Способ количественного определения фурана и метилфурана в детских кашах Российский патент 2022 года по МПК G01N33/02 G01N30/00 G01N30/94 

Изобретение относится к медицинским токсикологическим исследованиям, в частности, к санитарной токсикологии и может быть использовано для количественного определения фурана и метилфурана в продуктах питания, в частности, в детских кашах на основе круп.

Химическая безопасность пищевых продуктов является темой, вызывающей растущее беспокойство как в Российской Федерации, так и в Европейских странах. Высказано предположение, что химические загрязнители, обнаруженные в пищевых продуктах (и кормах) при низких уровнях концентраций, могут быть этиологическими факторами, стоящими за некоторыми заболеваниями (например, раком), причины которых до сих пор в значительной степени неизвестны.

Фуран и метилфуран - это ароматические гетероциклические соединения, которые отличаются высокой летучестью.

В последние годы изучению фурана и его производных в пищевых продуктах уделяется особое внимание. Из-за своей токсичности и канцерогенности фуран включен Международным агентством по изучению рака в группу 2 В как потенциально канцерогенный для человека. Наибольшее воздействие фурана было установлено на детях до года, в рационе которых преобладают готовые детские зерновые каши и детские пищевые продукты на основе зерна. Референтная доза (RfD) для фурана и метилфурана при хроническом пероральном поступлении составляет 0,001 мг/кг.

В связи с вышеизложенным, для решения проблемы канцерогенной безопасности пищи необходимо обеспечить их надежный контроль. Однако анализ фурана и метилфурана в пищевых продуктах является сложным из-за их высокой летучести, низкого молекулярного веса и низких уровней концентрации содержания в пищевых продуктах.

Из уровня техники не известны способы определения фурана, известны только способы определения некоторых его производных.

Было установлено, что, например, в авт. свид-ве СССР №1697000 описан способ качественного определения производных 5-нитрофурана с помощью роданида аммония.

Также известен Способ определения карбофурана и его метаболитов в воздухе методом тонкослойной хроматографии (Авт. свид-во СССР №1390562).

Но эти известные способы не могут быть использованы для определения фурана и метилфурана в кашах из крупы.

Из документа МУ 2711-83 «Методические указания по газохроматографическому определению фурана, тетрагидрофурана и сильвана в воздухе» (утверждены заместителем главного государственного санитарного врача СССР А.И. Заиченко 21 апреля 1983 г. N 2711-83) известен способ определения фурана методом газожидкостной хроматографии на приборе с пламенно-ионизационным детектором. Согласно этому способу воздух аспирируют через поглотительные сосуды с бутиловым спиртом, далее эту пробу микрошприцем вводят в испаритель хроматографа и определение производят методом абсолютной калибровки по высоте пиков. Однако указанный способ применим только для определения фурана в воздушной среде и неприменим для анализа фурана в каше.

При этом из уровня техники не были выявлены известные способы количественного определения фурана и метилфурана в детских кашах, поэтому сделать выбор ближайшего аналога к заявляемому изобретению не представляется возможным.

Технический результат, достигаемый предлагаемым способом, заключается в разработке достоверного способа количественного определения фурана и метилфурана в детских кашах.

Указанный технический результат достигается предлагаемым способом количественного определения фурана и метилфурана в детских кашах, включающим пробоподготовку и проведение твердофазной экстракции на приборе, содержащем угольный картридж, причем на стадии пробоподготовки пробу каши массой 20 г разбавляют водой объемом 100 см³, добавляют к ней высаливающие реагенты в количестве 5 г сульфата натрия и 5 г хлорида натрия, подкисляют 2,5 см³ 2%-ным раствором сульфаминовой кислоты и 0,5 см³ 60%-ной серной кислотой до рН=3, затем с помощью перегретого водяного пара отгоняют 70 см³ дистиллята пробы, и далее полученный дистиллят подвергают твердофазной экстракции на приборе, содержащем картридж марки Chromabond С18, при этом вначале производят последовательную промывку картриджа гептаном объемом 2 см³ в течение 3 сек, этилацетатом объемом 2 см³ в течение 5 сек. и промывку водой объемом 2 см³ в течение 5 сек., затем загружают ранее полученный дистиллят пробы, осуществляют элюирование дистиллята пробы с картриджа гептаном объемом 3 см³ в течение 1 мин., и полученные элюенты анализируют хромато-масс-спектрометрическим методом, устанавливая по хроматограммам количественное содержание фурана и метилфурана.

Поставленный технический результат достигается за счет следующего.

Известные приемы и способы пробоподготовки такие как - экстракция органическим растворителем, дистилляция с перегретым водяным паром, не позволяют достичь высокой полноты извлечения, а, следовательно, необходимой точности определений для реальной оценки содержания фурана и метилфурана в пищевых продуктах.

Благодаря использованию в предлагаемом способе операции твердофазной экстракции (далее - ТФЭ) при заявленных режимах и используемых реагентах и была обеспечена полнота извлечения фурана и метилфурана из пробы детской каши.

Предлагаемый способ реализуется следующим образом по трем этапам:

- пробоподготовка,

- выполнение ТФЭ,

- анализ полученных элюентов хромато-масс-спектрометрическим методом.

1. Пробоподготовка.

При открытии коробки каши, берут навеску каши массой 20 г, разбавляют водой объемом 100 см³ и полученную пробу помещают в круглодонную колбу объемом 500 см³ для отгона.

Добавляют к ней высаливающие реагенты (5 г сульфата натрия и 5 г хлорида натрия).

Подкисляют 2,5 мл 2%-ным раствором сульфаминовой кислоты и 0,5 мл 60%-ным раствором серной кислоты до рН=3.

С помощью перегретого водяного пара при температуре парообразователя, равной 100±5°С, и температуре колбы с пробой, равной 80±5°С, отгоняют 70 см³ дистиллята пробы.

2. Выполнение ТФЭ.

Вначале производят стадию кондиционирования - активацию угольного картриджа марки Chromabond С18, для чего его последовательно промывают гептаном объемом 2 см³ в течение 3 сек, этилацетатом объемом 2 см³ в течение 5 сек. и водой объемом 2 см³ в течение 5 сек.

Далее загружают ранее полученный дистиллят пробы объемом 70 см³ в течение 1 мин.

Осуществляют элюирование дистиллята пробы с картриджа гептаном объемом 3 см³ в течение 1 мин. в пробирку, находящейся в положении второй каретки автоматической системы ТФЭ.

3. Анализ полученных элюентов хромато-масс-спектрометрическим методом.

Полученные элюенты анализируют известным хромато-масс-спектрометрическим методом, устанавливая по хроматограммам количественное содержание фурана и метилфурана.

Отработка оптимальных хромато-масс-спектрометрических параметров определения фурана и метилфурана в образцах каш осуществлялась с использованием Исследования проводили на масс-спектрометре. Отработка оптимальных хромато-масс-спектрометрических параметров определения в образцах пищевых продуктов фурана и метилфурана осуществлялась с использованием газовой хроматографии и масс-спектрометрии (ГХ/МС): газовый хроматограф Agilent 7890А (USA) с масс-селективным детектором 5975С и квадрупольным масс-анализатором. Режим ионизации электронным ударом при 70 эВ. Качественное разделение фурана и метилфурана с близкими физико-химическими свойствами было достигнуто на капиллярной колонке серии VOC-5MS 90m⋅0,250 mm⋅0,250 μm длиной 90 метров, внутренним диаметром 0,250 мм и толщиной пленки неподвижной фазы 0,250 μm.

Хроматограмма стандартного раствора фурана и метилфурана с содержанием фурана (С_ф=1,0 мкг/см³), метилфурана (С_мф=1,0 мкг/см³) при оптимально подобранных в предлагаемом способе условиях хромато-масс-спектрометрического анализа, зарегистрированная по полному ионному току, представлена на рисунке 1.

Для выбора оптимальных режимов и используемых реагентов предлагаемого способа были проведены лабораторные исследования по установлению необходимых марок картриджей в приборе ТФЭ, отработаны условия схем элюирования ТФЭ и дистилляции на стандартных образцах фурана и метилфурана.

Выбор органического растворителя для экстракции фурана и метилфурана из образцов пищевой продукции.

С целью установления оптимальной растворимости исследуемых соединений использовали ряд органических растворителей. Для этого в исследуемый образец органического растворителя (объем 2 мл) добавляли стандартный раствор фурана и метилфурана (С=1 мкг/мл). Средние значения полноты растворения фурана и метилфурана с использованием стандартных образцов в различных растворителях представлены в таблице 1.

Выполненные исследования показали, что оптимальным растворителем для экстракции фурана и метилфурана из проб детских каш является гептан (полнота растворения составила 115% и 14% соответственно).

В ходе испытаний было исследовано влияние температуры на экстракцию фурана и метилфурана из образцов детских каш. Изучена эффективность извлечения фурана и метилфурана из проб пищевой продукции при изменении температуры образца. Результаты степени экстракции фурана и метилфурана с использованием в качестве растворителя гептана представлены в таблице 2.

Данные, приведенные в таблице 2, показывают, что при повышении температуры образца степень экстракции повышается незначительно на 0,02% для фурана и на 0,001% для метилфурана, что позволяет проводить определение этих веществ с достаточной точностью и при комнатной температуре.

При испытаниях определяли влияние рН среды на экстракцию фурана и метилфурана из образцов пищевой продукции.

При проведении экспериментальных исследований при отработке способа подготовки образцов пищевой продукции к хромато-масс-спектрометрическому анализу и достижения оптимальной степени экстракции изучена эффективность извлечения фурана и метилфурана из образцов пищевой продукции органическими растворителями различной природы и изменения рН среды. Средние значения полноты экстракции фурана и метилфурана из образцов пищевой продукции с использованием различного рН среды представлены в таблице 3.

Проведенные исследования (таблица 3) показали недостаточно высокую полноту извлечения фурана и метилфурана из проб пищевой продукции при отработанных условиях пробоподготовки. Поэтому проведены дополнительные исследования по изучению экстракции изучаемых соединений из образца с использованием высаливающих реагентов.

Влияние высаливающих реагентов на экстракцию фурана и метилфурана из образцов детских каш.

При отработке способа подготовки образцов пищевой продукции к хромато-масс-спектрометрическому анализу и достижения оптимальной степени экстракции экспериментально подобраны различные условия процедуры экстракции. Прецизионность анализа и эффективность извлечения фурана и метилфурана из образцов пищевой продукции устанавливали экспериментальным способом «введено-найдено» с применением стандартных образцов и многократной экстракцией. Средние значения полноты экстракции фурана и метилфурана из образцов пищевой продукции с применением смеси нейтральных солей щелочных металлов и гептана при n=5 (число опытов) и р=0,95 представлены в таблице 4.

По результатам экстракции (таблица 4) рассчитана степень извлечения фурана и метилфурана из детских каш, которая составляет 1,5% для фурана и не более 1% для метилфурана. Эти опыты показали, что традиционный метод экстракции веществ (без использования ТФЭ), в частности, фурана и метилфурана из образцов пищевой продукции даже с использованием смеси нейтральных солей щелочных металлов (Na₂SO₄, NaCl), гептана и многократной экстракции показал очень низкую степень экстракции, а значит был сделан вывод о необходимости дополнительного использования метода ТФЭ.

Была проведена отработка и оптимизация условий способа подготовки пробы детских каш к химическому анализу в них фурана и метилфурана с использованием современного метода твердофазной экстракции (ТФЭ).

Подготовка образцов пищевой продукции для хромато-масс-спектрометрического анализа фурана и метилфурана включала ряд последовательных операций, которые позволяют получить представительную пробу определенного химического состава исследуемого образца и перевод ее в удобную для химического анализа форму с выраженными аналитическими свойствами:

- дистилляция фурана и метилфурана с перегретым водяным паром (для увеличения полноты экстракционного извлечения аналитов);

- концентрирование дистиллята на картриджах автоматической системы твердофазной экстракции (ТФЭ) при использовании пробоподготовки и экспериментальной схемы элюирования.

Этап дистилляции включал отработку условий и параметров (рН, природа и концентрация высаливателей, объем дистиллята) метода дистилляции фурана и метилфурана стандартного образца и сорбции на картриджах различной природы.

После окончания процедуры дистилляции фурана и метилфурана из стандартного образца полученный дистиллят пропускали через картриджы системы твердофазной экстракции по экспериментальной схеме элюирования. При этом в исследованиях использовали картриджи различных марок.

Для выбора сорбционных патронов (картриджа) для ТФЭ использовали экспериментальную схему ТФЭ. Процедура ТФЭ состоит из следующих основных этапов:

1) активация патрона (картриджа) путем последовательной промывки картриджа гептаном объемом 2 см³ в течение 3 сек, этилацетатом объемом 2 см³ в течение 5 сек. и промывки водой объемом 2 см³ в течение 5 сек.,

2) внесение подготовленной пробы на картридж (загрузка пробы дистиллята объемом 70 см³ на картридж в течение 1 мин).

3) выполнение элюирования дистиллята пробы с картриджа гептаном объемом 3 см³ в течение 1 мин.

Полученные элюаты проанализированы хромато-масс-спектрометрическим методом. Результаты исследований представлены в таблице 5.

Результаты, приведенные в таблице 5, показали, что на картридже Chromobond С18 полнота извлечения фурана и метилфурана из образца пищевой продукции составила 100%. Поэтому, этот картридж выбран для дальнейших исследований.

В таблице 6 приведены результаты исследования полноты извлечения фурана и метилфурана с применением картриджа Chromobond С18 и различных схем пробоподготовки проб каши к химическому анализу и процесса элюирования.

Пояснения к таблице 6:

Пробоподготовка 1. Навеску каши 20 г помещали в колбу на 500 см³ для отгона. К продукту добавляли стандартный образец С=1 мкг/см³ фурана и метилфурана в объеме 100 см³, добавляли высаливающие реагенты (5 г сульфата натрия и 5 г хлорида натрия). Пробу подкисляли 2,5 см³ 2%-ным раствором сульфаминовой кислоты и 0,5 см³ 60%-ным раствором серной кислоты до рН=3. С помощью перегретого водяного пара при t_{парообразователя}=100±5°С и t_{колбы со стандартным образцом}=80±5°С отгоняли 70 см³ дистиллята.

Пробоподготовка 2. Навеску каши 20 г помещали в колбу на 500 см³ для отгона. К продукту добавляли стандартный образец С=1 мкг/см³ фурана и метилфурана в объеме 100 см³, добавляли щелочь (KOH) в количестве 5 г. С помощью нагретого водяного пара отгоняли 70 см³ дистиллята.

Схема элюирования 1:

1) стадия кондиционирования с целью активации картриджа: промывка гептаном объемом 2 см³ в течение 3 сек, этилацетатом объемом 2 см³ в течение 5 сек., водой объемом 2 см³ в течение 5 сек.

2) загрузка пробы дистиллята объемом 70 см³ на картридж Chromabond 6 см³ в течение 1 мин.

3) элюирование целевых аналитов гептаном с картриджа объемом 3 см³ в течение 1 мин.

4) химический анализ полученного элюата на содержание фурана и метилфурана методом хромато-масс-спектрометрии.

Схема элюирования 2:

Также, как и Схема элюирования 1, только на этапе 3) элюирование целевых аналитов гептаном с картриджа объемом 2 см³ в течение 1 мин. Схема элюирования 3:

Также, как и Схема элюирования 1, только на этапе 3) элюирование целевых аналитов гептаном с картриджа объемом 5 см³ в течение 1 мин.

В процессе выполненных исследований (таблица 6) установлено, что наиболее высокая полнота 100% извлечения фурана и метилфурана из стандартного образца достигнута при использовании дистилляции с перегретым водяным паром (дистиллят объемом 70 см³) и последующей пробоподготовки 1 и схемой элюирования 1 методом твердофазной экстракции на картридже Chromobond, т.е. при выполнении всех операций и их режимов по предлагаемому способу.

При этих, оптимально установленных условиях ТФЭ, далее при последующем хромато-масс-спектрометрического анализе при реализации предлагаемого способа была достигнута высокая эффективность разделения фурана и метилфурана, что наглядно иллюстрирует хроматограмма, приведенная на Рис. 1. Эта хроматограмма показывает, что в стандартном растворе содержатся следующие вещества: содержание фурана (С_ф=1,0 мкг/см³), содержание метилфурана (С_мф=1,0 мкг/см³).

Было доказано, что полнота извлечения указанных веществ из пробы каши составляет 100% при реализации предлагаемого способа (таблица 6).

Следует пояснить, что абсолютно такие же данные (таблицы 6), что и по стандартным образцам, были получены и для проб исследуемых каш, что подтверждает достоверность представленных данных.

Предлагаемый способ был опробован для различных видов детских каш, а именно: Овсяная молочная Винни, Мультизлаковая молочная ФрутоНяня, Гречневая с персиками и абрикосами ФрутоНяня, каша Сады Придонья рисовая. Исследования проводили путем определения для фурана и метилфурана «введено-найдено». Полученные результаты соответствуют полноте извлечения 99,6-100%.

Исследования стандартных образцов и проб каш различных производителей на содержание фурана и метилфурана выполняли методом хромато-масс-спектрометрии: газовый хроматограф Agilent 7890А (USA) с масс-селективным детектором 5975С и квадрупольным масс-анализатором. Режим ионизации электронным ударом при 70 эВ. Качественное разделение фурана и метилфурана с близкими физико-химическими свойствами было достигнуто на капиллярной колонке серии VOC-5MS 90m⋅0,250 mm⋅0,250 μm длиной 90 метров, внутренним диаметром 0,250 мм и толщиной пленки неподвижной фазы 0,250 μm.

Таким образом, предлагаемый способ имеет следующие преимущества перед известными.

Традиционный метод экстракции фурана и метилфурана из образцов пищевой продукции с использованием смеси нейтральных солей щелочных металлов (Na₂SO₄, NaCl), органического растворителя гептана и многократной экстракции показал степень экстракции не более 1,5%, в то время как при реализации предлагаемого способа степень экстракции составила 100% для обоих аналитов.

Предлагаемый способ обеспечивает максимальную чувствительность и селективность, а также обеспечивает относительно низкие пределы обнаружения (LOD; 0,001 мкг/мл).

Изобретение относится к медицинским токсикологическим исследованиям, в частности к санитарной токсикологии, проводят пробоподготовку и твердофазную экстракцию на приборе, содержащем угольный картридж. Способ количественного определения фурана и метилфурана в детских кашах включает подготовку пробы, для чего кашу массой 20 г разбавляют водой объемом 100 см³, добавляют к ней высаливающие реагенты в количестве 5 г сульфата натрия и 5 г хлорида натрия, подкисляют 2,5 см³ 2%-ным раствором сульфаминовой кислоты и 0,5 см³ 60%-ной серной кислотой до рН=3. Затем с помощью перегретого водяного пара отгоняют 70 см³ дистиллята пробы. Полученный дистиллят подвергают твердофазной экстракции на приборе, содержащем картридж марки Chromabond С18, который вначале последовательно промывают гептаном объемом 2 см³ в течение 3 с, этилацетатом объемом 2 см³ в течение 5 с и водой объемом 2 см³ в течение 5 с. Далее загружают полученный дистиллят пробы и осуществляют элюирование дистиллята пробы с картриджа гептаном объемом 3 см³ в течение 1 мин. Полученные элюенты анализируют хромато-масс-спектрометрическим методом, устанавливая по хроматограммам количественное содержание фурана и метилфурана. Предлагаемый способ количественного определения фурана и метилфурана в детских кашах позволяет достоверно определить содержание токсичного вещества в продукте. 6 табл., 1 ил.

Способ количественного определения фурана и метилфурана в детских кашах, включающий пробоподготовку и проведение твердофазной экстракции на приборе, содержащем угольный картридж, причем на стадии пробоподготовки пробу каши массой 20 г разбавляют водой объемом 100 см³, добавляют к ней высаливающие реагенты в количестве 5 г сульфата натрия и 5 г хлорида натрия, подкисляют 2,5 см³ 2%-ным раствором сульфаминовой кислоты и 0,5 см³ 60%-ной серной кислотой до рН=3, затем с помощью перегретого водяного пара отгоняют 70 см³ дистиллята пробы и далее полученный дистиллят подвергают твердофазной экстракции на приборе, содержащем картридж марки Chromabond С18, при этом вначале производят последовательную промывку картриджа гептаном объемом 2 см³ в течение 3 с, этилацетатом объемом 2 см³ в течение 5 с и промывку водой объемом 2 см³ в течение 5 с, затем загружают ранее полученный дистиллят пробы, осуществляют элюирование дистиллята пробы с картриджа гептаном объемом 3 см³ в течение 1 мин, и полученные элюенты анализируют хромато-масс-спектрометрическим методом, устанавливая по хроматограммам количественное содержание фурана и метилфурана.