ХИМЕРНЫЕ БЕЛКИ НА ОСНОВЕ TIGIT И LIGHT Российский патент 2022 года по МПК A61K38/17 A61K38/19 C07K14/525 

ПРИОРИТЕТ

Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно предварительной заявке на патент США №62/464002, поданной 27 февраля 2017 года, содержание которой полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.

ОПИСАНИЕ ТЕКСТОВОГО ФАЙЛА, ПОДАННОГО В ЭЛЕКТРОННОМ ВИДЕ

Настоящая заявка содержит перечень последовательностей. Он был подан в электронном виде через EFS-Web в виде текстового файла ASCII, названного "SHK-001PC1_SequenceListing_ST25". Размер файла с перечнем последовательностей составляет 141613 байт, и он был создан 27 февраля 2018 г. или приблизительно в эту дату. Перечень последовательностей полностью включен в настоящий документ посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится в том числе к композициям и способам, включающим химерные белки, которые находят применение при лечении заболеваний, такое как иммунотерапия рака и аутоиммунных нарушений.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Иммунная система играет центральную роль в ответе организма на инородные структуры, способные вызывать заболевания. Однако многие раковые заболевания выработали механизмы, позволяющие избегать иммунной системы, например, путем доставки или распространения иммуноингибирующих сигналов. Таким образом, остается необходимость в разработке терапевтических средств, наделенных несколькими функциональными возможностями, например, способностью обращать иммуноингибирующий сигнал и стимулировать противораковый иммунный ответ.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Соответственно, в различных аспектах настоящего изобретения предложены композиции и способы, подходящие для применения в иммунотерапии рака. Например, настоящее изобретение относится в том числе к определенным химерным белкам, обращающим или подавляющим иммуноингибирующие сигналы, в то же время обеспечивая иммуноактивирующие или костимулирующие сигналы. Важно, что, среди прочего, настоящее изобретение обеспечивает улучшенные химерные белки, способные поддерживать стабильное и продуцируемое мультимерное состояние, которое, как полагают, не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, основано на стабилизации в линкерной области, включающей одну или более дисульфидных связей. Соответственно, настоящие композиции и способы преодолевают различные недостатки в получении биспецифических агентов.

В некоторых аспектах химерный белок имеет следующую общую структуру: N-конец - (а)-(b)-(с) - С-конец, где (а) представляет собой первый домен, содержащий внеклеточный домен трансмембранного белка I типа, (b) представляет собой линкер, содержащий по меньшей мере один остаток цистеина, способный образовывать дисульфидную связь (включая, не ограничиваясь перечисленным, Fc-домен шарнир-СН2-СН3, полученный из человеческого IgG4), и (с) представляет собой второй домен, содержащий внеклеточный домен трансмембранного белка II типа, где линкер соединяет первый домен и второй домен и необязательно содержит один или более соединяющих линкеров, как описано в настоящем документе.

Например, в ряде вариантов осуществления внеклеточный домен трансмембранного белка I типа получен из TIGIT (VSIG9, VSTM3).

В ряде вариантов осуществления химерный белок имеет следующую общую структуру: N-конец - (a)-(b)-(c) - С-конец, где (а) представляет собой первый домен, содержащий внеклеточный домен трансмембранного белка I типа, представляющего собой TIGIT, (b) представляет собой линкер, содержащий по меньшей мере один остаток цистеина, способный образовывать дисульфидную связь (включая, не ограничиваясь перечисленным, Fc-домен шарнир-СН2-СН3, полученный из человеческого IgG4), и (с) представляет собой второй домен, содержащий внеклеточный домен трансмембранного белка II типа, выбранного из 4-1BBL (TNFSF9), GITRL (TNFSF18), TL1A (TNFSF15) и LIGHT (TNFSF14), где линкер соединяет первый домен и второй домен и необязательно содержит один или более соединяющих линкеров, как описано в настоящем документе.

Например, в ряде вариантов осуществления внеклеточный домен трансмембранного белка II типа получен из LIGHT.

В ряде вариантов осуществления химерный белок имеет следующую общую структуру: N-конец - (a)-(b)-(c) - С-конец, где (а) представляет собой первый домен, содержащий внеклеточный домен трансмембранного белка I типа, выбранного из PD-1, CD172a(SIRPα) и TIGIT, (b) представляет собой линкер, содержащий по меньшей мере один остаток цистеина, способный образовывать дисульфидную связь (включая, не ограничиваясь перечисленным, Fc-домен шарнир-СН2-СН3, полученный из человеческого IgG4), и (с) представляет собой второй домен, содержащий внеклеточный домен трансмембранного белка II типа, представляющего собой LIGHT, где линкер соединяет первый домен и второй домен и необязательно содержит один или более соединяющих линкеров, как описано в настоящем документе.

В некоторых аспектах предложен способ лечения рака или воспалительного заболевания, включающий введение эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей вышеупомянутые химерные белки. В ряде вариантов осуществления Т-клетки субъекта активируются при связывании вторым доменом химерного белка и (а) при связывании одной или более опухолевых клеток первым доменом химерного белка предотвращается передача ими иммуносупрессивного сигнала, (b) достигается количественно измеримый цитокиновый ответ в периферической крови субъекта, и/или (с) уменьшается рост опухоли у нуждающегося в этом субъекта по сравнению с субъектом, получавшим лечение антителами к белку I типа или II типа, или их соответствующим лигандам или рецепторам. В ряде вариантов осуществления способ стимулирует передачу сигналов одним или более из LIGHT, 4-1BBL, GITRL и TL1A и активирует антигенпрезентирующие клетки. В ряде вариантов осуществления способ уменьшает количество или активность регуляторных Т-клеток (Treg) по сравнению с субъектами, не получавшими лечения, или субъектами, получавшими лечение антителами к белку I типа или II типа, или их соответствующим лигандам или рецепторам. В ряде вариантов осуществления способ увеличивает примирование эффекторных Т-клеток в дренирующих лимфатических узлах субъекта по сравнению с субъектами, не получавшими лечения, или субъектами, получавшими лечение антителами к белку I типа или II типа, или их соответствующим лигандам или рецепторам. В ряде вариантов осуществления способ вызывает общее снижение числа иммуносупрессивных клеток и сдвиг в сторону более воспалительного окружения опухоли по сравнению с субъектами, не получавшими лечения, или субъектами, получавшими лечение антителами к белку I типа или II типа, или их соответствующим лигандам или рецепторам.

Любой аспект или вариант осуществления, описанные в настоящем документе, могут быть объединены с любым другим аспектом или вариантом осуществления, раскрытым в настоящем документе.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На ФИГ. 1A-1D приведены схематические иллюстрации того, как мембранный белок I типа и II типа (ФИГ. 1А и ФИГ. 1С) может быть сконструирован с удалением трансмембранного и внутриклеточного доменов и присоединением с помощью линкерной последовательности (ФИГ. 1В) с получением одного химерного белка, где каждый из внеклеточных доменов мембранных белков I типа и II типа в одном химерном белке обращен наружу. На ФИГ. 1В показано связывание мембранного белка I типа и II типа путем удаления трансмембранного и внутриклеточного доменов каждого белка, где освобожденные внеклеточные домены (ВКД) каждого белка были соединены линкерной последовательностью. ВКД на этой иллюстрации может включать всю аминокислотную последовательность белка-кандидата I типа или II типа, обычно локализованную снаружи клеточной мембраны, или любую ее часть, сохраняющую связывание с целевым рецептором или лигандом. На ФИГ. 1D показаны присоединенные внеклеточные домены в линейной конструкции, где внеклеточный домен мембранного белка I типа обращен к «левой» стороне конструкции, а внеклеточный домен мембранного белка II типа обращен к «правой» стороне конструкции.

На ФИГ. 2А на примере химерного белка PD-1-Fc-OX40L показано, что опухолевые клетки могут экспрессировать на своей поверхности PD-L1, который может связываться с PD-1, экспрессируемым Т-клеткой (ФИГ. 2В). Это взаимодействие подавляет активацию Т-клеток. Химерный белок, содержащий внеклеточный домен PD-1, присоединенный к внеклеточному домену OX40L, может связываться с PD-L1 на поверхности опухолевой клетки, предотвращая связывание с PD-1 на поверхности Т-клетки (ФИГ. 2С). Химерный белок может затем «свисать» с поверхности опухолевой клетки, и часть химерного белка, представляющая собой OX40L, может затем связываться с ОХ40, экспрессируемым на поверхности Т-клетки. Это приведет к замене ингибирующего сигнала PD-L1 костимулирующим сигналом OX40L, усиливая противоопухолевую активность Т-клеток. На ФИГ. 2D показан синапс, образованный химерным белком между опухолевой клеткой и Т-клеткой. На ФИГ. 2А-2С проиллюстрированы механизмы, посредством которых химерный белок PD-1-Fc-OX40L связывается со своими молекулами-мишенями, создавая синапс между клетками; таким образом, PD-1-Fc-OX40L является примером механизма, посредством которого действуют химерные белки согласно настоящему изобретению.

На ФИГ. 3А показаны вестерн-блоты мышиных химерных белков TIGIT-Fc-OX40L, прошедших SDS-PAGE (электрофорез белков в полиакриламидом геле в присутствии додецилсульфата натрия) в восстанавливающих условиях, после обработки N+O-дегликозилирующим ферментом и/или после кипячения.

На ФИГ. 3В показаны вестерн-блоты человеческих химерных белков TIGIT-Fc-OX40L, прошедших SDS-PAGE в восстанавливающих условиях, после обработки N+O-дегликозилирующим ферментом и/или после кипячения. В обоих случаях специфическое обнаружение каждого домена показано с помощью блотов с антителами к TIGIT, к Fc и к OX40L.

ФИГ. 4А представляет собой графики, демонстрирующие результаты анализа ELISA (иммуноферментного анализа) мышиных химерных белков TIGIT-Fc-OX40L, проведенного в следующих условиях: тяжелая + легкая цепь были захвачены и обнаружены с помощью Fc-HRP (вверху слева), CD155/PVR-His был захвачен и обнаружен с помощью IgG (вверху справа), OX40-His был захвачен и обнаружен с помощью антитела к mOX40L (внизу слева), и OX40-Fc был захвачен и обнаружен с помощью рекомбинантного CD155 (внизу справа). ФИГ. 4В представляет собой графики, демонстрирующие результаты анализа ELISA человеческих химерных белков TIGIT-Fc-OX40L, проведенного в следующих условиях: тяжелая + легкая цепь были захвачены и обнаружены с помощью Fc-HRP (вверху слева), CD155/PVR-His был захвачен и обнаружен с помощью IgG (вверху справа), OX40-His был захвачен и обнаружен с помощью антитела к mOX40L (внизу слева), и OX40-Fc был захвачен и обнаружен с помощью рекомбинантного белка CD155, CD112 или CD113 (внизу справа).

На ФИГ. 5А показаны клеточные линии, полученные для сверхэкспрессии человеческого PVR (CHOK1/PVR), которые можно использовать для обнаружения связывания посредством конструкции, содержащей TIGIT (на ФИГ. 5А неокрашенные и изотип перекрываются).

На ФИГ. 5В показаны клеточные линии, полученные для сверхэкспрессии нектина-2 (CHOK1/Nectin2), которые можно использовать для обнаружения связывания посредством конструкции, содержащей TIGIT.

На ФИГ. 5С показаны клеточные линии, полученные для сверхэкспрессии нектина-3 (CHOK1/Nectin3), которые можно использовать для обнаружения связывания с помощью конструкции, содержащей TIGIT (на ФИГ. 5С неокрашенные, изотип и Ab для обнаружения перекрываются).

ФИГ. 6 представляет собой графики, демонстрирующие связывание мышиного TIGIT-Fc-OX40L с клетками СНО-K1, экспрессирующими мышиный PVR (вверху слева), с родительскими клетками СНО-K1, лишенными PVR (внизу слева), или с клетками СНО-K1, экспрессирующими мышиный ОХ40 (справа).

ФИГ. 7 представляет собой таблицу с результатами, показывающую выявленных партнеров по связыванию человеческого TIGIT-Fc-OX40L из микрочипа, содержащего приблизительно 6000 человеческих мембранных белков. В каждом случае ожидаемые партнеры по связыванию для каждой молекулы-кандидата были выявлены с помощью скрининга. Не было обнаружено никаких свидетельств неспецифического связывания с другими человеческими белками, и связывание с галектином-1 видно на скрининге всех Fc-содержащих слитых белков.

На ФИГ. 8А показаны вестерн-блоты мышиных химерных белков mCD172a(SIRPα)-Fc-LIGHT, прошедших SDS-PAGE в восстанавливающих условиях, после обработки N+O-дегликозилирующим ферментом и/или после кипячения.

На ФИГ. 8В показаны вестерн-блоты человеческих химерных белков CD172a(SIRPα)-Fc-LIGHT, прошедших SDS-PAGE в восстанавливающих условиях, после обработки N+O-дегликозилирующим ферментом и/или после кипячения.

ФИГ. 9А представляет собой графики, демонстрирующие результаты анализа ELISA мышиных химерных белков mCD172a(SIRPα)-Fc-LIGHT, проведенного в следующих условиях: тяжелая + легкая цепь были захвачены и обнаружены с помощью Fc-HRP (вверху слева), CD47-His был захвачен и обнаружен с помощью IgG (вверху справа), mLTBR-His был захвачен и обнаружен с помощью антитела к mLIGHT (внизу слева), и LTBR His + GST был захвачен и обнаружен с помощью антитела к SIRPα (внизу справа). ФИГ. 9В представляет собой графики, демонстрирующие результаты анализа ELISA человеческих химерных белков CD172a(SIRPα)-Fc-LIGHT, проведенного в следующих условиях: тяжелая + легкая цепь были захвачены и обнаружены с помощью Fc-HRP (вверху слева), CD47-His был захвачен и обнаружен с помощью IgG (вверху справа), человеческий LTBR-His был захвачен и обнаружен с помощью антитела к человеческому LIGHT (внизу слева), и LTBR His + GST был захвачен и обнаружен с помощью антитела к SIRPα (внизу справа).

ФИГ. 10А представляет собой графики, демонстрирующие связывание мышиного CD 172a(SIRPα)-Fc-LIGHT с клетками СНО-K1, экспрессирующими мышиный CD47 (слева), или с клетками СНО-K1, экспрессирующими мышиный LTbR (справа). ФИГ. 10В представляет собой графики, демонстрирующие связывание человеческого CD172a(SIRPα)-Fc-LIGHT с клетками СНО-K1, экспрессирующими мышиный CD47 (контрольный пик детекции только антитела находится далеко слева, остаток пика распределен слева направо при увеличении концентрации (т.е. 250 находится далеко справа)).

ФИГ. 11А представляет собой графики, демонстрирующие связывание человеческих CD172a(SIRPα)-Fc-LIGHT и CD172a(SIRPα)-Fc-CD40L с эритроцитами яванского макака по сравнению с антителами, специфичными к CD47 (клон СС2С6 или СС900002), вверху слева. Лизис эритроцитов яванского макака после каждой обработки показан на кривой титрования в левом нижнем углу, а образец пластинки показан справа. В качестве положительного контроля, вызывающего лизис эритроцитов яванского макака, использовали Triton-X (для сравнения, на верхней секции, в точке на оси X, соответствующей 2 нМ, кривые сверху вниз представляют собой антитело к CD47/IgG-АРС, антитело к CD47-FITC, SIRPα-Fc-LIGHT и SIRPα-Fc-CD40L, в то время как на нижней секции в точке на оси X, соответствующей 2, кривые сверху вниз представляют собой Triton-X100, антитело к CD47 (СС2С6) и антитело к CD47 (СС9002), SIRPα-Fc-LIGHT и SIRPα-Fc-CD40L, все накладываются). ФИГ. 11В представляет собой графики, демонстрирующие связывание человеческих CD172a(SIRPα)-Fc-LIGHT и CD172a(SIRPα)-Fc-CD40L с человеческими эритроцитами по сравнению с антителами, специфичными к CD47 (клон СС2С6 или СС900002), полученными от каждого из 3 доноров человеческой крови. На ФИГ. 11С лизис человеческих эритроцитов после каждой обработки показан на кривой титрования слева, а образец пластинки показан справа. В качестве положительного контроля, вызывающего лизис эритроцитов яванского макака, использовали Triton-X. Данные приведены для 3 доноров человеческих эритроцитов.

На ФИГ. 12А показаны вестерн-блоты мышиных химерных белков PD-1-Fc-LIGHT, прошедших SDS-PAGE в восстанавливающих условиях, после обработки N+O-дегликозилирующим ферментом и/или после кипячения. На ФИГ. 12В показаны вестерн-блоты человеческих химерных белков PD-1-Fc-LIGHT, прошедших SDS-PAGE в восстанавливающих условиях, после обработки N+O-дегликозилирующим ферментом и/или после кипячения.

ФИГ. 13А представляет собой графики, демонстрирующие результаты анализа ELISA мышиных химерных белков PD-1-Fc-LIGHT, проведенного в следующих условиях: тяжелая + легкая цепь были захвачены и обнаружены с помощью Fc-HRP (слева), mLTBR-His был захвачен и обнаружен с помощью антитела к mLIGHT (посередине), и LmPD-L1 был захвачен и обнаружены с помощью антитела к mLIGHT (справа). ФИГ. 13 В представляет собой графики, демонстрирующие результаты анализа ELISA человеческих химерных белков PD-1-Fc-LIGHT, проведенного в следующих условиях: тяжелая + легкая цепь были захвачены и обнаружены с помощью Fc-HRP (слева), hLTBR-Fc His был захвачен и обнаружен с помощью биотинилированного hLIGHT (посередине), и hPDL1-Fc был захвачен и обнаружен с помощью hLTBR-His/6x His-HRP (справа).

ФИГ. 14А представляет собой графики, демонстрирующие связывание мышиного PD-1-Fc-LIGHT с клетками СНО-K1, экспрессирующими мышиный PD-L1 (слева), или с клетками СНО-K1, экспрессирующими мышиный LTbR (справа). ФИГ. 14В представляет собой графики, демонстрирующие связывание человеческого PD-1-Fc-LIGHT с клетками СНО-K1, экспрессирующими человеческий PD-L1.

На ФИГ. 15А показаны вестерн-блоты мышиных химерных белков TIGIT-Fc-LIGHT, прошедших SDS-PAGE в восстанавливающих условиях, после обработки N+O-дегликозилирующим ферментом и/или после кипячения. На ФИГ. 15В показаны вестерн-блоты человеческих химерных белков TIGIT-Fc-LIGHT, прошедших SDS-PAGE в восстанавливающих условиях, после обработки N+O-дегликозилирующим ферментом и/или после кипячения.

ФИГ. 16А представляет собой графики, демонстрирующие результаты анализа ELISA мышиных химерных белков TIGIT-Fc-LIGHT, проведенного в следующих условиях: тяжелая + легкая цепь были захвачены и обнаружены с помощью Fc-HRP (слева), CD155/PVR был захвачен и обнаружен с помощью Fc-HRP (посередине), и mLTBR-His был захвачен и обнаружен с помощью антитела к mLIGHT (справа). ФИГ. 16 В представляет собой графики, демонстрирующие результаты анализа ELISA человеческих химерных белков TIGIT-Fc-LIGHT, проведенного в следующих условиях: тяжелая + легкая цепь были захвачены и обнаружены с помощью Fc-HRP (слева), CD155-His был захвачен и обнаружен с помощью IgG (посередине), и hCD155-Fc был захвачен и обнаружен с помощью hLTBR-His/6x His-HRP (справа).

ФИГ. 17 представляет собой графики, демонстрирующие связывание мышиного TIGIT-Fc-LIGHT с клетками СНО-K1, экспрессирующими мышиный PVR (слева), или с клетками СНО-K1, экспрессирующими мышиный LTbR (справа).

ФИГ. 18А представляет собой графики, демонстрирующие результаты измерения аффинности связывания, полученные с помощью биослойной интерферометрии с использованием системы Octet, демонстрирующие связывание человеческих TIGIT-Fc-LIGHT, CD172a(SIRPα)-Fc-LIGHT и PD-1-Fc-LIGHT с человеческим LTbR (все секции, сверху вниз: 30, 10, 3,3, 0). ФИГ. 18 В представляет собой результаты измерения аффинности связывания, полученные с помощью биослойной интерферометрии с использованием системы Octet, демонстрирующие связывание человеческого PD-1-Fc-LIGHT с рекомбинантными человеческими PD-L1 и PD-L2 в диапазоне концентраций (сверху вниз: 500 нМ ARC x PD-L1, 500 нМ ARC x PD-L2, 166 нМ ARC x PD-L1, 166 нМ ARC x PD-L2, 56 нМ ARC x PD-L1, 56 нМ ARC x PD-L2, без ARC).

ФИГ. 19А представляют собой графики, демонстрирующие результаты измерения аффинности связывания, полученные с помощью биослойной интерферометрии с использованием системы Octet, демонстрирующие связывание человеческих TIGIT-Fc-OX40L и TIGIT-Fc-LIGHT с рекомбинантным человеческим CD155/PVR по сравнению с контролем односторонним слитым белком TIGIT-Fc (сверху вниз: TIGIT-Fc-LIGHT, TIGIT-Fc-Ox40L, TIGIT-Fc). ФИГ. 19В представляет собой результаты измерения аффинности связывания, полученные с помощью биослойной интерферометрии с использованием системы Octet, демонстрирующие связывание человеческого CD172a(SIRPα)-Fc-LIGHT с рекомбинантным человеческим CD47 по сравнению с контролем односторонним CD172a(SIRPα)-Fc, или одним из двух контролен антителом к CD47 (сверху вниз: SIRPα-Fc-LIGHT, антитело к CD47, антитело СС2С6 к CD47 и SIRP-Fc). ФИГ. 19С представляет собой результаты измерения аффинности связывания, полученные с помощью биослойной интерферометрии с использованием системы Octet, демонстрирующие связывание человеческого PD-1-Fc-LIGHT с рекомбинантными человеческими PD-L1 по сравнению с контролем односторонним PD-1-Fc, или контролем антителом к PD-L1 (атезолизумаб) (сверху вниз: PD-1-Fc-LIGHT, антитело к PDL1 и PD-1-Fc). ФИГ. 19D представляет собой результаты измерения аффинности связывания, полученные с помощью биослойной интерферометрии с использованием системы Octet, демонстрирующие связывание человеческих CD172a(SIRPα)-Fc-LIGHT, TIGIT-Fc-LIGHT или PD-1-Fc-LIGHT с рекомбинантным человеческим LTbR по сравнению с контролем односторонним слитым белком LIGHT-Fc или контролем антителом к LTbR (сверху вниз: TIGIT-Fc-LIGHT, Sirp1a-Fc-LIGHT, антитело к LTbR, PD-1-Fc-LIGHT и LIGHT-Fc).

На ФИГ. 20А и ФИГ. 20В показаны анализы высвобождения цитокинов под воздействием суперантигена, которые демонстрируют действия различных антител, химерных белков мышиного TIGIT-Fc-OX40L, мышиного CD172a(SIRPα)-Fc-LIGHT, мышиного TIGIT-Fc-LIGHT и мышиного PD-1-Fc-LIGHT на мышиные лейкоциты периферической крови, активированные стафилококковым энтеротоксином В (SEB). На ФИГ. 20А показан анализ секреции IL2, а на ФИГ. 20В показан анализ секреции TNFα. На ФИГ. 20А и ФИГ. 20В порядок условий для каждой концентрации SEB дублирует, слева направо, условия, перечисленные в легендах сверху вниз (например, α-PD-1 (RMP1-14) представляет собой третье сверху в легендах и, следовательно, является третьим слева на графиках, PD-1-Fc-LIGHT (10 нМ) представляет собой третье снизу в легендах и, следовательно, является третьим справа на графиках, и т.д.). На ФИГ. 20С показаны сводные данные, полученные для нескольких концентраций суперантигена (SEB) (в этом случае также порядок условий для каждой концентрации SEB дублирует, слева направо, условия, перечисленные в легендах сверху вниз).

На ФИГ. 21А-21С показаны анализы высвобождения цитокинов под воздействием суперантигена, которые демонстрируют действия различных антител, химерных белков человеческого TIGIT-Fc-LIGHT (ФИГ. 21А), человеческого TIGIT-Fc-OX40L (ФИГ. 21В), человеческого PD-1-Fc-LIGHT и человеческого CD172a(SIRPα)-Fc-LIGHT (ФИГ. 21С) на человеческие лейкоциты периферической крови, активированные стафилококковым энтеротоксином В (SEB).

На ФИГ. 22А и 22В показаны результаты исследований опухолей in vivo, демонстрирующие противоопухолевую эффективность химерных белков mTIGIT-Fc-OX40L, mCD172a(SIRPα)-Fc-LIGHT, mTIGIT-Fc-LIGHT и mPD-1-Fc-LIGHT по сравнению с моноклональными антителами к TIGIT, CD47, ОХ40, PD-1 или комбинации TIGIT и ОХ40. Опухоль СТ26 имплантировали мышам Balb/с до лечения указанными схемами. На ФИГ. 22А показано изменение размера опухоли в течение сорока дней после инокуляции опухоли для каждой группы. На ФИГ. 22В показан общий процент выживаемости мышей вплоть до сорока дней после инокуляции опухоли, а количество мышей, полностью отвергших опухоли, указано во встроенной таблице. На ФИГ. 22А и ФИГ. 22В условия лечения обозначены буквами.

На ФИГ. 23, не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, показаны четыре потенциальные конфигурации химерных белков PD-1-Fc-OX40L.

На ФИГ. 24 показаны вестерн-блоты химерных белков PD-1-Fc-OX40L, прошедших SDS-PAGE в невосстанавливающих условиях, восстанавливающих условиях, и восстанавливающих условиях после обработки пептид-N-гликозидазой F (PNGa3a F).

На ФИГ. 25 показана хроматограмма химерных белков PD-1-Fc-OX40L, полученная с помощью эксклюзионной хроматографии (SEC).

На ФИГ. 26 показаны результаты анализа SDS-PAGE и нативного PAGE (без SDS) химерных белков PD-1-Fc-OX40L, проведенного в невосстанавливающих условиях («-») или в восстанавливающих условиях («+»).

На ФИГ. 27 показаны результаты нативного PAGE (без SDS) химерных белков PD-1-No Fc-OX40L, лишенных Fc-домена.

На ФИГ. 28, не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, показана модель образования гексамера и конкатемеров из химерных белков согласно настоящему изобретению.

На ФИГ. 29A-29Q показана характеристика химерных белков PD-1-Fc-OX40L с различными последовательностями соединяющих линкеров с помощью вестерн-блоттинга. Последовательности различных соединяющих линкеров приведены ниже в разделе «Примеры». А именно, каждый отдельный домен слитой конструкции исследовали с использованием антитела к α-PD-1, α-Fc или α-OX40L. На каждой фигуре необработанные образцы химерного белка PD-1-Fc-OX40L, например, контрольный, загружали в 1 дорожку во всех блотах (без β-меркаптоэтанола или PNGазы). Образцы во 2 дорожке были обработаны восстановителем β-меркаптоэтанолом, тогда как образцы в 3 дорожке были обработаны PNGазой.

На ФИГ. 30 показана характеристика химерных белков PD-1-Fc-OX40L с различными последовательностями соединяющих линкеров с помощью анализа захвата и обнаружения на основе ELISA, направленного против центральной Fc-области белка. Была определена концентрация каждого химерного белка PD-1-Fc-OX40L с различными последовательностями соединяющих линкеров (№1-№17).

На ФИГ. 31А-31Р показаны профили проточной цитометрии химерных белков PD-1-Fc-OX40L с различными последовательностями соединяющих линкеров с помощью анализа FACS (сортировки клеток с активированной флуоресценцией) с PD-L1 или ОХ40. Значения ЕС₅₀ рассчитывали для каждого химерного белка PD-1-Fc-OX40L с различными последовательностями соединяющих линкеров (№2-№17, для идентификации линкеров см. метку на оси X и таблицу в приведенных ниже примерах).

ФИГ. 32 представляет собой таблицу, демонстрирующую соединяющие линкеры и Fc-линкеры, которые могут быть объединены в иллюстративные модульные линкеры. Показанные иллюстративные модульные линкеры могут быть объединены с любыми описанными в настоящем документе белками I типа и II типа и/или внеклеточными доменами описанных в настоящем документе белков I типа и II типа с образованием химерного белка согласно настоящему изобретению.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение основано в том числе на открытии того, что химерные белки могут быть сконструированы из внеклеточных, или эффекторных, областей иммуномодулирующих трансмембранных белков таким образом, чтобы были использованы ориентации этих белков (например, I тип по сравнению со II типом) и, следовательно, могла быть осуществлена доставка иммуностимулирующих и/или иммуноингибирующих сигналов, включая, например, маскирование иммуноингибирующего сигнала и замену его иммуностимулирующим сигналом при лечении рака, и, в частности, на открытии того, что химерные белки на основе LIGHT и/или TIGIT имеют медицинское применение.

Химерные белки

В некоторых аспектах химерный белок имеет следующую общую структуру: N-конец - (а)-(b)-(с) - С-конец, где (а) представляет собой первый домен, содержащий внеклеточный домен трансмембранного белка I типа, (b) представляет собой линкер, имеющий по меньшей мере один остаток цистеина, способный образовывать дисульфидную связь (включая, не ограничиваясь перечисленным, Fc-домен шарнир-СН2-СН3, полученный из человеческого IgG4), и (с) представляет собой второй домен, содержащий внеклеточный домен трансмембранного белка II типа, где линкер соединяет первый домен и второй домен и необязательно содержит один или более соединяющих линкеров, как описано в настоящем документе, где один из первого и второго внеклеточных доменов представляет собой иммуноингибирующий сигнал, и один из первого и второго внеклеточных доменов представляет собой иммуностимулирующий сигнал.

В ряде вариантов осуществления химерный белок относится к рекомбинантному слитому белку, например, к одному полипептиду, имеющему внеклеточные домены, описанные в настоящем документе. Например, в ряде вариантов осуществления химерный белок транслируется в клетке как единое целое. В ряде вариантов осуществления химерный белок относится к рекомбинантному белку из нескольких полипептидов, например, нескольких внеклеточных доменов, описанных в настоящем документе, связанных с образованием единого целого, например, in vitro (например, с помощью одного или более синтетических линкеров, описанных в настоящем документе).

В ряде вариантов осуществления химерный белок синтезируют химическим путем в виде одного полипептида, или каждый домен может быть отдельно синтезирован химическим путем и затем объединен. В ряде вариантов осуществления часть химерного белка транслируют, а часть синтезируют химическим путем.

В ряде вариантов осуществления внеклеточный домен относится к части трансмембранного белка, способной взаимодействовать с внеклеточной средой. В ряде вариантов осуществления внеклеточный домен относится к части транс мембранного белка, достаточной для связывания с лигандом или рецептором и эффективной передачи сигнала клетке. В ряде вариантов осуществления внеклеточный домен представляет собой полную аминокислотную последовательность трансмембранного белка, находящуюся вне клетки или клеточной мембраны. В ряде вариантов осуществления внеклеточный домен представляет собой ту часть аминокислотной последовательности трансмембранного белка, которая находится вне клетки или клеточной мембраны и необходима для передачи сигнала и/или связывания лиганда, что можно проанализировать с использованием способов, известных в данной области техники (например, in vitro анализов связывания лиганда и/или клеточной активации).

В ряде вариантов осуществления иммунноингибирующий сигнал относится к сигналу, который уменьшает или устраняет иммунный ответ. Например, в контексте онкологии такие сигналы могут уменьшать или устранять противоопухолевый иммунитет. В нормальных физиологических условиях ингибирующие сигналы используются для поддержания собственной толерантности (например, для предотвращения аутоиммунитета), а также для защиты тканей от повреждений, когда иммунная система реагирует на патогенную инфекцию. Например, не ограничиваясь перечисленным, иммуноингибирующий сигнал может быть идентифицирован путем обнаружения увеличения клеточной пролиферации, продукции цитокинов, активности по уничтожению клеток или фагоцитарной активности при блокировании такого ингибирующего сигнала.

В ряде вариантов осуществления иммуностимулирующий сигнал относится к сигналу, который усиливает иммунный ответ. Например, в контексте онкологии такие сигналы могут усиливать противоопухолевый иммунитет. Например, не ограничиваясь перечисленным, иммуностимулирующий сигнал может быть идентифицирован путем прямой стимуляции пролиферации, продукции цитокинов, активности по уничтожению или фагоцитарной активности лейкоцитов. Конкретные примеры включают прямую стимуляцию рецепторов надсемейства TNF, таких как ОХ40, LTbR, 4-1ВВ или TNFRSF25, с использованием антител-агонистов рецептора либо химерных белков, кодирующих лиганды для таких рецепторов (OX40L, LIGHT, 4-1BBL, TL1A, соответственно). Стимуляция посредством любого из этих рецепторов может непосредственно стимулировать пролиферацию и продукцию цитокинов отдельными подгруппами Т-клеток. Еще один пример включает прямую стимуляцию иммуноингибирующей клетки посредством рецептора, ингибирующего активность такой иммуносупрессорной клетки. Она может включать, например, стимуляцию регуляторных CD4+FoxP3+ Т-клеток с помощью антитела-агониста GITR или химерного белка, содержащего GITRL, что уменьшит способность этих регуляторных Т-клеток подавлять пролиферацию обычных CD4+ или CD8+ Т-клеток. В еще одном примере она может включать стимуляцию CD40 на поверхности антигенпрезентирующей клетки с помощью антитела-агониста CD40 или химерного белка, содержащего CD40L, вызывающую активацию антигенпрезентирующих клеток, включая повышенную способность этих клеток представлять антиген в контексте подходящих нативных костимулирующих молекул, в том числе молекул из надсемейства В7 или TNF. В еще одном примере она может включать стимуляцию LTBR на поверхности лимфоидной или стромальной клетки с помощью химерного белка, содержащего LIGHT, вызывающую активацию лимфоидной клетки и/или продукцию провоспалительных цитокинов или хемокинов для дальнейшей стимуляции иммунного ответа, необязательно внутри опухоли.

Мембранные белки обычно состоят из внеклеточного домена, одного или ряда трансмембранных доменов и внутриклеточного домена. Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, полагают, что внеклеточный домен мембранного белка отвечает за взаимодействие с растворимым или мембраносвязанным рецептором или лигандом. Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, полагают, что трансмембранный(ые) домен(ы) отвечают за локализацию белка в плазматической мембране. Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, полагают, что внутриклеточный домен мембранного белка отвечает за координацию взаимодействий с клеточными сигнальными молекулами для координации внутриклеточных ответов с внеклеточной средой (или наоборот). Существует два типа однопроходных мембранных белков: белки с внеклеточным аминоконцом и внутриклеточным карбоксиконцом (I тип) и белки с внеклеточным карбоксиконцом и внутриклеточным аминоконцом (II тип). Мембранные белки как I типа, так и II типа могут быть рецепторами или лигандами. В мембранных белках I типа аминоконец белка обращен за пределы клетки и, следовательно, содержит функциональные домены, отвечающие за взаимодействие с другими партнерами по связыванию (лигандами или рецепторами) во внеклеточной среде. В мембранных белках II типа карбоксиконец белка обращен за пределы клетки и, следовательно, содержит функциональные домены, отвечающие за взаимодействие с другими партнерами по связыванию (лигандами или рецепторами) во внеклеточной среде. Таким образом, эти два типа белков имеют противоположные друг другу ориентации.

Поскольку обращенные наружу домены мембранных белков I типа и II типа противоположны, можно связать внеклеточные домены мембранного белка I типа и II типа так, что «обращенные наружу» домены этих молекул также находятся в противоположной друг другу ориентации (ФИГ. 1D). Таким образом, полученная конструкция будет состоять из внеклеточного домена мембранного белка I типа на «левой» стороне молекулы, соединенного с внеклеточным доменом мембранного белка II типа на «правой» стороне молекулы с помощью линкерной последовательности. Эту конструкцию можно получить путем клонирования этих трех фрагментов (внеклеточного домена белка I типа, за которым следует линкерная последовательность, за которой следует внеклеточный домен белка II типа) в вектор (плазмиду вирусный или другой), где аминоконец полной последовательности соответствует «левой» стороне молекулы, содержащей белок I типа, а карбоксиконец полной последовательности соответствует «правой» стороне молекулы, содержащей белок II типа. Соответственно, в ряде вариантов осуществления настоящие химерные белки сконструированы как таковые.

В ряде вариантов осуществления внеклеточный домен может быть использован для получения растворимого белка, предназначенного для конкурентного ингибирования передачи сигналов лигандом этого рецептора. В ряде вариантов осуществления внеклеточный домен может использоваться для обеспечения искусственной передачи сигналов.

В ряде вариантов осуществления внеклеточный домен трансмембранного белка I типа представляет собой иммуноингибирующий сигнал. В ряде вариантов осуществления внеклеточный домен трансмембранного белка II типа представляет собой иммуностимулирующий сигнал.

В ряде вариантов осуществления настоящие химерные белки содержат внеклеточный домен трансмембранного белка I типа или его функциональный фрагмент. В ряде вариантов осуществления настоящие химерные белки содержат внеклеточный домен трансмембранного белка II типа или его функциональный фрагмент. В ряде вариантов осуществления настоящие химерные белки содержат внеклеточный домен трансмембранного белка I типа или его функциональный фрагмент и внеклеточный домен трансмембранного белка II типа или его функциональный фрагмент.

В ряде вариантов осуществления настоящие химерные белки могут быть сконструированы таким образом, чтобы они были нацелены на одну или более молекул, находящихся на человеческих лейкоцитах, включая, не ограничиваясь перечисленным, внеклеточные домены (где это применимо) SLAMF4, IL-2 Rα, 4-1BB/TNFRSF9, IL-2 Rβ, ALCAM, BTLA, B7-1, IL-4 R, B7-H3, BLAME/SLAMFS, CEACAM1, IL-6 R, IL-7 Rα, IL-10Rα, IL-10 Rβ, IL-12 Rβ1, IL-12 Rβ2, CD2, IL-13 Rα1, IL-13, CD3, CD4, ILT2/CDS5j, ILT3/CDS5k, ILT4/CDS5d, ILT5/CDS5a, интегрина α 4/CD49d, CDS, интегрина α E/CD103, CD6, интегрина α M/CD11b, CDS, интегрина α X/CD11c, интегрина β 2/CD1S, KIR/CD15S, CD27/TNFRSF7, KIR2DL1, CD2S, KIR2DL3, CD30/TNFRSFS, KIR2DL4/CD15Sd, CD31/PECAM-1, KIR2DS4, лиганда CD40/TNFSF5, CD43, LAIR1, CD45, LAIR2, CDS3, лейкотриена B4-R1, CDS4/SLAMF5, NCAM-L1, CD94, NKG2A, CD97, NKG2C, CD229/SLAMF3, NKG2D, CD2F-10/SLAMF9, NT-4, CD69, NTB-A/SLAMF6, общей γ-цепи/1b-2 Rγ, остеопонтина, CRACC/SLAMF7, PD-1, CRTAM, PSGL-1, CTLA-4, RANK/TNFRSF11 A, CX3CR1, CX3CL1, L-селектина, SIRP β1, SLAM, TCCR/WSX-1, DNAM-1, тимопоэтина, EMMPRIN/CD147, TIM-1, EphB6, TIM-2, Fas/TNFRSF6, TIM-3, лиганда Fas/TNFSF6, TIM-4, Fcγ RIII/CD16, TIM-6, TNFR1/TNFRSF1A, гранулизина, TNF RIII/TNFRSF1B, TRAIL R1/TNFRSFlOA, ICAM-1/CD54, TRAIL R2/TNFRSF10B, ICAM-2/CD102, TRAILR3/TNFRSF10C, IFN-γR1, TRAILR4/TNFRSF10D, IFN-γ R2, TSLP, IL-1 R1, LIGHT, LTBR (TNFRSF3) и TSLP R.

Активация регуляторных Т-клеток существенно зависит от костимулирующих и коингибирующих сигналов. Два основных семейства костимулирующих молекул включают семейства В7 и фактора некроза опухоли (TNF). Эти молекулы связываются с рецепторами на Т-клетках, принадлежащими к семействам рецепторов CD28 или TNF, соответственно. Многие хорошо охарактеризованные коингибиторы и их рецепторы принадлежат к семействам В7 и CD28.

В ряде вариантов осуществления настоящие химерные белки могут быть сконструированы для нацеливания на одну или более молекул, вовлеченных в иммунное ингибирование, включая, например, TIGIT.

В ряде вариантов осуществления химерный белок согласно настоящему изобретению содержит внеклеточный домен иммуноингибирующего агента, включая, например, TIGIT.

В ряде вариантов осуществления химерный белок согласно настоящему изобретению содержит внеклеточный домен мембранного белка I типа, обладающий иммуноингибирующими свойствами. В ряде вариантов осуществления химерный белок сконструирован так, чтобы нарушать, блокировать, уменьшать и/или ингибировать передачу иммуноингибирующего сигнала.

В ряде вариантов осуществления химерный белок согласно настоящему изобретению содержит внеклеточный домен иммуностимулирующего сигнала, представляющего собой LIGHT (CD258).

В ряде вариантов осуществления химерный белок имитирует связывание ингибирующего сигнального лиганда с его родственным рецептором (например, TIGIT с CD155/PVR, нектином-2, нектином-3 и/или нектином-4), но ингибирует передачу ингибирующего сигнала иммунной клетке (например, Т-клетке, макрофагу или другому лейкоциту).

В ряде вариантов осуществления химерный белок содержит внеклеточный домен иммуноингибирующего рецептора и внеклеточный домен иммуностимулирующего лиганда, способные, не ограничиваясь перечисленным, доставлять иммуностимулирующий сигнал Т-клетке, при этом маскируя иммуноингибирующие сигналы опухолевой клетки. В ряде вариантов осуществления химерный белок доставляет сигнал, в конечном итоге приводящий к активации Т-клеток.

В ряде вариантов осуществления химерный белок содержит иммуноингибирующий сигнал, представляющий собой ВКД рецептора иммуноингибирующего сигнала, и действует на опухолевую клетку, несущую родственный лиганд иммуноингибирующего сигнала. В ряде вариантов осуществления химерный белок содержит иммуностимулирующий сигнал, представляющий собой ВКД лиганда иммуностимулирующего сигнала, и действует на Т-клетку несущую родственный рецептор иммуностимулирующего сигнала. В ряде вариантов осуществления химерный белок содержит как (i) иммуноингибирующий сигнал, представляющий собой рецептор иммуноингибирующего сигнала и действующий на опухолевую клетку, несущую родственный лиганд иммуноингибирующего сигнала, так и (ii) иммуностимулирующий сигнал, представляющий собой лиганд иммуностимулирующего сигнала и действующий на Т-клетку несущую родственный рецептор иммуностимулирующего сигнала.

В ряде вариантов осуществления химерный белок согласно настоящему изобретению содержит внеклеточный домен одного или более иммуномодулирующих агентов, описанных в источнике Mahoney, Nature Reviews Drug Discovery 2015:14; 561-585, полностью включенном в настоящий документ посредством ссылки.

В ряде вариантов осуществления химерный белок способен связывать мышиный(ые) лиганд(ы)/рецептор(ы).

В ряде вариантов осуществления химерный белок способен связывать человеческий(ие) лиганд(ы)/рецептор(ы).

В ряде вариантов осуществления химерный белок согласно настоящему изобретению содержит внеклеточный домен мембранного белка II типа, обладающего иммуностимулирующими свойствами. В ряде вариантов осуществления химерный белок сконструирован для усиления, увеличения и/или стимуляции передачи иммуностимулирующего сигнала.

Например, в ряде вариантов осуществления внеклеточный домен трансмембранного белка I типа получен из TIGIT.

TIGIT представляет собой белок, подобный рецептору полиовируса (PVR), иммунорецептор, экспрессируемый на Т-клетках, содержащий домены иммуноглобулина и иммунорецепторного ингибирующего мотива на основе тирозина (ITIM). Таким образом, TIGIT действует как ингибирующая иммунная контрольная точка как на Т-клетки, так и на естественных киллеров (NK-клетки), обеспечивая возможность нацеливания как на адаптивную, так и на приобретенную ветви иммунной системы.

TIGIT экспрессируется на NK-клетках и подмножествах активированных Т-клеток, Т-клеток памяти и регуляторных Т-клеток, и, в частности, на фолликулярных Т-хелперных клетках во вторичных лимфоидных органах. Увеличение экспрессии CD155/PVR на эндотелиальных клетках происходит под воздействием IFN-гамма, и он высоко экспрессируется на незрелых тимоцитах, дендритных клетках лимфатических узлов и опухолевых клетках эпителиального и нейронального происхождения. В ряде вариантов осуществления настоящие химерные белки (например, содержащие ВКД TIGIT) модулируют любую из только что упомянутых клеток (например, в контексте иммунного синапса).

TIGIT связывает CD155/PVR, нектин-2, нектин-3 и нектин-4. В ряде вариантов осуществления настоящие химерные белки (например, содержащие ВКД TIGIT) модулируют связывание TIGIT с CD155/PVR (например, уменьшают или нарушают связывание или передачу сигнала). В ряде вариантов осуществления настоящие химерные белки (например, содержащие ВКД TIGIT) модулируют связывание TIGIT с нектином-2 (например, уменьшают или нарушают связывание или передачу сигнала). В ряде вариантов осуществления настоящие химерные белки (например, содержащие ВКД TIGIT) модулируют связывание TIGIT с нектином-3 (например, уменьшают или нарушают связывание или передачу сигнала). В ряде вариантов осуществления настоящие химерные белки (например, содержащие ВКД TIGIT) модулируют связывание TIGIT с нектином-4 (например, уменьшают или нарушают связывание или передачу сигнала).

В ряде вариантов осуществления химерный белок имеет следующую общую структуру: N-конец - (a)-(b)-(c) - С-конец, где (а) представляет собой первый домен, содержащий внеклеточный домен трансмембранного белка I типа, представляющего собой TIGIT, (b) представляет собой линкер, содержащий по меньшей мере один остаток цистеина, способный образовывать дисульфидную связь (включая, не ограничиваясь перечисленным, Fc-домен шарнир-СН2-СН3, полученный из человеческого IgG4), и (с) представляет собой второй домен, содержащий внеклеточный домен трансмембранного белка II типа, выбранного из 4-1BBL, GITRL, TL1A и LIGHT, где линкер соединяет первый домен и второй домен и необязательно содержит один или более соединяющих линкеров, как описано в настоящем документе.

В ряде вариантов осуществления химерный белок содержит внеклеточный домен иммуноингибирующего агента TIGIT в паре с иммуностимулирующим агентом следующим образом: TIGIT/OX-40L; TIGIT/4-1BBL, TIGIT/LIGHT; TIGIT/GITRL; TIGIT/CD70; TIGIT/CD30L; TIGIT/CD40L; TIGIT/CD137L; TIGIT/TL1A; и TIGIT/OX40L. В ряде вариантов осуществления химерный белок представляет собой TIGIT-Fc-4-lBBL, TIGIT-Fc-GITRL, TIGIT-Fc-LIGHT, TIGIT-Fc-OX40L или TIGIT-Fc-TLIA, где Fc представляет собой линкер, содержащий по меньшей мере часть Fc-домена антитела и содержащий по меньшей мере один остаток цистеина, способный образовывать дисульфидную связь.

Например, в ряде вариантов осуществления внеклеточный домен трансмембранного белка II типа получен из LIGHT.

LIGHT (HVEM-L, TNFSF14 или CD258), структура, гомологичная лимфотоксинам, обладающая индуцибельной природой и способная конкурировать с гликопротеином D вируса простого герпеса за медиатор проникновения вируса герпеса (HVEM)/связанный с фактором некроза опухоли (TNF) 2, является членом надсемейства TNF. Он представляет собой трансмембранный белок II типа молекулярной массой 29 кДа, экспрессируется в виде гомотримера на активированных Т-клетках, а также ДК (дендритных клетках), и имеет три рецептора, а именно: HVEM, рецептор LT-β (LTβR, TNFRSF3) и рецептор приманка 3 (DcR3). Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, известно, что три рецептора с различными паттернами клеточной экспрессии взаимодействуют с LIGHT: HVEM (TNFRSF14, CD270) обнаружен на активированных ДК, Т- и В-клетках, NK-клетках, моноцитах и эндотелиальных клетках; LTβR обнаружен на фолликулярных ДК и стромальных клетках и связывает LIGHT; и рецептор-приманка 3 растворимой структуры (DcR3) обнаружен на различных раковых клетках, таких как множественная миелома и диффузная B-крупноклеточная лимфома. В ряде вариантов осуществления настоящие химерные белки могут нарушать или снижать взаимодействие LIGHT с одним или более из этих трех рецепторов.

LIGHT связывает LTBR и, возможно, HVEM, а также DcR3. В ряде вариантов осуществления настоящие химерные белки (например, содержащие ВКД LIGHT) модулируют связывание LIGHT с LTBR (например, увеличивают или стимулируют связывание или передачу сигнала). LTBR экспрессируется висцеральными, лимфоидными и другими стромальными, эпителиальными и миелоидными клетками, но не лимфоцитами. В ряде вариантов осуществления настоящие химерные белки (например, содержащие ВКД LIGHT) модулируют одни или более из висцеральных, лимфоидных и других стромальных, эпителиальных и миелоидных клеток. В ряде вариантов осуществления настоящие химерные белки (например, содержащие ВКД LIGHT) модулируют связывание LIGHT с HVEM (например, увеличивают или стимулируют связывание или передачу сигнала). В ряде вариантов осуществления настоящие химерные белки (например, содержащие ВКД LIGHT) модулируют связывание LIGHT с DcR3 (например, увеличивают или стимулируют связывание или передачу сигнала).

В ряде вариантов осуществления химерный белок имеет следующую общую структуру: N-конец - (a)-(b)-(c) - С-конец, где (а) представляет собой первый домен, содержащий внеклеточный домен трансмембранного белка I типа, выбранного из PD-1, CD172a(SIRPα) и TIGIT, (b) представляет собой линкер, содержащий по меньшей мере один остаток цистеина, способный образовывать дисульфидную связь (включая, не ограничиваясь перечисленным, Fc-домен шарнир-СН2-СН3, полученный из человеческого IgG4), и (с) представляет собой второй домен, содержащий внеклеточный домен трансмембранного белка II типа, представляющего собой LIGHT, где линкер соединяет первый домен и второй домен и необязательно содержит один или более соединяющих линкеров, как описано в настоящем документе.

В ряде вариантов осуществления химерный белок содержит внеклеточный домен иммуностимулирующего агента LIGHT в паре с иммуноингибирующий агентом следующим образом: PD-1/LIGHT, CD172a(SIRPα)/LIGHT и TIGIT/LIGHT. В ряде вариантов осуществления химерный белок представляет собой PD-1-Fc-LIGHT, CD172a(SIRPα)-Fc-LIGHT и TIGIT-Fc-LIGHT, где Fc представляет собой линкер, содержащий по меньшей мере часть Fc-домена антитела и содержащий по меньшей мере один остаток цистеина, способный образовывать дисульфидную связь.

В одном варианте осуществления химерный белок содержит внеклеточный домен иммуноингибирующего агента в паре с иммуностимулирующим агентом. В ряде вариантов осуществления химерный белок связывается с родственным рецептором или лигандом с K_D, составляющей от приблизительно 1 нМ до приблизительно 5 нМ, например, приблизительно 1 нМ, приблизительно 1,5 нМ, приблизительно 2 нМ, приблизительно 2,5 нМ, приблизительно 3 нМ, приблизительно 3,5 нМ, приблизительно 4 нМ, приблизительно 4,5 нМ или приблизительно 5 нМ. В ряде вариантов осуществления химерный белок связывается с родственным рецептором или лигандом с K_D, составляющей от приблизительно 5 нМ до приблизительно 15 нМ, например, приблизительно 5 нМ, приблизительно 5,5 нМ, приблизительно 6 нМ, приблизительно 6,5 нМ, приблизительно 7 нМ, приблизительно 7,5 нМ, приблизительно 8 нМ, приблизительно 8,5 нМ, приблизительно 9 нМ, приблизительно 9,5 нМ, приблизительно 10 нМ, приблизительно 10,5 нМ, приблизительно 11 нМ, приблизительно 11,5 нМ, приблизительно 12 нМ, приблизительно 12,5 нМ, приблизительно 13 нМ, приблизительно 13,5 нМ, приблизительно 14 нМ, приблизительно 14,5 нМ или приблизительно 15 нМ.

В ряде вариантов осуществления химерный белок демонстрирует повышенную стабильность и время полужизни белка. В ряде вариантов осуществления химерный белок связывается с FcRn с высокой аффинностью. В ряде вариантов осуществления химерный белок может связываться с FcRn с K_D, составляющей от приблизительно 1 нМ до приблизительно 80 нМ. Например, химерный белок может связываться с FcRn с K_D, составляющей приблизительно 1 нМ, приблизительно 2 нМ, приблизительно 3 нМ, приблизительно 4 нМ, приблизительно 5 нМ, приблизительно 6 нМ, приблизительно 7 нМ, приблизительно 8 нМ, приблизительно 9 нМ, приблизительно 10 нМ, приблизительно 15 нМ, приблизительно 20 нМ, приблизительно 25 нМ, приблизительно 30 нМ, приблизительно 35 нМ, приблизительно 40 нМ, приблизительно 45 нМ, приблизительно 50 нМ, приблизительно 55 нМ, приблизительно 60 нМ, приблизительно 65 нМ, приблизительно 70 нМ, приблизительно 71 нМ, приблизительно 72 нМ, приблизительно 73 нМ, приблизительно 74 нМ, приблизительно 75 нМ, приблизительно 76 нМ, приблизительно 77 нМ, приблизительно 78 нМ, приблизительно 79 нМ или приблизительно 80 нМ. В одном варианте осуществления химерный белок может связываться с FcRn с K_D, составляющей приблизительно 9 нМ. В ряде вариантов осуществления химерный белок по существу не связывается с другими Fc-рецепторами (т.е. отличными от FcRn) с эффекторной функцией.

В ряде вариантов осуществления предложен способ лечения рака и/или воспалительного заболевания (например, любого из описанных в других частях настоящего документа) путем введения субъекту одного или более из химерных белков PD-1-Fc-LIGHT, CD172a(SIRPα)-Fc-LIGHT и TIGIT-Fc-LIGHT, где Fc представляет собой линкер, содержащий по меньшей мере часть Fc-домена антитела и содержащий по меньшей мере один остаток цистеина, способный образовывать дисульфидную связь. В ряде вариантов осуществления способ генерирует анамнестическую реакцию, способную, например, предупреждать рецидив. В ряде вариантов осуществления способ включает устойчивое терапевтическое действие одного или более из PD-1-Fc-LIGHT, CD172a(SIRPα)-Fc-LIGHT и TIGIT-Fc-LIGHT, например, ввиду связывания компонентов внеклеточного домена с их соответствующими партнерами по связыванию с низкими скоростями диссоциации (K_d или K_off), чтобы необязательно обеспечить устойчивый эффект маскирования отрицательного сигнала и/или более длительный эффект положительного сигнала, например, чтобы обеспечить адекватную стимуляцию эффекторной клетки для противоопухолевого действия.

В ряде вариантов осуществления предложен способ лечения рака или воспалительного заболевания (например, любого из описанных в других частях настоящего документа) путем введения субъекту одного или более из химерных белков TIGIT-Fc-4-1BBL, TIGIT-Fc-GITRL, TIGIT-Fc-TL1A и TIGIT-Fc-LIGHT, где Fc представляет собой линкер, содержащий по меньшей мере часть Fc-домена антитела и содержащий по меньшей мере один остаток цистеина, способный образовывать дисульфидную связь. В ряде вариантов осуществления способ генерирует анамнестическую реакцию, способную, например, предупреждать рецидив. В ряде вариантов осуществления способ включает устойчивое терапевтическое действие одного или более из TIGIT-Fc-4-1BBL, TIGIT-Fc-GITRL, TIGIT-Fc-TL1A и TIGIT-Fc-LIGHT, например, ввиду связывания компонентов внеклеточного домена с их соответствующими партнерами по связыванию с низкими скоростями диссоциации (K_d или K_off), чтобы необязательно обеспечить устойчивый эффект маскирования отрицательного сигнала и/или более длительный эффект положительного сигнала, например, чтобы обеспечить адекватную стимуляцию эффекторной клетки для противоопухолевого действия.

В ряде вариантов осуществления настоящие химерные белки могут содержать варианты внеклеточных доменов, описанных в настоящем документе, например, последовательность, по меньшей мере приблизительно на 60%, или по меньшей мере приблизительно на 61%, или по меньшей мере приблизительно на 62%, или по меньшей мере приблизительно на 63%, или по меньшей мере приблизительно на 64%, или по меньшей мере приблизительно на 65%, или по меньшей мере приблизительно на 66%, или по меньшей мере приблизительно на 67%, или по меньшей мере приблизительно на 68%, или по меньшей мере приблизительно на 69%, или по меньшей мере приблизительно на 70%, или по меньшей мере приблизительно на 71%, или по меньшей мере приблизительно на 72%, или по меньшей мере приблизительно на 73%, или по меньшей мере приблизительно на 74%, или по меньшей мере приблизительно на 75%, или по меньшей мере приблизительно на 76%, или по меньшей мере приблизительно на 77%, или по меньшей мере приблизительно на 78%, или по меньшей мере приблизительно на 79%, или по меньшей мере приблизительно на 80%, или по меньшей мере приблизительно на 81%, или по меньшей мере приблизительно на 82%, или по меньшей мере приблизительно на 83%, или по меньшей мере приблизительно на 84%, или по меньшей мере приблизительно на 85%, или по меньшей мере приблизительно на 86%, или по меньшей мере приблизительно на 87%, или по меньшей мере приблизительно на 88%, или по меньшей мере приблизительно на 89%, или по меньшей мере приблизительно на 90%, или по меньшей мере приблизительно на 91%, или по меньшей мере приблизительно на 92%, или по меньшей мере приблизительно на 93%, или по меньшей мере приблизительно на 94%, или по меньшей мере приблизительно на 95%, или по меньшей мере приблизительно на 96%, или по меньшей мере приблизительно на 97%, или по меньшей мере приблизительно на 98%, или по меньшей мере приблизительно на 99% идентичную известной аминокислотной последовательности или последовательности нуклеиновой кислоты любого из раскрытых внеклеточных доменов, например, человеческих внеклеточных доменов, например, одной или более из SEQ ID NO: 2, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 27, 29, 31, 37 или 41.

В ряде вариантов осуществления химерный белок согласно настоящему изобретению содержит внеклеточный домен LIGHT (SEQ ID NO: 2).

В ряде вариантов осуществления химерный белок согласно настоящему изобретению содержит внеклеточный домен PD-1 (SEQ ID NO: 4).

В ряде вариантов осуществления химерный белок согласно настоящему изобретению содержит внеклеточный домен TIGIT (SEQ ID NO: 10).

В ряде вариантов осуществления химерный белок согласно настоящему изобретению содержит внеклеточный домен CD172a(SIRPα) (SEQ ID NO: 7).

В ряде вариантов осуществления химерный белок согласно настоящему изобретению содержит внеклеточный домен LIGHT (SEQ ID NO: 2) и внеклеточный домен PD-1 (SEQ ID NO: 4).

В ряде вариантов осуществления химерный белок согласно настоящему изобретению содержит внеклеточный домен LIGHT (SEQ ID NO: 2) и внеклеточный домен TIGIT (SEQ ID NO: 10).

В ряде вариантов осуществления химерный белок согласно настоящему изобретению содержит внеклеточный домен LIGHT (SEQ ID NO: 2) и внеклеточный домен CD172a(SIRPα) (SEQ ID NO: 7).

В ряде вариантов осуществления химерный белок согласно настоящему изобретению содержит домен шарнир-СН2-СН3 из последовательности человеческого антитела IgG4 (SEQ ID NO: 46, 47 или 48).

В ряде вариантов осуществления химерный белок согласно настоящему изобретению содержит домен шарнир-СН2-СН3 из последовательности человеческого антитела IgG4 (SEQ ID NO: 46, 47 или 48), и эта последовательность фланкирована по меньшей мере одним соединяющим линкером, выбранным из SKYGPPCPSCP (SEQ ID NO: 49), SKYGPPCPPCP (SEQ ID NO: 50), IEGRMD SEQ ID NO: 52 (необязательно, SKYGPPCPSCP (SEQ ID NO: 49) или SKYGPPCPPCP (SEQ ID NO: 50) является N-концевой, а одна из IEGRMD SEQ ID NO: 52 является C-концевой).

В ряде вариантов осуществления химерный белок содержит модульный линкер, как показано на ФИГ. 32.

В ряде вариантов осуществления химерный белок согласно настоящему изобретению содержит внеклеточный домен LIGHT и внеклеточный домен PD-1 с использованием домена шарнир-СН2-СН3 из последовательности человеческого антитела IgG4 в качестве линкера (эта химера PD-1-Fc-LIGHT представляет собой SEQ ID NO: 5).

В ряде вариантов осуществления химерный белок согласно настоящему изобретению содержит внеклеточный домен LIGHT и внеклеточный домен TIGIT с использованием домена шарнир-СН2-СН3 из последовательности человеческого антитела IgG4 в качестве линкера (эта химера TIGIT-Fc-LIGHT представляет собой SEQ ID №: 11).

В ряде вариантов осуществления химерный белок согласно настоящему изобретению содержит внеклеточный домен LIGHT и внеклеточный домен CD172a(SIRPα), с использованием домена шарнир-СН2-СН3 из последовательности человеческого антитела IgG4 в качестве линкера (эта химера CD172a(SIRPα)-Fc-LIGHT представляет собой SEQ ID NO: 8).

В ряде вариантов осуществления химерный белок согласно настоящему изобретению содержит внеклеточный домен TIGIT (SEQ ID NO: 10).

В ряде вариантов осуществления химерный белок согласно настоящему изобретению содержит внеклеточный домен 4-1BBL (SEQ ID NO: 13).

В ряде вариантов осуществления химерный белок согласно настоящему изобретению содержит внеклеточный домен GITRL (SEQ ID NO: 16).

В ряде вариантов осуществления химерный белок согласно настоящему изобретению содержит внеклеточный домен TL1A(SEQ ID NO: 19).

В ряде вариантов осуществления химерный белок согласно настоящему изобретению содержит внеклеточный домен LIGHT (SEQ ID NO: 2).

В ряде вариантов осуществления химерный белок согласно настоящему изобретению содержит внеклеточный домен OX40L (SEQ ID NO: 22).

В ряде вариантов осуществления химерный белок согласно настоящему изобретению содержит внеклеточный домен TIGIT (SEQ ID NO: 10) и внеклеточный домен 4-1BBL (SEQ ID NO: 13).

В ряде вариантов осуществления химерный белок согласно настоящему изобретению содержит внеклеточный домен TIGIT (SEQ ID NO: 10) и внеклеточный домен GITRL (SEQ ID NO: 16).

В ряде вариантов осуществления химерный белок согласно настоящему изобретению содержит внеклеточный домен TIGIT (SEQ ID NO: 10) и внеклеточный домен TL1A (SEQ ID NO: 19).

В ряде вариантов осуществления химерный белок согласно настоящему изобретению содержит внеклеточный домен TIGIT (SEQ ID NO: 10) и внеклеточный домен LIGHT (SEQ ID NO: 2).

В ряде вариантов осуществления химерный белок согласно настоящему изобретению содержит внеклеточный домен TIGIT (SEQ ID NO: 10) и внеклеточный домен OX40L (SEQ ID NO: 22).

В ряде вариантов осуществления химерный белок согласно настоящему изобретению содержит домен шарнир-СН2-СН3 из последовательности человеческого антитела IgG4 (SEQ ID NO: 46, 47 или 48).

В ряде вариантов осуществления химерный белок согласно настоящему изобретению содержит домен шарнир-СН2-СН3 из последовательности человеческого антитела IgG4 (SEQ ID NO: 46, 47 или 48), и эта последовательность фланкирована по меньшей мере одним соединяющим линкером, выбранным из SKYGPPCPSCP (SEQ ID NO: 49), SKYGPPCPPCP (SEQ ID NO: 50), IEGRMD SEQ ID NO: 52 (необязательно, SKYGPPCPSCP (SEQ ID NO: 49) или SKYGPPCPPCP (SEQ ID NO: 50) является N-концевой, а одна из IEGRMD SEQ ID NO: 52 является C-концевой).

В ряде вариантов осуществления химерный белок согласно настоящему изобретению содержит внеклеточный домен TIGIT и внеклеточный домен 4-1BBL с использованием домена шарнир-СН2-СН3 из последовательности человеческого антитела IgG4 в качестве линкера (эта химера TIGIT-Fc-4-1BBL представляет собой SEQ ID №:14).

В ряде вариантов осуществления химерный белок согласно настоящему изобретению содержит внеклеточный домен TIGIT и внеклеточный домен GITRL с использованием домена шарнир-СН2-СНЗ из последовательности человеческого антитела IgG4 в качестве линкера (эта химера TIGIT-Fc-GITRL представляет собой SEQ ID №:17).

В ряде вариантов осуществления химерный белок согласно настоящему изобретению содержит внеклеточный домен TIGIT и внеклеточный домен TL1A с использованием домена шарнир-СН2-СНЗ из последовательности человеческого антитела IgG4 в качестве линкера (эта химера TIGIT-Fc-TL1A представляет собой SEQ ID №:20).

В ряде вариантов осуществления химерный белок согласно настоящему изобретению содержит внеклеточный домен TIGIT и внеклеточный домен LIGHT с использованием домена шарнир-СН2-СН3 из последовательности человеческого антитела IgG4 в качестве линкера (эта химера TIGIT-Fc-LIGHT представляет собой SEQ ID №:11).

В ряде вариантов осуществления химерный белок согласно настоящему изобретению содержит внеклеточный домен TIGIT и внеклеточный домен OX40L с использованием домена шарнир-СН2-СН3 из последовательности человеческого антитела IgG4 в качестве линкера (эта химера TIGIT-Fc-OX40L представляет собой SEQ ID №:23).

В ряде вариантов осуществления химерный белок может содержать внеклеточный домен из последовательности, идентифицированной в настоящем документе, в сочетании с внеклеточным доменом из другой последовательности, идентифицированной в настоящем документе. Например, последовательность химерного белка TIGIT-Fc-TL1A может включать внеклеточный домен TIGIT, как раскрыто выше в SEQ ID NO: 10, и внеклеточный домен TL1A, как раскрыто выше в SEQ ID NO:19.

В ряде вариантов осуществления дополнительные химерные белки и способы с использованием дополнительных химерных белков (например, при лечении рака и/или лечении воспалительного заболевания): TIGIT-Fc-4-1BBL, TIGIT-Fc-CD30L, TIGIT-Fc-FasL, TIGIT-Fc-GITRL, TIGIT-Fc-TLIA и TIGIT-Fc-TRAIL. Аминокислотная последовательность для 4-1BBL, CD30L, FasL, GITRL, TL1A и TRAIL содержит соответственно SEQ ID NO: 12, 26, 30, 15, 18 и 40. Аминокислотная последовательность для внеклеточного домена 4-1BBL, CD30L, FasL, GITRL, TL1A и TRAIL, соответственно, представляет собой SEQ ID NO: 13, 27, 31, 16, 19 и 41.

В ряде вариантов осуществления настоящие химерные белки могут представлять собой варианты, описанные в настоящем документе, например, настоящие химерные белки могут иметь последовательность, по меньшей мере приблизительно на 60%, или по меньшей мере приблизительно на 61%, или по меньшей мере приблизительно на 62%, или по меньшей мере приблизительно на 63%, или по меньшей мере приблизительно на 64%, или по меньшей мере приблизительно на 65%, или по меньшей мере приблизительно на 66%, или по меньшей мере приблизительно на 67%, или по меньшей мере приблизительно на 68%, или по меньшей мере приблизительно на 69%, или по меньшей мере приблизительно на 70%, или по меньшей мере приблизительно на 71%, или по меньшей мере приблизительно на 72%, или по меньшей мере приблизительно на 73%, или по меньшей мере приблизительно на 74%, или по меньшей мере приблизительно на 75%, или по меньшей мере приблизительно на 76%, или по меньшей мере приблизительно на 77%, или по меньшей мере приблизительно на 78%, или по меньшей мере приблизительно на 79%, или по меньшей мере приблизительно на 80%, или по меньшей мере приблизительно на 81%, или по меньшей мере приблизительно на 82%, или по меньшей мере приблизительно на 83%, или по меньшей мере приблизительно на 84%, или по меньшей мере приблизительно на 85%, или по меньшей мере приблизительно на 86%, или по меньшей мере приблизительно на 87%, или по меньшей мере приблизительно на 88%, или по меньшей мере приблизительно на 89%, или по меньшей мере приблизительно на 90%, или по меньшей мере приблизительно на 91%, или по меньшей мере приблизительно на 92%, или по меньшей мере приблизительно на 93%, или по меньшей мере приблизительно на 94%, или по меньшей мере приблизительно на 95%, или по меньшей мере приблизительно на 96%, или по меньшей мере приблизительно на 97%, или по меньшей мере приблизительно на 98%, или по меньшей мере приблизительно на 99% идентичную аминокислотной последовательности настоящих химерных белков, например, одной или более из SEQ ID NO: 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 42, 43, 44 или 45.

В ряде вариантов осуществления настоящие химерные белки содержат внеклеточный домен человеческого трансмембранного белка I типа, как указано в таблице 1 в PCT/US 2016/054598, или его функциональный фрагмент. В ряде вариантов осуществления настоящие химерные белки содержат внеклеточный домен человеческого трансмембранного белка II типа, как указано в таблице 2 в PCT/US 2016/054598, или его функциональный фрагмент. В ряде вариантов осуществления настоящие химерные белки содержат внеклеточный домен трансмембранного белка I типа, как указано в таблице 1 в PCT/US 2016/054598, или его функциональный фрагмент, и внеклеточный домен трансмембранного белка II типа, как указано в таблице 2 PCT/US 2016/054598, или его функциональный фрагмент. Содержание PCT/US 2016/054598 полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.

В ряде вариантов осуществления химерный белок может содержать аминокислотную последовательность, имеющую одну или более аминокислотных мутаций относительно любой из белковых последовательностей, описанных в настоящем документе. В ряде вариантов осуществления одна или более аминокислотных мутаций могут быть независимо выбраны из замен, инсерций, делеций и усечений.

В ряде вариантов осуществления аминокислотные мутации представляют собой аминокислотные замены и могут включать консервативные и/или неконсервативные замены.

«Консервативные замены» могут быть сделаны, например, на основе сходства по полярности, заряду, размеру, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатической природе участвующих аминокислотных остатков. 20 природных аминокислот могут быть сгруппированы в следующие шесть стандартных групп аминокислот: (1) гидрофобные: Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr; Asn, Gln; (3) кислые: Asp, Glu; (4) основные: His, Lys, Arg; (5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: Gly, Pro; и (6) ароматические: Trp, Tyr, Phe.

В контексте настоящего документа «консервативные замены» определены как обмен одной аминокислоты на другую аминокислоту, включенную в ту же группу из шести стандартных групп аминокислот, приведенных выше. Например, обмен Asp на Glu сохраняет один отрицательный заряд в модифицированном таким образом полипептиде. Кроме того, глицин и пролин могут быть замещены друг другом на основе их способности разрушать α-спирали.

В контексте настоящего документа «неконсервативные замены» определены как обмен одной аминокислоты на другую аминокислоту, включенную в другую группу из шести стандартных групп аминокислот (1)-(6), приведенных выше.

В ряде вариантов осуществления замены могут также включать неклассические аминокислоты (например, селеноцистеин, пирролизин, N-формилметионин, β-аланин, ГАМК (гамма-аминомасляную кислоту) и δ-аминолевулиновую кислоту, 4-аминобензойную кислоту (ПАБК), D-изомеры стандартных аминокислот, 2,4-диаминомасляную кислоту, α-аминоизомасляную кислоту, 4-аминомасляную кислоту, Abu, 2-аминомасляную кислоту, γ-Abu, ε-Ahx, 6-аминогексановую кислоту, Aib, 2-аминоизомасляную кислоту, 3-аминопропионовую кислоту, орнитин, норлейцин, норвалин, гидроксипролин, саркозин, цитруллин, гомоцитруллин, цистеиновую кислоту, трет-бутилглицин, трет-бутилаланин, фенилглицин, циклогексилаланин, β-аланин, фтораминокислоты, сконструированные аминокислоты, такие как β-метиламинокислоты, С α-метил аминокислоты, N α-метиламинокислоты и аналоги аминокислот в целом).

Мутации также могут быть внесены в нуклеотидные последовательности химерных белков со ссылкой на генетический код, в том числе с учетом вырожденности кодонов.

В ряде вариантов осуществления химерный белок содержит линкер. В ряде вариантов осуществления линкер содержит по меньшей мере один остаток цистеина, способный образовывать дисульфидную связь. Как описано в других местах настоящего документа, такой по меньшей мере один остаток цистеина, способный образовывать дисульфидную связь, отвечает, не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, за поддержание надлежащего мультимерного состояния химерного белка и обеспечение эффективной продукции.

В ряде вариантов осуществления линкер может быть получен из встречающихся в природе многодоменных белков или представлять собой эмпирические линкеры, как описано, например, в источниках Chichili et al., (2013), Protein Sci. 22(2):153-167, Chen et al., (2013), Adv Drug Deliv Rev. 65(10):1357-1369, полностью включенных в настоящий документ посредством ссылки. В ряде вариантов осуществления линкер может быть сконструирован с использованием баз данных и компьютерных программ для конструирования линкеров, таких как описанные в источниках Chen et al., (2013), Adv Drug Deliv Rev. 65(10):1357-1369 и Crasto et. al., (2000), Protein Eng. 13(5):309-312, полностью включенных в настоящий документ посредством ссылки.

В ряде вариантов осуществления линкер представляет собой синтетический линкер, такой как PEG.

В ряде вариантов осуществления линкер представляет собой полипептид. В ряде вариантов осуществления линкер имеет длину менее чем приблизительно 500 аминокислот, приблизительно 450 аминокислот, приблизительно 400 аминокислот, приблизительно 350 аминокислот, приблизительно 300 аминокислот, приблизительно 250 аминокислот, приблизительно 200 аминокислот, приблизительно 150 аминокислот или приблизительно 100 аминокислот. Например, линкер может иметь длину менее чем приблизительно 100, приблизительно 95, приблизительно 90, приблизительно 85, приблизительно 80, приблизительно 75, приблизительно 70, приблизительно 65, приблизительно 60, приблизительно 55, приблизительно 50, приблизительно 45, приблизительно 40, приблизительно 35, приблизительно 30, приблизительно 25, приблизительно 20, приблизительно 19, приблизительно 18, приблизительно 17, приблизительно 16, приблизительно 15, приблизительно 14, приблизительно 13, приблизительно 12, приблизительно 11, приблизительно 10, приблизительно 9, приблизительно 8, приблизительно 7, приблизительно 6, приблизительно 5, приблизительно 4, приблизительно 3 или приблизительно 2 аминокислоты. В ряде вариантов осуществления линкер является гибким. В еще одном варианте осуществления линкер является жестким.

В ряде вариантов осуществления линкер по существу состоит из остатков глицина и серина (например, содержит приблизительно 30%, или приблизительно 40%, или приблизительно 50%, или приблизительно 60%, или приблизительно 70%, или приблизительно 80%, или приблизительно 90%, или приблизительно 95%, или приблизительно 97%, или приблизительно 98%, или приблизительно 99%, или приблизительно 100% глицинов и серинов).

В ряде вариантов осуществления линкер представляет собой шарнирную область антитела (например, IgG, IgA, IgD и IgE, включая подклассы (например, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, и IgA1 и IgA2)). Шарнирная область, присутствующая в антителах класса IgG, IgA, IgD и IgE, действует как гибкий спейсер, позволяя Fab-части свободно перемещаться в пространстве. В отличие от константных областей, шарнирные домены структурно разнообразны, в иммуноглобулинах различных классов и подклассов они различаются как по последовательности, так и по длине. Например, длина и гибкость шарнирной области различается среди подклассов IgG. Шарнирная область IgG1 охватывает аминокислоты 216-231 и, поскольку она является гибкой в любых направлениях, Fab-фрагменты могут вращаться вокруг своих осей симметрии и перемещаться внутри сферы, центр которой находится в первом из двух дисульфидных мостиков между тяжелыми цепями. IgG2 имеет более короткий шарнир, чем IgG1, с 12 аминокислотными остатками и четырьмя дисульфидными мостиками. В шарнирной области IgG2 отсутствует остаток глицина, она является относительно короткой и содержит жесткую полипролиновую двойную спираль, стабилизированную дополнительными дисульфидными мостиками между тяжелыми цепями. Эти свойства ограничивают гибкость молекулы IgG2. IgG3 отличается от других подклассов своей уникальной увеличенной шарнирной областью (примерно в четыре раза более длинной, чем шарнир IgG1), содержащей 62 аминокислоты (включая 21 пролин и 11 цистеинов), образующей негибкую полипролиновую двойную спираль. В IgG3 Fab-фрагменты находятся относительно далеко от Fc-фрагмента, что придает молекуле большую гибкость. Удлиненный шарнир в IgG3 также отвечает за его более высокую молекулярную массу по сравнению с другими подклассами. Шарнирная область IgG4 короче, чем у IgG1, и ее гибкость является промежуточной между гибкостью IgG1 и IgG2. По имеющейся информации гибкость шарнирных областей уменьшается в следующем порядке: IgG3>IgG1>IgG4>IgG2. В ряде вариантов осуществления линкер может быть получен из человеческого IgG4 и содержать одну или более мутаций для усиления димеризации (включая S228P) или связывания FcRn.

Согласно кристаллографическим исследованиям, шарнирная область иммуноглобулина может быть с функциональной точки зрения дополнительно разделена на три области: верхнюю шарнирную область, центральную область и нижнюю шарнирную область. См. источник Shin et al., 1992 Immunological Reviews 130:87. Верхняя шарнирная область включает аминокислоты от карбоксильного конца C_H1 до первого остатка в шарнире, который ограничивает движение, обычно первого остатка цистеина, который образует межцепочечную дисульфидную связь между двумя тяжелыми цепями. Длина верхней шарнирной области коррелирует с сегментальной гибкостью антитела. Центральная шарнирная область ядра содержит дисульфидные мостики между тяжелыми цепями, а нижняя шарнирная область соединяет аминоконец домена C_H2 и включает остатки в C_H2. См. тот же источник. Центральная шарнирная область человеческого IgG1 дикого типа содержит последовательность Cys-Pro-Pro-Cys, которая, будучи димеризованной путем образования дисульфидной связи, образует циклический октапептид, который, как полагают, действует в качестве стержня, таким образом обеспечивая гибкость. В ряде вариантов осуществления настоящий линкер содержит одну, или две, или три из верхней шарнирной области, центральной шарнирной области и нижней шарнирной области любого антитела (например, IgG, IgA, IgD и IgE, включая подклассы (например, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, и IgA1 и IgA2)). Шарнирная область также может содержать один или более сайтов гликозилирования, которые включают ряд структурно различающихся типов сайтов для присоединения углеводов. Например, IgA1 содержит пять сайтов гликозилирования в сегменте шарнирной области длиной 17 аминокислот, что придает полипептиду шарнирной области устойчивость к кишечным протеазам, что считается желательным свойством для секреторного иммуноглобулина. В ряде вариантов осуществления линкер согласно настоящему изобретению содержит один или более сайтов гликозилирования.

В ряде вариантов осуществления линкер содержит Fc-домен антитела (например, IgG, IgA, IgD и IgE, включая подклассы (например, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, и IgA1 и IgA2)). В ряде вариантов осуществления линкер содержит Fc-домен шарнир-СН2-СН3, полученный из человеческого антитела IgG4. В ряде вариантов осуществления линкер содержит Fc-домен шарнир-СН2-СН3, полученный из человеческого антитела IgG1. В ряде вариантов осуществления Fc-домен проявляет повышенную аффинность и усиленное связывание с неонатальным Fc-рецептором (FcRn). В ряде вариантов осуществления Fc-домен включает одну или более мутаций, увеличивающих аффинность и усиливающих связывание с FcRn. Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, полагают, что увеличенная аффинность и усиленное связывание с FcRn повышает время полужизни настоящих химерных белков in vivo.

В ряде вариантов осуществления Fc-доменный линкер содержит одну или более аминокислотных замен по аминокислотному остатку 250, 252, 254, 256, 308, 309, 311, 416, 428, 433 или 434 (в соответствии с системой нумерации согласно Kabat, как в описано в источнике Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) специально включенном в настоящий документ посредством ссылки), или их эквиваленты. В одном варианте осуществления аминокислотная замена по аминокислотному остатку 250 представляет собой замену глутамином. В одном варианте осуществления аминокислотная замена по аминокислотному остатку 252 представляет собой замену тирозином, фенилаланином, триптофаном или треонином. В одном варианте осуществления аминокислотная замена по аминокислотному остатку 254 представляет собой замену треонином. В одном варианте осуществления аминокислотная замена по аминокислотному остатку 256 представляет собой замену серином, аргинином, глутамином, глутаминовой кислотой, аспарагиновой кислотой или треонином. В одном варианте осуществления аминокислотная замена по аминокислотному остатку 308 представляет собой замену треонином. В одном варианте осуществления аминокислотная замена по аминокислотному остатку 309 представляет собой замену пролином. В одном варианте осуществления аминокислотная замена по аминокислотному остатку 311 представляет собой замену серином. В одном варианте осуществления аминокислотная замена по аминокислотному остатку 385 представляет собой замену аргинином, аспарагиновой кислотой, серином, треонином, гистидином, лизином, аланином или глицином. В одном варианте осуществления аминокислотная замена по аминокислотному остатку 386 представляет собой замену треонином, пролином, аспарагиновой кислотой, серином, лизином, аргинином, изолейцином или метионином. В одном варианте осуществления аминокислотная замена по аминокислотному остатку 387 представляет собой замену аргинином, пролином, гистидином, серином, треонином или аланином. В одном варианте осуществления аминокислотная замена по аминокислотному остатку 389 представляет собой замену пролином, серином или аспарагином. В одном варианте осуществления аминокислотная замена по аминокислотному остатку 416 представляет собой замену лейцином. В одном варианте осуществления аминокислотная замена по аминокислотному остатку 428 представляет собой замену серином. В одном варианте осуществления аминокислотная замена по аминокислотному остатку 433 представляет собой замену аргинином, серином, изолейцином, пролином или глутамином. В одном варианте осуществления аминокислотная замена по аминокислотному остатку 434 представляет собой замену гистидином, фенилаланином или тирозином.

В ряде вариантов осуществления Fc-доменный линкер (например, содержащий константную область IgG) содержит одну или более мутаций, таких как замены по аминокислотному остатку 252, 254, 256, 433, 434 или 436 (в соответствии с системой нумерации согласно Kabat, как в описано в источнике Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) специально включенном в настоящий документ посредством ссылки). В одном варианте осуществления константная область IgG включает тройную мутацию M252Y/S254T/T256E или мутацию YTE. В еще одном варианте осуществления константная область IgG включает тройную мутацию H433K/N434F/Y436H или мутацию KFH. В дополнительном варианте осуществления константная область IgG включает мутацию YTE совместно с KFH.

В ряде вариантов осуществления модифицированные гуманизированные антитела согласно изобретению содержат константную область IgG, содержащую одну или более мутаций по аминокислотным остаткам 250, 253, 307, 310, 380, 416, 428, 433, 434 и 435. Примеры мутаций включают T250Q, M428L, Т307А, Е380А, I253A, Н310А, R416S, M428L, H433K, N434A, N434F, N434S и Н435А. В одном варианте осуществления константная область IgG содержит мутацию M428L/N434S или мутацию LS. В еще одном варианте осуществления константная область IgG содержит мутацию T250Q/M428L или мутацию QL. В еще одном варианте осуществления константная область IgG содержит мутацию N434A. В еще одном варианте осуществления константная область IgG содержит мутацию T307A/E380A/N434A или мутацию AAA. В еще одном варианте осуществления константная область IgG содержит мутацию I253A/H310A/H435A или мутацию IHH. В еще одном варианте осуществления константная область IgG содержит мутацию H433K/N434F. В одном варианте осуществления константная область IgG содержит мутацию M252Y/S254T/T256E совместно с H433K/N434F.

Дополнительные примеры мутаций в константной области IgG описаны, например, в источниках Robbie, et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy (2013), 57(12):6147-6153, Dall'Acqua et al., JBC (2006), 281(33):23514-24, Dall'Acqua et al., Journal of Immunology (2002), 169:5171-80, Ко et al. Nature (2014) 514:642-645, Grevys et al. Journal of Immunology. (2015), 194(11):5497-508 и патенте США №7083784, полностью включенных в настоящий документ посредством ссылки.

В ряде вариантов осуществления линкер содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 46 или последовательность, идентичную ей по меньшей мере на 90%, или 93%, или 95%, или 97%, или 98%, или 99%. В ряде вариантов осуществления в SEQ ID NO: 46 осуществляют мутации для увеличения стабильности и/или времени полужизни. Например, в ряде вариантов осуществления линкер имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 47 или последовательность, идентичную ей по меньшей мере на 90%, или 93%, или 95%, или 97%, или 98%, или 99%. В ряде вариантов осуществления линкер содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48 или последовательность, идентичную ей по меньшей мере на 90%, или 93%, или 95%, или 97%, или 98%, или 99%.

Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, полагают, что включение в химерный белок линкера, содержащего по меньшей мере часть Fc-домена, помогает избежать образования нерастворимых и, вероятно, нефункциональных конкатамеров и/или агрегатов белка. Частично это связано с наличием цистеинов в Fc-домене, которые способны образовывать дисульфидные связи между химерными белками.

Примером Fc-стабилизирующего мутанта является S228P. Примерами мутантов Fc, увеличивающих время полужизни, являются T250Q, M428L, V308T, L309P и Q311S, и настоящие линкеры могут содержать 1, или 2, или 3, или 4, или 5 этих мутантов.

Кроме того, один или более соединяющих линкеров могут быть использованы для соединения Fc-домена в линкере (например, одна из SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 или SEQ ID NO: 48, или последовательность, идентичная и, по меньшей мере на 90%, или 93%, или 95%, или 97%, или 98%, или 99%) и внеклеточных доменов. Например, любая из SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54 или их варианты могут соединять внеклеточный домен, как описано в настоящем документе, и линкер, как описано в настоящем документе. Необязательно, любая из SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54 или их варианты смещены между внеклеточным доменом, как описано в настоящем документе, и линкером, как описано в настоящем документе. Необязательно, любая из SEQ ID NO: 49-95 или их варианты расположены между внеклеточным доменом, как описано в настоящем документе, и Fc-доменом, как описано в настоящем документе. В ряде вариантов осуществления химерный белок содержит один соединяющий линкер, предшествующий Fc-домену, и второй соединяющий линкер, следующий за Fc-доменом; таким образом, химерный белок может содержать следующую структуру:

ВКД 1 - соединяющий линкер 1 - Fc-домен - соединяющий линкер 2 - ВКД 2.

В ряде вариантов осуществления первый и второй соединяющие линкеры могут быть разными или они могут быть одинаковыми.

Аминокислотные последовательности иллюстративных линкеров представлены в приведенной ниже таблице 1:

Дополнительные иллюстративные соединяющие линкеры включают, не ограничиваясь перечисленным, линкеры, имеющие последовательность LE, GGGGS (SEQ ID NO: 70), (GGGGS)_n (n равно 1-4) (SEQ ID NO: 70-73), (Gly)₈ (SEQ ID NO: 79), (Gly)₆ (SEQ ID NO: 80), (EAAAK)_n (n равно 1-3) (SEQ ID NO: 81-83), A(EAAAK)_nA (n равно 2-5) (SEQ ID NO: 84-87), AEAAAKEAAAKA (SEQ ID NO: 84), A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)₄A (SEQ ID NO: 88), PAPAP (SEQ ID NO: 89), KESGSVSSEQLAQFRSLD (SEQ ID NO: 90), EGKSSGSGSESKST (SEQ ID NO: 57), GSAGSAAGSGEF (SEQ ID NO: 91) и (XP)_n, где X обозначает любую аминокислоту, например, Ala, Lys или Glu.

В ряде вариантов осуществления соединяющий линкер по существу состоит из остатков глицина и серина (например, содержит приблизительно 30%, или приблизительно 40%, или приблизительно 50%, или приблизительно 60%, или приблизительно 70%, или приблизительно 80%, или приблизительно 90%, или приблизительно 95%, или приблизительно 97%, или приблизительно 98%, или приблизительно 99%, или приблизительно 100% глицинов и серинов). Например, в ряде вариантов осуществления соединяющий линкер представляет собой (Gly4Ser)_n, где n составляет от приблизительно 1 до приблизительно 8, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 (SEQ ID NO: 70 - SEQ ID NO: 77, соответственно). В ряде вариантов осуществления соединяющая линкерная последовательность представляет собой GGSGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 78). Дополнительные иллюстративные соединяющие линкеры включают, не ограничиваясь перечисленным, линкеры, имеющие последовательность LE, (Gly)₈ (SEQ ID NO: 79), (Gly)₆ (SEQ ID NO: 80), (EAAAK)_n (n равно 1-3) (SEQ ID NO: 81 - SEQ ID NO: 83), A(EAAAK)_nA (n равно 2-5) (SEQ ID NO: 84 -SEQ ID NO: 87), A(EAAAK)₄ALEA(EAAAK)₄A (SEQ ID NO: 88), PAPAP (SEQ ID NO: 89), KESGSVSSEQLAQFRSLD (SEQ ID NO: 90), GSAGSAAGSGEF (SEQ ID NO: 91) и (XP)n, где X обозначает любую аминокислоту, например, Ala, Lys или Glu. В ряде вариантов осуществления соединяющий линкер представляет собой GGS.

В ряде вариантов осуществления соединяющий линкер представляет собой один или более из GGGSE (SEQ ID NO: 92), GSESG (SEQ ID NO: 93), GSEGS (SEQ ID NO: 94), GEGGSGEGSSGEGSSSEGGGSEGGGSEGGGSEGGS (SEQ ID NO: 95), и соединяющий линкер, состоящий из случайным образом размещенных через каждые 4 аминокислоты Q S и Е.

В ряде вариантов осуществления химерный белок содержит модульный линкер, как показано на ФИГ. 32.

В ряде вариантов осуществления линкер может быть гибким, в том числе, не ограничиваясь перечисленным, высоко гибким. В ряде вариантов осуществления линкер может быть жестким, включая, не ограничиваясь перечисленным, жесткую альфа-спираль.

В ряде вариантов осуществления линкер может быть функциональным. Например, не ограничиваясь перечисленным, линкер может выполнять функцию, состоящую в улучшении фолдинга и/или стабильности, улучшения экспрессии, улучшения фармакокинетики и/или улучшения биологической активности настоящего химерного белка. В еще одном примере линкер может выполнять функцию, состоящую в нацеливании химерного белка на конкретный тип клеток или конкретное местоположение.

В ряде вариантов осуществления настоящие химерные белки способны и могут применяться в способах, включающих стимулирование иммунной активации (например, направленной против опухолей). В различных вариантах осуществления настоящие химерные белки способны и могут применяться в способах, включающих подавление иммунного ингибирования (например, позволяющего опухолям выживать). В различных вариантах осуществления настоящие химерные белки обеспечивают улучшенную иммунную активацию и/или улучшенное подавление иммунного ингибирования из-за близости передаваемых сигналов, обеспечиваемой химерной природой конструкций.

В различных вариантах осуществления настоящие химерные белки способны или могут применяться в способах, включающих модуляцию амплитуды иммунного ответа, например, модуляцию уровня эффекторного ответа. В ряде вариантов осуществления, например, при применении для лечения рака, настоящие химерные белки изменяют степень иммунной стимуляции по сравнению с иммунным ингибированием для увеличения амплитуды Т-клеточного ответа, включая, не ограничиваясь перечисленным, стимуляцию повышенных уровней продукции цитокинов, пролиферации или потенциала уничтожения мишеней.

В ряде вариантов осуществления настоящие химерные белки, в некоторых вариантах осуществления, способны или находят применение в способах, включающих маскирование ингибирующего лиганда на поверхности опухолевой клетки и замену этого иммуноингибирующего лиганда иммуностимулирующим лигандом. Соответственно, настоящие химерные белки в ряде вариантов осуществления способны или находят применение в способах, включающих уменьшение или устранение иммуноингибирующего сигнала и/или увеличение или активацию иммуностимулирующего сигнала. Например, опухолевая клетка, несущая ингибирующий сигнал (и таким образом уклоняющаяся от иммунного ответа), может быть заменена положительным сигналом, связывающимся на Т-клетке, которая затем может атаковать опухолевую клетку. Соответственно, в ряде вариантов осуществления иммуноингибирующий сигнал маскируется настоящими конструкциями и активируется иммуностимулирующий сигнал. Такие полезные свойства усиливаются подходом, используемым в настоящих химерных белках, состоящим в использовании единой конструкции. Например, замена сигнала может быть осуществлена почти одновременно, и замена сигнала приспособлена для локального осуществления в месте, имеющем клиническое значение (например, в микроокружении опухоли). В других вариантах тот же принцип применяется осуществления к другим химерным белковым конструкциям, таким как, например, (i) внеклеточный домен TIGIT и (ii) внеклеточный домен 4-1BBL; (i) внеклеточный домен TIGIT и (ii) внеклеточный домен GITRL; (i) внеклеточный домен TIGIT и (ii) внеклеточный домен TL1 A; (i) внеклеточный домен TIGIT и (ii) внеклеточный домен LIGHT; и (i) внеклеточный домен PD-1 и (ii) внеклеточный домен LIGHT; и (i) внеклеточный домен CD172a(SIRPα) и (ii) внеклеточный домен LIGHT; и (i) внеклеточный домен TIGIT и (ii) внеклеточный домен LIGHT; и другие.

В ряде вариантов осуществления настоящие химерные белки способны или находят применение в способах, включающих стимуляцию или усиление связывания пар иммуностимулирующий рецептор/лиганд. Примеры ко стимулирующих Т-клеточных рецепторов и их лигандов включают OX-40 : OX40-L, CD27 : CD70, CD30 : CD30-L, CD40 : CD40-L; CD137 : CD137-L, HVEM : LIGHT, GITR : GITR-L, TNFRSF25 : TL1A, DR5 : TRAILh BTLA : HVEM. В ряде вариантов осуществления настоящие химерные белки способны или находят применение в способах, включающих ингибирование или уменьшение связывания пар иммуноингибирующий рецептор/лиганд. Примеры коингибирующих Т-клеточных рецепторов и их лигандов включают, например, CTLA-4 : CD80/CD86, PD-1 : PD-L1/PD-L2, BTLA : HVEM, Т1М-3 : галектин-9/фосфатидилсерин, TIGIT/CD155 или CD112, VISTA/VSIG8, CD172a(SIRPα)/CD47, B7H3R/B7H3, B7H4R/B7H4, CD244/CD48, TMIGD2/HHLA2, и другие.

В ряде вариантов осуществления настоящий химерный белок блокирует, уменьшает и/или ингибирует PD-1 и PD-L1 или PD-L2, и/или связывание PD-1 с PD-L1 или PD-L2. В ряде вариантов осуществления настоящий химерный белок блокирует, уменьшает и/или ингибирует активность CTLA-4 и/или связывание CTLA-4 с одним или более из АР2М1, CD80, CD86, SHP-2 и PPP2R5A. В ряде вариантов осуществления настоящий химерный белок увеличивает и/или стимулирует GITR и/или связывание GITR с одним или более лигандами GITR. В ряде вариантов осуществления настоящий химерный белок увеличивает и/или стимулирует ОХ40 и/или связывание ОХ40 с одним или более лигандами ОХ40.

В ряде вариантов осуществления настоящие химерные белки способны или находят применение в способах, включающих усиление, восстановление, способствование и/или стимуляцию иммунной модуляции. В ряде вариантов осуществления настоящие химерные белки, описанные в настоящем документе, восстанавливают, способствуют и/или стимулируют активность или активацию одной или более иммунных клеток против опухолевых клеток, включая, не ограничиваясь перечисленным: Т-клетки, цитотоксические Т-лимфоциты, Т-хелперные клетки, естественных киллеров (NK-клетки), Т-клетки, обладающие свойствами естественных киллеров (NKT), противоопухолевые макрофаги (например, макрофаги M1), В-клетки и дендритные клетки. В ряде вариантов осуществления настоящие химерные белки усиливают, восстанавливают, способствуют и/или стимулируют активность и/или активацию Т-клеток, включая, в качестве неограничивающего примера, активацию и/или стимуляцию одного или более собственных Т-клеточных сигналов, включая сигнал выживания; аутокринный или паракринный сигнал роста; сигнал, опосредованный р38 МАРК, ERK, STAT, JAK, АКТ или PI3K; антиапоптотический сигнал; и/или сигнал, способствующий и/или необходимый для одного или более из продукции провоспалительных цитокинов, или миграции Т-клеток, или Т-клеточной инфильтрации опухоли.

В ряде вариантов осуществления настоящие химерные белки способны или находят применение в способах, включающих увеличение числа одного или более типов Т-клеток (включая, не ограничиваясь перечисленным, цитотоксические Т-лимфоциты, Т-хелперные клетки, Т-клетки, обладающие свойствами естественных киллеров (NKT)), В клетки, естественных киллеров (NK-клетки), Т-клетки, обладающие свойствами естественных киллеров (NKT), дендритные клетки, моноциты и макрофаги (например, один или более из M1 и М2) в опухоли или в микроокружении опухоли. В ряде вариантов осуществления настоящие химерные белки способны или находят применение в способах, включающих ингибирование и/или снижение рекрутирования иммуносупрессивных клеток (например, клеток-супрессоров миелоидного происхождения (MDSC), регуляторных Т-клеток (Treg), опухоль-ассоциированных нейтрофилов (TAN), макрофагов М2 и опухоль-ассоциированных макрофагов (ТАМ)) в опухоли и/или микроокружении опухоли (ТМЕ). В ряде вариантов осуществления настоящая терапия может изменять соотношение макрофагов M1 и М2 в месте опухоли и/или ТМЕ в пользу макрофагов M1.

В ряде вариантов осуществления настоящие химерные белки способны и могут применяться в способах, включающих ингибирование и/или уменьшение инактивации Т-клеток и/или иммунной толерантности к опухоли, включающих введение субъекту эффективного количества химерного белка, описанного в настоящем документе. В ряде вариантов осуществления настоящие химерные белки способны увеличивать сывороточные уровни различных цитокинов, включая, не ограничиваясь перечисленным, один или более из IFNγ, TNFα, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13, IL-17A, IL-17F и IL-22. В ряде вариантов осуществления настоящие химерные белки способны усиливать IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, IL-17A, IL-22, TNFα или IFNγ в сыворотке субъекта, получившего лечение. В ряде вариантов осуществления введение настоящего химерного белка способно усиливать секрецию TNFα. В конкретном варианте осуществления введение настоящего химерного белка способно усиливать опосредованную суперантигеном секрецию TNFα лейкоцитами. Детекция такого цитокинового ответа может обеспечить способ определения оптимального режима дозирования для указанного химерного белка.

В ряде вариантов осуществления настоящие химерные белки ингибируют, блокируют и/или уменьшают гибель противоопухолевых CD8+ и/или CD4+ Т-клеток; или стимулируют, вызывают и/или увеличивают гибель проопухолевых Т-клеток. Истощение Т-клеток это состояние дисфункции Т-клеток, характеризующееся прогрессирующей потерей пролиферативных и эффекторных функций, завершающееся клональной делецией. Соответственно, проопухолевая Т-клетка относится к состоянию дисфункции Т-клеток, которое возникает во время многих хронических инфекций и рака. Эта дисфункция определяется слабыми пролиферативными и/или эффекторными функциями, устойчивой экспрессией ингибирующих рецепторов и состоянием транскрипции, отличным от такового функциональных эффекторных Т-клеток или функциональных Т-клеток памяти. Истощение препятствует оптимальному контролю инфекции и опухолей. Кроме того, противоопухолевые CD8+ и/или CD4+ Т-клетки относятся к Т-клеткам, которые могут вызывать иммунный ответ на опухоль. Примеры проопухолевых Т-клеток включают, не ограничиваясь перечисленным, Treg, CD4+ и/или CD8+ Т-клетки, экспрессирующие один или более рецепторов, ингибирующих контрольные точки, Th2-клетки и Th17-клетки. Рецепторы, ингибирующие контрольные точки, относятся к рецепторам, экспрессируемым на иммунных клетках, которые предотвращают или ингибируют неконтролируемые иммунные ответы.

В ряде вариантов осуществления настоящие химерные белки способны и могут применяться в способах, включающих увеличение соотношения эффекторных Т-клеток и регуляторных Т-клеток. Примеры эффекторных Т-клеток включают ICOS⁺ эффекторные Т-клетки; цитотоксичные Т-клетки (например, αβ TCR, CD3⁺, CD8⁺, CD45RO⁺); CD4⁺ эффекторные Т-клетки (например, αβ TCR, CD3⁺, CD4⁺, CCR7⁺, CD62L(высокие), IL-7R/CD127⁺); CD8+эффекторные Т-клетки (например, αβ TCR, CD3⁺, CD8⁺, CCR7⁺, CB62L(высокие), IL-7R/CD127⁺); эффекторные Т-клетки памяти (например, CD62L(низкие), CD44⁺, TCR, CD3⁺, IL-7R/CD127⁺, IL-15R⁺, CCR7(низкие)); центральные Т-клетки памяти (например, CCR7⁺, CD62L⁺, CD27⁺; или CCR7(высокие), CD44⁺, CD62L(высокие), TCR, CD3⁺, IL-7R/CD127⁺, IL-15R⁺); CD62L⁺ эффекторные Т-клетки; CD8⁺ эффекторные Т-клетки памяти (ТЕМ), включая ранние эффекторные Т-клетки памяти (CD27⁺ CD62L^-) и поздние ранние эффекторные Т-клетки памяти (CD27^- CD62L^-) (ТетЕ и TemL, соответственно); CD127(⁺)CD25(низкие/-) эффекторные Т-клетки; CD127(^-)CD25(^-) эффекторные Т-клетки; CD8+стволовые эффекторные клетки памяти (TSCM) (например, CD44(низкие)CD62L(высокие)CD122(высокие)sca(⁺)); ТН1 эффекторные Т-клетки (например, CXCR3⁺, CXCR6⁺ и CCR5⁺; или αβ TCR, CD3⁺, CD4⁺, IL-12R⁺, IFNγR⁺, CXCR3⁺), TH2 эффекторные Т-клетки (например, CCR3⁺, CCR4⁺ и CCR8⁺; или αβ TCR, CD3⁺, CD4⁺, IL-4R⁺, IL-33R⁺, CCR4⁺, IL-17RB⁺, CRTH2⁺); TH9 эффекторные Т-клетки (например, αβ TCR, CD3⁺, CD4⁺); TH17 эффекторные Т-клетки (например, αβ TCR, CD3⁺, CD4⁺, IL-23R⁺, CCR6⁺, IL-1R⁺); CD4⁺CD45RO⁺CCR7⁺ эффекторные Т-клетки, CD4⁺CD45RO⁺CCR7(^-) эффекторные Т-клетки; и эффекторные Т-клетки, секретирующие IL-2, IL-4 и/или IFN-γ. Примеры регуляторных Т-клеток включают ICOS⁺ регуляторные Т-клетки, CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺ регуляторные Т-клетки, CD4⁺CD25⁺ регуляторные Т-клетки, CD4⁺CD25^- регуляторные Т-клетки, CD4⁺CD25(высокие) регуляторные Т-клетки, TIM-3⁺PD-1⁺ регуляторные Т-клетки, ген 3, активирующий лимфоциты (LAG-3)⁺ регуляторные Т-клетки, CTLA-4/CD152⁺ регуляторные Т-клетки, нейропилин-1 (Nrp-1)⁺ регуляторные Т-клетки, CCR4⁺CCR8⁺ регуляторные Т-клетки, CD62L (L-селектин)⁺ регуляторные Т-клетки, CD45RB(низкие) регуляторные Т-клетки, CD127(низкие) регуляторные Т-клетки, LRRC32/GARP⁺ регуляторные Т-клетки, CD39⁺ регуляторные Т-клетки, GITR⁺ регуляторные Т-клетки, LAP⁺ регуляторные Т-клетки, 1В11⁺ регуляторные Т-клетки, BTLA⁺ регуляторные Т-клетки, регуляторные Т-клетки 1 типа (Tr1-клетки), Т-хелперы 3 типа (Th3-клетки), регуляторные клетки, имеющие фенотип Т-клеток, обладающих свойствами естественных киллеров (NKTreg-клетки), CD8⁺ регуляторные Т-клетки, CD8⁺CD28⁺ регуляторные Т-клетки и/или регуляторные Т-клетки, секретирующие IL-10, IL-35, TGF-β, TNF-α, галектин-1, IFN-γ и/или МСР1.

В ряде вариантов осуществления химерный белок генерирует анамнестическую реакцию, которая может, например, быть способной предотвратить рецидив или защитить животное от повторной антигенной стимуляции. Таким образом, животное, получившее лечение химерным белком, впоследствии способно атаковать опухолевые клетки и/или предупреждать развитие опухолей при повторной антигенной стимуляции после первоначального лечения химерным белком. Соответственно, химерный белок согласно настоящему изобретению стимулирует как активное разрушение опухоли, так и иммунное распознавание опухолевых антигенов, которые необходимы для программирования анамнестической реакции, способной предупредить рецидив.

В ряде вариантов осуществления настоящие химерные белки способны и могут применяться в способах, включающих временную стимуляцию эффекторных Т-клеток в течение не более приблизительно 12 часов, приблизительно 24 часов, приблизительно 48 часов, приблизительно 72 часов или приблизительно 96 часов, или приблизительно 1 недели, или приблизительно 2 недель. В ряде вариантов осуществления настоящие химерные белки способны и могут применяться в способах, включающих временное истощение или ингибирование регуляторных Т-клеток в течение не более приблизительно 12 часов, приблизительно 24 часов, приблизительно 48 часов, приблизительно 72 часов или приблизительно 96 часов, или приблизительно 1 недели, или приблизительно 2 недель. В ряде вариантов осуществления временная стимуляция эффекторных Т-клеток и/или временное истощение или ингибирование регуляторных Т-клеток происходит по существу в кровотоке пациента или в конкретной ткани/месте, включая лимфоидные ткани, такие как, например, костный мозг, лимфатический узел, селезенка, вилочковая железа, лимфоидная ткань, ассоциированная со слизистыми оболочками (MALT), нелимфоидные ткани, или в микроокружении опухоли.

В ряде вариантов осуществления настоящие химерные белки обеспечивают преимущества, включающие, не ограничиваясь перечисленным, простоту использования и простоту производства. Это связано с тем, что два отдельных агента для иммунотерапии объединены в один продукт, что позволяет использовать один производственный процесс вместо двух независимых производственных процессов. Кроме того, введение одного агента вместо двух отдельных агентов обеспечивает более легкое введение и лучшее соблюдение пациентом режима лечения. Кроме того, в отличие от, например, моноклональных антител, которые представляют собой крупные мультимерные белки, содержащие множество дисульфидных связей и посттрансляционных модификаций, таких как гликозилирование, настоящие химерные белки являются более простыми и экономически выгодными в производстве.

В ряде вариантов осуществления настоящий химерный белок может продуцироваться в клетке-хозяине млекопитающего в виде единой секретируемой и полностью функциональной полипептидной цепи.

В ряде вариантов осуществления настоящий химерный белок неожиданно обеспечивает связывание компонентов внеклеточного домена с их соответствующими партнерами по связыванию с низкими скоростями диссоциации (K_d или K_off). В ряде вариантов осуществления это обеспечивает неожиданно длительное взаимодействие рецептора с лигандом и наоборот. Такое действие обеспечивает устойчивый эффект маскирования отрицательного сигнала. Кроме того, в ряде вариантов осуществления это обеспечивает более продолжительный положительный сигнальный эффект, например, чтобы обеспечить адекватную стимуляцию эффекторной клетки для противоопухолевого действия. Например, настоящий химерный белок, например, ввиду связывания с низкой скоростью диссоциации, обеспечивает достаточную передачу сигнала для обеспечения пролиферации Т-клеток и позволяет провести противоопухолевую атаку. В качестве дополнительного примера, настоящий химерный белок, например, ввиду связывания с низкой скоростью диссоциации, обеспечивает достаточную передачу сигнала для обеспечения высвобождения стимулирующих сигналов, таких как, например, цитокины.

Стабильный синапс клеток, стимулируемый настоящими агентами (например, опухолевой клетки, несущей отрицательные сигналы, и Т-клетки, способной атаковать опухоль), обеспечивает пространственную ориентацию, способствующую уменьшению опухоли, такую как приведение Т-клеток в положение для атаки опухолевых клеток и/или стерическое предотвращение доставки опухолевыми клетками отрицательных сигналов, включая отрицательные сигналы помимо тех, которые маскируются химерным белком согласно изобретению.

В ряде вариантов осуществления это обеспечивает более длительное время полужизни (t_1/2) на мишени (например, внутри опухоли) по сравнению с t_1/2 химерных белков в сыворотке. Такие свойства могут иметь совместное преимущество, заключающееся в снижении нецелевой токсичности, которая может быть связана с системным распределением химерных белков.

В ряде вариантов осуществления настоящие агенты позволяют отдельным иммунным клеткам действовать, например, противоопухолевым образом, путем предупреждения и/или нарушения ингибирования NK-клеток и/или подмножеств активированных Т-клеток, Т-клеток памяти и/или регуляторных Т-клеток, и/или хелперных Т-клеток, блокируя сигнал с помощью TIGIT и, необязательно, создавая дополнительные иммунные ответы с помощью стимулирующей передачи сигналов на основе 4-1BBL, и/или GITRL, и/или TL1A, и/или LIGHT.

В ряде вариантов осуществления настоящие агенты позволяют отдельным иммунным клеткам действовать, например, противоопухолевым образом, путем стимуляции и/или увеличения стимулирующей передачи сигналов на основе LIGHT, например, на висцеральных, и/или лимфоидных, и/или других стромальных, и/или эпителиальных, и/или миелоидных клетках и, необязательно, создают дополнительные иммунные ответы посредством блокады или уменьшения ингибирующей передачи сигналов на основе PD-1, и/или CD172a(SIRPα), и/или TIGIT.

Кроме того, в ряде вариантов осуществления настоящие химерные белки обеспечивают синергетическое терапевтическое действие, поскольку они позволяют улучшить сайт-специфическое взаимодействие двух иммунотерапевтических агентов.

В ряде вариантов осуществления настоящие химерные белки обеспечивают потенциал для снижения токсичности в месте лечения и/или системной токсичности.

В ряде вариантов осуществления настоящие химерные белки обеспечивают уменьшение побочных действий, например, осложнений со стороны желудочно-кишечного тракта, по сравнению с существующими иммунотерапиями, например, антителами к молекулам-контрольным точкам, как описано в настоящем документе. Примеры осложнений со стороны желудочно-кишечного тракта включают боль в животе, потерю аппетита, аутоиммунные эффекты, запоры, судороги, обезвоживание, диарею, проблемы с питанием, усталость, метеоризм, образование жидкости в брюшной полости или асцит, желудочно-кишечный (ЖК) дисбиоз, мукозит желудочно-кишечного тракта, воспалительные заболевания кишечника, синдром раздраженного кишечника (СРК-Д (синдром раздраженного кишечника с диареей) и СРК-3 (синдром раздраженного кишечника с запором)), тошноту, боль, изменения стула или мочи, язвенный колит, рвоту, увеличение массы тела из-за удержания жидкости и/или слабость.

Заболевания; способы лечения и отбор пациентов

В ряде вариантов осуществления настоящее изобретение относится к раковым заболеваниям и/или опухолям; например, лечению или предупреждению раковых заболеваний и/или опухолей. Как описано в других частях настоящего документа, лечение рака может включать, в ряде вариантов осуществления, модуляцию иммунной системы с помощью настоящих химерных белков, чтобы способствовать иммунной стимуляции по сравнению с иммунным ингибированием.

Раковые заболевания или опухоли относятся к неконтролируемому росту клеток и/или патологическому увеличению выживаемости клеток, и/или ингибированию апоптоза, что мешает нормальному функционированию органов и систем организма. В объем изобретения входят доброкачественные и злокачественные опухоли, полипы, гиперплазия, а также латентные опухоли или микрометастазы. Также в объем изобретения входят клетки, обладающие патологической пролиферацией, не сдерживаемой иммунной системой (например, клетки, инфицированные вирусом). Рак может представлять собой первичный или метастатический рак. Первичный рак может представлять собой область раковых клеток в месте возникновения, которая становится клинически обнаруживаемой, и может представлять собой первичную опухоль. Метастатический рак, напротив, может представлять собой распространение заболевания от одного органа или части к другому несмежному органу или части. Метастатический рак может быть вызван раковой клеткой, которая приобретает способность проникать и инфильтрировать окружающие нормальные ткани в локальной области, образуя новую опухоль, которая может представлять собой локальный метастаз. Рак также может быть вызван раковой клеткой, которая приобретает способность проникать через стенки лимфатических и/или кровеносных сосудов, после чего раковая клетка может циркулировать в кровотоке (тем самым являясь циркулирующей опухолевой клеткой) в другие места и ткани в организме. Рак может быть вызван таким процессом, как распространение в лимфатической или кровеносной системе. Рак также может быть вызван опухолевой клеткой, которая останавливается в другом месте, повторно проникает через сосуд или стенки, продолжает размножаться и в конечном итоге образует другую клинически обнаруживаемую опухоль. Рак может представлять собой эту новую опухоль, которая может представлять собой метастатическую (или вторичную) опухоль.

Рак может быть вызван метастазирующими опухолевыми клетками, которые могут представлять собой вторичную или метастатическую опухоль. Клетки опухоли могут быть такими же, как и в исходной опухоли. Например, если рак молочной железы или рак толстой кишки метастазирует в печень, вторичная опухоль, хотя и присутствует в печени, состоит из патологических клеток молочной железы или толстой кишки, а не патологических клеток печени. Таким образом, опухоль в печени может представлять собой метастатический рак молочной железы или метастатический рак толстой кишки, а не рак печени.

Рак может происходить из любой ткани. Рак может происходить из меланомы, толстой кишки, молочной железы или предстательной железы и, таким образом, может состоять из клеток, которые изначально представляли собой клетки кожи, толстой кишкой, молочной железы или предстательной железы, соответственно. Рак также может представлять собой гематологическое злокачественное новообразование, которое может представлять собой лейкоз или лимфому. Рак может поражать такие ткани, как печень, легкое, мочевой пузырь или кишечник.

Примеры раковых заболеваний и/или опухолей согласно настоящему изобретению включают, не ограничиваясь перечисленным, базальноклеточную карциному, рак желчевыводящих протоков; рак мочевого пузыря; рак кости; рак мозга и центральной нервной системы; рак молочной железы; рак брюшной полости; рак шейки матки; хориокарциному; рак толстой кишки и прямой кишки; рак соединительной ткани; рак пищеварительной системы; рак эндометрия; рак пищевода; рак глаза; рак головы и шеи; рак желудка (включая рак желудочно-кишечного тракта); глиобластому; карциному печени; гепатому; интраэпителиальное новообразование; рак почки или ренальный рак; рак гортани; лейкоз; рак печени; рак легкого (например, мелко клеточный рак легкого, не мелкоклеточный рак легкого, аденокарциному легкого и плоскоклеточную карциному легкого); меланому; миелому; нейробластому; рак ротовой полости полости (губ, языка, рта и глотки); рак яичника; рак поджелудочной железы; рак предстательной железы; ретинобластому; рабдомиосаркому; рак прямой кишки; рак дыхательной системы; карциному слюнной железы; саркомы; рак кожи; плоскоклеточный рак; рак желудка; рака яичка; рак щитовидной железы; рак матки или рак эндометрия; рак мочеполовой системы; рак вульвы; лимфому, включая лимфому Ходжкина и неходжкинскую лимфому а также В-клеточную лимфому (включая неходжкинскую лимфому (НХЛ) низкой степени злокачественности/фолликулярную НХЛ, малую лимфоцитарную (МЛ) НХЛ, НХЛ средней степени злокачественности/ фолликулярную НХЛ, диффузную НХЛ средней степени злокачественности; иммунобластную НХЛ высокой степени злокачественности, лимфобластную НХЛ высокой степени злокачественности, мелко клеточную НХЛ с нерассеченными ядрами высокой степени злокачественности, НХЛ с массивным поражением, лимфому клеток мантийной ткани, лимфому, связанную со СПИДом, и макроглобулинемию Вальденстрема, хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ), острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ); волосатоклеточный лейкоз, хронический миелобластный лейкоз, а также другие карциномы и саркомы; и посттрансплантационный лимфопролиферативный синдром (PTLD), а также патологическую пролиферацию сосудов, связанную с факоматозами, эдему (такую как связанная с опухолями головного мозга) и синдром Мейгса.

В ряде вариантов осуществления химерный белок применяют для лечения субъекта, имеющего невосприимчивый к лечению рак. В ряде вариантов осуществления химерный белок применяют для лечения субъекта, невосприимчивого к одному или более иммуномодулирующим агентам. Например, в ряде вариантов осуществления химерный белок применяют для лечения субъекта, у которого не наблюдается ответа на лечение или даже прогресса спустя приблизительно 12 недель лечения. Например, в ряде вариантов осуществления субъект является невосприимчивым к агенту PD-1, и/или PD-L1, и/или PD-L2, включая, например, пациентов, невосприимчивых к ниволумабу (ONO-4538/BMS-936558, MDX1106, OPDIVO, BRISTOL MYERS SQUIBB), пембролизумабу (KEYTRUDA, MERCK), пидилизумабу (CT-011, CURE TECH), MK-3475 (MERCK), BMS 936559 (BRISTOL MYERS SQUIBB), ибрутинибу (PHARMACYCLICS/ABBVIE), атезолизумабу (TECENTRIQ, GENENTECH) и/или MPDL3280A (ROCHE). Например, в ряде вариантов осуществления субъект является невосприимчивым к агенту против CTLA-4, например, пациентом, невосприимчивым к ипилимумабу (YERVOY) (например, пациенты с меланомой). Соответственно, в ряде вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способам лечения рака, эффективным для лечения пациентов, которые не отвечают на различные виды терапии, включая монотерапию одним или более иммуномодулирующими агентами.

В ряде вариантов осуществления настоящее изобретение относится к химерным белкам, нацеленным на клетку или ткань в микроокружении опухоли. В ряде вариантов осуществления клетка или ткань в микроокружении опухоли экспрессирует одну или более мишеней или партнеров по связыванию химерного белка. Микроокружение опухоли относится к клеточной среде, включая клетки, секретируемые белки, физиологические малые молекулы и кровеносные сосуды, в которой существует опухоль. В ряде вариантов осуществления клетки или ткань в микроокружении опухоли представляют собой одно или более из: сосудистой сети опухоли; инфильтрирующих опухоль лимфоцитов; фибробластных ретикулярных клеток; эндотелиальных клеток-предшественников (ЕРС); связанных с раком фибробластов; перицитов; других стромальных клеток; компонентов внеклеточного матрикса (ЕСМ); дендритных клеток; антигенпрезентирующих клеток; Т-клеток; регуляторных Т-клеток; макрофагов; нейтрофилов; и других иммунных клеток, расположенных в непосредственной близости от опухоли. В ряде вариантов осуществления настоящий химерный белок нацелен на раковую клетку. В ряде вариантов осуществления раковая клетка экспрессирует одну или более мишеней или партнеров по связыванию химерного белка.

В ряде вариантов осуществления химерный белок согласно изобретению может быть нацелен на клетку (например, раковую клетку или иммунную клетку), экспрессирующую TIGIT. В ряде вариантов осуществления химерный белок согласно изобретению может быть нацелен на клетку (например, раковую клетку или иммунную клетку), экспрессирующую CD155/PVR. В ряде вариантов осуществления химерный белок согласно изобретению может быть нацелен на клетку (например, раковую клетку или иммунную клетку), экспрессирующую нектин-2. В ряде вариантов осуществления химерный белок согласно настоящему изобретению может быть нацелен на клетку (например, раковую клетку или иммунную клетку), экспрессирующую нектин-3. В ряде вариантов осуществления химерный белок согласно настоящему изобретению может быть нацелен на клетку (например, раковую клетку или иммунную клетку), экспрессирующую нектин-4.

В ряде вариантов осуществления химерный белок согласно изобретению может быть нацелен на клетку (например, раковую клетку или иммунную клетку), экспрессирующую LIGHT. В ряде вариантов осуществления химерный белок согласно изобретению может быть нацелен на клетку (например, раковую клетку или иммунную клетку), экспрессирующую LTBR. В ряде вариантов осуществления химерный белок согласно изобретению может быть нацелен на клетку (например, раковую клетку или иммунную клетку), экспрессирующую HVEM. В ряде вариантов осуществления химерный белок согласно изобретению может быть нацелен на клетку (например, раковую клетку или иммунную клетку), экспрессирующую DcR3.

В ряде вариантов осуществления настоящие способы обеспечивают возможность лечения химерным белком пациента, невосприимчивого к дополнительному агенту, причем такие «дополнительные агенты» описаны в других частях настоящего документа, включая, не ограничиваясь перечисленным, различные химиотерапевтические агенты, описанные в настоящем документе.

В ряде вариантов осуществления химерные белки применяют для лечения, контроля или предупреждения одного или более воспалительных заболеваний или состояний. Неограничивающие примеры воспалительных заболеваний включают обыкновенные угри, острое воспаление, аллергический ринит, астму, атеросклероз, атопический дерматит, аутоиммунное заболевание, аутоиммунные воспалительные заболевания, аутосомно-рецессивную спастическую атаксию, бронхоэктазию, целиакию, хронический холецистит, хроническое воспаление, хронический простатит, колит, дивертикулит, семейную эозинофилию (СЭ), гломерулонефрит, дефицит глицеринкиназы, гнойный гидраденит, гиперчувствительность, воспаление, воспалительные заболевания кишечника, воспалительные заболевания органов таза, интерстициальный цистит, воспалительное заболевание гортани, синдром Ли, красный плоский лишай, синдром активации тучных клеток, мастоцитоз, воспалительные заболевания глаз, отит, боль, воспалительное заболевание тазовых органов, реперфузионное повреждение, респираторные заболевания, рестеноз, ревматизм, ревматический полиартрит, ринит, саркоидоз, септический шок, силикоз и другие пневмокониозы, отторжение трансплантата, туберкулез и васкулит.

В ряде вариантов осуществления воспалительное заболевание представляет собой аутоиммунное заболевание или состояние, такое как рассеянный склероз, сахарный диабет, волчанка, целиакия, болезнь Крона, язвенный колит, синдром Гийена-Барре, склеродермия, синдром Гудпасчера, гранулематоз Вегенера, аутоиммунная эпилепсия, энцефалит Расмуссена, первичный склероз желчных протоков, склерозирующий холангит, аутоиммунный гепатит, болезнь Аддисона, тиреоидит Хашимото, фибромиалгия, синдром Меньера; отторжение трансплантата (например, предупреждение отторжения аллотрансплантата), пернициозная анемия, ревматоидный артрит, системная красная волчанка, дерматомиозит, синдром Шегрена, красная волчанка, рассеянный склероз, миастения гравис, синдром Рейтера, болезнь Грейвса и другие аутоиммунные заболевания.

В некоторых аспектах настоящие химерные агенты применяют для устранения внутриклеточных патогенов. В некоторых аспектах настоящие химерные агенты применяют для лечения одной или более инфекций. В ряде вариантов осуществления настоящие химерные белки применяют в способах лечения вирусных инфекций (включая, например, ВИЧ (вирус иммунодефицита человека) и HCV (вирус гепатита С)), паразитарных инфекций (включая, например, малярию) и бактериальных инфекций. В ряде вариантов осуществления инфекции вызывают подавление иммунного ответа. Например, ВИЧ-инфекции часто приводят к подавлению иммунного ответа у инфицированных субъектов. Соответственно, как описано в других частях настоящего документа, лечение таких инфекций может включать, в ряде вариантов осуществления, модуляцию иммунной системы с помощью настоящих химерных белков, чтобы способствовать иммунной стимуляции по сравнению с иммунным ингибированием. В качестве альтернативы, настоящее изобретение относится к способам лечения инфекций, вызывающим активацию иммунного ответа. Например, кишечные гельминтные инфекции были связаны с хронической активацией иммунного ответа. В этих вариантах осуществления лечение таких инфекций может включать модуляцию иммунной системы с помощью настоящих химерных белков, чтобы способствовать иммунному ингибированию по сравнению с иммунной стимуляцией.

В ряде вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способам лечения вирусных инфекций, включая, не ограничиваясь перечисленным, острые или хронические вирусные инфекции, например, дыхательных путей, инфекции вирусом папилломы, инфекции вирусом простого герпеса (HSV), инфекцию вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) и вирусную инфекцию внутренних органов, такую как инфекция вирусами гепатита. В ряде вариантов осуществления вирусная инфекция вызвана вирусом семейства Flaviviridae. В ряде вариантов осуществления вирус семейства Flaviviridae выбран из вируса желтой лихорадки, вируса Западного Нила, вируса Денге, вируса японского энцефалита, вируса энцефалита Сент-Луис и вируса гепатита С. В ряде вариантов осуществления вирусная инфекция вызвана вирусом семейства Picornaviridae, например, полиовирусом, риновирусом, вирусом Коксаки. В ряде вариантов осуществления вирусная инфекция вызвана представителем Orthomyxoviridae, например, вирусом гриппа. В ряде вариантов осуществления вирусная инфекция вызвана представителем Retroviridae, например, лентивирусом. В ряде вариантов осуществления вирусная инфекция вызвана представителем Paramyxoviridae, например, респираторно-синцитиальным вирусом, вирусом парагриппа человека, рубулавирусом (например, вирусом паротита), вирусом кори и метапневмовирусом человека. В ряде вариантов осуществления вирусная инфекция вызвана представителем Bunyaviridae, например, хантавирусом. В ряде вариантов осуществления вирусная инфекция вызвана представителем Reoviridae, например, ротавирусом.

В ряде вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способам лечения паразитарных инфекций, таких как протозойные инфекции или гельминтозы. В ряде вариантов осуществления паразитарная инфекция представляет собой простейшего паразита. В ряде вариантов осуществления, паразит oritiziab выбран из простейших кишечника, простейших тканей или простейших крови. Примеры простейших паразитов включают, не ограничиваясь перечисленным, Entamoeba hystolytica, Giardia lamblia, Cryptosporidium muris, Trypanosomatida gambiense, Trypanosomatida rhodesiense, Trypanosomatida crusi, Leishmania mexicana, Leishmania braziliensis, Leishmania tropica, Leishmania donovani, Toxoplasma gondii, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae, Plasmodium falciparum, Trichomonas vaginalis и Histomonas meleagridis. В ряде вариантов осуществления паразитарная инфекция вызвана глистным паразитом, таким как нематоды (например, аденофореи). В ряде вариантов осуществления паразит выбран из Secementea (например, Trichuris trichiura, Ascaris lumbricoides, Enterobius vermicularis, Ancylostoma duodenale, Necator americanus, Strongyloides stercoralis, Wuchereria bancrofti, Dracunculus medinensis). В ряде вариантов осуществления паразит выбран из трематод (например, кровяные сосальщики, печеночные сосальщики, кишечные сосальщики и легочные сосальщики). В ряде вариантов осуществления паразит выбран из Schistosoma mansoni, Schistosoma haematobium, Schistosoma japonicum, Fasciola hepatica, Fasciola gigantica, Heterophyes, Paragonimus westermani. В ряде вариантов осуществления паразит выбран из цестод (например, Taenia solium, Taenia saginata, Hymenolepis nana, Echinococcus granulosus).

В ряде вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способам лечения бактериальных инфекций. В ряде вариантов осуществления бактериальная инфекция вызвана грамположительными бактериями, грамотрицательными бактериями, аэробными и/или анаэробными бактериями. В ряде вариантов осуществления бактерии выбраны, не ограничиваясь перечисленным, из Staphylococcus, Lactobacillus, Streptococcus, Sarcina, Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Pseudomonas, Acinetobacter, Mycobacterium, Proteus, Campylobacter, Citrobacter, Nisseria, Baccillus, Bacteroides, Peptococcus, Clostridium, Salmonella, Shigella, Serratia, Haemophilus, Brucella и других организмов. В ряде вариантов осуществления бактерии выбраны, не ограничиваясь перечисленным, из Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas acidovorans, Pseudomonas alcaligenes, Pseudomonas putida, Stenotrophomonas maltophilia, Burkholderia cepacia, Aeromonas hydrophilia, Escherichia coli, Citrobacter freundii, Salmonella typhimurium, Salmonella typhi, Salmonella paratyphi, Salmonella enteritidis, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Serratia marcescens, Francisella tularensis, Morganella morganii, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Providencia alcalifaciens, Providencia rettgeri, Providencia stuartii, Acinetobacter baumannii, Acinetobacter calcoaceticus, Acinetobacter haemolyticus, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis, Yersinia intermedia, Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis, Bordetella bronchiseptica, Haemophilus influenzae, Haemophilus parainfluenzae, Haemophilus haemolyticus, Haemophilus parahaemolyticus, Haemophilus ducreyi, Pasteurella multocida, Pasteurella haemolytica, Branhamella catarrhalis, Helicobacter pylori, Campylobacter fetus, Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Borrelia burgdorferi, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Legionella pneumophila, Listeria monocytogenes, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Kingella, Moraxella, Gardnerella vaginalis, Bacteroides fragilis, Bacteroides distasonis, бактероиды гомологической группы 3452A, Bacteroides vulgatus, Bacteroides ovalus, Bacteroides thetaiotaomicron, Bacteroides uniformis, Bacteroides eggerthii, Bacteroides splanchnicus, Clostridium difficile, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium leprae, Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium ulcerans, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pyogenes, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus intermedius, Staphylococcus hyicus subsp.hyicus, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus hominis или Staphylococcus saccharolyticus.

В некоторых аспектах настоящие химерные агенты применяют для лечения одного или более аутоиммунных заболеваний или расстройств. В ряде вариантов осуществления лечение аутоиммунного заболевания или расстройства может включать модуляцию иммунной системы с помощью настоящих химерных белков, чтобы способствовать иммунному ингибированию по сравнению с иммунной стимуляцией. Примеры аутоиммунных заболеваний или расстройств, подлежащих лечению настоящими химерными белками, включают те, при которых собственные антигены организма становятся мишенями для иммунного ответа, такие как, например, ревматоидный артрит, системная красная волчанка, сахарный диабет, анкилозирующий спондилит, синдром Шегрена, воспалительные заболевания кишечника (например, язвенный колит, болезнь Крона), рассеянный склероз, саркоидоз, псориаз, болезнь Грейвса, тиреоидит Хашимото, псориаз, реакции гиперчувствительности (например, аллергии, сенная лихорадка, астма и острый отек вызывают реакции гиперчувствительности I типа) и васкулит.

В еще одном аспекте настоящее изобретение направлено на способы лечения и предупреждения опосредованных Т-клетками заболеваний и расстройств, таких как, не ограничиваясь перечисленным, заболевания или расстройства, описанные в других частях настоящего документа, и воспалительное заболевание или расстройство, болезнь трансплантат против хозяина (GVHD), отторжение трансплантата и нарушение пролиферации Т-клеток.

В некоторых аспектах настоящие химерные агенты применяют в способах активации Т-клетки, например, с помощью внеклеточного домена, имеющего иммуностимулирующий сигнал.

В некоторых аспектах настоящие химерные агенты применяют в способах предупреждения передачи клетками иммуносупрессивного сигнала.

Комбинированная терапия и конъюгация

В ряде вариантов осуществления изобретение относится к химерным белкам и способам, дополнительно включающим введение субъекту дополнительного агента. В ряде вариантов осуществления изобретение относится к совместному введению и/или включению в состав комбинированного препарата. Любая из композиций, описанных в настоящем документе, может быть включена в состав комбинированного препарата и/или совместно введена.

В ряде вариантов осуществления любой химерный белок, описанный в настоящем документе, действует синергетически при совместном введении с другим агентом, и вводится в дозах, более низких, чем дозы, обычно используемые при использовании таких агентов в качестве монотерапии. В ряде вариантов осуществления любой агент, упомянутый в настоящем документе, может применяться в комбинации с любым из химерных белков, описанных в настоящем документе.

В ряде вариантов осуществления, включая, не ограничиваясь перечисленным, применения при раке, настоящее изобретение относится к химиотерапевтическим агентам в качестве дополнительных агентов. Примеры химиотерапевтических агентов включают, не ограничиваясь перечисленным, алкилирующие агенты, такие как тиотепа и циклофосфамид цитоксан; алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбоквон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метиламеламины, включая алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилолмеламин; ацетогенины (например, буллатацин и буллатацинон); камптотецин (включая синтетический аналог топотекан); бриостатин; кэлли статин; СС-1065 (включая его синтетические аналоги адозелезин, карзелезин и бизелезин); криптофицины (например, криптофицин-1 и криптофицин-8); доластатин; дуокармицин (включая синтетические аналоги, KW-2189 и СВ 1-ТМ1); элеутеробин; панкратистатин; саркодиктиин; спонгистатин; азотистые иприты, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, хлорфосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, гидрохлорид оксида мехлорэтамина, мелфалан, новэмбихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урамустин; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин и ранимустин; антибиотики, такие как ендииновые антибиотики (например, калихеамицин, в особенности калихеамицин гамма II и калихеамицин омега II (см, например, Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); динемицин, включая динемицин А; бифосфонаты, такие как клодронат; эсперамицин; а также хромофор неокарциностатин и родственные хромопротеин ендииновые антибиотики-хромофоры), аклациномизины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, карабицин, каминомицин, карзинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, доксорубицин адриамицин (включая морфолинодоксорубицин, цианоморфолинодоксорубицин, 2-пирролинодоксорубицин и деоксидоксорубицин), эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, такие как митомицин С, микофеноловую кислоту ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пурина, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; аналоги пиримидина, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидеоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин; андрогены, такие как калустерон, дростанолон, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; средства, угнетающие функции надпочечников, такие как аминоглутетимид, митотан, трилостан; пополнитель фолиевой кислоты, такой как фролиновая кислота; ацеглатон; алдофосфамида гликозид; аминолевулиновую кислоту; энилурацил; амсакрин; бестрабуцил; бисантрен; эдатраксат; демеколцин; диазиквон; элформитин; эллиптиния ацетат; эпотилон; этоглуцид; нитрат галлия; гидроксимочевину; лентинан; лонидаинин; майтанзиноиды, такие как майтанзин и ансамитоцины; митогуазон; митоксантрон; мопиданмол; нитраэрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; лозоксантрон; подофиллиновую кислоту; 2-этилгидразид; прокарбазин; полисахаридный комплекс ПСК (JHS Natural Products, Юджин, Орегон); разоксан; ризоксин; сизофуран; спирогерманий; тенуазоновую кислоту; триазиквон; 2,2',2''-трихлортриэтиламин; трихотецены (например, токсин Т-2, верракурин А, роридин А и ангуидин); уретан; виндезин; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид ("Ara-С"); циклофосфамид; тиотепу; таксоиды, например, паклитаксел таксол (Bristol-Myers Squibb Oncology, Принстон, Нью-Джерси), абраксан препарат из наночастиц паклитаксела, не содержащий кремофора и сконструированный на основе альбумина (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, 111.), и доцетаксел таксотер (Rhone-Poulenc Rorer, Антони, Франция); хлоранбуцил; гемцитабин гемзар; 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платины, такие как цисплатин, оксалиплатин и карбоплатин; винбластин; платину; этопозид (VP-16); ифосфамид; митоксантрон; винкристин; винорелбин навелбин; новантрон; тенипозид; эдатрексат; дауномицин; аминоптерин; кселода; ибандронат; иринотекан (камптосар, СРТ-11) (включая схему лечения иринотеканом с 5-FU и лейковорином); ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (DMFO); ретиноиды, такие как ретиноевая кислота; капецитабин; комбретастатин; лейковорин (LV); оксалиплатин, включая схему лечения оксалиплатином (FOLFOX); лапатиниб (TYKERB); ингибиторы PKC-α, Raf, H-Ras, EGFR (например, эрлотиниб (тарцева)) и VEGF-A, снижающие пролиферацию клеток, и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любых из перечисленных выше. Кроме того, способы лечения могут дополнительно включать применение радиации. Кроме того, способы лечения могут дополнительно включать применение фотодинамической терапии.

В ряде вариантов осуществления, включая, не ограничиваясь перечисленным, применения при раке, настоящий дополнительный агент представляет собой один или более иммуномодулирующих агентов, выбранных из агента, блокирующего, уменьшающего и/или ингибирующего PD-1 и PD-L1 или PD-L2 и/или связывание PD-1 с PD-L1 или PD-L2 (в качестве неограничивающего примера, один или более из ниволумаба (ONO-4538/BMS-936558, MDX1106, OPDIVO, BRISTOL MYERS SQUIBB), пембролизумаба (кейтруда, Merck), MK-3475 (MERCK), BMS 936559 (BRISTOL MYER SQUIBB), атезолизумаба (тецентрик, GENENTECH), MPDL3280A (ROCHE)), агента, увеличивающего и/или стимулирующего CD137 (4-1ВВ) и/или связывание CD137 (4-1ВВ) с одним или более лигандов 4-1ВВ (в качестве неограничивающего примера, урелумаб (BMS-663513 и антитело анти-4-1ВВ), и агента, блокирующего, уменьшающего и/или ингибирующего активность CTLA-4 и/или связывание CTLA-4 с одним или более из АР2М1, CD80, CD86, SHP-2 и PPP2R5A, и/или связывание ОХ40 с OX40L (в качестве неограничивающего примера, GBR 830 (GLENMARK), MEDI6469 (MEDIMMUNE).

В ряде вариантов осуществления, включая, не ограничиваясь перечисленным, применения при инфекционных заболеваниях, настоящее изобретение относится к противоинфекционным средствам в качестве дополнительных агентов. В ряде вариантов осуществления противоинфекционное средство представляет собой противовирусный агент, включающий, не ограничиваясь перечисленным, абакавир, ацикловир, адефовир, ампренавир, атазанавир, цидофовир, дарунавир, делавирдин, диданозин, докозанол, эфавиренц, эльвитегравир, эмтрицитабин, энфувиртид, этравирин, фамцикловир и фоскарнет. В ряде вариантов осуществления противоинфекционное средство представляет собой антибактериальный агент, включая, не ограничиваясь перечисленным, цефалоспориновые антибиотики (цефалексин, цефуроксим, цефадроксил, цефазолин, цефалотин, цефаклор, цефамандол, цефокситин, цефпрозил и цефтобипрол); фторхинолоновые антибиотики (ципро, левахин, флоксин, текин, авелокс и норфлокс); тетрациклиновые антибиотики (тетрациклин, миноциклин, окситетрациклин и доксициклин); пенициллиновые антибиотики (амоксициллин, ампициллин, пенициллин V, диклоксациллин, карбенициллин, ванкомицин и метициллин); монобактамовые антибиотики (азтреонам); и карбапенемные антибиотики (эртапенем, дорипенем, имипенем/циластатин и меропенем). В ряде вариантов осуществления противоинфекционные средства включают противомалярийные агенты (например, хлорохин, хинин, мефлохин, примахин, доксициклин, артеметер/люмефантрин, атовахон/прогуанил и сульфадоксин/пириметамин), метронидазол, тинидазол, ивермектин, пирантела памоат и албендазол.

В ряде вариантов осуществления, включая, не ограничиваясь перечисленным, применения при аутоиммунных заболеваниях, дополнительный агент представляет собой иммуносупрессант. В ряде вариантов осуществления иммуносупрессант представляет собой противовоспалительный агент, такой как стероидный противовоспалительный агент или нестероидный противовоспалительный агент (НПВС). Стероиды, в особенности, кортикостероиды надпочечников и их синтетические аналоги, хорошо известны в данной области техники. Примеры кортикостероидов, подходящих для применения в настоящем изобретении, включают, не ограничиваясь перечисленным, гидроксилтриамцинолон, альфа-метилдексаметазон, бета-метилбетаметазон, беклометазона дипропионат, бетаметазона бензоат, бетаметазона дипропионат, бетаметазона валерат, клобетазола валерат, дезонид, дезоксиметазон, дексаметазон, дифлоразона диацетат, дифлукортолона валерат, флуадренолон, флухлоролон ацетонид, флуметазона пивалат, флуоцинолона ацетонид, флуоцинониды, бутиловый эфир флукортина, флуокортолон, флупреднидена (флупреднилидена) ацетат, флурандренолон, галцинонид, гидрокортизона ацетат, гидрокортизона бутират, метилпреднизолон, триамцинолона ацетонид, кортизон, кортодоксон, флуцетонид, флудрокортизон, дифлуорозона диацетат, флурадренолона ацетонид, медризон, амцинафел, амцинафид, бетаметазон и его сложные эфиры, составляющие остаток в смеси, хлорпреднизон, клокортелон, клесцинолон, дихлоризон, дифлупреднат, флуклоронид, флунизолид, фторметалон, флуперолон, флупреднизолон, гидрокортизон, мепреднизон, параметазон, преднизолон, преднизон, беклометазона дипропионат. (НПВС), которые могут применяться в настоящем изобретении, включают, не ограничиваясь перечисленным, салициловую кислоту, ацетилсалициловую кислоту, метилсалицилат, салицилат гликоля, салицилмиды, бензил-2,5-диацетоксибензойную кислоту, ибупрофен, фулиндак, напроксен, кетопрофен, этофенамат, фенилбутазон и индометацин. В ряде вариантов осуществления иммуносупрессант может представлять собой цитостатики, такие как алкилирующие агенты, антиметаболиты (например, азатиоприн, метотрексат), цитотоксические антибиотики, антитела (например, базиликсимаб, даклизумаб и муромонаб), антииммунофилины (например, циклоспорин, такролимус, сиролимус), интерфероны, опиоиды, TNF-связывающие белки, микофенолаты и малые биологические агенты (например, финголимод, мириоцин).

В ряде вариантов осуществления химерные белки (и/или дополнительные агенты), описанные в настоящем документе, включают производные, которые являются модифицированными, т.е. путем ковалентного присоединения любого типа молекулы в композиции таким образом, что ковалентное присоединение не препятствует проявлению активности композиции. В качестве примера, но не в качестве ограничения, производные включают композиции, которые были модифицированы, среди прочего, путем гликозилирования, липидизации, ацетилирования, пэгилирования, фосфорилирования, амидирования, дериватизации известными защитными/блокирующими группами, протеолитического расщепления, связывания с клеточным лигандом или другим белком, и т.д. Любая из множества химических модификаций может быть осуществлена известными методами, включая, не ограничиваясь перечисленным, специфическое химическое расщепление, ацетилирование, формилирование, метаболический синтез туникамицина и т.д. Кроме того, производное может содержать одну или более неклассических аминокислот. В других вариантах осуществления химерные белки (и/или дополнительные агенты), описанные в настоящем документе, дополнительно содержат цитотоксическое средство, включающее, в иллюстративных вариантах осуществления, токсин, химиотерапевтическое средство, радиоактивный изотоп и агент, вызывающий апоптоз или гибель клеток. Такие средства могут быть конъюгированы с композицией, описанной в настоящем документе.

Химерные белки (и/или дополнительные агенты), описанные в настоящем документе, могут, таким образом, быть подвергнуты посттрансляционной модификации для добавления эффекторных фрагментов, таких как химические линкеры, детектируемые фрагменты, такие как, например, флуоресцентные красители, ферменты, субстраты, биолюминесцентные материалы, радиоактивные материалы и хемилюминесцентные фрагменты, или функциональных фрагментов, таких как, например, стрептавидин, авидин, биотин, цитотоксин, цитотоксический агент и радиоактивные материалы.

Составы

Химерные белки (и/или дополнительные агенты), описанные в настоящем документе, могут обладать достаточно основной функциональной группой, способной вступать в реакцию с неорганической или органической кислотой, или карбоксильной группой, способной вступать в реакцию с неорганическим или органическим основанием, с образованием фармацевтически приемлемой соли. Фармацевтически приемлемая кислотно-аддитивная соль образуется из фармацевтически приемлемой кислоты, как хорошо известно в данной области техники. Такие соли включают фармацевтически приемлемые соли перечисленные, например, в источниках Journal of Pharmaceutical Science, 66, 2-19 (1977) и The Handbook of Pharmaceutical Salts; Properties, Selection, and Use. P.H. Stahl, и С.G. Wermuth (eds.), Verlag, Zurich (Switzerland) 2002, полностью включенных в настоящий документ посредством ссылки.

В ряде вариантов осуществления композиции, описанные в настоящем документе, находятся в форме фармацевтически приемлемой соли.

Кроме того, любой химерный белок (и/или дополнительные агенты), описанный в настоящем документе, может быть введен субъекту в качестве компонента композиции, содержащей фармацевтически приемлемый наполнитель или носитель. Такие композиции могут необязательно содержать подходящее количество фармацевтически приемлемого эксципиента, чтобы обеспечить форму для надлежащего введения. Фармацевтические экципиенты могут представлять собой жидкости, такие как вода и масла, включая масла нефтяного, животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и тому подобное. Фармацевтические наполнители могут представлять собой, например, физиологический раствор, аравийскую камедь, желатин, крахмальную пасту, тальк, кератин, коллоидный диоксид кремния, мочевину и тому подобное. Кроме того, могут быть использованы вспомогательные, стабилизирующие, загущающие, смазывающие агенты и красители. В одном из вариантов осуществления фармацевтически приемлемые эксципиенты являются стерильными при введении субъекту. Вода является подходящим эксципиентом при внутривенном введении любого агента, описанного в настоящем документе. Солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина также могут применяться в качестве жидких эксципиентов, в частности, для инъекционных растворов. Подходящие фармацевтические эксципиенты также включают крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, моностеарат глицерина, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропилен, гликоль, воду, этанол и тому подобное. Любой агент, описанный в настоящем документе, при необходимости может также содержать незначительные количества смачивающих или эмульгирующих агентов или рН-буферных средств.

В ряде вариантов осуществления композиции, описанные в настоящем документе, повторно суспендируют в солевом буфере (включая, не ограничиваясь перечисленным, TBS (трис-буфер), PBS (натрий-фосфатный буфер) и тому подобное).

В ряде вариантов осуществления химерные белки могут быть конъюгированы и/или слиты с другим агентом, чтобы продлить время полужизни или иным образом улучшить фармакодинамические и фармакокинетические свойства. В ряде вариантов осуществления химерные белки могут быть слиты или конъюгированы с одним или более из PEG, XTEN (например, в виде rPEG (высвобождаемый PEG)), полисиаловой кислоты (POLYXEN), альбумина (например, человеческого сывороточного альбумина или HAS), эластиноподобного белка (ELP), PAS, НАР, GLK, СТР, трансферрина и тому подобного. В ряде вариантов осуществления каждый из отдельных химерных белков слит с одним или более агентами, описанными в источнике BioDrugs (2015) 29:215-239, полностью включенном в настоящий документ посредством ссылки.

Введение, дозирование и схемы лечения

Настоящее изобретение включает описанный химерный белок (и/или дополнительные агенты) в различных составах. Любой химерный белок (и/или дополнительные агенты), описанный в настоящем документе, может принимать форму растворов, суспензий, эмульсий, капель, таблеток, пилюль, гранул, капсул, капсул, содержащих жидкости, порошков, составов с замедленным высвобождением, суппозиториев, эмульсий, аэрозолей, спреев, суспензий, или любые другие формы, подходящие для применения. Также могут быть использованы конструкции ДНК или РНК, кодирующие белковые последовательности. В одном из вариантов осуществления композиция представлена в форме капсулы (см., например, патент США №5698155). Другие примеры подходящих фармацевтических эксципиентов описаны в источнике Remington's Pharmaceutical Sciences 1447-1676 (Alfonso R. Gennaro eds., 19th ed. 1995), включенном в настоящий документ посредством ссылки.

При необходимости составы, содержащие химерный белок (и/или дополнительные агенты), также могут включать солюбилизирующий агент. Кроме того, агенты могут быть доставлены с подходящим носителем или устройством для доставки, как известно в данной области техники. Комбинированная терапия, изложенная в данном документе, может быть осуществлена при совместной доставке в одном носителе или устройстве для доставки. Композиции для введения могут необязательно включать местный анестетик, такой как, например, лидокаин, для уменьшения боли в месте инъекции.

Составы, содержащие химерный белок (и/или дополнительные агенты) согласно настоящему изобретению, могут быть удобным образом представлены в единичных дозированных формах и могут быть получены любым из способов, хорошо известных в области фармации. Такие способы, как правило, включают стадию приведения терапевтических агентов в сочетание с носителем, составляющим один или более вспомогательных ингредиентов. Как правило, составы получают путем равномерного и тщательного объединения терапевтического агента с жидким наполнителем, тонкоизмельченным твердым наполнителем или обоими, а затем, при необходимости, формования продукта в лекарственные формы желаемого препарата (например, влажное или сухое гранулирование, порошковые смеси и т.д., с последующим таблетированием с использованием общепринятых способов, известных в данной области техники).

В одном из вариантов осуществления любой химерный белок (и/или дополнительный агент), описанный в настоящем документе, включают в состав препарата в соответствии с общеизвестными процедурами в виде композиции, адаптированной для способа введения, описанного в настоящем документе.

Способы введения включают, например: внутрикожный, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный, подкожный, интраназальный, эпидуральный, пероральный, сублингвальный, интраназальный, интрацеребральный, интравагинальный, трансдермальный, ректальный, путем ингаляции или местный, в частности, в уши, нос, глаза или на кожу. В ряде вариантов осуществления введение осуществляют перорально или путем парентеральной инъекции. В большинстве случаев введение приводит к высвобождению любого агента, описанного в настоящем документе, в кровоток.

Любой химерный белок (и/или дополнительные агенты), описанный в настоящем документе, может быть введен перорально. Такие химерные белки (и/или дополнительные агенты) могут также быть введены любым другим удобным способом, например, путем внутривенной инфузии или болюсной инъекции, путем абсорбции через эпителиальные или кожно-слизистые выстилающие ткани (например, слизистую оболочку полости рта, прямой кишки и слизистую оболочку кишечника, и т.д.) и могут быть введены вместе с другим биологически активным агентом. Введение может быть системным или местным. Известны различные системы для доставки, например, инкапсулирование в липосомы, микрочастицы, микрокапсулы, капсулы и т.п., которые можно применять для введения.

В конкретных вариантах осуществления может быть желательным локальное введение в область, нуждающуюся в лечении. В одном из вариантов осуществления, например, при лечении рака, химерный белок (и/или дополнительные агенты) вводят в микроокружение опухоли (например, клетки, молекулы, внеклеточный матрикс и/или кровеносные сосуды, окружающие и/или питающие опухолевую клетку, включая, например, сосудистую сеть опухоли; инфильтрирующие опухоль лимфоциты; фибробластные ретикулярные клетки; эндотелиальные клетки-предшественники (ЕРС); ассоциированные с раком фибробласты; перициты; другие стромальные клетки; компоненты внеклеточного матрикса (ЕСМ); дендритные клетки; антигенпрезентирующие клетки; Т-клетки; регуляторные Т-клетки; макрофаги; нейтрофилы; и другие иммунные клетки, расположенные в непосредственной близости от опухоли) или лимфатические узлы, и/или они нацелены на микроокружение опухоли или лимфатический узел. В различных вариантах осуществления данного изобретения, например, при лечении рака, химерный белок (и/или дополнительные агенты) вводят интратуморально.

В различных вариантах осуществления настоящий химерный белок проявляет двойной эффект, при котором наблюдается меньше побочных действий по сравнению с традиционной иммунотерапией (например, при лечении одним или более из препаратов опдиво, кейтруда, ервой и тецентрик). Например, описанные химерные белки уменьшают или предупреждают часто наблюдаемые нежелательные явления, связанные с иммунной системой, которые поражают различные ткани и органы, включая кожу, желудочно-кишечный тракт, почки, периферическую и центральную нервную систему, печень, лимфатические узлы, глаза, поджелудочную железу и эндокринную систему; например, гипофизит, колит, гепатит, пневмонит, сыпь и ревматическую болезнь. Кроме того, настоящее местное введение, например, интратуморально, устраняет нежелательные явления, наблюдаемые при стандартном системном введении, например, внутривенных инфузиях, которые применяются при обычной иммунотерапии (например, при лечении одним или более из препаратов опдиво, кейтруда, ервой и тецентрик).

Лекарственные формы, подходящие для парентерального введения (например, внутривенного, внутримышечного, внутрибрюшинного, подкожного и внутрисуставного введения и инфузии) включают, например, растворы, суспензии, дисперсии, эмульсии и тому подобное. Они также могут быть изготовлены в форме стерильных твердых композиций (например, лиофилизированной композиции), которые могут быть растворены или суспендированы в стерильной среде для инъекций непосредственно перед использованием. Они могут содержать, например, суспендирующие или диспергирующие агенты, известные в данной области техники.

Дозировка любого химерного белка (и/или дополнительных агентов), описанного в настоящем документе, а также схема введения может зависеть от различных параметров, включая, не ограничиваясь перечисленным, заболевание, подлежащее лечению, общее состояние здоровья субъекта, а также мнение лечащего врача. Любой химерный белок, описанный в настоящем документе, может быть введен до (например, за 5 минут, 15 минут, 30 минут, 45 минут, 1 час, 2 часа, 4 часа, 6 часов, 12 часов, 24 часа, 48 часов, 72 часа, 96 часов, 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 4 недели, 5 недель, 6 недель, 8 недель или 12 недель до), одновременно или после (например, через 5 минут, 15 минут, 30 минут, 45 минут, 1 час, 2 часа, 4 часа, 6 часов, 12 часов, 24 часа, 48 часов, 72 часа, 96 часов, 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 4 недели, 5 недель, 6 недель, 8 недель или 12 недель после) введения дополнительного агента субъекту, нуждающемуся в этом. В ряде вариантов осуществления любой химерный белок и дополнительный агент, описанные в настоящем документе, вводят с интервалом в 1 минуту, с интервалом в 10 минут, с интервалом в 30 минут, с интервалом менее 1 часа, с интервалом в 1 час, с интервалом от 1 часа до 2 часов, с интервалом от 2 часов до 3 часов, с интервалом от 3 часов до 4 часов, с интервалом от 4 часов до 5 часов, с интервалом от 5 часов до 6 часов, с интервалом от 6 часов до 7 часов, с интервалом от 7 часов до 8 часов, с интервалом от 8 часов до 9 часов, с интервалом от 9 часов до 10 часов, с интервалом от 10 часов до 11 часов, с интервалом от 11 часов до 12 часов, с интервалом в 1 день, с интервалом в 2 дня, с интервалом в 3 дня, с интервалом в 4 дня, с интервалом в 5 дней, с интервалом в 6 дней, с интервалом в 1 неделю, с интервалом в 2 недели, с интервалом в 3 недели или с интервалом в 4 недели.

В ряде вариантов осуществления настоящее изобретение относится к совместному введению химерного белка, индуцирующего врожденный иммунный ответ, и другого химерного белка, индуцирующего адаптивный иммунный ответ. В таких вариантах осуществления химерный белок, индуцирующий врожденный иммунный ответ, может быть введен до, одновременно или после введения химерного белка, индуцирующего адаптивный иммунный ответ. Например, химерные белки могут быть введены с интервалом в 1 минуту, с интервалом в 10 минут, с интервалом в 30 минут, с интервалом менее 1 часа, с интервалом в 1 час, с интервалом от 1 часа до 2 часов, с интервалом от 2 часов до 3 часов, с интервалом от 3 часов до 4 часов, с интервалом от 4 часов до 5 часов, с интервалом от 5 часов до 6 часов, с интервалом от 6 часов до 7 часов, с интервалом от 7 часов до 8 часов, с интервалом от 8 часов до 9 часов, с интервалом от 9 часов до 10 часов, с интервалом от 10 часов до 11 часов, с интервалом от 11 часов до 12 часов, с интервалом в 1 день, с интервалом в 2 дня, с интервалом в 3 дня, с интервалом в 4 дня, с интервалом в 5 дней, с интервалом в 6 дней, с интервалом в 1 неделю, с интервалом в 2 недели, с интервалом в 3 недели или с интервалом в 4 недели. В иллюстративном варианте осуществления химерный белок, индуцирующий врожденный иммунный ответ, и химерный белок, индуцирующий адаптивный ответ, вводят с интервалом в одну неделю или вводят попеременно раз в неделю (т.е. введение химерного белка, индуцирующего врожденный иммунный ответ, проводят через 1 неделю после введения химерного белка, индуцирующего адаптивный иммунный ответ, и т.д.).

Дозы любого химерного белка (и/или дополнительных агентов), описанного в настоящем документе, могут зависеть от различных факторов, включая тяжесть состояния, того, подлежит ли состояние лечению или предупреждению, а также возраста, массы тела и состояния здоровья пациента, подлежащего лечению. Кроме того, на используемую дозировку может влиять фармакогеномная (влияние генотипа на фармакокинетический, фармакодинамический профиль или профиль эффективности лекарственного средства) информация о конкретном субъекте. Кроме того, точные индивидуальные дозы могут быть скорректированы в некоторой степени в зависимости от целого ряда факторов, включая конкретную комбинацию вводимых агентов, время введения, способ введения, характеристики состава, скорость экскреции, конкретное заболевание, подлежащее лечению, тяжесть расстройства и анатомическую локализацию расстройства. Могут быть закономерны некоторые изменения дозировки.

При введении любого химерного белка (и/или дополнительных агентов), описанного в настоящем документе, путем парентеральной инъекции, дозировка обычно составляет от приблизительно 0,1 мг до приблизительно 250 мг в сутки, от приблизительно 1 мг до приблизительно 20 мг в сутки или от приблизительно 3 мг до приблизительно 5 мг в сутки. Обычно при пероральном или парентеральном введении дозировка любого агента, описанного в настоящем документе, может составлять от приблизительно 0,1 мг до приблизительно 1500 мг в сутки, или от приблизительно 0,5 мг до приблизительно 10 мг в сутки, или от приблизительно 0,5 мг до приблизительно 5 мг в сутки, или от приблизительно 200 до приблизительно 1200 мг в сутки (например, приблизительно 200 мг, приблизительно 300 мг, приблизительно 400 мг, приблизительно 500 мг, приблизительно 600 мг, приблизительно 700 мг, приблизительно 800 мг, приблизительно 900 мг, приблизительно 1000 мг, приблизительно 1100 мг, приблизительно 1200 мг в сутки).

В ряде вариантов осуществления введение химерного белка (и/или дополнительных агентов), описанного в настоящем документе, осуществляют с помощью парентеральной инъекции в дозировке от приблизительно 0,1 мг до приблизительно 1500 мг на курс лечения, или от приблизительно 0,5 мг до приблизительно 10 мг на курс лечения, или от приблизительно 0,5 мг до приблизительно 5 мг на курс лечения, или от приблизительно 200 до приблизительно 1200 мг на курс лечения (например, приблизительно 200 мг, приблизительно 300 мг, приблизительно 400 мг, приблизительно 500 мг, приблизительно 600 мг, приблизительно 700 мг, приблизительно 800 мг, приблизительно 900 мг, приблизительно 1000 мг, приблизительно 1100 мг, приблизительно 1200 мг на курс лечения).

В ряде вариантов осуществления подходящая дозировка химерного белка (и/или дополнительных агентов) составляет от приблизительно 0,01 мг/кг до приблизительно 100 мг/кг массы тела, или от приблизительно 0,01 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг массы тела субъекта, например, приблизительно 0,01 мг/кг, приблизительно 0,02 мг/кг, приблизительно 0,03 мг/кг, приблизительно 0,04 мг/кг, приблизительно 0,05 мг/кг, приблизительно 0,06 мг/кг, приблизительно 0,07 мг/кг, приблизительно 0,08 мг/кг, приблизительно 0,09 мг/кг, приблизительно 0,1 мг/кг, приблизительно 0,2 мг/кг, приблизительно 0,3 мг/кг, приблизительно 0,4 мг/кг, приблизительно 0,5 мг/кг, приблизительно 0,6 мг/кг, приблизительно 0,7 мг/кг, приблизительно 0,8 мг/кг, приблизительно 0,9 мг/кг, приблизительно 1 мг/кг, приблизительно 1,1 мг/кг, приблизительно 1,2 мг/кг, приблизительно 1,3 мг/кг, приблизительно 1,4 мг/кг, приблизительно 1,5 мг/кг, приблизительно 1,6 мг/кг, приблизительно 1,7 мг/кг, приблизительно 1,8 мг/кг, 1,9 мг/кг, приблизительно 2 мг/кг, приблизительно 3 мг/кг, приблизительно 4 мг/кг, приблизительно 5 мг/кг, приблизительно 6 мг/кг, приблизительно 7 мг/кг, приблизительно 8 мг/кг, приблизительно 9 мг/кг, приблизительно 10 мг/кг массы тела, включая все промежуточные значения и диапазоны между указанными.

В еще одном варианте осуществления доставка может осуществляться в везикуле, в частности, в липосоме (см. источник Langer, 1990, Science 249:1527-1533; Treat et al., in Liposomes in therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989).

Любой химерный белок (и/или дополнительные агенты), описанный в настоящем документе, может быть введен путем средств с контролируемым высвобождением или замедленным высвобождением, или с помощью устройств для доставки, хорошо известных специалистам в данной области техники. Примеры включают, не ограничиваясь перечисленным, описанные в патентах США №№3845770, 3916899, 3536809, 3598123, 4008719, 5674533, 5059595, 5591767, 5120548, 5073543, 5639476, 5354556 и 5733556, каждый из которых полностью включен в настоящий документ посредством ссылки. Такие лекарственные формы могут являться подходящими для обеспечения контролируемого или замедленного высвобождения одного или более активных ингредиентов с помощью, например, гидропропилметилцеллюлозы, других полимерных матриц, гелей, проницаемых мембран, осмотических систем, многослойных покрытий, микрочастиц, липосом, микросфер или их комбинации для обеспечения желаемого профиля высвобождения в различных пропорциях. Контролируемое или замедленное высвобождение активного ингредиента можно стимулировать различными условиями, включая, не ограничиваясь перечисленным, изменения рН, изменения температуры, стимуляцию с помощью света подходящей длины волны, концентрацию или доступность ферментов, концентрацию или доступность воды, или другие физиологические условия или соединения.

В еще одном варианте осуществления могут использоваться полимерные материалы (см. источники Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, 1983, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; см. также Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105).

В еще одном варианте осуществления система с контролируемым высвобождением может быть размещена в непосредственной близости от целевой области, подлежащей лечению, при этом требуется только часть системной дозы (см., например, источник Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, т. 2, стр. 115-138 (1984)). Могут быть использованы другие системы с контролируемым высвобождением, обсуждаемые в обзоре Langer, 1990, Science 249:1527-1533.

Введение любого химерного белка (и/или дополнительных агентов), описанных в настоящем документе, может независимым образом быть осуществлено от одного до четырех раз в сутки, или от одного до четырех раз в месяц, или от одного до шести раз в год, или один раз каждые два, три, четыре или пять лет. Введение может быть осуществлено на протяжении одного дня или одного месяца, двух месяцев, трех месяцев, шести месяцев, одного года, двух лет, трех лет, и может осуществляться даже на протяжении всей жизни субъекта.

Режим дозирования с использованием любого химерного белка (и/или дополнительных агентов), описанного в настоящем документе, может быть выбран в соответствии с различными факторами, включая тип, вид, возраст, массу тела, пол и медицинское состояние субъекта; тяжесть состояния, подлежащего лечению; способ введения; почечную или печеночную функцию субъекта; фармакогеномный характер индивидуума; и конкретное применяемое соединение согласно изобретению. Любой химерный белок (и/или дополнительные агенты), описанный в настоящем документе, может быть введен в виде разовой суточной дозы, или общая суточная доза может быть введена в виде дробных доз два, три или четыре раза в сутки. Кроме того, любой химерный белок (и/или дополнительные агенты), описанный в настоящем документе, может быть введен непрерывно, а не периодически, на протяжении всего режима введения.

Клетки и нуклеиновые кислоты

В ряде вариантов осуществления настоящее изобретение относится к вектору экспрессии, содержащему нуклеиновую кислоту, кодирующую химерный белок, описанный в настоящем документе. В ряде вариантов осуществления вектор экспрессии содержит ДНК или РНК. В ряде вариантов осуществления вектор экспрессии представляет собой вектор экспрессии млекопитающего.

Для экспрессии химерного белка могут быть использованы как прокариотические, так и эукариотические векторы. Прокариотические векторы включают конструкции, основанные на последовательностях E. coli (см., например, источник Makrides, Microbiol Rev 1996, 60:512-538). Неограничивающие примеры регуляторных областей, которые могут применяться для экспрессии в E. coli, включают lac, trp, lpp, phoA, recA, tac, Т3, T7 и λP_L. Неограничивающие примеры прокариотических векторов экспрессии могут включать серию векторов λgt, таких как λgt11 (Huynh et al., в источнике «DNA Cloning Techniques, Vol. I: A Practical Approach," 1984, (D. Glover, ed.), стр. 49-78, IRL Press, Oxford), и серию векторов pET (Studier et al., Methods Enzymol 1990, 185:60-89). Однако прокариотические системы хозяин-вектор не могут выполнять большую часть посттрансляционного процессинга клеток млекопитающих. Таким образом, эукариотические системы вектор-хозяин могут быть особенно подходящими. Для экспрессии химерных белков в клетках-хозяевах млекопитающих могут применяться различные регуляторные области. Например, могут применяться ранние и поздние промоторы SV40, предранний промотор цитомегаловируса (CMV) и промотор длинного концевого повтора вируса саркомы Рауса (RSV-LTR). Индуцибельные промоторы, которые могут являться подходящими для применения в клетках млекопитающих, включают, не ограничиваясь перечисленным, промоторы, связанные с геном металлотионеина II, длинные концевые повторы вируса молочной железы мышей, чувствительные к глюкокортикоидам (MMTV-LTR), ген β-интерферона и ген hsp70 (см. источники Williams et al., Cancer Res 1989, 49: 2735-42 и Taylor et al., Mol Cell Biol 1990, 10: 165-75). Промоторы теплового шока или стресс-промоторы также могут быть подходящими для управления экспрессией химерных белков в рекомбинантных клетках-хозяевах.

В ряде вариантов осуществления векторы экспрессии согласно изобретению содержат нуклеиновую кислоту кодирующую химерные белки (и/или дополнительные агенты) или их комплемент, функционально связанные с областью контроля экспрессии или ее комплементом, которая является функциональной в клетке млекопитающего. Область контроля экспрессии способна управлять экспрессией функционально связанного блокирующего и/или стимулирующего агента, кодирующего нуклеиновую кислоту, так что блокирующий и/или стимулирующий агент продуцируется в клетке человека, трансформированной вектором экспрессии.

Области контроля экспрессии представляют собой регуляторные полинуклеотиды (иногда называемые в настоящем документе элементами), такие как промоторы и энхансеры, которые влияют на экспрессию функционально связанной нуклеиновой кислоты. Область контроля экспрессии вектора экспрессии согласно изобретению способна экспрессировать функционально связанную кодирующую нуклеиновую кислоту в человеческой клетке. В одном варианте осуществления клетка представляет собой опухолевую клетку. В еще одном варианте осуществления клетка представляет собой неопухолевую клетку. В одном варианте осуществления область контроля экспрессии обеспечивает регулируемую экспрессию функционально связанной нуклеиновой кислоты. Сигнал (иногда называемый стимулом) может увеличивать или уменьшать экспрессию нуклеиновой кислоты, функционально связанной с такой областью контроля экспрессии. Такие области контроля экспрессии, которые увеличивают экспрессию в ответ на сигнал, часто называют индуцибельными. Такие области контроля экспрессии, которые уменьшают экспрессию в ответ на сигнал, часто называют репрессируемыми. Как правило, величина увеличения или уменьшения, обеспечиваемая такими элементами, пропорциональна величине присутствующего сигнала; чем больше уровень сигнала, тем больше увеличение или уменьшение экспрессии.

В варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает применение индуцибельных промоторов, способных временно вызывать высокий уровень экспрессии в ответ на сигнал. Например, будучи в непосредственной близости от опухолевой клетки, клетку, трансформированную вектором экспрессии химерного белка (и/или дополнительных агентов), содержащего такую последовательность контроля экспрессии, можно побудить к временной продукции высокого уровня агента, подвергая трансформированную клетку воздействию соответствующего сигнала. Примеры индуцибельных областей контроля экспрессии включают области, содержащие индуцибельный промотор, стимулируемый сигналом, таким как низкомолекулярное химическое соединение. Конкретные примеры можно найти, например, в патентах США №№5989910, 5935934, 6015709 и 6004941, каждый из которых полностью включен в настоящий документ посредством ссылки.

Области контроля экспрессии и области контроля локуса включают полноразмерные промоторные последовательности, такие как нативные промоторные и энхансерные элементы, а также подпоследовательности или варианты полинуклеотидов, которые сохраняют всю или часть полноразмерной или невариантной функции. В контексте настоящего документа термин «функциональный» и его грамматические варианты при использовании в отношении последовательности, подпоследовательности или фрагмента нуклеиновой кислоты означает, что последовательность имеет одну или более функций наивной последовательности нуклеиновой кислоты (например, не вариантной или немодифицированной последовательности).

В контексте настоящего документа термин «функциональная связь» относится к физическому смежному расположению описываемых компонентов таким образом, чтобы позволить им функционировать по назначению. В примере элемента контроля экспрессии в функциональной связи с нуклеиновой кислотой связь является такой, что элемент управления модулирует экспрессию нуклеиновой кислоты. Как правило, область контроля экспрессии, модулирующая транскрипцию, располагается рядом с 5'-концом транскрибируемой нуклеиновой кислоты (т.е. выше против хода транскрипции). Области контроля экспрессии также могут быть расположены на 3'-конце транскрибируемой последовательности (т.е. ниже по ходу транскрипции) или внутри транскрипта (например, в интроне). Элементы контроля экспрессии могут быть расположены на расстоянии от транскрибируемой последовательности (например, от 100 до 500, от 500 до 1000, от 2000 до 5000 или более нуклеотидов от нуклеиновой кислоты). Конкретным примером элемента контроля экспрессии является промотор, который обычно расположен на 5'-конце транскрибируемой последовательности. Еще одним примером элемента контроля экспрессии является энхансер, который может быть расположен на 5'- или 3'-конце транскрибируемой последовательности или внутри транскрибированной последовательности.

Системы экспрессии, функционирующие в человеческих клетках, хорошо известны в данной области техники и включают вирусные системы. Обычно промотор, функционирующий в человеческой клете, представляет собой любую последовательность ДНК, способную связывать РНК-полимеразу млекопитающих и инициировать нисходящую (в 3' направлении) транскрипцию кодирующей последовательности в иРНК. Промотор будет иметь область инициации транскрипции, которая обычно располагается проксимально к 5'-концу кодирующей последовательности, и, как правило, ТАТА-бокс расположен на 25-30 пар оснований выше сайта инициации транскрипции. Предполагается, что ТАТА-бокс направляет РНК-полимеразу II на начало синтеза РНК в нужном сайте. Промотор также обычно содержит вышерасположенный промоторный элемент (энхансерный элемент), обычно расположенный на 100-200 пар оснований выше ТАТА-бокса. Вышерасположенный промоторный элемент определяет скорость, с которой инициируется транскрипция, и может действовать в любой ориентации. Особенно подходящими в качестве промотороы являются промоторы из вирусных генов млекопитающих, поскольку вирусные гены часто характеризуются высокой экспрессией и имеют широкий спектр хозяев. Примеры включают ранний промотор SV40, промотор LTR вируса опухоли молочной железы мышей, основной поздний промотор аденовируса, промотор вируса простого герпеса и промотор CMV.

Как правило, последовательности терминации транскрипции и полиаденилирования, распознаваемые клетками млекопитающих, представляют собой регуляторные области, являющиеся 3'-концевыми относительно стоп-кодона трансляции и, таким образом, вместе с промоторными элементами фланкируют кодирующую последовательность. 3'-конец зрелой иРНК образуется путем сайт-специфического посттрансляционного расщепления и полиаденилирования. Примеры сигналов терминатора транскрипции и полиаденилирования включают сигналы, полученные из SV40. В конструкции экспрессии могут также быть включены интроны.

Существует множество методов введения нуклеиновых кислот в жизнеспособные клетки. Методы, подходящие для переноса нуклеиновой кислоты в клетки млекопитающих in vitro, включают применение липосом, электропорацию, микроинъекцию, слияние клеток, системы на основе полимеров, ДЭАЭ (диэтиламиноэтил)-декстран, вирусную трансдукцию, способ осаждения фосфатом кальция и т.д. Для переноса генов in vivo также можно использовать ряд методов и реагентов, включая липосомы; средства для доставки на основе природных полимеров, такие как хитозан и желатин; вирусные векторы также подходят для трансдукции in vivo. В некоторых ситуациях желательно обеспечить нацеливающий агент, такой как антитело или лиганд, специфичный для мембранного белка на поверхности опухолевой клетки. При использовании липосом белки, которые связываются с мембранным белком клеточной поверхности, связанным с эндоцитозом, могут применяться для нацеливания и/или облегчения поглощения, например, капсидные белки или их фрагменты, тропные для конкретного типа клеток, антитела к белкам, которые подвергаются интернализации в Велоспорт, белки, нацеленные на внутриклеточную локализацию и увеличивают внутриклеточное время полужизни. Техника рецептор-опосредованного эндоцитоза, описана, например, в источнике Wu et al., J. Biol. Chem. 262, 4429-4432 (1987); и Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990).

При необходимости также можно использовать агенты для доставки генов, такие как, например, интеграционные последовательности. В данной области техники известно множество интеграционных последовательностей (см., например, источники Nunes-Duby et al., Nucleic Acids Res. 26:391-406, 1998; Sadwoski, J. Bacteriol., 165:341-357, 1986; Bestor, Cell, 122(3):322-325, 2005; Plasterk et al., TIG 15:326-332, 1999; Kootstra et al., Ann. Rev. Pharm. Toxicol., 43: 413-439, 2003). Они включают рекомбиназы и транспозазы. Примеры включают Cre (Sternberg and Hamilton, J. Mol. Biol., 150:467-486, 1981), лямбда (Nash, Nature, 247, 543-545, 1974), FIp (Broach, et al., Cell, 29:227-234, 1982), R (Matsuzaki, et al., J. Bacteriology, 172:610-618, 1990), cpC31 (см., например, Groth et al., J. Mol. Biol. 335:667-678, 2004), "спящую красавицу", транспозазы семейства mariner (Plasterk et al., цитируемый выше) и компоненты для интеграции вирусов, такие как AAV, ретеровирусы и антивирусы, имеющие компоненты, обеспечивающие интеграцию вируса, такого как последовательности LTR ретровирусов или лентивируса и последовательности ITR AAV (Kootstra et al., Ann. Rev. Pharm. Toxicol., 43:413-439, 2003). Кроме того, для вставки последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих химерные слитые белки, могут применяться стратегии прямой и нацеленной генетической интеграции, включая технологии редактирования генов CRISPR/CAS9, цинкового пальца, TALEN и мегануклеазы.

В одном из аспектов изобретение относится к векторам экспрессии для экспрессии химерных белков (и/или дополнительных агентов), представляющим собой вирусные векторы. Известно много вирусных векторов, подходящих для генной терапии (см., например, источник Lundstrom, Trends Biotechnol., 21: 1 17, 122, 2003). Примеры вирусных векторов включают векторы, выбранные из антивирусов (LV), ретровирусов (RV), аденовирусов (AV), аденоассоциированных вирусов (AAV) и α-вирусов, хотя могут применяться и другие вирусные векторы. Для применения in vivo подходят вирусные векторы, которые не интегрируются в геном хозяина, такие как α-вирусы и аденовирусы. Примеры типов α-вирусов включают вирус Синдбис, вирус венесуэльского энцефалита лошадей (VEE) и вирус леса Семлики (SFV). Для применения in vitro подходят вирусные векторы, которые интегрируются в геном хозяина, такие как ретровирусы, AAV и антивирусы. В одном из вариантов осуществления изобретение относится к способам трансдукции человеческой клетки in vivo, включающим приведение солидной опухоли в контакт с вирусным вектором согласно изобретению in vivo.

В ряде вариантов осуществления настоящее изобретение относится к клетке-хозяину содержащей вектор экспрессии, содержащий химерный белок, описанный в настоящем документе.

Векторы экспрессии могут быть введены в клетки-хозяева для продукции настоящих химерных белков. Клетки могут, например, быть культивированы in vitro или генетически сконструированы. Подходящие клетки-хозяева млекопитающих включают, не ограничиваясь перечисленным, клетки, полученные от людей, обезьян и грызунов (см., например, Kriegler в «Transfer and Expression Gene: A Laboratory Manual», 1990, New York, Freeman & Co.). Они включают линии клеток почек обезьян, трансформированные SV40 (например, COS-7, АТСС CRL 1651); эмбриональные линии почек человека (например, клетки 293, 293-EBNA или 293, субклонированные для роста в суспензионной культуре, Graham et al., J Gen Virol 1977, 36:59); клетки почек детенышей хомяка (например, ВНК, АТСС CCL 10); клетки яичника китайского хомяка-DHFR (дигидрофолатредуктаза) (например, СНО, Urlaub and Chasin, Proc Natl Acad Sci USA 1980, 77:4216); клетки CHO DG44, клетки CHO-K1, мышиные клетки сертоли (Mather, Biol Reprod 1980, 23: 243-251); мышиные фибробласты (например, NIH-3T3), клетки почек обезьяны (например, CV1 АТСС CCL 70); клетки почек африканской зеленой мартышки (например, VERO-76, АТСС CRL-1587); клетки карциномы шейки матки человека (например, HELA, АТСС CCL 2); клетки почек собак (например, MDCK, АТСС CCL 34); клетки печени крысы линии Buffalo (например, BRL ЗА, АТСС CRL 1442); клетки легких человека (например, W138, АТСС CCL 75); клетки печени человека (например, Hep G2, НВ 8065); и клетки опухоли молочной железы мыши (например, ММТ 060562, АТСС CCL51). Примеры типов раковых клеток для экспрессии химерных белков, описанных в настоящем документе, включают линию мышиных фибробластов, NIH3T3, линию клеток карциномы легкого Льюис мыши, LLC, линию клеток мастоцитомы мыши, Р815, линию клеток лимфомы мыши, EL4 и ее овальбуминовый трансфектант, E.G7, линию клеток меланомы мыши, B16F10, линию клеток фибросаркомы мыши, МС57, и линии клеток мелкоклеточной карциномы легкого человека, SCLC#2 и SCLC#7.

Клетки-хозяева могут быть получены от нормальных или пораженных субъектов, включая здоровых людей, больных раком и пациентов с инфекционным заболеванием, депозиты частных лабораторий, общедоступные коллекции культур, такие как Американская коллекция типовых культур, или от коммерческих поставщиков.

Клетки, которые могут применяться для получения настоящих химерных белков in vitro, ex vivo и/или in vivo, включают, не ограничиваясь перечисленным, эпителиальные клетки, эндотелиальные клетки, кератиноциты, фибробласты, мышечные клетки, гепатоциты; клетки крови, такие как Т-лимфоциты, В-лимфоциты, моноциты, макрофаги, нейтрофилы, эозинофилы, мегакариоциты, гранулоциты; различные стволовые или прогениторные клетки, в частности, гемопоэтические стволовые или прогениторные клетки (например, полученные из костного мозга), пуповинная кровь, периферическая кровь, эмбриональную печень и т.д. Выбор типа клеток зависит от типа опухоли или инфекционного заболевания, подлежащего лечению или предупреждению, и он может быть определен специалистом в данной области техники.

Получение и очистка Fc-содержащих макромолекул (таких как моноклональные антитела) стали стандартным процессом с незначительными модификациями между продуктами. Например, многие Fc-содержащие макромолекулы вырабатываются клетками эмбриональных почек человека (HEK) (или их вариантами) или клетками яичника китайского хомячка (СНО) (или их вариантами), или, в некоторых случаях, бактериальными или синтетическими способами. После получения Fc-содержащие макромолекулы, секретируемые клетками HEK или СНО, очищают путем связывания с колонками, содержащими белок А, а затем «шлифуют» различными способами. В общем случае очищенные Fc-содержащие макромолекулы хранят в жидкой форме в течение некоторого периода времени, замораживают на длительные периоды времени или в некоторых случаях лиофилизируют. В ряде вариантов осуществления полученные химерные белки, рассматриваемые в настоящем документе, могут обладать уникальными характеристиками по сравнению с традиционными Fc-содержащими макромолекулами. В отдельных примерах химерные белки могут быть очищены с использованием специфических смол для хроматографии или с помощью хроматографических методов, не основанных на захвате белком А. В ряде вариантов осуществления химерные белки могут быть очищены в олигомерном состоянии или в нескольких олигомерных состояниях и обогащены в отношении конкретного олигомерного состояния определенными способами. Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, эти способы могут включать обработку определенными буферами, включая определенные концентрации солей, рН и композиции добавок. В других примерах такие способы могут включать способы обработки, благоприятствующие одному олигомерному состоянию по сравнению с другим. Химерные белки, полученные в настоящем документе, могут быть дополнительно «отшлифованы» с использованием способов, известных в данной области техники. В ряде вариантов осуществления химерные белки являются высокостабильными и способны переносить широкий диапазон воздействия рН (диапазон рН от 3 до 12), способны переносить большое количество стрессовых условий замораживания/оттаивания (более 3 циклов замораживания/оттаивания) и способны переносить длительную инкубацию при высоких температурах (более 2 недель при 40 градусах Цельсия). В ряде вариантов осуществления химерные белки способны оставаться интактными при таких стрессовых условиях, не проявляя признаков разложения, дезамидирования и т.д.

Субъекты и/или животные

В ряде вариантов осуществления субъект и/или животное представляет собой млекопитающее, например, человека, мышь, крысу, морскую свинку, собаку, кошку, лошадь, корову, свинью, кролика, овцу или не являющегося человеком примата, такого как обезьяна, шимпанзе или бабуин. В вариантах осуществления субъект и/или животное представляет собой животное, не являющееся млекопитающим, такое как, например, данио-рерио. В ряде вариантов осуществления субъект и/или животное может содержать флуоресцентно-меченые клетки (например, меченые GFP (зеленым флуоресцентным белком)). В ряде вариантов осуществления субъект и/или животное представляет собой трансгенное животное, содержащее флуоресцентную клетку.

В ряде вариантов осуществления субъект и/или животное представляет собой человека. В ряде вариантов осуществления человек представляет собой ребенка. В ряде вариантов осуществления человек представляет собой взрослого человека. В ряде вариантов осуществления человек представляет собой пожилого человека. В ряде вариантов осуществления человек может называться пациентом.

В отдельных вариантах осуществления возраст человека составляет от приблизительно 0 месяцев до приблизительно 6 месяцев, от приблизительно 6 до приблизительно 12 месяцев, от приблизительно 6 до приблизительно 18 месяцев, от приблизительно 18 до приблизительно 36 месяцев, от приблизительно 1 до приблизительно 5 лет, от приблизительно 5 до приблизительно 10 лет, от приблизительно 10 до приблизительно 15 лет, от приблизительно 15 до приблизительно 20 лет, от приблизительно 20 до приблизительно 25 лет, от приблизительно 25 до приблизительно 30 лет, от приблизительно 30 до приблизительно 35 лет, от приблизительно 35 до приблизительно 40 лет, от приблизительно 40 до приблизительно 45 лет, от приблизительно 45 до приблизительно 50 лет, от приблизительно 50 до приблизительно 55 лет, от приблизительно 55 до приблизительно 60 лет, от приблизительно 60 до приблизительно 65 лет, от приблизительно 65 до приблизительно 70 лет, от приблизительно 70 до приблизительно 75 лет, от приблизительно 75 до приблизительно 80 лет, от приблизительно 80 до приблизительно 85 лет, от приблизительно 85 до приблизительно 90 лет, от приблизительно 90 до приблизительно 95 лет или от приблизительно 95 до приблизительно 100 лет.

В ряде вариантов осуществления субъект представляет собой не являющееся человеком животное и, следовательно, изобретение относится к применению в ветеринарии. В конкретном варианте осуществления не являющееся человеком животное представляет собой домашнее животное. В другом конкретном варианте осуществления не являющееся человеком животное представляет собой представителя домашнего скота.

Наборы

Изобретение относится к наборам, которые могут упростить введение любого агента, описанного в настоящем документе. Иллюстративный набор согласно изобретению содержит любую композицию, описанную в настоящем документе, в единичной лекарственной форме. В одном из вариантов осуществления единичная лекарственная форма представляет собой контейнер, такой как предварительно заполненный шприц, который может быть стерильным, содержащий любой агент, описанный в настоящем документе, и фармацевтически приемлемый наполнитель, разбавитель, эксципиент или носитель. Набор может дополнительно содержать этикетку или напечатанные инструкции, дающие указания по применению любого агента, описанного в настоящем документе. Набор может также включать векорасширитель, местный анестетик и очищающее средство для места введения. Набор может также дополнительно содержать один или более дополнительных агентов, описанных в настоящем документе. В одном из вариантов осуществления набор содержит контейнер, содержащий эффективное количество композиции согласно изобретению и эффективное количество другой композиции, например, описанных в настоящем документе.

Любой аспект или вариант осуществления, описанные в настоящем документе, могут быть объединены с любым другим аспектом или вариантом осуществления, раскрытым в настоящем документе.

Изобретение будет дополнительно описано в следующих примерах, которые не ограничивают объем изобретения, описанный в формуле изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Характеристика химерных белков TIGIT-Fc-OX40L

В этом примере химерные белки, содержащие домены TIGIT и OX40L, были биохимически и функционально охарактеризованы.

Были получены мышиные химерные белки TIGIT-Fc-OX40L и человеческие химерные белки TIGIT-Fc-OX40L; их схематическое изображение приведено в верхней части ФИГ. 3А и ФИГ. 3В. Проводили SDS-PAGE химерных белков mTIGIT-Fc-OX40L и hTIGIT-Fc-OX40L в восстанавливающих условиях после обработки N+O-дегликозилирующим ферментом и/или после кипячения. Вестерн-блоты химерных белков mTIGIT-Fc-OX40L и hTIGIT-Fc-OX40L указывали на присутствие доминантной димерной полосы в невосстановленных дорожках (ФИГ. 3А и ФИГ. 3В, дорожка 2 на каждом блоте), которая была восстанавлена до гликозилированной мономерной полосы в присутствии восстановителя, β-меркаптоэтанола (ФИГ. 3А и ФИГ. 3В, дорожка 3 на каждом блоте). Как показано на ФИГ. 3А и 3В, дорожка 3 на каждом блоте, химерный белок проходил анализ в качестве мономера в присутствии как восстановителя (β-меркаптоэтанол), так и эндогликозидазы (PNGазы).

Затем анализировали связывающие способности химерных белков mTIGIT-Fc-OX40L и химерных белков hTIGIT-Fc-OX40L. Для каждого химерного белка проводили ELISA в следующих условиях: тяжелая + легкая цепь были захвачены и обнаружены с помощью Fc-HRP (ФИГ. 4А и ФИГ. 4В, вверху слева), CD155/PVR-His был захвачен и обнаружен с помощью IgG (ФИГ. 4А и ФИГ. 4В, вверху справа) и OX40-His был захвачен и обнаружен с помощью антитела к mOX40L (ФИГ. 4А и ФИГ. 4В, внизу слева). Химерный белок mTIGIT-Fc-OX40L был захвачен с помощью OX40-Fc и обнаружен с помощью рекомбинантного CD155 (ФИГ. 4А, внизу справа, «Двойной ELISA»), а химерный белок hTIGIT-Fc-OX40L был захвачен с помощью OX40-Fc и обнаружен с помощью рекомбинантного белка CD155, CD112 или CD113 (ФИГ. 4А, внизу справа, «Двойной ELISa»). Эти данные показывают, что химерный белок mTIGIT-Fc-OX40L и химерные белки hTIGIT-Fc-OX40L связывают каждую из своих мишеней и могут одновременно связывать обе мишени.

Были проведены дополнительные анализы, чтобы определить, может ли химерный белок mTIGIT-Fc-OX40L связывать свои мишени на поверхности живых клеток. Была создана клеточная линия для сверхэкспрессии человеческого PVR (т.е. CHOK1/PVR); эти клетки подходят для обнаружения связывания TIGIT-содержащей конструкции с PVR, ассоциированным с клеточной мембраной. См. ФИГ. 5А. Была создана клеточная линия для сверхэкспрессии нектина-2 (т.е. CHOK1/нектин2); Эти клетки подходят для обнаружения связывания TIGIT-содержащей конструкции с нектином-2, ассоциированным с клеточной мембраной. См. ФИГ. 5В. Была создана клеточная линия для сверхэкспрессии нектина-3 (т.е. CHOK1/нектин3); эти клетки подходят для обнаружения связывания TIGIT-содержащей конструкции с нектином-3, ассоциированным с клеточной мембраной. См. ФИГ. 5С. Была получена еще одна клеточная линия со сверхэкспрессией mOX40 (т.е. CHOK1-mOX40). Каждая из клеточных линий была основана на яичнике китайского хомячка K1 (CHOK1).

Химерный белок mTIGIT-Fc-OX40L или химерный белок mPD-1-Fc-OX40L инкубировали с родительскими и сверхэкспрессирующими клеточными линиями в течение 2 часов. Клетки собирали, промывали и окрашивали антителами для обнаружения связывания химерного белка с помощью проточной цитометрии. Как показано на ФИГ. 6 (внизу слева и справа), и, как и ожидалось, химерные белки не связывали линию родительских клеток при любой концентрации химерного белка. Однако mTIGIT-Fc-OX40L связывал сконструированную клеточную линию CHOK1/PVR зависимым от концентрации образом; на основании этих данных было рассчитано значение ЕС₅₀, составившее 4,634 нМ. См. ФИГ. 6 (вверху слева). Напротив, mPD-1-Fc-OX40L не связывал ни одну из сконструированных клеточных линий. Как и в случае со сконструированной клеточной линии CHOK1/PVR, химерный белок mTIGIT-Fc-OX40L также связывал сконструированную клеточную линию CHOK1-mOX40 зависимым от концентрации образом; на основании этих данных было рассчитано значение ЕС₅₀, составившее 1,7 нМ. См. ФИГ. 6 (справа). Эти данные указывают на то, что различные компоненты химерного белка способны связывать свои соответствующие рецепторы/лиганды на живых клетках.

Затем был проведен скрининг с помощью микрочипа для выявления других партнеров по связыванию hTIGIT-Fc-OX40L. ФИГ. 7 представляет собой таблицу с результатами, показывающую выявленных партнеров по связыванию hTIGIT-Fc-OX40L из микрочипа (содержащего приблизительно 6000 человеческих мембранных белков). Каждый ожидаемый партнер по связыванию для hTIGIT-Fc-OX40L был выявлен с помощью скрининга. Не было обнаружено никаких свидетельств неспецифического связывания с другими человеческими белками, и связывание с галектином-1 видно на скрининге всех Fc-содержащих слитых белков.

Пример 2: Характеристика химерных белков CD172a(SIRPα)-Fc-LIGHT

В этом примере химерные белки, содержащие домены LIGHT и CD172a(SIRPα), были биохимически и функционально охарактеризованы.

Были получены мышиные химерные белки CD172a(SIRPα)-Fc-LIGHT и человеческие химерные белки CD172a(SIRPα)-Fc-LIGHT; их схематическое изображение приведено в верхней части ФИГ. 8А и ФИГ. 8В. Проводили SDS-PAGE химерных белков mCD172a(SIRPα)-Fc-LIGHT и hCD172a(SIRPα)-Fc-LIGHT в восстанавливающих условиях после обработки N+O-дегликозилирующим ферментом и/или после кипячения. Вестерн-блоты химерных белков mCD172a(SIRPα)-Fc-LIGHT и hCD172a(SIRPα)-Fc-LIGHT указывали на присутствие доминантной димерной полосы в невосстановленных дорожках (ФИГ. 8А и ФИГ. 8В, дорожка 2 на каждом блоте), которая была восстанавлена до гликозилированной мономерной полосы в присутствии восстановителя, β-меркаптоэтанола (ФИГ. 8А и ФИГ. 8В, дорожка 3 на каждом блоте). Как показано на ФИГ. 8А и 8В, дорожка 3 на каждом блоте, химерный белок проходил анализ в качестве мономера в присутствии как восстановителя (β-меркаптоэтанол), так и эндогликозидазы (PNGазы).

Затем анализировали связывающие способности химерных белков mCD172a(SIRPα)-Fc-LIGHT и химерных белков hCD172a(SIRPα)-Fc-LIGHT. Для каждого химерного белка проводили ELISA в следующих условиях: тяжелая + легкая цепь были захвачены и обнаружены с помощью Fc-HRP (ФИГ. 9А и ФИГ. 9В, вверху слева), CD47-His был захвачен и обнаружен с помощью IgG (ФИГ. 9А и ФИГ. 9В, вверху справа), мышиный LTBR-His был захвачен и обнаружен с помощью антитела к мышиному LIGHT (ФИГ. 9А, внизу слева), или человеческий LTBR-His был захвачен и обнаружен с помощью антитела к человеческому LIGHT (ФИГ. 9В, внизу слева), и LTBR His+GST были захвачены и обнаружены с помощью антитела к SIRPα (ФИГ. 9А и ФИГ. 9В, внизу справа, «Двойной ELISA»). Эти данные показывают, что химерный белок mCD172a(SIRPα)-Fc-LIGHT и химерные белки hCD172a(SIRPα)-Fc-LIGHT связывают каждую из своих мишеней и могут одновременно связывать обе мишени.

Были проведены дополнительные анализы, чтобы определить, может ли химерный белок mCD172a(SIRPα)-Fc-LIGHT связывать свои мишени на поверхности живых клеток. Были получены клетки СНО-K1, экспрессирующие мышиный CD47 (ФИГ. 10А, слева), или клетки СНО-K1, экспрессирующие мышиный LTbR (ФИГ. 10А, справа).

Химерный белок mCD172a(SIRPα)-Fc-LIGHT инкубировали с родительскими и сверхэкспрессирующими клеточными линиями в течение 2 часов. Клетки собирали, промывали и окрашивали антителами для обнаружения связывания химерного белка с помощью проточной цитометрии. Как показано на ФИГ. 10А (слева), и, как и ожидалось, химерный белок не связывал линию родительских клеток при любой концентрации химерного белка. Однако mCD172a(SIRPα)-Fc-LIGHT связывал сконструированную клеточную линию mCD47 (ФИГ. 10А, слева) и сконструированную клеточную линию mLTbR (ФИГ. 10А, справа) зависимым от концентрации образом; на основании этих данных было рассчитано значение ЕС₅₀ для CD47, составившее 18 нМ, и для mCD172a(SIRPα), составившее 24 нМ. Кроме того, химерный белок hCD172a(SIRPα)-Fc-LIGHT инкубировали с клеточной линией, сверхэкспрессирующей mCD47. hCD172a(SIRPα)-Fc-LIGHT связывал сконструированную клеточную линию mCD47 (ФИГ. 10В) зависимым от концентрации образом; на основании этих данных было рассчитано значение ЕС₅₀, составившее 57 нМ. Эти данные указывают на то, что различные компоненты химерного белка способны связывать свои соответствующие рецепторы/лиганды на живых клетках.

Затем была протестирована неспособность человеческого химерного белка TIGIT-Fc-OX40L связываться с эритроцитами и, таким образом, вызывать гемолиз. В этом тесте hCD172a(SIRPα)-Fc-LIGHT, hCD172a(SIRPα)-Fc-CD40 или CD47-специфические антитела (клон СС2С6 или СС900002) приводили в контакт с эритроцитами яванского макака (ФИГ. 11А, слева вверху и внизу) или человеческими эритроцитами (ФИГ. 11В и ФИГ. 11С, все секции). По сравнению с обработками Triton-X (в качестве положительного контроля) ни hCD172a(SIRPα)-Fc-LIGHT, ни hCD172a(SIRPα)-Fc-CD40 не вызывали значительного лизиса эритроцитов яванского макака (ФИГ. 11А, внизу слева); показан пример пластины (ФИГ. 11А, справа). Ни hCD172a(SIRPα)-Fc-LIGHT, ни hCD172a(SIRPα)-Fc-CD40 существенным образом не связывались с человеческими эритроцитами (ФИГ. 11В, все секции). По сравнению с обработками Triton-X (в качестве положительного контроля) hCD172a(SIRPα)-Fc-LIGHT или hCD172a(SIRPα)-Fc-CD40 вызывали почти необнаружимые уровни лизиса человеческих эритроцитов (ФИГ. 11С, все секции); показан пример пластины (ФИГ. 11С, справа). Эти данные показывают, что hCD172a(SIRPα)-Fc-LIGHT и hCD172a(SIRPα)-Fc-CD40 не вызывают гемолиз человеческих эритроцитов в качестве нежелательного побочного действия.

Пример 3: Характеристика химерных белков PD-1-Fc-LIGHT

В этом примере химерные белки, содержащие домены LIGHT и PD-1, были биохимически и функционально охарактеризованы.

Были получены мышиные химерные белки PD-1-Fc-LIGHT и человеческие химерные белки PD-1-Fc-LIGHT; их схематическое изображение приведено в верхней части ФИГ. 12А и ФИГ. 12В. Проводили SDS-PAGE химерных белков mPD-1-Fc-LIGHT и hPD-1-Fc-LIGHT в восстанавливающих условиях после обработки N+O-дегликозилирующим ферментом и/или после кипячения. Вестерн-блоты химерных белков mPD-1-Fc-LIGHT и hPD-1-Fc-LIGHT указывали на присутствие доминантной димерной полосы в невосстановленных дорожках (ФИГ. 12А и ФИГ. 12В, дорожка 2 на каждом блоте), которая была восстановлена до гликозилированной мономерной полосы в присутствии восстановителя, β-меркаптоэтанола (ФИГ. 12А и ФИГ. 12В, дорожка 3 на каждом блоте). Как показано на ФИГ. 12А и 12В, дорожка 3 на каждом блоте, химерный белок проходил анализ в качестве мономера в присутствии как восстановителя (β-меркаптоэтанол), так и эндогликозидазы (PNGазы).

Затем анализировали связывающие способности химерных белков mPD-1-Fc-LIGHT и химерных белков hPD-1-Fc-LIGHT. Для каждого химерного белка проводили ELISA в следующих условиях: тяжелая + легкая цепь были захвачены и обнаружены с помощью Fc-HRP (ФИГ. 13А и ФИГ. 13В, вверху слева), мышиный LTBR-His был захвачен и обнаружен с помощью антитела к мышиному LIGHT (ФИГ. 13А, вверху справа) или человеческий LTBR-His был захвачен и обнаружен с помощью биотинилированного антитела к человеческому LIGHT (ФИГ. 13В, вверху справа), и mPD-L1 был захвачен и обнаружен с помощью антитела к mLIGHT (ФИГ. 13А, внизу слева; «Двойной ELISA») или hPDL1-Fc был захвачен и обнаружен с помощью hLTBR-His/6x His-HRP (ФИГ. 13А, внизу слева; «Двойной ELISA»). Эти данные показывают, что химерный белок mPD-1-Fc-LIGHT и химерные белки hPD-1-Fc-LIGHT связывают каждую из своих мишеней и могут одновременно связывать обе мишени.

Были проведены дополнительные анализы, чтобы определить, может ли мышиный химерный белок PD-1-Fc-LIGHT (ФИГ. 14А) или человеческий химерный белок PD-1-Fc-LIGHT (ФИГ. 14А) связывать свои мишени на поверхности живых клеток. Были получены клетки СНО-K1, экспрессирующие мышиный mPD-L1 (ФИГ. 14А, слева), клетки СНО-K1, экспрессирующие мышиный LTbR (ФИГ. 14А, справа), и клетки СНО-K1, экспрессирующие человеческий mPD-L1 (ФИГ. 14В, слева). Химерный белок mPD-1-Fc-LIGHT инкубировали с родительскими и сверхэкспрессирующими клеточными линиями в течение 2 часов. Клетки собирали, промывали и окрашивали антителами для обнаружения связывания химерного белка с помощью проточной цитометрии. Как показано на ФИГ. 14А (слева и справа), и, как и ожидалось, химерный белок mPD-1-Fc-LIGHT не связывал линию родительских клеток при любой концентрации химерного белка. Однако mPD-1-Fc-LIGHT связывал сконструированную клеточную линию mPD-L1 (ФИГ. 14А, слева) и сконструированную клеточную линию mLTbR (ФИГ. 14А, справа) зависимым от концентрации образом. Кроме того, химерный белок hPD-1-Fc-LIGHT инкубировали с клеточной линией, сверхэкспрессирующей hPD-L1. hPD-1-Fc-LIGHT связывал сконструированную клеточную линию hPD-L1 (ФИГ. 14В) зависимым от концентрации образом; на основании этих данных было рассчитано значение ЕС₅₀, составившее 48 нМ. Эти данные указывают на то, что различные компоненты химерного белка способны связывать свои соответствующие рецепторы/лиганды на живых клетках.

Пример 4: Характеристика химерных белков TIGIT-Fc-LIGHT

В этом примере химерные белки, содержащие домены TIGIT и LIGHT, были биохимически и функционально охарактеризованы.

Были получены мышиные химерные белки TIGIT-Fc-LIGHT и человеческие химерные белки TIGIT-Fc-LIGHT; их схематическое изображение приведено в верхней части ФИГ. 15А и ФИГ. 15В. Проводили SDS-PAGE химерных белков mTIGIT-Fc-LIGHT и hTIGIT-Fc-LIGHT в восстанавливающих условиях после обработки N+O-дегликозилирующим ферментом и/или после кипячения. Вестерн-блоты химерных белков mTIGIT-Fc-LIGHT и hTIGIT-Fc-LIGHT указывали на присутствие доминантной димерной полосы в невосстановленных дорожках (ФИГ. 15А и ФИГ. 15В, дорожка 2 на каждом блоте), которая была восстанавлена до гликозилированной мономерной полосы в присутствии восстановителя, β-меркаптоэтанола (ФИГ. 15А и ФИГ. 15В, дорожка 3 на каждом блоте). Как показано на ФИГ. 15А и 15В, дорожка 3 на каждом блоте, химерный белок проходил анализ в качестве мономера в присутствии как восстановителя (β-меркаптоэтанол), так и эндогликозидазы (PNGазы).

Затем анализировали связывающие способности химерных белков mTIGIT-1-Fc-LIGHT и химерных белков hTIGIT-1-Fc-LIGHT. Для каждого химерного белка проводили ELISA в следующих условиях: тяжелая + легкая цепь были захвачены и обнаружены с помощью Fc-HRP (ФИГ. 16А и ФИГ. 16В, вверху слева), CD155/PVR был захвачен и обнаружен с помощью Fc-HRP (ФИГ. 16А, вверху справа) или CD155-His был захвачен и обнаружен с помощью (ФИГ. 16В, вверху справа), и mLTBR-His был захвачен и обнаружен с помощью антитела к mLIGHT (ФИГ. 16А, внизу слева) или hCD155-Fc был захвачен и обнаружен с помощью hLTBR-His/6x His-HRP (ФИГ. 16В, внизу слева; «Двойной ELISA»). Эти данные показывают, что химерный белок mTIGIT-1-Fc-LIGHT и химерные белки hTIGIT-1-Fc-LIGHT связывают каждую из своих мишеней, и по крайней мере hTIGIT-1-Fc-LIGHT может одновременно связывать обе мишени.

Были проведены дополнительные анализы, чтобы определить, может ли мышиный химерный белок TIGIT-1-Fc-LIGHT (ФИГ. 17) связывать свои мишени на поверхности живых клеток.

Химерный белок mTIGIT-1-Fc-LIGHT или химерный белок mPD-1-Fc-LIGHT инкубировали с клетками СНО-K1, экспрессирующими мышиный PVR или экспрессирующими мышиный нектин-2 (ФИГ. 17, вверху слева), с клетками СНО-K1, экспрессирующими мышиный LTbR мыши (ФИГ. 17А, справа) или родительские клетки СНО-K1 (ФИГ. 17, внизу справа и слева).

Как показано на ФИГ. 17 (внизу слева), и, как и ожидалось, ни химерный белок mTIGIT-1-Fc-LIGHT, ни химерный белок mPD-1-Fc-LIGHT не связывали родительские клеточные линии, за исключением самой высокой концентрации химерного белка. Однако mTIGIT-1-Fc-LIGHT связывал сконструированную клеточную линию mPVR зависимым от концентрации образом; на основании этих данных было рассчитано значение ЕС50, составившее 214,9 нМ (ФИГ. 17, вверху слева). mTIGIT-1-Fc-LIGHT также связывал сконструированную клеточную линию mLTbR зависимым от концентрации образом; на основании этих данных было рассчитано значение ЕС₅₀, составившее 11 нМ (ФИГ. 17, справа). Эти данные указывают на то, что различные компоненты химерного белка способны связывать свои соответствующие рецепторы/лиганды на живых клетках.

Пример 5: Дополнительная характеристика химерных белков

В этом примере были проведены дополнительные эксперименты с химерными белками человеческий TIGIT-Fc-LIGHT, человеческий CD172a(SIRPα)-Fc-LIGHT, человеческий PD-1-Fc-LIGHT, мышиный PD-1-Fc-LIGHT, человеческий TIGIT-Fc-OX40L, человеческий TIGIT-Fc-LIGHT, человеческий CD172a(SIRPα)-Fc-LIGHT.

Аффинности связывания человеческого TIGIT-Fc-LIGHT, CD172a(SIRPα)-Fc-LIGHT или PD-1-Fc-LIGHT с человеческим LTbR измеряли с помощью биослойной интерферометрии с использованием системы Octet (см. ФИГ. 18А, все секции). Аффинности связывания человеческого PD-1-Fc-LIGHT с рекомбинантным человеческим PD-L1 или PD-L2 в диапазоне концентраций измеряли с помощью биослойной интерферометрии с использованием системы Octet (см. ФИГ. 18В).

Аффинности связывания человеческого TIGIT-Fc-OX40L и TIGIT-Fc-LIGHT с рекомбинантным человеческим CD155/PVR (по сравнению с контролем односторонним слитым белком TIGIT-Fc) измеряли с помощью биослойной интерферометрии с использованием системы Octet (см. ФИГ. 19А). Аффинности связывания человеческого CD172a(SIRPα)-Fc-LIGHT с рекомбинантным человеческим CD47 (по сравнению с контролем односторонним CD172a(SIRPα)-Fc или одним из двух контролей CD47-специфичным антителом) измеряли с помощью биослойной интерферометрии с использованием системы Octet (см. ФИГ. 19В). Аффинности связывания человеческого PD-1-Fc-LIGHT с рекомбинантным человеческим PD-L1 (по сравнению с с контролем односторонним PD-1-Fc или контролем антителом к PD-L1: атезолизумабом) измеряли с помощью биослойной интерферометрии с использованием системы Octet (см. ФИГ. 19С). Аффинности связывания человеческого CD172a(SIRPα)-Fc-LIGHT, TIGIT-Fc-LIGHT или PD-1-Fc-LIGHT с рекомбинантным человеческим LTbR (по сравнению с контролем односторонним слитым белком LIGHT-Fc или антителом к LTbR) измеряли с помощью биослойной интерферометрии с использованием системы Octet (см. ФИГ. 19D).

Функциональную способность химерных белков, содержащих домен LIGHT, или химерных белков, содержащих домен TIGIT, определяли в анализе высвобождения цитокинов под воздействием суперантигена. В этом анализе для активации человеческих лейкоцитов периферической крови в присутствии различных исследуемых агентов использовали возрастающие концентрации стафилококкового энтеротоксина В (SEB). Количество IL-2 (ФИГ. 20А) или TNFα (ФИГ. 20В), секретируемого в культуральный супернатант, контролировали как функциональное считывание способности тестируемых агентов либо блокировать события подавляющей сигнализации, либо совместно стимулировать иммуноактивирующие сигналы.

На ФИГ. 20А и ФИГ. 20В показаны анализы высвобождения цитокинов под воздействием супер антигена, которые демонстрируют действия различных антител, мышиных химерных белков TIGIT-Fc-OX40L, CD172a(SIRPα)-Fc-LIGHT, TIGIT-Fc-LIGHT и PD-1-Fc-LIGHT на мышиные лейкоциты периферической крови, активированные SEB. На ФИГ. 20С показаны сводные данные, полученные для нескольких концентраций суперантигена (SEB). Как показано на ФИГ. 20А и ФИГ. 20С, при введении 50 и 200 нг/мл SEB каждая из трех концентраций (10 нМ, 100 нМ и 250 нМ) для mCD172a(SIRPα)-Fc-LIGHT и the mPD-1-Fc-LIGHT обеспечивала значительно большую секрецию IL2, чем все контрольные антитела. Как показано на ФИГ. 20В, при введении 50 и 200 нг/мл SEB, mPD-1-Fc-LIGHT в концентрациях 100 нМ или 250 нМ обеспечивал значительно большую секрецию TNFα, чем все контрольные антитела; при введении 200 нг/мл SEB все три концентрации mCD172a(SIRPα)-Fc-LIGHT обеспечивали значительно большую секрецию TNFα, чем все контрольные антитела.

Более того, на ФИГ. 21А-21С показаны анализы высвобождения цитокинов под воздействием супер антигена, которые демонстрируют действия различных антител, человеческих химерных белков TIGIT-Fc-LIGHT (ФИГ. 21А), TIGIT-Fc-OX40L (ФИГ. 21В), PD-1-Fc-LIGHT и CD172a(SIRPα)-Fc-LIGHT (ФИГ. 21С) на человеческие лейкоциты периферической крови, активированные SEB.

Соответственно, приведенные выше данные демонстрируют, что химерные белки, содержащие домен LIGHT, и химерные белки, содержащие домен TIGIT, как описано в настоящем документе, способны связывать каждый из их трех партнеров по связыванию; они функционально активируют первичные человеческие лейкоциты in vitro.

Пример 6: Улучшенное уничтожение опухолей и увеличение выживаемости при лечении химерными белками

Противоопухолевую активность in vivo химерных белков мышиного TIGIT-Fc-OX40L, мышиного CD172a(SIRPα)-Fc-LIGHT, мышиного TIGIT-Fc-LIGHT и мышиного PD-1-Fc-LIGHT анализировали с использованием мышиной модели колоректальной опухоли СТ26. В одной серии экспериментов мышам Balb/с инокулировали опухоль СТ26. Когда опухоли достигали диаметра от 4 до 5 мм, мыши получали химерный белок mTIGIT-Fc-OX40L, mCD172a(SIRPα)-Fc-LIGHT, mTIGIT-Fc-LIGHT и mPD-1-Fc-LIGHT, или антитело к TIGIT, антитело к CD47, антитело к ОХ40 или антитело к PD-1, или комбинацию антитела к TIGIT и антитела к ОХ40.

Рост опухоли для каждой группы лечения оценивали, как показано на ФИГ. 22А (левая и правая секции). В частности, у не получавших лечения мышей быстро развивались опухоли, и лечение антителом или антителами, по-видимому, немного задерживало развитие опухолей. Напротив, лечение мышей химерным белком mTIGIT-Fc-OX40L, mCD172a(SIRPα)-Fc-LIGHT, mTIGIT-Fc-LIGHT или mPD-1-Fc-LIGHT значительно ингибировало рост и/или задерживало развитие опухолей.

Также оценивали общий процент выживаемости мышей спустя сорок дней после инокуляции опухоли. Все не получавшие лечения мыши погибли в течение двадцати дней после инокуляции опухоли, и ни у одной из мышей, получавших антитело или антитела, выживаемость в течение 40 дней не превышала 25%; см. ФИГ. 22В, левая секция. Немаловажно, что все мыши, получавшие химерный белок mTIGIT-Fc-OX40L, mCD172a(SIRPα)-Fc-LIGHT, mTIGIT-Fc-LIGHT или mPD-1-Fc-LIGHT, остались в живых спустя сорок дней после инокуляции опухоли; см. ФИГ. 22В, правая секция.

Эти данные показывают, что лечение in vivo химерным белком TIGIT-Fc-OX40L, CD172a(SIRPα)-Fc-LIGHT, TIGIT-Fc-LIGHT или PD-1-Fc-LIGHT ингибируют рост опухоли и улучшает выживаемость.

Пример 7: Характеристика вклада Fc-домена в линкере в функциональность химерных белков

В этом примере был проанализирован вклад Fc-домена в линкере в функциональность химерных белков согласно настоящему изобретению. В этом анализе в качестве модели Fc-содержащих химерных белков использовали PD-1-Fc-OX40L. Таким образом, представленные ниже данные относятся к химерным белкам согласно настоящему изобретению.

В своем нативном состоянии PD-1 существует в виде мономера, тогда как OX40L имеют тенденцию к димеризации из-за электростатических взаимодействий между доменами OX40L; Fc-домены связываются друг с другом через дисульфидные связи, например, через их остаток(остатки) цистеина. Вместе несколько межмолекулярных взаимодействий могут вносить вклад в четвертичную структуру PD-1-Fc-OX40L. Существует по меньшей мере четыре потенциальные конфигурации PD-1-Fc-OX40L, в которых химерный белок существует в виде мономера, димера, тримера или гексамера. См. ФИГ. 23.

Существование мономерной и димерной конфигураций химерного белка проверяли, подвергая химерные белки воздействию восстанавливающих и невосстанавливающих условий и затем проводя SDS-PAGE белков. В невосстанавливающих условиях (Восстановление: «-») химерный белок мигрировал в SDS-PAGE при приблизительно 200 кДа. В этом случае вестерн-блоты зондировали антителами к PD-1, Fc или OX40L, соответственно, в левом, среднем и правом блотах, показанных на ФИГ. 24. Поскольку предполагаемая молекулярная масса мономерной формы химерного белка составляет 57,6 кДа, ожидается, что разновидность молекулярной массой 200 кДа будет, по меньшей мере, димером. Однако в восстанавливающих условиях (Восстановление: «+»), восстанавливающих дисульфидные связи (например, между доменами Fc), химерный белок мигрировал в SDS-PAGE при приблизительно 100 кДа. Поскольку разновидность молекулярной массой 100 кДа была тяжелее, чем ожидалось, было предсказано, что избыточная масса была обусловлена гликозилированием. Наконец, химерные белки обрабатывали пептид-N-гликозидазой F (PNGаза F «+») и проводили SDS-PAGE в восстанавливающих условиях. В этих условиях химерный белок мигрировал при приблизительно 57,6 кДа. Эти данные свидетельствуют о том, что химерный белок гликозилирован и существует в природе, по крайней мере, в виде димера, в котором димеризация, по-видимому, обусловлена присутствием дисульфидной связи между Fc-доменами, например, посредством их остатка(остатков) цистеина.

Способы с использованием геля SDS-PAGE не позволяют точно предсказать молекулярную массу высоко заряженных и/или высокомолекулярных белков. Таким образом, химерные белки затем были охарактеризованы с помощью эксклюзионной хроматографии (SEC). В отличие от SDS-PAGE, в которой отрицательно заряженный SDS уменьшает основанные на заряде взаимодействия между пептидами, в SEC не используются детергенты или восстановители. При проведении SEC химерного белка PD-1-Fc-OX40L ни один из пиков не приближался к 200 кДа. Это говорит о том, что в нативной форме химерный белок не существует в виде димера. Вместо этого был обнаружен пик, имеющий размер более 670 кДа. См. ФИГ. 25. Эти и предыдущие данные свидетельствуют о том, что химерный белок PD-1-Fc-OX40L существует в виде гексамера в своем нативном состоянии.

Как показано выше, при проведении SDS-PAGE в невосстанавливающих условиях или в восстанавливающих условиях SDS в образце и/или рабочем буфере превращает гексамерный химерный белок PD-1-Fc-OX40L в преобладающую форму димера или мономера, соответственно, в отсутствие и в присутствии восстановителя. См. ФИГ. 26 (гель слева). При проведении нативного PAGE с гелем, не содержащим SDS, и в отсутствие восстановителя химерный белок существует в виде гексамера. Однако проведении нативного PAGE и в присутствии восстановителя (восстанавливающего дисульфидные связи) химерный белок мигрировал тяжелее, чем ожидалось; как показано на ФИГ. 26 (гель справа, дорожка 2), где химерному белку не удалось существенно мигрировать из загрузочной лунки. Эти данные свидетельствуют о том, что химерный белок олигомеризовался в белок высшего порядка. Таким образом, в химерных белках дисульфидная связь, по-видимому, важна для контроля олигомеризации высшего порядка.

Для дальнейшего подтверждения этого были сконструированы химерные белки, лишенные Fc-домена, например, «PD-1-без Fc-OX40L». Такие химерные белки не будут иметь дисульфидной связи, образуемой между Fc-доменами в химерных белках, описанных ранее. Как показано на ФИГ. 27, при проведении нативного PAGE химерных белков, лишенных Fc-доменов, ни один из белков практически не мигрирует из своей загрузочной лунки, что, опять же, дает основания полагать, что химерные белки «без Fc» образовали конкатемероподобный комплекс, содержащий множество белков. Таким образом, отсутствие Fc-домена в химерном белке приводит к образованию белковых агрегатов. Эти данные показывают, что дисульфидная связь, например, между Fc-доменами на разных химерных белках, стабилизирует химерные белки и гарантирует, что каждый из них существует в виде гексамера, а не в виде белка/конкатемера высшего порядка. Другими словами, Fc-домен неожиданно упорядочивает химерные белковые комплексы. Дорожки с 1 по 4 соответственно включают 2,5 мкг PD-1-без Fc-OX40L, 5 мкг PD-1-без Fc-OX40L, 2,5 мкг PD-1-без Fc-OX40L и 5 мкг PD-1-без Fc-OX40L.

На ФИГ. 28 показана модель, обобщающая вышеупомянутые данные и показывающая, как гексамер и конкатамеры образуются из химерных белков согласно настоящему изобретению. Иллюстративный химерный белок (PD-1-Fc-OX40L) естественным образом превращается в гексамер (вследствие электростатического взаимодействия между доменами OX40L и димеризации с помощью Fc-доменов). Однако, в отсутствие контролирующих эффектов дисульфидной связи между Fc-доменами в восстанавливающих условиях в белке PD-1-Fc-OX40L и из-за отсутствия Fc-доменов в PD-1-без Fc-OX40L, эти последние химерные белки образуют конкатамеры.

Кроме того, были сконструированы химерные белки, в которых Fc-домен (как описано в настоящем документе) был заменен на фиколин (в котором отсутствуют остатки цистеина, необходимые для образования дисульфидной связи между химерными белками). Как и в случае с химерными белками без Fc и химерными белками, содержащими Fc и проанализированными с помощью PAGE в присутствии восстановителя (оба из которых образовали агрегаты, которые не мигрируют в гель), химерные белки, содержащие фиколин, по-видимому, также образуют структуры высшего порядка, которые не мигрировали в гель. Эти данные подтверждают вывод о том, что дисульфидная связь важна для надлежащего фолдинга и функционирования химерных белков согласно настоящему изобретению.

Наконец, получали химерные белки с использованием спиральных Fc-доменов (CCDFc). При функциональной оценке было доставлено очень мало очищенного белка.

Соответственно, включение Fc-домена в линкер химерного белка (который способен образовывать дисульфидные связи между химерными белками) помогает избежать образования нерастворимых и, вероятно, нефункциональных конкатамеров и/или агрегатов белка.

Пример 8. Характеристика различных последовательностей соединяющих линкеров для химерных белков

Различные уникальные последовательности соединяющих линкеров (17 линкеров) были охарактеризованы различными параметрами (длина, растворимость, заряд и гибкость). Затем были синтезированы конструкции, включающие каждую из этих 17 последовательностей соединяющих линкеров в положении «линкер 2», где конфигурация химерного белка представляла собой следующую:

ВКД 1 - соединяющий линкер 1 - Fc-домен - соединяющий линкер 2 - ВКД 2.

Уровни продукции для этих 17 конструкций были протестированы в клетках СНО. В следующей таблице приведены сводные данные по различным последовательностям соединяющих линкеров, характеристикам этих соединяющих линкеров, уровню продукции (А280) и значениям связывания (ЕС₅₀) на основе анализа FACS с PD-L1 или ОХ40. Были определены некоторые различия в уровнях продукции и активности между отдельными последовательностями соединяющих линкеров.

Характеристика химерных белков PD-1-IgG4-OX40L с различными последовательностями соединяющих линкеров (17 линкеров) с помощью вестерн-блоттинга показана на ФИГ. 29А-ФИГ. 29Q. А именно, каждый отдельный домен слитой конструкции исследовали с использованием антитела к α-PD-1, α-Fc или α-OX40L. Результаты показали одинаковую эффективность для каждого химерного белка, что позволяет предположить, что все кандидаты последовательностей соединяющих линкеров были функциональными.

Кроме того, каждый очищенный белок с различными линкерными последовательностями также был охарактеризован связыванием с PD-L1 или ОХ40 в анализах ELISA (ФИГ. 30), а также в анализах проточной цитометрии на основе клеток (ФИГ. 31А-31Р).

Пример 9: Получение дополнительных TIGIT-содержащих химерных белков, содержащих внеклеточные домены других белков II типа

В этом примере описаны дополнительные химерные белки согласно настоящему изобретению. Такие дополнительные химерные белки будут получены аналогично тому как были получены химерные белки TIGIT-Fc-OX40L, TIGIT-Fc-CD40L или TIGIT-Fc-LIGHT, например, как описано выше в подробном описании изобретения и в приоритетном документе настоящей заявки U.S. 62/464,002.

Эти дополнительные химерные белки будут иметь общую формулу: ВКД 1 - -соединяющий линкер 1 Fc-домен соединяющий линкер 2 ВКД 2, где ВКД 1 представляет собой внеклеточный домен TIGIT, а ВКД 2 представляет собой внеклеточный домен белка II типа, отличного от CD40L, OX40L или LIGHT. Примеры белков II типа включают 4-1BBL, CD30L, FasL, GITRL, TL1A и TRAIL. Эти химерные белки могут не иметь одного или обоих соединяющих линкеров. Примеры соединяющих линкеров 1, Fc-доменов и соединяющих линкеров 2 описаны выше в таблице 1; модульные линкеры, подходящие для образования химерных белков и содержащие конкретные соединяющие линкеры 1, Fc-домены и соединяющие линкеры 2, показаны на ФИГ. 32.

В качестве альтернативы, дополнительные химерные белки будут представлять собой слитые белки, имеющие следующую общую формулу: N-конец - (а) - (b) - (с) - С-конец, где (а) представляет собой TIGIT, (b) представляет собой линкер, содержащий по меньшей мере часть Fc-домена, и (с) представляет собой внеклеточный домен белка II типа, отличный от CD40L, OX40L или LIGHT. Примеры белков II типа включают 4-1BBL, CD30L, FasL, GITRL, TL1A и TRAIL. Примеры линкеров описаны выше в таблице 1; модульные линкеры, подходящие для образования химерных белков и содержащие конкретные соединяющие линкеры 1, Fc-домены и соединяющие линкеры 2, показаны на ФИГ. 32.

Аминокислотная последовательность для 4-1BBL, CD30L, FasL, GITRL, TL1A и TRAIL содержит соответственно SEQ ID NO: 12, 26, 30, 15, 18 и 40. Аминокислотная последовательность для внеклеточного домена 4-1BBL, CD30L, FasL, GITRL, TL1A и TRAIL содержит соответственно SEQ ID NO: 13, 27, 31, 16, 19 и 41. Аминокислотная последовательность для TIGIT содержит SEQ ID NO: 9, а внеклеточный домен TIGIT содержит SEQ ID NO: 10. Химерные белки могут содержать вариант вышеупомянутых последовательностей, например, последовательность, по меньшей мере приблизительно на 95% идентичную вышеупомянутой последовательности.

Соответственно, настоящее изобретение дополнительно включает следующие дополнительные химерные белки и способы с использованием дополнительных химерных белков (например, при лечении рака и/или лечении воспалительного заболевания): TIGIT-Fc-4-1BBL, TIGIT-Fc-CD30L, TIGIT-Fc-FasL, TIGIT-Fc-GITRL, TIGIT-Fc-TLIA и TIGIT-Fc-TRAIL.

Дополнительные химерные белки будут охарактеризованы, как описано выше для TIGIT-Fc-OX40L, TIGIT-Fc-CD40L или TIGIT-Fc-LIGHT в примерах 1-8, но с реагентами (например, партнерами по связыванию, рекомбинантными клетками-мишенями и типами раковых клеток/опухолей), специфичными для дополнительных химерных белков, а не с реагентами, необходимыми для характеристики TIGIT-Fc-OX40L, TIGIT-Fc-CD40L или TIGIT-Fc-LIGHT. Таким образом, используя TIGIT-Fc-4-1BBL и TIGIT-Fc-CD40L в качестве примеров, можно охарактеризовать TIGIT-Fc-4-1BBL аналогично примеру 1 с использованием антител к TIGIT, к Fc и к 4-1BBL, а не антител к TIGIT, к Fc и к CD40L, необходимых для TIGIT-Fc-CD40L.

Как и в случае химерных белков TIGIT-Fc-OX40L, TIGIT-Fc-CD40L или TIGIT-Fc-LIGHT, дополнительные химерные белки будут эффективны при лечении рака и/или лечении воспалительного заболевания путем блокирования TIGIT (который ингибирует передачу иммуноингибирующего сигнала) и усиления, увеличения и/или стимуляции передачи иммуностимулирующего сигнала посредством активации рецептора/лиганда одного из 4-1BBL, CD30L, FasL, GITRL, TL1A и TRAIL. Кроме того, дополнительные химерные белки будут эффективны при лечении рака и/или воспалительного заболевания, при этом не вызывая токсичности и нежелательных побочных действий, например, осложнений со стороны желудочно-кишечного тракта, вызываемых лечением, включающим несколько антител, например, блокирующее антитело и антитело-агонист к рецептору/лиганду одного из 4-1BBL, CD30L, FasL, GITRL и TRAIL.

Пример 10: Получение дополнительных LIGHT-содержащих химерных белков, содержащих внеклеточные домены других белков I типа

В этом примере описаны дополнительные химерные белки согласно настоящему изобретению. Такие дополнительные химерные белки будут получены аналогично тому, как были получены химерные белки CD172a(SIRPα)-Fc-LIGHT, TIGIT-Fc-LIGHT bkb PD-1-Fc-LIGHT, например, как описано выше в подробном описании изобретения и в приоритетном документе настоящей заявки U.S. 62/464,002.

Эти дополнительные химерные белки будут иметь общую формулу: ВКД 1 соединяющий линкер 1 - Fc-домен - соединяющий линкер 2 - ВКД 2, где ВКД 1 представляет собой внеклеточный домен белка I типа, отличного от CD172a(SIRPα), TIGIT или PD-1, а ВКД 2 представляет собой внеклеточный домен LIGHT. Примеры белков I типа включают TIM3 и BTLA. Эти химерные белки могут не иметь одного или обоих соединяющих линкеров. Примеры соединяющих линкеров 1, Fc-доменов и соединяющих линкеров 2 описаны выше в таблице 1; модульные линкеры, подходящие для образования химерных белков и содержащие конкретные соединяющие линкеры 1, Fc-домены и соединяющие линкеры 2, показаны на ФИГ. 32.

В качестве альтернативы, дополнительные химерные белки будут представлять собой слитые белки, имеющие следующую общую формулу: N-конец - (а) - (b) - (с) - С-конец, где (а) представляет собой внеклеточный домен белка I типа, отличного от CD172a(SIRPα), TIGIT или PD-1, (b) представляет собой линкер, содержащий по меньшей мере часть Fc-домена, и (с) представляет собой внеклеточный домен LIGHT. Примеры белков I типа включают TIM3 и BTLA. Примеры линкеров описаны выше в таблице 1; модульные линкеры, подходящие для образования химерных белков и содержащие конкретные соединяющие линкеры 1, Fc-домены и соединяющие линкеры 2, показаны на ФИГ. 32.

Аминокислотная последовательность для TIM3 и BTLA содержит соответственно SEQ ID NO: 36 и 24. Аминокислотная последовательность для внеклеточного домена TIM3 и BTLA содержит соответственно SEQ ID NO: 37 и 25. Аминокислотная последовательность для LIGHT содержит SEQ ID NO: 1, а внеклеточный домен LIGHT содержит SEQ ID NO: 2. Химерные белки могут содержать вариант вышеупомянутых последовательностей, например, последовательность, по меньшей мере приблизительно на 95% идентичную вышеупомянутой последовательности.

Соответственно, настоящее изобретение дополнительно включает следующие дополнительные химерные белки и способы с использованием дополнительных химерных белков (например, при лечении рака и/или лечении воспалительного заболевания): TIM3-Fc-LIGHT и BTLA-Fc-LIGHT. Дополнительные химерные белки будут охарактеризованы, как описано выше для CD172a(SIRPα)-Fc-LIGHT, TIGIT-Fc-LIGHT или PD-1-Fc-LIGHT в примерах 1-8, но с реагентами (например, партнерами по связыванию, рекомбинантными клетками-мишенями и типами раковых клеток/опухолей), специфичными для дополнительных химерных белков, а не с реагентами, необходимыми для характеристики ТГМ3-Fc-LIGHT и BTLA-Fc-LIGHT; в качестве примеров, характеристика TIM3-Fc-LIGHT согласно примеру 2 может быть выполнена с помощью антител к LIGHT, Fc и TIM3, а не антител к LIGHT, Fc и CD172a(SIRPα), необходимых для CD172a(SIRPα)-Fc-LIGHT.

Как и в случае химерных белков CD172a(SIRPα)-Fc-LIGHT, TIGIT-Fc-LIGHT или PD-1-Fc-LIGHT, дополнительные химерные белки будут эффективны при лечении рака и/или лечении воспалительного заболевания путем блокирования TIM3 и LIGHT (который ингибирует передачу иммуноингибирующего сигнала) и усиления, увеличения и/или стимуляции передачи иммуностимулирующего сигнала посредством активации рецептора/лиганда посредством LIGHT. Кроме того, дополнительные химерные белки будут эффективны при лечении рака и/или воспалительного заболевания, при этом не вызывая токсичности и нежелательных побочных действий, например, осложнений со стороны желудочно-кишечного тракта, вызываемых лечением, включающим несколько антител, например, блокирующее антитело и антитело-агонист к рецептору/лиганду одного из TIM3 и LIGHT.

ЭКВИВАЛЕНТЫ

В то время как настоящее изобретение было описано в связи с конкретными вариантами его осуществления, следует понимать, что возможны дополнительные модификации и настоящая заявка охватывает любые вариации, применения или адаптации настоящего изобретения, следуя, в целом, принципам изобретения и включая такие отклонения от настоящего описания, которые возникают в результате известной или обычной практики в данной области, к которой относится изобретение, и которые могут быть применены к существенным признакам, изложенным ранее в настоящем документе и как следует в объеме прилагаемой формулы изобретения.

Специалистам в данной области техники будет ясно или они смогут установить, используя не более чем рутинные эксперименты, множество эквивалентов конкретных вариантов осуществления, описанных конкретно в настоящем документе. Подразумевается, что такие эквиваленты охватываются объемом следующей формулы изобретения.

ВКЛЮЧЕНИЕ ПОСРЕДСТВОМ ССЫЛКИ

Все патенты и публикации, упомянутые в настоящем документе, полностью включены в настоящий документ посредством ссылки.

Публикации, обсуждаемые в настоящем документе, приведены исключительно ради информации, содержащейся в их описании, известной до даты подачи настоящей заявки. Ничто в настоящем документе не следует интерпретировать в качестве признания того, что настоящее изобретение не может быть противопоставлено такой публикации с более ранним приоритетом ввиду более раннего раскрытия.

В контексте настоящего документа все заголовки приведены просто для структурирования и не предназначены для ограничения изобретения каким-либо образом. Содержание любого отдельного раздела может быть в равной степени применимо ко всем разделам.

ЭКВИВАЛЕНТЫ

В то время как настоящее изобретение было описано в связи с конкретными вариантами его осуществления, следует понимать, что возможны дополнительные модификации и настоящая заявка охватывает любые вариации, применения или адаптации настоящего изобретения, следуя, в целом, принципам изобретения и включая такие отклонения от настоящего описания, которые возникают в результате известной или обычной практики в данной области, к которой относится изобретение, и которые могут быть применены к существенным признакам, изложенным ранее в настоящем документе и как следует в объеме прилагаемой формулы изобретения.

Специалистам в данной области техники будет ясно или они смогут установить, используя не более чем рутинные эксперименты, множество эквивалентов конкретных вариантов осуществления, описанных конкретно в настоящем документе. Подразумевается, что такие эквиваленты охватываются объемом следующей формулы изобретения.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> SHATTUCK LABS, INC.

<120> ХИМЕРНЫЕ БЕЛКИ НА ОСНОВЕ TIGIT И LIGHT

<130> SHK-001PC1

<150> US 62/464,002

<151> 2017-02-27

<160> 101

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 240

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 1

Met Glu Glu Ser Val Val Arg Pro Ser Val Phe Val Val Asp Gly Gln

1 5 10 15

Thr Asp Ile Pro Phe Thr Arg Leu Gly Arg Ser His Arg Arg Gln Ser

20 25 30

Cys Ser Val Ala Arg Val Gly Leu Gly Leu Leu Leu Leu Leu Met Gly

35 40 45

Ala Gly Leu Ala Val Gln Gly Trp Phe Leu Leu Gln Leu His Trp Arg

50 55 60

Leu Gly Glu Met Val Thr Arg Leu Pro Asp Gly Pro Ala Gly Ser Trp

65 70 75 80

Glu Gln Leu Ile Gln Glu Arg Arg Ser His Glu Val Asn Pro Ala Ala

85 90 95

His Leu Thr Gly Ala Asn Ser Ser Leu Thr Gly Ser Gly Gly Pro Leu

100 105 110

Leu Trp Glu Thr Gln Leu Gly Leu Ala Phe Leu Arg Gly Leu Ser Tyr

115 120 125

His Asp Gly Ala Leu Val Val Thr Lys Ala Gly Tyr Tyr Tyr Ile Tyr

130 135 140

Ser Lys Val Gln Leu Gly Gly Val Gly Cys Pro Leu Gly Leu Ala Ser

145 150 155 160

Thr Ile Thr His Gly Leu Tyr Lys Arg Thr Pro Arg Tyr Pro Glu Glu

165 170 175

Leu Glu Leu Leu Val Ser Gln Gln Ser Pro Cys Gly Arg Ala Thr Ser

180 185 190

Ser Ser Arg Val Trp Trp Asp Ser Ser Phe Leu Gly Gly Val Val His

195 200 205

Leu Glu Ala Gly Glu Lys Val Val Val Arg Val Leu Asp Glu Arg Leu

210 215 220

Val Arg Leu Arg Asp Gly Thr Arg Ser Tyr Phe Gly Ala Phe Met Val

225 230 235 240

<210> 2

<211> 182

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 2

Leu Gln Leu His Trp Arg Leu Gly Glu Met Val Thr Arg Leu Pro Asp

1 5 10 15

Gly Pro Ala Gly Ser Trp Glu Gln Leu Ile Gln Glu Arg Arg Ser His

20 25 30

Glu Val Asn Pro Ala Ala His Leu Thr Gly Ala Asn Ser Ser Leu Thr

35 40 45

Gly Ser Gly Gly Pro Leu Leu Trp Glu Thr Gln Leu Gly Leu Ala Phe

50 55 60

Leu Arg Gly Leu Ser Tyr His Asp Gly Ala Leu Val Val Thr Lys Ala

65 70 75 80

Gly Tyr Tyr Tyr Ile Tyr Ser Lys Val Gln Leu Gly Gly Val Gly Cys

85 90 95

Pro Leu Gly Leu Ala Ser Thr Ile Thr His Gly Leu Tyr Lys Arg Thr

100 105 110

Pro Arg Tyr Pro Glu Glu Leu Glu Leu Leu Val Ser Gln Gln Ser Pro

115 120 125

Cys Gly Arg Ala Thr Ser Ser Ser Arg Val Trp Trp Asp Ser Ser Phe

130 135 140

Leu Gly Gly Val Val His Leu Glu Ala Gly Glu Lys Val Val Val Arg

145 150 155 160

Val Leu Asp Glu Arg Leu Val Arg Leu Arg Asp Gly Thr Arg Ser Tyr

165 170 175

Phe Gly Ala Phe Met Val

180

<210> 3

<211> 167

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 3

Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln

1 5 10 15

Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp

20 25 30

Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp

35 40 45

Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val

50 55 60

Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala

65 70 75 80

Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg

85 90 95

Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg

100 105 110

Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu

115 120 125

Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val

130 135 140

Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro

145 150 155 160

Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln

165

<210> 4

<211> 147

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 4

Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr

1 5 10 15

Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe

20 25 30

Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr

35 40 45

Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu

50 55 60

Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu

65 70 75 80

Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn

85 90 95

Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala

100 105 110

Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg

115 120 125

Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly

130 135 140

Gln Phe Gln

145

<210> 5

<211> 559

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 5

Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala

1 5 10 15

Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe

20 25 30

Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro

35 40 45

Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln

50 55 60

Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg

65 70 75 80

Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr

85 90 95

Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu

100 105 110

Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro

115 120 125

Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Ser

130 135 140

Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly

145 150 155 160

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met

165 170 175

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln

180 185 190

Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

195 200 205

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr

210 215 220

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Ser Gly

225 230 235 240

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Ser Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile

245 250 255

Glu Lys Thr Ile Ser Asn Ala Thr Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

260 265 270

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

275 280 285

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

290 295 300

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

305 310 315 320

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val

325 330 335

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu

340 345 350

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

355 360 365

Leu Gly Lys Ile Glu Gly Arg Met Asp Leu Gln Leu His Trp Arg Leu

370 375 380

Gly Glu Met Val Thr Arg Leu Pro Asp Gly Pro Ala Gly Ser Trp Glu

385 390 395 400

Gln Leu Ile Gln Glu Arg Arg Ser His Glu Val Asn Pro Ala Ala His

405 410 415

Leu Thr Gly Ala Asn Ser Ser Leu Thr Gly Ser Gly Gly Pro Leu Leu

420 425 430

Trp Glu Thr Gln Leu Gly Leu Ala Phe Leu Arg Gly Leu Ser Tyr His

435 440 445

Asp Gly Ala Leu Val Val Thr Lys Ala Gly Tyr Tyr Tyr Ile Tyr Ser

450 455 460

Lys Val Gln Leu Gly Gly Val Gly Cys Pro Leu Gly Leu Ala Ser Thr

465 470 475 480

Ile Thr His Gly Leu Tyr Lys Arg Thr Pro Arg Tyr Pro Glu Glu Leu

485 490 495

Glu Leu Leu Val Ser Gln Gln Ser Pro Cys Gly Arg Ala Thr Ser Ser

500 505 510

Ser Arg Val Trp Trp Asp Ser Ser Phe Leu Gly Gly Val Val His Leu

515 520 525

Glu Ala Gly Glu Lys Val Val Val Arg Val Leu Asp Glu Arg Leu Val

530 535 540

Arg Leu Arg Asp Gly Thr Arg Ser Tyr Phe Gly Ala Phe Met Val

545 550 555

<210> 6

<211> 373

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 6

Met Glu Pro Ala Gly Pro Ala Pro Gly Arg Leu Gly Pro Leu Leu Cys

1 5 10 15

Leu Leu Leu Ala Ala Ser Cys Ala Trp Ser Gly Val Ala Gly Glu Glu

20 25 30

Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala Ala Gly

35 40 45

Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro Val Gly

50 55 60

Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu Ile Tyr

65 70 75 80

Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Asp Leu

85 90 95

Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn Ile Thr

100 105 110

Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly Ser

115 120 125

Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val

130 135 140

Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala Arg Ala

145 150 155 160

Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly Phe Ser

165 170 175

Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu Leu Ser

180 185 190

Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser Tyr Ser

195 200 205

Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val His Ser

210 215 220

Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp Pro Leu

225 230 235 240

Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro Thr Leu

245 250 255

Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn Val Thr

260 265 270

Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr Trp Leu

275 280 285

Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val Thr Glu

290 295 300

Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val Asn Val

305 310 315 320

Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu His Asp

325 330 335

Gly Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser Ala His

340 345 350

Pro Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ala Glu Asn Thr Gly Ser Asn

355 360 365

Glu Arg Asn Ile Tyr

370

<210> 7

<211> 343

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 7

Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala

1 5 10 15

Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro

20 25 30

Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser

50 55 60

Asp Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn

65 70 75 80

Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys

85 90 95

Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu

100 105 110

Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala

115 120 125

Arg Ala Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly

130 135 140

Phe Ser Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu

145 150 155 160

Leu Ser Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser

165 170 175

Tyr Ser Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val

180 185 190

His Ser Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp

195 200 205

Pro Leu Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro

210 215 220

Thr Leu Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn

225 230 235 240

Val Thr Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr

245 250 255

Trp Leu Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val

260 265 270

Thr Glu Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val

275 280 285

Asn Val Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu

290 295 300

His Asp Gly Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser

305 310 315 320

Ala His Pro Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ala Glu Asn Thr Gly

325 330 335

Ser Asn Glu Arg Asn Ile Tyr

340

<210> 8

<211> 759

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 8

Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala

1 5 10 15

Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro

20 25 30

Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser

50 55 60

Asp Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn

65 70 75 80

Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys

85 90 95

Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu

100 105 110

Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala

115 120 125

Arg Ala Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly

130 135 140

Phe Ser Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu

145 150 155 160

Leu Ser Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser

165 170 175

Tyr Ser Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val

180 185 190

His Ser Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp

195 200 205

Pro Leu Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro

210 215 220

Thr Leu Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn

225 230 235 240

Val Thr Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr

245 250 255

Trp Leu Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val

260 265 270

Thr Glu Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val

275 280 285

Asn Val Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu

290 295 300

His Asp Gly Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser

305 310 315 320

Ala His Pro Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ala Glu Asn Thr Gly

325 330 335

Ser Asn Glu Arg Asn Ile Tyr Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro

340 345 350

Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

355 360 365

Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

370 375 380

Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn

385 390 395 400

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

405 410 415

Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

420 425 430

Leu His Gln Asp Trp Leu Ser Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

435 440 445

Ser Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Asn Ala Thr

450 455 460

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu

465 470 475 480

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

485 490 495

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

500 505 510

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

515 520 525

Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly

530 535 540

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

545 550 555 560

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Ile Glu Gly Arg Met

565 570 575

Asp Leu Gln Leu His Trp Arg Leu Gly Glu Met Val Thr Arg Leu Pro

580 585 590

Asp Gly Pro Ala Gly Ser Trp Glu Gln Leu Ile Gln Glu Arg Arg Ser

595 600 605

His Glu Val Asn Pro Ala Ala His Leu Thr Gly Ala Asn Ser Ser Leu

610 615 620

Thr Gly Ser Gly Gly Pro Leu Leu Trp Glu Thr Gln Leu Gly Leu Ala

625 630 635 640

Phe Leu Arg Gly Leu Ser Tyr His Asp Gly Ala Leu Val Val Thr Lys

645 650 655

Ala Gly Tyr Tyr Tyr Ile Tyr Ser Lys Val Gln Leu Gly Gly Val Gly

660 665 670

Cys Pro Leu Gly Leu Ala Ser Thr Ile Thr His Gly Leu Tyr Lys Arg

675 680 685

Thr Pro Arg Tyr Pro Glu Glu Leu Glu Leu Leu Val Ser Gln Gln Ser

690 695 700

Pro Cys Gly Arg Ala Thr Ser Ser Ser Arg Val Trp Trp Asp Ser Ser

705 710 715 720

Phe Leu Gly Gly Val Val His Leu Glu Ala Gly Glu Lys Val Val Val

725 730 735

Arg Val Leu Asp Glu Arg Leu Val Arg Leu Arg Asp Gly Thr Arg Ser

740 745 750

Tyr Phe Gly Ala Phe Met Val

755

<210> 9

<211> 141

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 9

Met Arg Trp Cys Leu Leu Leu Ile Trp Ala Gln Gly Leu Arg Gln Ala

1 5 10 15

Pro Leu Ala Ser Gly Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn

20 25 30

Ile Ser Ala Glu Lys Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser

35 40 45

Ser Thr Thr Ala Gln Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln

50 55 60

Leu Leu Ala Ile Cys Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser

65 70 75 80

Phe Lys Asp Arg Val Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln

85 90 95

Ser Leu Thr Val Asn Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr

100 105 110

Tyr Pro Asp Gly Thr Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu

115 120 125

Ser Ser Val Ala Glu His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro

130 135 140

<210> 10

<211> 120

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 10

Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys

1 5 10 15

Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln

20 25 30

Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Cys

35 40 45

Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val

50 55 60

Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn

65 70 75 80

Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr

85 90 95

Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu

100 105 110

His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro

115 120

<210> 11

<211> 536

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 11

Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys

1 5 10 15

Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln

20 25 30

Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Cys

35 40 45

Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val

50 55 60

Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn

65 70 75 80

Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr

85 90 95

Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu

100 105 110

His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro

115 120 125

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

130 135 140

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

145 150 155 160

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe

165 170 175

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

180 185 190

Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

195 200 205

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Ser Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

210 215 220

Ser Ser Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Asn Ala

225 230 235 240

Thr Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln

245 250 255

Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

260 265 270

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

275 280 285

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

290 295 300

Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu

305 310 315 320

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His

325 330 335

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Ile Glu Gly Arg

340 345 350

Met Asp Leu Gln Leu His Trp Arg Leu Gly Glu Met Val Thr Arg Leu

355 360 365

Pro Asp Gly Pro Ala Gly Ser Trp Glu Gln Leu Ile Gln Glu Arg Arg

370 375 380

Ser His Glu Val Asn Pro Ala Ala His Leu Thr Gly Ala Asn Ser Ser

385 390 395 400

Leu Thr Gly Ser Gly Gly Pro Leu Leu Trp Glu Thr Gln Leu Gly Leu

405 410 415

Ala Phe Leu Arg Gly Leu Ser Tyr His Asp Gly Ala Leu Val Val Thr

420 425 430

Lys Ala Gly Tyr Tyr Tyr Ile Tyr Ser Lys Val Gln Leu Gly Gly Val

435 440 445

Gly Cys Pro Leu Gly Leu Ala Ser Thr Ile Thr His Gly Leu Tyr Lys

450 455 460

Arg Thr Pro Arg Tyr Pro Glu Glu Leu Glu Leu Leu Val Ser Gln Gln

465 470 475 480

Ser Pro Cys Gly Arg Ala Thr Ser Ser Ser Arg Val Trp Trp Asp Ser

485 490 495

Ser Phe Leu Gly Gly Val Val His Leu Glu Ala Gly Glu Lys Val Val

500 505 510

Val Arg Val Leu Asp Glu Arg Leu Val Arg Leu Arg Asp Gly Thr Arg

515 520 525

Ser Tyr Phe Gly Ala Phe Met Val

530 535

<210> 12

<211> 254

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 12

Met Glu Tyr Ala Ser Asp Ala Ser Leu Asp Pro Glu Ala Pro Trp Pro

1 5 10 15

Pro Ala Pro Arg Ala Arg Ala Cys Arg Val Leu Pro Trp Ala Leu Val

20 25 30

Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Cys Ala Val Phe

35 40 45

Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser

50 55 60

Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp

65 70 75 80

Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val

85 90 95

Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp

100 105 110

Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu

115 120 125

Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe

130 135 140

Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser

145 150 155 160

Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala

165 170 175

Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala

180 185 190

Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala

195 200 205

Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His

210 215 220

Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val

225 230 235 240

Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu

245 250

<210> 13

<211> 205

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 13

Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala

1 5 10 15

Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro

20 25 30

Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala

35 40 45

Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro

50 55 60

Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp

65 70 75 80

Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe

85 90 95

Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val

100 105 110

Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala

115 120 125

Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg

130 135 140

Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly

145 150 155 160

Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala

165 170 175

Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr

180 185 190

Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu

195 200 205

<210> 14

<211> 559

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 14

Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys

1 5 10 15

Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln

20 25 30

Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Cys

35 40 45

Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val

50 55 60

Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn

65 70 75 80

Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr

85 90 95

Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu

100 105 110

His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro

115 120 125

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

130 135 140

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

145 150 155 160

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe

165 170 175

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

180 185 190

Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

195 200 205

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Ser Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

210 215 220

Ser Ser Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Asn Ala

225 230 235 240

Thr Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln

245 250 255

Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

260 265 270

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

275 280 285

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

290 295 300

Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu

305 310 315 320

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His

325 330 335

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Ile Glu Gly Arg

340 345 350

Met Asp Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly

355 360 365

Ser Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp

370 375 380

Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu

385 390 395 400

Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser

405 410 415

Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys

420 425 430

Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val

435 440 445

Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly

450 455 460

Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly

465 470 475 480

Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu

485 490 495

Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser

500 505 510

Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg

515 520 525

His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg

530 535 540

Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu

545 550 555

<210> 15

<211> 199

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 15

Met Thr Leu His Pro Ser Pro Ile Thr Cys Glu Phe Leu Phe Ser Thr

1 5 10 15

Ala Leu Ile Ser Pro Lys Met Cys Leu Ser His Leu Glu Asn Met Pro

20 25 30

Leu Ser His Ser Arg Thr Gln Gly Ala Gln Arg Ser Ser Trp Lys Leu

35 40 45

Trp Leu Phe Cys Ser Ile Val Met Leu Leu Phe Leu Cys Ser Phe Ser

50 55 60

Trp Leu Ile Phe Ile Phe Leu Gln Leu Glu Thr Ala Lys Glu Pro Cys

65 70 75 80

Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser Lys Trp Gln Met Ala Ser Ser

85 90 95

Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser Asp Trp Lys Leu Glu Ile Leu

100 105 110

Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln Val Ala Pro Asn Ala Asn

115 120 125

Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val Arg Leu Tyr Lys Asn Lys Asp

130 135 140

Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys Ile Gln Asn Val Gly Gly

145 150 155 160

Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr Ile Asp Leu Ile Phe Asn Ser

165 170 175

Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr Trp Gly Ile Ile Leu Leu

180 185 190

Ala Asn Pro Gln Phe Ile Ser

195

<210> 16

<211> 128

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 16

Gln Leu Glu Thr Ala Lys Glu Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu

1 5 10 15

Pro Ser Lys Trp Gln Met Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys

20 25 30

Val Ser Asp Trp Lys Leu Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Gln Val Ala Pro Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe

50 55 60

Glu Val Arg Leu Tyr Lys Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn

65 70 75 80

Lys Ser Lys Ile Gln Asn Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His Val Gly

85 90 95

Asp Thr Ile Asp Leu Ile Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu Lys Asn

100 105 110

Asn Thr Tyr Trp Gly Ile Ile Leu Leu Ala Asn Pro Gln Phe Ile Ser

115 120 125

<210> 17

<211> 482

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 17

Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys

1 5 10 15

Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln

20 25 30

Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Cys

35 40 45

Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val

50 55 60

Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn

65 70 75 80

Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr

85 90 95

Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu

100 105 110

His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro

115 120 125

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

130 135 140

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

145 150 155 160

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe

165 170 175

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

180 185 190

Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

195 200 205

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Ser Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

210 215 220

Ser Ser Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Asn Ala

225 230 235 240

Thr Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln

245 250 255

Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

260 265 270

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

275 280 285

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

290 295 300

Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu

305 310 315 320

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His

325 330 335

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Ile Glu Gly Arg

340 345 350

Met Asp Gln Leu Glu Thr Ala Lys Glu Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly

355 360 365

Pro Leu Pro Ser Lys Trp Gln Met Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val

370 375 380

Asn Lys Val Ser Asp Trp Lys Leu Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr

385 390 395 400

Leu Ile Tyr Gly Gln Val Ala Pro Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala

405 410 415

Pro Phe Glu Val Arg Leu Tyr Lys Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu

420 425 430

Thr Asp Lys Ser Lys Ile Gln Asn Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His

435 440 445

Val Gly Asp Thr Ile Asp Leu Ile Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu

450 455 460

Lys Asn Asn Thr Tyr Trp Gly Ile Ile Leu Leu Ala Asn Pro Gln Phe

465 470 475 480

Ile Ser

<210> 18

<211> 251

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 18

Met Ala Glu Asp Leu Gly Leu Ser Phe Gly Glu Thr Ala Ser Val Glu

1 5 10 15

Met Leu Pro Glu His Gly Ser Cys Arg Pro Lys Ala Arg Ser Ser Ser

20 25 30

Ala Arg Trp Ala Leu Thr Cys Cys Leu Val Leu Leu Pro Phe Leu Ala

35 40 45

Gly Leu Thr Thr Tyr Leu Leu Val Ser Gln Leu Arg Ala Gln Gly Glu

50 55 60

Ala Cys Val Gln Phe Gln Ala Leu Lys Gly Gln Glu Phe Ala Pro Ser

65 70 75 80

His Gln Gln Val Tyr Ala Pro Leu Arg Ala Asp Gly Asp Lys Pro Arg

85 90 95

Ala His Leu Thr Val Val Arg Gln Thr Pro Thr Gln His Phe Lys Asn

100 105 110

Gln Phe Pro Ala Leu His Trp Glu His Glu Leu Gly Leu Ala Phe Thr

115 120 125

Lys Asn Arg Met Asn Tyr Thr Asn Lys Phe Leu Leu Ile Pro Glu Ser

130 135 140

Gly Asp Tyr Phe Ile Tyr Ser Gln Val Thr Phe Arg Gly Met Thr Ser

145 150 155 160

Glu Cys Ser Glu Ile Arg Gln Ala Gly Arg Pro Asn Lys Pro Asp Ser

165 170 175

Ile Thr Val Val Ile Thr Lys Val Thr Asp Ser Tyr Pro Glu Pro Thr

180 185 190

Gln Leu Leu Met Gly Thr Lys Ser Val Cys Glu Val Gly Ser Asn Trp

195 200 205

Phe Gln Pro Ile Tyr Leu Gly Ala Met Phe Ser Leu Gln Glu Gly Asp

210 215 220

Lys Leu Met Val Asn Val Ser Asp Ile Ser Leu Val Asp Tyr Thr Lys

225 230 235 240

Glu Asp Lys Thr Phe Phe Gly Ala Phe Leu Leu

245 250

<210> 19

<211> 192

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 19

Arg Ala Gln Gly Glu Ala Cys Val Gln Phe Gln Ala Leu Lys Gly Gln

1 5 10 15

Glu Phe Ala Pro Ser His Gln Gln Val Tyr Ala Pro Leu Arg Ala Asp

20 25 30

Gly Asp Lys Pro Arg Ala His Leu Thr Val Val Arg Gln Thr Pro Thr

35 40 45

Gln His Phe Lys Asn Gln Phe Pro Ala Leu His Trp Glu His Glu Leu

50 55 60

Gly Leu Ala Phe Thr Lys Asn Arg Met Asn Tyr Thr Asn Lys Phe Leu

65 70 75 80

Leu Ile Pro Glu Ser Gly Asp Tyr Phe Ile Tyr Ser Gln Val Thr Phe

85 90 95

Arg Gly Met Thr Ser Glu Cys Ser Glu Ile Arg Gln Ala Gly Arg Pro

100 105 110

Asn Lys Pro Asp Ser Ile Thr Val Val Ile Thr Lys Val Thr Asp Ser

115 120 125

Tyr Pro Glu Pro Thr Gln Leu Leu Met Gly Thr Lys Ser Val Cys Glu

130 135 140

Val Gly Ser Asn Trp Phe Gln Pro Ile Tyr Leu Gly Ala Met Phe Ser

145 150 155 160

Leu Gln Glu Gly Asp Lys Leu Met Val Asn Val Ser Asp Ile Ser Leu

165 170 175

Val Asp Tyr Thr Lys Glu Asp Lys Thr Phe Phe Gly Ala Phe Leu Leu

180 185 190

<210> 20

<211> 549

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 20

Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys

1 5 10 15

Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln

20 25 30

Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Cys

35 40 45

Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val

50 55 60

Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn

65 70 75 80

Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr

85 90 95

Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu

100 105 110

His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro

115 120 125

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

130 135 140

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

145 150 155 160

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe

165 170 175

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

180 185 190

Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

195 200 205

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Ser Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

210 215 220

Ser Ser Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Asn Ala

225 230 235 240

Thr Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln

245 250 255

Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

260 265 270

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

275 280 285

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

290 295 300

Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu

305 310 315 320

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His

325 330 335

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Ile Glu Gly Arg

340 345 350

Met Asp Ser Gln Leu Arg Ala Gln Gly Glu Ala Cys Val Gln Phe Gln

355 360 365

Ala Leu Lys Gly Gln Glu Phe Ala Pro Ser His Gln Gln Val Tyr Ala

370 375 380

Pro Leu Arg Ala Asp Gly Asp Lys Pro Arg Ala His Leu Thr Val Val

385 390 395 400

Arg Gln Thr Pro Thr Gln His Phe Lys Asn Gln Phe Pro Ala Leu His

405 410 415

Trp Glu His Glu Leu Gly Leu Ala Phe Thr Lys Asn Arg Met Asn Tyr

420 425 430

Thr Asn Lys Phe Leu Leu Ile Pro Glu Ser Gly Asp Tyr Phe Ile Tyr

435 440 445

Ser Gln Val Thr Phe Arg Gly Met Thr Ser Glu Cys Ser Glu Ile Arg

450 455 460

Gln Ala Gly Arg Pro Asn Lys Pro Asp Ser Ile Thr Val Val Ile Thr

465 470 475 480

Lys Val Thr Asp Ser Tyr Pro Glu Pro Thr Gln Leu Leu Met Gly Thr

485 490 495

Lys Ser Val Cys Glu Val Gly Ser Asn Trp Phe Gln Pro Ile Tyr Leu

500 505 510

Gly Ala Met Phe Ser Leu Gln Glu Gly Asp Lys Leu Met Val Asn Val

515 520 525

Ser Asp Ile Ser Leu Val Asp Tyr Thr Lys Glu Asp Lys Thr Phe Phe

530 535 540

Gly Ala Phe Leu Leu

545

<210> 21

<211> 183

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 21

Met Glu Arg Val Gln Pro Leu Glu Glu Asn Val Gly Asn Ala Ala Arg

1 5 10 15

Pro Arg Phe Glu Arg Asn Lys Leu Leu Leu Val Ala Ser Val Ile Gln

20 25 30

Gly Leu Gly Leu Leu Leu Cys Phe Thr Tyr Ile Cys Leu His Phe Ser

35 40 45

Ala Leu Gln Val Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val

50 55 60

Gln Phe Thr Glu Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln

65 70 75 80

Lys Glu Asp Glu Ile Met Lys Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn

85 90 95

Cys Asp Gly Phe Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu

100 105 110

Val Asn Ile Ser Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln

115 120 125

Leu Lys Lys Val Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr

130 135 140

Tyr Lys Asp Lys Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu

145 150 155 160

Asp Asp Phe His Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn

165 170 175

Pro Gly Glu Phe Cys Val Leu

180

<210> 22

<211> 133

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 22

Gln Val Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val Gln Phe

1 5 10 15

Thr Glu Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln Lys Glu

20 25 30

Asp Glu Ile Met Lys Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn Cys Asp

35 40 45

Gly Phe Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu Val Asn

50 55 60

Ile Ser Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln Leu Lys

65 70 75 80

Lys Val Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr Tyr Lys

85 90 95

Asp Lys Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu Asp Asp

100 105 110

Phe His Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn Pro Gly

115 120 125

Glu Phe Cys Val Leu

130

<210> 23

<211> 487

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 23

Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys

1 5 10 15

Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln

20 25 30

Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Cys

35 40 45

Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val

50 55 60

Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn

65 70 75 80

Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr

85 90 95

Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu

100 105 110

His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro

115 120 125

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

130 135 140

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

145 150 155 160

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe

165 170 175

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

180 185 190

Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

195 200 205

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Ser Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

210 215 220

Ser Ser Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Asn Ala

225 230 235 240

Thr Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln

245 250 255

Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

260 265 270

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

275 280 285

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

290 295 300

Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu

305 310 315 320

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His

325 330 335

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Ile Glu Gly Arg

340 345 350

Met Asp Gln Val Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val

355 360 365

Gln Phe Thr Glu Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln

370 375 380

Lys Glu Asp Glu Ile Met Lys Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn

385 390 395 400

Cys Asp Gly Phe Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu

405 410 415

Val Asn Ile Ser Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln

420 425 430

Leu Lys Lys Val Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr

435 440 445

Tyr Lys Asp Lys Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu

450 455 460

Asp Asp Phe His Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn

465 470 475 480

Pro Gly Glu Phe Cys Val Leu

485

<210> 24

<211> 150

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 24

Met Lys Thr Leu Pro Ala Met Leu Gly Thr Gly Lys Leu Phe Trp Val

1 5 10 15

Phe Phe Leu Ile Pro Tyr Leu Asp Ile Trp Asn Ile His Gly Lys Glu

20 25 30

Ser Cys Asp Val Gln Leu Tyr Ile Lys Arg Gln Ser Glu His Ser Ile

35 40 45

Leu Ala Gly Asp Pro Phe Glu Leu Glu Cys Pro Val Lys Tyr Cys Ala

50 55 60

Asn Arg Pro His Val Thr Trp Cys Lys Leu Asn Gly Thr Thr Cys Val

65 70 75 80

Lys Leu Glu Asp Arg Gln Thr Ser Trp Lys Glu Glu Lys Asn Ile Ser

85 90 95

Phe Phe Ile Leu His Phe Glu Pro Val Leu Pro Asn Asp Asn Gly Ser

100 105 110

Tyr Arg Cys Ser Ala Asn Phe Gln Ser Asn Leu Ile Glu Ser His Ser

115 120 125

Thr Thr Leu Tyr Val Thr Asp Val Lys Ser Ala Ser Glu Arg Pro Ser

130 135 140

Lys Asp Glu Met Ala Ser

145 150

<210> 25

<211> 127

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 25

Lys Glu Ser Cys Asp Val Gln Leu Tyr Ile Lys Arg Gln Ser Glu His

1 5 10 15

Ser Ile Leu Ala Gly Asp Pro Phe Glu Leu Glu Cys Pro Val Lys Tyr

20 25 30

Cys Ala Asn Arg Pro His Val Thr Trp Cys Lys Leu Asn Gly Thr Thr

35 40 45

Cys Val Lys Leu Glu Asp Arg Gln Thr Ser Trp Lys Glu Glu Lys Asn

50 55 60

Ile Ser Phe Phe Ile Leu His Phe Glu Pro Val Leu Pro Asn Asp Asn

65 70 75 80

Gly Ser Tyr Arg Cys Ser Ala Asn Phe Gln Ser Asn Leu Ile Glu Ser

85 90 95

His Ser Thr Thr Leu Tyr Val Thr Asp Val Lys Ser Ala Ser Glu Arg

100 105 110

Pro Ser Lys Asp Glu Met Ala Ser Arg Pro Trp Leu Leu Tyr Arg

115 120 125

<210> 26

<211> 234

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 26

Met Asp Pro Gly Leu Gln Gln Ala Leu Asn Gly Met Ala Pro Pro Gly

1 5 10 15

Asp Thr Ala Met His Val Pro Ala Gly Ser Val Ala Ser His Leu Gly

20 25 30

Thr Thr Ser Arg Ser Tyr Phe Tyr Leu Thr Thr Ala Thr Leu Ala Leu

35 40 45

Cys Leu Val Phe Thr Val Ala Thr Ile Met Val Leu Val Val Gln Arg

50 55 60

Thr Asp Ser Ile Pro Asn Ser Pro Asp Asn Val Pro Leu Lys Gly Gly

65 70 75 80

Asn Cys Ser Glu Asp Leu Leu Cys Ile Leu Lys Arg Ala Pro Phe Lys

85 90 95

Lys Ser Trp Ala Tyr Leu Gln Val Ala Lys His Leu Asn Lys Thr Lys

100 105 110

Leu Ser Trp Asn Lys Asp Gly Ile Leu His Gly Val Arg Tyr Gln Asp

115 120 125

Gly Asn Leu Val Ile Gln Phe Pro Gly Leu Tyr Phe Ile Ile Cys Gln

130 135 140

Leu Gln Phe Leu Val Gln Cys Pro Asn Asn Ser Val Asp Leu Lys Leu

145 150 155 160

Glu Leu Leu Ile Asn Lys His Ile Lys Lys Gln Ala Leu Val Thr Val

165 170 175

Cys Glu Ser Gly Met Gln Thr Lys His Val Tyr Gln Asn Leu Ser Gln

180 185 190

Phe Leu Leu Asp Tyr Leu Gln Val Asn Thr Thr Ile Ser Val Asn Val

195 200 205

Asp Thr Phe Gln Tyr Ile Asp Thr Ser Thr Phe Pro Leu Glu Asn Val

210 215 220

Leu Ser Ile Phe Leu Tyr Ser Asn Ser Asp

225 230

<210> 27

<211> 172

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 27

Gln Arg Thr Asp Ser Ile Pro Asn Ser Pro Asp Asn Val Pro Leu Lys

1 5 10 15

Gly Gly Asn Cys Ser Glu Asp Leu Leu Cys Ile Leu Lys Arg Ala Pro

20 25 30

Phe Lys Lys Ser Trp Ala Tyr Leu Gln Val Ala Lys His Leu Asn Lys

35 40 45

Thr Lys Leu Ser Trp Asn Lys Asp Gly Ile Leu His Gly Val Arg Tyr

50 55 60

Gln Asp Gly Asn Leu Val Ile Gln Phe Pro Gly Leu Tyr Phe Ile Ile

65 70 75 80

Cys Gln Leu Gln Phe Leu Val Gln Cys Pro Asn Asn Ser Val Asp Leu

85 90 95

Lys Leu Glu Leu Leu Ile Asn Lys His Ile Lys Lys Gln Ala Leu Val

100 105 110

Thr Val Cys Glu Ser Gly Met Gln Thr Lys His Val Tyr Gln Asn Leu

115 120 125

Ser Gln Phe Leu Leu Asp Tyr Leu Gln Val Asn Thr Thr Ile Ser Val

130 135 140

Asn Val Asp Thr Phe Gln Tyr Ile Asp Thr Ser Thr Phe Pro Leu Glu

145 150 155 160

Asn Val Leu Ser Ile Phe Leu Tyr Ser Asn Ser Asp

165 170

<210> 28

<211> 261

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 28

Met Ile Glu Thr Tyr Asn Gln Thr Ser Pro Arg Ser Ala Ala Thr Gly

1 5 10 15

Leu Pro Ile Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu

20 25 30

Ile Thr Gln Met Ile Gly Ser Ala Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg

35 40 45

Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val

50 55 60

Phe Met Lys Thr Ile Gln Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser

65 70 75 80

Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gln Phe Glu Gly Phe Val Lys

85 90 95

Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu

100 105 110

Met Gln Lys Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser

115 120 125

Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly

130 135 140

Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln

145 150 155 160

Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr

165 170 175

Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser

180 185 190

Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala

195 200 205

Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His

210 215 220

Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn

225 230 235 240

Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe

245 250 255

Gly Leu Leu Lys Leu

260

<210> 29

<211> 215

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 29

His Arg Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp

1 5 10 15

Phe Val Phe Met Lys Thr Ile Gln Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser

20 25 30

Leu Ser Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gln Phe Glu Gly Phe

35 40 45

Val Lys Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu Asn Ser

50 55 60

Phe Glu Met Gln Lys Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val

65 70 75 80

Ile Ser Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu

85 90 95

Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly

100 105 110

Lys Gln Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln

115 120 125

Val Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile

130 135 140

Ala Ser Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu

145 150 155 160

Arg Ala Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser

165 170 175

Ile His Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe

180 185 190

Val Asn Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr

195 200 205

Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu

210 215

<210> 30

<211> 281

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 30

Met Gln Gln Pro Phe Asn Tyr Pro Tyr Pro Gln Ile Tyr Trp Val Asp

1 5 10 15

Ser Ser Ala Ser Ser Pro Trp Ala Pro Pro Gly Thr Val Leu Pro Cys

20 25 30

Pro Thr Ser Val Pro Arg Arg Pro Gly Gln Arg Arg Pro Pro Pro Pro

35 40 45

Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro

50 55 60

Pro Leu Pro Leu Pro Pro Leu Lys Lys Arg Gly Asn His Ser Thr Gly

65 70 75 80

Leu Cys Leu Leu Val Met Phe Phe Met Val Leu Val Ala Leu Val Gly

85 90 95

Leu Gly Leu Gly Met Phe Gln Leu Phe His Leu Gln Lys Glu Leu Ala

100 105 110

Glu Leu Arg Glu Ser Thr Ser Gln Met His Thr Ala Ser Ser Leu Glu

115 120 125

Lys Gln Ile Gly His Pro Ser Pro Pro Pro Glu Lys Lys Glu Leu Arg

130 135 140

Lys Val Ala His Leu Thr Gly Lys Ser Asn Ser Arg Ser Met Pro Leu

145 150 155 160

Glu Trp Glu Asp Thr Tyr Gly Ile Val Leu Leu Ser Gly Val Lys Tyr

165 170 175

Lys Lys Gly Gly Leu Val Ile Asn Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Val Tyr

180 185 190

Ser Lys Val Tyr Phe Arg Gly Gln Ser Cys Asn Asn Leu Pro Leu Ser

195 200 205

His Lys Val Tyr Met Arg Asn Ser Lys Tyr Pro Gln Asp Leu Val Met

210 215 220

Met Glu Gly Lys Met Met Ser Tyr Cys Thr Thr Gly Gln Met Trp Ala

225 230 235 240

Arg Ser Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr Ser Ala Asp His

245 250 255

Leu Tyr Val Asn Val Ser Glu Leu Ser Leu Val Asn Phe Glu Glu Ser

260 265 270

Gln Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu

275 280

<210> 31

<211> 179

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 31

Gln Leu Phe His Leu Gln Lys Glu Leu Ala Glu Leu Arg Glu Ser Thr

1 5 10 15

Ser Gln Met His Thr Ala Ser Ser Leu Glu Lys Gln Ile Gly His Pro

20 25 30

Ser Pro Pro Pro Glu Lys Lys Glu Leu Arg Lys Val Ala His Leu Thr

35 40 45

Gly Lys Ser Asn Ser Arg Ser Met Pro Leu Glu Trp Glu Asp Thr Tyr

50 55 60

Gly Ile Val Leu Leu Ser Gly Val Lys Tyr Lys Lys Gly Gly Leu Val

65 70 75 80

Ile Asn Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Val Tyr Phe Arg

85 90 95

Gly Gln Ser Cys Asn Asn Leu Pro Leu Ser His Lys Val Tyr Met Arg

100 105 110

Asn Ser Lys Tyr Pro Gln Asp Leu Val Met Met Glu Gly Lys Met Met

115 120 125

Ser Tyr Cys Thr Thr Gly Gln Met Trp Ala Arg Ser Ser Tyr Leu Gly

130 135 140

Ala Val Phe Asn Leu Thr Ser Ala Asp His Leu Tyr Val Asn Val Ser

145 150 155 160

Glu Leu Ser Leu Val Asn Phe Glu Glu Ser Gln Thr Phe Phe Gly Leu

165 170 175

Tyr Lys Leu

<210> 32

<400> 32

000

<210> 33

<400> 33

000

<210> 34

<400> 34

000

<210> 35

<400> 35

000

<210> 36

<211> 202

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 36

Met Phe Ser His Leu Pro Phe Asp Cys Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Thr Arg Ser Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu Val Gly Gln

20 25 30

Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu

35 40 45

Val Pro Val Cys Trp Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly

50 55 60

Asn Val Val Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser

65 70 75 80

Arg Tyr Trp Leu Asn Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val Ser Leu Thr

85 90 95

Ile Glu Asn Val Thr Leu Ala Asp Ser Gly Ile Tyr Cys Cys Arg Ile

100 105 110

Gln Ile Pro Gly Ile Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val

115 120 125

Ile Lys Pro Ala Lys Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg Gln Arg Asp Phe

130 135 140

Thr Ala Ala Phe Pro Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Gly Pro Ala

145 150 155 160

Glu Thr Gln Thr Leu Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr Gln Ile

165 170 175

Ser Thr Leu Ala Asn Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn Asp Leu

180 185 190

Arg Asp Ser Gly Ala Thr Ile Arg Ile Gly

195 200

<210> 37

<211> 181

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 37

Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu Val Gly Gln Asn Ala Tyr Leu Pro

1 5 10 15

Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu Val Pro Val Cys Trp

20 25 30

Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly Asn Val Val Leu Arg

35 40 45

Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser Arg Tyr Trp Leu Asn

50 55 60

Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val Ser Leu Thr Ile Glu Asn Val Thr

65 70 75 80

Leu Ala Asp Ser Gly Ile Tyr Cys Cys Arg Ile Gln Ile Pro Gly Ile

85 90 95

Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val Ile Lys Pro Ala Lys

100 105 110

Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg Gln Arg Asp Phe Thr Ala Ala Phe Pro

115 120 125

Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Gly Pro Ala Glu Thr Gln Thr Leu

130 135 140

Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr Gln Ile Ser Thr Leu Ala Asn

145 150 155 160

Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn Asp Leu Arg Asp Ser Gly Ala

165 170 175

Thr Ile Arg Ile Gly

180

<210> 38

<211> 150

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 38

Met Gly Ser Pro Gly Met Val Leu Gly Leu Leu Val Gln Ile Trp Ala

1 5 10 15

Leu Gln Glu Ala Ser Ser Leu Ser Val Gln Gln Gly Pro Asn Leu Leu

20 25 30

Gln Val Arg Gln Gly Ser Gln Ala Thr Leu Val Cys Gln Val Asp Gln

35 40 45

Ala Thr Ala Trp Glu Arg Leu Arg Val Lys Trp Thr Lys Asp Gly Ala

50 55 60

Ile Leu Cys Gln Pro Tyr Ile Thr Asn Gly Ser Leu Ser Leu Gly Val

65 70 75 80

Cys Gly Pro Gln Gly Arg Leu Ser Trp Gln Ala Pro Ser His Leu Thr

85 90 95

Leu Gln Leu Asp Pro Val Ser Leu Asn His Ser Gly Ala Tyr Val Cys

100 105 110

Trp Ala Ala Val Glu Ile Pro Glu Leu Glu Glu Ala Glu Gly Asn Ile

115 120 125

Thr Arg Leu Phe Val Asp Pro Asp Asp Pro Thr Gln Asn Arg Asn Arg

130 135 140

Ile Ala Ser Phe Pro Gly

145 150

<210> 39

<211> 128

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 39

Leu Ser Val Gln Gln Gly Pro Asn Leu Leu Gln Val Arg Gln Gly Ser

1 5 10 15

Gln Ala Thr Leu Val Cys Gln Val Asp Gln Ala Thr Ala Trp Glu Arg

20 25 30

Leu Arg Val Lys Trp Thr Lys Asp Gly Ala Ile Leu Cys Gln Pro Tyr

35 40 45

Ile Thr Asn Gly Ser Leu Ser Leu Gly Val Cys Gly Pro Gln Gly Arg

50 55 60

Leu Ser Trp Gln Ala Pro Ser His Leu Thr Leu Gln Leu Asp Pro Val

65 70 75 80

Ser Leu Asn His Ser Gly Ala Tyr Val Cys Trp Ala Ala Val Glu Ile

85 90 95

Pro Glu Leu Glu Glu Ala Glu Gly Asn Ile Thr Arg Leu Phe Val Asp

100 105 110

Pro Asp Asp Pro Thr Gln Asn Arg Asn Arg Ile Ala Ser Phe Pro Gly

115 120 125

<210> 40

<211> 281

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 40

Met Ala Met Met Glu Val Gln Gly Gly Pro Ser Leu Gly Gln Thr Cys

1 5 10 15

Val Leu Ile Val Ile Phe Thr Val Leu Leu Gln Ser Leu Cys Val Ala

20 25 30

Val Thr Tyr Val Tyr Phe Thr Asn Glu Leu Lys Gln Met Gln Asp Lys

35 40 45

Tyr Ser Lys Ser Gly Ile Ala Cys Phe Leu Lys Glu Asp Asp Ser Tyr

50 55 60

Trp Asp Pro Asn Asp Glu Glu Ser Met Asn Ser Pro Cys Trp Gln Val

65 70 75 80

Lys Trp Gln Leu Arg Gln Leu Val Arg Lys Met Ile Leu Arg Thr Ser

85 90 95

Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Gln Glu Lys Gln Gln Asn Ile Ser Pro

100 105 110

Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly

115 120 125

Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu

130 135 140

Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly

145 150 155 160

His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile

165 170 175

His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe

180 185 190

Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln

195 200 205

Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys

210 215 220

Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr

225 230 235 240

Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile

245 250 255

Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala

260 265 270

Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly

275 280

<210> 41

<211> 243

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 41

Thr Asn Glu Leu Lys Gln Met Gln Asp Lys Tyr Ser Lys Ser Gly Ile

1 5 10 15

Ala Cys Phe Leu Lys Glu Asp Asp Ser Tyr Trp Asp Pro Asn Asp Glu

20 25 30

Glu Ser Met Asn Ser Pro Cys Trp Gln Val Lys Trp Gln Leu Arg Gln

35 40 45

Leu Val Arg Lys Met Ile Leu Arg Thr Ser Glu Glu Thr Ile Ser Thr

50 55 60

Val Gln Glu Lys Gln Gln Asn Ile Ser Pro Leu Val Arg Glu Arg Gly

65 70 75 80

Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn

85 90 95

Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys

100 105 110

Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn

115 120 125

Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr

130 135 140

Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu Glu Ile Lys Glu

145 150 155 160

Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr

165 170 175

Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys

180 185 190

Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly

195 200 205

Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn

210 215 220

Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe

225 230 235 240

Leu Val Gly

<210> 42

<211> 543

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 42

Lys Glu Ser Cys Asp Val Gln Leu Tyr Ile Lys Arg Gln Ser Glu His

1 5 10 15

Ser Ile Leu Ala Gly Asp Pro Phe Glu Leu Glu Cys Pro Val Lys Tyr

20 25 30

Cys Ala Asn Arg Pro His Val Thr Trp Cys Lys Leu Asn Gly Thr Thr

35 40 45

Cys Val Lys Leu Glu Asp Arg Gln Thr Ser Trp Lys Glu Glu Lys Asn

50 55 60

Ile Ser Phe Phe Ile Leu His Phe Glu Pro Val Leu Pro Asn Asp Asn

65 70 75 80

Gly Ser Tyr Arg Cys Ser Ala Asn Phe Gln Ser Asn Leu Ile Glu Ser

85 90 95

His Ser Thr Thr Leu Tyr Val Thr Asp Val Lys Ser Ala Ser Glu Arg

100 105 110

Pro Ser Lys Asp Glu Met Ala Ser Arg Pro Trp Leu Leu Tyr Arg Ser

115 120 125

Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly

130 135 140

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met

145 150 155 160

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln

165 170 175

Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

180 185 190

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr

195 200 205

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Ser Gly

210 215 220

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Ser Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile

225 230 235 240

Glu Lys Thr Ile Ser Asn Ala Thr Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

245 250 255

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

260 265 270

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

275 280 285

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

290 295 300

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val

305 310 315 320

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu

325 330 335

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

340 345 350

Leu Gly Lys Ile Glu Gly Arg Met Asp Leu Gln Leu His Trp Arg Leu

355 360 365

Gly Glu Met Val Thr Arg Leu Pro Asp Gly Pro Ala Gly Ser Trp Glu

370 375 380

Gln Leu Ile Gln Glu Arg Arg Ser His Glu Val Asn Pro Ala Ala His

385 390 395 400

Leu Thr Gly Ala Asn Ser Ser Leu Thr Gly Ser Gly Gly Pro Leu Leu

405 410 415

Trp Glu Thr Gln Leu Gly Leu Ala Phe Leu Arg Gly Leu Ser Tyr His

420 425 430

Asp Gly Ala Leu Val Val Thr Lys Ala Gly Tyr Tyr Tyr Ile Tyr Ser

435 440 445

Lys Val Gln Leu Gly Gly Val Gly Cys Pro Leu Gly Leu Ala Ser Thr

450 455 460

Ile Thr His Gly Leu Tyr Lys Arg Thr Pro Arg Tyr Pro Glu Glu Leu

465 470 475 480

Glu Leu Leu Val Ser Gln Gln Ser Pro Cys Gly Arg Ala Thr Ser Ser

485 490 495

Ser Arg Val Trp Trp Asp Ser Ser Phe Leu Gly Gly Val Val His Leu

500 505 510

Glu Ala Gly Glu Lys Val Val Val Arg Val Leu Asp Glu Arg Leu Val

515 520 525

Arg Leu Arg Asp Gly Thr Arg Ser Tyr Phe Gly Ala Phe Met Val

530 535 540

<210> 43

<211> 838

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 43

Val Pro Val Val Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys

1 5 10 15

Ser Pro Thr Ile Pro Leu Gln Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly

20 25 30

Val Thr Trp Gln His Gln Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro

35 40 45

Gly His Pro Leu Ala Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp

50 55 60

Gly Pro Arg Pro Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly

65 70 75 80

Leu Arg Ser Gly Arg Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu

85 90 95

Arg Gly Arg Gln Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg

100 105 110

Arg Ala Asp Ala Gly Glu Tyr Arg Ala Ala Val His Leu Arg Asp Arg

115 120 125

Ala Leu Ser Cys Arg Leu Arg Leu Arg Leu Gly Gln Ala Ser Met Thr

130 135 140

Ala Ser Pro Pro Gly Ser Leu Arg Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn

145 150 155 160

Cys Ser Phe Ser Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg

165 170 175

Asn Arg Gly Gln Gly Arg Val Pro Val Arg Glu Ser Pro His His His

180 185 190

Leu Ala Glu Ser Phe Leu Phe Leu Pro Gln Val Ser Pro Met Asp Ser

195 200 205

Gly Pro Trp Gly Cys Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser

210 215 220

Ile Met Tyr Asn Leu Thr Val Leu Gly Leu Glu Pro Pro Thr Pro Leu

225 230 235 240

Thr Val Tyr Ala Gly Ala Gly Ser Arg Val Gly Leu Pro Cys Arg Leu

245 250 255

Pro Ala Gly Val Gly Thr Arg Ser Phe Leu Thr Ala Lys Trp Thr Pro

260 265 270

Pro Gly Gly Gly Pro Asp Leu Leu Val Thr Gly Asp Asn Gly Asp Phe

275 280 285

Thr Leu Arg Leu Glu Asp Val Ser Gln Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Thr

290 295 300

Cys His Ile His Leu Gln Glu Gln Gln Leu Asn Ala Thr Val Thr Leu

305 310 315 320

Ala Ile Ile Thr Val Thr Pro Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gly Ser Leu

325 330 335

Gly Lys Leu Leu Cys Glu Val Thr Pro Val Ser Gly Gln Glu Arg Phe

340 345 350

Val Trp Ser Ser Leu Asp Thr Pro Ser Gln Arg Ser Phe Ser Gly Pro

355 360 365

Trp Leu Glu Ala Gln Glu Ala Gln Leu Leu Ser Gln Pro Trp Gln Cys

370 375 380

Gln Leu Tyr Gln Gly Glu Arg Leu Leu Gly Ala Ala Val Tyr Phe Thr

385 390 395 400

Glu Leu Ser Ser Pro Gly Ala Gln Arg Ser Gly Arg Ala Pro Gly Ala

405 410 415

Leu Pro Ala Gly His Leu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys

420 425 430

Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

435 440 445

Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

450 455 460

Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp

465 470 475 480

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

485 490 495

Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

500 505 510

His Gln Asp Trp Leu Ser Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Ser

515 520 525

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Asn Ala Thr Gly

530 535 540

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu

545 550 555 560

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

565 570 575

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

580 585 590

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

595 600 605

Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

610 615 620

Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

625 630 635 640

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Ile Glu Gly Arg Met Asp

645 650 655

Leu Gln Leu His Trp Arg Leu Gly Glu Met Val Thr Arg Leu Pro Asp

660 665 670

Gly Pro Ala Gly Ser Trp Glu Gln Leu Ile Gln Glu Arg Arg Ser His

675 680 685

Glu Val Asn Pro Ala Ala His Leu Thr Gly Ala Asn Ser Ser Leu Thr

690 695 700

Gly Ser Gly Gly Pro Leu Leu Trp Glu Thr Gln Leu Gly Leu Ala Phe

705 710 715 720

Leu Arg Gly Leu Ser Tyr His Asp Gly Ala Leu Val Val Thr Lys Ala

725 730 735

Gly Tyr Tyr Tyr Ile Tyr Ser Lys Val Gln Leu Gly Gly Val Gly Cys

740 745 750

Pro Leu Gly Leu Ala Ser Thr Ile Thr His Gly Leu Tyr Lys Arg Thr

755 760 765

Pro Arg Tyr Pro Glu Glu Leu Glu Leu Leu Val Ser Gln Gln Ser Pro

770 775 780

Cys Gly Arg Ala Thr Ser Ser Ser Arg Val Trp Trp Asp Ser Ser Phe

785 790 795 800

Leu Gly Gly Val Val His Leu Glu Ala Gly Glu Lys Val Val Val Arg

805 810 815

Val Leu Asp Glu Arg Leu Val Arg Leu Arg Asp Gly Thr Arg Ser Tyr

820 825 830

Phe Gly Ala Phe Met Val

835

<210> 44

<211> 597

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 44

Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu Val Gly Gln Asn Ala Tyr Leu Pro

1 5 10 15

Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu Val Pro Val Cys Trp

20 25 30

Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly Asn Val Val Leu Arg

35 40 45

Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser Arg Tyr Trp Leu Asn

50 55 60

Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val Ser Leu Thr Ile Glu Asn Val Thr

65 70 75 80

Leu Ala Asp Ser Gly Ile Tyr Cys Cys Arg Ile Gln Ile Pro Gly Ile

85 90 95

Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val Ile Lys Pro Ala Lys

100 105 110

Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg Gln Arg Asp Phe Thr Ala Ala Phe Pro

115 120 125

Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Gly Pro Ala Glu Thr Gln Thr Leu

130 135 140

Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr Gln Ile Ser Thr Leu Ala Asn

145 150 155 160

Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn Asp Leu Arg Asp Ser Gly Ala

165 170 175

Thr Ile Arg Ile Gly Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

180 185 190

Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

195 200 205

Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

210 215 220

Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr

225 230 235 240

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

245 250 255

Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

260 265 270

Gln Asp Trp Leu Ser Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Ser Lys

275 280 285

Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Asn Ala Thr Gly Gln

290 295 300

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met

305 310 315 320

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

325 330 335

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

340 345 350

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

355 360 365

Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val

370 375 380

Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

385 390 395 400

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Ile Glu Gly Arg Met Asp Leu

405 410 415

Gln Leu His Trp Arg Leu Gly Glu Met Val Thr Arg Leu Pro Asp Gly

420 425 430

Pro Ala Gly Ser Trp Glu Gln Leu Ile Gln Glu Arg Arg Ser His Glu

435 440 445

Val Asn Pro Ala Ala His Leu Thr Gly Ala Asn Ser Ser Leu Thr Gly

450 455 460

Ser Gly Gly Pro Leu Leu Trp Glu Thr Gln Leu Gly Leu Ala Phe Leu

465 470 475 480

Arg Gly Leu Ser Tyr His Asp Gly Ala Leu Val Val Thr Lys Ala Gly

485 490 495

Tyr Tyr Tyr Ile Tyr Ser Lys Val Gln Leu Gly Gly Val Gly Cys Pro

500 505 510

Leu Gly Leu Ala Ser Thr Ile Thr His Gly Leu Tyr Lys Arg Thr Pro

515 520 525

Arg Tyr Pro Glu Glu Leu Glu Leu Leu Val Ser Gln Gln Ser Pro Cys

530 535 540

Gly Arg Ala Thr Ser Ser Ser Arg Val Trp Trp Asp Ser Ser Phe Leu

545 550 555 560

Gly Gly Val Val His Leu Glu Ala Gly Glu Lys Val Val Val Arg Val

565 570 575

Leu Asp Glu Arg Leu Val Arg Leu Arg Asp Gly Thr Arg Ser Tyr Phe

580 585 590

Gly Ala Phe Met Val

595

<210> 45

<211> 569

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 45

Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys

1 5 10 15

Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln

20 25 30

Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Cys

35 40 45

Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val

50 55 60

Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn

65 70 75 80

Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr

85 90 95

Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu

100 105 110

His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro

115 120 125

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

130 135 140

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

145 150 155 160

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe

165 170 175

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

180 185 190

Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

195 200 205

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Ser Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

210 215 220

Ser Ser Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Asn Ala

225 230 235 240

Thr Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln

245 250 255

Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

260 265 270

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

275 280 285

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

290 295 300

Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu

305 310 315 320

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His

325 330 335

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Ile Glu Gly Arg

340 345 350

Met Asp His Arg Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His

355 360 365

Glu Asp Phe Val Phe Met Lys Thr Ile Gln Arg Cys Asn Thr Gly Glu

370 375 380

Arg Ser Leu Ser Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gln Phe Glu

385 390 395 400

Gly Phe Val Lys Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu

405 410 415

Asn Ser Phe Glu Met Gln Lys Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala

420 425 430

His Val Ile Ser Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp

435 440 445

Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu

450 455 460

Asn Gly Lys Gln Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr

465 470 475 480

Ala Gln Val Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro

485 490 495

Phe Ile Ala Ser Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile

500 505 510

Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln

515 520 525

Gln Ser Ile His Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser

530 535 540

Val Phe Val Asn Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly

545 550 555 560

Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu

565

<210> 46

<211> 217

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 46

Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Ser Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Ser Lys

85 90 95

Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Asn Ala Thr Gly Gln

100 105 110

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met

115 120 125

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

130 135 140

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

145 150 155 160

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

165 170 175

Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Trp Gln Glu Gly Asn Val

180 185 190

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

195 200 205

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

210 215

<210> 47

<211> 217

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 47

Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Thr Pro His

65 70 75 80

Ser Asp Trp Leu Ser Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Ser Lys

85 90 95

Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Asn Ala Thr Gly Gln

100 105 110

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met

115 120 125

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

130 135 140

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

145 150 155 160

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

165 170 175

Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Trp Gln Glu Gly Asn Val

180 185 190

Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

195 200 205

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

210 215

<210> 48

<211> 217

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 48

Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Ser Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Ser Lys

85 90 95

Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Asn Ala Thr Gly Gln

100 105 110

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met

115 120 125

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

130 135 140

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

145 150 155 160

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

165 170 175

Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val

180 185 190

Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

195 200 205

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

210 215

<210> 49

<211> 11

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 49

Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro

1 5 10

<210> 50

<211> 11

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 50

Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10

<210> 51

<211> 6

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 51

Ser Lys Tyr Gly Pro Pro

1 5

<210> 52

<211> 6

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 52

Ile Glu Gly Arg Met Asp

1 5

<210> 53

<211> 9

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 53

Gly Gly Gly Val Pro Arg Asp Cys Gly

1 5

<210> 54

<211> 15

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 54

Ile Glu Gly Arg Met Asp Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly

1 5 10 15

<210> 55

<211> 8

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 55

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 56

<211> 12

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 56

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

1 5 10

<210> 57

<211> 14

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 57

Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr

1 5 10

<210> 58

<211> 4

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 58

Gly Gly Ser Gly

1

<210> 59

<211> 12

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 59

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10

<210> 60

<211> 15

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 60

Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys

1 5 10 15

<210> 61

<211> 20

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 61

Glu Ala Ala Ala Arg Glu Ala Ala Ala Arg Glu Ala Ala Ala Arg Glu

1 5 10 15

Ala Ala Ala Arg

20

<210> 62

<211> 17

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 62

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala

1 5 10 15

Ser

<210> 63

<211> 9

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 63

Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly

1 5

<210> 64

<400> 64

000

<210> 65

<211> 6

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 65

Gly Ser Gly Ser Gly Ser

1 5

<210> 66

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 66

Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser

1 5 10

<210> 67

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 67

Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser

1 5

<210> 68

<211> 20

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 68

Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro

1 5 10 15

Ala Pro Ala Pro

20

<210> 69

<211> 4

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 69

Cys Pro Pro Cys

1

<210> 70

<211> 5

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 70

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 71

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 71

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 72

<211> 15

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 72

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 73

<211> 20

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 73

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser

20

<210> 74

<211> 25

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 74

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

20 25

<210> 75

<211> 30

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 75

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

20 25 30

<210> 76

<211> 35

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 76

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

20 25 30

Gly Gly Ser

35

<210> 77

<211> 40

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 77

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

20 25 30

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

35 40

<210> 78

<211> 16

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 78

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 79

<211> 8

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 79

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly

1 5

<210> 80

<211> 6

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 80

Gly Gly Gly Gly Gly Gly

1 5

<210> 81

<211> 5

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 81

Glu Ala Ala Ala Lys

1 5

<210> 82

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 82

Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys

1 5 10

<210> 83

<211> 15

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 83

Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys

1 5 10 15

<210> 84

<211> 12

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 84

Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala

1 5 10

<210> 85

<211> 17

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 85

Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys

1 5 10 15

Ala

<210> 86

<211> 22

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 86

Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys

1 5 10 15

Glu Ala Ala Ala Lys Ala

20

<210> 87

<211> 27

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 87

Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys

1 5 10 15

Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala

20 25

<210> 88

<211> 46

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 88

Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys

1 5 10 15

Glu Ala Ala Ala Lys Ala Leu Glu Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala

20 25 30

Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala

35 40 45

<210> 89

<211> 5

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 89

Pro Ala Pro Ala Pro

1 5

<210> 90

<211> 18

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 90

Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu Ala Gln Phe Arg Ser

1 5 10 15

Leu Asp

<210> 91

<211> 12

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 91

Gly Ser Ala Gly Ser Ala Ala Gly Ser Gly Glu Phe

1 5 10

<210> 92

<211> 5

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 92

Gly Gly Gly Ser Glu

1 5

<210> 93

<211> 5

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 93

Gly Ser Glu Ser Gly

1 5

<210> 94

<211> 5

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 94

Gly Ser Glu Gly Ser

1 5

<210> 95

<211> 35

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 95

Gly Glu Gly Gly Ser Gly Glu Gly Ser Ser Gly Glu Gly Ser Ser Ser

1 5 10 15

Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu

20 25 30

Gly Gly Ser

35

<210> 96

<211> 234

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 96

Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu

1 5 10 15

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

20 25 30

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

35 40 45

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

50 55 60

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

65 70 75 80

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Ser

85 90 95

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Ser Lys Gly Leu Pro Ser Ser

100 105 110

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Asn Ala Thr Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

115 120 125

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

130 135 140

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

145 150 155 160

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

165 170 175

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

180 185 190

Val Asp Lys Ser Ser Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

195 200 205

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

210 215 220

Ser Leu Gly Lys Ile Glu Gly Arg Met Asp

225 230

<210> 97

<211> 234

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 97

Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu

1 5 10 15

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu

20 25 30

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

35 40 45

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

50 55 60

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

65 70 75 80

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Thr Pro His Ser Asp Trp Leu Ser

85 90 95

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Ser Lys Gly Leu Pro Ser Ser

100 105 110

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Asn Ala Thr Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

115 120 125

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

130 135 140

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

145 150 155 160

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

165 170 175

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

180 185 190

Val Asp Lys Ser Ser Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

195 200 205

Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

210 215 220

Ser Leu Gly Lys Ile Glu Gly Arg Met Asp

225 230

<210> 98

<211> 234

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 98

Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu

1 5 10 15

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu

20 25 30

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

35 40 45

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

50 55 60

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

65 70 75 80

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Ser

85 90 95

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Ser Lys Gly Leu Pro Ser Ser

100 105 110

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Asn Ala Thr Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

115 120 125

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

130 135 140

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

145 150 155 160

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

165 170 175

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

180 185 190

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

195 200 205

Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

210 215 220

Ser Leu Gly Lys Ile Glu Gly Arg Met Asp

225 230

<210> 99

<211> 234

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 99

Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu

1 5 10 15

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

20 25 30

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

35 40 45

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

50 55 60

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

65 70 75 80

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Ser

85 90 95

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Ser Lys Gly Leu Pro Ser Ser

100 105 110

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Asn Ala Thr Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

115 120 125

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

130 135 140

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

145 150 155 160

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

165 170 175

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

180 185 190

Val Asp Lys Ser Ser Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

195 200 205

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

210 215 220

Ser Leu Gly Lys Ile Glu Gly Arg Met Asp

225 230

<210> 100

<211> 234

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 100

Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu

1 5 10 15

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu

20 25 30

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

35 40 45

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

50 55 60

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

65 70 75 80

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Thr Pro His Ser Asp Trp Leu Ser

85 90 95

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Ser Lys Gly Leu Pro Ser Ser

100 105 110

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Asn Ala Thr Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

115 120 125

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

130 135 140

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

145 150 155 160

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

165 170 175

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

180 185 190

Val Asp Lys Ser Ser Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

195 200 205

Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

210 215 220

Ser Leu Gly Lys Ile Glu Gly Arg Met Asp

225 230

<210> 101

<211> 234

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 101

Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu

1 5 10 15

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu

20 25 30

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

35 40 45

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

50 55 60

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

65 70 75 80

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Ser

85 90 95

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Ser Lys Gly Leu Pro Ser Ser

100 105 110

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Asn Ala Thr Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

115 120 125

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

130 135 140

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

145 150 155 160

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

165 170 175

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

180 185 190

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

195 200 205

Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

210 215 220

Ser Leu Gly Lys Ile Glu Gly Arg Met Asp

225 230

<---

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, в частности к новым иммуностимулирующим белкам, и может быть использовано в медицине. Изобретение позволяет получить химерные белки, в состав которых входят внеклеточные домены трансмембранных белков, в том числе белков TIGIT и/или LIGHT. Такие химерные белки способны к одновременному подавлению иммуноингибирующих сигналов и стимулированию иммунного ответа у субъекта в опухолевых клетках. Изобретение может быть использовано в качестве лекарственного средства при лечении раковых заболеваний. 10 н. и 37 з.п. ф-лы, 2 табл., 10 пр., 32 ил.

1. Химерный белок для одновременного подавления иммуноингибирующих сигналов и обеспечения иммуноактивирующих или костимулирующих сигналов, где химерный белок имеет следующую общую структуру:

N-конец – (a) – (b) – (c) – C-конец,

где:

(а) представляет собой первый домен, содержащий внеклеточный домен трансмембранного белка I типа, который представляет собой иммуноингибирующий сигнал, где трансмембранный белок представляет собой TIGIT и содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10,

(b) представляет собой линкер, содержащий по меньшей мере один остаток цистеина, способный образовывать дисульфидную связь, и

(c) представляет собой второй домен, содержащий внеклеточный домен трансмембранного белка II типа, обладающий иммуностимулирующими свойствами, где трансмембранный белок выбран из

4-1BBL и содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 13,

GITRL и содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16,

TL1A и содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19, и

LIGHT и содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, где:

линкер соединяет первый домен и второй домен и необязательно содержит один или несколько соединяющих линкеров, выбранных из SEQ ID NO: 49-95.

2. Химерный белок по п. 1, где второй домен представляет собой 4-1BBL.

3. Химерный белок по п. 1, где второй домен представляет собой GITRL.

4. Химерный белок по п. 1, где второй домен представляет собой TL1A.

5. Химерный белок по п. 1, где второй домен представляет собой LIGHT.

6. Химерный белок для одновременного подавления иммуноингибирующих сигналов и обеспечения иммуноактивирующих или костимулирующих сигналов, где химерный белок имеет следующую общую структуру:

N-конец – (a) – (b) – (c) – C-конец,

где:

(а) представляет собой первый домен, содержащий внеклеточный домен трансмембранного белка I типа, который представляет собой иммуноингибирующий сигнал, где трансмембранный белок выбран из

PD-1 и содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4,

CD172a(SIRPα) и содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7, и

TIGIT и содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10,

(b) представляет собой линкер, содержащий по меньшей мере один остаток цистеина, способный образовывать дисульфидную связь, и

(c) представляет собой второй домен, содержащий внеклеточный домен трансмембранного белка II типа, обладающий иммуностимулирующими свойствами, где трансмембранный белок представляет собой LIGHT и содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, где

линкер соединяет первый домен и второй домен и необязательно содержит один или несколько соединяющих линкеров, выбранных из SEQ ID NO: 49-95.

7. Химерный белок по п. 6, где первый домен представляет собой PD-1.

8. Химерный белок по п. 6, где первый домен представляет собой CD172a(SIRPα).

9. Химерный белок по п. 6, где первый домен представляет собой TIGIT.

10. Химерный белок по любому из пп. 1-9, где линкер представляет собой полипептид, выбранный из гибкой аминокислотной последовательности, шарнирной области IgG или последовательности антитела.

11. Химерный белок по любому из пп. 1-10, где линкер содержит Fc-домен шарнир-CH2-CH3, полученный из IgG4.

12. Химерный белок по п. 11, где Fc-домен шарнир-CH2-CH3 получен из человеческого IgG4.

13. Химерный белок по п. 11 или 12, где линкер содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 46 или SEQ ID NO: 47.

14. Химерный белок по п. 11 или 12, где линкер содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 48.

15. Химерный белок по любому из пп. 10-14, где линкер содержит один или несколько соединяющих линкеров, независимо выбранных из SEQ ID NO: 49-95.

16. Химерный белок по п. 15, где линкер содержит два или более соединяющих линкера, каждый из которых независимо выбран из SEQ ID NO: 49-95, где один соединяющий линкер является N-концевым относительно Fc-домена шарнир-CH2-CH3, а другой соединяющий линкер является C-концевым относительно Fc-домена шарнир-CH2-CH3.

17. Химерный белок по любому из пп. 1-16, представляющий собой рекомбинантный слитый белок.

18. Химерный белок по любому из пп. 1-17, способный создавать стабильный синапс между клетками.

19. Химерный белок по п. 18, где стабильный синапс между клетками обеспечивает пространственную ориентацию, способствующую уменьшению опухоли.

20. Химерный белок по п. 18 или 19, где пространственная ориентация приводит Т-клетки в положение для атаки опухолевых клеток и/или стерически предотвращает доставку опухолевыми клетками отрицательных сигналов, включая отрицательные сигналы помимо тех, которые маскируются химерным белком согласно изобретению.

21. Химерный белок по любому из пп. 1-20, где связывание одного из или обоих внеклеточных доменов с его соответствующим партнером по связыванию происходит с низкими скоростями диссоциации (K_off), что обеспечивает длительное взаимодействие рецептора и его лиганда.

22. Химерный белок по п. 21, где длительное взаимодействие обеспечивает устойчивый эффект маскирования отрицательного сигнала.

23. Химерный белок по п. 21 или 22, где длительное взаимодействие обеспечивает более длительный положительный сигнальный эффект.

24. Химерный белок по п. 23, где более длительный положительный сигнальный эффект обеспечивает адекватную стимуляцию эффекторной клетки для противоопухолевого действия.

25. Химерный белок по любому из пп. 21-24, где длительное взаимодействие обеспечивает пролиферацию Т-клеток и обеспечивает противоопухолевую атаку.

26. Химерный белок по любому из пп. 21-25, где длительное взаимодействие обеспечивает достаточную передачу сигнала для обеспечения высвобождения стимулирующих сигналов.

27. Химерный белок по п. 26, где стимулирующий сигнал представляет собой цитокин.

28. Химерный белок по п. 1, имеющий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотной последовательности одной из SEQ ID NO: 14, 17 или 20.

29. Химерный белок по п. 6, имеющий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотной последовательности одной из SEQ ID NO: 5, 8 или 11.

30. Нуклеиновая кислота, кодирующая химерный белок по любому из пп. 1-29.

31. Клетка-хозяин для получения химерного белка по любому из пп. 1-29, содержащая вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту по п. 30.

32. Фармацевтическая композиция для модуляции иммунного ответа пациента путем способствования иммунной стимуляции по сравнению с иммунным ингибированием, содержащая терапевтически эффективное количество химерного белка по любому из пп. 1-29.

33. Способ лечения рака, включающий введение эффективного количества фармацевтической композиции по п. 32 нуждающемуся в этом субъекту.

34. Способ модуляции иммунного ответа пациента путем способствования иммунной стимуляции по сравнению с иммунным ингибированием, включающий введение эффективного количества фармацевтической композиции по п. 32 нуждающемуся в этом субъекту.

35. Способ по п. 33 или 34, где Т-клетки пациента являются активированными.

36. Способ по любому из пп. 33-35, где у пациента имеется опухоль и предотвращается передача иммуносупрессивного сигнала одной или более опухолевыми клетками.

37. Способ лечения рака, включающий введение эффективного количества фармацевтической композиции нуждающемуся в этом субъекту, где фармацевтическая композиция содержит химерный белок, содержащий:

(а) первый домен, содержащий внеклеточный домен трансмембранного белка I типа, который представляет собой иммуноингибирующий сигнал, где трансмембранный белок представляет собой TIGIT и содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10,

(b) линкер, содержащий по меньшей мере один остаток цистеина, способный образовывать дисульфидную связь, и

(c) второй домен, содержащий внеклеточный домен трансмембранного белка II типа, обладающий иммуностимулирующими свойствами, где трансмембранный белок выбран из 4-1BBL и содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 13, GITRL и содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16, TL1A и содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19, и LIGHT и содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2.

38. Способ лечения рака, включающий введение эффективного количества фармацевтической композиции нуждающемуся в этом субъекту, где фармацевтическая композиция содержит химерный белок, содержащий:

(а) первый домен, содержащий внеклеточный домен трансмембранного белка I типа, который представляет собой иммуноингибирующий сигнал, где трансмембранный белок выбран из PD-1 и содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4, CD172a(SIRPα) и содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7, и TIGIT и содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10,

(b) линкер, содержащий по меньшей мере один остаток цистеина, способный образовывать дисульфидную связь, и

(c) второй домен, содержащий внеклеточный домен трансмембранного белка II типа, обладающий иммуностимулирующими свойствами, где трансмембранный белок представляет собой LIGHT и содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2.

39. Способ по п. 37 или 38, где Т-клетки субъекта активируются при связывании вторым доменом химерного белка, и:

(а) при связывании одной или более опухолевых клеток первым доменом химерного белка предотвращается передача ими иммуносупрессивного сигнала,

(b) достигается количественно измеримый цитокиновый ответ в периферической крови субъекта и/или

(c) уменьшается рост опухоли у нуждающегося в этом субъекта по сравнению с субъектом, получавшим лечение антителами к белку I типа или II типа или их соответствующим лигандам или рецепторам.

40. Способ по любому из пп. 33-39, стимулирующий передачу сигналов одним или более из LIGHT, 4-1BBL, GITRL и TL1A и активирующий антигенпрезентирующие клетки.

41. Способ по любому из пп. 33-40, уменьшающий количество или активность регуляторных Т-клеток (Treg) по сравнению с субъектами, не получавшими лечения, или субъектами, получавшими лечение антителами к белку I типа или II типа или их соответствующим лигандам или рецепторам.

42. Способ по любому из пп. 33-41, увеличивающий примирование эффекторных Т-клеток в дренирующих лимфатических узлах субъекта по сравнению с субъектами, не получавшими лечения, или субъектами, получавшими лечение антителами к белку I типа или II типа или их соответствующим лигандам или рецепторам.

43. Способ по любому из пп. 33-42, вызывающий общее снижение числа иммуносупрессивных клеток и сдвиг в сторону более воспалительного окружения опухоли по сравнению с субъектами, не получавшими лечения, или субъектами, получавшими лечение антителами к белку I типа или II типа или их соответствующим лигандам или рецепторам.

44. Химерный белок по любому из пп. 1-29 для применения в качестве лекарственного средства.

45. Химерный белок по любому из пп. 1-29 для применения при лечении рака.

46. Химерный белок по любому из пп. 1-29 для применения при лечении воспалительного заболевания.

47. Применение химерного белка по любому из пп. 1-29 при изготовлении лекарственного средства для модуляции иммунного ответа пациента путем способствования иммунной стимуляции по сравнению с иммунным ингибированием.