий из SEQ ID NO: 85, представляет собой рекомбинантный связывающий белок, состоящий из SEQ ID NO: 95, в которой С-концевой сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину (в этом случае SEQ ID NO: 50), а также соседний полипептидный линкер (в этом случае SEQ ID NO: 9) удалены. Важно отметить, что оставшийся сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину (SEQ ID NO: 50) из SEQ ID NO: 85 является N-концевым, a SEQ ID NO: 95 содержит такую же SEQ ID NO: 50 в той же позиции. Аналогичным образом рекомбинантный связывающий белок, состоящий из SEQ ID NO: 83, представляет собой рекомбинантный связывающий белок, состоящий из SEQ ID NO: 110, в котором С-концевой сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину (в этом случае SEQ ID NO: 50), а также соседний полипептидный линкер (в данном случае SEQ ID NO: 9) удалены.

Выражение «демонстрирует улучшенные фармакокинетические свойства», «улучшенные фармакокинетические свойства» или «улучшение фармакокинетических свойств» в данном изобретении имеет такое значение, что фармакокинетический параметр рекомбинантного связывающего белка улучшен по сравнению с соответствующим фармакокинетическим параметром белка, с которым он сравнивается. Соответствующие примеры показаны в Примерах 5 и 6 и на Фигурах 3 и 4. Например, при сравнении Белка #110 (белок, состоящий из SEQ ID NO: 110 и дополнительно SEQ ID NO: 1 на N-конце) с Белком #83 (белок, состоящий из SEQ ID NO: 83 и дополнительно SEQ ID NO: 1 на N-конце) в фармакокинетических исследованиях на макаках-крабоедахБелок #110 имеет более высокую экспозицию (+32%), уменьшенный клиренс (-47%), а также более длительный конечный период полувыведения (+168%, расчет выполнен с дня 1 по день 6), чем Белок #83. В качестве другого примера, при сравнении Белка #62 (белок, состоящий из SEQ ID NO: 62 и дополнительно SEQ ID NO: 1 на N-конце) с Белком #57 (белок, состоящий из SEQ ID NO: 57 и дополнительно SEQ ID NO: 1 на N-конце) в фармакокинетических исследованиях на макаках-крабоедахБелок #62 имеет более высокую экспозицию (+119%), уменьшенный клиренс (-71%), а также более длительный конечный период полувыведения (+97%, расчет выполнен с дня 1 по день 7), чем Белок #57. Или при сравнении Белка #109 (белок, состоящий из SEQ ID NO: 109 и дополнительно SEQ ID NO: 1 на N-конце) с Белком #82 (белок, состоящий из SEQ ID NO: 82 и дополнительно SEQ ID NO: 1 на N-конце) в фармакокинетических исследованиях на макаках-крабоедахБелок #109 имеет более высокую экспозицию (+19%), уменьшенный клиренс (-37%), а также более длительный конечный период полувыведения (+55%, расчет выполнен с дня 1 по день 7), чем Белок #82. В качестве еще одного примера при сравнении Белка #97 (белок, состоящий из SEQ ID NO: 97 и дополнительно SEQ ID NO: 1 на N-конце) с Белком #68 (белок, состоящий из SEQ ID NO: 68 и дополнительно SEQ ID NO: 1 на N-конце) в фармакокинетических исследованиях на макаках-крабоедах Белок #97 имеет более высокий конечный период полувыведения (+264%, расчет выполнен с дня 1 по день 7), чем Белок #68. Другие примеры приведены в Примерах 5 и 6, а также на Фигурах 3 и 4. Предпочтительно, улучшенное фармакокинетическое свойство представляет собой уменьшенный клиренс и/или повышенную экспозицию и/или увеличенный конечный период полувыведения. Более предпочтительно, улучшенное фармакокинетическое свойство представляет собой увеличенный конечный период полу выведения. В одном варианте осуществления рекомбинантный связывающий белок по настоящему изобретению, содержащий по меньшей мере два, более предпочтительно содержащий два, сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, демонстрирует увеличенный конечный период полувыведения и/или уменьшенный клиренс, и/или увеличенную экспозицию по меньшей мере на 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200% или 250% по сравнению с рекомбинантным связывающим белком, содержащим только один сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину. В одном варианте осуществления рекомбинантный связывающий белок по настоящему изобретению, содержащий по меньшей мере два, более предпочтительно содержащий два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, демонстрирует увеличенный конечный период полувыведения, предпочтительно увеличенный конечный период полувыведения по меньшей мере на 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200% или 250% по сравнению с рекомбинантным связывающим белком, содержащим только один сконструированный анкириноовый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину.

Предпочтительно, оценка клиренса и/или экспозиции и/или конечного периода полувыведения проводится у млекопитающего, более предпочтительно мыши и/или макака-крабоеда, более предпочтительно макака-крабоеда. Предпочтительно, при измерении клиренса и/или экспозиции и/или конечного периода полувыведения у мыши оценка проводится с учетом данных до 48 ч после инъекции. Более предпочтительно, оценка конечного периода полувыведения у мыши рассчитывается с 24 ч до 48 ч. Предпочтительно, при измерении клиренса и/или экспозиции и/или конечного периода полувыведения у макака-крабоеда оценка проводится с учетом данных вплоть до дня 7 после инъекции. Более предпочтительно, оценка конечного периода полувыведения у макака-крабоеда рассчитывается с дня 1 по день 7. Термин «конечный период полувыведения» лекарственного средства, как например, рекомбинантный связывающий белок по изобретению, относится к времени, которое требуется для достижения половины концентрации в плазме лекарственного средства, полученного млекопитающим, после достижения псевдоравновесия (например, рассчитанная с 24 до 48 часов у мышей или рассчитанная с дня 1 по день 7 у макака-крабоеда). Конечный период полувыведения не определяется как время, необходимое для удаления из организма половины дозы препарата, вводимого млекопитающему. Термин конечный период полувыведения хорошо известен специалистам в данной области. Предпочтительно, фармакокинетическое сравнение проводится при любой дозировке, более предпочтительно при эквивалентной дозировке (т.е. такой дозировке мг/кг) или эквимолярной дозировке (т.е. такой дозировке моль/кг), более предпочтительно в эквимолярной дозировке (т.е. такой дозировке моль/кг). Специалистам в данной области понятно, что эквивалентное и/или эквимолярное дозирование у животных подвержено экспериментальным вариациям дозы по меньшей мере 20%, более предпочтительно 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100%. Предпочтительно, дозировка, используемая для фармакокинетических измерений, выбирается от 0,001 до 1000 мг/кг, более предпочтительно от 0,01 до 100 мг/кг, более предпочтительно от 0,1 до 50 мг/кг, более предпочтительно от 0,5 до 10 мг/кг.

В одном варианте осуществления рекомбинантный связывающий белок по настоящему изобретению, содержащий по меньшей мере два, более предпочтительно содержащий два, сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, демонстрирует более высокий процент вводимой дозы у мышей через 24 ч и/или 48 ч и/или 72 ч после инъекции, предпочтительно через 24 ч после инъекции, предпочтительно через 48 ч после инъекции, более предпочтительно через 72 ч после инъекции, более предпочтительно 72 ч и 48 ч после инъекции, более предпочтительно 24 ч, 48 ч и 72 ч после инъекции по сравнению с рекомбинантным связывающим белком, содержащим только один сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину. Предпочтительно, процент вводимой дозы у мышей рассчитывается путем сравнения с показателем концентрации через 1 час или 4 часа, предпочтительно 1 после инъекции. В одном варианте осуществления рекомбинантный связывающий белок по настоящему изобретению, содержащий по меньшей мере два, более предпочтительно содержащий два сконструированных анкириновых повторяющихся доменов со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, демонстрирует более высокий процент вводимой дозы у макака-крабоеда через 4 дня и/или 5 дней и/или через 6 дней после инъекции, предпочтительно 4 дня, предпочтительно 5 дней, более предпочтительно 6 дней, более предпочтительно 5 и 6 дней после инъекции, более предпочтительно 4, 5 и 6 дней после инъекции по сравнению с рекомбинантным связывающим белком, содержащим только один сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину. Предпочтительно, процент вводимой дозы у макака-крабоеда рассчитывается путем сравнения с показателем концентрации через 10 мин или 1 час, предпочтительно через 10 мин после инъекции. Более высокий процент вводимой дозы относится к увеличению процента дозы по меньшей мере на 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200% или 250%.

В одном варианте осуществления рекомбинантный связывающий белок по настоящему изобретению содержит по меньшей мере три сконструированных анкириновых повторяющихся домена, в котором по меньшей мере два сконструированных анкириновых повторяющихся домена представляют собой сконструированные анкириновые повторяющиеся домены с связывающей специфичностью к сывороточному альбумину. Примеры таких рекомбинантных связывающих белков приведены в аминокислотных последовательностях SEQ ID NO: 73-81 и 95-179.

В одном варианте осуществления рекомбинантный связывающий белок содержит по меньшей мере четыре сконструированных анкириновых повторяющихся домена, в котором по меньшей мере два сконструированных анкириновых повторяющихся домена представляют собой сконструированные анкириновые повторяющиеся домены со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину. Примеры таких рекомбинантных связывающих белков приведены в аминокислотных последовательностях SEQ ID NO: 95-179.

В одном варианте осуществления изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему по меньшей мере два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, в котором каждый из указанных сконструированных анкириновых повторяющихся доменов со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину в PBS обладает связывающей специфичностью к сывороточному альбумину млекопитающих, более предпочтительно мыши, крысы, собаки, макака-крабоеда или человеческому, более предпочтительно к сывороточному альбумину мыши, макака-крабоеда или человеческому, более предпочтительно к сывороточному альбумину макака-крабоеда или человеческому, более предпочтительно к человеческому сывороточному альбумину.

В одном варианте осуществления изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему по меньшей мере два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, в котором каждый из указанных сконструированных анкириновых повторяющихся доменов со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину связывается с сывороточным альбумином, более предпочтительно, сывороточным альбумином млекопитающих, более предпочтительно сывороточным альбумином мыши, крысы, собаки, макака-крабоеда или человеческим, более предпочтительно сывороточным альбумином мыши, макака-крабоеда или человеческим, более предпочтительно сывороточным альбумином макака-крабоеда или человеческим, предпочтительно человеческим сывороточным альбумином в PBS с константой диссоциации (Kd) ниже 10^-5 М, предпочтительно ниже 10^-6 М, более предпочтительно ниже 10^-7 М. Примеры таких сконструированных анкириновых повторяющихся доменов со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину приведены в Примере 2 и в SEQ ID NO: 40-56.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, в котором указанные два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину находятся в любой позиции по сравнению с любым другим доменом белка, предпочтительно любым другим сконструированным анкириновым повторяющимся доменом, содержащимся в указанном рекомбинантном связывающем белке, причем предпочтительно указанные два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину оба являются N-концом любого другого домена белка, предпочтительно любого другого сконструированного анкиринового повторяющегося домена, содержащегося в указанном рекомбинантном связывающем белке, или в котором указанные два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину являются один N-концом и один С-концом любого другого домена белка, предпочтительно любого другого сконструированного анкиринового повторяющегося домена, содержащегося в указанном рекомбинантном связывающем белке, или, более предпочтительно, указанные два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину являются один N-концом и один С-концом любого другого домена белка, предпочтительно любого другого сконструированного анкиринового повторяющегося домена, содержащегося в указанном рекомбинантном связывающем белке. Предпочтительно, указанные два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину не являются оба С-концом любого другого домена белка, предпочтительно любого другого сконструированного анкиринового повторяющегося домена, содержащегося в указанном рекомбинантном связывающем белке. Примеры различных расположений сконструированных анкириновых повторяющихся доменов в рекомбинантном связывающем белке приведены в SEQ ID NO: 95-179 и описаны в Примерах. SEQ ID NO: 134 иллюстрирует предпочтительное расположение двух сконструированных анкириновых повторяющихся доменов со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину в рекомбинантном связывающем белке в соответствии с настоящим изобретением.

В одном варианте осуществления изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему по меньшей мере три, предпочтительно содержащему по меньшей мере четыре, более предпочтительно содержащему четыре сконструированных анкириновых повторяющихся домена, причем два из указанных по меньшей мере трех, предпочтительно по меньшей мере четырех, более предпочтительно четырех сконструированных анкириновых повторяющихся доменов, каждый, имеют связывающую специфичность к сывороточному альбумину и/или, предпочтительно, указанные по меньшей мере три, предпочтительно по меньшей мере четыре, более предпочтительно четыре сконструированных анкириновых повторяющихся домена связаны полипептидными линкерами.

В одном варианте осуществления изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему по меньшей мере два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, в котором указанные сконструированные анкириновые повторяющиеся домены со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину имеют по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с любой аминокислотной последовательностью, выбранной из группы SEQ ID NO: 44-52, предпочтительно SEQ ID NO: 48-50, более предпочтительно SEQ ID NO: 49 и 50. более предпочтительно SEQ ID NO: 50.

В одном варианте осуществления изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему по меньшей мере два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, в котором указанные сконструированные анкириновые повторяющиеся домены со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину выбирают из любой аминокислотной последовательности, выбранной из группы SEQ ID NO: 44-52, предпочтительно SEQ ID NO: 48-50, более предпочтительно SEQ ID NO: 49 и 50, более предпочтительно SEQ ID NO: 50, и в каждом из двух сконструированных повторяющихся анкириновых доменов со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину до 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 или 0 аминокислот замещаются любой аминокислотой.

В одном варианте осуществления изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему по меньшей мере два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, в котором указанные сконструированные анкириновые повторяющиеся домены со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину выбирают из любой аминокислотной последовательности, выбранной из группы SEQ ID NO: 44-52, предпочтительно SEQ ID NO: 48-50, более предпочтительно SEQ ID NO: 49 и 50, более предпочтительно SEQ ID NO: 50. В одном варианте осуществления изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему по меньшей мере два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, в котором каждый из указанных сконструированных анкириновых повторяющихся доменов со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 50.

В одном варианте осуществления изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему по меньшей мере два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, в котором указанные сконструированные анкириновые повторяющиеся домены со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину по меньшей мере на 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичны по аминокислотной последовательности. В одном варианте осуществления указанные сконструированные анкириновые повторяющиеся домены со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину указанного рекомбинантного связывающего белка идентичны по аминокислотной последовательности. Например, два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, содержащихся в SEQ ID NO: 130, по меньшей мере на 95% идентичны (различие 6 остатков на 124 аминокислотах). В другом примере два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, содержащиеся в SEQ ID NO: 129, по меньшей мере на 80% идентичны (различие 24 остатка на 124 аминокислотах).

В одном варианте осуществления изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему по меньшей мере два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, в котором каждый из сконструированных анкириновых повторяющихся доменов со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину способен связывать одну молекулу сывороточного альбумина одновременно. Предпочтительно, указанный сывороточный альбумин является альбумином человеческого происхождения. Примеры одновременного связывания двух молекул человеческого сывороточного альбумина рекомбинантными связывающими белками по настоящему изобретению, содержащими два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, показаны в Примере 7.

В одном варианте осуществления изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 сконструированных анкириновых повторяющихся доменов со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину.

В одном варианте осуществления изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему по меньшей мере три, предпочтительно по меньшей мере четыре, более предпочтительно содержащему четыре сконструированных анкириновых повторяющихся домена, в котором по меньшей мере два, более предпочтительно два, из указанных сконструированных анкириновых повторяющихся доменов являются сконструированными анкириновыми повторяющимися доменами со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, более предпочтительно к человеческому сывороточному альбумину, и указанные по меньшей мере два, более предпочтительно два, сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумин являются по меньшей мере, предпочтительно являются, один N-концом и один С-концом любого другого сконструированного анкиринового повторяющегося домена, предпочтительно двух других сконструированных анкириновых повторяющихся доменов, и указанные по меньшей мере два, более предпочтительно два, сконструированных повторяющихся анкириновых домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, каждый, связываются с сывороточным альбумином, предпочтительно человеческим сывороточным альбумином, в PBS с константой диссоциации (Kd) по меньшей мере 10^-5 М, предпочтительно ниже 10^-6 М или более предпочтительно ниже 10^-7 М, и указанный рекомбинантный связывающий белок демонстрирует увеличенный конечный период полувыведения, предпочтительно увеличенный конечный период полувыведения по меньшей мере на 5%, 10%, 15%, 20% 25%, 30%, 35%, 40%, 45% или 50% по сравнению с рекомбинантным связывающим белком, содержащим только один сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, и указанные по меньшей мере три, предпочтительно по меньшей мере четыре, более предпочтительно четыре сконструированных анкириновых повторяющихся домена связаны полипептидными линкерами. В одном варианте осуществления указанные по меньшей мере два, более предпочтительно два, сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину указанного рекомбинантного связывающего белка по меньшей мере на 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92% 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичны, более предпочтительно идентичны.

В одном варианте осуществления домены белка или сконструированные анкириновые повторяющиеся домены, присутствующие в рекомбинантном связывающем белке по настоящему изобретению, связаны полипептидными линкерами любой композиции аминокислотной последовательности. В одном варианте осуществления полипептидные линкеры, связывающие домены белка или сконструированные анкириновые повторяющиеся домены, присутствующие в рекомбинантном связывающем белке по настоящему изобретению, содержат аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 2-9, более предпочтительно SEQ ID NO: 3-9, более предпочтительно SEQ ID NO: 4-9, более предпочтительно SEQ ID NO: 6 или 9, более предпочтительно SEQ ID NO: 9, в которых до 4, 3, 2, 1, 0 аминокислот замещаются любой аминокислотой. В одном варианте осуществления указанные полипептидные линкеры содержат аминокислотную последовательность, выбранную из любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 2-9, более предпочтительно SEQ ID NO: 3-9, более предпочтительно SEQ ID NO: 4-9, более предпочтительно SEQ ID NO: 6 или 9, более предпочтительно SEQ ID NO: 9. В одном варианте осуществления фланкирующий N-концевой Gly Ser из SEQ ID NO: 7-9 и/или фланкирующий С-концевой Gly Ser из SEQ ID NO: 2-9 необязательно отсутствует. В одном варианте осуществления SEQ ID NO: 7-9 дополнительно содержит Arg Ser на С-конце (как, например, присутствует в SEQ ID NO: 68 и 109). В одном варианте осуществления второй от С-конца аминокислотный глицин указанных полипептидных линкеров SEQ ID NO: 2-6 может быть замещен аргинином (как, например, присутствует в SEQ ID NO: 70 и 88). В одном варианте осуществления полипептидные линкеры, связывающие сконструированные анкириновые повторяющиеся домены, присутствующие в рекомбинантном связывающем белке по настоящему изобретению, состоят из аминокислотной последовательности, выбранной из любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 2-9, более предпочтительно SEQ ID NO: 3-9, более предпочтительно SEQ ID NO: 4 - 9, более предпочтительно SEQ ID NO:6 или 9, более предпочтительно SEQ ID NO: 9. В одном варианте осуществления указанные полипептидные линкеры, присутствующие в рекомбинантном связывающем белке по настоящему изобретению, на 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичны, предпочтительно идентичны.

В одном варианте осуществления изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему по меньшей мере два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, в котором указанные полипептидные линкеры содержат аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 2-9, более предпочтительно SEQ ID NO: 3-9, более предпочтительно SEQ ID NO: 4-9, более предпочтительно SEQ ID NO: 6 или 9, более предпочтительно SEQ ID NO: 9, где до 4, 3, 2, 1, 0 аминокислот замещаются любой аминокислотой, и указанные сконструированные анкириновые повторяющиеся домены со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину имеют по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% идентичность с любой аминокислотной последовательностью, выбранной из группы SEQ ID NO: 44-52, предпочтительно SEQ ID NO: 48-50, более предпочтительно SEQ ID NO: 49 и 50, более предпочтительно SEQ ID NO: 50.

В одном варианте осуществления изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему по меньшей мере два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, в котором указанные полипептидные линкеры состоят из аминокислотных последовательностей, выбранных из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 6 или 9, где до 4, 3, 2, 1, 0 аминокислот замещаются любой аминокислотой, и указанные сконструированные анкириновые повторяющиеся домены со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, каждый, состоят из аминокислотной последовательности, которая имеет по меньшей мере 90% 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% идентичность с любой аминокислотной последовательностью, выбранной из группы SEQ ID NO: 48-50.

В одном варианте осуществления изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему по меньшей мере два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, в котором указанные по меньшей мере два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, каждый, содержат аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 50.

В одном варианте осуществления изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему по меньшей мере два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, в котором указанные по меньшей мере два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, каждый, содержат аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 50, и указанный рекомбинантный связывающий белок демонстрирует улучшенную устойчивость при хранении, предпочтительно уменьшенные количества продуктов деградации после хранения при 40°С в течение 1 месяца при 10 мг/мл в PBS по сравнению с рекомбинантным связывающим белком, указанные по меньшей мере два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, каждый, содержат аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49, и/или по сравнению с рекомбинантным связывающим белком, в котором указанные по меньшей мере два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, каждый, содержат аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 51, предпочтительно по сравнению с рекомбинантным связывающим белком, и указанные по меньшей мере два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, каждый, содержат аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49.

В одном варианте осуществления изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему по меньшей мере два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, в котором указанные по меньшей мере два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, каждый, содержат аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 50, и указанные сконструированные анкириновые повторяющиеся домены связаны полипептидными линкерами, каждый из которых содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9.

В одном варианте осуществления изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему по меньшей мере два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, в котором указанные по меньшей мере два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, каждый, состоят из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 50.

В одном варианте осуществления изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему по меньшей мере два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, в котором указанные по меньшей мере два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, каждый, состоят из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 50, и указанные сконструированные анкириновые повторяющиеся домены связаны полипептидными линкерами, каждый из которых состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9.

В одном варианте осуществления изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему четыре сконструированных анкириновых повторяющихся домена, в котором два из указанных сконструированных анкириновых повторяющихся доменов представляют собой сконструированные анкириновые повторяющиеся домены со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, и указанные два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, каждый, содержат аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 50, и указанные сконструированные анкириновые повторяющиеся домены связаны полипептидными линкерами, каждый из которых содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, и указанные сконструированные анкириновые повторяющиеся домены расположены (со стороны N-конца к стороне С-конца): SEQ ID NO: 50 - SEQ ID NO: 9 - XXX - SEQ ID NO: 9 - YYY - SEQ ID NO: 9 - SEQ ID NO: 50, где каждый из XXX и YYY представляет собой сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к другой мишени, исключая сывороточный альбумин.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему по меньшей мере первый, второй, третий и четвертый сконструированные анкириновые повторяющиеся домены, в котором указанный первый сконструированный анкириновый повторяющийся домен имеет связывающую специфичность к VEGF-A, и указанный второй сконструированный анкириновый повторяющийся домен имеет связывающую специфичность к HGF, и указанные третий и четвертый сконструированные анкириновые повторяющиеся домены, каждый, имеют связывающую специфичность к сывороточному альбумину. Предпочтительно, указанный рекомбинантный связывающий белок состоит из одной полипептидной цепи. Более предпочтительно, указанный первый, второй, третий и четвертый сконструированные анкириновые повторяющиеся домены связаны полипептидными линкерами. В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему первый, второй, третий и четвертый сконструированные анкириновые повторяющиеся домены, в котором указанный первый сконструированный анкириновый повторяющийся домен имеет связывающую специфичность к VEGF-A, и в котором указанный второй сконструированный анкириновый повторяющийся домен имеет связывающую специфичность к HGF, и в котором указанные третий и четвертый сконструированные анкириновые повторяющиеся домены, каждый, имеют связывающую специфичность к сывороточному альбумину. Примеры таких рекомбинантных связывающих белков приведены в аминокислотных последовательностях SEQ ID NO: 95-108 и 116-179.

Предпочтительно, сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к VEGF-A связывает VEGF-A мыши, крысы, собаки, кролика, макака-крабоеда или человека, более предпочтительно VEGF-A мыши, макака-крабоеда или человека, более предпочтительно VEGF-A макака-крабоеда или человека, более предпочтительно VEGF-A человека. Предпочтительно, VEGF-A представляет собой VEGF-A165 человека. Приведены примеры сконструированных анкириновых повторяющихся доменов со связывающей специфичностью к VEGF-A (SEQ ID NO: 12-21, см. примеры), другие примеры описаны в WO 2010/060748 и WO 2011/135067.

Предпочтительно, сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к HGF связывает HGF мыши, крысы, собаки, кролика, макака-крабоеда или человека, более предпочтительно HGF мыши, макака-крабоеда или человека, более предпочтительно HGF макака-крабоеда или человека, более предпочтительно HGF человека. Приведены примеры сконструированных анкириновых повторяющихся доменов со связывающей специфичностью к HGF (SEQ ID NO: 23-37, см. примеры), другие примеры описаны в WO 2014/191574.

В одном варианте осуществления рекомбинантный связывающий белок или сконструированный анкириновый повторяющийся домен лишен свободного остатка Cys.

«Свободный остаток Cys» не участвует в формировании дисульфидной связи. В одном варианте осуществления изобретение относится к связывающему белку или связывающему домену, не содержащему остаток Cys. В одном варианте осуществления сконструированный анкириновый повторяющийся домен и/или рекомбинантный связывающий белок лишен дисульфидной связи. Например, дисульфидные связи фрагментов антител известны специалистам в данной области как тормозящие простое продуцирование фрагментов антител в бактериях.

Методы модификации рекомбинантного связывающего белка по настоящему изобретению хорошо известны специалистам в данной области.

В частности, изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему по меньшей мере первый, второй, третий и четвертый сконструированные анкириновые повторяющиеся домены, в котором указанный первый сконструированный анкириновый повторяющийся домен связывает VEGF-A в PBS при константе диссоциации (Kd) ниже 10^-7М; предпочтительно ниже 10^-8М; более предпочтительно ниже 10^-9М; или более предпочтительно ниже 10^-10М; и указанный второй сконструированный анкириновый повторяющийся домен связывает HGF в PBS при Kd ниже 10^-7М; предпочтительно ниже 10^-8М; более предпочтительно ниже 10^-9М; или более предпочтительно ниже 10^-10М; и указанные третий и четвертый сконструированные анкириновые повторяющиеся домены, каждый, связывают сывороточный альбумин в PBS при Kd ниже 10^-5М; предпочтительно ниже 10^-6М; или более предпочтительно ниже 10^-7М. Приведены примеры сконструированных анкириновых повторяющихся доменов со связывающей специфичностью к VEGF-A, сконструированных анкириновых повторяющихся доменов со связывающей специфичностью к HGF и сконструированных анкириновых повторяющихся доменов со связывающей специфичностью к сывороточным альбумином (SEQ ID NO: 12-56, см. примеры).

Кроме того, изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему по меньшей мере первый, второй, третий и четвертый сконструированные анкириновые повторяющиеся домены, в котором указанный первый сконструированный анкириновый повторяющийся домен ингибирует связывание VEGF-A человека с VEGFR-2 человека в PBS при величине IC₅₀ ниже 10^-7М, предпочтительно 10^-8М, более предпочтительно 10^--9М, и указанный второй сконструированный анкириновый повторяющийся домен ингибирует связывание HGF человека с cMet человека в PBS при величине IC₅₀ ниже 10^-7М, предпочтительно 10^-8М, более предпочтительно 10^-9М. В примерах приведены различные примеры сконструированных анкириновых повторяющихся доменов, выбранных из SEQ ID NO: 12-37.

В одном варианте осуществления изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему по меньшей мере первый, второй, третий и четвертый сконструированные анкириновые повторяющиеся домены, в котором указанный первый сконструированный анкириновый повторяющийся домен содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%), 99%, 100% идентичность аминокислотной последовательности с одним сконструированным анкириновым повторяющимся доменом, выбранным из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 12-21, более предпочтительно SEQ ID NO: 17-21, более предпочтительно SEQ ID NO: 18-20, более предпочтительно SEQ ID NO: 18. В одном варианте осуществления указанный первый сконструированный анкириновый повторяющийся домен содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 12-21, более предпочтительно SEQ ID NO: 17-21, более предпочтительно SEQ ID NO: 18-20, более предпочтительно SEQ ID NO: 18, и аминокислотные последовательности, в которых до 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0 аминокислот из SEQ ID NO: 12-21, более предпочтительно SEQ ID NO: 17-21, более предпочтительно SEQ ID NO: 18-20, более предпочтительно SEQ ID NO: 18 замещаются любой аминокислотой. В одном варианте осуществления указанный первый сконструированный анкириновый повторяющийся домен содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 14-21, в которой индивидуальные аминокислоты замещаются любой аминокислотой, встречающейся в той же позиции выравнивания аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 14-21. В одном варианте осуществления указанный первый сконструированный анкириновый повторяющийся домен содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 12-21, более предпочтительно SEQ ID NO: 17-21, более предпочтительно SEQ ID NO: 18-20, более предпочтительно SEQ ID NO: 18. В одном варианте осуществления указанный первый сконструированный анкириновый повторяющийся домен состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 12-21, более предпочтительно SEQ ID NO: 17-21, более предпочтительно SEQ ID NO: 18-20, более предпочтительно SEQ ID NO: 18. Кроме того, указанный второй сконструированный анкириновый повторяющийся домен указанного рекомбинантного связывающего белка предпочтительно содержит аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% идентичность аминокислотной последовательности с одним сконструированным анкириновым повторяющимся доменом, выбранным из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 23-37, более предпочтительно SEQ ID NO: 23-27, более предпочтительно SEQ ID NO: 25-27, более предпочтительно SEQ ID NO: 26. В одном варианте осуществления указанный второй сконструированный анкириновый повторяющийся домен содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 23-37, более предпочтительно SEQ ID NO: 23-27, более предпочтительно SEQ ID NO: 25-27, более предпочтительно SEQ ID NO: 26, и аминокислотные последовательности, в которых до 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0 аминокислот из SEQ ID NO: 23-37, более предпочтительно SEQ ID NO: 23-27, более предпочтительно SEQ ID NO: 25-27, более предпочтительно SEQ ID NO: 26 замещаются любой аминокислотой. В одном варианте осуществления указанный второй сконструированный анкириновый повторяющийся домен содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 23-27, в которой индивидуальные аминокислоты замещаются любой аминокислотой, встречающейся в той же позиции выравнивания аминокислотных последовательностей из SEQ ID NO: 23-27. В одном варианте осуществления указанный второй сконструированный анкириновый повторяющийся домен содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 23-37, более предпочтительно SEQ ID NO: 23-27, более предпочтительно SEQ ID NO: 25-27, более предпочтительно SEQ ID NO: 26. В одном варианте осуществления указанный второй сконструированный анкириновый повторяющийся домен состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 23-37, более предпочтительно SEQ ID NO: 23-27, более предпочтительно SEQ ID NO: 25-27, более предпочтительно SEQ ID NO: 26. В одном варианте осуществления указанные третий и четвертый сконструированные анкириновые повторяющиеся домены указанного рекомбинантного связывающего белка, каждый, содержат аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% идентичность аминокислотной последовательности с одним анкириновым повторяющимся доменом, выбранным из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 40-56, предпочтительно SEQ ID NO: 48-52, более предпочтительно SEQ ID NO: 48-50, более предпочтительно SEQ ID NO: 50. В одном варианте осуществления указанные третий и четвертый сконструированные анкириновые повторяющиеся домены содержат аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 40-56, предпочтительно SEQ ID NO: 48-52, более предпочтительно SEQ ID NO: 48-50, более предпочтительно SEQ ID NO: 50, и аминокислотные последовательности, в которых до 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1,0 аминокислот из SEQ ID NO: 40-56, предпочтительно SEQ ID NO: 48-52, более предпочтительно SEQ ID NO: 48-50, более предпочтительно SEQ ID NO: 50, замещаются любой другой аминокислотой. В одном варианте осуществления указанные третий и четвертый сконструированные анкириновые повторяющиеся домены, каждый, содержат аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 42-51, в которых индивидуальные аминокислоты замещаются любой аминокислотой, встречающейся в той же позиции выравнивания аминокислотных последовательностей из SEQ ID NO: 42-51. В одном варианте осуществления указанные третий и четвертый сконструированные анкириновые повторяющиеся домены содержат аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 40-56, предпочтительно SEQ ID NO: 48-52, более предпочтительно SEQ ID NO: 48-50, более предпочтительно SEQ ID NO:50. В одном варианте осуществления указанные третий и четвертый сконструированные анкириновые повторяющиеся домены, каждый, состоят из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 40-56, предпочтительно SEQ ID NO: ID NO: 48-52, более предпочтительно SEQ ID NO: 48-50, более предпочтительно SEQ ID NO: 50. В одном варианте осуществления указанные третий и четвертый сконструированные анкириновые повторяющиеся домены идентичны. Кроме того, в этом варианте осуществления указанные сконструированные анкириновые повторяющиеся домены связаны полипептидными линкерами, выбранными из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 2-9, более предпочтительно SEQ ID NO: 3-9, более предпочтительно SEQ ID NO: 4-9, более предпочтительно SEQ ID NO: 6 или 9, более предпочтительно SEQ ID NO: 9, и аминокислотные последовательности, в которых до 4, 3, 2, 1,0 аминокислот из SEQ ID NO: 2-9, более предпочтительно SEQ ID NO: 3-9, более предпочтительно SEQ ID NO: 4-9, более предпочтительно SEQ ID NO: 6 или 9, более предпочтительно SEQ ID NO: 9, замещаются любой аминокислотой. В одном варианте осуществления указанные полипептидные линкеры содержат аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 2-9, более предпочтительно SEQ ID NO: 3-9, более предпочтительно SEQ ID NO: 4-9, более предпочтительно SEQ ID NO: 6 или 9, более предпочтительно SEQ ID NO: 9. В одном варианте осуществления фланкирующий N-концевой Gly Ser из SEQ ID NO: 7-9 и/или фланкирующий С-концевой Gly Ser из SEQ ID NO: 2-9 необязательно отсутствует. В одном варианте осуществления SEQ ID NO: 7-9 дополнительно содержит Arg Ser на С-конце (как, например, присутствует в SEQ ID NO: 97 и 98). В одном варианте осуществления второй от С-конца аминокислотный глицин указанных полипептидных линкеров из SEQ ID NO: 2-6 может быть замещен аргинином (как, например, присутствует в SEQ ID NO: 99 и 100). В одном варианте осуществления полипептидные линкеры, связывающие сконструированные анкириновые повторяющиеся домены, присутствующие в рекомбинантном связывающем белке в соответствии с настоящим изобретением, состоят из аминокислотной последовательности, выбранной из любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 2-9, более предпочтительно SEQ ID NO: 3-9, более предпочтительно SEQ ID NO: 4-9, более предпочтительно SEQ ID NO: 6 или 9, более предпочтительно SEQ ID NO: 9. В одном варианте осуществления указанные полипептидные линкеры, присутствующие в рекомбинантном связывающем белке в соответствии с настоящим изобретением, идентичны. Примеры таких полипептидных линкеров, их вариации, а также применение таких полипептидных линкеров в рекомбинантных связывающих белках приведены в примерах.

В одном варианте осуществления изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему по меньшей мере первый, второй, третий и четвертый сконструированные анкириновые повторяющиеся домены, в котором указанный первый сконструированный анкириновый повторяющийся домен содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 12-21, предпочтительно SEQ ID NO: 17-21, более предпочтительно SEQ ID NO: 18-20, более предпочтительно SEQ ID NO: 18, и в котором указанный второй сконструированный анкириновый повторяющийся домен содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 23-37, более предпочтительно SEQ ID NO: 23-27, более предпочтительно SEQ ID NO: 25-27, более предпочтительно SEQ ID NO: 26, указанные третий и четвертый сконструированные анкириновые повторяющиеся домены, каждый, содержат аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 40-56, предпочтительно SEQ ID NO: 48-52, более предпочтительно SEQ ID NO: 48-50, более предпочтительно SEQ ID NO: 50, и указанные сконструированные анкириновые повторяющиеся домены связаны полипептидными линкерами, выбранными из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 2-9, более предпочтительно SEQ ID NO: 3-9, более предпочтительно SEQ ID NO: 4-9, более предпочтительно SEQ ID NO: 6 или 9, более предпочтительно SEQ ID NO: 9.

В одном варианте осуществления изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему по меньшей мере первый, второй, третий и четвертый сконструированные анкириновые повторяющиеся домены, в котором указанный первый сконструированный анкириновый повторяющийся домен имеет связывающую специфичность к VEGF-A, указанный второй сконструированный анкириновый повторяющийся домен имеет связывающую специфичность к HGF, указанные третий и четвертый сконструированные анкириновые повторяющиеся домены имеют связывающую специфичность к сывороточному альбумину, указанные сконструированные анкириновые повторяющиеся домены связаны полипептидными линкерами, и указанный рекомбинантный связывающий белок может связываться с VEGF-A и HGF, более предпочтительно с VEGF-A, HGF и сывороточным альбумином, более предпочтительно человеческим VEGF-A, человеческим HGF и человеческим сывороточным альбумином одновременно. В одном варианте осуществления указанный рекомбинантный связывающий белок может одновременно связывать две молекулы сывороточного альбумина, более предпочтительно две молекулы человеческого сывороточного альбумина.

Термины «первый», «второй», «третий» и, необязательно, «четвертый», используемый в выражениях «первый сконструированный анкириновый повторяющийся домен», «второй сконструированный анкириновый повторяющийся домен», «третий сконструированный анкириновый повторяющийся домен» и «четвертый сконструированный анкириновый повторяющийся домен», не означают или подразумевают какого-либо позиционного расположения указанных сконструированных анкириновых повторяющихся доменов в рекомбинантном связывающем белке.

В одном варианте осуществления изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему по меньшей мере первый, второй, третий и четвертый сконструированные анкириновые повторяющиеся домены, которые связаны полипептидными линкерами. В одном варианте осуществления указанный первый сконструированный анкириновый повторяющийся домен является N-концом С-концевого сконструированного анкиринового повторяющегося домена и С-концом двух других сконструированных анкириновых повторяющихся доменов. В одном варианте осуществления указанный второй сконструированный анкириновый повторяющийся домен, имеющий связывающую специфичность к HGF, является С-концом N-концевого сконструированного анкиринового повторяющегося домена и N-концом двух других сконструированных анкириновых повторяющихся доменов. В одном варианте осуществления указанные третий и четвертый сконструированные анкириновые повторяющиеся домены, каждый имеющий связывающую специфичность к сывороточному альбумину, являются один N-концом и один С-концом двух других сконструированных анкириновых повторяющихся доменов, или они являются N-концом двух других сконструированных анкириновых повторяющихся доменов, более предпочтительно указанные третий и четвертый сконструированные анкириновые повторяющиеся домены являются один N-концом и один С-концом двух других сконструированных анкириновых повторяющихся доменов. В одном варианте осуществления указанный третий сконструированный анкириновый повторяющийся домен является N-концом трех других сконструированных анкириновых повторяющихся доменов, указанный четвертый сконструированный анкириновый повторяющийся домен является С-концом указанных трех других сконструированных анкириновых повторяющихся доменов, указанный второй сконструированный анкириновый повторяющийся домен является С-концом указанного третьего сконструированного анкиринового повторяющегося домена и N-концом указанного первого сконструированного анкиринового повторяющегося домена, и указанный первый сконструированный анкириновый повторяющийся домен является С-концом указанного второго сконструированного анкиринового повторяющегося домена и N-концом указанного четвертого сконструированного анкиринового повторяющегося домена.

В одном варианте осуществления изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему по меньшей мере первый, второй, третий и четвертый сконструированные анкириновые повторяющиеся домены, в котором указанный первый сконструированный анкириновый повторяющийся домен имеет связывающую специфичность к VEGF-A, указанный второй сконструированный анкириновый повторяющийся домен имеет связывающую специфичность к HGF, указанные третий и четвертый сконструированные анкириновые повторяющиеся домены, каждый, имеют связывающую специфичность к сывороточному альбумину, и указанные сконструированные анкириновые повторяющиеся домены связаны полипептидными линкерами. В одном варианте осуществления упомянутые первый, второй, третий и четвертый сконструированные анкириновые повторяющиеся домены расположены в следующем порядке (от N-конца к С-концу) третий-второй-первый-четвертый, третий-четвертый-второй-первый, четвертый-второй-первый-третий или четвертый-третий-второй-первый, еще более предпочтительно третий-второй-первый-четвертый или четвертый-второй-первый-третий, более предпочтительно третий-второй-первый-четвертый.

В одном варианте осуществления изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему по меньшей мере первый, второй, третий и четвертый сконструированные анкириновые повторяющиеся домены, в котором указанный первый сконструированный анкириновый повторяющийся домен имеет связывающую специфичность к VEGF-A, указанный второй сконструированный анкириновый повторяющийся домен имеет связывающую специфичность к HGF, указанные третий и четвертый сконструированные анкириновые повторяющиеся домены, каждый, имеют связывающую специфичность к сывороточному альбумину, и указанный рекомбинантный связывающий белок связывается с VEGF-A, предпочтительно человеческим VEGF-A, при ЕС₅₀ менее 10^-7М, предпочтительно менее 10^--8 М, более предпочтительно менее 10^--9 М, более предпочтительно менее 10^-10М.

В одном варианте осуществления изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему по меньшей мере первый, второй, третий и четвертый сконструированные анкириновые повторяющиеся домены, в котором указанные третий и четвертый сконструированные анкириновые повторяющиеся домены, каждый, содержат аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 50. В одном варианте осуществления изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему по меньшей мере первый, второй, третий и четвертый сконструированные анкириновые повторяющиеся домены, в котором указанный первый сконструированный повторяющийся анкириновый домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, указанный второй сконструированный анкириновый повторяющийся домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, указанные третий и четвертый сконструированные анкириновые повторяющиеся домены, каждый, содержат аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 50, и указанные сконструированные анкириновые повторяющиеся домены связаны полипептидными линкерами, каждый из которых содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9.

В одном варианте осуществления изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему по меньшей мере первый, второй, третий и четвертый сконструированные анкириновые повторяющиеся домены, в котором указанный первый сконструированный анкириновый повторяющийся домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, указанный второй сконструированный анкириновый повторяющийся домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, указанные третий и четвертый сконструированные анкириновые повторяющиеся домены, каждый, содержат аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 50, и указанные сконструированные анкириновые повторяющиеся домены связаны полипептидными линкерами, каждый из которых содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, и указанные сконструированные анкириноыве повторяющиеся домены расположены следующим образом (со стороны N-конца к стороне С-конца): SEQ ID NO: 50 - SEQ ID NO: 9 - SEQ ID NO: 26 - SEQ ID NO: 9 - SEQ ID NO: 18 - SEQ ID NO: 9 - SEQ ID NO: 50.

В одном варианте осуществления изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему по меньшей мере первый, второй, третий и четвертый сконструированные анкириновые повторяющиеся домены, в котором указанный первый сконструированный анкириновый повторяющийся домен имеет связывающую специфичность к VEGF-A, указанный второй сконструированный анкириновый повторяющийся домен имеет связывающую специфичность к HGF, указанные третий и четвертый сконструированные анкириновые повторяющиеся домены, каждый, имеют связывающую специфичность к сывороточному альбумину, и указанные сконструированные анкириновые повторяющиеся домены связаны полипептидными линкерами, каждый из которых содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, и указанный рекомбинантный связывающий белок связывается с VEGF-A и/или HGF, предпочтительно с VEGF-A при более низком, т.е. лучшем показателе ЕС₅₀ по сравнению с рекомбинантным связывающим белком, и указанные сконструированные анкириновые повторяющиеся домены связаны полипептидными линкерами, каждый из которых содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6. Примеры влияния линкера на ЕС₅₀ приведены в Примере 8, а термин «более низкий ЕС₅₀» хорошо известен специалистам в данной области. Предпочтительно, термин «более низкий ЕС₅₀» означает значение ЕС₅₀, которое улучшено в 1,1 раза, более предпочтительно 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0 раза.

В одном варианте осуществления изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему по меньшей мере первый, второй, третий и четвертый сконструированные анкириновые повторяющиеся домены, в котором указанный первый сконструированный анкириновый повторяющийся домен имеет связывающую специфичность к VEGF-A, указанный второй сконструированный анкириновый повторяющийся домен имеет связывающую специфичность к HGF, указанные третий и четвертый сконструированные анкириновые повторяющиеся домены имеют связывающую специфичность к сывороточному альбумину, и указанный рекомбинантный связывающий белок связывается с VEGF-A и/или HGF, предпочтительно VEGF-A, при более низком, т.е. лучшем ЕС₅₀ по сравнению с рекомбинантным связывающим белком, содержащим только один сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину. Примеры приведены в Примере 8.

В одном варианте осуществления изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 134-179, предпочтительно SEQ ID NO: 134-158, более предпочтительно SEQ ID NO: 134-149, более предпочтительно SEQ ID NO: 134-140, более предпочтительно SEQ ID NO: 134.

В одном варианте осуществления изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 134-179, предпочтительно SEQ ID NO: 134-158, более предпочтительно SEQ ID NO: 134-149, более предпочтительно SEQ ID NO: 134-140, более предпочтительно SEQ ID NO: 134, в которых до 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 или 0 аминокислот замещаются любой аминокислотой.

В любом варианте осуществления настоящего изобретения, относящемся к сконструированному анкириновому повторяющемуся домену или рекомбинантному связывающему белку, содержащему аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%-ную идентичность к заданной аминокислотной последовательности, не идентичные аминокислоты могут быть расположены в любой позиции сконструированного анкиринового повторяющегося домена или рекомбинантного связывающего белка.

Аналогично, в любом варианте осуществления настоящего изобретения, относящемся к сконструированному анкириновому повторяющемуся домену или рекомбинантному связывающему белку, в котором до 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 или 0 аминокислот замещаются любой аминокислотой, замещенные аминокислоты могут быть расположены в любой позиции сконструированного анкиринового повторяющегося домена.

В одном варианте осуществления изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 134-179, предпочтительно SEQ ID NO: 134-158, более предпочтительно SEQ ID NO: 134-149, более предпочтительно SEQ ID NO: 134-140, более предпочтительно SEQ ID NO: 134.

Изобретение, в частности, относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%-ную идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 134.

В одном варианте осуществления изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 134, в которой до 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 или 0 аминокислот замещаются любой аминокислотой.

Кроме того, настоящее изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 134. В одном варианте осуществления изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 134.

В одном варианте осуществления изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, состоящему из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 134-179, предпочтительно SEQ ID NO: 134-158, более предпочтительно SEQ ID NO: 134-149, более предпочтительно SEQ ID NO: 134-140, более предпочтительно SEQ ID NO: 134.

Предпочтительной является SEQ ID NO: 134. Предпочтительным является рекомбинантный связывающий белок, в котором аминокислотная последовательность представляет собой SEQ ID NO: 134. Предпочтительным является белок, в котором аминокислотная последовательность представляет собой SEQ ID NO: 134. Предпочтительным является рекомбинантный связывающий белок состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 134.

Ряд признаков делают SEQ ID NO: 134 предпочтительным рекомбинантным связывающим белком в соответствии с изобретением. Он содержит два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, каждый состоит из SEQ ID NO: 50, которая демонстрирует улучшенные свойства устойчивости при хранении (см. Пример 9; Фигура 2) по сравнению с известным сконструированным анкириновым повторяющимся доменом со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину. Он содержит два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, что неожиданно дает улучшенные фармакокинетические свойства (Примеры 5 и 6, Фигуры 3 и 4). Два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину фланкируют другие сконструированные анкириновые повторяющиеся домены, что дает наилучшие наблюдаемые фармакокинетические свойства (Пример 6). Для максимизации активности соединения были выбраны сконструированные анкириновые повторяющиеся домены со связывающей специфичностью к VEGF-A и HGF, а также их структурное расположение (Пример 8). Сконструированные анкириновые повторяющиеся домены соединены с помощью богатого РТ линкера, что неожиданно приводит к улучшению активности индивидуальных сконструированных анкириновых повторяющихся доменов (Пример 8) и неожиданно улучшению фармакокинетических свойств (Пример 5).

В одном варианте осуществления изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему по меньшей мере первый, второй, третий и четвертый сконструированные анкириновые повторяющиеся домены, в котором указанный первый сконструированный анкириновый повторяющийся домен имеет связывающую специфичность к VEGF-A, указанный второй сконструированный анкириновый повторяющийся домен имеет связывающую специфичность к HGF, указанные третий и четвертый сконструированные анкириновые повторяющиеся домены имеют, каждый, связывающую специфичность к сывороточному альбумину и указанные первый, второй, третий и четвертый сконструированные анкириновые повторяющиеся домены связаны полипептидными линкерами, указанный рекомбинантный связывающий белок демонстрирует увеличение конечного периода полувыведения, предпочтительно увеличение конечного периода полувыведения по меньшей мере на 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% или 45% по сравнению с рекомбинантным связывающим белком, в котором отсутствует указанный четвертый сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину. Примеры такого увеличения конечного периода полувыведения приведены в Примерах 5 и 6, а также на Фигурах 3 и 4.

В одном варианте осуществления изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей аминокислотную последовательность сконструированного анкиринового повторяющегося домена или рекомбинантного связывающего белка по настоящему изобретению, более предпочтительно рекомбинантного связывающего белка по настоящему изобретению. В одном варианте осуществления изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей аминокислотную последовательность любого рекомбинантного связывающего белка по настоящему изобретению, содержащего по меньшей мере два, более предпочтительно содержащего два, сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину. В одном варианте осуществления изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей аминокислотную последовательность рекомбинантного связывающего белка в соответствии с настоящим изобретением. Кроме того, изобретение относится к векторам, содержащим любую нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению. Нуклеиновые кислоты хорошо известны специалистам. В примерах нуклеиновые кислоты были использованы для получения сконструированных анкириновых повторяющихся доменов или рекомбинантных связывающих белков в соответствии с изобретением в Е. coli.

В одном варианте осуществления изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей рекомбинантный связывающий белок и/или сконструированный анкириновый повторяющийся домен в соответствии с настоящим изобретением, или к нуклеиновой кислоте, кодирующей рекомбинантный связывающий белок и/или сконструированный анкириновый повторяющийся домен по настоящему изобретению, и необязательно фармацевтически приемлемый носитель и/или разбавитель.

В одном варианте осуществления изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей рекомбинантный связывающий белок или нуклеиновую кислоту, кодирующую рекомбинантный связывающий белок, и необязательно фармацевтически приемлемый носитель и/или разбавитель.

Фармацевтические приемлемые носители и/или разбавители известны специалистам в данной области и более подробно описаны ниже. Кроме того, рассматривается диагностическая композиция, содержащая один или несколько вышеупомянутых рекомбинантных связывающих белков и/или сконструированных анкириновых повторяющихся доменов и/или нуклеиновых кислот, в частности рекомбинантных связывающих белков.

Фармацевтическая композиция содержит рекомбинантный связывающий белок и/или сконструированный анкириновый повторяющийся домен и/или нуклеиновую кислоту, как описано здесь, и фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент или стабилизатор, например, как описано в 16-м издании Remington Pharmaceutical Sciences, Osol, A. Ed., 1980. Подходящими носителями, эксципиентами или стабилизаторами, известными специалистам, являются солевой раствор, раствор Рингера, раствор декстрозы, раствор Хэнкса, фиксированные масла, этилолеат, 5% декстроза в солевом растворе, вещества, которые усиливают изотоничность и химическую устойчивость, буферы и консерванты. Другие подходящие носители включают любой носитель, который сам по себе не индуцирует образование антител, вредных для индивидуума, получающего композицию, как например, белки, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты и аминокислотные сополимеры. Фармацевтическая композиция может также представлять собой комбинированный состав, содержащий дополнительный активный агент, такой как противораковый агент или антиангиогенный агент, или дополнительное биологически активное соединение.

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к применению рекомбинантного связывающего белка в соответствии с настоящим изобретением, содержащего по меньшей мере два, предпочтительно содержащего два, сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину для получения фармацевтической композиции, в котором указанный рекомбинантный связывающий белок демонстрирует увеличенный конечный период полувыведения, предпочтительно конечный период полувыведения, увеличенный по меньшей мере на 5%, предпочтительно на 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200% или 250% по сравнению с рекомбинантным связывающим белком, содержащим только один сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину.

В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит по меньшей мере один рекомбинантный связывающий белок, как описано здесь, и детергент, такой как неионный детергент, буфер, такой как фосфат, и сахар, такой как сахароза. В одном варианте осуществления такая композиция содержит рекомбинантные связывающие белки, как описано выше, и PBS.

В одном варианте осуществления изобретение относится к применению фармацевтической композиции или рекомбинантного связывающего белка в соответствии с настоящим изобретением для лечения заболевания. С этой целью фармацевтическую композицию или рекомбинантный связывающий белок в соответствии с настоящим изобретением вводят пациенту, нуждающемуся в этом, в терапевтически эффективном количестве. Введение может включать местное введение, пероральное введение и парентеральное введение. Типичным путем введения является парентеральное введение. При парентеральном введении лекарственный препарат в соответствии с настоящим изобретением составляется в виде однократной инъекционной дозы, такой как раствор, суспензия или эмульсия, в сочетании с фармацевтически приемлемыми эксципиентами, как определено выше. Дозировка и способ введения зависят от индивидуума, подлежащего лечению, и от конкретного заболевания.

Кроме того, для лечения нарушения рассматривается любой из вышеупомянутых фармацевтической композиции или рекомбинантного связывающего белка.

Фармацевтическую композицию в соответствии с настоящим изобретением можно вводить, например, парентеральным способом. При парентеральном введении лекарственный препарат по настоящему изобретению составляется в виде однократной инъекционной дозы, такой как раствор, суспензия или эмульсия, в сочетании с фармацевтически приемлемыми эксципиентами, как определено выше. Доза и способ введения зависят от индивидуума, подлежащего лечению, и от конкретного заболевания. В одном варианте осуществления указанный рекомбинантный связывающий белок или такая другая фармацевтическая композиция, описанная здесь, вводится внутривенно. Для парентерального применения рекомбинантный связывающий белок или указанную фармацевтическую композицию можно вводить в виде болюсной инъекции или путем медленной инфузии в терапевтически эффективном количестве.

В одном варианте осуществления изобретение относится к способу лечения медицинского состояния, причем способ включает этап введения пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества рекомбинантного связывающего белка по изобретению. В одном варианте осуществления изобретение относится к способу лечения медицинского состояния, который включает этап введения пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по изобретению. Пример 14 (Фигура 10) иллюстрирует эффективность применения рекомбинантного связывающего белка, состоящего из SEQ ID NO: 134, для лечения рака. В одном варианте осуществления изобретение относится к применению фармацевтической композиции по настоящему изобретению для лечения заболевания. В одном варианте осуществления изобретение относится к фармацевтической композиции для применения при лечении заболевания.

«Медицинское состояние» (или нарушение) может быть состояние, которое характеризуется неадекватным ангиогенезом. Медицинское состояние может быть гиперпролиферативным состоянием. Примеры медицинских состояний, для которых применимо лечение, включают аутоиммунные нарушения, воспалительные нарушения, ретинопатии (особенно пролиферативные ретинопатии), нейродегенеративные нарушения, инфекции и неопластические заболевания. Любой из описанных здесь рекомбинантных связывающих белков может быть использован для получения лекарственного препарата для лечения такого нарушения, в частности нарушения, выбранного из группы, состоящей из аутоиммунного нарушения, воспалительного нарушения, ретинопатии и неопластического заболевания. Изобретение, в частности, относится к способу лечения медицинского состояния, который включает этап введения пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества рекомбинантного связывающего белка или указанной фармацевтической композиции по изобретению. В некоторых вариантах осуществления указанное медицинское состояние является неопластическим заболеванием. Термин «неопластическое заболевание», как используется здесь, относится к ненормальному состоянию или состоянию клеток или ткани, характеризующемуся быстро пролиферирующим клеточным ростом или неоплазмом. В более конкретном значении термин относится к раку. В более конкретном значении этот термин может относиться к раку почек и/или раку желудка и/или к множественной миеломе. Термин «терапевтически эффективное количество» означает количество, достаточное для достижения желаемого действия на пациента.

В частности, изобретение относится к лечению медицинского состояния с использованием фармацевтической композиции по настоящему изобретению, в котором указанным медицинским состоянием является рак.

Применение рекомбинантного связывающего белка по настоящему изобретению или указанных фармацевтических композиций для лечения онкологических заболеваний также может осуществляться в сочетании с любой другой терапией, известной в данной области. Термин «применение в сочетании с», как используется здесь, относится к совместному введению, которое осуществляется в соответствии с данной схемой. Он включает в себя синхронное введение различных соединений, а также смещенное во времени введение различных соединений (например, соединение А дается один раз, а соединение В дается несколько раз после него или наоборот или оба соединения даются синхронно, и один из двух также дается на более поздних этапах).

Далее рассматривается применение рекомбинантного белка для лечения заболевания, включающего патологический ангиогенез. Термин «патологический ангиогенез» относится к образованию и росту кровеносных сосудов во время поддержания и прогрессирования нескольких болезненных состояний.

В еще одном варианте осуществления изобретение относится к применению рекомбинантного связывающего белка по изобретению для изготовления лекарственного препарата, который используется для лечения медицинского состояния, предпочтительно неопластического заболевания, более предпочтительно рака.

В одном варианте осуществления изобретение относится к применению фармацевтической композиции по изобретению для изготовления лекарственного препарата, который используется для лечения медицинского состояния, которое может быть неопластическим заболеванием, в частности раком.

Составы, применяемые для введения in vivo, должны быть асептическими или стерильными. Это легко обеспечивается фильтрацией через стерильные фильтрующие мембраны.

Термин «выбранный из группы, состоящий из» в связи с одним выбором в данном изобретении, имеет значение этого конкретного выбора. Например, в одном варианте осуществления «изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 134», которое имеет значение «изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 134».

В одном варианте осуществления изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему любой из вышеупомянутых повторяющихся доменов. В одном варианте осуществления изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему любую из вышеупомянутых SEQ ID NO: 134-179.

Изобретение не ограничивается конкретными вариантами осуществления, описанными в Примерах. Другие источники могут использоваться и обрабатываться в соответствии с приведенной ниже общей концепцией.

В данном описании делается ссылка на ряд документов. Содержание этих документов включено в настоящее описание посредством ссылки.

Данное описание относится к ряду аминокислотных последовательностей из перечня аминокислотных последовательностей в данном описании под названием «P014_Sequence_Protocol.txt», и аминокислотные последовательности протокола последовательностей включены в данное описание посредством ссылки.

ПРИМЕРЫ

Все стандартные материалы и реагенты, описанные здесь, известны специалистам в данной области и доступны коммерчески или могут быть получены с помощью хорошо известных методик.

Материалы

Химические вещества были приобретены у Sigma-Aldrich (Швейцария). Олигонуклеотиды были получены от Microsynth (Швейцария). Если не указано иное, ДНК-полимеразы, рестрикционные ферменты и буферы были получены от New England Biolabs (США) или Thermo Fisher Scientific Fermentas (Литва). Штамм для клонирования и получения белка представлял собой Е. coli XL1-blue (Stratagene, США) или BL21 (Novagen, США). Рекомбинантные VEGF-A (человеческие, мышиные, крысиные), VEGF-C, PDGF-AB и HGF (человеческие, макака-крабоеда, мышиные) были получены от R&D Systems (Biotechne, Миннеаполис, США), Peprotech (Rocky Hill, США) Sino Biological (Пекин, Китай), ReliaTech (, Германия) или продуцированы в клетках яичника китайского хомячка или в Pichia pastoris и очищены в соответствии со стандартными протоколами. Сывороточный альбумин различных видов был получен от Sigma-Aldrich, Innovative Research (Novi, США), CSL Behring (Швейцария) или был взят у животных непосредственно с помощью стандартных способов. Биотинилированный VEGF-A или HGF получали химическим образом путем присоединения биотинового фрагмента к первичным аминам белка с использованием стандартных реактивов и способов биотинилирования (Thermo Fisher Scientific Inc., США). Антитела были получены от Thermo Fisher Scientific или QIAgen (Германия) или вырабатывались с использованием стандартных процедур иммунизации и гибридомы у мышей или кроликов, эти процедуры хорошо известны специалистам в соответствующей области. Реагенты для клеточной культуры были получены от Lonza (Швейцария), Roche (Швейцария), Thermo Fisher Scientific и Promocell (Германия).

Молекулярная биология

Если не указано иное, способы выполняются в соответствии с описанными протоколами (Sambrook J., Fritsch E.F. and Maniatis Т., Molecular Cloning: The Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory 1989, New York).

Сконструированные анкириновые повторяющиеся домены, библиотеки и наборы

Описаны способы создания библиотек сконструированных анкириновых повторяющихся доменов, примеры библиотек сконструированных анкириновых повторяющихся доменов и способы отбора сконструированных анкириновых повторяющихся доменов из библиотек сконструированных анкириновых повторяющихся доменов (WO 2002/020565; WO 2010/060748; WO 2012/069654; WO 2012/069655; WO 2014/001442; Binz et al. 2004, loc. cit.).

Пример 1. Отбор, экспрессия, очистка и анализ сконструированных анкириновых повторяющихся доменов со связывающей специфичностью к VEGF-A, HGF или сывороточному альбумину

С помощью рибосомного дисплея (Binz et al., 2004, loc. cit.) из комбинаторных библиотек отобрали сконструированные анкириновые повторяющиеся домены со связывающей специфичностью к VEGF-A, HGF или сывороточному альбумину, используя способы, описанные в WO 2010/060748 для создания сконструированных анкириновых повторяющихся доменов со связывающей специфичностью к VEGF-A, и способы, описанные в WO 2014/191574 для создания сконструированных анкириновых повторяющихся доменов со связывающей специфичностью к HGF, и способы, описанные в WO 2012/069654 для создания сконструированных анкириновых повторяющихся доменов со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину. Связывание отобранных клонов со специфическими (VEGF-A, HGF или сывороточный альбумин соответственно) и неспецифическими (например, МВР, мальтоза-связывающий белок Е. Coli) мишенями оценивали с помощью ELISA на неочищенном экстракте, показавшем, что сотни сконструированных анкириновых повторяющихся доменов со связывающей специфичностью к VEGF-A, HGF или сывороточному альбумину, соответственно, были успешно отобраны в каждом наборе для соответствующей мишени. Например, сконструированные анкириновые повторяющиеся домены SEQ ID NO: 12-22 составляют аминокислотные последовательности анкириновых повторяющихся доменов со связывающей специфичностью к VEGF-A, сконструированные анкириновые повторяющиеся домены SEQ ID NO: 23-37 составляют аминокислотные последовательности сконструированных анкириновых повторяющихся доменов со связывающей специфичностью к HGF, а сконструированные анкириновые повторяющиеся домены SEQ ID NO: 40-56 составляют аминокислотные последовательности сконструированных анкириновых повторяющихся доменов со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину.

Эти сконструированные анкириновые повторяющиеся домены со связывающей специфичностью к VEGF-A, HGF или сывороточному альбумину и сконструированные анкириновые повторяющиеся домены отрицательного контроля с неизвестной связывающей специфичностью (например, Белки #10 и #11) были клонированы в экспрессионный вектор на основе pQE (QIAgen, Германия), обеспечивающий N-концевую His-метку для облегчения простой очистки белка. Белки были получены и очищены способами, известными специалистам в данной области, как например, описанные в WO 2010/060748.

Пример 2. Характеристика сконструированных анкириновых повторяющихся доменов с использованием поверхностного плазмонного резонанса

Поверхностный плазмонный резонанс (SPR) измеряли с помощью прибора ProteOn (BioRad), измерение проводили в соответствии со стандартными процедурами, известными специалистам в данной области. Значения Kd, которые были измерены для выбранных белков, приведены в Таблицах 1-3.

* Белок #12, #13 и #16 в этой таблице представляют сконструированные анкириновые повторяющиеся домены, состоящие из соответствующей аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12, 13 и 16, и дополнительно

N-концевой His-метки (SEQ ID NO: 1).

Аналогичные значения констант диссоциации VEGF-A получены для Белков #14, # 15 и #17-#22.

* Белки #23-#29 в этой таблице представляет сконструированные анкириновые повторяющиеся домены, состоящие из соответствующей аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 23-29, и дополнительно N-концевой His-метки (SEQ ID NO: 1).

Аналогичные значения констант диссоциации HGF получены для Белков #30-#37.

* Белки #44-#55 в этой таблице представляют сконструированные анкириновые повторяющиеся домены, состоящие из соответствующей аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 54 и 55, и дополнительно N-концевой His-метки (SEQ ID NO: 1).

Аналогичные константы диссоциации сывороточного альбумина человека получены для Белков #40-#43, #53, #56 и #57.

Пример 3: Конкурентные анализы связывания и анализ конкурентного связывания с рецептором

Характеристика сконструированных анкириновых повторяющихся доменов со связывающей специфичностью к VEGF-A, HGF или сывороточному альбумину, соответственно, с помощью конкурентных анализов. Такие анализы хорошо известны специалистам в данной области. В отношении сконструированных анкириновых повторяющихся доменов со связывающей специфичностью к VEGF-A применяли количественный метод сэндвич-ферментного иммуноанализа согласно рекомендациям производителя (VEGF-A Quantikine kit DVE00, R & D Systems). Моноклональные антитела, специфичные к VEGF-A, предварительно наносили на микропланшет.VEGF-A стандарты и смеси VEGF-A (20 пМ) и Белка #18, #19 или #20 в различных концентрациях наносили в лунки и любой присутствующий свободный VEGF-A (т.е. не связанный с сконструированным анкириновым повторяющимся доменом) связывается иммобилизованным антителом. После смывания всех несвязанных веществ в лунки добавляют связанные с ферментом поликлональные антитела, специфичные к VEGF-A. После промывания и удаления любого несвязанного антитело-ферментного реагента в лунки добавляют раствор субстрата и цвет развивается пропорционально количеству VEGF-A, связанного на начальном этапе. Развитие цвета останавливается и измеряется интенсивность цвета. В этом анализе тестируемые сконструированные анкириновые повторяющиеся белки показали высокую активность ингибированйя VEGF-A. Значения IC₅₀ рассчитывали на основе кривых титрования, полученных, как описано выше, с использованием программного обеспечения Graph Pad Prism и стандартных процедур, известных специалистам в данной области. В отношении сконструированных анкириновых повторяющихся доменов со связывающей специфичностью к HGF был проведен анализ конкурентного связывания с cMet-рецептором. С этой целью 5 нМ человеческого cMet-рецептора в PBS иммобилизовали на планшетах Maxisorp в течение ночи при 4°С. После промывания с помощью PBS 0,05% TWEEN 20 планшет блокировали в течение 2 часов при встряхивании со скоростью 300 об/мин с использованием PBS, содержащего 0,05% TWEEN 20 и 0,25% казеина, при комнатной температуре. Постоянную концентрацию 5 нМ человеческого HGF предварительно инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре с 1000 мМ-1 пМ Белков #23, #26, #28 и #29 (серия разведения 1:4 для каждого) на планшете для разбавления в PBS 0,05% TWEEN 20. После промывания планшета ELISA с помощью PBS 0,05% TWEEN предварительно инкубированные образцы переносили на планшет ELISA и планшет инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре при встряхивании со скоростью 300 об/мин. После промывания с помощью PBS 0,25% TWEEN 200 нг/мл антитела против человеческого HGF добавляли в течение 1 часа при комнатной температуре при встряхивании со скоростью 300 об/мин. После промывания с помощью PBS 0,05% TWEEN 100 нг/мл HRP-коньюгированного поликлонального aнти-HGF-антитела добавляли в течение 30 мин при комнатной температуре при встряхивании со скоростью 300 об/мин. Для детектирования использовали разведенный 1:3 ВМ blue POD (Roche). Через 15 минут цветную реакцию останавливали добавлением 1 М H2SO4. Считывание данных производили при А450, используя А620 в качестве эталонной длины волны.

Примеры значений IC₅₀, полученных с помощью этих анализов, приведены в Таблицах 4 и 5. Аналогичные значения IC₅₀ для V50F-A получены с Белками #12-#17, #21, а аналогичные значения IC₅₀ для HGF получены с Белками #24, #25, #27 и #30-#37.

* Белки #18-#20 в этой таблице представляют сконструированные анкириновые повторяющиеся домены, состоящие из соответствующей аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18-20 и дополнительно N-концевой His-метки (SEQ ID NO: 1).

* Белки #23, #26, #28 и #29 в этой таблице представляют сконструированные анкириновые повторяющиеся домены, состоящие из соответствующей аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 23, 26, 28 и 29 и дополнительно N-концевой His-метки (SEQ ID NO: 1).

Пример 4: Создание рекомбинантных связывающих белков, в частности рекомбинантных белков, содержащих два, три или четыре сконструированных анкириновых повторяющихся домена, и других повторяющихся белков

ДНК, кодирующая сконструированные анкириновые повторяющиеся домены или рекомбинантные связывающие белки, была получена с помощью генетических средств, хорошо известных специалистам в данной области. Рекомбинантные связывающие белки, выбранные из группы аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 58 - 133, дополнительно имеющие SEQ ID NO: 1 или аминокислоты GS на N-конце, или рекомбинантные связывающие белки, выбранные из группы аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 134-179, или сконструированные анкириновые повторяющиеся домены, выбранные из группы аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 10-57, дополнительно имеющие SEQ ID NO: 1 или аминокислоты GS на N-конце, экспрессировали в цитоплазме Escherichia coli с помощью стандартных методик, используя экспрессионную систему pQE от Qiagen (Германия). В случае, когда аминокислоты GS находятся на N-конце, остаток Met, дополнительно кодированный экспрессионным вектором, эффективно отщеплялся в цитоплазме E.coli от экспрессированного полипептида, так как за стартовым Met следовал небольшой остаток Gly (т.е. аминокислота в позиции 1 последовательности SEQ ID NO: 134-179). Клетки лизировали, используя пресс Френча, и белки очищали почти до однородности из неочищенного клеточного экстракта с использованием стандартных хроматографических методик, хорошо известных специалистам в данной области.

Пример 5. Улучшение фармакокинетических свойств с увеличением количества сконструированных анкириновых повторяющихся доменов со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, содержащихся в рекомбинантном связывающем белке - фармакокинетические исследования на мышах.

Для фармакокинетических исследований на мышах Белки #57, #62, #63, #64, #68, #73, #74, # 82, #83, #97, #109 и #110 (белки, соответствующие SEQ ID NOs: 57, 62, 63, 64, 68, 73, 74, 82, 83, 97, 109 и 110, дополнительно имеющие SEQ ID NO: 1 на N-конце), полученные как описано в Примере 4, были радиоактивно мечены, как описано (Zahnd, С, Kawe, М., Stumpp, М.Т., de Pasquale, С, Tamaskovic, R., Nagy-Davidescu, G., Dreier, В., Schibli, R., Binz, H.K., Waibel, R., , A., Cancer Res.70, 1595-1605, 2010) и введены в дозе 10 μг на 100 μг в виде однократной внутривенной болюсной инъекции в хвостовую вену самкам мышей BALB/c соответственно. Образцы сыворотки от каждой мыши собирали в различные моменты времени и накопленную радиоактивность определяли с помощью гамма-сцинтилляционного счетчика.

В этих экспериментах белки, содержащие два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, постоянно демонстрировали улучшенные фармакокинетические свойства по сравнению с сопоставимыми конструкциями, содержащими только один сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину (Фигура 3). Например, сравнение Белка #57, который содержит один сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину (SEQ ID NO: 57, содержащая SEQ ID NO: 51 плюс С-концевой полипептид), с Белками #62 и #63, которые содержат два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину (двойная SEQ ID NO: 51, связанная с помощью богатыми GS (SEQ ID NO: 63) или РТ (SEQ ID NO: 62) полипептидными линкерами), показывает, что наличие двух сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину приводит к более высокой % ID, например, через 24 ч (+57% GS, +59% РТ), 48 ч (+76% GS, +82%) РТ) или 72 ч (+79% GS, +94% РТ) после инъекции, и дает улучшенный конечный период полувыведения (+38% GS, +48% РТ) по сравнению с белком, содержащим только один сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину (Фигура 3а). В частности, использование богатого РТ линкера, в частности SEQ ID NO: 9, дает улучшенные фармакокинетические свойства (Фигура 3а). Следующие три примера показывают, что способ улучшения фармакокинетических свойств за счет использования двух (вместо одного) сконструированных анкириновых повторяющихся доменов со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, присутствующему в белке, переносится на различные белки, содержащие различные сконструированные анкириновые повторяющиеся домены. Например, сравнение фармакокинетического профиля Белка #64, содержащего SEQ ID NO: 22 (сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к другой мишени, исключая сывороточный альбумин) и 51 (сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину), с Белками #73 и #74, каждый из которых содержит SEQ ID NO: 22 и двойную 51 (Белок #73 имеет SEQ ID NO: 51, фланкирующую SEQ ID NO: 22, а Белок #74 имеет SEQ ID NO: 51 на N-конце SEQ ID NO: 22), показывает, что наличие двух сконструированных анкириновых повторяющихся доменов со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину приводит к более высокой % ID, например через 24 ч (62% N-концевая; +89% фланкирующая) или 48 ч (+136% N-концевая; +175% фланкирующая) после инъекции и дает улучшенный конечный период полувыведения (+>63% как для N-концевых, так и для фланкирующих) по сравнению с белком, содержащим только один конструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину (Фигура 3b). Аналогично, сравнение фармакокинетического профиля Белка #82, содержащего двойную SEQ ID NO: 11 (сконструированный анкириновый повторяющийся домен с неизвестной связывающей специфичностью) и одиночную SEQ ID NO: 51 (сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину), с Белком #109, содержащим двойную SEQ ID NO: 11 и двойную SEQ ID NO: 51 (N-концевая), показывает, что наличие двух сконструированных анкириновых повторяющихся доменов со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину приводит к более высокой % ID, например, через 24 ч (+12%) или 48 ч (+35%) после инъекции и дает улучшенный конечный период полувыведения (+71%) по сравнению с белком, содержащим только один сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину (Фигура 3с). Кроме того, сравнение фармакокинетического профиля Белка #83, содержащего SEQ ID NO: 38 и 39 (сконструированные анкириновые повторяющиеся домены, каждый со связывающей специфичностью к другой мишени, исключая сывороточный альбумин) и 50 (сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину) с Белками #110, каждый из которых содержит SEQ ID NO: 38 и 39 и двойную SEQ ID NO: 50 (фланкирующую SEQ ID NO: 38 и 39), показывает, что наличие двух сконструированных анкириновых повторяющихся доменов со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину приводит к более высокой % ID, например, через 24 ч (+198%), 48 ч (+198%) или 72 ч (+228%) после инъекции и дает улучшенный конечный период полувыведения (+19%) по сравнению с белком, содержащим только один сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину (Фигура 3d). Кроме того, Белок #97 продемонстрировал существенное улучшение фармакокинетических свойств по сравнению с Белком #68, т.е. конечный период полувыведения составлял 21 и 16 часов соответственно, что указывает на то, что наличие двух сконструированных анкириновых повторяющихся доменов со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину имеет преимущество по отношению к наличию только одного такого домена.

Эти результаты, как ни удивительно, показывают, что использование двух сконструированных анкириновых повторяющихся доменов со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину вместо одного в рекомбинантном связывающем белке приводит к улучшению фармакокинетических свойств, как описано далее в Примере 6.

Пример б. Улучшение фармакокинетических свойств с увеличением количества сконструированных анкириновых повторяющихся доменов со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, содержащихся в рекомбинантном связывающем белке, - фармакокинетические исследования на макаках-крабоедах.

Для фармакокинетических исследований на макаках-крабоедахБелки #57, #62 и #97 (белки, соответствующие SEQ ID NO: 57, 62 и 97, дополнительно имеющие SEQ ID NO: 1 на N-конце) и Белок #134 (белок, соответствующий SEQ ID NO: 134), полученные, как описано в Примере 4, вводили макакам-крабоедам путем внутривенной инфузии в течение 30 мин при уровне целевой дозы от 0,5 до 100 мг/кг. Образцы крови брали перед введением дозы и дальше в определенные моменты времени, например, через 5 мин, 10 мин, 0,5 ч, 1 ч, 2 ч, 4 ч, 8 ч, 12 ч, 24 ч, 48 ч, 72 ч, 96 ч, 120 ч и 168 ч после окончания инфузии (т.е. после инъекции). Образцы крови оставляли при комнатной температуре и центрифугировали для получения сыворотки с последующим хранением при -80°С до проведения анализов. Фармакокинетические параметры определяли с помощью процедур, хорошо известных специалистам в данной области. Концентрации сыворотки Белков #57, #62, #97 и #134 определяли с помощью «сэндвич»-метода ELISA с использованием кроличьего моноклонального антитела против сконструированного анкиринового повторяющегося домена в качестве реагента захвата и мышиного моноклонального антитела против сконструированного анкиринового повторяющегося домена в качестве детектирующего реагента и с использованием калибровочной кривой. Фармакокинетические параметры определяли с использованием стандартного программного обеспечения, такого как Phoenix WinNonLin (Certara, Принстон, США) или GraphPadPrism (GraphPad Software, Ла-Холья, США) и стандартных анализов, таких как некомпартментные анализы. Полученные фармакокинетические профили показаны на Фигуре 4. Белки, содержащие два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, постоянно демонстрировали улучшенные фармакокинетические свойства по сравнению с сопоставимыми конструкциями, содержащими только один сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину. Например, путем сравнения Белка #57 (0,5 мг/кг; 27,7 нмоль/кг), содержащего один сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину (SEQ ID NO: 51), с Белком #62 (1,04 мг/кг; 34,5 нмоль/кг), белком, содержащим два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину (двойная SEQ ID NO: 51, связанная РТ-богатым полипептидным линкером), результаты показывают, что наличие двух сконструированных анкириновых повторяющихся доменов со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину в белке приводит к более высокой экспозиции (2138 д*нмоль/л против 4676 д*нмоль/л, т.е. +119%, расчет выполнен до дня 7), приводит к уменьшенному клиренсу (0,0108 л/(д*кг) против 0,0031 л/(д*кг), т.е. -71%) и приводит к улучшению конечного периода полувыведения (4,57 д против 9,00 д, т.е. +97%), расчет выполнен с дня 1 по день 7) по сравнению с белком, содержащим только один сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину (Фигура 4а). Кроме того, процентная вводимая доза, нормализованная до концентрации, измеренной через 10 минут после инъекции, увеличивается при сравнении Белка #57 с Белком #62 на день 4 (23,39% против 57,72%, +148%), день 5 (19,00% против 48,41%, +155%) и день 6 (18,5% против 51,94%, +175%»). В качестве дополнительного примера на макаке-крабоеде, Белок #134 (белок, соответствующий SEQ ID NO: 134, полученный как описано в Примере 4), протестировали в разных дозах на 10 животных каждая (5 самцов, 5 самок, каждая доза) и конечный период полувыведения оценивали с использованием WinNonLin с учетом значений концентрации до дня 7. Белок #134 продемонстрировал средний конечный период полувыведения 4,0 дня (95 часов) при объеме введения 1 мг/кг (по сравнению с Белком #97, продемонстрировавшем конечный период полувыведения 2,7 дня (65 ч) при 1 мг/кг (+46%)), 5,3 дня (127 ч) при введении 10 мг/кг и 5,8 дня (139 ч) при введении 100 мг/кг макаку-крабоеду. Фармакокинетический профиль Белка #134 по сравнению с Белком #97 у макака-крабоеда показан на Фигуре 4b. Как и в Примере 5, эти результаты, как ни удивительно, показывают, что применение двух сконструированных анкириновых повторяющихся доменов со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину вместо одного в рекомбинантном связывающем белке приводит к улучшению фармакокинетических свойств. Описание этих результатов приводится далее.

При отсутствии какой-либо активности к связыванию с альбумином рекомбинантный связывающий белок имеет конечный период полувыведения в интервале, исчисляемом минутами и у мыши, и у макака-крабоеда (см. WO 2012/069654). Белки, содержащие по меньшей мере один сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, демонстрируют конечные периоды полувыведения, которые гораздо больше, чем в случае отсутствия сконструированного анкиринового повторяющегося домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину. Фармакокинетический профиль белка, содержащего один сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, показан на Фигурах 3а и 4а.

Данная область включает исследование, в котором изучалось влияние валентности другого связывающегося с альбумином домена белка - связывающегося с альбумином домена (ABD), полученного из стрептококкового белка G (Норр et al., 2010; loc. cit.). В другом исследовании используются С-концевые слитые пептиды (WO 2011/095545), которые не являются доменами белка. ABD представляет собой спиральный домен белка со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину. Важно отметить, что в Норр et al. 2010 (loc. cit.) показано, что наличие двух таких доменов ABD (один N-концевой и один С-концевой) в рекомбинантном связывающем белке не приводит к значительному улучшению конечного периода полувыведения у мыши по сравнению с рекомбинантным связывающим белком, содержащим только один ABD (С-концевой, 37,9±1,1 ч против 36,4±4,8 ч). В частности, через 24 ч и через 72 ч после инъекции рекомбинантный связывающий белок, содержащий один ABD, показал такие же процентные вводимые дозы, как и рекомбинантный связывающий белок, содержащий два ABD, что указывает на эквивалентные фармакокинетические свойства двух рекомбинантных связывающих белков. Основываясь на полученных данных в отношении ABD, специалист в данной области должен предположить, что рекомбинантный связывающий белок, содержащий два связывающихся с альбумином домена белка, такие как сконструированные анкириновые повторяющиеся домены со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, не имел бы улучшенных фармакокинетических свойств по сравнению с рекомбинантным связывающим белком, содержащим только один сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину. Как ни удивительно, но авторы обнаружили, что это не так. В отличие от Норр et al. (loc. cit.), рекомбинантные связывающие белки, содержащие два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, как ни удивительно, демонстрировали явно более длительные конечные периоды полувыведения по сравнению с рекомбинантными связывающими белками, содержащими только один сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину.

Эти примеры иллюстрируют ряд дополнительных выводов. Например, фармакокинетические свойства Белка #134 превосходят фармакокинетические свойства Белка #97, что иллюстрирует важность выбора индивидуальных сконструированных анкириновых повторяющихся доменов. SEQ ID NO: 134 была выбрана как составленная из компонентов, которые приводят к максимальной активности и оптимальным фармакокинетическим свойствам. Кроме того, расположение сконструированных анкириновых повторяющихся доменов в Белке #134 было выбрано с целью обеспечения оптимальных фармакокинетических свойств. При анализе рекомбинантных связывающих белков, содержащих четыре сконструированных анкириновых повторяющихся домена, включая два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину с учетом фармакокинетики мыши и макака-крабоеда, наиболее благоприятные фармакокинетические свойства наблюдались в отношении рекомбинантных связывающих белков, имеющих два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, фланкирующих два других сконструированных анкириновых повторяющихся домена.

В качестве примеров из этого примера представлены различные комбинации сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к другой мишени, исключая сывороточный альбумин, подход использования по меньшей мере двух сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину для улучшения фармакокинетических свойств представляется, в общем, применимым к белкам, содержащим несколько сконструированных анкириновых повторяющихся доменов.

Пример 7. Одновременное связывание двух молекул человеческого сывороточного альбумина Белком #134.

Белок #134 (рекомбинантный связывающий белок, состоящий из SEQ ID NO: 134, дополнительно имеющий GS на N-конце) получали, как описано в Примере 4. Белок #134, очищенный человеческий сывороточный альбумин (HSA), а также смесь Белок #134/HSA (стехиометрия 1:2) анализировали с помощью эксклюзионной хроматографии в сочетании с многоракурсным статическим светорассеянием (SEC-MALS). SEC-MALS проводили с использованием белков из Таблицы 6 при концентрации 30 μМ (Белок #134) или 60 μМ (HSA) на системе Agilent 1200 (Life Technologies, США), подключенной к Wyatt (США) MALS и детектору показателя преломления (расход: 0,6 мл/мин, объем инъекции: 100 μл; колонка: GE Healthcare (США) Superdex200 10/300GL). Смесь Белок #134/HSA подвергали предварительной инкубации в течение 3 часов при 20°С перед инъекцией. Хроматограммы показаны на Фигуре 5 и молекулярные массы элюатов были определены и сопоставлены с теоретическими молекулярными массами, как показано в Таблице 6. Для этого эксперимента 100 мг HSA (20% раствор CSL Behring) очищали с использованием колонки Superdex 200_26.60 на первичной системе AEKTA (GE Healthcare, 2,0 мл/мин, PBS, изократический поток, объем инъекции 10 мл 1:20 в PBS, разбавленный HSA, собрали 4 мл фракции). Для выполнения эксперимента SEC-MALS использовалась пиковая фракция основного пика.

Белок #134, 30 μМ, был монодисперсным с фракциями элюирования, содержащими белок с ожидаемой молекулярной массой (Фигура 5). Аналогично, очищенный HSA, 60 μМ, был монодисперсным с фракциями элюирования, содержащими белок с ожидаемой молекулярной массой (Таблица 6). Смесь 30 μМ Белка #134 и 60 μМ HSA дала в результате два пика в SEC. Один пик содержал белковые комплексы с молекулярной массой, соответствующей комплексу 1:2 (Белок #134/HSA), что указывает на то, что два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину работают одновременно. Кроме того, в хвосте этого пика можно было обнаружить белковые комплексы с молекулярной массой, соответствующей комплексу 1: 1 (Белок #134/HSA). Кроме того, можно было обнаружить свободный HSA. Поскольку это количество является незначительным, можно исключить, что основным пиком является комплекс 2:1 (Белок #134/HSA), который теоретически соответствовал бы наблюдаемой массе, однако ожидаемой была бы большая фракция, соответствующая 75% свободного HSA. Свободной Белок #134/HSA не обнаружен. Не обнаружены пики с молекулярной массой, соответствующей большей, чем масса комплекса 1:2 (Белок #134/HSA). Измерения SEC-MALS и вариации, наблюдаемые в измерениях SEC-MALS, хорошо известны специалистам в данной области.

Одновременное связывание двух молекул человеческого сывороточного альбумина одним рекомбинантным связывающим белком аналогично наблюдается при анализе Белка #97, а также Белка #102, Белка #109, Белка #110 при эксклюзионной хроматографии в сочетании со статическим светорассеянием.

Пример 8: Максимизация активности связывания с мишенью путем выбора состава линкера и путем выбора количества сконструированных анкириновых повторяющихся доменов со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину

Полипептидные линкеры, которые связывают домены белка, хорошо известны специалистам в данной области. Gly-Ser-богатые линкеры хорошо известны из одноцепочечных Fv фрагментов антител, где они используются для связывания двух Fv полипептидньгх цепей. Существуют различные другие полипептидные линкеры, включающие, например, шарнирные зоны антитела, или неструктурированные полипептиды, такие как последовательности, содержащие преимущественно аминокислоты Ala, Glu, Lys, Pro, Ser, Thr (WO 2007/103515) или Ala, Pro и Ser (WO 2008/155134). Кроме того, имеется описание Pro-Thr-богатых линкеров (WO 2014/191574). Влияние такого линкера на свойства доменов белка, связанных таким линкером, необходимо оценивать для каждой комбинации линкер/домен. Далее, после природы полипептидного линкера авторы, как ни удивительно, обнаружили, что количество связывающихся с сывороточным альбумином доменов может влиять на функциональность белка. Для максимизации активности связывания с мишенью рекомбинантных связывающих белков по настоящему изобретению провели сравнение рекомбинантных связывающих белков, содержащих Gly-Ser- и Pro-Thr-богатые полипептидные линкеры, а также рекомбинантных связывающих белков, содержащих один или два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину. С этой целью Белки #69, #71 и #107, каждый дополнительно имеющий SEQ ID NO: 1 на N-конце, полученные, как описано в Примере 4, были проанализированы на связывание с VEGF-A и HGF, соответственно, с помощью ELISA (способы см. в Примере 4). Результаты показаны в Таблице 7. Сравнение значений ЕС₅₀ Белка #69 с Белком #71 показывает, что рекомбинантный связывающий белок с Pro-Thr-богатыми линкерами более эффективен по отношению к связыванию с VEGF-A (фактор 2) и с HGF (фактор 1,3), соответственно, по сравнению с рекомбинантными связывающими белками с Gly-Ser-богатыми линкерами. Сравнение значений ЕС₅₀ Белка #69 с Белком #107 показывает, что рекомбинантный связывающий белок, содержащий два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, более эффективен по отношению к связыванию с VEGF-A (фактор 1.4) и с HGF (фактор 1.1), соответственно, по сравнению с рекомбинантным связывающим белком, содержащим только один сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину. Это удивительно, учитывая предыдущие результаты (Норр et al., 2010), где наличие двух связывающихся с альбумином доменов в конструкции оказывает отрицательное влияние на функциональность молекулы. Этот результат показывает, что рекомбинантные связывающие белки предпочтительно содержат Pro-Thr-богатые линкеры и два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, а не Gly-Ser-богатые линкеры и один сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину.

* Белки #69, #71 и #107 в этой таблице представляют сконструированные анкириновые повторяющиеся домены, состоящие из соответствующей аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 69, 71 и 107 и дополнительно N-концевой His-метки (SEQ ID NO: 1).

Количество сконструированных анкириновых повторяющихся доменов со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину

Пример 9. Улучшение устойчивости белка при использовании SEQ ID NO: 50.

Белки #48, #49 и #51 были дополнительно охарактеризованы по их средней точке температуры денатурации (т.е. средней точки кооперативного разворачивания при увеличении температуры) путем смешивания Белков (25 μл; 100 μМ в PBS) с флуоресцентным красителем (25 μл Sypro оранжевый (Life Technologies), разбавленный 1/2500 в PBS) и измерения кривой плавления с помощью термоциклера, содержащего ридер флюоресценции (CFX96 Real-Time PCR Detection System; Biorad; время выдержки 25 секунд каждые 0,5°С, за которым следует считывание флуоресценция), по существу, как описано в Niesen et al. 2007 (Niesen, F.H., Berglund, H., Vedadi, M., Nature Protocols 2, 2212-2221, 2007). В PBS Белок #48 показал среднюю точку денатурации 83,5°С, Белок #49 показал среднюю точку денатурации 84,5°С, тогда как Белок #51 показал среднюю точку денатурации 79,5°С.

Чтобы идентифицировать сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, обладающего лучшими свойствами устойчивости при хранении, Белки #49, #50 и #51 (представляющие собой SEQ ID NO: 49, 50 и 51 соответственно, дополнительно имеющие SEQ ID NO: 1 на N-конце) получали, как описано в Примере 4, и образцы концентрировали до 10 мг/мл в PBS. Белки #50 и #51 затем хранили в течение 1 месяца при -80°С или при 40°С в стеклянных флаконах, далее выполняли анализ на SDS 15% PAGE. В то время как Белки #50 и #51 демонстрировали эквивалентную устойчивость при хранении при -80°С, Белки #50 показали значительно уменьшенные количества продуктов деградации с уменьшением >50% по сравнению с Белком #51 на SDS 15% PAGE после 1 месяца хранения при 40°С. Аналогично, при хранении при температуре 4°С, 25°С, 40°С и 60°С в течение одной недели при 10 мг/мл в PBS, Белок #50 показал существенное снижение количества продуктов деградации по сравнению с Белком #49. В частности, Белок #50 показал >50% снижение продуктов деградации по сравнению с Белком #49 на SDS 15% PAGE как во время хранения при 40°С, так и при 60°С, соответственно (Фигура 2). Эти данные показывают, что Белок #50 обладает улучшенной устойчивостью при хранении по сравнению с Белками #49 и #51. Аналогично, при сравнении устойчивости при хранении Белков #48-#51 (соответствующих SEQ ID NO: 48-51, дополнительно имеющих SEQ ID NO: 1 на N-конце; полученные, как описано в Примере 4) путем инкубации белков при 10 мг/мл в PBS в стеклянных флаконах в течение 1 месяца при 40°С Белки #48-#50 демонстрируют >30% снижение продуктов деградации по сравнению с Белком #51.

Эти выводы подтверждаются тестированием устойчивости при хранении Белка #102 и Белка #103 (рекомбинантные связывающие белки, состоящие из аминокислотных последовательностей, соответствующих SEQ ID NO: 102 и 103, причем оба имеют SEQ ID NO: 1 на N-конце). Белок #102 и Белок #103 получали, как описано в Примере 4, образцы концентрировали до 10 мг/мл в PBS и хранили в течение 1 месяца при -80°С или при 40°С в стеклянных флаконах, далее выполняли анализ стандартной эксклюзионной хроматографии. Тогда как Белки #102 и #103 показали эквивалентные профили элюирования при хранении при -80°С, Белок #102 показал 98,72% мономерную форму вид, а Белок #103 показал 100% мономерную форму при хранении при 40°С. то указывает на то, что наличие SEQ ID NO: 50, присутствующей в рекомбинантном связывающем белке, является более благоприятным в отношении устойчивости при хранении, чем наличие SEQ ID NO: 49. Аналогично, Белок #103 демонстрирует меньшие количества продуктов деградации, чем Белок #102 при анализе с помощью SDS-PAGE через 1 месяц хранения при 40°С в стеклянных флаконах в PBS при концентрации 10 мг/мл, что подтверждает более высокую устойчивость при хранении рекомбинантного связывающего белка, содержащего SEQ ID NO: 50 по сравнению с рекомбинантным связывающим белком, содержащим SEQ ID NO: 49.

Аналогичные результаты получены при сравнении Белка #134 с Белком #143 или Белком #150 (рекомбинантные связывающие белки, состоящие из аминокислотных последовательностей, соответствующих SEQ ID NO: 134, 143 и 150, соответственно), полученных, как описано в Примере 4. При хранении при 40°С в течение одного месяца при концентрации 10 мг/мл в PBS в стеклянных флаконах Белок #134 показывает >50% снижение продуктов деградации по сравнению с Белками #143 и #150 при анализе на SDS 15% PAGE. Это указывает на то, что наличие SEQ ID NO: 50 в рекомбинантном связывающем белке является более благоприятным в отношении устойчивости при хранении, чем наличие либо SEQ ID NO: 49, либо SEQ ID NO: 51.

Пример 10: Характеристика рекомбинантных связывающих белков с использованием ELISA

Очищенный рекомбинантный связывающий белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 134, полученный, как описано в Примере 4, подвергали анализам ELISA. 100 μл или 50 μл 20-нМ мишени (VEGF-A, HGF или сывороточный альбумин) в PBS на лунку иммобилизовали на планшете Maxisorp (Nunc, Дания) в течение ночи при 4°С. После 5-кратного промывания с помощью 300 μл PBST (PBS с добавлением 0,1% Tween 20) лунки блокировали с помощью 300 μл PBST-C (PBST с добавлением 0,25% казеина) в течение 2 ч при комнатной температуре при встряхивании со скоростью 450 об/мин на шейкере Titramax 1000 (Heidolph, Германия). После 5-кратного промывания, как описано выше, наносили 100 μл/лунку или 50 μл/лунку Белка #134 (концентрации от 100 нМ до 0,01 пМ) в PBST-C и инкубировали в течение от 1 ч до 2 ч при комнатной температуре при встряхивании со скоростью 450 об/мин. После 5-кратного промывания, как описано выше, связывание Белка #134 определяли с использованием 100 μл или 50 μл/лунку кроличьего моноклонального антитела против сконструированного анкиринового повторяющегося домена в PBST-C в течение 1 ч при комнатной температуре при встряхивании со скоростью 450 об/мин. После 5-кратного промывания, как описано выше, связанное антитело против сконструированного анкиринового повторяющегося домена определяли с помощью 100 μл или 50 μл/лунку козьего антикроличьего конъюгата IgG-HRP в PBST-C в течение 1 ч при комнатной температуре при встряхивании со скоростью 450 об/мин. После 5-кратного промывания, как описано выше, затем провели ELISA с использованием 100 μл ВМ-растворимого синего POD субстрата (Roche, Швейцария), разбавленного 1:4 в воде. Реакцию останавливали через 5 мин, используя 100 μл 1 М H₂SO₄. Затем регистрировали OD (OD 450 нм - OD 620 нм).

Результаты ELISA показывают, что Белок #134 связывает человеческий, макака-крабоеда, крысиный и мышиный VEGF-A с эквивалентной эффективностью (Таблица 8 и Фигура 6а). VEGF-A макака-крабоеда идентична человеческому VEGF-A и, таким образом, отдельное тестирование не проводилось. Связывание Белка #134 с VEGF-C и PDGF-AB не было обнаружено (Таблица 9 и Фигура 6а). Человеческий, макака-крабоеда и мышиный HGF связывается Белком #134 с эквивалентной эффективностью (значения EC₅₀ в диапазоне 20-50 пМ; Таблица 8 и Фигура 6b). Кроме того, Белок #134 связывает сывороточный альбумин человека, макака-крабоеда, крысы, собаки и мыши с эквивалентной эффективностью (значения ЕС₅₀ в диапазоне 10-20 пМ; Таблица 8 и Фигура 6 с). Сравнение Белка #134 (т.е. белка, состоящего из SEQ ID NO: 134) с Белком #60 или Белком #61 (т.е. белками, состоящими из SEQ ID NO: 60 или 61, дополнительно имеющими SEQ ID NO: 1 на N-конце, полученными, как описано в Примере 4) выявило, что показатель ЕС₅₀ Белка #134, наблюдаемый в отношении связывания человеческого сывороточного альбумина, значительно лучше, чем у Белков #60 или #61 (225 пМ или 322 пМ соответственно).

Пример 11: Характеристика рекомбинантных связывающих белков с помощью конкурентных анализов

Очищенный рекомбинантный связывающий белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 134, полученный, как описано в Примере 4, подвергали конкурентным анализам ELISA и FRET. Такие конкурентные анализы FRET и ELISA хорошо известны специалистам в данной области. Белок #134 измеряли в конкурентном анализе FRET с VEGF-A/VEGFR-2. С этой целью Белок #134 и биотинилированный VEGF-A165 (Reliatech, #300-076Bi-L) получали в виде массы восьмикратной концентрации в PBS, содержащей 0,2% BSA и 0,01% Tween (PBST-BSA). Конкурентную смесь из 5 μл Белка #134 восьмикратной концентрации и 5 μл биотинилированного VEGF-А165 восьмикратной концентрации предварительно инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре (конкурентная смесь). Параллельно добавляли 5 μл стрептавидина-Tb (стрептавидин-Луми4-тербий криптат донор, Cisbio # 610SATLB) и 5 μл PAb-анти-hIgG-de (D2-конъюгированный козий анти-человеческий IgG, Cisbio # 61HFCDAA) до 500 μл PBST-BSA и инкубировали в течение 20 минут (2х реагент). Десять μл/лунку 2х реагента распределяли в 384-луночный HTRF белый планшет (Thermo Fisher Scientific Inc.) и добавляли 5 μл/лунку соединения hVEGF-R2-Fc четырехкратной концентрации (Reliatech # SFC-008). Затем в лунки добавляли пять μл предварительно инкубированной конкурентной смеси. Полную реакционную смесь инкубировали в темноте в течение 1 часа при комнатной температуре перед считыванием флуоресценции с использованием ридера флуоресценции. Конечная смесь содержала 10 нМ растворимого соединения VEGF-R2-Fc, 10 нМ биотинилированного VEGF-A и варьирующихся концентраций Белка #134. Считывание проводилось для длин волн А665 нм и А595 нм (возбуждение 340 нм). Результаты анализа показаны на Фигуре 7а. В этом анализе Белок #134 ингибирует взаимодействие VEGF-A/VEGFR-2 при значении IC₅₀ 0,6 нМ. Белок #134 дополнительно измеряли в эксперименте конкурентного анализа ELISA с HGF/cMet, как описано в Примере 3. Результаты анализа показаны на Фигуре 7b. В этом анализе Белок #134 ингибирует взаимодействие HGF/cMet при значении IC₅₀ 0,92 нМ. Белок #134 также измеряли в эксперименте конкурентного анализа ELISA с VEGF-A, как описано в Примере 3. Результаты показаны на Фигуре 7 с. В этом анализе Белок #134 ингибирует VEGF-связывание при значении IC₅₀ в одноразрядном пМ-диапазоне (IC₅₀ 4,5 пМ).

Пример 12: Характеристика одновременного связывания рекомбинантных связывающих белков с мишенью с помощью поверхностного плазменного резонанса

SPR (поверхностный плазмонный резонанс) измеряли аналогичным образом, как описано в Примере 2, со следующей уставкой. 2700 RU человеческого HGF были иммобилизованы на сенсорном чипе. Затем в течение 180 секунд вводили 100 нМ Белка #134 или PBST с последующей промывкой с помощью PBST 360 секунд. После этого в течение 180 секунд вводили 100 нМ человеческого VEGF-A или PBST (до насыщения), затем промывали с помощью PBST 360 секунд. Наконец, 100 нМ человеческого сывороточного альбумина или PBST вводили в течение 180 секунд, затем промывали с помощью PBST 600 секунд. Результирующие сигналы показаны на Фигуре 8. Результаты показывают, что Белок #134 может связывать HGF, VEGF-A и сывороточный альбумин. Кроме того, результаты показывают, что Белок #134 может связывать HGF и VEGF-A, а также HGF, VEGF-A и сывороточный альбумин одновременно.

Пример 13: Характеристика рекомбинантных связывающих белков в клеточной культуре

Очищенный рекомбинантный связывающий белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 134, полученный, как описано в Примере 4, дополнительно подвергали клеточным анализам, включая анализ пролиферации HUVEC, для оценки ингибирования VEGF-A, и анализу миграции клеток А549, а также анализу фосфорилирования cMet, оба для оценки ингибирования HGF, анализам, которые хорошо известны специалистам в данной области. Ингибирование пролиферации VEGF-A-индуцированных HUVEC определяли путем титрования увеличения концентраций Белка #134 в анализе пролиферации HUVEC. Человеческий VEGF-A использовали в концентрации 8 нг/мл (соответствует ЕС80, как определено в анализе пролиферации). Белок #134 титровали от 200 нг/мл до 0,195 нг/мл. Клетки высевали в 50 μл среды для количественного определения. Разведения белка (в среде для количественного определения) делали путем 1:2-кратного серийного разведения в планшете для разведения; концентрация была в четыре раза выше конечной концентрации. Разведения Белка #134 смешивали с четырехкратными концентрациями VEGF-A (32 нг/мл; конечная 8 нг/мл) в соотношении 1:1. 50 μл смесей добавляли к клеткам в течение 72 часов.

Пролиферацию клеток определяли либо путем инкорпорации BrdU в реплицируемую ДНК, либо путем мониторинга метаболической активности с использованием WST-1. Результаты показаны на Фигуре 9а, что указывает на то, что Белок #134 демонстрирует значение IC₅₀ 5,7 нг/мл (91,35 пМ).

Ингибирование взаимодействия HGF/cMet определяли с использованием Белка #134 в анализе миграции клеток Oris (Platypus Technologies, США). Анализ проводили в соответствии с протоколом производителей. Вкратце, клетки высеявали в объеме 100000 клеток А549 в бессывороточный DMEM. Клетки прикрепились через 24 часа и среду заменили на среду для количественного определения; DMEM, содержащая и не содержащая 0,5 нМ HGF с и без 5 μМ белка. HGF и нейтрализующий Белок предварительно инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре перед добавлением в клетки. Пробки Oris™ были удалены. Затем пробу инкубировали в течение 48 ч, чтобы обеспечить миграцию клеток. Клетки окрашивали кальцеином (2,5 нг/мл) в течение 40 минут и сделали снимки. Зону миграции измеряли с помощью инверсного микроскопа Olympus и его программного обеспечения CellSens Dimension. Область миграции была рассчитана как покрытая область путем вычитания непокрытой области лунки перед миграцией с непокрытой областью соответствующих лунок с образцами. Непокрытая область представляла собой область без клеток и ее измеряли, используя функцию диаметра в папке обработки программного обеспечения. Результаты представлены на Фигуре 9b и показывают, что Белок #134 может подавлять HGF-индуцированную клеточную миграцию клеток А549.

Ингибирование фосфорилирования cMet Белком #134 измеряли с использованием клеток А549 и DuoSet P-cMet-ELISA (RnD Systems). Клетки высевали в полную среду на 96-луночные планшеты в объеме 200000 клеток на лунку в полной среде. Через 24 ч среду заменяли средой без сыворотки. Клетки инкубировали в течение еще 24 ч и стимулировали с помощью 1 нМ человеческого HGF (или PBS для отрицательного контроля) в присутствии и в отсутствие Белка #134. HGF и Белок #134 предварительно инкубировали в течение по меньшей мере 30 мин при комнатной температуре перед добавлением в клетки. Клетки стимулировали в течение 10 минут при комнатной температуре. Стимуляцию прекращали удалением супернатанта клеток (путем стряхивания) и добавлением буфера для лизиса клеток в соответствии с протоколом. Лизаты клеток выдерживали при -20°С до выполнения эксперимента с помощью ELISA.

Результаты приведены на Фигуре 9 с и показывают, что Белок #134 может подавлять HGF-опосредованное фосфорилирование cMet при IC₅₀ 184 пМ.

Пример 14: Влияние рекомбинантных связывающих белков нарост опухоли in vivo

Мышиную модель ксенотрансплантата U87MG использовали для оценки преимущества наличия сконструированного анкиринового повторяющегося домена со связывающей специфичностью к VEGF-A в сочетании с сконструированным анкириновым повторяющимся доменом со связывающей специфичностью к HGF в сравнении с их использованием раздельно. Белок #134, состоящий из SEQ ID NO: 134 (содержащей два сконструированных анкириновых повторяющихся домена со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, каждый из которых состоит из аминокислот SEQ ID NO: 50, содержащей один сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к VEGF-A, состоящий из SEQ ID NO: 18, и содержащей один сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к HGF, состоящий из аминокислот SEQ ID NO: 26), Белок #61, состоящий из SEQ ID NO:61 (содержащей сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, состоящий из аминокислот SEQ ID NO: 50, и содержащей сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к VEGF-A, состоящий из аминокислот SEQ ID NO: 18) и дополнительно имеющий SEQ ID NO: 1 на N-конце, или Белок #60, состоящий из SEQ ID NO: 60 (содержащей сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к сывороточному альбумину, состоящий из аминокислот SEQ ID NO: 50, и содержащей сконструированный анкириновый повторяющийся домен со связывающей специфичностью к HGF, состоящий из аминокислот SEQ ID NO: 26) и дополнительно имеющий SEQ ID NO: 1 на N-конце, получали, как описано в Примере 4. Для анализа in vivo 2*106 U87MG клеток на каждую мышь имплантировали подкожно в правый бок самок мыши NMRI nu/nu (Harlan), мышей объединили в группы с эквивалентными объемами опухолей в каждой. На день 29 и день 32 мышам вводили PBS или 4 мг/кг белка внутривенно. На день 35 опухоли собирали и подвергали криозамораживанию. Ежедневно во время испытания объем каждой опухоли измеряли по формуле: объем = (ширина)² х длина/2. Измерения массы тела не показали существенной разницы между четырьмя группами. Затем поперечные разрезы опухоли окрашивали с использованием антител к Ki67 (ab66155; Abсam, Великобритания) для количественной оценки пролиферации или с использованием антител к CD-31 (BD550274, BD Biosciences, США) для количественной оценки ангиогенеза с применением стандартных IHC-способов. Процент пролиферирующих клеток и процент средних сосудистых областей измеряли с использованием программного обеспечения Image J. Результаты показаны на Фигуре 10а. По сравнению с PBS Белок #60, а также Белок #61 ингибируют пролиферацию, а Белок #60 (незначительно), а также Белок #61 ингибируют ангиогенез, как и ожидалось. Однако комбинация этих двух, дающая в результате Белок #134, приводит к улучшению ингибирования как пролиферации, так и ангиогенеза. Это указывает на то, что комбинация активности анти-VEGF-A- и анти-HGF является ключом к хорошей эффективности.

Белок #134 дополнительно охарактеризовали на двух мышиных моделях ксенотрансплантата, полученного от пациента, на модели рака желудка и модели рака почки. Мышиные модели ксенотрансплантата, полученного от пациента, хорошо известны специалистам в данной области. Белок #134 получали, как описано в Примере 4.

Для мышиной модели полученного от пациента ксенотрансплантата рака почки образцы рака почки из хирургических образцов имплантировали подкожно мышам NMRI nu/nu и пассировали три-пять раз до установления стабильных шаблонов роста. После удаления из донорных мышей опухоли разрезали на фрагменты диаметром 4-5 мм, которые имплантировали подкожно мышам NMRI nu/nu. После явного начала роста солидной опухоли мышей рандомизировали в группы по три животных в каждой и испытательные образцы вводили следующим образом в каждой одной группе животных: PBS давали внутривенно по 10 мл/кг три раза в неделю трижды; Белок #134 давали внутривенно по 4 мг/кг три раза в неделю трижды; сорафениб давали перорально по 200 мг/кг ежедневно в течение 21 дня. Объемы опухолей оценивали, как описано выше, в день начала обработки, а также в дни 3, 7, 10, 14, 18 и 21. Результаты показаны на Фигуре 10b. В этой модели Белок #134 более эффективен, чем сорафениб, согласно существующему стандарту клинической практики при лечении рака почек.

Для мышиной модели полученного от пациента ксенотрансплантата рака желудка образцы рака желудка из хирургических образцов имплантировали мышам NMRI nu/nu и пассировали три-пять раз до установления стабильных шаблонов роста. После удаления из донорных мышей опухоли разрезали на фрагменты диаметром 4-5 мм, которые имплантировали подкожно мышам NMRI nu/nu. После явного начала роста солидной опухоли мышей рандомизировали в группы по восемь животных в каждой и испытуемые образцы вводили следующим образом в одной группе животных каждому: PBS давали внутривенно по 10 мл/кг в дни 0, 3, 6, 9, 12, 15 и 18; Белок #134 давали внутривенно по 4 мл/кг в дни 0, 3, 6, 9, 12, 15 и 18; паклитаксел давали внутривенно по 15 мг/кг в дни 0, 7 и 14; Белок #134 плюс паклитаксел давали внутривенно по 4 мг/кг в дни 0, 3, 6, 9, 12, 15 и 18 и внутривенно по 15 мг/кг в дни 0, 7 и 14. Объемы опухолей оценивали, как описано выше, в день начала обработки, а также в дни 2, 6, 13, 16 и 20. Результаты показаны на Фигуре 10с. В этой модели Белок #134 имел по меньшей мере такую же эффективность, как и паклитаксел, и комбинация этих двух компонентов была гораздо более эффективной, чем отдельные компоненты.

--->

SEQUENCE LISTING

<110> Molecular Partners AG

<120> RECOMBINANT BINDING PROTEINS AND THEIR USE

<130> MD41211

<150> EP 15 162 502

<151> 2015-04-02

<150> EP 15 162 511

<151> 2015-04-02

<160> 181

<170> BiSSAP 1.3

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> His-tag

<400> 1

Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser

1 5 10

<210> 2

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GS-linker

<400> 2

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GS-linker

<400> 3

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser

1 5

<210> 4

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Polypeptide linker

<400> 4

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser

1 5 10

<210> 5

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GS-linker

<400> 5

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Ser

<210> 6

<211> 22

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GS-linker

<400> 6

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Ser

20

<210> 7

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PT-linker

<400> 7

Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser

1 5 10

<210> 8

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PT-linker

<400> 8

Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly

1 5 10 15

Ser

<210> 9

<211> 24

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PT-linker

<400> 9

Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr

1 5 10 15

Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser

20

<210> 10

<211> 157

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Designed ankyrin repeat domain

<400> 10

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Thr Asp

20 25 30

Asn Asp Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser Asn Gly His Leu

35 40 45

Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Ser

50 55 60

Asp Leu Thr Gly Ile Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Thr Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Tyr Asp Asn Asp Gly His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Lys Tyr Gly

100 105 110

His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn

115 120 125

Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn

130 135 140

Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala

145 150 155

<210> 11

<211> 124

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Designed ankyrin repeat domain

<400> 11

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Lys Asp Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Glu Gly His Leu

35 40 45

Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Lys Asp Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Glu Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn Gly

100 105 110

Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala

115 120

<210> 12

<211> 157

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Designed ankyrin repeat domain

<400> 12

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Phe Asp

20 25 30

Trp Met Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala His Glu Gly His Leu

35 40 45

Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Thr

50 55 60

Asp Val Ser Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Asp Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Thr

85 90 95

Lys Asp Asn Thr Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ser Ala Asp Leu Gly

100 105 110

His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn

115 120 125

Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn

130 135 140

Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala

145 150 155

<210> 13

<211> 157

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Designed ankyrin repeat domain

<400> 13

Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Tyr Leu Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala His Glu Gly His Leu

35 40 45

Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Val Ser Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Asp Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Lys Asp Asn Thr Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ser Ala Asp Leu Gly

100 105 110

His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn

115 120 125

Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn

130 135 140

Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala

145 150 155

<210> 14

<211> 124

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Designed ankyrin repeat domain

<400> 14

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Thr Ala Asp

20 25 30

Ser Thr Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Pro Trp Gly His Pro

35 40 45

Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala His

50 55 60

Asp Tyr Gln Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Thr Leu Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn Gly

100 105 110

Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala

115 120

<210> 15

<211> 124

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Designed ankyrin repeat domain

<400> 15

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Thr Ala Asp

20 25 30

Ser Thr Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Val Pro Trp Gly His Leu

35 40 45

Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Gln Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Ile Gly His

65 70 75 80

Gln Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn Gly

100 105 110

Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala

115 120

<210> 16

<211> 124

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Designed ankyrin repeat domain

<400> 16

Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Ser Thr Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Pro Trp Gly His Leu

35 40 45

Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Tyr Gln Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Val Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

115 120

<210> 17

<211> 124

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Designed ankyrin repeat domain

<400> 17

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Arg Asp

20 25 30

Ser Thr Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Pro Trp Gly His Pro

35 40 45

Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Ala

50 55 60

Asp Phe Gln Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Val Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn Gly

100 105 110

Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala

115 120

<210> 18

<211> 124

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Designed ankyrin repeat domain

<400> 18

Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Ser Thr Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Pro Trp Gly His Pro

35 40 45

Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Gln Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Ala Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

115 120

<210> 19

<211> 124

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Designed ankyrin repeat domain

<400> 19

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Ser Thr Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Pro Trp Gly His Pro

35 40 45

Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Gln Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Ala Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

115 120

<210> 20

<211> 124

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Designed ankyrin repeat domain

<400> 20

Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Ser Thr Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Pro Trp Gly His Pro

35 40 45

Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Gln Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Val Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

115 120

<210> 21

<211> 124

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Designed ankyrin repeat domain

<400> 21

Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Ser Thr Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Pro Trp Gly His Pro

35 40 45

Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Tyr Gln Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Val Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

115 120

<210> 22

<211> 124

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Designed ankyrin repeat domain

<400> 22

Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Ser Thr Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Pro Trp Gly His Leu

35 40 45

Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Gln Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Val Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn Gly

100 105 110

Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala

115 120

<210> 23

<211> 157

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Designed ankyrin repeat domain

<400> 23

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Arg Phe Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Ile Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala Glu

50 55 60

Asp Trp Phe Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser Met Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Met Asp Asp Tyr Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Thr Gly

100 105 110

His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn

115 120 125

Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn

130 135 140

Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala

145 150 155

<210> 24

<211> 157

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Designed ankyrin repeat domain

<400> 24

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Arg Phe Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Ile Gly His Leu

35 40 45

Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Trp Phe Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser Phe Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Lys Asp Asp Tyr Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Thr Gly

100 105 110

His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn

115 120 125

Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn

130 135 140

Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala

145 150 155

<210> 25

<211> 157

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Designed ankyrin repeat domain

<400> 25

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Arg Tyr Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Ile Gly His Leu

35 40 45

Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Glu

50 55 60

Asp Tyr Phe Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser Tyr Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Lys Asp Asp Tyr Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Thr Gly

100 105 110

His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn

115 120 125

Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala

130 135 140

Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

145 150 155

<210> 26

<211> 157

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Designed ankyrin repeat domain

<400> 26

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Arg Tyr Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Ile Gly His Leu

35 40 45

Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Glu

50 55 60

Asp Tyr Phe Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser Tyr Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Lys Asp Asp Tyr Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Thr Gly

100 105 110

His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn

115 120 125

Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala

130 135 140

Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

145 150 155

<210> 27

<211> 157

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Designed ankyrin repeat domain

<400> 27

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Arg Tyr Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Glu

50 55 60

Asp Tyr Phe Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser Ala Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Lys Asp Asp Ala Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Thr Gly

100 105 110

His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn

115 120 125

Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala

130 135 140

Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

145 150 155

<210> 28

<211> 124

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Designed ankyrin repeat domain

<400> 28

Asp Leu Gly Met Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala His Asp

20 25 30

Thr Trp Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Phe His Gly His Gln

35 40 45

Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln

50 55 60

Asp Phe Tyr Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Leu Arg Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Gln Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn Gly

100 105 110

Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala

115 120

<210> 29

<211> 157

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Designed ankyrin repeat domain

<400> 29

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Tyr

20 25 30

Glu Asp Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Phe Tyr Gly His Leu

35 40 45

Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala Thr

50 55 60

Asp Ala Trp Gly His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr Tyr Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asn Thr

85 90 95

His Asp Lys Glu Gly Met Thr Ala Leu His Leu Ala Ala Leu Thr Gly

100 105 110

His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn

115 120 125

Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn

130 135 140

Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala

145 150 155

<210> 30

<211> 157

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Designed ankyrin repeat domain

<400> 30

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Thr His Asp

20 25 30

Asn Phe Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser Ile Gly His Leu

35 40 45

Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala Phe

50 55 60

Asp Ser Tyr Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser Ser Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Leu Asp Tyr Asn Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Ser Gly

100 105 110

Arg Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn

115 120 125

Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn

130 135 140

Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala

145 150 155

<210> 31

<211> 157

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Designed ankyrin repeat domain

<400> 31

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Val Asp

20 25 30

Ala Trp Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser Ile Gly His Leu

35 40 45

Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Ala

50 55 60

Asp Tyr Tyr Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser Ala Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Asp Asn Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Thr Gly

100 105 110

Arg Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn

115 120 125

Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn

130 135 140

Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala

145 150 155

<210> 32

<211> 157

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Designed ankyrin repeat domain

<400> 32

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Ile Asp

20 25 30

Thr Trp Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Tyr Gly His Leu

35 40 45

Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Leu

50 55 60

Asp Trp Phe Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser Leu Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Val Asp Thr Tyr Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Thr Gly

100 105 110

Arg Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asn

115 120 125

Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn

130 135 140

Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala

145 150 155

<210> 33

<211> 157

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Designed ankyrin repeat domain

<400> 33

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp

20 25 30

Arg Trp Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser Ala Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asn Ala Asp

50 55 60

Asp Val Phe Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser Leu Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Asp Asp Tyr Ala Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Thr Gly

100 105 110

His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn

115 120 125

Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn

130 135 140

Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala

145 150 155

<210> 34

<211> 157

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Designed ankyrin repeat domain

<400> 34

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp

20 25 30

Arg Trp Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser Ala Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asn Ala Asp

50 55 60

Asp Val Phe Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser Leu Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Asp Asp Tyr Ala Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Thr Gly

100 105 110

His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asn

115 120 125

Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn

130 135 140

Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala

145 150 155

<210> 35

<211> 157

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Designed ankyrin repeat domain

<400> 35

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Asn Asp

20 25 30

Phe Leu Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser Thr Gly His Leu

35 40 45

Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asn Ala Ile

50 55 60

Asp Ala Tyr Gly His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asn Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Ile Asp His Phe Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Met Phe Gly

100 105 110

His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn

115 120 125

Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn

130 135 140

Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala

145 150 155

<210> 36

<211> 157

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Designed ankyrin repeat domain

<400> 36

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Asn Asp

20 25 30

Ser Ser Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Phe Tyr Gly His Leu

35 40 45

Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asn Ala Asp

50 55 60

Asp Asp Trp Gly His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala His Tyr Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Ile Asp Thr Arg Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ile Ala Gly

100 105 110

His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asn

115 120 125

Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn

130 135 140

Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala

145 150 155

<210> 37

<211> 157

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Designed ankyrin repeat domain

<400> 37

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Ser Asp

20 25 30

Asp Thr Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Arg Gly His Leu

35 40 45

Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala Asn

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Met Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Val Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

His Asp Asp Tyr Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Trp Arg

100 105 110

His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn

115 120 125

Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn

130 135 140

Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala

145 150 155

<210> 38

<211> 157

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Designed ankyrin repeat domain

<400> 38

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Lys Ser Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Phe Gly His Leu

35 40 45

Glu Ile Val Glu Phe Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Glu Thr Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ile Trp Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Lys Asp Leu Tyr Gly Arg Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Lys Leu Arg

100 105 110

His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn

115 120 125

Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn

130 135 140

Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala

145 150 155

<210> 39

<211> 157

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Designed ankyrin repeat domain

<400> 39

Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Leu Asp

20 25 30

Gln Ile Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Tyr Gly His Leu

35 40 45

Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Leu Trp Gly Gln Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Trp Lys Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Lys Asp Thr Asp Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ile Arg Gly

100 105 110

His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn

115 120 125

Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala

130 135 140

Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

145 150 155

<210> 40

<211> 124

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Designed ankyrin repeat domain

<400> 40

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Ser Gly Ala Asp Val Asn Ala Ala Asp

20 25 30

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asp Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asp Ala Ser

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Asp Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn Gly

100 105 110

Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala

115 120

<210> 41

<211> 124

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Designed ankyrin repeat domain

<400> 41

Asp Leu Gly Lys Glu Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Ala Asp

20 25 30

Tyr Phe Gly His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asn Ala Ser

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Ala Phe Glu Ile Ser Ile Asp Asn Gly

100 105 110

Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala

115 120

<210> 42

<211> 124

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Designed ankyrin repeat domain

<400> 42

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Ala Asp

20 25 30

Tyr Phe Gly His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asp Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asn Ala Ser

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn Gly

100 105 110

Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala

115 120

<210> 43

<211> 124

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Designed ankyrin repeat domain

<400> 43

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Ala Asp

20 25 30

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asp Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asn Ala Ser

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn Gly

100 105 110

Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala

115 120

<210> 44

<211> 124

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Designed ankyrin repeat domain

<400> 44

Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu

35 40 45

Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

115 120

<210> 45

<211> 124

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Designed ankyrin repeat domain

<400> 45

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu

35 40 45

Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

115 120

<210> 46

<211> 124

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Designed ankyrin repeat domain

<400> 46

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

115 120

<210> 47

<211> 124

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Designed ankyrin repeat domain

<400> 47

Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

115 120

<210> 48

<211> 124

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Designed ankyrin repeat domain

<400> 48

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

115 120

<210> 49

<211> 124

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Designed ankyrin repeat domain

<400> 49

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

115 120

<210> 50

<211> 124

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Designed ankyrin repeat domain

<400> 50

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

115 120

<210> 51

<211> 124

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Designed ankyrin repeat domain

<400> 51

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

115 120

<210> 52

<211> 124

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Designed ankyrin repeat domain

<400> 52

Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Glu Arg Gly Thr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Val Tyr Gly His Leu

35 40 45

Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asn Glu Thr Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Asp Ser Ser Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Ser Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

115 120

<210> 53

<211> 124

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Designed ankyrin repeat domain

<400> 53

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Phe Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Ala Asp

20 25 30

Glu Arg Gly Thr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Val Tyr Gly His Leu

35 40 45

Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln

50 55 60

Asn Glu Thr Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Asp Ser Ser Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Ser Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn Gly

100 105 110

Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala

115 120

<210> 54

<211> 124

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Designed ankyrin repeat domain

<400> 54

Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Glu Arg Gly Thr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Val Tyr Gly His Leu

35 40 45

Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asn Glu Thr Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Asp Ser Ser Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

115 120

<210> 55

<211> 124

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Designed ankyrin repeat domain

<400> 55

Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Glu Arg Gly Thr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Val Tyr Gly His Leu

35 40 45

Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asn Glu Thr Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Asp Ser Ser Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

115 120

<210> 56

<211> 124

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Designed ankyrin repeat domain

<400> 56

Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Glu Arg Gly Thr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Val Tyr Gly His Leu

35 40 45

Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asn Glu Thr Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Asp Ser Ser Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Ser Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

115 120

<210> 57

<211> 159

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Designed ankyrin repeat domain with a C-terminal polypeptide

linker

<400> 57

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Gly Ser Pro Thr Pro

115 120 125

Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro

130 135 140

Thr Gly Ser Arg Ser Asp Leu Asp Ile Thr Gly Leu Lys Leu Asn

145 150 155

<210> 58

<211> 302

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising two designed ankyrin repeat domains

<400> 58

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg

130 135 140

Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp

145 150 155 160

Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

165 170 175

Asp Arg Tyr Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Ile Gly His

180 185 190

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

195 200 205

Glu Asp Tyr Phe Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser Tyr Gly

210 215 220

His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn

225 230 235 240

Ala Lys Asp Asp Tyr Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Thr

245 250 255

Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

260 265 270

Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp

275 280 285

Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Asn

290 295 300

<210> 59

<211> 269

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising two designed ankyrin repeat domains

<400> 59

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg

130 135 140

Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp

145 150 155 160

Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

165 170 175

Asp Ser Thr Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Pro Trp Gly His

180 185 190

Pro Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

195 200 205

Lys Asp Phe Gln Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Val Gly

210 215 220

His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn

225 230 235 240

Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala

245 250 255

Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Asn

260 265

<210> 60

<211> 305

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising two designed ankyrin repeat domains

<400> 60

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr

115 120 125

Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr

130 135 140

Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala

145 150 155 160

Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

165 170 175

Asn Ala Lys Asp Arg Tyr Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp

180 185 190

Ile Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

195 200 205

Val Asn Ala Glu Asp Tyr Phe Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

210 215 220

Ser Tyr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

225 230 235 240

Asp Val Asn Ala Lys Asp Asp Tyr Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala

245 250 255

Ala Asn Thr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly

260 265 270

Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu

275 280 285

Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala

290 295 300

Ala

305

<210> 61

<211> 272

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising two designed ankyrin repeat domains

<400> 61

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr

115 120 125

Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr

130 135 140

Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala

145 150 155 160

Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

165 170 175

Asn Ala Lys Asp Ser Thr Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Pro

180 185 190

Trp Gly His Pro Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

195 200 205

Val Asn Ala Lys Asp Phe Gln Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

210 215 220

Ala Ala Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

225 230 235 240

Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala

245 250 255

Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

260 265 270

<210> 62

<211> 273

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising two designed ankyrin repeat domains

<400> 62

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Gly Ser Pro Thr Pro

115 120 125

Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro

130 135 140

Thr Gly Ser Arg Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg

145 150 155 160

Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp

165 170 175

Val Asn Ala Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

180 185 190

Arg Asn Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

195 200 205

Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala

210 215 220

Ala Asn Asp Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly

225 230 235 240

Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile

245 250 255

Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu

260 265 270

Asn

<210> 63

<211> 269

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising two designed ankyrin repeat domains

<400> 63

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg

130 135 140

Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp

145 150 155 160

Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

165 170 175

Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His

180 185 190

Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

195 200 205

Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp Gly

210 215 220

His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn

225 230 235 240

Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala

245 250 255

Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Asn

260 265

<210> 64

<211> 273

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising two designed ankyrin repeat domains

<400> 64

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Gly Ser Pro Thr Pro

115 120 125

Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro

130 135 140

Thr Gly Ser Arg Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg

145 150 155 160

Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp

165 170 175

Val Asn Ala Lys Asp Ser Thr Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

180 185 190

Pro Trp Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

195 200 205

Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Gln Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala

210 215 220

Ala Ala Val Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly

225 230 235 240

Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile

245 250 255

Ser Ile Asp Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Leu

260 265 270

Asn

<210> 65

<211> 273

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising two designed ankyrin repeat domains

<400> 65

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Gly Ser Pro Thr Pro

115 120 125

Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro

130 135 140

Thr Gly Ser Arg Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg

145 150 155 160

Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp

165 170 175

Val Asn Ala Lys Asp Lys Asp Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

180 185 190

Arg Glu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

195 200 205

Asp Val Asn Ala Lys Asp Lys Asp Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala

210 215 220

Ala Arg Glu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly

225 230 235 240

Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile

245 250 255

Ser Ile Asp Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Leu

260 265 270

Asn

<210> 66

<211> 272

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising two designed ankyrin repeat domains

<400> 66

Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Glu Arg Gly Thr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Val Tyr Gly His Leu

35 40 45

Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asn Glu Thr Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Asp Ser Ser Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Ser Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr

115 120 125

Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr

130 135 140

Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala

145 150 155 160

Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val

165 170 175

Asn Ala Lys Asp Ser Thr Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Pro

180 185 190

Trp Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

195 200 205

Val Asn Ala Lys Asp Phe Gln Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

210 215 220

Ala Val Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

225 230 235 240

Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser

245 250 255

Ile Asp Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala

260 265 270

<210> 67

<211> 272

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising two designed ankyrin repeat domains

<400> 67

Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Ser Thr Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Pro Trp Gly His Leu

35 40 45

Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Gln Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Val Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn Gly

100 105 110

Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr

115 120 125

Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr

130 135 140

Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala

145 150 155 160

Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

165 170 175

Asn Ala Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg

180 185 190

Asn Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

195 200 205

Val Asn Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

210 215 220

Asn Glu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

225 230 235 240

Asp Val Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala

245 250 255

Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

260 265 270

<210> 68

<211> 488

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising three designed ankyrin repeat domains

<400> 68

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Gly Ser Pro Thr Pro

115 120 125

Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro

130 135 140

Thr Gly Ser Arg Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg

145 150 155 160

Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

165 170 175

Val Asn Ala Lys Asp Arg Tyr Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

180 185 190

Asp Ala Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

195 200 205

Asp Val Asn Ala Glu Asp Tyr Phe Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala

210 215 220

Ala Ser Ala Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly

225 230 235 240

Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Asp Ala Gly Asn Thr Pro Leu His Leu

245 250 255

Ala Ala Asn Thr Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala

260 265 270

Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp

275 280 285

Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys

290 295 300

Leu Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr

305 310 315 320

Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Arg Ser Asp Leu Asp Lys Lys

325 330 335

Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu

340 345 350

Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr Leu Gly Trp Thr

355 360 365

Pro Leu His Leu Ala Ala His Glu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val

370 375 380

Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Val Ser Gly Tyr

385 390 395 400

Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Asp Gly His Leu Glu Ile Val Glu

405 410 415

Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Asn Thr Gly

420 425 430

Trp Thr Pro Leu His Leu Ser Ala Asp Leu Gly His Leu Glu Ile Val

435 440 445

Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe

450 455 460

Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn Gly Asn Glu Asp Leu

465 470 475 480

Ala Glu Ile Leu Gln Lys Leu Asn

485

<210> 69

<211> 488

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising three designed ankyrin repeat domains

<400> 69

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Gly Ser Pro Thr Pro

115 120 125

Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro

130 135 140

Thr Gly Ser Arg Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg

145 150 155 160

Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

165 170 175

Val Asn Ala Lys Asp Tyr Leu Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

180 185 190

His Glu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

195 200 205

Asp Val Asn Ala Lys Asp Val Ser Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala

210 215 220

Ala Ala Asp Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly

225 230 235 240

Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Asn Thr Gly Trp Thr Pro Leu His Leu

245 250 255

Ser Ala Asp Leu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala

260 265 270

Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp

275 280 285

Ile Ser Ile Asp Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys

290 295 300

Leu Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr

305 310 315 320

Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Arg Ser Asp Leu Gly Lys Lys

325 330 335

Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu

340 345 350

Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Arg Tyr Gly Asp Thr

355 360 365

Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val

370 375 380

Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Glu Asp Tyr Phe Gly Asn

385 390 395 400

Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser Ala Gly His Leu Glu Ile Val Glu

405 410 415

Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Asp Ala Gly

420 425 430

Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Thr Gly His Leu Lys Ile Val

435 440 445

Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser

450 455 460

Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile

465 470 475 480

Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Asn

485

<210> 70

<211> 480

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising three designed ankyrin repeat domains

<400> 70

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg

130 135 140

Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp

145 150 155 160

Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

165 170 175

Asp Arg Tyr Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Ala Gly His

180 185 190

Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

195 200 205

Glu Asp Tyr Phe Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser Ala Gly

210 215 220

His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn

225 230 235 240

Ala Lys Asp Asp Ala Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Thr

245 250 255

Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

260 265 270

Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp

275 280 285

Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Gly Gly Gly

290 295 300

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

305 310 315 320

Ser Arg Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly

325 330 335

Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn

340 345 350

Ala Lys Asp Tyr Leu Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala His Glu

355 360 365

Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

370 375 380

Asn Ala Lys Asp Val Ser Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala

385 390 395 400

Asp Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

405 410 415

Val Asn Ala Lys Asp Asn Thr Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ser Ala

420 425 430

Asp Leu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

435 440 445

Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser

450 455 460

Ile Asp Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Leu Asn

465 470 475 480

<210> 71

<211> 480

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising three designed ankyrin repeat domains

<400> 71

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg

130 135 140

Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp

145 150 155 160

Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

165 170 175

Asp Tyr Leu Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala His Glu Gly His

180 185 190

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

195 200 205

Lys Asp Val Ser Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Asp Gly

210 215 220

His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn

225 230 235 240

Ala Lys Asp Asn Thr Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ser Ala Asp Leu

245 250 255

Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

260 265 270

Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp

275 280 285

Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Leu Gly Gly Gly

290 295 300

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

305 310 315 320

Ser Arg Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly

325 330 335

Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn

340 345 350

Ala Lys Asp Arg Tyr Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Ala

355 360 365

Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

370 375 380

Asn Ala Glu Asp Tyr Phe Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser

385 390 395 400

Ala Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

405 410 415

Val Asn Ala Lys Asp Asp Ala Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

420 425 430

Asn Thr Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

435 440 445

Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala

450 455 460

Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Asn

465 470 475 480

<210> 72

<211> 455

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising three designed ankyrin repeat domains

<400> 72

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Gly Ser Pro Thr Pro

115 120 125

Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro

130 135 140

Thr Gly Ser Arg Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg

145 150 155 160

Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

165 170 175

Val Asn Ala Lys Asp Arg Tyr Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

180 185 190

Asp Ala Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

195 200 205

Asp Val Asn Ala Glu Asp Tyr Phe Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala

210 215 220

Ala Ser Ala Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly

225 230 235 240

Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Asp Ala Gly Asn Thr Pro Leu His Leu

245 250 255

Ala Ala Asn Thr Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala

260 265 270

Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp

275 280 285

Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys

290 295 300

Leu Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr

305 310 315 320

Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Arg Ser Asp Leu Asp Lys Lys

325 330 335

Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu

340 345 350

Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Ser Thr Gly Tyr Thr

355 360 365

Pro Leu His Leu Ala Ala Pro Trp Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val

370 375 380

Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr Gln Gly Trp

385 390 395 400

Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Val Gly His Leu Glu Ile Val Glu

405 410 415

Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly

420 425 430

Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala

435 440 445

Glu Val Leu Gln Lys Leu Asn

450 455

<210> 73

<211> 422

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising three designed ankyrin repeat domains

<400> 73

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Gly Ser Pro Thr Pro

115 120 125

Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro

130 135 140

Thr Gly Ser Arg Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg

145 150 155 160

Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp

165 170 175

Val Asn Ala Lys Asp Ser Thr Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

180 185 190

Pro Trp Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

195 200 205

Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Gln Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala

210 215 220

Ala Ala Val Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly

225 230 235 240

Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile

245 250 255

Ser Ile Asp Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Leu

260 265 270

Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr

275 280 285

Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Arg Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu

290 295 300

Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met

305 310 315 320

Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro

325 330 335

Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu

340 345 350

Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr

355 360 365

Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val

370 375 380

Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys

385 390 395 400

Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu

405 410 415

Val Leu Gln Lys Leu Asn

420

<210> 74

<211> 422

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising three designed ankyrin repeat domains

<400> 74

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Gly Ser Pro Thr Pro

115 120 125

Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro

130 135 140

Thr Gly Ser Arg Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg

145 150 155 160

Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp

165 170 175

Val Asn Ala Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

180 185 190

Arg Asn Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

195 200 205

Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala

210 215 220

Ala Asn Asp Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly

225 230 235 240

Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile

245 250 255

Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu

260 265 270

Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr

275 280 285

Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Arg Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu

290 295 300

Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met

305 310 315 320

Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Ser Thr Gly Trp Thr Pro

325 330 335

Leu His Leu Ala Ala Pro Trp Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu

340 345 350

Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Gln Gly Trp Thr

355 360 365

Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Val Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val

370 375 380

Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys

385 390 395 400

Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu

405 410 415

Ile Leu Gln Lys Leu Asn

420

<210> 75

<211> 422

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising three designed ankyrin repeat domains

<400> 75

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Gly Ser Pro Thr Pro

115 120 125

Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro

130 135 140

Thr Gly Ser Arg Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg

145 150 155 160

Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp

165 170 175

Val Asn Ala Lys Asp Lys Asp Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

180 185 190

Arg Glu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

195 200 205

Asp Val Asn Ala Lys Asp Lys Asp Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala

210 215 220

Ala Arg Glu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly

225 230 235 240

Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile

245 250 255

Ser Ile Asp Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Leu

260 265 270

Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr

275 280 285

Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Arg Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu

290 295 300

Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met

305 310 315 320

Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro

325 330 335

Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu

340 345 350

Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr

355 360 365

Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val

370 375 380

Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys

385 390 395 400

Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu

405 410 415

Val Leu Gln Lys Leu Asn

420

<210> 76

<211> 422

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising three designed ankyrin repeat domains

<400> 76

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Gly Ser Pro Thr Pro

115 120 125

Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro

130 135 140

Thr Gly Ser Arg Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg

145 150 155 160

Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp

165 170 175

Val Asn Ala Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

180 185 190

Arg Asn Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

195 200 205

Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala

210 215 220

Ala Asn Asp Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly

225 230 235 240

Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile

245 250 255

Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu

260 265 270

Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr

275 280 285

Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Arg Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu

290 295 300

Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met

305 310 315 320

Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Lys Asp Gly Tyr Thr Pro

325 330 335

Leu His Leu Ala Ala Arg Glu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu

340 345 350

Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Lys Asp Gly Tyr Thr

355 360 365

Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Glu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val

370 375 380

Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys

385 390 395 400

Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu

405 410 415

Ile Leu Gln Lys Leu Asn

420

<210> 77

<211> 420

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising three designed ankyrin repeat domains

<400> 77

Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Glu Arg Gly Thr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Val Tyr Gly His Leu

35 40 45

Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asn Glu Thr Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Asp Ser Ser Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Ser Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr

115 120 125

Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr

130 135 140

Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala

145 150 155 160

Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val

165 170 175

Asn Ala Lys Asp Glu Arg Gly Thr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Val

180 185 190

Tyr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

195 200 205

Val Asn Ala Lys Asn Glu Thr Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Asp

210 215 220

Ser Ser Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Ser Ala

225 230 235 240

Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala

245 250 255

Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

260 265 270

Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr

275 280 285

Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu

290 295 300

Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn

305 310 315 320

Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Ser Thr Gly Trp Thr Pro Leu His

325 330 335

Leu Ala Ala Pro Trp Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys

340 345 350

Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Gln Gly Trp Thr Pro Leu

355 360 365

His Leu Ala Ala Ala Val Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu

370 375 380

Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala

385 390 395 400

Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu

405 410 415

Gln Lys Ala Ala

420

<210> 78

<211> 420

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising three designed ankyrin repeat domains

<400> 78

Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Glu Arg Gly Thr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Val Tyr Gly His Leu

35 40 45

Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asn Glu Thr Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Asp Ser Ser Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Ser Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr

115 120 125

Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr

130 135 140

Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala

145 150 155 160

Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val

165 170 175

Asn Ala Lys Asp Ser Thr Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Pro

180 185 190

Trp Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

195 200 205

Val Asn Ala Lys Asp Phe Gln Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

210 215 220

Ala Val Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

225 230 235 240

Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser

245 250 255

Ile Asp Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala

260 265 270

Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr

275 280 285

Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu

290 295 300

Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn

305 310 315 320

Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Glu Arg Gly Thr Thr Pro Leu His

325 330 335

Leu Ala Ala Val Tyr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys

340 345 350

Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asn Glu Thr Gly Tyr Thr Pro Leu

355 360 365

His Leu Ala Asp Ser Ser Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu

370 375 380

Lys His Ser Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro

385 390 395 400

Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu

405 410 415

Gln Lys Ala Ala

420

<210> 79

<211> 420

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising three designed ankyrin repeat domains

<400> 79

Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Ser Thr Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Pro Trp Gly His Leu

35 40 45

Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Gln Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Val Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn Gly

100 105 110

Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr

115 120 125

Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr

130 135 140

Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala

145 150 155 160

Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

165 170 175

Asn Ala Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg

180 185 190

Asn Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

195 200 205

Val Asn Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

210 215 220

Asn Glu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

225 230 235 240

Asp Val Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala

245 250 255

Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

260 265 270

Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr

275 280 285

Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu

290 295 300

Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala

305 310 315 320

Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His

325 330 335

Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys

340 345 350

Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu

355 360 365

His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu

370 375 380

Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro

385 390 395 400

Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu

405 410 415

Gln Lys Ala Ala

420

<210> 80

<211> 420

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising three designed ankyrin repeat domains

<400> 80

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr

115 120 125

Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr

130 135 140

Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala

145 150 155 160

Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val

165 170 175

Asn Ala Lys Asp Ser Thr Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Pro

180 185 190

Trp Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

195 200 205

Val Asn Ala Lys Asp Phe Gln Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

210 215 220

Ala Val Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

225 230 235 240

Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser

245 250 255

Ile Asp Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala

260 265 270

Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr

275 280 285

Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu

290 295 300

Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala

305 310 315 320

Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His

325 330 335

Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys

340 345 350

Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu

355 360 365

His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu

370 375 380

Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro

385 390 395 400

Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu

405 410 415

Gln Lys Ala Ala

420

<210> 81

<211> 420

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising three designed ankyrin repeat domains

<400> 81

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr

115 120 125

Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr

130 135 140

Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala

145 150 155 160

Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

165 170 175

Asn Ala Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg

180 185 190

Asn Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

195 200 205

Val Asn Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

210 215 220

Asn Glu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

225 230 235 240

Asp Val Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala

245 250 255

Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

260 265 270

Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr

275 280 285

Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu

290 295 300

Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn

305 310 315 320

Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Ser Thr Gly Trp Thr Pro Leu His

325 330 335

Leu Ala Ala Pro Trp Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys

340 345 350

Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Gln Gly Trp Thr Pro Leu

355 360 365

His Leu Ala Ala Ala Val Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu

370 375 380

Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala

385 390 395 400

Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu

405 410 415

Gln Lys Ala Ala

420

<210> 82

<211> 422

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising three designed ankyrin repeat domains

<400> 82

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Gly Ser Pro Thr Pro

115 120 125

Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro

130 135 140

Thr Gly Ser Arg Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg

145 150 155 160

Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp

165 170 175

Val Asn Ala Lys Asp Lys Asp Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

180 185 190

Arg Glu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

195 200 205

Asp Val Asn Ala Lys Asp Lys Asp Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala

210 215 220

Ala Arg Glu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly

225 230 235 240

Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile

245 250 255

Ser Ile Asp Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Leu

260 265 270

Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr

275 280 285

Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Arg Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu

290 295 300

Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met

305 310 315 320

Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Lys Asp Gly Tyr Thr Pro

325 330 335

Leu His Leu Ala Ala Arg Glu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu

340 345 350

Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Lys Asp Gly Tyr Thr

355 360 365

Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Glu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val

370 375 380

Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys

385 390 395 400

Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu

405 410 415

Ile Leu Gln Lys Leu Asn

420

<210> 83

<211> 486

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising three designed ankyrin repeat domains

<400> 83

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr

115 120 125

Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr

130 135 140

Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala

145 150 155 160

Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

165 170 175

Asn Ala Lys Asp Lys Ser Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg

180 185 190

Phe Gly His Leu Glu Ile Val Glu Phe Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

195 200 205

Val Asn Ala Lys Asp Glu Thr Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

210 215 220

Ile Trp Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

225 230 235 240

Asp Val Asn Ala Lys Asp Leu Tyr Gly Arg Thr Pro Leu His Leu Ala

245 250 255

Ala Lys Leu Arg His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly

260 265 270

Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile

275 280 285

Ser Ile Asp Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala

290 295 300

Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr

305 310 315 320

Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu

325 330 335

Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys

340 345 350

Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Leu Asp Gln Ile Gly Trp Thr Pro Leu

355 360 365

His Leu Ala Ala Asn Tyr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu

370 375 380

Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Leu Trp Gly Gln Thr Pro

385 390 395 400

Leu His Leu Ala Ala Trp Lys Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu

405 410 415

Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Thr Asp Gly Leu Thr

420 425 430

Pro Leu His Leu Ala Ala Ile Arg Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val

435 440 445

Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys

450 455 460

Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu

465 470 475 480

Val Leu Gln Lys Ala Ala

485

<210> 84

<211> 486

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising three designed ankyrin repeat domains

<400> 84

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Lys Ser Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Phe Gly His Leu

35 40 45

Glu Ile Val Glu Phe Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Glu Thr Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ile Trp Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Lys Asp Leu Tyr Gly Arg Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Lys Leu Arg

100 105 110

His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn

115 120 125

Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn

130 135 140

Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro

145 150 155 160

Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro

165 170 175

Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg

180 185 190

Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

195 200 205

Val Asn Ala Leu Asp Gln Ile Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

210 215 220

Asn Tyr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

225 230 235 240

Asp Val Asn Ala Lys Asp Leu Trp Gly Gln Thr Pro Leu His Leu Ala

245 250 255

Ala Trp Lys Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly

260 265 270

Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Thr Asp Gly Leu Thr Pro Leu His Leu

275 280 285

Ala Ala Ile Arg Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala

290 295 300

Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp

305 310 315 320

Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys

325 330 335

Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro

340 345 350

Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu

355 360 365

Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu

370 375 380

Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro

385 390 395 400

Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu

405 410 415

Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr

420 425 430

Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val

435 440 445

Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys

450 455 460

Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu

465 470 475 480

Val Leu Gln Lys Ala Ala

485

<210> 85

<211> 453

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising three designed ankyrin repeat domains

<400> 85

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr

115 120 125

Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr

130 135 140

Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala

145 150 155 160

Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

165 170 175

Asn Ala Lys Asp Arg Tyr Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp

180 185 190

Ile Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

195 200 205

Val Asn Ala Glu Asp Tyr Phe Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

210 215 220

Ser Tyr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

225 230 235 240

Asp Val Asn Ala Lys Asp Asp Tyr Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala

245 250 255

Ala Asn Thr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly

260 265 270

Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu

275 280 285

Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala

290 295 300

Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr

305 310 315 320

Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu

325 330 335

Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys

340 345 350

Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Ser Thr Gly Trp Thr Pro Leu

355 360 365

His Leu Ala Ala Pro Trp Gly His Pro Glu Ile Val Glu Val Leu Leu

370 375 380

Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Gln Gly Trp Thr Pro

385 390 395 400

Leu His Leu Ala Ala Ala Ala Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu

405 410 415

Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr

420 425 430

Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val

435 440 445

Leu Gln Lys Ala Ala

450

<210> 86

<211> 449

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising three designed ankyrin repeat domains

<400> 86

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln

145 150 155 160

Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

165 170 175

Lys Asp Arg Tyr Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Ile Gly

180 185 190

His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn

195 200 205

Ala Glu Asp Tyr Phe Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser Tyr

210 215 220

Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

225 230 235 240

Asn Ala Lys Asp Asp Tyr Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn

245 250 255

Thr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

260 265 270

Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala

275 280 285

Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly

290 295 300

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

305 310 315 320

Gly Gly Ser Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg

325 330 335

Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

340 345 350

Val Asn Ala Lys Asp Ser Thr Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

355 360 365

Pro Trp Gly His Pro Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

370 375 380

Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Gln Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala

385 390 395 400

Ala Ala Ala Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly

405 410 415

Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu

420 425 430

Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala

435 440 445

Ala

<210> 87

<211> 453

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising three designed ankyrin repeat domains

<400> 87

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Arg Tyr Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Ile Gly His Leu

35 40 45

Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Glu

50 55 60

Asp Tyr Phe Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser Tyr Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Lys Asp Asp Tyr Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Thr Gly

100 105 110

His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn

115 120 125

Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala

130 135 140

Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro

145 150 155 160

Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro

165 170 175

Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg

180 185 190

Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

195 200 205

Val Asn Ala Lys Asp Ser Thr Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

210 215 220

Pro Trp Gly His Pro Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

225 230 235 240

Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Gln Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala

245 250 255

Ala Ala Ala Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly

260 265 270

Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu

275 280 285

Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala

290 295 300

Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr

305 310 315 320

Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu

325 330 335

Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys

340 345 350

Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu

355 360 365

His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu

370 375 380

Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro

385 390 395 400

Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu

405 410 415

Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr

420 425 430

Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val

435 440 445

Leu Gln Lys Ala Ala

450

<210> 88

<211> 480

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising three designed ankyrin repeat domains

<400> 88

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg

130 135 140

Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp

145 150 155 160

Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

165 170 175

Asp Tyr Leu Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala His Glu Gly His

180 185 190

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

195 200 205

Lys Asp Val Ser Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Asp Gly

210 215 220

His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn

225 230 235 240

Ala Lys Asp Asn Thr Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ser Ala Asp Leu

245 250 255

Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

260 265 270

Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp

275 280 285

Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Leu Gly Gly Gly

290 295 300

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

305 310 315 320

Ser Arg Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly

325 330 335

Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn

340 345 350

Ala Lys Asp Arg Tyr Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Ala

355 360 365

Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

370 375 380

Asn Ala Glu Asp Tyr Phe Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser

385 390 395 400

Ala Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

405 410 415

Val Asn Ala Lys Asp Asp Ala Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

420 425 430

Asn Thr Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

435 440 445

Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala

450 455 460

Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Asn

465 470 475 480

<210> 89

<211> 453

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising three designed ankyrin repeat domains

<400> 89

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr

115 120 125

Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr

130 135 140

Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala

145 150 155 160

Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

165 170 175

Asn Ala Lys Asp Arg Tyr Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp

180 185 190

Ile Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

195 200 205

Val Asn Ala Glu Asp Tyr Phe Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

210 215 220

Ser Tyr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

225 230 235 240

Asp Val Asn Ala Lys Asp Asp Tyr Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala

245 250 255

Ala Asn Thr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly

260 265 270

Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu

275 280 285

Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala

290 295 300

Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr

305 310 315 320

Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu

325 330 335

Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys

340 345 350

Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Ser Thr Gly Trp Thr Pro Leu

355 360 365

His Leu Ala Ala Pro Trp Gly His Pro Glu Ile Val Glu Val Leu Leu

370 375 380

Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Gln Gly Trp Thr Pro

385 390 395 400

Leu His Leu Ala Ala Ala Val Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu

405 410 415

Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr

420 425 430

Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val

435 440 445

Leu Gln Lys Ala Ala

450

<210> 90

<211> 453

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising three designed ankyrin repeat domains

<400> 90

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr

115 120 125

Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr

130 135 140

Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala

145 150 155 160

Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

165 170 175

Asn Ala Lys Asp Arg Tyr Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp

180 185 190

Ile Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

195 200 205

Val Asn Ala Glu Asp Tyr Phe Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

210 215 220

Ser Tyr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

225 230 235 240

Asp Val Asn Ala Lys Asp Asp Tyr Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala

245 250 255

Ala Asn Thr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly

260 265 270

Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu

275 280 285

Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala

290 295 300

Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr

305 310 315 320

Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu

325 330 335

Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys

340 345 350

Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Ser Thr Gly Trp Thr Pro Leu

355 360 365

His Leu Ala Ala Pro Trp Gly His Pro Glu Ile Val Glu Val Leu Leu

370 375 380

Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Gln Gly Trp Thr Pro

385 390 395 400

Leu His Leu Ala Ala Ala Val Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu

405 410 415

Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr

420 425 430

Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val

435 440 445

Leu Gln Lys Ala Ala

450

<210> 91

<211> 449

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising three designed ankyrin repeat domains

<400> 91

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln

145 150 155 160

Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

165 170 175

Lys Asp Ser Thr Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Pro Trp Gly

180 185 190

His Pro Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn

195 200 205

Ala Lys Asp Tyr Gln Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Val

210 215 220

Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

225 230 235 240

Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp

245 250 255

Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Gly

260 265 270

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

275 280 285

Gly Ser Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala

290 295 300

Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

305 310 315 320

Asn Ala Lys Asp Arg Tyr Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp

325 330 335

Ala Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

340 345 350

Val Asn Ala Glu Asp Tyr Phe Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

355 360 365

Ser Ala Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

370 375 380

Asp Val Asn Ala Lys Asp Asp Ala Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala

385 390 395 400

Ala Asn Thr Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly

405 410 415

Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu

420 425 430

Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala

435 440 445

Ala

<210> 92

<211> 453

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising three designed ankyrin repeat domains

<400> 92

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr

115 120 125

Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr

130 135 140

Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala

145 150 155 160

Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

165 170 175

Asn Ala Lys Asp Arg Tyr Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp

180 185 190

Ala Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

195 200 205

Val Asn Ala Glu Asp Tyr Phe Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

210 215 220

Ser Ala Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

225 230 235 240

Asp Val Asn Ala Lys Asp Asp Ala Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala

245 250 255

Ala Asn Thr Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly

260 265 270

Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu

275 280 285

Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala

290 295 300

Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr

305 310 315 320

Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu

325 330 335

Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys

340 345 350

Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Ser Thr Gly Trp Thr Pro Leu

355 360 365

His Leu Ala Ala Pro Trp Gly His Pro Glu Ile Val Glu Val Leu Leu

370 375 380

Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Gln Gly Trp Thr Pro

385 390 395 400

Leu His Leu Ala Ala Ala Val Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu

405 410 415

Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr

420 425 430

Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val

435 440 445

Leu Gln Lys Ala Ala

450

<210> 93

<211> 453

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising three designed ankyrin repeat domains

<400> 93

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr

115 120 125

Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr

130 135 140

Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala

145 150 155 160

Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

165 170 175

Asn Ala Lys Asp Ser Thr Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Pro

180 185 190

Trp Gly His Pro Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

195 200 205

Val Asn Ala Lys Asp Tyr Gln Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

210 215 220

Ala Val Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

225 230 235 240

Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala

245 250 255

Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

260 265 270

Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr

275 280 285

Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu

290 295 300

Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala

305 310 315 320

Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Arg Tyr Gly Asp Thr Pro Leu His

325 330 335

Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys

340 345 350

Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Glu Asp Tyr Phe Gly Asn Thr Pro Leu

355 360 365

His Leu Ala Ala Ser Ala Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu

370 375 380

Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Asp Ala Gly Asn Thr Pro

385 390 395 400

Leu His Leu Ala Ala Asn Thr Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu

405 410 415

Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr

420 425 430

Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val

435 440 445

Leu Gln Lys Ala Ala

450

<210> 94

<211> 453

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising three designed ankyrin repeat domains

<400> 94

Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Ser Thr Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Pro Trp Gly His Leu

35 40 45

Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Gln Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Val Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn Gly

100 105 110

Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr

115 120 125

Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr

130 135 140

Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala

145 150 155 160

Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

165 170 175

Asn Ala Lys Asp Arg Tyr Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp

180 185 190

Ala Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

195 200 205

Val Asn Ala Glu Asp Tyr Phe Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

210 215 220

Ser Ala Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

225 230 235 240

Asp Val Asn Ala Lys Asp Asp Ala Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala

245 250 255

Ala Asn Thr Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly

260 265 270

Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu

275 280 285

Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala

290 295 300

Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr

305 310 315 320

Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu

325 330 335

Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala

340 345 350

Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Glu Arg Gly Thr Thr Pro Leu

355 360 365

His Leu Ala Ala Val Tyr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu

370 375 380

Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asn Glu Thr Gly Tyr Thr Pro

385 390 395 400

Leu His Leu Ala Asp Ser Ser Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu

405 410 415

Leu Lys His Ser Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr

420 425 430

Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val

435 440 445

Leu Gln Lys Ala Ala

450

<210> 95

<211> 601

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising four designed ankyrin repeat domains

<400> 95

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr

115 120 125

Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr

130 135 140

Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala

145 150 155 160

Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

165 170 175

Asn Ala Lys Asp Arg Tyr Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp

180 185 190

Ile Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

195 200 205

Val Asn Ala Glu Asp Tyr Phe Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

210 215 220

Ser Tyr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

225 230 235 240

Asp Val Asn Ala Lys Asp Asp Tyr Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala

245 250 255

Ala Asn Thr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly

260 265 270

Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu

275 280 285

Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala

290 295 300

Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr

305 310 315 320

Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu

325 330 335

Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys

340 345 350

Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Ser Thr Gly Trp Thr Pro Leu

355 360 365

His Leu Ala Ala Pro Trp Gly His Pro Glu Ile Val Glu Val Leu Leu

370 375 380

Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Gln Gly Trp Thr Pro

385 390 395 400

Leu His Leu Ala Ala Ala Ala Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu

405 410 415

Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr

420 425 430

Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val

435 440 445

Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr

450 455 460

Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly

465 470 475 480

Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg

485 490 495

Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr Phe Ser

500 505 510

His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu Lys Ile Val

515 520 525

Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Ala

530 535 540

Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His Leu Glu Ile

545 550 555 560

Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Ile

565 570 575

Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp

580 585 590

Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

595 600

<210> 96

<211> 601

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising four designed ankyrin repeat domains

<400> 96

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr

115 120 125

Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr

130 135 140

Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala

145 150 155 160

Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val

165 170 175

Asn Ala Lys Asp Arg Tyr Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp

180 185 190

Ile Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

195 200 205

Val Asn Ala Glu Asp Tyr Phe Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

210 215 220

Ser Tyr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

225 230 235 240

Asp Val Asn Ala Lys Asp Asp Tyr Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala

245 250 255

Ala Asn Thr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly

260 265 270

Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu

275 280 285

Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala

290 295 300

Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr

305 310 315 320

Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu

325 330 335

Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys

340 345 350

Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Ser Thr Gly Trp Thr Pro Leu

355 360 365

His Leu Ala Ala Pro Trp Gly His Pro Glu Ile Val Glu Val Leu Leu

370 375 380

Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Gln Gly Trp Thr Pro

385 390 395 400

Leu His Leu Ala Ala Ala Val Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu

405 410 415

Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr

420 425 430

Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val

435 440 445

Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr

450 455 460

Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly

465 470 475 480

Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg

485 490 495

Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr Phe Ser

500 505 510

His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu Lys Ile Val

515 520 525

Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Ala

530 535 540

Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp Gly His Leu Glu Ile

545 550 555 560

Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Ile

565 570 575

Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp

580 585 590

Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

595 600

<210> 97

<211> 637

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising four designed ankyrin repeat domains

<400> 97

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Gly Ser Pro Thr Pro

115 120 125

Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro

130 135 140

Thr Gly Ser Arg Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg

145 150 155 160

Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

165 170 175

Val Asn Ala Lys Asp Arg Tyr Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

180 185 190

Asp Ala Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

195 200 205

Asp Val Asn Ala Glu Asp Tyr Phe Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala

210 215 220

Ala Ser Ala Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly

225 230 235 240

Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Asp Ala Gly Asn Thr Pro Leu His Leu

245 250 255

Ala Ala Asn Thr Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala

260 265 270

Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp

275 280 285

Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys

290 295 300

Leu Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr

305 310 315 320

Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Arg Ser Asp Leu Asp Lys Lys

325 330 335

Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu

340 345 350

Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr Leu Gly Trp Thr

355 360 365

Pro Leu His Leu Ala Ala His Glu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val

370 375 380

Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Val Ser Gly Tyr

385 390 395 400

Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Asp Gly His Leu Glu Ile Val Glu

405 410 415

Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Asn Thr Gly

420 425 430

Trp Thr Pro Leu His Leu Ser Ala Asp Leu Gly His Leu Glu Ile Val

435 440 445

Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe

450 455 460

Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn Gly Asn Glu Asp Leu

465 470 475 480

Ala Glu Ile Leu Gln Lys Leu Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr

485 490 495

Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Arg

500 505 510

Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp

515 520 525

Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

530 535 540

Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His

545 550 555 560

Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

565 570 575

Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp Gly

580 585 590

His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn

595 600 605

Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala

610 615 620

Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Asn

625 630 635

<210> 98

<211> 637

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising four designed ankyrin repeat domains

<400> 98

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Gly Ser Pro Thr Pro

115 120 125

Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro

130 135 140

Thr Gly Ser Arg Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg

145 150 155 160

Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

165 170 175

Val Asn Ala Lys Asp Tyr Leu Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

180 185 190

His Glu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

195 200 205

Asp Val Asn Ala Lys Asp Val Ser Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala

210 215 220

Ala Ala Asp Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly

225 230 235 240

Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Asn Thr Gly Trp Thr Pro Leu His Leu

245 250 255

Ser Ala Asp Leu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala

260 265 270

Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp

275 280 285

Ile Ser Ile Asp Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys

290 295 300

Leu Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr

305 310 315 320

Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Arg Ser Asp Leu Gly Lys Lys

325 330 335

Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu

340 345 350

Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Arg Tyr Gly Asp Thr

355 360 365

Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val

370 375 380

Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Glu Asp Tyr Phe Gly Asn

385 390 395 400

Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser Ala Gly His Leu Glu Ile Val Glu

405 410 415

Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Asp Ala Gly

420 425 430

Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Thr Gly His Leu Lys Ile Val

435 440 445

Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser

450 455 460

Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile

465 470 475 480

Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr

485 490 495

Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Arg

500 505 510

Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp

515 520 525

Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

530 535 540

Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His

545 550 555 560

Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

565 570 575

Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp Gly

580 585 590

His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn

595 600 605

Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala

610 615 620

Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Asn

625 630 635

<210> 99

<211> 625

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising four designed ankyrin repeat domains

<400> 99

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg

130 135 140

Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp

145 150 155 160

Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

165 170 175

Asp Arg Tyr Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Ala Gly His

180 185 190

Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

195 200 205

Glu Asp Tyr Phe Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser Ala Gly

210 215 220

His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn

225 230 235 240

Ala Lys Asp Asp Ala Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Thr

245 250 255

Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

260 265 270

Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp

275 280 285

Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Gly Gly Gly

290 295 300

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

305 310 315 320

Ser Arg Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly

325 330 335

Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn

340 345 350

Ala Lys Asp Tyr Leu Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala His Glu

355 360 365

Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

370 375 380

Asn Ala Lys Asp Val Ser Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala

385 390 395 400

Asp Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

405 410 415

Val Asn Ala Lys Asp Asn Thr Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ser Ala

420 425 430

Asp Leu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

435 440 445

Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser

450 455 460

Ile Asp Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Leu Gly

465 470 475 480

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

485 490 495

Gly Gly Ser Arg Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg

500 505 510

Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp

515 520 525

Val Asn Ala Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

530 535 540

Arg Asn Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

545 550 555 560

Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala

565 570 575

Ala Asn Asp Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly

580 585 590

Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile

595 600 605

Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu

610 615 620

Asn

625

<210> 100

<211> 625

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising four designed ankyrin repeat domains

<400> 100

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg

130 135 140

Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp

145 150 155 160

Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

165 170 175

Asp Tyr Leu Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala His Glu Gly His

180 185 190

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

195 200 205

Lys Asp Val Ser Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Asp Gly

210 215 220

His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn

225 230 235 240

Ala Lys Asp Asn Thr Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ser Ala Asp Leu

245 250 255

Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

260 265 270

Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp

275 280 285

Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Leu Gly Gly Gly

290 295 300

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

305 310 315 320

Ser Arg Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly

325 330 335

Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn

340 345 350

Ala Lys Asp Arg Tyr Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Ala

355 360 365

Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

370 375 380

Asn Ala Glu Asp Tyr Phe Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser

385 390 395 400

Ala Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

405 410 415

Val Asn Ala Lys Asp Asp Ala Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

420 425 430

Asn Thr Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

435 440 445

Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala

450 455 460

Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Gly

465 470 475 480

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

485 490 495

Gly Gly Ser Arg Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg

500 505 510

Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp

515 520 525

Val Asn Ala Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

530 535 540

Arg Asn Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

545 550 555 560

Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala

565 570 575

Ala Asn Asp Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly

580 585 590

Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile

595 600 605

Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu

610 615 620

Asn

625

<210> 101

<211> 595

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising four designed ankyrin repeat domains

<400> 101

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln

145 150 155 160

Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

165 170 175

Lys Asp Arg Tyr Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Ile Gly

180 185 190

His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn

195 200 205

Ala Glu Asp Tyr Phe Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser Tyr

210 215 220

Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

225 230 235 240

Asn Ala Lys Asp Asp Tyr Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn

245 250 255

Thr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

260 265 270

Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala

275 280 285

Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly

290 295 300

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

305 310 315 320

Gly Gly Ser Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg

325 330 335

Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

340 345 350

Val Asn Ala Lys Asp Ser Thr Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

355 360 365

Pro Trp Gly His Pro Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

370 375 380

Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Gln Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala

385 390 395 400

Ala Ala Ala Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly

405 410 415

Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu

420 425 430

Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala

435 440 445

Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

450 455 460

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala

465 470 475 480

Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly

485 490 495

Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu

500 505 510

Ala Ala Arg Asn Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala

515 520 525

Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His

530 535 540

Leu Ala Ala Asn Glu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys

545 550 555 560

Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala

565 570 575

Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln

580 585 590

Lys Ala Ala

595

<210> 102

<211> 601

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising four designed ankyrin repeat domains

<400> 102

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr

115 120 125

Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr

130 135 140

Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala

145 150 155 160

Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

165 170 175

Asn Ala Lys Asp Arg Tyr Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp

180 185 190

Ile Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

195 200 205

Val Asn Ala Glu Asp Tyr Phe Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

210 215 220

Ser Tyr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

225 230 235 240

Asp Val Asn Ala Lys Asp Asp Tyr Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala

245 250 255

Ala Asn Thr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly

260 265 270

Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu

275 280 285

Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala

290 295 300

Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr

305 310 315 320

Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu

325 330 335

Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys

340 345 350

Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Ser Thr Gly Trp Thr Pro Leu

355 360 365

His Leu Ala Ala Pro Trp Gly His Pro Glu Ile Val Glu Val Leu Leu

370 375 380

Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Gln Gly Trp Thr Pro

385 390 395 400

Leu His Leu Ala Ala Ala Val Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu

405 410 415

Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr

420 425 430

Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val

435 440 445

Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr

450 455 460

Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly

465 470 475 480

Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg

485 490 495

Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr Phe Ser

500 505 510

His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu Lys Ile Val

515 520 525

Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Ala

530 535 540

Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp Gly His Leu Glu Ile

545 550 555 560

Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Ile

565 570 575

Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp

580 585 590

Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

595 600

<210> 103

<211> 601

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising four designed ankyrin repeat domains

<400> 103

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr

115 120 125

Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr

130 135 140

Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala

145 150 155 160

Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

165 170 175

Asn Ala Lys Asp Arg Tyr Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp

180 185 190

Ile Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

195 200 205

Val Asn Ala Glu Asp Tyr Phe Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

210 215 220

Ser Tyr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

225 230 235 240

Asp Val Asn Ala Lys Asp Asp Tyr Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala

245 250 255

Ala Asn Thr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly

260 265 270

Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu

275 280 285

Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala

290 295 300

Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr

305 310 315 320

Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu

325 330 335

Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys

340 345 350

Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Ser Thr Gly Trp Thr Pro Leu

355 360 365

His Leu Ala Ala Pro Trp Gly His Pro Glu Ile Val Glu Val Leu Leu

370 375 380

Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Gln Gly Trp Thr Pro

385 390 395 400

Leu His Leu Ala Ala Ala Val Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu

405 410 415

Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr

420 425 430

Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val

435 440 445

Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr

450 455 460

Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly

465 470 475 480

Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg

485 490 495

Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr Phe Ser

500 505 510

His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu Lys Ile Val

515 520 525

Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Ala

530 535 540

Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His Leu Glu Ile

545 550 555 560

Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Ile

565 570 575

Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp

580 585 590

Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

595 600

<210> 104

<211> 601

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising four designed ankyrin repeat domains

<400> 104

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr

115 120 125

Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr

130 135 140

Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala

145 150 155 160

Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val

165 170 175

Asn Ala Lys Asp Arg Tyr Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp

180 185 190

Ile Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

195 200 205

Val Asn Ala Glu Asp Tyr Phe Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

210 215 220

Ser Tyr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

225 230 235 240

Asp Val Asn Ala Lys Asp Asp Tyr Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala

245 250 255

Ala Asn Thr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly

260 265 270

Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu

275 280 285

Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala

290 295 300

Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr

305 310 315 320

Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu

325 330 335

Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys

340 345 350

Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Ser Thr Gly Trp Thr Pro Leu

355 360 365

His Leu Ala Ala Pro Trp Gly His Pro Glu Ile Val Glu Val Leu Leu

370 375 380

Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Gln Gly Trp Thr Pro

385 390 395 400

Leu His Leu Ala Ala Ala Val Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu

405 410 415

Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr

420 425 430

Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val

435 440 445

Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr

450 455 460

Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly

465 470 475 480

Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg

485 490 495

Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr Phe Ser

500 505 510

His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu Lys Ile Val

515 520 525

Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Ala

530 535 540

Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His Leu Glu Ile

545 550 555 560

Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Ile

565 570 575

Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp

580 585 590

Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

595 600

<210> 105

<211> 595

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising four designed ankyrin repeat domains

<400> 105

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln

145 150 155 160

Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

165 170 175

Lys Asp Ser Thr Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Pro Trp Gly

180 185 190

His Pro Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn

195 200 205

Ala Lys Asp Tyr Gln Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Val

210 215 220

Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

225 230 235 240

Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp

245 250 255

Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Gly

260 265 270

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

275 280 285

Gly Ser Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala

290 295 300

Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

305 310 315 320

Asn Ala Lys Asp Arg Tyr Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp

325 330 335

Ala Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

340 345 350

Val Asn Ala Glu Asp Tyr Phe Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

355 360 365

Ser Ala Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

370 375 380

Asp Val Asn Ala Lys Asp Asp Ala Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala

385 390 395 400

Ala Asn Thr Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly

405 410 415

Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu

420 425 430

Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala

435 440 445

Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

450 455 460

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala

465 470 475 480

Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly

485 490 495

Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu

500 505 510

Ala Ala Arg Asn Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala

515 520 525

Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His

530 535 540

Leu Ala Ala Asn Asp Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys

545 550 555 560

Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala

565 570 575

Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln

580 585 590

Lys Ala Ala

595

<210> 106

<211> 601

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising four designed ankyrin repeat domains

<400> 106

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr

115 120 125

Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr

130 135 140

Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala

145 150 155 160

Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

165 170 175

Asn Ala Lys Asp Arg Tyr Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp

180 185 190

Ala Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

195 200 205

Val Asn Ala Glu Asp Tyr Phe Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

210 215 220

Ser Ala Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

225 230 235 240

Asp Val Asn Ala Lys Asp Asp Ala Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala

245 250 255

Ala Asn Thr Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly

260 265 270

Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu

275 280 285

Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala

290 295 300

Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr

305 310 315 320

Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu

325 330 335

Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys

340 345 350

Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Ser Thr Gly Trp Thr Pro Leu

355 360 365

His Leu Ala Ala Pro Trp Gly His Pro Glu Ile Val Glu Val Leu Leu

370 375 380

Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Gln Gly Trp Thr Pro

385 390 395 400

Leu His Leu Ala Ala Ala Val Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu

405 410 415

Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr

420 425 430

Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val

435 440 445

Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr

450 455 460

Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly

465 470 475 480

Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg

485 490 495

Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr Phe Ser

500 505 510

His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu Lys Ile Val

515 520 525

Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Ala

530 535 540

Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp Gly His Leu Glu Ile

545 550 555 560

Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Ile

565 570 575

Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp

580 585 590

Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

595 600

<210> 107

<211> 601

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising four designed ankyrin repeat domains

<400> 107

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr

115 120 125

Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr

130 135 140

Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala

145 150 155 160

Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

165 170 175

Asn Ala Lys Asp Ser Thr Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Pro

180 185 190

Trp Gly His Pro Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

195 200 205

Val Asn Ala Lys Asp Tyr Gln Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

210 215 220

Ala Val Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

225 230 235 240

Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala

245 250 255

Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

260 265 270

Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr

275 280 285

Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu

290 295 300

Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala

305 310 315 320

Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Arg Tyr Gly Asp Thr Pro Leu His

325 330 335

Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys

340 345 350

Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Glu Asp Tyr Phe Gly Asn Thr Pro Leu

355 360 365

His Leu Ala Ala Ser Ala Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu

370 375 380

Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Asp Ala Gly Asn Thr Pro

385 390 395 400

Leu His Leu Ala Ala Asn Thr Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu

405 410 415

Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr

420 425 430

Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val

435 440 445

Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr

450 455 460

Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly

465 470 475 480

Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg

485 490 495

Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr Phe Ser

500 505 510

His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu Lys Ile Val

515 520 525

Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Ala

530 535 540

Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp Gly His Leu Glu Ile

545 550 555 560

Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Ile

565 570 575

Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp

580 585 590

Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

595 600

<210> 108

<211> 601

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising four designed ankyrin repeat domains

<400> 108

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr

115 120 125

Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr

130 135 140

Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala

145 150 155 160

Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

165 170 175

Asn Ala Lys Asp Arg Tyr Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp

180 185 190

Ala Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

195 200 205

Val Asn Ala Glu Asp Tyr Phe Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

210 215 220

Ser Ala Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

225 230 235 240

Asp Val Asn Ala Lys Asp Asp Ala Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala

245 250 255

Ala Asn Thr Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly

260 265 270

Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu

275 280 285

Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala

290 295 300

Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr

305 310 315 320

Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu

325 330 335

Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys

340 345 350

Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu

355 360 365

His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu

370 375 380

Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro

385 390 395 400

Leu His Leu Ala Ala Asn Asp Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu

405 410 415

Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr

420 425 430

Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val

435 440 445

Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr

450 455 460

Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp

465 470 475 480

Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg

485 490 495

Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Ser Thr Gly

500 505 510

Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Pro Trp Gly His Pro Glu Ile Val

515 520 525

Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Gln

530 535 540

Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Val Gly His Leu Glu Ile

545 550 555 560

Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys

565 570 575

Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp

580 585 590

Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

595 600

<210> 109

<211> 571

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising four designed ankyrin repeat domains

<400> 109

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Gly Ser Pro Thr Pro

115 120 125

Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro

130 135 140

Thr Gly Ser Arg Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg

145 150 155 160

Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp

165 170 175

Val Asn Ala Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

180 185 190

Arg Asn Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

195 200 205

Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala

210 215 220

Ala Asn Asp Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly

225 230 235 240

Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile

245 250 255

Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu

260 265 270

Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr

275 280 285

Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Arg Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu

290 295 300

Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met

305 310 315 320

Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Lys Asp Gly Tyr Thr Pro

325 330 335

Leu His Leu Ala Ala Arg Glu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu

340 345 350

Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Lys Asp Gly Tyr Thr

355 360 365

Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Glu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val

370 375 380

Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys

385 390 395 400

Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu

405 410 415

Ile Leu Gln Lys Leu Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr

420 425 430

Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Arg Ser Asp

435 440 445

Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu

450 455 460

Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Lys

465 470 475 480

Asp Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Glu Gly His Leu Glu

485 490 495

Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

500 505 510

Lys Asp Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Glu Gly His Leu

515 520 525

Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln

530 535 540

Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn Gly Asn

545 550 555 560

Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Leu Asn

565 570

<210> 110

<211> 634

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising four designed ankyrin repeat domains

<400> 110

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr

115 120 125

Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr

130 135 140

Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala

145 150 155 160

Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

165 170 175

Asn Ala Lys Asp Lys Ser Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg

180 185 190

Phe Gly His Leu Glu Ile Val Glu Phe Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

195 200 205

Val Asn Ala Lys Asp Glu Thr Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

210 215 220

Ile Trp Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

225 230 235 240

Asp Val Asn Ala Lys Asp Leu Tyr Gly Arg Thr Pro Leu His Leu Ala

245 250 255

Ala Lys Leu Arg His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly

260 265 270

Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile

275 280 285

Ser Ile Asp Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala

290 295 300

Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr

305 310 315 320

Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu

325 330 335

Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys

340 345 350

Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Leu Asp Gln Ile Gly Trp Thr Pro Leu

355 360 365

His Leu Ala Ala Asn Tyr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu

370 375 380

Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Leu Trp Gly Gln Thr Pro

385 390 395 400

Leu His Leu Ala Ala Trp Lys Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu

405 410 415

Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Thr Asp Gly Leu Thr

420 425 430

Pro Leu His Leu Ala Ala Ile Arg Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val

435 440 445

Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys

450 455 460

Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu

465 470 475 480

Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro

485 490 495

Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu

500 505 510

Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val

515 520 525

Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr Phe

530 535 540

Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu Lys Ile

545 550 555 560

Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe

565 570 575

Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His Leu Glu

580 585 590

Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp

595 600 605

Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly His Glu

610 615 620

Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

625 630

<210> 111

<211> 634

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising four designed ankyrin repeat domains

<400> 111

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr

115 120 125

Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr

130 135 140

Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala

145 150 155 160

Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

165 170 175

Asn Ala Lys Asp Lys Ser Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg

180 185 190

Phe Gly His Leu Glu Ile Val Glu Phe Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

195 200 205

Val Asn Ala Lys Asp Glu Thr Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

210 215 220

Ile Trp Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

225 230 235 240

Asp Val Asn Ala Lys Asp Leu Tyr Gly Arg Thr Pro Leu His Leu Ala

245 250 255

Ala Lys Leu Arg His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly

260 265 270

Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile

275 280 285

Ser Ile Asp Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala

290 295 300

Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr

305 310 315 320

Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu

325 330 335

Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys

340 345 350

Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu

355 360 365

His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu

370 375 380

Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro

385 390 395 400

Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu

405 410 415

Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr

420 425 430

Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val

435 440 445

Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr

450 455 460

Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp

465 470 475 480

Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg

485 490 495

Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Leu Asp Gln Ile Gly

500 505 510

Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Tyr Gly His Leu Glu Ile Val

515 520 525

Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Leu Trp

530 535 540

Gly Gln Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Trp Lys Gly His Leu Glu Ile

545 550 555 560

Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Thr

565 570 575

Asp Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ile Arg Gly His Leu Glu

580 585 590

Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp

595 600 605

Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu

610 615 620

Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

625 630

<210> 112

<211> 634

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising four designed ankyrin repeat domains

<400> 112

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr

115 120 125

Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr

130 135 140

Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala

145 150 155 160

Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

165 170 175

Asn Ala Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg

180 185 190

Asn Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

195 200 205

Val Asn Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

210 215 220

Asn Glu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

225 230 235 240

Asp Val Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala

245 250 255

Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

260 265 270

Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr

275 280 285

Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu

290 295 300

Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala

305 310 315 320

Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Lys Ser Gly Asn Thr Pro Leu His

325 330 335

Leu Ala Ala Arg Phe Gly His Leu Glu Ile Val Glu Phe Leu Leu Lys

340 345 350

Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Glu Thr Gly Lys Thr Pro Leu

355 360 365

His Leu Ala Ala Ile Trp Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu

370 375 380

Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Leu Tyr Gly Arg Thr Pro

385 390 395 400

Leu His Leu Ala Ala Lys Leu Arg His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu

405 410 415

Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr

420 425 430

Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile

435 440 445

Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr

450 455 460

Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp

465 470 475 480

Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg

485 490 495

Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Leu Asp Gln Ile Gly

500 505 510

Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Tyr Gly His Leu Glu Ile Val

515 520 525

Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Leu Trp

530 535 540

Gly Gln Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Trp Lys Gly His Leu Glu Ile

545 550 555 560

Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Thr

565 570 575

Asp Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ile Arg Gly His Leu Glu

580 585 590

Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp

595 600 605

Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu

610 615 620

Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

625 630

<210> 113

<211> 634

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising four designed ankyrin repeat domains

<400> 113

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Lys Ser Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Phe Gly His Leu

35 40 45

Glu Ile Val Glu Phe Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Glu Thr Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ile Trp Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Lys Asp Leu Tyr Gly Arg Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Lys Leu Arg

100 105 110

His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn

115 120 125

Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn

130 135 140

Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro

145 150 155 160

Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro

165 170 175

Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg

180 185 190

Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

195 200 205

Val Asn Ala Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

210 215 220

Arg Asn Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

225 230 235 240

Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala

245 250 255

Ala Asn Glu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly

260 265 270

Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile

275 280 285

Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala

290 295 300

Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr

305 310 315 320

Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu

325 330 335

Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys

340 345 350

Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Leu Asp Gln Ile Gly Trp Thr Pro Leu

355 360 365

His Leu Ala Ala Asn Tyr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu

370 375 380

Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Leu Trp Gly Gln Thr Pro

385 390 395 400

Leu His Leu Ala Ala Trp Lys Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu

405 410 415

Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Thr Asp Gly Leu Thr

420 425 430

Pro Leu His Leu Ala Ala Ile Arg Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val

435 440 445

Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys

450 455 460

Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu

465 470 475 480

Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro

485 490 495

Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu

500 505 510

Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val

515 520 525

Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr Phe

530 535 540

Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu Lys Ile

545 550 555 560

Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe

565 570 575

Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His Leu Glu

580 585 590

Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp

595 600 605

Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly His Glu

610 615 620

Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

625 630

<210> 114

<211> 634

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising four designed ankyrin repeat domains

<400> 114

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Lys Ser Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Phe Gly His Leu

35 40 45

Glu Ile Val Glu Phe Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Glu Thr Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ile Trp Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Lys Asp Leu Tyr Gly Arg Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Lys Leu Arg

100 105 110

His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn

115 120 125

Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn

130 135 140

Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro

145 150 155 160

Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro

165 170 175

Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg

180 185 190

Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

195 200 205

Val Asn Ala Leu Asp Gln Ile Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

210 215 220

Asn Tyr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

225 230 235 240

Asp Val Asn Ala Lys Asp Leu Trp Gly Gln Thr Pro Leu His Leu Ala

245 250 255

Ala Trp Lys Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly

260 265 270

Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Thr Asp Gly Leu Thr Pro Leu His Leu

275 280 285

Ala Ala Ile Arg Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala

290 295 300

Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp

305 310 315 320

Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys

325 330 335

Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro

340 345 350

Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu

355 360 365

Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu

370 375 380

Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro

385 390 395 400

Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu

405 410 415

Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr

420 425 430

Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val

435 440 445

Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys

450 455 460

Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu

465 470 475 480

Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro

485 490 495

Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu

500 505 510

Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val

515 520 525

Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr Phe

530 535 540

Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu Lys Ile

545 550 555 560

Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe

565 570 575

Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His Leu Glu

580 585 590

Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp

595 600 605

Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly His Glu

610 615 620

Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

625 630

<210> 115

<211> 634

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising four designed ankyrin repeat domains

<400> 115

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Lys Ser Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Phe Gly His Leu

35 40 45

Glu Ile Val Glu Phe Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Glu Thr Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ile Trp Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Lys Asp Leu Tyr Gly Arg Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Lys Leu Arg

100 105 110

His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn

115 120 125

Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn

130 135 140

Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro

145 150 155 160

Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro

165 170 175

Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg

180 185 190

Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

195 200 205

Val Asn Ala Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

210 215 220

Arg Asn Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

225 230 235 240

Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala

245 250 255

Ala Asn Glu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly

260 265 270

Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile

275 280 285

Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala

290 295 300

Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr

305 310 315 320

Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu

325 330 335

Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys

340 345 350

Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu

355 360 365

His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu

370 375 380

Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro

385 390 395 400

Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu

405 410 415

Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr

420 425 430

Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val

435 440 445

Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr

450 455 460

Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp

465 470 475 480

Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg

485 490 495

Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Leu Asp Gln Ile Gly

500 505 510

Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Tyr Gly His Leu Glu Ile Val

515 520 525

Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Leu Trp

530 535 540

Gly Gln Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Trp Lys Gly His Leu Glu Ile

545 550 555 560

Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Thr

565 570 575

Asp Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ile Arg Gly His Leu Glu

580 585 590

Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp

595 600 605

Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu

610 615 620

Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

625 630

<210> 116

<211> 595

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising four designed ankyrin repeat domains

<400> 116

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln

145 150 155 160

Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

165 170 175

Lys Asp Arg Tyr Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Ile Gly

180 185 190

His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn

195 200 205

Ala Glu Asp Tyr Phe Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser Tyr

210 215 220

Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

225 230 235 240

Asn Ala Lys Asp Asp Tyr Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn

245 250 255

Thr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

260 265 270

Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala

275 280 285

Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly

290 295 300

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

305 310 315 320

Gly Gly Ser Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg

325 330 335

Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

340 345 350

Val Asn Ala Lys Asp Ser Thr Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

355 360 365

Pro Trp Gly His Pro Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

370 375 380

Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Gln Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala

385 390 395 400

Ala Ala Ala Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly

405 410 415

Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu

420 425 430

Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala

435 440 445

Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

450 455 460

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala

465 470 475 480

Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly

485 490 495

Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu

500 505 510

Ala Ala Arg Asn Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala

515 520 525

Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His

530 535 540

Leu Ala Ala Asn Glu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys

545 550 555 560

Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala

565 570 575

Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln

580 585 590

Lys Ala Ala

595

<210> 117

<211> 601

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising four designed ankyrin repeat domains

<400> 117

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Arg Tyr Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Ile Gly His Leu

35 40 45

Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Glu

50 55 60

Asp Tyr Phe Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser Tyr Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Lys Asp Asp Tyr Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Thr Gly

100 105 110

His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn

115 120 125

Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala

130 135 140

Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro

145 150 155 160

Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro

165 170 175

Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg

180 185 190

Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

195 200 205

Val Asn Ala Lys Asp Ser Thr Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

210 215 220

Pro Trp Gly His Pro Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

225 230 235 240

Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Gln Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala

245 250 255

Ala Ala Ala Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly

260 265 270

Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu

275 280 285

Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala

290 295 300

Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr

305 310 315 320

Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu

325 330 335

Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys

340 345 350

Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu

355 360 365

His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu

370 375 380

Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro

385 390 395 400

Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu

405 410 415

Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr

420 425 430

Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val

435 440 445

Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr

450 455 460

Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly

465 470 475 480

Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg

485 490 495

Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr Phe Ser

500 505 510

His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu Lys Ile Val

515 520 525

Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Ala

530 535 540

Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His Leu Glu Ile

545 550 555 560

Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Ile

565 570 575

Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp

580 585 590

Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

595 600

<210> 118

<211> 601

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising four designed ankyrin repeat domains

<400> 118

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Arg Tyr Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Ile Gly His Leu

35 40 45

Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Glu

50 55 60

Asp Tyr Phe Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser Tyr Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Lys Asp Asp Tyr Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Thr Gly

100 105 110

His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn

115 120 125

Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala

130 135 140

Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro

145 150 155 160

Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro

165 170 175

Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg

180 185 190

Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

195 200 205

Val Asn Ala Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

210 215 220

Arg Asn Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

225 230 235 240

Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala

245 250 255

Ala Asn Glu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly

260 265 270

Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile

275 280 285

Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala

290 295 300

Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr

305 310 315 320

Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu

325 330 335

Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys

340 345 350

Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Ser Thr Gly Trp Thr Pro Leu

355 360 365

His Leu Ala Ala Pro Trp Gly His Pro Glu Ile Val Glu Val Leu Leu

370 375 380

Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Gln Gly Trp Thr Pro

385 390 395 400

Leu His Leu Ala Ala Ala Ala Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu

405 410 415

Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr

420 425 430

Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val

435 440 445

Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr

450 455 460

Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly

465 470 475 480

Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg

485 490 495

Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr Phe Ser

500 505 510

His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu Lys Ile Val

515 520 525

Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Ala

530 535 540

Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His Leu Glu Ile

545 550 555 560

Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Ile

565 570 575

Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp

580 585 590

Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

595 600

<210> 119

<211> 601

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising four designed ankyrin repeat domains

<400> 119

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr

115 120 125

Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr

130 135 140

Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala

145 150 155 160

Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

165 170 175

Asn Ala Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg

180 185 190

Asn Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

195 200 205

Val Asn Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

210 215 220

Asn Glu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

225 230 235 240

Asp Val Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala

245 250 255

Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

260 265 270

Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr

275 280 285

Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu

290 295 300

Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala

305 310 315 320

Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Arg Tyr Gly Asp Thr Pro Leu His

325 330 335

Leu Ala Ala Asp Ile Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys

340 345 350

Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Glu Asp Tyr Phe Gly Asn Thr Pro Leu

355 360 365

His Leu Ala Ala Ser Tyr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu

370 375 380

Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Asp Tyr Gly Asn Thr Pro

385 390 395 400

Leu His Leu Ala Ala Asn Thr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu

405 410 415

Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr

420 425 430

Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val

435 440 445

Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr

450 455 460

Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp

465 470 475 480

Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg

485 490 495

Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Ser Thr Gly

500 505 510

Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Pro Trp Gly His Pro Glu Ile Val

515 520 525

Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Gln

530 535 540

Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Ala Gly His Leu Glu Ile

545 550 555 560

Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys

565 570 575

Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp

580 585 590

Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

595 600

<210> 120

<211> 601

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising four designed ankyrin repeat domains

<400> 120

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Arg Tyr Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Ile Gly His Leu

35 40 45

Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Glu

50 55 60

Asp Tyr Phe Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser Tyr Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Lys Asp Asp Tyr Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Thr Gly

100 105 110

His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn

115 120 125

Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala

130 135 140

Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro

145 150 155 160

Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro

165 170 175

Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg

180 185 190

Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

195 200 205

Val Asn Ala Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

210 215 220

Arg Asn Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

225 230 235 240

Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala

245 250 255

Ala Asn Glu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly

260 265 270

Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile

275 280 285

Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala

290 295 300

Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr

305 310 315 320

Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu

325 330 335

Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys

340 345 350

Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu

355 360 365

His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu

370 375 380

Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro

385 390 395 400

Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu

405 410 415

Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr

420 425 430

Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val

435 440 445

Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr

450 455 460

Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp

465 470 475 480

Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg

485 490 495

Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Ser Thr Gly

500 505 510

Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Pro Trp Gly His Pro Glu Ile Val

515 520 525

Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Gln

530 535 540

Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Ala Gly His Leu Glu Ile

545 550 555 560

Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys

565 570 575

Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp

580 585 590

Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

595 600

<210> 121

<211> 601

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising four designed ankyrin repeat domains

<400> 121

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr

115 120 125

Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr

130 135 140

Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala

145 150 155 160

Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

165 170 175

Asn Ala Lys Asp Arg Tyr Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp

180 185 190

Ile Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

195 200 205

Val Asn Ala Glu Asp Tyr Phe Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

210 215 220

Ser Tyr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

225 230 235 240

Asp Val Asn Ala Lys Asp Asp Tyr Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala

245 250 255

Ala Asn Thr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly

260 265 270

Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu

275 280 285

Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala

290 295 300

Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr

305 310 315 320

Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu

325 330 335

Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys

340 345 350

Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu

355 360 365

His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu

370 375 380

Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro

385 390 395 400

Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu

405 410 415

Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr

420 425 430

Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val

435 440 445

Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr

450 455 460

Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp

465 470 475 480

Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg

485 490 495

Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Ser Thr Gly

500 505 510

Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Pro Trp Gly His Pro Glu Ile Val

515 520 525

Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Gln

530 535 540

Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Ala Gly His Leu Glu Ile

545 550 555 560

Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys

565 570 575

Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp

580 585 590

Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

595 600

<210> 122

<211> 601

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising four designed ankyrin repeat domains

<400> 122

Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Glu Arg Gly Thr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Val Tyr Gly His Leu

35 40 45

Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asn Glu Thr Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Asp Ser Ser Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Ser Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr

115 120 125

Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr

130 135 140

Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala

145 150 155 160

Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val

165 170 175

Asn Ala Lys Asp Ser Thr Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Pro

180 185 190

Trp Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

195 200 205

Val Asn Ala Lys Asp Phe Gln Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

210 215 220

Ala Val Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

225 230 235 240

Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser

245 250 255

Ile Asp Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala

260 265 270

Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr

275 280 285

Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu

290 295 300

Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala

305 310 315 320

Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Arg Tyr Gly Asp Thr Pro Leu His

325 330 335

Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys

340 345 350

Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Glu Asp Tyr Phe Gly Asn Thr Pro Leu

355 360 365

His Leu Ala Ala Ser Ala Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu

370 375 380

Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Asp Ala Gly Asn Thr Pro

385 390 395 400

Leu His Leu Ala Ala Asn Thr Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu

405 410 415

Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr

420 425 430

Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val

435 440 445

Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr

450 455 460

Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp

465 470 475 480

Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg

485 490 495

Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Glu Arg Gly

500 505 510

Thr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Val Tyr Gly His Leu Glu Ile Val

515 520 525

Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asn Glu Thr

530 535 540

Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Asp Ser Ser Gly His Leu Glu Ile

545 550 555 560

Val Glu Val Leu Leu Lys His Ser Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys

565 570 575

Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp

580 585 590

Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

595 600

<210> 123

<211> 601

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising four designed ankyrin repeat domains

<400> 123

Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Ser Thr Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Pro Trp Gly His Leu

35 40 45

Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Gln Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Val Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn Gly

100 105 110

Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr

115 120 125

Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr

130 135 140

Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala

145 150 155 160

Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

165 170 175

Asn Ala Lys Asp Arg Tyr Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp

180 185 190

Ala Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

195 200 205

Val Asn Ala Glu Asp Tyr Phe Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

210 215 220

Ser Ala Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

225 230 235 240

Asp Val Asn Ala Lys Asp Asp Ala Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala

245 250 255

Ala Asn Thr Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly

260 265 270

Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu

275 280 285

Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala

290 295 300

Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr

305 310 315 320

Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu

325 330 335

Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala

340 345 350

Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Glu Arg Gly Thr Thr Pro Leu

355 360 365

His Leu Ala Ala Val Tyr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu

370 375 380

Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asn Glu Thr Gly Tyr Thr Pro

385 390 395 400

Leu His Leu Ala Asp Ser Ser Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu

405 410 415

Leu Lys His Ser Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr

420 425 430

Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val

435 440 445

Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr

450 455 460

Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp

465 470 475 480

Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg

485 490 495

Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Glu Arg Gly

500 505 510

Thr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Val Tyr Gly His Leu Glu Ile Val

515 520 525

Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asn Glu Thr

530 535 540

Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Asp Ser Ser Gly His Leu Glu Ile

545 550 555 560

Val Glu Val Leu Leu Lys His Ser Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys

565 570 575

Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp

580 585 590

Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

595 600

<210> 124

<211> 601

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising four designed ankyrin repeat domains

<400> 124

Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Glu Arg Gly Thr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Val Tyr Gly His Leu

35 40 45

Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asn Glu Thr Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Asp Ser Ser Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Ser Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr

115 120 125

Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr

130 135 140

Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala

145 150 155 160

Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val

165 170 175

Asn Ala Lys Asp Glu Arg Gly Thr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Val

180 185 190

Tyr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

195 200 205

Val Asn Ala Lys Asn Glu Thr Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Asp

210 215 220

Ser Ser Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Ser Ala

225 230 235 240

Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala

245 250 255

Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

260 265 270

Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr

275 280 285

Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu

290 295 300

Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn

305 310 315 320

Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Ser Thr Gly Trp Thr Pro Leu His

325 330 335

Leu Ala Ala Pro Trp Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys

340 345 350

Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Gln Gly Trp Thr Pro Leu

355 360 365

His Leu Ala Ala Ala Val Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu

370 375 380

Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala

385 390 395 400

Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu

405 410 415

Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro

420 425 430

Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys

435 440 445

Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile

450 455 460

Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Arg Tyr Gly Asp

465 470 475 480

Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Leu Lys Ile Val Glu

485 490 495

Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Glu Asp Tyr Phe Gly

500 505 510

Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser Ala Gly His Leu Glu Ile Val

515 520 525

Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Asp Ala

530 535 540

Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Thr Gly His Leu Lys Ile

545 550 555 560

Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys

565 570 575

Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp

580 585 590

Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

595 600

<210> 125

<211> 601

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising four designed ankyrin repeat domains

<400> 125

Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Glu Arg Gly Thr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Val Tyr Gly His Leu

35 40 45

Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asn Glu Thr Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Asp Ser Ser Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Ser Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr

115 120 125

Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr

130 135 140

Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala

145 150 155 160

Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val

165 170 175

Asn Ala Lys Asp Ser Thr Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Pro

180 185 190

Trp Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

195 200 205

Val Asn Ala Lys Asp Phe Gln Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

210 215 220

Ala Val Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

225 230 235 240

Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser

245 250 255

Ile Asp Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala

260 265 270

Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr

275 280 285

Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu

290 295 300

Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn

305 310 315 320

Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Glu Arg Gly Thr Thr Pro Leu His

325 330 335

Leu Ala Ala Val Tyr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys

340 345 350

Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asn Glu Thr Gly Tyr Thr Pro Leu

355 360 365

His Leu Ala Asp Ser Ser Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu

370 375 380

Lys His Ser Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro

385 390 395 400

Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu

405 410 415

Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro

420 425 430

Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys

435 440 445

Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile

450 455 460

Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Arg Tyr Gly Asp

465 470 475 480

Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Leu Lys Ile Val Glu

485 490 495

Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Glu Asp Tyr Phe Gly

500 505 510

Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser Ala Gly His Leu Glu Ile Val

515 520 525

Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Asp Ala

530 535 540

Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Thr Gly His Leu Lys Ile

545 550 555 560

Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys

565 570 575

Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp

580 585 590

Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

595 600

<210> 126

<211> 601

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising four designed ankyrin repeat domains

<400> 126

Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Ser Thr Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Pro Trp Gly His Leu

35 40 45

Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Gln Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Val Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn Gly

100 105 110

Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr

115 120 125

Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr

130 135 140

Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala

145 150 155 160

Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val

165 170 175

Asn Ala Lys Asp Glu Arg Gly Thr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Val

180 185 190

Tyr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

195 200 205

Val Asn Ala Lys Asn Glu Thr Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Asp

210 215 220

Ser Ser Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Ser Ala

225 230 235 240

Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala

245 250 255

Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

260 265 270

Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr

275 280 285

Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu

290 295 300

Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn

305 310 315 320

Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Glu Arg Gly Thr Thr Pro Leu His

325 330 335

Leu Ala Ala Val Tyr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys

340 345 350

Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asn Glu Thr Gly Tyr Thr Pro Leu

355 360 365

His Leu Ala Asp Ser Ser Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu

370 375 380

Lys His Ser Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro

385 390 395 400

Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu

405 410 415

Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro

420 425 430

Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys

435 440 445

Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile

450 455 460

Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Arg Tyr Gly Asp

465 470 475 480

Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Leu Lys Ile Val Glu

485 490 495

Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Glu Asp Tyr Phe Gly

500 505 510

Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser Ala Gly His Leu Glu Ile Val

515 520 525

Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Asp Ala

530 535 540

Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Thr Gly His Leu Lys Ile

545 550 555 560

Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys

565 570 575

Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp

580 585 590

Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

595 600

<210> 127

<211> 601

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising four designed ankyrin repeat domains

<400> 127

Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Ser Thr Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Pro Trp Gly His Leu

35 40 45

Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Gln Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Val Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn Gly

100 105 110

Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr

115 120 125

Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr

130 135 140

Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala

145 150 155 160

Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val

165 170 175

Asn Ala Lys Asp Glu Arg Gly Thr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Val

180 185 190

Tyr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

195 200 205

Val Asn Ala Lys Asn Glu Thr Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Asp

210 215 220

Ser Ser Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Ser Ala

225 230 235 240

Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala

245 250 255

Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

260 265 270

Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr

275 280 285

Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu

290 295 300

Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala

305 310 315 320

Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Arg Tyr Gly Asp Thr Pro Leu His

325 330 335

Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys

340 345 350

Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Glu Asp Tyr Phe Gly Asn Thr Pro Leu

355 360 365

His Leu Ala Ala Ser Ala Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu

370 375 380

Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Asp Ala Gly Asn Thr Pro

385 390 395 400

Leu His Leu Ala Ala Asn Thr Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu

405 410 415

Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr

420 425 430

Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val

435 440 445

Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr

450 455 460

Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp

465 470 475 480

Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg

485 490 495

Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Glu Arg Gly

500 505 510

Thr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Val Tyr Gly His Leu Glu Ile Val

515 520 525

Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asn Glu Thr

530 535 540

Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Asp Ser Ser Gly His Leu Glu Ile

545 550 555 560

Val Glu Val Leu Leu Lys His Ser Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys

565 570 575

Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp

580 585 590

Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

595 600

<210> 128

<211> 637

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising four designed ankyrin repeat domains

<400> 128

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Gly Ser Pro Thr Pro

115 120 125

Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro

130 135 140

Thr Gly Ser Arg Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg

145 150 155 160

Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp

165 170 175

Val Asn Ala Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

180 185 190

Arg Asn Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

195 200 205

Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala

210 215 220

Ala Asn Asp Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly

225 230 235 240

Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile

245 250 255

Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu

260 265 270

Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr

275 280 285

Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Arg Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu

290 295 300

Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu

305 310 315 320

Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Arg Tyr Gly Asp Thr Pro

325 330 335

Leu His Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu

340 345 350

Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Glu Asp Tyr Phe Gly Asn Thr

355 360 365

Pro Leu His Leu Ala Ala Ser Ala Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val

370 375 380

Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Asp Ala Gly Asn

385 390 395 400

Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Thr Gly His Leu Lys Ile Val Glu

405 410 415

Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly

420 425 430

Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala

435 440 445

Glu Val Leu Gln Lys Leu Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro

450 455 460

Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Arg Ser

465 470 475 480

Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

485 490 495

Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

500 505 510

Tyr Leu Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala His Glu Gly His Leu

515 520 525

Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

530 535 540

Asp Val Ser Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Asp Gly His

545 550 555 560

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

565 570 575

Lys Asp Asn Thr Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ser Ala Asp Leu Gly

580 585 590

His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn

595 600 605

Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn

610 615 620

Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Leu Asn

625 630 635

<210> 129

<211> 601

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising four designed ankyrin repeat domains

<400> 129

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr

115 120 125

Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr

130 135 140

Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala

145 150 155 160

Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

165 170 175

Asn Ala Lys Asp Arg Tyr Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp

180 185 190

Ile Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

195 200 205

Val Asn Ala Glu Asp Tyr Phe Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

210 215 220

Ser Tyr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

225 230 235 240

Asp Val Asn Ala Lys Asp Asp Tyr Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala

245 250 255

Ala Asn Thr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly

260 265 270

Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu

275 280 285

Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala

290 295 300

Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr

305 310 315 320

Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu

325 330 335

Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys

340 345 350

Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Ser Thr Gly Trp Thr Pro Leu

355 360 365

His Leu Ala Ala Pro Trp Gly His Pro Glu Ile Val Glu Val Leu Leu

370 375 380

Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Gln Gly Trp Thr Pro

385 390 395 400

Leu His Leu Ala Ala Ala Ala Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu

405 410 415

Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr

420 425 430

Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val

435 440 445

Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr

450 455 460

Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp

465 470 475 480

Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg

485 490 495

Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Glu Arg Gly

500 505 510

Thr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Val Tyr Gly His Leu Glu Ile Val

515 520 525

Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asn Glu Thr

530 535 540

Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Asp Ser Ser Gly His Leu Glu Ile

545 550 555 560

Val Glu Val Leu Leu Lys His Ser Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys

565 570 575

Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp

580 585 590

Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

595 600

<210> 130

<211> 601

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising four designed ankyrin repeat domains

<400> 130

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr

115 120 125

Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr

130 135 140

Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala

145 150 155 160

Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

165 170 175

Asn Ala Lys Asp Arg Tyr Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp

180 185 190

Ile Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

195 200 205

Val Asn Ala Glu Asp Tyr Phe Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

210 215 220

Ser Tyr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

225 230 235 240

Asp Val Asn Ala Lys Asp Asp Tyr Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala

245 250 255

Ala Asn Thr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly

260 265 270

Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu

275 280 285

Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala

290 295 300

Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr

305 310 315 320

Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu

325 330 335

Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys

340 345 350

Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Ser Thr Gly Trp Thr Pro Leu

355 360 365

His Leu Ala Ala Pro Trp Gly His Pro Glu Ile Val Glu Val Leu Leu

370 375 380

Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Gln Gly Trp Thr Pro

385 390 395 400

Leu His Leu Ala Ala Ala Ala Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu

405 410 415

Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr

420 425 430

Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val

435 440 445

Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr

450 455 460

Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly

465 470 475 480

Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg

485 490 495

Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr Phe Ser

500 505 510

His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu Lys Ile Val

515 520 525

Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Ala

530 535 540

Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp Gly His Leu Glu Ile

545 550 555 560

Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Ile

565 570 575

Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp

580 585 590

Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

595 600

<210> 131

<211> 601

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising four designed ankyrin repeat domains

<400> 131

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr

115 120 125

Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr

130 135 140

Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala

145 150 155 160

Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

165 170 175

Asn Ala Lys Asp Arg Tyr Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp

180 185 190

Ile Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

195 200 205

Val Asn Ala Glu Asp Tyr Phe Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

210 215 220

Ser Tyr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

225 230 235 240

Asp Val Asn Ala Lys Asp Asp Tyr Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala

245 250 255

Ala Asn Thr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly

260 265 270

Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu

275 280 285

Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala

290 295 300

Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr

305 310 315 320

Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu

325 330 335

Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys

340 345 350

Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Ser Thr Gly Trp Thr Pro Leu

355 360 365

His Leu Ala Ala Pro Trp Gly His Pro Glu Ile Val Glu Val Leu Leu

370 375 380

Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Gln Gly Trp Thr Pro

385 390 395 400

Leu His Leu Ala Ala Ala Ala Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu

405 410 415

Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr

420 425 430

Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val

435 440 445

Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr

450 455 460

Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp

465 470 475 480

Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg

485 490 495

Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Glu Arg Gly

500 505 510

Thr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Val Tyr Gly His Leu Glu Ile Val

515 520 525

Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asn Glu Thr

530 535 540

Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Asp Ser Ser Gly His Leu Glu Ile

545 550 555 560

Val Glu Val Leu Leu Lys His Ser Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys

565 570 575

Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp

580 585 590

Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

595 600

<210> 132

<211> 601

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising four designed ankyrin repeat domains

<400> 132

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr

115 120 125

Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr

130 135 140

Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala

145 150 155 160

Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val

165 170 175

Asn Ala Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg

180 185 190

Asn Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

195 200 205

Val Asn Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

210 215 220

Asn Asp Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala

225 230 235 240

Asp Val Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala

245 250 255

Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

260 265 270

Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr

275 280 285

Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu

290 295 300

Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala

305 310 315 320

Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Arg Tyr Gly Asp Thr Pro Leu His

325 330 335

Leu Ala Ala Asp Ile Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys

340 345 350

Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Glu Asp Tyr Phe Gly Asn Thr Pro Leu

355 360 365

His Leu Ala Ala Ser Tyr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu

370 375 380

Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Asp Tyr Gly Asn Thr Pro

385 390 395 400

Leu His Leu Ala Ala Asn Thr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu

405 410 415

Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr

420 425 430

Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val

435 440 445

Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr

450 455 460

Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp

465 470 475 480

Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg

485 490 495

Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Ser Thr Gly

500 505 510

Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Pro Trp Gly His Pro Glu Ile Val

515 520 525

Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Gln

530 535 540

Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Ala Gly His Leu Glu Ile

545 550 555 560

Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys

565 570 575

Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp

580 585 590

Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

595 600

<210> 133

<211> 601

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising four designed ankyrin repeat domains

<400> 133

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

20 25 30

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu

35 40 45

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

50 55 60

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His

65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

85 90 95

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 110

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr

115 120 125

Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr

130 135 140

Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala

145 150 155 160

Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val

165 170 175

Asn Ala Lys Asp Glu Arg Gly Thr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Val

180 185 190

Tyr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

195 200 205

Val Asn Ala Lys Asn Glu Thr Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Asp

210 215 220

Ser Ser Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Ser Ala

225 230 235 240

Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala

245 250 255

Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

260 265 270

Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr

275 280 285

Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu

290 295 300

Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala

305 310 315 320

Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Arg Tyr Gly Asp Thr Pro Leu His

325 330 335

Leu Ala Ala Asp Ile Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys

340 345 350

Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Glu Asp Tyr Phe Gly Asn Thr Pro Leu

355 360 365

His Leu Ala Ala Ser Tyr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu

370 375 380

Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Asp Tyr Gly Asn Thr Pro

385 390 395 400

Leu His Leu Ala Ala Asn Thr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu

405 410 415

Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr

420 425 430

Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val

435 440 445

Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr

450 455 460

Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp

465 470 475 480

Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg

485 490 495

Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Ser Thr Gly

500 505 510

Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Pro Trp Gly His Pro Glu Ile Val

515 520 525

Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Gln

530 535 540

Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Ala Gly His Leu Glu Ile

545 550 555 560

Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys

565 570 575

Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp

580 585 590

Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

595 600

<210> 134

<211> 603

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising four designed ankyrin repeat domains

<400> 134

Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln

1 5 10 15

Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

20 25 30

Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly

35 40 45

His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn

50 55 60

Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu

65 70 75 80

Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

85 90 95

Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp

100 105 110

Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser

115 120 125

Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr

130 135 140

Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala

145 150 155 160

Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala

165 170 175

Asp Val Asn Ala Lys Asp Arg Tyr Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala

180 185 190

Ala Asp Ile Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly

195 200 205

Ala Asp Val Asn Ala Glu Asp Tyr Phe Gly Asn Thr Pro Leu His Leu

210 215 220

Ala Ala Ser Tyr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala

225 230 235 240

Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Asp Tyr Gly Asn Thr Pro Leu His

245 250 255

Leu Ala Ala Asn Thr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys

260 265 270

Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala

275 280 285

Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln

290 295 300

Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr

305 310 315 320

Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys

325 330 335

Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu

340 345 350

Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Ser Thr Gly Trp Thr

355 360 365

Pro Leu His Leu Ala Ala Pro Trp Gly His Pro Glu Ile Val Glu Val

370 375 380

Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Gln Gly Trp

385 390 395 400

Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Ala Gly His Leu Glu Ile Val Glu

405 410 415

Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly

420 425 430

Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala

435 440 445

Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr

450 455 460

Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp

465 470 475 480

Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu

485 490 495

Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr

500 505 510

Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu Lys

515 520 525

Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

530 535 540

Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His Leu

545 550 555 560

Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln

565 570 575

Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly His

580 585 590

Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

595 600

<210> 135

<211> 603

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising four designed ankyrin repeat domains

<400> 135

Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln

1 5 10 15

Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

20 25 30

Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly

35 40 45

His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn

50 55 60

Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu

65 70 75 80

Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

85 90 95

Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp

100 105 110

Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser

115 120 125

Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr

130 135 140

Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala

145 150 155 160

Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala

165 170 175

Asp Val Asn Ala Lys Asp Ser Thr Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala

180 185 190

Ala Pro Trp Gly His Pro Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly

195 200 205

Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Gln Gly Trp Thr Pro Leu His Leu

210 215 220

Ala Ala Ala Ala Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala

225 230 235 240

Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp

245 250 255

Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys

260 265 270

Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro

275 280 285

Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu

290 295 300

Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu

305 310 315 320

Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Arg Tyr Gly Asp Thr Pro

325 330 335

Leu His Leu Ala Ala Asp Ile Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu

340 345 350

Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Glu Asp Tyr Phe Gly Asn Thr

355 360 365

Pro Leu His Leu Ala Ala Ser Tyr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val

370 375 380

Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Asp Tyr Gly Asn

385 390 395 400

Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Thr Gly His Leu Glu Ile Val Glu

405 410 415

Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly

420 425 430

Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala

435 440 445

Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr

450 455 460

Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp

465 470 475 480

Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu

485 490 495

Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr

500 505 510

Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu Lys

515 520 525

Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

530 535 540

Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His Leu

545 550 555 560

Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln

565 570 575

Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly His

580 585 590

Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

595 600

<210> 136

<211> 603

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising four designed ankyrin repeat domains

<400> 136

Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln

1 5 10 15

Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

20 25 30

Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly

35 40 45

His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn

50 55 60

Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu

65 70 75 80

Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

85 90 95

Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp

100 105 110

Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser

115 120 125

Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr

130 135 140

Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala

145 150 155 160

Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala

165 170 175

Asp Val Asn Ala Lys Asp Arg Tyr Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala

180 185 190

Ala Asp Ile Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly

195 200 205

Ala Asp Val Asn Ala Glu Asp Tyr Phe Gly Asn Thr Pro Leu His Leu

210 215 220

Ala Ala Ser Tyr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala

225 230 235 240

Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Asp Tyr Gly Asn Thr Pro Leu His

245 250 255

Leu Ala Ala Asn Thr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys

260 265 270

Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala

275 280 285

Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln

290 295 300

Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr

305 310 315 320

Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys

325 330 335

Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu

340 345 350

Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Ser Thr Gly Trp Thr

355 360 365

Pro Leu His Leu Ala Ala Pro Trp Gly His Pro Glu Ile Val Glu Val

370 375 380

Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Gln Gly Trp

385 390 395 400

Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Ala Gly His Leu Glu Ile Val Glu

405 410 415

Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly

420 425 430

Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala

435 440 445

Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr

450 455 460

Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp

465 470 475 480

Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu

485 490 495

Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr

500 505 510

Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu Lys

515 520 525

Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

530 535 540

Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His Leu

545 550 555 560

Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln

565 570 575

Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly His

580 585 590

Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

595 600

<210> 137

<211> 603

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising four designed ankyrin repeat domains

<400> 137

Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln

1 5 10 15

Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

20 25 30

Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly

35 40 45

His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn

50 55 60

Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu

65 70 75 80

Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

85 90 95

Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp

100 105 110

Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser

115 120 125

Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr

130 135 140

Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala

145 150 155 160

Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala

165 170 175

Asp Val Asn Ala Lys Asp Arg Tyr Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala

180 185 190

Ala Asp Ala Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly

195 200 205

Ala Asp Val Asn Ala Glu Asp Tyr Phe Gly Asn Thr Pro Leu His Leu

210 215 220

Ala Ala Ser Ala Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala

225 230 235 240

Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Asp Ala Gly Asn Thr Pro Leu His

245 250 255

Leu Ala Ala Asn Thr Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys

260 265 270

Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala

275 280 285

Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln

290 295 300

Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr

305 310 315 320

Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys

325 330 335

Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu

340 345 350

Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Ser Thr Gly Trp Thr

355 360 365

Pro Leu His Leu Ala Ala Pro Trp Gly His Pro Glu Ile Val Glu Val

370 375 380

Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Gln Gly Trp

385 390 395 400

Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Ala Gly His Leu Glu Ile Val Glu

405 410 415

Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly

420 425 430

Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala

435 440 445

Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr

450 455 460

Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp

465 470 475 480

Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu

485 490 495

Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr

500 505 510

Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu Lys

515 520 525

Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

530 535 540

Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His Leu

545 550 555 560

Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln

565 570 575

Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly His

580 585 590

Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

595 600

<210> 138

<211> 603

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising four designed ankyrin repeat domains

<400> 138

Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln

1 5 10 15

Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

20 25 30

Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly

35 40 45

His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn

50 55 60

Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu

65 70 75 80

Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

85 90 95

Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp

100 105 110

Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser

115 120 125

Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr

130 135 140

Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala

145 150 155 160

Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala

165 170 175

Asp Val Asn Ala Lys Asp Arg Tyr Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala

180 185 190

Ala Asp Ile Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly

195 200 205

Ala Asp Val Asn Ala Glu Asp Tyr Phe Gly Asn Thr Pro Leu His Leu

210 215 220

Ala Ala Ser Tyr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala

225 230 235 240

Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Asp Tyr Gly Asn Thr Pro Leu His

245 250 255

Leu Ala Ala Asn Thr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys

260 265 270

Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala

275 280 285

Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln

290 295 300

Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr

305 310 315 320

Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys

325 330 335

Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu

340 345 350

Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Ser Thr Gly Trp Thr

355 360 365

Pro Leu His Leu Ala Ala Pro Trp Gly His Pro Glu Ile Val Glu Val

370 375 380

Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Gln Gly Trp

385 390 395 400

Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Ala Gly His Leu Glu Ile Val Glu

405 410 415

Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly

420 425 430

Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala

435 440 445

Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr

450 455 460

Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp

465 470 475 480

Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu

485 490 495

Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr

500 505 510

Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu Lys

515 520 525

Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

530 535 540

Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His Leu

545 550 555 560

Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln

565 570 575

Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly His

580 585 590

Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

595 600

<210> 139

<211> 603

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising four designed ankyrin repeat domains

<400> 139

Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln

1 5 10 15

Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

20 25 30

Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly

35 40 45

His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn

50 55 60

Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu

65 70 75 80

Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

85 90 95

Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp

100 105 110

Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser

115 120 125

Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr

130 135 140

Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala

145 150 155 160

Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala

165 170 175

Asp Val Asn Ala Lys Asp Arg Tyr Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala

180 185 190

Ala Asp Ile Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly

195 200 205

Ala Asp Val Asn Ala Glu Asp Tyr Phe Gly Asn Thr Pro Leu His Leu

210 215 220

Ala Ala Ser Tyr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala

225 230 235 240

Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Asp Tyr Gly Asn Thr Pro Leu His

245 250 255

Leu Ala Ala Asn Thr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys

260 265 270

Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala

275 280 285

Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln

290 295 300

Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr

305 310 315 320

Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys

325 330 335

Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu

340 345 350

Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Ser Thr Gly Trp Thr

355 360 365

Pro Leu His Leu Ala Ala Pro Trp Gly His Pro Glu Ile Val Glu Val

370 375 380

Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Gln Gly Trp

385 390 395 400

Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Ala Gly His Leu Glu Ile Val Glu

405 410 415

Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly

420 425 430

Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala

435 440 445

Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr

450 455 460

Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp

465 470 475 480

Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu

485 490 495

Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr

500 505 510

Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu Lys

515 520 525

Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

530 535 540

Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His Leu

545 550 555 560

Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln

565 570 575

Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly His

580 585 590

Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

595 600

<210> 140

<211> 636

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising four designed ankyrin repeat domains

<400> 140

Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln

1 5 10 15

Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

20 25 30

Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly

35 40 45

His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn

50 55 60

Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu

65 70 75 80

Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

85 90 95

Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp

100 105 110

Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser

115 120 125

Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr

130 135 140

Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala

145 150 155 160

Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala

165 170 175

Asp Val Asn Ala Lys Asp Arg Tyr Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala

180 185 190

Ala Asp Ile Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly

195 200 205

Ala Asp Val Asn Ala Glu Asp Tyr Phe Gly Asn Thr Pro Leu His Leu

210 215 220

Ala Ala Ser Tyr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala

225 230 235 240

Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Asp Tyr Gly Asn Thr Pro Leu His

245 250 255

Leu Ala Ala Asn Thr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys

260 265 270

Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala

275 280 285

Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln

290 295 300

Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr

305 310 315 320

Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys

325 330 335

Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu

340 345 350

Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr Leu Gly Trp Thr

355 360 365

Pro Leu His Leu Ala Ala His Glu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val

370 375 380

Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Val Ser Gly Tyr

385 390 395 400

Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Asp Gly His Leu Glu Ile Val Glu

405 410 415

Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Asn Thr Gly

420 425 430

Trp Thr Pro Leu His Leu Ser Ala Asp Leu Gly His Leu Glu Ile Val

435 440 445

Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe

450 455 460

Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn Gly Asn Glu Asp Leu

465 470 475 480

Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr

485 490 495

Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser

500 505 510

Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp

515 520 525

Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

530 535 540

Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu

545 550 555 560

Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

565 570 575

Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His

580 585 590

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

595 600 605

Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly

610 615 620

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

625 630 635

<210> 141

<211> 603

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising four designed ankyrin repeat domains

<400> 141

Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln

1 5 10 15

Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

20 25 30

Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly

35 40 45

His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn

50 55 60

Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu

65 70 75 80

Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

85 90 95

Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp

100 105 110

Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser

115 120 125

Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr

130 135 140

Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala

145 150 155 160

Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala

165 170 175

Asp Val Asn Ala Lys Asp Arg Tyr Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala

180 185 190

Ala Asp Ile Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly

195 200 205

Ala Asp Val Asn Ala Glu Asp Tyr Phe Gly Asn Thr Pro Leu His Leu

210 215 220

Ala Ala Ser Tyr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala

225 230 235 240

Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Asp Tyr Gly Asn Thr Pro Leu His

245 250 255

Leu Ala Ala Asn Thr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys

260 265 270

Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala

275 280 285

Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln

290 295 300

Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr

305 310 315 320

Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys

325 330 335

Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu

340 345 350

Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Ser Thr Gly Trp Thr

355 360 365

Pro Leu His Leu Ala Ala Pro Trp Gly His Pro Glu Ile Val Glu Val

370 375 380

Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Gln Gly Trp

385 390 395 400

Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Val Gly His Leu Glu Ile Val Glu

405 410 415

Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly

420 425 430

Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala

435 440 445

Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr

450 455 460

Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp

465 470 475 480

Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu

485 490 495

Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr

500 505 510

Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu Lys

515 520 525

Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

530 535 540

Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His Leu

545 550 555 560

Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln

565 570 575

Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly His

580 585 590

Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

595 600

<210> 142

<211> 603

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising four designed ankyrin repeat domains

<400> 142

Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln

1 5 10 15

Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

20 25 30

Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly

35 40 45

His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn

50 55 60

Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu

65 70 75 80

Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

85 90 95

Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp

100 105 110

Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser

115 120 125

Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr

130 135 140

Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala

145 150 155 160

Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala

165 170 175

Asp Val Asn Ala Lys Asp Arg Phe Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala

180 185 190

Ala Asp Ile Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly

195 200 205

Ala Asp Val Asn Ala Glu Asp Trp Phe Gly Asn Thr Pro Leu His Leu

210 215 220

Ala Ala Ser Met Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr

225 230 235 240

Gly Ala Asp Val Asn Ala Met Asp Asp Tyr Gly Asn Thr Pro Leu His

245 250 255

Leu Ala Ala Asn Thr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys

260 265 270

His Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe

275 280 285

Asp Ile Ser Ile Asp Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln

290 295 300

Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr

305 310 315 320

Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys

325 330 335

Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu

340 345 350

Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Ser Thr Gly Trp Thr

355 360 365

Pro Leu His Leu Ala Ala Pro Trp Gly His Pro Glu Ile Val Glu Val

370 375 380

Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Gln Gly Trp

385 390 395 400

Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Ala Gly His Leu Glu Ile Val Glu

405 410 415

Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly

420 425 430

Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala

435 440 445

Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr

450 455 460

Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp

465 470 475 480

Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu

485 490 495

Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr

500 505 510

Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu Lys

515 520 525

Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

530 535 540

Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His Leu

545 550 555 560

Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln

565 570 575

Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly His

580 585 590

Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

595 600

<210> 143

<211> 603

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising four designed ankyrin repeat domains

<400> 143

Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln

1 5 10 15

Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

20 25 30

Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly

35 40 45

His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn

50 55 60

Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu

65 70 75 80

Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

85 90 95

Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp

100 105 110

Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser

115 120 125

Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr

130 135 140

Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala

145 150 155 160

Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala

165 170 175

Asp Val Asn Ala Lys Asp Arg Tyr Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala

180 185 190

Ala Asp Ile Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly

195 200 205

Ala Asp Val Asn Ala Glu Asp Tyr Phe Gly Asn Thr Pro Leu His Leu

210 215 220

Ala Ala Ser Tyr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala

225 230 235 240

Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Asp Tyr Gly Asn Thr Pro Leu His

245 250 255

Leu Ala Ala Asn Thr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys

260 265 270

Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala

275 280 285

Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln

290 295 300

Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr

305 310 315 320

Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys

325 330 335

Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu

340 345 350

Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Ser Thr Gly Trp Thr

355 360 365

Pro Leu His Leu Ala Ala Pro Trp Gly His Pro Glu Ile Val Glu Val

370 375 380

Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Gln Gly Trp

385 390 395 400

Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Ala Gly His Leu Glu Ile Val Glu

405 410 415

Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly

420 425 430

Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala

435 440 445

Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr

450 455 460

Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp

465 470 475 480

Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu

485 490 495

Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr

500 505 510

Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu Lys

515 520 525

Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

530 535 540

Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His Leu

545 550 555 560

Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln

565 570 575

Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly His

580 585 590

Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

595 600

<210> 144

<211> 603

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising four designed ankyrin repeat domains

<400> 144

Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln

1 5 10 15

Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

20 25 30

Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly

35 40 45

His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn

50 55 60

Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp

65 70 75 80

Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

85 90 95

Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp

100 105 110

Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser

115 120 125

Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr

130 135 140

Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala

145 150 155 160

Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala

165 170 175

Asp Val Asn Ala Lys Asp Arg Tyr Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala

180 185 190

Ala Asp Ile Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly

195 200 205

Ala Asp Val Asn Ala Glu Asp Tyr Phe Gly Asn Thr Pro Leu His Leu

210 215 220

Ala Ala Ser Tyr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala

225 230 235 240

Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Asp Tyr Gly Asn Thr Pro Leu His

245 250 255

Leu Ala Ala Asn Thr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys

260 265 270

Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala

275 280 285

Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln

290 295 300

Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr

305 310 315 320

Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys

325 330 335

Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu