ХЕМОЭНЗИМНЫЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ALL-TRANS-ИЗОМЕРОВ СУБСТАНЦИЙ ЛЮТЕИНА И ЗЕАКСАНТИНА Российский патент 2022 года по МПК C07C69/78 C07C57/48 

Изобретение относится к фармации, в частности к химико-фармацевтической отрасли, касается способа получения транс-изомеров оптически активных субстанций и может использоваться для получения стандартных образцов и лекарственных препаратов на основе этих соединений.

Значительное число фармацевтических субстанций природного и синтетического происхождения существуют в форме цис- и транс-изомеров [http://grls.rosminzdrav.ru, ttp://femb.ru/femb/pharmacopea.php].

Известно, что в связи с разницей в геометрической конфигурации цис- и транс-изомеры, изомеры одного и того же вещества, обладают различным сродством к белкам-мишеням, а, следовательно, проявляют различный уровень фармакологической активности и токсичности [Cis-and Trans-Palmitoleic Acid Isomers Regulate Cholesterol Metabolism in Different Ways / Wen-wen Huang, Bi-hong Hong, Kai-kai Bai, Ran Tan, Ting Yang, Ji-peng Sun, Rui-zao Yi, Hao Wu // Original research article Front. Pharmacol. - 2020, https://doi.org/10.3389/fphar.2020.602115, The relative toxicity of brodifacoum enantiomers / Feinstein D.L., Gierzal K., Iqbal Α., Kalinin S., Ripper R., Lindeblad M., Zahkarov Α., Lyubimov Α., van Breemen R., Weinberg G., Rubinstein I. // Toxicol Lett. - 2019, Vol.15, №306, P. 61-65]. Кроме того, для соединений природного происхождения характерна «нативная» геометрическая конфигурация, в которой они преимущественно существуют и являются максимально биологически активными [Screening of In Vitro Health Benefits of Tangerine Tomatoes / Hartono Tanambell, Siew Young Quek, Karen Suzanne Bishop // Antioxidants. - 2019, Vol.8. P. 230 - 245, Compartmental and noncompartmental modeling of ¹³C-lycopene absorption, isomerization, and distribution kinetics in healthy adults / Nancy E. Moran, Morgan J. Cichon, Kenneth M. Riedl., Elizabeth M. Grainger, Steven J. Schwartz, Janet A. Novotny, John W. Erdman Jr., Steven K. Clinton // Am J Clin Nutr. - 2015. - Vol.102 (6), P. 1436-49].

Каротиноиды являются одним из классов природных соединений с максимальной вариабильностью изомерных форм, например, для лютеина и зеаксантина характерно существование R и S стереоизомеров по положению 3 и 3', а так же цис- и транс-изомеров по положениям 9, 9' и 13, 13'. «Нативной» конфигурацией для обоих соединений является трансформа, которая обеспечивает максимальное сродство с рецепторами, и, следовательно, биологическое действие [Horvath М.Р., George E.W., Tran Q.T., Baumgardner К., Zharov G., Lee S., Sharifzadeh H., Shihab S., Mattinson Т., Li В., Bernstein P.S./ Structure of the lutein-binding domain of human StARD3 at 1.74 resolution and model of a complex with lutein // Struct. Biol. Commun. 2016. Vol.72. N 8. P. 609-618., Jirayu Tanprasertsuk, Binxing Li, Paul S. Bernstein, Rohini Vishwanathan, Mary Ann Johnson, Leonard Poon, Elizabeth J. Johnson / Relationship between concentrations of lutein and StARD3among pediatric and geriatric human brain tissue // PLOS ONE. 2016. Vol. 11. N 7. е0159877]. Лютеин и зеаксантин способны подавлять возрастную макулярную дегенерацию, но при этом организм человека не способен синтезировать лютеин и зеаксантин de novo, что предопределяет их поступление только с пищей или в составе биодобавок и лекарственных средств [Johnson EJ, Maras JE, Rasmussen HM, Tucker KL. Intake of lutein and zeaxanthin differ with age, sex, and ethnicity. J Am Diet Assoc. 2010;110(9):1357-1362, Changes in carotenoid intake in the United States: the 1987 and 1992 National Health Interview Surveys / L. C. Nebeling, M. R. Forman, В. I. Graubard, R. A. Snyder // J Am Diet Assoc. 1997 Sep;97(9):991-6. doi: 10.1016/S0002-8223(97)00239-3].

Лютеин и зеаксантин получают или из растительных объектов, или синтетическим путем. Следует учитывать, что в процессе технологической обработки источников получения каротиноидов, например, экстракции, происходит частичный переход субстанций в цисформы, что влияет на их биодоступность и физиологическую активность и оказывает существенное влияние на проявление фармакологического эффекта лютеина и зеаксантина [Robert Aman, Jan Biehl, Reinhold Carle, JuËrgen Conrad, Uwe Beifuss, Andreas Schieber / Application of HPLC coupled with DAD, APcI-MS and NMR to the analysis of lutein and zeaxanthin stereoisomers in thermally processed vegetables // Food Chemistry 92 (2005) 753-763].

Другой, не менее важной проблемой использования субстанций с большим диапазоном изомерных форм, является получение образцов одного из типов изомеров с высоким уровнем чистоты. Этот момент значим в области создания стандартных образцов, которые обеспечивают не только аналитическую достоверность и воспроизводимость исследований, но и достоверность фармакологического эксперимента.

В периодической литературе опубликованы работы, посвященные использованию энзимов для синтеза эфиров каротиноидов, например, лютеина и ангидрида янтарной кислоты в диметилформамиде (ДМФ) [Synthesis of lutein esters using a novel biocatalyst of Candida antarctica lipase В covalently immobilized on functionalized graphitic carbon nitride nanosheets / Huijuan Shangguan, Shan Zhang, Xin Li, Qi Zhou, Jie Shi, Qianchun Deng, Fenghong Huang // Royal Society of Chemistry Advances. 2020.10, 8949-8957], дипальмитата лютеина [Enzymatic Synthesis of Lutein Dipalmitate in Organic Solvents / Rui Wang, Miao Hou, Yifei Zhang, Jun Ge, Zheng Liu // Catal Lett.2015.145:995-999, DOI 10.1007/s10562-015-1493-8], сложных эфиров астаксантина и лютеина [Патент РФ 2702005 Синтез полусинтетических производных природных лютеина и атаксантина / Печинский С.В., Курегян А.Г., Степанова Э.Ф. опубликовано 03.10.2019, Бюл. №28. - 2 с., Печинский С.В., Курегян А.Г., Оганесян Э.Т., Степанова Э.Ф. // Журн. общ. Химии. 2019. Т. 89 (5). С.721-725], сложных зеаксантина в присутствии биокатализаторов [Патент РФ 2739248 Синтез полусинтетических сложных эфиров природного зеаксантина / Печинский С.В., Курегян А.Г., Оганесян Э.Т. опубликовано 22.12.2020, Бюл. №36. - 2 с., Печинский С.В., Курегян А.Г., Оганесян Э.Т. // Журнал общей химии. 2020, Т. 90.(5).с.730-735], получение стереоселективных эфиров ретинолов, которые являются близкими к каротиноидам соединениями [Zhi-Qiang Liul, Ling-Mei Zhou, Peng Liu, Peter James Baker, Shan-Shan Liu, Ya-Ping Xue, Ming Xu, Yu-Guo Zheng / Efficient two-step chemo-enzymatic synthesis of all-trans-retinyl palmitate with high substrate concentration and product yield // Appl Microbiol Biotechnol DOI 10.1007/s00253-015-6825-5, Shang-Ming Huang, Hsin-Ju Li, Yung-Chuan Liu, Chia-Hung Kuo, Chwen-Jen Shieh / An Efficient Approach for Lipase-Catalyzed Synthesis of Retinyl Laurate Nutraceutical by Combining Ultrasound Assistance and Artificial Neural Network Optimization // Molecules. 2017 Nov 15;22(11):1972. doi: 10.3390/molecules22111972].

Однако все эти исследования преследуют цель получить сложные эфиры каротиноидов. Мы предлагаем двухступенчатый способ получения транс-изомеров субстанций зеаксантина и лютеина, при использовании которого образуются субстанции лютеина и зеаксантина, содержащие только один тип стереоизомера (рисунок 1).

За прототип был принят способ получения пальмитата ретинола [Zhi-Qiang Liul, Ling-Mei Zhou, Peng Liu, Peter James Baker, Shan-Shan Liu, Ya-Ping Xue, Ming Xu, Yu-Guo Zheng / Efficient two-step chemo-enzymatic synthesis of all-trans-retinyl palmitate with high substrate concentration and product yield // Appl Microbiol Biotechnol DOI 10.1007/s00253-015-6825-5] и лаурата ретинола [Shang-Ming Huang, Hsin-Ju Li, Yung-Chuan Liu, Chia-Hung Kuo, Chwen-Jen Shieh / An Efficient Approach for Lipase-Catalyzed Synthesis of Retinyl Laurate Nutraceutical by Combining Ultrasound Assistance and Artificial Neural Network Optimization // Molecules. 2017 Nov 15;22(11):1972. doi: 10.3390/molecules22111972].

Согласно описанию авторы [00253 Zhi-Qiang Liul, Ling-Mei Zhou, Peng Liu, Peter James Baker, Shan-Shan Liu, Ya-Ping Xue, Ming Xu, Yu-Guo Zheng / Efficient two-step chemo-enzymatic synthesis of all-trans-retinyl palmitate with high substrate concentration and product yield // Appl Microbiol Biotechnol DOI 10.1007/s00253-015-6825-5] в качестве исходного материала используют ретинилацета, подвергая его химическому гидролизу в присутствии 5 Μ раствора гидроксида калия с образования ретинола, а далее проводят опосредованную этерификацию ретинола пальмитиновой кислотой с получением полностью транс-ретинилпальмитата, в которой использовалась неводная среда - н-гексан, безводный сульфат натрия, количество липазы 0,3 г, температура синтеза 30°С, режим перемешивания -180 об./мин. Перекристаллизацию не прореагировавшей пальмитиновой кислоты проводили при -5°С в течение 12 ч, перекристаллизацию сложного эфира - при -7°С в течение 15 ч, перегоняя его из ацетонового фильтрата при 32°С.

Согласно описанию [Shang-Ming Huang, Hsin-Ju Li, Yung-Chuan Liu, Chia-Hung Kuo, Chwen-Jen Shieh / An Efficient Approach for Lipase-Catalyzed Synthesis of Retinyl Laurate Nutraceutical by Combining Ultrasound 10.3390/molecules22111972] синтез сложных эфиров ретинола и одноосновной предельной Assistance and Artificial Neural Network Optimization // Molecules.2017 Nov 15;22(11):1972. doi: лауриновой (додекановой кислотой (12:0)) проводился в присутствии энзима липазы Novozym 435 и в условиях ультразвуковой обработки реакционной среды с мощностью 120 Вт.

Заявляемое изобретение ставит своей целью предложить способ получения субстанций лютеина и зеаксантина в all-trans-форме:

лютеин all-trans-изомер (рисунок 1)

зеаксантин all-trans-изомер.

Существенными отличительными признаками изобретения являются следующие особенности:

1-й этап - для получения сложного эфира бензойной кислоты лютеина и зеаксантина используют:

лютеина или зеаксантина - 0,002 моль;

бензойную кислоту - 0,005 моль (0,6 г);

время проведения этерификации - 12 часов;

температура процесса - 37°С;

скорость вращения мешалки - 50 об/мин;

не прореагировавшую бензойную кислоту осаждают при 4°С;

перекристаллизацию бензоатов лютеина и зеаксантина проводят при 10°С;

2-й этап - стереосопряженный гидролиз бензоатов лютеина и зеаксантина:

щелочной агент - 10% спиртовой раствор гидроксида калия;

температура - 20-22°С;

время гидролиза - 30 минут;

скоростью вращения мешалки - 100 об/мин.

Подтверждение структуры полученных эфиров зеаксантина проведено - методом масс-спектрометрии:

all-trans-β,ε-каротин-3,3'-дибензоат.Масс-спектр, m/z: 777.4851 [Μ+Н]⁺(вычислено для C₅₄H_б4O₄H⁺: 777.4877).

all-trans-β,β-каротин-3,3'-дибензоат.Масс-спектр, m/z: 777.4853 [Μ+Н]⁺(вычислено для С₅₄H₆₄О₄H⁺777.4877).

all-trans-β,ε-каротин. Масс-спектр, m/z: 569.4334 [Μ+Н]⁺(вычислено для С₅₄H₆₄О₄H⁺569.4353).

all-trans-β,β-каротин. Масс-спектр, m/z: 569.4337 [Μ+Н]⁺(вычислено для C₅₄H_б4O₄H⁺569.4353).

Заявляемый способ предусматривает следующие стадии:

1-этап - получение all-trans-эфиров лютеина и зеаксантина в присутствии энантиоселективного энзима:

1) в 20 мл н-гексана растворяют 0,002 моль субстанций лютеина или зеаксантина, содержащих смеси цис- и танс-изомеров, добавляют избыток бензойной кислоты 0,005 моль (0,6 г) и 0,3 г Novozyme 435;

2) полученную реакционную смесь перемешивают в течение 12 часов при температуре 37°С со скоростью 50 об/мин;

3) после окончания реакции этерификации иммобилизированный фермент отделяют фильтрованием;

4) полученный фильтрат охлаждают при температуре 4°С, для отделения не прореагировавшей бензойной кислоты изомеров лютеина или зеаксантина, полученный раствор фильтруют;

5) к фильтрату прибавляют 80 мл ацетона и охлаждают при температуре 10°С в течение 12 часов. Кристаллы бензоатов лютеина и зеаксантина отделяют фильтрованием;

2-й этап - стереосопряженный гидролиз эфиров лютеина и зеаксантина:

6) к полученным эфирами прибавляют 20 мл спиртового раствора 10% калия гидроксида и перемешивают в течение 30 минут со скоростью 100 об/мин;

7) далее раствор помещают в делительную воронку и прибавляют 100 мл н-гексана, перемешивают 5 минут и отделяют верхний слой органического растворителя;

8) раствор промывают 5 раз водой очищенной, охлаждают при температуре 20°С в течение 12 часов. Транс-изомеры лютеина или зеаксантина отделяют фильтрованием;

9) на всех этапах получения реакционные смеси предохраняют от действия света и кислорода воздуха, учитывая высокую светочувствительность и способность к окислению лютеина и зеаксантина.

Пример получения субстанции лютеина в форме all-trans-изомерa: в 20 мл н-гексана растворяют 0,002 моль лютеина, добавляют избыток бензойной кислоты (0,005 моль, что соответствовало 0,6 г), 0,3 г Novozyme 435. Реакционную смесь перемешивают в течение 12 часов при температуре 37°С со скоростью 50 об/мин. После окончания реакции этерификации иммобилизированный фермент отделяют фильтрованием, полученный фильтрат охлаждают при температуре 4°С, для отделения не прореагировавшей бензойной кислоты и изомеров лютеина. Далее фильтруют полученный раствор, к фильтрату прибавляют 80 мл ацетона и охлаждают при температуре 10°С в течение 12 часов. Кристаллы бензоата лютеина отделяют фильтрованием. К полученному эфиру прибавляют 20 мл спиртового раствора 10% калия гидроксида и перемешивают в течение 30 минут со скоростью 100 об/мин. Затем раствор помещают в делительную воронку и прибавляют 100 мл н-гексана, перемешивают 5 минут и отделяют верхний слой органического растворителя. Раствор промывают 5 раз водой очищенной и анализируют методом ВЭЖХ. Полученный раствор охлаждают при температуре 20°С в течение 12 часов. Транс-изомеры лютеина отделяют фильтрованием. На всех этапах получения реакционные смеси предохраняют от действия света и кислорода воздуха, учитывая высокую светочувствительность и способность к окислению лютеина и зеаксантина.

Предлагаемый энантиоселективный способ получения субстанций лютеина и зеаксантина позволяет синтезировать all-trans-изомеры этих веществ. Полученные субстанции могут в дальнейшем быть использованы для разработки стандартных образцов необходимых в аналитических и фармакологических исследованиях, а также для разработки новых оригинальных отечественных лекарственных средств, предотвращающих возрастную макулярную дегенерацию.

Изобретение относится к синтезу all-trans-изомеров субстанций лютеина или зеаксантина, при котором на 1-м этапе для получения сложного эфира бензойной кислоты лютеина или зеаксантина в присутствии Новозима 435 используют лютеин или зеаксантин по 0,002 моль, бензойную кислоту - 0,005 моль (0,6 г), время проведения этерификации 12 часов, температура процесса 37°С, скорость вращения мешалки 50 об/мин, не прореагировавшую бензойную кислоту осаждают при 4°С, перекристаллизацию бензоатов лютеина или зеаксантина проводят при 10°С; на 2-м этапе проводят стереосопряженный гидролиз бензоатов лютеина или зеаксантина, используя щелочной агент - 10% спиртовой раствор гидроксида калия, при температуре 20-22°С, время гидролиза - 30 минут и скорость вращения мешалки - 100 об/мин. 1 пр., 1 ил.

Синтез all-trans-изомеров субстанций лютеина или зеаксантина, при котором на 1-м этапе для получения сложного эфира бензойной кислоты лютеина или зеаксантина в присутствии Новозима 435 используют лютеин или зеаксантин по 0,002 моль, бензойную кислоту - 0,005 моль (0,6 г), время проведения этерификации 12 часов, температура процесса 37°С, скорость вращения мешалки 50 об/мин, не прореагировавшую бензойную кислоту осаждают при 4°С, перекристаллизацию бензоатов лютеина или зеаксантина проводят при 10°С; на 2-м этапе проводят стереосопряженный гидролиз бензоатов лютеина или зеаксантина, используя щелочной агент - 10% спиртовой раствор гидроксида калия, при температуре 20-22°С, время гидролиза - 30 минут и скорость вращения мешалки - 100 об/мин.