БЕЛОК, СВЯЗЫВАЮЩИЙСЯ С NKG2D, CD16 И С ОПУХОЛЕСПЕЦИФИЧЕСКИМ АНТИГЕНОМ Российский патент 2023 года по МПК A61K39/395 C07K16/28 C07K16/30 C07K16/46 C07K19/00 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА СВЯЗАННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Эта заявка испрашивает преимущество и приоритет предварительной патентной заявки США № 62/510137, поданной 23 мая 2017 г., предварительной патентной заявки США № 62/510168, поданной 23 мая 2017 г., предварительной патентной заявки США № 62/510169, поданной 23 мая 2017 г., предварительной патентной заявки США № 62/510167, поданной 23 мая 2017 г., и 62/539425, поданной 31 июля 2017 г., содержание каждой из которых настоящим включено в качестве ссылки в полном объеме для всех целей.

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[0002] Настоящая заявка содержит список последовательностей, который представлен в электронном виде в формате ASCII и включен в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. Указанная копия ASCII, созданная 21 мая 2018 года, имеет имя DFY-018WO.txt и имеет размер 144 кб.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0003] Изобретение относится к полиспецифическим связывающим белкам, которые связываются с NKG2D, CD16, и с опухолеспецифическим антигеном, выбранным из 5T4, GPNMB, FR-альфа, PAPP-A и GPC3.

Уровень техники

[0004] Злокачественное новообразование продолжает оставаться серьезной проблемой для здоровья, несмотря на значительные исследовательские усилия и научные достижения для лечения этого заболевания, о которых сообщается в литературе. Некоторые из наиболее часто диагностируемых видов злокачественных новообразований включают рак предстательной железы, рак молочной железы и рак легкого. Рак предстательной железы является наиболее распространенной формой злокачественных новообразований у мужчин. Рак молочной железы остается основной причиной смерти у женщин. Существующие методы лечения этих видов злокачественных новообразований не эффективны для всех пациентов и/или могут иметь существенные побочные эффекты. Другие виды злокачественных новообразований также остаются сложными для лечения с использованием существующих методов лечения.

[0005] Противоопухолевая иммунотерапия желательна, потому что она высокоспецифична и может способствовать разрушению опухолевых клеток с использованием собственной иммунной системы пациента. Слитые белки, такие как биспецифичные белки, рекрутирующие T-клетки, представляют собой противоопухолевые иммунотерапевтические средства, описанные в литературе, которые связываются с опухолевыми клетками и T-клетками для облегчения разрушения опухолевых клеток. Антитела, которые связываются с определенными опухолеспецифическими антигенами и с определенными иммунными клетками, описаны в литературе. См., например, WO 2016/134371 и WO 2015/095412.

[0006] Клетки-натуральные киллеры (NK) являются компонентом врожденной иммунной системы и составляют приблизительно 15% циркулирующих лимфоцитов. NK-клетки проникают практически во все ткани, и первоначально характеризовались своей способностью эффективно уничтожать опухолевые клетки без необходимости предварительной сенсибилизации. Активированные NK-клетки уничтожают клетки-мишени с помощью средств, аналогичных цитотоксическим Т-клеткам, то есть с помощью цитолитических гранул, которые содержат перфорин и гранзимы, а также посредством путей рецепторов клеточной смерти. Активированные NK-клетки также секретируют воспалительные цитокины, такие как IFN-γ и хемокины, которые способствуют рекрутингу других лейкоцитов в ткани-мишени.

[0007] NK-клетки реагируют на сигналы через различные активирующие и ингибирующие рецепторы на своей поверхности. Например, когда NK-клетки встречают здоровые аутоклетки, их активность ингибируется активацией иммуноглобулино-подобных рецепторов (KIR) клеток-киллеров. Альтернативно, когда NK-клетки встречают чужеродные клетки или опухолевые клетки, они активируются через свои активирующие рецепторы (например, NKG2D, NCR, DNAM1). NK-клетки также активируются константной областью некоторых иммуноглобулинов через рецепторы CD16 на их поверхности. Общая чувствительность NK-клеток к активации зависит от суммы стимулирующих и ингибирующих сигналов.

[0008] Человеческий трофобластный гликопротеин 5T4 представляет собой N-гликозилированный трансмембранепротеин. Его экспрессия механистически связана с направленным движением клеток через эпителиальный мезенхимальный переход, с облегчением хемотаксиса CXCL12/CXCR4 и блокированием канонического пути Wnt/бета-катенин, в то же время способствуя передаче сигналов неканонического пути. Эти процессы строго регулируются в процессе развития и в тканях взрослых, но они помогают стимулировать распространение опухолевых клеток. Было показано, что 5T4 имеет очень ограниченную экспрессию в нормальной ткани взрослого человека, но широко распространен во многих злокачественных новообразованиях, включая рак толстой кишки, рак яичников, немелкоклеточный рак легкого, рак почки и рак желудка.

[0009] Неметастатический гликопротеин b (GPNMB) представляет собой трансмембранный белок типа I, который проявляет гомологию с предшественником pmel17, меланоцит-специфическим белком. Сообщалось, что GPNMB экспрессируется в различных типах клеток, включая меланоциты, остеокласты, остеобласты, дендритные клетки. Кроме того, он высоко экспрессируется при различных типах злокачественных новообразований, включая меланому, рак молочной железы, включая трижды негативный рак молочной железы, остеосаркому и глиому/глиобластому. Было показано, что GPNMB способствует миграции, инвазии и метастазированию опухолевых клеток.

[0010] Достаточное потребление фолата необходимо в быстро пролиферирующих клетках для одноуглеродной метаболической реакции и биосинтеза, репарации и метилирования ДНК. Фолат может транспортироваться рецепторами фолата, из которых есть четыре члена гликополипептида (FRα, FRβ, FRγ и FRδ). Альфа-изоформа FR-альфа представляет собой гликозилфосфатидилинозитол (GPI)-заякоренный мембранный белок, обладающий высокой аффинностью, для связывания и координации транспорта активной формы фолата, 5-метилтетрагидрофолата (5-MTF). Сообщалось, что FR-альфа сверхэкспрессируется в солидных опухолях, таких как рак яичников, рак молочной железы, включая трижды негативный рак молочной железы, аденокарцинома легкого и опухоли эпителиального происхождения. С другой стороны, распределение FR-альфа в нормальных тканях человека ограничено низким уровнем экспрессии на апикальных поверхностях некоторых органов, таких как почка, легкое и сосудистое сплетение. Исследования показали, что сверхэкспрессия FR-альфа может способствовать росту опухолевых клеток благодаря механизмам, как связанным, так и не зависящим от поглощения фолиевой кислоты.

[0011] Связанный с беременностью белок плазмы-A (PAPPA) представляет собой металлопротеиназу цинка и расщепляет белки, связывающие инсулиноподобный фактор роста. Его протеолитическая функция активируется при связывании коллагена, и считается, что он участвует в локальных пролиферативных процессах, таких как заживление ран и ремоделирование кости. PAPP-A был вовлечен в несколько видов злокачественных новообразований, включая рак легких, молочной железы, яичников и саркому Юинга.

[0012] Глипикан-3 (GPC3), гепарансульфатпротеогликан, экспрессируется в человеческих эмбриональных тканях, но исчезает из большинства тканей взрослого человека, за исключением молочной железы. Несколько сообщений связывают GPC3 со злокачественным новообразованием. Сверхэкспрессия GPC3 была продемонстрирована при гепатоцеллюлярной карциноме, меланоме, опухоли Вильмса, опухоли желточного мешка, светлоклеточной карциноме яичника, раке желудка и раке пищевода.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0013] Изобретение относится к полиспецифическим связывающим белкам, которые связываются с рецептором NKG2D и рецептором CD16 на клетках-натуральных киллерах, и с опухолеспецифическим антигеном, выбранным из 5T4, GPNMB, FR-альфа, PAPP-A и GPC3. Такие белки могут взаимодействовать более чем с одним типом рецепторов, активирующих NK, и могут блокировать связывание природных лигандов с NKG2D. В некоторых вариантах осуществления белок может быть агонистом NK-клеток у людей. В некоторых вариантах осуществления белок может быть агонистом NK-клеток у людей и у других видов, таких как грызуны и яванские макаки. Различные аспекты и варианты осуществления изобретения описаны более подробно ниже.

[0014] Соответственно, один аспект изобретения относится к белку, который включает первый антигенсвязывающий сайт, который связывается с NKG2D; второй антигенсвязывающий сайт, который связывается с опухолеспецифическим антигеном, выбранным из 5T4, GPNMB, FR-альфа, PAPP-A и GPC3; и Fc-домен антитела, его часть, достаточную для связывания CD16, или третий антигенсвязывающий сайт, который связывается с CD16.

[0015] Каждый антигенсвязывающий сайт может включать вариабельный домен тяжелой цепи антитела и вариабельный домен легкой цепи антитела (например, расположенный как в антителе или слитый вместе с scFv), или один или более антигенсвязывающих сайтов могут быть однодоменным антителом, таким как антитело V_HH, такое как верблюжье антитело, или антитело V_NAR, подобное тем, которые обнаружены у хрящевых рыб.

[0016] В одном аспекте настоящее изобретение относится к полиспецифическим связывающим белкам, которые связываются с рецептором NKG2D и рецептором CD16 на клетках-натуральных киллерах, и к опухолеспецифическому антигену, выбранному из 5T4, GPNMB, FR-альфа, PAPP-A, и GPC3. NKG2D-связывающий сайт включает вариабельный домен тяжелой цепи, по меньшей мере, на 90% идентичный аминокислотной последовательности, выбранной из: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 85 и SEQ ID NO: 93.

[0017] Первый антигенсвязывающий сайт, который связывается с NKG2D, в некоторых вариантах осуществления может включать вариабельный домен тяжелой цепи, связанный с SEQ ID NO: 1, как например, благодаря присутствию аминокислотной последовательности по меньшей мере на 90% (например, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%), идентичной SEQ ID NO: 1, и/или включая аминокислотные последовательности, идентичные последовательностям CDR1 (SEQ ID NO: 105), CDR2 (SEQ ID NO: 106) и CDR3 (SEQ ID NO: 107) SEQ ID NO: 1. Вариабельный домен тяжелой цепи, связанный с SEQ ID NO: 1, может быть связан с различными вариабельными доменами легкой цепи с образованием сайта связывания NKG2D. Например, первый антигенсвязывающий сайт, который включает вариабельный домен тяжелой цепи, связанный с SEQ ID NO: 1, может дополнительно включать вариабельный домен легкой цепи, выбранный из любой из последовательностей, связанных с SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36 и 40. Например, первый антигенсвязывающий сайт включает вариабельный домен тяжелой цепи с аминокислотными последовательностями, по меньшей мере, на 90% (например, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичными SEQ ID NO: 1, и вариабельный домен легкой цепи с аминокислотными последовательностями, по меньшей мере, на 90% (например, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичными любой из последовательностей, выбранных из SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36 и 40.

[0018]Альтернативно, первый антигенсвязывающий сайт может включать вариабельный домен тяжелой цепи, связанный с SEQ ID NO: 41, и вариабельный домен легкой цепи, связанный с SEQ ID NO: 42. Например, вариабельный домен тяжелой цепи первого антигенсвязывающего сайта может быть, по меньшей мере, на 90% (например, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичен SEQ ID NO: 41 и/или включает аминокислотные последовательности, идентичные последовательностям CDR1 (SEQ ID NO: 43), CDR2 (SEQ ID NO: 44) и CDR3 (SEQ ID NO: 45) SEQ ID NO: 41. Аналогично, вариабельный домен легкой цепи второго антигенсвязывающего сайта может быть, по меньшей мере, на 90% (например, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичен SEQ ID NO: 42 и/или включает аминокислотные последовательности, идентичные последовательностям CDR1 (SEQ ID NO: 46), CDR2 (SEQ ID NO: 47) и CDR3 (SEQ ID NO: 48) SEQ ID NO: 42.

[0019] В других вариантах осуществления первый антигенсвязывающий сайт может включать вариабельный домен тяжелой цепи, связанный с SEQ ID NO: 49, и вариабельный домен легкой цепи, связанный с SEQ ID NO: 50. Например, вариабельный домен тяжелой цепи первого антигенсвязывающего сайта может быть, по меньшей мере, на 90% (например, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичен SEQ ID NO: 49 и/или включает аминокислотные последовательности, идентичные последовательностям CDR1 (SEQ ID NO: 51), CDR2 (SEQ ID NO: 52) и CDR3 (SEQ ID NO: 53) SEQ ID NO: 49. Аналогично, вариабельный домен легкой цепи второго антигенсвязывающего сайта может быть, по меньшей мере, на 90% (например, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичен SEQ ID NO: 50 и/или включает аминокислотные последовательности, идентичные последовательностям CDR1 (SEQ ID NO: 54), CDR2 (SEQ ID NO: 55) и CDR3 (SEQ ID NO: 56) SEQ ID NO: 50.

[0020] Альтернативно, первый антигенсвязывающий сайт может включать вариабельный домен тяжелой цепи, связанный с SEQ ID NO: 57, и вариабельный домен легкой цепи, связанный с SEQ ID NO: 58, например, путем наличия аминокислотных последовательностей, по меньшей мере, на 90% (например, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичных SEQ ID NO: 57 и SEQ ID NO: 58, соответственно. В другом варианте осуществления первый антигенсвязывающий сайт может включать вариабельный домен тяжелой цепи, связанный с SEQ ID NO: 59, и вариабельный домен легкой цепи, связанный с SEQ ID NO: 60. Например, вариабельный домен тяжелой цепи первого антигенсвязывающего сайта может быть, по меньшей мере, на 90% (например, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичен SEQ ID NO: 59 и/или включает аминокислотные последовательности, идентичные последовательностям CDR1 (SEQ ID NO: 186), CDR2 (SEQ ID NO: 187) и CDR3 (SEQ ID NO: 188) SEQ ID NO: 59. Аналогично, вариабельный домен легкой цепи второго антигенсвязывающего сайта может быть, по меньшей мере, на 90% (например, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичен SEQ ID NO: 60 и/или включает аминокислотные последовательности, идентичные последовательностям CDR1 (SEQ ID NO: 189), CDR2 (SEQ ID NO: 190) и CDR3 (SEQ ID NO: 191) последовательности SEQ ID NO: 60.

[0021] В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий сайт, который связывается с NKG2D, может включать вариабельный домен тяжелой цепи, связанный с SEQ ID NO: 61, и вариабельный домен легкой цепи, связанный с SEQ ID NO: 62. Например, вариабельный домен тяжелой цепи первого антигенсвязывающего сайта может быть, по меньшей мере, на 90% (например, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичен SEQ ID NO: 61 и/или включает аминокислотные последовательности, идентичные последовательностям CDR1 (SEQ ID NO: 63), CDR2 (SEQ ID NO: 64) и CDR3 (SEQ ID NO: 65) SEQ ID NO: 61. Аналогично, вариабельный домен легкой цепи второго антигенсвязывающего сайта может быть, по меньшей мере, на 90% (например, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичен SEQ ID NO: 62 и/или включает аминокислотные последовательности, идентичные CDR1 (SEQ ID NO: 66), CDR2 (SEQ ID NO: 67) и CDR3 (SEQ ID NO: 68) последовательности SEQ ID NO: 62. В других вариантах осуществления первый антигенсвязывающий сайт может включать вариабельный домен тяжелой цепи, связанный с SEQ ID NO: 69, и вариабельный домен легкой цепи, связанный с SEQ ID NO: 70. Например, вариабельный домен тяжелой цепи первого антигенсвязывающего сайта может быть, по меньшей мере, на 90% (например, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичен SEQ ID NO: 69 и/или включает аминокислотные последовательности, идентичные последовательностям CDR1 (SEQ ID NO: 71), CDR2 (SEQ ID NO: 72) и CDR3 (SEQ ID NO: 73) SEQ ID NO: 69. Аналогично, вариабельный домен легкой цепи второго антигенсвязывающего сайта может быть, по меньшей мере, на 90% (например, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичен SEQ ID NO: 70 и/или включает аминокислотные последовательности, идентичные последовательностям CDR1 (SEQ ID NO: 74), CDR2 (SEQ ID NO: 75) и CDR3 (SEQ ID NO: 76) SEQ ID NO: 70.

[0022] В других вариантах осуществления первый антигенсвязывающий сайт может включать вариабельный домен тяжелой цепи, связанный с SEQ ID NO: 77, и вариабельный домен легкой цепи, связанный с SEQ ID NO: 78. Например, вариабельный домен тяжелой цепи первого антигенсвязывающего сайта может быть, по меньшей мере, на 90% (например, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичен SEQ ID NO: 77 и/или включает аминокислотные последовательности, идентичные последовательностям CDR1 (SEQ ID NO: 79), CDR2 (SEQ ID NO: 80) и CDR3 (SEQ ID NO: 81) SEQ ID NO: 77. Аналогично, вариабельный домен легкой цепи второго антигенсвязывающего сайта может быть, по меньшей мере, на 90% (например, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичен SEQ ID NO: 78 и/или включает аминокислотные последовательности, идентичные последовательностям CDR1 (SEQ ID NO: 82), CDR2 (SEQ ID NO: 83) и CDR3 (SEQ ID NO: 84) SEQ ID NO: 78.

[0023] В других вариантах осуществления первый антигенсвязывающий сайт может включать вариабельный домен тяжелой цепи, связанный с SEQ ID NO: 85, и вариабельный домен легкой цепи, связанный с SEQ ID NO: 86. Например, вариабельный домен тяжелой цепи первого антигенсвязывающего сайта может быть, по меньшей мере, на 90% (например, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичен SEQ ID NO: 85 и/или включает аминокислотные последовательности, идентичные последовательностям CDR1 (SEQ ID NO: 87), CDR2 (SEQ ID NO: 88) и CDR3 (SEQ ID NO: 89) SEQ ID NO: 85. Аналогично, вариабельный домен легкой цепи второго антигенсвязывающего сайта может быть, по меньшей мере, на 90% (например, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичен SEQ ID NO: 86 и/или включает аминокислотные последовательности, идентичные последовательностям CDR1 (SEQ ID NO: 90), CDR2 (SEQ ID NO: 91) и CDR3 (SEQ ID NO: 92) SEQ ID NO: 86.

[0024] В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий сайт может включать вариабельный домен тяжелой цепи, связанный с SEQ ID NO: 93, и вариабельный домен легкой цепи, связанный с SEQ ID NO: 94. Например, вариабельный домен тяжелой цепи первого антигенсвязывающего сайта может быть, по меньшей мере, на 90% (например, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичен SEQ ID NO: 93 и/или включает аминокислотные последовательности, идентичные последовательностям CDR1 (SEQ ID NO: 95), CDR2 (SEQ ID NO: 96) и CDR3 (SEQ ID NO: 97) SEQ ID NO: 93. Аналогично, вариабельный домен легкой цепи второго антигенсвязывающего сайта может быть, по меньшей мере, на 90% (например, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичен SEQ ID NO: 94 и/или включает аминокислотные последовательности, идентичные последовательностям CDR1 (SEQ ID NO: 98), CDR2 (SEQ ID NO: 99) и CDR3 (SEQ ID NO: 100) последовательности SEQ ID NO: 94.

[0025] В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий сайт может включать вариабельный домен тяжелой цепи, связанный с SEQ ID NO: 101, и вариабельный домен легкой цепи, связанный с SEQ ID NO: 102, как например, путем наличия последовательностей, по меньшей мере, на 90% (например, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичных SEQ ID NO: 101 и по меньшей мере, на 90% (например, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичных SEQ ID NO: 102, соответственно. В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий сайт может включать вариабельный домен тяжелой цепи, связанный с SEQ ID NO: 103, и вариабельный домен легкой цепи, связанный с SEQ ID NO: 104, как например путем наличия последовательностей, по меньшей мере, на 90% (например, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичных SEQ ID NO: 103 и , по меньшей мере, на 90% (например, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичных SEQ ID NO: 104, соответственно.

[0026] В некоторых вариантах осуществления второй антигенсвязывающий сайт, связывающийся с 5T4, может включать вариабельный домен тяжелой цепи, связанный с SEQ ID NO: 109, и вариабельный домен легкой цепи, связанный с SEQ ID NO: 113. Например, вариабельный домен тяжелой цепи второго антигенсвязывающего сайта может быть, по меньшей мере, на 90% (например, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичен SEQ ID NO: 109 и/или включает аминокислотные последовательности, идентичные последовательностям CDR1 (SEQ ID NO: 110), CDR2 (SEQ ID NO: 111) и CDR3 (SEQ ID NO: 112) последовательности SEQ ID NO: 109. Аналогично, вариабельный домен легкой цепи второго антигенсвязывающего сайта может быть, по меньшей мере, на 90% (например, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичен SEQ ID NO: 113 и/или включает аминокислотные последовательности, идентичные последовательностям CDR1 (SEQ ID NO: 114), CDR2 (SEQ ID NO: 115) и CDR3 (SEQ ID NO: 116) последовательности SEQ ID NO: 113.

[0027] Альтернативно, второй антигенсвязывающий сайт, связывающийся с 5T4, может включать вариабельный домен тяжелой цепи, связанный с SEQ ID NO: 117, и вариабельный домен легкой цепи, связанный с SEQ ID NO: 121. Например, вариабельный домен тяжелой цепи второго антигенсвязывающего сайта может быть, по меньшей мере, на 90% (например, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичен SEQ ID NO: 117 и/или включает аминокислотные последовательности, идентичные CDR1 (SEQ ID NO: 118), CDR2 (SEQ ID NO: 119) и CDR3 (SEQ ID NO: 120) последовательности SEQ ID NO: 117. Аналогично, вариабельный домен легкой цепи второго антигенсвязывающего сайта может быть, по меньшей мере, на 90% (например, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичен SEQ ID NO: 121 и/или включает аминокислотные последовательности, идентичные CDR1 (SEQ ID NO: 122), CDR2 (SEQ ID NO: 123) и CDR3 (SEQ ID NO: 124) последовательности SEQ ID NO: 121.

[0028] Второй антигенсвязывающий сайт, связывающийся с 5T4, необязательно может включать вариабельный домен тяжелой цепи, связанный с SEQ ID NO: 125, и вариабельный домен легкой цепи, связанный с SEQ ID NO: 129. Например, вариабельный домен тяжелой цепи второго антигенсвязывающего сайта может быть, по меньшей мере, на 90% (например, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичен SEQ ID NO: 125 и/или включает аминокислотные последовательности, идентичные CDR1 (SEQ ID NO: 126), CDR2 (SEQ ID NO: 127) и CDR3 (SEQ ID NO: 128) последовательности SEQ ID NO: 125. Аналогично, вариабельный домен легкой цепи второго антигенсвязывающего сайта может быть, по меньшей мере, на 90% (например, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичен SEQ ID NO: 129 и/или включает аминокислотные последовательности, идентичные CDR1 (SEQ ID NO: 130), CDR2 (SEQ ID NO: 131) и CDR3 (SEQ ID NO: 132) последовательности SEQ ID NO: 129.

[0029] Второй антигенсвязывающий сайт, связывающийся с 5T4, необязательно может включать вариабельный домен тяжелой цепи, связанный с SEQ ID NO: 192, и вариабельный домен легкой цепи, связанный с SEQ ID NO: 196. Например, вариабельный домен тяжелой цепи второго антигенсвязывающего сайта может быть, по меньшей мере, на 90% (например, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичен SEQ ID NO: 192 и/или включает аминокислотные последовательности, идентичные CDR1 (SEQ ID NO: 193), CDR2 (SEQ ID NO: 194) и CDR3 (SEQ ID NO: 195) последовательности SEQ ID NO: 192. Аналогично, вариабельный домен легкой цепи второго антигенсвязывающего сайта может быть, по меньшей мере, на 90% (например, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичен SEQ ID NO: 196 и/или включает аминокислотные последовательности, идентичные CDR1 (SEQ ID NO: 197), CDR2 (SEQ ID NO: 198) и CDR3 (SEQ ID NO: 199) последовательности SEQ ID NO: 196.

[0030] Второй антигенсвязывающий сайт, связывающийся с 5T4, необязательно может включать вариабельный домен тяжелой цепи, связанный с SEQ ID NO: 200, и вариабельный домен легкой цепи, связанный с SEQ ID NO: 204. Например, вариабельный домен тяжелой цепи второго антигенсвязывающего сайта может быть, по меньшей мере, на 90% (например, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичен SEQ ID NO: 200 и/или включает аминокислотные последовательности, идентичные CDR1 (SEQ ID NO: 201), CDR2 (SEQ ID NO: 202) и CDR3 (SEQ ID NO: 203) последовательности SEQ ID NO: 200. Аналогично, вариабельный домен легкой цепи второго антигенсвязывающего сайта может быть, по меньшей мере, на 90% (например, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичен SEQ ID NO: 204 и/или включает аминокислотные последовательности, идентичные CDR1 (SEQ ID NO: 205), CDR2 (SEQ ID NO: 206) и CDR3 (SEQ ID NO: 207) последовательности SEQ ID NO: 204.

[0031] В некоторых вариантах осуществления второй антигенсвязывающий сайт, связывающийся с GPNMB, необязательно может включать вариабельный домен тяжелой цепи, связанный с SEQ ID NO: 134, и вариабельный домен легкой цепи, связанный с SEQ ID NO: 138. Например, вариабельный домен тяжелой цепи второго антигенсвязывающего сайта может быть, по меньшей мере, на 90% (например, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичен SEQ ID NO: 134 и/или включает аминокислотные последовательности, идентичные CDR1 (SEQ ID NO: 135), CDR2 (SEQ ID NO: 136) и CDR3 (SEQ ID NO: 137) последовательности SEQ ID NO: 134. Аналогично, вариабельный домен легкой цепи второго антигенсвязывающего сайта может быть, по меньшей мере, на 90% (например, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичен SEQ ID NO: 138 и/или включает аминокислотные последовательности, идентичные CDR1 (SEQ ID NO: 139), CDR2 (SEQ ID NO: 140) и CDR3 (SEQ ID NO: 141) последовательности SEQ ID NO: 138. Альтернативно, второй антигенсвязывающий сайт, связывающийся с GPNMB, необязательно может включать вариабельный домен тяжелой цепи, связанный с SEQ ID NO: 142, и вариабельный домен легкой цепи, связанный с SEQ ID NO: 146. Например, вариабельный домен тяжелой цепи второго антигенсвязывающего сайта может быть, по меньшей мере, на 90% (например, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичен SEQ ID NO: 142 и/или включает аминокислотные последовательности, идентичные CDR1 (SEQ ID NO: 143), CDR2 (SEQ ID NO: 144) и CDR3 (SEQ ID NO: 145) последовательности SEQ ID NO: 142. Аналогично, вариабельный домен легкой цепи второго антигенсвязывающего сайта может быть, по меньшей мере, на 90% (например, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичен SEQ ID NO: 146 и/или включает аминокислотные последовательности, идентичные CDR1 (SEQ ID NO: 147), CDR2 (SEQ ID NO: 148) и CDR3 (SEQ ID NO: 149) последовательности SEQ ID NO: 146.

[0034] Альтернативно, второй антигенсвязывающий сайт, связывающийся с FR-альфа, необязательно может включать вариабельный домен тяжелой цепи, связанный с SEQ ID NO: 167, и вариабельный домен легкой цепи, связанный с SEQ ID NO: 171. Например, вариабельный домен тяжелой цепи второго антигенсвязывающего сайта может быть, по меньшей мере, на 90% (например, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичен SEQ ID NO: 167 и/или включает аминокислотные последовательности, идентичные CDR1 (SEQ ID NO: 168), CDR2 (SEQ ID NO: 169) и CDR3 (SEQ ID NO: 170) последовательности SEQ ID NO: 167. Аналогично, вариабельный домен легкой цепи второго антигенсвязывающего сайта может быть, по меньшей мере, на 90% (например, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичен SEQ ID NO: 171 и/или включает аминокислотные последовательности, идентичные CDR1 (SEQ ID NO: 172), CDR2 (SEQ ID NO: 173) и CDR3 (SEQ ID NO: 174) последовательности SEQ ID NO: 171.

[0035] В некоторых вариантах осуществления второй антигенсвязывающий сайт, связывающийся с GPC3, необязательно может включать вариабельный домен тяжелой цепи, связанный с SEQ ID NO: 177, и вариабельный домен легкой цепи, связанный с SEQ ID NO: 181. Например, вариабельный домен тяжелой цепи второго антигенсвязывающего сайта может быть, по меньшей мере, на 90% (например, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичен SEQ ID NO: 177 и/или включает аминокислотные последовательности, идентичные CDR1 (SEQ ID NO: 178), CDR2 (SEQ ID NO: 179) и CDR3 (SEQ ID NO: 180) последовательности SEQ ID NO: 177. Аналогично, вариабельный домен легкой цепи второго антигенсвязывающего сайта может быть, по меньшей мере, на 90% (например, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичен SEQ ID NO: 181 и/или включает аминокислотные последовательности, идентичные CDR1 (SEQ ID NO: 182), CDR2 (SEQ ID NO: 183) и CDR3 (SEQ ID NO: 184) последовательности SEQ ID NO: 181.

[0036] В некоторых вариантах осуществления второй антигенсвязывающий сайт включает вариабельный домен легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности вариабельного домена легкой цепи, присутствующей в первом антигенсвязывающем сайте.

[0037] В некоторых вариантах осуществления белок включает часть Fc-домена антитела, достаточную для связывания CD16, где Fc-домен антитела содержит шарнирные и CH2-домены и/или аминокислотные последовательности, по меньшей мере, на 90% идентичные аминокислотной последовательности 234-332 последовательности человеческого антитела IgG.

[0038] Предложены составы, содержащие один из этих белков; клетки, содержащие одну или более нуклеиновых кислот, экспрессирующих эти белки, и способы усиления гибели опухолевых клеток с использованием этих белков.

[0039] Другой аспект изобретения относится к способу лечения злокачественного новообразования у пациента. Способ включает введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества описанного в настоящем документе полиспецифичного связывающего белка. Злокачественные новообразования, подлежащие лечению с использованием 5T4-нацеленных полиспецифических связывающих белков, включают любое злокачественное новообразование, экспрессирующее 5T4, например, колоректальный рак, рак яичников, немелкоклеточный рак легких, рак почки и рак желудка. Злокачественные новообразования, подлежащие лечению с использованием GPNMB-нацеленных полиспецифических связывающих белков, включает любые злокачественные новообразования, которые экспрессируют GPNMB, например, меланому, рак молочной железы, включая трижды негативный рак молочной железы, остеосаркому, глиому и глиобластому. Рак, подлежащий лечению с использованием FR-альфа-нацеленных полиспецифических связывающих белков, включает любые злокачественные новообразования, которые экспрессируют FR-альфа, например рак яичников, рак молочной железы, включая трижды негативный рак молочной железы, аденокарциному легких и опухоли эпителиального происхождения. Рак, подлежащий лечению с использованием PAPP-A-нацеленных полиспецифических связывающих белков, включает любые виды злокачественные новообразования, которые экспрессируют PAPP-A, например, рак легких, рак молочной железы, рак простаты и саркому Юинга. Злокачественные новообразования, подлежащие лечению с использованием GPC3-нацеленных полиспецифических связывающих белков, любые злокачественные новообразования, которые экспрессируют GPC3, например, гепатоцеллюлярную карциному, меланому, опухоль Вильмса, опухоль желточного мешка, светлоклеточную карциному яичника, рак желудка и рак пищевода.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0040] ФИГ. 1 представляет гетеродимерное полиспецифическое антитело. Каждое плечо может представлять собой либо NKG2D-связывающий домен, либо связывающий домен для 5T4, GPNMB, FR-альфа, PAPP-A, или GPC3. В некоторых вариантах осуществления NKG2D- и антигенсвязывающие домены могут иметь общую легкую цепь.

[0041] ФИГ. 2 представляет гетеродимерное полиспецифическое антитело. Либо NKG2D-связывающий домен или связывающий домен для 5T4, GPNMB, FR-альфа, PAPP-A, или GPC3, может принимать формат scFv (правое плечо).

[0042] ФИГ. 3 представляет собой линейные графики, демонстрирующие аффинность связывания NKG2D-связывающих доменов (перечисленных в виде клонов) с рекомбинантным NKG2D человека в анализе ИФА.

[0043] ФИГ. 4 представляет собой линейные графики, демонстрирующие аффинность связывания NKG2D-связывающих доменов (перечисленных в виде клонов) с рекомбинантным NKG2D яванской макаки в анализе ИФА.

[0044] ФИГ. 5 представляет собой линейные графики, демонстрирующие аффинность связывания NKG2D-связывающих доменов (перечисленных в виде клонов) с рекомбинантным NKG2D мыши в анализе ИФА.

[0045] ФИГ. 6 представляет собой гистограммы, демонстрирующие с помощью проточной цитометрии связывание NKG2D-связывающих доменов (перечисленных в виде клонов) с клетками EL4, экспрессирующими NKG2D человека, демонстрируя кратное превышение средней интенсивности флуоресценции (MFI) относительно фона (FOB).

[0046] ФИГ. 7 представляет собой гистограммы, демонстрирующие с помощью проточной цитометрии связывание NKG2D-связывающих доменов (перечисленных в виде клонов) с клетками EL4, экспрессирующими мышиный NKG2D, демонстрируя кратное превышение средней интенсивности флуоресценции (MFI) относительно фона (FOB).

[0047] ФИГ. 8 представляет собой линейные графики, демонстрирующие специфическую аффинность связывания NKG2D-связывающих доменов (перечисленных в виде клонов) с рекомбинантным человеческим NKG2D-Fc путем конкуренции с природным лигандом ULBP-6.

[0048] ФИГ. 9 представляет собой линейные графики, демонстрирующие специфическую аффинность связывания NKG2D-связывающих доменов (перечисленных в виде клонов) с рекомбинантным человеческим NKG2D-Fc путем конкуренции с природным лигандом MICA.

[0049] ФИГ. 10 представляет собой линейные графики, демонстрирующие специфическую аффинность связывания NKG2D-связывающих доменов (перечисленных в виде клонов) с рекомбинантным мышиным NKG2D-Fc путем конкуренции с природным лигандом Rae-1 дельта.

[0050] ФИГ. 11 представляет собой гистограммы, показывающие активацию человеческого NKG2D посредством NKG2D-связывающих доменов (перечисленных в виде клонов) путем количественного определения процента TNF-α-положительных клеток, которые экспрессируют слитые белки человеческий NKG2D-CD3 дзета.

[0051] ФИГ. 12 представляет собой гистограммы, показывающие активацию мышиного NKG2D с помощью NKG2D-связывающих доменов (перечисленных в виде клонов) путем количественного определения процента TNF-α-положительных клеток, которые экспрессируют слитые белки мышиный NKG2D-CD3 дзета.

[0052] ФИГ. 13 представляет собой гистограммы, показывающие активацию человеческих NK-клеток NKG2D-связывающими доменами (перечислены в виде клонов).

[0053] ФИГ. 14 представляет собой гистограммы, показывающие активацию человеческих NK-клеток NKG2D-связывающими доменами (перечислены в виде клонов).

[0054] ФИГ. 15 представляет собой гистограммы, показывающие активацию мышиных NK-клеток NKG2D-связывающими доменами (перечислены в виде клонов).

[0055] ФИГ. 16 представляет собой гистограммы, показывающие активацию мышиных NK-клеток NKG2D-связывающими доменами (перечислены в виде клонов).

[0056] ФИГ. 17 представляет собой гистограммы, показывающие цитотоксический эффект NKG2D-связывающих доменов (перечисленных в виде клонов) в отношении опухолевых клеток.

[0057] ФИГ. 18 представляет собой гистограммы, показывающие температуру плавления NKG2D-связывающих доменов (перечисленных в виде клонов), измеренную с помощью дифференциальной сканирующей флуориметрии.

[0058] ФИГ. 19А-19С представляет собой гистограммы синергетической активации NK-клеток с использованием связывания CD16 и NKG2D. ФИГ. 19А демонстрирует уровень CD107a; ФИГ. 19В демонстрирует уровень IFN-γγ; ФИГ 19С демонстрирует уровень продуцирования CD107a и IFN-γ. Графики показывают среднее (n=2) ± SD. Данные представляют пять независимых экспериментов с использованием пяти разных здоровых доноров.

[0059] ФИГ. 20 представляет собой TriNKET в форме Triomab, которое представляет собой трифункциональное биспецифичное антитело, которое поддерживает IgG-подобную форму. Эта химера состоит из двух половинных антител, каждое с одной легкой и одной тяжелой цепью, которые происходят от двух родительских антител. Форма Triomab может представлять собой гетеродимерную конструкцию, содержащую 1/2 антитела крысы и 1/2 антитела мыши.

[0060] ФИГ. 21 представляет собой TriNKET в форме общей легкой цепи (LC) KiH, которая включает технологию «выступы-во-впадины» (KIH). KiH представляет собой гетеродимер, содержащий 2 Fab, связывающихся с мишенью 1 и 2, и Fc, стабилизированный мутациями гетеродимеризации. TriNKET в формате KiH может представлять собой гетеродимерную конструкцию с 2 Fab, связывающимися с мишенью 1 и мишенью 2, и содержит 2 различных тяжелых цепи и общую легкую цепь, которая спаривается с обеими тяжелыми цепями.

[0061] ФИГ. 22 представляет собой TriNKET в форме иммуноглобулина с двумя вариабельными доменами (DVD-Ig™), который объединяет домены, связывающиеся с мишенью двух моноклональных антител через гибкие встречающиеся в природе линкеры с получением четырехвалентной IgG-подобной молекулы. DVD-Ig™ представляет собой гомодимерную конструкцию, в которой вариабельный домен, нацеленный на антиген 2, слит с N-концом вариабельного домена Fab, нацеленного на антиген 1. Конструкция содержит нормальный Fc.

[0062] ФИГ. 23 представляет собой TriNKET в форме интерфейса ортогонального Fab (Орто-Fab), который представляет собой гетеродимерную конструкцию, которая содержит 2 Fab-фрагмента, связывающихся с мишенью 1 и мишенью 2, слитых с Fc. Спаривание LC-HC обеспечивается ортогональным интерфейсом. Гетеродимеризация обеспечивается мутациями в Fc.

[0063] ФИГ. 24 представляет собой TrinKET в формате 2-в-1 Ig.

[0064] ФИГ. 25 представляет собой TriNKET в форме ES, которая представляет собой гетеродимерную конструкцию, содержащую 2 различных Fab-фрагмента, связывающихся с мишенью 1 и мишенью 2, слитых с Fc. Гетеродимеризация обеспечивается мутациями электростатической регуляции в Fc.

[0065] ФИГ. 26 представляет собой TriNKET в форме с обменом Fab-фрагментами: антитела, которые обмениваются Fab-фрагментами путем замены тяжелой цепи и присоединенной легкой цепи (полу-молекулы) с парой тяжелых-легких цепей из другой молекулы, с получением биспецифичных антител. KiH представляет собой гетеродимер, содержащий 2 Fab, связывающихся с мишенью 1 и 2, и Fc, стабилизированный мутациями гетеродимеризации.

[0066] ФИГ. 27 представляет собой TriNKET в форме SEED Body, который представляет собой гетеродимер, содержащий 2 Fab-фрагмента, связывающихся с мишенью 1 и 2, и FC, стабилизированный мутациями гетеродимеризации.

[0067] ФИГ. 28 представляет собой TriNKET в форме LuZ-Y, в котором домен лейциновой застежки используется для индуцирования гетеродимеризации двух различных HC. LuZ-Y форма представляет собой гетеродимер, содержащий 2 разных scFab, связывающихся с мишенью 1 и 2, слитых с Fc. Гетеродимеризация обеспечивается благодаря мотивам лейциновой застежки, слитым с С-концом Fc.

[0068] ФИГ. 29 представляет собой TriNKET в форме Cov-X-Body.

[0069] ФИГ. 30A-30B - представляют собой TriNKET в формах κλ-Body, которые представляют собой гетеродимерные конструкции с двумя различными Fab, слитыми с Fc, стабилизированными мутациями гетеродимеризации: Fab 1, нацеленный на антиген 1, содержит каппа LC, а второй Fab, нацеленный на антиген 2, содержит лямбда LC. ФИГ. 30А является иллюстративным изображением одной формы κλ-Body; ФИГ. 30B является иллюстративным изображением другого κλ-Body.

[0070] ФИГ. 31 представляет собой гетеродимерную конструкцию Oasc-Fab, которая включает Fab, связывающийся с мишенью 1, и scFab, связывающийся с мишенью 2, слитые с Fc. Гетеродимеризация обеспечивается мутациями в Fc.

[0071] ФИГ. 32 представляет собой DuetMab, который представляет собой гетеродимерную конструкцию, содержащую 2 разных Fab, связывающихся с антигеном 1 и 2, и Fc, стабилизированный мутациями гетеродимеризации. Fab 1 и 2 содержат различные SS-мостики, которые обеспечивают правильное спаривание легкой цепи (LC) и тяжелой цепи (HC).

[0072] ФИГ. 33 представляет собой CrossmAb, который представляет собой гетеродимерную конструкцию с 2 различными Fab, связывающимися с мишенью 1 и 2, слитыми с Fc, стабилизированным гетеродимеризацией. Домены CL и CH1 и домены VH и VL переключаются, например, CH1 сливается в одной линии с VL, в то время как CL сливается в одной линии с VH.

[0073] ФИГ. 34 представляет собой Fit-Ig, который представляет собой гомодимерные конструкции, в которых Fab, связывающийся с антигеном 2, слит с N-концом HC Fab, который связывается с антигеном 1. Конструкция содержит Fc дикого типа.

[0074] ФИГ. 35 представляет собой кривую, демонстрирующую дозозависимое связывание 5T4-нацеленных TriNKET и 5T4 моноклональных антител (mAb) с NKG2D, экспрессируемым на клетках EL4.

[0075] ФИГ. 36 представляет собой кривую, демонстрирующую дозозависимое связывание 5T4-нацеленных TriNKET и 5T4 моноклональных антител (mAb) с NKG2D, экспрессируемым на первичных человеческих NK-клетках.

[0076] ФИГ. 37 представляет собой кривую, показывающую дозозависимое связывание 5T4-нацеленных TriNKET и 5T4 моноклональных антител (mAb) с 5T4, экспрессируемым на клетках рака поджелудочной железы человека BxPC3.

[0077] ФИГ. 38 представляет собой кривую связывания 5T4-нацеленных TriNKET и 5T4 моноклональных антител (mAb) c 5T4, экспрессируемым на клетках мелкоклеточного рака легких человека H146.

[0078] ФИГ. 39 представляет собой кривую связывания 5T4-нацеленных TriNKET и 5T4 моноклональных антител (mAb) с 5T4, экспрессируемым на клетках немелкоклеточного рака легких человека H1975.

[0079] ФИГ. 40 представляет собой кривую связывания 5T4-нацеленных TriNKET и 5T4 моноклональных антител (mAb) с 5T4, экспрессируемым на клетках рака толстой кишки человека HCT116.

[0080] ФИГ. 41 представляет собой кривую связывания 5T4-нацеленных TriNKET и 5T4 моноклональных антител (mAb) с 5T4, экспрессируемым на клетках рака молочной железы человека MCF7.

[0081] ФИГ. 42 представляет собой кривую дозозависимого связывания 5T4-нацеленных TriNKET и 5T4 моноклональных антител (mAb) с 5T4, экспрессируемым на клетках рака желудка человека N87.

[0082] ФИГ. 43А и ФИГ. 43B представляют собой гистограммы, демонстрирующие, что TriNKET опосредуют более высокий уровень цитотоксичности NK-клеток в отношении 5T4-экспрессирующих клеток немелкоклеточного рака легкого человека H1975, чем родительские моноклональные антитела против 5T4. 6,7 мкг/мл TriNKET или моноклональных антител использовали на ФИГ. 43А. 20 мкг/мл TriNKET или моноклональных антител использовали на ФИГ. 43В. Соотношение эффектор/мишень составляло 10:1.

[0083] ФИГ. 44 представляет собой кривую, демонстрирующую, что TriNKET опосредуют более высокий уровень цитотоксичности NK-клеток в отношении 5T4-экспрессирующих клеток рака молочной железы человека MCF7, чем родительские моноклональные антитела против 5T4. Соотношение эффектор/мишень составляло 10:1.

[0084] ФИГ. 45А и ФИГ. 45B представляют собой гистограммы, демонстрирующие, что TriNKET опосредуют более высокий уровень цитотоксичности NK-клеток в отношении 5T4-экспрессирующих клеток рака желудка человека N87, чем родительские моноклональные антитела против 5T4. Использовали 6,7 мкг/мл TriNKET или моноклональных антител. Соотношение эффектор/мишень составляло 10:1. Для экспериментов на ФИГ. 45А и ФИГ. 45B были использованы NK-клетки, полученные от разных здоровых доноров.

[0085] ФИГ. 46 представляет собой кривую доза-ответ, демонстрирующую, что TriNKET опосредуют более высокий уровень цитотоксичности NK-клеток по отношению к 5T4-экспрессирующим клеткам рака толстой кишки человека HCT116, чем родительские моноклональные антитела против 5T4. Соотношение эффектор/мишень составляло 10:1.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

[0086] Изобретение относится к полиспецифическим связывающим белкам, которые связываются с рецептором NKG2D и рецептором CD16 на клетках-натуральных киллерах и с опухолеспецифическим антигеном, выбранным из 5T4, GPNMB, FR-альфа, PAPP-A, и GPC3. В некоторых вариантах осуществления полиспецифические белки дополнительно включают дополнительный антигенсвязывающий сайт, который связывается с опухолеспецифическим антигеном. Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим такие полиспецифические связывающие белки, и к терапевтическим способам с использованием таких полиспецифических белков и фармацевтических композиций, для ьаких целей, как для лечения злокачественного новообразования. Различные аспекты изобретения изложены ниже в разделах; однако аспекты изобретения, описанные в одном конкретном разделе, не должны быть ограничены каким-либо конкретным разделом.

[0087] Чтобы облегчить понимание настоящего изобретения, ряд терминов и выражений определены ниже.

[0088] Термин в единственном числе, используемый в настоящем описании, означает «один или более» и включают множественное число, если контекст не является неподходящим.

[0089]Используемый в настоящем описании термин «антигенсвязывающий сайт» относится к части молекулы иммуноглобулина, которая участвует в связывании антигена. В антителах человека антигенсвязывающий сайт образуется аминокислотными остатками N-концевых вариабельных («V») областей тяжелой («H») и легкой («L») цепей. Три сильно расходящихся участка в V-областях тяжелой и легкой цепей называются «гипервариабельными областями», которые расположены между более консервативными фланкирующими участками, известными как «каркасные области» или «FR». Таким образом, термин «FR» относится к аминокислотным последовательностям, которые естественным образом находятся между и по соседству с гипервариабельными областями в иммуноглобулинах. В молекуле человеческого антитела три гипервариабельные области легкой цепи и три гипервариабельные области тяжелой цепи располагаются относительно друг друга в трехмерном пространстве с образованием антигенсвязывающей поверхности. Антигенсвязывающая поверхность комплементарна трехмерной поверхности связанного антигена, и три гипервариабельные области каждой из тяжелых и легких цепей обозначаются как «области, определяющие комплементарность» или «CDR». У некоторых животных, таких как верблюды и хрящевые рыбы, антигенсвязывающий сайт образован одной цепью антитела, образующей «однодоменное антитело». Антигенсвязывающие сайты могут существовать в интактном антителе, в антигенсвязывающем фрагменте антитела, который сохраняет антигенсвязывающую поверхность, или в рекомбинантном полипептиде, таком как scFv, с использованием пептидного линкера для соединения вариабельного домена тяжелой цепи с вариабельным доменом легкой цепи в одном полипептиде.

[0090] Используемый в настоящем описании термин «опухолеспецифический антиген» означает любой антиген, включая, но не ограничиваясь этим, белок, гликопротеин, ганглиозид, углевод, липид, который ассоциирован со злокачественным новообразованием. Такой антиген может экспрессироваться на злокачественных клетках или в микроокружении опухоли, как например, на кровеносных сосудах, ассоциированных с опухолью, внеклеточном матриксе, мезенхимальной строме или иммунных инфильтратах.

[0091] Используемые в настоящем описании термины «субъект» и «пациент» относятся к организму, подлежащему лечению способами и композициями, описанными в настоящем документе. Такие организмы предпочтительно включают, но не ограничиваются ими, млекопитающих (например, мышей, обезьян, лошадей, крупный рогатый скот, свиней, собак, кошек и тому подобное) и, более предпочтительно, включают человека.

[0092] Используемый в настоящем описании термин «эффективное количество» относится к количеству соединения (например, соединения по настоящему изобретению), достаточному для достижения полезных или желаемых результатов. Эффективное количество может быть введено за одно или более введений, применений или дозировок и не предназначено для ограничения конкретным составом или путем введения. Используемый в настоящем описании термин «лечение» включает любой эффект, например уменьшение, снижение, модуляцию, улучшение или устранение, которое приводит к улучшению состояния, заболевания, расстройства и т. п. или ослаблению его симптома.

[0093] Используемый в настоящем описании термин «фармацевтическая композиция» относится к комбинации активного агента с носителем, инертным или активным, что делает композицию особенно подходящей для диагностического или терапевтического применения in vivo или ex vivo.

[0094] Используемый в настоящем описании термин «фармацевтически приемлемый носитель» относится к любому из стандартных фармацевтических носителей, таких как фосфатно-буферный солевой раствор, вода, эмульсии (например, такие как эмульсии масло/вода или вода/масло) и различные типы смачивающих агентов. Композиции также могут включать стабилизаторы и консерванты. Для примеров носителей, стабилизаторов и адъювантов см., например, Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Ed., Mack Publ. Co., Easton, PA [1975].

[0095] Используемый в настоящем описании термин «фармацевтически приемлемая соль» относится к любой фармацевтически приемлемой соли (например, кислоты или основания) соединения по настоящему изобретению, которая при введении пациенту способна обеспечить соединение по настоящему изобретению или активный метаболит или его остаток. Как известно специалистам в данной области техники, «соли» соединений по настоящему изобретению могут быть получены из неорганических или органических кислот и оснований. Примеры кислот включают, но не ограничиваются ими, соляную, бромводородную, серную, азотную, хлорную, фумаровую, малеиновую, фосфорную, гликолевую, молочную, салициловую, янтарную, толуол-п-сульфоновую, винную, уксусную, лимонную, метансульфоновую, этансульфоновую, муравьиную, бензойную, малоновую, нафталин-2-сульфоновую, бензолсульфоновую кислота и тому подобное. Другие кислоты, такие как щавелевая кислота, хотя сами по себе они не являются фармацевтически приемлемыми, могут быть использованы при получении солей, полезных в качестве промежуточных соединений при получении соединений по изобретению и их фармацевтически приемлемых кислотно-аддитивных солей.

[0096] Примеры оснований включают, но не ограничиваются ими, гидроксиды щелочных металлов (например, натрия), гидроксиды щелочноземельных металлов (например, магния), аммиак и соединения формулы NW₄⁺, где W представляет собой C_1-4алкил и тому подобное.

[0097] Примеры солей включают, но не ограничиваются ими: ацетат, адипат, альгинат, аспартат, бензоат, бензолсульфонат, бисульфат, бутират, цитрат, камфорат, камфорсульфонат, циклопентанпропионат, диглюконат, додецилсульфат, этансульфонат, фумарат, флукогептаноат, глицерофосфат, гемисульфат, гептаноат, гексаноат, гидрохлорид, гидробромид, гидройодид, 2-гидроксиэтансульфонат, лактат, малеат, метансульфонат, 2-нафталинсульфонат, никотинат, оксалат, пальмоат, пектинат, персульфат, фенилпропионат, пикрат, пивалат, пропионат, сукцинат, тартрат, тиоцианат, тозилат, ундеканоат и тому подобное. Другие примеры солей включают анионы соединений по настоящему изобретению, соединенные с подходящим катионом, таким как Na⁺, NH₄⁺ и NW₄⁺ (где W представляет собой C_1-4алкильную группу), и тому подобное.

[0098] Для терапевтического применения соли соединений по настоящему изобретению рассматриваются как фармацевтически приемлемые. Однако соли кислот и оснований, которые не являются фармацевтически приемлемыми, также могут найти применение, например, при получении или очистке фармацевтически приемлемого соединения.

[0099] Во всем описании, где композиции описаны как имеющие, включающие или содержащие конкретные компоненты, или где процессы и способы описаны как имеющие, включающие или содержащие конкретные стадии, предполагается, что дополнительно существуют композиции по настоящему изобретению, которые состоят по существу или состоят из перечисленных компонентов и что существуют процессы и способы согласно настоящему изобретению, которые состоят по существу или состоят из перечисленных стадий обработки.

[0100] Как правило, если в композиции указан процент, то это процент по массе, если не указано иное. Кроме того, если переменная не сопровождается определением, то предыдущее определение переменной является приоритетным.

I. Белки

[0101] Изобретение относится к полиспецифическим связывающим белкам, которые связываются с рецептором NKG2D и рецептором CD16 на клетках-натуральных киллерах, И с опухолеспецифическим антигеном, выбранным из 5T4, GPNMB, FR-альфа, PAPP-A, и GPC3. Полиспецифические связывающие белки пригодны в фармацевтических композициях и терапевтических способах, описанных в настоящем документе. Связывание полиспецифического связывающего белка с рецептором NKG2D и рецептором CD16 на клетке-натуральном киллере усиливает активность клетки-натурального киллера в отношении разрушения опухолевых клеток, экспрессирующих антиген 5T4, GPNMB, FR-альфа, PAPP-A, и/или GPC3. Связывание полиспецифических связывающих белков с клетками, экспрессирующими 5T4, GPNMB, FR-альфа, PAPP-A, и GPC3 приводит к тому, что опухолевые клетки приближаются к клетке-натуральному киллеру, что облегчает прямое и косвенное разрушение опухолевых клеток клеткой-натуральным киллером. Дальнейшее описание некоторых примеров полиспецифических связывающих белков приведено ниже.

[0102] Первый компонент полиспецифических связывающих белков связывается с клетками, экспрессирующими рецептор NKG2D, которые могут включать, но не ограничиваются ими, NK-клетки, γδ T-клетки и CD8⁺ αβ T-клетки. При NKG2D-связывании полиспецифические связывающие белки могут блокировать природные лиганды, такие как ULBP6 и MICA, от связывания с NKG2D и активации рецепторов NKG2D.

[0103] Второй компонент полиспецифических связывающих белков связывается с 5T4, GPNMB, FR-альфа, PAPP-A, или GPC3. 5T4-экспрессирующие клетки могут быть обнаружены, например, при колоректальном раке, раке яичников, немелкоклеточном раке легкого, раке почки и раке желудка. GPNMB-экспрессирующие клетки могут быть обнаружены, например, при меланоме, раке молочной железы, включая трижды негативный рак молочной железы, остеосаркому, глиому и глиобластому. FR-альфа-экспрессирующие клетки могут быть обнаружены, например, при раке яичников, раке молочной железы, включая трижды негативный рак молочной железы, аденокарциному легкого и опухоли эпителиального происхождения. PAPP-A-экспрессирующие клетки могут быть обнаружены, например, при раке легких, раке молочной железы, раке яичников и саркоме Юинга. GPC3-экспрессирующие клетки могут быть обнаружены, например, в гепатоцеллюлярной карциноме, меланоме, опухоли Вильмса, опухоли желточного мешка, светлоклеточной карциноме яичника, раке желудка и раке пищевода.

[0104] Третий компонент для полиспецифических связывающих белков связывается с клетками, экспрессирующими CD16, Fc-рецептор на поверхности лейкоцитов, включая клетки-натуральные киллеры, макрофаги, нейтрофилы, эозинофилы, тучные клетки и фолликулярные дендритные клетки.

[0105] Описанные в настоящем документе полиспецифические связывающие белки могут принимать различные форматы. Например, один формат представляет собой гетеродимерное полиспецифическое антитело, которое включает первую тяжелую цепь иммуноглобулина, первую легкую цепь иммуноглобулина и вторую тяжелую цепь иммуноглобулина и вторую легкую цепь иммуноглобулина (ФИГ. 1). Первая тяжелая цепь иммуноглобулина включает первый Fc-домен (шарнир-CH2-CH3), первый вариабельный домен тяжелой цепи и необязательный первый домен CH1 тяжелой цепи. Первая легкая цепь иммуноглобулина включает первый вариабельный домен легкой цепи и первый константный домен легкой цепи. Первая легкая цепь иммуноглобулина вместе с первой тяжелой цепью иммуноглобулина образует антигенсвязывающий сайт, который связывается с NKG2D. Вторая тяжелая цепь иммуноглобулина содержит второй Fc-домен (шарнир-CH2-CH3), второй вариабельный домен тяжелой цепи и, необязательно, второй домен CH1 тяжелой цепи. Вторая легкая цепь иммуноглобулина включает второй вариабельный домен легкой цепи и второй константный домен легкой цепи. Вторая легкая цепь иммуноглобулина вместе со второй тяжелой цепью иммуноглобулина образует антигенсвязывающий сайт, который связывается с 5T4, GPNMB, FR-альфа, PAPP-A или GPC3. Первый Fc-домен и второй Fc-домен вместе могут связываться с CD16 (ФИГ.1). В некоторых вариантах осуществления первая легкая цепь иммуноглобулина идентична второй легкой цепи иммуноглобулина.

[0106] Другой примерный формат включает гетеродимерное полиспецифическое антитело, включающее первую тяжелую цепь иммуноглобулина, вторую тяжелую цепь иммуноглобулина и легкую цепь иммуноглобулина (ФИГ. 2). Первая тяжелая цепь иммуноглобулина включает первый Fc-домен (шарнир-CH2-CH3), слитый либо через линкер, либо за счет шарнира антитела с одноцепочечным вариабельным фрагментом (scFv), состоящим из вариабельного домена тяжелой цепи и вариабельного домена легкой цепи, которые спариваются и связываются с NKG2D или связываются с антигеном, выбранным из 5T4, GPNMB, FR-альфа, PAPP-A и GPC3. Вторая тяжелая цепь иммуноглобулина включает второй Fc-домен (шарнир-CH2-CH3), второй вариабельный домен тяжелой цепи и, необязательно, домен тяжелой цепи CH1. Легкая цепь иммуноглобулина включает вариабельный домен легкой цепи и константный домен легкой цепи. Вторая тяжелая цепь иммуноглобулина соединяется с легкой цепью иммуноглобулина и связывается с NKG2D или связывается с опухолеспецифическим антигеном, выбранным из 5T4, GPNMB, FR-альфа, PAPP-A и GPC3. Первый Fc-домен и второй Fc-домен вместе могут связываться с CD16 (ФИГ. 2).

[0107] Один или более дополнительных мотивов связывания могут быть слиты с С-концом домена СН3 константной области, необязательно через линкерную последовательность. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий сайт может представлять собой одноцепочечную или стабилизированную дисульфидной цепью вариабельную область (scFv), или может образовывать четырехвалентную или трехвалентную молекулу.

[0108] В некоторых вариантах осуществления полиспецифический связывающий белок находится в форме Triomab, который представляет собой трифункциональное биспецифичное антитело, которое поддерживает IgG-подобную форму. Эта химера состоит из двух половинных антител, каждое с одной легкой и одной тяжелой цепью, которые происходят от двух родительских антител.

[0109] В некоторых вариантах осуществления полиспецифический связывающий белок представляет собой форму с общей легкой цепью (LC) KiH, в которой используется технология «выступы во впадины» (KIH). KIH включает сконструированные домены CH3 для создания либо «выступа», либо «впадины» в каждой тяжелой цепи для содействия гетеродимеризации. Концепция технологии Fc «выступы-во-впадины (KiH)» заключалась в том, чтобы ввести «выступ» в одном домене CH3 (CH3A) путем замены небольшого остатка на объемный (например, T366W_CH3A в нумерации EU). Чтобы приспособить «выступ», на другом домене CH3 (CH3B) была создана комплементарная поверхность «впадины» путем замены ближайших соседних к выступу остатков на меньшие (т. е. T366S/L368A/Y407V_CH3B). Мутация «впадины» была оптимизирована путем структурно-управляемого скрининга фаговой библиотеки (Atwell S, Ridgway JB, Wells JA, Carter P. Stable heterodimers from remodeling the domain interface of a homodimer using a phage display library. Biol. (1997) 270(1):26-35). Рентгенокристаллические структуры вариантов KiH Fc (Elliott JM, Ultsch M, Lee J, Tong R, Takeda K, Spiess C, et al., Antiparallel conformation of knob and hole aglycosylated half-antibody homodimers is mediated by a CH2-CH3 hydrophobic interaction. J. Mol. Biol. (2014) 426(9):1947-57; Mimoto F, Kadono S, Katada H, Igawa T, Kamikawa T, Hattori K. Crystal structure of a novel asymmetrically engineered Fc variant with improved affinity for FcγRs. Mol. Immunol. (2014) 58 (1): 132-8) продемонстрировали, что гетеродимеризация термодинамически поддерживается гидрофобными взаимодействиями, обусловленными стерической комплементарностью в коровом интерфейсе между CH3-доменами, тогда как интерфейсы выступ-выступ и впадина-впадина не благоприятствуют гомодимеризация вследствие стерических помех и нарушения благоприятных взаимодействий, соответственно.

[0110] В некоторых вариантах осуществления полиспецифический связывающий белок находится в форме иммуноглобулина с двумя вариабельными доменами (DVD-Ig™), который объединяет домены связывания мишеней двух моноклональных антител через гибкие природные линкеры с получением четырехвалентной IgG-подобной молекулы.

[0111] В некоторых вариантах осуществления полиспецифический связывающий белок находится в форме ортогонального Fab-интерфейса (Орто-Fab). В подходе ortho-Fab IgG (Lewis SM, Wu X, Pustilnik A, Sereno A, Huang F, Rick HL, et al., Generation of bispecific IgG antibodies by structure-based design of an orthogonal Fab interface. Nat. Biotechnol. (2014) 32 (2): 191-8), региональный дизайн на основе структуры вводит комплементарные мутации в интерфейсе LC и HCVH-CH1 только в одном Fab без каких-либо изменений в другом Fab.

[0112] В некоторых вариантах осуществления полиспецифический связывающий белок имеет формат 2-в-1 Ig. В некоторых вариантах осуществления полиспецифический связывающий белок находится в форме ES, которая представляет собой гетеродимерную конструкцию, содержащую 2 различных Fab, связывающихся с мишенью 1 и мишенью 2, слитых с Fc. Гетеродимеризация обеспечивается мутациями электростатического взаимодействия в Fc.

[0113] В некоторых вариантах осуществления полиспецифический связывающий белок находится в форме κλ-Body, которая представляет собой гетеродимерные конструкции с 2 различными Fab, слитыми с Fc, стабилизированными мутациями гетеродимеризации: Fab1, нацеленный на антиген 1, содержит каппа-LC, тогда как второй Fab, нацеленный на антиген 2, содержит лямбда LC. ФИГ. 30А является примерным представлением одной формы κλ-Body; ФИГ. 30B является примерным представлением другого κλ-Body.

[0114] В некоторых вариантах осуществления полиспецифический связывающий белок находится в форме с обменом Fab-фрагментов (антитела, которые обмениваются Fab-фрагментами путем замены тяжелой цепи и присоединенной легкой цепи (полу-молекулы) на пару тяжелых-легких цепей из другой молекулы, что приводит к получению биспецифичных антител).

[0115] В некоторых вариантах осуществления полиспецифический связывающий белок имеет форму SEED Body. Сконструированная доменная платформа с обменом цепей (SEED) была разработана для генерирования асимметричных и биспецифичных антителоподобных молекул, что позволяет расширять терапевтические применения природных антител. Эта платформа, сконструированная белками, основана на обмене структурно родственных последовательностей иммуноглобулина в консервативных доменах СН3. Конструкция SEED позволяет эффективно генерировать гетеродимеры AG/GA, в то же время препятствуя гомодимеризации доменов AG и GA SEED CH3. (Muda M. et al., Protein Eng. Des. Sel. (2011, 24 (5): 447-54).

[0116] В некоторых вариантах осуществления полиспецифический связывающий белок находится в форме LuZ-Y, в которой домен лейциновой застежки используется для индуцирования гетеродимеризации двух разных HC. (Wranik, BJ. Et al., J. Biol. Chem. (2012), 287: 43331-9).

[0117] В некоторых вариантах осуществления полиспецифический связывающий белок находится в форме Cov-X-Body. В биспецифических CovX-Body два разных пептида соединяются вместе с использованием разветвленного азетидинонового линкера и сливаются с каркасным антителом в мягких условиях сайтспецифичным образом. В то время как фармакофоры отвечают за функциональную активность, каркас антител обеспечивает длительный период полужизни и Ig-подобное распределение. Фармакофоры могут быть химически оптимизированы или заменены другими фармакофорами для получения оптимизированных или уникальных биспецифичных антител. (Doppalapudi VR et al., PNAS (2010), 107 (52); 22611-22616).

[0118] В некоторых вариантах осуществления полиспецифический связывающий белок находится в гетеродимерной форме Oasc-Fab, которая включает Fab, связывающийся с мишенью 1, и scFab, связывающийся с мишенью 2, слитые с Fc. Гетеродимеризация обеспечивается мутациями в Fc.

[0119] В некоторых вариантах осуществления полиспецифический связывающий белок находится в форме DuetMab, которая представляет собой гетеродимерную конструкцию, содержащую 2 различных Fab, связывающихся с антигеном 1 и 2, и Fc, стабилизированный мутациями гетеродимеризации. Fab 1 и 2 содержат дифференциальные SS-мостики, которые обеспечивают правильное спаривание LC и HC.

[0120] В некоторых вариантах осуществления полиспецифический связывающий белок находится в форме CrossmAb, которая представляет собой гетеродимерную конструкцию с 2 различными Fab, связывающимися с мишенью 1 и 2, слитыми с Fc, стабилизированными гетеродимеризацией. Домены CL и CH1 и домены VH и VL переключаются, например, CH1 сливается в одной линии с VL, в то время как CL сливается в одной линии с VH.

[0121] В некоторых вариантах осуществления полиспецифический связывающий белок находится в форме Fit-Ig, которая представляет собой гомодимерные конструкции, где Fab, связывающийся с антигеном 2, слит с N-концом HC Fab, который связывается с антигеном 1. Конструкция содержит Fc дикого типа.

[0122] В Таблице 1 перечислены пептидные последовательности вариабельных доменов тяжелой цепи и вариабельных доменов легкой цепи, которые в комбинации могут связываться с NKG2D. NKG2D-связывающие домены могут различаться по своей аффинности связывания с NKG2D, тем не менее, все они активируют человеческие NKG2D и NK-клетки.

Таблица 1 Клоны Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи ADI-27705 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:1)
CDR1 (SEQ ID NO:105) -GSFSGYYWS
CDR2 (SEQ ID NO:106) -
EIDHSGSTNYNPSLKS
CDR3 (SEQ ID NO:107) -
ARARGPWSFDP DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSYPITFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:2) ADI-27724 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:3) EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPITFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:4) ADI-27740
(A40) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:5) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSIGSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYHSFYTFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:6) ADI-27741 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:7) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSIGSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQSNSYYTFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:8) ADI-27743 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:9) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSYPTFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:10) ADI-28153 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWGFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:11) ELQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSQSISSYLNWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDSATYYCQQSYDIPYTFGQGTKLEIK
(SEQ ID NO:12) ADI-28226
(C26) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:13) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYGSFPITFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:14) ADI-28154 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:15) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPDDFATYYCQQSKEVPWTFGQGTKVEIK
(SEQ ID NO:16) ADI-29399 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:17) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSFPTFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:18) ADI-29401 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:19) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSIGSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYDIYPTFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:20) ADI-29403 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:21) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYDSYPTFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:22) ADI-29405 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:23) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYGSFPTFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:24) ADI-29407 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:25) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYQSFPTFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:26) ADI-29419 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:27) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYSSFSTFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:28) ADI-29421 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:29) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYESYSTFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:30) ADI-29424 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:31) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYDSFITFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:32) ADI-29425 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:33) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYQSYPTFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:34) ADI-29426 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:35) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSIGSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYHSFPTFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:36) ADI-29429 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:37) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSIGSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYELYSYTFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:38) ADI-29447
(F47) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:39) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYDTFITFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:40) ADI-27727 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGDSSIRHAYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
(SEQ ID NO:41)
CDR1 (SEQ ID NO:43) -
GTFSSYAIS
CDR2 (SEQ ID NO:44) -
GIIPIFGTANYAQKFQG
CDR3 (SEQ ID NO:45) -
ARGDSSIRHAYYYYGMDV DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSTPITFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:42)
CDR1 (SEQ ID NO:46) -
KSSQSVLYSSNNKNYLA
CDR2 (SEQ ID NO:47) -
WASTRES
CDR3 (SEQ ID NO:48) -
QQYYSTPIT ADI-29443
(F43) QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGSDRFHPYFDYWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:49)
CDR1 (SEQ ID NO:51) -
GSISSSSYYWG
CDR2 (SEQ ID NO:52) -
SIYYSGSTYYNPSLKS
CDR3 (SEQ ID NO:53) -
ARGSDRFHPYFDY EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSRYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQFDTWPPTFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:50)
CDR1 (SEQ ID NO:54) -
RASQSVSRYLA
CDR2 (SEQ ID NO:55) -
DASNRAT
CDR3 (SEQ ID NO:56) -
QQFDTWPPT ADI-29404
(F04) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:57) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCEQYDSYPTFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:58) ADI-28200 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRGRKASGSFYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
(SEQ ID NO:59)
CDR1 (SEQ ID NO:186) - GTFSSYAIS
CDR2 (SEQ ID NO:187) - GIIPIFGTANYAQKFQG
CDR3 (SEQ ID NO:188) - ARRGRKASGSFYYYYGMDV DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCESSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKPLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYSYPYTFGQGTKLEIK
(SEQ ID NO:60)
CDR1 (SEQ ID NO:189) - ESSQSLLNSGNQKNYLT
CDR2 (SEQ ID NO:190) - WASTRES
CDR3 (SEQ ID NO:191) - QNDYSYPYT ADI-29379
(E79) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGAPNYGDTTHDYYYMDVWGKGTTVTVSS
(SEQ ID NO:61)
CDR1 (SEQ ID NO:63) - YTFTSYYMH
CDR2 (SEQ ID NO:64) - IINPSGGSTSYAQKFQG
CDR3 (SEQ ID NO:65) - ARGAPNYGDTTHDYYYMDV EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYDDWPFTFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:62)
CDR1 (SEQ ID NO:66) - RASQSVSSNLA
CDR2 (SEQ ID NO:67) - GASTRAT
CDR3 (SEQ ID NO:68) - QQYDDWPFT ADI-29463
(F63) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDTGEYYDTDDHGMDVWGQGTTVTVSS
(SEQ ID NO:69)
CDR1 (SEQ ID NO:71) - YTFTGYYMH
CDR2 (SEQ ID NO:72) - WINPNSGGTNYAQKFQG
CDR3 (SEQ ID NO:73) - ARDTGEYYDTDDHGMDV EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQDDYWPPTFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:70)
CDR1 (SEQ ID NO:74) - RASQSVSSNLA
CDR2 (SEQ ID NO:75) - GASTRAT
CDR3 (SEQ ID NO:76) - QQDDYWPPT ADI-27744
(A44) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDGGYYDSGAGDYWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:77)
CDR1 (SEQ ID NO:79) - FTFSSYAMS
CDR2 (SEQ ID NO:80) - AISGSGGSTYYADSVKG
CDR3 (SEQ ID NO:81) - AKDGGYYDSGAGDY DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIDSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGVSYPRTFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:78)
CDR1 (SEQ ID NO:82) - RASQGIDSWLA
CDR2 (SEQ ID NO:83) - AASSLQS
CDR3 (SEQ ID NO:84) - QQGVSYPRT ADI-27749
(A49) EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGAPMGAAAGWFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:85)
CDR1 (SEQ ID NO:87) - FTFSSYSMN
CDR2 (SEQ ID NO:88) - SISSSSSYIYYADSVKG
CDR3 (SEQ ID NO:89) - ARGAPMGAAAGWFDP DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGVSFPRTFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:86)
CDR1 (SEQ ID NO:90) - RASQGISSWLA
CDR2 (SEQ ID NO:91) - AASSLQS
CDR3 (SEQ ID NO:92) - QQGVSFPRT ADI-29378
(E78) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREGAGFAYGMDYYYMDVWGKGTTVTVSS
(SEQ ID NO:93)
CDR1 (SEQ ID NO:95) - YTFTSYYMH
CDR2 (SEQ ID NO:96) - IINPSGGSTSYAQKFQG
CDR3 (SEQ ID NO:97) - AREGAGFAYGMDYYYMDV EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSDNWPFTFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:94)
CDR1 (SEQ ID NO:98) - RASQSVSSYLA
CDR2 (SEQ ID NO:99) - DASNRAT
CDR3 (SEQ ID NO:100) - QQSDNWPFT

[0123] Альтернативно, вариабельный домен тяжелой цепи, определенный SEQ ID NO: 101, может спариваться с вариабельным доменом легкой цепи, определенным SEQ ID NO: 102, с образованием антигенсвязывающего сайта, который может связываться с NKG2D, как проиллюстрировано в патенте США 9273136.

SEQ ID NO:101

QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAFIRYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRGLGDGTYFDYWGQGTTVTVSS

SEQ ID NO:102:

QSALTQPASVSGSPGQSITISCSGSSSNIGNNAVNWYQQLPGKAPKLLIYYDDLLPSGVSDRFSGSKSGTSAFLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGPVFGGGTKLTVL

[0124] Альтернативно, вариабельный домен тяжелой цепи, определенный SEQ ID NO: 103, может спариваться с вариабельным доменом легкой цепи, определенным SEQ ID NO: 104, с образованием антигенсвязывающего сайта, который может связываться с NKG2D, как проиллюстрировано в патенте США 7879985.

SEQ ID NO:103

QVHLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSDDSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGHISYSGSANYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCANWDDAFNIWGQGTMVTVSS

SEQ ID NO:104

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIK

[0125] В одном аспекте настоящее раскрытие относится к полиспецифическим связывающим белкам, которые связываются с рецептором NKG2D и рецептором CD16 на клетках-натуральных киллерах, и антигеном 5T4. В Таблице 2 перечислены некоторые иллюстративные последовательности вариабельных доменов тяжелой цепи и вариабельных доменов легкой цепи, которые в комбинации могут связываться с 5T4.

Таблица 2 Клоны Аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи Аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи 5T4 антитело
(публикация патента No. WO2006015882) EVQLQQSGPDLVKPGASVKISCKASGYSFTGYYMHWVKQSPGKGLEWIGRINPNNGVTLYNQKFKDKATLTVDKSSTTAYMELRSLTSEDSAVYYCARSTMITNYVMDYWGQGTSVTVSSA
(SEQ ID NO:109)
CDR1 (SEQ ID NO:110) - GYSFTGY
CDR2 (SEQ ID NO:111) - NPNNGV
CDR3 (SEQ ID NO:112) - STMITNYVMDY SIVMTQTPTSLLVSAGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGQSPKLLISYTSSRYAGVPDRFSGSGYGTDFTLTISSVQAEDAAVYFCQQDYNSPPTFGGGTKLEIKR
(SEQ ID NO:113)
CDR1(SEQ ID NO:114) - QSVSNDVA
CDR2 (SEQ ID NO:115) - YTSSRYA
CDR3 (SEQ ID NO:116) - QQDYNSPPT 5T4 антитело
(публикация патента США No. 20130011418) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNFGMNWVRQAPGKGLEWVAWINTNTGEPRYAEEFKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDWDGAYFFDYWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:117)
CDR1 (SEQ ID NO:118) - GYTFTNF
CDR2 (SEQ ID NO:119) - NTNTGE
CDR3 (SEQ ID NO:120) - DWDGAYFFDY DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGKAPKLLIYFATNRYTGVPSRFSGSGYGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYSSPWTFGQGTKVEIK
(SEQ ID NO:121)
CDR1 (SEQ ID NO:122) - QSVSNDVA
CDR2 (SEQ ID NO:123) - FATNRYT
CDR3 (SEQ ID NO:124) - QQDYSSPWT 5T4 антитело
(публикация патента No. WO2016022939) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTLSRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRYSNYVGWFDPWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:125)
CDR1 (SEQ ID NO:126) - GFTFSSYW
CDR2 (SEQ ID NO:127) - ISGSGGST
CDR3 (SEQ ID NO:128) - ARDRYSNYVGWFDP DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTLWTFGQGTKVEIK
(SEQ ID NO:129)
CDR1 (SEQ ID NO:130) - QSISSY
CDR2 (SEQ ID NO:131) - AAS
CDR3 (SEQ ID NO:132) - QQSYSTLWT 5T4 антитело (5T4A) (публикация патента No. WO2013041687) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWMNWVRQAPGKGLEWVGEIRLKSDKYATYYAESVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNNLKTEDTGVYYCARRRGYYGSAYGMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:192)
CDR1 (SEQ ID NO:193) - NYWMN
CDR2 (SEQ ID NO:194) - EIRLKSDKYATYYAESVKG
CDR3 (SEQ ID NO:195) - RRGYYGSAYGMDY DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKAPKILIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGKDFTFTISSLQPEDIATYYCLQYDFLPLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:196)
CDR1 (SEQ ID NO:197) - KASQDINSYLS
CDR2 (SEQ ID NO:198) - RANRLVD
CDR3 (SEQ ID NO:199) - LQYDFLPLT 5T4 антитело (5T4R) (публикация патента No. WO2017072207) EVHLLESGGGLVHPGGSLRLSCAASGFTFRSDAMHWVRQAPGKGLEWVSGVSGSGGSPYYADSVKGRFTISRDDSKTTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATGGSIAGSYYYYPMDVWGQGTTV TVSS (SEQ ID NO:200)
CDR1 (SEQ ID NO:201) - SDAMH
CDR2 (SEQ ID NO:202) - GVSGSGGSPYYADSVKG
CDR3 (SEQ ID NO:203) - GGSIAGSYYYYPMDV DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQIGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDFATYYCQQANSFPLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:204)
CDR1 (SEQ ID NO:205) - QASQDISNYLN
CDR2 (SEQ ID NO:206) - AASTLQI
CDR3 (SEQ ID NO:207) - QQANSFPLT

[0126] Альтернативно, новые антигенсвязывающие сайты, которые могут связываться с 5T4, могут быть идентифицированы путем скрининга на связывание с аминокислотной последовательностью, определенной SEQ ID NO: 133.

SEQ ID NO:133

MPGGCSRGPAAGDGRLRLARLALVLLGWVSSSSPTSSASSFSSSAPFLASAVSAQPPLPDQCPALCECSEAARTVKCVNRNLTEVPTDLPAYVRNLFLTGNQLAVLPAGAFARRPPLAELAALNLSGSRLDEVRAGAFEHLPSLRQLDLSHNPLADLSPFAFSGSNASVSAPSPLVELILNHIVPPEDERQNRSFEGMVVAALLAGRALQGLRRLELASNHFLYLPRDVLAQLPSLRHLDLSNNSLVSLTYVSFRNLTHLESLHLEDNALKVLHNGTLAELQGLPHIRVFLDNNPWVCDCHMADMVTWLKETEVVQGKDRLTCAYPEKMRNRVLLELNSADLDCDPILPPSLQTSYVFLGIVLALIGAIFLLVLYLNRKGIKKWMHNIRDACRDHMEGYHYRYEINADPRLTNLSSNSDV

[0127] В одном аспекте настоящее раскрытие относится к полиспецифическим связывающим белкам, которые связываются с рецептором NKG2D и рецептором CD16 на клетках-натуральных киллерах, и антигеном GPNMB. В Таблице 3 перечислены некоторые иллюстративные пептидные последовательности вариабельных доменов тяжелой цепи и вариабельных доменов легкой цепи, которые в комбинации могут связываться с GPNMB.

Таблица 3 Клоны Аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи Аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи GPNMB антитело
(публикация патента No. WO2006071441) QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSFNYYWSWIRHHPGKGLEWIGYIYYSGSTYSNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLTLSSVTAADTAVYYCARGYNWNYFDYWGQGTLVTVSSA
(SEQ ID NO:134)
CDR1 (SEQ ID NO:135) - GGSISSFNY
CDR2 (SEQ ID NO:136) -YYSGS
CDR3 (SEQ ID NO:137) -GYNWNYFDY EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVDNNLVWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNWPPWTFGQGTKVEIKR
(SEQ ID NO:138)
CDR1(SEQ ID NO:139) - QSVDNNLV
CDR2 (SEQ ID NO:140) -GASTRAT
CDR3 (SEQ ID NO:141) - QQYNNWPPWT GPNMB антитело
(Патент США No. 9115196) MAQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTPhrSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGPNTWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:142)
CDR1 (SEQ ID NO:143) - SSYAI
CDR2 (SEQ ID NO:144) - GIIPIFGTANYAQKFQG
CDR3 (SEQ ID NO:145) - GPNT LDVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVGAGDVGVYYCMETLQTHPTFGQGTKVGIKR
(SEQ ID NO:146)
CDR1 (SEQ ID NO:147) - RSSQSLLHSNGYNYLD
CDR2 (SEQ ID NO:148) - LGSNRAS
CDR3 (SEQ ID NO:149) - METLQTHPT

[0128] Альтернативно, новые антигенсвязывающие сайты, которые могут связываться с GPNMB, могут быть идентифицированы путем скрининга на связывание с аминокислотной последовательностью, определенной SEQ ID NO: 150.

SEQ ID NO:150

MECLYYFLGFLLLAARLPLDAAKRFHDVLGNERPSAYMREHNQLNGWSSDENDWNEKLYPVWKRGDMRWKNSWKGGRVQAVLTSDSPALVGSNITFAVNLIFPRCQKEDANGNIVYEKNCRNEAGLSADPYVYNWTAWSEDSDGENGTGQSHHNVFPDGKPFPHHPGWRRWNFIYVFHTLGQYFQKLGRCSVRVSVNTANVTLGPQLMEVTVYRRHGRAYVPIAQVKDVYVVTDQIPVFVTMFQKNDRNSSDETFLKDLPIMFDVLIHDPSHFLNYSTINYKWSFGDNTGLFVSTNHTVNHTYVLNGTFSLNLTVKAAAPGPCPPPPPPPRPSKPTPSLATTLKSYDSNTPGPAGDNPLELSRIPDENCQINRYGHFQATITIVEGILEVNIIQMTDVLMPVPWPESSLIDFVVTCQGSIPTEVCTIISDPTCEITQNTVCSPVDVDEMCLLTVRRTFNGSGTYCVNLTLGDDTSLALTSTLISVPDRDPASPLRMANSALISVGCLAIFVTVISLLVYKKHKEYNPIENSPGNVVRSKGLSVFLNRAKAVFFPGNQEKDPLLKNQEFKGVS

[0129] В одном аспекте настоящее раскрытие относится к полиспецифическим связывающим белкам, которые связываются с рецептором NKG2D и рецептором CD16 на клетках-натуральных киллерах, и антигеном FR-альфа. В Таблице 4 перечислены некоторые иллюстративные пептидные последовательности вариабельных доменов тяжелой цепи и вариабельных доменов легкой цепи, которые в комбинации могут связываться с FR-альфа.

Таблица 4 Клоны Аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи Аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи FR-альфа антитело
(Публикация патента No. WO2005080431) EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCSASGFTFSGYGLSWVRQAPGKGLEWVAMISSGGSYTYYADSVKGRFAISRDNAKNTLFLQMDSLRPEDTGVYFCARHGDDPAWFAYWGQGTPVTVSSA
(SEQ ID NO:151)
CDR1 (SEQ ID NO:152) - GFTFSGY
CDR2 (SEQ ID NO:153) - SSGGSY
CDR3 (SEQ ID NO:154) - HGDDPAWFAY DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSVSSSISSNNLHWYQQKPGKAPKPWIYGTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQWSSYPYMYTFGQGTKVEIKR
(SEQ ID NO:155)
CDR1(SEQ ID NO:156) - SSISSNNLH
CDR2 (SEQ ID NO:157) - GTSNLAS
CDR3 (SEQ ID NO:158) - QQWSSYPYMYT FR-альфа антитело
(Патент США No. 8557966) QVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKASGYTFTGYFMNWVKQSPGQSLEWIGRIHPYDGDTFYNQKFQGKATLTVDKSSNTAHMELLSLTSEDFAVYYCTRYDGSRAMDYWGQGTTVTVSSA
(SEQ ID NO:159)
CDR1 (SEQ ID NO:160) - GYTFTGY
CDR2 (SEQ ID NO:161) - HPYDGD
CDR3 (SEQ ID NO:162) - YDGSRAMDY DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPGQQPRLLIYRASNLEAGVPDRFSGSGSKTDFTLTISPVEAEDAATYYCQQSREYPYTFGGGTKLEIKR
(SEQ ID NO:163)
CDR1 (SEQ ID NO:164) - QSVSFAGTSLMH
CDR2 (SEQ ID NO:165) - RASNLEA
CDR3 (SEQ ID NO:166) - QQSREYPYT FR-альфа антитело
(Патент США No. 8388972) NVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTTSGFTFGDYAMIWARQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARERYDFWSGMDVWGKGTTVTVSS
(SEQ ID NO:167)
CDR1 (SEQ ID NO:168) - GFTFGDY
CDR2 (SEQ ID NO:169) - SSSSSY
CDR3 (SEQ ID NO:170) - ERYDFWSGMDV EIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSFLGINLIHWYQQKPGQPPKLLIYQASNKDTGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDTANYYCLQSKNFPPYTFGQGTKLEIKR
(SEQ ID NO:171)
CDR1 (SEQ ID NO:172) - ESVSFLGINLIH
CDR2 (SEQ ID NO:173) - QASNKDT
CDR3 (SEQ ID NO:174) - SKNFPPYT

[0130] Альтернативно, новые антигенсвязывающие сайты, которые могут связываться с FR-альфа, могут быть идентифицированы путем скрининга на связывание с аминокислотной последовательностью, определенной SEQ ID NO: 175.

SEQ ID NO:175

MAQRMTTQLLLLLVWVAVVGEAQTRIAWARTELLNVCMNAKHHKEKPGPEDKLHEQCRPWRKNACCSTNTSQEAHKDVSYLYRFNWNHCGEMAPACKRHFIQDTCLYECSPNLGPWIQQVDQSWRKERVLNVPLCKEDCEQWWEDCRTSYTCKSNWHKGWNWTSGFNKCAVGAACQPFHFYFPTPTVLCNEIWTHSYKVSNYSRGSGRCIQMWFDPAQGNPNEEVARFYAAAMSGAGPWAAWPFLLSLALMLLWLLS

[0131] Антигенсвязывающие сайты, которые связываются с PAPP-A, могут быть идентифицированы путем скрининга на связывание с аминокислотной последовательностью, определенной SEQ ID NO: 176.

SEQ ID NO:176

MRLWSWVLHLGLLSAALGCGLAERPRRARRDPRAGRPPRPAAGPATCATRAARGRRASPPPPPPPGGAWEAVRVPRRRQQREARGATEEPSPPSRALYFSGRGEQLRLRADLELPRDAFTLQVWLRAEGGQRSPAVITGLYDKCSYISRDRGWVVGIHTISDQDNKDPRYFFSLKTDRARQVTTINAHRSYLPGQWVYLAATYDGQFMKLYVNGAQVATSGEQVGGIFSPLTQKCKVLMLGGSALNHNYRGYIEHFSLWKVARTQREILSDMETHGAHTALPQLLLQENWDNVKHAWSPMKDGSSPKVEFSNAHGFLLDTSLEPPLCGQTLCDNTEVIASYNQLSSFRQPKVVRYRVVNLYEDDHKNPTVTREQVDFQHHQLAEAFKQYNISWELDVLEVSNSSLRRRLILANCDISKIGDENCDPECNHTLTGHDGGDCRHLRHPAFVKKQHNGVCDMDCNYERFNFDGGECCDPEITNVTQTCFDPDSPHRAYLDVNELKNILKLDGSTHLNIFFAKSSEEELAGVATWPWDKEALMHLGGIVLNPSFYGMPGHTHTMIHEIGHSLGLYHVFRGISEIQSCSDPCMETEPSFETGDLCNDTNPAPKHKSCGDPGPGNDTCGFHSFFNTPYNNFMSYADDDCTDSFTPNQVARMHCYLDLVYQGWQPSRKPAPVALAPQVLGHTTDSVTLEWFPPIDGHFFERELGSACHLCLEGRILVQYASNASSPMPCSPSGHWSPREAEGHPDVEQPCKSSVRTWSPNSAVNPHTVPPACPEPQGCYLELEFLYPLVPESLTIWVTFVSTDWDSSGAVNDIKLLAVSGKNISLGPQNVFCDVPLTIRLWDVGEEVYGIQIYTLDEHLEIDAAMLTSTADTPLCLQCKPLKYKVVRDPPLQMDVASILHLNRKFVDMDLNLGSVYQYWVITISGTEESEPSPAVTYIHGSGYCGDGIIQKDQGEQCDDMNKINGDGCSLFCRQEVSFNCIDEPSRCYFHDGDGVCEEFEQKTSIKDCGVYTPQGFLDQWASNASVSHQDQQCPGWVIIGQPAASQVCRTKVIDLSEGISQHAWYPCTISYPYSQLAQTTFWLRAYFSQPMVAAAVIVHLVTDGTYYGDQKQETISVQLLDTKDQSHDLGLHVLSCRNNPLIIPVVHDLSQPFYHSQAVRVSFSSPLVAISGVALRSFDNFDPVTLSSCQRGETYSPAEQSCVHFACEKTDCPELAVENASLNCSSSDRYHGAQCTVSCRTGYVLQIRRDDELIKSQTGPSVTVTCTEGKWNKQVACEPVDCSIPDHHQVYAASFSCPEGTTFGSQCSFQCRHPAQLKGNNSLLTCMEDGLWSFPEALCELMCLAPPPVPNADLQTARCRENKHKVGSFCKYKCKPGYHVPGSSRKSKKRAFKTQCTQDGSWQEGACVPVTCDPPPPKFHGLYQCTNGFQFNSECRIKCEDSDASQGLGSNVIHCRKDGTWNGSFHVCQEMQGQCSVPNELNSNLKLQCPDGYAIGSECATSCLDHNSESIILPMNVTVRDIPHWLNPTRVERVVCTAGLKWYPHPALIHCVKGCEPFMGDNYCDAINNRAFCNYDGGDCCTSTVKTKKVTPFPMSCDLQGDCACRDPQAQEHSRKDLRGYSHG

[0132] В одном аспекте настоящее раскрытие относится к полиспецифическим связывающим белкам, которые связываются с рецептором NKG2D и рецептором CD16 на клетках-натуральных киллерах, и антигеном GPC3. В Таблице 5 перечислены некоторые иллюстративные пептидные последовательности вариабельных доменов тяжелой цепи и вариабельных доменов легкой цепи, которые в комбинации могут связываться с GPC3.

Таблица 5 Клоны Аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи Аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи GPC3 антитело
(Публикация патента No. WO2004022739) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQAPGQGLEWMGALDPKTGDTAYSQKFKGRVTLTADKSTSTAYMELSSLTSEDTAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSSA
(SEQ ID NO:177)
CDR1 (SEQ ID NO:178 - GYTFTDY
CDR2 (SEQ ID NO:179) - DPKTGD
CDR3 (SEQ ID NO:180) - FYSYTY DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNRNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPPTFGQGTKLEIKR
(SEQ ID NO:181)
CDR1(SEQ ID NO:182) - QSLVHSNRNTYLH
CDR2 (SEQ ID NO:183) - KVSNRFS
CDR3 (SEQ ID NO:184) - SQNTHVPPT

[0133] Альтернативно, новые антигенсвязывающие сайты, которые могут связываться с GPC3, могут быть идентифицированы путем скрининга на связывание с аминокислотной последовательностью, определенной SEQ ID NO: 185.

SEQ ID NO:185

MAGTVRTACLVVAMLLSLDFPGQAQPPPPPPDATCHQVRSFFQRLQPGLKWVPETPVPGSDLQVCLPKGPTCCSRKMEEKYQLTARLNMEQLLQSASMELKFLIIQNAAVFQEAFEIVVRHAKNYTNAMFKNNYPSLTPQAFEFVGEFFTDVSLYILGSDINVDDMVNELFDSLFPVIYTQLMNPGLPDSALDINECLRGARRDLKVFGNFPKLIMTQVSKSLQVTRIFLQALNLGIEVINTTDHLKFSKDCGRMLTRMWYCSYCQGLMMVKPCGGYCNVVMQGCMAGVVEIDKYWREYILSLEELVNGMYRIYDMENVLLGLFSTIHDSIQYVQKNAGKLTTTIGKLCAHSQQRQYRSAYYPEDLFIDKKVLKVAHVEHEETLSSRRRELIQKLKSFISFYSALPGYICSHSPVAENDTLCWNGQELVERYSQKAARNGMKNQFNLHELKMKGPEPVVSQIIDKLKHINQLLRTMSMPKGRVLDKNLDEEGFESGDCGDDEDECIGGSGDGMIKVKNQLRFLAELAYDLDVDDAPGNSQQATPKDNEISTFHNLGNVHSPLKLLTSMAISVVCFFFLVH

[0134] Внутри Fc-домена связывание CD16 опосредуется шарнирной областью и доменом CH2. Например, в человеческом IgG1 взаимодействие с CD16, главным образом, сосредоточено на аминокислотных остатках Asp 265 - Glu 269, Asn 297 - Thr 299, Ala 327 - Ile 332, Leu 234 - Ser 239 и углеводном остатке N-ацетил-D -глюкозамин в домене СН2 (см. Sondermann et al., Nature, 406 (6793): 267-273). На основе известных доменов мутации могут быть выбраны для усиления или уменьшения аффинности связывания с CD16, например, с использованием представленных на фаге библиотек или библиотек кДНК, представленных на поверхности дрожжей, или могут быть сконструированы на основе известной трехмерной структуры взаимодействия.

[0135] Сборка гетеродимерных тяжелых цепей антител может быть осуществлена путем экспрессии двух разных последовательностей тяжелых цепей антител в одной и той же клетке, что может привести к сборке гомодимеров каждой тяжелой цепи антитела, а также сборке гетеродимеров. Стимулирование преимущественной сборки гетеродимеров может быть достигнуто путем включения различных мутаций в домен СН3 каждой константной области тяжелой цепи антитела, как показано в US13/494870, US16/028850, US11/533709, US12/875015, US13/289934, US14/773418, US12/811207, US13/866756, US14/647480, US14/830336. Например, мутации могут быть сделаны в домене CH3 на основе человеческого IgG1 и включают различные пары аминокислотных замен в первом полипептиде и втором полипептиде, которые позволяют этим двум цепям селективно гетеродимеризоваться друг с другом. Положения аминокислотных замен, показанные ниже, пронумерованы в соответствии с индексом EU, как в Kabat.

[0136] В одном сценарии аминокислотная замена в первом полипептиде заменяет исходную аминокислоту более крупной аминокислотой, выбранной из аргинина (R), фенилаланина (F), тирозина (Y) или триптофана (W) и, по меньшей мере, одна аминокислотная замена во втором полипептиде заменяет исходную аминокислоту (аминокислоты) меньшей аминокислотой(аминокислотами), выбранной из аланина (A), серина (S), треонина (T) или валина (V), так что более крупная аминокислотная замена (выпуклость) вписывается в поверхность более мелких аминокислотных замен (полость). Например, один полипептид может включать замену T366W, а другой может включать три замены, включая T366S, L368A и Y407V.

[0137] Вариабельный домен тяжелой цепи антитела по изобретению необязательно может быть связан с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере, на 90% идентичной константной области антитела, такой как константная область IgG, включая шарнирные домены, домены СН2 и СН3 с доменом СН1 или без него. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность константной области, по меньшей мере, на 90% идентична константной области человеческого антитела, такой как константная область человеческого IgG1, константная область IgG2, константная область IgG3 или константная область IgG4. В некоторых других вариантах осуществления аминокислотная последовательность константной области, по меньшей мере, на 90% идентична константной области антитела другого млекопитающего, такого как кролик, собака, кошка, мышь или лошадь. Одна или более мутаций могут быть включены в константную область по сравнению с константной областью человеческого IgG1, например, в Q347, Y349, L351, S354, E356, E357, K360, Q362, S364, T366, L368, K370, N390, K392, T394, D399, S400, D401, F405, Y407, K409, T411 и/или K439. Типичные замены включают, например, Q347E, Q347R, Y349S, Y349K, Y349T, Y349D, Y349E, Y349C, T350V, L351K, L351D, L351Y, S354C, E356K, E357Q, E357L, E357W, K360E, K360W, Q362E, S364K, S364E, S364H, S364D, T366V, T366I, T366L, T366M, T366K, T366W, T366S, L368E, L368A, L368D, K370S, N390D, N390E, K392L, K392M, K392V, K392F, K392D, K392E, T394F, T394W, D399R, D399K, D399V, S400K, S400R, D401K, F405A, F405T, Y407A, Y407I , Y407V, K409F, K409W, K409D, T411D, T411E, K439D, и K439E.

[0138] В некоторых вариантах осуществления мутации, которые могут быть включены в CH1 константной области человеческого IgG1, могут находиться в аминокислоте V125, F126, P127, T135, T139, A140, F170, P171 и/или V173. В некоторых вариантах осуществления мутации, которые могут быть включены в Cκ константной области человеческого IgG1, могут находиться в аминокислоте E123, F116, S176, V163, S174 и/или T164.

[0139] Альтернативно, аминокислотные замены могут быть выбраны из следующих наборов замен, показанных в Таблице 6.

Таблица 6 Первый полипептид Второй полипептид Набор 1 S364E/F405A Y349K/T394F Набор 2 S364H/D401K Y349T/T411E Набор 3 S364H/T394F Y349T/F405A Набор 4 S364E/T394F Y349K/F405A Набор 5 S364E/T411E Y349K/D401K Набор 6 S364D/T394F Y349K/F405A Набор 7 S364H/F405A Y349T/T394F Набор 8 S364K/E357Q L368D/K370S Набор 9 L368D/K370S S364K Набор 10 L368E/K370S S364K Набор 11 K360E/Q362E D401K Набор 12 L368D/K370S S364K/E357L Набор 13 K370S S364K/E357Q Набор 14 F405L K409R Набор 15 K409R F405L

[0140] Альтернативно, аминокислотные замены могут быть выбраны из следующих наборов замен, показанных в Таблице 7.

Таблица 7 Первый полипептид Второй полипептид Набор 1 K409W D399V/F405T Набор 2 Y349S E357W Набор 3 K360E Q347R Набор 4 K360E/K409W Q347R/D399V/F405T Набор 5 Q347E/K360E/K409W Q347R/D399V/F405T Набор 6 Y349S/K409W E357W/D399V/F405T

[0141] Альтернативно, аминокислотные замены могут быть выбраны из следующего набора замен, показанного в Таблице 8.

Таблица 8 Первый полипептид Второй полипептид Набор 1 T366K/L351K L351D/L368E Набор 2 T366K/L351K L351D/Y349E Набор 3 T366K/L351K L351D/Y349D Набор 4 T366K/L351K L351D/Y349E/L368E Набор 5 T366K/L351K L351D/Y349D/L368E Набор 6 E356K/D399K K392D/K409D

[0142] Альтернативно, по меньшей мере, одна аминокислотная замена в каждой полипептидной цепи может быть выбрана из Таблицы 9.

Таблица 9 Первый полипептид Второй полипептид L351Y, D399R, D399K, S400K, S400R, Y407A, Y407I, Y407V T366V, T366I, T366L, T366M, N390D, N390E, K392L, K392M, K392V, K392F K392D, K392E, K409F, K409W, T411D и T411E

[0143] Альтернативно, по меньшей мере, одна аминокислотная замена может быть выбрана из следующего набора замен в Таблице 10, где положение(я), указанное в столбце «Первый полипептид», заменено любой известной отрицательно заряженной аминокислотой, и положение(я), указанное в столбце «Второй полипептид», заменено любой известной положительно заряженной аминокислотой.

Таблица 10 Первый полипептид Второй полипептид K392, K370, K409, или K439 D399, E356, или E357

[0144] Альтернативно, по меньшей мере, одна аминокислотная замена может быть выбрана из следующего набора в Таблице 11, где положение(я), указанное в столбце «Первый полипептид», заменено любой известной положительно заряженной аминокислотой, и указанное положение(я), указанное в столбце «Второй полипептид», заменено любой известная отрицательно заряженной аминокислотой.

Таблица 11 Первый полипептид Второй полипептид D399, E356, или E357 K409, K439, K370, или K392

[0145] Альтернативно, аминокислотные замены могут быть выбраны из следующего набора в Таблице 12.

Таблица 12 Первый полипептид Второй полипептид T350V, L351Y, F405A, и Y407V T350V, T366L, K392L, и T394W

[0146] Альтернативно или дополнительно, структурная стабильность гетеромультимерного белка может быть повышена путем введения S354C либо на первой, либо на второй полипептидной цепи, и Y349C на противоположной полипептидной цепи, которая образует искусственный дисульфидный мостик внутри интерфейса двух полипептидов.

[0147] В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность одной полипептидной цепи константной области антитела отличается от аминокислотной последовательности константной области IgG1 в положении T366, и где аминокислотная последовательность другой полипептидной цепи константной области антитела отличается от аминокислотной последовательности константной области IgG1 в одном или более положениях, выбранных из группы, состоящей из T366, L368 и Y407.

[0148] В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность одной полипептидной цепи константной области антитела отличается от аминокислотной последовательности константной области IgG1 в одном или более положениях, выбранных из группы, состоящей из T366, L368 и Y407, и где аминокислотная последовательность другой полипептидной цепи константной области антитела отличается от аминокислотной последовательности константной области IgG1 в положении T366.

[0149] В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность одной полипептидной цепи константной области антитела отличается от аминокислотной последовательности константной области IgG1 в одном или более положениях, выбранных из группы, состоящей из E357, K360, Q362, S364, L368, K370, T394, D401, F405 и T411, и где аминокислотная последовательность другой полипептидной цепи константной области антитела отличается от аминокислотной последовательности константной области IgG1 в одном или более положениях, выбранных из группы, состоящей из Y349, E357 , S364, L368, K370, T394, D401, F405 и T411.

[0150] В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность одной полипептидной цепи константной области антитела отличается от аминокислотной последовательности константной области IgG1 в одном или более положениях, выбранных из группы, состоящей из Y349, E357, S364, L368, K370, T394, D401, F405 и T411, и где аминокислотная последовательность другой полипептидной цепи константной области антитела отличается от аминокислотной последовательности константной области IgG1 в одном или более положениях, выбранных из группы, состоящей из E357, K360, Q362, S364, L368, K370, T394, D401, F405 и T411.

[0151] В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность одной полипептидной цепи константной области антитела отличается от аминокислотной последовательности константной области IgG1 в одном или более положениях, выбранных из группы, состоящей из L351, D399, S400 и Y407, и где аминокислотная последовательность другой полипептидной цепи константной области антитела отличается от аминокислотной последовательности константной области IgG1 в одном или более положениях, выбранных из группы, состоящей из T366, N390, K392, K409 и T411.

[0152] В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность одной полипептидной цепи константной области антитела отличается от аминокислотной последовательности константной области IgG1 в одном или более положениях, выбранных из группы, состоящей из T366, N390, K392, K409 и T411, и где аминокислотная последовательность другой полипептидной цепи константной области антитела отличается от аминокислотной последовательности константной области IgG1 в одном или более положениях, выбранных из группы, состоящей из L351, D399, S400 и Y407.

[0153] В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность одной полипептидной цепи константной области антитела отличается от аминокислотной последовательности константной области IgG1 в одном или более положениях, выбранных из группы, состоящей из Q347, Y349, K360 и K409, и где аминокислотная последовательность другой полипептидной цепи константной области антитела отличается от аминокислотной последовательности константной области IgG1 в одном или более положениях, выбранных из группы, состоящей из Q347, E357, D399 и F405.

[0154] В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность одной полипептидной цепи константной области антитела отличается от аминокислотной последовательности константной области IgG1 в одном или более положениях, выбранных из группы, состоящей из Q347, E357, D399 и F405, и где аминокислотная последовательность другой полипептидной цепи константной области антитела отличается от аминокислотной последовательности константной области IgG1 в одном или более положениях, выбранных из группы, состоящей из Y349, K360, Q347 и K409.

[0155] В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность одной полипептидной цепи константной области антитела отличается от аминокислотной последовательности константной области IgG1 в одном или более положениях, выбранных из группы, состоящей из K370, K392, K409 и K439, и где аминокислотная последовательность другой полипептидной цепи константной области антитела отличается от аминокислотной последовательности константной области IgG1 в одном или более положениях, выбранных из группы, состоящей из D356, E357 и D399.

[0156] В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность одной полипептидной цепи константной области антитела отличается от аминокислотной последовательности константной области IgG1 в одном или более положениях, выбранных из группы, состоящей из D356, E357 и D399, и где аминокислотная последовательность другой полипептидной цепи константной области антитела отличается от аминокислотной последовательности константной области IgG1 в одном или более положениях, выбранных из группы, состоящей из K370, K392, K409 и K439.

[0157] В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность одной полипептидной цепи константной области антитела отличается от аминокислотной последовательности константной области IgG1 в одном или более положениях, выбранных из группы, состоящей из L351, E356, T366 и D399, и где аминокислотная последовательность другой полипептидной цепи константной области антитела отличается от аминокислотной последовательности константной области IgG1 в одном или более положениях, выбранных из группы, состоящей из Y349, L351, L368, K392 и K409.

[0158] В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность одной полипептидной цепи константной области антитела отличается от аминокислотной последовательности константной области IgG1 в одном или более положениях, выбранных из группы, состоящей из Y349, L351, L368, K392 и K409, и где аминокислотная последовательность другой полипептидной цепи константной области антитела отличается от аминокислотной последовательности константной области IgG1 в одном или более положениях, выбранных из группы, состоящей из L351, E356, T366 и D399.

[0159] В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность одной полипептидной цепи константной области антитела отличается от аминокислотной последовательности константной области IgG1 заменой S354C, и где аминокислотная последовательность другой полипептидной цепи константной области антитела отличается от аминокислотной последовательности константной области IgG1 заменой Y349C.

[0160] В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность одной полипептидной цепи константной области антитела отличается от аминокислотной последовательности константной области IgG1 заменой Y349C, и где аминокислотная последовательность другой полипептидной цепи константной области антитела отличается от аминокислотной последовательности константной области IgG1 заменой S354C.

[0161] В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность одной полипептидной цепи константной области антитела отличается от аминокислотной последовательности константной области IgG1 заменами K360E и K409W, и где аминокислотная последовательность другой полипептидной цепи константной области антитела отличается от аминокислотной последовательности константной области IgG1 заменами O347R, D399V и F405T.

[0162] В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность одной полипептидной цепи константной области антитела отличается от аминокислотной последовательности константной области IgG1 заменами O347R, D399V и F405T, и где аминокислотная последовательность другой полипептидной цепи константной области антитела отличается от аминокислотной последовательности константной области IgG1 заменами K360E и K409W.

[0163] В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность одной полипептидной цепи константной области антитела отличается от аминокислотной последовательности константной области IgG1 заменой T366W, и где аминокислотная последовательность другой полипептидной цепи константной области антитела отличается от аминокислотной последовательности константной области IgG1 заменами T366S, T368A и Y407V.

[0164] В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность одной полипептидной цепи константной области антитела отличается от аминокислотной последовательности константной области IgG1 заменами T366S, T368A и Y407V, и где аминокислотная последовательность другой полипептидной цепи константной области антитела отличается от аминокислотной последовательности константной области IgG1 заменой T366W.

[0165] В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность одной полипептидной цепи константной области антитела отличается от аминокислотной последовательности константной области IgG1 заменами T350V, L351Y, F405A и Y407V, и где аминокислотная последовательность другой полипептидной цепи константной области антитела отличается от аминокислотной последовательности константной области IgG1 заменами T350V, T366L, K392L и T394W.

[0166] В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность одной полипептидной цепи константной области антитела отличается от аминокислотной последовательности константной области IgG1 заменами T350V, T366L, K392L и T394W, и где аминокислотная последовательность другой полипептидной цепи константной области антитела отличается от аминокислотной последовательности константной области IgG1 заменами T350V, L351Y, F405A и Y407V.

[0167] Полиспецифические белки, описанные выше, могут быть получены с использованием технологии рекомбинантных ДНК, хорошо известных специалисту в данной области. Например, первая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая первую тяжелую цепь иммуноглобулина, может быть клонирована в первый экспрессирующий вектор; вторая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая вторую тяжелую цепь иммуноглобулина, может быть клонирована во второй экспрессирующий вектор; третью последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую легкую цепь иммуноглобулина, можно клонировать в третий экспрессирующий вектор; и первый, второй и третий экспрессирующие векторы могут стабильно трансфецироваться вместе в клетки-хозяева для продуцирования мультимерных белков.

[0168] Для достижения наибольшего выхода полиспецифического белка можно изучить различные соотношения первого, второго и третьего экспрессирующего вектора, чтобы определить оптимальное соотношение для трансфекции в клетки-хозяева. После трансфекции отдельные клоны могут быть выделены для генерации банка клеток с использованием методов, известных в данной области, таких как лимитированное разведение, ИФА, FACS, микроскопия или Clonepix.

[0169] Клоны можно культивировать в условиях, подходящих для масштабирования для биореактора и поддержания экспрессии полиспецифического белка. Полиспецифические белки могут быть выделены и очищены с использованием методов, известных в данной области, включая центрифугирование, глубинную фильтрацию, лизис клеток, гомогенизацию, замораживание-оттаивание, аффинную очистку, гель-фильтрацию, ионообменную хроматографию, обменную хроматографию гидрофобного взаимодействия и смешанный режим хроматографии.

II. Характеристика полиспецифических белков

[0170] Полиспецифические белки, описанные в настоящем документе, включают в себя NKG2D-связывающий сайт и CD16-связывающий сайт и опухолеспецифический антиген, выбранный из 5T4, GPNMB, FR-alpha, PAPP-A и GPC3. В некоторых вариантах осуществления полиспецифические белки связываются одновременно с клетками, экспрессирующими NKG2D и/или CD16, такими как NK-клетки, и опухолевыми клетками, экспрессирующими любой из вышеуказанных антигенов. Связывание полиспецифических белков с NK-клетками может повышать активность NK-клеток в отношении разрушения опухолевых клеток.

[0171] В некоторых вариантах осуществления полиспецифические белки связываются с опухолеспецифическим антигеном, выбранным из 5T4, GPNMB, FR-alpha, PAPP-A и GPC3 с аффинностью как у соответствующего моноклонального антитела. В некоторых вариантах осуществления полиспецифические белки более эффективны в уничтожении опухолевых клеток, экспрессирующих антигены, чем соответствующие родительские моноклональные антитела.

[0172] В некоторых вариантах осуществления описанные в настоящем документе полиспецифические белки, которые включают в себя NKG2D-связывающий сайт и связывающий сайт для опухолеспецифического антигена, выбранного из 5T4, GPNMB, FR-alpha, PAPP-A и GPC3, активировать первичные NK-клетки человека при совместном культивировании с клетками, экспрессирующими 5T4, GPNMB, FR-alpha, PAPP-A и GPC3, соответственно. Активация NK-клеток отмечена увеличением дегрануляции CD107a и продуцированием цитокинов IFNγ. Кроме того, по сравнению с соответствующим родительским моноклональным антителом, полиспецифические белки могут демонстрировать превосходную активацию человеческих NK-клеток в присутствии клеток, экспрессирующих 5T4, GPNMB, FR-alpha, PAPP-A и GPC3.

[0173] В некоторых вариантах осуществления описанные в настоящем документе полиспецифические белки, которые включают в себя NKG2D-связывающий сайт и связывающий сайт для опухолеспецифического антигена, выбранного из 5T4, GPNMB, FR-alpha, PAPP-A и GPC3, усиливают цитотоксическую активность покоящихся и IL-2-активированных NK-клеток человека при совместном культивировании с клетками, экспрессирующими 5T4, GPNMB, FR-alpha, PAPP-A и GPC3, соответственно.

[0174] В некоторых вариантах осуществления по сравнению с соответствующим родительским моноклональным антителом, которое связывается с 5Т4, GPNMB, FR-альфа, PAPP-A или GPC3, полиспецифичные белки обладают преимуществом в опосредовании цитотоксичности NK-клеток в отношении опухолевых клеток, которые экспрессируют 5T4, GPNMB, FR-альфа, PAPP-A и GPC3, на умеренном и низком уровне, соответственно.

III. Терапевтические применения

[0175] Изобретение относится к способам лечения злокачественного новообразования с использованием полиспецифического связывающего белка, описанного в настоящем документе, и/или к фармацевтической композиции, описанной в настоящем документе. Способы могут быть использованы для лечения различных видов злокачественных новообразований, клетки которых экспрессируют 5T4, GPNMB, FR-alpha, PAPP-A и GPC3. Примерами злокачественных новообразований, подлежащих лечению с помощью GPNMB-нацеленных полиспецифических связывающих белков, могут быть меланома, рак молочной железы, в том числе трижды негативный рак молочной железы, остеосаркома, глиома, орлиобластома. Примерами злокачественных новообразований, подлежащих лечению с помощью FR-альфа-нацеленных полиспецифических связывающих белков могут быть злокачественная меланома, рак предстательной железы, хронический лимфобластный лейкоз, гематологические злокачественные новообразования, рак яичников, трижды негативный рак молочной железы, немелкоклеточный рак легкого или колоректальный рак. Примерами злокачественных новообразований, подлежащих лечению с помощью PAPP-A-нацеленных полиспецифических связывающих белков, могут быть рак яичников, рак молочной железы, в том числе трижды негативный рак молочной железы, аденокарцинома легкого, опухоли эпителиального происхождения. Примерами злокачественных новообразований, подлежащих лечению с помощью GPC3-нацеленных полиспецифических связывающих белков, могут быть гепатоцеллюлярная карцинома, меланома, опухоль Вильмса, опухоль желточного мешка, светлоклеточная карцинома яичника, рак желудка, рак пищевода.

[0176] В некоторых других вариантах осуществления злокачественное новообразование, подлежащее лечению, включает рак мозга, ректальный рак, и рак матки. Еще в других вариантах осуществления злокачественное новообразование представляет собой плоскоклеточную карциному, аденокарциному, мелкоклеточную карциному, меланому, нейробластому, саркому (например, ангиосаркому или хондросаркому), рак гортани, рак околоушной железы, рак желчных путей, рак щитовидной железы, акрально-лентигинозную меланому, актинический кератоз, острый лимфоцитарный лейкоз, острый миелоидный лейкоз, аденоидно-кистозную карциному, аденому, аденосаркому, железисто-плоскоклеточную карциному, рак анального канала, анальный рак, ректальный рак, астроцитарную опухоль, карциному бартолиновой железы, базальноклеточную карциному, рак печени, рак костей, рак костного мозга, рак бронхов, карциному бронхиальной железы, карциноид, холангиокарциному, хондосаркому, хориодпапиллому/карциному, хронический лимфолейкоз, хронический миелоидный лейкоз, светлоклеточную карциному, рак соединительной ткани, цистаденому, рак пищеварительной системы, рак двенадцатиперстной кишки, рак эндокринной системы, опухоль эндодермальной пазухи, гиперплазию эндометрия, стромальную саркому эндометрия, эндометриоидную аденокарциному, эндотелиальный рак, эпендимальный рак, эпителиально-клеточный рак, саркому Юинга, рак глаз и глазной орбиты, рак женских половых органов, фокальную нодулярную гиперплазию, рак желчного пузыря, рак полости желудка, рак дна желудка, гастриному, глиобластому, глюкагоному, рак сердца, гемангибластомы, гемангиоэндотелиому, гемангиомы, печеночную аденому, печеночный аденоматоз, гепатобилиарный рак, гепатоцеллюлярную карциному, болезнь Ходжкина, рак подвздошной кишки, инсулиному, интраэпителиальную неоплазию, интраэпителиальную плоскоклеточную неоплазию, рак внутрипеченочных желчных протоков, инвазивную плоскоклеточную карциному, рак тонкой кишки, рак соединительной ткани, саркому Капоши, рак малого таза, крупноклеточный рак, рак толстой кишки, лейомиосаркому, лентиго-меланому, лимфому, рак мужских половых органов, злокачественную меланому, злокачественные мезотелиальные опухоли, медуллобластому, медуллоэпителиому, менингеальный рак, мезотелиальный рак, метастатический рак, рак полости рта, мукоэпидермоидную карциному, множественную миелому, рак мышц, рак носового канала, рак нервной системы, нейроэпителиальную аденокарциному, нодулярную меланому, неэпителиальный рак кожи, неходжкинскую лимфому, овсяно-клеточный рак, олигодендроглиальный рак, рак полости рта, остеосаркому, папиллярную серозную аденокарциному, опухоли гипофиза, плазмоцитому, псевдосаркому, легочную бластому, рак прямой кишки, почечно-клеточный рак, рак дыхательной системы, ретинобластому, рабдомиосаркому, саркому, серозную карциному, рак пазухи, рак кожи, мелкоклеточный рак, рак тонкого кишечника, рак мягких тканей, соматостатин-секретирующую опухоль, рак позвоночника, плоскоклеточную карциному, рак поперечно-полосатых мышц, субмезотелиальный рак, меланому поверхностного распространения, Т-клеточный лейкоз, рак языка, недифференцированный рак, рак мочеточника, рак мочеиспускательного канала, рак мочевого пузыря, рак мочеполовой системы, рак шейки матки, рак тела матки, увеальную меланому, рак влагалища, бородавчатый рак, Випому, рак вульвы, хорошо дифференцированную карциному или опухоль Вильмса.

[0177] В некоторых других вариантах осуществления злокачественное новообразование, подлежащее лечению, представляет собой неходжкинскую лимфому, такую как В-клеточная лимфома или Т-клеточная лимфома. В некоторых вариантах осуществления неходжкинская лимфома представляет собой В-клеточную лимфому, такую как диффузная крупноклеточная В-клеточная лимфома, первичная средостенная В-клеточная лимфома, фолликулярная лимфома, малкоклеточная лимфоцитарная лимфома, лимфома мантийных клеток, В-клеточная лимфома маргинальной зоны, B-клеточная лимфома экстранодальной маргинальной зоны, B-клеточная лимфома узловой маргинальной зоны, B-клеточная лимфома маргинальной зоны селезенки, лимфома Беркитта, лимфоплазмоцитарная лимфома, волосатоклеточный лейкоз или лимфома первичной центральной нервной системы (ЦНС). В некоторых других вариантах осуществления неходжкинская лимфома представляет собой Т-клеточную лимфому, такую как лимфобластная лимфома предшественников Т-клеток, периферическая Т-клеточная лимфома, кожная Т-клеточная лимфома, ангиоиммунобластная Т-клеточная лимфома, экстранодальная лимфома клеток-натуральных киллеров/Т-клеток, узловая Т-клеточная лимфома, кожная Т-клеточная лимфома, Т-клеточная лимфома энтеропатического типа, Т-клеточная лимфома типа подкожного панникулита, анапластическая крупноклеточная лимфома или узловая Т-клеточная лимфома.

IV. Комбинированная терапия

[0178] Еще один аспект изобретения предусматривает комбинированную терапию. Полиспецифический связывающий белок, описанный в настоящем документе, может использоваться в комбинации с дополнительными терапевтическими агентами для лечения злокачественного новообразования.

[0179] Типичные терапевтические агенты, которые могут быть использованы в качестве части комбинированной терапии при лечении злокачественного новообразования, включают, например, облучение, митомицин, третиноин, рибомустин, гемцитабин, винкристин, этопозид, кладрибин, митобронит, метотрексат, доксорубицин, карбоквон, пентостатин, нитракрин, зиностатин, цетрореликс, летрозол, ралтитрексед, даунорубицин, фадрозол, фотемустин, тималфазин, собузоксан, недаплатин, цитарабин, бикалутамид, винорелбина, веснаринон, аминоглютетимид, амсакрин, проглумид, эллиптиния ацетат, кетансерин, доксифлуридин, этретинат, изотретиноин, стрептозоцин, нимустин, виндезины, флутамид, дрогенил, бутоцин, кармофур, разоксан, сизофилан, карбоплатин, митолактол, тегафур, ифосфамид, преднимустин, пицибанил, левамизол, тенипозид, импросульфан, эноцитабин, лизурид, оксимететолон, тамоксифен, прогестерон, мепитиостан, эпитиостанол, форместан, интерферон альфа, интерферон-2 альфа, интерферон-бета, интерферон-гамма, колониестимулирующий фактор-1, колониестимулирующий фактор-2, денилейкин дифитокс, интерлейкин-2, фактор высвобождения лютеинизирующего гормона и вариации вышеупомянутых агентов, которые могут проявлять дифференциальное связывание с их родственным рецептором, а также увеличивать или уменьшать период полужизни в сыворотке.

[0180] Дополнительный класс агентов, которые могут быть использованы в качестве части комбинированной терапии при лечении злокачественного новообразования, относится к ингибиторам иммунной контрольной точки. Типичные ингибиторы иммунной контрольной точки включают агенты, которые ингибируют один или более из (i) антигена 4 (CTLA-4), ассоциированного с цитотоксическими Т-лимфоцитами, (ii) белка 1 программированной клеточной смерти (PD1), (iii) PDL1, (iv) LAG-3, (v) B7-H3, (vi) B7-H4 и (vii) TIM3. Ингибитор CTLA4 ипилимумаб был одобрен Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США для лечения меланомы.

[0181] Другие агенты, которые могут быть использованы в качестве части комбинированной терапии при лечении злокачественного новообразования, представляют собой агенты моноклональных антител, которые нацелены на мишени, отличные от контрольных точек (например, герцептин), и нецитотоксические агенты (например, ингибиторы тирозинкиназы).

[0182] Другие категории противоопухолевых агентов включают, например: (i) ингибитор, выбранный из ингибитора ALK, ингибитора ATR, антагониста A2A, ингибитора репарации исключения оснований, ингибитора Bcr-Abl тирозинкиназы, ингибитора тирозинкиназы Брутона, ингибитора CDC7, ингибитора CHK1, ингибитора циклин-зависимой киназы, ингибитора DNA-PK, ингибитора как DNA-PK, так и mTOR, ингибитора DNMT1, ингибитора DNMT1 плюс 2-хлор-дезоксиаденозин, ингибитора HDAC , ингибитора сигнального пути Hedgehog, ингибитора IDO, ингибитора JAK, ингибитора mTOR, ингибитора MEK, ингибитора MELK, ингибитора MTH1, ингибитора PARP, ингибитора фосфоинозитид-3-киназы, ингибитора обоих PARP1 и DHODH, протеосомного ингибитора, ингибитора топоизомеразы-II, ингибитора тирозинкиназы, ингибитора VEGFR и ингибитора WEE1; (ii) агонист OX40, CD137, CD40, GITR, CD27, HVEM, TNFRSF25 или ICOS; и (iii) цитокин, выбранный из IL-12, IL-15, GM-CSF и G-CSF.

[0183] Белки по изобретению также можно использовать в качестве дополнения к хирургическому удалению первичного поражения.

[0184] Количество полиспецифического связывающего белка и дополнительного терапевтического агента и относительные сроки введения могут быть выбраны для достижения желаемого комбинированного терапевтического эффекта. Например, при назначении комбинированной терапии пациенту, нуждающемуся в таком введении, терапевтические агенты в комбинации или фармацевтическую композицию или композиции, содержащие терапевтические агенты, можно вводить в любом порядке, таком как, например, последовательно, одновременно, вместе, одновременно и тому подобное. Кроме того, например, полиспецифический связывающий белок может быть введен в течение времени, когда дополнительный терапевтический агент(ы) оказывает свое профилактическое или терапевтическое действие, или наоборот.

V. Фармацевтические композиции

[0185] Настоящее раскрытие также относится к фармацевтическим композициям, которые содержат терапевтически эффективное количество белка, описанного в настоящем документе. Композиция может быть приготовлена для использования в различных системах доставки лекарственных средств. Одно или более физиологически приемлемых вспомогательных веществ или носителей также могут быть включены в композицию для подходящего состава. Подходящие составы для использования в настоящем раскрытии есть в Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 17th ed., 1985. Для краткого обзора способов доставки лекарственных средств см., например, Langer (Science 249: 1527-1533, 1990).

[0186] Композиция для внутривенной доставки лекарственного средства по настоящему изобретению может содержаться в пакете, ручке или шприце. В некоторых вариантах осуществления пакет может быть соединен с каналом, содержащим трубку и/или иглу. В определенных вариантах осуществления состав может представлять собой лиофилизированный состав или жидкий состав. В определенных вариантах осуществления состав может быть заморожен-высушен (лиофилизирован) и может содержаться примерно в 12-60 флаконах. В некоторых вариантах осуществления композиция может быть лиофилизирована, и 45 мг лиофилизированной композиции может содержаться в одном флаконе. В некоторых вариантах осуществления примерно 40-100 мг лиофилизированной композиции может содержаться в одном флаконе. В некоторых вариантах осуществления лиофилизированный состав из 12, 27 или 45 флаконов объединяют для получения терапевтической дозы белка в составе внутривенного лекарственного средства. В некоторых вариантах осуществления композиция может представлять собой жидкую композицию и храниться в концентрации примерно от 250 мг/флакон примерно до 1000 мг/флакон. В определенных вариантах осуществления композиция может представлять собой жидкую композицию и храниться в концентрации примерно 600 мг/флакон. В некоторых вариантах осуществления композиция может представлять собой жидкую композицию и храниться в концентрации примерно 250 мг/флакон.

[0187] Белки настоящего раскрытия может существовать в жидкой водной фармацевтической композиции, включающей терапевтически эффективное количество белка в буферном растворе с образованием композиции.

[0188] Эти композиции могут быть стерилизованы обычными методами стерилизации или могут быть стерильно отфильтрованы. Полученные водные растворы могут быть упакованы для использования как есть или лиофилизированы, причем лиофилизированный препарат объединяют со стерильным водным носителем перед введением. РН препаратов обычно составляет от 3 до 11, более предпочтительно от 5 до 9 или от 6 до 8, и наиболее предпочтительно от 7 до 8, например от 7 до 7,5. Полученные композиции в твердой форме могут быть упакованы в виде нескольких однодозовых единиц, каждая из которых содержит фиксированное количество вышеупомянутого агента или агентов. Композиция в твердой форме также может быть упакована в контейнер для гибкого количества.

[0189] В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие относится к составу с увеличенным сроком хранения, включающему белок по настоящему изобретению, в сочетании с маннитом, моногидратом лимонной кислоты, цитратом натрия, дигидратом динатрийфосфата, дигидратом дигидрофосфата натрия, хлоридом натрия, полисорбатом 80, вода и гидроксидом натрия.

[0190] В некоторых вариантах осуществления готовят водный состав, включающий белок по настоящему изобретению в рН-буферном растворе. Буфер данного изобретения может иметь рН в диапазоне примерно от 4 примерно до 8, например, примерно от 4,5 примерно до 6 или примерно от 4,8 примерно до 5,5, или может иметь рН примерно от 5 примерно до 5,2. Диапазоны, промежуточные по отношению к указанным выше значениям pH, также должны быть частью этого раскрытия. Например, диапазоны значений, использующие комбинацию любого из приведенных выше значений в качестве верхнего и/или нижнего пределов, предназначены для включения. Примеры буферов, которые будут контролировать рН в этом диапазоне, включают ацетатные (например, ацетат натрия), сукцинатные (такие как сукцинат натрия), глюконатные, гистидиновые, цитратные и другие буферы органических кислот.

[0191] В определенных вариантах осуществления композиция включает буферную систему, которая содержит цитрат и фосфат для поддержания рН в диапазоне примерно от 4 примерно до 8. В некоторых вариантах осуществления диапазон рН может составлять примерно от 4,5 примерно до 6, или примерно от рН 4,8 примерно до 5,5, или в диапазоне рН примерно от 5 примерно до 5,2. В некоторых вариантах осуществления буферная система включает моногидрат лимонной кислоты, цитрат натрия, дигидрат динатрийфосфата и/или дигидрат дигидрофосфата натрия. В некоторых вариантах осуществления буферная система включает в себя примерно 1,3 мг/мл лимонной кислоты (например, 1,305 мг/мл), примерно 0,3 мг/мл цитрата натрия (например, 0,305 мг/мл), примерно 1,5 мг/мл динатрийфосфата. дигидрат (например, 1,53 мг/мл), примерно 0,9 мг/мл дигидрата дигидрофосфата натрия (например, 0,86) и примерно 6,2 мг/мл хлорида натрия (например, 6,165 мг/мл). В некоторых вариантах осуществления буферная система включает от 1 до 1,5 мг/мл лимонной кислоты, от 0,25 до 0,5 мг/мл цитрата натрия, от 1,25 до 1,75 мг/мл дигидрата динатрийфосфата, от 0,7 до 1,1 мг/мл дигидрата дигидрофосфата натрия, и от 6 до 6,4 мг/мл хлорида натрия. В некоторых вариантах осуществления pH композиции доводят с помощью гидроксида натрия.

[0192] Полиол, который действует как тонизирующий агент и может стабилизировать антитело, также может быть включен в состав. Полиол добавляют к составу в количестве, которое может варьироваться в зависимости от желаемой изотоничности состава. В некоторых вариантах осуществления водная композиция может быть изотонической. Количество добавляемого полиола также может быть изменено по отношению к молекулярной массе полиола. Например, может быть добавлено меньшее количество моносахарида (например, маннита) по сравнению с дисахаридом (таким как трегалоза). В некоторых вариантах осуществления полиол, который может быть использован в составе в качестве средства для повышения тоничности, представляет собой маннит. В определенных вариантах осуществления концентрация маннита может составлять примерно от 5 примерно до 20 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления концентрация маннита может составлять примерно 7,5-15 мг/мл. В некоторых вариантах концентрация маннита может составлять примерно 10-14 мг/мл. В определенных вариантах концентрация маннита может составлять примерно 12 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления полиол сорбит может быть включен в состав.

[0193] Детергент или поверхностно-активное вещество также могут быть добавлены в состав. Типичные детергенты включают неионогенные детергенты, такие как полисорбаты (например, полисорбаты 20, 80 и т. д.) или полоксамеры (например, полоксамер 188). Количество добавляемого детергента таково, что оно уменьшает агрегацию антитела в составе и/или сводит к минимуму образование частиц в составе, и/или уменьшает адсорбцию. В определенных вариантах осуществления состав может включать поверхностно-активное вещество, которое представляет собой полисорбат. В некоторых вариантах осуществления композиция может содержать детергент полисорбат 80 или Tween 80. Tween 80 - это термин, используемый для описания полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеата (см. Fiedler, Lexikon der Hifsstoffe, Editio Cantor Verlag Aulendorf, 4th ed., 1996). В некоторых вариантах осуществления композиция может содержать примерно от 0,1 примерно до 10 мг/мл полисорбата 80 или примерно от 0,5 примерно до 5 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления в композицию можно добавлять примерно 0,1% полисорбата 80.

[0194] В некоторых вариантах осуществления белковый продукт по настоящему изобретению приготовлен в виде жидкой композиции. Жидкий состав может быть представлен в концентрации 10 мг/мл во флаконе любого типа USP/Ph Eur типа I 50R, закрытом резиновой пробкой и запечатанном с использованием алюминиевого обжимного уплотнения. Пробка может быть изготовлена из эластомера, соответствующего USP и Ph Eur. В некоторых вариантах осуществления флаконы могут быть заполнены 61,2 мл раствора белкового продукта, чтобы обеспечить экстрагируемый объем 60 мл. В некоторых вариантах осуществления жидкая композиция может быть разбавлена 0,9% солевым раствором.

[0195] В некоторых вариантах осуществления жидкая композиция белков по изобретению может быть приготовлена в виде раствора с концентрацией 10 мг/мл в комбинации с сахаром на стабилизирующем уровне. В некоторых вариантах осуществления жидкая композиция может быть приготовлена в водном носителе. В некоторых вариантах осуществления стабилизатор может быть добавлен в количестве, не превышающем того, которое может привести к вязкости, нежелательной или непригодной для внутривенного введения. В некоторых вариантах осуществления сахар может представлять собой дисахариды, например сахарозу. В некоторых вариантах осуществления жидкая композиция также может включать один или более из буферного агента, поверхностно-активного вещества и консерванта.

[0196] В некоторых вариантах осуществления pH жидкого состава может быть установлено путем добавления фармацевтически приемлемой кислоты и/или основания. В некоторых вариантах осуществления фармацевтически приемлемая кислота может представлять собой соляную кислоту. В некоторых вариантах осуществления основание может представлять собой гидроксид натрия.

[0197] В дополнение к агрегации, дезамидирование является распространенным вариантом продукта пептидов и белков, который может возникать во время ферментации, сбора/осветления клеток, очистки, хранения лекарственного вещества/лекарственного продукта и во время анализа образца. Дезамидирование представляет собой потерю NH₃ из белка с образованием промежуточного сукцинимида, который может подвергаться гидролизу. Промежуточный сукцинимид приводит к снижению массы исходного пептида на 17 дальтон. Последующий гидролиз приводит к увеличению массы на 18 дальтон. Выделение промежуточного сукцинимида затруднено из-за нестабильности в водных условиях. По существу, дезамидирование обычно определяется как увеличение массы на 1 дальтон. Дезамидирование аспарагина приводит к получению аспарагиновой или изоаспарагиновой кислоты. Параметры, влияющие на скорость дезамидирования, включают pH, температуру, диэлектрическую постоянную растворителя, ионную силу, первичную последовательность, локальную конформацию полипептида и третичную структуру. Аминокислотные остатки, соседствующие с Asn в пептидной цепи, влияют на скорости дезамидирования. Gly и Ser, следующие за Asn в белковых последовательностях, приводят к более высокой чувствительности к дезамидированию.

[0198] В некоторых вариантах осуществления жидкая композиция белков по настоящему изобретению может быть сохранена в условиях pH и влажности для предотвращения дезаминирования белкового продукта.

[0199] Представляющий интерес водный носитель в настоящем описании является фармацевтически приемлемым (безопасным и нетоксичным для введения человеку) и полезным для приготовления жидкой композиции. Иллюстративные носители включают стерильную воду для инъекций (SWFI), бактериостатическую воду для инъекций (BWFI), рН-буферный раствор (например, фосфатно-буферный солевой раствор), стерильный физиологический раствор, раствор Рингера или раствор декстрозы.

[0200] Консервант необязательно может быть добавлен в составы для уменьшения бактериального действия. Добавление консерванта может, например, способствовать получению многоразового (многодозового) состава.

[0201] Внутривенные (IV) составы могут быть предпочтительным путем введения в конкретных случаях, например, когда пациент находится в больнице после трансплантации, получая все лекарственные средства посредством IV пути. В некоторых вариантах осуществления жидкую композицию разбавляют 0,9% раствором хлорида натрия перед введением. В некоторых вариантах осуществления разбавленный лекарственный продукт для инъекций является изотоническим и пригодным для введения путем внутривенной инфузии.

[0202] В некоторых вариантах осуществления соли или буферные компоненты могут быть добавлены в количестве 10-200 мМ. Соли и/или буферы являются фармацевтически приемлемыми и получены из различных известных кислот (неорганических и органических) с металлами или аминами, образующими основание. В некоторых вариантах осуществления буфер может представлять собой фосфатный буфер. В некоторых вариантах осуществления буфер может представлять собой глицинатный, карбонатный, цитратный буферы, и в этом случае ионы натрия, калия или аммония могут служить в качестве противоиона.

[0203] Консервант может быть необязательно добавлен в составы для уменьшения бактериального действия. Добавление консерванта может, например, способствовать получению многоразового (многодозового) состава.

[0204] Представляющий интерес водный носитель в настоящем описании является фармацевтически приемлемым (безопасным и нетоксичным для введения человеку) и полезным для приготовления жидкой композиции. Иллюстративные носители включают стерильную воду для инъекций (SWFI), бактериостатическую воду для инъекций (BWFI), рН-буферный раствор (например, фосфатно-буферный солевой раствор), стерильный физиологический раствор, раствор Рингера или раствор декстрозы.

[0205] Белки по настоящему раскрытию могут существовать в лиофилизированной композиции, включающей белки и лиопротектор. Лиопротектором может быть сахар, например дисахариды. В некоторых вариантах осуществления ликопротектор может представлять собой сахарозу или мальтозу. Лиофилизированный состав может также включать один или более из буферного агента, поверхностно-активного вещества, наполнителя и/или консерванта.

[0206] Количество сахарозы или мальтозы, полезное для стабилизации лиофилизированного лекарственного продукта, может быть в массовом соотношении по меньшей мере 1:2 белка к сахарозе или мальтозе. В некоторых вариантах осуществления массовое соотношение белок/сахароза или мальтоза может составлять от 1:2 до 1:5.

[0207] В некоторых вариантах осуществления pH композиции перед лиофилизацией может быть установлено путем добавления фармацевтически приемлемой кислоты и/или основания. В некоторых вариантах осуществления фармацевтически приемлемая кислота может представлять собой соляную кислоту. В некоторых вариантах осуществления фармацевтически приемлемым основанием может быть гидроксид натрия.

[0208] Перед лиофилизацией pH раствора, содержащего белок по настоящему изобретению, можно доводить в диапазоне от 6 до 8. В некоторых вариантах осуществления диапазон pH для лиофилизированного лекарственного продукта может составлять от 7 до 8.

[0209] В некоторых вариантах осуществления соли или буферные компоненты могут быть добавлены в количестве 10-200 мМ. Соли и/или буферы являются фармацевтически приемлемыми и получены из различных известных кислот (неорганических и органических) с металлами или аминами, образующими основание. В некоторых вариантах осуществления буфер может представлять собой фосфатный буфер. В некоторых вариантах осуществления буфер может представлять собой глицинатный, карбонатный, цитратный буферы, и в этом случае ионы натрия, калия или аммония могут служить в качестве противоиона.

[0210] В некоторых вариантах осуществления может быть добавлен «наполнитель». «Наполнитель» представляет собой соединение, которое добавляет массу к лиофилизированной смеси и способствует физической структуре лиофилизированной таблетки (например, облегчает производство по существу однородной лиофилизированной таблетки, которая поддерживает структуру с открытыми порами). Иллюстративные наполнители включают маннит, глицин, полиэтиленгликоль и сорбит. Лиофилизированные составы по настоящему изобретению могут содержать такие наполнители.

[0211] Консервант может быть необязательно добавлен в составы для уменьшения бактериального действия. Добавление консерванта может, например, способствовать получению многоразового (многодозового) состава.

[0212] В некоторых вариантах осуществления лиофилизированный лекарственный продукт может состоять из водного носителя. Представляющий интерес водный носитель настоящего описания является фармацевтически приемлемым (например, безопасным и нетоксичным для введения человеку) и полезным для приготовления жидкой композиции после лиофилизации. Иллюстративные разбавители включают стерильную воду для инъекций (SWFI), бактериостатическую воду для инъекций (BWFI), рН-буферный раствор (например, фосфатно-буферный солевой раствор), стерильный физиологический раствор, раствор Рингера или раствор декстрозы.

[0213] В некоторых вариантах осуществления лиофилизированный лекарственный продукт по настоящему изобретению восстанавливается либо стерильной водой для инъекций, USP (SWFI), либо 0,9% инъекцией хлорида натрия, USP. Во время восстановления лиофилизированный порошок растворяется в растворе.

[0214] В некоторых вариантах осуществления лиофилизированный белковый продукт по настоящему изобретению состоит из примерно 4,5 мл воды для инъекций и разбавляется 0,9% солевым раствором (раствор хлорида натрия).

[0215] Фактические уровни дозировки активных ингредиентов в фармацевтических композициях могут варьироваться так, чтобы получить количество активного ингредиента, которое эффективно для достижения искомого терапевтического ответа для конкретного пациента, композиции и режима введения, без токсичности для пациента.

[0216] Конкретная доза может представлять собой унифицированную дозу для каждого пациента, например, 50-5000 мг белка. Альтернативно, доза для пациента может быть адаптирована к приблизительной массе тела или площади поверхности пациента. Другие факторы в определении подходящей дозировки могут включать заболевание или состояние, которое подлежит лечению или предотвращению, тяжесть заболевания, способ введения, а также возраст, пол и состояние здоровья пациента. Специалисты в данной области обычно проводят дальнейшее уточнение расчетов, необходимых для определения подходящей дозировки для лечения, особенно в свете информации о дозировке и анализах, раскрытых в настоящем документе. Дозировка также может быть определена путем использования известных анализов для определения доз, используемых в сочетании с соответствующими данными доза-ответ. Дозировка индивидуального пациента может быть скорректирована по мере наблюдения за развитием заболевания. Уровни в крови нацеливающей конструкции или комплекса у пациента могут быть измерены, чтобы увидеть, нужно ли корректировать дозировку для достижения или поддержания эффективной концентрации. Фармакогеномика может быть использована для определения того, какие нацеливающие конструкции и/или комплексы и их дозы наиболее вероятно будут эффективны для данного индивидуума (Schmitz et al., Clinica Chimica Acta 308: 43-53, 2001; Steimer et al. Clinica Chimica Acta 308: 33-41, 2001).

[0217] Как правило, дозы на основе массы тела, составляют примерно от 0,01 мкг примерно до 100 мг на кг массы тела, например, примерно от 0,01 мкг примерно до 100 мг/кг массы тела, примерно от 0,01 мкг примерно до 50 мг/кг массы тела, примерно от 0,01 мкг примерно до 10 мг/кг массы тела, примерно от 0,01 мкг примерно до 1 мг/кг массы тела, примерно от 0,01 мкг примерно до 100 мкг/кг массы тела, примерно от 0,01 мкг примерно до 50 мкг/кг массы тела, примерно от 0,01 мкг примерно до 10 мкг/кг массы тела, примерно от 0,01 мкг примерно до 1 мкг/кг массы тела, примерно от 0,01 мкг примерно до 0,1 мкг/кг массы тела, примерно от 0,1 мкг примерно до 100 мг/кг массы тела, примерно от 0,1 мкг примерно до 50 мг/кг массы тела, примерно от 0,1 мкг примерно до 10 мг/кг массы тела, примерно от 0,1 мкг примерно до 1 мг/кг массы тела, примерно от 0,1 мкг примерно до 100 мкг/кг массы тела, примерно от 0,1 мкг примерно до 50 мкг/кг массы тела, примерно от 0,1 мкг примерно до 10 мкг/кг массы тела, примерно от 0,1 мкг примерно до 1 мкг/кг массы тела, примерно от 1 мкг примерно до 100 мг/кг массы тела, примерно от 1 мкг примерно до 50 мг/кг массы тела, примерно от 1 мкг примерно до 10 мг/кг массы тела, примерно от 1 мкг примерно до 1 мг/кг массы тела, примерно от 1 мкг примерно до 100 мкг/кг массы тела, примерно от 1 мкг примерно до 50 мкг/кг массы тела, примерно от 1 мкг примерно до 10 мкг/кг массы тела, примерно от 10 мкг примерно до 100 мг/кг массы тела, примерно от 10 мкг примерно до 50 мг/кг массы тела, примерно от 10 мкг примерно до 10 мг/кг массы тела, примерно от 10 мкг примерно до 1 мг/кг массы тела, примерно от 10 мкг примерно до 100 мкг/кг массы тела, примерно от 10 мкг примерно до 50 мкг/кг массы тела, примерно от 50 мкг примерно до 100 мг/кг массы тела, примерно от 50 мкг примерно до 50 мг/кг массы тела, примерно от 50 мкг примерно до 10 мг/кг массы тела, примерно от 50 мкг примерно до 1 мг/кг массы тела, примерно от 50 мкг примерно до 100 мкг/кг массы тела, примерно от 100 мкг примерно до 100 мг/кг массы тела, примерно от 100 мкг примерно до 50 мг/кг массы тела, примерно от 100 мкг примерно до 10 мг/кг массы тела, примерно от 100 мкг примерно до 1 мг/кг массы тела, примерно от 1 мг примерно до 100 мг/кг массы тела, примерно от 1 мг примерно до 50 мг/кг массы тела, примерно от 1 мг примерно до 10 мг/кг массы тела, примерно от 10 мг примерно до 100 мг/кг массы тела, примерно от 10 мг примерно до 50 мг/кг массы тела, примерно от 50 мг примерно до 100 мг/кг массы тела.

[0218] Дозы могут вводиться один или более раз в день, еженедельно, ежемесячно или ежегодно, или даже один раз каждые 2-20 лет. Специалисты в данной области техники могут легко оценить частоту повторения для дозирования на основании измеренного времени удерживания и концентраций нацеливающей конструкции или комплекса в жидкостях или тканях организма. Введение по настоящему изобретению может быть внутривенным, внутриартериальным, внутрибрюшинным, внутримышечным, подкожным, внутриплевральным, интратекальным, внутриполостным, путем перфузии через катетер или путем прямой внутриклеточной инъекции. Это может осуществляться один или более раз в день, один или более раз в неделю, один или более раз в месяц и один или более раз в год.

[0219] Вышеприведенное описание описывает множество аспектов и вариантов осуществления изобретения. В заявке на патент конкретно рассматриваются все комбинации и перестановки аспектов и вариантов осуществления.

ПРИМЕРЫ

[0220] Настоящее изобретение теперь в целом описано, оно будет более понятно с помощью ссылок на следующие примеры, которые включены только в целях иллюстрации некоторых аспектов и вариантов осуществления настоящего изобретения и не предназначены для ограничения изобретения каким-либо образом.

Пример 1 - NKG2D-связывающие домены связываются с NKG2D

NKG2D-связывающие домены связываются с очищенным рекомбинантным NKG2D

[0221] Последовательности нуклеиновых кислот эктодоменов NKG2D человека, мыши или яванской макаки были слиты с последовательностями нуклеиновых кислот, кодирующими Fc-домены IgG1 человека, и введены в клетки млекопитающих для экспрессии. После очистки слитые белки NKG2D-Fc были адсорбированы в лунках микропланшетов. После блокирования лунок бычьим сывороточным альбумином для предотвращения неспецифического связывания, NKG2D-связывающие домены титровали и добавляли в лунки, на которые предварительно адсорбировали слитые белки NKG2D-Fc. Связывание первичного антитела определяли с использованием вторичного антитела, которое конъюгировано с пероксидазой хрена и специфически распознает легкую цепь каппа человека, чтобы избежать перекрестной реактивности Fc. 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (TMB), субстрат для пероксидазы хрена, добавляли в лунки для визуализации сигнала связывания, поглощение которого измеряли при 450 нМ и корректировали при 540 нМ. Клон NKG2D-связывающего домена, контроль изотипа или положительный контроль (включая вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи, выбранные из SEQ ID NO: 101-104 или антимышиные клоны NKG2D MI-6 и CX-5, доступные в eBioscience) добавляли в каждую лунку.

[0222] Контроль изотипа показал минимальное связывание с рекомбинантными белками NKG2D-Fc, в то время как положительный контроль наиболее сильно связывался с рекомбинантными антигенами. NKG2D-связывающие домены, продуцируемые всеми клонами, демонстрировали связывание с рекомбинантными белками NKG2D-Fc человека, мыши и яванской макаки, хотя с разными аффинностями от клона к клону. Как правило, каждый анти-NKG2D-клон связывается с рекомбинантным NKG2D-Fc человека (ФИГ. 3) и яванской макаки (ФИГ. 4) с аналогичной аффинностью, но с более низкой аффинностью к рекомбинантному NKG2D-Fc мыши (ФИГ. 5).

NKG2D-связывающие домены связываются с клетками, экспрессирующими NKG2D

[0223] Клеточные линии мышиной лимфомы EL4 были сконструированы для экспрессии химерного антигенного рецептора NKG2D и сигнального домена CD3-дзета человека или мыши. NKG2D-связывающий клон, изотипический контроль или положительный контроль использовали в концентрации 100 нМ для окрашивания внеклеточного NKG2D, экспрессированного на клетках EL4. Связывание антител определяли с использованием вторичных антител против человеческого IgG, конъюгированных с флуорофором. Клетки анализировали с помощью проточной цитометрии и рассчитывали превышение относительно фона (fold-over-background) (FOB) с использованием средней интенсивности флуоресценции (MFI) NKG2D-экспрессирующих клеток по сравнению с родительскими клетками EL4.

[0224] NKG2D-связывающие домены, продуцируемые всеми клонами, связывались с клетками EL4, экспрессирующими NKG2D человека и мыши. Антитела положительного контроля (включая вариабельные домены тяжелой и легкой цепи, выбранные из SEQ ID NO: 101-104 или анти-мышиные клоны NKG2D MI-6 и CX-5, доступные на eBioscience) давали лучший сигнал связывания FOB. Аффинность связывания NKG2D для каждого клона была сходной между клетками, экспрессирующими NKG2D человека (ФИГ. 6) и мыши (ФИГ. 7).

Пример 2 - NKG2D-связывающие домены блокируют связывание природного лиганда с NKG2D

Конкуренция с ULBP-6

[0225] Рекомбинантные белки NKG2D-Fc человека адсорбировали в лунках микропланшета, и лунки блокировали бычьим сывороточным альбумином для снижения неспецифического связывания. Насыщенную концентрацию ULBP-6-His-биотин добавляли в лунки с последующим добавлением клонов NKG2D-связывающего домена. После 2-часовой инкубации лунки промывали и ULBP-6-His-биотин, который оставался связанным с лунками, покрытыми NKG2D-Fc, детектировали стрептавидином, конъюгированным с пероксидазой хрена и субстратом TMB. Поглощение измеряли при 450 нМ и корректировали при 540 нМ. После вычитания фона специфическое связывание NKG2D-связывающих доменов с белками NKG2D-Fc рассчитывали по проценту ULBP-6-His-биотина, который блокировался от связывания с белками NKG2D-Fc в лунках. Антитело положительного контроля (включая вариабельные домены тяжелой и легкой цепи, выбранные из SEQ ID NO: 101-104) и различные NKG2D-связывающие домены блокировали связывание ULBP-6 с NKG2D, в то время как изотипический контроль показал небольшую конкуренцию с ULBP-6 (ФИГ. 8).

Последовательность ULBP-6 представлена SEQ ID NO: 108

MAAAAIPALLLCLPLLFLLFGWSRARRDDPHSLCYDITVIPKFRPGPRWCAVQGQVDEKTFLHYDCGNKTVTPVSPLGKKLNVTMAWKAQNPVLREVVDILTEQLLDIQLENYTPKEPLTLQARMSCEQKAEGHSSGSWQFSIDGQTFLLFDSEKRMWTTVHPGARKMKEKWENDKDVAMSFHYISMGDCIGWLEDFLMGMDSTLEPSAGAPLAMSSGTTQLRATATTLILCCLLIILPCFILPGI (SEQ ID NO:108)

Конкуренция с MICA

[0226] Рекомбинантные белки MICA-Fc человека адсорбировали в лунках микропланшета, и лунки блокировали бычьим сывороточным альбумином для уменьшения неспецифического связывания. NKG2D-Fc-биотин добавляли в лунки, за которыми следовало добавление NKG2D-связывающих доменов. После инкубации и промывания NKG2D-Fc-биотин, который оставался связанным с лунками, покрытыми MICA-Fc, детектировали с использованием субстрата стрептавидин-HRP и TMB. Поглощение измеряли при 450 нМ и корректировали при 540 нМ. После вычитания фона специфическое связывание NKG2D-связывающих доменов с белками NKG2D-Fc рассчитывали по проценту NKG2D-Fc-биотина, который блокировался от связывания с MICA-Fc в лунках. Антитело позитивного контроля (включая вариабельные домены тяжелой и легкой цепи, выбранные из SEQ ID NO: 101-104) и различные NKG2D-связывающие домены блокировали связывание MICA с NKG2D, в то время как изотипический контроль показал небольшую конкуренцию с MICA (ФИГ. 9).

Конкуренция с Rae-1 дельта

[0227] Рекомбинантный мышиный Rae-1delta-Fc (приобретенный у R & D Systems) адсорбировали в лунках микропланшета, и лунки блокировали бычьим сывороточным альбумином для снижения неспецифического связывания. Мышиный NKG2D-Fc-биотин добавляли в лунки с последующим добавлением NKG2D-связывающих доменов. После инкубации и промывания NKG2D-Fc-биотин, который оставался связанным с лунками, покрытыми Rae-1delta-Fc, детектировали с использованием субстрата стрептавидин-HRP и TMB. Поглощение измеряли при 450 нМ и корректировали при 540 нМ. После вычитания фона специфическое связывание NKG2D-связывающих доменов с белками NKG2D-Fc рассчитывали по проценту NKG2D-Fc-биотина, который блокировался от связывания с лунками, покрытыми Rae-1delta-Fc. Положительный контроль (включая вариабельные домены тяжелой и легкой цепи, выбранные из SEQ ID NO: 47-50 или анти-мышиных клонов NKG2D MI-6 и CX-5, доступных на eBioscience) и различные клоны NKG2D-связывающего домена блокировали связывание Rae-1-дельта с мышиным NKG2D, в то время как антитело изотипического контроля демонстрировало небольшую конкуренцию с Rae-1delta (ФИГ. 10).

Пример 3 - клоны NKG2D-связывающего домена активируют NKG2D

[0228] Последовательности нуклеиновой кислоты NKG2D человека и мыши были слиты с последовательностями нуклеиновой кислоты, кодирующими сигнальный домен CD3 дзета, с получением конструкций химерного антигенного рецептора (CAR). Конструкции NKG2D-CAR затем клонировали в ретровирусный вектор с использованием сборки Гибсона и трансфицировали в клетки expi293 с получением ретровируса. Клетки EL4 инфицировали вирусами, содержащими NKG2D-CAR вместе с 8 мкг/мл полибрена. Через 24 часа после инфекции уровни экспрессии NKG2D-CAR в клетках EL4 анализировали проточной цитометрией и отбирали клоны, которые экспрессируют на высоком уровне NKG2D-CAR на клеточной поверхности.

[0229] Чтобы определить, активируют ли NKG2D-связывающие домены NKG2D, их адсорбировали в лунки микропланшета, и клетки NKG2D-CAR EL4 культивировали в лунках, покрытых фрагментом антитела, в течение 4 часов в присутствии брефельдина-A и монензина. Внутриклеточное продуцирование TNF-α, индикатора активации NKG2D, анализировали с помощью проточной цитометрии. Процент TNF-α-положительных клеток был нормализован по отношению к клеткам, обработанным положительным контролем. Все NKG2D-связывающие домены активировали как NKG2D человека (ФИГ. 11), так и мыши (ФИГ. 12).

Пример 4 - NKG2D-связывающие домены активируют NK-клетки

Первичные человеческие NK-клетки

[0230] Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) выделяли из лейкотромбоцитарного слоя периферической крови с использованием центрифугирования в градиенте плотности. NK-клетки (CD3^-CD56⁺) выделяли с использованием отрицательного отбора с помощью магнитных гранул из PBMC, и чистота выделенных NK-клеток обычно составляла> 95%. Затем выделенные NK-клетки культивировали в среде, содержащей 100 нг/мл IL-2, в течение 24-48 часов, после чего их переносили в лунки микропланшета, на котором были адсорбированы NKG2D-связывающие домены, и культивировали в среде, содержащей конъюгированный с флуорофором антитело против CD107a, брефелдин-А и монензин. После культивирования NK-клетки анализировали проточной цитометрией с использованием антител, конъюгированных с флуорофором, против CD3, CD56 и IFN-γ. Окрашивание CD107a и IFN-γ анализировали в клетках CD3^-CD56⁺ для оценки активации NK-клеток. Увеличение количества CD107a/IFN-γ-двойных положительных клеток свидетельствует о лучшей активации NK-клеток за счет рекрутирования двух активирующих рецепторов, а не одного рецептора. NKG2D-связывающие домены и положительный контроль (например, вариабельный домен тяжелой цепи, представленный SEQ ID NO:101, или вариабельный домен легкой цепи, представленный SEQ ID NO:104) показали более высокий процент NK-клеток, становящихся CD107a⁺ и IFN-γ⁺, чем изотипический контроль (ФИГ. 13 и ФИГ. 14 представляют два независимых эксперимента, в каждом из которых использовали разных доноров PBMC для приготовления NK-клеток).

Первичные мышиные NK-клетки

[0231] Селезенки получали от мышей C57Bl/6 и измельчали через сито для клеток 70 мкм для получения суспензии отдельных клеток. Клетки осаждали и ресуспендировали в лизирующем буфере ACK (приобретенном у Thermo Fisher Scientific # A1049201; 155 мМ хлорида аммония, 10 мМ бикарбоната калия, 0,01 мМ EDTA) для удаления эритроцитов. Оставшиеся клетки культивировали с 100 нг/мл человеческого IL-2 (hIL-2) в течение 72 часов, а затем собирали и готовили для выделения NK-клеток. NK-клетки (CD3^-NK1.1⁺) затем выделяли из клеток селезенки с использованием метода отрицательного истощения с использованием магнитных гранул с чистотой> 90%. Очищенные NK-клетки культивировали в среде, содержащей 100 нг/мл мышиного IL-15 (mIL-15), в течение 48 часов, после чего их переносили в лунки микропланшета, на котором были адсорбированы NKG2D-связывающие домены, и культивировали в среде, содержащей конъюгированный с флуорофором антитело против CD107a, брефелдин-А и монензин. После культивирования в лунках, покрытых NKG2D-связывающим доменом, NK-клетки анализировали проточной цитометрией с использованием антител, конъюгированных с флуорофором, против CD3, NK1.1 и IFN-γ. Окрашивание CD107a и IFN-γ анализировали в клетках CD3^-NK1.1⁺ для оценки активации NK-клеток. Увеличение количества CD107a/IFN-γ-двойных положительных клеток свидетельствует о лучшей активации NK-клеток за счет вовлечения двух активирующих рецепторов, а не одного рецептора. NKG2D-связывающие домены и положительный контроль (выбранный из анти-мышиных NKG2D-клонов MI-6 и CX-5, доступных в eBioscience) показали более высокий процент NK-клеток, становящихся CD107a⁺ и IFN-γ⁺, чем изотипический контроль (ФИГ. 15 и ФИГ. 16 представляют два независимых эксперимента, в каждом из которых использовали разных мышей для приготовления NK-клеток).

Пример 5 - NKG2D-связывающие домены обеспечивают цитотоксичность опухолевых клеток-мишеней

[0232] Анализы активации первичных NK-клеток человека и мыши демонстрируют повышенный уровень маркеров цитотоксичности для NK-клеток после инкубации с NKG2D-связывающими доменами. Чтобы определить, приводит ли это к усилению лизиса опухолевых клеток, был использован клеточный анализ, в котором каждый NKG2D-связывающий домен превращался в моноспецифическое антитело. Fc-область использовали в качестве одного нацеливающего фрагмента, тогда как Fab-область (NKG2D-связывающий домен) действовала как другой нацеливающий фрагмент для активации NK-клеток. Клетки THP-1, которые имеют человеческое происхождение и экспрессируют на высоком уровне Fc-рецепторы, использовали в качестве опухолевой мишени и использовали набор для цитотоксичности Perkin Elmer DELFIA. Клетки THP-1 метили реагентом BATDA и ресуспендировали в количестве 10⁵/мл в культуральной среде. Меченые клетки THP-1 затем объединяли с антителами NKG2D и выделенными мышиными NK-клетками в лунках микропланшета при 37°С в течение 3 часов. После инкубации удаляли 20 мкл культурального супернатанта, смешивали с 200 мкл раствора европия и инкубировали при встряхивании в течение 15 минут в темноте. Флуоресценцию измеряли во времени с помощью планшет-ридера PheraStar, оборудованного модулем флуоресценции с разрешением по времени (возбуждение 337 нм, излучение 620 нм), и специфический лизис рассчитывали в соответствии с инструкциями набора.

[0233] Положительный контроль, ULBP-6 - естественный лиганд для NKG2D, показал повышенный специфический лизис клеток-мишеней THP-1 мышиными NK-клетками. Антитела NKG2D также увеличивали специфический лизис клеток-мишеней THP-1, тогда как антитело изотипического контроля показало снижение специфического лизиса. Пунктирная линия указывает на специфический лизис клеток THP-1 мышиными NK-клетками без добавления антител (ФИГ. 17).

Пример 6 - антитела NKG2D показывают высокую термостабильность

[0234] Температуру плавления NKG2D-связывающих доменов анализировали с использованием дифференциальной сканирующей флуориметрии. Экстраполированные кажущиеся температуры плавления являются высокими по сравнению с типичными антителами IgG1 (ФИГ. 18).

Пример 7. Синергическая активация человеческих NK-клеток путем перекрестного связывания NKG2D и CD16.

Анализ активации первичных человеческих NK-клеток

[0235] Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) выделяли из лейкотромбоцитарного слоя периферической крови с использованием центрифугирования в градиенте плотности. NK-клетки очищали из РВМС с использованием отрицательных магнитных гранул (StemCell # 17955). NK-клетки были> 90% CD3^-CD56⁺, как определено проточной цитометрией. Затем клетки наращивали 48 часов в среде, содержащей 100 нг/мл hIL-2 (Peprotech # 200-02), перед использованием в анализах активации. Антитела наносили на 96-луночный планшет с плоским дном в концентрации 2 мкг/мл (анти-CD16, Biolegend # 302013) и 5 мкг/мл (анти-NKG2D, R & D # MAB139) в 100 мкл стерильного PBS в течение ночи при 4°С с последующим тщательным промыванием лунок для удаления избытка антител. Для оценки дегрануляции IL-2-активированные NK-клетки ресуспендировали в количестве 5х10⁵ клеток/мл в культуральной среде, дополненной 100 нг/мл hIL2 и 1 мкг/мл APC-конъюгированного анти-CD107a mAb (Biolegend # 328619). Затем на планшеты, покрытые антителами, добавляли 1х10⁵ клеток/лунку. Ингибиторы транспорта белка Брефельдин А (BFA, Biolegend # 420601) и Монензин (Biolegend # 420701) добавляли в конечном разведении 1:1000 и 1:270, соответственно. Посеянные клетки инкубировали в течение 4 часов при 37°С в 5% СО₂. Для внутриклеточного окрашивания IFN-γ NK-клетки метили анти-CD3 (Biolegend # 300452) и анти-CD56 mAb (Biolegend # 318328), а затем фиксировали и пермеабилизовали и метили анти-IFN-γ mAb (Biolegend # 506507). NK-клетки анализировали на экспрессию CD107a и IFN-γ методом проточной цитометрии после гейтинга живых CD56⁺CD3^-клеток.

[0236] Чтобы исследовать относительную эффективность комбинации рецепторов, проводили перекрестное связывание NKG2D или CD16 и совместное связывание обоих рецепторов посредством стимулирования в состоянии, связанном с планшетом. Как показано на Фигуре. 19 (ФИГ. 19A-19C), комбинированное стимулирование CD16 и NKG2D приводило к сильно повышенным уровням CD107a (дегрануляция) (ФИГ. 19A) и/или к продуцированию IFN-γ (ФИГ. 19B). Пунктирные линии представляют аддитивный эффект отдельных стимулирований каждого рецептора.

[0237] Уровни CD107a и внутриклеточное продуцирование IFN-γ активированных IL-2 NK-клеток анализировали через 4 часа стимулирования, связанного с планшетом, с помощью анти-CD16, анти-NKG2D или комбинацией обоих моноклональных антител. Графики показывают среднее (n=2) ± SD. ФИГ. 19А демонстрирует уровень CD107a; ФИГ. 19B демонстрирует уровень IFN-γ; ФИГ.19C демонстрирует уровень CD107a и IFN-γ. Данные, показанные на ФИГ. 19А-19С представляют пять независимых экспериментов с использованием пяти различных здоровых доноров.

Пример 8 - TriNKET связываются с NKG2D человека

[0238] Первичные человеческие NK-клетки и клеточные линии мышиной лимфомы EL4, сконструированные для экспрессии NKG2D человека, использовали для тестирования аффинности связывания триспецифических связывающих белков (TriNKET) с NKG2D. Каждый из тестируемых TriNKET содержит NKG2D-связывающий домен, опухолеспецифический антигенсвязывающий домен (например, 5T4-связывающий домен) и Fc-домен, который связывается с CD16, как показано на ФИГ. 1. TriNKET разводили до 20мкг/мл и затем разводили последовательно. Связывание TriNKET или родительских моноклональных антител 5Т4 с NKG2D определяли, используя конъюгированные с флуорофором вторичные антитела против человеческого IgG. Клетки анализировали с помощью проточной цитометрии и рассчитывали превышение относительно фона (fold-over-background) (FOB) путем нормализации средней интенсивности флуоресценции (MFI) к контролю окрашивания человеческого рекомбинантного IgG1.

[0239] Протестированные моноклональные антитела против 5T4 включают 5T4R (включая SEQ ID NO: 200-207) и 5T4A (включая SEQ ID NO: 192-199). Тестируемые TriNKET включают A49-TriNKET-5T4R, который включает 5T4-связывающий домен из моноклонального антитела 5T4R и NKG2D-связывающий домен из клона ADI-27749; и A49-TriNKET-5T4A, который включает 5T4-связывающий домен из моноклонального антитела 5T4A и NKG2D-связывающий домен из клона ADI-27749. ФИГ. 35 демонстрирует, что TriNKET, каждый из которых включает 5T4-связывающий домен и отдельный NKG2D-связывающий домен, связываются с NKG2D на клетках EL4 дозозависимым образом. Фиг. 36 демонстрирует, что TriNKET связываются с NKG2D на первичных человеческих NK-клетках дозозависимым образом, в то время как моноклональные антитела против 5T4, 5T4R и 5T4A, не связываются.

Пример 9 - Оценка связывания TriNKET с опухолеспецифическим антигеном, экспрессируемым клеткой

[0240] Человеческие опухолевые клеточные линии (BxPC3, H146, H1975, HCT116, MCF7 и N87), экспрессирующие опухолеспецифический антиген 5Т4, использовали для анализа связывания 5Т4-нацеленных TriNKET с антигеном. TriNKET или родительские моноклональные антитела против 5Т4 инкубировали с каждой из клеточных линий и связывание детектировали с использованием вторичных антител против человеческого IgG, конъюгированных с флуорофором. Проточную цитометрию использовали для анализа связывания TriNKET или моноклональных антител против 5Т4 с клетками, и рассчитывали превышение относительно фона (FOB) путем нормализации средней интенсивности флуоресценции (MFI) к контролю окрашивания рекомбинантного человеческого IgG1.

[0241] Как A49-TriNKET-5T4R, так и A49-TriNKET-5T4A связывались с 5T4, экспрессированным на клетках рака поджелудочной железы человека BxPC3 (ФИГ. 37), на клетках мелкоклеточного рака легкого человека H146 (ФИГ. 38), клетках немелкоклеточного рака легкого H1975 (ФИГ. 39), клетках рака толстой кишки человека HCT116 (ФИГ. 40), клетках рака молочной железы человека MCF7 (ФИГ. 41) и клетках рака желудка человека N87 (ФИГ 42).

[0242] Результаты продемонстрировали, что A49-TriNKET-5T4R выявил более высокие максимальное связывание и аффинность связывания, чем родительское моноклональное антитело против 5T4R. Контрольный TriNKET содержит сайт связывания для опухолевого антигена, отличного от 5T4, и NKG2D-связывающий домен из клона ADI-27749.

Пример 10 - TriNKET повышают цитотоксичность человеческих NK-клеток по отношению к опухолевым клеткам.

[0243] Для тестирования способности человеческих NK-клеток лизировать опухолевые клетки в присутствии TriNKET использовали клетки линии NK-клеток человека KHYG-1 или первичные NK-клетки.

[0244] Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) выделяли из лейкотромбоцитарного слоя периферической крови с использованием центрифугирования в градиенте плотности. NK-клетки (CD3^-CD56⁺) выделяли с использованием отрицательного отбора с помощью магнитных гранул из PBMC, и чистота выделенных NK-клеток обычно составляла> 90%. Выделенные NK-клетки оставляли на ночь без цитокина. Эти NK-клетки использовали на следующий день в анализах на цитотоксичность.

[0245] KHYG-1 поддерживали в 10% HI-FBS-RPMI-1640 с 10 нг/мл цитокина IL-2. Клетки KHYG-1 собирали из культуры за день до использования, клетки отмывали от среды, содержащей цитокин IL-2и ресуспендировали в 10% HI-FBS-RPMI-1640 в течение ночи без цитокина IL-2.

[0246] Все анализы цитотоксичности готовили следующим образом: клетки человеческих опухолевых клеточных линий, экспрессирующих интересующую мишень (например, 5Т4-положительные опухолевые клетки), собирали из культуры, клетки промывали PBS и ресуспендировали в ростовой среде в количестве 10⁶/мл для мечения реагентом ацетометилового лиганда, усиливающего флуоресценцию (BATDA) (Perkin Elmer AD0116). Следовали инструкциям производителя по мечению клеток-мишеней. После мечения клетки промывали 3 раза PBS и ресуспендировали в количестве 0,5-1,0х10⁵/мл в культуральной среде. Для приготовления фоновых лунок отбирали аликвоту меченых клеток, и клетки извлекали из среды. 100 мкл среды осторожно добавляли в лунки в трех экземплярах, чтобы не повредить осажденные клетки. 100 мкл BATDA-меченных клеток добавляли в каждую лунку 96-луночного планшета. Лунки предохраняли для спонтанного высвобождения из клеток-мишеней, и лунки были подготовлены для максимального лизиса клеток-мишеней путем добавления 1% Triton-X. Моноклональные антитела и TriNKET против интересующей опухоли-мишени (например, A49-TriNKET-5T4R) разводили в культуральной среде, и 50 мкл разведенных моноклональных антител и TriNKET добавляли в соответствующие лунки. Клетки KHYG-1 промывали и ресуспендировали в количестве 10⁵-2,0х10⁶/мл в культуральной среде в зависимости от соотношения эффекторной клетки к клетке-мишени 10:1. 50 мкл NK-клеток добавляли в каждую лунку планшета, чтобы получить в общей сложности 200 мкл культурального объема. Планшет инкубировали при 37°C с 5% CO₂ в течение 2-3 часов, прежде чем проводить анализ. После культивирования в течение 3-4 часов планшет извлекали из инкубатора, и клетки осаждали центрифугированием при 200g в течение 5 минут. 20 мкл культурального супернатанта переносили в чистый микропланшет, предоставленный производителем, и 200 мкл раствора европия при комнатной температуре добавляли в каждую лунку. Планшет защищали от света и инкубировали на шейкере для планшетов при 250 об/мин в течение 15 минут. Планшет считывался с использованием инструментов Victor 3 или SpectraMax i3X. % специфического лизиса рассчитывали следующим образом: %Специфического лизиса = ((Экспериментальное высвобождение - спонтанное высвобождение)/(Максимальное высвобождение - спонтанное высвобождение)) * 100%.

Анализ цитотоксичности с высвобождением LDH:

[0247] Опухолевые клеточные линии человека, экспрессирующие интересующую мишень, собирали из культуры, высевали при 5 × 10³ клеток/лунку в 96-луночный планшет и культивировали в течение ночи при 37°C с 5% CO₂. Были включены следующие контроли: контроль без клеток для определения фона культуральной среды, контроль спонтанного высвобождения LDH эффекторных клеток, содержащий необработанные эффекторные клетки, контроль спонтанного высвобождения LDH клеток-мишеней, содержащий необработанные клетки-мишени, и контроль максимального высвобождения LDH клеток-мишеней с помощью раствора для лизиса добавляли перед цитотоксическим реагентом. Моноклональные антитела или TriNKET против интересующей опухоли-мишени разводили в культуральной среде, 50 мкл разведенных mAb или TriNKET (например, A49-TriNKET-5T4R) добавляли в соответствующие лунки. Покоящиеся NK-клетки собирали из культуры, клетки отмывали и ресуспендировали при 10⁵-2×10⁶/мл в культуральной среде в зависимости от желаемого соотношения E:T. 50 мкл NK-клеток добавляли в каждую лунку планшета, чтобы получить общий объем культуры 200 мкл. Планшет инкубировали при 37°С с 5% СО₂ в течение 3-4 часов, прежде чем проводить анализ.

[0248] После культивирования в течение 3-4 часов планшет извлекали из инкубатора и в каждую лунку добавляли 50 мкл цитотоксического реагента. Планшет защищали от света и инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре. 50 мкл стоп-раствора добавляли в каждую лунку. Планшет считывали на поглощение при 490 нм с использованием приборов Victor 3 или SpectraMax i3X. % Специфического лизиса рассчитывали следующим образом:

% специфического лизиса = (Экспериментальное высвобождение LDH - Спонтанное Эффектора - Спонтанное Мишени) / (Максимальное Высвобождение Мишени - Спонтанное Высвобождение Мишени) * 100%

[0249] TriNKET, нацеленные на 5T4, опосредовали цитотоксичность NK-клеток человека по отношению к 5T4-положительным клеткам H1975 немелкоклеточного рака легкого. Как показано на ФИГ. 43A-43B, TriNKET опосредовали более эффективное уничтожение опухолевых клеток-мишеней, чем их родительские 5T4 моноклональные антитела. Были протестированы две различные концентрации моноклональных антител TriNKET или 5T4. Как показано на ФИГ. 43А, 6,7 мкг/мл TriNKET имели более высокий процент специфического лизиса, чем 6,7 мкг/мл антител 5Т4. Как показано на ФИГ. 43B, 20 мкг/мл TriNKET имели более высокий процент специфического лизиса, чем 20 мкг/мл антител 5T4.

[0250] TriNKET, нацеленные на 5T4, опосредовали цитотоксичность NK-клеток человека по отношению к 5T4-положительным клеткам MCF7 рака молочной железы человека. Как показано на ФИГ. 44, TriNKET опосредовали более эффективное уничтожение опухолевых клеток-мишеней, чем их родительские 5T4 моноклональные антитела.

[0251] TriNKET, нацеленные на 5T4, опосредовали цитотоксичность NK-клеток человека по отношению к 5T4-положительным N87 клеткам рака желудка человека. Как показано на ФИГ. 45А и ФИГ. 45B, 6,7 мкг/мл TriNKET опосредовали более эффективное уничтожение опухолевых клеток-мишеней, чем их родительские 5T4 моноклональные антитела.

[0252] TriNKET, нацеленные на 5T4, опосредовали цитотоксичность NK-клеток человека по отношению к 5T4-положительным клеткам HCT116 рака толстой кишки человека. Как показано на ФИГ. 46, TriNKET обеспечивал более эффективное уничтожение опухолевых клеток-мишеней, чем его родительское 5T4 моноклональное антитело.

ВКЛЮЧЕНИЕ С ПОМОЩЬЮ ССЫЛКИ

[0253] Полное раскрытие каждого из патентных документов и научных статей, упомянутых в настоящем документе, включено в качестве ссылки для всех целей.

ЭКВИВАЛЕНТЫ

[0254] Изобретение может быть воплощено в других конкретных формах без отклонения от его сущности или существенных характеристик. Таким образом, вышеприведенные варианты осуществления следует рассматривать во всех отношениях как иллюстративные, а не ограничивающие изобретение, описанное в настоящем документе. Таким образом, объем изобретения обозначен прилагаемой формулой изобретения, а не предшествующим описанием, и все изменения, которые входят в значение и диапазон эквивалентности формулы изобретения, предназначены для включения в нее.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ADIMAB, LLC.

<120> БЕЛОК, СВЯЗЫВАЮЩИЙСЯ С NKG2D, CD16 И С ОПУХОЛЕСПЕЦИФИЧЕСКИМ АНТИГЕНОМ

<130> DFY-018WO

<140>

<141>

<150> 62/539,425

<151> 2017-07-31

<150> 62/510,137

<151> 2017-05-23

<150> 62/510,168

<151> 2017-05-23

<150> 62/510,169

<151> 2017-05-23

<150> 62/510,167

<151> 2017-05-23

<160> 207

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 117

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 1

Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 2

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 2

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Ile

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 3

<211> 117

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 3

Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 4

<211> 108

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 4

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro

85 90 95

Ile Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 5

<211> 117

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 5

Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 6

<211> 106

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 6

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser Phe Tyr Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 7

<211> 117

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 7

Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 8

<211> 106

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 8

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Tyr Tyr Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 9

<211> 117

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 9

Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 10

<211> 106

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 10

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 11

<211> 117

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 11

Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Arg Gly Pro Trp Gly Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 12

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 12

Glu Leu Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Asp Ile Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 13

<211> 117

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 13

Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 14

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 14

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Phe Pro Ile

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 15

<211> 117

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 15

Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 16

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 16

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys Glu Val Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 17

<211> 117

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 17

Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 18

<211> 106

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 18

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 19

<211> 117

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 19

Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 20

<211> 106

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 20

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Ile Tyr Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 21

<211> 117

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 21

Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 22

<211> 106

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 22

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Ser Tyr Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 23

<211> 117

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 23

Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 24

<211> 106

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 24

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 25

<211> 117

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 25

Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 26

<211> 106

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 26

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gln Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 27

<211> 117

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 27

Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 28

<211> 106

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 28

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Ser Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 29

<211> 117

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 29

Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 30

<211> 106

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 30

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Glu Ser Tyr Ser Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 31

<211> 117

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 31

Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 32

<211> 106

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 32

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Ser Phe Ile Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 33

<211> 117

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 33

Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 34

<211> 106

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 34

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gln Ser Tyr Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 35

<211> 117

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 35

Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 36

<211> 106

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 36

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser Phe Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 37

<211> 117

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 37

Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 38

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 38

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Glu Leu Tyr Ser Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 39

<211> 117

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 39

Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 40

<211> 106

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 40

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Thr Phe Ile Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 41

<211> 125

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 41

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Asp Ser Ser Ile Arg His Ala Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met

100 105 110

Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 42

<211> 113

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 42

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser

20 25 30

Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Ser Thr Pro Ile Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 43

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 43

Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser

1 5

<210> 44

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 44

Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 45

<211> 18

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 45

Ala Arg Gly Asp Ser Ser Ile Arg His Ala Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met

1 5 10 15

Asp Val

<210> 46

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 46

Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 47

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 47

Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser

1 5

<210> 48

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 48

Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Ile Thr

1 5

<210> 49

<211> 121

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 49

Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser

20 25 30

Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Gly Ser Asp Arg Phe His Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 50

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 50

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asp Thr Trp Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 51

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 51

Gly Ser Ile Ser Ser Ser Ser Tyr Tyr Trp Gly

1 5 10

<210> 52

<211> 16

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 52

Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser

1 5 10 15

<210> 53

<211> 13

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 53

Ala Arg Gly Ser Asp Arg Phe His Pro Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 54

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 54

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 55

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 55

Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr

1 5

<210> 56

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 56

Gln Gln Phe Asp Thr Trp Pro Pro Thr

1 5

<210> 57

<211> 117

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 57

Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 58

<211> 106

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 58

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Glu Gln Tyr Asp Ser Tyr Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 59

<211> 126

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 59

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Gly Arg Lys Ala Ser Gly Ser Phe Tyr Tyr Tyr Tyr Gly

100 105 110

Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 60

<211> 113

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 60

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Glu Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn

85 90 95

Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 61

<211> 126

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 61

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ala Pro Asn Tyr Gly Asp Thr Thr His Asp Tyr Tyr Tyr

100 105 110

Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 62

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 62

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asp Trp Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 63

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 63

Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr Met His

1 5

<210> 64

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 64

Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 65

<211> 19

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 65

Ala Arg Gly Ala Pro Asn Tyr Gly Asp Thr Thr His Asp Tyr Tyr Tyr

1 5 10 15

Met Asp Val

<210> 66

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 66

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala

1 5 10

<210> 67

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 67

Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr

1 5

<210> 68

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 68

Gln Gln Tyr Asp Asp Trp Pro Phe Thr

1 5

<210> 69

<211> 124

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 69

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Thr Gly Glu Tyr Tyr Asp Thr Asp Asp His Gly Met Asp

100 105 110

Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 70

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 70

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Asp Tyr Trp Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 71

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 71

Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr Tyr Met His

1 5

<210> 72

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 72

Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 73

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 73

Ala Arg Asp Thr Gly Glu Tyr Tyr Asp Thr Asp Asp His Gly Met Asp

1 5 10 15

Val

<210> 74

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 74

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala

1 5 10

<210> 75

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 75

Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr

1 5

<210> 76

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 76

Gln Gln Asp Asp Tyr Trp Pro Pro Thr

1 5

<210> 77

<211> 121

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 77

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Gly Gly Tyr Tyr Asp Ser Gly Ala Gly Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 78

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 78

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asp Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Val Ser Tyr Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 79

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 79

Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser

1 5

<210> 80

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 80

Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 81

<211> 14

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 81

Ala Lys Asp Gly Gly Tyr Tyr Asp Ser Gly Ala Gly Asp Tyr

1 5 10

<210> 82

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 82

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asp Ser Trp Leu Ala

1 5 10

<210> 83

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 83

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 84

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 84

Gln Gln Gly Val Ser Tyr Pro Arg Thr

1 5

<210> 85

<211> 122

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 85

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ala Pro Met Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 86

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 86

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Val Ser Phe Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 87

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 87

Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ser Met Asn

1 5

<210> 88

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 88

Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 89

<211> 15

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 89

Ala Arg Gly Ala Pro Met Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro

1 5 10 15

<210> 90

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 90

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala

1 5 10

<210> 91

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 91

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 92

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 92

Gln Gln Gly Val Ser Phe Pro Arg Thr

1 5

<210> 93

<211> 125

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 93

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Ala Gly Phe Ala Tyr Gly Met Asp Tyr Tyr Tyr Met

100 105 110

Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 94

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 94

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asp Asn Trp Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 95

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 95

Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr Met His

1 5

<210> 96

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 96

Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 97

<211> 18

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 97

Ala Arg Glu Gly Ala Gly Phe Ala Tyr Gly Met Asp Tyr Tyr Tyr Met

1 5 10 15

Asp Val

<210> 98

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 98

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 99

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 99

Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr

1 5

<210> 100

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 100

Gln Gln Ser Asp Asn Trp Pro Phe Thr

1 5

<210> 101

<211> 121

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 101

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Arg Gly Leu Gly Asp Gly Thr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 102

<211> 110

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 102

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn

20 25 30

Ala Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Tyr Asp Asp Leu Leu Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Phe Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu

85 90 95

Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 103

<211> 115

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 103

Gln Val His Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Asp Asp Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly His Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Ala Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Asn Trp Asp Asp Ala Phe Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 104

<211> 108

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 104

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro

85 90 95

Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 105

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 105

Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr Trp Ser

1 5

<210> 106

<211> 16

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 106

Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser

1 5 10 15

<210> 107

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 107

Ala Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro

1 5 10

<210> 108

<211> 246

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 108

Met Ala Ala Ala Ala Ile Pro Ala Leu Leu Leu Cys Leu Pro Leu Leu

1 5 10 15

Phe Leu Leu Phe Gly Trp Ser Arg Ala Arg Arg Asp Asp Pro His Ser

20 25 30

Leu Cys Tyr Asp Ile Thr Val Ile Pro Lys Phe Arg Pro Gly Pro Arg

35 40 45

Trp Cys Ala Val Gln Gly Gln Val Asp Glu Lys Thr Phe Leu His Tyr

50 55 60

Asp Cys Gly Asn Lys Thr Val Thr Pro Val Ser Pro Leu Gly Lys Lys

65 70 75 80

Leu Asn Val Thr Met Ala Trp Lys Ala Gln Asn Pro Val Leu Arg Glu

85 90 95

Val Val Asp Ile Leu Thr Glu Gln Leu Leu Asp Ile Gln Leu Glu Asn

100 105 110

Tyr Thr Pro Lys Glu Pro Leu Thr Leu Gln Ala Arg Met Ser Cys Glu

115 120 125

Gln Lys Ala Glu Gly His Ser Ser Gly Ser Trp Gln Phe Ser Ile Asp

130 135 140

Gly Gln Thr Phe Leu Leu Phe Asp Ser Glu Lys Arg Met Trp Thr Thr

145 150 155 160

Val His Pro Gly Ala Arg Lys Met Lys Glu Lys Trp Glu Asn Asp Lys

165 170 175

Asp Val Ala Met Ser Phe His Tyr Ile Ser Met Gly Asp Cys Ile Gly

180 185 190

Trp Leu Glu Asp Phe Leu Met Gly Met Asp Ser Thr Leu Glu Pro Ser

195 200 205

Ala Gly Ala Pro Leu Ala Met Ser Ser Gly Thr Thr Gln Leu Arg Ala

210 215 220

Thr Ala Thr Thr Leu Ile Leu Cys Cys Leu Leu Ile Ile Leu Pro Cys

225 230 235 240

Phe Ile Leu Pro Gly Ile

245

<210> 109

<211> 121

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 109

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Val Thr Leu Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Thr Met Ile Thr Asn Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120

<210> 110

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 110

Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr

1 5

<210> 111

<211> 6

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 111

Asn Pro Asn Asn Gly Val

1 5

<210> 112

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 112

Ser Thr Met Ile Thr Asn Tyr Val Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 113

<211> 108

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 113

Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Thr Ser Leu Leu Val Ser Ala Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Ser Tyr Thr Ser Ser Arg Tyr Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Ala Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Ser Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 114

<211> 8

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 114

Gln Ser Val Ser Asn Asp Val Ala

1 5

<210> 115

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 115

Tyr Thr Ser Ser Arg Tyr Ala

1 5

<210> 116

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 116

Gln Gln Asp Tyr Asn Ser Pro Pro Thr

1 5

<210> 117

<211> 119

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 117

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Arg Tyr Ala Glu Glu Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Trp Asp Gly Ala Tyr Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 118

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 118

Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe

1 5

<210> 119

<211> 6

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 119

Asn Thr Asn Thr Gly Glu

1 5

<210> 120

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 120

Asp Trp Asp Gly Ala Tyr Phe Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 121

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 121

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Phe Ala Thr Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 122

<211> 8

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 122

Gln Ser Val Ser Asn Asp Val Ala

1 5

<210> 123

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 123

Phe Ala Thr Asn Arg Tyr Thr

1 5

<210> 124

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 124

Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Trp Thr

1 5

<210> 125

<211> 121

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 125

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Arg Tyr Ser Asn Tyr Val Gly Trp Phe Asp Pro Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 126

<211> 8

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 126

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Trp

1 5

<210> 127

<211> 8

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 127

Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr

1 5

<210> 128

<211> 14

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 128

Ala Arg Asp Arg Tyr Ser Asn Tyr Val Gly Trp Phe Asp Pro

1 5 10

<210> 129

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 129

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Leu Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 130

<211> 6

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 130

Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

1 5

<210> 131

<211> 3

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 131

Ala Ala Ser

1

<210> 132

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 132

Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Leu Trp Thr

1 5

<210> 133

<211> 420

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 133

Met Pro Gly Gly Cys Ser Arg Gly Pro Ala Ala Gly Asp Gly Arg Leu

1 5 10 15

Arg Leu Ala Arg Leu Ala Leu Val Leu Leu Gly Trp Val Ser Ser Ser

20 25 30

Ser Pro Thr Ser Ser Ala Ser Ser Phe Ser Ser Ser Ala Pro Phe Leu

35 40 45

Ala Ser Ala Val Ser Ala Gln Pro Pro Leu Pro Asp Gln Cys Pro Ala

50 55 60

Leu Cys Glu Cys Ser Glu Ala Ala Arg Thr Val Lys Cys Val Asn Arg

65 70 75 80

Asn Leu Thr Glu Val Pro Thr Asp Leu Pro Ala Tyr Val Arg Asn Leu

85 90 95

Phe Leu Thr Gly Asn Gln Leu Ala Val Leu Pro Ala Gly Ala Phe Ala

100 105 110

Arg Arg Pro Pro Leu Ala Glu Leu Ala Ala Leu Asn Leu Ser Gly Ser

115 120 125

Arg Leu Asp Glu Val Arg Ala Gly Ala Phe Glu His Leu Pro Ser Leu

130 135 140

Arg Gln Leu Asp Leu Ser His Asn Pro Leu Ala Asp Leu Ser Pro Phe

145 150 155 160

Ala Phe Ser Gly Ser Asn Ala Ser Val Ser Ala Pro Ser Pro Leu Val

165 170 175

Glu Leu Ile Leu Asn His Ile Val Pro Pro Glu Asp Glu Arg Gln Asn

180 185 190

Arg Ser Phe Glu Gly Met Val Val Ala Ala Leu Leu Ala Gly Arg Ala

195 200 205

Leu Gln Gly Leu Arg Arg Leu Glu Leu Ala Ser Asn His Phe Leu Tyr

210 215 220

Leu Pro Arg Asp Val Leu Ala Gln Leu Pro Ser Leu Arg His Leu Asp

225 230 235 240

Leu Ser Asn Asn Ser Leu Val Ser Leu Thr Tyr Val Ser Phe Arg Asn

245 250 255

Leu Thr His Leu Glu Ser Leu His Leu Glu Asp Asn Ala Leu Lys Val

260 265 270

Leu His Asn Gly Thr Leu Ala Glu Leu Gln Gly Leu Pro His Ile Arg

275 280 285

Val Phe Leu Asp Asn Asn Pro Trp Val Cys Asp Cys His Met Ala Asp

290 295 300

Met Val Thr Trp Leu Lys Glu Thr Glu Val Val Gln Gly Lys Asp Arg

305 310 315 320

Leu Thr Cys Ala Tyr Pro Glu Lys Met Arg Asn Arg Val Leu Leu Glu

325 330 335

Leu Asn Ser Ala Asp Leu Asp Cys Asp Pro Ile Leu Pro Pro Ser Leu

340 345 350

Gln Thr Ser Tyr Val Phe Leu Gly Ile Val Leu Ala Leu Ile Gly Ala

355 360 365

Ile Phe Leu Leu Val Leu Tyr Leu Asn Arg Lys Gly Ile Lys Lys Trp

370 375 380

Met His Asn Ile Arg Asp Ala Cys Arg Asp His Met Glu Gly Tyr His

385 390 395 400

Tyr Arg Tyr Glu Ile Asn Ala Asp Pro Arg Leu Thr Asn Leu Ser Ser

405 410 415

Asn Ser Asp Val

420

<210> 134

<211> 120

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 134

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Phe

20 25 30

Asn Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg His His Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Ser Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65 70 75 80

Ser Leu Thr Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Gly Tyr Asn Trp Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120

<210> 135

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 135

Gly Gly Ser Ile Ser Ser Phe Asn Tyr

1 5

<210> 136

<211> 5

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 136

Tyr Tyr Ser Gly Ser

1 5

<210> 137

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 137

Gly Tyr Asn Trp Asn Tyr Phe Asp Tyr

1 5

<210> 138

<211> 109

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 138

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Asn Asn

20 25 30

Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro

85 90 95

Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 139

<211> 8

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 139

Gln Ser Val Asp Asn Asn Leu Val

1 5

<210> 140

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 140

Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr

1 5

<210> 141

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 141

Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro Trp Thr

1 5 10

<210> 142

<211> 117

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 142

Met Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro

1 5 10 15

Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Pro His

20 25 30

Arg Ser Ser Tyr Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly

35 40 45

Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr

50 55 60

Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr

65 70 75 80

Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala

85 90 95

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Pro Asn Thr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 143

<211> 5

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 143

Ser Ser Tyr Ala Ile

1 5

<210> 144

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 144

Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 145

<211> 4

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 145

Gly Pro Asn Thr

1

<210> 146

<211> 114

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 146

Leu Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro

1 5 10 15

Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His

20 25 30

Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys

65 70 75 80

Ile Ser Arg Val Gly Ala Gly Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Glu

85 90 95

Thr Leu Gln Thr His Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Gly Ile

100 105 110

Lys Arg

<210> 147

<211> 16

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 147

Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp

1 5 10 15

<210> 148

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 148

Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser

1 5

<210> 149

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 149

Met Glu Thr Leu Gln Thr His Pro Thr

1 5

<210> 150

<211> 572

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 150

Met Glu Cys Leu Tyr Tyr Phe Leu Gly Phe Leu Leu Leu Ala Ala Arg

1 5 10 15

Leu Pro Leu Asp Ala Ala Lys Arg Phe His Asp Val Leu Gly Asn Glu

20 25 30

Arg Pro Ser Ala Tyr Met Arg Glu His Asn Gln Leu Asn Gly Trp Ser

35 40 45

Ser Asp Glu Asn Asp Trp Asn Glu Lys Leu Tyr Pro Val Trp Lys Arg

50 55 60

Gly Asp Met Arg Trp Lys Asn Ser Trp Lys Gly Gly Arg Val Gln Ala

65 70 75 80

Val Leu Thr Ser Asp Ser Pro Ala Leu Val Gly Ser Asn Ile Thr Phe

85 90 95

Ala Val Asn Leu Ile Phe Pro Arg Cys Gln Lys Glu Asp Ala Asn Gly

100 105 110

Asn Ile Val Tyr Glu Lys Asn Cys Arg Asn Glu Ala Gly Leu Ser Ala

115 120 125

Asp Pro Tyr Val Tyr Asn Trp Thr Ala Trp Ser Glu Asp Ser Asp Gly

130 135 140

Glu Asn Gly Thr Gly Gln Ser His His Asn Val Phe Pro Asp Gly Lys

145 150 155 160

Pro Phe Pro His His Pro Gly Trp Arg Arg Trp Asn Phe Ile Tyr Val

165 170 175

Phe His Thr Leu Gly Gln Tyr Phe Gln Lys Leu Gly Arg Cys Ser Val

180 185 190

Arg Val Ser Val Asn Thr Ala Asn Val Thr Leu Gly Pro Gln Leu Met

195 200 205

Glu Val Thr Val Tyr Arg Arg His Gly Arg Ala Tyr Val Pro Ile Ala

210 215 220

Gln Val Lys Asp Val Tyr Val Val Thr Asp Gln Ile Pro Val Phe Val

225 230 235 240

Thr Met Phe Gln Lys Asn Asp Arg Asn Ser Ser Asp Glu Thr Phe Leu

245 250 255

Lys Asp Leu Pro Ile Met Phe Asp Val Leu Ile His Asp Pro Ser His

260 265 270

Phe Leu Asn Tyr Ser Thr Ile Asn Tyr Lys Trp Ser Phe Gly Asp Asn

275 280 285

Thr Gly Leu Phe Val Ser Thr Asn His Thr Val Asn His Thr Tyr Val

290 295 300

Leu Asn Gly Thr Phe Ser Leu Asn Leu Thr Val Lys Ala Ala Ala Pro

305 310 315 320

Gly Pro Cys Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Arg Pro Ser Lys Pro Thr

325 330 335

Pro Ser Leu Ala Thr Thr Leu Lys Ser Tyr Asp Ser Asn Thr Pro Gly

340 345 350

Pro Ala Gly Asp Asn Pro Leu Glu Leu Ser Arg Ile Pro Asp Glu Asn

355 360 365

Cys Gln Ile Asn Arg Tyr Gly His Phe Gln Ala Thr Ile Thr Ile Val

370 375 380

Glu Gly Ile Leu Glu Val Asn Ile Ile Gln Met Thr Asp Val Leu Met

385 390 395 400

Pro Val Pro Trp Pro Glu Ser Ser Leu Ile Asp Phe Val Val Thr Cys

405 410 415

Gln Gly Ser Ile Pro Thr Glu Val Cys Thr Ile Ile Ser Asp Pro Thr

420 425 430

Cys Glu Ile Thr Gln Asn Thr Val Cys Ser Pro Val Asp Val Asp Glu

435 440 445

Met Cys Leu Leu Thr Val Arg Arg Thr Phe Asn Gly Ser Gly Thr Tyr

450 455 460

Cys Val Asn Leu Thr Leu Gly Asp Asp Thr Ser Leu Ala Leu Thr Ser

465 470 475 480

Thr Leu Ile Ser Val Pro Asp Arg Asp Pro Ala Ser Pro Leu Arg Met

485 490 495

Ala Asn Ser Ala Leu Ile Ser Val Gly Cys Leu Ala Ile Phe Val Thr

500 505 510

Val Ile Ser Leu Leu Val Tyr Lys Lys His Lys Glu Tyr Asn Pro Ile

515 520 525

Glu Asn Ser Pro Gly Asn Val Val Arg Ser Lys Gly Leu Ser Val Phe

530 535 540

Leu Asn Arg Ala Lys Ala Val Phe Phe Pro Gly Asn Gln Glu Lys Asp

545 550 555 560

Pro Leu Leu Lys Asn Gln Glu Phe Lys Gly Val Ser

565 570

<210> 151

<211> 120

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 151

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Gly Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Met Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg His Gly Asp Asp Pro Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120

<210> 152

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 152

Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr

1 5

<210> 153

<211> 6

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 153

Ser Ser Gly Gly Ser Tyr

1 5

<210> 154

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 154

His Gly Asp Asp Pro Ala Trp Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 155

<211> 111

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 155

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Asn

20 25 30

Asn Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp

35 40 45

Ile Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro

85 90 95

Tyr Met Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105 110

<210> 156

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 156

Ser Ser Ile Ser Ser Asn Asn Leu His

1 5

<210> 157

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 157

Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser

1 5

<210> 158

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 158

Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Tyr Met Tyr Thr

1 5 10

<210> 159

<211> 119

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 159

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Phe Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile His Pro Tyr Asp Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala His

65 70 75 80

Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Tyr Asp Gly Ser Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser Ala

115

<210> 160

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 160

Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr

1 5

<210> 161

<211> 6

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 161

His Pro Tyr Asp Gly Asp

1 5

<210> 162

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 162

Tyr Asp Gly Ser Arg Ala Met Asp Tyr

1 5

<210> 163

<211> 112

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 163

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ile Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Phe Ala

20 25 30

Gly Thr Ser Leu Met His Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ala Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Lys Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg

85 90 95

Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

<210> 164

<211> 12

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 164

Gln Ser Val Ser Phe Ala Gly Thr Ser Leu Met His

1 5 10

<210> 165

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 165

Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ala

1 5

<210> 166

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 166

Gln Gln Ser Arg Glu Tyr Pro Tyr Thr

1 5

<210> 167

<211> 120

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 167

Asn Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Thr Ser Gly Phe Thr Phe Gly Asp Tyr

20 25 30

Ala Met Ile Trp Ala Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Arg Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Met Asp Val Trp Gly Lys

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 168

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 168

Gly Phe Thr Phe Gly Asp Tyr

1 5

<210> 169

<211> 6

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 169

Ser Ser Ser Ser Ser Tyr

1 5

<210> 170

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 170

Glu Arg Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Met Asp Val

1 5 10

<210> 171

<211> 113

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 171

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Phe Leu

20 25 30

Gly Ile Asn Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Asn Lys Asp Thr Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Asn Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Lys

85 90 95

Asn Phe Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg

<210> 172

<211> 12

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 172

Glu Ser Val Ser Phe Leu Gly Ile Asn Leu Ile His

1 5 10

<210> 173

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 173

Gln Ala Ser Asn Lys Asp Thr

1 5

<210> 174

<211> 8

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 174

Ser Lys Asn Phe Pro Pro Tyr Thr

1 5

<210> 175

<211> 257

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 175

Met Ala Gln Arg Met Thr Thr Gln Leu Leu Leu Leu Leu Val Trp Val

1 5 10 15

Ala Val Val Gly Glu Ala Gln Thr Arg Ile Ala Trp Ala Arg Thr Glu

20 25 30

Leu Leu Asn Val Cys Met Asn Ala Lys His His Lys Glu Lys Pro Gly

35 40 45

Pro Glu Asp Lys Leu His Glu Gln Cys Arg Pro Trp Arg Lys Asn Ala

50 55 60

Cys Cys Ser Thr Asn Thr Ser Gln Glu Ala His Lys Asp Val Ser Tyr

65 70 75 80

Leu Tyr Arg Phe Asn Trp Asn His Cys Gly Glu Met Ala Pro Ala Cys

85 90 95

Lys Arg His Phe Ile Gln Asp Thr Cys Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn

100 105 110

Leu Gly Pro Trp Ile Gln Gln Val Asp Gln Ser Trp Arg Lys Glu Arg

115 120 125

Val Leu Asn Val Pro Leu Cys Lys Glu Asp Cys Glu Gln Trp Trp Glu

130 135 140

Asp Cys Arg Thr Ser Tyr Thr Cys Lys Ser Asn Trp His Lys Gly Trp

145 150 155 160

Asn Trp Thr Ser Gly Phe Asn Lys Cys Ala Val Gly Ala Ala Cys Gln

165 170 175

Pro Phe His Phe Tyr Phe Pro Thr Pro Thr Val Leu Cys Asn Glu Ile

180 185 190

Trp Thr His Ser Tyr Lys Val Ser Asn Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg

195 200 205

Cys Ile Gln Met Trp Phe Asp Pro Ala Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu

210 215 220

Val Ala Arg Phe Tyr Ala Ala Ala Met Ser Gly Ala Gly Pro Trp Ala

225 230 235 240

Ala Trp Pro Phe Leu Leu Ser Leu Ala Leu Met Leu Leu Trp Leu Leu

245 250 255

Ser

<210> 176

<211> 1627

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 176

Met Arg Leu Trp Ser Trp Val Leu His Leu Gly Leu Leu Ser Ala Ala

1 5 10 15

Leu Gly Cys Gly Leu Ala Glu Arg Pro Arg Arg Ala Arg Arg Asp Pro

20 25 30

Arg Ala Gly Arg Pro Pro Arg Pro Ala Ala Gly Pro Ala Thr Cys Ala

35 40 45

Thr Arg Ala Ala Arg Gly Arg Arg Ala Ser Pro Pro Pro Pro Pro Pro

50 55 60

Pro Gly Gly Ala Trp Glu Ala Val Arg Val Pro Arg Arg Arg Gln Gln

65 70 75 80

Arg Glu Ala Arg Gly Ala Thr Glu Glu Pro Ser Pro Pro Ser Arg Ala

85 90 95

Leu Tyr Phe Ser Gly Arg Gly Glu Gln Leu Arg Leu Arg Ala Asp Leu

100 105 110

Glu Leu Pro Arg Asp Ala Phe Thr Leu Gln Val Trp Leu Arg Ala Glu

115 120 125

Gly Gly Gln Arg Ser Pro Ala Val Ile Thr Gly Leu Tyr Asp Lys Cys

130 135 140

Ser Tyr Ile Ser Arg Asp Arg Gly Trp Val Val Gly Ile His Thr Ile

145 150 155 160

Ser Asp Gln Asp Asn Lys Asp Pro Arg Tyr Phe Phe Ser Leu Lys Thr

165 170 175

Asp Arg Ala Arg Gln Val Thr Thr Ile Asn Ala His Arg Ser Tyr Leu

180 185 190

Pro Gly Gln Trp Val Tyr Leu Ala Ala Thr Tyr Asp Gly Gln Phe Met

195 200 205

Lys Leu Tyr Val Asn Gly Ala Gln Val Ala Thr Ser Gly Glu Gln Val

210 215 220

Gly Gly Ile Phe Ser Pro Leu Thr Gln Lys Cys Lys Val Leu Met Leu

225 230 235 240

Gly Gly Ser Ala Leu Asn His Asn Tyr Arg Gly Tyr Ile Glu His Phe

245 250 255

Ser Leu Trp Lys Val Ala Arg Thr Gln Arg Glu Ile Leu Ser Asp Met

260 265 270

Glu Thr His Gly Ala His Thr Ala Leu Pro Gln Leu Leu Leu Gln Glu

275 280 285

Asn Trp Asp Asn Val Lys His Ala Trp Ser Pro Met Lys Asp Gly Ser

290 295 300

Ser Pro Lys Val Glu Phe Ser Asn Ala His Gly Phe Leu Leu Asp Thr

305 310 315 320

Ser Leu Glu Pro Pro Leu Cys Gly Gln Thr Leu Cys Asp Asn Thr Glu

325 330 335

Val Ile Ala Ser Tyr Asn Gln Leu Ser Ser Phe Arg Gln Pro Lys Val

340 345 350

Val Arg Tyr Arg Val Val Asn Leu Tyr Glu Asp Asp His Lys Asn Pro

355 360 365

Thr Val Thr Arg Glu Gln Val Asp Phe Gln His His Gln Leu Ala Glu

370 375 380

Ala Phe Lys Gln Tyr Asn Ile Ser Trp Glu Leu Asp Val Leu Glu Val

385 390 395 400

Ser Asn Ser Ser Leu Arg Arg Arg Leu Ile Leu Ala Asn Cys Asp Ile

405 410 415

Ser Lys Ile Gly Asp Glu Asn Cys Asp Pro Glu Cys Asn His Thr Leu

420 425 430

Thr Gly His Asp Gly Gly Asp Cys Arg His Leu Arg His Pro Ala Phe

435 440 445

Val Lys Lys Gln His Asn Gly Val Cys Asp Met Asp Cys Asn Tyr Glu

450 455 460

Arg Phe Asn Phe Asp Gly Gly Glu Cys Cys Asp Pro Glu Ile Thr Asn

465 470 475 480

Val Thr Gln Thr Cys Phe Asp Pro Asp Ser Pro His Arg Ala Tyr Leu

485 490 495

Asp Val Asn Glu Leu Lys Asn Ile Leu Lys Leu Asp Gly Ser Thr His

500 505 510

Leu Asn Ile Phe Phe Ala Lys Ser Ser Glu Glu Glu Leu Ala Gly Val

515 520 525

Ala Thr Trp Pro Trp Asp Lys Glu Ala Leu Met His Leu Gly Gly Ile

530 535 540

Val Leu Asn Pro Ser Phe Tyr Gly Met Pro Gly His Thr His Thr Met

545 550 555 560

Ile His Glu Ile Gly His Ser Leu Gly Leu Tyr His Val Phe Arg Gly

565 570 575

Ile Ser Glu Ile Gln Ser Cys Ser Asp Pro Cys Met Glu Thr Glu Pro

580 585 590

Ser Phe Glu Thr Gly Asp Leu Cys Asn Asp Thr Asn Pro Ala Pro Lys

595 600 605

His Lys Ser Cys Gly Asp Pro Gly Pro Gly Asn Asp Thr Cys Gly Phe

610 615 620

His Ser Phe Phe Asn Thr Pro Tyr Asn Asn Phe Met Ser Tyr Ala Asp

625 630 635 640

Asp Asp Cys Thr Asp Ser Phe Thr Pro Asn Gln Val Ala Arg Met His

645 650 655

Cys Tyr Leu Asp Leu Val Tyr Gln Gly Trp Gln Pro Ser Arg Lys Pro

660 665 670

Ala Pro Val Ala Leu Ala Pro Gln Val Leu Gly His Thr Thr Asp Ser

675 680 685

Val Thr Leu Glu Trp Phe Pro Pro Ile Asp Gly His Phe Phe Glu Arg

690 695 700

Glu Leu Gly Ser Ala Cys His Leu Cys Leu Glu Gly Arg Ile Leu Val

705 710 715 720

Gln Tyr Ala Ser Asn Ala Ser Ser Pro Met Pro Cys Ser Pro Ser Gly

725 730 735

His Trp Ser Pro Arg Glu Ala Glu Gly His Pro Asp Val Glu Gln Pro

740 745 750

Cys Lys Ser Ser Val Arg Thr Trp Ser Pro Asn Ser Ala Val Asn Pro

755 760 765

His Thr Val Pro Pro Ala Cys Pro Glu Pro Gln Gly Cys Tyr Leu Glu

770 775 780

Leu Glu Phe Leu Tyr Pro Leu Val Pro Glu Ser Leu Thr Ile Trp Val

785 790 795 800

Thr Phe Val Ser Thr Asp Trp Asp Ser Ser Gly Ala Val Asn Asp Ile

805 810 815

Lys Leu Leu Ala Val Ser Gly Lys Asn Ile Ser Leu Gly Pro Gln Asn

820 825 830

Val Phe Cys Asp Val Pro Leu Thr Ile Arg Leu Trp Asp Val Gly Glu

835 840 845

Glu Val Tyr Gly Ile Gln Ile Tyr Thr Leu Asp Glu His Leu Glu Ile

850 855 860

Asp Ala Ala Met Leu Thr Ser Thr Ala Asp Thr Pro Leu Cys Leu Gln

865 870 875 880

Cys Lys Pro Leu Lys Tyr Lys Val Val Arg Asp Pro Pro Leu Gln Met

885 890 895

Asp Val Ala Ser Ile Leu His Leu Asn Arg Lys Phe Val Asp Met Asp

900 905 910

Leu Asn Leu Gly Ser Val Tyr Gln Tyr Trp Val Ile Thr Ile Ser Gly

915 920 925

Thr Glu Glu Ser Glu Pro Ser Pro Ala Val Thr Tyr Ile His Gly Ser

930 935 940

Gly Tyr Cys Gly Asp Gly Ile Ile Gln Lys Asp Gln Gly Glu Gln Cys

945 950 955 960

Asp Asp Met Asn Lys Ile Asn Gly Asp Gly Cys Ser Leu Phe Cys Arg

965 970 975

Gln Glu Val Ser Phe Asn Cys Ile Asp Glu Pro Ser Arg Cys Tyr Phe

980 985 990

His Asp Gly Asp Gly Val Cys Glu Glu Phe Glu Gln Lys Thr Ser Ile

995 1000 1005

Lys Asp Cys Gly Val Tyr Thr Pro Gln Gly Phe Leu Asp Gln Trp

1010 1015 1020

Ala Ser Asn Ala Ser Val Ser His Gln Asp Gln Gln Cys Pro Gly

1025 1030 1035

Trp Val Ile Ile Gly Gln Pro Ala Ala Ser Gln Val Cys Arg Thr

1040 1045 1050

Lys Val Ile Asp Leu Ser Glu Gly Ile Ser Gln His Ala Trp Tyr

1055 1060 1065

Pro Cys Thr Ile Ser Tyr Pro Tyr Ser Gln Leu Ala Gln Thr Thr

1070 1075 1080

Phe Trp Leu Arg Ala Tyr Phe Ser Gln Pro Met Val Ala Ala Ala

1085 1090 1095

Val Ile Val His Leu Val Thr Asp Gly Thr Tyr Tyr Gly Asp Gln

1100 1105 1110

Lys Gln Glu Thr Ile Ser Val Gln Leu Leu Asp Thr Lys Asp Gln

1115 1120 1125

Ser His Asp Leu Gly Leu His Val Leu Ser Cys Arg Asn Asn Pro

1130 1135 1140

Leu Ile Ile Pro Val Val His Asp Leu Ser Gln Pro Phe Tyr His

1145 1150 1155

Ser Gln Ala Val Arg Val Ser Phe Ser Ser Pro Leu Val Ala Ile

1160 1165 1170

Ser Gly Val Ala Leu Arg Ser Phe Asp Asn Phe Asp Pro Val Thr

1175 1180 1185

Leu Ser Ser Cys Gln Arg Gly Glu Thr Tyr Ser Pro Ala Glu Gln

1190 1195 1200

Ser Cys Val His Phe Ala Cys Glu Lys Thr Asp Cys Pro Glu Leu

1205 1210 1215

Ala Val Glu Asn Ala Ser Leu Asn Cys Ser Ser Ser Asp Arg Tyr

1220 1225 1230

His Gly Ala Gln Cys Thr Val Ser Cys Arg Thr Gly Tyr Val Leu

1235 1240 1245

Gln Ile Arg Arg Asp Asp Glu Leu Ile Lys Ser Gln Thr Gly Pro

1250 1255 1260

Ser Val Thr Val Thr Cys Thr Glu Gly Lys Trp Asn Lys Gln Val

1265 1270 1275

Ala Cys Glu Pro Val Asp Cys Ser Ile Pro Asp His His Gln Val

1280 1285 1290

Tyr Ala Ala Ser Phe Ser Cys Pro Glu Gly Thr Thr Phe Gly Ser

1295 1300 1305

Gln Cys Ser Phe Gln Cys Arg His Pro Ala Gln Leu Lys Gly Asn

1310 1315 1320

Asn Ser Leu Leu Thr Cys Met Glu Asp Gly Leu Trp Ser Phe Pro

1325 1330 1335

Glu Ala Leu Cys Glu Leu Met Cys Leu Ala Pro Pro Pro Val Pro

1340 1345 1350

Asn Ala Asp Leu Gln Thr Ala Arg Cys Arg Glu Asn Lys His Lys

1355 1360 1365

Val Gly Ser Phe Cys Lys Tyr Lys Cys Lys Pro Gly Tyr His Val

1370 1375 1380

Pro Gly Ser Ser Arg Lys Ser Lys Lys Arg Ala Phe Lys Thr Gln

1385 1390 1395

Cys Thr Gln Asp Gly Ser Trp Gln Glu Gly Ala Cys Val Pro Val

1400 1405 1410

Thr Cys Asp Pro Pro Pro Pro Lys Phe His Gly Leu Tyr Gln Cys

1415 1420 1425

Thr Asn Gly Phe Gln Phe Asn Ser Glu Cys Arg Ile Lys Cys Glu

1430 1435 1440

Asp Ser Asp Ala Ser Gln Gly Leu Gly Ser Asn Val Ile His Cys

1445 1450 1455

Arg Lys Asp Gly Thr Trp Asn Gly Ser Phe His Val Cys Gln Glu

1460 1465 1470

Met Gln Gly Gln Cys Ser Val Pro Asn Glu Leu Asn Ser Asn Leu

1475 1480 1485

Lys Leu Gln Cys Pro Asp Gly Tyr Ala Ile Gly Ser Glu Cys Ala

1490 1495 1500

Thr Ser Cys Leu Asp His Asn Ser Glu Ser Ile Ile Leu Pro Met

1505 1510 1515

Asn Val Thr Val Arg Asp Ile Pro His Trp Leu Asn Pro Thr Arg

1520 1525 1530

Val Glu Arg Val Val Cys Thr Ala Gly Leu Lys Trp Tyr Pro His

1535 1540 1545

Pro Ala Leu Ile His Cys Val Lys Gly Cys Glu Pro Phe Met Gly

1550 1555 1560

Asp Asn Tyr Cys Asp Ala Ile Asn Asn Arg Ala Phe Cys Asn Tyr

1565 1570 1575

Asp Gly Gly Asp Cys Cys Thr Ser Thr Val Lys Thr Lys Lys Val

1580 1585 1590

Thr Pro Phe Pro Met Ser Cys Asp Leu Gln Gly Asp Cys Ala Cys

1595 1600 1605

Arg Asp Pro Gln Ala Gln Glu His Ser Arg Lys Asp Leu Arg Gly

1610 1615 1620

Tyr Ser His Gly

1625

<210> 177

<211> 116

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 177

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala

115

<210> 178

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 178

Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

1 5

<210> 179

<211> 6

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 179

Asp Pro Lys Thr Gly Asp

1 5

<210> 180

<211> 6

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 180

Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr

1 5

<210> 181

<211> 113

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 181

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Asn Arg Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn

85 90 95

Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg

<210> 182

<211> 13

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 182

Gln Ser Leu Val His Ser Asn Arg Asn Thr Tyr Leu His

1 5 10

<210> 183

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 183

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 184

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 184

Ser Gln Asn Thr His Val Pro Pro Thr

1 5

<210> 185

<211> 580

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 185

Met Ala Gly Thr Val Arg Thr Ala Cys Leu Val Val Ala Met Leu Leu

1 5 10 15

Ser Leu Asp Phe Pro Gly Gln Ala Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Asp

20 25 30

Ala Thr Cys His Gln Val Arg Ser Phe Phe Gln Arg Leu Gln Pro Gly

35 40 45

Leu Lys Trp Val Pro Glu Thr Pro Val Pro Gly Ser Asp Leu Gln Val

50 55 60

Cys Leu Pro Lys Gly Pro Thr Cys Cys Ser Arg Lys Met Glu Glu Lys

65 70 75 80

Tyr Gln Leu Thr Ala Arg Leu Asn Met Glu Gln Leu Leu Gln Ser Ala

85 90 95

Ser Met Glu Leu Lys Phe Leu Ile Ile Gln Asn Ala Ala Val Phe Gln

100 105 110

Glu Ala Phe Glu Ile Val Val Arg His Ala Lys Asn Tyr Thr Asn Ala

115 120 125

Met Phe Lys Asn Asn Tyr Pro Ser Leu Thr Pro Gln Ala Phe Glu Phe

130 135 140

Val Gly Glu Phe Phe Thr Asp Val Ser Leu Tyr Ile Leu Gly Ser Asp

145 150 155 160

Ile Asn Val Asp Asp Met Val Asn Glu Leu Phe Asp Ser Leu Phe Pro

165 170 175

Val Ile Tyr Thr Gln Leu Met Asn Pro Gly Leu Pro Asp Ser Ala Leu

180 185 190

Asp Ile Asn Glu Cys Leu Arg Gly Ala Arg Arg Asp Leu Lys Val Phe

195 200 205

Gly Asn Phe Pro Lys Leu Ile Met Thr Gln Val Ser Lys Ser Leu Gln

210 215 220

Val Thr Arg Ile Phe Leu Gln Ala Leu Asn Leu Gly Ile Glu Val Ile

225 230 235 240

Asn Thr Thr Asp His Leu Lys Phe Ser Lys Asp Cys Gly Arg Met Leu

245 250 255

Thr Arg Met Trp Tyr Cys Ser Tyr Cys Gln Gly Leu Met Met Val Lys

260 265 270

Pro Cys Gly Gly Tyr Cys Asn Val Val Met Gln Gly Cys Met Ala Gly

275 280 285

Val Val Glu Ile Asp Lys Tyr Trp Arg Glu Tyr Ile Leu Ser Leu Glu

290 295 300

Glu Leu Val Asn Gly Met Tyr Arg Ile Tyr Asp Met Glu Asn Val Leu

305 310 315 320

Leu Gly Leu Phe Ser Thr Ile His Asp Ser Ile Gln Tyr Val Gln Lys

325 330 335

Asn Ala Gly Lys Leu Thr Thr Thr Ile Gly Lys Leu Cys Ala His Ser

340 345 350

Gln Gln Arg Gln Tyr Arg Ser Ala Tyr Tyr Pro Glu Asp Leu Phe Ile

355 360 365

Asp Lys Lys Val Leu Lys Val Ala His Val Glu His Glu Glu Thr Leu

370 375 380

Ser Ser Arg Arg Arg Glu Leu Ile Gln Lys Leu Lys Ser Phe Ile Ser

385 390 395 400

Phe Tyr Ser Ala Leu Pro Gly Tyr Ile Cys Ser His Ser Pro Val Ala

405 410 415

Glu Asn Asp Thr Leu Cys Trp Asn Gly Gln Glu Leu Val Glu Arg Tyr

420 425 430

Ser Gln Lys Ala Ala Arg Asn Gly Met Lys Asn Gln Phe Asn Leu His

435 440 445

Glu Leu Lys Met Lys Gly Pro Glu Pro Val Val Ser Gln Ile Ile Asp

450 455 460

Lys Leu Lys His Ile Asn Gln Leu Leu Arg Thr Met Ser Met Pro Lys

465 470 475 480

Gly Arg Val Leu Asp Lys Asn Leu Asp Glu Glu Gly Phe Glu Ser Gly

485 490 495

Asp Cys Gly Asp Asp Glu Asp Glu Cys Ile Gly Gly Ser Gly Asp Gly

500 505 510

Met Ile Lys Val Lys Asn Gln Leu Arg Phe Leu Ala Glu Leu Ala Tyr

515 520 525

Asp Leu Asp Val Asp Asp Ala Pro Gly Asn Ser Gln Gln Ala Thr Pro

530 535 540

Lys Asp Asn Glu Ile Ser Thr Phe His Asn Leu Gly Asn Val His Ser

545 550 555 560

Pro Leu Lys Leu Leu Thr Ser Met Ala Ile Ser Val Val Cys Phe Phe

565 570 575

Phe Leu Val His

580

<210> 186

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 186

Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser

1 5

<210> 187

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 187

Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 188

<211> 19

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 188

Ala Arg Arg Gly Arg Lys Ala Ser Gly Ser Phe Tyr Tyr Tyr Tyr Gly

1 5 10 15

Met Asp Val

<210> 189

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 189

Glu Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Thr

<210> 190

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 190

Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser

1 5

<210> 191

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

<400> 191

Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr

1 5

<210> 192

<211> 124

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 192

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asp Lys Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Gly Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Arg Arg Gly Tyr Tyr Gly Ser Ala Tyr Gly Met Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 193

<211> 5

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 193

Asn Tyr Trp Met Asn

1 5

<210> 194

<211> 19

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 194

Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asp Lys Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser

1 5 10 15

Val Lys Gly

<210> 195

<211> 13

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 195

Arg Arg Gly Tyr Tyr Gly Ser Ala Tyr Gly Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 196

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 196

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ile Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Lys Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Phe Leu Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 197

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 197

Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr Leu Ser

1 5 10

<210> 198

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 198

Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp

1 5

<210> 199

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 199

Leu Gln Tyr Asp Phe Leu Pro Leu Thr

1 5

<210> 200

<211> 124

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 200

Glu Val His Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Asp

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Val Ser Gly Ser Gly Gly Ser Pro Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Gly Gly Ser Ile Ala Gly Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Pro Met Asp

100 105 110

Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 201

<211> 5

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 201

Ser Asp Ala Met His

1 5

<210> 202

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 202

Gly Val Ser Gly Ser Gly Gly Ser Pro Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 203

<211> 15

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 203

Gly Gly Ser Ile Ala Gly Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Pro Met Asp Val

1 5 10 15

<210> 204

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 204

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ile Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 205

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 205

Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 206

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 206

Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ile

1 5

<210> 207

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 207

Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Leu Thr

1 5

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к новым антителам, и может быть применимо в медицине. Изобретение раскрывает биспецифическое антитело, в котором Fab-фрагменты связываются с рецепторами NKG2D и 5T4, а Fc-фрагмент связывается с CD16. Изобретение может быть использовано для стимуляции специфического иммунного ответа при терапии злокачественных новообразований, экспрессирующих сверх нормы человеческий трофобластный гликопротеин (5T4). 5 н. и 20 з.п. ф-лы, 10 пр., 12 табл., 46 ил.

1. Полиспецифический связывающий белок, который связывается с NKG2D, CD16 и 5T4, содержащий:

(а) первый антигенсвязывающий сайт, содержащий вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи антитела к NKG2D;

(b) второй антигенсвязывающий сайт, содержащий вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи антитела к 5T4; и

(c) первый полипептид Fc-домена антитела; и

(d) второй полипептид Fc-домена антитела,

где указанный первый полипептид Fc–домена антитела и указанный второй полипептид Fc–домена антитела вместе связывают CD16, и

где указанный вариабельный домен тяжелой цепи или указанный вариабельный домен легкой цепи антитела к NKG2D слит с N-концом указанного первого полипептида Fc–домена антитела и указанный вариабельный домен тяжелой цепи или указанный вариабельный домен легкой цепи антитела к 5T4 слит с N-концом указанного второго полипептида Fc–домена антитела.

2. Полиспецифический связывающий белок, который связывается с NKG2D, CD16 и 5T4, по п. 1, где первый антигенсвязывающий сайт связывается с NKG2D у человека или приматов, отличных от человека.

3. Полиспецифический связывающий белок, который связывается с NKG2D, CD16 и 5T4, по п. 1 или 2, где вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи первого антигенсвязывающего сайта присутствуют в одном и том же полипептиде.

4. Полиспецифический связывающий белок, который связывается с NKG2D, CD16 и 5T4, по любому из пп. 1-3, где вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи второго антигенсвязывающего сайта присутствуют в одном и том же полипептиде.

5. Полиспецифический связывающий белок, который связывается с NKG2D, CD16 и 5T4, по любому из пп. 1-4, где первый антигенсвязывающий сайт содержит вариабельный домен тяжелой цепи, по меньшей мере на 90% идентичный аминокислотной последовательности, выбранной из: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 57 и SEQ ID NO: 59.

6. Полиспецифический связывающий белок, который связывается с NKG2D, CD16 и 5T4, по любому из пп. 1-4, где первый антигенсвязывающий сайт содержит вариабельный домен тяжелой цепи, по меньшей мере на 90% идентичный SEQ ID NO: 41, и вариабельный домен легкой цепи, по меньшей мере на 90% идентичный SEQ ID NO: 42.

7. Полиспецифический связывающий белок, который связывается с NKG2D, CD16 и 5T4, по любому из пп. 1-4, где первый антигенсвязывающий сайт содержит вариабельный домен тяжелой цепи, по меньшей мере на 90% идентичный SEQ ID NO: 49, и вариабельный домен легкой цепи, по меньшей мере на 90% идентичный SEQ ID NO: 50.

8. Полиспецифический связывающий белок, который связывается с NKG2D, CD16 и 5T4, по любому из пп. 1-4, где первый антигенсвязывающий сайт содержит вариабельный домен тяжелой цепи, по меньшей мере на 90% идентичный SEQ ID NO: 57, и вариабельный домен легкой цепи, по меньшей мере, на 90% идентичный SEQ ID NO: 58.

9. Полиспецифический связывающий белок, который связывается с NKG2D, CD16 и 5T4, по любому из пп. 1-4, где первый антигенсвязывающий сайт содержит вариабельный домен тяжелой цепи, по меньшей мере на 90% идентичный SEQ ID NO: 59, и вариабельный домен легкой цепи, по меньшей мере на 90% идентичный SEQ ID NO: 60.

10. Полиспецифический связывающий белок, который связывается с NKG2D, CD16 и 5T4, по любому из пп. 1-4, где первый антигенсвязывающий сайт содержит вариабельный домен тяжелой цепи, по меньшей мере на 90% идентичный SEQ ID NO: 101, и вариабельный домен легкой цепи, по меньшей мере на 90% идентичный SEQ ID NO: 102.

11. Полиспецифический связывающий белок, который связывается с NKG2D, CD16 и 5T4, по любому из пп. 1-4, где первый антигенсвязывающий сайт содержит вариабельный домен тяжелой цепи, по меньшей мере на 90% идентичный SEQ ID NO: 103, и вариабельный домен легкой цепи, по меньшей мере на 90% идентичный SEQ ID NO: 104.

12. Полиспецифический связывающий белок, который связывается с NKG2D, CD16 и 5T4, по любому из пп. 1-11, где вариабельный домен тяжелой цепи второго антигенсвязывающего сайта содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную SEQ ID NO: 109, и вариабельный домен легкой цепи второго антигенсвязывающего сайта содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную SEQ ID NO: 113.

13. Полиспецифический связывающий белок, который связывается с NKG2D, CD16 и 5T4, по любому из пп. 1-11, где вариабельный домен тяжелой цепи второго антигенсвязывающего сайта содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную SEQ ID NO: 117, и вариабельный домен легкой цепи второго антигенсвязывающего сайта содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную SEQ ID NO: 121.

14. Полиспецифический связывающий белок, который связывается с NKG2D, CD16 и 5T4, по любому из пп. 1-11, где вариабельный домен тяжелой цепи второго антигенсвязывающего сайта содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную SEQ ID NO: 125, и вариабельный домен легкой цепи второго антигенсвязывающего сайта содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную SEQ ID NO: 129.

15. Полиспецифический связывающий белок, который связывается с NKG2D, CD16 и 5T4, по любому из пп. 1-11, где вариабельный домен тяжелой цепи второго антигенсвязывающего сайта содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную SEQ ID NO: 192, и вариабельный домен легкой цепи второго антигенсвязывающего сайта содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную SEQ ID NO: 196.

16. Полиспецифический связывающий белок, который связывается с NKG2D, CD16 и 5T4, по любому из пп. 1-11, где вариабельный домен тяжелой цепи второго антигенсвязывающего сайта содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную SEQ ID NO: 200, и вариабельный домен легкой цепи второго антигенсвязывающего сайта содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную SEQ ID NO: 204.

17. Полиспецифический связывающий белок, который связывается с NKG2D, CD16 и 5T4, по любому из пп. 1-16, где белок содержит часть Fc-домена антитела, достаточную для связывания CD16, где Fc-домен антитела содержит шарнирный и CH2-домены.

18. Полиспецифический связывающий белок, который связывается с NKG2D, CD16 и 5T4, по п. 17, где Fc-домен антитела содержит шарнирный и СН2-домены человеческого антитела IgG1.

19. Полиспецифический связывающий белок, который связывается с NKG2D, CD16 и 5T4, по п. 17 или 18, где Fc-домен содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 234-332 человеческого антитела IgG1.

20. Полиспецифический связывающий белок, который связывается с NKG2D, CD16 и 5T4, по п. 19, где Fc-домен содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную Fc-домену человеческого IgG1, и отличается в одном или более положениях, выбранных из группы, состоящей из Q347, Y349, L351, S354, E356, E357, K360, Q362, S364, T366, L368, K370, N390, K392, T394, D399, S400, D401, F405, Y407, K409, T411 и K439.

21. Композиция для лечения экспрессирующего 5T4 злокачественного новообразования, содержащая эффективное количество полиспецифического связывающего белка, который связывается с NKG2D, CD16 и 5T4, по любому из пп. 1-20 и фармацевтически приемлемый носитель.

22. Клетка-хозяин для получения рекомбинантного белка, содержащая одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих полиспецифический связывающий белок, который связывается с NKG2D, CD16 и 5T4, по любому из пп. 1-20.

23. Способ усиления гибели экспрессирующих 5T4 опухолевых клеток, включающий воздействие эффективного полиспецифического связывающего количества белка, который связывается с NKG2D, CD16 и 5T4, по любому из пп. 1-20 на экспрессирующие 5T4 опухолевые клетки и клетки-натуральные киллеры.

24. Способ лечения экспрессирующего 5T4 злокачественного новообразования, где указанный способ включает введение пациенту эффективного количества полиспецифического связывающего белка, который связывается с NKG2D, CD16 и 5T4, по любому из пп. 1-20 или композиции по п. 21.

25. Способ по п. 24, где экспрессирующее 5T4 злокачественное новообразование, подлежащее лечению, выбирают из группы, состоящей из колоректального рака, рака яичника, немелкоклеточного рака легкого, рака почки и рака желудка.