Выделенный гуманизированный белок, связывающийся с гликопротеином VI человека, выделенное антитело, связывающееся с гликопротеином VI человека Российский патент 2022 года по МПК A61K39/395 A61P9/00 C07K16/28 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к лечению сердечно-сосудистых заболеваний. В частности, настоящее изобретение относится к способу лечения сердечно-сосудистого заболевания, включающему непрерывное введение нового антитела против гликопротеина VI человека или его фрагмента нуждающемуся в этом человеку.

Предпосылки создания изобретения

Острые нарушения коронарного и мозгового кровообращения в настоящее время являются основной причиной смерти в мире. Кроме того, общая частота рецидивов и смертельных случаев за 6-месячный период вслед за лечением после острого коронарного синдрома по-прежнему составляет 8-15%.

В случае острого коронарного синдрома с подъемом сегмента ST высокоэффективным является механическое лечение методом коронарной ангиопластики и введения стента с целью срочного восстановления кровотока в коронарной артерии, но это не предотвращает заболеваемость/смертность около у 15% пациентов в течение следующих 6 месяцев. Лечение тромболитиками, в основе которого лежит долгосрочная взаимосвязь фибринолитиков, антикоагулянтов и антиагрегантов, дает еще менее обнадеживающие результаты. Действительно, несмотря на улучшение лечения тромбоза, заболеваемость/смертность через 6 месяцев аналогична той, которая наблюдаются при остром коронарном синдроме без подъема сегмента ST.

Что касается ишемических нарушений мозгового кровообращения, их лечение по-прежнему очень ограничено из-за обычно запоздалого ухода за большинством пациентов и риска кровоизлияний, связанного с доступной в настоящее время антитромботической терапией.

Таким образом, по-прежнему существует клиническая потребность в улучшении лечения сердечнососудистых заболеваний и, в особенности, в новых молекулах с улучшенными свойствами по сравнению с доступными молекулами и в особых режимах дозирования при введении упомянутых молекул. Задачей, требующей решения, является получение молекул и создание протоколов введения с высокой эффективностью в отношении патологического тромбоза, но без риска кровотечения.

Чтобы выполнить на это требование, мишень должна играть большую роль в тромбообразовании, происходящем в пораженном сосуде, чем при физиологическом гемостазе, необходимом для ограничения кровотечения в здоровом сосуде. Это относится к тромбоциту гликопротеин VI, который, как продемонстрировано на животных, играет определенную роль в экспериментальном тромбозе, включая инсульт, ремоделировании сосудов, и крайне важен при тромбозе артерий, пораженных атеросклерозом.

В отличие от антагонистов интегрина αIIbβ3, которые в настоящее время используются при лечении тромбоза и ингибируют фазу окончательной активации тромбоцитов, т.е. агрегацию тромбоцитов, и от антагонистов рекрутинга тромбоцитов (ингибиторов аденозиндифосфатного рецептора P2Y12 и аспирина), GPVI вовлечен в несколько стадий формирования тромбоцитов: инициирование посредством взаимодействия с поврежденной стенкой сосуда, амплификацию посредством начальной активации тромбоцитов, приводящую к секреции вторичных агонистов, активацию интегринов и прокоагулянтную активность тромбоцитов, рост и стабилизацию посредством взаимодействия с фибрином (Mammadova и др., 2015, Blood, 126(5):683-91). Таким образом, антагонисты GPVI могут предотвращать не только агрегацию тромбоцитов, но и высвобождение вторичных агонистов, а также секрецию факторов роста и цитокинов, приводящую к развитию сосудистых поражений. Наконец, экспрессия GPVI ограничена тромбоцитами и мегакариоцитами и, следовательно, представляет собой в полной мере специфическую мишень для лечения тромбоза.

Соответственно, были разработаны антагонисты GPVI для лечения сердечнососудистых заболеваний.

В заявках WO 2001/000810 и WO 2003/008454 описан растворимый рекомбинантный белок GPVI, который представляет собой гибридный белок внеклеточного домена GPVI и Fc-домена Ig человека. Этот растворимый рекомбинантный белок GPVI конкурирует с тромбоцитом GPVI за связывание коллагена. Обнадеживающие результаты применения этого растворимого белка GPVI были впервые получены на мышиной модели тромбоза, но эти результаты не были подтверждены. Кроме того, этот подход имеет структурные, функциональные и фармакологические недостатки. Во-первых, это соединение представляет собой высокомолекулярный химерный белок (с молекулярной массой ~160 кДа). Мишенью GPVI-Fc является коллаген, обнаруженный в месте повреждения сосудов, количество и доступность которого плохо предсказуемы, и, следовательно, количество вводимого продукта является потенциальным недостатком применения GPVI-Fc. Другим недостатком может являться риск иммунизации против неоэпитопов, потенциально обнаруживаемых в гибридном белке.

Также описаны нейтрализующие моноклональные антитела против GPVI человека.

Например, в патентах ЕР 1224942 и ЕР 1228768 описано крысиное моноклональное антитело JAQ1 против GPVI, которое специфически связывает GPVI мыши, для лечения тромбоза. Антитело JAQ1 индуцирует необратимое поглощение рецептора GPVI тромбоцитами мыши.

В патенте ЕР 1538165 описано еще одно крысиное моноклональное антитело против GPVI (hGP 5С4), Fab-фрагмент которого, как обнаружено, оказывает выраженное ингибирующее действие на основные физиологические функции тромбоцитов, индуцированных стимуляцией коллагена: Fab hGP 5С4 полностью предотвращал стимуляцию маркеров опосредованной коллагеном физиологической активации PAC-I и CD62P-селектина, a Fab hGP 5С4 эффективно ингибировал агрегацию тромбоцитов человека ex vivo без какой-либо собственной активности. Однако 5С4 является крысиным антителом и, следовательно, имеет весьма ограниченный терапевтический потенциал.

В заявке WO 2005/111083 описаны четыре мышиных моноклональных антитела ОМ1, ОМ2, ОМ3 и ОМ4 против GPVI, которые, как было обнаружено, ингибируют связывание GPVI коллагена, индуцированную коллагеном секрецию и образование in vitro тромбоксана А2 (ТХА2), а также индуцированную коллагеном агрегацию ex vivo тромбоцитов после внутривенной инъекции яванским макакам. ОМ4 также, по-видимому, ингибирует тромбообразование на крысиной модели тромбоза.

В заявке WO 2001/000810 также описаны различные мышиные моноклональные антитела против GPVI, названные 8М14.3, 3F8.1, 9Е18.3, 3J24.2, 6Е12.3, 1Р10.2, 4L7.3, 7Н4.6, 9O12.2, 7Н14.1 и 9Е18.2, а также несколько scFv-фрагментов фаговых антител человека, названных А9, А10, С9, А4, С10, В4, С3 и D11. Было обнаружено, что некоторые из этих антител и scFv-фрагментов ингибируют связывание GPVI коллагена, включая антитела 8М14.3, 3F8.1, 9Е18.3, 3J24.2, 6Е12.3, 1Р10.2, 4L7.3, 7Н4.6 и 9012.2, и scFv-фрагменты А10, А4, С10, В4, С3 и D11. Кроме того, было обнаружено, что Fab-фрагменты 9012.2 полностью блокируют индуцированную коллагеном агрегацию и секрецию тромбоцитов, блокируют индуцированную фибрином агрегацию тромбоцитов, ингибируют прокоагулянтную активность стимулированных коллагеном или фибрином тромбоцитов и адгезию тромбоцитов с коллагеном или фибрином в статических условиях, ослабляют адгезию тромбоцитов и предотвращают тромбообразование в условиях артериального потока.

В заявке WO 2008/049928 описан полученный из 9012.2 scFv-фрагмент, состоящий из VH- и VL-доменов моноклонального антитела 9012.2, связанного посредством пептида (Gly₄Ser)₃.

Однако было показано, что ни одно из известных в настоящее время антител против GPVI не является эффективным in vivo для профилактики и/или лечения сердечнососудистых заболеваний. В частности, большинство антител против GPVI, о которых сообщалось, оказалист не приспособленными для разработки антитромботического средства для медицинского применения человеком, в особенности, из-за их животного происхождения.

В частности, сообщалось, что некоторые scFv-фрагменты фаговых антител человека против GPVI человека, обладают ингибирующей активностью, но их аффинность, по-видимому, является низкой. Более того, сшивание GPVI на поверхности тромбоцитов двухвалентным или многовалентным лигандом, таким как цельный IgG 9012.2, приводит к активации тромбоцитов посредством димеризации GPVI и сшивания GPVI с низкоаффинным Fc-рецептором (FcγRIIA). Напротив, одновалентные Fab- и scFv-фрагменты 9012.2 обладают ингибирующей активностью.

Однако эти фрагменты не могут использоваться в терапевтических целях из-за их размера и животного происхождения, что делает их иммуногенными для пациентов-людей. Кроме того, scFv-фрагменты имеют короткий период полувыведения, что ограничивает их терапевтический потенциал.

Таким образом, по-прежнему существует потребность в нейтрализации антагонистов GPVI без иммуногенности для человека.

В заявке US 2006/0088531 описан scFv-фрагмент 10В12 антитела человека, обладающий K_D связывания GPVI человека около 7.9×10^-7. В работе М. Smethurst (Smethurst и др., 2004. Blood, 103(3):903-11) также описан эпитоп, связанный антителом 10В12 в Ig-подобном домене 1 (D1) типа С2 GPVI человека. Этот эпитоп содержит остатки R58, K61, R66, K79 и R80 GPVI человека (нумерация согласно инвентарному номеру Q9HCN6 в открытой базе данных последовательностей белков UniProtKB).

В работе ( и др., 2006, J. Biol. Chem. 281(44):33505-10) также описан scFv-фрагмент 1С3 антитела человека с низкой аффинностью в отношении GPVI (5,4×10^-7 М), который не блокировал ни индуцированную коллагеном агрегацию тромбоцитов, ни связывание GPVI коллагена, но усиливал ингибирующий эффект антитела 10В12. Эпитоп 1С3 в GPVI содержит аминокислоту I168, и также теоретически допускается, что этот эпитоп может охватывать область между остатками S164 и S182, которая является высококонсервативной при переносе человеку от мыши.

Таким образом, существует потребность в гуманизированном антителе (т.е. в антителе без иммуногенности при введении человеку) с улучшенной аффинностью, эффективностью и периодом полувыведения по сравнению с известными антагонистами в качестве средства эффективного и достаточного предотвращения и/или лечения сердечнососудистых болезней человека. Кроме того, эти антагонисты предпочтительно должны легко очищаться.

Описаны антитела против GPVI, индуцирующие истощенный фенотип GPVI (WO 2006/118350, WO 2011/073954, ЕР 2363416). В частности, в заявке WO 2006/118350 описано антитело против GPVI всех млекопитающих. Описан эпитоп GPVI, связываемый этим антителом и соответствующий петлям 9 и 11 Ig-подобного домена 2 типа С2 IgGVI, которые соответствуют аминокислотным остаткам 136-142 и 158-162 соответственно.

Однако истощение GPVI нежелательно, так как оно не может контролироваться и является необратимым (т.е. длится в течение жизни тромбоцитов или даже дольше из-за истощения GPVI в мегакариоцитах).

В терапии требуется быстрый и безопасный антитромбоцитарный эффект. Поэтому следует разработать антитела, не индуцирующие истощенный фенотип GPVI и предпочтительно не индуцирующие снижение количества тромбоцитов in vivo (т.е. с обратимым эффектом).

Заявитель разработал антитело против GPVI, при этом упомянутое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывает новый, неописанный конформационный эпитоп. Это антитело против GPVI имеет высокую аффинность в отношении GPVI человека и блокирует взаимодействие GPVI с его лигандами (включая коллаген и фибрин), не уменьшая количество тромбоцитов и не истощая GPVI in vivo. При непрерывном введении в течение, по меньшей мере, 2 часов, антитело (или его фрагмент) демонстрирует пролонгированный эффект in vivo. Таким образом, настоящее изобретение относится к терапевтическому применению усовершенствованного гуманизированного нейтрализующего антитела или его фрагмента, специфического в отношении GPVI человека.

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к выделенному гуманизированному белку, связывающему гликопротеин VI человека (hGPVI), для лечения связанного с GPVI состояния у нуждающегося в этом субъекта, при этом упомянутый выделенный гуманизированный белок должен вводиться субъекту в течение, по меньшей мере, 2 часов, предпочтительно в течение, по меньшей мере, 4-6 часов.

В одном из вариантов осуществления выделенный гуманизированный белок вводится предпочтительно путем внутривенного вливания. В другом варианте осуществления выделенный гуманизированный белок вводится внутрибрюшинно.

В одном из вариантов осуществления доза гуманизированного белка для введения пациенту составляет от около 0,5 мг/кг до около 50 мг/кг, предпочтительно от около 1 мг/кг до около 32 мг/кг, более предпочтительно от около 2,5 мг/кг до около 25 мг/кг, еще более предпочтительно от около 5 мг/кг до около 15 мг/кг и еще более предпочтительно около 8 мг/кг.

В другом варианте осуществления доза белка для применения в настоящем изобретении составляет от около 125 мг до около 2000 мг, предпочтительно от около 250 мг до около 1000 мг или от около 500 мг до около 1000 мг.

В одном из вариантов осуществления вводится первый болюс, который составляет около 10-50%, предпочтительно около 20% общей дозы выделенного гуманизированного белка для введения, при этом первый болюс предпочтительно вводится в течение около 5-30 минут, предпочтительно в течение около 15 минут.

В одном из вариантов осуществления упомянутый белок связывает конформационный эпитоп, содержащий:

по меньшей мере, один аминокислотный остаток из аминокислотных остатков 114-142 hGPVI (SEQ ID NO: 13) или из последовательности, по меньшей мере, на 60% идентичной на протяжении аминокислотных остатков 114-142 hGPVI (SEQ ID NO: 13), и

по меньшей мере, один аминокислотный остаток из аминокислотных остатков 165-187 hGPVI (SEQ ID NO: 13) или из последовательности, по меньшей мере, на 60% идентичной на протяжении аминокислотных остатков 165-187 hGPVI (SEQ ID NO: 13).

В одном из вариантов осуществления упомянутый конформационный эпитоп содержит:

по меньшей мере, один аминокислотный остаток из аминокислотных остатков 121-135 hGPVI (SEQ ID NO: 13) или из последовательности, по меньшей мере, на 60% идентичной на протяжении аминокислотных остатков 121-135 hGPVI (SEQ ID NO: 13); и

по меньшей мере, один аминокислотный остаток из аминокислотных остатков 169-183 hGPVI (SEQ ID NO: 13) или из последовательности, по меньшей мере, на 60% идентичной на протяжении аминокислотных остатков 169-183 hGPVI (SEQ ID NO: 13).

В одном из вариантов осуществления упомянутый конформационный эпитоп содержит:

по меньшей мере, один аминокислотный остаток из аминокислотных остатков 121-136 hGPVI (SEQ ID NO: 13) или из последовательности, по меньшей мере, на 60% идентичной на протяжении аминокислотных остатков 121-136 hGPVI (SEQ ID NO: 13); и

по меньшей мере, один аминокислотный остаток из аминокислотных остатков 169-183 hGPVI (SEQ ID NO: 13) или из последовательности, по меньшей мере, на 60% идентичной на протяжении аминокислотных остатков 169-183 hGPVI (SEQ ID NO: 13).

В одном из вариантов осуществления упомянутый белок имеет Ко связывания hGPVI менее 1,5 нМ, который измеряется путем поверхностного плазмонного резонанса с использованием 960-1071 резонансных единиц (RU) растворимого GPVI человека и с использованием PBS с рН 7,4 в качестве рабочего буфера, при этом изолированный гуманизированный белок не индуцирует истощенный фенотип GPVI in vivo.

В одном из вариантов осуществления выделенный гуманизированный белок, связывающий hGPVI, для применения в соответствии с настоящим изобретением представляет собой молекулу антитела, выбранного из группы, включающей цельное антитело, гуманизированное антитело, одноцепочечное антитело, Fv, Fab; или фрагмент антитела, выбранного из группы, включающей унитело, доменное антитело и нанотело; или мономерное антитело-миметик, выбранное из группы, включающей аффитело, аффилин, аффитин, аднектин, атример, эвазин, DARPin, антикалин, авимер, финомер и версатело, предпочтительно одновалентное антитело.

В одном из вариантов осуществления молекулой выделенного антитела, связывающего hGPVI, является молекула антитела, у которого:

вариабельная область тяжелой цепи содержит, по меньшей мере, один из следующих гипервариабельных участков (CDR):

VH-CDR1: GYTFTSYNMH (SEQ ID NO: 1);

VH-CDR2: GIYPGNGDTSYNQKFQG (SEQ ID NO: 2); и

VH-CDR3: GTVVGDWYFDV (SEQ ID NO: 3);

или любой CDR, имеющий аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 60% идентичную SEQ ID NO: 1-3; и

вариабельная область легкой цепи содержит, по меньшей мере, один из следующих CDR:

VL-CDR1: RSSQSLENGNTYLN (SEQ ID NO: 4);

VL-CDR2: RVSNRFS (SEQ ID NO: 5); и

V1-CDR3: LQLTHVPWT (SEQ ID NO: 6);

или любой CDR, имеющий аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 60% идентичную SEQ ID NO: 4-6.

В одном из вариантов осуществления вариабельная область тяжелой цепи содержит следующие CDR: GYTFTSYNME (SEQ ID NO: 1), GIYPGNGDTSYNQKFQG (SEQ ID NO: 2) и GTVVGDWYFDV (SEQ ID NO: 3), а вариабельная область легкой цепи содержит следующие CDR: RSSQSLENGNTYLN (SEQ ID NO: 4), RVSNRFS (SEQ ID NO: 5) и LQLTHVPWT (SEQ ID NO: 6), или любой CDR, имеющий аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 60% идентичную SEQ ID NO: 1-6.

В одном из вариантов осуществления аминокислотной последовательностью, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи, является SEQ ID NO: 7, а аминокислотной последовательностью, кодирующей вариабельную область легкой цепи, является SEQ ID NO: 8 или любая аминокислотная последовательность, по меньшей мере, на 60% идентичная SEQ ID NO: 7 или 8.

В одном из вариантов осуществления аминокислотной последовательностью, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи, является SEQ ID NO: 7, а аминокислотной последовательностью, кодирующей вариабельную область легкой цепи, является SEQ ID NO: 9 или любая аминокислотная последовательность, по меньшей мере, на 60% идентичная SEQ ID NO: 7 или 9.

В одном из вариантов осуществления упомянутым связанным с GPVI состоянием является сердечно-сосудистое заболевание, выбранное из артериального и венозного тромбоза, рестеноза, острого коронарного синдрома и нарушений мозгового кровообращения вследствие атеросклероза.

В одном из вариантов осуществления упомянутым связанным с GPVI состоянием является сердечно-сосудистое заболевание, выбранное из артериального и венозного тромбоза, рестеноза, острого коронарного синдрома и нарушений мозгового кровообращения вследствие атеросклероза, инфаркта миокарда, легочной эмболии, критической ишемии конечностей и заболевания периферических артерий.

Подробное описание

Термин "гликопротеин VI (GPVI)" означает мембранный тромбоцитарный гликопротеин, который участвует во взаимодействиях тромбоцитов и коллагена. GPVI является трансмембранным коллагеновым рецептором, который экспрессирует на поверхности тромбоцитов. В одном из вариантов осуществления аминокислотной последовательностью GPVI человека является SEQ ID NO: 13 (инвентарный номер ВАА89353.1) или любая аминокислотная последовательность идентичная SEQ ID NO: 13, по меньшей мере, на около 90%, предпочтительно идентичная SEQ ID NO: 13, по меньшей мере, на около 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более.

(SEQ ID NO: 13)

MSPSPTALFCLGCLGRVPA (Сигнальный пептид)

QSGPLPKPSLQALPSSLVPLEKPVTLRCQGPPGVDLYRLEKLSSSRYQDQAVLFIPAMKRSLAGRYRCSYQNGSLWSLPSDQLELVATGVFAKPSLSAQPGPAVSSGGDVTLQCQTRYGFDQFALYKEGDPAPYKNPERWYRASFPIITVTAAHSGTYRCYSFSSRDPYLWSAPSDPLELVVTGTSVTPSRLPTEPPSSVAEFSEATAELTVSFTNKVFTTETSRSITTSPKESDSPAGPARQYYTKGN (Внеклеточный домен).

LVRICLGAVILIILAGFLAEDWHSRRKRLRHRGRAVQRPLPPLPPLPQTRKSHGGQDGGRQDVHSRGLCS (Трансмембранный и цитоплазматический домены).

Внеклеточный домен GPVI состоит из двух Ig-подобных доменов типа С2, а именно, D1 и D2, связанных шарнирной междоменной областью. В одном из вариантов осуществления D1 содержит аминокислотные остатки 21-109 SEQ ID NO: 13. В одном из вариантов осуществления шарнирная междоменная область между D1 и D2 содержит аминокислотные остатки 110-113 SEQ ID NO: 13. В одном из вариантов осуществления D2 содержит аминокислотные остатки 114-207 SEQ ID NO: 13.

Термин "около", предшествующий какой-либо численной величине, означает на 10% больше или меньше указанной величины.

Используемый термин "иммуноглобулин" означает белок, содержащий сочетание двух тяжелых и двух легких цепей независимо от того, обладает ли он какой-либо соответствующей специфической иммунореактивностью. Термин "антитела" означает узлы, которые обладают значительной известной специфической иммунореактивностью в отношении представляющего интерес антигена (например, GPVI человека). Термин "антитела против GPVI" означает антитела, которые демонстрируют иммуноспецифичность в отношении белка GPVI человека. Как пояснено далее, "специфичность" в отношении GPVI человека не исключает перекрестной реакции с видовыми гомологами GPVI. Антитела и иммуноглобулины содержат легкие и тяжелые цепи с ковалентной связью между цепями или без нее. Основные структуры иммуноглобулина в системах позвоночных животных относительно хорошо изучены. Родовым термином "иммуноглобулин" обозначаются антитела пяти различных классов, которые различимы биохимическими методами. Антитела всех пяти классов входят в объем настоящего изобретения; в следующем далее описании рассмотрены в основном молекулы иммуноглобулина класса IgG. Что касается IgG, иммуноглобулины содержат две идентичные легкие полипептидные цепи с молекулярной массой около 23000 дальтон и две идентичные тяжелые цепи с молекулярной массой около 53000-70000 дальтон. Все четыре цепи соединены дисульфидными связями с образованием Y-конфигурации, в которой легкие цепи разграничивают тяжелые цепи, начинающиеся в устье "Y" и продолжающиеся через вариабельную область. Легкие цепи антитела подразделяются на классы каппа и лямбда ([κ], [λ]). Тяжелая цепь каждого класса может быть связана с легкой каппа-цепью или лямбда-цепью. Обычно легкие и тяжелые цепи ковалентно связаны друг с другом, а "хвостовые" области обеих тяжелых цепей связаны друг с другом ковалентными дисульфидными связями или нековалентными связями, когда иммуноглобулины образованы гибридомами, В-клетками или генно-инженерными клетками-хозяевами. В тяжелой цепи аминокислотные последовательности проходят от N-конца на раздвоенных концах Y-конфигурации до С-конца в нижней части каждой цепи. Специалистам в данной области техники известно, что тяжелые цепи подразделяются на классы гамма, мю, альфа, дельта и эпсилон (γ, μ, α, δ, ε), в которые входит несколько подклассов (например, γ1-γ4). Именно природа этой цепи определяет "класс" антитела как IgG, IgM, IgA IgD или IgE, соответственно. Подклассы иммуноглобулина (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и т.д. хорошо охарактеризованы и, как известно, придают функциональную специализацию. Модифицированные версии каждого из этих классов и изотипов являются легко распознаваемыми для специалиста в контексте настоящего описания и, соответственно, входят в объем настоящего изобретения. Как указано выше, вариабельная область антитела позволяет антителу избирательно распознавать и специфически связывать эпитопы в антигенах. Иными словами, вариабельный домен легкой цепи (VL-домен) и вариабельный домен тяжелой цепи (VH-домен) антитела объединяются с образованием вариабельной области, которая образует трехмерный антигенсвязывающий сайт. Эта четвертичная структура антитела образует антигенсвязывающий сайт на конце каждого плеча "Y". Более точно, антигенсвязывающий сайт определяется тремя гипервариабельными участками (CDR) в каждой из VH- и VL-цепей.

Используемый термин "выделенное антитело" означает антитело, которое выделено и/или восстановлено из какого-либо компонента его природной среды. Загрязняющими компонентами его природной среды являются вещества, которые будут препятствовать диагностическому или терапевтическому применению антитела и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые компоненты. В предпочтительных вариантах антитело очищают: (1) до достижения концентрации антитела более 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95% по весу или более, определенного методом Лоури, наиболее предпочтительно до достижения концентрации более 99% по весу; (2) до достижения степени, достаточной для получения, по меньшей мере, 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности путем использования секвенатора с вращающимся стаканом; или (3) до достижения однородности по данным SDS-PAGE в восстановительных или невосстановительных условиях и с использованием окрашивания голубым кумасси или предпочтительно серебром. Выделенное антитело включает антитело in situ в рекомбинантных клетках ввиду отсутствия, по меньшей мере, одного компонента природной среды антитела. Однако обычно выделенное антитело получают путем очистки, по меньшей мере, на одной стадии.

Используемый термин "вариант аффинности" означает вариантное антитело, которое содержит одно или несколько изменений в аминокислотной последовательности по сравнению с эталонным антителом против GPVI, при этом вариант аффинности имеет измененную афинность в отношении белка GPVI человека по сравнению с эталонным антителом. Обычно варианты аффинности имеют улучшенную аффинность в отношении GPVI человека по сравнению с эталонным антителом против GPVI. Улучшением может являться меньшая K_D в отношении GPVI человека, более высокая K_A в отношении GPVI человека, более высокая скорость ассоциации с GPVI человека или меньшая скорость диссоциации с GPVI человека или изменение схемы перекрестной реактивности с гомологами GPVI животных помимо человека. Варианты аффинности обычно имеют одно или несколько изменений CDR в аминокислотной последовательности по сравнению с эталонным антителом против GPVI. Такие замены могут приводить к замене исходной аминокислоты, присутствующей в заданном положении в CDR, отличающимся аминокислотным остатком, которым может являться встречающийся или не встречающийся в природе аминокислотный остаток. Замены аминокислот могут являться консервативными или неконсервативными.

Используемый термин "сайт связывания" означает область белка, которая отвечает за избирательное связывание представляющего интерес целевого антигена (например, GPVI человека). Связывающие домены или области содержат, по меньшей мере, один сайт связывания. Примеры связывающих доменов включают вариабельный домен антитела. Белок согласно изобретению может содержать один антигенсвязывающий сайт или множество (например, два, три или четыре) антигенсвязывающих сайтов. Однако предпочтительно, чтобы белок согласно изобретению содержал единственный антигенсвязывающий сайт.

Используемый термин "консервативная замена аминокислоты" означает замену, при которой аминокислотный остаток заменяется аминокислотным остатком со сходными свойствами, в результате чего специалист в области химии пептидов ожидал бы, что вторичная структура и гидропатия полипептида останутся преимущественно неизменными. Соответственно, замены аминокислот обычно основаны на относительном сходстве заместителей боковых цепей аминокислот, например, их гидрофобности, гидрофильности, заряда, размера и т.п. Примеры замен с учетом различных из приведенных выше характеристик хорошо известны специалистам в данной области техники и включают аргинин и лизин; глутамат и аспартат; серии и треонин; глутамин и аспарагин; и валин, лейцин и изолейцин. Замены аминокислот могут дополнительно основываться на сходстве полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатического характера остатков. Например, отрицательно заряженные аминокислоты включают аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту; положительно заряженные аминокислоты включают лизин и аргинин; и аминокислоты с незаряженными полярными головными группами, имеющими одинаковые значения гидрофильности, включают лейцин, изолейцин и валин; глицин и аланин; аспарагин и глутамин; и серии, треонин, фенилаланин и тирозин. Другие группы аминокислот, в которых возможны консервативные изменения, включают (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his и (5) phe, tyr, trp, his. Аминокислотные остатки других семейств, имеющих сходные боковые цепи, известны из техники и включают основные боковые цепи (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотные боковые цепи (например, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту), незаряженные полярные боковые цепи (например, глицин, аспарагин, глутамин, серии, треонин, тирозин, цистеин), неполярные боковые цепи (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленные боковые цепи (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматические боковые цепи (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, несущественный аминокислотный остаток в полипептиде иммуноглобулина может быть заменен другим аминокислотным остатком из того же семейства боковых цепей. В другом варианте осуществления цепочка аминокислот может быть заменена структурно сходной цепочкой, которая отличается порядком и/или составом членов семейства боковых цепей.

Используемый термин "химерный" белок означает белок, у которого первая аминокислотная последовательность связана со второй аминокислотной последовательностью, с которой она не связана в природе. Аминокислотные последовательности могут нормально существовать в отдельных белках, которые объединены в гибридный белок, или могут нормально существовать в одном и том же белке, но иметь новое расположение в гибридном белке. Химерный белок может быть создан, например, путем химического синтеза или путем создания и преобразования полинуклеотида, в котором пептидные области закодированы в желаемой зависимости.

Используемый термин "гипервариабельный участок" или "CDR" означает несмежные антигенсвязывающие центры антител, находящиеся в вариабельной области полипептидов как с тяжелыми, так и легкими цепями. CDR были идентифицированы в соответствии со следующими правилами, установленными Kabat (Kabat и др., 1991, J. Immunol. 147(5):1709-19) и Chotia и Lesk (Chothia С. и A.M. Lesk, 1987, J. Mol. Biol, 196(4):901-17):

CDR-L1:

Начало: приблизительно остаток 24;

Предшествующим остатком всегда является Cys;

Последующим остатком всегда является Trp. Обычно TRP-TYR-GLN, но также TRP-LEU-GLN, TRP-PHE-GLN, TRP-TYR-LEU;

Длина: 10-17 остатков;

CDR-L2:

Начало: всегда через 16 остатков после окончания L1;

Предшествующими остатками обычно являются ILE-TYR, но также, VAL-TYR, ILE-LYS, ILE-PHE;

Длина: всегда 7 остатков;

CDR-L3:

Начало: всегда через 33 остатка после окончания L2:

Предшествующим остатком всегда является Cys;

Последующими остатками всегда являются PHE-GL Y-XXX-GLY (SEQ ID NO: 21);

Длина: 7-11 остатков;

CDR-H1:

Начало: приблизительно остаток 26 (всегда через 4 остатка после CYS) [согласно определению Chothia/AbM]; согласно определению Kabat начинается на 5 остатков позже;

Предшествующими остатками всегда являются CYS-XXX-XXX-XXX (SEQ ID NO: 22)

Последующим остатком всегда является TRP. Обычно TRP-VAL, но также TRP-ILE, TRP-ALA;

Длина: 10-12 остатков (согласно определению AbM); согласно определению Chothia за исключением последних 4 остатков;

CDR-H2:

Начало: всегда через 15 остатков после окончания CDR-H1 согласно определению Kabat/AbM);

Предшествующими остатками обычно являются LEU-GLU-TRP-ILE-GLY (SEQ ID NO: 23), но с рядом вариаций;

Последующими остатками являются LYS/ARG-LEU/ILE/VAL/PHE/THP ALA-THR/SEMLE/ALA;

Длина: 16-19 остатков согласно определению Kabat (согласно определение AbM заканчивается на 7 остатков раньше);

CDR-H3:

Начало: всегда через 33 остатка после окончания CDR-H2 (всегда через 2 остатка после CYS);

Предшествующими остатками всегда являются CYS-XXX-XXX (обычно CYS-ALA-ARG);

Последующими остатками всегда являются TRP-GLY-XXX-GLY (SEQ ID NO: 24);

Длина: 3-25 остатков.

Используемый термин "СН2-домен" означает область молекулы с тяжелой цепью, которая обычно начинается вблизи аминокислоты 231 и заканчивается вблизи аминокислоты 340. СН2-домен уникален тем, что он не образует тесную парную связь с другим доменом. Напротив, между двумя СН2-доменами интактной нативной молекулы IgG находятся две N-связанные разветвленные углеводные цепи. Предполагалось, что углевод может обеспечивать замену попарному связыванию доменов и способствовать стабилизации СН2-домена (Burton, Molec. Immunol. 22 (1985) 161-206).

Используемый термин "производное" указанного белка (например, антитела против GPVI или его антигенсвязывающего фрагмента) означает происхождение белка. В одном из вариантов осуществления белковой или аминокислотной последовательностью, производной конкретного исходного белка, является последовательность CDR или связанная с ней последовательность. В одном из вариантов осуществления аминокислотная последовательность, производная конкретного исходного белка, не является смежной. Например, в одном из вариантов осуществления производным исходного антитела является один, два, три, четыре, пять или шесть CDR. В одном из вариантов осуществления белковой или аминокислотной последовательностью, производной конкретного исходного белка или аминокислотной последовательности, является аминокислотная последовательность, которая преимущественно идентична исходной аминокислотной последовательности или ее области, состоящей, по меньшей мере, из 3-5 аминокислот, по меньшей мере, 5-10 аминокислот, по меньшей мере, 10-20 аминокислот, по меньшей мере, 20-30 аминокислот или, по меньшей мере, 30-50 аминокислот, или происхождение которой от исходной последовательности может быть иначе распознано специалистом в данной области техники. В одном из вариантов осуществления одна или несколько последовательностей CDR, являющихся производными исходного антитела, изменены с целью получения вариантных последовательностей CDR, вариантов аффинности, при этом вариантные последовательности CDR сохраняют связывающую активность в отношении GPVI.

Используемый термин "диатела" означает небольшие фрагменты антител, полученные путем конструирования фрагментов sFv (см. раздел sFv) с помощью коротких линкеров (около 5-10 остатков) между VH- и VL-доменами, в результате чего достигается межцепочечное, а не внутрицепочечное попарное связывание V-доменов, что приводит к получению двухвалентного фрагмента, то есть фрагмента, имеющего два антигенсвязывающих сайта. Биспецифические диатела являются гетеродимерами двух "кроссоверных" sFv-фрагментов, у которых в различающихся полипептидных цепях присутствуют VH и VL-домены обоих антител. Диатела более подробно описаны, например, в патенте ЕР 0404097; заявке WO 1993/011161; и у Holliger (Holliger и др., Proc Natl Acad Sci 90 (14): 6444-6448).

Используемый термин "биоинженерный" означает манипулирование молекулами нуклеиновых кислот или полипептидов методами синтеза (например, рекомбинантными методами, методами пептидного синтеза in vitro, путем ферментативного или химического сопряжения пептидов или применения какого-либо сочетания этих методов). Антителами согласно изобретению предпочтительно являются биоинженерные антитела, включая, например, гуманизированные и/или химерные антитела, и антитела, сконструированные с целью улучшения одного или нескольких свойств, таких как связывание антигена, стабильность/период полувыведения или эффекторная функция.

Используемый термин "эпитоп" означает конкретное расположение аминокислот в белке или белках, которые связывает антитело. Эпитопы часто состоят из химически активной поверхностной группировки молекул, таких как аминокислоты или боковые сахарные цепи, и имеют специфические трехмерные структурные характеристики, а также специфические характеристики заряда. Эпитопы могут являться линейными или конформационными, т.е. с участием двух или более последовательностей аминокислот в различных областях антигена, которые необязательно могут являться смежными.

Используемый термин "каркасная область" или "FR-область" означает аминокислотные остатки, которые являются частью вариабельной области, но не являются частью CDR (например, CDR согласно определению Kabat/Chothia). Следовательно, каркас вариабельной области имеет длину около 100-120 аминокислот, но содержит только те аминокислоты, которые находятся за пределами CDR. В качестве конкретного примера вариабельной области тяжелой цепи и CDR согласно определению Kabat/Chothia, каркасная область 1 может соответствовать домену вариабельной области, охватывающему аминокислоты 1-25; каркасная область 2 может соответствовать домену вариабельной области, охватывающему аминокислоты 36-49; каркасная область 3 может соответствовать домену вариабельной области, охватывающему аминокислоты 67-98, а каркасная область 4 может соответствовать домену вариабельной области, охватывающему аминокислоты 110 до конца вариабельной области. Каркасные области легкой цепи аналогичным образом разделены каждым из CDR вариабельной области легкой цепи. У встречающихся в природе антител шесть CDR, присутствующих в каждом мономерном антителе, представляют собой короткие, несмежные последовательности аминокислот, которые имеют специфическое расположение с образованием антигенсвязывающего сайта, когда антитело принимает свою трехмерную конфигурацию в водной среде. Остатки вариабельных областей тяжелых и легких цепей демонстрируют меньшую межмолекулярную изменчивость в аминокислотной последовательности и называются каркасными областями. Каркасные области в значительной степени принимают бета-складчатую конформацию, при этом CDR образуют петли, которые соединяют и в некоторых случаях составляют часть бета-складчатой структуры. Таким образом, эти каркасные области образуют клеточный каркас, который обеспечивает размещение шести CDR с правильной ориентацией путем межцепочечных нековалентных взаимодействий. Антигенсвязывающий сайт, образованный позиционируемыми CDR, определяет поверхность, комплементарную эпитопу иммунореактивного антигена. Эта комплементарная поверхность способствует нековалентному связыванию антитела с эпитопом иммунореактивного антигенна. Положение CDR может легко распознаваться специалистом в данной области техники.

Используемый термин "фрагмент" означает часть или область антитела или цепи антитела, содержащую меньшее число аминокислотных остатков, чем интактное или полное антитело или цепь антитела. Термин "антигенсвязывающий фрагмент" означает белковый фрагмент иммуноглобулина или антитела, которое связывает антиген или конкурирует с интактным антителом (т.е. интактным антителом, производным которого он является) за связывание антигена (т.е. специфическое связывание GPVI человека). Используемый термин "фрагмент" молекулы антитела означает антигенсвязывающие фрагменты антител, например вариабельный домен легкой цепи (VL) антитела, вариабельный домен тяжелой цепи (VH) антитела, одноцепочечное антитело (scFv), Р(ab')2-фрагмент, Fab-фрагмент, Fd-фрагмент, Fv-фрагмент, фрагмент однодоменного антитела (DAb), неполное (одновалентное) антитело, диатела или любую антигенсвязывающую молекулу, образованную путем сочетания, сборки или конъюгации таких антигенсвязывающих фрагментов. Фрагменты могут быть получены, например, путем химической или ферментативной обработки интактного или полного антитела или цепи антитела или рекомбинантными методами.

Используемый термин "Fc-фрагмент" антитела означает карбоксильные концевые участки обеих Н-цепей, удерживаемые вместе дисульфидами. Эффекторные функции антител определяются последовательностями в Fc-области, которая также является частью, распознаваемой Fc-рецепторами (FcR), обнаруживаемыми в клетках определенных типов.

Используемый термин "Fv" означает минимальный фрагмент антитела, который содержит полный антигенраспознающий и антигенсвязывающий сайт. Этот фрагмент состоит из димера одного домена вариабельной области тяжелой цепи и одного домена вариабельной области легкой цепи в тесной нековалентной связи. При складывании этих двух доменов образуются шесть гипервариабельных петель (по три петли из Н- и L-цепей), которые вносят вклад в связывание антигена и придают антителу антигенсвязывающую специфичность. Однако даже один вариабельный домен (или половина Fv, содержащая только три CDR, специфических в отношении антигена) обладает способностью распознавать и связывать антиген, хотя и с более низкой афинностью, чем весь сайт связывания.

Используемый термин "область тяжелой цепи" означает аминокислотные последовательности, являющиеся производными константных доменов тяжелой цепи иммуноглобулина. Белок, имеющий область тяжелой цепи, содержит, по меньшей мере, одно из следующего: СН1-домен, шарнирный домен (например, верхнюю, среднюю и/или нижнюю шарнирную область), СН2-домен, СН3-домен или их вариант или фрагмент. В одном из вариантов осуществления связывающая молекула согласно изобретению может содержать Fc-область тяжелой цепи иммуноглобулина (например, шарнирный участок часть, СН2-домен и СН3-домен). В другом варианте осуществления связывающая молекула согласно изобретению не имеет, по меньшей мере, области константного домена (например, всего СН2-домена или его части). В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере, один, предпочтительно все константные домены являются производными тяжелой цепи иммуноглобулина человека. Например, в одном предпочтительном варианте осуществления область тяжелой цепи содержит полностью человеческий шарнирный домен. В других предпочтительных вариантах осуществления область тяжелой цепи содержит полностью человеческую Fc-область (например, шарнирные, СН2- и СН3-доменные последовательности иммуноглобулина человека). В некоторых вариантах осуществления образующие область тяжелой цепи константные домены относятся к молекулам различных иммуноглобулинов. Например, область тяжелой цепи белка может содержать СН2-домен, являющийся производным молекулы IgG1, шарнирную область, являющуюся производной молекулы IgG3 или IgG4. В других вариантах осуществления константными доменами являются химерные домены, содержащие области молекул различных иммуноглобулинов. Например, шарнир может содержать первую область, являющуюся производной молекулы IgG1, и вторую область, являющуюся производной молекулы IgG3 или IgG4. Как указано выше, специалисту в данной области техники ясно, что константные домены области тяжелой цепи могут быть модифицированы таким образом, чтобы отличаться в аминокислотной последовательности от молекулы встречающегося в природе иммуноглобулина (дикого типа). Иными словами, описанные белки согласно изобретению могут содержать изменения или модификации в одном или нескольких константных доменах тяжелой цепи (СН1, шарнира, СН2 или СН3) и/или в константном домене легкой цепи (CL). Примеры модификаций включают добавления, делеции или замены одной или нескольких аминокислот в одном или нескольких доменах.

Используемый термин "шарнирная область" означает область молекулы тяжелой цепи, которая соединяет СН1-домен с СН2-доменом. Эта шарнирная область содержит приблизительно 25 остатков и является гибкой, что позволяет двум N-концевым антигенсвязывающим областям перемещаться независимо друг от друга. Шарнирные области можно подразделить на три отдельных домена: верхний, средний и нижний шарнирные домены (Roux и др., 1998, J. Immunol., 161(8):4083-90).

Термины "гипервариабельная петля" и "гипервариабельный участок" не являются строго синонимами, поскольку гипервариабельные петли (HV) характеризуются на основе структуры, а гипервариабельные участки (CDR) характеризуются на основе вариабельности последовательностей (Kabat, Elvin А. (1983). Sequences of proteins of immunological interest (5^th edition), Bethesda, Md, Public Health Service, National Institutes of Health), при этом пределы HV и CDR могут различаться в некоторых VH- и VL-доменах. CDR VH- и VL-доменов обычно могут характеризоваться согласно определению Kabat/Chothia (смотри выше). В одном из вариантов осуществления CDR VL- и VH-доменов могут содержать следующие аминокислоты: остатки 24-39 (CDRL1), 55-61 (CDRL2) и 94-102 (CDRL3) в вариабельном домене легкой цепи и остатки 26-35 (CDRH1), 50-66 (CDRH2) и 99-109 (CDRH3) в вариабельном домене тяжелой цепи. Таким образом, HV могут входить в соответствующие CDR, при этом упоминание "гипервариабельных петель" VH- и VL-доменов следует считать также относящимся к соответствующим CDR и наоборот, если не указано иное. Более высококонсервативные области вариабельных доменов называются каркасной областью (FR) согласно определению, данному в настоящей заявке. Вариабельные домены нативных тяжелых и легких цепей содержат по четыре FR (FR1, FR2, FR3 и FR4 соответственно), в основном, с бета-складчатой конфигурацией, соединенной тремя гипервариабельными петлями. Гипервариабельные петли в каждой цепи удерживаются в непосредственной близости друг от друга посредством FR и вместе с гипервариабельными петлями другой цепи способствуют образованию антигенсвязывающего сайта антител. Структурный анализ антител выявил взаимосвязь между последовательностью и формой сайта связывания, образуемого гипервариабельными участками (Chothia и др., 1992, J. Mol. Biol. 227:799-817; Tramontano и др., 1990, J. Mol. Biol, 215:175-182 (1990)). Несмотря на высокую вариабельность их последовательностей, пять из шести петель имеют лишь небольшой набор конформаций главной цепи, называемых "каноническими структурами". Эти конформаций в первую очередь определяются длиной петель, а во-вторых, присутствием в определенных положениях в петлях и в каркасных областях ключевых остатков, которые определяют конформацию посредством своей упаковки, водородных связей или способности принимать необычные конформаций основных цепей.

Используемый термин "гуманизированный" относится к химерным иммуноглобулинам, цепям иммуноглобулинов или их фрагментам (таким как Fv, Fab, Fab' или другим антигенсвязывающим подпоследовательностям антител), которые содержат минимальную последовательность, являющуюся производной мышиного иммуноглобулина. Например, гуманизированными антителами являются иммуноглобулины человека (антитело-реципиент), в которых остатки гипервариабельного участка (CDR) реципиента заменены остатками CDR исходного антитела (донорного антитела) с сохранением желаемой специфичности, аффинности и связывающей способности исходного антитела.

Используемый термин "гуманизирующие замены" означает замены аминокислот, в которых аминокислотный остаток, присутствующий в определенном положении в VH или VL-домене антитела животных помимо человека (например, мышиного антитела) против GPVI, заменен аминокислотным остатком, который находится в эквивалентном положении в эталонном присущем человеку VH или VL-домене. Эталонным присущим человеку VH- или VL-доменом может являться VH-или VL-домен, кодируемый зародышевой линией клеток человека, и в этом случае замещенные остатки могут именоваться "гуманизирующими заменами". Гуманизирующие замены могут делаться в каркасных областях и/или CDR антитела против GPVI согласно определению, данному в настоящей заявке.

Антитело, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и вариабельный домен легкой цепи (VL) считается имеющим высокую гомологию белкам человека, если аминокислотные последовательности вместе взятых VH- и VL-доменов, по меньшей мере, на 70, 75, 80, 85, 90, 95% или более идентичны наиболее точно совпадающим последовательностям VH- и VL-доменов клеток зародышевой линии человека. Антитела, имеющие высокую гомологию белкам человека, могут включать антитела, содержащие VH и VL-домены нативных антител животных помимо человека с достаточно высоким процентом идентичности последовательностям клеток зародышевой линии человека, а также биоинженерные, в особенности, гуманизированные варианты таких антител, а также "полностью человеческие" антитела. В одном из вариантов осуществления идентичность аминокислотных последовательностей или гомология последовательностей VH-домена антитела с высокой гомологией белку человека и одного или нескольких VH-доменов человека может составлять 75%, 80% или более на протяжении каркасных областей FR1, FR2, FR3 и FR4. В других вариантах осуществления идентичность аминокислотных последовательностей или гомология последовательностей VH-домена белка согласно изобретению и наиболее точно совпадающей последовательности VH-домена клеток зародышевой линии человека может составлять 85% или более, 90% или более, 95% или более, 97% или более или до 99% или даже на 100%. В одном из вариантов осуществления VH-домен антитела с высокой гомологией белку человека может содержать одно или несколько (например, от 1 до 20) несовпадений аминокислотных последовательностей, на протяжении каркасных областей FR1, FR2, FR3 и FR4 по сравнению с наиболее точно совпадающей последовательностью VH-домена человека. В другом варианте осуществления идентичность или гомология последовательностей VL-домена антитела с высокой гомологией белку человека и одного или нескольких VL-доменов человека может составлять 80% или более на протяжении каркасных областей FR1, FR2, FR3 и FR4. В других вариантах осуществления идентичность аминокислотных последовательностей или гомология последовательностей VL-домена белка согласно изобретению и наиболее точно совпадающей последовательности VL-домена клеток зародышевой линии человека может составлять 85% или более 90% или более, 95% или более, 97% или более или до 99% или даже на 100%.

В одном из вариантов осуществления VL-домен антитела с высокой гомологией белку человека может содержать одно или несколько (например, от 1 до 20, предпочтительно от 1 до 10, более предпочтительно от 1 до 5) несовпадений аминокислотных последовательностей на протяжении каркасных областей FR1, FR2, FR3 и FR4 по сравнению с наиболее точно совпадающей последовательностью VL-домена человека. Перед анализом процентной идентичности последовательностей антитела с высокой гомологией белку человека и VH- и VL-доменов клетках зародышевой линии человека могут определяться канонические складки, которые позволяют идентифицировать семейство сегментов клетках зародышевой линии человека с одинаковой комбинацией канонических складок H1 и Н2 или L1 и L2 (и L3).

Впоследствии выбирают член семейства клеток зародышевой линии человека, который имеет самую высокую степень гомологии последовательностей относительно вариабельной области представляющего интерес антитела, для оценки гомологии последовательностей. Определение канонических классов гипервариабельных петель L1, L2, L3, H1 и Н2 согласно Chothia может осуществляться средствами биоинформатики, общедоступными на сайте www.bioinf.org.uk/abs/chothia.html.page. Результаты вычислений содержат требования к ключевым остаткам в файле данных. В этих файлах данных положения ключевых остатков показаны с разрешенными аминокислотами в каждом положении. Последовательность вариабельной области представляющего интерес антитела вводится в качестве входных данных и сначала совмещается с консенсусной последовательностью антитела с целью присвоения номера согласно схеме нумерации Kabat/Chothia. При анализе канонических складок используется набор шаблонов ключевых остатков, полученных автоматизированным методом, разработанным Martin и Thornton (Martin и др., J., 1996, Mol. Biol. 263:800-815). Если известен конкретный сегмент клеток зародышевой линии V человека, в котором используется одинаковая комбинация канонических складок для H1 и Н2 или для L1 и L2 (и L3), может определяться член семейства, наиболее точно совпадающий с точки зрения гомологии последовательностей. Средствами биоинформатики может определяться процент идентичности аминокислотных последовательностей VH и VL-доменов интересующего антитела и соответствующих последовательностей, кодируемых клеток зародышевой линии человека, но также может применяться выравнивание последовательностей вручную. Последовательности иммуноглобулина человека могут идентифицироваться в нескольких базах данных белков, таких как база данных VBase (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) или база данных Pluckthun/Honegger (http://www.bioc.unizh.ch/antibody/Sequences/Germlines). Для сравнения последовательностей человека с V-областями VH- или VL-доменов в интересующем антителе может использоваться алгоритм выравнивания последовательностей, такой как алгоритм, доступный на сайтах, таких как www.expasy.ch/tools/#align, но также может осуществляться выравнивание вручную с ограниченным набором последовательностей. Выбирают последовательности легкой и тяжелой цепей из семейств клеток зародышевой линии человека с одинаковыми комбинациями канонических складок и с наивысшей степенью гомологии каркасным областям 1, 2 и 3 каждой цепи, и сравнивают с представляющей интерес вариабельной областью; также проверяют FR4 на соответствие областям JH и JK или JL клеток зародышевой линии человека. Следует отметить, что при расчете общего процента гомологии последовательностей оценивают остатки FR1, FR2 и FR3 с использованием наиболее точно совпадающей последовательности из семейства клеток зародышевой линии человека с идентичной комбинацией канонических складок. Оценивают только остатки, отличающиеся от наиболее точного совпадения или других членов того же семейства с одинаковой комбинацией канонических складок (за исключением любых кодируемых праймером различий).

Однако в целях гуманизации остатки в каркасных областях, идентичные членам других семейств клетках зародышевой линии человека, которые не имеют такой же комбинации канонических складок, могут считаться "человеческими", несмотря на то, что они оцениваются как "отрицательные" в соответствии с наиболее строгими условиями, описанными выше. В основе этого допущения лежит подход к гуманизации "путем смешивания и подгонки", когда каждую из FR1, FR2, FR3 и FR4 по отдельности сравнивают с наиболее точно совпадающей с ней последовательностью клеток зародышевой линии человека, в результате чего гуманизированная молекула содержит комбинацию различных FR, как это было сделано Qu и коллегами (Qu и др., Clin. Cancer Res. 5:3095-3100 (1999)) и Ono и коллегами (Ono и др., Mol. Immunol. 36:387-395 (1999)). Границы отдельных каркасных областей могут устанавливаться с использованием схемы нумерации IMGT, которая является одним из вариантов схемы нумерации Chothia (Lefranc и др., Nucleic acid res 27:209-212 (1999); http://im.gt.cines.fr). Антитела с высокой гомологией белку человека могут содержать гипервариабельные петли или CDR, имеющие канонические складки человека или подобные складкам человека, как подробно описано далее. В одном из вариантов осуществления, по меньшей мере, одна гипервариабельная петля или CDR в VH-домене или VL-домене антитела с высокой гомологией белку человека может быть получена или выделена из VH-домена или VL-домена антитела животных помимо человека, но при этом имеют предсказанную или фактическую каноническую складчатую структуру, преимущественно идентичную канонической складчатой структуре, которая встречается в антителах человека. Из техники хорошо известно, что, хотя первичные аминокислотные последовательности гипервариабельных петель, присутствующие как в VH-доменах, так и в VL-доменах, кодируемых зародышевой линией клеток человека, по определению являются высоковариабельными, все гипервариабельные петли, за исключением CDR Н3 VH-домена, имеют лишь несколько особых структурных конформаций, называемых каноническими складками (Chothia и др., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Tramontano и др., Proteins 6: 382-94 (1989)), которые зависят как от длины гипервариабельной петли, так и от присутствия так называемых канонических аминокислотных остатков (Chothia и др., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Фактические канонические структуры гипервариабельных петель в интактных VH- или VL-доменах могут определяться путем структурного анализа (например, рентгеновской кристаллографии), но каноническую структуру также можно предсказать на основе ключевых аминокислотных остатков, характерных для конкретной структуры (как подробнее описано далее). По сути, конкретная схема остатков, которая определяет каждую каноническую структуру, образует "подпись", позволяющую распознавать каноническую структуру в гипервариабельных петлях VH- или VL-домена неизвестной структуры; соответственно, канонические структуры можно предсказать на основе только первичной аминокислотной последовательности.

Предсказанные канонические складчатые структуры гипервариабельных петель любой заданной последовательности VH- или VL-домена в антителе с высокой гомологией белку человека могут анализироваться с использованием алгоритмов, общедоступных на сайтах

www.bioinf.org.uk/abs/chothia.html,

www.biochem.ucl.ac.uk/~martin/antibodies.html и

www.bioc.unizh.ch/antibody/Sequences/Germlines/Vbase_hVk.html. Эти инструменты позволяют выравнивать искомые последовательности VH-или VL-доменов VH и последовательности VH- или VL-доменов человека с известной канонической структурой и предсказывать каноническую структуру гипервариабельных петель искомой последовательности. Что касается VH-домена, петли H1 и Н2 могут оцениваться как имеющие каноническую складчатую структуру, "преимущественно идентичную" канонической структуре складки, которая, как известно, встречается в антителах человека, при выполнении, по меньшей мере, первого, предпочтительно обоих из следующих критериев.

1. Определяемое числом остатков одинаковое расстояние до наиболее точного совпадающего канонического структурного класса человека.

2. Идентичность, по меньшей мере, на 33%, предпочтительно, по меньшей мере, на 50% ключевым аминокислотным остаткам, описанным для соответствующих канонических структурных классов H1 и Н2 человека (в целях приведенного выше анализа петли H1 и Н2 рассматривают по отдельности и сравнивают каждую из них с наиболее точно совпадающим каноническим структурным классом человека). Приведенный выше анализ основан на предсказании канонической структуры петель H1 и Н2 представляющего интерес антитела. Если известны фактические структуры петель H1 и Н2 в представляющем интерес антителе, например, согласно данным рентгеновской кристаллографии, петли H1 и Н2 в представляющем интерес антителе также могут оцениваться как имеющие каноническую складчатую структуру, "преимущественно идентичную" канонической складчатой структуре, которая, как известно, встречается в антителах человека, если длина петли отличается от длины наиболее точного совпадающего канонического структурного класса человека (обычно на +1 или +2 аминокислоты), но фактическая структура петель H1 и Н2 в представляющем интерес антителе совпадает со структурой канонической складки человека. Ключевые аминокислотные остатки первой и второй гипервариабельных петель VH-доменов (H1 и Н2) человека, обнаруженные в канонических структурных классах человека, описаны в работе Chothia и др., J. Mol. Biol. 227:799-817 (1992), содержание которой во всей полноте в порядке ссылки включено в настоящую заявку. В частности, в Таблице 3, которая в порядке ссылки конкретно включена в настоящую заявку, на странице 802 работы Chothia и др. приведены предпочтительные аминокислотные остатки в ключевых положениях канонических структур HI, обнаруженных в клетках зародышевой линии человека, а в Таблице 4 на стр. 803, которая также в порядке ссылки конкретно включена в настоящую заявку, приведены предпочтительные аминокислотные остатки в ключевых положениях канонических структур Н2 CDR, обнаруженных в клетках зародышевой линии человека. В одном из вариантов осуществления как H1, так и Н2 в VH-домене антитела с высокой гомологией белку человека имеют предсказанную или фактическую каноническую складчатую структуру, преимущественно идентичную канонической складчатой структуре, которая встречается в антителах человека. Антитела с высокой гомологией белку человека могут содержать VH-домен, в котором гипервариабельные петли H1 и Н2 образуют комбинацию канонических складчатых структур, идентичную комбинации канонических структур, которая, как известно, встречается, по меньшей мере, в одном VH-домене клеток зародышевой линии человека. Было замечено, что в VH-доменах, кодируемых зародышевой линией клеток человека, фактически встречаются только определенные комбинации канонических складчатых структур H1 и Н2. В одном из вариантов осуществления H1 и Н2 в VH-домене антитела с высокой гомологией белку человека могут быть получены из VH-домена животных помимо человека, но при этом образуют комбинацию предсказанных или фактических канонических складчатых структур, идентичную комбинации канонических структур которая, как известно, встречается в клетках зародышевой линии человека или VH-домене с соматической мутацией. В неограничивающих вариантах осуществления H1 и Н2 в VH-домене антитела с высокой гомологией белку человека могут быть получены из VH-домена животных помимо человека и образуют одну из следующих комбинаций канонических складок: 1-1, 1-2, 1-3, 1-6, 1-4, 2-1, 3-1 и 3-5. Антитело с высокой гомологией белку человека может содержать VH-домен, имеющий высокую гомологию/идентичность последовательностей последовательностям VH человека и содержащий гипервариабельные петли со структурной гомологией VH человека. Может быть выгодным, чтобы канонические складки, присутствующие в H1 и Н2 в VH-домене антитела с высокой гомологией белку человека, и их комбинация была "правильной" для последовательности клеток зародышевой линии VH человека, наиболее точно совпадающей с VH-доменом антитела с высокой гомологией белку человека с точки зрения общей идентичности первичных аминокислотных последовательностей. В качестве примера, если наиболее точным совпадением последовательностей является совпадение с VH3-доменом клеток зародышевой линии человека, может быть выгодным, чтобы для H1 и Н2 образовывали комбинацию канонических складок, которая также встречается в природе в VH3-домене человека. Это может быть особенно важным в случае антител с высокой гомологией белку человека, источником которых являются животные помимо человека, например, содержащих VH- и VL-домены антител, полученных из традиционных верблюжьих антител, в особенности, антител, содержащих гуманизированные верблюжьи VH- и VL-домены. Так, в одном из вариантов осуществления последовательности VH-домена антитела против GPVI с высокой гомологией белку человека могут являться на 70% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более, 95% или более, 97% или более или до 99% или даже на 100% идентичными или гомологичными VH-домену человека на протяжении каркасных областей FR1, FR2, FR3 и FR4, а H1 и Н2 в том же антителе получены из VH-домена животных помимо человека, но образуют комбинацию предсказанных или фактических канонических складчатых структур, идентичную комбинации канонических складок, которая, как известно, встречается в природе в таком же VH-домене человека. В других вариантах осуществления петли L1 и L2 в VL-домене антитела с высокой гомологией белку человека получены из VL-домена животных помимо человека и каждая из них имеет предсказанную или фактическую каноническую складчатую структуру, преимущественно идентичную канонической складчатой структуре, которая встречается в антителах человека. Как и в VH-доменах, гипервариабельные петли VL-доменов как типа V-лямбда, так и типа V-каппа могут иметь ограниченное число конформаций или канонических структур, частично определяемых по длине, а также по присутствию ключевых аминокислотных остатков в определенных канонических положениях.

У представляющего интерес антитела с высокой гомологией белку человека петли L1, L2 и L3, полученные из VL-домена животных помимо человека, например, животных вида верблюжьих, могут оцениваться как имеющие каноническую складчатую структуру, "преимущественно идентичную" канонической складчатой структуре, которая, как известно, встречается в антителах человека при выполнении, по меньшей мере, первого, предпочтительно обоих из следующих критериев.

1. Определяемое числом остатков одинаковое расстояние до наиболее точного совпадающего канонического структурного класса человека.

2. Идентичность, по меньшей мере, на 33%, предпочтительно, по меньшей мере, на 50% ключевым аминокислотным остаткам, описанным для соответствующих канонических структурных классов L1 и L2 человека типа V-каппа или V-лямбда (в целях приведенного выше анализа петли L1 и L2 рассматривают по отдельности и сравнивают каждую из них с наиболее точно совпадающим каноническим структурным классом человека). Приведенный выше анализ основан на предсказании канонической структуры петель L1, L2 и L3 представляющего интерес антитела. Если известны фактические структуры петель L1, L2 и L3 в представляющем интерес антителе, например, согласно данным рентгеновской кристаллографии, петли L1, L2 или L3 в представляющем интерес антителе также могут оцениваться как имеющие каноническую складчатую структуру, "преимущественно идентичную" канонической складчатой структуре, которая, как известно, встречается в антителах человека, если длина петли отличается от длины наиболее точного совпадающего канонического структурного класса человека (обычно на +1 или +2 аминокислоты), но фактическая структура петель совпадает со структурой канонической складки человека. Ключевые аминокислотные остатки, обнаруженные в CDR доменов цепей V-лямбда и доменов цепей V-каппа человека в канонических структурных классах человека, описаны у Morea и др., Methods, 20:267-279 (2000) и Martin и др., J. Mol. Biol, 263:800-815 (1996).

Структурный набор домена цепи V-лямбда человека также описан у Tomlinson и др., EMBO J. 14:4628-4638 (1995), а структурный набор домена цепи V-каппа описан у Williams и др., J. Mol. Biol., 264:220-232 (1996). Содержание всех этих документов в порядки ссылки включено в настоящую заявку. L1 и L2 в VL-домене антитела с высокой гомологией белку человека могут образовывать комбинацию предсказанных или фактических канонических складчатых структур, которая идентична комбинации канонических складчатых структур, которые, как известно, встречаются в VL-домене клеток зародышевой линии человека. В неограничивающих вариантах осуществления L1 и L2 в VL-домене антитела с высокой гомологией белку человека могут образовывать одну из следующих комбинаций канонических складок: 11-7, 13-7 (А, В, С), 14-7 (А, В), 12-11, 14-11 и 12-12 (согласно определению Williams и др., J. Mol. Biol. 264:220-32 (1996), представленных на сайте http://www.bioc.uzh.ch/antibody/Sequences/Germlines/VBase_hVL.html). В неограничивающих вариантах осуществления L1 и L2 в домене V-каппа могут образовывать одну из следующих комбинаций канонических складок: 2-1, 3-1, 4-1 и 6-1 (согласно определению Tomlinson и др., ЕМВО J. 14:4628-38 (1995), представленных на сайте http://www.bioc.uzh.ch/antibody/Sequences/Germliries/ VBase_hVK.html).

В еще одном варианте осуществления все три L1, L2 и L3 в VL-домене антитела с высокой гомологией белку человека могут обладать, преимущественно, присущей человеку структурой. Предпочтительно, чтобы VL-домен антитела с высокой гомологией белку человека имел высокую гомологию/идентичность последовательностям VL-домена человека, а гипервариабельные петли в области VL-домене также имели структурную гомологию VL-домену человека.

В одном из вариантов осуществления последовательности VL-домена антитела против GPVI с высокой гомологией белку человека могут являться на 70% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более, 95% или более, 97% или более или до 99% или даже на 100% идентичными VL-домену человека на протяжении каркасных областей FR1, FR2, FR3 и FR4, а гипервариабельная петля LI и гипервариабельная петля L2 также могут образовывать комбинацию предсказанных или фактических канонических складчатых структур, идентичных комбинации канонических складок, которая, как известно, встречается в природе в таком VL-домене человека. Разумеется, предусмотрено, что VH-домены с высокой гомологией/идентичностью последовательностям VH-домена человека, а также со структурной гомологией гипервариабельным петлям VH-домена человека комбинируются с VL-доменами с высокой гомологией/идентичностью последовательностям VL-домена человека, а также со структурной гомологией гипервариабельными петлям VL-домена человека с целью получения антител с высокой гомологией белку человека, содержащих попарно связанные VH/VL-домены с максимальной гомологией последовательностей и структурной гомологией попарно связанным VH/VL-доменам, кодируемым клетками зародышевой линии человека.

В контексте настоящего изобретения антитело считается "иммуноспецифическим", "специфическим" или "специфически связывающим" антиген, если оно вступает в реакцию с антигеном на обнаруживаемом уровне, предпочтительно с константой аффинности K_A около 10⁶ М^-1 или более, около 10⁷ М^-1 или более, около 10⁸ М^-1 или более, около 1,5×10⁸ М^-1, или более, около 10⁹ М^-1 или более, около 5×10⁹ М^-1 или более. Аффинность антитела его родственному антигену также обычно выражается как константа диссоциации K_D, и в некоторых вариантах осуществления антитело специфически связывает антиген, если K_D составляет 10^-6 М или менее, 10^-7 М или менее, 1,5×10^-8 М или менее, 10^-8 М или менее, 5×10^-9 М или менее или 10^-9 М или менее. Аффинность антител может легко определяться обычными методами, например, описанными у Scatchard G и др. (The attractions of proteins for small molecules and ions. Ann NY Acad Sci 1949, 51:660-612). Свойства антител связывать антигены, клетки или их ткани обычно могут определяться и оцениваться методами иммунодетекции, включая, например, ELISA, методами иммунофлуоресцентного анализа, такими как иммуногистохимия (IHC) и/или сортировки клеток с возбуждением флуоресценции (FACS), или поверхностным плазмонным резонансом (SPR, BIAcore).

Используемый термин "выделенная нуклеиновая кислота" означает нуклеиновую кислоту, преимущественно отделенную от других последовательностей ДНК генома, а также белков или комплексов, таких как рибосомы и полимеразы, которые в природе сопутствуют нативной последовательности. Термин охватывает последовательность нуклеиновых кислот, которые были извлечена из их природной среды, и включает изоляты и химически синтезированные аналоги рекомбинантных или клонированных ДНК или аналоги, биологически синтезированные гетерологичными системами. Преимущественно чистая нуклеиновая кислота включает выделенные формы нуклеиновой кислоты. Разумеется, это относится к нуклеиновой кислоте в первоначально выделенном виде и не исключает генов или последовательностей, которые позднее вручную добавляются человеком к выделенной нуклеиновой кислоте.

Термин "полипептид" используется в его общепринятом значении, т.е. означает последовательность менее 100 аминокислот. Полипептид обычно относится к мономерному объекту.

Термин "белок" относится к последовательности более чем 100 аминокислот и/или к мультимерному объекту. Белки согласно изобретению не ограничены конкретной длиной продукта. Этот термин не включает пост-экспрессионные модификации белка, например, в результате гликозилирования, ацетилирования, фосфорилирования и т.п., а также другие известные из техники модификации, как встречающиеся, так и не встречающиеся в природе. Белком может являться цельный белок или его подпоследовательность. Конкретными белками, представляющими интерес в контексте настоящего изобретения, являются аминокислотные подпоследовательности, содержащие CDR и способные связывать антиген.

"Выделенным белком" является белок, который был идентифицирован, и выделен и/или извлечен из компонента его природной среды. В предпочтительных вариантах осуществления выделенный белок очищают: (1) до достижения концентрации более 80, 85, 90, 95% по весу белка, определенного методом Лоури, наиболее предпочтительно более 96, 97, 98 или 99% по весу, (2) до достижения степени, достаточной для получения, по меньшей мере, 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности путем использования секвенатора с вращающимся стаканом; или (3) до достижения однородности по данным SDS-PAGE в восстановительных или невосстановительных условиях и с использованием окрашивания голубым кумасси или предпочтительно серебром. Выделенный белок включает белок in situ в рекомбинантных клетках ввиду отсутствия, по меньшей мере, одного компонента природной среды антитела. Однако обычно выделенное антитело получают путем, по меньшей мере, одной стадии очистки.

Термин "идентичность" или "идентичный", используемый применительно к взаимосвязи между двумя или более аминокислотными последовательностями, означает степень взаимосвязи между аминокислотными последовательностями, определяемой числом совпадений цепочек двух или более аминокислотных остатков. "Идентичность" является показателем процента идентичных совпадений у меньшей из двух или более последовательностей с выравниваниями разрывов (если они существуют), что определяется конкретной математической моделью или компьютерной программой (то есть "алгоритмами"). Идентичность связанных аминокислотных последовательностей может легко рассчитываться известными способами. Такие методы включают без ограничения методы, описанные Arthur М. Lesk, Computational Molecular Biology: Sources and Methods for Sequence Analysis (New-York: Oxford University Press, 1988); Douglas W. Smith, Biocomputing: Informatics and Genome Projects (New-York: Academic Press, 1993); Hugh G. Griffin и Annette M. Griffin, Computer Analysis of Sequence Data, Part 1 (New Jersey: Humana Press, 1994); Gunnar von Heinje, Sequence Analysis in Molecular Biology: Treasure Trove or Trivial Pursuit (Academic Press, 1987); Michael Gribskov и John Devereux, Sequence Analysis Primer (New York: M. Stockton Press, 1991); и Carillo и др., 1988, SIAM J. Appl. Math. 48(5): 1073-1082. Предпочтительные методы определения идентичности рассчитаны на получение наибольшего совпадения тестируемых последовательностей. Методы определения идентичности описаны в общедоступных компьютерных программах. Предпочтительные компьютерные программные методы определения идентичности двух последовательностей включают пакет программ GCG, в том числе GAP (Devereux и др., 1984, Nucl. Acid. Res. 12(1 Pt l): 387-395; Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, Madison, WI), BLASTP, BLASTN, TBLASTN and FASTA (Altschul и др., 1990, J. Mol. Biol. 215(3): 403-410). Программа BLASTX общедоступна в Национальном центре биотехнологической информации (NCBI) и других источниках (BLAST Manual, Altschul и др., NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul и др., 1990, J. Mol. Biol. 215(3): 403-410). Для определения идентичности также может использоваться хорошо известный алгоритм Смита-Уотермана.

Используемый термин "модифицированное антитело" означает синтетические формы антител, которые изменены таким образом, что они не встречаются в природе, например антитела, которые содержат, по меньшей мере, две области тяжелой цепи, но не две полные тяжелые цепи (такие как, например, антитела или мини-антитела с удаленными доменами); мультиспецифические формы антител (например, биспецифические, триспецифические и т.д.), модифицированные с целью связывания двух или более различных антигенов или различных эпитопов в одном антигене; молекулы тяжелой цепи, присоединенные к молекулам scFv и т.п. Молекулы ScFv известны из техники и описаны, например, в патенте US 5892019. Кроме того, термин "модифицированное антитело" означает многовалентные формы антител (например, трехвалентные, четырехвалентные и т.д., антитела, которые связывают три или более копий одного и того же антигена). В другом варианте осуществления модифицированным антителом согласно изобретению является гибридный белок, содержащий, по меньшей мере, одну область тяжелой цепи, лишенную СН2-домена, и содержащую связывающий домен белка, включающий область связывания одного члена из пары рецептор-лиганд.

Используемый термин "млекопитающее" означает любое млекопитающее, включая людей, сельскохозяйственных животных, а также животных, содержащихся в зоопарках, животных, участвующих в спортивных соревнованиях, или домашних животных, таких как собаки, кошки, крупный рогатый скот, лошади, овцы, свиньи, козы, кролики и т.д. Млекопитающим предпочтительно является примат, более предпочтительно человек.

Используемый термин "моноклональное антитело" означает антитело, полученное из популяции преимущественно гомогенных антител, т.е. отдельные антитела, содержащиеся в популяции, идентичны за исключением возможных встречающихся в природе мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифическими и направленными против одного антигенного сайта. Кроме того, в отличие от препаратов поликлональных антител, которые включают различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одной детерминанты в антигене. Помимо своей специфичности, моноклональные антитела выгодны тем, что их можно синтезировать без загрязнения другими антителами. Определение "моноклональное" не следует интерпретировать как требующее продуцирования антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела, применимые в настоящем изобретении, могут быть получены гибридомным методом, впервые описанным Kohler и др., Nature, 256: 495 (1975), или могут методами рекомбинантных ДНК в бактериальных, эукариотических клетках животных или растений (смотри, например, патент US 4816567). "Моноклональные антитела" также могут выделяться из библиотек фаговых антител методами, описанными, например, у Clackson и др., Nature, 352: 624-628 (1991) и Marks и др., J. Mol. Biol, 222: 581-597 (1991).

Используемый термин нуклеотид "с нативной последовательностью" означает полинуклеотид, который имеет такую же нуклеотидную последовательность, как и полинуклеотид природного происхождения. Соответственно, белком "с нативной последовательностью" является белок, который имеет такую же аминокислотную последовательность, как и белок (например, антитело) природного происхождения (например, животных любых видов). Такие полинуклеотиды и белки с нативными последовательностями могут иметь природное происхождение или могут быть получены рекомбинантными или синтетическими методами.

Используемый термин "вариант" полинуклеотида означает полинуклеотид, который обычно отличается от конкретно описанного в изобретении полинуклеотида одной или несколькими заменами, делециями, добавлениями и/или вставками. Такие варианты могут встречаться в природе или могут быть синтезированы, например, путем модификации одной или нескольких полинуклеотидных последовательностей согласно изобретению и оценки одного или нескольких показателей биологической активности описанных кодированных белков и/или путем использования любого из ряда методов, хорошо известных из техники.

Используемый термин "вариант" белка означает белок, который обычно отличается от конкретно описанного белка одной или несколькими заменами, делециями, добавлениями и/или вставками. Такие варианты могут встречаться в природе или могут быть синтезированы, например, путем модификации одной или нескольких белковых последовательностей согласно изобретению и оценки одного или нескольких показателей биологической активности описанного белка и/или путем использования любого из ряда методов, хорошо известных из техники. В структуру полинуклеотидов и белков согласно настоящему изобретению могут быть внесены модификации с получением при этом функциональной молекулы, которая кодирует вариант или производное белка с желательными характеристиками. Когда желательно изменить аминокислотную последовательность белка, чтобы создать эквивалентный или даже улучшенный вариант или область белка согласно изобретению, специалист в данной области техники обычно изменяет один или несколько кодонов кодирующей последовательности ДНК. Например, некоторые аминокислоты могут замещаться другими аминокислотами в структуре белка без заметной потери способности связывать другие белки (например, антигены) или клетки. Поскольку биологическая функциональная активность белка определяется именно его связывающей способностью и природой, в последовательности белка и, разумеется, в лежащей в ее основе кодирующей последовательности ДНК могут быть сделаны некоторые замены аминокислотных последовательностей с получением при этом белка со сходными свойствами. Таким образом, предусмотрено, что в аминокислотные последовательности описанных композиций или соответствующие последовательности ДНК, которые кодируют указанные белки, могут вноситься различные изменения без существенной потери их биологической применимости или активности. Во многих случаях вариант белка содержит одну или несколько консервативных замен.

"Консервативной заменой" является замена, при которой аминокислота замещена другой аминокислотой со сходными свойствами, в результате чего специалист в области химии пептидов ожидал бы, что вторичная структура и гидропатия белка останутся преимущественно неизменными. Как указано выше, замены аминокислот обычно основаны на относительном сходстве заместителей боковых цепей аминокислот, например, их гидрофобности, гидрофильности, заряда, размера и т.п. Примеры замен с учетом некоторых из вышеперечисленных характеристик, хорошо известны специалистам в данной области техники и включают аргинин и лизин; глутамат и аспартат; серии и треонин; глутамин и аспарагин; и валин, лейцин и изолейцин. Замены аминокислот могут дополнительно осуществляться на основе сходства полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатической природы остатков. Например, отрицательно заряженные аминокислоты включают аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту; положительно заряженные аминокислоты включают лизин и аргинин; и аминокислоты с незаряженными полярными головными группами со сходными значениями гидрофильности включают лейцин, изолейцин и валин; глицин и аланин; аспарагин и глутамин; и серии, треонин, фенилаланин и тирозин. Другие группы аминокислот, которые могут содержать консервативные изменения, включают: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gin, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; и (5) phe, tyr, trp, his. Вариант также может содержать или, в качестве альтернативы, содержит неконсервативные изменения. В одном из предпочтительных вариантов осуществления варианты белков отличаются от нативной последовательности заменой, делецией или добавлением пяти или менее аминокислот. Варианты также могут быть (или в качестве альтернативы) модифицированы, например, путем делеции или добавления аминокислот, которые оказывают минимальное влияние на иммуногенность, вторичную структуру и гидропатию белка.

Используемый термин "фармацевтически приемлемый эксципиент" означает любые растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые препараты, изотонические и задерживающие абсорбцию средства и т.п. Эксципиент не вызывает неблагоприятную, аллергическую или другую нежелательную реакцию при введении животному, предпочтительно человеку. В случае введения человеку препараты должны соответствовать требованиям стерильности, апирогенности и общим стандартам безопасности и чистоты, установленным регламентирующими органами, такими как, например, FDA или ЕМА.

Используемый термин "специфичность" означает способность специфически связывать (например, вступать в иммунную реакцию) заданную мишень, например, GPVI. Белок может являться моноспецифическим и содержать один или несколько сайтов связывания, которые специфически связывают мишень, или белок может являться мультиспецифическим и содержать два или более сайтов связывания, которые специфически связывают одни и те же или различные мишени. В одном из вариантов осуществления антитело согласно изобретению является специфическим в отношении нескольких мишеней. Например, в одном из вариантов осуществления мультиспецифическая связывающая молекула согласно изобретению связывает GPVI и вторую молекулу.

Используемые термины "одноцепочечные Fv", "sFv" или "scFv" означают фрагменты антител, которые содержат VH- и VL-домены антител, объединенные в одну аминокислотную цепь. Аминокислотная последовательность sFv предпочтительно дополнительно содержит пептидный линкер между VH- и VL-доменами, который позволяет sFv формировать желаемую структуру для связывания антигена. Смотри далее обзор sFv у Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, том 113, под редакцией Rosenburg и Moore, издательство Springer, Нью-Йорк, стр. 269-315 (1994); Borrebaeck 1995.

Используемый термин "субъект" означает млекопитающее, предпочтительно человека. В одном из вариантов осуществления субъектом может являться "пациент", то есть теплокровное животное, более предпочтительно человек, который ожидает получения или получает медицинскую помощь или был/является/будет являться объектом медицинской процедуры или наблюдается на предмет развития заболевания.

Используемый термин "синтетический" применительно к белкам включает белки, содержащим аминокислотную последовательность, которая не встречается в природе. Например, не встречающимися в природе белками являются модифицированные формы встречающихся в природе белков (например, содержащие мутацию, такую как добавление, замена или делеция) или белки, содержащие первую аминокислотную последовательность (которая необязательно встречается в природе), связанную в линейной последовательности аминокислот со второй аминокислотной последовательностью (которая необязательно встречается в природе), с которой она не связана в природе.

Термин "терапевтически эффективное количество" означает уровень или количество вещества, которое без значительных отрицательных или неблагоприятных побочных эффектов нацелено на мишень, (1) задерживая или предотвращая начало связанного с GPVI заболевания; (2) замедляя или прекращая прогрессирование, обострение или ухудшение одного или нескольких симптомов связанного с GPVI заболевания; (3) облегчая симптомы связанного с GPVI заболевания; (4) снижая тяжесть или частоту связанного с GPVI заболевания; или (5) излечивая связанное с GPVI заболевание. Терапевтически эффективное количество может вводиться до начала связанного с GPVI заболевания с целью профилактики или предотвращения. В качестве альтернативы или дополнительно терапевтически эффективное количество может вводиться после начала связанного с GPVI заболевания с целью лечения.

Используемые термины "лечение" или "облегчение" относятся как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим или предупреждающим мерам; при этом задачей является предотвращение или замедление (ослабление) целевого патологического состояния или нарушения. В число субъектов, нуждающихся в лечении, входят те, кто уже страдает нарушением, а также те, кто имеет предрасположенность к нарушению, или те, у кого должно быть предотвращено нарушение. У субъекта или млекопитающего успешно "лечат" целевое патологическое состояние или нарушение, если после получения терапевтического количества белка согласно настоящему изобретению у пациента обнаруживается наблюдаемое и/или измеряемое уменьшение или отсутствие одного или нескольких из следующего: уменьшение числа патогенных клеток; уменьшение процента общего числа клеток, которые являются патогенными; и/или облегчение до некоторой степени одного или нескольких симптомов, связанных с конкретным заболеванием или состоянием; снижение заболеваемости и смертности; и повышение качества жизни. Вышеуказанные параметры оценки успешности лечения и положительной динамики заболевания легко поддаются измерению стандартными методами, знакомыми врачам.

Используемый термин "вариабельный" означает, что некоторые области вариабельных VH- и VL-доменов имеют значительные различия в последовательностях антител и участвуют в связывании и специфичности каждого конкретного антитела в отношении его антигена-мишени. Однако вариабельность распределена неравномерно среди вариабельных доменов антител. Она сосредоточена в трех сегментах каждого VL-домена и VH-домена, называемых "гипервариабельными петлями", которые входят в состав антигенсвязывающего сайта. Первая, вторая и третья гипервариабельные петли домена легкой цепи V-лямбда называются L1(λ), L2(λ) и L3(λ) и могут быть охарактеризованы как содержащие остатки 24-33 (L1(λ), состоящая из 9, 10 или 11 аминокислотных остатков), 49-53 (L2(λ), состоящая из 3 остатков) и 90-96 (L3(λ), состоящая из 6 остатков) в VL-домене (Morea и др., Methods 20: 267-279 (2000)). Первая, вторая и третья гипервариабельные петли домена легкой цепи V-каппа называются L1(κ), L2(κ) и L3(κ) и могут быть охарактеризованы как содержащие остатки 25-33 (L1(κ), состоящая из 6, 7, 8, 11, 12 или 13 остатков), 49-53 (L2(κ), состоящая из 3 остатков) и 90-97 (L3(κ), состоящая из 6 остатков) в VL-домене (Morea и др., Methods 20: 267-279 (2000)). Первая, вторая и третья гипервариабельные петли VH-домена называются H1, Н2 и Н3 и могут быть охарактеризованы как содержащие остатки 25-33 (H1, состоящая из 7, 8 или 9 остатков), 52-56 (Н2, состоящая из 3 или 4 остатков) и 91-105 (Н3, высоковариабельная по длине) в VH-домене (Morea и др., Methods 20: 267-279 (2000)). Если не указано иное, термины L1, L2 и L3, соответственно, относятся к первой, второй и третьей гипервариабельным петлям VL-домена, включая гипервариабельные петли, полученные из изотипов как V-каппа, так V-лямбда. Термины H1, Н2 и Н3, соответственно, относятся к первой, второй и третьей гипервариабельным петлям VH-домена, включая гипервариабельные петли, полученные из любого из известных изотипов тяжелой цепи, включая гамма, эпсилон, дельта, альфа или мю. Каждая из гипервариабельных петель L1, L2, L3, H1, Н2 и Н3 может входить в состав "гипервариабельного участка" или "CDR" согласно данному выше определению.

Используемый термин "валентность" относится к числу потенциальных сайтов связывания мишени в белке. Каждый сайт связывания мишени специфически связывает одну молекулу-мишень или конкретную область молекулы-мишени. Когда белок содержит несколько сайтов связывания мишени, каждый сайт связывания мишени может специфически связывать одни и те же или различные молекулы (например, может связывать различные лиганды или различные антигены или различные эпитопы в одном и том же антигене). Рассматриваемые связывающие молекулы предпочтительно имеют, по меньшей мере, один сайт связывания, специфический в отношении молекулы GPVI человека. Описанные белки предпочтительно являются одновалентными.

Объектом настоящего изобретения является выделенный гуманизированный белок, связывающий гликопротеин VI человека (hGPVI), для лечения или применения при лечении связанного с GPVI состояния у нуждающегося в этом субъекта, при этом выделенный гуманизированный белок вводится (или должен вводиться) субъекту в течение, по меньшей мере, 2 часов, предпочтительно в течение, по меньшей мере, 4-6 часов.

В одном из вариантов выделенными гуманизированными белками, связывающими GPVI человека, являются выделенные гуманизированные антитела против GPVI человека

В одном из вариантов осуществления выделенный белок очищают.

В одном из вариантов осуществления изобретения белок связывает внеклеточный домен GPVI.

В одном из вариантов осуществления изобретения белок связывает Ig-подобный домен 2 (D2) типа С2 GPVI человека.

Так, в одном из вариантов осуществления изобретения белок связывает эпитоп, содержащий, по меньшей мере, один аминокислотный остаток из аминокислотных остатков GPVI человека с 14 до 207 (SEQ ID NO: 13) или из последовательности, по меньшей мере, на 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичной на протяжении аминокислотных остатков 114-207 GPVI человека (SEQ ID NO: 13).

В одном из вариантов осуществления упомянутый эпитоп содержит, по меньшей мере, один аминокислотный остаток из аминокислотных остатков 114-187, предпочтительно 115-187, более предпочтительно 116-187, более предпочтительно 117-187, более предпочтительно 118-186, более предпочтительно 119-185, более предпочтительно 120-184, еще более предпочтительно 121-183 GPVI человека (SEQ ID NO: 13) или из последовательности, по меньшей мере, на 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичной на протяжении аминокислотных остатков 114-187, предпочтительно 115-187, более предпочтительно 116-187, более предпочтительно 117-187, более предпочтительно 118-186, более предпочтительно 119-185, более предпочтительно 120-184, еще более предпочтительно 121-183 GPVI человека (SEQ ID NO: 13).

В одном из вариантов осуществления упомянутый эпитоп содержит, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 или более аминокислотных остатков из аминокислотных остатков 114-187, предпочтительно 115-187, более предпочтительно 116-187, более предпочтительно 117-187, более предпочтительно 118-186, более предпочтительно 119-185, более предпочтительно 120-184, еще более предпочтительно 121-183 GPVI человека (SEQ ID NO: 13) или из последовательности, по меньшей мере, на 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичной на протяжении аминокислотных остатков 114-187, предпочтительно 115-187, более предпочтительно 116-187, более предпочтительно 117-187, более предпочтительно 118-186, более предпочтительно 119-185, более предпочтительно 120-184, еще более предпочтительно 121-183 GPVI человека (SEQ ID NO: 13).

В одном из вариантов осуществления эпитоп содержит, по меньшей мере, один (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8) из следующих остатков в последовательности GPVI (SEQ ID NO: 13) 125S, 126S, 128G, 133Q, 136T, 17IT, 172А и/или 174H. В одном из вариантов осуществления эпитоп содержит, по меньшей мере, один (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7) из следующих остатков в последовательности GPVI (SEQ ID NO: 13) 125S, 126S, 128G, 133Q, 171T, 172A и/или 174H.

В одном из вариантов осуществления упомянутый эпитоп содержит, по меньшей мере, один аминокислотный остаток из аминокислотных остатков 114-142, предпочтительно 115-141, более предпочтительно 116-140, более предпочтительно 117-139, более предпочтительно 118-138, более предпочтительно 119-137, более предпочтительно 120-136, еще более предпочтительно 121-135 или 121-136 GPVI человека (SEQ ID NO: 13) или из последовательности, по меньшей мере, на 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичной на протяжении аминокислотных остатков 114-142, предпочтительно 115-141, более предпочтительно 116-140, более предпочтительно 117-139, более предпочтительно 118-138, более предпочтительно 119-137, более предпочтительно 120-136, более предпочтительно 121-135, еще более предпочтительно 121-136 GPVI человека (SEQ ID NO: 13).

В одном из вариантов осуществления упомянутый эпитоп содержит, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 аминокислотных остатков из аминокислотных остатков 114-142, предпочтительно 115-141, более предпочтительно 116-140, более предпочтительно 117-139, более предпочтительно 118-138, более предпочтительно 119-137, более предпочтительно 120-136, еще более предпочтительно 121-135 или 121-136 GPVI человека (SEQ ID NO: 13) или из последовательности, по меньшей мере, на 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичной на протяжении аминокислотных остатков 114-142, предпочтительно 115-141, более предпочтительно 116-140, более предпочтительно 117-139, более предпочтительно 118-138, более предпочтительно 119-137, более предпочтительно 120-136, еще более предпочтительно 121-135 или 121-136 GPVI человека (SEQ ID NO: 13).

В одном из вариантов осуществления упомянутый эпитоп содержит, по меньшей мере, один аминокислотный остаток из аминокислотных остатков 114-135, предпочтительно 115-135, более предпочтительно 116-135, более предпочтительно 117-135, более предпочтительно 118-135, более предпочтительно 119-135, более предпочтительно 120-135, еще более предпочтительно 121-135 или 121-136 GPVI человека (SEQ ID NO: 13) или из последовательности, по меньшей мере, на 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 99% идентичной на протяжении аминокислотных остатков 114-135, предпочтительно 115-135, более предпочтительно 116-135, более предпочтительно 117-135, более предпочтительно 118-135, более предпочтительно 119-135, более предпочтительно 120-135, еще более предпочтительно 121-135 или 121-136 GPVI человека (SEQ ID NO: 13).

В одном из вариантов осуществления упомянутый эпитоп содержит, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 21 аминокислотный остаток из аминокислотных остатков 114-135, предпочтительно 115-135, более предпочтительно 116-135, более предпочтительно 117-135, более предпочтительно 118-135, более предпочтительно 119-135, более предпочтительно 120-135, еще более предпочтительно 121-135 или 121-136 GPVI человека (SEQ ID NO: 13) или из последовательности, по меньшей мере, на 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичной на протяжении аминокислотных остатков 114-135, предпочтительно 115-135, более предпочтительно 116-135, более предпочтительно 117-135, более предпочтительно 118-135, более предпочтительно 119-135, более предпочтительно 120-135, еще более предпочтительно 121-135 или 121-136 GPVI человека (SEQ ID NO: 13).

В одном из вариантов осуществления эпитоп содержит, по меньшей мере, один (например, 1, 2, 3, 4 или 5) следующих остатков в последовательности GPVI (SEQ ID NO: 13): 125S, 126S, 128G, 133Q и/или 136T. В одном из вариантов осуществления эпитоп содержит, по меньшей мере, один (например, 1, 2, 3 или 4) из следующих остатков в последовательности GPVI (SEQ ID NO: 13): 125S, 126S, 128G и/или 133Q.

В одном из вариантов осуществления упомянутый эпитоп содержит, по меньшей мере, один аминокислотный остаток из аминокислотных остатков 165-187, предпочтительно 166-186, более предпочтительно 167-185, более предпочтительно 168-184, еще более предпочтительно 169-183 GPVI человека (SEQ ID NO: 13) или из последовательности, по меньшей мере, на 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичной на протяжении аминокислотных остатков 165-187, предпочтительно 166-186, более предпочтительно 167-185, более предпочтительно 168-184, еще более предпочтительно 169-183 GPVI человека (SEQ ID NO: 13).

В одном из вариантов осуществления упомянутый эпитоп содержит, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 аминокислотных остатка из аминокислотных остатков 165-187, предпочтительно 166-186, более предпочтительно 167-185, более предпочтительно 168-184, еще более предпочтительно 169-183 GPVI человека (SEQ ID NO: 13) или из последовательности, по меньшей мере, на 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичной на протяжении аминокислотных остатков 165-187, предпочтительно 166-186, более предпочтительно 167-185, более предпочтительно 168-184, еще более предпочтительно 169-183 GPVI человека (SEQ ID NO: 13).

В одном из вариантов осуществления эпитоп содержит, по меньшей мере, один (например, 1, 2, 3) из следующих остатков в последовательности GPVI: 171Т, 172А и/или 174Н.

В одном из вариантов осуществления выделенный белок связывает конформационный эпитоп.

В одном из вариантов осуществления упомянутый конформационный эпитоп содержит, по меньшей мере, один, предпочтительно, по меньшей мере, два аминокислотного остатка GPVI человека.

В одном из вариантов осуществления упомянутый конформационный эпитоп содержит, по меньшей мере, один, предпочтительно, по меньшей мере, два аминокислотного остатка Ig-подобного домена 2 (D2) типа С2 GPVI человека.

В одном из вариантов осуществления упомянутый конформационный эпитоп содержит, по меньшей мере, один, предпочтительно, по меньшей мере, два аминокислотных остатка из аминокислотных остатков 114-207 GPVI человека (SEQ ID NO: 13).

В одном из вариантов осуществления упомянутый конформационный эпитоп содержит, по меньшей мере, один аминокислотный остаток из аминокислотных остатков 114-187, предпочтительно 115-187, более предпочтительно 116-187, более предпочтительно 117-187, более предпочтительно 118-186, более предпочтительно 119-185, более предпочтительно 120-184, еще более предпочтительно 121-183 GPVI человека (SEQ ID NO: 13) или из последовательности, по меньшей мере, на 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичной на протяжении аминокислотных остатков 114-187, предпочтительно 115-187, более предпочтительно 116-187, более предпочтительно 117-187, более предпочтительно 118-185, более предпочтительно 120-184, еще более предпочтительно 121-183 GPVI человека (SEQ ID NO: 13).

В одном из вариантов осуществления упомянутый конформационный эпитоп содержит, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 или более аминокислотных остатков из аминокислотных остатков 114-187, предпочтительно 115-187, более предпочтительно 116-187, более предпочтительно 117-187, более предпочтительно 118-186, более предпочтительно 119-185, более предпочтительно 120-184, еще более предпочтительно 121-183 GPVI человека (SEQ ID NO: 13) или из последовательности, по меньшей мере, на 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичной на протяжении аминокислотных остатков 114-187, предпочтительно 115-187, более предпочтительно 116-187, более предпочтительно 117-187, более предпочтительно 118-186, более предпочтительно 119-185, более предпочтительно 120-184, еще более предпочтительно 121-183 GPVI человека (SEQ ID NO: 13).

В одном из вариантов осуществления конформационный эпитоп содержит, по меньшей мере, один (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8) из следующих остатков в последовательности GPVI (SEQ ID NO: 13): 125S, 126S, 128G, 133Q, 136T, 17I T 172A и/или 174Н. В одном из вариантов осуществления конформационный эпитоп содержит, по меньшей мере, один (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7) из следующих остатков в последовательности GPVI (SEQ ID NO: 13): 125S, 126S, 128G, 133Q, 171T, 172A и/или 174H.

В одном из вариантов осуществления упомянутый конформационный эпитоп содержит, по меньшей мере, один аминокислотный остаток из аминокислотных остатков 114-142, предпочтительно 115-141, более предпочтительно 116-140, более предпочтительно 117-139, более предпочтительно 118-138, более предпочтительно 119-137, более предпочтительно 120-136, еще более предпочтительно 121-135 или 121-136 GPVI человека (SEQ ID NO: 13) или из последовательности, по меньшей мере, на 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичной на протяжении аминокислотных остатков 114-142, предпочтительно 115-141, более предпочтительно 116-140, более предпочтительно 117-139, более предпочтительно 118-138, более предпочтительно 119-137, более предпочтительно 120-136, еще более предпочтительно 121-135 или 121-136 GPVI человека (SEQ ID NO: 13).

В одном из вариантов осуществления упомянутый конформационный эпитоп содержит, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 аминокислотных остатков из аминокислотных остатков 114-142, предпочтительно 115-141, более предпочтительно 116-140, более предпочтительно 117-139, более предпочтительно 118-138, более предпочтительно 119-137, более предпочтительно 120-136, еще более предпочтительно 121-135 или 121-136 GPVI человека (SEQ ID NO: 13) или из последовательности, по меньшей мере, на 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичной на протяжении аминокислотных остатков 114-142, предпочтительно 115-141, более предпочтительно 116-140, более предпочтительно 117-139, более предпочтительно 118-138, более предпочтительно 119-137, более предпочтительно 120-136, еще более предпочтительно 121-135 или 121-136 GPVI человека (SEQ ID NO: 13).

В одном из вариантов осуществления упомянутый конформационный эпитоп содержит, по меньшей мере, один аминокислотный остаток из аминокислотных остатков 114-135, предпочтительно 115-135, более предпочтительно 116-135, более предпочтительно 117-135, более предпочтительно 118-135, более предпочтительно 119-135, более предпочтительно 120-135, еще более предпочтительно 121-135 или 121-136 GPVI человека (SEQ ID NO: 13), или из последовательности, по меньшей мере, на 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичной на протяжении аминокислотных остатков 114-135, предпочтительно 115-135, более предпочтительно 116-135, более предпочтительно 117-135, более предпочтительно 118-135, более предпочтительно 119-135, более предпочтительно 120-135, еще более предпочтительно 121-135 или 121-136 GPVI человека (SEQ ID NO: 13).

В одном из вариантов осуществления упомянутый конформационный эпитоп содержит, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 аминокислотных остатков из аминокислотных остатков 114-135, предпочтительно 115-135, более предпочтительно 116-135, более предпочтительно 117-135, более предпочтительно 118-135, более предпочтительно 119-135, более предпочтительно 120-135, еще более предпочтительно 121-135 или 121-136 GPVI человека (SEQ ID NO: 13) или из последовательности, по меньшей мере, на 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичной на протяжении аминокислотных остатков 114-135, предпочтительно 115-135, более предпочтительно 116-135, более предпочтительно 117-135, более предпочтительно 118-135, более предпочтительно 119-135, более предпочтительно 120-135, еще более предпочтительно 121-135 или 121-136 GPVI человека (SEQ ID NO: 13).

В одном из вариантов осуществления конформационный эпитоп содержит, по меньшей мере, один (например, 1, 2, 3, 4 или 5) из следующих остатков в последовательности GPVI (SEQ ID NO: 13): 125S, 126S, 128G, 133Q и/или 136T. В одном из вариантов осуществления конформационный эпитоп содержит, по меньшей мере, один (например, 1, 2, 3 или 4) из следующих остатков в последовательности GPVI

(SEQ ID NO: 13): 125S, 126S, 128G и/или 133Q.

В одном из вариантов осуществления упомянутый конформационный эпитоп содержит, по меньшей мере, один аминокислотный остаток из аминокислотных остатков 165-187, предпочтительно 166-186, более предпочтительно 167-185, более предпочтительно 168-184, еще более предпочтительно 169-183 GPVI человека (SEQ ID NO: 13) или из последовательности, по меньшей мере, на 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичной на протяжении аминокислотных остатков 165-187, предпочтительно 166-186, более предпочтительно 167-185, более предпочтительно 168-184, еще более предпочтительно 169-183 GPVI человека (SEQ ID NO: 13).

В одном из вариантов осуществления упомянутый конформационный эпитоп содержит, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 аминокислотных остатка из аминокислотных остатков 165-187, предпочтительно 166-186, более предпочтительно 167-185, более предпочтительно 168-184, еще более предпочтительно 169-183 GPVI человека (SEQ ID NO: 13) или из последовательности, по меньшей мере, на 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичной на протяжении аминокислотных остатков 165-187, предпочтительно 166-186, более предпочтительно 167-185, более предпочтительно 168-184, еще более предпочтительно 169-183 GPVI человека (SEQ ID NO: 13).

В одном из вариантов осуществления конформационный эпитоп содержит, по меньшей мере, один (например, 1, 2, 3) из следующих остатков в последовательности GPVI: 171Т, 172А и/или 174Н.

В одном из вариантов осуществления упомянутый конформационный эпитоп содержит:

по меньшей мере, один аминокислотный остаток из аминокислотных остатков 114-142, предпочтительно 115-141, более предпочтительно 116-140, более предпочтительно 117-139, более предпочтительно 118-138, более предпочтительно 119-137, более предпочтительно 120-136, еще более предпочтительно 121-135 или 121-136 GPVI человека (SEQ ID NO: 13) или из последовательности, по меньшей мере, на 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичной на протяжении аминокислотных остатков 114-142, предпочтительно 115-141, более предпочтительно 116-140, более предпочтительно 117-139, более предпочтительно 118-138, более предпочтительно 119-137, более предпочтительно 120-136, еще более предпочтительно 121-135 или 121-136 GPVI человека (SEQ ID NO: 13), и

по меньшей мере, один аминокислотный остаток из аминокислотных остатков 165-187, предпочтительно 166-186, более предпочтительно 167-185, более предпочтительно 168-184, еще более предпочтительно 169-183 GPVI человека (SEQ ID NO: 13) или из последовательности, по меньшей мере, на 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичной на протяжении аминокислотных остатков 165-187, предпочтительно 166-186, более предпочтительно 167-185, более предпочтительно 168-184, еще более предпочтительно 169-183 GPVI человека (SEQ ID NO: 13).

В одном из вариантов осуществления упомянутый конформационный эпитоп содержит:

по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 аминокислотных остатков из аминокислотных остатков 114-142, предпочтительно 115-141, более предпочтительно 116-140, более предпочтительно 117-139, более предпочтительно 118-138, более предпочтительно 119-137, более предпочтительно 120-136, еще более предпочтительно 121-135 или 121-136 GPVI человека (SEQ ID NO 13) или из последовательности, по меньшей мере, на 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичной на протяжении аминокислотных остатков 114-142, предпочтительно 115-141, более предпочтительно 116-140, более предпочтительно 117-139, более предпочтительно 118-138, более предпочтительно 119-137, более предпочтительно 120-136, еще более предпочтительно 121-135 или 121-136 GPVI человека (SEQ ID NO: 13); и

по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 аминокислотных остатка из аминокислотных остатков 165-187, предпочтительно 166-186, более предпочтительно 167-185, более предпочтительно 168-184, еще более предпочтительно 169-183 GPVI человека (SEQ ID NO: 13) или из последовательности, по меньшей мере, на 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 99% идентичной на протяжении аминокислотных остатков 165-187, предпочтительно 166-186, более предпочтительно 167-185, более предпочтительно 168-184, еще более предпочтительно 169-183 GPVI человека (SEQ ID NO: 13).

В одном из вариантов осуществления упомянутый конформационный эпитоп содержит:

по меньшей мере, один аминокислотный остаток из аминокислотных остатков 114-135, предпочтительно 115-135, более предпочтительно 116-135, более предпочтительно 117-135, более предпочтительно 118-135, более предпочтительно 119-135, более предпочтительно 120-135, еще более предпочтительно 121-135 или 121-136 GPVI человека (SEQ ID NO: 13) или из последовательности, по меньшей мере, на 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичной на протяжении аминокислотных остатков 114-135, предпочтительно 115-135, более предпочтительно 116-135, более предпочтительно 117-135, более предпочтительно 118-135, более предпочтительно 119-135, более предпочтительно 120-135, еще более предпочтительно 121-135 или 121-136 GPVI человека (SEQ ID NO: 13); и

по меньшей мере, один аминокислотный остаток из аминокислотных остатков 165-187, предпочтительно 166-186, более предпочтительно 167-185, более предпочтительно 168-184, еще более предпочтительно 169-183 GPVI человека (SEQ ID NO: 13) или из последовательности, по меньшей мере, на 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичной на протяжении аминокислотных остатков 165-187, предпочтительно 166-186, более предпочтительно 167-185, более предпочтительно 168-184, еще более предпочтительно 169-183 GPVI человека (SEQ ID NO: 13).

В одном из вариантов осуществления упомянутый конформационный эпитоп содержит:

по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 аминокислотный остаток из аминокислотных остатков 114-135, предпочтительно 115-135, более предпочтительно 116-135, более предпочтительно от 117-135, более предпочтительно 118-135, более предпочтительно от 119-135, более предпочтительно 120-135, еще более предпочтительно 121-135 или 121-136 GPVI человека (SEQ ID NO: 13) или из последовательности, по меньшей мере, на 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичной на протяжении аминокислотных остатков 114-135, предпочтительно 115-135, более предпочтительно 116-135, более предпочтительно 117-135, более предпочтительно 118-135, более предпочтительно от 119-135, более предпочтительно 120-135, еще более предпочтительно 121-135 или 121-136 GPVI человека (SEQ ID NO 13); и

1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22 аминокислотных остатка из аминокислотных остатков 165-187, предпочтительно 166-186, более предпочтительно 167-185, более предпочтительно 168-184, еще более предпочтительно 169-183 GPVI человека (SEQ ID NO: 13) или из последовательности, по меньшей мере, на 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) идентичной на протяжении аминокислотных остатков 165-187, предпочтительно 166-186, более предпочтительно 167-185, более предпочтительно 168-184, еще более предпочтительно 169-183 GPVI человека (SEQ ID NO: 13).

В одном из вариантов осуществления упомянутый конформационный эпитоп содержит, по меньшей мере, один аминокислотный остаток из аминокислотных остатков 121-135 или 121-136 GPVI человека (SEQ ID NO: 13) или из последовательности, по меньшей мере, на 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичной на протяжении аминокислотных остатков 121-135 или 121-136 GPVI человека (SEQ ID NO: 13), и, по меньшей мере, один аминокислотный остаток из аминокислотных остатков 169-183 GPVI человека (SEQ ID NO 13) или из последовательности, по меньшей мере, на 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичной на протяжении аминокислотных остатков 169-183 GPVI человека (SEQ ID NO: 13).

Так, в одном из вариантов осуществления изобретения белок связывает конформационный эпитоп, содержащий, по меньшей мере, один аминокислотный остаток из аминокислотных остатков 121-135 или 121-136 GPVI человека (SEQ ID NO: 13) или из последовательности, по меньшей мере, на 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичной на протяжении аминокислотных остатков 121-135 или 121-136 GPVI человека (SEQ ID NO: 13), и, по меньшей мере, один аминокислотный остаток из аминокислотных остатков 169-183 GPVI человека (SEQ ID NO 13) или из последовательности, по меньшей мере, на 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичной на протяжении аминокислотных остатков 169-183 GPVI человека (SEQ ID NO: 13).

В одном из вариантов осуществления упомянутый конформационный эпитоп содержит, по меньшей мере, один аминокислотный остаток из аминокислотных остатков 121-135 или 121-136 GPVI человека (SEQ ID NO: 13) или из последовательности, по меньшей мере, на 60%, 70%, 15%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичной на протяжении аминокислотных остатков 121-135 или 121-136 GPVI человека (SEQ ID NO: 13), и, по меньшей мере, один аминокислотный остаток из аминокислотных остатков 169-180 GPVI человека (SEQ ID NO: 13) или из последовательности, по меньшей мере, на 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичной на протяжении аминокислотных остатков 169-180 GPVI человека (SEQ ID NO: 13).

Так, в одном из вариантов осуществления изобретения белок связывает конформационный эпитоп, содержащий, по меньшей мере, один аминокислотный остаток из аминокислотных остатков 121-135 или 121-136 GPVI человека (SEQ ID NO: 13) или из последовательности, по меньшей мере, на 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичной на протяжении аминокислотных остатков 121-135 или 121-136 GPVI человека (SEQ ID NO: 13), и, по меньшей мере, один аминокислотный остаток из аминокислотных остатков 169-180 GPVI человека (SEQ ID NO 13) или из последовательности, по меньшей мере, на 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичной на протяжении аминокислотных остатков 169-180 GPVI человека (SEQ ID NO: 13).

В одном из вариантов осуществления конформационный эпитоп содержит, по меньшей мере, один (например, 1, 2, 3, 4 или 5) из следующих остатков в последовательности GPVI (SEQ ID NO: 13): 125S, 126S, 128G, 133Q и/или 136T; и, по меньшей мере, один (например, 1, 2 или 3) следующих остатков в последовательности GPVI (SEQ ID NO: 13): 171T, 172A и/или 174H.

В одном из вариантов осуществления конформационный эпитоп содержит, пПо меньшей мере один (например, 1, 2, 3 или 4) из следующих остатков в последовательности GPVI (SEQ ID NO: 13): 125S, 126S, 128G и/или 133Q; и, по меньшей мере, один (например, 1, 2 или 3) из следующих остатков в последовательности GPVI (SEQ ID NO: 13): 171T, 172A и/или 174H.

В одном из вариантов осуществления конформационный эпитоп содержит следующие остатки в последовательности GPVI (SEQ ID NO: 13): 125S, 126S, 128G, 133Q и 136Т; и следующие остатки в последовательности GPVI (SEQ ID NO: 13): 171T, 172A и 174H.

В одном из вариантов осуществления конформационный эпитоп содержит следующие остатки в последовательности GPVI (SEQ ID NO: 13): 125S, 126S, 128G и 133Q; и следующие остатки в последовательности GPVI (SEQ ID NO: 13): 171T, 172А и 174Н.

В одном из вариантов осуществления упомянутый конформационный эпитоп состоит из:

аминокислотных остатков 121-135 или 121-136 GPVI человека (SEQ ID NO: 13) или последовательности, по меньшей мере, на 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) идентичной на протяжении аминокислотных остатков 121-135 или 121-136 GPVI человека (SEQ ID NO: 13); и

аминокислотных остатков 169-183 GPVI человека (SEQ ID NO: 13) или последовательности, по меньшей мере, на 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичной на протяжении аминокислотных остатков 169-183 GPVI человека (SEQ ID NO: 13).

Так, в одном из вариантов осуществления изобретения белок связывает конформационный эпитоп, состоящий из:

аминокислотных остатков 121-135 или 121-136 GPVI человека (SEQ ID NO: 13) или последовательности, по меньшей мере, на 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) идентичной на протяжении аминокислотных остатков 121-135 или 121-136 GPVI человека (SEQ ID NO: 13); и

аминокислотных остатков 169-183 GPVI человека (SEQ ID NO: 13) или последовательности, по меньшей мере, на 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичной на протяжении аминокислотных остатков 169-183 GPVI человека (SEQ ID NO: 13).

В одном из вариантов осуществления упомянутый конформационный эпитоп состоит из:

аминокислотных остатков 121-135 или 121-136 GPVI человека (SEQ ID NO: 13) или последовательности, по меньшей мере, на 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) идентичной на протяжении аминокислотных остатков 121-135 или 121-136 GPVI человека (SEQ ID NO: 13); и

аминокислотных остатков 169-180 GPVI человека (SEQ ID NO: 13) или последовательности, по меньшей мере, на 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичной на протяжении аминокислотных остатков 169-180 GPVI человека (SEQ ID NO: 13).

Так, в одном из вариантов осуществления изобретения белок связывает конформационный эпитоп, состоящий из:

аминокислотных остатков 121-135 или 121-136 GPVI человека (SEQ ID NO: 13) или последовательности, по меньшей мере, на 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) идентичной на протяжении аминокислотных остатков 121-135 или 121-136 GPVI человека (SEQ ID NO: 13); и

аминокислотных остатков 169-180 GPVI человека (SEQ ID NO: 13) или последовательности, по меньшей мере, на 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичной на протяжении аминокислотных остатков 169-180 GPVI человека (SEQ ID NO: 13).

В одном из вариантов осуществления изобретения выделенный белок, связывающий GPVI человека, при применения в настоящем изобретении, имеет K_D связывания GPVI человека, предпочтительно растворимого GPVI человека 15 нМ или меньше, предпочтительно 10 нМ или меньше, более предпочтительно 5 нМ или меньше.

В одном из вариантов осуществления выделенный белок имеет k_off связывания GPVI человека около 8,10^-4 сек^-1 или меньше, предпочтительно около 6,10^-4 сек^-1 или меньше, более предпочтительно около 4,10^-4 сек^-1 или меньше.

В одном из вариантов осуществления выделенный белок имеет k_on связывания GPVI человека, по меньшей мере, около 5⋅10⁴ М^-1 сек^-1, предпочтительно, по меньшей мере, около 5,5⋅10⁴ М^-1 сек^-1, более предпочтительно, по меньшей мере, около 5,9⋅10⁴ М^-1 сек^-1, еще более предпочтительно, по меньшей мере, около 6⋅10⁴ М^-1 сек^-1.

В одном из вариантов K_D может определяться путем поверхностного плазмонного резонанса (SPR, BIAcore) с использованием иммобилизованного растворимого GPVI в дозе от около 700 до около 1600 резонансных единиц (RU) (что соответствует от около 8,5 до около 11,3 фмоль/мм²), предпочтительно от около 850 до около 1200 RU, более предпочтительно от около 950 до около 1075 RU и/или с использованием PBS с рН 7,4 в качестве рабочего буфера и/или с использованием версии 3.0 программного обеспечения BIAevaluation для анализа данных. В одном из вариантов растворимый GPVI соответствует внеклеточному домену GPVI, С-конец которого посредством линкера (такого как, например, линкер Gly-Gly-Arg) слит с последовательностью hFc. Этот растворимый GPVI может именоваться растворимым GPVI-Fc.

Способы определения аффинности белка лиганду хорошо известны из техники. Далее приведен один из примеров способа определения аффинности белка растворимому GPVI.

Связывание белком растворимого GPVI человека анализируют путем поверхностного плазмонного резонанса с использованием системы BIAcore 2000 (Уппсала, Швеция).

Иммобилизуют растворимый GPVI-Fc в дозе от около 700 до около 1600 RU (что соответствует от около 8,5 до 11,3 фмоль/мм²), предпочтительно от около 850 до около 1200 RU, более предпочтительно от около 950 до около 1075 RU и еще более предпочтительно от около 960 до около 1071 RU на микросхеме датчика СМ5 карбоксиметил-декстрана методом связывания амина (процедура Wizard). Затем пропускают белок над иммобилизованным GPVI-Fc в PBS с рН 7,4 (10 мМ фосфата, 138 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, рН 7,42 при 25,4°С) со скоростью 20 мкл/ч при 25°С. Определяют кинетические константы (k_on, k_off) и аффинность с использованием версии 3.0 программного обеспечения BIAevaluation путем подгонки данных к модели связывания. PBS с рН 7,4 является подвижным буфером.

В одном из вариантов осуществления изобретения белком для применения в настоящем изобретении является молекула антитела или ее фрагмент, выбранный из группы, включающей цельное антитело, гуманизированное антитело, одноцепочечное антитело, димерное одноцепочечное антитело, Fv, Fab, F(ab)'2, дефукозилированное антитело, биспецифическое антитело, диатело, триатело и тетратело.

В другом варианте осуществления изобретения белком для применения в настоящем изобретении является фрагмент антитела, выбранный из группы, включающей унитело, доменное антитело и нанотело.

В другом варианте осуществления изобретения белком для применения в настоящем изобретении является антитело-миметик, выбранное из группы, включающей аффинное антитело, аффилин, аффитин, аднектин, атример, эвазин, DARPin, антикалин, авимер, финомер, версатело и дуокалин.

Доменное антитело хорошо известно из техники и относится к наименьшим функциональным связывающим единицам антител, соответствующим вариабельным областям тяжелых или легких цепей антител.

Нанотело хорошо известно из техники и относится к полученному из антитела терапевтическому белку, который имеет уникальные структурные и функциональные свойства встречающихся в природе антител с тяжелыми цепями. Эти антитела с тяжелыми цепями могут содержать один вариабельный домен (VHH) и два константных домена (СН2 и СН3).

Унитело хорошо известно из техники и относится к фрагменту антитела, у которого отсутствует шарнирная область антител IgG4. Делеция шарнирной области приводит к образованию молекулы преимущественно вдвое меньшего размера, чем у традиционных антител IgG4, которая имеет область одновалентного связывания вместо области двухвалентного связывания антител IgG4.

Аффитело хорошо известно из техники и относится к аффинным белкам на основе домена белка из 58 аминокислотных остатков, полученного из одного из IgG-связывающих доменов белка А стафилококка.

DARPin (сконструированные белки с анкириновыми повторами) хорошо известны из техники и относятся к антителу-миметику DRP (сконструированному белку с повторами), разработанному с целью использования связывающих способностей белков, не являющихся антителами.

Антикалины хорошо известны из техники и относятся к другой технологии имитации антител, чья специфичность унаследована от липокалинов. Антикалины также могут иметь формат белка с двойным нацеливанием, называемого дуокалином.

Авимеры хорошо известны из техники и относятся к другой технологии миметиков антител.

Версатела хорошо известны из техники и относятся к другой технологии имитации антител. Они представляют собой небольшие белки с молекулярной массой 3-5 кДа и содержанием цистеинов >15%, которые образуют каркас с высокой плотностью дисульфидов вместо гидрофобной сердцевины, которую имеют типичные белки.

В одном из вариантов осуществления белок согласно изобретению является одновалентным и предпочтительно выбран из цельного одновалентного антитела, гуманизированного одновалентного антитела, одноцепочечного антитела, Fv, Fab или фрагмента антитела, выбранного из группы, включающей унитело, доменное антитело и нанотело; или из мономерного антитела-миметика, выбранного из группы, включающей аффитело, аффилин, аффитин, аднектин, атример, эвазин, DARPin, антикалин, авимер, финомер и версатело.

В другом варианте осуществления белком для применения в настоящем изобретении является иммуноконъюгат, содержащий антитело или его фрагмент, конъюгированный с терапевтическим средством.

В другом варианте осуществления изобретения белком для применения в настоящем изобретении является конъюгат, содержащий белок, конъюгированный с визуализирующим агентом. Указанный белок можно использовать, например, для получения изображений.

В одном из вариантов осуществления изобретения белком для применения в настоящем изобретении является моноклональное антитело или его фрагмент.

В другом варианте осуществления изобретения белком для применения в настоящем изобретении является поликлональное антитело или его фрагмент.

Таким образом, другим объектом изобретения является антитело против hGPVI или его антигенсвязывающий фрагмент для лечения или для применения при лечении связанного с GPVI заболевания у нуждающегося в этом субъекта, при это антитело против hGPV1 или его антигенсвязывающий фрагмент вводится (или должен вводиться) субъекту в течение, по меньшей мере, 2 часов, предпочтительно в течение, по меньшей мере, 4-6 часов.

В одном из вариантов осуществления вариабельная область тяжелой цепи антитела против hGPV1 или его антигенсвязывающего фрагмента для применения в настоящем изобретении содержит, по меньшей мере, один из следующих CDR:

VH-CDR1: GYTFIT SYNMH (SEQ ID NO: 1);

VH-CDR2: GIYPGNGDTSYQKFQG (SEQ ID NO: 2); и

VH-CDR3: GTPVVGDWYFDV (SEQ ID NO: 3).

Нумерация и определение CDR дано согласно Kabat/Chothia.

В одном из вариантов осуществления вариабельная область легкой цепи антитела против hGPV1 или его антигенсвязывающего фрагмента для применения в настоящем изобретении содержит, по меньшей мере, один из следующих CDR:

V1-CDR1: RSSQSLENSNGNTYLN (SEQ ID NO: 4);

VL-CDR2: RVS RFS (SEQ ID NO: 5); и

VL-CDR3: LQLTHVPWT (SEQ ID NO: 6).

Нумерация и определение CDR дано согласно Kabat/Chothia.

В одном из вариантов осуществления антитело против hGPV1 или его антигенсвязывающий фрагмент для применения в настоящем изобретении содержит:

по меньшей мере, один из следующих CDR в тяжелой цепи:

GYTFTSYNME (SEQ ID NO: 1), GIYPGGDTSYNQKFQG (SEQ ID NO: 2) и GTVVGDWYFDV (SEQ ID NO: 3); и/или

по меньшей мере, один из следующих CDR в легкой цепи:

RSSQSLENGNTYLN (SEQ ID NO: 4), RVSNRFS (SEQ ID NO: 5) И LQLTHVPWT (SEQ ID NO: 6).

В другом варианте осуществления изобретения антитело против hGPV1 или его антигенсвязывающий фрагмент для применения в настоящем изобретении содержит три CDR: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3 в своей тяжелой цепи.

В другом варианте осуществления изобретения антитело против hGPV1 или его антигенсвязывающий фрагмент для применения в настоящем изобретении содержит три CDR: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6 в своей легкой цепи.

В другом варианте осуществления изобретения антитело против hGPV1 или его антигенсвязывающий фрагмент для применения в настоящем изобретении содержит три CDR: SEQ ID NO: 1. SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3 в своей тяжелой цепи и три CDR SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6 в своей легкой цепи.

В другом варианте осуществления изобретения антитело против hGPV1 или его антигенсвязывающий фрагмент для применения в настоящем изобретении содержит три CDR SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3 в своей тяжелой цепи и три CDR SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6 в своей легкой цепи, при этом одна, две, три или более аминокислот в любой из указанных последовательностей могут быть необязательно замещены другой аминокислотой.

Согласно изобретению любой из CDR 1, 2 и 3 тяжелой и легкой цепей может быть охарактеризован как имеющий аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичную конкретному CDR или наборам CDR, перечисленным в соответствующей SEQ ID NO.

В другом варианте осуществления изобретения антителом против hGPV1 или его антигенсвязывающим фрагментом для применения в настоящем изобретении является антитело, содержащее:

(i) CDR 1, 2 и 3 тяжелой цепи (VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3), содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1, 2 и 3 соответственно; и

(ii) CDR 1, 2 и 3 легкой цепи (VL-CDR1, VL-CDR2, VL-CDR3), содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 4, 5 и 6, соответственно;

при этом одна, две, три или более аминокислот в любой из указанных последовательностей могут быть необязательно заменены другой аминокислотой.

В одном из вариантов осуществления антитело против GPVI или его антигенсвязывающий фрагмент для применения в настоящем изобретении содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность или состоящую из последовательности SEQ ID NO: 7

(SEQ ID NO: 7)

В одном из вариантов осуществления антитело против GPVI или его антигенсвязывающий фрагмент для применения в настоящем изобретении содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность или состоящую из последовательности SEQ ID NO: 8.

(SEQ ID NO: 8).

В одном из вариантов осуществления антитело против GPVI или его антигенсвязывающий фрагмент для применения в настоящем изобретении содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность или состоящую из последовательности SEQ ID NO: 9.

(SEQ ID NO: 9).

В другом варианте осуществления изобретения антитело против GPVI (антитело АСТ017) или его антигенсвязывающий фрагмент для применения в настоящем изобретении содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность или состоящую из последовательности SEQ ID NO: 7, и вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность или состоящую из последовательности SEQ ID NO: 8.

В другом варианте осуществления изобретения антитело против GPV1 (антитело АСТ006) или его антигенсвязывающий фрагмент для применения в настоящем изобретении содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность или состоящую из последовательности SEQ ID NO: 7 и вариабельная область легкой цепи, содержащую последовательность или состоящую из последовательности SEQ ID NO: 9.

Согласно изобретению одна, две, три или более аминокислот описанных выше вариабельных областей тяжелой цепи или вариабельных областей легкой цепи могут быть заменены другой аминокислотой.

В другом варианте осуществления антитело (или его фрагмент) для применения в настоящем изобретении содержит вариабельные области тяжелых и легких цепей, имеющие аминокислотные последовательности, гомологичные аминокислотным последовательностям описанного антитела АСТ017, при этом антитела сохраняют желаемые функциональные свойства белка, описанного в настоящем изобретении.

В другом варианте осуществления антитело (или его фрагмент) для применения в настоящем изобретении содержит вариабельные области тяжелых и легких цепей, имеющие аминокислотные последовательности, гомологичные аминокислотным последовательностям описанного антитела АСТ006, при этом антитела сохраняют требуемые функциональные свойства белка, описанного в настоящем изобретении.

В соответствии с настоящим изобретением вариабельная область тяжелой цепи содержит последовательности, на 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичные SEQ ID NO: 7.

Согласно изобретению вариабельная область легкой цепи содержит последовательности, на 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичные SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 9.

В любом из антител согласно изобретению (например, АСТ017 или АСТ006), указанные последовательности вариабельных областей и CDR могут содержать консервативные модификации последовательностей. Консервативные модификации последовательностей относятся к модификациям аминокислот, которые не оказывают существенного влияния на связывающие характеристики антитела, содержащего аминокислотную последовательность, или не изменяют их. Такие консервативные модификации включают аминокислотные замены, добавления и делеции. Модификации могут вводиться в антитело согласно изобретению известными из техники стандартными методами, такими как сайт-направленный мутагенез и опосредованный ПЦР мутагенез. Консервативными аминокислотными заменами обычно являются замены, при которых аминокислотный остаток заменяется аминокислотным остатком, имеющим боковую цепь со сходными физико-химическими свойствами. Указанные последовательности вариабельных областей и CDR могут содержать одну, две, три, четыре или более аминокислотных вставок, делеций или замен. В случае замен предпочтительными заменами являются консервативные модификации. Из техники известны семейства аминокислотных остатков, имеющих сходные боковые цепи. Эти семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серии, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, один или несколько аминокислотных остатков в областях CDR антитела согласно изобретению могут заменяться другими аминокислотными остатками из того же семейства боковых цепей, и измененное антитело может подвергаться проверке на сохранение функций (т.е. описанных свойств) путем описанных испытаний.

В одном из вариантов осуществления антитело (или его фрагмент) для применения в настоящем изобретении связывает преимущественно тот же эпитоп, что и антитело АСТ017 или антитело АСТ006. В настоящем изобретении антитело, которое связывает преимущественно тот же эпитоп, что и антитело АСТ017 или антитело АСТ006, именуется АСТ017-подобным или АСТ006-подобным антителом, соответственно.

В одном из вариантов осуществления антитело (или его фрагмент) для применения в настоящем изобретении конкурирует за связывание hGPVI с описанным выше антителом, в частности, с антителом, выбранным из АСТ017 и АСТ006.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитела против hGPVI или их фрагменты, содержащие VH- и VL-домены, или их CDR могут содержать СН1- и/или CL-домены, аминокислотная последовательность которых является полностью или преимущественно присущей человеку. Если антигенсвязывающим белком согласно изобретению является антитело, предназначенное для применения в целях терапии человека, вся константная область антитела или, по меньшей мере, ее часть обычно имеет полностью или преимущественно присущую человеку аминокислотную последовательность. Следовательно, аминокислотная последовательность одной или нескольких или любой комбинации СН1-домена, шарнирной области, СН2-домена, СН3-домена и CL-домена (и СН4-домена, если он присутствуют) может являться полностью или преимущественно присущей человеку. СН1-домен, шарнирная область, СН2-домен, СН3-домен и CL-домен (и СН4-домен, если он присутствует) во всех случаях предпочтительно могут иметь полностью или преимущественно присущую человеку аминокислотную последовательность. Применительно к константной области гуманизированного или химерного антитела или фрагмента антитела термин "преимущественно человеческая" означает, что аминокислотная последовательность, по меньшей мере, на 70% или, по меньшей мере, на 80% или, по меньшей мере, на 90%, или, по меньшей мере, на 95%, или, по меньшей мере, на 97%, или, по меньшей мере, на 99% идентична константной области человека. Термин "аминокислотная последовательность человека" в этом контексте означает аминокислотную последовательность, которую кодирует ген человека, который включает гены клеток зародышевой линии, перегруппированные гены и гены с соматической мутацией. В изобретении также предусмотрены белки, содержащие константные домены аминокислотной последовательности человека, которые были изменены путем одного или нескольких добавлений, делеций или замен аминокислот относительно аминокислотной последовательности человека, за исключением тех вариантов осуществления, в которых в прямой форме требуется присутствие "полностью человеческой" шарнирной области. Присутствие "полностью человеческой" шарнирной области в антителах против hGPVI согласно изобретению может являться полезным как для сведения к минимуму иммуногенности, так и для оптимизации стабильности антитела. Считается, что в константной области тяжелой и/или легкой цепи, в особенности, в пределах области Fc может быть сделана одна или несколько аминокислотных замен, вставок или делеций. Замены аминокислот могут приводить к замене заменяемой аминокислоты другой природной аминокислотой или не встречающейся в природе или модифицированной аминокислотой. Также допустимы другие структурные модификации, такие как, например, изменения в схеме гликозилирования (например, путем добавления или делеций N- или О-связанных сайтов гликозилирования). В зависимости от предполагаемого применения антитела может быть желательным модифицировать антитело согласно изобретению в том, что касается его связывающих свойств в отношении Fc-рецепторов, например, с целью модуляции эффекторной функции. Например, в Fc-область может вводиться цистеиновый остаток(-ки), что тем самым обеспечивает формирование межцепочечной дисульфидной связи в этой области. Полученное таким образом гомодимерное антитело может иметь улучшенную эффекторную функцию. Смотри Caron и др., J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992) и Shopes, В.J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992).

В одном из вариантов осуществления вариабельную область тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 7 кодирует SEQ ID NO: 10.

(SEQ ID NO: 10)

В одном из вариантов осуществления вариабельную область легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 8 кодирует SEQ ID NO: 11.

(SEQ ID NO: 11)

В одном из вариантов осуществления вариабельную область легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 9 кодирует SEQ ID NO: 12.

(SEQ ID NO: 12)

В одном из вариантов осуществления последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие антитело против GPVI или его фрагмент для применения в настоящем изобретении, содержатся в векторе экспрессии. В одном из вариантов осуществления вектор экспрессии содержит, по меньшей мере, одну из последовательностей, включающих SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 12, или любую последовательность нуклеиновых кислоты, по меньшей мере, на 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичную упомянутым последовательностям SEQ ID NO: 10-12.

В одном из вариантов осуществления изобретения вектор содержит последовательность SEQ ID NO: 10 и последовательность, кодирующую константную область тяжелой цепи. Неограничивающим примером последовательности, кодирующей константную область тяжелой цепи, является SEQ ID NO: 14.

(SEQ ID NO: 14)

В одном из вариантов осуществления изобретения вектор содержит последовательность SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 12 и последовательность, кодирующую константную область легкой цепи. Неограничивающим примером последовательности, кодирующей константную область легкой цепи, является SEQ ID NO: 15.

(SEQ ID NO: 15)

В одном из вариантов осуществления изобретения вектор содержит последовательность, кодирующую сигнальный пептид. Неограничивающие примеры последовательностей сигнальных пептидов включают без ограничения SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 17.

(SEQ ID NO: 16)

(SEQ ID NO: 17)

В одном из вариантов осуществления вектор содержит SEQ ID NO: 10 и последовательность, кодирующую константную область тяжелой цепи (такую как, например, SEQ ID NO: 14) и сигнальную пептидную последовательность. Примером такого вектора является вектор, содержащий SEQ ID NO: 18. SEQ ID NO: 18 дополнительно содержит сайты клонирования

(SEQ ID NO: 18)

В одном из вариантов осуществления вектор содержит SEQ ID NO: 8 и последовательность, кодирующую константную область легкой цепи (такую как, например, SEQ ID NO: 15) и сигнальную пептидную последовательность. Примером такого вектора является вектор, содержащий SEQ ID NO: 19. SEQ ID NO: 19 дополнительно содержит сайты клонирования.

(SEQ ID NO: 19)

В одном из вариантов осуществления вектор содержит SEQ ID NO: 9 и последовательность, кодирующую константную область легкой цепи (такую как, например, SEQ ID NO: 15) и сигнальную пептидную последовательность. Примером такого вектора является вектор, содержащий SEQ ID NO: 20. SEQ ID NO: 20 дополнительно содержит сайты клонирования.

(SEQ ID NO: 20)

В одном из вариантов осуществления описанный выше вектор содержится в выделенной клетке-хозяине. Упомянутая клетка-хозяин может применяться для рекомбинантного продуцирования антител при применения в настоящем изобретении. В одном из вариантов осуществления клетками-хозяевами могут являться прокариотные, дрожжевые или эукариотные клетки, предпочтительно клетки млекопитающих, такие как, например, линии CV1 клеток почки обезьяны, трансформированные посредством SV40 (COS-7, АТСС CRL 1651); линии эмбриональных клеток почки человека (293 клетки, субклонированные с целью выращивания в суспензионной культуре, Graham и др., J. Gen. Virol. 36:59 (1977)); клетки почки детеныша хомяка (BHK, АТСС CCL 10); клетки/-DHFR яичника китайского хомячка (СНО, Urlaub и др., Proc. Natl. Акад. Sci. USA 77: 4216 (1980)); клетки мышей линии Сертоли (ТМ4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); клетки мышиной миеломы SP2/0-AG14 (АТСС CRL 1581, АТСС CRL 8287) или NSO (№85110503 в коллекции культур HPA); клетки почки обезьяны (CV1 АТСС CCL 70); клетки почки африканской зеленой обезьяны (VERO-76, АТСС CRL-1587); клетки карциномы шейки матки человека (HELA, АТСС CCL 2); клетки почки собаки (MDCK, АТСС CCL 34); клетки печени крысы линии Buffalo (BRL 3 А, АТСС CRL 1442); клетки легкого человека (W138, АТСС CCL 75); клетки печени человека (Hep G2, НВ 8065); клетки опухоли молочной железы мыши (ММТ 060562, АТСС CCL51); клетки TRI (Mather и др., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); клетки MRC 5; клетки FS4; линия клеток гепатомы человека (Hep G2), а также линия PERC-6 клеток компании DSM. Векторы экспрессии, применимые для использования в каждой из этих клеток-хозяев, также в целом известны из техники. Следует отметить, что термин "клетка-хозяин" обычно относится к линии культивированных клеток. Из определения "клетки-хозяина" в прямой форме исключен организм человека в целом, в который введен вектор экспрессии, кодирующий антигенсвязывающий белок для применения в настоящем изобретении.

Способы получения антитела против hGPVI или его антигенсвязывающего фрагмента для применения в настоящем изобретении хорошо известны из техники. Примеры применимых способов включают культивирование клеток-хозяев, содержащих выделенную полинуклеотидную последовательность, кодирующую антитело против hGPVI его фрагмент для применения в настоящем изобретении, в условиях, применимых для экспрессии антитела против hGPVI или его фрагмента, и выделение экспрессированного антитела против hGPVI или его фрагмента. Этот рекомбинантный способ может применяться для крупномасштабного производства антител против hGPVI или их фрагментов для применения в настоящем изобретении, включая моноклональные антитела, предназначенные для терапевтического применения in vivo. Эти способы известны специалистам в данной области техники.

В одном из вариантов осуществления белок для применения в настоящем изобретении может очищаться путем хроматографии, предпочтительно аффинной хроматографии, более предпочтительно аффинной хроматографии на протеин L-агарозе.

Соответственно, в одном из вариантов осуществления белок для применения в настоящем изобретении содержит домен связывания белка L (PpL). Способы переноса связывающей PpL активности на белки согласно изобретению описаны в работах Muzard и др., Analytical Biochemistry 388, 331-338, 2009 и Lakhrif и др., MAbs. 2016; 8 (2):379-88, содержание которых в порядке ссылки включено в настоящую заявку.

Фрагменты и производные антител для применения в настоящем изобретении (согласно термину "антитело" или "антитела", используемому в настоящей заявке, если не указано или из контекста явно не следует иное), предпочтительно АСТ017-подобное или АСТ006-подобное антитело может быть получено известными из техники способами. "Фрагменты" представляют собой часть интактного антитела, обычно антигенсвязывающего сайта или вариабельной области. Примеры фрагментов антител включают Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2 и Fv-фрагменты; диатела; фрагмент любого антитела, которым является белок, имеющий первичную структуру, состоящую из одной непрерывной последовательности смежных аминокислотных остатков (называемой "фрагментом одноцепочечного антитела" или "одноцепочечным белком"), включая, без ограничения (1) одноцепочечные Fv-молекулы, (2) одноцепочечные белки, содержащие только один вариабельный домен легкой цепи или его фрагмент, который содержит три CDR вариабельного домена легкой цепи без соответствующей части тяжелой цепи, и (3) одноцепочечные белки, содержащие только одну вариабельную область тяжелой цепи или ее фрагмент, содержащий три CDR вариабельной области тяжелой цепи без соответствующей части легкой цепи; и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител. Фрагменты антител согласно настоящему изобретению могут быть получены стандартными способами. Например, Fab- или Р(ab')2-фрагменты могут быть получены путем разложения выделенных антител протеазой в соответствии с общепринятыми методиками. Следует учесть, что иммунореактивные фрагменты могут модифицироваться известными способами; например, с целью замедления клиренса in vivo и получения более желательного фармакокинетического профиля фрагмент может модифицироваться полиэтиленгликолем (ПЭГ). Способы связывания и сайт-специфической конъюгации ПЭГ с Fab'-фрагментом описаны, например, в работах Leong и др., Cytokines 16 (3): 106-119 (2001) и Delgado и др., Br. J. Cancer 73 (2): 175-187 (1996), содержание которых в порядке ссылки включено в настоящую заявку.

В качестве альтернативы, ДНК, кодирующая антитело для применения в настоящем изобретении, предпочтительно АСТ017-подобное или АСТ006-подобное антитело может модифицироваться таким образом, чтобы кодировать какой-либо фрагмент. Затем модифицированную ДНК вставляют в вектор экспрессии и используют для трансформации или трансфекции соответствующей клетки, которая затем экспрессирует желаемый фрагмент.

Другим объектом изобретения является композиция для лечения или для применения при лечении связанного с GPVI заболевания у нуждающегося в этом субъекта, которая содержит, по меньшей мере, один описанный выше выделенный гуманизированный белок, связывающий гликопротеин VI человека (hGPVI), и которая вводится (или должна вводиться) субъекту в течение, по меньшей мере, 2 часов, предпочтительно в течение, по меньшей мере, 4-6 часов.

Другим объектом изобретения является фармацевтическая композиция для лечения или для применения при лечении связанного с GPVI заболевания у нуждающегося в этом субъекта, которая содержит, по меньшей мере, один описанный выше выделенный гуманизированный белок, связывающий гликопротеин VI человека (hGPVI), и, по меньшей мере, один фармацевтически приемлемый эксципиент, и которая вводится (или должна вводиться) субъекту в течение, по меньшей мере, 2 часов, предпочтительно в течение, по меньшей мере, 4-6 часов.

Фармацевтически приемлемые эксципиенты, которые могут использоваться в этих композициях, включают без ограничения ионообменники, оксид алюминия, стеарат алюминия, лецитин, сывороточные белки, такие как сывороточный альбумин человека, буферные вещества, такие как ацетаты, цитраты, фосфаты, глицин, сорбиновую кислоту, сорбат калия, сахара, такие как глюкоза, частичные глицеридные смеси насыщенных растительных жирных кислот, воду, соли или электролиты, такие как протаминсульфат, динатрийгидрофосфат, гидрофосфат калия, хлорид натрия, соли цинка, коллоидный диоксид кремния, трисиликат магния, поливинилпирролидон, вещества на основе целлюлозы (например натрийкарбоксиметилцеллюлозу), полиэтиленгликоль, полиакрилаты, воски, блок-полимеры полиэтилена и полиоксипропилена, полиэтиленгликоль и ланолин.

Другим объектом изобретения является фармацевтическая композиция для лечения или для применения при лечении связанного с GPVI заболевания у нуждающегося в этом субъекта, рН которой составляет от 4 до 6, предпочтительно около 5,0.

Другим объектом изобретения является лекарственное средство для лечения или для применения при лечении связанного с GPVI заболевания у нуждающегося в этом субъекта, которое содержит, по меньшей мере, один описанный выше выделенный гуманизированный белок, связывающий гликопротеин VI человека (hGPVI), и которое вводится (или должно вводиться) субъекту в течение, по меньшей мере, 2 часов, предпочтительно в течение, по меньшей мере, 4-6 часов.

В одном из вариантов осуществления композиция, фармацевтическая композиция или лекарственное средство для применения в настоящем изобретении дополнительно содержит другое средство, применимое для лечения связанного с GPVI заболевания, например, тромболитик. Одним из примеров тромболитика является t-PA, включая нативный t-PA и рекомбинантный t-PA, а также модифицированные формы t-PA, которые сохраняют ферментативную и/или фибринолитическую активность нативного t-PA. Используемый термин t-РА имеет принятое в данной области техники значение и относится к активатору плазминогена тканевого типа. Ферментативная активность модифицированной формы t-PA может измеряться путем оценки способности молекулы превращать плазминоген в плазмин. Фибринолитическая активность модифицированной формы t-PA может определяться любым известным из техники методом определения фибринолитической активности крови in vitro. t-PA предлагается на рынке под названием альтеплаза (Activase® или Actilyse®). Рекомбинантный t-РА был описан в данной области техники и известен специалистам. Модифицированные формы т-РА описаны в данной области техники, известны специалистам и включают без ограничения t-PA с делециями или заменами аминокислот или доменов, модифицированным статусом гликозилирования и варианты, конъюгированные или слитые с другими молекулами. Примеры модифицированных форм t-PA описаны, например, в ЕР 0352119, WO 93/24635, ЕР 0382174 и WO 2013/034710, которые в порядке ссылки включены в настоящую заявку.

В одном из вариантов осуществления композиция, фармацевтическая композиция или лекарственное средство для применения в настоящем изобретении дополнительно содержит видоизмененный t-PA, как описано в WO 2013/034710.

В одном из вариантов осуществления упомянутый видоизмененный t-PA содержит последовательность SEQ ID NO: 25 (соответствующую зрелой форме wt t-PA человека) или SEQ ID NO: 26 (соответствующую первой цепи двухцепочечного wt t-PA человека), предпочтительно состоит из SEQ ID NO: 25 или из сочетания SEQ ID NO: 26 и SEQ ID NO: 27 (соответствующей второй цепи двухцепочечного wt t-PA человека) или, по меньшей мере, на 80% идентичного варианта, при этом упомянутые последовательности содержат мутацию, состоящую из замены любой аминокислоты сайта связывания лизина в последовательности SEQ ID NO: 25 или SEQ ID NO: 26 гидрофильной аминокислотой, выбранной из аргинина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, лизина, аспарагина, глутамина, серина, треонина, тирозина и гистидина, предпочтительно аргинина, и/или мутацию, состоящую из замены аргинина серином в положении 275 в последовательности SEQ ID NO: 25 или SEQ ID NO: 26.

В одном из вариантов осуществления упомянутый видоизмененный t-PA содержит последовательность SEQ ID NO: 25 (соответствующую зрелой форме wt t-PA человека) или SEQ ID NO: 26 (второй цепи двухцепочечного wt t-PA человека), предпочтительно состоит из SEQ ID NO: 25 или сочетания SEQ ID NO: 26 и SEQ ID NO: 27 (соответствующей второй цепи двухцепочечного wt t-РА человека) или, по меньшей мере, на 80% идентичного варианта, при этом упомянутые последовательности содержат мутацию, состоящую из замены триптофана в положении 253 в последовательности SEQ ID NO: 25 или SEQ ID NO: 26 гидрофильной аминокислотой, выбранной из аргинина, аспарагиновой кислоты, глютаминовой кислоты, лизина, аспарагина, глутамина, серина, треонина, тирозина и гистидина, предпочтительно аргинина, и/или мутацию, состоящую из замены аргинина серином в положении 275 в последовательности SEQ ID NO: 25 или SEQ ID NO: 26.

В одном из вариантов осуществления упомянутый видоизмененный t-PA дополнительно содержит, по меньшей мере, одну из следующих мутаций:

замену пролина аргинином в положении 125 в последовательности SEQ ID NO: 25 или SEQ ID NO: 26;

делецию цинкосодержащей пальцеобразной области на N-конце и/или делецию EGF-подобного домена в последовательности SEQ ID NO: 25 или SEQ ID NO: 26, и/или замену аспарагина глутамином в положении 117 в последовательности SEQ ID NO: 25 или SEQ ID NO: 26;

замену треонина аспарагином в положении 103 в последовательности SEQ ID NO: 25 или SEQ ID NO: 26 и/или замену аспарагина глутамином в положении 117 в последовательности SEQ ID NO: 25 или SEQ ID NO: 26 и/или замену лизина-гистидина-аргинина-аргинина (KHRR) аланином-аланином-аланином-аланином (АААА) в положениях 296-299 в последовательности SEQ ID NO: 25;

замену цистеина серином в положении 84 в последовательности SEQ ID NO: 25 или SEQ ID NO: 26;

замену аргинина глутаминовой кислотой или глицином в положении 275 в последовательности SEQ ID NO: 25 или SEQ ID NO: 26 и/или делецию домена "двойная петля 1" в последовательности SEQ I D NO: 25 или SEQ ID NO: 26.

Соответственно, в одном из вариантов осуществления композиция, фармацевтическая композиция или лекарственное средство для применения в настоящем изобретении содержит, по меньшей мере, один описанный выше выделенный гуманизированный белок, связывающий гликопротеин VI человека (hGPVI), предпочтительно, по меньшей мере, одно описанное выше антитело против hGPVI или его антигенсвязывающий фрагмент и t-PA (в нативной, рекомбинантной или модифицированной форме).

Одним из объектов изобретения является набор, содержащий, по меньшей мере, один описанный выше выделенный гуманизированный белок, связывающий гликопротеин VI человека (hGPVI) (предпочтительно, по меньшей мере, одно описанное выше выделенное антитело против hGPVI или его антигенсвязывающий фрагмент), и, по меньшей мере, один t-PA (в нативной, рекомбинантной или модифицированной форме).

Таким образом, другим объектом является описанный выше набор для применения при лечении связанного с GPVI заболевания у нуждающегося в этом субъекта.

В одном из вариантов осуществления изобретения белком для применения в настоящем изобретении является антитело против hGPVI или его антигенсвязывающий фрагмент, который ингибирует передачу сигналов GPVI и/или передачу сигналов лиганда GPVI. Используемый термин "ингибировать" означает, что белок для применения в настоящем изобретении способен блокировать, снижать, предотвращать или нейтрализовать взаимодействие GPVI с его лигандами, передачу сигналов GPVI и/или активацию молекул из сигнального пути GPVI.

Примеры лигандов GPVI включают без ограничения, коллаген, фибрин, фибронектин, витронектин и ламинины.

В одном из вариантов осуществления упомянутым белком для применения в настоящем изобретении является нейтрализующее антитело против hGPVI или его фрагмент.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения белок для применения в настоящем изобретении ингибирует связывание GPVI его лиганда (такого как, например, например, коллаген, фибрин или любой другой лиганд GPVI, способный индуцировать передачу нисходящих сигналов и активацию тромбоцитов).

В одном из вариантов осуществления изобретения белок для применения в настоящем изобретении ингибирует и/или предотвращает активацию, секрецию и агрегацию тромбоцитов в качестве реакции на лиганд GPVI, такой как, например, коллаген. В одном из вариантов осуществления изобретения белок для применения в настоящем изобретении ингибирует и/или предотвращает адгезию тромбоцитов с лигандом GPVI, таким как, например, коллаген.

В одном из вариантов осуществления изобретения белок для применения в настоящем изобретении ингибирует и/или предотвращает образование GPVI-зависимого тромбина в качестве реакции на лиганд GPVI, такой как, например, фибрин. В одном из вариантов осуществления изобретения белок для применения в настоящем изобретении ингибирует и/или предотвращает катализируемое тромбоцитами образование тромбина в качестве реакции на коллаген и/или тканевый фактор.

В одном из вариантов осуществления изобретения белок для применения в настоящем изобретении ингибирует и/или предотвращает рекрутинг тромбоцитов лигандом GPVI (таким как, например, фибрин) посредством GPVI.

В одном из вариантов осуществления изобретения белок для применения в настоящем изобретении индуцирует насыщение тромбоцитами цельной крови или богатой тромбоцитами плазмы при их концентрации от около 1 до около 200 мкг/мл, предпочтительно от около 2 до около 100 мкг/мл и более предпочтительно от около 5 до около 50 мкг/мл.

В одном из вариантов осуществления изобретения белок для применения в настоящем изобретении ингибирует индуцируемую коллагеном агрегацию тромбоцитов при использовании в концентрации, по меньшей мере, около 15 мкг/мл, предпочтительно, по меньшей мере, около 10 мкг/мл. Белок для применения в настоящем изобретении предпочтительно полностью ингибирует индуцируемую коллагеном агрегацию тромбоцитов при использовании в таких концентрациях.

В одном из вариантов осуществления IC50 белка для применения в настоящем изобретении с целью ингибирования индуцированной коллагеном агрегации тромбоцитов составляет от около 0,5 до около 10 мкг/мл, предпочтительно от около 1 до около 6 мкг/мл, более предпочтительно от около 2 до около 3,2 мкг/мл.

В одном из вариантов осуществления концентрация белка для применения в настоящем изобретении, снижающая на 50% скорость индуцированной коллагеном агрегации тромбоцитов, составляет от около 0,5 до около 5 мкг/мл, предпочтительно от около 1 до около 3 мкг/мл, более предпочтительно от около 2 мкг/мл.

В одном из вариантов осуществления изобретения концентрация белка для применения в настоящем изобретении, снижающая на 50% скорость индуцированной коллагеном агрегации тромбоцитов, составляет от около 0,5 до около 10 мкг/мл, предпочтительно от около 1 до около 6 мкг/мл, более предпочтительно около 3,2 мкг/мл.

В одном из вариантов осуществления изобретения белок для применения в настоящем изобретении не индуцирует истощение GPVI при введении in vivo, например, в дозе от 0,01 до 500 мг.

В одном из вариантов осуществления изобретения белок для применения в настоящем изобретении не индуцирует снижение числа тромбоцитов, то есть тромбоцитопению, при введении in vivo, например, в дозе от 0,01 до 500 мг.

Примеры связанных с GPVI состояний хорошо известны из техники и включают без ограничения воспаление, тромбоз, нарушения, связанные с аномальным или аберрантным мегакариоцитом и/или пролиферацией, дифференцировкой, морфологией, миграцией, агрегацией, дегрануляцией и/или функцией тромбоцитов, тромботические нарушения (такие как, например, тромботическая окклюзия коронарных артерий), заболевания, характеризующиеся количественной или качественной дисфункцией тромбоцитов, и заболевания, характеризующиеся дисфункцией эндотелия, заболевания сосудов мозга, заболевания коронарных артерий, нарушения, возникающие в результате любого поражения кровеносных сосудов, которое может приводить к агрегации тромбоцитов, нарушения, связанные с аберрантной сигнальной трансдукцией в качестве реакции на лиганды GPVI, нарушения, связанные с аберрантными уровнями экспрессии и/или активности GPVI в клетках, которые обычно экспрессируют GPVI, или в клетках, которые не экспрессируют GPVI, заболевания костного мозга и периферической крови или нарушения, которым способствуют тромбоциты путем модуляции воспалительных реакций.

В одном из вариантов осуществления связанным с GPVI состоянием сердечнососудистая болезнь, выбранная из артериального и венозного тромбоза, рестеноза, острого коронарного синдрома, ишемических нарушений мозгового кровообращения вследствие атеросклероза, инфаркта миокарда, легочной эмболии, критической ишемии конечностей и заболевания периферических артерий.

В одном из вариантов осуществления связанным с GPVI состоянием является венозный тромбоз. В одном из вариантов осуществления связанным с GPVI состоянием является рестеноз. В одном из вариантов осуществления связанным с GPVI состоянием является острый коронарный синдром. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения связанным с GPVI состоянием, являются ишемические нарушения мозгового кровообращения вследствие атеросклероза. В одном из вариантов осуществления связанным с GPVI состоянием является инфаркт миокарда. В одном из вариантов осуществления связанным с GPVI состоянием является легочная эмболия. В одном из вариантов осуществления связанным с GPVI состоянием является критическая ишемией конечности. В одном из вариантов осуществления связанным с GPVI состоянием является заболевание периферических артерий.

В одном из вариантов осуществления изобретения описанные выше белок, композиция, фармацевтическая композиция или лекарственное средство применяются для модуляции взаимодействий между лейкоцитами и тромбоцитами при воспалении и/или тромбозе. Соответственно, в одном из вариантов осуществления изобретения описанные выше белок, композиция, фармацевтическая композиция или лекарственное средство применяются для лечения воспаления и/или тромбоза.

В одном из вариантов осуществления изобретения описанные выше белок, композиция, фармацевтическая композиция или лекарственное средство применяются для модуляции, предпочтительно для предотвращения агрегации и дегрануляции адгезии тромбоцитов.

В одном из вариантов осуществления изобретения описанные выше белок, композиция, фармацевтическая композиция или лекарственное средство применяются для лечения тромботических нарушений (таких как, например, тромботическая окклюзия коронарных артерий), заболеваний, характеризующихся количественной или качественной дисфункцией тромбоцитов, и заболеваний, характеризующихся дисфункцией эндотелия. Эти заболевания включают без ограничения заболевания коронарных артерий и мозговых артерий.

В одном из вариантов осуществления изобретения описанные выше белок, композиция, фармацевтическая композиция или лекарственное средство применяются для лечения заболеваний сосудов головного мозга, включая ишемический инсульт, тромбоэмболических заболеваний вен (таких как, например, заболевания, связанные с опуханием, болью и изъязвлением ног, легочная эмболия, абдоминальный венозный тромбоз), тромботической микроангиопатии, сосудистой пурпуры.

В одном из вариантов осуществления изобретения описанные выше белок, композиция, фармацевтическая композиция или лекарственное средство применяются для лечения заболеваний коронарных артерий (таких как, например, сердечнососудистые заболевания, включая нестабильную стенокардию, инфаркт миокарда, острый инфаркт миокарда, ишемическая болезнь сердца, реваскуляризация коронарных артерий, рестеноз коронарных артерий, тромбоэмболия желудочков, атеросклероз, болезнь коронарных артерий (например, окклюзионные поражения артерий), образование бляшек, сердечная ишемия, включая осложнения, связанные с процедурами коронарного шунтирования, такими как чрескожная ангиопластика коронарных артерий (баллонная ангиопластика)). Что касается коронарных процедур, такое лечение может осуществляться путем введения описанного белка до, во время или после процедуры. В одном из предпочтительных вариантов осуществления такое введение может использоваться для предотвращения острой сердечной ишемии после ангиопластики.

В одном из вариантов осуществления изобретения описанные выше белок, композиция, фармацевтическая композиция или лекарственное средство применяются для лечения нарушений, возникающих в результате любого поражения кровеносных сосудов, которое может приводить к агрегации тромбоцитов. Такие поражения кровеносных сосудов включают без ограничения повреждение стенок сосудов, такие как повреждения сосудов, которые приводят к образованию открытой высокотромбогенной поверхности внутри в остальном неповрежденного кровеносного сосуда, например, повреждения стенок сосудов, приводящие к высвобождению ADP, тромбина и/или адреналина, напряжение сдвига жидкости, которое возникает в месте сужения, трещин и/или разрывов сосудов на участках атеросклеротических бляшек, и травмы возникающие в результате баллонной ангиопластики или атерэктомии.

Кроме того, в некоторых вариантах осуществления предпочтительно, чтобы белок согласно изобретению не влиял на другие признаки или функции тромбоцитов, такие как индуцированное агонистами изменение формы тромбоцитов (например, опосредованная GPIb-vWF активация тромбоцитов), высвобождение содержимого гранул тромбоцитов, активация путей сигнальной трансдукции или индукция мобилизации кальция при активации тромбоцитов агонистами, которые не взаимодействуют с GPVI.

В одном из вариантов осуществления изобретения описанные выше белок, композиция, фармацевтическая композиция или лекарственное средство применяются для лечения нарушений, связанных с аберрантной сигнальной трансдукцией в качестве реакции на лиганды GPVI (включая без ограничения коллаген, фибрин, фибронектин, витронектин и ламинины) или другие белки внеклеточного матрикса.

В одном из вариантов осуществления изобретения описанные выше белок, композиция, фармацевтическая композиция или лекарственное средство применяются для лечения нарушений, связанных с аберрантными уровнями экспрессии и/или активности GPVI в клетках, которые нормально экспрессируют GPVI, или в клетках, которые не экспрессируют GPVI. Например, белок может использоваться для модуляции нарушений, связанных с аберрантной экспрессией GPVI в раковых (например, опухолевых) клетках, которые нормально не экспрессируют GPVI. Такие нарушения могут включать, например, нарушения, которые связаны с миграцией и метастазированием опухолевых клеток.

В одном из вариантов осуществления изобретения описанные выше белок, композиция, фармацевтическая композиция или лекарственное средство применяются для модуляции иммунорегуляторных функций тромбоцитов.

В одном из вариантов осуществления изобретения описанные выше белок, композиция, фармацевтическая композиция или лекарственное средство применяются для лечения заболеваний костного мозга и периферической крови

В одном из вариантов осуществления изобретения описанные выше белок, композиция, фармацевтическая композиция или лекарственное средство применяются для лечения нарушений, которым способствуют тромбоциты путем модуляции воспалительных реакций, включая без ограничения длительное или продолжительное воспаление, связанное с инфекцией, артритом, фиброзом или нарушениями, при которых тромбоциты модулируют функции клеток, включая без ограничения пролиферацию и/или распространение раковых клеток.

Другие примеры связанных с GPVI заболеваний, нарушений или состояний включают без ограничения сердечнососудистые заболевания и/или сердечнососудистые события, такие как, например, артериальный тромбоз, включая атеротромбоз, ишемические события, острый коронарный синдром, инфаркт миокарда (сердечный приступ), острую ишемию головного мозга (инсульт), чрескожное коронарное вмешательство, тромбоз стента, ишемический рестеноз, ишемию (острую и хроническую), заболевания аорты и ее ветвей (такие как аневризма аорты, тромбоз), болезнь периферических артерий, венозный тромбоз, острый флебит и легочную эмболию, связанный с раком тромбоз (симптом Труссо), воспалительный тромбоз и связанный с инфекцией тромбоз.

В одном из вариантов осуществления фармацевтическая композиция или лекарственное средство согласно настоящему изобретению предназначено для лечения или для применения при лечении артериальных или венозных тромбозов, рестеноза, острого коронарного синдрома или нарушений мозгового кровообращения вследствие атеросклероза, предпочтительно тромбоза.

В одном из вариантов осуществления предпочтительно у субъекта диагностировано связанное с GPVI заболевание, нарушение или состояние, предпочтительно сердечно-сосудистое заболевание и/или событие.

В одном из вариантов осуществления пациент перенес сердечнососудистое событие (такое как, например, тромбоз, инсульт, инфаркт миокарда или нарушение мозгового кровообращения) менее чем за 48 часов, предпочтительно менее чем за 24 часов, за 12 часов или менее до введения белка для применения в настоящем изобретении.

В одном из вариантов осуществления пациент принимает описанные выше белок, композицию, фармацевтическую композицию или лекарственное средство как часть протокола лечения.

В одном из вариантов осуществления протокол лечения дополнительно включает введение другого средства, применимого для лечения связанного с GPVI заболевания, такого как, например, тромболитик, предпочтительно t-PA (включая нативный t-PA и рекомбинантный t-PA, а также модифицированные формы т-РА, которые сохраняют ферментативную и/или фибринолитическую активность нативного t-PA) до, одновременно или после введения белка согласно изобретению.

В одном из вариантов осуществления протокол лечения дополнительно включает лечение субъекта путем эндоваскулярной терапии и/или тромбэктомии (также известной как эмболэктомия) до, одновременно или после введения белка согласно изобретению.

Соответственно, в одном из вариантов осуществления подлежащий лечению субъект ранее получал лечение путем эндоваскулярной терапии и/или тромбэктомии.

В одном из вариантов осуществления пациенту вводится (или должен вводиться) белок для применения в настоящем изобретении в дозе от около 0,5 мг/кг до около 50 мг/кг, предпочтительно от около 1 мг/кг до около 32 мг/кг, более предпочтительно около 8 мг/кг. В другом варианте осуществления пациенту должна вводиться гуманизированный белок в дозе от около 2,5 мг/кг до около 25 мг/кг, предпочтительно от около 5 мг/кг до около 15 мг/кг, более предпочтительно около 8 мг/кг. В одном из вариантов осуществления субъекту вводится (или должен вводиться) белок для применения в настоящем изобретении в дозе около 0,5 мг/кг, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или около 50 мг/кг.

В одном из вариантов осуществления субъекту вводится (или должен вводиться) белок для применения в настоящем изобретении в дозе от около 30 мг до около 3000 мг, предпочтительно от около 60 мг до около 2000 мг, более предпочтительно от около 100 до около 1000 мг и еще более предпочтительно около 500 мг. В одном из вариантов осуществления доза белка для применения в настоящем изобретении составляет около 30, 60, 62,5, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1500, 2000, 2500 или около 3000 мг. В другом варианте осуществления доза белка для применения в настоящем изобретении составляет от около 100 мг до около 2000 мг, от около 125 мг до около 2000 мг, предпочтительно от около 250 мг до около 1000 мг или от около 500 мг до около 1000 мг.

Композиция составляется с целью введения субъекту. Композиции согласно изобретению могут вводиться парентерально, с помощью ингаляционного аэрозоля, ректально, назально или через имплантированный резервуар. Используемый термин "введение" включает подкожную, внутривенную, внутримышечную, внутрисуставную, внутрисиновиальную, интрастернальную, внутриоболочечную, внутрипеченочную, внутрираневую и внутричерепную инъекцию или методы вливания.

В одном из вариантов осуществления изобретения белок для применения в настоящем изобретении вводится предпочтительно путем внутривенного вливания. В другом варианте осуществления изобретения белок для применения в настоящем изобретении вводится внутрибрюшинно. В другом варианте осуществления изобретения белок для применения в настоящем изобретении вводится внутрикожно.

Примеры форм, приспособленных для инъекции, включают без ограничения растворы, такие как, например, стерильные водные растворы, гели, дисперсии, эмульсии, суспензии, твердые формы, применимые для приготовления растворов или суспензий путем добавлении жидкости перед использованием, такие как, например, порошок, липосомальные формы и т.п.

Стерильные инъекционные формы композиций согласно настоящему изобретению могут представлять собой водную или маслянистую суспензию. Эти суспензии могут составляться известными из техники способами с использованием применимых диспергирующих или смачивающих средств и суспендирующих средств. Стерильным препаратом для инъекций также может являться стерильный раствор или суспензия для инъекций в нетоксичном парентерально приемлемом разбавителе или растворителе. В число приемлемых носителей и растворителей, которые могут использоваться, входят вода, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, в качестве растворителя или суспендирующей среды традиционно используют стерильные, нелетучие масла. В этих целях может использоваться любое мягкое нелетучее масло, включая синтетические моно- или диглицериды. Для приготовления инъекционных материалов могут применяться жирные кислоты, такие как олеиновая кислота и ее глицеридные производные, а также натуральные фармацевтически приемлемые масла, такие как оливковое масло или касторовое масло, особенно, в их полиоксиэтилированных формах. Эти масляные растворы или суспензии могут также содержать длинноцепочечный спиртовой разбавитель или диспергатор, такой как карбоксиметилцеллюлоза или аналогичные диспергирующие средства, которые обычно используются в составе фармацевтически приемлемых лекарственных форм, включая эмульсии и суспензии. В целях приготовления составов также могут использоваться другие распространенные поверхностно-активные вещества, такие как Tweens, Spans, и другие эмульгаторы или усилители биодоступности, которые широко применяются при изготовлении фармацевтически приемлемых твердых, жидких или других лекарственных форм.

В одном из вариантов осуществления изобретения белок для применения в настоящем изобретении вводится (или должен вводиться) субъекту в течение около 2 часов, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5 или в течение около 12 часов.

В одном из вариантов осуществления изобретения белок для применения в настоящем изобретении непрерывно вводится субъекту в течение, по меньшей мере, 2 часов, предпочтительно в течение, по меньшей мере, 4-6 часов (например, в течение 2 часов, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5 или в течение около 12 часов). Используемый термин "непрерывно вводится" относится к введению соединения в течение продолжительного периода времени преимущественно с постоянной скоростью.

В другом варианте осуществления вводится первый болюс белка с последующим непрерывным введением оставшейся дозы белка.

В одном из вариантов осуществления первый введенный болюс составляет от около 10 до 50%, предпочтительно около 20% общей дозы выделенного гуманизированного белка для введения. В одном из вариантов осуществления первый введенный болюс составляет около 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или около 50% общей дозы выделенного гуманизированного белка для введения.

В одном из вариантов осуществления первый болюс вводится в течение около от 5 до 30 минут, предпочтительно в течение около 15 минут.

В одном из вариантов осуществления около 20% общей дозы белка для применения в настоящем введении вводится в течение первых 15 минут с последующим непрерывным введением оставшихся 80% в течение следующих 5 часов 45 минут.

В одном из вариантов осуществления конкретный режим введения (непрерывное введение в течение, по меньшей мере, 2 часов необязательно с использованием первого болюса) обеспечивает пролонгированное действие белка, которое может наблюдаться после окончания его введения, как продемонстрировано в примерах. В одном из вариантов осуществления действие белка на агрегацию тромбоцитов наблюдается в течение, по меньшей мере, около 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12, 18, 24, 36 или 48 часов после окончания введения белка.

В одном из вариантов осуществления изобретения присутствующий в фармацевтической композиции белок для применения в настоящем изобретении может поставляться в концентрации от около 1 до около 100 мг/мл, например, в концентрации 1 мг/мл, 5 мг/мл, 10 мг/мл, 50 мг/мл или 100 мг/мл. В одном из вариантов осуществления изобретения белок поставляется в концентрации около 10 мг/мл в 100-мг (10-мл) или в 500-мг (50-мл) одноразовых флаконах.

В одном из вариантов осуществления фармацевтическая композиция может содержать белок согласно изобретению в PBS с рН 7,2-7,7.

В одном из вариантов осуществления фармацевтическая композиция может содержать белок согласно изобретению в 20 мМ буфера на основе цитрата натрия, 130 мМ NaCl с рН 5,0.

Другим объектом изобретения является способ лечения связанного с GPVI состояния, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту описанного выше выделенного гуманизированного белка, связывающего hGPVI, или описанной выше композиции, фармацевтической композиции или лекарственного средства. Способ согласно изобретению включает введение белка, композиции, фармацевтической композиции или лекарственного средства в течение, по меньшей мере, 2 часов субъекту, предпочтительно в течение, по меньшей мере, 4-6 часов.

В одном из вариантов осуществления способ лечения связанного с GPVI заболевания согласно настоящему изобретению дополнительно включает лечение пациента путем эндоваскулярной терапии и/или тромбэктомии. В одном из вариантов осуществления изобретения эндоваскулярная терапия и/или тромбэктомия проводится до, одновременно или после введения белка (предпочтительно антитела) согласно настоящему изобретению.

В одном из вариантов осуществления способ лечения связанного с GPVI заболевания согласно настоящему изобретению дополнительно включает стадию введения другого средства, применимого для лечения связанного с GPVI заболевания, такого как, например тромболитик, предпочтительно t-PA (включая нативный t-PA и рекомбинантный t-PA, а также модифицированные формы t-PA, которые сохраняют ферментативную и/или фибринолитическую активность нативного t-PA). В одном из вариантов осуществления дополнительное средство вводится до, одновременно или после введения белка (предпочтительно антитела) согласно настоящему изобретению.

В одном из вариантов осуществления способ согласно изобретению включает введение описанного в настоящем изобретении белка в дозе от около 0,5 мг/кг до около 50 мг/кг, предпочтительно от около 1 мг/кг до около 32 мг/кг, более предпочтительно около 8 мг/кг. В другом варианте осуществления способ согласно изобретению включает введение описанного в настоящем изобретении белка в дозе от около 2,5 мг/кг до около 25 мг/кг, предпочтительно от около 5 мг/кг до около 15 мг/кг, более предпочтительно около 8 мг/кг. В одном из вариантов осуществления способ согласно изобретению включает введение описанного в настоящем изобретении белка в дозе около 0,5 мг/кг, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,21,22, 23,24,25,26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или около 50 мг/кг.

В одном из вариантов осуществления способ согласно изобретению включает введение описанного в настоящем изобретении белка в дозе от около 30 мг до около 3000 мг, предпочтительно от около 60 мг до около 2000 мг, более предпочтительно от около 100 до около 1000 мг, еще более предпочтительно около 500 мг. В одном из вариантов осуществления способ согласно изобретению включает введение описанного в настоящем изобретении белка в дозе около 30, 60, 62,5, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1500, 2000, 2500 или около 3000 мг. В другом варианте осуществления способ согласно изобретению включает введение описанного в настоящем изобретении белка в дозе от около 100 мг до около 2000 мг, от около 125 мг до около 2000 мг, предпочтительно от около 250 мг до около 1000 мг или от около 500 мг до около 1000 мг.

В одном из вариантов осуществления изобретения описанный в настоящем изобретении белок вводится предпочтительно путем внутривенного вливания.

В одном из вариантов осуществления способ согласно изобретению включает введение белка в течение около 2 часов, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5 или в течение около 12 часов.

В одном из вариантов осуществления способ согласно изобретению включает непрерывное введение белка в течение, по меньшей мере, 2 часов, предпочтительно в течение, по меньшей мере, 4-6 часов (например, в течение около 2 часов, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5 или в течение около 12 часов)

В другом варианте осуществления способ согласно изобретению включает введение первого болюса белка с последующим непрерывным введением оставшейся дозы белка.

В одном из вариантов осуществления первый введенный болюс составляет от около 10 до 50%, предпочтительно около 20% общей дозы выделенного гуманизированного белка для введения. В одном из вариантов осуществления первый введенный болюс составляет около 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или около 50% общей дозы выделенного гуманизированного белка для введения.

В одном из вариантов осуществления указанный первый болюс вводится в течение от около 5 до 30 минут, предпочтительно в течение около 15 минут.

В одном из вариантов осуществления около 20% общей дозы белка для применения в настоящем введении вводится в течение первых 15 минут с последующим непрерывным введением оставшихся 80% в течение следующих 5 часов 45 минут.

В одном из вариантов осуществления способ согласно изобретению предназначен для ингибирования функции рецептора GPVI и передачи нисходящих сигналов с целью лечения тем самым связанного с GPVI состояния.

В одном из вариантов осуществления способ ингибирования функции рецептора GPVI и передачи нисходящих сигналов не влияет на количество тромбоцитов, экспрессию GPVI на поверхности тромбоцитов и длительность кровотечения.

В одном из вариантов осуществления способ ингибирования функции рецептора GPVI и передачи нисходящих сигналов является эффективным и обратимым.

В одном из вариантов осуществления способ согласно изобретению предназначен для ингибирования связывания GPVI его лигандов (предпочтительно, но не исключительно коллагена) с целью лечения тем самым связанного с GPVI состояния.

В одном из вариантов осуществления способ ингибирования связывания GPVI его лигандов не влияет на количество тромбоцитов, экспрессию GPVI на поверхности тромбоцитов и длительность кровотечения.

В одном из вариантов осуществления способ ингибирования связывания GPVI его лигандов является эффективным и обратимым.

В одном из вариантов осуществления способ согласно изобретению предназначен для ингибирования и/или предотвращения адгезии тромбоцитов и коллагена с целью лечения тем самым связанного с GPVI состояния.

В одном из вариантов осуществления способ согласно изобретению предназначен для ингибирования и/или предотвращения индуцированной коллагеном агрегации тромбоцитов с целью лечения тем самым связанного с GPVI состояния.

В одном из вариантов осуществления способ согласно изобретению предназначен для ингибирования и/или предотвращения активации тромбоцитов, в частности агрегации тромбоцитов в качестве реакции на коллаген с целью лечения тем самым связанного с GPVI состояния.

В одном из вариантов осуществления способ согласно изобретению предназначен для ингибирования и/или предотвращения образования тромбина в качестве реакции на коллаген и/или тканевой фактор с целью лечения тем самым связанного с GPVI состояния.

В одном из вариантов осуществления способ согласно изобретению предназначен для ингибирования связывания GPVI фибрина с целью лечения тем самым связанного с GPVI состояния.

В одном из вариантов осуществления способ согласно изобретению предназначен для ингибирования и/или предотвращения рекрутинга тромбоцитов фибрином посредством GPVI с целью лечения тем самым связанного с GPVI состояния.

В одном из вариантов осуществления способ согласно изобретению предназначен для ингибирования и/или предотвращения GPVI-зависимого образования тромбина в качестве реакции на фибрин с целью лечения тем самым связанного с GPVI состояния.

В одном из вариантов осуществления введение описанного выше белка субъекту не вызывает истощения GPVI in vivo.

В одном из вариантов осуществления введение описанного выше белка субъекту не вызывает снижение количества тромбоцитов. Таким образом, в одном из вариантов осуществления введение описанного выше белка субъекту не вызывает тромбоцитопению.

В одном из вариантов осуществления введение описанного выше белка субъекту не вызывает увеличения времени кровотечения.

В одном из вариантов осуществления способ согласно изобретению включает введение субъекту терапевтически эффективного количества белка.

Настоящее изобретение также относится к способу повышения активности тромболитика (предпочтительно t-PA (включая нативный t-PA и рекомбинантный t-PA а также модифицированные формы t-PA, которые сохраняют ферментативную и/или фибринолитическую активность нативного t-РА)) с целью лечения связанного с GPVI заболевания, при этом способ включает введение субъекту сочетания тромболитика и белка согласно изобретению (предпочтительно терапевтически эффективного количества белка согласно изобретению).

В одном из вариантов осуществления способ согласно изобретению позволяет снизить дозу тромболитика (предпочтительно t-PA) для введения субъекту.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 показана комбинация графиков, иллюстрирующих среднюю интенсивность ± стандартная ошибка средней величины (SEM) (А) и скорость (В) индуцированной коллагеном агрегации тромбоцитов, измеренную через 30 минут и через 2 часа после окончания 15-минутного вливания возрастающих доз АСТ017 (1, 2, 4, 8 мг/кг) яванским макакам (n=4).

На фиг. 2 показано количество тромбоцитов у яванских макаков, измеренное до любого лечения (время = 0) или через 24 часа после вливания им носителя или возрастающих доз АСТ017 (1, 2, 4, 8 мг/кг).

На фиг. 3 показана комбинация графиков, иллюстрирующих длительность кровотечения, измеренное у 4 субъектов до лечения (время = 0) и через 30 мин и через 2 часа после вливания АСТ017 (1, 2, 4, 8 мг/кг) или носителя яванским макакам.

На фиг. 4 показана комбинация графиков, иллюстрирующих среднюю интенсивность ± стандартное отклонение (SD) (А) и скорость (В) индуцированной коллагеном агрегации тромбоцитов, измеренную в различное время после начала вливания двух доз АСТ017 (2 и 8 мг/кг) в течение 1 часа яванским макакам (n=8).

На фиг. 5 показан график, иллюстрирующий уровень экспрессии GPVI, измеренный методом проточной цитометрии, в тромбоцитах яванских макаков (n=8) в различное время после начала вливания 2 мг/кг АСТ017 в течение 1 часа (MFI: средняя интенсивность флуоресценции).

На фиг. 6 показан график, иллюстрирующий среднюю интенсивность ± стандартное отклонение (SD) индуцированной коллагеном агрегации тромбоцитов, измеренную в различное время (от 20 минут до 24 часов) после окончания 25-минутного введения болюса АСТ017 в дозе 8 мг/кг (n=4), вливания в течение 1 часа АСТ017 в дозе 8 мг/кг (n=8) или 15-минутного введения болюса АСТ017 в дозе 2 мг/кг с последующим вливанием АСТ017 в течение 5 часов 45 минут в дозе 6 мг/кг яванским макакам (n=4).

На фиг. 7 показан график, иллюстрирующий связывание коллагена посредством GPVI-Fc дикого типа (черный график) и GPVI с двунаправленной мутацией (серый график).

На фиг. 8 показан график, иллюстрирующий связывание GPVI-Fc дикого типа (черный график) и GPVI с двунаправленной мутацией (серый график) посредством АСТ017.

На фиг. 9 показан график, иллюстрирующий процент агрегации тромбоцитов, измеренный у двух здоровых субъектов из группы 4 в различное время (от 15 мин до 168 часов). Субъекты из группы 4 получали 500 мг АСТ017 или плацебо. "Период исследования" означает измерение процента агрегации тромбоцитов в течение одной недели или 24 часов до введения АСТ017 или его соответствующего плацебо. "До введения" означает исходное измерение введения АСТ017 или его соответствующего плацебо. Черным цветом на графике представлены данные для здорового субъекта 1, а серым цветом представлены данные для здорового субъекта 2.

Примеры.

Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано следующими примерами.

Пример 1

Биологические данные приматов помимо человека

Материалы и методы

Животные

В исследовании использовали 28 яванских макаков, не получавших ранее какого-либо лечения.

Лечение

Сначала в течение 1-5 минут (n=4-8) внутривенно вводили возрастающие дозы АСТ017 (1, 2, 4, 8 мг/кг) или его носителя. Через 30 минут и через 2 часа после введения были взяты образцы крови.

Во втором эксперименте вводили АСТ017 животным путем инъекции или вливания болюсов. В исследование были включены три лечебные группы: группа, получавшая 8 мг/кг АСТ017 путем инъекции болюсов в течение 25 минут (n=4), группа, получавшая 8 мг/кг АСТ017 путем вливания в течение 1 часа (n=8), группа, получавшая 2 мг/кг АСТ017 путем 15-минутной инъекции болюсов с последующим вливанием 6 мг/кг АСТ017 в течение 5 часов 45 минут (n=4). В различное время в течение от 20 минут до 24 часов после введения были взяты образцы крови.

Анализ

Агрегация тромбоцитов

Получили и немедленно использовали богатую тромбоцитами плазму (PRP) крови обезьян после центрифугирования (120 × g, 15 минут; 20°С). Определяли и непрерывно регистрировали скорость и интенсивность агрегации тромбоцитов с использованием агрегатора АРАСТ® и коллагена типа I (Horm collagen, Nycomed, Германия) в концентрации 2,5 мкг⋅мл^-1, добавленного в PRP, содержащую различные концентрации Fab согласно изобретению. Измерили интенсивность агрегации тромбоцитов как процент увеличения пропускания света. Средняя интенсивность ± SD представлена в указанное время после начала инъекции.

Измерили количество тромбоцитов в крови, предохраненной от свертывания с помощью ЭДТА. Определили количество тромбоцитов с помощью ветеринарного гематологического анализатора SCIL Vet abc™ (производства компании Scil Animal Care, Ольтсайм, Франция), настроенного на параметры обезьяны.

Измерили длительность кровотечения у бодрствующих обезьян на поверхности предплечья согласно стандартной клинической процедуре (процедуре Иви) с помощью 0,5-см устройства Surgicutt™ для измерения длительности кровотечения.

Экспрессия GPVI

Собрали образцы крови в шприцы с ЭДТА до инъекции и через 30 минут после инъекции возрастающих доз АСТ017 или эквивалентного объема носителя и инкубировали с предлагаемым на рынке конъюгированным с FITC моноклональным антителом против GPVI человека (клон 1G5, Biocytex)), близкородственным GPVI яванских макаков, и измерили флуоресценцию на цитометре Beckman Coulter Gallios Flow.

Результаты

Дополнительно охарактеризовали эффект АСТ017 при введении приматам помимо человека. В исследовании участвовало восемь яванских макаков.

Сначала в течение 15 минут внутривенно вводили возрастающие дозы АСТ017 (1, 2, 4, 8 мг/кг). Взяли образцы крови через 30 минут и 2 часа после введения. Агрегация тромбоцитов обратимо ингибировалась в зависимости от доз (фиг. 1). Увеличение дозы с 1 до 2 и с 2 до 4 мг/кг усиливало эффект, а доза 8 мг/кг не имела дополнительного эффекта по сравнению с дозой 4 мг/кг. Количество тромбоцитов, измеренное через 24 часа после инъекции, не изменилось по сравнению с величинами, полученными перед инъекцией (фиг. 2). После введения носителя или 2, 4 или 8 мг/кг АСТ017 (фиг. 3) не наблюдалось значительного увеличения длительности кровотечения. Затем, после перерыва на выведение из организма яванские макаки получили АСТ017 (2 или 8 мг/кг) в форме одночасовой перфузии. Измерили агрегации тромбоцитов и экспрессию GPVI в различное время после начала лечения: (через 1, 1,5, 2, 4 и 7 часов) (фиг. 4 и 5). У макаков, получивших 8 мг/кг, обратимо ингибировалась индуцированная коллагеном агрегация тромбоцитов и возрастала длительность эффекта по сравнению с дозой 2 мг/кг (фиг. 4). Экспрессия GPVI в тромбоцитах оставалась стабильной в различное время после начала лечения по сравнению с показателями до лечения (фиг. 5).

Вместе эти результаты подтверждают, что введение АСТ017 приматам помимо человека эффективно и обратимо ингибирует функцию GPVI без воздействия на количество тромбоцитов, экспрессию GPVI на поверхности тромбоцитов или длительность кровотечения.

Кроме того, в соответствии с предыдущими результатами ингибирующее действие АСТ017 на агрегацию тромбоцитов после вливания в течение 1 часа оказалось эффективным в течение ограниченного периода времени. В действительности, АСТ017 индуцировало выраженное и стабильное ингибирование агрегации тромбоцитов только в течение 2 часов после начала введения, т.е. в течение не более 1 часа после окончания вливания в течение 1 часа (см. фиг. 4). Даже если ингибирование продолжалось при введении дозы 8 мг/кг, через 2 часа, ингибирующее действие АСТ017 шло на убыль в случае всех протестированных доз.

Во втором эксперименте было дополнительно охарактеризовано действие АСТ017 в дозе 8 мг/кг на агрегацию тромбоцитов после введения в течение различного времени, включая введение в течение 1 часа и 6 часов. Агрегация тромбоцитов обратимо ингибировалась в зависимости от времени (фиг. 6).

Инъекция болюса в дозе 8 мг/кг в течение 25 минут вызывала полное ингибирование индуцированной коллагеном агрегации тромбоцитов, измеренное через 0,5 часа. Через 2 часа ингибирование агрегации тромбоцитов снижалось, и интенсивность агрегации возвращалась к значениям 24±34%. Действие АСТ017 не наблюдалось через 24 часа.

Вливание в течение 1 часа дозы 8 мг/кг приводило к пролонгированному ингибированию индуцированной коллагеном агрегации тромбоцитов. Однако ингибирование было полным (<5%) у всех животных только в течение 2 часов. Через 4 часа и через 7 часов после введения АСТ017 ингибирование шло на убыль, и общая средняя интенсивность агрегации составляла, соответственно, 16±29% и 25±32%.

Таким образом, при введении в течение 25 минут ингибирующее действие АСТ017, по-видимому, является выраженным только в течение короткого времени после его введения в течение 1 часа.

Вливание в течение 6 часов дозы 8 мг/кг приводила к полному ингибированию индуцированной коллагеном агрегации тромбоцитов, в течение, по меньшей мере, 9 часов. Действительно, в течение 9 часов после начала вливания в течение 6 часов интенсивность агрегации тромбоцитов составляла менее 2%. Кроме того, не исключена возможность более длительного действия, поскольку анализ не проводился в период между 9 часами и 24 часами. Через 24 часа действие АСТ017 почти полностью прекратилось у трех из четырех животных, и средняя интенсивность агрегации достигла 47±30%.

В заключение, доза 8 мг/кг при вливании в течение 6 часов эффективно ингибирует индуцированную коллагеном агрегацию тромбоцитов в течение, по меньшей мере, 3 часов после окончания введения.

Пример 2

Исследование безопасности, переносимости, фармакокинетики и фармакодинамики АСТ017 на здоровых добровольцах

Материалы и методы

Данное исследование представляет собой рандомизированное, безопасности, переносимости, фармакокинетики и фармакодинамики возрастающей разовой дозы АСТ017 на здоровых добровольцев

Субъекты

Субъектами, включенными в исследование, являлись здоровые субъекты мужского пола или небеременные, не кормящие грудью субъекты женского пола в возрасте от 30 до 60 лет (включительно) с индексом массы тела от ≥18 кг/м² до ≤30 кг/м². В общей сложности 48 субъектов были распределены среди 6 групп, получавших возрастающие дозы, при этом каждая группа состояла из 8 субъектов, 6 из которых получали действующее вещество, а 2 получали плацебо. Каждая группа была разделена на 2 подгруппы: субъекты в одной подгруппе получали дозу с самого начала (1 субъект действующее вещество и 1 субъект плацебо), а субъекты в другой подгруппе получали дозу через 48 часов после этого (5 субъектов действующее вещество и 1 субъект плацебо).

В день 1 каждого периода введения доз субъекты приглашались в исследовательский центр, в котором они оставались, по меньшей мере, в течение 48 часов после введения дозы. Последующий осмотр проводился в день 7. Субъекты находились в стационаре с 1 дня до утра 3 дня.

Лечение

Препараты, проходившие клиническое испытание, находились в 50-мл флаконах, содержащих 500 мг АСТ017 и раствора соответствующего плацебо. Лечение проводилось путем вливания в течение 6 часов.

Каждая доза вводилась путем вливания в течение 6 часов с 15-минутной инъекцией первого болюса, который соответствовал около 1/4 конечной дозы.

Группа 1: лечение А: 62,5 мг АСТ017 (n=6), лечение В: соответствующее плацебо (n=2)

Группа 2: лечение А: 125 мг АСТ017 (n=6), лечение В: соответствующее плацебо (n=2)

Группа 3: лечение А: 250 мг АСТ017 (n=6), лечение В: соответствующее плацебо (n=2)

Группа 4: лечение А: 500 мг АСТ017 (n=6), лечение В: соответствующее плацебо (n=2)

Группа 5: лечение А: 1000 мг АСТ017 (n=6), лечение В: соответствующее плацебо (n=2)

Группа 6: лечение А: 2000 мг АСТ017 (n=6), лечение В: соответствующее плацебо (n=2)

Анализ

У каждого субъекта было взято по 15 проб крови в целях анализа фармакокинетики АСТ017.

У каждого субъекта осуществлялся сбор мочи в течение около 5 интервалов в целях анализа АСТ017.

Анализ безопасности и переносимости включал следующие исследования:

- неблагоприятные события: в течение всего исследования;

- жизненно важные показатели: часто;

- ЭКГ (электрокардиограмма): реже, чем жизненно важные показатели;

- клинические анализы, анализы крови: 2 раза;

- параметры коагуляции: 5 раз;

- длительность кровотечения: 4 раза;

- количество тромбоцитов: 7 раз;

- агрегация тромбоцитов (коллаген): 6 раз;

- иммуногенность/ADA: 3 раза.

Агрегация тромбоцитов

Получили и немедленно использовали богатую тромбоцитами плазму (PRP) крови здоровых субъектов, внутривенно получавших плацебо или АСТ017 в дозе 500 мг, из которых 25% вводилось в течение первых 15 минут, а 75% вводилось в течение следующих 5 часов 45 минут, после центрифугирования (120 × g; 15 мин; 20°С). Определяли и непрерывно регистрировали скорость и интенсивность агрегации тромбоцитов с использованием агрегатора APACT® и коллагена типа I (Horm collagen, Nycomed, Германия) в концентрации 2,5 мкг⋅мл^-1, добавленного в PRP, содержащую различные концентрации Fab согласно изобретению. Измерили интенсивность агрегации тромбоцитов как процент увеличения пропускания света.

Результаты

Как показано на фиг. 9, процент агрегации тромбоцитов у субъекта 2 уменьшился примерно на 70% по сравнению с исходным показателем только через 15 минут после начала введения и поддерживается на уровне около 10% в течение следующих 8 часов, затем снова увеличился и достиг около 70% через 24 часа, а затем вернулся к исходному показателю через 48 часов после введения. Через 168 часов после введения не наблюдалось какого-либо влияния на агрегации тромбоцитов. Таким образом, эффект, наблюдаемый у субъекта 2, является обратимым. У субъекта 1 процент агрегации тромбоцитов, по-видимому, оставался неизменным в течение 168 часов эксперимента.

Пример 3

Исследование аффинности эпитопов АСТ017 в GPVI

Эпитоп АСТ017 в GPVI путем картирования был ранее идентифицирован как конформационный эпитоп, содержащий две области в GPVI: аминокислоты 121-135 и аминокислоты 169-183 в SEQ ID NO: 13. Для подтверждения этого эпитопа, была сконструирована следующая двунаправленная мутация: S125P, S126Q, G128R, Q133K, T136S, T171D, A172L и H174V, и измерена ее афинность в отношении коллагена и АСТ017.

Материалы и методы

Был получен растворимый GPVI-Fc следующим образом: синтезировали ген, кодирующий эктодомен GPVI человека из первого метионина в аспарагин 269, слитый с Fc-доменом IgG1 человека через трипептид GGR, после оптимизации кодона. Клонировали этот ген в вектор рТТ5 до трансфекции клеток HEK 293-6Е. Очистили выделенный GPVI-Fc от кондиционированной среды клеток путем аффинной хроматографии с использованием матрицы MAbselect (GE Healthcare, 17519901) с последующей полировочной хроматографией на катионообменной смоле Nuvia™ HR-S (BioRad, 15605).

Действие двунаправленной мутации на способность GPVI-Fc связывать коллаген

Нанесли коллаген в PBS (20 мкг/мл, 100 мкл на лунку) на планшеты для микротитрования и выдержали при температуре 4°С в течение ночи. В течение 30 минут насытили сайты неспецифического связывания с использованием 200 мкл 1% BSA в PBS. Затем в течение 30 минут инкубировали планшеты с возрастающими концентрациями препаратов GPVI-Fc дикого типа или с двунаправленной мутацией (100 мкл в PBS, содержащем 0,1% BSA и 0,1% Tween 20). После 3 циклов промывания в течение 30 мин инкубировали планшеты с конъюгированным с пероксидазой вторичным антителом против Fc(Ab) человека. Наконец, в течение 4 мин добавили в каждую лунку по 100 мкл раствора субстрата, и остановили колориметрическую реакцию с помощью 25 мкл 3 М NaOH.

Действие двунаправленной мутации на способность АСТ017 связывать GPVI-Fc

Нанесли GPVI-Fc в PBS (20 мкг/мл, 100 мкл на лунку) на планшеты для микротитрования и выдержали при температуре 4°С в течение ночи. В течение 30 минут насытили сайты неспецифического связывания с использованием 200 мкл 1% BSA в PBS. Затем в течение 30 минут инкубировали планшеты с возрастающими концентрациями препаратов АСТ017 (100 мкл в PBS, содержащем 0,1% BSA и 0,1% Tween 20). После 3 циклов промывания в течение 30 мин инкубировали планшеты с конъюгированным с пероксидазой вторичным антителом против IgA человека. Наконец, в течение 4 мин добавили в каждую лунку по 100 мкл раствора субстрата, и остановили колориметрическую реакцию с помощью 25 мкл 3 М NaOH.

Анализ

Измерили спектральную поглощательную способность на волне 450 нм с помощью Flustar Optima.

Результаты

Как показано на фиг. 7, GPVI-Fc с двойной мутацией все еще способен связывать коллаген в зависимости от дозы, что говорит о преимущественном сохранении афинности GPVI в отношении коллагена в присутствии этих мутаций. Однако, как показано на фиг. 8, АСТ017 способно связывать GPVI-Fc дикого типа, но не с двойной мутацией даже в высоких концентрациях. Таким образом, эти результаты подтвердили положение эпитопа АСТ017 в последовательности GPVI.

--->

Перечень последовательностей

<110> AKTИКOР БИOTEK,

УНИВЕРСИТЕ ПАРИ ДИДРО-ПАРИ 7,

УНИВЕРСИТЕ ПАРИ,

ИНСТИТЬЮТ НАСЬОНАЛ ДЕ ЛА САНТЕ РЕШЕРШ МЕДИКАЛЬ (ИНСЕРМ),

УНИВЕРСИТЕ ПАРИ-СЮД 11, FR

<120> Выделенный гуманизированный белок, связывающийся с гликопротеином

VI человека

<150> RU 2019127768

<160> 27

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<223> VH-CDR1

<400> 1

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His

1 5 10

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<223> VH-CDR2

<400> 2

Gly Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<223> VH-CDR3

<400> 3

Gly Thr Val Val Gly Asp Trp Tyr Phe Asp Val

1 5 10 2

<210> 4

<211> 16

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<223> VL-CDR1

<400> 4

Arg Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn

1 5 10 15

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<223> VL-CDR2

<400> 5

Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<223> VL-CDR3

<400> 6

Leu Gln Leu Thr His Val Pro Trp Thr

1 5

<210> 7

<211> 120

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<223> Вариабельная область тяжёлой цепи

<400> 7

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95 3

Ala Arg Gly Thr Val Val Gly Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 8

<211> 113

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<223> Вариабельная область лёгкой цепи

<400> 8

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile

65 70 75 80

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Leu

85 90 95

Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Thr

100 105 110

Arg

<210> 9

<211> 113

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<223> Вариабельная область лёгкой цепи

<400> 9

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Ser Leu Glu Asn Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75 80

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Leu

85 90 95

Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg 4

<210> 10

<211> 360

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<223> Вариабельная область тяжёлой цепи

<400> 10

caggttcagc tggttcagtc aggggctgag gtgaagaagc ctggagcctc agtgaaggtg 60

tcctgcaagg cttctggcta cacatttacc agttacaata tgcactgggt aagacaggct 120

cctggacagg gcctggaatg gatgggaggt atttatccag gaaatggtga tacttcctac 180

aatcagaagt tccagggccg agttactatg actcgggaca cttccacctc tacagtgtac 240

atggagctca gcagcctgag atctgaggac accgcggtct attactgtgc aagaggcacc 300

gtggtcggcg actggtactt cgatgtgtgg ggccaaggca ccctggtcac cgtgagcagt 360

<210> 11

<211> 339

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<223> Вариабельная область лёгкой цепи

<400> 11

gacatccaga tgacccagag cccaagcagc ctgagcgcca gcgtgggtga cagagtgacc 60

atcacctgta gaagtagtca gagccttgag aacagcaacg gaaacaccta cctgaattgg 120

taccagcaga agccaggtaa ggctccaaag ctgctgatct acagagtttc caaccgattc 180

tctggtgtgc caagcagatt cagcggtagc ggtagcggta ccgacttcac cttcaccatc 240

agcagcctcc agccagagga catcgccacc tactactgcc tccagctgac tcatgtccca 300

tggaccttcg gtcagggcac caaggtggag atcacccgg 339

<210> 12

<211> 339

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<223> Вариабельная область лёгкой цепи

<400> 12

gacatccaga tgacccagag cccaagcagc ctgagcgcca gcgtgggtga cagagtgacc 60

atcacctgta gtgccagtca gagccttgag aacagcaacg gaaacaccta cctgaattgg 120 5

taccagcaga agccaggtaa ggctccaaag ctgctgatct acagagtttc caaccgattc 180

tctggtgtgc caagcagatt cagcggtagc ggtagcggta ccgacttcac cctcaccatc 240

agcagcctcc agccagagga cttcgccacc tactactgcc tccagctgac tcatgtccca 300

tggaccttcg gtcagggcac caaggtggag atcaaacgc 339

<210> 13

<211> 339

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 13

Met Ser Pro Ser Pro Thr Ala Leu Phe Cys Leu Gly Leu Cys Leu Gly

1 5 10 15

Arg Val Pro Ala Gln Ser Gly Pro Leu Pro Lys Pro Ser Leu Gln Ala

20 25 30

Leu Pro Ser Ser Leu Val Pro Leu Glu Lys Pro Val Thr Leu Arg Cys

35 40 45

Gln Gly Pro Pro Gly Val Asp Leu Tyr Arg Leu Glu Lys Leu Ser Ser

50 55 60

Ser Arg Tyr Gln Asp Gln Ala Val Leu Phe Ile Pro Ala Met Lys Arg

65 70 75 80

Ser Leu Ala Gly Arg Tyr Arg Cys Ser Tyr Gln Asn Gly Ser Leu Trp

85 90 95

Ser Leu Pro Ser Asp Gln Leu Glu Leu Val Ala Thr Gly Val Phe Ala

100 105 110

Lys Pro Ser Leu Ser Ala Gln Pro Gly Pro Ala Val Ser Ser Gly Gly

115 120 125

Asp Val Thr Leu Gln Cys Gln Thr Arg Tyr Gly Phe Asp Gln Phe Ala

130 135 140

Leu Tyr Lys Glu Gly Asp Pro Ala Pro Tyr Lys Asn Pro Glu Arg Trp

145 150 155 160

Tyr Arg Ala Ser Phe Pro Ile Ile Thr Val Thr Ala Ala His Ser Gly

165 170 175

Thr Tyr Arg Cys Tyr Ser Phe Ser Ser Arg Asp Pro Tyr Leu Trp Ser

180 185 190

Ala Pro Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val Val Thr Gly Thr Ser Val Thr

195 200 205

Pro Ser Arg Leu Pro Thr Glu Pro Pro Ser Ser Val Ala Glu Phe Ser

210 215 220

Glu Ala Thr Ala Glu Leu Thr Val Ser Phe Thr Asn Lys Val Phe Thr

225 230 235 240

Thr Glu Thr Ser Arg Ser Ile Thr Thr Ser Pro Lys Glu Ser Asp Ser

245 250 255

Pro Ala Gly Pro Ala Arg Gln Tyr Tyr Thr Lys Gly Asn Leu Val Arg

260 265 270

Ile Cys Leu Gly Ala Val Ile Leu Ile Ile Leu Ala Gly Phe Leu Ala

275 280 285

Glu Asp Trp His Ser Arg Arg Lys Arg Leu Arg His Arg Gly Arg Ala

290 295 300 6

Val Gln Arg Pro Leu Pro Pro Leu Pro Pro Leu Pro Gln Thr Arg Lys

305 310 315 320

Ser His Gly Gly Gln Asp Gly Gly Arg Gln Asp Val His Ser Arg Gly

325 330 335

Leu Cys Ser

<210> 14

<211> 321

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<223> Константная область тяжёлой цепи

<400> 14

gcctccacca agggtccctc agtcttccca ctggcaccct cctccaagag cacctctggt 60

ggcacagctg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc cagaaccagt gactgtgtca 120

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc ctgctgtctt gcagtcctca 180

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agtcgagcct 300

aagtcatgcg acaagactca c 321

<210> 15

<211> 318

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<223> Константная область лёгкой цепи

<400> 15

actgtggctg caccaagtgt gttcatcttc ccacctagcg atgagcagtt gaaatctgga 60

actgcctctg tcgtgtgcct cctgaacaac ttctacccac gggaggccaa ggtacagtgg 120

aaggtggata acgccctcca atccggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaagatagc 180

aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctgactctga gcaaagcaga ctacgagaag 240

cacaaggtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gttcccctgt cacaaagagc 300

ttcaaccggg gagagtgt 318

<210> 16

<211> 66

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность 7

<223> Сигнальный пептид

<400> 16

atggatatgc gtgtaccagc tcaactactt ggacttctat tgctttggct tcgtggtgct 60

agatgt 66

<210> 17

<211> 57

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<223> Сигнальный пептид

<400> 17

atggactgga cttggagaat cctattcttg gttgctgcag ctacaggtgc tcattca 57

<210> 18

<211> 762

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<223> Тяжёлая цепь

<400> 18

gcggccgcca ccatggactg gacttggaga atcctattct tggttgctgc agctacaggt 60

gctcattcac aggttcagct ggttcagtca ggggctgagg tgaagaagcc tggagcctca 120

gtgaaggtgt cctgcaaggc ttctggctac acatttacca gttacaatat gcactgggta 180

agacaggctc ctggacaggg cctggaatgg atgggaggta tttatccagg aaatggtgat 240

acttcctaca atcagaagtt ccagggccga gttactatga ctcgggacac ttccacctct 300

acagtgtaca tggagctcag cagcctgaga tctgaggaca ccgcggtcta ttactgtgca 360

agaggcaccg tggtcggcga ctggtacttc gatgtgtggg gccaaggcac cctggtcacc 420

gtgagcagtg cctccaccaa gggtccctca gtcttcccac tggcaccctc ctccaagagc 480

acctctggtg gcacagctgc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc agaaccagtg 540

actgtgtcat ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc tgctgtcttg 600

cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc 660

acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa 720

gtcgagccta agtcatgcga caagactcac tgatgaggat cc 762 8

<210> 19

<211> 742

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<223> Лёгкая цепь

<400> 19

gacgtcacca tggatatgcg tgtaccagct caactacttg gacttctatt gctttggctt 60

cgtggtgcta gatgtgacat ccagatgacc cagagcccaa gcagcctgag cgccagcgtg 120

ggtgacagag tgaccatcac ctgtagaagt agtcagagcc ttgagaacag caacggaaac 180

acctacctga attggtacca gcagaagcca ggtaaggctc caaagctgct gatctacaga 240

gtttccaacc gattctctgg tgtgccaagc agattcagcg gtagcggtag cggtaccgac 300

ttcaccttca ccatcagcag cctccagcca gaggacatcg ccacctacta ctgcctccag 360

ctgactcatg tcccatggac cttcggtcag ggcaccaagg tggagatcac ccggactgtg 420

gctgcaccaa gtgtgttcat cttcccacct agcgatgagc agttgaaatc tggaactgcc 480

tctgtcgtgt gcctcctgaa caacttctac ccacgggagg ccaaggtaca gtggaaggtg 540

gataacgccc tccaatccgg taactcccag gagagtgtca cagagcaaga tagcaaggac 600

agcacctaca gcctcagcag caccctgact ctgagcaaag cagactacga gaagcacaag 660

gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc ctgagttccc ctgtcacaaa gagcttcaac 720

cggggagagt gttgatgata tc 742

<210> 20

<211> 742

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<223> Лёгкая цепь

<400> 20

gacgtcacca tggatatgcg tgtaccagct caactacttg gacttctatt gctttggctt 60

cgtggtgcta gatgtgacat ccagatgacc cagagcccaa gcagcctgag cgccagcgtg 120

ggtgacagag tgaccatcac ctgtagtgcc agtcagagcc ttgagaacag caacggaaac 180

acctacctga attggtacca gcagaagcca ggtaaggctc caaagctgct gatctacaga 240

gtttccaacc gattctctgg tgtgccaagc agattcagcg gtagcggtag cggtaccgac 300

ttcaccctca ccatcagcag cctccagcca gaggacttcg ccacctacta ctgcctccag 360 9

ctgactcatg tcccatggac cttcggtcag ggcaccaagg tggagatcaa acgcactgtg 420

gctgcaccaa gtgtgttcat cttcccacct agcgatgagc agttgaaatc tggaactgcc 480

tctgtcgtgt gcctcctgaa caacttctac ccacgggagg ccaaggtaca gtggaaggtg 540

gataacgccc tccaatccgg taactcccag gagagtgtca cagagcaaga tagcaaggac 600

agcacctaca gcctcagcag caccctgact ctgagcaaag cagactacga gaagcacaag 660

gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc ctgagttccc ctgtcacaaa gagcttcaac 720

cggggagagt gttgatgata tc 742

<210> 21

<211> 4

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<223> CDR-L3 – Остатки после

<220>

<221> Сайт

<222> 3

<223> X является любой аминокислотой

<400> 21

Phe Gly Xaa Gly

1

<210> 22

<211> 4

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<223> CDR-H1 -остатки до

<221> Сайт

<222> 2

<223> X является любой аминокислотой

<221> Сайт

<222> 3

<223> X является любой аминокислотой

<221> Сайт

<222> 4

<223> X является любой аминокислотой

<400> 22

Cys Xaa Xaa Xaa 10

1

<210> 23

<211> 5

<212> PRT

<213> искусственная последовательность

<223> CDR-H2 – остатки до

<400> 23

Leu Glu Trp Ile Gly

1 5

<210> 24

<211> 4

<212> PRT

<213> искусственная последовательность

<223> CDR-H3 – остстки после

<221> Сайт

<222> 3

<223> X является любой аминокислотой

<400> 24

Trp Gly Xaa Gly

1

<210> 25

<211> 527

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 25

Ser Tyr Gln Val Ile Cys Arg Asp Glu Lys Thr Gln Met Ile Tyr Gln

1 5 10 15

Gln His Gln Ser Trp Leu Arg Pro Val Leu Arg Ser Asn Arg Val Glu

20 25 30

Tyr Cys Trp Cys Asn Ser Gly Arg Ala Gln Cys His Ser Val Pro Val

35 40 45

Lys Ser Cys Ser Glu Pro Arg Cys Phe Asn Gly Gly Thr Cys Gln Gln

50 55 60

Ala Leu Tyr Phe Ser Asp Phe Val Cys Gln Cys Pro Glu Gly Phe Ala

65 70 75 80

Gly Lys Cys Cys Glu Ile Asp Thr Arg Ala Thr Cys Tyr Glu Asp Gln

85 90 95

Gly Ile Ser Tyr Arg Gly Thr Trp Ser Thr Ala Glu Ser Gly Ala Glu

100 105 110

Cys Thr Asn Trp Asn Ser Ser Ala Leu Ala Gln Lys Pro Tyr Ser Gly

115 120 125

Arg Arg Pro Asp Ala Ile Arg Leu Gly Leu Gly Asn His Asn Tyr Cys

130 135 140 11

Arg Asn Pro Asp Arg Asp Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Val Phe Lys Ala

145 150 155 160

Gly Lys Tyr Ser Ser Glu Phe Cys Ser Thr Pro Ala Cys Ser Glu Gly

165 170 175

Asn Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Asn Gly Ser Ala Tyr Arg Gly Thr His

180 185 190

Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp Asn Ser Met Ile

195 200 205

Leu Ile Gly Lys Val Tyr Thr Ala Gln Asn Pro Ser Ala Gln Ala Leu

210 215 220

Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ala Lys

225 230 235 240

Pro Trp Cys His Val Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr Trp Glu Tyr Cys

245 250 255

Asp Val Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gln Tyr Ser Gln Pro

260 265 270

Gln Phe Arg Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala Ser His Pro

275 280 285

Trp Gln Ala Ala Ile Phe Ala Lys His Arg Arg Ser Pro Gly Glu Arg

290 295 300

Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile Leu Ser Ala

305 310 315 320

Ala His Cys Phe Gln Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu Thr Val Ile

325 330 335

Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Val Pro Gly Glu Glu Glu Gln Lys Phe

340 345 350

Glu Val Glu Lys Tyr Ile Val His Lys Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr

355 360 365

Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gln Leu Lys Ser Asp Ser Ser Arg Cys

370 375 380

Ala Gln Glu Ser Ser Val Val Arg Thr Val Cys Leu Pro Pro Ala Asp

385 390 395 400

Leu Gln Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys

405 410 415

His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys Glu Ala His

420 425 430

Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gln His Leu Leu Asn

435 440 445

Arg Thr Val Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly

450 455 460

Gly Pro Gln Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly

465 470 475 480

Pro Leu Val Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Val Gly Ile Ile

485 490 495

Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gln Lys Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr

500 505 510

Lys Val Thr Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro

515 520 525

<210> 26

<211> 275

<212> PRT

<213> Homo sapiens 12

<400> 26

Ser Tyr Gln Val Ile Cys Arg Asp Glu Lys Thr Gln Met Ile Tyr Gln

1 5 10 15

Gln His Gln Ser Trp Leu Arg Pro Val Leu Arg Ser Asn Arg Val Glu

20 25 30

Tyr Cys Trp Cys Asn Ser Gly Arg Ala Gln Cys His Ser Val Pro Val

35 40 45

Lys Ser Cys Ser Glu Pro Arg Cys Phe Asn Gly Gly Thr Cys Gln Gln

50 55 60

Ala Leu Tyr Phe Ser Asp Phe Val Cys Gln Cys Pro Glu Gly Phe Ala

65 70 75 80

Gly Lys Cys Cys Glu Ile Asp Thr Arg Ala Thr Cys Tyr Glu Asp Gln

85 90 95

Gly Ile Ser Tyr Arg Gly Thr Trp Ser Thr Ala Glu Ser Gly Ala Glu

100 105 110

Cys Thr Asn Trp Asn Ser Ser Ala Leu Ala Gln Lys Pro Tyr Ser Gly

115 120 125

Arg Arg Pro Asp Ala Ile Arg Leu Gly Leu Gly Asn His Asn Tyr Cys

130 135 140

Arg Asn Pro Asp Arg Asp Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Val Phe Lys Ala

145 150 155 160

Gly Lys Tyr Ser Ser Glu Phe Cys Ser Thr Pro Ala Cys Ser Glu Gly

165 170 175

Asn Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Asn Gly Ser Ala Tyr Arg Gly Thr His

180 185 190

Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp Asn Ser Met Ile

195 200 205

Leu Ile Gly Lys Val Tyr Thr Ala Gln Asn Pro Ser Ala Gln Ala Leu

210 215 220

Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ala Lys

225 230 235 240

Pro Trp Cys His Val Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr Trp Glu Tyr Cys

245 250 255

Asp Val Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gln Tyr Ser Gln Pro

260 265 270

Gln Phe Arg

275

<210> 27

<211> 252

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 27

Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala Ser His Pro Trp Gln Ala

1 5 10 15

Ala Ile Phe Ala Lys His Arg Arg Ser Pro Gly Glu Arg Phe Leu Cys

20 25 30

Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile Leu Ser Ala Ala His Cys

35 40 45

Phe Gln Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu Thr Val Ile Leu Gly Arg

50 55 60 13

Thr Tyr Arg Val Val Pro Gly Glu Glu Glu Gln Lys Phe Glu Val Glu

65 70 75 80

Lys Tyr Ile Val His Lys Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr Asp Asn Asp

85 90 95

Ile Ala Leu Leu Gln Leu Lys Ser Asp Ser Ser Arg Cys Ala Gln Glu

100 105 110

Ser Ser Val Val Arg Thr Val Cys Leu Pro Pro Ala Asp Leu Gln Leu

115 120 125

Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys His Glu Ala

130 135 140

Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys Glu Ala His Val Arg Leu

145 150 155 160

Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gln His Leu Leu Asn Arg Thr Val

165 170 175

Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly Gly Pro Gln

180 185 190

Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val

195 200 205

Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Val Gly Ile Ile Ser Trp Gly

210 215 220

Leu Gly Cys Gly Gln Lys Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr

225 230 235 240

Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro

245 250

<---

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложено применение выделенного гуманизированного белка, связывающего гликопротеин VI человека (hGPVI), для лечения связанного с GPVI состояния у нуждающегося в этом субъекта. Выделенный гуманизированный белок вводят субъекту в течение, по меньшей мере, 2 часов, предпочтительно в течение, по меньшей мере, 4-6 часов. Указанный белок является молекулой антитела или фрагментом антитела. Изобретение обеспечивает улучшенную безопасность и переносимость при введении антитела человеку и может быть использовано для предотвращения и/или лечения сердечно-сосудистых болезней человека. 2 н. и 10 з.п. ф-лы, 9 ил., 3 пр.

1. Применение выделенного гуманизированного белка, связывающего гликопротеин VI человека (hGPVI), для лечения связанного с GPVI состояния у нуждающегося в этом субъекта, при этом упомянутый выделенный гуманизированный белок вводят субъекту в течение, по меньшей мере, 2 часов, предпочтительно в течение, по меньшей мере, 4-6 часов, и указанный белок является молекулой антитела или фрагментом антитела, причём вариабельная область тяжелой цепи представляет SEQ ID NO: 7, и вариабельная область легкой цепи представляет SEQ ID NO: 8.

2. Применение выделенного гуманизированного белка по п. 1, при котором введение осуществляют путем инъекции, предпочтительно путем внутривенного вливания.

3. Применение выделенного гуманизированного белка по п. 1, при котором указанный белок вводят пациенту в дозе от около 0,5 мг/кг до около 50 мг/кг, предпочтительно от около 1 мг/кг до около 32 мг/кг, более предпочтительно около 8 мг/кг.

4. Применение выделенного гуманизированного белка по п. 1, при котором доза составляет от около 125 мг до около 2000 мг, предпочтительно от около 250 мг до около 1000 мг или от около 500 мг до около 1000 мг.

5. Применение выделенного гуманизированного белка по п. 1, при котором вводят белок в форме первого болюса, предпочтительно составляющего от около 10 до 50%, предпочтительно около 20% общей дозы, при этом первый болюс предпочтительно вводится в течение от около 5 до 30 минут, предпочтительно в течение около 15 минут.

6. Применение выделенного гуманизированного белка по п. 1, при этом белок связывает эпитоп, содержащий:

- по меньшей мере, один аминокислотный остаток из аминокислотных остатков 114-142 hGPVI (SEQ ID NO: 13) или из последовательности, по меньшей мере, на 60% идентичной на протяжении аминокислотных остатков 114-142 hGPVI (SEQ ID NO: 13); и

- по меньшей мере, один аминокислотный остаток из аминокислотных остатков 165-187 hGPVI (SEQ ID NO: 13) или из последовательности, по меньшей мере, на 60% идентичной на протяжении аминокислотных остатков 165-187 hGPVI (SEQ ID NO: 13).

7. Применение выделенного гуманизированного белка по п. 1, при этом белок имеет K_D связывания hGPVI менее 15 нМ, которая измеряется путем поверхностного плазмонного резонанса с использованием 960-1071 резонансных единиц (RU) растворимого GPVI человека и с использованием PBS с рН 7,4 в качестве рабочего буфера, а изолированный гуманизированный белок не индуцирует истощенный фенотип GPVI in vivo.

8. Применение выделенного гуманизированного белка по п. 1, представляющего собой молекулу антитела, выбранную из группы, включающей цельное антитело, одноцепочечное антитело, Fv, Fab; или фрагмент антитела, выбранного из группы, включающей унитело, доменное антитело и нанотело, предпочтительно одновалентное.

9. Применение выделенного гуманизированного белка по любому из пп. 1-8, при этом связанным с GPVI состоянием является артериальный и венозный тромбоз, острый коронарный синдром, нарушение мозгового кровообращения вследствие атеросклероза, критическая ишемия конечностей, цереброваскулярные заболевания, включая ишемический инсульт, венозная тромбоэмболия, тромботическая микроангиопатия и сосудистая пурпура.

10. Применение выделенного гуманизированного белка по любому из пп. 1-8, где связанными с GPVI состояниями являются заболевания коронарных и церебральных артерий.

11. Применение выделенного гуманизированного белка по любому из пп. 1-8, где связанными с GPVI состояниями являются сердечно-сосудистые заболевания, выбираемые из ишемических состояний, острого синдрома коронарных артерий, инфаркта миокарда, инсульта, чрескожного коронарного вмешательства, стентирующего тромбоза, ишемического рестеноза, острой ишемии, хронической ишемии, заболеваний аорты и ее ветвей, заболеваний периферических артерий, тромбоза вен, острого флебита, эмболии легких, связанного с раком тромбоза, тромбоза, связанного с воспалением или раком.

12. Способ лечения связанного с GPVI состояния, отличающийся тем, что вводят субъекту выделенный гуманизированный белок, связывающий гликопротеин VI человека (hGPVI), при этом упомянутый выделенный гуманизированный белок вводят субъекту в течение, по меньшей мере, 2 часов, предпочтительно в течение, по меньшей мере, 4-6 часов, и указанный белок является молекулой антитела или фрагментом антитела, причём вариабельная область тяжелой цепи представляет SEQ ID NO: 7, и вариабельная область легкой цепи представляет SEQ ID NO: 8.