ТРИСПЕЦИФИЧЕСКИЕ СВЯЗЫВАЮЩИЕ БЕЛКИ, СВЯЗЫВАЮЩИЕ CD38, CD28 И CD3, А ТАКЖЕ СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ Российский патент 2024 года по МПК C07K16/28 

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Настоящая заявка испрашивает преимущество приоритета согласно международной заявке № PCT/US2018/055084, поданной 9 октября 2018 г., предварительной заявке на патент США с серийным номером 62/831572, поданной 9 апреля 2019 г., предварительной заявке на патент США с серийным номером 62/831608, поданной 9 апреля 2019 г., и европейской патентной заявке № 19306097.7, поданной 11 сентября 2019 г., все из которых включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

ПРЕДСТАВЛЕНИЕ ПЕРЕЧНЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ В ТЕКСТОВОМ ФАЙЛЕ ASCII

[0002] Содержание нижеследующего представленного текстового файла ASCII включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте: машиночитаемая форма (CRF) перечня последовательностей (название файла: 183952032140SEQLIST.TXT, дата составления: 2 октября 2019 г., размер: 144 КБ).

Область техники, к которой относится изобретение

[0003] Настоящее изобретение относится к способам применения триспецифических связывающих белков, содержащих четыре полипептидных цепи, которые образуют три антигенсвязывающих участка, которые специфически связывают полипептид CD38 (например, полипептиды CD38 человека и/или макака-крабоеда), полипептид CD28 и полипептид CD3, для размножения Т-клеток памяти (например, специфических в отношении вируса Т-клеток памяти) и/или лечения хронической вирусной инфекции.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0004] Как часть адаптивного иммунитета человека, Т-клеточный иммунитет играет решающую роль в контроле вирусной инфекции, устраняя инфицированные клетки, что приводит к клиренсу вирусной инфекции. При хронических инфекционных заболеваниях, таких как инфекция вируса герпеса (HSV, CMV, EBV и т.д.), HIV и HBV, вирусы сохраняют свою устойчивость у людей с помощью различных механизмов, включая подавление иммунитета, истощение Т-клеток и установление латентного периода. Тем не менее, вирусная инфекция обычно индуцирует вирусный антигенспецифический иммунитет, включающий антигенспецифические CD8 Т-клетки, которые могут легко распознавать инфицированные клетки для контроля или уничтожения посредством высвобождения цитокинов или процессов уничтожения, опосредованных цитотоксическими Т-клетками (CTL).

[0005] Таким образом, активация и/или амплификация вирусных антигенспецифических Т-клеток in vivo и/или ex vivo может обеспечить терапевтические стратегии против хронических вирусных инфекций.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0006] В данном документе представлены триспецифические антитела к CD38/CD28xCD3, которые разрабатывали и оценивали на предмет их способности активировать Т-клетки и последующую пролиферацию и/или амплификацию антигенспецифических Т-клеток. Эти триспецифические Ab могут эффективно расширять популяции CD4 и CD8 эффекторных клеток и клеток памяти, в том числе антигенспецифических CD8 центральных T-клеток памяти и эффекторных клеток памяти in vitro. В частности, продемонстрировали in vitro размножение специфических в отношении CMV, EBV, HIV-1, вируса гриппа CD8 центральных клеток памяти и эффекторных клеток памяти. Триспецифические антитела к CD38/CD28xCD3, описываемые в данном документе, демонстрировали новые свойства путем вовлечения CD3/CD28/CD38 с обеспечением пути передачи сигнала для стимуляции и размножения Т-клеток, что может обеспечить эффективную стратегию лечения хронических инфекционных заболеваний, таких как инфекции HSV, CMV, EBV, HIV-1 и HBV.

[0007] Для удовлетворения этих и других потребностей в данном документе представлены связывающие белки, которые связывают полипептид CD38 (например, полипептиды CD38 человека и макака-крабоеда), полипептид CD28 и полипептид CD3.

[0008] В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлен способ размножения специфических в отношении вируса Т-клеток памяти, предусматривающий введение в контакт специфической в отношении вируса Т-клетки памяти со связывающим белком, где связывающий белок содержит четыре полипептидные цепи, которые образуют три антигенсвязывающих участка, где первая полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_L2-L₁-V_L1-L₂-C_L [I],

и вторая полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_H1-L₃-V_H2-L₄-C_H1-шарнир-C_H2-C_H3 [II];

и третья полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_H3-C_H1-шарнир-C_H2-C_H3 [III];

и четвертая полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_L3-C_L [IV];

где

V_L1 представляет собой первый вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;

V_L2 представляет собой второй вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;

V_L3 представляет собой третий вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;

V_H1 представляет собой первый вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;

V_H2 представляет собой второй вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;

V_H3 представляет собой третий вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;

C_L представляет собой константный домен легкой цепи иммуноглобулина;

C_H1 представляет собой константный домен C_H1 тяжелой цепи иммуноглобулина;

C_H2 представляет собой константный домен C_H2 тяжелой цепи иммуноглобулина;

C_H3 представляет собой константный домен C_H3 тяжелой цепи иммуноглобулина;

шарнир представляет собой шарнирный участок иммуноглобулина, соединяющий домены C_H1 и C_H2; и

L₁, L₂, L₃ и L₄ представляют собой аминокислотные линкеры,

где полипептид формулы I и полипептид формулы II образуют кроссоверную пару легкая_цепь-тяжелая_цепь, и

где V_H1 и V_L1 образуют первый антигенсвязывающий участок, который связывает полипептид CD28, где V_H2 и V_L2 образуют второй антигенсвязывающий участок, который связывает полипептид CD3, и где V_H3 и V_L3 образуют третий антигенсвязывающий участок, который связывает полипептид CD38

[0009] В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлен связывающий белок, который содержит четыре полипептидные цепи, которые образуют три антигенсвязывающих участка, где первая полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_L2-L₁-V_L1-L₂-C_L [I],

и вторая полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_H1-L₃-V_H2-L₄-C_H1-шарнир-C_H2-C_H3 [II];

и третья полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_H3-C_H1-шарнир-C_H2-C_H3 [III];

и четвертая полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_L3-C_L [IV];

где

V_L1 представляет собой первый вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;

V_L2 представляет собой второй вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;

V_L3 представляет собой третий вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;

V_H1 представляет собой первый вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;

V_H2 представляет собой второй вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;

V_H3 представляет собой третий вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;

C_L представляет собой константный домен легкой цепи иммуноглобулина;

C_H1 представляет собой константный домен C_H1 тяжелой цепи иммуноглобулина;

C_H2 представляет собой константный домен C_H2 тяжелой цепи иммуноглобулина;

C_H3 представляет собой константный домен C_H3 тяжелой цепи иммуноглобулина;

шарнир представляет собой шарнирный участок иммуноглобулина, соединяющий домены C_H1 и C_H2; и

L₁, L₂, L₃ и L₄ представляют собой аминокислотные линкеры,

где полипептид формулы I и полипептид формулы II образуют кроссоверную пару легкая_цепь-тяжелая_цепь, и

где V_H1 и V_L1 образуют первый антигенсвязывающий участок, который связывает полипептид CD28, где V_H2 и V_L2 образуют второй антигенсвязывающий участок, который связывает полипептид CD3, и где V_H3 и V_L3 образуют третий антигенсвязывающий участок, который связывает полипептид CD38, для применения в размножении специфических в отношении вируса Т-клеток памяти.

[0010] В некоторых вариантах осуществления специфическую в отношении вируса Т-клетку памяти приводят в контакт со связывающим белком in vitro или ex vivo. В некоторых вариантах осуществления приведение в контакт специфической в отношении вируса Т-клетки памяти со связывающим белком вызывает активацию и/или пролиферацию специфических в отношении вируса Т-клеток памяти.

[0011] В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлен способ размножения Т-клеток, предусматривающий приведение в контакт Т-клетки со связывающим белком in vitro или ex vivo, где связывающий белок содержит четыре полипептидные цепи, которые образуют три антигенсвязывающих участка, где первая полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_L2-L₁-V_L1-L₂-C_L [I],

и вторая полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_H1-L₃-V_H2-L₄-C_H1-шарнир-C_H2-C_H3 [II];

и третья полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_H3-C_H1-шарнир-C_H2-C_H3 [III];

и четвертая полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_L3-C_L [IV];

где

V_L1 представляет собой первый вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;

V_L2 представляет собой второй вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;

V_L3 представляет собой третий вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;

V_H1 представляет собой первый вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;

V_H2 представляет собой второй вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;

V_H3 представляет собой третий вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;

C_L представляет собой константный домен легкой цепи иммуноглобулина;

C_H1 представляет собой константный домен C_H1 тяжелой цепи иммуноглобулина;

C_H2 представляет собой константный домен C_H2 тяжелой цепи иммуноглобулина;

C_H3 представляет собой константный домен C_H3 тяжелой цепи иммуноглобулина;

шарнир представляет собой шарнирный участок иммуноглобулина, соединяющий домены C_H1 и C_H2; и

L₁, L₂, L₃ и L₄ представляют собой аминокислотные линкеры,

где полипептид формулы I и полипептид формулы II образуют кроссоверную пару легкая_цепь-тяжелая_цепь, и

где V_H1 и V_L1 образуют первый антигенсвязывающий участок, который связывает полипептид CD28, где V_H2 и V_L2 образуют второй антигенсвязывающий участок, который связывает полипептид CD3, и где V_H3 и V_L3 образуют третий антигенсвязывающий участок, который связывает полипептид CD38.

[0012] В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлен связывающий белок, который содержит четыре полипептидные цепи, которые образуют три антигенсвязывающих участка, где первая полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_L2-L₁-V_L1-L₂-C_L [I],

и вторая полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_H1-L₃-V_H2-L₄-C_H1-шарнир-C_H2-C_H3 [II];

и третья полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_H3-C_H1-шарнир-C_H2-C_H3 [III];

и четвертая полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_L3-C_L [IV];

где

V_L1 представляет собой первый вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;

V_L2 представляет собой второй вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;

V_L3 представляет собой третий вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;

V_H1 представляет собой первый вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;

V_H2 представляет собой второй вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;

V_H3 представляет собой третий вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;

C_L представляет собой константный домен легкой цепи иммуноглобулина;

C_H1 представляет собой константный домен C_H1 тяжелой цепи иммуноглобулина;

C_H2 представляет собой константный домен C_H2 тяжелой цепи иммуноглобулина;

C_H3 представляет собой константный домен C_H3 тяжелой цепи иммуноглобулина;

шарнир представляет собой шарнирный участок иммуноглобулина, соединяющий домены C_H1 и C_H2; и

L₁, L₂, L₃ и L₄ представляют собой аминокислотные линкеры,

где полипептид формулы I и полипептид формулы II образуют кроссоверную пару легкая_цепь-тяжелая_цепь, и

где V_H1 и V_L1 образуют первый антигенсвязывающий участок, который связывает полипептид CD28, где V_H2 и V_L2 образуют второй антигенсвязывающий участок, который связывает полипептид CD3, и где V_H3 и V_L3 образуют третий антигенсвязывающий участок, который связывает полипептид CD38, для применения в способе размножения Т-клеток.

[0013] В некоторых вариантах осуществления Т-клетка представляет собой Т-клетку памяти или эффекторную Т-клетку. В некоторых вариантах осуществления Т-клетка экспрессирует химерный антигенный рецептор (CAR) на своей клеточной поверхности или содержит полинуклеотид, кодирующий CAR.

[0014] В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлен способ лечения хронической вирусной инфекции, предусматривающий введение индивидууму, нуждающемуся в этом, эффективного количества связывающего белка, где связывающий белок содержит четыре полипептидные цепи, которые образуют три антигенсвязывающих участка, где первая полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_L2-L₁-V_L1-L₂-C_L [I],

и вторая полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_H1-L₃-V_H2-L₄-C_H1-шарнир-C_H2-C_H3 [II];

и третья полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_H3-C_H1-шарнир-C_H2-C_H3 [III];

и четвертая полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_L3-C_L [IV];

где

V_L1 представляет собой первый вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;

V_L2 представляет собой второй вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;

V_L3 представляет собой третий вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;

V_H1 представляет собой первый вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;

V_H2 представляет собой второй вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;

V_H3 представляет собой третий вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;

C_L представляет собой константный домен легкой цепи иммуноглобулина;

C_H1 представляет собой константный домен C_H1 тяжелой цепи иммуноглобулина;

C_H2 представляет собой константный домен C_H2 тяжелой цепи иммуноглобулина;

C_H3 представляет собой константный домен C_H3 тяжелой цепи иммуноглобулина;

шарнир представляет собой шарнирный участок иммуноглобулина, соединяющий домены C_H1 и C_H2; и

L₁, L₂, L₃ и L₄ представляют собой аминокислотные линкеры,

где полипептид формулы I и полипептид формулы II образуют кроссоверную пару легкая_цепь-тяжелая_цепь, и

где V_H1 и V_L1 образуют первый антигенсвязывающий участок, который связывает полипептид CD28, где V_H2 и V_L2 образуют второй антигенсвязывающий участок, который связывает полипептид CD3, и где V_H3 и V_L3 образуют третий антигенсвязывающий участок, который связывает полипептид CD38.

[0015] В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлен связывающий белок, который содержит четыре полипептидные цепи, которые образуют три антигенсвязывающих участка, где первая полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_L2-L₁-V_L1-L₂-C_L [I],

и вторая полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_H1-L₃-V_H2-L₄-C_H1-шарнир-C_H2-C_H3 [II];

и третья полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_H3-C_H1-шарнир-C_H2-C_H3 [III];

и четвертая полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_L3-C_L [IV];

где

V_L1 представляет собой первый вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;

V_L2 представляет собой второй вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;

V_L3 представляет собой третий вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;

V_H1 представляет собой первый вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;

V_H2 представляет собой второй вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;

V_H3 представляет собой третий вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;

C_L представляет собой константный домен легкой цепи иммуноглобулина;

C_H1 представляет собой константный домен C_H1 тяжелой цепи иммуноглобулина;

C_H2 представляет собой константный домен C_H2 тяжелой цепи иммуноглобулина;

C_H3 представляет собой константный домен C_H3 тяжелой цепи иммуноглобулина;

шарнир представляет собой шарнирный участок иммуноглобулина, соединяющий домены C_H1 и C_H2; и

L₁, L₂, L₃ и L₄ представляют собой аминокислотные линкеры,

где полипептид формулы I и полипептид формулы II образуют перекрестно расположенную пару легкая_цепь-тяжелая_цепь; и где V_H1 и V_L1 образуют первый антигенсвязывающий участок, который связывает полипептид CD28, где V_H2 и V_L2 образуют второй антигенсвязывающий участок, который связывает полипептид CD3, и где V_H3 и V_L3 образуют третий антигенсвязывающий участок, который связывает полипептид CD38, для применения в способе лечения хронической вирусной инфекции, где указанный способ предусматривает введение индивидууму, нуждающемуся в этом, эффективного количества связывающего белка. В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлен связывающий белок для применения в способе лечения хронической вирусной инфекции, где указанный способ предусматривает введение индивидууму, нуждающемуся в этом, эффективного количества связывающего белка, где связывающий белок содержит четыре полипептидные цепи, которые образуют три антигенсвязывающих участка, где первая полипептидная цепь связывающего белка содержит структуру, представленную формулой:

V_L2-L₁-V_L1-L₂-C_L [I],

а вторая полипептидная цепь связывающего белка содержит структуру, представленную формулой:

V_H1-L₃-V_H2-L₄-C_H1-шарнир-C_H2-C_H3 [II],

и третья полипептидная цепь связывающего белка содержит структуру, представленную формулой:

V_H3-C_H1-шарнир-C_H2-C_H3 [III],

и четвертая полипептидная цепь связывающего белка содержит структуру, представленную формулой:

V_L3-C_L [IV],

где

V_L1 представляет собой первый вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;

V_L2 представляет собой второй вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;

V_L3 представляет собой третий вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;

V_H1 представляет собой первый вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;

V_H2 представляет собой второй вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;

V_H3 представляет собой третий вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;

C_L представляет собой константный домен легкой цепи иммуноглобулина;

C_H1 представляет собой константный домен C_H1 тяжелой цепи иммуноглобулина;

C_H2 представляет собой константный домен C_H2 тяжелой цепи иммуноглобулина;

C_H3 представляет собой константный домен C_H3 тяжелой цепи иммуноглобулина;

шарнир представляет собой шарнирный участок иммуноглобулина, соединяющий домены C_H1 и C_H2; и

L₁, L₂, L₃ и L₄ представляют собой аминокислотные линкеры,

где полипептид формулы I и полипептид формулы II образуют кроссоверную пару легкая_цепь-тяжелая_цепь, и

где V_H1 и V_L1 образуют первый антигенсвязывающий участок, который связывает полипептид CD28, где V_H2 и V_L2 образуют второй антигенсвязывающий участок, который связывает полипептид CD3, и где V_H3 и V_L3 образуют третий антигенсвязывающий участок, который связывает полипептид CD38.

[0016] В некоторых вариантах осуществления индивидуум является человеком. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок вводят индивидууму в фармацевтическом составе, содержащем связывающий белок и фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых вариантах осуществления введение связывающего белка приводит к активации и/или пролиферации специфических в отношении вируса Т-клеток памяти у индивидуума.

[0017] В некоторых вариантах осуществления, которые могут представлять собой объединение любых других вариантов осуществления, описываемых в данном документе, Т-клетки памяти представляют собой CD8+ или CD4+ Т-клетки памяти. В некоторых вариантах осуществления Т-клетки памяти представляют собой центральные Т-клетки памяти (T_CM) или эффекторные Т-клетки памяти (T_EM).

[0018] В некоторых вариантах осуществления, которые могут представлять собой объединение любых других вариантов осуществления, описываемых в данном документе, полипептид CD28 представляет собой полипептид CD28 человека, где полипептид CD3 представляет собой полипептид CD3 человека, и где полипептид CD38 представляет собой полипептид CD38 человека.

[0019] В некоторых вариантах осуществления, которые могут представлять собой объединение любых других вариантов осуществления, описываемых в данном документе, домен V_H3 содержит последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GYTFTSFN (SEQ ID NO:31), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IYPGNGGT (SEQ ID NO:32), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO:33), и домен V_L3 содержит последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность ESVDSYGNGF (SEQ ID NO:34), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность LAS (SEQ ID NO:35), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQNKEDPWT (SEQ ID NO:36). В некоторых вариантах осуществления домен V_H3 содержит последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GYTFTSYA (SEQ ID NO:37), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IYPGQGGT (SEQ ID NO:38), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO:33), и домен V_L3 содержит последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность QSVSSYGQGF (SEQ ID NO:39), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность GAS (SEQ ID NO:40), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQNKEDPWT (SEQ ID NO:36). В некоторых вариантах осуществления домен V_H3 содержит последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GFTFSSYG (SEQ ID NO:41), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IWYDGSNK (SEQ ID NO:42), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARMFRGAFDY (SEQ ID NO:43), и домен V_L3 содержит последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность QGIRND (SEQ ID NO:44), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность AAS (SEQ ID NO:45), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность LQDYIYYPT (SEQ ID NO:46). В некоторых вариантах осуществления домен V_H3 содержит аминокислотную последовательность QVQLQQSGAELVRSGASVKMSCKASGYTFTSFNMHWVKETPGQGLEWIGYIYPGNGGTNYNQKFKGKATLTADTSSSTAYMQISSLTSEDSAVYFCARTGGLRRAYFTYWGQGTLVTVS (SEQ ID NO:5), и домен V_L3 содержит аминокислотную последовательность DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYGNGFMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYCQQNKEDPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:6). В некоторых вариантах осуществления домен V_H3 содержит аминокислотную последовательность Qvqlvqsgaevvkpgasvkvsckasgytftsyamhwvkeapgqrlewigyiypgqggtnynqkfqgratltadtsastaymelsslrsedtavyfcartgglrrayftywgqgtlvtvss (SEQ ID NO:13), и домен V_L3 содержит аминокислотную последовательность Divltqspatlslspgeratiscrasqsvssygqgfmhwyqqkpgqpprlliygassratgiparfsgsgsgtdftltisplepedfavyycqqnkedpwtfgggtkleik (SEQ ID NO:14). В некоторых вариантах осуществления домен V_H3 содержит аминокислотную последовательность QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTSFNMHWVKEAPGQRLEWIGYIYPGNGGTNYNQKFQGRATLTADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFCARTGGLRRAYFTYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:17), и домен V_L3 содержит аминокислотную последовательность DIVLTQSPATLSLSPGERATISCRASESVDSYGNGFMHWYQQKPGQPPRLLIYLASSRAT GIPARFSGSGSGTDFTLTISPLEPEDFAVYYCQQNKEDPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:18). В некоторых вариантах осуществления домен V_H3 содержит аминокислотную последовательность QVQLVQSGAEVVKSGASVKVSCKASGYTFTSFNMHWVKEAPGQGLEWIGYIYPGNGGTNYNQKFQGRATLTADTSASTAYMEISSLRSEDTAVYFCARTGGLRRAYFTYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:21), и домен V_L3 содержит аминокислотную последовательность DIVLTQSPATLSLSPGERATISCRASESVDSYGNGFMHWYQQKPGQPPRLLIYLASSRAT GIPARFSGSGSGTDFTLTISPLEPEDFAVYYCQQNKEDPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:18). В некоторых вариантах осуществления домен V_H3 содержит аминокислотную последовательность QVQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSFNMHWVKEAPGQRLEWIGYIYPGNGGTNYNQKFQGRATLTADTSASTAYMEISSLRSEDTAVYFCARTGGLRRAYFTYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:23), и домен V_L3 содержит аминокислотную последовательность DIVLTQSPATLSLSPGERATISCRASESVDSYGNGFMHWYQQKPGQPPRLLIYLASSRAT GIPARFSGSGSGTDFTLTISPLEPEDFAVYYCQQNKEDPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:18). В некоторых вариантах осуществления домен V_H3 содержит аминокислотную последовательность QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISGDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARMFRGAFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:9), и домен V_L3 содержит аминокислотную последовательность AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISGLQPEDSATYYCLQDYIYYPTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:10).

[0020] В некоторых вариантах осуществления, которые могут представлять собой объединение любых других вариантов осуществления, описываемых в данном документе, домен V_H1 содержит последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GYTFTSYY (SEQ ID NO:108), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IYPGNVNT (SEQ ID NO:109), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность TRSHYGLDWNFDV (SEQ ID NO:110), и домен V_L1 содержит последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность QNIYVW (SEQ ID NO:111), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность KAS (SEQ ID NO:112), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQGQTYPY (SEQ ID NO:113). В некоторых вариантах осуществления домен V_H1 содержит последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GFSLSDYG (SEQ ID NO:114), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IWAGGGT (SEQ ID NO:115), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARDKGYSYYYSMDY (SEQ ID NO:116), и домен V_L1 содержит последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность ESVEYYVTSL (SEQ ID NO:117), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность AAS (SEQ ID NO:118), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQSRKVPYT (SEQ ID NO:119). В некоторых вариантах осуществления домен V_H1 содержит аминокислотную последовательность qvqlvqsgaevvkpgasvkvsckasgytftsyyihwvrqapgqglewigsiypgnvntnyaqkfqgratltvdtsistaymelsrlrsddtavyyctrshygldwnfdvwgkgttvtvss (SEQ ID NO:49), и домен V_L1 содержит аминокислотную последовательность diqmtqspsslsasvgdrvtitcqasqniyvwlnwyqqkpgkapklliykasnlhtgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpediatyycqqgqtypytfgqgtkleik (SEQ ID NO:50). В некоторых вариантах осуществления домен V_H1 содержит аминокислотную последовательность qvqlqesgpglvkpsqtlsltctvsgfslsdygvhwvrqppgkglewlgviwagggtnynpslksrktiskdtsknqvslklssvtaadtavyycardkgysyyysmdywgqgttvtvs (SEQ ID NO:51), и домен V_L1 содержит аминокислотную последовательность divltqspaslavspgqratitcrasesveyyvtslmqwyqqkpgqppkllifaasnvesgvparfsgsgsgtdftltinpveandvanyycqqsrkvpytfgqgtkleik (SEQ ID NO:52).

[0021] В некоторых вариантах осуществления, которые могут представлять собой объединение любых других вариантов осуществления, описываемых в данном документе, домен V_H2 содержит последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность gftftkaw (SEQ ID NO:120), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IKDKSNSYAT (SEQ ID NO:121), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность RGVYYALSPFDY (SEQ ID NO:122), и домен V_L2 содержит последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность QSLVHNNANTY (SEQ ID NO:123), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность KVS (SEQ ID NO:124), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность GQGTQYPFT (SEQ ID NO:125). В некоторых вариантах осуществления домен V_H2 содержит последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GFTFTKAW (SEQ ID NO:126), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IKDKSNSYAT (SEQ ID NO:127), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность GVYYALSPFDY (SEQ ID NO:128), и домен V_L2 содержит последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность QSLVHNNGNTY (SEQ ID NO:129), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность KVS (SEQ ID NO:130), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность GQGTQYPFT (SEQ ID NO:131). В некоторых вариантах осуществления домен V_H2 содержит аминокислотную последовательность qvqlvesgggvvqpgrslrlscaasgftftkawmhwvrqapgkqlewvaqikdksnsyatyyadsvkgrftisrddskntlylqmnslraedtavyycrgvyyalspfdywgqgtlvtvss (SEQ ID NO:53), и домен V_L2 содержит аминокислотную последовательность divmtqtplslsvtpgqpasisckssqslvhnnantylswylqkpgqspqsliykvsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyycgqgtqypftfgsgtkveik (SEQ ID NO:54). В некоторых вариантах осуществления домен V_H2 содержит аминокислотную последовательность qvqlvesgggvvqpgrslrlscaasgftftkawmhwvrqapgkglewvaqikdksnsyatyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycrgvyyalspfdywgqgtlvtvss (SEQ ID NO:84), и домен V_L2 содержит аминокислотную последовательность divmtqtplslsvtpgqpasisckssqslvhnngntylswylqkpgqspqlliykvsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyycgqgtqypftfgggtkveik (SEQ ID NO:85).

[0022] В некоторых вариантах осуществления, которые могут представлять собой объединение любых других вариантов осуществления, описываемых в данном документе, по меньшей мере один из L₁, L₂, L₃ или L₄ независимо имеет длину, составляющую 0 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления каждый из L₁, L₂, L₃ и L₄ независимо имеет длину, составляющую ноль аминокислот, или содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:55), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 56), S, RT, TKGPS (SEQ ID NO: 57), GQPKAAP (SEQ ID NO: 58) и GGSGSSGSGG (SEQ ID NO: 59). В некоторых вариантах осуществления каждый из L₁, L₂, L₃ и L₄ независимо содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:55), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:56), S, RT, TKGPS (SEQ ID NO:57), GQPKAAP (SEQ ID NO: 58) и GGSGSSGSGG (SEQ ID NO:59). В некоторых вариантах осуществления L₁ содержит последовательность GQPKAAP (SEQ ID NO: 58), L₂ содержит последовательность TKGPS (SEQ ID NO: 57), L₃ содержит последовательность S, и L₄ содержит последовательность RT.

[0023] В некоторых вариантах осуществления, которые могут представлять собой объединение любых других вариантов осуществления, описываемых в данном документе, домены шарнир-C_H2-C_H3 второй и третьей полипептидных цепей представляют собой домены шарнир_IgG4-C_H2-C_H3 человека, и при этом каждый из доменов шарнир-C_H2-C_H3 содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 234 и 235 IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой F234A и L235A. В некоторых вариантах осуществления домены шарнир-C_H2-C_H3 второй и третьей полипептидных цепей представляют собой домены шарнир_IgG4-C_H2-C_H3 человека, и при этом каждый из доменов шарнир-C_H2-C_H3 содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 233-236 IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой E233P, F234V, L235A, и делецию в положении 236 В некоторых вариантах осуществления домены шарнир-C_H2-C_H3 второй и третьей полипептидных цепей представляют собой домены шарнир_IgG4-C_H2-C_H3 человека, и при этом каждый из доменов шарнир-C_H2-C_H3 содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 228 и 409 IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой S228P и R409K. В некоторых вариантах осуществления домены шарнир-C_H2-C_H3 второй и третьей полипептидных цепей представляют собой домены шарнир_IgG1-C_H2-C_H3 человека, и при этом каждый из доменов шарнир-C_H2-C_H3 содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 234, 235 и 329 IgG1 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой L234A, L235A и P329A. В некоторых вариантах осуществления домены шарнир-C_H2-C_H3 второй и третьей полипептидных цепей представляют собой домены шарнир_IgG1-C_H2-C_H3 человека, и при этом каждый из доменов шарнир-C_H2-C_H3 содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 298, 299 и 300 IgG1 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой S298N, T299A и Y300S. В некоторых вариантах осуществления домен шарнир-C_H2-C_H3 второй полипептидной цепи содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 349, 366, 368 и 407 IgG1 или IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой Y349C, T366S, L368A и Y407V; и где домен шарнир-C_H2-C_H3 третьей полипептидной цепи содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 354 и 366 IgG1 или IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой S354C и T366W. В некоторых вариантах осуществления домен шарнир-C_H2-C_H3 второй полипептидной цепи содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 354 и 366 IgG1 или IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой S354C и T366W; и где домен шарнир-C_H2-C_H3 третьей полипептидной цепи содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 349, 366, 368 и 407 IgG1 или IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой Y349C, T366S, L368A и Y407V.

[0024] В определенных вариантах осуществления первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:61, вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:60, третья полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:62, и четвертая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:63. В определенных вариантах осуществления первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:61, вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:64, третья полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:65, и четвертая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:63. В определенных вариантах осуществления первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:61, вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:66, третья полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:67, и четвертая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:63. В определенных вариантах осуществления первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:61, вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:60, третья полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:68, и четвертая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:69. В определенных вариантах осуществления первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:61, вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:64, третья полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:70, и четвертая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:69. В определенных вариантах осуществления первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:61, вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:66, третья полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:71, и четвертая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:69.

[0025] В некоторых вариантах осуществления, которые могут представлять собой объединение любых других вариантов осуществления, описываемых в данном документе, вирус представляет собой вирус иммунодефицита человека (HIV), вирус гриппа, цитомегаловирус (CMV), вирус гепатита В (HBV), папилломавирус человека (HPV), вирус Эпштейна-Барр (EBV), спумавирус человека (HFV), вирус простого герпеса 1 (HSV-1) или вирус простого герпеса 2 (HSV-2).

[0026] Следует понимать, что один, несколько или все признаки различных вариантов осуществления, описанных в данном документе, можно комбинировать с получением других вариантов осуществления настоящего изобретения. Эти и другие аспекты настоящего изобретения будут очевидны специалисту в данной области техники. Эти и другие варианты осуществления настоящего изобретения дополнительно описаны с помощью нижеследующего подробного описания.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0027] На ФИГ. 1 изображено схематическое представление триспецифического связывающего белка, содержащего четыре полипептидные цепи, которые образуют три антигенсвязывающих участка, которые связывают три целевых белка: CD28, CD3 и CD38. Первая пара полипептидов обладает двойными вариабельными доменами, имеющими кроссоверную ориентацию (VH1-VH2 и VL2-VL1), с образованием двух антигенсвязывающих участков, которые распознают CD3 и CD28, а вторая пара полипептидов обладает одним вариабельным доменом (VH3 и VL3), образующим один антигенсвязывающий участок, который распознает CD38. В триспецифическом связывающем белке, показанном на ФИГ. 1, используется константный участок IgG4 с мутацией по типу "выступы-во-впадины", где выступ находится на второй паре полипептидов с одним вариабельным доменом.

[0028] На ФИГ. 2 показаны обобщенные данные аффинности связывания указанных триспецифических связывающих белков с их родственными антигенами (CD3, CD28 и CD38 человека), что измерено с помощью SPR.

[0029] На ФИГ. 3 обобщены данные аффинности связывания указанных триспецифических связывающих белков, связывающих CD38x-CD28x-CD3, в отношении CD38 человека, что измерено с помощью SPR или проточной цитометрии (FACS).

[0030] На ФИГ. 4A-4D показана характеристика размножения подгруппы Т-клеток in vitro в ответ на триспецифические антитела CD38VH1/CD3midxCD28sup. Оценку размножения подгруппы Т-клеток осуществляли путем покрытия лунок при помощи 350 нг/лунка триспецифического Ab к CD38 в отсутствие экзогенных цитокинов. Популяции Т-клеток измеряли в указанные моменты времени. Триспецифическое Ab, имеющее три мутантных антигенсвязывающих домена использовали в качестве отрицательного контроля. Проточную цитометрию использовали для определения центральных (T_cm) и эффекторных (T_em) CD4 Т-клеток памяти (ФИГ. 4A), T-хелперных клеток (Th1, Th17, Th2) (ФИГ. 4B), центральных (T_cm) и эффекторных (T_em) CD8 Т-клеток памяти (ФИГ. 4C) и специфических в отношении цитомегаловируса (CMV) pp65 CD8 клеток (ФИГ. 4D), как это описано в примере 3. Анализ специфических в отношении CMV pp65 эффекторных клеток проводили путем окрашивания пентамером мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) от доноров HLA-A2 CMV+, обработанных триспецифическим в отношении CD38 или трижды отрицательным контролем.

[0031] На ФИГ. 5A-5B показана характеристика размножения подгруппы Т-клеток in vitro в PBMC, собранных от инфицированного CMV донора B, в ответ на триспецифическое антитело CD38_VH1/CD28sup x CD3mid. Популяции Т-клеток измеряли в указанные моменты времени. Трижды мутантное триспецифическое антитело использовали в качестве отрицательного контроля. Проточную цитометрию использовали для количественного определения специфических в отношении CMV CD8+ Т-клеток памяти (ФИГ. 5A), а также специфических в отношении CMV центральных Т-клеток памяти (T_cm) и эффекторных (T_em) CD8+ Т-клеток памяти (ФИГ. 5B). Триспецифическое антитело CD38_VH1/CD28sup x CD3mid активировало Т-клетки и обеспечивало пролиферацию специфических в отношении CMV CD8+ Т-клеток памяти.

[0032] На ФИГ. 6A-6B показана характеристика размножения подгруппы Т-клеток in vitro в PBMC, собранных от инфицированного CMV донора С, в ответ на триспецифическое антитело CD38_VH1/CD28sup x CD3mid. Популяции Т-клеток измеряли в указанные моменты времени. Трижды мутантное триспецифическое антитело использовали в качестве отрицательного контроля. Проточную цитометрию использовали для количественного определения специфических в отношении CMV CD8+ Т-клеток памяти (ФИГ. 6A), а также специфических в отношении CMV центральных Т-клеток памяти (T_cm) и эффекторных (T_em) CD8+ Т-клеток памяти (ФИГ. 6B). Триспецифическое антитело CD38_VH1/CD28sup x CD3mid активировало Т-клетки и обеспечивало пролиферацию специфических в отношении CMV CD8+ Т-клеток памяти.

[0033] На ФИГ. 7A-7B показана характеристика размножения подгруппы Т-клеток in vitro в PBMC, собранных от инфицированного вирусом Эпштейна-Барр (EBV) донора A, в ответ на триспецифическое антитело CD38_VH1/CD28sup x CD3mid. Популяции Т-клеток измеряли в указанные моменты времени. Трижды мутантное триспецифическое антитело использовали в качестве отрицательного контроля. Проточную цитометрию использовали для количественного определения специфических в отношении EBV CD8+ Т-клеток памяти (ФИГ. 7A), а также специфических в отношении EBV центральных Т-клеток памяти (T_cm) и эффекторных (T_em) CD8+ Т-клеток памяти (ФИГ. 7B). Триспецифическое антитело CD38_VH1/CD28sup x CD3mid активировало Т-клетки и обеспечивало пролиферацию специфических в отношении EBV CD8+ Т-клеток памяти.

[0034] На ФИГ. 8A-8B показана характеристика размножения подгруппы Т-клеток in vitro в PBMC, собранных от инфицированного EBV донора B, в ответ на триспецифическое антитело CD38_VH1/CD28sup x CD3mid. Популяции Т-клеток измеряли в указанные моменты времени. Трижды мутантное триспецифическое антитело использовали в качестве отрицательного контроля. Проточную цитометрию использовали для количественного определения специфических в отношении EBV CD8+ Т-клеток памяти (ФИГ. 8A), а также специфических в отношении EBV центральных Т-клеток памяти (T_cm) и эффекторных (T_em) CD8+ Т-клеток памяти (ФИГ. 8B). Триспецифическое антитело CD38_VH1/CD28sup x CD3mid активировало Т-клетки и обеспечивало пролиферацию специфических в отношении EBV CD8+ Т-клеток памяти.

[0035] На ФИГ. 9 показаны профили проточной цитометрии PBMC от указанных положительных в отношении вируса иммунодефицита человека (HIV) доноров (нижние панели и верхняя правая панель), анализируемых на предмет специфических в отношении HIV Gag CD8+ Т-клеток (A*02:01 - SLYNTVATL (HIV-1 gag p17 76-84) пентамер, конъюгированный с PE, ProImmune) на исходном уровне (день 0; до инкубации с триспецифическими антителами). PBMC от HIV-отрицательного донора использовали в качестве отрицательного контроля (верхняя левая панель). Представлены и показаны в рамках проценты популяции специфических в отношении Gag CD8+ Т-клеток. На исходном уровне PBMC от HIV-положительных доноров содержат специфические в отношении HIV Gag CD8+ Т-клетки. Доноры A-C на ФИГ. 9 такие же, как доноры D-F, показанные на ФИГ. 10A-12B.

[0036] На ФИГ. 10A-10B показана характеристика размножения подгруппы Т-клеток in vitro в PBMC, собранных от HIV-положительного донора D в ответ на триспецифическое антитело CD38_VH1/CD28sup x CD3mid. Популяции Т-клеток измеряли в указанные моменты времени. Трижды мутантное триспецифическое антитело использовали в качестве отрицательного контроля. Проточную цитометрию использовали для количественного определения специфических в отношении HIV CD8+ Т-клеток памяти (ФИГ. 10A), а также специфических в отношении HIV центральных Т-клеток памяти (T_cm) и эффекторных (T_em) CD8+ Т-клеток памяти (ФИГ. 10B). Триспецифическое антитело CD38_VH1/CD28sup x CD3mid активировало Т-клетки и обеспечивало пролиферацию эффекторных (T_em) CD8+ Т-клеток памяти.

[0037] На ФИГ. 11A-11B показана характеристика размножения подгруппы Т-клеток in vitro в PBMC, собранных от HIV-положительного донора Е в ответ на триспецифическое антитело CD38_VH1/CD28sup x CD3mid. Популяции Т-клеток измеряли в указанные моменты времени. Трижды мутантное триспецифическое антитело использовали в качестве отрицательного контроля. Проточную цитометрию использовали для количественного определения специфических в отношении HIV CD8+ Т-клеток памяти (ФИГ. 11A), а также специфических в отношении HIV центральных Т-клеток памяти (T_cm) и эффекторных (T_em) CD8+ Т-клеток памяти (ФИГ. 11B). Триспецифическое антитело CD38_VH1/CD28sup x CD3mid активировало Т-клетки и обеспечивало пролиферацию эффекторных (T_em) CD8+ Т-клеток памяти.

[0038] На ФИГ. 12A-12B показана характеристика размножения подгруппы Т-клеток in vitro в PBMC, собранных от HIV-положительного донора F в ответ на триспецифическое антитело CD38_VH1/CD28sup x CD3mid. Популяции Т-клеток измеряли в указанные моменты времени. Трижды мутантное триспецифическое антитело использовали в качестве отрицательного контроля. Проточную цитометрию использовали для количественного определения специфических в отношении HIV CD8+ Т-клеток памяти (ФИГ. 12A), а также специфических в отношении HIV центральных Т-клеток памяти (T_cm) и эффекторных (T_em) CD8+ Т-клеток памяти (ФИГ. 12B). Триспецифическое антитело CD38_VH1/CD28sup x CD3mid активировало Т-клетки и обеспечивало пролиферацию эффекторных (T_em) CD8+ Т-клеток памяти.

[0039] На ФИГ. 13A-13B показана характеристика размножения подгруппы Т-клеток in vitro в PBMC, собранных от инфицированного вирусом гриппа донора A в ответ на триспецифическое антитело CD38_VH1/CD28sup x CD3mid. Популяции Т-клеток измеряли в указанные моменты времени. Трижды мутантное триспецифическое антитело использовали в качестве отрицательного контроля. Проточную цитометрию использовали для количественного определения специфических в отношении вируса гриппа (Flu) CD8+ Т-клеток памяти (ФИГ. 13A), а также специфические в отношении Flu центральных Т-клеток памяти (T_cm) и эффекторных (T_em) CD8+ Т-клеток памяти (ФИГ. 13B). Триспецифическое антитело CD38_VH1/CD28sup x CD3mid активировало Т-клетки и обеспечивало пролиферацию T_em CD8+ Т-клеток (например, см. дни 7, 11) и T_cm CD8+ Т-клеток (например, см. день 7).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

[0040] Настоящее изобретение относится к триспецифическим связывающим белкам, содержащим четыре полипептидных цепи, которые образуют три антигенсвязывающих участка, которые специфически связывают полипептид CD38 (например, полипептиды CD38 человека и макака-крабоеда), полипептид CD28 и полипептид CD3, которые могут найти применение, например, в размножении Т-клеток памяти (например, специфических в отношении вируса Т-клеток памяти) и/или в лечении хронической вирусной инфекции.

I. Общие определения

[0041] Используемые в соответствии с настоящим изобретением следующие термины, если не указано иное, следует понимать как имеющие следующие значения. Если контекстом не требуется иное, термины в единственном числе будут включать формы множественного числа, и термины во множественном числе будут включать форму единственного числа. Используемая в данном подробном описании и прилагаемой формуле изобретения форма единственного числа включают ссылку на форму множественного числа, если в содержании прямо не указано иное. Таким образом, например, ссылка на "молекулу" необязательно включает комбинацию двух или более таких молекул и им подобное.

[0042] Понятно, что аспекты и варианты осуществления настоящего изобретения, описанные в данном документе, включают аспекты и варианты осуществления "содержащие", "состоящие из" и/или "по сути состоящие из".

[0043] Используемый в данном документе термин "полинуклеотид" относится к полимерам в виде однонитевой или двунитевой нуклеиновой кислоты, имеющих длину по меньшей мере 10 нуклеотидов. В определенных вариантах осуществления нуклеотиды, составляющие полинуклеотид, могут представлять собой рибонуклеотиды, или дезоксирибонуклеотиды, или модифицированную форму любого типа нуклеотида. Такие модификации включают модификации оснований, как, например, бромуридин, модификации рибозы, как, например, арабинозид и 2',3'-дидезоксирибоза, и модификации межнуклеотидных связей, как, например, фосфотиоат, фосфодитиоат, фосфоселеноат, фосфодиселеноат, фосфоанилотиоат, фосфоаниладат и фосфоамидат. Термин "полинуклеотид" конкретно подразумевает однонитевые и двунитевые формы ДНК.

[0044] "Выделенный полинуклеотид" представляет собой полинуклеотид, имеющий геномное, кДНК- или синтетическое происхождение или характеризующийся некоторой их комбинацией, который: (1) не ассоциирован со всем полинуклеотидом, в котором выделенный полинуклеотид встречается в природе, или его частью, (2) связан с полинуклеотидом, с которым он не связан в природе, или (3) не встречается в природе в виде части более крупной последовательности.

[0045] "Выделенный полипептид" представляет собой такой полипептид, который: (1) не содержит по меньшей мере некоторых других полипептидов, с которыми он обычно встречается, (2) фактически не содержит других полипептидов из одного и того же источника, например, из одного и того же вида, (3) экспрессируется клеткой из другого вида, (4) был отделен по меньшей мере от приблизительно 50 процентов полинуклеотидов, липидов, углеводов или других веществ, с которыми он связан в природе, (5) не связан (посредством ковалентного или нековалентного взаимодействия) с частями полипептида, с которыми "выделенный полипептид" связан в природе, (6) функционально связан (посредством ковалентного или нековалентного взаимодействия) с полипептидом, с которым он не связан в природе, или (7) не встречается в природе. Такой выделенный полипептид может кодироваться геномной ДНК, cDNA, mRNA или другой РНК синтетического происхождения или любой их комбинацией. Предпочтительно выделенный полипептид по сути не содержит полипептидов или других контаминантов, которые встречаются в его природном окружении, которые бы вызывали затруднения при его применении (терапевтическом, диагностическом, профилактическом, исследовательском или ином).

[0046] Встречающиеся в природе антитела обычно представляют собой тетрамер. Каждый такой тетрамер обычно состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, при этом каждая пара имеет одну полноразмерную "легкую" цепь (обычно имеющую молекулярную массу приблизительно 25 кДа) и одну полноразмерную "тяжелую" цепь (обычно имеющую молекулярную массу приблизительно 50-70 кДа). Используемые в данном документе термины "тяжелая цепь" и "легкая цепь" обозначают любой полипептид иммуноглобулина, содержащий последовательность вариабельного домена, достаточную для придания специфичности в отношении антигена-мишени. Аминоконцевая часть каждой легкой и тяжелой цепей обычно содержит вариабельный домен из приблизительно 100-110 аминокислот или больше, который обычно отвечает за распознавание антигена. Карбоксиконцевая часть каждой цепи обычно определяет константный домен, ответственный за эффекторную функцию. Таким образом, во встречающемся в природе антителе полноразмерный полипептид, представляющий собой тяжелую цепь иммуноглобулина, содержит вариабельный домен (V_H) и три константных домена (C_H1, C_H2 и C_H3), где домен V_H находится на аминоконце полипептида, а домен C_H3 находится на карбоксильном конце, и полноразмерный полипептид, представляющий собой легкую цепь иммуноглобулина, содержит вариабельный домен (V_L) и константный домен (C_L), где домен V_L находится на аминоконце полипептида, а домен C_L находится на карбоксильном конце.

[0047] Легкие цепи человека обычно классифицируют как легкие каппа- и лямбда-цепи, а тяжелые цепи человека обычно классифицируют как мю, дельта, гамма, альфа или эпсилон, и они определяют изотип антитела IgM, IgD, IgG, IgA и IgE соответственно. IgG имеет несколько подклассов, в том числе без ограничения IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. IgM имеет подклассы, в том числе без ограничения IgM1 и IgM2. IgA аналогичным образом подразделяют на подклассы, в том числе без ограничения IgA1 и IgA2. В полноразмерных легких и тяжелых цепях вариабельные и константные домены обычно соединены с помощью "J"-участка из приблизительно 12 или больше аминокислот, при этом тяжелая цепь также содержит "D"-участок из приблизительно 10 или больше аминокислот. См., например, Fundamental Immunology (Paul, W., ed., Raven Press, 2nd ed., 1989), которая включена посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей. Вариабельные области каждой пары легкая/тяжелая цепь обычно образуют антигенсвязывающий участок. Вариабельные домены встречающихся в природе антител обычно характеризуются одинаковой общей структурой относительно консервативных каркасных участков (FR), соединенных с помощью трех гипервариабельных участков, также называемых определяющими комплементарность участками или CDR. CDR из двух цепей каждой пары обычно выровнены с помощью каркасных участков, что может обеспечивать возможность связывания со специфическим эпитопом. От аминоконца к карбоксильному концу вариабельные домены как легкой, так и тяжелой цепей обычно содержат домены FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4.

[0048] Термин "совокупность CDR" обозначает группу из трех CDR, которые содержатся в одном вариабельном участке, способном связывать антиген. Точные границы этих CDR определяли по-разному в соответствии с различными системами. Система, описанная Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (Национальные институты здравоохранения, Бетесда, Мэриленд. (1987) и (1991)), не только предусматривает однозначную систему нумерации остатков, применимую к любому вариабельному участку антитела, но также предусматривает точные границы остатков, определяющие три CDR. Эти CDR могут называться CDR в соответствии с Kabat. Chothia и коллеги (Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-17; Chothia et al., 1989, Nature 342: 877-83) обнаружили, что определенные субфрагменты в пределах CDR в соответствии с Kabat принимают почти идентичные конформации пептидного каркаса, несмотря на наличие большого различия на уровне аминокислотной последовательности. Эти субфрагменты были обозначены как L1, L2 и L3 или H1, H2 и H3, где "L" и "H" обозначают участки легкой цепи и тяжелой цепи соответственно. Эти участки могут называться CDR в соответствии с Chothia, границы которых совпадают с CDR в соответствии с Kabat. Другие границы, определяющие CDR, которые совпадают с CDR в соответствии с Kabat, были описаны Padlan, 1995, FASEB J. 9: 133-39; MacCallum, 1996, J. Mol. Biol. 262(5): 732-45; и Lefranc, 2003, Dev. Comp. Immunol. 27: 55-77. Еще одни определения границ CDR могут не строго соответствовать одной из систем, приведенных в данном документе, но тем не менее будут совпадать с CDR в соответствии с Kabat, несмотря на то, что они могут быть укорочены или удлинены с учетом прогностических или экспериментальных выводов о том, что конкретные остатки или группы остатков или даже все CDR не влияют в значительной степени на связывание антигена. В способах, используемых в данном документе, можно использовать CDR, определенные в соответствии с любой из этих систем, несмотря на то, что в определенных вариантах осуществления применяют CDR, определенные в соответствии с Kabat или Chothia. Идентификация прогнозируемых CDR с помощью аминокислотной последовательности хорошо известна в данной области техники, например, в Martin, A.C. "Protein sequence and structure analysis of antibody variable domains" в Antibody Engineering, Vol. 2. Kontermann R., Dübel S., eds. Springer-Verlag, Berlin, p. 33-51 (2010). Аминокислотную последовательность вариабельного домена тяжелой и/или легкой цепи можно также исследовать с целью идентификации последовательностей CDR с помощью других традиционных способов, например, путем сравнения с известными аминокислотными последовательностями других вариабельных участков тяжелой и легкой цепей с определением участков гипервариабельности в последовательности. Пронумерованные последовательности можно выравнивать вручную или путем использования программы выравнивания, такой как одна из пакета программ CLUSTAL, как описано в Thompson, 1994, Nucleic Acids Res. 22: 4673-80. Молекулярные модели традиционно используют для того, чтобы правильно определить каркасные и CDR-участки и таким образом скорректировать основанные на последовательности выравнивания.

[0049] В некоторых вариантах осуществления определение CDR/FR в легкой или тяжелой цепи иммуноглобулина следует давать на основании определения по IMGT (Lefranc et al. Dev. Comp. Immunol., 2003, 27(1):55-77; www.imgt.org).

[0050] Используемый в данном документе термин "Fc" обозначает молекулу, будь то в мономерной или мультимерной форме, содержащую последовательность, не являющуюся частью антигенсвязывающего фрагмента, которая получена в результате расщепления антитела или получена другими способами, и при этом она может содержать шарнирный участок. Исходный иммуноглобулиновый источник нативного Fc предпочтительно происходит от человека и может представлять собой любой из иммуноглобулинов. Молекулы Fc составлены из мономерных полипептидов, которые могут быть связаны в димерные или мультимерные формы посредством ковалентной (т. е. дисульфидных связей) и нековалентной связи. Число межмолекулярных дисульфидных связей между мономерными субъединицами нативных молекул Fc варьирует от 1 до 4 в зависимости от класса (например, IgG, IgA и IgE) или подкласса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgA1, IgGA2 и IgG4). Одним примером Fc является димер с дисульфидной связью, полученный в результате расщепления IgG папаином. Термин "нативный Fc", используемый в данном документе, является общим для мономерных, димерных и мультимерных форм.

[0051] F(ab)-фрагмент обычно содержит одну легкую цепь и домены V_H и C_H1 одной тяжелой цепи, где часть V_H-C_H1 тяжелой цепи F(ab)-фрагмента не может образовывать дисульфидную связь с другим полипептидом тяжелой цепи. Как используется в данном документе, F(ab)-фрагмент также может содержать одну легкую цепь, содержащую два вариабельных домена, разделенных аминокислотным линкером, и одну тяжелую цепь, содержащую два вариабельных домена, разделенных аминокислотным линкером, и домен C_H1.

[0052] F(ab')-фрагмент обычно содержит одну легкую цепь и часть одной тяжелой цепи, которая содержит большую часть константного участка (между доменами C_H1 и C_H2), вследствие чего межцепочечная дисульфидная связь может быть образована между двумя тяжелыми цепями с образованием молекулы F(ab')₂.

[0053] Используемый в данном документе термин "связывающий белок" относится к не встречающейся в природе (или рекомбинантной, или сконструированной) молекуле, которая специфически связывается с по меньшей мере одним целевым антигеном, например, полипептидом CD38 по настоящему изобретению.

[0054] "Рекомбинантная" молекула представляет собой молекулу, которая была получена, экспрессирована, создана или выделена рекомбинантными способами.

[0055] В одном варианте осуществления настоящего изобретения представлены связывающие белки, характеризующиеся биологической и иммунологической специфичностью в отношении одного-трех антигенов-мишеней. В другом варианте осуществления настоящего изобретения представлены молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептидные цепи, которые образуют такие связывающие белки. В другом варианте осуществления настоящего изобретения представлены векторы экспрессии, содержащие молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептидные цепи, которые образуют такие связывающие белки. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения представлены клетки-хозяева, которые экспрессируют такие связывающие белки (т. е. содержащие молекулы нуклеиновой кислоты или векторы, кодирующие полипептидные цепи, которые образуют такие связывающие белки).

[0056] Используемый в данном документе термин "способность к обмену" обозначает способность к взаимозамене вариабельных доменов в формате связывающего белка, при этом с сохранением укладки и наивысшей аффинности связывания. "Способность к полному обмену" относится к способности менять порядок доменов как V_H1, так и V_H2 и, следовательно, порядок доменов V_L1 и V_L2 в полипептидной цепи формулы I или полипептидной цепи формулы II (т. е. обращать порядок), при этом поддерживая полную функциональность связывающего белка, о чем свидетельствует сохранение аффинности связывания. Кроме того, следует отметить, что обозначения V_H и V_L относятся лишь к положению домена в конкретной белковой цепи в конечном формате. Например, V_H1 и V_H2 могут быть получены из доменов V_L1 и V_L2 исходных антител и введены в положения, соответствующие V_H1 и V_H2 связывающего белка. Аналогично V_L1 и V_L2 могут быть получены из доменов V_H1 и V_H2 исходных антител и помещены в положения, соответствующие V_H1 и V_H2 связывающего белка. Таким образом, обозначения V_H и V_L относятся к существующему в данный момент положению, а не к первоначальному положению в исходном антителе. Следовательно, домены V_H и V_L являются "способными к обмену".

[0057] Используемый в данном документе термин "антиген", или "антиген-мишень", или "целевой антиген" обозначает молекулу или часть молекулы, которая может связываться связывающим белком и дополнительно может использоваться у животного для получения антител, способных связываться с эпитопом этого антигена. Антиген-мишень может иметь один или несколько эпитопов. С учетом того, что каждый антиген-мишень распознается связывающим белком, связывающий белок способен конкурировать с интактным антителом, которое распознает антиген-мишень.

[0058] "CD38" означает полипептид 38 кластера дифференцировки и представляет собой гликопротеин, обнаруживаемый на поверхности многих иммунных клеток. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению связывает внеклеточный домен одного или нескольких полипептидов CD38. Иллюстративные последовательности внеклеточного домена полипептида CD38 включают без ограничения внеклеточный домен CD38 человека (например, представленный под SEQ ID NO:1) и внеклеточный домен CD38 макака-крабоеда (например, представленный под SEQ ID NO:30).

[0059] Термин "рекрутер T-клеток" обозначает связывающие белки, направленные на иммунную систему хозяина, более конкретно на цитотоксическую активность T-клеток, а также направленные на опухолевый белок-мишень.

[0060] Термин "моноспецифический связывающий белок" обозначает связывающий белок, который специфически связывается с одним антигеном-мишенью.

[0061] Термин "моновалентный связывающий белок" обозначает связывающий белок, который имеет один антигенсвязывающий участок.

[0062] Термин "биспецифический связывающий белок" обозначает связывающий белок, который специфически связывается с двумя различными антигенами-мишенями. В некоторых вариантах осуществления биспецифический связывающий белок связывается с двумя разными антигенами. В некоторых вариантах осуществления биспецифический связывающий белок связывается с двумя разными эпитопами на одном и том же антигене.

[0063] Термин "бивалентный связывающий белок" обозначает связывающий белок, который имеет два связывающих участка.

[0064] Термин "триспецифический связывающий белок" обозначает связывающий белок, который специфически связывается с тремя различными антигенами-мишенями. В некоторых вариантах осуществления триспецифический связывающий белок связывается с тремя разными антигенами. В некоторых вариантах осуществления триспецифический связывающий белок связывается с одним, двумя или тремя разными эпитопами на одном и том же антигене.

[0065] Термин "тривалентный связывающий белок" обозначает связывающий белок, который имеет три связывающих участка. В конкретных вариантах осуществления тривалентный связывающий белок может связываться с одним антигеном-мишенью. В других вариантах осуществления тривалентный связывающий белок может связываться с двумя антигенами-мишенями. В других вариантах осуществления тривалентный связывающий белок может связываться с тремя антигенами-мишенями.

[0066] "Выделенный" связывающий белок представляет собой связывающий белок, который был идентифицирован и отделен и/или извлечен из компонента своего природного окружения. Компоненты-контаминанты из его природного окружения представляют собой вещества, которые бы вызывали затруднения при диагностических или терапевтических применениях связывающего белка, и могут включать ферменты, гормоны и другие растворенные вещества белковой или небелковой природы. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок будет очищенным: (1) до более чем 95% по весу антитела, как определяется способом Лоури, и наиболее предпочтительно до более чем 99% по весу, (2) до степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности с применением секвенатора с вращающимся стаканом, или (3) до гомогенности с помощью SDS-PAGE в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях с применением кумасси голубого или предпочтительно серебряного красителя. Выделенные связывающие белки включают связывающий белок in situ в рекомбинантных клетках, поскольку по меньшей мере один компонент природного окружения связывающего белка не будет присутствовать.

[0067] Используемые в данном документе термины "в значительной степени чистый" или "в значительной степени очищенный" обозначают соединение или структуру, которая является преобладающей присутствующей структурой (т. е. в расчете на моль она более многочисленна, чем любая другая отдельная структура в композиции). В некоторых вариантах осуществления в значительной степени очищенная фракция представляет собой композицию, где структура составляет по меньшей мере приблизительно 50% (в расчете на моль) от всех присутствующих макромолекулярных структур. В других вариантах осуществления в значительной степени чистая композиция будет содержать более чем приблизительно 80%, 85%, 90%, 95% или 99% от всех макромолекулярных структур, присутствующих в композиции. В еще одних вариантах осуществления структура является очищенной до необходимой гомогенности (загрязняющие структуры не могут быть выявлены в композиции с помощью традиционных способов выявления), где композиция состоит фактически из одной макромолекулярной структуры.

[0068] Термин "эпитоп" подразумевает любую детерминанту, предпочтительно полипептидную детерминанту, способную специфически связываться с иммуноглобулином или T-клеточным рецептором. В определенных вариантах осуществления эпитопные детерминанты включают химически активные поверхностные группы молекул, такие как аминокислоты, боковые цепи сахаров, фосфорильные группы или сульфонильные группы, и в определенных вариантах осуществления могут иметь специфические характеристики трехмерной структуры и/или специфические характеристики заряда. Эпитоп представляет собой участок антигена, которая связывается антителом или связывающим белком. В определенных вариантах осуществления считается, что связывающий белок специфически связывает антиген, если он предпочтительно распознает свой антиген-мишень в сложной смеси белков и/или макромолекул. В некоторых вариантах осуществления считается, что связывающий белок специфически связывает антиген, если равновесная константа диссоциации составляет ≤ 10^-8 M, более предпочтительно если равновесная константа диссоциации составляет ≤ 10^-9 M и наиболее предпочтительно если константа диссоциации составляет ≤ 10^-10 M.

[0069] Константу диссоциации (K_D) связывающего белка можно определить, например, с помощью поверхностного плазмонного резонанса. В целом в анализе поверхностного плазмонного резонанса измеряют связывающие взаимодействия между лигандом (антигеном-мишенью на биосенсорной матрице) и аналитом (связывающим белком в растворе) в реальном времени с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR) с применением системы BIAcore (Pharmacia Biosensor; Пискатауэй, Нью-Джерси). Анализ поверхностного плазмонного резонанса можно также выполнять посредством иммобилизации аналита (связывающего белка на биосенсорной матрице) и представления лиганда (антигена-мишени). Используемый в данном документе термин "K_D" обозначает константу диссоциации взаимодействия между конкретным связывающим белком и антигеном-мишенью.

[0070] Используемый в данном документе термин "связывается с" в ссылке на связывающий белок обозначает способность связывающего белка или его антигенсвязывающего фрагмента связываться с антигеном, содержащим эпитоп, с Kd, составляющей по меньшей мере приблизительно 1×10^-6 M, 1×10^-7 M, 1×10^-8 M, 1×10^-9 M, 1×10^-10 M, 1×10^-11 M, 1×10^-12 M или больше, и/или связываться с эпитопом с аффинностью, которая по меньшей мере в два раза превышает его аффинность к неспецифическому антигену. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению связывается с двумя или более антигенами, например, полипептидом CD38 человека и макака-крабоеда.

[0071] В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен и/или связывающий белок по настоящему изобретению "перекрестно реагирует" с полипептидами CD38 человека и макака-крабоеда, например, внеклеточными доменами CD38, такими как SEQ ID NO:1 (изоформа A CD38 человека), SEQ ID NO:105 (изоформа E CD38 человека) и SEQ ID NO:30 (CD38 макака-крабоеда). Связывание связывающего белка с антигеном 1(Ag1) является "перекрестно реактивным" в отношении антигена 2 (Ag2), если значения EC50 находятся в аналогичном диапазоне для обоих антигенов. В настоящей заявке связывание связывающего белка с Ag1 является перекрестно-реактивным в отношении Ag2, если соотношение аффинности к Ag2 и аффинности к Ag1 равно 10 или меньше (например, 5, 2, 1 или 0,5), при этом аффинности измеряют с помощью одного и того же метода в случае обоих антигенов.

[0072] Связывание связывающего белка с Ag1 не является "в значительной степени перекрестно-реактивным" в отношении Ag2, если показатели аффинности к этим двум антигенам очень отличаются. Аффинность к Ag2 может не поддаваться измерению, если реакция связывания является слишком слабой. В настоящей заявке связывание связывающего белка с Ag1 не является в значительной степени перекрестно-реактивным в отношении Ag2, если реакция связывания связывающего белка с Ag2 составляет менее 5% от реакции связывания того же самого связывающего белка с Ag1 при тех же экспериментальных условиях и при той же концентрации антитела. На практике используемая концентрация связывающего белка может составлять EC50 или концентрацию, требуемую для достижения плато насыщения, наблюдаемого в случае Ag1.

[0073] Используемый в данном документе термин "линкер" обозначает один или несколько аминокислотных остатков, вставленных между доменами иммуноглобулина для обеспечения подвижности, достаточной для того, чтобы домены легкой и тяжелой цепей сворачивались в иммуноглобулины с кроссоверными двумя вариабельными участками. Линкер вставляют в переходный участок между вариабельными доменами или между вариабельным и константным доменами, соответственно, на уровне последовательности. Переходный участок между доменами можно идентифицировать, поскольку приблизительный размер доменов иммуноглобулина хорошо известен. Точное местоположение переходного участка между доменами можно определить путем определения положения пептидных отрезков, которые не образуют элементов со вторичной структурой, такой как бета-слои или альфа-спирали, что показано с помощью экспериментальных данных или что можно прогнозировать с помощью методик моделирования или прогнозирования вторичной структуры. Линкеры, описанные в данном документе, обозначены как L₁, который расположен на легкой цепи между C-концом домена V_L2 и N-концом домена V_L1; и L₂, который расположен на легкой цепи между C-концом домена V_L1 и N-концом домена C_L. Линкеры тяжелой цепи называют как L₃, который расположен между C-концом домена V_H1 и N-концом домена V_H2; и L₄, который расположен между C-концом домена V_H2 и N-концом домена C_H1.

[0074] Используемый в данном документе термин "вектор" относится к любой молекуле (например, нуклеиновой кислоте, плазмиде или вирусу), используемой для переноса закодированной информации в клетку-хозяина. Термин "вектор" подразумевает молекулу нуклеиновой кислоты, которая способна транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой ее связали. Одним типом вектора является "плазмида", которая обозначает кольцевую двунитевую молекулу ДНК, в которую могут быть вставлены дополнительные сегменты ДНК. Другим типом вектора является вирусный вектор, при этом в геном вируса могут быть вставлены дополнительные сегменты ДНК. Определенные векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую их вводят (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальную точку начала репликации, и эписомные векторы для млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомные векторы для млекопитающих) могут быть интегрированы в геном клетки-хозяина после введения в клетку-хозяина, и за счет этого они реплицируются вместе с геномом хозяина. Кроме того, определенные векторы способны управлять экспрессией генов, с которыми они функционально связаны. Такие векторы называются в данном документе "рекомбинантными векторами экспрессии" (или просто "векторами экспрессии"). Как правило, векторы экспрессии, полезные в технологиях рекомбинантных ДНК, часто находятся в форме плазмид. Термины "плазмида" и "вектор" могут использоваться взаимозаменяемо в данном документе, поскольку плазмида является наиболее широко используемой формой вектора. Однако подразумевается, что в настоящее изобретение включены и другие формы векторов экспрессии, такие как вирусные векторы (например, ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы с дефектной репликацией), которые выполняют эквивалентные функции.

[0075] Используемая в данном документе фраза "рекомбинантная клетка-хозяин" (или "клетка-хозяин") обозначает клетку, в которую был введен рекомбинантный вектор экспрессии. Подразумевается, что рекомбинантная клетка-хозяин или клетка-хозяин обозначают не только конкретную рассматриваемую клетку, но также и потомство такой клетки. Поскольку в последующих поколениях могут возникать определенные модификации вследствие мутации либо влияний окружающей среды, такое потомство в действительности может не быть идентичным родительской клетке, однако такие клетки по-прежнему включены в объем используемого в данном документе термина "клетка-хозяин". Широкое разнообразие систем экспрессии в клетке-хозяине можно применять для экспрессии связывающих белков, в том числе системы экспрессии на основе бактерий, дрожжей, бакуловирусов и клеток млекопитающих (а также системы экспрессии на основе фагового дисплея). Примером подходящего бактериального вектора экспрессии является pUC19. Для рекомбинантной экспрессии связывающего белка клетку-хозяина трансформируют или трансфицируют одним или несколькими рекомбинантными векторами экспрессии, несущими фрагменты ДНК, кодирующие полипептидные цепи связывающего белка, вследствие чего полипептидные цепи экспрессируются в клетке-хозяине и предпочтительно секретируются в среду, в которой клетки-хозяева культивируются, при этом из данной среды можно извлечь связывающий белок.

[0076] Используемый в данном документе термин "трансформация" обозначает изменение генетических характеристик клетки, и при этом клетка была трансформирована, если ее модифицировали с тем, чтобы она содержала новую ДНК. Например, клетка является трансформированной, если она генетически модифицирована по сравнению с ее нативным состоянием. После трансформации трансформирующая ДНК может подвергаться рекомбинации с ДНК клетки путем физической интеграции в хромосому клетки, или может временно сохраняться в виде эписомального элемента без репликации, или может реплицироваться независимо как плазмида. Считается, что клетка является стабильно трансформированной, если ДНК реплицируется при делении клетки. Используемый в данном документе термин "трансфекция" обозначает захват чужеродной или экзогенной ДНК клеткой, и при этом клетка была "трансфицирована", если экзогенную ДНК ввели внутрь от клеточной мембраны. Ряд методик трансфекции хорошо известен из уровня техники. Такие методики можно применять для введения одной или нескольких экзогенных молекул ДНК в подходящие клетки-хозяева.

[0077] Используемый в данном документе термин "встречающийся в природе" и применяемый в отношении объекта обозначает тот факт, что объект может обнаруживаться в природе и не был подвергнут манипуляциям со стороны человека. Например, полинуклеотид или полипептид, присутствующий в организме (включая вирусы), который может быть выделен из природного источника и который не был преднамеренно модифицирован человеком, является встречающимся в природе. Аналогично используемый в данном документе термин "не встречающийся в природе" обозначает объект, который не обнаруживается в природе или который был структурно модифицирован или синтезирован человеком.

[0078] Как используется в данном документе, двадцать стандартных аминокислот и их аббревиатуры соответствуют общепринятой практике. Стереоизомеры (например, d-аминокислоты) двадцати стандартных аминокислот; не встречающиеся в природе аминокислоты и аналоги, такие как α-,α-двузамещенные аминокислоты, N-алкиламинокислоты, молочная кислота и другие нестандартные аминокислоты также могут быть подходящими компонентами полипептидных цепей связывающих белков. Примеры нестандартных аминокислот включают 4-гидроксипролин, γ-карбоксиглутамат, ε-N, N,N-триметиллизин, ε-N-ацетиллизин, O-фосфосерин, N-ацетилсерин, N-формилметионин, 3-метилгистидин, 5-гидроксилизин, σ-N-метиларгинин и другие подобные аминокислоты и иминокислоты (например, 4-гидроксипролин). В системе обозначений полипептидов, используемой в данном документе, левое направление представляет собой направление в сторону аминоконца, а правое направление представляет собой направление в сторону карбоксильного конца в соответствии со стандартной практикой и правилами.

[0079] Встречающиеся в природе остатки можно разделить на классы на основании общих свойств боковой цепи:

(1) гидрофобные: Met, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Trp, Tyr, Pro;

(2) полярные гидрофильные: Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, His, Lys, Ser, Thr;

(3) алифатические: Ala, Gly, Ile, Leu, Val, Pro;

(4) алифатические гидрофобные: Ala, Ile, Leu, Val, Pro;

(5) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(6) кислые: Asp, Glu;

(7) основные: His, Lys, Arg;

(8) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: Gly, Pro;

(9) ароматические: His, Trp, Tyr, Phe; и

(10) ароматические гидрофобные: Phe, Trp, Tyr.

[0080] Консервативные аминокислотные замены могут включать обмен представителя одного из этих классов на другого представителя того же класса. Неконсервативные замены могут включать обмен представителя одного из этих классов на представителя другого класса.

[0081] Специалист в данной области техники сможет определить подходящие варианты полипептидных цепей связывающих белков с помощью общеизвестных методик. Например, специалист в данной области техники может идентифицировать подходящие участки в полипептидной цепи, которые можно изменить без нарушения активности, путем нацеливания на участки, которые, как предполагается, не являются важными с точки зрения активности. Альтернативно специалист в данной области техники может идентифицировать остатки и части молекул, которые являются консервативными среди схожих полипептидов. Кроме того, даже участки, которые могут быть важными с точки зрения биологической активности или с точки зрения структуры, могут подвергаться консервативным аминокислотным заменам без нарушения биологической активности или без неблагоприятного воздействия на структуру полипептида.

[0082] Используемый в данном документе термин "пациент" включает людей и животных (например, млекопитающих, таких как собаки, свиньи, лошади, кошки, коровы и т. д.).

[0083] Используемые в данном документе термины "лечение" или "лечить" обозначают как терапевтическое лечение, так и профилактические или превентивные меры. К нуждающимся в лечении относят тех, у которых имеется нарушение, а также тех, которые предрасположены к нарушению, или тех, у которых нужно предотвратить нарушение. В конкретных вариантах осуществления связывающие белки можно применять для лечения людей с хронической вирусной инфекцией или для облегчения хронической вирусной инфекции у субъекта-человека.

[0084] Используемые в данном документе термины "фармацевтическая композиция" или "терапевтическая композиция" обозначают соединение или композицию, способные индуцировать необходимый терапевтический эффект при введении пациенту должным образом.

[0085] Используемый в данном документе термин "фармацевтически приемлемый носитель" или "физиологически приемлемый носитель" обозначает одно или несколько веществ состава, подходящие для осуществления или улучшения доставки связывающего белка.

[0086] Термины "эффективное количество" и "терапевтически эффективное количество" при использовании в отношении фармацевтической композиции, содержащей один или несколько связывающих белков, обозначают количество или дозу, достаточные для получения необходимого терапевтического результата. Более конкретно, терапевтически эффективное количество представляет собой количество связывающего белка, достаточное для ингибирования, на некоторый период времени, одного или нескольких клинически определенных патологических процессов, ассоциированных с состоянием, подлежащим лечению. Эффективное количество может меняться в зависимости от конкретного связывающего белка, подлежащего применению, а также зависит от ряда факторов и состояний, связанных с пациентом, подлежащим лечению, и тяжестью нарушения. Например, если связывающий белок подлежит введению in vivo, то факторы, такие как возраст, масса тела и состояние здоровья пациента, а также кривые зависимости "доза-эффект" и данные о токсичности, полученные в доклиническом исследовании на животных, будут входить в число таковых учитываемых факторов. Определение эффективного количества или терапевтически эффективного количества указанной фармацевтической композиции находится в пределах компетенции специалистов в данной области техники.

[0087] В одном варианте осуществления настоящего изобретения представлена фармацевтическая композиция, содержащая фармацевтически приемлемый носитель и терапевтически эффективное количество связывающего белка.

Триспецифические связывающие белки

[0088] Некоторые аспекты настоящего изобретения относятся к триспецифическим связывающим белкам (например, которые связывают полипептиды CD38, CD28 и CD3). Любые из CDR или вариабельных доменов любого из антигенсвязывающих белков, описываемых в данном документе, могут найти применение в получении триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению.

[0089] В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению представляет собой триспецифический связывающий белок, содержащий четыре полипептидные цепи, которые образуют три антигенсвязывающих участка, которые связывают один или несколько (например, три) разных целевых антигенов или целевых белков. В некоторых вариантах осуществления первая полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_L2-L₁-V_L1-L₂-C_L [I];

и вторая полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_H1-L₃-V_H2-L₄-C_H1-шарнир-C_H2-C_H3 [II];

и третья полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_H3-C_H1-шарнир-C_H2-C_H3 [III];

и четвертая полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_L3-C_L [IV];

где

V_L1 представляет собой первый вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;

V_L2 представляет собой второй вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;

V_L3 представляет собой третий вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;

V_H1 представляет собой первый вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;

V_H2 представляет собой второй вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;

V_H3 представляет собой третий вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;

C_L представляет собой константный домен легкой цепи иммуноглобулина;

C_H1 представляет собой константный домен C_H1 тяжелой цепи иммуноглобулина;

C_H2 представляет собой константный домен C_H2 тяжелой цепи иммуноглобулина;

C_H3 представляет собой константный домен C_H3 тяжелой цепи иммуноглобулина;

шарнир представляет собой шарнирный участок иммуноглобулина, соединяющий домены C_H1 и C_H2; и

L₁, L₂, L₃ и L₄ представляют собой аминокислотные линкеры,

где полипептид формулы I и полипептид формулы II образуют кроссоверную пару легкая_цепь-тяжелая_цепь. В некоторых вариантах осуществления первая полипептидная цепь и вторая полипептидная цепь характеризуются кроссоверной ориентацией, при этом они образуют два разных антигенсвязывающих участка.

[0090] В некоторых вариантах осуществления V_H1 и V_L1 образуют первый антигенсвязывающий участок, который связывает полипептид CD28, где V_H2 и V_L2 образуют второй антигенсвязывающий участок, который связывает полипептид CD3, и где V_H3 и V_L3 образуют третий антигенсвязывающий участок, который связывает полипептид CD38. В некоторых вариантах осуществления полипептид CD28 представляет собой полипептид CD28 человека. В некоторых вариантах осуществления полипептид CD3 представляет собой полипептид CD3 человека. В некоторых вариантах осуществления полипептид CD38 представляет собой полипептид CD38 человека. В некоторых вариантах осуществления триспецифический связывающий белок содержит один или несколько антигенсвязывающих участков, описанных ниже.

[0091] Связывающие белки согласно настоящему изобретению можно получить с использованием доменов или последовательностей, полученных или происходящих из любого антитела человека или антитела нечеловеческого происхождения, в том числе, например, из антител человека, мыши или гуманизированных антител. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению представляет собой антитело. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой моноклональное антитело. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой химерное, гуманизированное или человеческое антитело.

Связывающие участки антитела к CD38

[0092] Определенные аспекты настоящего изобретения относятся к связывающим белкам, которые содержат антигенсвязывающий участок, который связывает полипептид CD38 (например, полипептиды CD38 человека и макака-крабоеда).

[0093] В некоторых вариантах осуществления связывающий белок или его антигенсвязывающий фрагмент перекрестно реагирует с CD38 человека (например, полипептидом CD38 изоформы А и/или изоформы Е человека) и CD38 макака-крабоеда. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок индуцирует апоптоз CD38+ клетки. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок осуществляет рекрутинг Т-клетку к CD38+ клетке и необязательно активирует Т-клетку (например, посредством стимуляции TCR и/или костимуляции).

[0094] В некоторых вариантах осуществления связывающий участок, который связывает CD38, содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH) антитела, содержащий последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GYTFTSFN (SEQ ID NO:31) или GYTFTSYA (SEQ ID NO:37), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IYPGNGGT (SEQ ID NO:32) или IYPGQGGT (SEQ ID NO:38), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO:33); и/или вариабельный домен легкой цепи (VL) антитела, содержащий последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность ESVDSYGNGF (SEQ ID NO:34) или QSVSSYGQGF (SEQ ID NO:39), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность LAS (SEQ ID NO:35) или GAS (SEQ ID NO:40), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQNKEDPWT (SEQ ID NO:36). В некоторых вариантах осуществления связывающий участок, который связывает CD38, содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH) антитела, содержащий последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GYTFTSFN (SEQ ID NO:31) или GYTFTSYA (SEQ ID NO:37), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IYPGNGGT (SEQ ID NO:32) или IYPGQGGT (SEQ ID NO:38), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO:33); и/или вариабельный домен легкой цепи (VL) антитела, содержащий последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность ESVDSYGNGF (SEQ ID NO:34) или QSVSSYGQG (SEQ ID NO:132), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность LAS (SEQ ID NO:35) или GAS (SEQ ID NO:40), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQNKEDPWT (SEQ ID NO:36). В некоторых вариантах осуществления связывающие белки содержат 1, 2, 3, 4, 5 или 6 CDR из последовательности домена VH и/или VL antiCD38_C2-CD38-1, antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1, antiCD38_C2-CD38-1_VH3-VL3, antiCD38_C2-CD38-1_VH5-VL3, antiCD38_C2-CD38-1_VH6-VL3, CD38_HHY1370 (также может называться в данном документе antiCD38_1370), antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1xCD28supxCD3mid IgG4 FALA, antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1xCD28supxCD3mid IgG1LALA P329A, antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1xCD28supxCD3mid IgG1 NNSA, CD38_HHY1370xCD28supxCD3mid IgG4 FALA, CD38_HHY1370xCD28supxCD3mid IgG1LALA P329A или CD38_HHY1370xCD28supxCD3mid IgG1 NNSA, представленных в таблицах G, H или I.

[0095] В некоторых вариантах осуществления связывающий участок, который связывает CD38, содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH) антитела, содержащий последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GYTFTSFN (SEQ ID NO:31) или GYTFTSYA (SEQ ID NO:37), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IYPGNGGT (SEQ ID NO:32) или IYPGQGGT (SEQ ID NO:38), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO:33); и вариабельный домен легкой цепи (VL) антитела, содержащий последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность ESVDSYGNGF (SEQ ID NO:34) или QSVSSYGQGF (SEQ ID NO:39), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность LAS (SEQ ID NO:35) или GAS (SEQ ID NO:40), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQNKEDPWT (SEQ ID NO:36).

[0096] В некоторых вариантах осуществления связывающий участок, который связывает CD38, содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH) антитела, содержащий последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GYTFTSFN (SEQ ID NO:31), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IYPGNGGT (SEQ ID NO:32), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO:33); и/или вариабельный домен легкой цепи (VL) антитела, содержащий последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность ESVDSYGNGF (SEQ ID NO:34), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность LAS (SEQ ID NO:35), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQNKEDPWT (SEQ ID NO:36). В некоторых вариантах осуществления связывающий участок, который связывает CD38, содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH) антитела, содержащий последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GYTFTSFN (SEQ ID NO:31), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IYPGNGGT (SEQ ID NO:32), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO:33); и вариабельный домен легкой цепи (VL) антитела, содержащий последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность ESVDSYGNGF (SEQ ID NO:34), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность LAS (SEQ ID NO:35), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQNKEDPWT (SEQ ID NO:36). В других вариантах осуществления связывающий участок, который связывает CD38, содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH) антитела, содержащий последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GYTFTSYA (SEQ ID NO:37), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IYPGQGGT (SEQ ID NO:38), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO:33); и/или вариабельный домен легкой цепи (VL) антитела, содержащий последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность QSVSSYGQGF (SEQ ID NO:39), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность GAS (SEQ ID NO:40), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQNKEDPWT (SEQ ID NO:36). В некоторых вариантах осуществления связывающий участок, который связывает CD38, содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH) антитела, содержащий последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GYTFTSYA (SEQ ID NO:37), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IYPGQGGT (SEQ ID NO:38), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO:33); и вариабельный домен легкой цепи (VL) антитела, содержащий последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность QSVSSYGQGF (SEQ ID NO:39), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность GAS (SEQ ID NO:40), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQNKEDPWT (SEQ ID NO:36).

[0097] В некоторых вариантах осуществления домен VH содержит в направлении от N-конца к C-концу последовательность FR1-CDR-H1-FR2-CDR-H2-FR3-CDR-H3-FR4; где FR1 содержит последовательность QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKAS (SEQ ID NO:86), QVQLVQSGAEVVKSGASVKVSCKAS (SEQ ID NO:87) или QVQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKAS (SEQ ID NO:88); где FR2 содержит последовательность MHWVKEAPGQRLEWIGY (SEQ ID NO:90) или MHWVKEAPGQGLEWIGY (SEQ ID NO:91); где FR3 содержит последовательность NYNQKFQGRATLTADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFC (SEQ ID NO:93) или NYNQKFQGRATLTADTSASTAYMEISSLRSEDTAVYFC (SEQ ID NO:94); и где FR4 содержит последовательность WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:96). В некоторых вариантах осуществления домен VL содержит в направлении от N-конца к C-концу последовательность FR1-CDR-L1-FR2-CDR-L2-FR3-CDR-L3-FR4; где FR1 содержит последовательность DIVLTQSPATLSLSPGERATISCRAS (SEQ ID NO:97); где FR2 содержит последовательность MHWYQQKPGQPPRLLIY (SEQ ID NO:99); где FR3 содержит последовательность SRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISPLEPEDFAVYYC (SEQ ID NO:101); и где FR4 содержит последовательность FGGGTKLEIK (SEQ ID NO:103).

[0098] В некоторых вариантах осуществления домен VH содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:5; и/или домен VL содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:6. В некоторых вариантах осуществления домен VH содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:17; и/или домен VL содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:18. В некоторых вариантах осуществления домен VH содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере, 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:21; и/или домен VL содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:18. В некоторых вариантах осуществления домен VH содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:23; и/или домен VL содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:18. В некоторых вариантах осуществления домен VH содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:13; и/или домен VL содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:14.

[0099] В некоторых вариантах осуществления домен VH содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:5; и домен VL содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:6. В некоторых вариантах осуществления домен VH содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:17; и домен VL содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:18. В некоторых вариантах осуществления домен VH содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:21; и домен VL содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:18. В некоторых вариантах осуществления домен VH содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:23; и домен VL содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:18. В некоторых вариантах осуществления домен VH содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:13; и домен VL содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:14.

[0100] В некоторых вариантах осуществления домен VH содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:5, и домен VL содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:6. В некоторых вариантах осуществления домен VH содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:17, и домен VL содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:18. В некоторых вариантах осуществления домен VH содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:21, и домен VL содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:18. В некоторых вариантах осуществления домен VH содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:23, и домен VL содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:18. В некоторых вариантах осуществления домен VH содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:13, и домен VL содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:14.

[0101] В некоторых вариантах осуществления связывающий участок, который связывает CD38, содержит тяжелую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7, и/или легкую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению содержит тяжелую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:19, и/или легкую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:20. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению содержит тяжелую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:22, и/или легкую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:20. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению содержит тяжелую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:24, и/или легкую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:20. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению содержит тяжелую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:15, и/или легкую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:16.

[0102] В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению содержит тяжелую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:7, и легкую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:8. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению содержит тяжелую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:19, и легкую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:20. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению содержит тяжелую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:22, и легкую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:20. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению содержит тяжелую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:24, и легкую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:20. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению содержит тяжелую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:15, и легкую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:16.

[0103] В некоторых вариантах осуществления связывающий участок, который связывает CD38, содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH) антитела, содержащий последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GFTFSSYG (SEQ ID NO:41), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IWYDGSNK (SEQ ID NO:42), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARMFRGAFDY (SEQ ID NO:43); и/или вариабельный домен легкой цепи (VL) антитела, содержащий последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность QGIRND (SEQ ID NO:44), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность AAS (SEQ ID NO:45), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность LQDYIYYPT (SEQ ID NO:46). В некоторых вариантах осуществления связывающий участок, который связывает CD38, содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH) антитела, содержащий последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GFTFSSYG (SEQ ID NO:41), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IWYDGSNK (SEQ ID NO:42), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARMFRGAFDY (SEQ ID NO:43); и вариабельный домен легкой цепи (VL) антитела, содержащий последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность QGIRND (SEQ ID NO:44), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность AAS (SEQ ID NO:45), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность LQDYIYYPT (SEQ ID NO:46).

[0104] В некоторых вариантах осуществления домен VH содержит в направлении от N-конца к C-концу последовательность FR1-CDR-H1-FR2-CDR-H2-FR3-CDR-H3-FR4; где FR1 содержит последовательность QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAAS (SEQ ID NO:89); где FR2 содержит последовательность MHWVRQAPGKGLEWVAV (SEQ ID NO:92); где FR3 содержит последовательность YYADSVKGRFTISGDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC (SEQ ID NO:95); и где FR4 содержит последовательность WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:96). В некоторых вариантах осуществления домен VL содержит в направлении от N-конца к C-концу последовательность FR1-CDR-L1-FR2-CDR-L2-FR3-CDR-L3-FR4; где FR1 содержит последовательность AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAS (SEQ ID NO:98); где FR2 содержит последовательность GWYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO:100); где FR3 содержит последовательность SLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISGLQPEDSATYYC (SEQ ID NO:102); и где FR4 содержит последовательность WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:104).

[0105] В некоторых вариантах осуществления домен VH содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:9; и/или домен VL содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:10.

[0106] В некоторых вариантах осуществления домен VH содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:9; и домен VL содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:10. В некоторых вариантах осуществления домен VH содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:9, и домен VL содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:10.

[0107] В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению содержит тяжелую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:11, или легкую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:12. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению содержит тяжелую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:11, и легкую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:12.

Связывающие участки антитела к CD28

[0108] Некоторые аспекты настоящего изобретения относятся к связывающим белкам, которые содержат антигенсвязывающий участок, который связывает полипептид CD28 (например, полипептид CD28 человека).

[0109] В некоторых вариантах осуществления связывающий участок, который связывает CD28, содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH) антитела, содержащий последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GYTFTSYY (SEQ ID NO:108), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IYPGNVNT (SEQ ID NO:109), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность TRSHYGLDWNFDV (SEQ ID NO:110), и/или вариабельный домен легкой цепи (VL) антитела, содержащий последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность QNIYVW (SEQ ID NO:111), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность KAS (SEQ ID NO:112), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQGQTYPY (SEQ ID NO:113). В некоторых вариантах осуществления связывающий участок, который связывает CD28, содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH) антитела, содержащий последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GYTFTSYY (SEQ ID NO:108), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IYPGNVNT (SEQ ID NO:109), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность TRSHYGLDWNFDV (SEQ ID NO:110), и вариабельный домен легкой цепи (VL) антитела, содержащий последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность QNIYVW (SEQ ID NO:111), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность KAS (SEQ ID NO:112), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQGQTYPY (SEQ ID NO:113).

[0110] В некоторых вариантах осуществления связывающий участок, который связывает CD28, содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH) антитела, содержащий последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GFSLSDYG (SEQ ID NO:114), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IWAGGGT (SEQ ID NO:115), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARDKGYSYYYSMDY (SEQ ID NO:116), и/или вариабельный домен легкой цепи (VL) антитела, содержащий последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность ESVEYYVTSL (SEQ ID NO:117), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность AAS (SEQ ID NO:118), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQSRKVPYT (SEQ ID NO:119). В некоторых вариантах осуществления связывающий участок, который связывает CD28, содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH) антитела, содержащий последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GFSLSDYG (SEQ ID NO:114), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IWAGGGT (SEQ ID NO:115), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARDKGYSYYYSMDY (SEQ ID NO:116), и вариабельный домен легкой цепи (VL) антитела, содержащий последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность ESVEYYVTSL (SEQ ID NO:117), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность AAS (SEQ ID NO:118), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQSRKVPYT (SEQ ID NO:119).

Связывающие участки антитела к CD3

[0111] Некоторые аспекты настоящего изобретения относятся к связывающим белкам, которые содержат антигенсвязывающий участок, который связывает полипептид CD3 (например, полипептид CD3 человека).

[0112] В некоторых вариантах осуществления связывающий участок, который связывает CD3, содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH) антитела, содержащий последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GFTFTKAW (SEQ ID NO:120), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IKDKSNSYAT (SEQ ID NO:121), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность RGVYYALSPFDY (SEQ ID NO:122), и/или вариабельный домен легкой цепи (VL) антитела, содержащий последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность QSLVHNNANTY (SEQ ID NO:123), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность KVS (SEQ ID NO:124), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность GQGTQYPFT (SEQ ID NO:125). В некоторых вариантах осуществления связывающий участок, который связывает CD3, содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH) антитела, содержащий последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GFTFTKAW (SEQ ID NO:120), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IKDKSNSYAT (SEQ ID NO:121), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность RGVYYALSPFDY (SEQ ID NO:122), и вариабельный домен легкой цепи (VL) антитела, содержащий последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность QSLVHNNANTY (SEQ ID NO:123), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность KVS (SEQ ID NO:124), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность GQGTQYPFT (SEQ ID NO:125).

[0113] В некоторых вариантах осуществления связывающий участок, который связывает CD3, содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH) антитела, содержащий последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GFTFTKAW (SEQ ID NO:126), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IKDKSNSYAT (SEQ ID NO:127), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность GVYYALSPFDY (SEQ ID NO:128), и/или вариабельный домен легкой цепи (VL) антитела, содержащий последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность QSLVHNNGNTY (SEQ ID NO:129), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность KVS (SEQ ID NO:130), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность GQGTQYPFT (SEQ ID NO:131).

[0114] В некоторых вариантах осуществления любого из триспецифических связывающих белков по настоящему изобретению один антигенсвязывающий домен связывает полипептид CD3 (например, CD3 человека), и один антигенсвязывающий домен связывает полипептид CD28 (например, CD28 человека). В некоторых вариантах осуществления домен V_H1 содержит три CDR из SEQ ID NO:49 или 51, как показано в таблице H, и домен V_L1 содержит три CDR из SEQ ID NO:50 или 52, как показано в таблице H. В некоторых вариантах осуществления домен V_H2 содержит три CDR из SEQ ID NO:49 или 51, как показано в таблице H, и домен V_L2 содержит три CDR из SEQ ID NO:50 или 52, как показано в таблице H. В некоторых вариантах осуществления домен V_H1 содержит три CDR из SEQ ID NO:53 или 84, как показано в таблице H, и домен V_L1 содержит три CDR из SEQ ID NO:54 или 85, как показано в таблице H. В некоторых вариантах осуществления домен V_H2 содержит три CDR из SEQ ID NO:53 или 84, как показано в таблице H, и домен V_L2 содержит три CDR из SEQ ID NO:54 или 85, представленных в таблице H.

[0115] В некоторых вариантах осуществления домен V_H1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:49, домен V_L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:50, домен V_H2 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:53, и домен V_L2 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:54. В некоторых вариантах осуществления домен V_H2 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:49, домен V_L2 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:50, домен V_H1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:53, и домен V_L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:54. В некоторых вариантах осуществления домен V_H1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:51, домен V_L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:52, домен V_H2 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:53, и домен V_L2 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:54. В некоторых вариантах осуществления домен V_H2 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:51, домен V_L2 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:52, домен V_H1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:53, и домен V_L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:54.

[0116] В некоторых вариантах осуществления домен V_H1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:49, домен V_L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:50, домен V_H2 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:53, домен V_L2 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:54, домен V_H3 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:13, и домен V_L3 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:14. В некоторых вариантах осуществления домен V_H1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:49, домен V_L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:50, домен V_H2 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:53, домен V_L2 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:54, домен V_H3 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:9, и домен V_L3 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:10.

[0117] В некоторых вариантах осуществления первая полипептидная цепь содержит полипептидную последовательность, которая на по меньшей мере 95% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:61, вторая полипептидная цепь содержит полипептидную последовательность, которая на по меньшей мере 95% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:60, третья полипептидная цепь содержит полипептидную последовательность, которая на по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:62, и четвертая полипептидная цепь содержит полипептидную последовательность, которая на по меньшей мере 95% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:63. В некоторых вариантах осуществления первая полипептидная цепь содержит полипептидную последовательность, которая на по меньшей мере 95% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:61, вторая полипептидная цепь содержит полипептидную последовательность, которая на по меньшей мере 95% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:64, третья полипептидная цепь содержит полипептидную последовательность, которая на по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:65, и четвертая полипептидная цепь содержит полипептидную последовательность, которая на по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:63. В определенных вариантах осуществления первая полипептидная цепь содержит полипептидную последовательность, которая на по меньшей мере 95% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:61, вторая полипептидная цепь содержит полипептидную последовательность, которая на по меньшей мере 95% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:66, третья полипептидная цепь содержит полипептидную последовательность, которая на по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:67, и четвертая полипептидная цепь содержит полипептидную последовательность, которая на по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:63. В определенных вариантах осуществления первая полипептидная цепь содержит полипептидную последовательность, которая на по меньшей мере 95% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:61, вторая полипептидная цепь содержит полипептидную последовательность, которая на по меньшей мере 95% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:60, третья полипептидная цепь содержит полипептидную последовательность, которая на по меньшей мере 95% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:68, и четвертая полипептидная цепь содержит полипептидную последовательность, которая на по меньшей мере 95% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:69. В определенных вариантах осуществления первая полипептидная цепь содержит полипептидную последовательность, которая на по меньшей мере 95% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:61, вторая полипептидная цепь содержит полипептидную последовательность, которая на по меньшей мере 95% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:64, третья полипептидная цепь содержит полипептидную последовательность, которая на по меньшей мере 95% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:70, и четвертая полипептидная цепь содержит полипептидную последовательность, которая на по меньшей мере 95% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:69. В определенных вариантах осуществления первая полипептидная цепь содержит полипептидную последовательность, которая на по меньшей мере 95% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:61, вторая полипептидная цепь содержит полипептидную последовательность, которая на по меньшей мере 95% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:66, третья полипептидная цепь содержит полипептидную последовательность, которая на по меньшей мере 95% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:71, и четвертая полипептидная цепь содержит полипептидную последовательность, которая на по меньшей мере 95% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:69.

[0118] В определенных вариантах осуществления первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:61, вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:60, третья полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:62, и четвертая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:63. В определенных вариантах осуществления первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:61, вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:64, третья полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:65, и четвертая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:63. В определенных вариантах осуществления первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:61, вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:66, третья полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:67, и четвертая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:63. В определенных вариантах осуществления первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:61, вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:60, третья полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:68, и четвертая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:69. В определенных вариантах осуществления первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:61, вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:64, третья полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:70, и четвертая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:69. В определенных вариантах осуществления первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:61, вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:66, третья полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:71, и четвертая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:69.

[0119] В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению содержит 1, 2, 3, 4, 5 или 6 последовательностей CDR из последовательности антитела, показанной в таблице G. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению содержит 1, 2, 3, 4, 5 или 6 последовательностей CDR, последовательность домена VH и/или последовательность домена VL из последовательности антитела, показанной в таблице H. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению содержит 1, 2, 3, 4, 5 или 6 последовательностей CDR, последовательность домена VH и/или последовательность домена VL из последовательности антитела, показанной в таблице I. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению содержит 1, 2, 3 или 4 полипептидные последовательности, показанные в таблице I.

Таблица G. Последовательности CDR белков, связывающих CD38

Ab CDR_H1 CDR_H2 CDR_H3 CDR_L1 CDR_L2 CDR_L3 antiCD38_C2-CD38-1 GYTFTSFN
(SEQ ID NO:31) IYPGNGGT
(SEQ ID NO:32) ARTGGLRRAYFTY
(SEQ ID NO:33) ESVDSYGNGF
(SEQ ID NO:34) LAS
(SEQ ID NO:35) QQNKEDPWT
(SEQ ID NO:36) antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1 GYTFTSYA
(SEQ ID NO:37) IYPGQGGT
(SEQ ID NO:38) ARTGGLRRAYFTY
(SEQ ID NO:33) QSVSSYGQGF
(SEQ ID NO:39) GAS
(SEQ ID NO:40) QQNKEDPWT
(SEQ ID NO:36) antiCD38_C2-CD38-1_VH3-VL3 GYTFTSFN
(SEQ ID NO:31) IYPGNGGT
(SEQ ID NO:32) ARTGGLRRAYFTY
(SEQ ID NO:33) ESVDSYGNGF
(SEQ ID NO:34) LAS
(SEQ ID NO:35) QQNKEDPWT
(SEQ ID NO:36) antiCD38_C2-CD38-1_VH5-VL3 GYTFTSFN
(SEQ ID NO:31) IYPGNGGT
(SEQ ID NO:32) ARTGGLRRAYFTY
(SEQ ID NO:33) ESVDSYGNGF
(SEQ ID NO:34) LAS
(SEQ ID NO:35) QQNKEDPWT
(SEQ ID NO:36) antiCD38_C2-CD38-1_VH6-VL3 GYTFTSFN
(SEQ ID NO:31) IYPGNGGT
(SEQ ID NO:32) ARTGGLRRAYFTY
(SEQ ID NO:33) ESVDSYGNGF
(SEQ ID NO:34) LAS
(SEQ ID NO:35) QQNKEDPWT
(SEQ ID NO:36) CD38_HHY1370 GFTFSSYG
(SEQ ID NO:41) IWYDGSNK
(SEQ ID NO:42) ARMFRGAFDY
(SEQ ID NO:43) QGIRND
(SEQ ID NO:44) AAS
(SEQ ID NO:45) LQDYIYYPT (SEQ ID NO:46)

[0146]

Таблица H. Последовательности вариабельных доменов белков, связывающих CD38 и других связывающих белков

Ab VH (белок) VL (белок) antiCD38_C2-CD38-1 QVQLQQSGAELVRSGASVKMSCKASGYTFTSFNMHWVKETPGQGLEWIGYIYPGNGGTNYNQKFKGKATLTADTSSSTAYMQISSLTSEDSAVYFCARTGGLRRAYFTYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:5) DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYGNGFMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYCQQNKEDPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:6 antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1 QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTSYAMHWVKEAPGQRLEWIGYIYPGQGGTNYNQKFQGRATLTADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFCARTGGLRRAYFTYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:13) DIVLTQSPATLSLSPGERATISCRASQSVSSYGQGFMHWYQQKPGQPPRLLIYGASSRAT
GIPARFSGSGSGTDFTLTISPLEPEDFAVYYCQQNKEDPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:14) antiCD38_C2-CD38-1_VH3-VL3 QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTSFNMHWVKEAPGQRLEWIGYIYPGNGGTNYNQKFQGRATLTADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFCARTGGLRRAYFTYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:17) DIVLTQSPATLSLSPGERATISCRASESVDSYGNGFMHWYQQKPGQPPRLLIYLASSRAT
GIPARFSGSGSGTDFTLTISPLEPEDFAVYYCQQNKEDPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:18) antiCD38_C2-CD38-1_VH5-VL3 QVQLVQSGAEVVKSGASVKVSCKASGYTFTSFNMHWVKEAPGQGLEWIGYIYPGNGGTNYNQKFQGRATLTADTSASTAYMEISSLRSEDTAVYFCARTGGLRRAYFTYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:21) DIVLTQSPATLSLSPGERATISCRASESVDSYGNGFMHWYQQKPGQPPRLLIYLASSRAT
GIPARFSGSGSGTDFTLTISPLEPEDFAVYYCQQNKEDPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:18) antiCD38_C2-CD38-1_VH6-VL3 QVQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSFNMHWVKEAPGQRLEWIGYIYPGNGGTNYNQKFQGRATLTADTSASTAYMEISSLRSEDTAVYFCARTGGLRRAYFTYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:23) DIVLTQSPATLSLSPGERATISCRASESVDSYGNGFMHWYQQKPGQPPRLLIYLASSRAT
GIPARFSGSGSGTDFTLTISPLEPEDFAVYYCQQNKEDPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:18) CD38_HHY1370 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISGDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARMFRGAFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:9) AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISGLQPEDSATYYCLQDYIYYPTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:10) antiCD38_SB19 Qvqlvqsgaevakpgtsvklsckasgytftdywmqwvkqrpgqglewigtiypgdgdtgyaqkfqgkatltadkssktvymhlsslasedsavyycargdyygsnsldywgqgtsvtvss (SEq ID NO:47) DIVMTQSHLSMSTSLGDPVSITCKASQDVSTVVAWYQQKPGQSPRRLIYSASYRYIGVPDRFTGSGAGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQQHYSPPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:48) Anti-CD28_sup qvqlvqsgaevvkpgasvkvsckasgytftsyyihwvrqapgqglewigsiypgnvntnyaqkfqgratltvdtsistaymelsrlrsddtavyyctrshygldwnfdvwgkgttvtvss (SEQ ID NO:49) diqmtqspsslsasvgdrvtitcqasqniyvwlnwyqqkpgkapklliykasnlhtgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpediatyycqqgqtypytfgqgtkleik (SEq ID NO:50) Anti-CD28_cvn qvqlqesgpglvkpsqtlsltctvsgfslsdygvhwvrqppgkglewlgviwagggtnynpslksrktiskdtsknqvslklssvtaadtavyycardkgysyyysmdywgqgttvtvss (SEQ ID NO:51) divltqspaslavspgqratitcrasesveyyvtslmqwyqqkpgqppkllifaasnvesgvparfsgsgsgtdftltinpveandvanyycqqsrkvpytfgqgtkleik (SEQ ID NO:52) Anti-CD3_mid qvqlvesgggvvqpgrslrlscaasgftftkawmhwvrqapgkqlewvaqikdksnsyatyyadsvkgrftisrddskntlylqmnslraedtavyycrgvyyalspfdywgqgtlvtvss (SEQ ID NO:53) divmtqtplslsvtpgqpasisckssqslvhnnantylswylqkpgqspqsliykvsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyycgqgtqypftfgsgtkveik (SEQ ID NO:54) Anti-CD3_low qvqlvesgggvvqpgrslrlscaasgftftkawmhwvrqapgkglewvaqikdksnsyatyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycrgvyyalspfdywgqgtlvtvss (SEQ ID NO:84) divmtqtplslsvtpgqpasisckssqslvhnngntylswylqkpgqspqlliykvsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyycgqgtqypftfgggtkveik (SEq ID NO:85)

Примечание: в аминокислотных последовательностях, приведенных выше, последовательности CDR выделены жирным шрифтом и подчеркнуты.

Таблица I. Полноразмерные последовательности связывающих белков

antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1xCD28supxCD3mid IgG4 FALA тяжелая цепь 1 FALA CD28supxCD3mid IgG4(впадина)
(например, вторая полипептидная цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) Qvqlvqsgaevvkpgasvkvsckasgytftsyyihwvrqapgqglewigsiypgnvntnyaqkfqgratltvdtsistaymelsrlrsddtavyyctrshygldwnfdvwgkgttvtvsssqvqlvesgggvvqpgrslrlscaasgftftkawmhwvrqapgkqlewvaqikdksnsyatyyadsvkgrftisrddskntlylqmnslraedtavyycrgvyyalspfdywgqgtlvtvssrtastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvctlppsqeemtknqvslscavkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflvskltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslg SEQ ID NO: 60 легкая цепь 1 CD28supxCD3mid
(например, первая полипептидная цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) Divmtqtplslsvtpgqpasisckssqslvhnnantylswylqkpgqspqsliykvsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyycgqgtqypftfgsgtkveikgqpkaapdiqmtqspsslsasvgdrvtitcqasqniyvwlnwyqqkpgkapklliykasnlhtgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpediatyycqqgqtypytfgqgtkleiktkgpsrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec SEQ ID NO: 61 тяжелая цепь 2 FALA antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1 IgG4(выступ)
(например, третья полипептидная цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) Qvqlvqsgaevvkpgasvkvsckasgytftsyamhwvkeapgqrlewigyiypgqggtnynqkfqgratltadtsastaymelsslrsedtavyfcartgglrrayftywgqgtlvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppcqeemtknqvslwclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslg SEQ ID NO: 62 легкая цепь 2 antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1
(например, четвертая полипептидная цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) Divltqspatlslspgeratiscrasqsvssygqgfmhwyqqkpgqpprlliygassratgiparfsgsgsgtdftltisplepedfavyycqqnkedpwtfgggtkleikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec SEQ ID NO: 63 antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1xCD28supxCD3mid IgG1LALA P329A тяжелая цепь 1 LALA P329A CD28supxCD3mid IgG1(впадина)
(например, вторая полипептидная цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) Qvqlvqsgaevvkpgasvkvsckasgytftsyyihwvrqapgqglewigsiypgnvntnyaqkfqgratltvdtsistaymelsrlrsddtavyyctrshygldwnfdvwgkgttvtvsssqvqlvesgggvvqpgrslrlscaasgftftkawmhwvrqapgkqlewvaqikdksnsyatyyadsvkgrftisrddskntlylqmnslraedtavyycrgvyyalspfdywgqgtlvtvssrtastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalaapiektiskakgqprepqvctlppsrdeltknqvslscavkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflvskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg SEQ ID NO: 64 легкая цепь 1 CD28supxCD3mid
(например, первая полипептидная цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) Смотри выше. SEQ ID NO: 61 тяжелая цепь 2 LALA P329A antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1 IgG1(выступ)
(например, третья полипептидная цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) Qvqlvqsgaevvkpgasvkvsckasgytftsyamhwvkeapgqrlewigyiypgqggtnynqkfqgratltadtsastaymelsslrsedtavyfcartgglrrayftywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalaapiektiskakgqprepqvytlppcrdeltknqvslwclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg SEQ ID NO: 65 легкая цепь 2 antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1
(например, четвертая полипептидная цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) Смотри выше. SEQ ID NO: 63 antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1xCD28supxCD3mid IgG1 NNSA тяжелая цепь 1 NNSA CD28supxCD3mid IgG1(впадина)
(например, вторая полипептидная цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) Qvqlvqsgaevvkpgasvkvsckasgytftsyyihwvrqapgqglewigsiypgnvntnyaqkfqgratltvdtsistaymelsrlrsddtavyyctrshygldwnfdvwgkgttvtvsssqvqlvesgggvvqpgrslrlscaasgftftkawmhwvrqapgkqlewvaqikdksnsyatyyadsvkgrftisrddskntlylqmnslraedtavyycrgvyyalspfdywgqgtlvtvssrtastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynnasrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvctlppsrdeltknqvslscavkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflvskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg SEQ ID NO: 66 легкая цепь 1 CD28supxCD3mid
(например, первая полипептидная цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) Смотри выше. SEQ ID NO: 61 тяжелая цепь 2 NNSA antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1 IgG1(выступ)
(например, третья полипептидная цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) qvqlvqsgaevvkpgasvkvsckasgytftsyamhwvkeapgqrlewigyiypgqggtnynqkfqgratltadtsastaymelsslrsedtavyfcartgglrrayftywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynnasrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppcrdeltknqvslwclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg SEQ ID NO: 67 легкая цепь 2 CD38VH1
(например, четвертая полипептидная цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) Смотри выше. SEQ ID NO: 63 CD38_HHY1370xCD28supxCD3mid IgG4 FALA тяжелая цепь 1 FALA CD28supxCD3mid IgG4(впадина)
(например, вторая полипептидная цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) Смотри выше. SEQ ID NO: 60 легкая цепь 1 CD28supxCD3mid
(например, первая полипептидная цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) Смотри выше. SEQ ID NO: 61 тяжелая цепь 2 FALA CD38_HHY1370 IgG4(выступ)
(например, третья полипептидная цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) Qvqlvesgggvvqpgrslrlscaasgftfssygmhwvrqapgkglewvaviwydgsnkyyadsvkgrftisgdnskntlylqmnslraedtavyycarmfrgafdywgqgtlvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppcqeemtknqvslwclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslg SEQ ID NO: 68 легкая цепь 2 CD38_HHY1370
(например, четвертая полипептидная цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) aiqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqgirndlgwyqqkpgkapklliyaasslqsgvpsrfsgsgsgtdftltisglqpedsatyyclqdyiyyptfgqgtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec SEQ ID NO: 69 CD38_HHY1370 xCD28supxCD3mid IgG1LALA P329A тяжелая цепь 1 LALA P329A CD28supxCD3mid IgG1(впадина)
(например, вторая полипептидная цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) Смотри выше. SEQ ID NO: 64 легкая цепь 1 CD28supxCD3mid
(например, первая полипептидная цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) Смотри выше. SEQ ID NO: 61 тяжелая цепь 2 LALA P329A CD38_HHY1370 IgG1(выступ)
(например, третья полипептидная цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) qvqlvesgggvvqpgrslrlscaasgftfssygmhwvrqapgkglewvaviwydgsnkyyadsvkgrftisgdnskntlylqmnslraedtavyycarmfrgafdywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalaapiektiskakgqprepqvytlppcrdeltknqvslwclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg SEQ ID NO: 70 легкая цепь 2 CD38_HHY1370
(например, четвертая полипептидная цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) Смотри выше. SEQ ID NO: 69 CD38_HHY1370xCD28supxCD3mid IgG1 NNSA тяжелая цепь 1 NNSA CD28supxCD3mid IgG1(впадина)
(например, вторая полипептидная цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) Смотри выше. SEQ ID NO: 66 легкая цепь 1 CD28supxCD3mid
(например, первая полипептидная цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) Смотри выше. SEQ ID NO: 61 тяжелая цепь 2 NNSA CD38_HHY1370 IgG1(выступ)
(например, третья полипептидная цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) Qvqlvesgggvvqpgrslrlscaasgftfssygmhwvrqapgkglewvaviwydgsnkyyadsvkgrftisgdnskntlylqmnslraedtavyycarmfrgafdywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynnasrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppcrdeltknqvslwclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg SEQ ID NO: 71 легкая цепь 2 CD38_HHY1370
(например, четвертая полипептидная цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) Смотри выше. SEQ ID NO: 69 моновалентное антитело antiCD38_C2-CD38-1 тяжелая цепь antiCD38_C2-CD38-1 QVQLQQSGAELVRSGASVKMSCKASGYTFTSFNMHWVKETPGQGLEWIGYIYPGNGGTNYNQKFKGKATLTADTSSSTAYMQISSLTSEDSAVYFCARTGGLRRAYFTYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLAGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPLPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG SEQ ID NO: 7 легкая цепь antiCD38_C2-CD38-1 DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYGNGFMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLES
GVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYCQQNKEDPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 8 моновалентное антитело antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1 тяжелая цепь antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1 QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTSYAMHWVKEAPGQRLEWIGYIYPGQGGTNYNQKFQGRATLTADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFCARTGGLRRAYFTYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLAGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPLPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG SEQ ID NO: 15 легкая цепь antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1 DIVLTQSPATLSLSPGERATISCRASQSVSSYGQGFMHWYQQKPGQPPRLLIYGASSRAT
GIPARFSGSGSGTDFTLTISPLEPEDFAVYYCQQNKEDPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVF
IFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 16 моновалентное антитело antiCD38_C2-CD38-1_VH3-VL3 тяжелая цепь antiCD38_C2-CD38-1_VH3-VL3 QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTSFNMHWVKEAPGQRLEWIGYIYPGNGGTNYNQKFQGRATLTADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFCARTGGLRRAYFTYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLAGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPLPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG SEQ ID NO: 19 легкая цепь antiCD38_C2-CD38-1_VH3-VL3 DIVLTQSPATLSLSPGERATISCRASESVDSYGNGFMHWYQQKPGQPPRLLIYLASSRAT
GIPARFSGSGSGTDFTLTISPLEPEDFAVYYCQQNKEDPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVF
IFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 20 моновалентное антитело antiCD38_C2-CD38-1_VH5-VL3 тяжелая цепь antiCD38_C2-CD38-1_VH5-VL3 QVQLVQSGAEVVKSGASVKVSCKASGYTFTSFNMHWVKEAPGQGLEWIGYIYPGNGGTNYNQKFQGRATLTADTSASTAYMEISSLRSEDTAVYFCARTGGLRRAYFTYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLAGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPLPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG SEQ ID NO: 22 легкая цепь antiCD38_C2-CD38-1_VH5-VL3 DIVLTQSPATLSLSPGERATISCRASESVDSYGNGFMHWYQQKPGQPPRLLIYLASSRAT
GIPARFSGSGSGTDFTLTISPLEPEDFAVYYCQQNKEDPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVF
IFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 20 моновалентное антитело antiCD38_C2-CD38-1_VH6-VL3 тяжелая цепь antiCD38_C2-CD38-1_VH6-VL3 QVQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSFNMHWVKEAPGQRLEWIGYIYPGNGGTNYNQKFQGRATLTADTSASTAYMEISSLRSEDTAVYFCARTGGLRRAYFTYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLAGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPLPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG SEQ ID NO: 24 легкая цепь antiCD38_C2-CD38-1_VH6-VL3 DIVLTQSPATLSLSPGERATISCRASESVDSYGNGFMHWYQQKPGQPPRLLIYLASSRAT
GIPARFSGSGSGTDFTLTISPLEPEDFAVYYCQQNKEDPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVF
IFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 20 моновалентное антитело CD38_HHY1370 тяжелая цепь CD38_HHY1370 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISGDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARMFRGAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLAGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPLPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG SEQ ID NO: 11 легкая цепь CD38_HHY1370 AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPS
RFSGSGSGTDFTLTISGLQPEDSATYYCLQDYIYYPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPP
SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 12 моновалентное антитело antiCD38_SB19 тяжелая цепь antiCD38_SB19 QVQLVQSGAEVAKPGTSVKLSCKASGYTFTDYWMQWVKQRPGQGLEWIGTIYPGDGDTGYAQKFQGKATLTADKSSKTVYMHLSSLASEDSAVYYCARGDYYGSNSLDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 107 легкая цепь antiCD38_SB19 DIVMTQSHLSMSTSLGDPVSITCKASQDVSTVVAWYQQKPGQSPRRLIYSASYRYIGVPDRFTGSGAGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQQHYSPPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPP
SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 106

Таблица J. Полноразмерные полинуклеотидные последовательности связывающих белков

antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1xCD28supxCD3mid IgG4 FALA тяжелая цепь 1 FALA CD28supxCD3mid IgG4(впадина)
(например, последовательность, кодирующая вторую полипептидную цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) caggtgcagctggtgcagtctggcgccgaggtcgtgaaacctggcgcctctgtgaaggtgtcctgcaaggccagcggctacacctttaccagctactacatccactgggtgcgccaggcccctggacagggactggaatggatcggcagcatctaccccggcaacgtgaacaccaactacgcccagaagttccagggcagagccaccctgaccgtggacaccagcatcagcaccgcctacatggaactgagccggctgagaagcgacgacaccgccgtgtactactgcacccggtcccactacggcctggattggaacttcgacgtgtggggcaagggcaccaccgtgacagtgtctagcagccaggtgcagctggtggaatctggcggcggagtggtgcagcctggcagaagcctgagactgagctgtgccgccagcggcttcaccttcaccaaggcctggatgcactgggtgcgccaggcccctggaaagcagctggaatgggtggcccagatcaaggacaagagcaacagctacgccacctactacgccgacagcgtgaagggccggttcaccatcagccgggacgacagcaagaacaccctgtacctgcagatgaacagcctgcgggccgaggacaccgccgtgtactactgtcggggcgtgtactatgccctgagccccttcgattactggggccagggaaccctcgtgaccgtgtctagtcggaccgccagcacaaagggcccatcggtgttccctctggccccttgcagcagaagcaccagcgaatctacagccgccctgggctgcctcgtgaaggactactttcccgagcccgtgaccgtgtcctggaactctggcgctctgacaagcggcgtgcacacctttccagccgtgctccagagcagcggcctgtactctctgagcagcgtcgtgacagtgcccagcagcagcctgggcaccaagacctacacctgtaacgtggaccacaagcccagcaacaccaaggtggacaagcgggtggaatctaagtacggccctccctgccctccttgcccagcccctgaagctgccggcggaccctccgtgttcctgttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatcagccggacccccgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtcccaggaagatcccgaggtgcagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagttcaacagcacctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaagggcctgcccagctccatcgagaaaaccatcagcaaggccaagggccagccccgcgagcctcaagtgtgtaccctgccccctagccaggaagagatgaccaagaaccaggtgtccctgagctgtgccgtgaaaggcttctaccccagcgacattgccgtggaatgggagagcaacggccagcccgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggacagcgacggctcattcttcctggtgtccaagctgaccgtggacaagagccggtggcaggaaggcaacgtgttcagctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgtctctgtccctgggc SEQ ID NO:72 легкая цепь 1 CD28supxCD3mid
(например, последовательность, кодирующая первую полипептидную цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) gacatcgtgatgacccagacccccctgagcctgagcgtgacacctggacagcctgccagcatcagctgcaagagcagccagagcctggtgcacaacaacgccaacacctacctgagctggtatctgcagaagcccggccagagcccccagtccctgatctacaaggtgtccaacagattcagcggcgtgcccgacagattctccggcagcggctctggcaccgacttcaccctgaagatcagccgggtggaagccgaggacgtgggcgtgtactattgtggccagggcacccagtaccccttcacctttggcagcggcaccaaggtggaaatcaagggccagcccaaggccgcccccgacatccagatgacccagagccccagcagcctgtctgccagcgtgggcgacagagtgaccatcacctgtcaggccagccagaacatctacgtgtggctgaactggtatcagcagaagcccggcaaggcccccaagctgctgatctacaaggccagcaacctgcacaccggcgtgcccagcagattttctggcagcggctccggcaccgacttcaccctgacaatcagctccctgcagcccgaggacattgccacctactactgccagcagggccagacctacccctacacctttggccagggcaccaagctggaaatcaagaccaagggccccagccgtacggtggccgctcccagcgtgttcatcttcccacctagcgacgagcagctgaagtccggcacagcctctgtcgtgtgcctgctgaacaacttctacccccgcgaggccaaagtgcagtggaaggtggacaacgccctgcagagcggcaacagccaggaaagcgtgaccgagcaggacagcaaggactccacctacagcctgagcagcaccctgacactgagcaaggccgactacgagaagcacaaggtgtacgcctgcgaagtgacccaccagggcctgtctagccccgtgaccaagagcttcaaccggggcgagtgt SEQ ID NO:73 тяжелая цепь 2 FALA antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1 IgG4(выступ)
(например, последовательность, кодирующая третью полипептидную цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) caggtgcagctggtgcagtctggcgccgaagtcgtgaaacctggcgcctccgtgaaggtgtcctgcaaggccagcggctacacctttaccagctacgccatgcactgggtcaaagaggcccctggccagagactggaatggatcggctacatctaccccggccagggcggcaccaactacaaccagaagttccagggcagagccaccctgaccgccgatacaagcgccagcaccgcctacatggaactgagcagcctgcggagcgaggataccgccgtgtacttctgtgccagaacaggcggcctgaggcgggcctactttacctattggggccagggcaccctcgtgaccgtgtctagcgctagcacaaagggcccatcggtgttccctctggccccttgcagcagaagcaccagcgaatctacagccgccctgggctgcctcgtgaaggactactttcccgagcccgtgaccgtgtcctggaactctggcgctctgacaagcggcgtgcacacctttccagccgtgctccagagcagcggcctgtactctctgagcagcgtcgtgacagtgcccagcagcagcctgggcaccaagacctacacctgtaacgtggaccacaagcccagcaacaccaaggtggacaagcgggtggaatctaagtacggccctccctgccctccttgcccagcccctgaagctgccggcggaccctccgtgttcctgttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatcagccggacccccgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtcccaggaagatcccgaggtgcagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagttcaacagcacctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaagggcctgcccagctccatcgagaaaaccatcagcaaggccaagggccagccccgcgagcctcaagtgtataccctgcccccttgccaggaagagatgaccaagaaccaggtgtccctgtggtgtctcgtgaaaggcttctaccccagcgacattgccgtggaatgggagagcaacggccagcccgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggacagcgacggctcattcttcctgtactccaagctgaccgtggacaagagccggtggcaggaaggcaacgtgttcagctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgtctctgtccctgggc SEQ ID NO:74 легкая цепь 2 antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1
(например, кодирующая четвертую полипептидную цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) gacatcgtgctgacacagagccctgccaccctgtctctgagccctggcgagagagccaccatcagctgtagagccagccagagcgtgtccagctacggccagggcttcatgcactggtatcagcagaagcccggccagccccccagactgctgatctatggcgccagcagcagagccacaggcatccccgccagattttctggctctggcagcggcaccgacttcaccctgacaatcagccccctggaacccgaggacttcgccgtgtactactgccagcagaacaaagaggacccctggaccttcggcggaggcaccaagctggaaatcaagcgtacggtggccgctcccagcgtgttcatcttcccacctagcgacgagcagctgaagtccggcacagcctctgtcgtgtgcctgctgaacaacttctacccccgcgaggccaaggtgcagtggaaggtggacaatgccctgcagagcggcaacagccaggaaagcgtgaccgagcaggacagcaaggactccacctacagcctgagcagcaccctgaccctgtccaaggccgattacgagaagcacaaggtgtacgcctgcgaagtgacccaccagggcctgtctagccccgtgaccaagagcttcaaccggggcgagtgc SEQ ID NO:75 antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1xCD28supxCD3mid IgG1LALA P329A тяжелая цепь 1 LALA P329A CD28supxCD3mid IgG1(впадина)
(например, последовательность, кодирующая вторую полипептидную цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) caggtgcagctggtgcagtctggcgccgaggtcgtgaaacctggcgcctctgtgaaggtgtcctgcaaggccagcggctacacctttaccagctactacatccactgggtgcgccaggcccctggacagggactggaatggatcggcagcatctaccccggcaacgtgaacaccaactacgcccagaagttccagggcagagccaccctgaccgtggacaccagcatcagcaccgcctacatggaactgagccggctgagaagcgacgacaccgccgtgtactactgcacccggtcccactacggcctggattggaacttcgacgtgtggggcaagggcaccaccgtgacagtgtctagcagccaggtgcagctggtggaatctggcggcggagtggtgcagcctggcagaagcctgagactgagctgtgccgccagcggcttcaccttcaccaaggcctggatgcactgggtgcgccaggcccctggaaagcagctggaatgggtggcccagatcaaggacaagagcaacagctacgccacctactacgccgacagcgtgaagggccggttcaccatcagccgggacgacagcaagaacaccctgtacctgcagatgaacagcctgcgggccgaggacaccgccgtgtactactgtcggggcgtgtactatgccctgagccccttcgattactggggccagggaaccctcgtgaccgtgtctagtcggaccgccagcacaaagggccccagcgtgttccctctggcccctagcagcaagagcacatctggcggaacagccgccctgggctgcctcgtgaaggactactttcccgagcccgtgaccgtgtcctggaattctggcgccctgaccagcggcgtgcacacctttccagctgtgctgcagtccagcggcctgtacagcctgagcagcgtcgtgacagtgcccagcagctctctgggcacccagacctacatctgcaacgtgaaccacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaggtggaacccaagagctgcgacaagacccacacctgtcccccttgtcctgcccccgaagccgccggaggcccttccgtgttcctgttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatcagccggacccccgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtcccacgaggaccctgaagtgaagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagccaagagaggaacagtacaacagcacctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaaggccctggccgcccccatcgagaaaaccatcagcaaggccaagggccagccccgcgaaccccaggtgtgcacactgcccccaagcagggacgagctgaccaagaaccaggtgtccctgagctgtgccgtgaaaggcttctacccctccgatatcgccgtggaatgggagagcaacggccagcccgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggacagcgacggctcattcttcctggtgtccaagctgacagtggacaagtcccggtggcagcagggcaacgtgttcagctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgagcctgagccccggc SEQ ID NO:76 легкая цепь 1 CD28supxCD3mid
(например, последовательность, кодирующая первую полипептидную цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) Смотри выше. SEQ ID NO:73 тяжелая цепь 2 LALA P329A antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1 IgG1(выступ)
(например, кодирующая третью полипептидную цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) caggtgcagctggtgcagtctggcgccgaagtcgtgaaacctggcgcctccgtgaaggtgtcctgcaaggccagcggctacacctttaccagctacgccatgcactgggtcaaagaggcccctggccagagactggaatggatcggctacatctaccccggccagggcggcaccaactacaaccagaagttccagggcagagccaccctgaccgccgatacaagcgccagcaccgcctacatggaactgagcagcctgcggagcgaggataccgccgtgtacttctgtgccagaacaggcggcctgaggcgggcctactttacctattggggccagggcaccctcgtgaccgtgtctagcgctagcacaaagggccccagcgtgttccctctggcccctagcagcaagagcacatctggcggaacagccgccctgggctgcctcgtgaaggactactttcccgagcccgtgaccgtgtcctggaattctggcgccctgaccagcggcgtgcacacctttccagctgtgctgcagtccagcggcctgtacagcctgagcagcgtcgtgacagtgcccagcagctctctgggcacccagacctacatctgcaacgtgaaccacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaggtggaacccaagagctgcgacaagacccacacctgtcccccttgtcctgcccccgaagccgccggaggcccttccgtgttcctgttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatcagccggacccccgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtcccacgaggaccctgaagtgaagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagccaagagaggaacagtacaacagcacctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaaggccctggccgcccccatcgagaaaaccatcagcaaggccaagggccagccccgcgaaccccaggtgtacacactgcccccatgcagggacgagctgaccaagaaccaggtgtccctgtggtgtctggtgaaaggcttctacccctccgatatcgccgtggaatgggagagcaacggccagcccgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggacagcgacggctcattcttcctgtactccaagctgacagtggacaagtcccggtggcagcagggcaacgtgttcagctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgagcctgagccccggc SEQ ID NO:77 легкая цепь 2 antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1
(например, кодирующая четвертую полипептидную цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) Смотри выше. SEQ ID NO:75 antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1xCD28supxCD3mid IgG1 NNSA тяжелая цепь 1 NNSA CD28supxCD3mid IgG1(впадина)
(например, последовательность, кодирующая вторую полипептидную цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) caggtgcagctggtgcagtctggcgccgaggtcgtgaaacctggcgcctctgtgaaggtgtcctgcaaggccagcggctacacctttaccagctactacatccactgggtgcgccaggcccctggacagggactggaatggatcggcagcatctaccccggcaacgtgaacaccaactacgcccagaagttccagggcagagccaccctgaccgtggacaccagcatcagcaccgcctacatggaactgagccggctgagaagcgacgacaccgccgtgtactactgcacccggtcccactacggcctggattggaacttcgacgtgtggggcaagggcaccaccgtgacagtgtctagcagccaggtgcagctggtggaatctggcggcggagtggtgcagcctggcagaagcctgagactgagctgtgccgccagcggcttcaccttcaccaaggcctggatgcactgggtgcgccaggcccctggaaagcagctggaatgggtggcccagatcaaggacaagagcaacagctacgccacctactacgccgacagcgtgaagggccggttcaccatcagccgggacgacagcaagaacaccctgtacctgcagatgaacagcctgcgggccgaggacaccgccgtgtactactgtcggggcgtgtactatgccctgagccccttcgattactggggccagggaaccctcgtgaccgtgtctagtcggaccgccagcacaaagggccccagcgtgttccctctggcccctagcagcaagagcacatctggcggaacagccgccctgggctgcctcgtgaaggactactttcccgagcccgtgaccgtgtcctggaattctggcgccctgaccagcggcgtgcacacctttccagctgtgctgcagtccagcggcctgtacagcctgagcagcgtcgtgacagtgcccagcagctctctgggcacccagacctacatctgcaacgtgaaccacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaggtggaacccaagagctgcgacaagacccacacctgtcccccttgtcctgcccccgaactgctgggaggcccttccgtgttcctgttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatcagccggacccccgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtcccacgaggaccctgaagtgaagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagccaagagaggaacagtacaacaatgcctcccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaaggccctgcctgcccccatcgagaaaaccatcagcaaggccaagggccagccccgcgaaccccaggtgtgcacactgcccccaagcagggacgagctgaccaagaaccaggtgtccctgagctgtgccgtgaaaggcttctacccctccgatatcgccgtggaatgggagagcaacggccagcccgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggacagcgacggctcattcttcctggtgtccaagctgacagtggacaagtcccggtggcagcagggcaacgtgttcagctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgagcctgagccccggc SEQ ID NO:78 легкая цепь 1 CD28supxCD3mid
(например, последовательность, кодирующая первую полипептидную цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) Смотри выше. SEQ ID NO:73 тяжелая цепь 2 NNSA antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1 IgG1(выступ)
(например, кодирующая третью полипептидную цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) caggtgcagctggtgcagtctggcgccgaagtcgtgaaacctggcgcctccgtgaaggtgtcctgcaaggccagcggctacacctttaccagctacgccatgcactgggtcaaagaggcccctggccagagactggaatggatcggctacatctaccccggccagggcggcaccaactacaaccagaagttccagggcagagccaccctgaccgccgatacaagcgccagcaccgcctacatggaactgagcagcctgcggagcgaggataccgccgtgtacttctgtgccagaacaggcggcctgaggcgggcctactttacctattggggccagggcaccctcgtgaccgtgtctagcgctagcacaaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtatgttgacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacaatgcctcccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatgccgggatgagctgaccaagaatcaagtcagcctgtggtgcctggtaaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctactcaaaactcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggt SEQ ID NO:79 легкая цепь 2 antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1
(например, кодирующая четвертую полипептидную цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) Смотри выше. SEQ ID NO:75 CD38_HHY1370xCD28supxCD3mid IgG4 FALA тяжелая цепь 1 FALA CD28supxCD3mid IgG4(впадина)
(например, последовательность, кодирующая вторую полипептидную цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) Смотри выше. SEQ ID NO:72 легкая цепь 1 CD28supxCD3mid
(например, последовательность, кодирующая первую полипептидную цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) Смотри выше. SEQ ID NO:73 тяжелая цепь 2 FALA CD38_HHY1370 IgG4(выступ)
(например, кодирующая третью полипептидную цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) caggtgcagctggtggaaagcggcggaggcgtggtgcagcctggcaggtctctgagactgagctgtgccgccagcggcttcaccttcagcagctacggaatgcactgggtgcgccaggcccctggcaaaggactggaatgggtggccgtgatttggtacgacggcagcaacaagtactacgccgacagcgtgaagggccggttcaccatcagcggcgacaacagcaagaacaccctgtacctgcagatgaacagcctgcgggccgaggacaccgccgtgtactactgcgccagaatgttcagaggcgccttcgactactggggccagggcacactcgtgaccgtgtctagtgcgtcgaccaagggcccatcggtgttccctctggccccttgcagcagaagcaccagcgaatctacagccgccctgggctgcctcgtgaaggactactttcccgagcccgtgaccgtgtcctggaactctggcgctctgacaagcggcgtgcacacctttccagccgtgctccagagcagcggcctgtactctctgagcagcgtcgtgacagtgcccagcagcagcctgggcaccaagacctacacctgtaacgtggaccacaagcccagcaacaccaaggtggacaagcgggtggaatctaagtacggccctccctgccctccttgcccagcccctgaagctgccggcggaccctccgtgttcctgttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatcagccggacccccgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtcccaggaagatcccgaggtgcagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagttcaacagcacctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaagggcctgcccagctccatcgagaaaaccatcagcaaggccaagggccagccccgcgagcctcaagtgtataccctgcccccttgccaggaagagatgaccaagaaccaggtgtccctgtggtgtctcgtgaaaggcttctaccccagcgacattgccgtggaatgggagagcaacggccagcccgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggacagcgacggctcattcttcctgtactccaagctgaccgtggacaagagccggtggcaggaaggcaacgtgttcagctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgtctctgtccctgggc SEQ ID NO:80 легкая цепь 2 CD38_HHY1370
(например, кодирующая четвертую полипептидную цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) gccatccagatgacccagagccccagcagcctgtctgccagcgtgggcgacagagtgaccatcacctgtagagccagccagggcatccggaacgacctgggctggtatcagcagaagcctggcaaggcccccaagctgctgatctacgccgctagctctctgcagtccggcgtgcccagcagattttctggcagcggctccggcaccgacttcaccctgacaatctctggcctgcagcccgaggacagcgccacctactactgtctgcaagactacatctactaccccaccttcggccagggcaccaaggtggaaatcaagcgtacggtggccgctcccagcgtgttcatcttcccacctagcgacgagcagctgaagtccggcacagcctctgtcgtgtgcctgctgaacaacttctacccccgcgaggccaaagtgcagtggaaggtggacaacgccctgcagagcggcaacagccaggaaagcgtgaccgagcaggacagcaaggactccacctacagcctgagcagcaccctgacactgagcaaggccgactacgagaagcacaaggtgtacgcctgcgaagtgacccaccagggcctgtctagccccgtgaccaagagcttcaaccggggcgagtgt SEQ ID NO:81 CD38_HHY1370xCD28supxCD3mid IgG1LALA P329A тяжелая цепь 1 LALA P329A CD28supxCD3mid IgG1(впадина)
(например, последовательность, кодирующая вторую полипептидную цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) Смотри выше. SEQ ID NO:76 легкая цепь 1 CD28supxCD3mid
(например, последовательность, кодирующая первую полипептидную цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) Смотри выше. SEQ ID NO:73 тяжелая цепь 2 LALA P329A CD38_HHY1370 IgG1(выступ)
(например, кодирующая третью полипептидную цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) caggtgcagctggtggaaagcggcggaggcgtggtgcagcctggcaggtctctgagactgagctgtgccgccagcggcttcaccttcagcagctacggaatgcactgggtgcgccaggcccctggcaaaggactggaatgggtggccgtgatttggtacgacggcagcaacaagtactacgccgacagcgtgaagggccggttcaccatcagcggcgacaacagcaagaacaccctgtacctgcagatgaacagcctgcgggccgaggacaccgccgtgtactactgcgccagaatgttcagaggcgccttcgactactggggccagggcacactcgtgaccgtgtctagtgcgtcgaccaagggccccagcgtgttccctctggcccctagcagcaagagcacatctggcggaacagccgccctgggctgcctcgtgaaggactactttcccgagcccgtgaccgtgtcctggaattctggcgccctgaccagcggcgtgcacacctttccagctgtgctgcagtccagcggcctgtacagcctgagcagcgtcgtgacagtgcccagcagctctctgggcacccagacctacatctgcaacgtgaaccacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaggtggaacccaagagctgcgacaagacccacacctgtcccccttgtcctgcccccgaagccgccggaggcccttccgtgttcctgttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatcagccggacccccgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtcccacgaggaccctgaagtgaagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagccaagagaggaacagtacaacagcacctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaaggccctggccgcccccatcgagaaaaccatcagcaaggccaagggccagccccgcgaaccccaggtgtacacactgcccccatgcagggacgagctgaccaagaaccaggtgtccctgtggtgtctggtgaaaggcttctacccctccgatatcgccgtggaatgggagagcaacggccagcccgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggacagcgacggctcattcttcctgtactccaagctgacagtggacaagtcccggtggcagcagggcaacgtgttcagctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgagcctgagccccggc SEQ ID NO:82 легкая цепь 2 CD38_HHY1370
(например, кодирующая четвертую полипептидную цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) Смотри выше. SEQ ID NO:81 CD38_HHY1370xCD28supxCD3mid IgG1 NNSA тяжелая цепь 1 NNSA CD28supxCD3mid IgG1(впадина)
(например, последовательность, кодирующая вторую полипептидную цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) Смотри выше. SEQ ID NO:78 легкая цепь 1 CD28supxCD3mid
(например, последовательность, кодирующая первую полипептидную цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) Смотри выше. SEQ ID NO:73 тяжелая цепь 2 NNSA CD38_HHY1370 IgG1(выступ)
(например, кодирующая третью полипептидную цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) caggtgcagctggtggaaagcggcggaggcgtggtgcagcctggcaggtctctgagactgagctgtgccgccagcggcttcaccttcagcagctacggaatgcactgggtgcgccaggcccctggcaaaggactggaatgggtggccgtgatttggtacgacggcagcaacaagtactacgccgacagcgtgaagggccggttcaccatcagcggcgacaacagcaagaacaccctgtacctgcagatgaacagcctgcgggccgaggacaccgccgtgtactactgcgccagaatgttcagaggcgccttcgactactggggccagggcacactcgtgaccgtgtctagtgcgtcgaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtatgttgacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacaatgcctcccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatgccgggatgagctgaccaagaatcaagtcagcctgtggtgcctggtaaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctactcaaaactcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggt SEQ ID NO:83 легкая цепь 2 CD38_HHY1370
(например, кодирующая четвертую полипептидную цепь триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению) Смотри выше. SEQ ID NO:81

Полипептиды CD38

[0147] В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению содержит антигенсвязывающий участок, который связывает внеклеточный домен полипептида CD38 человека и внеклеточный домен полипептида CD38 макака-крабоеда. Иллюстративные анализы для определения того, связывает ли антигенсвязывающий участок антиген, описаны в данном документе и известны в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления связывание определяют с помощью анализа ELISA, например, как это описано ниже. В некоторых вариантах осуществления связывание определяют с помощью анализа SPR, например, как это описано ниже. В некоторых вариантах осуществления связывание определяют с помощью анализа проточной цитометрии с использованием клеток, экспрессирующих полипептид CD38, на их клеточной поверхности, например, как это описано ниже.

[0148] В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению связывает очищенный полипептид или его фрагмент, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1 и/или 30 (как, например, измерено с помощью ELISA или SPR). В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению связывается с полипептидом или содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1 и/или 30 при экспрессии на поверхности клетки (как, например, измерено с помощью проточной цитометрии).

[0149] В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению связывается с полипептидом CD38 изоформы A (например, содержащим аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1). В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению связывается с полипептидом CD38 изоформы E (например, содержащим аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:105 и не содержащим полную аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1, состоящим из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:105 или состоящим по сути из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:105). В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению связывается с полипептидом CD38 изоформы A (например, содержащим аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1) и полипептидом CD38 изоформы E (например, содержащим аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:105, и не содержащим полную аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1, состоящим из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:105 или состоящим по сути из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:105). Не ограничиваясь какой-либо теорией, полагают, что связывание с полипептидом CD38 изоформы E может быть преимущественным, например, при нацеливании связывающего белка по настоящему изобретению на клетку (клетки), экспрессирующие полипептид CD38 изоформы E.

Полипептидная последовательность внеклеточного домена CD38 изоформы A человека

RWRQQWSGPGTTKRFPETVLARCVKYTEIHPEMRHVDCQSVWDAFKGAFISKHPCNITEEDYQPLMKLGTQTVPCNKILLWSRIKDLAHQFTQVQRDMFTLEDTLLGYLADDLTWCGEFNTSKINYQSCPDWRKDCSNNPVSVFWKTVSRRFAEAACDVVHVMLNGSRSKIFDKNSTFGSVEVHNLQPEKVQTLEAWVIHGGREDSRDLCQDPTIKELESIISKRNIQFSCKNIYRPDKFLQCVKNPEDSSCTSEI (SEQ ID NO:1)

Полипептидная последовательность CD38 изоформы E человека

RWRQQWSGPGTTKRFPETVLARCVKYTEIHPEMRHVDCQSVWDAFKGAFISKHPCNITEEDYQPLMKLGTQTVPCNKILLWSRIKDLAHQFTQVQRDMFTLEDTLLGYLADDLTWCGEFNTSKINYQSCPDWRKDCSNNPVSVFWKTVSRRHFWECGSP (SEQ ID NO:105)

[0150] В некоторых вариантах осуществления внеклеточный домен полипептида CD38 человека содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1. В некоторых вариантах осуществления внеклеточный домен полипептида CD38 макака-крабоеда содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:30.

Полипептидная последовательность CD38 макака-крабоеда

RWRQQWSGSGTTSRFPETVLARCVKYTEVHPEMRHVDCQSVWDAFKGAFISKYPCNITEEDYQPLVKLGTQTVPCNKTLLWSRIKDLAHQFTQVQRDMFTLEDMLLGYLADDLTWCGEFNTFEINYQSCPDWRKDCSNNPVSVFWKTVSRRFAETACGVVHVMLNGSRSKIFDKNSTFGSVEVHNLQPEKVQALEAWVIHGGREDSRDLCQDPTIKELESIISKRNIRFFCKNIYRPDKFLQCVKNPEDSSCLSGI (SEQ ID NO:30)

Линкеры

[0151] В некоторых вариантах осуществления длина линкеров L₁, L₂, L₃ и L₄ варьирует от нуля аминокислот (длина=0) до приблизительно 100 аминокислот или менее 100, 50, 40, 30, 20 или 15 аминокислот или меньше. Длина линкеров также может составлять 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислоту. Все из L₁, L₂, L₃ и L₄ в одном связывающем белке могут иметь одну и ту же аминокислотную последовательность, или все из них могут иметь разные аминокислотные последовательности.

[0152] Примеры подходящих линкеров включают одиночный глициновый (Gly) остаток; диглициновый пептид (Gly-Gly); трипептид (Gly-Gly-Gly); пептид из четырех глициновых остатков; пептид из пяти глициновых остатков; пептид из шести глициновых остатков; пептид из семи глициновых остатков и пептид из восьми глициновых остатков. Можно использовать другие комбинации аминокислотных остатков, как, например, пептид GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 55), пептид GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 56), пептид TKGPS (SEQ ID NO: 57), пептид GQPKAAP (SEQ ID NO:58), а также пептид GGSGSSGSGG (SEQ ID NO:59). Вышеперечисленные примеры не предназначены для какого-либо ограничения объема настоящего изобретения, и при этом было показано, что линкеры, содержащие выбранные случайным образом аминокислоты, выбранные из группы, состоящей из валина, лейцина, изолейцина, серина, треонина, лизина, аргинина, гистидина, аспартата, глутамата, аспарагина, глутамина, глицина и пролина, подходят для связывающих белков. Дополнительное описание линкерных последовательностей см., например, в WO2012135345 и международной заявке № PCT/US2017/027488.

[0153] Состав и последовательность аминокислотных остатков в линкере может меняться в зависимости от типа элемента вторичной структуры, который необходимо достигнуть при помощи линкера. Например, глицин, серин и аланин являются наиболее подходящими для линкеров, характеризующихся максимальной гибкостью. Некоторые комбинации глицина, пролина, треонина и серина применимы, если необходим более жесткий и удлиненный линкер. При необходимости любой аминокислотный остаток может рассматриваться как линкер в комбинации с другими аминокислотными остатками для конструирования более длинных пептидных линкеров в зависимости от требуемых свойств.

[0154] В некоторых вариантах осуществления длина по меньшей мере одного из L₁, L₂, L₃ или L₄ независимо составляет 0 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина каждого из L₁, L₂, L₃ или L₄ независимо составляет по меньшей мере одну аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления длина L₁ в по меньшей два раза превышает длину L₃. В некоторых вариантах осуществления длина L₂ в по меньшей два раза превышает длину L₄. В некоторых вариантах осуществления длина L₁ в по меньшей мере два раза превышает длину L₃, а длина L₂ в по меньшей мере два раза превышает длину L₄. В некоторых вариантах осуществления длина L₁ составляет 3-12 аминокислотных остатков, длина L₂ составляет 3-14 аминокислотных остатков, длина L₃ составляет 1-8 аминокислотных остатков, и длина L₄ составляет 1-3 аминокислотных остатка. В некоторых вариантах осуществления длина L₁ составляет 5-10 аминокислотных остатков, длина L₂ составляет 5-8 аминокислотных остатков, длина L₃ составляет 1-5 аминокислотных остатков, и длина L₄ составляет 1-2 аминокислотных остатка. В некоторых вариантах осуществления длина L₁ составляет 7 аминокислотных остатков, длина L₂ составляет 5 аминокислотных остатков, длина L₃ составляет 1 аминокислотный остаток, и длина L₄ составляет 2 аминокислотных остатка. В некоторых вариантах осуществления длина L₁ составляет 10 аминокислотных остатков, длина L₂ составляет 10 аминокислотных остатков, длина L₃ составляет 0 аминокислотных остатков, и длина L₄ составляет 0 аминокислотных остатков. В некоторых вариантах осуществления каждый из L₁, L₂, L₃ и L₄ имеет независимо выбранную длину, составляющую от 0 до 15 аминокислот (например, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 аминокислот), где по меньшей мере два линкера имеют длину 1-15 аминокислот (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 аминокислот). В некоторых вариантах осуществления длина каждого из L₁, L₂, L₃ и L₄ составляет 0 аминокислот.

[0155] В некоторых вариантах осуществления L₁, L₂, L₃ и/или L₄ содержат последовательность, полученную из встречающейся в природе последовательности в участке соединения между вариабельным доменом антитела и константным доменом антитела (например, описанной в WO2012/135345). Например, в некоторых вариантах осуществления линкер содержит последовательность, находящуюся в переходном участке между эндогенными доменами V_H и C_H1 или между эндогенными доменами V_L и C_L (например, каппа- или лямбда-цепей). В некоторых вариантах осуществления линкер содержит последовательность, находящуюся в переходном участке между эндогенными доменами V_H и C_H1 человека или между эндогенными доменами V_L и C_L человека (например, каппа- или лямбда-цепей человека).

[0156] В некоторых вариантах осуществления каждый из L₁, L₂, L₃ и L₄ независимо имеет длину, составляющую ноль аминокислот, или содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:55), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:56), S, RT, TKGPS (SEQ ID NO:57), GQPKAAP (SEQ ID NO: 58) и GGSGSSGSGG (SEQ ID NO:59). В некоторых вариантах осуществления каждый из L₁, L₂, L₃ и L₄ независимо содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:55), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:56), S, RT, TKGPS (SEQ ID NO:57), GQPKAAP (SEQ ID NO: 58) и GGSGSSGSGG (SEQ ID NO:59).

[0157] В некоторых вариантах осуществления L₁ содержит последовательность GQPKAAP (SEQ ID NO: 58), L₂ содержит последовательность TKGPS (SEQ ID NO: 57), L₃ содержит последовательность S, и L₄ содержит последовательность RT. В некоторых вариантах осуществления L₁ содержит последовательность GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 55), L₂ содержит последовательность GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 55), длина L₃ составляет 0 аминокислот, и длина L₄ составляет 0 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления L₁ содержит последовательность GGSGSSGSGG (SEQ ID NO: 59), L₂ содержит последовательность GGSGSSGSGG (SEQ ID NO: 59), длина L₃ составляет 0 аминокислот, и длина L₄ составляет 0 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления L₁ содержит последовательность GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 56), длина L₂ составляет 0 аминокислот, L₃ содержит последовательность GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 56), и длина L₄ составляет 0 аминокислот.

Fc-участки и константные домены

[0158] В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению содержит полноразмерную тяжелую цепь антитела или полипептидную цепь, содержащую Fc-участок. В некоторых вариантах осуществления Fc-участок представляет собой Fc-участок человека, например, Fc-участок IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека. В некоторых вариантах осуществления Fc-участок включает шарнирный участок, C_H1, C_H2, C_H3 и необязательно домены C_H4. В некоторых вариантах осуществления Fc-участок представляет собой Fc-участок IgG1 человека. В некоторых вариантах осуществления Fc-участок представляет собой Fc-участок IgG4 человека. В некоторых вариантах осуществления Fc-участок содержит одну или несколько мутаций, описанных ниже.

[0159] В некоторых вариантах осуществления связывающий белок согласно настоящему изобретению содержит один или два варианта Fc. Термин "вариант Fc", используемый в данном документе, обозначает молекулу или последовательность, которая модифицирована по сравнению с нативным Fc, но все еще содержит участок связывания для рецептора реутилизации FcRn (неонатального Fc-рецептора). Приводимые в качестве примера варианты Fc и их взаимодействие с рецептором реутилизации известны в данной области техники. Таким образом, термин "вариант Fc" может предусматривать молекулу или последовательность, полученную в результате гуманизации нативного Fc отличного от человеческого происхождения. Кроме того, нативный Fc содержит участки, которые можно удалить, поскольку они обеспечивают структурные признаки или биологическую активность, которые не требуются для антителоподобных связывающих белков согласно настоящему изобретению. Таким образом, термин "вариант Fc" предусматривает молекулу или последовательность, в которой отсутствует один или несколько участков или остатков нативного Fc или в которой были модифицированы один или несколько участков или остатков Fc, воздействующих на или вовлеченных в: (1) образование дисульфидной связи, (2) несовместимость с выбранной клеткой-хозяином, (3) гетерогенность N-концов при экспрессии в выбранной клетке-хозяине, (4) гликозилирование, (5) взаимодействие с системой комплемента, (6) связывание с Fc-рецептором, отличным от рецептора реутилизации, или (7) антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC).

[0160] В некоторых вариантах осуществления Fc-участок содержит одну или несколько мутаций, которые уменьшают или устраняют связывание Fc-рецептора и/или эффекторную функцию Fc-участка (например, антителозависимый клеточный фагоцитоз, опосредованный Fc-рецепторами (ADCP), комплементзависимую цитотоксичность (CDC) и/или антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC)).

[0161] В некоторых вариантах осуществления Fc-участок представляет собой Fc-участок IgG1 человека, содержащий одну или несколько аминокислотных замен в положениях, соответствующих положениям 234, 235 и/или 329 IgG1 человека в соответствии с EU-индексом. В некоторых вариантах осуществления аминокислотные замены представляют собой L234A, L235A и/или P329A. В некоторых вариантах осуществления Fc-участок представляет собой Fc-участок IgG1 человека, содержащий аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 298, 299 и/или 300 IgG1 человека в соответствии с EU-индексом. В некоторых вариантах осуществления аминокислотные замены представляют собой S298N, T299A и/или Y300S.

[0162] В некоторых вариантах осуществления Fc-участок представляет собой Fc-участок IgG4 человека, содержащий одну или несколько мутаций, которые ослабляют или устраняют связывание FcγI и/или FcγII. В некоторых вариантах осуществления Fc-участок представляет собой Fc-участок IgG4 человека, содержащий одну или несколько мутаций, которые ослабляют или устраняют связывание FcγI и/или FcγII, но не влияют на связывание FcRn. В некоторых вариантах осуществления Fc-участок представляет собой Fc-участок IgG4 человека, содержащий аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 228 и/или 409 IgG4 человека в соответствии с EU-индексом. В некоторых вариантах осуществления аминокислотные замены представляют собой S228P и/или R409K. В некоторых вариантах осуществления Fc-участок представляет собой Fc-участок IgG4 человека, содержащий аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 234 и/или 235 IgG4 человека в соответствии с EU-индексом. В некоторых вариантах осуществления аминокислотные замены представляют собой F234A и/или L235A. В некоторых вариантах осуществления Fc-участок представляет собой Fc-участок IgG4 человека, содержащий аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 228, 234, 235 и/или 409 IgG4 человека в соответствии с EU-индексом. В некоторых вариантах осуществления аминокислотные замены представляют собой S228P, F234A, L235A и/или R409K. В некоторых вариантах осуществления Fc-участок представляет собой Fc-участок IgG4 человека, содержащий аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 233-236 IgG4 человека в соответствии с EU-индексом. В некоторых вариантах осуществления аминокислотные замены представляют собой E233P, F234V, L235A, и делецию в положении 236. В некоторых вариантах осуществления Fc-участок представляет собой Fc-участок IgG4 человека, содержащий аминокислотные мутации в положениях, соответствующих положениям 228, 233-236 и/или 409 IgG4 человека в соответствии с EU-индексом. В некоторых вариантах осуществления аминокислотные мутации представляют собой S228P; E233P, F234V, L235A, и делецию в положении 236; и/или R409K.

[0163] В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению содержит одну или несколько мутаций для улучшения очистки, например, путем модулирования аффинности к реагенту для очистки. Например, известно, что гетеродимерные связывающие белки можно избирательно очищать от их гомодимерных форм, если один из двух Fc-участков гетеродимерной формы содержит мутацию (мутации), которая (которые) ослабляют или устраняют связывание с белком A, поскольку гетеродимерная форма будет характеризоваться промежуточной аффинностью к средству для очистки на основе белка A по сравнению с любой гомодимерной формой и может быть избирательно элюирована с белка A, например, путем использования другого значения pH (см., например, Smith, E.J. et al. (2015) Sci. Rep.5:17943). В некоторых вариантах осуществления мутация предусматривает замены в положениях, соответствующих положениям 435 и 436 IgG1 или IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой H435R и Y436F. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок содержит вторую полипептидную цепь, дополнительно содержащую первый Fc-участок, связанный с C_H1, при этом первый Fc-участок содержит шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены C_H2 и C_H3 тяжелой цепи иммуноглобулина, и при этом третья полипептидная цепь дополнительно содержит второй Fc-участок, связанный с C_H1, при этом второй Fc-участок содержит шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены C_H2 и C_H3 тяжелой цепи иммуноглобулина; и где только один из первого и второго Fc-участков содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 435 и 436 IgG1 или IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой H435R и Y436F. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению содержит мутации по типу выступа и впадины и одну или несколько мутаций для улучшения очистки. В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй Fc-участки представляют собой Fc-участки IgG1 человека. В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй Fc-участки представляют собой Fc-участки IgG4 человека.

[0164] В некоторых вариантах осуществления один или оба Fc-участка представляют собой Fc-участки IgG4 человека, содержащие аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 233-236 IgG4 человека в соответствии с EU-индексом. В некоторых вариантах осуществления аминокислотные замены представляют собой E233P, F234V, L235A, и делецию в положении 236. В некоторых вариантах осуществления Fc-участки представляют собой Fc-участки IgG4 человека, содержащие аминокислотные мутации в положениях, соответствующих положениям 228, 233-236 и/или 409 IgG4 человека в соответствии с EU-индексом. В некоторых вариантах осуществления аминокислотные мутации представляют собой S228P; E233P, F234V, L235A, и делецию в положении 236; и/или R409K. В некоторых вариантах осуществления один или оба Fc-участка представляют собой Fc-участки IgG1 человека, содержащие одну или несколько аминокислотных замен в положениях, соответствующих положениям 234, 235 и/или 329 IgG1 человека в соответствии с EU-индексом. В некоторых вариантах осуществления аминокислотные замены представляют собой L234A, L235A и/или P329A. В некоторых вариантах осуществления Fc-участки представляют собой Fc-участки IgG1 человека, содержащие аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 298, 299 и/или 300 IgG1 человека в соответствии с EU-индексом. В некоторых вариантах осуществления аминокислотные замены представляют собой S298N, T299A и/или Y300S.

[0165] Для повышения выхода некоторых связывающих белков (например, биспецифических или триспецифических связывающих белков) домены C_H3 можно изменить с помощью технологии "выступ-во-впадине", которая описана подробно с несколькими примерами, например, в международной публикации № WO 96/027011, Ridgway et al., 1996, Protein Eng. 9: 617-21; и Merchant et al., 1998, Nat. Biotechnol. 16: 677-81. В частности, взаимодействующие поверхности двух доменов C_H3 изменяют для повышения гетеродимеризации обеих тяжелых цепей, содержащих эти два домена C_H3. Каждый из двух доменов C_H3 (из двух тяжелых цепей) может представлять собой "выступ", тогда как другой представляет собой "впадину". Введение дисульфидного мостика дополнительно стабилизирует гетеродимеры (Merchant et al., 1998; Atwell et al., 1997, J. Mol. Biol. 270: 26-35) и повышает выход. В определенных вариантах осуществления выступ находится на второй паре полипептидов с одним вариабельным доменом. В других вариантах осуществления выступ находится на первой паре полипептидов, характеризующихся перекрестной ориентацией. В еще одних вариантах осуществления домены C_H3 не содержат "выступ-во-впадине".

[0166] В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению (например, триспецифический связывающий белок) содержит мутацию по типу "выступа" на второй полипептидной цепи и мутацию по типу "впадины" на третьей полипептидной цепи. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок согласно настоящему изобретению содержит мутацию по типу "выступа" на третьей полипептидной цепи и мутацию по типу "впадины" на второй полипептидной цепи. В некоторых вариантах осуществления мутация по типу "выступа" предусматривает замену (замены) в положениях, соответствующих положениям 354 и/или 366 IgG1 или IgG4 человека в соответствии с EU-индексом. В некоторых вариантах осуществления аминокислотные замены представляют собой S354C, T366W, T366Y, S354C и T366W или S354C и T366Y. В некоторых вариантах осуществления мутация по типу "выступа" предусматривает замены в положениях, соответствующих положениям 354 и 366 IgG1 или IgG4 человека в соответствии с EU-индексом. В некоторых вариантах осуществления аминокислотные замены представляют собой S354C и T366W. В некоторых вариантах осуществления мутация по типу "впадины" предусматривает замену(замены) в положениях, соответствующих положениям 407 и необязательно 349, 366 и/или 368 IgG1 или IgG4 человека в соответствии с EU-индексом. В некоторых вариантах осуществления аминокислотные замены представляют собой Y407V или Y407T и необязательно Y349C, T366S и/или L368A. В некоторых вариантах осуществления мутация по типу "впадины" предусматривает замены в положениях, соответствующих положениям 349, 366, 368 и 407 IgG1 или IgG4 человека в соответствии с EU-индексом. В некоторых вариантах осуществления аминокислотные замены представляют собой Y349C, T366S, L368A и Y407V.

[0167] В некоторых вариантах осуществления вторая полипептидная цепь дополнительно содержит первый Fc-участок, связанный с CH1, при этом первый Fc-участок содержит шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены CH2 и CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, где первый Fc-участок содержит аминокислотную (аминокислотные) замену (замены) в положениях, соответствующих положениям 366 и необязательно 354 IgG1 или IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой T366W или T366Y и необязательно S354C; и где третья полипептидная цепь дополнительно содержит второй Fc-участок, связанный с CH1, при этом второй Fc-участок содержит шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены CH2 и CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, где второй Fc-участок содержит аминокислотную (аминокислотные) замену (замены) в положениях, соответствующих положениям 407 и необязательно 349, 366 и/или 368 IgG1 или IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой Y407V или Y407T и необязательно Y349C, T366S и/или L368A.

[0168] В некоторых вариантах осуществления вторая полипептидная цепь дополнительно содержит первый Fc-участок, связанный с CH1, при этом первый Fc-участок содержит шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены CH2 и CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, где первый Fc-участок содержит аминокислотную (аминокислотные) замену (замены) в положениях, соответствующих положениям 407 и необязательно 349, 366 и/или 368 IgG1 или IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой Y407V или Y407T и необязательно Y349C, T366S и/или L368A; и где третья полипептидная цепь дополнительно содержит второй Fc-участок, связанный с CH1, при этом второй Fc-участок содержит шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены CH2 и CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, где второй Fc-участок содержит аминокислотную (аминокислотные) замену (замены) в положениях, соответствующих положениям 366 и необязательно 354 IgG1 или IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой T366W или T366Y и необязательно S354C.

[0169] В некоторых вариантах осуществления вторая полипептидная цепь дополнительно содержит первый Fc-участок, связанный с CH1, при этом первый Fc-участок содержит шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены CH2 и CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, где первый Fc-участок содержит аминокислотную замену в положении, соответствующем положению 366 IgG1 или IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотная замена представляет собой T366W; и где третья полипептидная цепь дополнительно содержит второй Fc-участок, связанный с CH1, при этом второй Fc-участок содержит шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены CH2 и CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, где второй Fc-участок содержит аминокислотную (аминокислотные) замену (замены) в положениях, соответствующих положениям 366, 368 и/или 407 IgG1 или IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой T366S, L368A и/или Y407V.

[0170] В некоторых вариантах осуществления вторая полипептидная цепь дополнительно содержит первый Fc-участок, связанный с CH1, при этом первый Fc-участок содержит шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены CH2 и CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, где первый Fc-участок содержит аминокислотную (аминокислотные) замену (замены) в положениях, соответствующих положениям 366, 368 и/или 407 IgG1 или IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой T366S, L368A и/или Y407V; и где третья полипептидная цепь дополнительно содержит второй Fc-участок, связанный с CH1, при этом второй Fc-участок содержит шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены CH2 и CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, где второй Fc-участок содержит аминокислотную замену в положении, соответствующем положению 366 IgG1 или IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотная замена представляет собой T366W.

[0171] В некоторых вариантах осуществления вторая полипептидная цепь дополнительно содержит первый Fc-участок, связанный с CH1, при этом первый Fc-участок содержит шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены CH2 и CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, где первый Fc-участок содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 354 и 366 IgG1 или IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой S354C и T366W; и где третья полипептидная цепь дополнительно содержит второй Fc-участок, связанный с CH1, при этом второй Fc-участок содержит шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены CH2 и CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, где второй Fc-участок содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 349, 366, 368 и 407 IgG1 или IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой Y349C, T366S, L368A и Y407V. В некоторых вариантах осуществления вторая полипептидная цепь дополнительно содержит первый Fc-участок, связанный с CH1, при этом первый Fc-участок содержит шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены CH2 и CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, где первый Fc-участок содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 349, 366, 368 и 407 IgG1 или IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой Y349C, T366S, L368A и Y407V; и где третья полипептидная цепь дополнительно содержит второй Fc-участок, связанный с CH1, при этом второй Fc-участок содержит шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены CH2 и CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, где второй Fc-участок содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 354 и 366 IgG1 или IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой S354C и T366W. В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй Fc-участки представляют собой Fc-участки IgG1 человека. В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй Fc-участки представляют собой Fc-участки IgG4 человека.

[0172] В некоторых вариантах осуществления вторая полипептидная цепь дополнительно содержит первый Fc-участок, связанный с CH1, где первый Fc-участок представляет собой Fc-участок IgG4 человека, содержащий шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены CH2 и CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, где первый Fc-участок содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 228, 354, 366 и 409 IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой S228P, S354C, T366W и R409K; и где третья полипептидная цепь дополнительно содержит второй Fc-участок, связанный с CH1, где второй Fc-участок представляет собой Fc-участок IgG4 человека, содержащий шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены CH2 и CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, где второй Fc-участок содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 228, 349, 366, 368, 407 и 409 IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой S228P, Y349C, T366S, L368A, Y407V и R409K. В некоторых вариантах осуществления вторая полипептидная цепь дополнительно содержит первый Fc-участок, связанный с CH1, где первый Fc-участок представляет собой Fc-участок IgG4 человека, содержащий шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены CH2 и CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, где первый Fc-участок содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 228, 349, 366, 368, 407 и 409 IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой S228P, Y349C, T366S, L368A, Y407V и R409K; и где третья полипептидная цепь дополнительно содержит второй Fc-участок, связанный с CH1, где второй Fc-участок представляет собой Fc-участок IgG4 человека, содержащий шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены CH2 и CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, где второй Fc-участок содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 228, 354, 366 и 409 IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой S228P, S354C, T366W и R409K.

[0173] В некоторых вариантах осуществления вторая полипептидная цепь дополнительно содержит первый Fc-участок, связанный с CH1, где первый Fc-участок представляет собой Fc-участок IgG4 человека, содержащий шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены CH2 и CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, где первый Fc-участок содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 234, 235, 354 и 366 IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой F234A, L235A, S354C и T366W; и где третья полипептидная цепь дополнительно содержит второй Fc-участок, связанный с CH1, где второй Fc-участок представляет собой Fc-участок IgG4 человека, содержащий шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены CH2 и CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, где второй Fc-участок содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 234, 235, 349, 366, 368 и 407 IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой F234A, L235A, Y349C, T366S, L368A и Y407V. В некоторых вариантах осуществления вторая полипептидная цепь дополнительно содержит первый Fc-участок, связанный с CH1, где первый Fc-участок представляет собой Fc-участок IgG4 человека, содержащий шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены CH2 и CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, где первый Fc-участок содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 234, 235, 349, 366, 368 и 407 IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой F234A, L235A, Y349C, T366S, L368A и Y407V; и где третья полипептидная цепь дополнительно содержит второй Fc-участок, связанный с CH1, где второй Fc-участок представляет собой Fc-участок IgG4 человека, содержащий шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены CH2 и CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, где второй Fc-участок содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 234, 235, 354 и 366 IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой F234A, L235A, S354C и T366W.

[0174] В некоторых вариантах осуществления вторая полипептидная цепь дополнительно содержит первый Fc-участок, связанный с CH1, где первый Fc-участок представляет собой Fc-участок IgG4 человека, содержащий шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены CH2 и CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, где первый Fc-участок содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 228, 234, 235, 354, 366 и 409 IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой S228P, F234A, L235A, S354C, T366W и R409K; и где третья полипептидная цепь дополнительно содержит второй Fc-участок, связанный с CH1, где второй Fc-участок представляет собой Fc-участок IgG4 человека, содержащий шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены CH2 и CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, где второй Fc-участок содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 228, 234, 235, 349, 366, 368, 407 и 409 IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой S228P, F234A, L235A, Y349C, T366S, L368A, Y407V и R409K. В некоторых вариантах осуществления вторая полипептидная цепь дополнительно содержит первый Fc-участок, связанный с CH1, где первый Fc-участок представляет собой Fc-участок IgG4 человека, содержащий шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены CH2 и CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, где первый Fc-участок содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 228, 234, 235, 349, 366, 368, 407 и 409 IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой S228P, F234A, L235A, Y349C, T366S, L368A, Y407V и R409K; и где третья полипептидная цепь дополнительно содержит второй Fc-участок, связанный с CH1, где второй Fc-участок представляет собой Fc-участок IgG4 человека, содержащий шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены CH2 и CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, где второй Fc-участок содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 228, 234, 235, 354, 366 и 409 IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой S228P, F234A, L235A, S354C, T366W и R409K.

[0175] В некоторых вариантах осуществления связывающий белок согласно настоящему изобретению содержит одну или несколько мутаций для увеличения периода полужизни в сыворотке крови (см., например, Hinton, P.R. et al. (2006) J. Immunol. 176(1):346-56). В некоторых вариантах осуществления мутация предусматривает замены в положениях, соответствующих положениям 428 и 434 IgG1 или IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой M428L и N434S. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок содержит вторую полипептидную цепь, дополнительно содержащую первый Fc-участок, связанный с CH1, при этом первый Fc-участок содержит шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены CH2 и CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, и при этом третья полипептидная цепь дополнительно содержит второй Fc-участок, связанный с CH1, при этом второй Fc-участок содержит шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены CH2 и CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, где первый и/или второй Fc-участки содержат аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 428 и 434 IgG1 или IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой M428L и N434S. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок согласно настоящему изобретению содержит мутации по типу выступа и впадины и одну или несколько мутаций для увеличения периода полужизни в сыворотке крови. В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй Fc-участки представляют собой Fc-участки IgG1 человека. В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй Fc-участки представляют собой Fc-участки IgG4 человека.

[0176] В некоторых вариантах осуществления связывающий белок согласно настоящему изобретению содержит одну или несколько мутаций для улучшения стабильности, например, шарнирного участка и/или поверхности контакта димера IgG4 (см., например, Spiess, C. et al. (2013) J. Biol. Chem. 288:26583-26593). В некоторых вариантах осуществления мутация предусматривает замены в положениях, соответствующих положениям 228 и 409 IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой S228P и R409K. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок содержит вторую полипептидную цепь, дополнительно содержащую первый Fc-участок, связанный с C_H1, при этом первый Fc-участок содержит шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены C_H2 и C_H3 тяжелой цепи иммуноглобулина, и при этом третья полипептидная цепь дополнительно содержит второй Fc-участок, связанный с C_H1, при этом второй Fc-участок содержит шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены C_H2 и C_H3 тяжелой цепи иммуноглобулина; где первый и второй Fc-участки представляют собой Fc-участки IgG4 человека; и где каждый из первого и второго Fc-участков содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 228 и 409 IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой S228P и R409K. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению содержит мутации по типу выступа и впадины и одну или несколько мутаций для улучшения стабильности. В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй Fc-участки представляют собой Fc-участки IgG4 человека.

[0177] В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению содержит одну или несколько мутаций для улучшения очистки, например, путем модулирования аффинности к реагенту для очистки. Например, известно, что гетеродимерные связывающие белки можно избирательно очищать от их гомодимерных форм, если один из двух Fc-участков гетеродимерной формы содержит мутацию (мутации), которая (которые) ослабляют или устраняют связывание с белком A, поскольку гетеродимерная форма будет характеризоваться промежуточной аффинностью к средству для очистки на основе белка A по сравнению с любой гомодимерной формой и может быть избирательно элюирована с белка A, например, путем использования другого значения pH (см., например, Smith, E.J. et al. (2015) Sci. Rep.5:17943). В некоторых вариантах осуществления мутация предусматривает замены в положениях, соответствующих положениям 435 и 436 IgG1 или IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой H435R и Y436F. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок содержит вторую полипептидную цепь, дополнительно содержащую первый Fc-участок, связанный с C_H1, при этом первый Fc-участок содержит шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены C_H2 и C_H3 тяжелой цепи иммуноглобулина, и при этом третья полипептидная цепь дополнительно содержит второй Fc-участок, связанный с C_H1, при этом второй Fc-участок содержит шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены C_H2 и C_H3 тяжелой цепи иммуноглобулина; и где только один из первого и второго Fc-участков содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 435 и 436 IgG1 или IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой H435R и Y436F. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению содержит мутации по типу выступа и впадины и одну или несколько мутаций для улучшения очистки. В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй Fc-участки представляют собой Fc-участки IgG1 человека. В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй Fc-участки представляют собой Fc-участки IgG4 человека.

[0178] В некоторых вариантах осуществления связывающий белок согласно настоящему изобретению содержит одну или несколько мутаций для увеличения периода полужизни в сыворотке крови (см., например, Hinton, P.R. et al. (2006) J. Immunol. 176(1):346-56). В некоторых вариантах осуществления мутация предусматривает замены в положениях, соответствующих положениям 428 и 434 IgG1 или IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой M428L и N434S. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок содержит вторую полипептидную цепь, дополнительно содержащую первый Fc-участок, связанный с CH1, при этом первый Fc-участок содержит шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены CH2 и CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, и при этом третья полипептидная цепь дополнительно содержит второй Fc-участок, связанный с CH1, при этом второй Fc-участок содержит шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены CH2 и CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, где первый и/или второй Fc-участки содержат аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 428 и 434 IgG1 или IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой M428L и N434S. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок согласно настоящему изобретению содержит мутации по типу выступа и впадины и одну или несколько мутаций для увеличения периода полужизни в сыворотке крови. В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй Fc-участки представляют собой Fc-участки IgG1 человека. В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй Fc-участки представляют собой Fc-участки IgG4 человека.

[0179] В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению содержит одну или несколько мутаций для снижения эффекторной функции, например, антителозависимого клеточного фагоцитоза, опосредованного Fc-рецепторами (ADCP), комплементзависимой цитотоксичности (CDC) и/или антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC). В некоторых вариантах осуществления вторая полипептидная цепь дополнительно содержит первый Fc-участок, связанный с C_H1, при этом первый Fc-участок содержит шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены C_H2 и C_H3 тяжелой цепи иммуноглобулина; где третья полипептидная цепь дополнительно содержит второй Fc-участок, связанный с C_H1, при этом второй Fc-участок содержит шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены C_H2 и C_H3 тяжелой цепи иммуноглобулина; где первый и второй Fc-участки представляют собой Fc-участки IgG1 человека; и где каждый из первого и второго Fc-участков содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 234 и 235 IgG1 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой L234A и L235A. В некоторых вариантах осуществления Fc-участки второй и третьей полипептидных цепей представляют собой Fc-участки IgG1 человека, и при этом каждый из Fc-участков содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 234 и 235 IgG1 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой L234A и L235A. В некоторых вариантах осуществления вторая полипептидная цепь дополнительно содержит первый Fc-участок, связанный с C_H1, при этом первый Fc-участок содержит шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены C_H2 и C_H3 тяжелой цепи иммуноглобулина; где третья полипептидная цепь дополнительно содержит второй Fc-участок, связанный с C_H1, при этом второй Fc-участок содержит шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены C_H2 и C_H3 тяжелой цепи иммуноглобулина; где первый и второй Fc-участки представляют собой Fc-участки IgG1 человека; и где каждый из первого и второго Fc-участков содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 234, 235 и 329 IgG1 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой L234A, L235A и P329A. В некоторых вариантах осуществления Fc-участки второй и третьей полипептидных цепей представляют собой Fc-участки IgG1 человека, и где каждый из Fc-участков содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 234, 235 и 329 IgG1 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой L234A, L235A и P329A. В некоторых вариантах осуществления Fc-участки второй и третьей полипептидных цепей представляют собой Fc-участки IgG4 человека, и каждый из Fc-участков содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 234 и 235 IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой F234A и L235A. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок содержит вторую полипептидную цепь, дополнительно содержащую первый Fc-участок, связанный с C_H1, при этом первый Fc-участок содержит шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены C_H2 и C_H3 тяжелой цепи иммуноглобулина, и при этом третья полипептидная цепь дополнительно содержит второй Fc-участок, связанный с C_H1, при этом второй Fc-участок содержит шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены C_H2 и C_H3 тяжелой цепи иммуноглобулина; и где каждый из первого и второго Fc-участков содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 234 и 235 IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой F234A и L235A.

[0180] В некоторых вариантах осуществления связывающий белок по настоящему изобретению содержит мутации по типу выступа и впадины и одну или несколько мутаций для снижения эффекторной функции. В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй Fc-участки представляют собой Fc-участки IgG1 человека. В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй Fc-участки представляют собой Fc-участки IgG4 человека. Для дальнейшего описания Fc-мутаций в положении 329, см., например, Shields, R.L. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604 и WO1999051642.

[0181] В некоторых вариантах осуществления типы мутаций, описанные выше, можно комбинировать в любом порядке или комбинации. Например, связывающий белок по настоящему изобретению может содержать две или более мутаций по типу "выступа" и "впадины", одну или несколько мутаций для увеличения периода полужизни в сыворотке крови, одну или несколько мутаций для улучшения стабильности IgG4, одну или несколько мутаций для улучшения очистки и/или одну или несколько мутаций для снижения эффекторной функции, описанных выше.

Нуклеиновые кислоты

[0182] Стандартные технологии рекомбинантной ДНК применяют для конструирования полинуклеотидов, которые кодируют полипептиды, образующие связывающие белки, встраивания этих полинуклеотидов в рекомбинантные векторы экспрессии и введения таких векторов в клетки-хозяева. См., например, Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd ed.). Ферментативные реакции и методики очистки можно проводить в соответствии со спецификациями производителей, которые обычно выполняют в данной области техники или как описано в данном документе. Если не предусмотрены конкретные определения, то терминология, используемая в контексте аналитической химии, синтетической органической химии и медицинской и фармацевтической химии, а также лабораторные процедуры и их методики, описанные в данном документе, являются общеизвестными и широко используемыми в данной области техники. Аналогично традиционные методики можно использовать для вариантов химического синтеза, вариантов химического анализа, фармацевтического получения, составления, доставки и лечения пациентов.

[0183] Другие аспекты настоящего изобретения относятся к выделенным молекулам нуклеиновой кислоты, содержащим нуклеотидную последовательность, кодирующую любой из связывающих белков, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления выделенные молекулы нуклеиновой кислоты содержат последовательность, которая на меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична последовательностям под SEQ ID NO:60-83 и/или представленным в таблице J.

[0184] Определенные аспекты настоящего изобретения относятся к наборам полинуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления один или несколько полинуклеотидов представляют собой вектор (например, вектор экспрессии). Наборы могут найти применение помимо прочего в получении одного или нескольких связывающих белков, описанных в данном документе, например, триспецифического связывающего белка по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления набор содержит один, два, три или четыре полинуклеотида, показанных в таблице J (например, antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1xCD28supxCD3mid IgG4 FALA, antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1xCD28supxCD3mid IgG1LALA P329A, antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1xCD28supxCD3mid IgG1 NNSA, CD38_HHY1370xCD28supxCD3mid IgG4 FALA, CD38_HHY1370xCD28supxCD3mid IgG1LALA P329A или CD38_HHY1370CD28supxCD3mid IgG1 NNSA). В некоторых вариантах осуществления набор полинуклеотидов содержит первый полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:73, второй полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:72, третий полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:74, и четвертый полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:75. В некоторых вариантах осуществления набор полинуклеотидов содержит первый полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:73, второй полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:76, третий полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:77, и четвертый полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:75. В некоторых вариантах осуществления набор полинуклеотидов содержит первый полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:73, второй полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:78, третий полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:79, и четвертый полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:75. В некоторых вариантах осуществления набор полинуклеотидов содержит первый полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:73, второй полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:72, третий полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:80, и четвертый полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:81. В некоторых вариантах осуществления набор полинуклеотидов содержит первый полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:73, второй полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:76, третий полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:82, и четвертый полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:81. В некоторых вариантах осуществления набор полинуклеотидов содержит первый полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:73, второй полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:78, третий полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:83, и четвертый полинуклеотид, содержащий последовательность под SEQ ID NO:81.

[0185] В некоторых вариантах осуществления выделенная нуклеиновая кислота функционально связана с гетерологичным промотором для управления транскрипцией последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей связывающий белок. Промотор может относиться к контролирующим последовательностям нуклеиновой кислоты, которые управляют транскрипцией нуклеиновой кислоты. Первая последовательность нуклеиновой кислоты функционально связана со второй последовательностью нуклеиновой кислоты, где первая последовательность нуклеиновой кислоты находится в функциональной связи со второй последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, промотор функционально связан с последовательностью, кодирующей связывающий белок, если промотор влияет на транскрипцию или экспрессию кодирующей последовательности. Примеры промоторов могут включать без ограничения промоторы, полученные из геномов вирусов (таких как вирус полиомы, вирус оспы кур, аденовирус (такой как аденовирус 2), вирус папилломы крупного рогатого скота, вирус саркомы птиц, цитомегаловирус, ретровирус, вирус гепатита B, вирус обезьян 40 (SV40) и т. п.), гетерологичные промоторы эукариот (такие как промотор гена актина, промотор гена иммуноглобулина, промоторы генов белков теплового шока и т. п.), CAG-промотор (Niwa et al., Gene 108(2):193-9, 1991), промотор гена фосфоглицераткиназы (PGK), индуцируемый тетрациклином промотор (Masui et al., Nucleic Acids Res. 33:e43, 2005), lac-систему, trp-систему, tac-систему, trc-систему, основные операторные и промоторные участки лямбда-фага, промотор гена 3-фосфоглицераткиназы, промоторы гена кислой фосфатазы дрожжей и промотор гена альфа-фактора спаривания дрожжей. Полинуклеотиды, кодирующие по белки согласно настоящему изобретению, могут находиться под контролем конститутивного промотора, индуцируемого промотора или любого другого подходящего промотора, описанного в данном документе, или другого подходящего промотора, который легко распознает специалист в данной области техники.

[0186] В некоторых вариантах осуществления выделенную нуклеиновую кислоту встраивают в вектор. В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой вектор экспрессии. Векторы экспрессии могут содержать одну или несколько регуляторных последовательностей, функционально связанных с полинуклеотидом, подлежащим экспрессии. Термин "регуляторная последовательность" включает промоторы, энхансеры и другие элементы, контролирующие экспрессию (например, сигналы полиаденилирования). Примеры подходящих энхансеров могут включать без ограничения энхансерные последовательности из генов млекопитающих (таких как гены глобина, эластазы, альбумина, α-фетопротеина, инсулина и т. п.) и энхансерные последовательности из вируса эукариотических клеток (такие как энхансер SV40 на участке позднего начала репликации (100-270 п. о.), ранний промотор/энхансер цитомегаловируса, энхансер полиомы на участке позднего начала репликации, энхансеры аденовирусов и т. п.). Примеры подходящих векторов могут включать, например, плазмиды, космиды, эписомы, транспозоны и вирусные векторы (например, векторы на основе аденовируса, вируса осповакцины, вируса Синдбис, вируса кори, вируса герпеса, лентивируса, ретровируса, аденоассоциированного вируса и т. д.). Векторы экспрессии можно применять для трансфекции клеток-хозяев, таких как, например, клетки бактерий, клетки дрожжей, клетки насекомых и клетки млекопитающих. Биологически функциональные векторы на основе ДНК вируса и плазмидной ДНК, способные экспрессироваться и реплицироваться в хозяине, известны в данной области техники и могут применяться для трансфекции любой клетки, представляющей интерес.

[0187] Другие аспекты настоящего изобретения относятся к векторной системе, содержащей один или несколько векторов, кодирующих первую, вторую, третью и четвертую полипептидные цепи любого из связывающих белков, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления векторная система содержит первый вектор, кодирующий первую полипептидную цепь связывающего белка, второй вектор, кодирующий вторую полипептидную цепь связывающего белка, третий вектор, кодирующий третью полипептидную цепь связывающего белка, и четвертый вектор, кодирующий четвертую полипептидную цепь связывающего белка. В некоторых вариантах осуществления векторная система содержит первый вектор, кодирующий первую и вторую полипептидные цепи связывающего белка, и второй вектор, кодирующий третью и четвертую полипептидные цепи связывающего белка. В некоторых вариантах осуществления векторная система содержит первый вектор, кодирующий первую и третью полипептидные цепи связывающего белка, и второй вектор, кодирующий вторую и четвертую полипептидные цепи связывающего белка. В некоторых вариантах осуществления векторная система содержит первый вектор, кодирующий первую и четвертую полипептидные цепи связывающего белка, и второй вектор, кодирующий вторую и третью полипептидные цепи связывающего белка. В некоторых вариантах осуществления векторная система содержит первый вектор, кодирующий первую, вторую, третью и четвертую полипептидные цепи связывающего белка. Один или несколько векторов векторной системы могут представлять собой любые из векторов, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления один или несколько векторов представляют собой векторы экспрессии.

Выделенные клетки-хозяева

[0188] Другие аспекты настоящего изобретения относятся к выделенной клетке-хозяину, содержащей один или несколько выделенных полинуклеотидов, наборов полинуклеотидов, векторов и/или векторных систем, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой клетку бактерии (например, клетку E. coli). В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой клетку дрожжей (например, клетку S. cerevisiae). В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой клетку насекомого. Примеры клеток-хозяев насекомого могут включать, например, клетки Drosophila (например, клетки S2), клетки Trichoplusia ni (например, клетки High Five^™) и клетки Spodoptera frugiperda (например, клетки Sf21 или Sf9). В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой клетку млекопитающего. Примеры клеток-хозяев млекопитающего могут включать, например, клетки почки эмбриона человека (например, клетки 293 или клетки 293, субклонированные для роста в суспензионной культуре), клетки Expi293™, клетки CHO, клетки почки новорожденного хомяка (например, BHK, ATCC CCL 10), клетки Сертоли мыши (например, клетки TM4), клетки почки обезьяны (например, CV1 ATCC CCL 70), клетки почки африканской зеленой мартышки (например, VERO-76, ATCC CRL-1587), клетки карциномы шейки матки человека (например, HELA, ATCC CCL 2), клетки почки собаки (например, MDCK, ATCC CCL 34), клетки печени крысы линии Buffalo (например, BRL 3A, ATCC CRL 1442), клетки легкого человека (например, W138, ATCC CCL 75), клетки печени человека (например, Hep G2, HB 8065), клетки опухоли молочной железы мыши (например, MMT 060562, ATCC CCL51), клетки TRI, клетки MRC 5, клетки FS4, линию клеток гепатомы человека (например, Hep G2) и клетки миеломы (например, клетки NS0 и Sp2/0).

Способы и варианты применения связывающих белков

[0189] Некоторые аспекты настоящего изобретения относятся к способам размножения специфических в отношении вируса Т-клеток памяти. В некоторых вариантах осуществления способы предусматривают приведение в контакт специфической в отношении вируса Т-клетки памяти со связывающим белком по настоящему изобретению, например, триспецифическим связывающим белком, который содержит первый антигенсвязывающий участок, который связывает полипептид CD28, второй антигенсвязывающий участок, который связывает полипептид CD3, и третий антигенсвязывающий участок, который связывает полипептид CD38.

[0190] В некоторых вариантах осуществления специфическую в отношении вируса Т-клетку памяти приводят в контакт со связывающим белком in vitro или ex vivo.

[0191] В некоторых вариантах осуществления приведение в контакт специфической в отношении вируса Т-клетки памяти со связывающим белком вызывает активацию и/или пролиферацию специфических в отношении вируса Т-клеток памяти.

[0192] Другие аспекты настоящего изобретения относятся к способам размножения Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления способы предусматривают приведение в контакт Т-клетки со связывающим белком по настоящему изобретению, например, триспецифическим связывающим белком, который содержит первый антигенсвязывающий участок, который связывает полипептид CD28, второй антигенсвязывающий участок, который связывает полипептид CD3, и третий антигенсвязывающий участок, который связывает полипептид CD38.

[0193] В некоторых вариантах осуществления Т-клетка представляет собой Т-клетку памяти или эффекторную Т-клетку.

[0194] В некоторых вариантах осуществления Т-клетка экспрессирует химерный антигенный рецептор (CAR) на своей клеточной поверхности или содержит полинуклеотид, кодирующий CAR.

[0195] Другие аспекты настоящего изобретения относятся к способам лечения хронической вирусной инфекции, например, у индивидуума, нуждающегося в этом. В некоторых вариантах осуществления способы предусматривают введение индивидууму, нуждающемуся в этом, эффективного количества связывающего белка по настоящему изобретению, например, триспецифического связывающего белка, который содержит первый антигенсвязывающий участок, который связывает полипептид CD28, второй антигенсвязывающий участок, который связывает полипептид CD3, и третий антигенсвязывающий участок, который связывает полипептид CD38.

[0196] В некоторых вариантах осуществления индивидуум является человеком.

[0197] В некоторых вариантах осуществления связывающий белок вводят индивидууму в фармацевтическом составе, содержащем связывающий белок и фармацевтически приемлемый носитель.

[0198] В некоторых вариантах осуществления введение связывающего белка приводит к активации и/или пролиферации специфических в отношении вируса Т-клеток памяти у индивидуума.

[0199] В любом из представленных выше способов Т-клетки памяти могут представлять собой CD8+ или CD4+ Т-клетки памяти. В любом из представленных выше способов Т-клетки памяти могут представлять собой центральные Т-клетки памяти (T_CM) или эффекторные Т-клетки памяти (T_EM).

[0200] Любые из связывающих белков, описываемых в данном документе, могут найти применение в способах по настоящему изобретению.

[0201] Связывающие белки можно использовать в любом известном способе анализа, таком как анализы конкурентного связывания, прямые и непрямые сэндвич-анализы и анализы иммунопреципитации для выявления и количественного определения одного или нескольких антигенов-мишеней. Связывающие белки будут связывать один или несколько антигенов-мишеней с аффинностью, которая соответствует используемому способу анализа.

[0202] Для диагностических применений в определенных вариантах осуществления связывающие белки можно метить выявляемым фрагментом. Выявляемый фрагмент может представлять собой любой фрагмент, который способен непосредственно либо опосредованно генерировать выявляемый сигнал. Например, выявляемый фрагмент может представлять собой радиоизотоп, такой как ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, ¹²⁵I, ⁹⁹Tc, ¹¹¹In или ⁶⁷Ga; флуоресцентное или хемилюминесцентное соединение, такое как изотиоцианат флуоресцеина, родамин или люциферин; или фермент, такой как щелочная фосфатаза, β-галактозидаза или пероксидаза хрена.

[0203] Связывающие белки также применимы для визуализации in vivo. Связывающий белок, меченный выявляемым фрагментом, можно вводить животному, предпочтительно в кровоток, и анализировать присутствие и положение меченного антитела в организме хозяина. Связывающий белок можно метить любым фрагментом, который можно выявить в организме животного с помощью ядерного магнитного резонанса, рентгенологического исследования либо с помощью других способов выявления, известных в данной области техники.

[0204] Для клинических или исследовательских применений в некоторых вариантах осуществления связывающие белки могут быть конъюгированы с цитотоксическим средством. Для нацеливания цитотоксических полезных нагрузок на конкретные опухолевые клетки использовали разнообразные антитела, связанные с цитотоксическими средствами (то есть конъюгаты антитело-лекарственное средство). Цитотоксические средства и линкеры, которые обеспечивают конъюгацию средства с антителом, известны в данной области техники; см., например, Parslow, A.C. et al. (2016) Biomedicines 4:14 и Kalim, M. et al. (2017) Drug Des. Devel. Ther. 11:2265-2276.

[0205] Настоящее изобретение также относится к набору, содержащему связывающий белок и другие реагенты, применимые для выявления уровней целевых антигенов в биологических образцах. Такие реагенты могут включать выявляемую метку, блокирующую сыворотку крови, образцы положительного и отрицательного контроля и реагенты для выявления. В некоторых вариантах осуществления набор содержит композицию, содержащую любой связывающий белок, полинуклеотид, вектор, векторную систему и/или клетку-хозяина, описанные в данном документе. В некоторых вариантах осуществления набор содержит контейнер и этикетку или листовку-вкладыш на контейнере или вместе с ним. Подходящие контейнеры включают, например, бутылки, флаконы, шприцы, мешки с раствором для в/в инъекции и т. д. Контейнеры могут быть изготовлены из ряда материалов, таких как стекло или пластик. Контейнер содержит композицию, которая сама по себе или в комбинации с другой композицией является эффективной для лечения, предупреждения и/или диагностирования состояния и может иметь стерильное входное отверстие (например, контейнер может представлять собой мешок с раствором для внутривенной инъекции или флакон с пробкой, которую можно проколоть иглой для подкожных инъекций). В некоторых вариантах осуществления на этикетке или листовке-вкладыше указывается, что композиция применяется для предупреждения, диагностирования и/или лечения предпочтительного состояния. Альтернативно или дополнительно изделие или набор может дополнительно содержать второй (или третий) контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер, такой как бактериостатическая вода для инъекций (BWFI), фосфатно-буферный раствор солевой раствор Рингера и раствор декстрозы. Он может дополнительно включать другие вещества, необходимые с коммерческой точки зрения и с точки зрения потребителя, в том числе другие буферы, разбавители, наполнители, иглы и шприцы.

Терапевтические композиции на основе связывающих белков и их введение

[0206] Терапевтические или фармацевтические композиции, содержащие связывающие белки, находятся в пределах объема настоящего изобретения. Такие терапевтические или фармацевтические композиции могут содержать терапевтически эффективное количество связывающего белка или конъюгата связывающий белок-лекарственное средство в смеси с фармацевтически или физиологически приемлемым средством для составления, выбранным в соответствии со способом введения. Эти фармацевтические композиции могут найти применение в любом из способов и вариантов применения, описываемых в данном документе (например, ex vivo, in vitro и/или in vivo).

[0207] Приемлемые вещества для составления предпочтительно являются нетоксичными для получающих их пациентов при используемых дозах и концентрациях.

[0208] Фармацевтическая композиция может содержать вещества для составления, предназначенные для модификации, поддержания или сохранения, например, pH, осмолярности, вязкости, прозрачности, цвета, изотоничности, запаха, стерильности, стабильности, скорости растворения или высвобождения, всасывания или проникновения композиции. Подходящие вещества для составления включают без ограничения аминокислоты (такие как глицин, глутамин, аспарагин, аргинин или лизин), противомикробные средства, антиоксиданты (такие как аскорбиновая кислота, сульфит натрия или гидросульфит натрия), буферы (такие как борат, бикарбонат, Tris-HCl, цитраты, фосфаты или другие органические кислоты), объемообразующие вещества (такие как маннит или глицин), хелатирующие вещества (такие как этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA)), комплексообразующие вещества (такие как кофеин, поливинилпирролидон, бета-циклодекстрин или гидроксипропил-бета-циклодекстрин), наполнители, моносахариды, дисахариды и другие углеводы (такие как глюкоза, манноза или декстрины), белки (такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины), красители, ароматизаторы и разбавители, эмульгаторы, гидрофильные полимеры (такие как поливинилпирролидон), низкомолекулярные полипептиды, солеобразующие противоионы (такие как ион натрия), консерванты (такие как хлорид бензалкония, бензойная кислота, салициловая кислота, тимеросал, фенетиловый спирт, метилпарабен, пропилпарабен, хлоргексидин, сорбиновая кислота или пероксид водорода), растворители (такие как глицерин, пропиленгликоль или полиэтиленгликоль), сахароспирты (такие как маннит или сорбит), суспендирующие вещества, поверхностно-активные вещества или смачивающие вещества (такие как плюроники; PEG; сложные эфиры сорбита; полисорбаты, такие как полисорбат 20 или полисорбат 80; тритон; трометамин; лецитин; холестерин или тилоксапол), вещества, повышающие стабильность (такие как сахароза и сорбит), вещества, повышающие тоничность (такие как галогениды щелочных металлов - предпочтительно хлорид натрия или калия - или маннит, сорбит), среды для доставки, разбавители, вспомогательные вещества и/или фармацевтические адъюванты (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences (18th Ed., A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company 1990) и его последующие издания, которые включены в данный документ посредством ссылки для любой цели).

[0209] Оптимальную фармацевтическую композицию будет определять специалист в данной области техники в зависимости, например, от предполагаемого пути введения, формата доставки и требуемой дозы. На такие композиции могут оказывать влияние физическое состояние, стабильность, скорость высвобождения in vivo и скорость выведения in vivo связывающего белка.

[0210] Основная среда или носитель в фармацевтической композиции могут быть водными либо неводными по своей природе. Например, подходящей средой или носителем для инъекции может быть вода, физиологический солевой раствор или искусственная спинномозговая жидкость, возможно, с добавкой других веществ, общепринятых для композиций для парентерального введения. Нейтральный забуференный солевой раствор или солевой раствор, смешанный с сывороточным альбумином, представляют собой дополнительные приводимые в качестве примера среды. Другие приводимые в качестве примера фармацевтические композиции содержат буфер Tris со значением pH, составляющим приблизительно 7,0-8,5, или ацетатный буфер со значением pH, составляющим приблизительно 4,0-5,5, который может дополнительно включать сорбит или подходящий заменитель. В одном варианте осуществления настоящего изобретения композиции на основе связывающего белка могут быть получены для хранения в форме лиофилизированной массы или водного раствора путем смешивания выбранной композиции с требуемой степенью чистоты с необязательными средствами для составления. Кроме того, связывающий белок может быть составлен в форме лиофилизата с применением подходящих вспомогательных веществ, таких как сахароза.

[0211] Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению могут предназначаться для парентеральной или подкожной доставки. Альтернативно композиции могут предназначаться для ингаляции или для доставки через пищеварительный тракт, например, перорально. Получение таких фармацевтически приемлемых композиций находится в пределах компетенции специалиста в данной области техники.

[0212] Компоненты состава присутствуют в концентрациях, которые являются приемлемыми для места введения. Например, буферы используют для поддержания значения pH композиции на физиологическом уровне или при немного меньшем значении pH, обычно в диапазоне значений pH от приблизительно 5 до приблизительно 8.

[0213] Если предусмотрено парентеральное введение, то терапевтические композиции, предназначенные для применения, могут быть в форме апирогенного приемлемого для парентерального введения водного раствора, содержащего требуемый связывающий белок в фармацевтически приемлемой среде. Особенно подходящей средой для парентеральной инъекции является стерильная дистиллированная вода, с помощью которой связывающий белок составляют в виде стерильного изотонического раствора с подходящими консервантами. Еще один препарат может предусматривать состав на основе требуемой молекулы со средством, таким как инъецируемые микросферы, биоразлагаемые частицы, полимерные соединения (такие как полимолочная кислота или полигликолевая кислота), гранулы или липосомы, которое обеспечивает контролируемое или замедленное высвобождение продукта, который затем может быть доставлен посредством депо-инъекции. Можно также использовать гиалуроновую кислоту, и она может оказывать эффект обеспечения длительного пребывания в кровотоке. Другие подходящие средства для введения требуемой молекулы включают имплантируемые устройства для доставки лекарственных средств.

[0214] В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция может быть составлена для ингаляции. Например, связывающий белок может быть составлен в виде сухого порошка для ингаляции. Растворы для ингаляций на основе связывающего белка можно также составлять с пропеллентом для аэрозольной доставки. В еще одном варианте осуществления растворы можно распылять.

[0215] Также предусматривается, что определенные составы можно вводить перорально. В одном варианте осуществления настоящего изобретения связывающие белки, которые вводят таким способом, можно составлять с такими носителями, которые обычно используют при составлении твердых лекарственных форм, таких как таблетки и капсулы, или без них. Например, капсула может быть предназначена для высвобождения активной части состава в момент попадания в пищеварительный тракт, где биодоступность повышается до максимума, а распад до попадания в системный кровоток сводится к минимуму. Можно включать дополнительные вещества для облегчения всасывания связывающего белка. Также можно использовать разбавители, ароматизаторы, легкоплавкие воски, растительные масла, смазывающие вещества, суспендирующие средства, средства для улучшения распадаемости таблеток и связующие средства.

[0216] Другая фармацевтическая композиция может включать эффективное количество связывающих белков в смеси с нетоксичными вспомогательными веществами, которые являются подходящими для изготовления таблеток. Путем растворения таблеток в стерильной воде или другой подходящей среде можно получить растворы в форме со стандартной дозой. Подходящие вспомогательные вещества включают без ограничения инертные разбавители, такие как карбонат кальция, карбонат или бикарбонат натрия, лактоза или фосфат кальция; или связующие вещества, такие как крахмал, желатин или аравийская камедь; или смазывающие вещества, такие как стеарат магния, стеариновая кислота или тальк.

[0217] Дополнительные фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению будут очевидны специалистам в данной области техники, в том числе составы, включающие связывающие белки, в форме с замедленной или контролируемой доставкой. Методики составления ряда других средств с замедленной или контролируемой доставкой, таких как липосомные носители, биоразлагаемые микрочастицы или пористые гранулы и формы для депо-инъекций, также известны специалистам в данной области техники. Дополнительные примеры препаратов с замедленным высвобождением включают полупроницаемые полимерные матрицы в форме изделий определенной формы, например, пленок или микрокапсул. Матрицы с замедленным высвобождением могут включать сложные полиэфиры, гидрогели, полилактиды, сополимеры L-глутаминовой кислоты и гамма-этил-L-глутамата, поли(2-гидроксиэтилметакрилат), этиленвинилацетат или поли-D(-)-3-гидроксимасляную кислоту. Композиции с замедленным высвобождением также могут включать липосомы, которые можно получить любым из нескольких известных из уровня техники способов.

[0218] Фармацевтические композиции, подлежащие применению для введения in vivo, обычно должны быть стерильными. Этого можно достичь путем фильтрации через стерильные фильтрационные мембраны. Если композиция является лиофилизированной, то стерилизация с помощью этого способа может быть проведена либо до, либо после лиофилизации и восстановления. Композиция для парентерального введения может храниться в лиофилизированной форме или в форме раствора. Кроме того, композиции для парентерального введения, как правило, помещают в контейнер, имеющий стерильное входное отверстие, например, мешок с раствором для внутривенной инъекции или флакон с пробкой, которую можно проколоть гиподермической иглой для инъекций.

[0219] После того как фармацевтическая композиция составлена, ее можно хранить в стерильных флаконах в виде раствора, суспензии, геля, эмульсии, твердого вещества или в виде обезвоженного или лиофилизированного порошка. Такие составы можно хранить либо в готовой к применению форме, либо в форме (например, лиофилизированной), требующей восстановления перед введением.

[0220] Настоящее изобретение также охватывает наборы для получения единицы для однократного введения дозы. Каждый из наборов может содержать как первый контейнер с высушенным белком, так и второй контейнер с водным составом. В объем настоящего изобретения также включены наборы, содержащие одно- и многокамерные предварительно заполненные шприцы (например, шприцы с жидкостью и шприцы с лиофилизатом).

[0221] Эффективное количество фармацевтической композиции на основе связывающего белка, подлежащей терапевтическому применению, будет зависеть, например, от терапевтического случая и целей. Специалисту в данной области техники будет понятно, что подходящие уровни доз для лечения будут, таким образом, меняться отчасти в зависимости от доставляемой молекулы, показания, в соответствии с которым будут применять связывающий белок, пути введения и метрических характеристик (массы тела, поверхности тела или размера органа) и состояния (возраста и общего состояния здоровья) пациента. Соответственно врач может подобрать дозу и видоизменить путь введения для получения оптимального терапевтического эффекта.

[0222] Частота дозирования будет зависеть от фармакокинетических параметров связывающего белка в составе, подлежащем применению. Обычно врач будет вводить композицию до тех пор, пока доза не достигнет такого уровня, при котором достигается необходимый эффект. Следовательно, композицию можно вводить в виде однократной дозы, в виде двух или более доз (которые могут содержать одинаковое количество требуемой молекулы или могут не содержать его) в течение определенного периода времени или в виде непрерывной инфузии посредством имплантируемого устройства или катетера. Дополнительное уточнение подходящей дозировки выполняется стандартным способом рядовыми специалистами в данной области техники и находится в диапазоне задач, которые они обычно выполняют. Подходящие дозировки можно определять с помощью соответствующих данных о дозозависимом ответе.

[0223] Путь введения фармацевтической композиции соответствует известным способам, например, перорально; посредством инъекции с помощью внутривенного, интраперитонеального, интрацеребрального (интрапаренхиматозного), интрацеребровентрикулярного, внутримышечного, внутриглазного, внутриартериального, интрапортального или внутриочагового путей; с помощью систем с замедленным высвобождением или с помощью имплантируемых устройств. При необходимости композиции можно вводить в виде болюсной инъекции или непрерывно путем инфузии или с помощью имплантируемого устройства.

[0224] Композицию также можно вводить местно посредством имплантации мембраны, губки или другого подходящего материала, в который необходимая молекула была поглощена или инкапсулирована. Если применяют имплантируемое устройство, то устройство можно имплантировать в любую подходящую ткань или орган, и доставка требуемой молекулы может осуществляться посредством диффузии, болюсного введения с регулируемым во времени высвобождением или непрерывного введения.

ПРИМЕРЫ

[0225] Приведенные ниже примеры иллюстрируют конкретные варианты осуществления настоящего изобретения и различные варианты их применения. Они приведены только для пояснительных целей, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем настоящего изобретения.

[0226] Следующую терминологию можно использовать взаимозаменяемо в примерах и графических материалах, приведенных в данном документе, для обозначения конкретных антигенсвязывающих доменов или антител к CD38:

antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1 или CD38_VH1

antiCD38_1370 или CD38_HHY1370

antiCD38_SB19 или изатуксимаб.

Пример 1. Перекрестная реактивность и индуцирование апоптоза антител к CD38

[0227] Гуманизированные варианты антитела к CD38 характеризовали в отношении связывания с полипептидами CD38 человека и макака-крабоеда и индуцирования апоптоза.

Материалы и способы

Аффинность связывания с растворимыми внеклеточными доменами CD38

[0228] Связывающие свойства mAb к CD38 оценивали с использованием BIAcore 2000 (BIAcore Inc., Uppsala, NJ). Вкратце биосенсорный чип CM5 BIAcore фиксировали в данном инструменте и активировали посредством 250 мкл 1:1 NHS/EDC при комнатной температуре. Мышиное антитело к Fc IgG1 человека (GE Healthcare, № BR-1008-39) (13,5 мкг/мл в 0,05 М ацетатном буфере, рН 5) иммобилизовали на активированных чипах в проточных ячейках 1. Иммобилизацию проводили при скорости потока 5 мкл/мин. Затем чип блокировали путем введения 55 мкл этаноламин-HCl, pH 8,5, с последующим пятикратным промыванием при помощи 50 мМ NaOH, 1 М NaCl. Для измерения связывания mAb к CD38 с белком CD38 человека или CD38 макака-крабоеда использовали антитела в концентрации 2 мкг/мл в рабочем буфере BIAcore (HBS-EP). Антигены (CD38 человека-метка his (ID2) или CD38 макака-крабоеда-метка his (ID3)) вводили при от 3 до 1000 нМ. После завершения фазы введения контролировали диссоциацию в рабочем буфере BIAcore при той же скорости потока в течение 360 с. Поверхность регенерировали между введениями, используя 30 мкл 50 мМ NaOH-1 М NaCl. Отдельные сенсограммы анализировали с применением программного обеспечения BIAsimulation.

Аффинность связывания с предшественниками В-клеток, экспрессирующими CD38 человека

[0229] Связывание антител к CD38 с CD38, экспрессируемыми на поверхности рекомбинантных мышиных клеток preB::300.19, определяли с помощью проточной цитометрии. Линия рекомбинантных клеток была описана в J. Deckket et al. 2014 Clin. Cancer Res 20:4574-4583. Мышиные preB::300.19 CD38-экспрессирующие клетки переносили в количестве 40000 клеток/лунка в 96-луночный планшет High Bind (MSD L15XB-3) и 100 мкл/лунка антител к CD38 добавляли в течение 45 минут при 4°C и промывали три раза при помощи PBS 1% BSA. 100 мкл/лунка козьего антитела к IgG человека, конъюгированного с Alexa488 (Jackson ImmunoResearch; № 109-545-098), добавляли в течение 45 мин при 4°С и трижды промывали при помощи PBS 1% BSA. Связывание антител оценивали после центрифугирования и ресуспендирования клеток путем добавления 200 мкл/лунка 1% BSA PBS и считывания с использованием системы для проточной цитометрии Guava® easyCyte™ 8HT. Значения кажущейся KD и EC50 оценивали с использованием программ BIOST@T-BINDING и BIOST@T-SPEED соответственно.

Рекомбинантные белки CD38

[0230] Использовали различные рекомбинантные белки CD38, полученные из изоформы A, с разными метками и точечными мутациями (SEQ ID NO:2, 3, 4 и 28), и меченую версию CD38 изоформы E (SEQ ID NO: 105), охватывающую внеклеточный домен CD38 R45-P203. Белки получали путем временной экспрессии в клетках млекопитающих. Кодирующие последовательности ДНК клонировали в плазмиды экспрессии млекопитающих под влиянием энхансера/промотора CMV и полиА-сигналов SV40. Клетки HEK293 (Invitrogen; №K9000-10) временно трансфицировали плазмидами экспрессии с использованием системы экспрессии FreeStyle™ MAX 293 в соответствии с инструкциями производителя.

Анализ индуцирования апоптоза

[0231] Клетки инкубировали при 2×10⁵ клеток/мл в полной среде (RPMI-1640, 10% FBS, 2 мМ L-глутамина) с 1,5 мкг/мл (10 нМ) указанных антител в течение 20 часов при 37°C с 5% CO2. Клетки окрашивали аннексином V-FITC в соответствии с инструкциями производителя (Life Technologies). Образцы анализировали с помощью проточной цитометрии на проточном цитометре BD FACSAria™ с использованием программного обеспечения BD FACSDiva для контроля сбора и анализа данных (оба BD Biosciences).

Анализы ELISA

[0232] 96-луночные планшеты покрывали CD38 при 0,5 мкг/лунка в PBS и в планшет добавляли антитела в концентрации 100 мкл/лунка антител. Планшет инкубировали при 37°С в течение 1 часа и пять раз промывали с помощью PBS, содержащего 0,05% Tween-20 (PBS-T). Затем в каждую лунку добавляли 100 мкл в разведении 1:25000 человеческого антитела к IgG, конъюгированного с пероксидазой хрена (Jackson Ref: 109-035-098). После инкубации при 37°С в течение 1 ч в темноте планшеты промывали при помощи PBS-T пять раз. Связывание антител визуально контролировали путем добавления буфера TMB-H₂O₂ и считывали при длине волны 450 нм. Значения EC50 оценивали с использованием программного обеспечения BIOST@T-SPEED.

Результаты

[0233] Свойства связывания выбранных антител к CD38 человека с растворимым CD38 человека и CD38 макака-крабоеда исследовали с использованием ELISA и анализа поверхностного плазмонного резонанса (SPR) с использованием системы BIAcore (Pharmacia Biosensor; Пискатауэй, Нью-Джерси). Данные анализа ELISA использовали для определения EC50 связывания антител с CD38 человека и макака-крабоеда для гуманизированных антител к CD38 antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1, antiCD38_C2-CD38-1_VH3-VL3, antiCD38_C2-CD38-1_VH5-VL3, antiCD38_C2-CD38-1_VH6-VL3 и человеческого антитела к CD38 antiCD38_1370.

[0234] Связывание гуманизированных вариантов антител к CD38 или человеческого mAb к CD38 с CD38 также оценивали с использованием анализов SPR. Данные анализа SPR использовали для определения K_D и k_off связывания антител с CD38 человека и макака-крабоеда для гуманизированных антител к CD38 antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1, antiCD38_C2-CD38-1_VH3-VL3, antiCD38_C2-CD38-1_VH5-VL3, antiCD38_C2-CD38-1_VH6-VL3 и человеческого антитела к CD38 antiCD38_1370. Данные по связыванию, обобщенные в таблице K, показывают, что все mAb к CD38 связываются с CD38 с аналогичными характеристиками связывания.

Таблица K. Аффинность связывания mAb к CD38 с растворимым внеклеточным доменом CD38 человека и CD38 макака-крабоеда, определенная с помощью поверхностного плазмонного резонанса

hCD38-his (SEQ ID NO:2) cCD38-his (SEQ ID NO:4) Kd (с-1) KD (M) Kd (с-1) KD (M) antiCD38_C2-CD38-1 2,66E-04 3,36E-10 9,85E-05 3,90E-10 antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1 3,90E-04 3,32E-10 7,84E-04 3,44E-09 antiCD38_C2-CD38-1_VH3-VL3 2,83E-04 4,83E-10 1,29E-04 7,10E-10 antiCD38_C2-CD38-1_VH5-VL3 5,29E-04 8,22E-10 2,01E-04 1,14E-09 antiCD38_C2-CD38-1_VH6-VL3 3,33E-04 3,12E-10 1,25E-04 5,63E-10 antiCD38_1370 2,03E-04 1,44E-09 1,90E-04 1,38E-09

[0235] Способность гуманизированных вариантов антител к CD38 связываться с клетками, экспрессирующими CD38, оценивали с использованием анализа связывания на основе FACS, описанного выше. Данные анализа FACS использовали для определения EC50 связывания антител с CD38 человека и макака-крабоеда для гуманизированных антител к CD38 antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1, antiCD38_C2-CD38-1_VH3-VL3, antiCD38_C2-CD38-1_VH5-VL3, antiCD38_C2-CD38-1_VH6-VL3 и человеческого антитела к CD38 antiCD38_1370. Данные анализа связывания, приведенные в таблице L, показывают, что все гуманизированные варианты антител к CD38 проявляли аналогичные аффинности связывания с CD38 на клеточной поверхности.

Таблица L. Аффинность связывания mAb к CD38 с мышиными клетками preB::300.19, экспрессирующими CD38

Кажущаяся KD при FACS (M) hCD38-экспрессирующие клетки cCD38-экспрессирующие клетки antiCD38_C2-CD38-1 2,80E-10 2,20E-10 antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1 3,30E-10 7,50E-10 antiCD38_C2-CD38-1_VH3-VL3 7,80E-10 1,31E-09 antiCD38_C2-CD38-1_VH5-VL3 5,50E-10 1,15E-09 antiCD38_C2-CD38-1_VH6-VL3 6,80E-10 1,07E-09 antiCD38_1370 2,07E-09 1,14E-09

[0236] Данные анализа связывания из приведенных выше анализов ELISA, SPR и FACS обобщены в таблице L2, наряду с идентичностью последовательностей доменов VH и VL с V-участками человека.

Таблица L2. Обобщение анализов ELISA, SPR и FACS, характеризующих связывание указанных антител с полипептидами CD38 человека (Hu) и макака-крабоеда (Cyno).

INN
Номенклатура ELISA
EC50, нМ SPR
KD, нМ FACS
EC50, нМ Идентичность с V-участком человека Hu Cyno Hu Cyno Hu Cyno Hu Cyno antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1 -zumAb 0,11 0,10 0,33 3,44 0,33 0,76 84,7% 87,1% antiCD38_C2-CD38-1_VH3-VL3 -zumAb 0,16 0,15 0,48 0,71 0,78 1,31 83,7% 83,9% antiCD38_C2-CD38-1_VH5-VL3 -zumAb 0,16 0,17 0,82 1,14 0,55 1,15 80,6% 83,9% antiCD38_C2-CD38-1_VH6-VL3 -zumAb 0,14 0,14 0,31 0,56 0,68 1,06 81,6% 83,9% antiCD38_1370 -umAb 0,05 0,09 1,44 1,38 2,00 1,14 99,0% 95,8%

[0237] Также исследовали способность антител к CD38 связываться с обеими изоформами A и E CD38 человека. Для оценки связывания с изоформой А и изоформой Е CD38 проводили иммуноферментный анализ (ELISA) с использованием белков изоформы А и изоформы Е (полученных так, как описано выше) в качестве захватывающего антигена. 96-луночные планшеты покрывали путем внесения каждой из изоформ антител в концентрации 0,5 мкг/лунка в PBS и 100 мкл/лунка. Планшет инкубировали при 37°С в течение 1 часа и пять раз промывали с помощью PBS, содержащего 0,05% Tween-20 (PBS-T). Затем в каждую лунку добавляли 100 мкл в разведении 1:25000 человеческого антитела к IgG, конъюгированного с пероксидазой хрена (Jackson Ref: 109-035-098). После инкубации при 37°С в течение 1 ч в темноте планшеты промывали при помощи PBS-T пять раз. Связывание антител визуально контролировали путем добавления буфера TMB-H₂O₂ и считывали при длине волны 450 нм. Значения EC50 оценивали с использованием программного обеспечения BIOST@T-SPEED.

[0238] Аффинность связывания различных антител с CD38 изоформы A (SEQ ID NO:1) и изоформы E (SEQ ID NO:105) определяли так, как это показано в таблице L3. В таблице М приведено сравнение связывающих свойств для различных антител к CD38.

Таблица L3. Аффинность связывания антител к CD38 с CD38 изоформ A и E на основе EC50 согласно данным анализа ELISA

Антитело CD38 изоформа A, EC50 (нM) CD38 изоформа E, EC50 (нM) antiCD38_C2-CD38-1 0,11 (CV 9%) 0,08 (CV 7%) antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1 0,14 (CV 13%) 0,10 (CV 12%) antiCD38_1370 0,47 (CV 3,7%) 0,32 (CV 5%) antiCD38_SB19 0,10 (CV 7,1%) Связывание отсутствует

Таблица M. Связывающие характеристики различных антител к CD38

Антитело к CD38 H11 (Santa Cruz) Даратумумаб antiCD38_SB19 antiCD38_C2-CD38-1 antiCD38_1370 Связывание с CD38 изоформы A человека + + + + + Связывание с CD38 изоформы Е человека + - - + + Связывание с CD38 макака-крабоеда + - - + +

[0239] В заключение, только antiCD38_C2-CD38-1 связывалось с CD38 и человека, и макака-крабоеда с субнаномолярной аффинностью и связывалось с CD38 изоформ A и E.

Пример 2. Получение триспецифических белков, связывающих CD38

[0240] Затем связывающие свойства антигенсвязывающих доменов выбранных антител к CD38, описанных в примере 1, анализировали в триспецифическом формате, показанном на ФИГ. 1.

Материалы и способы

Получение и очистка триспецифических связывающих белков

[0241] Триспецифические связывающие белки получали путем транзиентной трансфекции клеток Expi293 4 экспрессионными плазмидами с помощью набора для трансфекции ExpiFectamine™ 293 (Thermo Fisher Scientific) в соответствии с протоколом производителя. Вкратце 25% (вес/вес) каждой плазмиды разбавляли в Opti-MEM, смешивали с предварительно разбавленным реагентом ExpiFectamine в течение 20-30 минут при комнатной температуре (к. т.) и добавляли к клеткам Expi293 (2,5×10⁶ клеток/мл). Оптимизацию трансфекции для определения наилучшего соотношения плазмид часто использовали с целью получения триспецифического связывающего белка с хорошим выходом и чистотой.

[0242] Через 4-5 дней после трансфекции надосадочную жидкость культуры трансфицированных клеток собирали и фильтровали через фильтрующий блок с размером пор 0,45 мкм (Nalgene). Триспецифический связывающий белок в надосадочной жидкости очищали с помощью 3-стадийной процедуры. На первой стадии применяли аффинную очистку с помощью белка A, и связанное Ab элюировали с помощью "буфера для элюирования IgG" (Thermo Fisher Scientific). На второй стадии продукт подвергали диализу против PBS (pH 7,4) в течение ночи с 2 заменами буфера PBS. Любой осадок очищали путем фильтрации через фильтрующий блок на 0,45 мкм (Nalgene) перед следующей стадией. На третьей стадии применяли очистку с помощью эксклюзионной хроматографии (SEC) (Hiload 16/600 Superdex 200 пг или Hiload 26/600 Superdex 200 пг, GE Healthcare) для удаления агрегатов и других структур в образце. Перед их объединением фракции анализировали с помощью SDS-PAGE в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях с целью идентификации фракций, содержащих мономерный триспецифический связывающий белок. Очищенное антитело можно разделить на аликвоты и хранить при -80°C в течение длительного срока.

Анализы ELISA

[0243] Связывающие свойства очищенных антител анализировали с помощью способов ELISA или SPR. Для ELISA использовали соответствующие антигены для каждого связывающего участка в триспецифическом связывающем белке для покрытия 96-луночного Immuno Plate (Nunc 439454, Thermo Fisher Scientific) в течение ночи при 4°C с использованием 2 мкг/мл каждого антигена в PBS (pH 7,4). Покрытый планшет блокировали 5% обезжиренным молоком+2% BSA в PBS в течение одного часа при к. т. с последующим трехкратным промыванием в PBS+0,25% Tween 20 (Aqua Max 400, Molecular Devices). Антитела (триспецифические и контрольные Ab) получали в серийном разведении и добавляли в планшеты для ELISA (100 мкл/лунка в двух повторах), инкубировали при к. т. в течение часа с последующим 5-кратным промыванием с помощью PBS+0,25% Tween 20.

[0244] После промывания в каждую лунку добавляли вторичное антитело к Fab человека, конъюгированное с HRP (1:5000, № по кат. 109-035-097, Jackson ImmunoResearch Inc) и инкубировали при к. т. в течение 30 минут. После 5-кратного промывания с помощью PBS+0,25% Tween 20 в каждую лунку добавляли 100 мкл субстрата пероксидазы TMB Microwell Peroxidase Substrate (KPL, Гейтерсберг, Мэриленд, США). Реакцию останавливали путем добавления 50 мкл 1 M H₂SO₄ и OD₄₅₀ измеряли с помощью SpectraMax M5 (Molecular Devices) и анализировали с помощью программного обеспечения SoftMax Pro6.3 (Molecular Devices). Окончательные данные переносили в программное обеспечение GraphPad Prism (GraphPad Software, Калифорния, США) и откладывали на графике, как это показано. EC50 рассчитывали с помощью того же программного обеспечения.

[0245] Для определения связывания триспецифических антител к CD38xCD28xCD3 или изотипических контрольных антител (IgG4 человека) с CD3 человека (Cambridge Biologics LLC, № по кат. 03-01-0051), CD28 (Cambridge Biologics LLC, номер по кат. 03-01-0303) и CD38 (Cambridge Biologics LLC, № по кат. 03-01-0369) использовали анализ ELISA. Связанные антитела выявляли с помощью вторичного антитела к Fab, конъюгированного с пероксидазой хрена (HRP)(Jackson ImmunoResearch Inc., №109-035-097).

Результаты

[0246] С помощью SPR антигенсвязывающие домены, связывающие CD38, исследовали в триспецифическом формате (связывающие CD38x-CD28x-CD3) в отношении способности связывать CD38, когда другие антигенсвязывающие домены связаны с их родственными лигандами. Для последовательного связывания трех антигенов с каждым триспецифическим Ab вводили насыщающую концентрацию (> 10 кДа) каждого антигена в течение 8 минут с последующей диссоциацией в течение 5 минут. Регенерацию поверхности проводили путем введения 10 мМ глицина-HCl pH 2,5 в течение 60 с при 30 мкл/мин. Данные аппроксимировали с моделью кинетического связывания 1:1 и анализировали с использованием Biacore S200 Evaluation Software v 1.0. Равновесную константу диссоциации (K_D) рассчитывали с использованием константы скорости ассоциации (k_on) и константы скорости диссоциации (k_off).

[0247] Данный анализ на основе SPR показал, что триспецифические связывающие белки способны связывать CD38 независимо от того, были ли антигенсвязывающие домены CD3 и/или CD28 также связаны с их родственным антигеном. Кинетические параметры, измеренные с помощью SPR, представлены в таблице M2.

Таблица M2. Связывание триспецифических связывающих белков, связывающих CD38x-CD28x-CD3 с 1, 2 или 3 родственными антигенами

Состояние связывающего белка перед связыванием CD38 k_a (M^-1с^-1) k_d (с^-1) K_D (M) Отсутствует предварительное связывание 9,02E+05 1,42E-03 1,57E-09 Предварительное связывание с CD3 8,35E+05 1,24E-03 1,48E-09 Предварительное связывание с CD28 7,39E+05 1,32E-03 1,79E-09 Предварительное связывание с CD3, затем с CD28 8,18E+05 1,23E-03 1,50E-09 Предварительное связывание с CD28, затем с CD3 8,37E+05 1,23E-03 1,47E-09

[0248] Данные результаты демонстрируют, что все три мишени могут одновременно связываться с триспецифическими связывающими белками. Предварительное связывание триспецифических связывающих белков с CD28, CD3 или обоими (в любом порядке) не изменяло кинетику связывания или афинность связывания с CD38.

[0249] Затем каждый антигенсвязывающий домен триспецифического связывающего белка CD38_SB19xCD28_supxCD3_mid оценивали с помощью SPR в отношении способности связывать родственный антиген с двумя другими антигенсвязывающими доменами и без них при насыщении. Таблицы М3 и М4 показывают результаты этих анализов.

Таблица M3. Связывание мишени в отсутствие других мишеней

Мишень k_a (M^-1с^-1) k_d (с^-1) K_D (M) CD38 8,04E+05 1,41E-03 1,75E-09 CD28 1,16E+05 3,14E-04 2,71E-09 CD3 2,90E+04 6,73E-04 2,32E-08

Таблица M4. Связывание мишени с другими мишенями при насыщении

Мишень k_a (M^-1с^-1) k_d (с^-1) K_D (M) CD38 5,93E+05 1,44E-03 2,42E-09 CD28 1,05E+05 3,96E-04 3,77E-09 CD3 1,27E+05 2,36E-03 1,86E-08

[0250] Как показано в таблицах М3 и М4, наличие двух мишеней, насыщенных предварительным связыванием с антигеном, не влияло на кинетику или аффинность связывания третьей мишени для CD38 или CD28. В случае связывания CD3 предварительно связанный CD38 и/или CD28 приводил к более быстрой кинетике (приблизительно 4-кратное влияние на значения k_on и k_off).

[0251] Антигенсвязывающие домены, связывающие CD38, исследовали в триспецифическом формате с двумя антигенсвязывающими доменами, связывающими CD28 (суперагонист, "sup" и традиционный агонист "cvn") и двумя антигенсвязывающими доменами, связывающими CD3 ("mid" и "low"). Последовательности вариабельных доменов для этих антигенсвязывающих доменов представлены следующим образом: anti-CD28_sup: SEQ ID NO:49 (VH) и SEQ ID NO:50 (VL); anti-CD28_cvn: SEQ ID NO:51 (VH) и SEQ ID NO:52 (VL); anti-CD3_mid: SEQ ID NO:53 (VH) и SEQ ID NO:54 (VL); anti-CD3_low: SEQ ID NO:84 (VH) и SEQ ID NO:85 (VL). Результаты анализов SPR, оценивающих связывание триспецифических связывающих белков, показаны на ФИГ. 2. Три домена, связывающих CD38, характеризовались примерно одинаковой аффинностью связывания в формате триспецифического связывающего белка, как и в моноспецифическом формате. Оба домена, связывающих CD3,характеризовались приблизительно одинаковой аффинностью связывания в моно-, би- и триспецифических форматах. Домены, связывающие CD28, показывали немного более низкую (но все же наномолярную) аффинность связывания в би- или триспецифическом формате по сравнению с моноспецифическим. Если два других антигенсвязывающих домена были насыщенными, домены, связывающие CD38_SB19 и CD28_sup, имели сходные аффинности связывания по сравнению с тем, когда два других антигенсвязывающих домена не были связаны с антигеном. Однако домен, связывающий CD3_mid, показал более быструю кинетику, когда два других антигенсвязывающих домена находились в насыщенном состоянии. Эти результаты демонстрируют, что домены, связывающие CD38, CD28 и CD3, являются совместимыми для применения в формате триспецифического связывающего белка.

[0252] Антигенсвязывающие домены, связывающие CD38, получение которых описано в данном документе, также сравнивали с существующим антигенсвязывающим доменом, связывающим CD38, antiCD38_SB19 (см. SEQ ID NO:47 для VH и SEQ ID NO:48 для последовательностей VL, соответственно). Связывание триспецифических молекул с CD38, экспрессируемым на поверхности рекомбинантных мышиных клеток preB::300.19, определяли с помощью проточной цитометрии, и параллельно анализировали соответствующие моновалентные антитела к CD38. Линия рекомбинантных клеток была описана в J. Deckket et al. 2014 Clin. Cancer Res 20:4574-4583. Мышиные preB::300.19 CD38-экспрессирующие клетки переносили при 40000 клеток/лунка в 96-луночный планшет High Bind (MSD L15XB-3), а 100 мкл/лунка триспецифических молекул добавляли в течение 45 минут при 4°C и трижды промывали при помощи PBS 1% BSA. 100 мкл/лунка козьего антитела к IgG человека, конъюгированного с Alexa488 (Jackson ImmunoResearch; № 109-545-098), добавляли в течение 45 мин при 4°С и трижды промывали при помощи PBS 1% BSA. Связывание антител оценивали после центрифугирования и ресуспендирования клеток путем добавления 200 мкл/лунка 1% BSA PBS и считывания с использованием системы для проточной цитометрии Guava® easyCyte™ 8HT. Значения кажущейся KD и EC50 оценивали с использованием программ BIOST@T-BINDING и BIOST@T-SPEED соответственно.

[0253] Проточную цитометрию использовали так, как это описано выше, для исследования связывания антитела antiCD38_SB19 или триспецифического связывающего белка с антигенсвязывающим доменом, связывающим CD38, antiCD38_SB19 с мышиными В-клетками-предшественниками, экспрессирующими полипептид CD38 человека или макака-крабоеда на своей клеточной поверхности. Триспецифический связывающий белок CD38xCD28_supxCD3_mid с антигенсвязывающим доменом, связывающим CD38, antiCD38_SB19 связывался с клетками, экспрессирующими CD38 человека, с кажущейся аффинностью, которая в 8 раз меньше (EC50=4 нM), чем у моноспецифического антитела antiCD38_SB19 (EC50=0,5 нM). Ни моноспецифическое антитело antiCD38_SB19, ни триспецифический связывающий белок с антигенсвязывающим доменом, связывающим CD38, antiCD38_SB19 не связывались с клетками, экспрессирующими CD38 макака-крабоеда.

[0254] Связывающий домен гуманизированного антитела к CD38 antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1 также тестировали в триспецифических форматах в отношении связывания с клетками, экспрессирующими полипептиды CD38 человека или макака-крабоеда. В отличие от antiCD38_SB19 триспецифические связывающие белки CD38xCD28_supxCD3_mid и CD38xCD28_cvnxCD3_mid с антигенсвязывающим доменом, связывающим CD38, antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1, а также моноспецифическое антитело antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1 были способны связывать полипептиды CD38 и человека, и макака-крабоеда. Триспецифический связывающий белок CD38xCD28_cvnxCD3_mid с антигенсвязывающим доменом, связывающим CD38, antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1 связывался с клетками, экспрессирующими CD38 человека, с кажущейся аффинностью, которая в 9 раз меньше (EC50=4,4 нM), чем у родительского антитела antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1 (EC50=0,5 нM). Триспецифический связывающий белок CD38xCD28_cvnxCD3_mid с антигенсвязывающим доменом, связывающим CD38, antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1 связывался с клетками, экспрессирующими CD38 макака-крабоеда, с кажущейся аффинностью, которая в 7,5 раза меньше (EC50=7,5 нM), чем у родительского антитела antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1 (EC50=1 нM). Триспецифический связывающий белок CD38xCD28_supxCD3_mid с антигенсвязывающим доменом, связывающим CD38, antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1 связывался с клетками, экспрессирующими CD38 человека, с кажущейся аффинностью, которая в 2,5 раза меньше (EC50=11 нM), чем у триспецифического связывающего белка CD38xCD28_cvnxCD3_mid с антигенсвязывающим доменом, связывающим CD38, antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1 (EC50=4,4 нM).

[0255] Связывающий домен гуманизированного антитела к CD38 antiCD38_1370 также сравнивали с моноспецифическим антителом antiCD38_1370 в отношении связывания с клетками, экспрессирующими полипептиды CD38 человека или макака-крабоеда. Хотя моноспецифическое антитело antiCD38_1370 связывалось с клетками, экспрессирующими полипептиды CD38 человека (EC50=11,2 нM) или макака-крабоеда (EC50=6,6 нM) в нМ диапазоне, триспецифический связывающий белок CD38xCD28_supxCD3_mid триспецифический связывающий белок с антигенсвязывающим доменом, связывающим CD38, antiCD38_1370 связывался с клетками, экспрессирующими полипептиды CD38 человека или макака-крабоеда, в отсутствие насыщения.

[0256] В заключение, выяснили, что аффинность связывания триспецифического связывающего белка CD38_SB19xCD28_supxCD3_mid (домена, связывающего CD38, antiCD38_SB19) с CD38 человека находится в одном и том же диапазоне независимо от того, исследуют ли связывание с рекомбинантным CD38 человека с помощью SPR или с CD38 человека, экспрессируемым на поверхности клетки, с помощью проточной цитометрии (ФИГ. 3). Аналогичным образом аффинность триспецифических связывающих белков CD38_VH1xCD28_supxCD3_mid/low (домена, связывающего CD38, antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1) и CD38_VH1xCD28_cvnxCD3_mid/low (домена, связывающего CD38, antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1) в отношении связывания с CD38 человека также находилась в одном и том же диапазоне в обоих анализах. В случае CD38_HHY1370xCD28_supxCD3_mid (домена, связывающего CD38, antiCD38_1370) K_D для связывания CD38 человека, определяемая с помощью SPR, составляла 1 нМ, тогда как точную величину EC50 невозможно было оценить с помощью проточной цитометрии (ФИГ. 3). Итоговое описание значений кажущейся KD (полученных с помощью анализа FACS) для триспецифических связывающих белков с различными доменами, связывающими CD38, представлено в таблице M5.

Таблица M5. Обобщение значений кажущейся KD, полученных с помощью анализа проточной цитометрии

Кажущаяся KD при FACS (M) hCD38-экспрессирующие клетки cCD38-экспрессирующие клетки Триспецифическое антитело с доменом, связывающим CD38, antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1 4,4 нM 7,5 нM Триспецифическое антителос доменом, связывающим CD38, antiCD38_1370 Насыщение отсутствует Насыщение отсутствует Триспецифическое антитело с доменом, связывающим CD38, antiCD38_SB19 4 нМ Связывание отсутствует Кажущаяся KD при FACS (M) hCD38-экспрессирующие клетки cCD38-экспрессирующие клетки antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1 0,5 нM 1 нM antiCD38_1370 11,2 нM 6,6 нM antiCD38_SB19 0,5 нM Связывание отсутствует

[0257] Как и ожидалось, триспецифический белок, связывающий ΔCD38xCD28_supxCD3_mid, не имеющий домена, связывающего CD38, не связывался с клетками, экспрессирующими полипептиды CD38 человека или макака-крабоеда. Это указывает на то, что связывание, наблюдаемое в данном анализе, было специфичным для антигенсвязывающих доменов антитела к CD38.

Пример 3. Ab CD38/CD3xCD28 стимулирует центральные клетки памяти CD4 и CD8, Th1 и антиген-специфические ответы

[0258] Чтобы определить, может ли триспецифическое Ab CD38/CD3xCD28 усиливать клеточную иммунную функцию, оценивали фенотип Т-клеток, размноженных in vitro.

Материалы и способы

[0259] Мононуклеарные клетки периферической крови выделяли из крови здоровых доноров, собранной компанией Research Blood Components, LLC (Бостон, Массачусетс). РВМС добавляли в покрытые антителами планшеты (350 нг/лунка) (5×10⁵ клеток/мл), как описано выше, и инкубировали при 37°С в течение 3 и 7 дней. Клетки собирали в определенные моменты времени и анализировали с помощью проточной цитометрии в отношении подгрупп Т-клеток: не подвергавшихся воздействию (CCR7+ CD45RO-), Tcm (CCR7+ CD45RO+), Tem (CCR7- CD45RO+), Treg (CD4+ Foxp3+ CD25hi). Клетки также обрабатывали монензином (GolgiStop) (BD Biosciences, Калифорния) в течение по меньшей мере 6 часов перед окрашиванием для проточной цитометрии для определения экспрессии внутриклеточных цитокинов: Th1 (CD4+ IFN-γ+), Th2 (CD4+ IL-4+) и Th17 (CD4+ IL-17+). CMV pp65-специфичные CD8+ T-клетки выявляли с использованием флуоресцентно-конъюгированного пентамера, с ограничением PBMC доноров по HLA (A*02:01/NLVPMVATV) (ProImmune, Оксфорд, Великобритания). PBMC получали от HemaCare (Ван-Найз, Калифорния) от доноров с известными CMV-позитивными популяциями и типами HLA. PMBC от доноров, отрицательных в отношении ограничивающего типа HLA, использовали в качестве отрицательного контроля. Окрашивание проводили в соответствии с протоколом производителя.

Результаты

[0260] PBMC человека от инфицированных CMV доноров инкубировали в течение 7 дней с триспецифическим Ab или триспецифическим антителом с тремя мутантными антигенсвязывающими участками в качестве отрицательного контроля в отсутствие цитокинов. Анализ субпопуляций CD4 выявил наибольшую пролиферацию в пуле центральных клеток памяти с меньшим увеличением количества эффекторных клеток памяти (ФИГ. 4A). Анализ субпопуляций CD4 также выявил наибольшую пролиферацию клеток Th1 (> 6 раз) по сравнению с клетками Th2 или Th17 (ФИГ. 4B). В субпопуляции CD8 ко дню 7 наблюдали увеличение в >150 раз субпопуляции CD8 центральных клеток памяти с меньшим увеличением количества эффекторных клеток памяти (ФИГ. 4C). Важно то, что ранее существовавшие антиген-специфические ответы CD8 на CMV, направленные на эпитоп pp65 у серопозитивных доноров HLA-A2 с использованием окрашивания тетрамером (Gratama JW, van Esser JW, et al. Blood 98:1358-1364(2001)), увеличились в >44 раза в присутствии триспецифического белка-антитела к CD38 по сравнению с отрицательным контролем (ФИГ. 4D).

[0261] В совокупности эти данные указывают на то, что триспецифическое Ab к CD38 стимулирует функцию Th1 и защитные ответы CD8 T-клеток памяти, которые могут усиливать противоопухолевый и противовирусный иммунитет in vivo.

Пример 4. Триспецифические антитела CD38/CD28xCD3 обеспечивают специфический в отношении CMV иммунный ответ

[0262] Активация и/или пролиферация специфических в отношении вирусного антигена Т-клеток может обеспечить терапевтическую стратегию против вирусных инфекций, таких как инфекции, вызванные цитомегаловирусом (CMV). Определяли способность триспецифических антител CD38/CD28xCD3 обеспечивать активацию и размножение специфических в отношении CMV Т-клеток.

Материалы и способы

Анализы ELISA

[0263] Аффинности связывания для каждого целевого антигена рекрутерами CD38/CD28xCD3 Т-клеток измеряли с помощью ELISA. Вкратце, каждый антиген использовали для покрытия 96-луночного планшета Immuno Plate (Thermo Fisher Scientific) на протяжении ночи при 4°C с использованием 200 нг/лунка в PBS (pH 7,4) каждого антигена. Покрытый планшет блокировали 5% обезжиренным молоком+2% BSA в PBS в течение одного часа при к. т. с последующим трехкратным промыванием в PBS+0,25% Tween 20 (Aqua Max 400, Molecular Devices). Антитела (триспецифические и контрольные Ab) получали в серийном разведении и добавляли в планшеты для ELISA (100 мкл/лунка в двух повторах), инкубировали при к. т. в течение часа с последующим 5-кратным промыванием с помощью PBS+0,25% Tween 20. После промывания в каждую лунку добавляли вторичное антитело к Fab человека, конъюгированное с HRP (1:5000, № по кат. 109-035-097, Jackson ImmunoResearch Inc) и инкубировали при к. т. в течение 30 минут. После 5-кратного промывания с помощью PBS+0,25% Tween 20 в каждую лунку добавляли 100 мкл субстрата пероксидазы TMB Microwell Peroxidase Substrate (KPL, Гейтерсберг, Мэриленд, США). Реакцию останавливали путем добавления 50 мкл 1 M H2SO4, OD450 измеряли с помощью SpectraMax M5 (Molecular Devices) и анализировали с помощью программного обеспечения SoftMax Pro6.3 (Molecular Devices). Окончательные данные переносили в программное обеспечение GraphPad Prism (GraphPad Software, Калифорния, США) и откладывали на графике. EC50 рассчитывали с помощью того же программного обеспечения.

Анализы SPR

[0264] Для полного кинетического анализа использовали антигены CD38-His человека (Cambridge Biologics, Кембридж, Массачусетс). Получение кинетических характеристик очищенных антител выполняли с помощью технологии SPR на BIACORE 3000 (GE Healthcare). Применяли анализ захвата с использованием захвата антителами, специфическими к IgG1 человека, и ориентации исследуемых антител. Для захвата конструкций содержащего Fc белка использовали набор для захвата антител человека (GE Healthcare). Для захвата His-меченного антигена использовали набор для захвата антител, связывающих His (GE Healthcare). Захватывающее антитело иммобилизовали посредством первичных аминогрупп (11000 RU) на чипе CM5 высокой чистоты (GE Life Sciences) с помощью стандартных процедур. Анализируемое антитело захватывали при скорости потока 10 мкл/мин. со скорректированным значением RU, что должно было давать в результате максимальный сигнал связывания с аналитом, обычно составляющий 30 RU. Кинетические характеристики связывания измеряли с триспецифическими антителами. В качестве аналитического буфера использовали HBS-EP (10 мМ HEPES, pH 7,4, 150 мМ NaCl, 3 мМ EDTA и 0,005% поверхностно-активное вещество P20) при скорости потока 30 мкл/мин. Поверхности чипов подвергали регенерации с помощью регенерирующего раствора из соответствующего набора для захвата. Кинетические параметры анализировали и рассчитывали с помощью пакета программ BIA evaluation v4.1 с использованием проточной кюветы без захваченного антитела в качестве эталона и модели Ленгмюра для связывания 1:1 с массобменом.

Измерение пролиферации Т-клеток in vitro

[0265] Т-клетки выделяли у доноров человеческих мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) путем отрицательной селекции с использованием набора Pan T Cell Isolation Kit (Miltenyi Biotec GmbH, Германия) в магнитном поле. Антитела наносили на 96-луночные планшеты для культивирования клеток, получая антитела в стерильном PBS и распределяя по 50 мкл в каждую лунку (350 нг/лунка). Затем планшеты инкубировали при 37°C в течение по меньшей мере 2 часов, а потом промывали стерильным PBS. Добавляли неприкрепленные Т-клетки в покрытые антителами планшеты (5×10⁵ клеток/мл) и инкубировали при 37°C в течение нескольких дней. В день 4 клетки пересевали с новой средой для культивирования клеток на планшеты, только что покрытые антителами. В некоторых экспериментах с 7-дневной инкубацией добавляли только свежую среду без замены на планшет, только что покрытый антителами. Клетки собирали в определенные моменты времени, и количество клеток рассчитывали с использованием гранул для подсчета CountBright™.

Анализ пролиферации Т-клеток и определение подгруппы Т-клеток in vitro

[0266] Мононуклеарные клетки периферической крови выделяли из крови здоровых доноров, собранной компанией Research Blood Components, LLC (Бостон, Массачусетс). РВМС добавляли в покрытые антителами планшеты (350 нг/лунка) (5×10⁵ клеток/мл), как описано выше, и инкубировали при 37°С в течение 3 и 7 дней. Клетки собирали в определенные моменты времени и анализировали с помощью проточной цитометрии в отношении подгрупп Т-клеток: не подвергавшихся воздействию (CCR7+ CD45RO-), T_cm (CCR7+ CD45RO+), T_em (CCR7- CD45RO+), T_reg (CD4+ Foxp3+ CD25hi). Клетки также обрабатывали монензином (GolgiStop) (BD Biosciences, Калифорния) в течение по меньшей мере 6 часов перед окрашиванием для проточной цитометрии для определения экспрессии внутриклеточных цитокинов: Th1 (CD4+ IFN-γ+), Th2 (CD4+ IL-4+) и Th17 (CD4+ IL-17+). Специфические в отношении CMV pp65, специфические в отношении EBV BMLF, специфические в отношении вируса гриппа A MP и специфические в отношении HIV-1 Gag CD8+ Т-клетки выявляли с использованием флуоресцентно-конъюгированного пентамера, с ограничением PBMC доноров по HLA/вирусному пептиду (A*02:01/NLVPMVATV; SEQ ID NO:26), (A*02:01/GLCTLVAML; SEQ ID NO:27), (A*02:01/GILGFVFTL; SEQ ID NO:28) и (A*02:01/SLYNTVATL; SEQ ID NO:25), соответственно (ProImmune, Оксфорд, Великобритания). PBMC получали от компании HemaCare (Van Nuys, CA) у доноров с известной инфекцией CMV, EBV или вируса гриппа A и от компании BioIVT (Вестбери, Нью-Йорк ) у доноров, для которых известны положительные результаты в отношении HIV-1 и типов HLA. PMBC от доноров, отрицательных в отношении ограничивающего типа HLA, использовали в качестве отрицательного контроля. Окрашивание проводили в соответствии с протоколом производителя.

Количественное определение специфических в отношении CMV T-клеток

[0267] Как описывается выше, PBMC выделяли из крови доноров-людей, для которых подтверждено инфицирование CMV, и добавляли в планшеты, содержащие триспецифическиеантитела или контрольные антитела. Планшеты инкубировали при 37°C. Клетки собирали в указанные моменты времени и анализировали, как описывается выше.

Результаты

[0268] Триспецифическое антитело CD38_VH1/CD28sup x CD3mid активировало Т-клетки и обеспечивало пролиферацию специфических в отношении CMV CD8+ Т-клеток памяти после инкубации в течение 10 дней с PBMC, выделенными из инфицированного CMV донора-человека B (ФИГ. 5A-5B) и инфицированного CMV донора-человека C (ФИГ. 6A-6B). Как показано на ФИГ. 5A (инфицированный CMV донор С) и на ФИГ. 6A (инфицированный CMV донор C), триспецифическое антитело CD38_VH1/CD28sup x CD3mid приводило к повышению количеств специфических в отношении CMV CD8+ Т-клеток памяти (клеток/мкл) по сравнению с трижды мутантным контрольным антителом. Кроме того, триспецифическое антитело CD38_VH1/CD28sup x CD3mid повышало процент специфических в отношении CMV CD8+ эффекторных Т-клеток памяти (T_em) и центральных Т-клеток памяти (T_cm) по сравнению с трижды мутантным контрольным антителом (инфицированный CMV донор B, ФИГ. 5B; инфицированный CMV донор C, ФИГ. 6B).

[0269] В совокупности эти данные указывают на то, что триспецифические антитела CD38/CD28xCD3 обеспечивают активацию и размножение специфических в отношении CMV Т-клеток, таких как специфические в отношении CMV CD8+ Т-клетки, специфических в отношении CMV эффекторных (T_em) CD8+ Т-клеток памяти и специфических в отношении CMV центральных (T_cm) CD8+ Т-клеток памяти.

Пример 5. Триспецифические антитела CD38/CD28xCD3 обеспечивают специфический в отношении EBV иммунный ответ

[0270] Далее определяли способность триспецифических антител CD38/CD28xCD3 обеспечивать активацию и размножение специфических в отношении вируса Эпштейна-Барр (EBV) Т-клеток.

Материалы и способы

Количественное определение специфических в отношении EBV T-клеток

[0271] Как описывается выше, PBMC выделяли из крови доноров-людей с известной инфекцией EBV и добавляли в планшеты, содержащие триспецифические антитела или контрольные антитела. Планшеты инкубировали при 37°C. Клетки собирали в указанные моменты времени и анализировали, как описывается выше.

Результаты

[0272] Триспецифическое антитело CD38_VH1/CD28sup x CD3mid активировало Т-клетки и обеспечивало пролиферацию специфических в отношении EBV CD8+ Т-клеток памяти после инкубации в течение 11 дней с PBMC, выделенными из инфицированного EBV донора-человека A (ФИГ. 7A-7B) и инфицированного EBV донора-человека B (ФИГ. 8A-8B). Как показано на ФИГ. 7A (инфицированный EBV донор А) и на ФИГ. 8A (инфицированный EBV донор В), триспецифическое антитело CD38_VH1/CD28sup x CD3mid приводило к повышению количеств специфических в отношении EBV CD8+ Т-клеток памяти (клеток/мкл) по сравнению с трижды мутантным контрольным антителом. Кроме того, триспецифическое антитело CD38_VH1/CD28sup x CD3mid повышало процент специфических в отношении EBV CD8+ T_em-клеток и T_cm-клеток по сравнению с трижды мутантным контрольным антителом (инфицированный EBV донор A, ФИГ. 7B; инфицированный EBV донор B, ФИГ. 8B, например, см. день 7).

[0273] В совокупности эти данные указывают на то, что триспецифические антитела CD38/CD28xCD3 обеспечивают активацию и размножение специфических в отношении EBV Т-клеток, таких как специфические в отношении EBV CD8+ Т-клетки, специфических в отношении EBV эффекторных (T_em) CD8+ Т-клеток памяти и специфических в отношении EBV центральных (T_cm) CD8+ Т-клеток памяти.

Пример 6. Триспецифические антитела CD38/CD28xCD3 обеспечивают специфический в отношении HIV иммунный ответ

[0274] Далее определяли способность триспецифических антител CD38/CD28xCD3 обеспечивать активацию и размножение специфических в отношении вируса иммунодефицита человека (HIV) Т-клеток.

Материалы и способы

Количественное определение специфических в отношении HIV T-клеток

[0275] Как описывается выше, PBMC выделяли из крови доноров-людей, для которых подтверждено инфицирование HIV, и добавляли в планшеты, содержащие триспецифические антитела или контрольные антитела. Планшеты инкубировали при 37°C. Клетки собирали в указанные моменты времени и анализировали, как описывается выше.

Результаты

[0276] В день 0 (до инкубации с триспецифическими антителами), PBMC от HIV-положительных доноров демонстрировали специфические в отношении HIV Gag CD8 Т-клетки (A*02:01 - SLYNTVATL (HIV-1 gag p17 76-84) пентамер, конъюгированный с PE, ProImmune) (ФИГ. 9). Например, три HIV-положительных донора PBMC имели 0,86% (инфицированный HIV донор A), 0,95% (инфицированный HIV донор B) и 2,27% (инфицированный HIV донор C) специфических в отношении Gag CD8 Т-клеток по сравнению с 0,33% в PBMC от HIV-отрицательного донора.

[0277] Инкубация PBMC в течение 10 дней с триспецифическим антителом CD38_VH1/CD28sup x CD3mid активировала Т-клетки и обеспечивала пролиферацию специфических в отношении HIV Т-клеток. Как показано на ФИГ. 10A (инфицированный HIV донор D), ФИГ. 11A (инфицированный HIV донор E) и ФИГ. 12A (инфицированный HIV донор F), триспецифическое антитело CD38_VH1/CD28sup x CD3mid приводило к повышению количеств специфических в отношении HIV CD8+ Т-клеток памяти (клеток/мкл) по сравнению с трижды мутантным контрольным антителом. Кроме того, триспецифическое антитело CD38_VH1/CD28sup x CD3mid увеличивало процент специфических в отношении HIV CD8+ эффекторных (T_em) клеток памяти (например, см. дни 7 и 10), а также в меньшей степени CD8+ центральных (T_cm) клеток памяти по сравнению с трижды мутантным контрольным антителом (инфицированный HIV донор D, ФИГ. 10B, инфицированный HIV донор E, ФИГ. 11B, инфицированный HIV донор F, ФИГ. 12B).

Пример 7. Триспецифические антитела CD38/CD28xCD3 обеспечивают специфический в отношении вируса гриппа иммунный ответ

[0278] Определяли способность триспецифических антител CD38/CD28xCD3 обеспечивать активацию и размножение специфических в отношении вируса гриппа Т-клеток.

Материалы и способы

Количественное определение специфических в отношении вируса гриппа T-клеток

[0279] Как описывается выше, PBMC выделяли из крови доноров-людей с подтвердденным инфированием вирусом гриппа А и добавляли в планшеты, содержащие триспецифические антитела или контрольные антитела. Планшеты инкубировали при 37°C. Клетки собирали в указанные моменты времени и анализировали, как описывается выше.

Результаты

[0280] Триспецифическое антитело CD38_VH1/CD28sup x CD3mid активировало Т-клетки и обеспечивало пролиферацию специфических в отношении вируса гриппа CD8+ Т-клеток памяти после инкубации в течение 11 дней с PBMC, выделенными у донора-человека с известной инфекцией вируса гриппа (ФИГ. 13A-13B, инфицированный вирусом гриппа донор А). Как показано на ФИГ. 13A, триспецифическое антитело CD38_VH1/CD28sup x CD3mid приводило к повышению количеств специфических в отношении вируса гриппа CD8+ Т-клеток памяти (клеток/мкл) по сравнению с трижды мутантным контрольным антителом. Кроме того, триспецифическое антитело CD38_VH1/CD28sup x CD3mid увеличивало процент специфических в отношении вируса гриппа (Flu) CD8+ T_em-клеток (например, см. дни 7 и 11) и T_cm-клеток (например, см. день 7) по сравнению с трижды мутантным контрольным антителом (ФИГ. 13B).

[0281] В совокупности данные, представленные в примерах 1-7, демонстрируют, что триспецифические антитела, связывающие CD38/CD3/CD28, стимулируют мощный противовирусный иммунитет против различных вирусов. Не ограничиваясь какой-либо теорией, полагают, что триспецифические антитела CD38/CD3/CD28 могут активировать и обеспечивать пролиферацию Т-клеток за счет вовлечения всех трех лигандов на Т-клетках. В частности, полагают, что вовлечение CD3/CD28 на Т-клетках с помощью триспецифических антител CD38/CD3/CD28 инициирует активацию, пролиферацию и дифференцировку Т-клеток в Т-клетки памяти. Кроме того, не ограничиваясь какой-либо теорией полагают, что вовлечение CD28 обеспечивает полезный костимуляторный сигнал, который увеличивает продолжительность и величину иммунного ответа и обеспечивает пролиферацию и выживание Т-клеток.

[0282] Хотя настоящее изобретение включает различные варианты осуществления, следует понимать, что видоизменения и модификации будут очевидны специалистам в данной области техники. Таким образом, предполагается, что прилагаемая формула изобретения охватывает все такие эквивалентные вариации, которые попадают в пределы объема настоящего изобретения. Кроме того, названия разделов, используемые в данном документе, представлены лишь в целях систематизации, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие описываемый объект настоящего изобретения.

[0283] Каждый вариант осуществления, описанный в данном документе, можно объединять с любым другим вариантом осуществления или вариантами осуществления, если четко не указано противоположное. В частности, любой признак или вариант осуществления в качестве предпочтительного или преимущественного может быть объединен с другим признаком или признаками или вариантом осуществления или вариантами осуществления, указанными в качестве предпочтительных или преимущественных, если четко не указано противоположное.

[0284] Все источники литературы, цитируемые в настоящей заявке, явным образом включены посредством ссылки в данный документ.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Sanofi

<120> ТРИСПЕЦИФИЧЕСКИЕ СВЯЗЫВАЮЩИЕ БЕЛКИ, СВЯЗЫВАЮЩИЕ CD38, CD28 И CD3,

А ТАКЖЕ СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ

<130> 18395-20321.40

<140> Пока еще не назначен

<141> Одновременно с этим

<150> EP 19306097.7

<151> 2019-09-11

<150> US 62/831,608

<151> 2019-04-09

<150> US 62/831,572

<151> 2019-04-09

<150> PCT/US2018/055084

<151> 2018-10-09

<160> 132

<170> FastSEQ для Windows версии 4.0

<210> 1

<211> 256

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 1

Arg Trp Arg Gln Gln Trp Ser Gly Pro Gly Thr Thr Lys Arg Phe Pro

1. 5 10 15

Glu Thr Val Leu Ala Arg Cys Val Lys Tyr Thr Glu Ile His Pro Glu

20 25 30

Met Arg His Val Asp Cys Gln Ser Val Trp Asp Ala Phe Lys Gly Ala

35 40 45

Phe Ile Ser Lys His Pro Cys Asn Ile Thr Glu Glu Asp Tyr Gln Pro

50 55 60

Leu Met Lys Leu Gly Thr Gln Thr Val Pro Cys Asn Lys Ile Leu Leu

65 70 75 80

Trp Ser Arg Ile Lys Asp Leu Ala His Gln Phe Thr Gln Val Gln Arg

85 90 95

Asp Met Phe Thr Leu Glu Asp Thr Leu Leu Gly Tyr Leu Ala Asp Asp

100 105 110

Leu Thr Trp Cys Gly Glu Phe Asn Thr Ser Lys Ile Asn Tyr Gln Ser

115 120 125

Cys Pro Asp Trp Arg Lys Asp Cys Ser Asn Asn Pro Val Ser Val Phe

130 135 140

Trp Lys Thr Val Ser Arg Arg Phe Ala Glu Ala Ala Cys Asp Val Val

145 150 155 160

His Val Met Leu Asn Gly Ser Arg Ser Lys Ile Phe Asp Lys Asn Ser

165 170 175

Thr Phe Gly Ser Val Glu Val His Asn Leu Gln Pro Glu Lys Val Gln

180 185 190

Thr Leu Glu Ala Trp Val Ile His Gly Gly Arg Glu Asp Ser Arg Asp

195 200 205

Leu Cys Gln Asp Pro Thr Ile Lys Glu Leu Glu Ser Ile Ile Ser Lys

210 215 220

Arg Asn Ile Gln Phe Ser Cys Lys Asn Ile Tyr Arg Pro Asp Lys Phe

225 230 235 240

Leu Gln Cys Val Lys Asn Pro Glu Asp Ser Ser Cys Thr Ser Glu Ile

245 250 255

<210> 2

<211> 265

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 2

Arg Trp Arg Gln Gln Trp Ser Gly Pro Gly Thr Thr Lys Arg Phe Pro

1. 5 10 15

Glu Thr Val Leu Ala Arg Cys Val Lys Tyr Thr Glu Ile His Pro Glu

20 25 30

Met Arg His Val Asp Cys Gln Ser Val Trp Asp Ala Phe Lys Gly Ala

35 40 45

Phe Ile Ser Lys His Pro Cys Asn Ile Thr Glu Glu Asp Tyr Gln Pro

50 55 60

Leu Met Lys Leu Gly Thr Gln Thr Val Pro Cys Asn Lys Ile Leu Leu

65 70 75 80

Trp Ser Arg Ile Lys Asp Leu Ala His Gln Phe Thr Gln Val Gln Arg

85 90 95

Asp Met Phe Thr Leu Glu Asp Thr Leu Leu Gly Tyr Leu Ala Asp Asp

100 105 110

Leu Thr Trp Cys Gly Glu Phe Asn Thr Ser Lys Ile Asn Tyr Gln Ser

115 120 125

Cys Pro Asp Trp Arg Lys Asp Cys Ser Asn Asn Pro Val Ser Val Phe

130 135 140

Trp Lys Thr Val Ser Arg Arg Phe Ala Glu Ala Ala Cys Asp Val Val

145 150 155 160

His Val Met Leu Asn Gly Ser Arg Ser Lys Ile Phe Asp Lys Asn Ser

165 170 175

Thr Phe Gly Ser Val Glu Val His Asn Leu Gln Pro Glu Lys Val Gln

180 185 190

Thr Leu Glu Ala Trp Val Ile His Gly Gly Arg Glu Asp Ser Arg Asp

195 200 205

Leu Cys Gln Asp Pro Thr Ile Lys Glu Leu Glu Ser Ile Ile Ser Lys

210 215 220

Arg Asn Ile Gln Phe Ser Cys Lys Asn Ile Tyr Arg Pro Asp Lys Phe

225 230 235 240

Leu Gln Cys Val Lys Asn Pro Glu Asp Ser Ser Cys Thr Ser Glu Ile

245 250 255

Ser Ala Ser His His His His His His

260 265

<210> 3

<400> 3

000

<210> 4

<211> 265

<212> БЕЛОК

<213> Macaca fascicularis

<400> 4

Arg Trp Arg Gln Gln Trp Ser Gly Ser Gly Thr Thr Ser Arg Phe Pro

1. 5 10 15

Glu Thr Val Leu Ala Arg Cys Val Lys Tyr Thr Glu Val His Pro Glu

20 25 30

Met Arg His Val Asp Cys Gln Ser Val Trp Asp Ala Phe Lys Gly Ala

35 40 45

Phe Ile Ser Lys Tyr Pro Cys Asn Ile Thr Glu Glu Asp Tyr Gln Pro

50 55 60

Leu Val Lys Leu Gly Thr Gln Thr Val Pro Cys Asn Lys Thr Leu Leu

65 70 75 80

Trp Ser Arg Ile Lys Asp Leu Ala His Gln Phe Thr Gln Val Gln Arg

85 90 95

Asp Met Phe Thr Leu Glu Asp Met Leu Leu Gly Tyr Leu Ala Asp Asp

100 105 110

Leu Thr Trp Cys Gly Glu Phe Asn Thr Phe Glu Ile Asn Tyr Gln Ser

115 120 125

Cys Pro Asp Trp Arg Lys Asp Cys Ser Asn Asn Pro Val Ser Val Phe

130 135 140

Trp Lys Thr Val Ser Arg Arg Phe Ala Glu Thr Ala Cys Gly Val Val

145 150 155 160

His Val Met Leu Asn Gly Ser Arg Ser Lys Ile Phe Asp Lys Asn Ser

165 170 175

Thr Phe Gly Ser Val Glu Val His Asn Leu Gln Pro Glu Lys Val Gln

180 185 190

Ala Leu Glu Ala Trp Val Ile His Gly Gly Arg Glu Asp Ser Arg Asp

195 200 205

Leu Cys Gln Asp Pro Thr Ile Lys Glu Leu Glu Ser Ile Ile Ser Lys

210 215 220

Arg Asn Ile Arg Phe Phe Cys Lys Asn Ile Tyr Arg Pro Asp Lys Phe

225 230 235 240

Leu Gln Cys Val Lys Asn Pro Glu Asp Ser Ser Cys Leu Ser Gly Ile

245 250 255

Ser Ala Ser His His His His His His

260 265

<210> 5

<211> 119

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 5

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Ser Gly Ala

1. 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe

20 25 30

Asn Met His Trp Val Lys Glu Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Ile Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Thr Gly Gly Leu Arg Arg Ala Tyr Phe Thr Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

115

<210> 6

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 6

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1. 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr

20 25 30

Gly Asn Gly Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Lys

85 90 95

Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 7

<211> 449

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 7

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Ser Gly Ala

1. 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe

20 25 30

Asn Met His Trp Val Lys Glu Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Ile Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Thr Gly Gly Leu Arg Arg Ala Tyr Phe Thr Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Ala Gly

225 230 235 240

Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 8

<211> 218

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 8

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1. 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr

20 25 30

Gly Asn Gly Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Lys

85 90 95

Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 9

<211> 117

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 9

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1. 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gly Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Met Phe Arg Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 10

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 10

Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1. 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp

20 25 30

Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Tyr Ile Tyr Tyr Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 11

<211> 446

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 11

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1. 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gly Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Met Phe Arg Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Ala Gly Pro Asp Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

<210> 12

<211> 214

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 12

Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1. 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp

20 25 30

Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Tyr Ile Tyr Tyr Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 13

<211> 120

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 13

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1. 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Lys Glu Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Gln Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Thr Gly Gly Leu Arg Arg Ala Tyr Phe Thr Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 14

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 14

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1. 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Gln Gly Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Pro Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Lys

85 90 95

Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 15

<211> 449

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 15

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1. 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Lys Glu Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Gln Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Thr Gly Gly Leu Arg Arg Ala Tyr Phe Thr Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Ala Gly

225 230 235 240

Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 16

<211> 218

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 16

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1. 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Gln Gly Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Pro Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Lys

85 90 95

Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 17

<211> 120

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 17

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1. 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe

20 25 30

Asn Met His Trp Val Lys Glu Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Thr Gly Gly Leu Arg Arg Ala Tyr Phe Thr Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 18

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 18

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1. 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr

20 25 30

Gly Asn Gly Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Pro Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Lys

85 90 95

Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 19

<211> 449

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 19

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1. 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe

20 25 30

Asn Met His Trp Val Lys Glu Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Thr Gly Gly Leu Arg Arg Ala Tyr Phe Thr Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Ala Gly

225 230 235 240

Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 20

<211> 218

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 20

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1. 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr

20 25 30

Gly Asn Gly Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Pro Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Lys

85 90 95

Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 21

<211> 120

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 21

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Ser Gly Ala

1. 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe

20 25 30

Asn Met His Trp Val Lys Glu Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Ile Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Thr Gly Gly Leu Arg Arg Ala Tyr Phe Thr Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 22

<211> 449

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 22

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Ser Gly Ala

1. 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe

20 25 30

Asn Met His Trp Val Lys Glu Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Ile Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Thr Gly Gly Leu Arg Arg Ala Tyr Phe Thr Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Ala Gly

225 230 235 240

Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 23

<211> 120

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 23

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1. 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe

20 25 30

Asn Met His Trp Val Lys Glu Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Ile Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Thr Gly Gly Leu Arg Arg Ala Tyr Phe Thr Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 24

<211> 449

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 24

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1. 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe

20 25 30

Asn Met His Trp Val Lys Glu Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Ile Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Thr Gly Gly Leu Arg Arg Ala Tyr Phe Thr Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Ala Gly

225 230 235 240

Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 25

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 25

Ser Leu Tyr Asn Thr Val Ala Thr Leu

1. 5

<210> 26

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 26

Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val

1. 5

<210> 27

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 27

Gly Leu Cys Thr Leu Val Ala Met Leu

1. 5

<210> 28

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 28

Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu

1. 5

<210> 29

<400> 29

000

<210> 30

<211> 256

<212> БЕЛОК

<213> Macaca fascicularis

<400> 30

Arg Trp Arg Gln Gln Trp Ser Gly Ser Gly Thr Thr Ser Arg Phe Pro

1. 5 10 15

Glu Thr Val Leu Ala Arg Cys Val Lys Tyr Thr Glu Val His Pro Glu

20 25 30

Met Arg His Val Asp Cys Gln Ser Val Trp Asp Ala Phe Lys Gly Ala

35 40 45

Phe Ile Ser Lys Tyr Pro Cys Asn Ile Thr Glu Glu Asp Tyr Gln Pro

50 55 60

Leu Val Lys Leu Gly Thr Gln Thr Val Pro Cys Asn Lys Thr Leu Leu

65 70 75 80

Trp Ser Arg Ile Lys Asp Leu Ala His Gln Phe Thr Gln Val Gln Arg

85 90 95

Asp Met Phe Thr Leu Glu Asp Met Leu Leu Gly Tyr Leu Ala Asp Asp

100 105 110

Leu Thr Trp Cys Gly Glu Phe Asn Thr Phe Glu Ile Asn Tyr Gln Ser

115 120 125

Cys Pro Asp Trp Arg Lys Asp Cys Ser Asn Asn Pro Val Ser Val Phe

130 135 140

Trp Lys Thr Val Ser Arg Arg Phe Ala Glu Thr Ala Cys Gly Val Val

145 150 155 160

His Val Met Leu Asn Gly Ser Arg Ser Lys Ile Phe Asp Lys Asn Ser

165 170 175

Thr Phe Gly Ser Val Glu Val His Asn Leu Gln Pro Glu Lys Val Gln

180 185 190

Ala Leu Glu Ala Trp Val Ile His Gly Gly Arg Glu Asp Ser Arg Asp

195 200 205

Leu Cys Gln Asp Pro Thr Ile Lys Glu Leu Glu Ser Ile Ile Ser Lys

210 215 220

Arg Asn Ile Arg Phe Phe Cys Lys Asn Ile Tyr Arg Pro Asp Lys Phe

225 230 235 240

Leu Gln Cys Val Lys Asn Pro Glu Asp Ser Ser Cys Leu Ser Gly Ile

245 250 255

<210> 31

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 31

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe Asn

1. 5

<210> 32

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 32

Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Gly Thr

1. 5

<210> 33

<211> 13

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 33

Ala Arg Thr Gly Gly Leu Arg Arg Ala Tyr Phe Thr Tyr

1. 5 10

<210> 34

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 34

Glu Ser Val Asp Ser Tyr Gly Asn Gly Phe

1. 5 10

<210> 35

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 35

Leu Ala Ser

1

<210> 36

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 36

Gln Gln Asn Lys Glu Asp Pro Trp Thr

1. 5

<210> 37

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 37

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Ala

1. 5

<210> 38

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 38

Ile Tyr Pro Gly Gln Gly Gly Thr

1. 5

<210> 39

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 39

Gln Ser Val Ser Ser Tyr Gly Gln Gly Phe

1. 5 10

<210> 40

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 40

Gly Ala Ser

1

<210> 41

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 41

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly

1. 5

<210> 42

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 42

Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys

1. 5

<210> 43

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 43

Ala Arg Met Phe Arg Gly Ala Phe Asp Tyr

1. 5 10

<210> 44

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 44

Gln Gly Ile Arg Asn Asp

1. 5

<210> 45

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 45

Ala Ala Ser

1

<210> 46

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 46

Leu Gln Asp Tyr Ile Tyr Tyr Pro Thr

1. 5

<210> 47

<211> 120

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 47

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Lys Pro Gly Thr

1. 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Lys Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met His Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Asp Tyr Tyr Gly Ser Asn Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 48

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 48

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Leu Ser Met Ser Thr Ser Leu Gly

1. 5 10 15

Asp Pro Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Val

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Arg Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ile Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Pro Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 49

<211> 120

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 49

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1. 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ser Ile Tyr Pro Gly Asn Val Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Ser His Tyr Gly Leu Asp Trp Asn Phe Asp Val Trp Gly Lys

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 50

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 50

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1. 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Val Trp

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Thr Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 51

<211> 119

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 51

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1. 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asp Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Lys Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Asp Lys Gly Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

115

<210> 52

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 52

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly

1. 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr

20 25 30

Val Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Phe Ala Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Asn Asp Val Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg

85 90 95

Lys Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 53

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 53

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1. 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Lys Ala

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Gln Ile Lys Asp Lys Ser Asn Ser Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Arg Gly Val Tyr Tyr Ala Leu Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 54

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 54

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1. 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val His Asn

20 25 30

Asn Ala Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Ser Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Gly

85 90 95

Thr Gln Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 55

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 55

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1. 5 10

<210> 56

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 56

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1. 5 10 15

<210> 57

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 57

Thr Lys Gly Pro Ser

1. 5

<210> 58

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 58

Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro

1. 5

<210> 59

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 59

Gly Gly Ser Gly Ser Ser Gly Ser Gly Gly

1. 5 10

<210> 60

<211> 570

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 60

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1. 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ser Ile Tyr Pro Gly Asn Val Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Ser His Tyr Gly Leu Asp Trp Asn Phe Asp Val Trp Gly Lys

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala

130 135 140

Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Lys Ala Trp Met His Trp Val Arg Gln

145 150 155 160

Ala Pro Gly Lys Gln Leu Glu Trp Val Ala Gln Ile Lys Asp Lys Ser

165 170 175

Asn Ser Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr

180 185 190

Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser

195 200 205

Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Arg Gly Val Tyr Tyr

210 215 220

Ala Leu Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

225 230 235 240

Ser Ser Arg Thr Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

245 250 255

Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

260 265 270

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

275 280 285

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

290 295 300

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

305 310 315 320

Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr

325 330 335

Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro

340 345 350

Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

355 360 365

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

370 375 380

Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn

385 390 395 400

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

405 410 415

Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

420 425 430

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

435 440 445

Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

450 455 460

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu

465 470 475 480

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe

485 490 495

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

500 505 510

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

515 520 525

Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly

530 535 540

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

545 550 555 560

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly

565 570

<210> 61

<211> 338

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 61

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1. 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val His Asn

20 25 30

Asn Ala Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Ser Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Gly

85 90 95

Thr Gln Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser

115 120 125

Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala

130 135 140

Ser Gln Asn Ile Tyr Val Trp Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly

145 150 155 160

Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly

165 170 175

Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

180 185 190

Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln

195 200 205

Gln Gly Gln Thr Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu

210 215 220

Ile Lys Thr Lys Gly Pro Ser Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe

225 230 235 240

Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val

245 250 255

Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp

260 265 270

Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr

275 280 285

Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr

290 295 300

Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val

305 310 315 320

Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly

325 330 335

Glu Cys

<210> 62

<211> 446

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 62

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1. 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Lys Glu Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Gln Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Thr Gly Gly Leu Arg Arg Ala Tyr Phe Thr Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro

210 215 220

Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Cys Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly

435 440 445

<210> 63

<211> 218

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 63

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1. 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Gln Gly Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Pro Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Lys

85 90 95

Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 64

<211> 573

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 64

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1. 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ser Ile Tyr Pro Gly Asn Val Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Ser His Tyr Gly Leu Asp Trp Asn Phe Asp Val Trp Gly Lys

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala

130 135 140

Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Lys Ala Trp Met His Trp Val Arg Gln

145 150 155 160

Ala Pro Gly Lys Gln Leu Glu Trp Val Ala Gln Ile Lys Asp Lys Ser

165 170 175

Asn Ser Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr

180 185 190

Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser

195 200 205

Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Arg Gly Val Tyr Tyr

210 215 220

Ala Leu Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

225 230 235 240

Ser Ser Arg Thr Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

245 250 255

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

260 265 270

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

275 280 285

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

290 295 300

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

305 310 315 320

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

325 330 335

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

340 345 350

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe

355 360 365

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

370 375 380

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

385 390 395 400

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

405 410 415

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

420 425 430

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

435 440 445

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Ala Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

450 455 460

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro

465 470 475 480

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val

485 490 495

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

500 505 510

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

515 520 525

Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

530 535 540

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

545 550 555 560

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

565 570

<210> 65

<211> 449

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 65

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1. 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Lys Glu Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Gln Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Thr Gly Gly Leu Arg Arg Ala Tyr Phe Thr Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Ala Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 66

<211> 573

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 66

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1. 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ser Ile Tyr Pro Gly Asn Val Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Ser His Tyr Gly Leu Asp Trp Asn Phe Asp Val Trp Gly Lys

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala

130 135 140

Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Lys Ala Trp Met His Trp Val Arg Gln

145 150 155 160

Ala Pro Gly Lys Gln Leu Glu Trp Val Ala Gln Ile Lys Asp Lys Ser

165 170 175

Asn Ser Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr

180 185 190

Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser

195 200 205

Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Arg Gly Val Tyr Tyr

210 215 220

Ala Leu Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

225 230 235 240

Ser Ser Arg Thr Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

245 250 255

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

260 265 270

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

275 280 285

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

290 295 300

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

305 310 315 320

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

325 330 335

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

340 345 350

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

355 360 365

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

370 375 380

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

385 390 395 400

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

405 410 415

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Asn Ala Ser Arg Val Val Ser Val

420 425 430

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

435 440 445

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

450 455 460

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro

465 470 475 480

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val

485 490 495

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

500 505 510

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

515 520 525

Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

530 535 540

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

545 550 555 560

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

565 570

<210> 67

<211> 449

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 67

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1. 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Lys Glu Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Gln Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Thr Gly Gly Leu Arg Arg Ala Tyr Phe Thr Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Asn Ala Ser Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 68

<211> 443

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 68

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1. 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gly Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Met Phe Arg Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro

210 215 220

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

225 230 235 240

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

245 250 255

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe

260 265 270

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

275 280 285

Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

290 295 300

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

305 310 315 320

Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

325 330 335

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Gln

340 345 350

Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly

355 360 365

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

370 375 380

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

385 390 395 400

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu

405 410 415

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

420 425 430

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly

435 440

<210> 69

<211> 214

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 69

Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1. 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp

20 25 30

Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Tyr Ile Tyr Tyr Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 70

<211> 446

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 70

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1. 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gly Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Met Phe Arg Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Ala Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

<210> 71

<211> 446

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 71

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1. 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gly Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Met Phe Arg Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Asn Ala Ser Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

<210> 72

<211> 1710

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 72

caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgag gtcgtgaaac ctggcgcctc tgtgaaggtg 60

tcctgcaagg ccagcggcta cacctttacc agctactaca tccactgggt gcgccaggcc 120

cctggacagg gactggaatg gatcggcagc atctaccccg gcaacgtgaa caccaactac 180

gcccagaagt tccagggcag agccaccctg accgtggaca ccagcatcag caccgcctac 240

atggaactga gccggctgag aagcgacgac accgccgtgt actactgcac ccggtcccac 300

tacggcctgg attggaactt cgacgtgtgg ggcaagggca ccaccgtgac agtgtctagc 360

agccaggtgc agctggtgga atctggcggc ggagtggtgc agcctggcag aagcctgaga 420

ctgagctgtg ccgccagcgg cttcaccttc accaaggcct ggatgcactg ggtgcgccag 480

gcccctggaa agcagctgga atgggtggcc cagatcaagg acaagagcaa cagctacgcc 540

acctactacg ccgacagcgt gaagggccgg ttcaccatca gccgggacga cagcaagaac 600

accctgtacc tgcagatgaa cagcctgcgg gccgaggaca ccgccgtgta ctactgtcgg 660

ggcgtgtact atgccctgag ccccttcgat tactggggcc agggaaccct cgtgaccgtg 720

tctagtcgga ccgccagcac aaagggccca tcggtgttcc ctctggcccc ttgcagcaga 780

agcaccagcg aatctacagc cgccctgggc tgcctcgtga aggactactt tcccgagccc 840

gtgaccgtgt cctggaactc tggcgctctg acaagcggcg tgcacacctt tccagccgtg 900

ctccagagca gcggcctgta ctctctgagc agcgtcgtga cagtgcccag cagcagcctg 960

ggcaccaaga cctacacctg taacgtggac cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 1020

cgggtggaat ctaagtacgg ccctccctgc cctccttgcc cagcccctga agctgccggc 1080

ggaccctccg tgttcctgtt ccccccaaag cccaaggaca ccctgatgat cagccggacc 1140

cccgaagtga cctgcgtggt ggtggatgtg tcccaggaag atcccgaggt gcagttcaat 1200

tggtacgtgg acggcgtgga agtgcacaac gccaagacca agcccagaga ggaacagttc 1260

aacagcacct accgggtggt gtccgtgctg accgtgctgc accaggactg gctgaacggc 1320

aaagagtaca agtgcaaggt gtccaacaag ggcctgccca gctccatcga gaaaaccatc 1380

agcaaggcca agggccagcc ccgcgagcct caagtgtgta ccctgccccc tagccaggaa 1440

gagatgacca agaaccaggt gtccctgagc tgtgccgtga aaggcttcta ccccagcgac 1500

attgccgtgg aatgggagag caacggccag cccgagaaca actacaagac caccccccct 1560

gtgctggaca gcgacggctc attcttcctg gtgtccaagc tgaccgtgga caagagccgg 1620

tggcaggaag gcaacgtgtt cagctgctcc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac 1680

acccagaagt ccctgtctct gtccctgggc 1710

<210> 73

<211> 1014

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 73

gacatcgtga tgacccagac ccccctgagc ctgagcgtga cacctggaca gcctgccagc 60

atcagctgca agagcagcca gagcctggtg cacaacaacg ccaacaccta cctgagctgg 120

tatctgcaga agcccggcca gagcccccag tccctgatct acaaggtgtc caacagattc 180

agcggcgtgc ccgacagatt ctccggcagc ggctctggca ccgacttcac cctgaagatc 240

agccgggtgg aagccgagga cgtgggcgtg tactattgtg gccagggcac ccagtacccc 300

ttcacctttg gcagcggcac caaggtggaa atcaagggcc agcccaaggc cgcccccgac 360

atccagatga cccagagccc cagcagcctg tctgccagcg tgggcgacag agtgaccatc 420

acctgtcagg ccagccagaa catctacgtg tggctgaact ggtatcagca gaagcccggc 480

aaggccccca agctgctgat ctacaaggcc agcaacctgc acaccggcgt gcccagcaga 540

ttttctggca gcggctccgg caccgacttc accctgacaa tcagctccct gcagcccgag 600

gacattgcca cctactactg ccagcagggc cagacctacc cctacacctt tggccagggc 660

accaagctgg aaatcaagac caagggcccc agccgtacgg tggccgctcc cagcgtgttc 720

atcttcccac ctagcgacga gcagctgaag tccggcacag cctctgtcgt gtgcctgctg 780

aacaacttct acccccgcga ggccaaagtg cagtggaagg tggacaacgc cctgcagagc 840

ggcaacagcc aggaaagcgt gaccgagcag gacagcaagg actccaccta cagcctgagc 900

agcaccctga cactgagcaa ggccgactac gagaagcaca aggtgtacgc ctgcgaagtg 960

acccaccagg gcctgtctag ccccgtgacc aagagcttca accggggcga gtgt 1014

<210> 74

<211> 1338

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 74

caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtcgtgaaac ctggcgcctc cgtgaaggtg 60

tcctgcaagg ccagcggcta cacctttacc agctacgcca tgcactgggt caaagaggcc 120

cctggccaga gactggaatg gatcggctac atctaccccg gccagggcgg caccaactac 180

aaccagaagt tccagggcag agccaccctg accgccgata caagcgccag caccgcctac 240

atggaactga gcagcctgcg gagcgaggat accgccgtgt acttctgtgc cagaacaggc 300

ggcctgaggc gggcctactt tacctattgg ggccagggca ccctcgtgac cgtgtctagc 360

gctagcacaa agggcccatc ggtgttccct ctggcccctt gcagcagaag caccagcgaa 420

tctacagccg ccctgggctg cctcgtgaag gactactttc ccgagcccgt gaccgtgtcc 480

tggaactctg gcgctctgac aagcggcgtg cacacctttc cagccgtgct ccagagcagc 540

ggcctgtact ctctgagcag cgtcgtgaca gtgcccagca gcagcctggg caccaagacc 600

tacacctgta acgtggacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagcg ggtggaatct 660

aagtacggcc ctccctgccc tccttgccca gcccctgaag ctgccggcgg accctccgtg 720

ttcctgttcc ccccaaagcc caaggacacc ctgatgatca gccggacccc cgaagtgacc 780

tgcgtggtgg tggatgtgtc ccaggaagat cccgaggtgc agttcaattg gtacgtggac 840

ggcgtggaag tgcacaacgc caagaccaag cccagagagg aacagttcaa cagcacctac 900

cgggtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa agagtacaag 960

tgcaaggtgt ccaacaaggg cctgcccagc tccatcgaga aaaccatcag caaggccaag 1020

ggccagcccc gcgagcctca agtgtatacc ctgccccctt gccaggaaga gatgaccaag 1080

aaccaggtgt ccctgtggtg tctcgtgaaa ggcttctacc ccagcgacat tgccgtggaa 1140

tgggagagca acggccagcc cgagaacaac tacaagacca ccccccctgt gctggacagc 1200

gacggctcat tcttcctgta ctccaagctg accgtggaca agagccggtg gcaggaaggc 1260

aacgtgttca gctgctccgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagtcc 1320

ctgtctctgt ccctgggc 1338

<210> 75

<211> 654

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 75

gacatcgtgc tgacacagag ccctgccacc ctgtctctga gccctggcga gagagccacc 60

atcagctgta gagccagcca gagcgtgtcc agctacggcc agggcttcat gcactggtat 120

cagcagaagc ccggccagcc ccccagactg ctgatctatg gcgccagcag cagagccaca 180

ggcatccccg ccagattttc tggctctggc agcggcaccg acttcaccct gacaatcagc 240

cccctggaac ccgaggactt cgccgtgtac tactgccagc agaacaaaga ggacccctgg 300

accttcggcg gaggcaccaa gctggaaatc aagcgtacgg tggccgctcc cagcgtgttc 360

atcttcccac ctagcgacga gcagctgaag tccggcacag cctctgtcgt gtgcctgctg 420

aacaacttct acccccgcga ggccaaggtg cagtggaagg tggacaatgc cctgcagagc 480

ggcaacagcc aggaaagcgt gaccgagcag gacagcaagg actccaccta cagcctgagc 540

agcaccctga ccctgtccaa ggccgattac gagaagcaca aggtgtacgc ctgcgaagtg 600

acccaccagg gcctgtctag ccccgtgacc aagagcttca accggggcga gtgc 654

<210> 76

<211> 1719

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 76

caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgag gtcgtgaaac ctggcgcctc tgtgaaggtg 60

tcctgcaagg ccagcggcta cacctttacc agctactaca tccactgggt gcgccaggcc 120

cctggacagg gactggaatg gatcggcagc atctaccccg gcaacgtgaa caccaactac 180

gcccagaagt tccagggcag agccaccctg accgtggaca ccagcatcag caccgcctac 240

atggaactga gccggctgag aagcgacgac accgccgtgt actactgcac ccggtcccac 300

tacggcctgg attggaactt cgacgtgtgg ggcaagggca ccaccgtgac agtgtctagc 360

agccaggtgc agctggtgga atctggcggc ggagtggtgc agcctggcag aagcctgaga 420

ctgagctgtg ccgccagcgg cttcaccttc accaaggcct ggatgcactg ggtgcgccag 480

gcccctggaa agcagctgga atgggtggcc cagatcaagg acaagagcaa cagctacgcc 540

acctactacg ccgacagcgt gaagggccgg ttcaccatca gccgggacga cagcaagaac 600

accctgtacc tgcagatgaa cagcctgcgg gccgaggaca ccgccgtgta ctactgtcgg 660

ggcgtgtact atgccctgag ccccttcgat tactggggcc agggaaccct cgtgaccgtg 720

tctagtcgga ccgccagcac aaagggcccc agcgtgttcc ctctggcccc tagcagcaag 780

agcacatctg gcggaacagc cgccctgggc tgcctcgtga aggactactt tcccgagccc 840

gtgaccgtgt cctggaattc tggcgccctg accagcggcg tgcacacctt tccagctgtg 900

ctgcagtcca gcggcctgta cagcctgagc agcgtcgtga cagtgcccag cagctctctg 960

ggcacccaga cctacatctg caacgtgaac cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 1020

aaggtggaac ccaagagctg cgacaagacc cacacctgtc ccccttgtcc tgcccccgaa 1080

gccgccggag gcccttccgt gttcctgttc cccccaaagc ccaaggacac cctgatgatc 1140

agccggaccc ccgaagtgac ctgcgtggtg gtggatgtgt cccacgagga ccctgaagtg 1200

aagttcaatt ggtacgtgga cggcgtggaa gtgcacaacg ccaagaccaa gccaagagag 1260

gaacagtaca acagcaccta ccgggtggtg tccgtgctga ccgtgctgca ccaggactgg 1320

ctgaacggca aagagtacaa gtgcaaggtg tccaacaagg ccctggccgc ccccatcgag 1380

aaaaccatca gcaaggccaa gggccagccc cgcgaacccc aggtgtgcac actgccccca 1440

agcagggacg agctgaccaa gaaccaggtg tccctgagct gtgccgtgaa aggcttctac 1500

ccctccgata tcgccgtgga atgggagagc aacggccagc ccgagaacaa ctacaagacc 1560

accccccctg tgctggacag cgacggctca ttcttcctgg tgtccaagct gacagtggac 1620

aagtcccggt ggcagcaggg caacgtgttc agctgctccg tgatgcacga ggccctgcac 1680

aaccactaca cccagaagtc cctgagcctg agccccggc 1719

<210> 77

<211> 1347

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 77

caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtcgtgaaac ctggcgcctc cgtgaaggtg 60

tcctgcaagg ccagcggcta cacctttacc agctacgcca tgcactgggt caaagaggcc 120

cctggccaga gactggaatg gatcggctac atctaccccg gccagggcgg caccaactac 180

aaccagaagt tccagggcag agccaccctg accgccgata caagcgccag caccgcctac 240

atggaactga gcagcctgcg gagcgaggat accgccgtgt acttctgtgc cagaacaggc 300

ggcctgaggc gggcctactt tacctattgg ggccagggca ccctcgtgac cgtgtctagc 360

gctagcacaa agggccccag cgtgttccct ctggccccta gcagcaagag cacatctggc 420

ggaacagccg ccctgggctg cctcgtgaag gactactttc ccgagcccgt gaccgtgtcc 480

tggaattctg gcgccctgac cagcggcgtg cacacctttc cagctgtgct gcagtccagc 540

ggcctgtaca gcctgagcag cgtcgtgaca gtgcccagca gctctctggg cacccagacc 600

tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggaaccc 660

aagagctgcg acaagaccca cacctgtccc ccttgtcctg cccccgaagc cgccggaggc 720

ccttccgtgt tcctgttccc cccaaagccc aaggacaccc tgatgatcag ccggaccccc 780

gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtcc cacgaggacc ctgaagtgaa gttcaattgg 840

tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc aagaccaagc caagagagga acagtacaac 900

agcacctacc gggtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa 960

gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaggcc ctggccgccc ccatcgagaa aaccatcagc 1020

aaggccaagg gccagccccg cgaaccccag gtgtacacac tgcccccatg cagggacgag 1080

ctgaccaaga accaggtgtc cctgtggtgt ctggtgaaag gcttctaccc ctccgatatc 1140

gccgtggaat gggagagcaa cggccagccc gagaacaact acaagaccac cccccctgtg 1200

ctggacagcg acggctcatt cttcctgtac tccaagctga cagtggacaa gtcccggtgg 1260

cagcagggca acgtgttcag ctgctccgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 1320

cagaagtccc tgagcctgag ccccggc 1347

<210> 78

<211> 1719

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 78

caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgag gtcgtgaaac ctggcgcctc tgtgaaggtg 60

tcctgcaagg ccagcggcta cacctttacc agctactaca tccactgggt gcgccaggcc 120

cctggacagg gactggaatg gatcggcagc atctaccccg gcaacgtgaa caccaactac 180

gcccagaagt tccagggcag agccaccctg accgtggaca ccagcatcag caccgcctac 240

atggaactga gccggctgag aagcgacgac accgccgtgt actactgcac ccggtcccac 300

tacggcctgg attggaactt cgacgtgtgg ggcaagggca ccaccgtgac agtgtctagc 360

agccaggtgc agctggtgga atctggcggc ggagtggtgc agcctggcag aagcctgaga 420

ctgagctgtg ccgccagcgg cttcaccttc accaaggcct ggatgcactg ggtgcgccag 480

gcccctggaa agcagctgga atgggtggcc cagatcaagg acaagagcaa cagctacgcc 540

acctactacg ccgacagcgt gaagggccgg ttcaccatca gccgggacga cagcaagaac 600

accctgtacc tgcagatgaa cagcctgcgg gccgaggaca ccgccgtgta ctactgtcgg 660

ggcgtgtact atgccctgag ccccttcgat tactggggcc agggaaccct cgtgaccgtg 720

tctagtcgga ccgccagcac aaagggcccc agcgtgttcc ctctggcccc tagcagcaag 780

agcacatctg gcggaacagc cgccctgggc tgcctcgtga aggactactt tcccgagccc 840

gtgaccgtgt cctggaattc tggcgccctg accagcggcg tgcacacctt tccagctgtg 900

ctgcagtcca gcggcctgta cagcctgagc agcgtcgtga cagtgcccag cagctctctg 960

ggcacccaga cctacatctg caacgtgaac cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 1020

aaggtggaac ccaagagctg cgacaagacc cacacctgtc ccccttgtcc tgcccccgaa 1080

ctgctgggag gcccttccgt gttcctgttc cccccaaagc ccaaggacac cctgatgatc 1140

agccggaccc ccgaagtgac ctgcgtggtg gtggatgtgt cccacgagga ccctgaagtg 1200

aagttcaatt ggtacgtgga cggcgtggaa gtgcacaacg ccaagaccaa gccaagagag 1260

gaacagtaca acaatgcctc ccgggtggtg tccgtgctga ccgtgctgca ccaggactgg 1320

ctgaacggca aagagtacaa gtgcaaggtg tccaacaagg ccctgcctgc ccccatcgag 1380

aaaaccatca gcaaggccaa gggccagccc cgcgaacccc aggtgtgcac actgccccca 1440

agcagggacg agctgaccaa gaaccaggtg tccctgagct gtgccgtgaa aggcttctac 1500

ccctccgata tcgccgtgga atgggagagc aacggccagc ccgagaacaa ctacaagacc 1560

accccccctg tgctggacag cgacggctca ttcttcctgg tgtccaagct gacagtggac 1620

aagtcccggt ggcagcaggg caacgtgttc agctgctccg tgatgcacga ggccctgcac 1680

aaccactaca cccagaagtc cctgagcctg agccccggc 1719

<210> 79

<211> 1347

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 79

caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtcgtgaaac ctggcgcctc cgtgaaggtg 60

tcctgcaagg ccagcggcta cacctttacc agctacgcca tgcactgggt caaagaggcc 120

cctggccaga gactggaatg gatcggctac atctaccccg gccagggcgg caccaactac 180

aaccagaagt tccagggcag agccaccctg accgccgata caagcgccag caccgcctac 240

atggaactga gcagcctgcg gagcgaggat accgccgtgt acttctgtgc cagaacaggc 300

ggcctgaggc gggcctactt tacctattgg ggccagggca ccctcgtgac cgtgtctagc 360

gctagcacaa agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 660

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 720

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840

tatgttgacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 900

aatgcctccc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatg ccgggatgag 1080

ctgaccaaga atcaagtcag cctgtggtgc ctggtaaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200

ctggactccg acggctcctt cttcctctac tcaaaactca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320

cagaagagcc tctccctgtc tccgggt 1347

<210> 80

<211> 1329

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 80

caggtgcagc tggtggaaag cggcggaggc gtggtgcagc ctggcaggtc tctgagactg 60

agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc agctacggaa tgcactgggt gcgccaggcc 120

cctggcaaag gactggaatg ggtggccgtg atttggtacg acggcagcaa caagtactac 180

gccgacagcg tgaagggccg gttcaccatc agcggcgaca acagcaagaa caccctgtac 240

ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagaatgttc 300

agaggcgcct tcgactactg gggccagggc acactcgtga ccgtgtctag tgcgtcgacc 360

aagggcccat cggtgttccc tctggcccct tgcagcagaa gcaccagcga atctacagcc 420

gccctgggct gcctcgtgaa ggactacttt cccgagcccg tgaccgtgtc ctggaactct 480

ggcgctctga caagcggcgt gcacaccttt ccagccgtgc tccagagcag cggcctgtac 540

tctctgagca gcgtcgtgac agtgcccagc agcagcctgg gcaccaagac ctacacctgt 600

aacgtggacc acaagcccag caacaccaag gtggacaagc gggtggaatc taagtacggc 660

cctccctgcc ctccttgccc agcccctgaa gctgccggcg gaccctccgt gttcctgttc 720

cccccaaagc ccaaggacac cctgatgatc agccggaccc ccgaagtgac ctgcgtggtg 780

gtggatgtgt cccaggaaga tcccgaggtg cagttcaatt ggtacgtgga cggcgtggaa 840

gtgcacaacg ccaagaccaa gcccagagag gaacagttca acagcaccta ccgggtggtg 900

tccgtgctga ccgtgctgca ccaggactgg ctgaacggca aagagtacaa gtgcaaggtg 960

tccaacaagg gcctgcccag ctccatcgag aaaaccatca gcaaggccaa gggccagccc 1020

cgcgagcctc aagtgtatac cctgccccct tgccaggaag agatgaccaa gaaccaggtg 1080

tccctgtggt gtctcgtgaa aggcttctac cccagcgaca ttgccgtgga atgggagagc 1140

aacggccagc ccgagaacaa ctacaagacc accccccctg tgctggacag cgacggctca 1200

ttcttcctgt actccaagct gaccgtggac aagagccggt ggcaggaagg caacgtgttc 1260

agctgctccg tgatgcacga ggccctgcac aaccactaca cccagaagtc cctgtctctg 1320

tccctgggc 1329

<210> 81

<211> 642

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 81

gccatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgtctgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60

atcacctgta gagccagcca gggcatccgg aacgacctgg gctggtatca gcagaagcct 120

ggcaaggccc ccaagctgct gatctacgcc gctagctctc tgcagtccgg cgtgcccagc 180

agattttctg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga caatctctgg cctgcagccc 240

gaggacagcg ccacctacta ctgtctgcaa gactacatct actaccccac cttcggccag 300

ggcaccaagg tggaaatcaa gcgtacggtg gccgctccca gcgtgttcat cttcccacct 360

agcgacgagc agctgaagtc cggcacagcc tctgtcgtgt gcctgctgaa caacttctac 420

ccccgcgagg ccaaagtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagagcgg caacagccag 480

gaaagcgtga ccgagcagga cagcaaggac tccacctaca gcctgagcag caccctgaca 540

ctgagcaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaagtgac ccaccagggc 600

ctgtctagcc ccgtgaccaa gagcttcaac cggggcgagt gt 642

<210> 82

<211> 1338

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 82

caggtgcagc tggtggaaag cggcggaggc gtggtgcagc ctggcaggtc tctgagactg 60

agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc agctacggaa tgcactgggt gcgccaggcc 120

cctggcaaag gactggaatg ggtggccgtg atttggtacg acggcagcaa caagtactac 180

gccgacagcg tgaagggccg gttcaccatc agcggcgaca acagcaagaa caccctgtac 240

ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagaatgttc 300

agaggcgcct tcgactactg gggccagggc acactcgtga ccgtgtctag tgcgtcgacc 360

aagggcccca gcgtgttccc tctggcccct agcagcaaga gcacatctgg cggaacagcc 420

gccctgggct gcctcgtgaa ggactacttt cccgagcccg tgaccgtgtc ctggaattct 480

ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttt ccagctgtgc tgcagtccag cggcctgtac 540

agcctgagca gcgtcgtgac agtgcccagc agctctctgg gcacccagac ctacatctgc 600

aacgtgaacc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aggtggaacc caagagctgc 660

gacaagaccc acacctgtcc cccttgtcct gcccccgaag ccgccggagg cccttccgtg 720

ttcctgttcc ccccaaagcc caaggacacc ctgatgatca gccggacccc cgaagtgacc 780

tgcgtggtgg tggatgtgtc ccacgaggac cctgaagtga agttcaattg gtacgtggac 840

ggcgtggaag tgcacaacgc caagaccaag ccaagagagg aacagtacaa cagcacctac 900

cgggtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa agagtacaag 960

tgcaaggtgt ccaacaaggc cctggccgcc cccatcgaga aaaccatcag caaggccaag 1020

ggccagcccc gcgaacccca ggtgtacaca ctgcccccat gcagggacga gctgaccaag 1080

aaccaggtgt ccctgtggtg tctggtgaaa ggcttctacc cctccgatat cgccgtggaa 1140

tgggagagca acggccagcc cgagaacaac tacaagacca ccccccctgt gctggacagc 1200

gacggctcat tcttcctgta ctccaagctg acagtggaca agtcccggtg gcagcagggc 1260

aacgtgttca gctgctccgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagtcc 1320

ctgagcctga gccccggc 1338

<210> 83

<211> 1338

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 83

caggtgcagc tggtggaaag cggcggaggc gtggtgcagc ctggcaggtc tctgagactg 60

agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc agctacggaa tgcactgggt gcgccaggcc 120

cctggcaaag gactggaatg ggtggccgtg atttggtacg acggcagcaa caagtactac 180

gccgacagcg tgaagggccg gttcaccatc agcggcgaca acagcaagaa caccctgtac 240

ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagaatgttc 300

agaggcgcct tcgactactg gggccagggc acactcgtga ccgtgtctag tgcgtcgacc 360

aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 420

gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 480

ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 540

tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 600

aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 660

gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 720

ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 780

tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtatgttgac 840

ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa caatgcctcc 900

cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 960

tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020

gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat gccgggatga gctgaccaag 1080

aatcaagtca gcctgtggtg cctggtaaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1140

tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1200

gacggctcct tcttcctcta ctcaaaactc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1260

aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1320

ctctccctgt ctccgggt 1338

<210> 84

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 84

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1. 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Lys Ala

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Gln Ile Lys Asp Lys Ser Asn Ser Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Arg Gly Val Tyr Tyr Ala Leu Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 85

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 85

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1. 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val His Asn

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Gly

85 90 95

Thr Gln Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 86

<211> 25

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 86

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1. 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser

20 25

<210> 87

<211> 25

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 87

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Ser Gly Ala

1. 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser

20 25

<210> 88

<211> 25

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 88

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1. 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser

20 25

<210> 89

<211> 25

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 89

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1. 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 90

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 90

Met His Trp Val Lys Glu Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile Gly

1. 5 10 15

Tyr

<210> 91

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 91

Met His Trp Val Lys Glu Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly

1. 5 10 15

Tyr

<210> 92

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 92

Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala

1. 5 10 15

Val

<210> 93

<211> 38

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 93

Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr

1. 5 10 15

Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Phe Cys

35

<210> 94

<211> 38

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 94

Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr

1. 5 10 15

Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Ile Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Phe Cys

35

<210> 95

<211> 38

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 95

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gly Asp Asn

1. 5 10 15

Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 96

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 96

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1. 5 10

<210> 97

<211> 26

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 97

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1. 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser

20 25

<210> 98

<211> 26

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 98

Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1. 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser

20 25

<210> 99

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 99

Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile

1. 5 10 15

Tyr

<210> 100

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 100

Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

1. 5 10 15

<210> 101

<211> 36

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 101

Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1. 5 10 15

Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Pro Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala

20 25 30

Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 102

<211> 36

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 102

Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1. 5 10 15

Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Pro Glu Asp Ser Ala

20 25 30

Thr Tyr Tyr Cys

35

<210> 103

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 103

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

1. 5 10

<210> 104

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 104

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1. 5 10

<210> 105

<211> 159

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 105

Arg Trp Arg Gln Gln Trp Ser Gly Pro Gly Thr Thr Lys Arg Phe Pro

1. 5 10 15

Glu Thr Val Leu Ala Arg Cys Val Lys Tyr Thr Glu Ile His Pro Glu

20 25 30

Met Arg His Val Asp Cys Gln Ser Val Trp Asp Ala Phe Lys Gly Ala

35 40 45

Phe Ile Ser Lys His Pro Cys Asn Ile Thr Glu Glu Asp Tyr Gln Pro

50 55 60

Leu Met Lys Leu Gly Thr Gln Thr Val Pro Cys Asn Lys Ile Leu Leu

65 70 75 80

Trp Ser Arg Ile Lys Asp Leu Ala His Gln Phe Thr Gln Val Gln Arg

85 90 95

Asp Met Phe Thr Leu Glu Asp Thr Leu Leu Gly Tyr Leu Ala Asp Asp

100 105 110

Leu Thr Trp Cys Gly Glu Phe Asn Thr Ser Lys Ile Asn Tyr Gln Ser

115 120 125

Cys Pro Asp Trp Arg Lys Asp Cys Ser Asn Asn Pro Val Ser Val Phe

130 135 140

Trp Lys Thr Val Ser Arg Arg His Phe Trp Glu Cys Gly Ser Pro

145 150 155

<210> 106

<211> 214

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 106

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Leu Ser Met Ser Thr Ser Leu Gly

1. 5 10 15

Asp Pro Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Val

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Arg Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ile Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Pro Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 107

<211> 450

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 107

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Lys Pro Gly Thr

1. 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Lys Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met His Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Asp Tyr Tyr Gly Ser Asn Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210> 108

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 108

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr

1. 5

<210> 109

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 109

Ile Tyr Pro Gly Asn Val Asn Thr

1. 5

<210> 110

<211> 13

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 110

Thr Arg Ser His Tyr Gly Leu Asp Trp Asn Phe Asp Val

1. 5 10

<210> 111

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 111

Gln Asn Ile Tyr Val Trp

1. 5

<210> 112

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 112

Lys Ala Ser

1

<210> 113

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 113

Gln Gln Gly Gln Thr Tyr Pro Tyr

1. 5

<210> 114

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 114

Gly Phe Ser Leu Ser Asp Tyr Gly

1. 5

<210> 115

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 115

Ile Trp Ala Gly Gly Gly Thr

1. 5

<210> 116

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 116

Ala Arg Asp Lys Gly Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr

1. 5 10

<210> 117

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 117

Glu Ser Val Glu Tyr Tyr Val Thr Ser Leu

1. 5 10

<210> 118

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 118

Ala Ala Ser

1

<210> 119

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 119

Gln Gln Ser Arg Lys Val Pro Tyr Thr

1. 5

<210> 120

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 120

Gly Phe Thr Phe Thr Lys Ala Trp

1. 5

<210> 121

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 121

Ile Lys Asp Lys Ser Asn Ser Tyr Ala Thr

1. 5 10

<210> 122

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 122

Arg Gly Val Tyr Tyr Ala Leu Ser Pro Phe Asp Tyr

1. 5 10

<210> 123

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 123

Gln Ser Leu Val His Asn Asn Ala Asn Thr Tyr

1. 5 10

<210> 124

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 124

Lys Val Ser

1

<210> 125

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 125

Gly Gln Gly Thr Gln Tyr Pro Phe Thr

1. 5

<210> 126

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 126

Gly Phe Thr Phe Thr Lys Ala Trp

1. 5

<210> 127

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 127

Ile Lys Asp Lys Ser Asn Ser Tyr Ala Thr

1. 5 10

<210> 128

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 128

Gly Val Tyr Tyr Ala Leu Ser Pro Phe Asp Tyr

1. 5 10

<210> 129

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 129

Gln Ser Leu Val His Asn Asn Gly Asn Thr Tyr

1. 5 10

<210> 130

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 130

Lys Val Ser

1

<210> 131

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 131

Gly Gln Gly Thr Gln Tyr Pro Phe Thr

1. 5

<210> 132

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 132

Gln Ser Val Ser Ser Tyr Gly Gln Gly

1. 5

<---

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ размножения специфических в отношении вируса Т-клеток памяти, включающий введение специфической в отношении вируса Т-клетки памяти в контакт со связывающим белком, где связывающий белок содержит четыре полипептидные цепи, которые образуют три антигенсвязывающих участка. Описан способ размножения Т-клеток, включающий введение Т-клетки в контакт со связывающим белком in vitro или ex vivo, где связывающий белок содержит четыре полипептидные цепи, которые образуют три антигенсвязывающих участка. Раскрыт способ лечения хронической вирусной инфекции, включающий введение пациенту эффективного количества связывающего белка, где связывающий белок содержит четыре полипептидные цепи, которые образуют три антигенсвязывающих участка. Изобретение расширяет арсенал средств для лечения хронических вирусных инфекций. 3 н. и 28 з.п. ф-лы, 13 ил., 13 табл., 7 пр.

1. Способ размножения специфических в отношении вируса Т-клеток памяти, включающий введение специфической в отношении вируса Т-клетки памяти в контакт со связывающим белком, где связывающий белок содержит четыре полипептидные цепи, которые образуют три антигенсвязывающих участка, где первая полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_L2-L₁-V_L1-L₂-C_L [I],

и вторая полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_H1-L₃-V_H2-L₄-C_H1-шарнир-C_H2-C_H3 [II],

и третья полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_H3-C_H1-шарнир-C_H2-C_H3 [III],

и четвертая полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_L3-C_L [IV],

где

V_L1 представляет собой первый вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;

V_L2 представляет собой второй вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;

V_L3 представляет собой третий вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;

V_H1 представляет собой первый вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;

V_H2 представляет собой второй вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;

V_H3 представляет собой третий вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;

C_L представляет собой константный домен легкой цепи иммуноглобулина;

C_H1 представляет собой константный домен C_H1 тяжелой цепи иммуноглобулина;

C_H2 представляет собой константный домен C_H2 тяжелой цепи иммуноглобулина;

C_H3 представляет собой константный домен C_H3 тяжелой цепи иммуноглобулина;

шарнир представляет собой шарнирный участок иммуноглобулина, соединяющий домены C_H1 и C_H2; и

L₁, L₂, L₃ и L₄ представляют собой аминокислотные линкеры,

где полипептид формулы I и полипептид формулы II образуют кроссоверную пару легкая_цепь-тяжелая_цепь, и

где V_H1 и V_L1 образуют первый антигенсвязывающий участок, который связывает полипептид CD28, где V_H2 и V_L2 образуют второй антигенсвязывающий участок, который связывает полипептид CD3, и где V_H3 и V_L3 образуют третий антигенсвязывающий участок, который связывает полипептид CD38.

2. Способ по п.1, где специфическую в отношении вируса Т-клетку памяти приводят в контакт со связывающим белком in vitro или ex vivo.

3. Способ по п.1 или 2, где введение специфической в отношении вируса Т-клетки памяти в контакт со связывающим белком вызывает активацию и/или пролиферацию специфических в отношении вируса Т-клеток памяти.

4. Способ размножения Т-клеток, включающий введение Т-клетки в контакт со связывающим белком in vitro или ex vivo, где связывающий белок содержит четыре полипептидные цепи, которые образуют три антигенсвязывающих участка, где первая полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_L2-L₁-V_L1-L₂-C_L [I],

и вторая полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_H1-L₃-V_H2-L₄-C_H1-шарнир-C_H2-C_H3 [II],

и третья полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_H3-C_H1-шарнир-C_H2-C_H3 [III],

и четвертая полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_L3-C_L [IV],

где

V_L1 представляет собой первый вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;

V_L2 представляет собой второй вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;

V_L3 представляет собой третий вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;

V_H1 представляет собой первый вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;

V_H2 представляет собой второй вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;

V_H3 представляет собой третий вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;

C_L представляет собой константный домен легкой цепи иммуноглобулина;

C_H1 представляет собой константный домен C_H1 тяжелой цепи иммуноглобулина;

C_H2 представляет собой константный домен C_H2 тяжелой цепи иммуноглобулина;

C_H3 представляет собой константный домен C_H3 тяжелой цепи иммуноглобулина;

шарнир представляет собой шарнирный участок иммуноглобулина, соединяющий домены C_H1 и C_H2; и

L₁, L₂, L₃ и L₄ представляют собой аминокислотные линкеры,

где полипептид формулы I и полипептид формулы II образуют кроссоверную пару легкая_цепь-тяжелая_цепь, и

где V_H1 и V_L1 образуют первый антигенсвязывающий участок, который связывает полипептид CD28, где V_H2 и V_L2 образуют второй антигенсвязывающий участок, который связывает полипептид CD3, и где V_H3 и V_L3 образуют третий антигенсвязывающий участок, который связывает полипептид CD38.

5. Способ по п.4, где Т-клетка представляет собой Т-клетку памяти или эффекторную Т-клетку.

6. Способ по п.4 или 5, где Т-клетка экспрессирует химерный антигенный рецептор (CAR) на своей клеточной поверхности или содержит полинуклеотид, кодирующий CAR.

7. Способ лечения хронической вирусной инфекции, включающий введение пациенту эффективного количества связывающего белка, где связывающий белок содержит четыре полипептидные цепи, которые образуют три антигенсвязывающих участка, где первая полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_L2-L₁-V_L1-L₂-C_L [I],

и вторая полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_H1-L₃-V_H2-L₄-C_H1-шарнир-C_H2-C_H3 [II],

и третья полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_H3-C_H1-шарнир-C_H2-C_H3 [III],

и четвертая полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:

V_L3-C_L [IV],

где

V_L1 представляет собой первый вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;

V_L2 представляет собой второй вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;

V_L3 представляет собой третий вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;

V_H1 представляет собой первый вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;

V_H2 представляет собой второй вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;

V_H3 представляет собой третий вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;

C_L представляет собой константный домен легкой цепи иммуноглобулина;

C_H1 представляет собой константный домен C_H1 тяжелой цепи иммуноглобулина;

C_H2 представляет собой константный домен C_H2 тяжелой цепи иммуноглобулина;

C_H3 представляет собой константный домен C_H3 тяжелой цепи иммуноглобулина;

шарнир представляет собой шарнирный участок иммуноглобулина, соединяющий домены C_H1 и C_H2; и

L₁, L₂, L₃ и L₄ представляют собой аминокислотные линкеры,

где полипептид формулы I и полипептид формулы II образуют кроссоверную пару легкая_цепь-тяжелая_цепь, и

где V_H1 и V_L1 образуют первый антигенсвязывающий участок, который связывает полипептид CD28, где V_H2 и V_L2 образуют второй антигенсвязывающий участок, который связывает полипептид CD3, и где V_H3 и V_L3 образуют третий антигенсвязывающий участок, который связывает полипептид CD38.

8. Способ по п.7, где пациент представляет собой человека.

9. Способ по п.7 или 8, где связывающий белок вводят пациенту в фармацевтическом составе, содержащем связывающий белок и фармацевтически приемлемый носитель.

10. Способ по любому из пп.7-9, где введение связывающего белка приводит к активации и/или пролиферации специфических в отношении вируса Т-клеток памяти у пациента.

11. Способ по любому из пп.1-6 и 10, где Т-клетки памяти представляют собой CD8+ или CD4+ Т-клетки памяти.

12. Способ по любому из пп.1-6, 10 и 11, где Т-клетки памяти представляют собой центральные Т-клетки памяти (T_CM) или эффекторные Т-клетки памяти (T_EM).

13. Способ по любому из пп.1-12, где полипептид CD28 представляет собой полипептид CD28 человека, где полипептид CD3 представляет собой полипептид CD3 человека, и где полипептид CD38 представляет собой полипептид CD38 человека.

14. Способ по любому из пп.1-13, где:

(a) домен V_H3 содержит последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GYTFTSFN (SEQ ID NO:31), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IYPGNGGT (SEQ ID NO:32), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO:33), и домен V_L3 содержит последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность ESVDSYGNGF (SEQ ID NO:34), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность LAS (SEQ ID NO:35), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQNKEDPWT (SEQ ID NO:36);

(b) домен V_H3 содержит последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GYTFTSYA (SEQ ID NO:37), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IYPGQGGT (SEQ ID NO:38), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO:33), и домен V_L3 содержит последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность QSVSSYGQGF (SEQ ID NO:39), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность GAS (SEQ ID NO:40), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQNKEDPWT (SEQ ID NO:36); или

(с) домен V_H3 содержит последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GFTFSSYG (SEQ ID NO:41), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IWYDGSNK (SEQ ID NO:42), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARMFRGAFDY (SEQ ID NO:43), и домен V_L3 содержит последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность QGIRND (SEQ ID NO:44), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность AAS (SEQ ID NO:45), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность LQDYIYYPT (SEQ ID NO:46).

15. Способ по п.14, где:

(a) домен V_H3 содержит аминокислотную последовательность QVQLQQSGAELVRSGASVKMSCKASGYTFTSFNMHWVKETPGQGLEWIGYIYPGNGGTNYNQKFKGKATLTADTSSSTAYMQISSLTSEDSAVYFCARTGGLRRAYFTYWGQGTLVTVS (SEQ ID NO:5), и домен V_L3 содержит аминокислотную последовательность DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYGNGFMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYCQQNKEDPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:6);

(b) домен V_H3 содержит аминокислотную последовательность Qvqlvqsgaevvkpgasvkvsckasgytftsyamhwvkeapgqrlewigyiypgqggtnynqkfqgratltadtsastaymelsslrsedtavyfcartgglrrayftywgqgtlvtvss (SEQ ID NO:13), и домен V_L3 содержит аминокислотную последовательность Divltqspatlslspgeratiscrasqsvssygqgfmhwyqqkpgqpprlliygassratgiparfsgsgsgtdftltisplepedfavyycqqnkedpwtfgggtkleik (SEQ ID NO:14);

(c) домен V_H3 содержит аминокислотную последовательность QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTSFNMHWVKEAPGQRLEWIGYIYPGNGGTNYNQKFQGRATLTADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFCARTGGLRRAYFTYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:17), и домен V_L3 содержит аминокислотную последовательность DIVLTQSPATLSLSPGERATISCRASESVDSYGNGFMHWYQQKPGQPPRLLIYLASSRAT GIPARFSGSGSGTDFTLTISPLEPEDFAVYYCQQNKEDPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:18);

(d) домен V_H3 содержит аминокислотную последовательность QVQLVQSGAEVVKSGASVKVSCKASGYTFTSFNMHWVKEAPGQGLEWIGYIYPGNGGTNYNQKFQGRATLTADTSASTAYMEISSLRSEDTAVYFCARTGGLRRAYFTYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:21), и домен V_L3 содержит аминокислотную последовательность DIVLTQSPATLSLSPGERATISCRASESVDSYGNGFMHWYQQKPGQPPRLLIYLASSRAT GIPARFSGSGSGTDFTLTISPLEPEDFAVYYCQQNKEDPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:18);

(e) домен V_H3 содержит аминокислотную последовательность QVQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSFNMHWVKEAPGQRLEWIGYIYPGNGGTNYNQKFQGRATLTADTSASTAYMEISSLRSEDTAVYFCARTGGLRRAYFTYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:23), и домен V_L3 содержит аминокислотную последовательность DIVLTQSPATLSLSPGERATISCRASESVDSYGNGFMHWYQQKPGQPPRLLIYLASSRAT GIPARFSGSGSGTDFTLTISPLEPEDFAVYYCQQNKEDPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:18); или

(f) домен V_H3 содержит аминокислотную последовательность QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISGDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARMFRGAFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:9), и домен V_L3 содержит аминокислотную последовательность AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISGLQPEDSATYYCLQDYIYYPTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:10).

16. Способ по любому из пп.1-15, где:

(a) домен V_H1 содержит последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GYTFTSYY (SEQ ID NO:108), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IYPGNVNT (SEQ ID NO:109), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность TRSHYGLDWNFDV (SEQ ID NO:110), и домен V_L1 содержит последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность QNIYVW (SEQ ID NO:111), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность KAS (SEQ ID NO:112), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQGQTYPY (SEQ ID NO:113); или

(b) домен V_H1 содержит последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GFSLSDYG (SEQ ID NO:114), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IWAGGGT (SEQ ID NO:115), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность ARDKGYSYYYSMDY (SEQ ID NO:116), и домен V_L1 содержит последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность ESVEYYVTSL (SEQ ID NO:117), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность AAS (SEQ ID NO:118), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность QQSRKVPYT (SEQ ID NO:119).

17. Способ по п.16, где:

(a) домен V_H1 содержит аминокислотную последовательность qvqlvqsgaevvkpgasvkvsckasgytftsyyihwvrqapgqglewigsiypgnvntnyaqkfqgratltvdtsistaymelsrlrsddtavyyctrshygldwnfdvwgkgttvtvss (SEQ ID NO:49), и домен V_L1 содержит аминокислотную последовательность diqmtqspsslsasvgdrvtitcqasqniyvwlnwyqqkpgkapklliykasnlhtgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpediatyycqqgqtypytfgqgtkleik (SEQ ID NO:50); или

(b) домен V_H1 содержит аминокислотную последовательность qvqlqesgpglvkpsqtlsltctvsgfslsdygvhwvrqppgkglewlgviwagggtnynpslksrktiskdtsknqvslklssvtaadtavyycardkgysyyysmdywgqgttvtvs (SEQ ID NO:51), и домен V_L1 содержит аминокислотную последовательность divltqspaslavspgqratitcrasesveyyvtslmqwyqqkpgqppkllifaasnvesgvparfsgsgsgtdftltinpveandvanyycqqsrkvpytfgqgtkleik (SEQ ID NO:52).

18. Способ по любому из пп.1-17, где:

(a) домен V_H2 содержит последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GFTFTKAW (SEQ ID NO:120), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IKDKSNSYAT (SEQ ID NO:121), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность RGVYYALSPFDY (SEQ ID NO:122), и домен V_L2 содержит последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность QSLVHNNANTY (SEQ ID NO:123), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность KVS (SEQ ID NO:124), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность GQGTQYPFT (SEQ ID NO:125); или

(b) домен V_H2 содержит последовательность CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GFTFTKAW (SEQ ID NO:126), последовательность CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность IKDKSNSYAT (SEQ ID NO:127), и последовательность CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность GVYYALSPFDY (SEQ ID NO:128), и домен V_L2 содержит последовательность CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность QSLVHNNGNTY (SEQ ID NO:129), последовательность CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность KVS (SEQ ID NO:130), и последовательность CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность GQGTQYPFT (SEQ ID NO:131).

19. Способ по п.18, где:

(a) домен V_H2 содержит аминокислотную последовательность qvqlvesgggvvqpgrslrlscaasgftftkawmhwvrqapgkqlewvaqikdksnsyatyyadsvkgrftisrddskntlylqmnslraedtavyycrgvyyalspfdywgqgtlvtvss (SEQ ID NO:53), и домен V_L2 содержит аминокислотную последовательность divmtqtplslsvtpgqpasisckssqslvhnnantylswylqkpgqspqsliykvsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyycgqgtqypftfgsgtkveik (SEQ ID NO:54); или

(b) домен V_H2 содержит аминокислотную последовательность qvqlvesgggvvqpgrslrlscaasgftftkawmhwvrqapgkglewvaqikdksnsyatyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycrgvyyalspfdywgqgtlvtvss (SEQ ID NO:84), и домен V_L2 содержит аминокислотную последовательность divmtqtplslsvtpgqpasisckssqslvhnngntylswylqkpgqspqlliykvsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyycgqgtqypftfgggtkveik (SEQ ID NO:85).

20. Способ по любому из пп.1-19, где по меньшей мере один из L₁, L₂, L₃ или L₄ независимо имеет длину, составляющую 0 аминокислот.

21. Способ по любому из пп.1-19, где (a) каждый из L₁, L₂, L₃ и L₄ независимо имеет длину, составляющую ноль аминокислот, или содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:55), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 56), S, RT, TKGPS (SEQ ID NO: 57), GQPKAAP (SEQ ID NO: 58) и GGSGSSGSGG (SEQ ID NO: 59); или (b) каждый из L₁, L₂, L₃ и L₄ независимо содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:55), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:56), S, RT, TKGPS (SEQ ID NO:57), GQPKAAP (SEQ ID NO: 58) и GGSGSSGSGG (SEQ ID NO:59).

22. Способ по любому из пп.1-19, где L₁ содержит последовательность GQPKAAP (SEQ ID NO: 58), L₂ содержит последовательность TKGPS (SEQ ID NO:57), L₃ содержит последовательность S, и L₄ содержит последовательность RT.

23. Способ по любому из пп.1-22, где домены шарнир-C_H2-C_H3 второй и третьей полипептидных цепей представляют собой домены шарнир_IgG4-C_H2-C_H3 человека, и где каждый из доменов шарнир-C_H2-C_H3 содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 234 и 235 IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой F234A и L235A.

24. Способ по любому из пп.1-22, где домены шарнир-C_H2-C_H3 второй и третьей полипептидных цепей представляют собой домены шарнир_IgG4-C_H2-C_H3 человека, и где каждый из доменов шарнир-C_H2-C_H3 содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 233-236 IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой E233P, F234V, L235A, и делецию в положении 236.

25. Способ по любому из пп.1-24, где домены шарнир-C_H2-C_H3 второй и третьей полипептидных цепей представляют собой домены шарнир_IgG4-C_H2-C_H3 человека, и где каждый из доменов шарнир-C_H2-C_H3 содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 228 и 409 IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой S228P и R409K.

26. Способ по любому из пп.1-22, где домены шарнир-C_H2-C_H3 второй и третьей полипептидных цепей представляют собой домены шарнир_IgG1-C_H2-C_H3 человека, и где каждый из доменов шарнир-C_H2-C_H3 содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 234, 235 и 329 IgG1 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой L234A, L235A и P329A.

27. Способ по любому из пп.1-22, где домены шарнир-C_H2-C_H3 второй и третьей полипептидных цепей представляют собой домены шарнир_IgG1-C_H2-C_H3 человека, и где каждый из доменов шарнир-C_H2-C_H3 содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 298, 299 и 300 IgG1 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой S298N, T299A и Y300S.

28. Способ по любому из пп.1-27, где домен шарнир-C_H2-C_H3 второй полипептидной цепи содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 349, 366, 368 и 407 IgG1 или IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой Y349C, T366S, L368A и Y407V; и где домен шарнир-C_H2-C_H3 третьей полипептидной цепи содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 354 и 366 IgG1 или IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой S354C и T366W.

29. Способ по любому из пп.1-27, где домен шарнир-C_H2-C_H3 второй полипептидной цепи содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 354 и 366 IgG1 или IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой S354C и T366W; и где домен шарнир-C_H2-C_H3 третьей полипептидной цепи содержит аминокислотные замены в положениях, соответствующих положениям 349, 366, 368 и 407 IgG1 или IgG4 человека в соответствии с EU-индексом, где аминокислотные замены представляют собой Y349C, T366S, L368A и Y407V.

30. Способ по п.1, где:

(a) первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:61, вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:60, третья полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:62, и четвертая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:63;

(b) первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:61, вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:64, третья полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:65, и четвертая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:63;

(c) первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:61, вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:66, третья полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:67, и четвертая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:63;

(d) первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:61, вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:60, третья полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:68, и четвертая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:69;

(e) первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:61, вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:64, третья полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:70, и четвертая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:69; или

(f) первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:61, вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:66, третья полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:71, и четвертая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:69.

31. Способ по любому из пп.1-30, где вирус представляет собой вирус иммунодефицита человека (HIV), вирус гриппа, цитомегаловирус (CMV), вирус гепатита В (HBV), папилломавирус человека (HPV), вирус Эпштейна-Барр (EBV), спумавирус человека (HFV), вирус простого герпеса 1 (HSV-1) или вирус простого герпеса 2 (HSV-2).