Региоселективный энзимный синтез производных кверцетина и мирицетина Российский патент 2023 года по МПК C07D311/32 

зобретение относится к фармации, в частности, к химико-фармацевтической отрасли, касается региоселективного способа получения эфиров кверцетина и мирицетина и может использоваться для получения стандартных образцов и лекарственных препаратов на основе этих соединений.

Не смотря на более чем 70-летнюю современную историю изучения флавоноидов эти вторичные метаболиты растений, безусловно, являются самым изучаемым классом природных соединений. По данным базы «PubMed» количество статей посвященных флавоноидам за последние 10 лет увеличилось примерно в два раза: в 2011 году общее число публикаций по запросу «flavonoids» составило 6394 работ, а в 2021 - 12281 [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/?term=flavonoids&sort=pubdate&timeline=expanded]. Такой возрастающий интерес связан с обширным диапазоном активности [Flavonoids and Other Phenolic Compounds from Medicinal Plants for Pharmaceutical and Medical Aspects / Tungmunnithum Duangjai, Thongboonyou Areeya, Pholboon Apinan, Yangsabai Aujana // Medicine. 2018. 5(3), 93 109. doi:10.3390/medicines5030093; Shashank Kumar, Abhay K. Pandey Chemistry and Biological Activities of Flavonoids: An Overview. e Scientific World Journal, 2013, 1-16. https://doi.org/10.1155/2013/162750; Panche A., Diwan A., Chandra S. Flavonoids: An overview. / Journal of Nutritional Science. 2016. Vol. 5, E47. doi:10.1017/jns.2016.41] и увеличением научной доказательности фармакологических свойств флавоноидов, что закономерно ведет к росту числа исследований этого класса биологически активных соединений.

Однако вместе с этим многогранное изучение флавоноидов крайне редко выходит за переделы научного исследования и не приводит к созданию лекарственного препарата. Такой парадокс связан с тем, что природные флавоноиды зачастую проявляют более низкую фармакологическую активностью по сравнению с синтетическими соединениями, обладают неудовлетворительными фармакокинетическими свойствами, в частности, низкими показателями растворимости и абсорбции, быстро метаболизируют [Guowen Li; Xiaoli Zeng; Yan Xie; Zhenzhen Cai; Jeffrey C. Moore; Xiurong Yuan; Zhihong Cheng; Guang Ji (2012). Pharmacokinetic properties of isorhamnetin, kaempferol and quercetin after oral gavage of total flavones of Hippophae rhamnoides L. in rats using a UPLC-MS method. , 83(1), 182-191. doi:10.1016/j.fitote.2011.10.012].

Одной из эффективных тактик решения данной проблемы может стать направленная модификация структуры флавоноидов. Большинство получаемых из растительных источников флавоноидов находятся в форме О-гликозидов, биологическая активность и биодоступность которых зависит от положения конъюгированного углеводного остатка [Park, Kwang-Su; Kim, Hyungmi; Kim, Mi Kyoung; Kim, Kyungdo; Chong, Youhoon (2015). Synthesis and biological evaluation of flavonol-glucose conjugates for cosmeceutical development. Journal of the Korean Society for Applied Biological Chemistry, 58(3), 317-323. doi:10.1007/s13765-015-0049-3 ]. Введение в структуру сахаров могло бы решить часть задач по повышению эффективности и биодоступности флавоноидов, но необходимо учитывать, что гликозиды могут легко подвергаться гидролизу, как происходит, например, при их экстракции из растительных объектов [Hydrolysis of Glycosidic Flavonoids during the Preparation of Danggui Buxue Tang: An Outcome of Moderate Boiling of Chinese Herbal Mixture. Wendy Li Zhang, Jian-Ping Chen, Kelly Yin-Ching Lam, Janis Ya-Xian Zhan, Ping Yao, Tina Ting-Xia Dong, Karl Wah-Keung Tsim // Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. Volume 2014, Article ID 608721, 11 pages.https://doi.org/10.1155/2014/608721].

На наш взгляд получение сложных эфиров флавоноидов можно рассматривать как перспективный способ направленной модификации их структуры. Ранее нами были получены эфиры нарингенина, кверцетина, гесперетина по гидроксильным группам кольца В [Хемоэнзимный синтез сложных эфиров флавоноидов / С. В. Печинский, А. Г. Курегян, Э. Т. Оганесян // Журнал общей химии, 2022, том 92, № 8, с. 1200-1207. DOI: 10.31857/S0044460X22080066] и показана возможность региоселективного синтеза сложных эфиров нарингенина и кверцетина по положению 4′ и гесперетина - по положению 3′.

Следует отметить, что наиболее ключевым видом активности флавоноидов является антиоксидантная, которую большинство ученых связывают с тем, что эти соединения являются полифенолами. Гидроксильные группы в кольце В обусловливают наиболее выраженные антиоксидантные свойства, тогда как гидроксильная группа в положение 3 принимает наименьше участие в проявлении этого вида активности. Кроме того, образование эфиров по 3 положению приводит к наименьшему снижению антиоксидантных свойств исходных флавоноидов, но при этом и самая низкая подвижность водорода наблюдается именно в этом положении [Li, Wei; Wu, Huan; Liu, Benguo; Hou, Xuedan; Wan, Duanji; Lou, Wenyong; Zhao, Jian (2015). Highly efficient and regioselective synthesis of dihydromyricetin esters by immobilized lipase. Journal of Biotechnology, 199(), 31-37. doi:10.1016/j.jbiotec.2015.02.012; Benguo Liu; Wei Li; Tien An Nguyen; Jian Zhao (2012). Empirical, thermodynamic and quantum-chemical investigations of inclusion complexation between flavanones and (2-hydroxypropyl)-cyclodextrins, 134(2), 926-932. doi:10.1016/j.foodchem.2012.02.207]. В этой связи представляется логичным, что для получения эфиров в 3 положение необходимо предварительно заблокировать все более реакционно-способные гидроксильные группы. Важным аргументов в пользу этерификации флавоноидов по 3-му положению является и то, что изменение характера радикала в этом положение не окажет отрицательного влияния на фармакофоры - двойную связь в положение 2-3 и гидроксильные группы, но при этом, вероятней всего, будет увеличены стабильность и липофильность молекулы [Saskia A.B.E. Van Acker; Dirk-jan Van Den Berg; MichÈl N.J.L. Tromp; Désirée H. Griffioen; Wout P. Van Bennekom; Wim J.F. Van Der Vijgh; Aalt Bast (1996). Structural aspects of antioxidant activity of flavonoids. , 20(3), 331-342. doi:10.1016/0891-5849(95)02047-0; Laura Sardone; Bruno Pignataro; Francesco Castelli; Maria G Sarpietro; Giovanni Nicolosi; Giovanni Marletta (2004). Temperature and pressure dependence of quercetin-3-O-palmitate interaction with a model phospholipid membrane: film balance and scanning probe microscopy study. 271(2), 329-335. doi:10.1016/j.jcis.2003.11.037].

Еще одним важным процессом, который следует учитывать при модификации структуры флавоноидов, является окисление кверцетина и родственных ему соединений в процессе метаболизма :

В результате такого пути окисления флавоноиды теряют фармакологическую активность, т.к. происходит изменение структуры фармакофора [Enhanced Stability and Intracellular Accumulation of Quercetin by Protection of the Chemically or Metabolically Susceptible Hydroxyl Groups with a Pivaloxymethyl (POM) Promoiety / Kim Mi Kyoung; Park Kwang-Su; Lee Chaewoon; Park Hye Ri; Choo Hyunah; Chong Youhoon // J. Med. Chem. 2010, 53 (24), 8597-8607. doi:10.1021/jm101252m].

В связи свыше сказанным мы считаем, что синтез эфиров по 3 положению может играть ключевую роль в стабилизации кверцетина и мирицетина от окислительной деградации и имеет перспективы для создания новых оптимизированных молекул флавоноидов.

За прототип был принят способ получения 3-О-метилкверцетина и 7-O-бензоилкверцетина [US3661890A Preparation of quercetin derivatives. Leonard Jurd, Application filed by US Department of Agriculture USDA]. Согласно описанию в эксперименте в качестве исходного соединения использовали рутин. Авторы патента для получения 5,7,3',4'-бензоилпроизводных рутина использовали бензоилхлорид, реакцию проводили при комнатной температуре в течение 1 часа. Полученный продукт растворяли в кипящем этаноле и далее проводили кислотный гидролиз гликозида на водяной бане в течение 1 часа в присутствии кислоты соляной концентрированной. Далее концентрировали эфир в ацетоне, метилировали кипячением в присутствии диметилсульфата в среде ацетона, после чего гидролизовали эфирные связи в положениях 7,5, 3',4' в среде 15% раствора калия гидроксида в теплом метаноле. Продуктом синтеза являлся 3-О-метилкверцетин. Другой аспект прототипа касается получения 7-О-бензоилкверцетина, которое заключается в следующем: рутин растворяли в 5-10% водном растворе буры, добавляли избыточное по отношению к рутину количество моль бензоилхлорида, далее полученный 7-О-бензоилрутин подвергали кислотному гидролизу в присутствии соляной или серной кислот, нагревая на водяной бане до около 50-100°С, 7-O-бензоилкверцетин отделяли и перекристаллизовывали из смеси ацетон-метанол.

Заявляемое изобретение ставит своей целью синтез сложных эфиров флавоноидов по 3 положению после защиты не участвующих в синтезе гидроксильных групп, в частности, сложных эфиров:

кверцетина и салициловой кислоты;

кверцетина и 4-гидроксибензойной кислоты;

кверцетина и 2,6-дигидроксибензойной кислоты;

кверцетина и протокатеховой кислоты;

кверцетина и галловой кислоты;

мирицетина и салициловой кислоты;

мирицетина и 4-гидроксибензойной кислоты;

мирицетина и 2,6-дигидроксибензойной кислоты;

мирицетина и протокатеховой кислоты;

мирицетина и галловой кислоты;

Существенными отличительными признаками изобретения являются следующие особенности:

1-й этап - образование эфиров по всем гидроксильным группам флавоноида, с использованием реакции Шоттена-Баумана:

эфиры бензойной кислоты получены для кверцетина и мирицетина;

этерификация проводилась в течение 1 часа;

этерификация проводилась при температуре 35°С;

эфиры отделяются фильтрованием;

эфиры сушатся при температуре 60°С в термостате.

2-й этап - гидролиз сложноэфирной связи только в 3-м положении:

средой является ацетонитрил;

гидролиз проводят концентрированной серной кислотой;

скорость перемешивания реакционной среды - 200 об/мин;

температура процесса - 80°С;

время гидролиза - 2 часа.

3-й этап - этерификация по 3 положению:

нейтрализацию среды до рН=6 проводят 10% спиртовым раствором калия гидроксида;

используют биокатализатор - Novozyme 435;

в качестве кислот для этерификации используют:

2-гидроксибензойную (салициловую) кислоту,

4-гидроксибензойную кислоту,

2,6-дигидроксибензойную кислоту,

3,4-дигидроксибензойную (прокатеховую) кислоту,

3,4,5-тригидроксибензойную (галловую) кислоту;

температура синтеза - 50°С;

время синтеза - 6 часа.

скорость перемешивания реакционной среды - 120 об/мин;

4-й этап - щелочной гидролиз заблокированных гидроксильных групп с помощью:

10% спиртового раствора калия гидроксида;

нагревания при температуре 70°С;

в течение 7 минут;

с дальнейшей нейтрализацией 10% раствором серной кислоты;

промыванием хлороформом;

перекристаллизацией целевого продукта при температуре -10°С.

5-й этап - очистка целевого продукта:

полученный на 4-м этапе эфир растворяют в метаноле;

раствор пропускают через колонку, заполненную 5 г силикагеля;

промывают подвижной фазой, состоящей из смеси этилацетат-метанол 1:9 (объемные отношения);

целевой продукт сушат 2 часа;

режим сушки: давление - 25 мм рт. ст., температура - 60°С.

Установление структуры полученных эфиров проведено методом масс-спектрометрии:

Кверцетин-3-салицилат [2-(3,4-дигидроксифенил)-5,7-дигидрокси-4-оксо-4Н-хромен-3-ил 2-гидроксибензоат]. Масс-спектр, m/z: 423.04 [M + Н]⁺ (вычислено для С₂₂Н₁₅О₉⁺: 423.06).

Кверцетин-3-гидроксибензоат-4 [2-(3,4-дигидроксифенил)-5,7-дигидрокси-4-оксо-4Н-хромен-3-ил 4-гидроксибензоат]. Масс-спектр, m/z: 423.03 [M + Н]⁺ (вычислено для С₂₂Н₁₅О₉⁺: 423.06).

Кверцетин-3-дигидроксибензоат-2,6 [2-(3,4-дигидроксифенил)-5,7-дигидрокси-4-оксо-4Н-хромен-3-ил 2,6-дигидроксибензоат]. Масс-спектр, m/z: 439.30 [M + Н]⁺ (вычислено для С₂₂Н₁₅О₁₀⁺: 439.34).

Кверцетин-3-дигидроксибензоат-3,4 [2-(3,4-дигидроксифенил)-5,7-дигидрокси-4-оксо-4Н-хромен-3-ил 3,4-дигидроксибензоат]. Масс-спектр, m/z: 439.32 [M + Н]⁺ (вычислено для С₂₂Н₁₅О₁₀⁺: 439.34).

Кверцетин-3-тригидроксибензоат-3,4,5 [2-(3,4-дигидроксифенил)-5,7-дигидрокси-4-оксо-4Н-хромен-3-ил 3,4,5-тригидроксибензоат]. Масс-спектр, m/z: 455.29 [M + Н]⁺ (вычислено для С₂₂Н₁₅О₁₁⁺: 455.34).

Мирицетин-3-салицилат [5,7-дигидрокси-4-оксо-2-(3,4,5-тригидроксифенил)-4Н-хромен-3-ил 2-гидроксибензоат]. Масс-спектр, m/z: 439.29 [M + Н]⁺ (вычислено для С₂₂Н₁₅О₁₀⁺: 439.34).

Мирицетин-3-гидроксибензоат-4 [5,7-дигидрокси-4-оксо-2-(3,4,5-тригидроксифенил)-4Н-хромен-3-ил 4-гидроксибензоат]. Масс-спектр, m/z: 439.28 [M + Н]⁺ (вычислено для С₂₂Н₁₅О₁₀⁺: 439.34).

Мирицетин-3-дигидроксибензоат-2,6 [5,7-дигидрокси-4-оксо-2-(3,4,5-тригидроксифенил)-4Н-хромен-3-ил 2,6-дигидроксибензоат]. Масс-спектр, m/z: 454.29 [M + Н]⁺ (вычислено для С₂₂Н₁₅О₁₁⁺: 454.34).

Мирицетин-3-дигидроксибензоат-3,4 [5,7-дигидрокси-4-оксо-2-(3,4,5-тригидроксифенил)-4Н-хромен-3-ил 3,4-дигидроксибензоат]. Масс-спектр, m/z: 439.31 [M + Н]⁺ (вычислено для С₂₂Н₁₅О₁₁⁺: 454.34).

Мирицетин-3-тригидроксибензоат-3,4,5 [5,7-дигидрокси-4-оксо-2-(3,4,5-тригидроксифенил)-4Н-хромен-3-ил 3,4,5-тригидроксибензоат]. Масс-спектр, m/z: 470.30 [M + Н]⁺ (вычислено для С₂₂Н₁₅О₁₂⁺: 470.34).

Предлагаемый способ включает следующие стадии:

1-й этап - образование эфиров по всем гидроксильным группам, с использованием реакции Шоттена-Баумана и избытка бензоилхлорида в щелочной среде при температуре 35°С. Пентабензойный для кверцетина или гексабензойный для мирецитина эфир выпадают в виде осадка, отделяются фильтрованием, сушатся при температуре 60°С в термостате.

2-й этап - гидролиз сложноэфирной связи только в 3-м положении, что обеспечивает кислотный гидролиз в среде концентрированной серной кислоты при температуре 80°С в среде ацетонитрила в течение 2 часов.

3-й этап - этерификация по 3-му положению, которая включает нейтрализацию кислой среды 10% спиртовым раствором гидроксида калия до рН=6, добавление фермента Novozyme 435 и одной из соответствующих модельных кислот: 2-гидроксибензойной (салициловой), 4-гидроксибензойной, 2,6-дигидроксибензойной, 3,4-дигидроксибензойной (прокатеховой), 3,4,5-тригидроксибензойной (галловой) кислоты, реакцию проводят при температуре 50°С в течение 6 часов, после чего иммобилизированный фермент удаляется фильтрованием и может быть использован повторно.

4-й этап - гидролиз заблокированных гидроксильных групп с помощью щелочного гидролиза, а именно 10% спиртового раствора калия гидроксида и нагревания при температуре 70°С в течение 7 минут с дальнейшей нейтрализацией 10% раствором серной кислоты до нейтральной реакции среды, промыванием хлороформом и перекристаллизацией целевого продукта при температуре -10°С.

5-й этап - очистка целевого продукта предусматривает растворение эфира, полученного на 4-м этапе, в метаноле, дальнейшее пропускание раствора через колонку, заполненную 5 г силикагеля, и промывание подвижной фазой, состоящей из смеси этилацетат- метанол 1:9 (объемные отношения), сушку целевого продукта в течение 2 часов при давлении 25 мм рт. ст. и температуре 60°С.

Пример получения кверцетин-3-салицилата [2-(3,4-дигидроксифенил)-5,7-дигидрокси-4-оксо-4Н-хромен-3-ил 2-гидроксибензоат]: к раствору 2 ммоль кверцетина (0,604 г) в 500 мл 10% раствора калия карбоната прибавляют 20 ммоль бензоилхлорида (2,3 мл), после перемешивания в течение 1 часа при температуре 35°С полученный осадок отделяют фильтрованием, сушат при температуре 60°С в термостате. Полученный продукт растворяют в 200 мл ацетонитрила и прибавляют 12 мл концентрированной серной кислоты, реакционную среду перемешивают со скоростью 200 об/мин при температуре 80°С в течение двух часов. Далее раствор охлаждают, доводят до рН=6 10% спиртовым раствором калия гидроксида и прибавляют 0,5 г катализатора Novozyme 435 и 2 ммоль (0,276 г) 2-гидрроксибензойной (салициловой) кислоты. Реакционную смесь перемешивают в течение 6 часов при температуре 50°С со скоростью 120 об/мин. Полученный раствор фильтруют, добавляют 10 мл 10% спиртового раствора калия гидроксида и нагревают при температуре 70°С в течение 7 минут. После охлаждения реакционной смеси к ней прибавляют 10% серную кислоту до нейтральной реакции среды (рН=6), промывают хлороформом и перекристаллизовывают целевой эфир при температуре -10°С. Полученный продукт растворяют в метаноле и пропускают через колонку, заполненную силикагелем (5 г), используя в качестве подвижной фазы смесь этилацетат-метанол 1:9 (объемное отношение). Целевой продукт сушат в течение 2 часов при давлении 25 мм рт. ст. и температуре 60°С. Чистоту собираемой фракции контролируют методом ВЭЖХ.

Пример получения кверцетин-3-гидроксибензоата-4 [2-(3,4-дигидроксифенил)-5,7-дигидрокси-4-оксо-4Н-хромен-3-ил 4-гидроксибензоат]: к раствору 2 ммоль кверцетина (0,604 г) в 500 мл 10% раствора калия карбоната прибавляют 20 ммоль бензоилхлорида (2,3 мл), после перемешивания в течение 1 часа при температуре 35°С полученный осадок отделяют фильтрованием, сушат при температуре 60°С в термостате. Полученный продукт растворяют в 200 мл ацетонитрила и прибавляют 12 мл концентрированной серной кислоты, реакционную среду перемешивают со скоростью 200 об/мин при температуре 80°С в течение двух часов. Далее раствор охлаждают, доводят до рН=6 10% спиртовым раствором калия гидроксида и прибавляют 0,5 г катализатора Novozyme 435 и 2 ммоль (0,276 г) 4-гидроксибензойной кислоты (0,276 г). Реакционную смесь перемешивают в течение 6 часов при температуре 50°С со скоростью 120 об/мин. Полученный раствор фильтруют, добавляют 10 мл 10% спиртового раствора калия гидроксида и нагревают при температуре 70°С в течение 7 минут. После охлаждения реакционной смеси к ней прибавляют 10% серную кислоту до нейтральной реакции среды (рН=6), промывают хлороформом и перекристаллизовывают целевой эфир при температуре -10°С. Полученный продукт растворяют в метаноле и пропускают через колонку, заполненную силикагелем (5 г), используя в качестве подвижной фазы смесь этилацетат-метанол 1:9 (объемное отношение). Целевой продукт сушат в течение 2 часов при давлении 25 мм рт. ст. и температуре 60°С. Чистоту собираемой фракции контролируют методом ВЭЖХ.

Пример получения кверцетин-3-дигидроксибензоата-2,6 [2-(3,4-дигидроксифенил)-5,7-дигидрокси-4-оксо-4Н-хромен-3-ил 2,6-дигидроксибензоат]: к раствору 2 ммоль кверцетина (0,604 г) в 500 мл 10% раствора калия карбоната прибавляют 20 ммоль бензоилхлорида (2,3 мл), после перемешивания в течение 1 часа при температуре 35°С полученный осадок отделяют фильтрованием, сушат при температуре 60°С в термостате. Полученный продукт растворяют в 200 мл ацетонитрила и прибавляют 12 мл концентрированной серной кислоты, реакционную среду перемешивают со скоростью 200 об/мин при температуре 80°С в течение двух часов. Далее раствор охлаждают, доводят до рН=6 10% спиртовым раствором калия гидроксида и прибавляют 0,5 г катализатора Novozyme 435 и 2 ммоль (0,308 г) 2,6-дигидроксибензойной кислоты. Реакционную смесь перемешивают в течение 6 часов при температуре 50°С со скоростью 120 об/мин. Полученный раствор фильтруют, добавляют 10 мл 10% спиртового раствора калия гидроксида и нагревают при температуре 70°С в течение 7 минут. После охлаждения реакционной смеси к ней прибавляют 10% серную кислоту до нейтральной реакции среды (рН=6), промывают хлороформом и перекристаллизовывают целевой эфир при температуре -10°С. Полученный продукт растворяют в метаноле и пропускают через колонку, заполненную силикагелем (5 г), используя в качестве подвижной фазы смесь этилацетат-метанол 1:9 (объемное отношение). Целевой продукт сушат в течение 2 часов при давлении 25 мм рт. ст. и температуре 60°С. Чистоту собираемой фракции контролируют методом ВЭЖХ.

Пример получения кверцетин-3-дигидроксибензоата-3,4 [2-(3,4-дигидроксифенил)-5,7-дигидрокси-4-оксо-4Н-хромен-3-ил 3,4-дигидроксибензоат]: к раствору 2 ммоль кверцетина (0,604 г) в 500 мл 10% раствора калия карбоната прибавляют 20 ммоль бензоилхлорида (2,3 мл), после перемешивания в течение 1 часа при температуре 35°С полученный осадок отделяют фильтрованием, сушат при температуре 60°С в термостате. Полученный продукт растворяют в 200 мл ацетонитрила и прибавляют 12 мл концентрированной серной кислоты, реакционную среду перемешивают со скоростью 200 об/мин при температуре 80°С в течение двух часов. Далее раствор охлаждают, доводят до рН=6 10% спиртовым раствором калия гидроксида и прибавляют 0,5 г катализатора Novozyme 435 и 2 ммоль (0,308 г) протокатеховой кислоты. Реакционную смесь перемешивают в течение 6 часов при температуре 50°С со скоростью 120 об/мин. Полученный раствор фильтруют, добавляют 10 мл 10% спиртового раствора калия гидроксида и нагревают при температуре 70°С в течение 7 минут. После охлаждения реакционной смеси к ней прибавляют 10% серную кислоту до нейтральной реакции среды (рН=6), промывают хлороформом и перекристаллизовывают целевой эфир при температуре -10°С. Полученный продукт растворяют в метаноле и пропускают через колонку, заполненную силикагелем (5 г), используя в качестве подвижной фазы смесь этилацетат-метанол 1:9 (объемное отношение). Целевой продукт сушат в течение 2 часов при давлении 25 мм рт. ст. и температуре 60°С. Чистоту собираемой фракции контролируют методом ВЭЖХ.

Пример получения кверцетин-3-тригидроксибензоата-3,4,5 [2-(3,4-дигидроксифенил)-5,7-дигидрокси-4-оксо-4Н-хромен-3-ил 3,4,5-тригидроксибензоат]: к раствору 2 ммоль кверцетина (0,604 г) в 500 мл 10% раствора калия карбоната прибавляют 20 ммоль бензоилхлорида (2,3 мл), после перемешивания в течение 1 часа при температуре 35°С полученный осадок отделяют фильтрованием, сушат при температуре 60°С в термостате. Полученный продукт растворяют в 200 мл ацетонитрила и прибавляют 12 мл концентрированной серной кислоты, реакционную среду перемешивают со скоростью 200 об/мин при температуре 80°С в течение двух часов. Далее раствор охлаждают, доводят до рН=6 10% спиртовым раствором калия гидроксида и прибавляют 0,5 г катализатора Novozyme 435 и 2 ммоль (0,340 г) галловой кислоты. Реакционную смесь перемешивают в течение 6 часов при температуре 50°С со скоростью 120 об/мин. Полученный раствор фильтруют, добавляют 10 мл 10% спиртового раствора калия гидроксида и нагревают при температуре 70°С в течение 7 минут. После охлаждения реакционной смеси к ней прибавляют 10% серную кислоту до нейтральной реакции среды (рН=6), промывают хлороформом и перекристаллизовывают целевой эфир при температуре -10°С. Полученный продукт растворяют в метаноле и пропускают через колонку, заполненную силикагелем (5 г), используя в качестве подвижной фазы смесь этилацетат-метанол 1:9 (объемное отношение). Целевой продукт сушат в течение 2 часов при давлении 25 мм рт. ст. и температуре 60°С. Чистоту собираемой фракции контролируют методом ВЭЖХ.

Пример получения мирицетин-3-салицилата [5,7-дигидрокси-4-оксо-2-(3,4,5-тригидроксифенил)-4Н-хромен-3-ил 2-гидроксибензоат]: к раствору 2 ммоль мирицетина (0,636 г) в 500 мл 10% раствора калия карбоната прибавляют 20 ммоль бензоилхлорида (2,3 мл), после перемешивания в течение 1 часа при температуре 35°С полученный осадок отделяют фильтрованием, сушат при температуре 60°С в термостате. Полученный продукт растворяют в 200 мл ацетонитрила и прибавляют 12 мл концентрированной серной кислоты, реакционную среду перемешивают со скоростью 200 об/мин при температуре 80°С в течение двух часов. Далее раствор охлаждают, доводят до рН=6 10% спиртовым раствором калия гидроксида и прибавляют 0,5 г катализатора Novozyme 435 и 2 ммоль (0,276 г) 2-гидрроксибензойной (салициловой) кислоты. Реакционную смесь перемешивают в течение 6 часов при температуре 50°С со скоростью 120 об/мин. Полученный раствор фильтруют, добавляют 10 мл 10% спиртового раствора калия гидроксида и нагревают при температуре 70°С в течение 7 минут. После охлаждения реакционной смеси к ней прибавляют 10% серную кислоту до нейтральной реакции среды (рН=6), промывают хлороформом и перекристаллизовывают целевой эфир при температуре -10°С. Полученный продукт растворяют в метаноле и пропускают через колонку, заполненную силикагелем (5 г), используя в качестве подвижной фазы смесь этилацетат-метанол 1:9 (объемное отношение). Целевой продукт сушат в течение 2 часов при давлении 25 мм рт. ст. и температуре 60°С. Чистоту собираемой фракции контролируют методом ВЭЖХ.

Пример получения мирицетин-3-гидроксибензоата-4 [5,7-дигидрокси-4-оксо-2-(3,4,5-тригидроксифенил)-4Н-хромен-3-ил 4-гидроксибензоат]: к раствору 2 ммоль мирицетина (0,636 г) в 500 мл 10% раствора калия карбоната прибавляют 20 ммоль бензоилхлорида (2,3 мл), после перемешивания в течение 1 часа при температуре 35°С полученный осадок отделяют фильтрованием, сушат при температуре 60°С в термостате. Полученный продукт растворяют в 200 мл ацетонитрила и прибавляют 12 мл концентрированной серной кислоты, реакционную среду перемешивают со скоростью 200 об/мин при температуре 80°С в течение двух часов. Далее раствор охлаждают, доводят до рН=6 10% спиртовым раствором калия гидроксида и прибавляют 0,5 г катализатора Novozyme 435 и 2 ммоль (0,276 г) 4-гидроксибензойной кислоты (0,276 г). Реакционную смесь перемешивают в течение 6 часов при температуре 50°С со скоростью 120 об/мин. Полученный раствор фильтруют, добавляют 10 мл 10% спиртового раствора калия гидроксида и нагревают при температуре 70°С в течение 7 минут. После охлаждения реакционной смеси к ней прибавляют 10% серную кислоту до нейтральной реакции среды (рН=6), промывают хлороформом и перекристаллизовывают целевой эфир при температуре -10⁰С. Полученный продукт растворяют в метаноле и пропускают через колонку, заполненную силикагелем (5 г), используя в качестве подвижной фазы смесь этилацетат-метанол 1:9 (объемное отношение). Целевой продукт сушат в течение 2 часов при давлении 25 мм рт. ст. и температуре 60°С. Чистоту собираемой фракции контролируют методом ВЭЖХ.

Пример получения мирицетин-3-дигидроксибензоата-2,6 [5,7-дигидрокси-4-оксо-2-(3,4,5-тригидроксифенил)-4Н-хромен-3-ил 2,6-дигидроксибензоат]: к раствору 2 ммоль мирицетина (0,636 г) в 500 мл 10% раствора калия карбоната прибавляют 20 ммоль бензоилхлорида (2,3 мл), после перемешивания в течение 1 часа при температуре 35°С полученный осадок отделяют фильтрованием, сушат при температуре 60°С в термостате. Полученный продукт растворяют в 200 мл ацетонитрила и прибавляют 12 мл концентрированной серной кислоты, реакционную среду перемешивают со скоростью 200 об/мин при температуре 80°С в течение двух часов. Далее раствор охлаждают, доводят до рН=6 10% спиртовым раствором калия гидроксида и прибавляют 0,5 г катализатора Novozyme 435 и 2 ммоль (0,308 г) 2,6-дигидроксибензойной кислоты. Реакционную смесь перемешивают в течение 6 часов при температуре 50°С со скоростью 120 об/мин. Полученный раствор фильтруют, добавляют 10 мл 10% спиртового раствора калия гидроксида и нагревают при температуре 70°С в течение 7 минут. После охлаждения реакционной смеси к ней прибавляют 10% серную кислоту до нейтральной реакции среды (рН=6), промывают хлороформом и перекристаллизовывают целевой эфир при температуре -10°С. Полученный продукт растворяют в метаноле и пропускают через колонку, заполненную силикагелем (5 г), используя в качестве подвижной фазы смесь этилацетат-метанол 1:9 (объемное отношение). Целевой продукт сушат в течение 2 часов при давлении 25 мм рт. ст. и температуре 60°С. Чистоту собираемой фракции контролируют методом ВЭЖХ.

Пример получения мирицетин-3-дигидроксибензоата-3,4 [5,7-дигидрокси-4-оксо-2-(3,4,5-тригидроксифенил)-4Н-хромен-3-ил 3,4-дигидроксибензоат]: к раствору 2 ммоль мирицетина (0,636 г) в 500 мл 10% раствора калия карбоната прибавляют 20 ммоль бензоилхлорида (2,3 мл), после перемешивания в течение 1 часа при температуре 35°С полученный осадок отделяют фильтрованием, сушат при температуре 60°С в термостате. Полученный продукт растворяют в 200 мл ацетонитрила и прибавляют 12 мл концентрированной серной кислоты, реакционную среду перемешивают со скоростью 200 об/мин при температуре 80°С в течение двух часов. Далее раствор охлаждают, доводят до рН=6 10% спиртовым раствором калия гидроксида и прибавляют 0,5 г катализатора Novozyme 435 и 2 ммоль (0,308 г) протокатеховой кислоты. Реакционную смесь перемешивают в течение 6 часов при температуре 50°С со скоростью 120 об/мин. Полученный раствор фильтруют, добавляют 10 мл 10% спиртового раствора калия гидроксида и нагревают при температуре 70°С в течение 7 минут. После охлаждения реакционной смеси к ней прибавляют 10% серную кислоту до нейтральной реакции среды (рН=6), промывают хлороформом и перекристаллизовывают целевой эфир при температуре -10°С. Полученный продукт растворяют в метаноле и пропускают через колонку, заполненную силикагелем (5 г), используя в качестве подвижной фазы смесь этилацетат-метанол 1:9 (объемное отношение). Целевой продукт сушат в течение 2 часов при давлении 25 мм рт. ст. и температуре 60°С. Чистоту собираемой фракции контролируют методом ВЭЖХ.

Пример получения мирицетин-3-тригидроксибензоата-3,4,5 [5,7-дигидрокси-4-оксо-2-(3,4,5-тригидроксифенил)-4Н-хромен-3-ил 3,4,5-тригидроксибензоат]: к раствору 2 ммоль мирицетина (0,636 г) в 500 мл 10% раствора калия карбоната прибавляют 20 ммоль бензоилхлорида (2,3 мл), после перемешивания в течение 1 часа при температуре 35°С полученный осадок отделяют фильтрованием, сушат при температуре 60°С в термостате. Полученный продукт растворяют в 200 мл ацетонитрила и прибавляют 12 мл концентрированной серной кислоты, реакционную среду перемешивают со скоростью 200 об/мин при температуре 80°С в течение двух часов. Далее раствор охлаждают, доводят до рН=6 10% спиртовым раствором калия гидроксида и прибавляют 0,5 г катализатора Novozyme 435 и 2 ммоль (0,340 г) галловой кислоты. Реакционную смесь перемешивают в течение 6 часов при температуре 50°С со скоростью 120 об/мин. Полученный раствор фильтруют, добавляют 10 мл 10% спиртового раствора калия гидроксида и нагревают при температуре 70°С в течение 7 минут. После охлаждения реакционной смеси к ней прибавляют 10% серную кислоту до нейтральной реакции среды (рН=6), промывают хлороформом и перекристаллизовывают целевой эфир при температуре -10°С. Полученный продукт растворяют в метаноле и пропускают через колонку, заполненную силикагелем (5 г), используя в качестве подвижной фазы смесь этилацетат-метанол 1:9 (объемное отношение). Целевой продукт сушат в течение 2 часов при давлении 25 мм рт. ст. и температуре 60°С. Чистоту собираемой фракции контролируют методом ВЭЖХ.

Предлагаемый способ синтеза сложных эфиров кверцетина и мирицетина с модельными кислотами (2-гидроксибензойной (салициловой), 4-гидроксибензойной, 2,6-дигидроксибензойной, 3,4-дигидроксибензойной (прокатеховой), 3,4,5-тригидроксибензойн (галловой)) в дальнейшем может быть использован для получения новых оригинальных отечественных лекарственных средств.

Изобретение относится к фармации, в частности к химико-фармацевтической отрасли, и касается региоселективного способа получения сложных эфиров флавоноидов, выбранных из сложных эфиров кверцетина или мирицетина, и может использоваться для получения стандартных образцов и лекарственных препаратов на основе этих соединений. Предлагаемый способ включает следующие этапы: на 1-м этапе получают пентабензоат кверцетина или гексабензоат мирицетина при температуре 35°С в течение 1 часа; на 2-м этапе высушенные при температуре 60°С пентабензоат кверцетина или гексабензоат мирецитина растворяют в ацетонитриле, гидролизуют только по 3 положению, что обеспечивается нагреванием до 80°С, добавлением концентрированной серной кислоты, перемешиванием со скоростью 200 об/мин в течение 2 часов; на 3-м этапе проводят этерификацию по 3 положению, нейтрализуя среду до рН=6 10% спиртовым раствором калия гидроксида, используя биокатализатор Novozyme 435, в качестве кислот – или 2-гидроксибензойную (салициловую) кислоту, или 4-гидроксибензойную кислоту, или 2,6-дигидроксибензойную кислоту, или 3,4-дигидроксибензойную (прокатеховую) кислоту, или 3,4,5-тригидроксибензойную (галловую) кислоту, перемешивая реакционную среду со скоростью 120 об/мин при температуре 50°С в течение 6 часов; на 4-м этапе осуществляют щелочной гидролиз заблокированных гидроксильных групп с помощью 10% спиртового раствора калия гидроксида при температуре 70°С в течение 7 минут с дальнейшей нейтрализацией 10% раствором серной кислоты, промыванием хлороформом, перекристаллизацией целевого продукта при температуре -10°С; на 5-м этапе осуществляют очистку целевого продукта на колонке, заполненной 5 г силикагеля, путем промывания подвижной фазой, состоящей из смеси этилацетата-метанола, взятых в объемном отношении 1:9, и сушки в течение 2 часов при давлении – 25 мм рт.ст. и 60°С. Предлагаемый способ позволяет получать эфиры только по 3 положению кверцетина и мирицетина, что достигается путем предварительной химической блокировки всех более реакционно-способных гидроксильных групп. 10 пр.

Способ синтеза сложных эфиров флавоноидов, выбранных из сложных эфиров кверцетина или мирицетина, включающий следующие этапы:

на 1-м этапе получают пентабензоат кверцетина или гексабензоат мирицетина при температуре 35°С в течение 1 часа;

на 2-м этапе высушенные при температуре 60°С пентабензоат кверцетина или гексабензоат мирецитина растворяют в ацетонитриле, гидролизуют только по 3 положению, что обеспечивается нагреванием до 80°С, добавлением концентрированной серной кислоты, перемешиванием со скоростью 200 об/мин в течение 2 часов;

на 3-м этапе проводят этерификацию по 3 положению, нейтрализуя среду до рН=6 10% спиртовым раствором калия гидроксида, используя биокатализатор Novozyme 435, в качестве кислот – или 2-гидроксибензойную (салициловую) кислоту, или 4-гидроксибензойную кислоту, или 2,6-дигидроксибензойную кислоту, или 3,4-дигидроксибензойную (прокатеховую) кислоту, или 3,4,5-тригидроксибензойную (галловую) кислоту, перемешивая реакционную среду со скоростью 120 об/мин при температуре 50°С в течение 6 часов;

на 4-м этапе осуществляют щелочной гидролиз заблокированных гидроксильных групп с помощью 10% спиртового раствора калия гидроксида при температуре 70°С в течение 7 минут с дальнейшей нейтрализацией 10% раствором серной кислоты, промыванием хлороформом, перекристаллизацией целевого продукта при температуре -10°С;

на 5-м этапе осуществляют очистку целевого продукта на колонке, заполненной 5 г силикагеля, путем промывания подвижной фазой, состоящей из смеси этилацетата-метанола, взятых в объемном отношении 1:9, и сушки в течение 2 часов при давлении – 25 мм рт.ст. и 60°С.