ГУМАНИЗИРОВАННОЕ МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО ПРОТИВ Aβ и ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2022 года по МПК C07K16/18 C12N15/13 C12N15/70 A61K47/68 A61P25/28 

Настоящая заявка испрашивает приоритет заявки на патент Китая, поданной в Патентное ведомство Китая 1 февраля 2019 г., с номером заявки 201910104326.1 и названием изобретения «Гуманизированное моноклональное антитело против Aβ и его применение», содержание которой включено в настоящую заявку посредством ссылки в полном объеме.

Область техники

Настоящее описание относится к лекарственным средствам на основе антител, в частности, к гуманизированным моноклональным антителам против Aβ и их применению.

Уровень техники

A β

Амилоид β (Aβ) кодируется геном 21 хромосомы человека, содержит 39-43 аминокислот, имеет структуру β-листа, является гидрофобным и имеет молекулярную массу 4 кДа. Aβ происходит из остатка полипептида, продуцируемого фрагментацией белка-предшественника амилоида (APP) протеолитическими ферментами. АРР может разлагаться α-, β- и γ-протеазами, а продукты разложения имеют разные биологические функции. Среди них Aβ получается непрерывным действием β-протеазы и γ-протеазы. С-конец Aβ получается с помощью γ-протеазы, и большое количество подтипов остатков с 39-43 аминокислотами продуцируется путем разрезания APP в трансмембранной области. Наиболее распространенными из всех подтипов остатков являются Aβ40 и Aβ42. Первый обычно образуется путем разрезания APP в эндоплазматическом ретикулуме, тогда как последний формируется в сети транс-Гольджи.

Патологический механизм A β

В настоящее время известно, что все нервные клетки, включая нейроны, астроциты, микроглию и эндотелиальные клетки, в центральной нервной системе (ЦНС) могут экспрессировать АРР и продуцировать Aβ. В нормальных физиологических условиях АРР гидролизуется α-секретазой с образованием растворимого фрагмента sAPPα. Этот фрагмент содержит внеклеточную область АРР и С-конец с 83 аминокислотами, расположенными на клеточной мембране. sAPPα может регулировать возбудимость нейронов, улучшать пластичность, обучение и память синапсов, а также повышать устойчивость нейронов к окислительному и метаболическому стрессу. В невропатологических условиях APP сначала гидролизуется β-секретазой 1 (BACE) с образованием фрагмента sAPPβ и пептидного фрагмента с 99-аминокислотами (C99), связанными с клеточной мембраной. Затем пептид C99 подвергается действию γ-секретазы с образованием Aβ. В отличие от sAPPα, Aβ может вызывать потерю функции нервных синапсов, снижать пластичность нейронов, изменять энергетический метаболизм клеток, вызывать реакцию окислительного стресса и дисфункцию митохондрий, тем самым вызывая дисбаланс внутриклеточных ионов кальция. Образование, накопление и отложение Aβ, особенно Aβ42, может вызывать нейротоксичность и нейродегенеративные заболевания, а также играть важную роль в патогенезе болезни Альцгеймера (AD).

A β и болезнь Альцгеймера (AD)

Как один из основных внутримозговых патологических белков-маркеров болезни Альцгеймера, образование, отложение и деградация Aβ проходят через весь патологический процесс AD. Aβ делится на два типа: растворимый и нерастворимый. Сам по себе растворимый Aβ не обладает нейротоксичностью, но проявляет нейроцитотоксичность после превращения в нерастворимые преципитаты при образовании агрегатов нитевидных волокон с помощью β-листа. Первичная структура человеческого Aβ является определяющим фактором нейротоксичности. Согласно сообщениям в литературе, нейротоксичность Aβ в основном отражается в следующих четырех аспектах: холинергическое повреждение нейронов, апоптоз нервных клеток, пероксидное повреждение и воспалительная реакция.

Поражение холинергических нейронов

Повреждение и потеря большого количества нейронов холинергической системы и нервных синапсов в передней базальной проекции к гиппокампу и коре головного мозга являются основными причинами снижения памяти и когнитивных способностей пациентов с AD. Aβ активирует протеинкиназу GSK-3/киназу-3β гликогенсинтазы, которая вызывает фосфорилирование тау-белка и митохондриальной пируватдегидрогеназы, снижает активность фермента и снижает превращение пирувата в ацетилкофермент A (ацетилкофермент A), тем самым уменьшая синтез ацетилхолина (ACh), ингибирование сукцинатдегидрогеназы, снижение энергоснабжения, вызывающее повреждение, дегенерацию и нарушение передачи медиатора холинергических нейронов и синапсов, а также снижение активности холинергической системы. Снижение ACh, в свою очередь, приводит к увеличению продукции Aβ, что, в свою очередь, образует замкнутый круг.

Апоптоз нервных клеток

Основная характеристика AD - уменьшение количества нейронов в коре головного мозга и гиппокампе. Когда Aβ агрегирует в структуру складывания β-листа, его нейротоксичность значительно усиливается, и он может вызывать апоптоз нервных клеток. Это важная причина отсутствия селективных нейронов и синапсов при AD. Волокнистые и агрегированные Aβ и APP и другие трансмембранные рецепторы взаимодействуют и перекрестно связываются через секреторные пути на поверхности клетки, что приводит к ингибированию и аномальной активации путей передачи сигнала, тем самым запуская апоптоз нервных клеток. Aβ-индуцированный дисбаланс Ca2+ во внутренней среде стимулирует рецепторы NMDA или изменяет проницаемость мембран за счет воздействия свободных радикалов, вызывая приток Ca2+ для активации рецепторов глутамата и вызывая перевозбуждение и гибель глутаматергических нейронов. Кроме того, Aβ может также вызывать усиление синтеза NO, тем самым вызывая апоптоз нейрональных клеток.

Пероксидное повреждение

Aβ может вызывать окислительный стресс разными способами. Окислительный стресс, вызванный увеличением свободных радикалов, индуцированных Aβ, является важной причиной. Токсичность Aβ опосредуется H₂O₂, и Aβ увеличивает накопление H₂O₂ в организме через рецептор конечного продукта гликирования (RAGE), вызывая окислительное повреждение и вызывая клеточную смерть. Кроме того, окислительный стресс вызывает пролиферацию и миграцию микроглии по градиенту концентрации Aβ, что приводит к агрегации микроглии вокруг сенильных бляшек, образованию нейритных бляшек и образованию более активных свободных радикалов кислорода. Aβ также может увеличивать пероксидное окисление липидов. H2O2 является не только источником свободных гидроксильных радикалов , но также увеличивает аномальную экспрессию белка ядерного фактора κB (NF-κB), который вызывает повреждение мембраны нервных клеток и приводит к нейрональной дегенерации.

Воспалительная реакция

У пациентов с AD обычно наблюдается воспалительная реакция в головном мозге. Глиальные клетки размножаются вокруг бляшек и нейрофибриллярных клубков. Aβ может стимулировать высвобождение ряда воспалительных белков с сильной нейротоксичностью. Например, Aβ активирует астроциты и микроглию для высвобождения воспалительных цитокинов, таких как NO, интерлейкин-1 (IL-1, IL-1 может вызывать нарушение выработки белка цитоскелета-белка нейрофиламента, тем самым нарушая функцию нейронов), интерлейкин -6 (IL-6, IL-6 увеличивает сверхэкспрессию ADP и способствует образованию Aβ, в то время как Aβ может индуцировать экспрессию IL-6 в микроглии, тем самым образуя замкнутый круг в иммунопатологическом процессе AD), фактор-α некроза опухоли (TNF-α, TNF-α участвует в патологическом процессе AD через наиболее важный аполипопротеин ApoE ЦНС), γ-интерферон (γ-IFN), β-антитрипсин (ACT), фактор комплемента C1, C3 и хемокины, факторы адгезии и т. д. Многие воспалительные факторы вызывают воспаление, способствуют образованию свободных радикалов, окислительному стрессу, что приводит к дегенерации и некрозу нервных клеток.

Лекарственные средства и терапевтические механизмы для воздействия, направленного на A β

Исходя из вышеизложенного, токсичность Aβ для нейронов является важным фактором возникновения AD. Следовательно, ингибируя продукцию Aβ и ускоряя его выведение, можно остановить болезненный процесс AD и облегчить симптомы заболевания. Лекарственные средства, которые в настоящее время разрабатываются и используются в клинике, также основаны на механизме продуцирования и выведения Aβ, который включает следующие части.

1. Ингибирование β- и γ-секретаз

Гидролиз АРР β-секретазой является начальной стадией образования амилоида. Подавление активности β-секретазы может подавлять продукцию Aβ, но может вызывать более серьезные побочные эффекты. Поскольку помимо АРР, β-секретаза имеет множество субстратов, и гидролиз этих субстратов играет важную роль в пластичности нейронов и синапсов в нервной системе. Клинически ингибиторы β-секретазы, такие как E2609 (ID клинического исследования NCT01600859), MK-8931 (NCT01739348) и LY2886721 (NCT01807026, NCT01561430), могут снижать уровни Aβ в спинномозговой жидкости человека на 80-90%, но в настоящее время до сих пор на рынке нет ингибитора β-секретазы.

Гидролиз APP γ-секретазой является последней стадией продукции амилоида, который непосредственно продуцирует фрагменты Aβ40 и Aβ42. Следовательно, также считается, что ингибирование γ-секретазы может эффективно ингибировать продукцию Aβ, чтобы достичь цели лечения AD. Однако, помимо гидролиза APP, γ-секретаза также гидролизует другие белки-субстраты, включая белок Notch. Белок Notch важен для пролиферации, дифференцировки и межклеточной передачи сигнала. Семагацестат (LY450139) в качестве ингибитора γ-секретазы был клинически протестирован на 3000 пациентов (NCT00762411, NCT01035138, NCT00762411). Результаты теста показали, что когнитивные способности испытуемых не улучшилось, а ухудшилось и сопровождалось такими побочными эффектами, как потеря веса, повышение вероятности рака кожи и высокий риск инфекции. Другие ингибиторы γ-секретазы, такие как Авагацестат, также не прошли клинических испытаний (NCT00810147, NCT00890890, NCT00810147, NCT01079819). Селективный модулятор γ-секретазы (SGSM) теоретически может избежать побочных эффектов, вызванных полным ингибированием γ-секретазы, и только ингибировать путь гидролиза APP, не мешая другим сигнальным каналам, таким как гидролиз белка Notch. Некоторые нестероидные противовоспалительные лекарственные средства, такие как ибупрофен, сулиндак, индометацин и флурбипрофен, могут регулировать уровень γ-секретазы и снижать уровень Aβ42 в экспериментах с активностью in vivo и in vitro. Хотя было показано, что такие препараты облегчают легкие когнитивные нарушения и снижают уровень воспалительных факторов в спинномозговой жидкости, длительное использование нестероидных противовоспалительных препаратов для лечения AD все еще требует клинической проверки.

2. Ингибирование агрегации Aβ

Ингибирование сенильных бляшек может быть достигнуто путем препятствия или противодействия накоплению Aβ. Например, 3-амино-1-пропансульфоновая кислота (3-APS, Alzhemed, трамипрозат) препятствует взаимодействию между растворимым Aβ и эндогенным аминодекстраном, в котором последний может способствовать образованию и осаждению амилоидных волокон Aβ, тем самым ингибируя накопление Aβ. Однако результаты клинического исследования 3-APS фазы III были неудовлетворительными, что привело к приостановке исследования. Другие лекарственные средства против агрегации Aβ также потерпели неудачу в клинических испытаниях фазы II и фазы III, включая колостринин, который может ингибировать агрегацию Aβ и нейтрализовать нейротоксичность Aβ в тесте in vitro, а также может улучшить когнитивные способности мышей в тестах in vivo, но он не дал удовлетворительных результатов в клинической фазе II исследования. Сцилло-инозитол (ELND005) является пероральным лекарственным средством против агрегации Aβ, и эксперименты на мышах показали, что сцилло-инозитол может снизить токсичность Aβ, но не дало ожидаемых результатов в 18-месячном клиническом испытании фазы II у пациентов с легкой и средней степенью AD.

3. Стимулирование выведения отложений Aβ и полимера

Существует три основных способа удаления отложений Aβ и полимера: активация активности ферментов, разрушающих амилоидные бляшки; регуляция транспорта Aβ в головном мозге и периферическом кровообращении; и иммунотерапия против Aβ.

Отложение и полимер Aβ могут разлагаться множеством протеолитических ферментов, включая плазмин, эндотелин-превращающий фермент, ангиотензин-превращающий фермент, металлопротеиназу и т. д. Уровни этих ферментов в головном мозге пациентов с AD относительно низкие, но из-за отсутствия специфичности для этих ферментов в настоящее время в клинику такие лекарственные средства не поступали.

Транспорт Aβ между центральной нервной системой и периферической системой кровообращения регулируется аполипопротеином. Белок, связанный с рецептором липопротеинов низкой плотности (LRP-1), может способствовать потоку Aβ из мозга в кровь. Рецептор конечных продуктов гликирования (RAGE) может способствовать прохождению Aβ через гематоэнцефалический барьер. Этот механизм лечения заключается в снижении нагрузки амилоида в головном мозге путем ограничения попадания Aβ в периферическое кровообращение. На данный момент в клинические испытания прошли только ингибиторы/модуляторы RAGE, в том числе PF-0449470052 и TTP4000. Первые потерпели неудачу в клинических испытаниях фазы II, в то время как у вторых не было надежных данных, чтобы показать, что ожидаемые результаты были достигнуты в клинических испытаниях фазы I.

Антитела против Aβ могут нейтрализовать токсичность Aβ и улучшить когнитивные способности трансгенных животных. Антитела против Aβ стали горячей темой в лечении AD. Антитела против Aβ в основном нацелены на раннее лечение AD, а также лечение AD от легкой до умеренной степени. Это также связано с патогенным механизмом Aβ, то есть, как только нейроны повреждаются, это трудно обратить вспять и восстановить, поэтому раннее удаление Aβ может более эффективно лечить и облегчать AD.

4. Антитела, направленные на Aβ, которые в настоящее время проходят клинические испытания

В настоящее время проходят клинические испытания 15 лекарственных средств на основе антител против Aβ. Для сравнения: Адуканумаб, Гантенерумаб и Соланезумаб быстро продвинулись вперед и вошли в фазу III клинических испытаний. Как упоминалось в разделе механизма, различные компании нацелены на легкую болезнь Альцгеймера в качестве показаний.

Несмотря на наличие определенных теоретических знаний в области лечения и предотвращения болезни Альцгеймера, все еще существует потребность в улучшении композиции и способа лечения и/или предотвращения заболевания, а также в антителах и методах лечения, которые могут направленно воздействовать на Aβ. Хотя были получены некоторые гуманизированные моноклональные антитела с большими терапевтическими преимуществами, отсеивание гуманизированных моноклональных антител с необходимыми свойствами и функциями - непростая задача. В действительности, такие гуманизированные моноклональные антитела все еще остро необходимы.

Содержание настоящего описания

Ввиду этого техническая проблема, которая должна быть решена настоящим описанием, заключается в предложении гуманизированного моноклонального антитела против Aβ и его применения, а также в предложении носителя и клетки-хозяина для нуклеотида, кодирующего моноклональное антитело, и его прменения. Из последовательности вариабельной области гена антитела, включенного в настоящее описание, может быть сконструирована полноразмерная молекула антитела, которая может быть использована в качестве лекарственного средства для лечения и диагностики связанных с амилоидозом заболеваний и расстройств (таких как болезнь Альцгеймера) в условиях клиники.

Чтобы достичь вышеупомянутой цели настоящего описания, в настоящем описании предложены следующие технические решения.

В настоящем описании предложено гуманизированное моноклональное антитело против Aβ, в котором

(I) аминокислотные последовательности трех областей CDR тяжелой цепи моноклонального антитела представляют собой аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1, 2 и 3, соответственно; и (II) аминокислотные последовательности трех областей CDR легкой цепи моноклонального антитела представляют собой аминокислотные последовательности SEQ ID NO:4, 5 и 6, соответственно;

или

(III) аминокислотные последовательности представляют собой аминокислотные последовательности, полученные из аминокислот (I) или (II) посредством замены, делеции или вставки одной или более аминокислот, и представляют собой аминокислотные последовательности, выполняющие ту же функцию, что и аминокислотная последовательность (I) или (II);

кроме того, функция включает две или три функции, выбранные из группы, состоящей из ингибирования полимеризации Aβ, улучшения когнитивных способностей к обучению и памяти в модели деменции Альцгеймера и цитотоксической защитной активности;

или

(IV) аминокислотные последовательности представляют собой аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 97% гомологии с аминокислотными последовательностями (I), (II) или (III).

Кроме того, моноклональное антитело по настоящему изобретению содержит антигенсвязывающий эпитоп Aβ_30~42.

В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего описания в настоящем описании предложено гуманизированное моноклональное антитело против Aβ, где:

его тяжелая цепь содержит три области CDR, в которых по меньшей мере одна из областей CDR имеет аминокислотную последовательность, которая представляет собой аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, 2 или 3, или аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере 97% гомологии с этой аминокислотной последовательностью;

его легкая цепь содержит три области CDR, в которых по меньшей мере одна из областей CDR имеет аминокислотную последовательность, которая представляет собой аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4, 5 или 6, или аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере 97% гомология с этой аминокислотной последовательностью.

В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего описания три области CDR тяжелой цепи моноклонального антитела имеют аминокислотные последовательности, которые представляют собой аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1, 2 и 3, соответственно;

три области CDR легкой цепи моноклонального антитела имеют аминокислотные последовательности, которые представляют собой аминокислотные последовательности SEQ ID NO:4, 5 и 6, соответственно.

В настоящей заявке последовательность SEQ ID NO:1 представляет собой SYAMS;

последовательность SEQ ID NO:2 представляет собой SISTTSNTYYPDSVKG;

последовательность SEQ ID NO:3 представляет собой GVITNQAWFAY;

последовательность SEQ ID NO:4 представляет собой RASQSISNNLH;

последовательность SEQ ID NO:5 представляет собой YASQSIS;

последовательность SEQ ID NO:6 представляет собой QQSNSWPLT.

В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего описания в настоящем описании предложено моноклональное антитело, в котором

(V) аминокислотные последовательности 4 областей FR тяжелой цепи моноклонального антитела представляют собой аминокислотные последовательности SEQ ID NO:7, 8, 9 и 10, соответственно; и (VI) аминокислотные последовательности 4 областей FR легкой цепи моноклонального антитела представляют собой аминокислотные последовательности SEQ ID NO:11, 12, 13 и 14, соответственно;

или

(VII) аминокислотные последовательности представляют собой аминокислотные последовательности, полученные из аминокислот (V) или (VI) посредством замены, делеции или вставки одной или более аминокислот, и представляют собой аминокислотные последовательности, выполняющие ту же функцию, что и аминокислотные последовательности (V) или (VI);

кроме того, функция включает две или три функции, выбранные из группы, состоящей из ингибирования полимеризации Aβ, улучшения когнитивных способностей к обучению и памяти в модели деменции Альцгеймера и цитотоксической защитной активности;

или

(VIII) аминокислотные последовательности представляют собой аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 97% гомологии с аминокислотными последовательностями (V), (VI) или (VII).

В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего описания его тяжелая цепь включает 4 области FR, в которых по меньшей мере одна из областей FR имеет аминокислотную последовательность, которая является аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:7, 8, 9 или 10, или аминокислотная последовательность, которая имеет по меньшей мере 97% гомологии с этой аминокислотной последовательностью;

его легкая цепь содержит 4 области FR, в которых по меньшей мере одна из областей FR имеет аминокислотную последовательность, которая представляет собой аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11, 12, 13 или 14, или аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере 97% гомологии с этой аминокислотной последовательностью.

В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего описания четыре FR-области тяжелой цепи моноклонального антитела имеют аминокислотные последовательности, которые представляют собой аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7, 8, 9 и 10, соответственно, или аминокислотные последовательности, которые имеют по меньшей мере 97% гомологии с этими аминокислотными последовательностями;

4 FR области легкой цепи моноклонального антитела имеют аминокислотные последовательности, которые представляют собой аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11, 12, 13 и 14, соответственно, или аминокислотные последовательности, которые имеют по меньшей мере 97% гомологии последовательности с этими аминокислотными последовательностями.

В настоящей заявке последовательность SEQ ID NO:7 представляет собой EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGFTFR;

последовательность SEQ ID NO:8 представляет собой WVRQAPGKGLEWVA;

последовательность SEQ ID NO:9 представляет собой RFTTSRDNSKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCGR;

последовательность SEQ ID NO:10 представляет собой WGQGTLVTVSS;

последовательность SEQ ID NO:11 представляет собой DIVLTQSPATLSVSPGERATLSC;

последовательность SEQ ID NO:12 представляет собой WYQQKPGQAPRLLIK;

последовательность SEQ ID NO:13 представляет собой GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLQSEDFAVYFC;

последовательность SEQ ID NO:14 представляет собой FGGGTKVEIK.

В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего описания для моноклонального антитела

(IX) его вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO:15-19; и (X) его вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO:20-24;

или

(XI) его вариабельная область тяжелой цепи или вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, полученную из аминокислот (IX) или (X) посредством замены, делеции или вставки одной или более аминокислот, и они представляют собой аминокислотные последовательности, имеющие ту же функцию, что и аминокислотная последовательность (IX) или (X);

кроме того, функция включает две или три функции, выбранные из группы, состоящей из ингибирования полимеризации Aβ, улучшения когнитивных способностей к обучению и памяти в модели деменции Альцгеймера и цитотоксической защитной активности;

или

(XII) его вариабельная область тяжелой цепи или вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 97% гомологии с аминокислотной последовательностью (IX), (X) или (XI).

В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего описания вариабельная область его тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO:15-19; и его вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO:20-24.

В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего описания гуманизированное моноклональное антитело против Aβ включает:

вариабельную область тяжелой цепи, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:15, 16, 17, 18 или 19, и вариабельную область легкой цепи, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:20; или

вариабельную область тяжелой цепи, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:15, 16, 17, 18 или 19, и вариабельную область легкой цепи, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:21; или

вариабельную область тяжелой цепи, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:15, 16, 17, 18 или 19, и вариабельную область легкой цепи, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:22; или

вариабельную область тяжелой цепи, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:15, 16, 17, 18 или 19, и вариабельную область легкой цепи, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:23; или

вариабельную область тяжелой цепи, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:15, 16, 17, 18 или 19, и вариабельную область легкой цепи, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:24.

В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего описания для моноклонального антитела

(XIII) его вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:16, а его вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:21; или

(XIV) его вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:16, а его вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:22; или

(XV) его вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:18, а его вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:21; или

(XVI) его вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:19, а его вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:20; или

(XVII) его вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:19, а его вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:21; или

(XVIII) его вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность в SEQ ID NO:19, а его вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:22.

В настоящем описании последовательность, которая имеет по меньшей мере 97% гомологию последовательности, представляет собой аминокислотную последовательность, полученную заменой, делецией или вставкой одной или более аминокислот на основе исходной последовательности, где большее количество аминокислот относится к 2, 3, 4 или 5 аминокислотам.

В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего описания моноклональное антитело дополнительно содержит константную область, в которой моноклональное антитело имеет константную область тяжелой цепи, которая относится к любому из человеческих IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4; и моноклональное антитело имеет константную область легкой цепи, которая относится к типу κ или типу λ.

В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего описания моноклональное антитело против Aβ, представленное в соответствии с настоящим описанием, имеет константную область тяжелой цепи, которая представляет собой человеческий IgG1, и константную область легкой цепи, которая является константной областью человеческой κ-цепи.

Гуманизированное моноклональное антитело против Aβ, предложенное в настоящем описании, может связываться с человеческим Aβ; в некоторых вариантах осуществления аффинность между антителом и его мишенью характеризуется Ka (константа ассоциации), Kd (константа диссоциации) и KD (константа равновесной диссоциации); и значение KD антитела, предложенного в настоящем описании, не выше чем 36,3 нМ. Гуманизированное моноклональное антитело против Aβ, предложенное в настоящем описании, может ингибировать полимеризацию мономера Aβ, защищать нервные клетки от токсичности Aβ и оказывает определенное влияние на улучшение когнитивных способностей к обучению и памяти у мышей с моделью деменции Альцгеймера.

В настоящем описании также предложены нуклеотиды, кодирующие моноклональное антитело.

В настоящем описании предложена нуклеотидная последовательность, кодирующая тяжелую цепь моноклонального антитела.

В настоящем описании предложена нуклеотидная последовательность, кодирующая легкую цепь моноклонального антитела.

В настоящем описании предложена нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи моноклонального антитела.

В настоящей заявке нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи моноклонального антитела, представлена в SEQ ID NO:25-29 или является комплементарной последовательностью SEQ ID NO:25-29.

В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего описания нуклеотид имеет нуклеотидную последовательность, которая получена из нуклеотидной последовательности любой из SEQ ID NO:25-29 посредством замены, делеции или вставки одного или более нуклеотидов и имеет функцию такую же или аналогичную функции нуклеотидной последовательности любой из SEQ ID NO:25-29.

В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего описания для нуклеотидной последовательности, которая получена из нуклеотидной последовательности любой из SEQ ID NO:25-29 посредством замены, делеции или вставки одного или более нуклеотидов, большее количество нуклеотидов относится к 2 , 3, 4 или 5 нуклеотидам.

В настоящем описании предложена нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи моноклонального антитела.

В настоящей заявке нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи моноклонального антитела, представлена в SEQ ID NO:30-34 или является комплементарной последовательностью SEQ ID NO:30-34.

В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего описания нуклеотид имеет нуклеотидную последовательность, которая получена из нуклеотидной последовательности любой из SEQ ID NO:30-34 посредством замены, делеции или вставки одного или более нуклеотидов, и имеет функцию, такую же или аналогичную функции нуклеотидной последовательности любой из SEQ ID NO:30-34.

В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего описания для нуклеотидной последовательности, которая получена из нуклеотидной последовательности любой из SEQ ID NO:30-34, посредством замены, делеции или вставки одного или более нуклеотидов, большее количество нуклеотидов относится к 2, 3, 4 или 5 нуклеотидам.

Экспрессирующий вектор, предложенный в настоящем описании, содержит нуклеотиды, кодирующие моноклональное антитело против Aβ.

В настоящем описании также предложена клетка-хозяин, которая трансформирована или трансфецирована экспрессирующим вектором.

Способ получения моноклонального антитела против Aβ по настоящему изобретению включает: культивирование клетки-хозяина и индукцию экспрессии моноклонального антитела против Aβ.

В настоящем описании также предложен конъюгат, содержащий моноклональное антитело, меченное химически или биологически.

На химической этикетке указан изотоп, иммунотоксин и/или химический препарат.

Биологическая метка представляет собой метку биотина, авидина или фермента.

Ферментная метка предпочтительно представляет собой пероксидазу хрена или щелочную фосфатазу.

Иммунотоксин предпочтительно представляет собой афлатоксин, токсин дифтерии, экзотоксин pseudomonas aeruginosa, рицин, абрин, лектин омелы белой, токсин волкенсина, PAP, сапорин, гелонин или люффин.

В настоящем описании также предлагается продукт связывания, который получают путем связывания моноклонального антитела или его конъюгата с твердой средой или полутвердой средой.

Твердая среда или нетвердая среда выбирается из коллоидного золота, полистирольные пластины или гранулы.

В настоящем описании также предложено применение моноклонального антитела, конъюгата и/или продукта связывания в производстве агента для борьбы с когнитивными нарушениями, агента для лечения болезни Альцгеймера, агента для ингибирования прогрессирования болезни Альцгеймера, агента для ингибирования образования сенильных бляшек, агента для ингибирования накопления Aβ, агента для борьбы с нейротоксичностью, агента для ингибирования образования амилоидных фибрилл Aβ и/или агента для борьбы с синаптической токсичностью.

В настоящем описании также предложено применение гуманизированного моноклонального антитела против Aβ, конъюгата и/или продукта связывания в производстве лекарственного средства для предотвращения и лечения заболевания;

причем заболевание включает амилоидоз, который представляет собой заболевание и аномалию, связанные с амилоидным белком, амилоидоз включает вторичный амилоидоз и возрастной амилоидоз, и заболевание включает, но не ограничивается этим, неврологическое заболевание, такое как болезнь Альцгеймера.

В настоящем описании также предложено лекарственное средство, содержащее гуманизированное моноклональное антитело против Aβ, его конъюгат и/или продукт связывания.

В настоящем описании также предложен способ предотвращения и/или лечения заболевания, включающий введение лекарственного средства по настоящему описанию; заболевание и нарушение включают амилоидоз, который представляет собой заболевание и аномалию, связанные с амилоидным белком, амилоидоз включает вторичный амилоидоз и возрастной амилоидоз, и заболевание, включающее, но не ограничиваясь этим, неврологическое заболевание, такое как болезнь Альцгеймера.

Гуманизированное моноклональное антитело против Aβ, предложенное в настоящем описании, может ингибировать полимеризацию мономеров Aβ, защищать нервные клетки от токсичности Aβ, оказывать определенное влияние на улучшение когнитивных способностей к обучению и памяти у мышей с моделью деменции Альцгеймера и может использоваться для лечения и диагностики заболеваний и расстройств, связанных с амилоидозом, таких как болезнь Альцгеймера.

В настоящем описании также предложено применение гуманизированного моноклонального антитела против Aβ, конъюгата и/или продукта связывания в производстве продукта для детектирования экспрессии Aβ.

Эксперименты показывают, что гуманизированное моноклональное антитело против Aβ, предложенное в настоящем описании, может связываться с мономером Aβ. Следовательно, гуманизированное моноклональное антитело против Aβ, предложенное в настоящем описании, можно использовать для детектирования мономера Aβ.

В настоящем описании также предложен набор, содержащий гуманизированное моноклональное антитело против Aβ, его конъюгат и/или продукт связывания.

Набор для детектирования мономера Aβ или смеси полимеров, предложенный в настоящем описании, дополнительно включает буфер для покрытия, промывочный раствор, блокирующий раствор и/или раствор для проявления цвет.

Буфер для покрытия представляет собой карбонатный буфер.

Промывочный раствор включает PBS, Tween, хлорид натрия, хлорид калия, гидрофосфат динатрия и гидрофосфат калия.

Блокирующий раствор содержит PBS и BSA.

Раствор для проявления цвета включает раствор TMB, раствор субстратного буфера и стоп-раствор.

Субстратный буфер включает лимонную кислоту и динатрий гидрофосфат.

Стоп-раствор представляет собой водный раствор перекиси водорода.

Набор для детектирования клетки с поверхностной экспрессией Aβ дополнительно включает PBS, козье антитело против мышиного Fc IgG и вторичное антитело TITC.

В настоящем описании также предложен способ диагностики заболевания, включающий использование набора, предложенного в настоящем описании, для детектирования экспрессии Aβ и определение наличия заболевания на основе количества экспрессии Aβ; заболевание включает амилоидоз, который представляет собой заболевание и аномалию, связанные с амилоидным белком, амилоидоз включает вторичный амилоидоз и возрастной амилоидоз, и заболевание включает, но не ограничивается этим, неврологическое заболевание, такое как болезнь Альцгеймера.

В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего описания стандарт для определения наличия заболевания на основе количества экспрессии Aβ составляет: от 600 до 1000 пг/мл для здоровых людей, от 200 до 450 пг/мл для пациентов с AD, и требуемая чувствительность детектирования <20 пг/мл.

Если не указано иное, все используемые в настоящей заявке научные и технологические термины имеют такое же значение, как их понимают специалисты в данной области. Определения и термины в этой области можно найти в Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel). Аббревиатура аминокислотного остатка представляет собой стандартный трехбуквенный и/или однобуквенный код, используемый в данной области техники для обозначения одной из 20 обычно используемых L-аминокислот.

«Антитело» относится к белку, состоящему из одного или более полипептидов, которые могут специфически связываться с антигеном. Одна форма антитела составляет основную структурную единицу антитела. Эта форма представляет собой тетрамер, который состоит из двух пар идентичных цепей антител, каждая из которых имеет легкую цепь и тяжелую цепь. В каждой паре цепей антитела вариабельные области легкой цепи и тяжелой цепи совместно отвечают за связывание антигена, в то время как константные области отвечают за эффекторную функцию антитела.

«Вариабельная область» тяжелой или легкой цепи антитела представляет собой N-концевую зрелую область цепи. Известные в настоящее время типы антител включают легкие цепи κ и λ, а также тяжелые цепи α, γ (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), δ, ε и μ или их эквиваленты другого типа. Полноразмерная «легкая цепь» иммуноглобулина (приблизительно 25 кДа или приблизительно 214 аминокислот) включает вариабельную область, образованную приблизительно 110 аминокислотами на NH2-конце, и константную область κ или λ на COOH-конце. Полноразмерная «тяжелая цепь» иммуноглобулина (приблизительно 50 кДа или приблизительно 446 аминокислот) также включает вариабельную область (приблизительно 116 аминокислот) и одну из константных областей тяжелой цепи, такую как γ (приблизительно 330 аминокислот).

«Антитело» включает любое изотипическое антитело или иммуноглобулин, или фрагмент антитела, который сохраняет специфическое связывание с антигеном, включая, но не ограничиваясь ими, Fab, Fv, scFv и Fd фрагменты, химерные антитела, гуманизированные антитела, одноцепочечные антитела и слитые белки, содержащие антиген-связывающую часть антитела и белок, не являющийся антителом. Антитело может быть меченным и детектируемым. Например, оно может быть меченным и детекируемым с помощью радиоизотопов, ферментов, флуоресцентных белков, биотина и т. д., которые могут производить детектируемые вещества. Антитело также может быть связано с твердым носителем, включая, помимо прочего, полистирольные пластины или гранулы.

«Гуманизированное антитело» относится к антителу, которое содержит область CDR, полученную из антитела, не являющегося человеческим, а другие части молекулы антитела происходят из одного (или нескольких) человеческих антител. Более того, чтобы сохранить аффинность связывания, можно модифицировать некоторые остатки сегмента каркаса (называемого FR).

«Моноклональное антитело» относится к препарату молекул антитела с одним молекулярным составом. Композиция моноклональных антител демонстрирует единственную специфичность связывания и аффинность к конкретному эпитопу.

Лекарственное средство включает по меньшей мере один функциональный ингредиент и, кроме того, включает фармацевтически приемлемый носитель. Предпочтительно фармацевтически приемлемый носитель представляет собой воду, буферный водный раствор, изотонический солевой раствор, такой как PBS (фосфатно-солевой буфер), глюкоза, маннит, декстроза, лактоза, крахмал, стеарат магния, целлюлоза, карбонат магния, 0,3% глицерин, гиалуроновая кислота, этанол или полиалкиленгликоли, такие как полипропиленгликоль, триглицериды и т. д. Тип используемого фармацевтически приемлемого носителя зависит, в частности, от того, приготовлена ли композиция согласно настоящему описанию для перорального, назального, внутрикожного, подкожного, внутримышечного или внутривенного введения. Композиция согласно настоящему описанию может содержать смачивающий агент, эмульгатор или буферное вещество в качестве добавки.

Используемый в настоящем описании термин «CDR-область» или «CDR» относится к гипервариабельной области тяжелой цепи и легкой цепи иммуноглобулина, как определено Kabat et al. (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5th Ed., US Department of Health and Human Services, NIH, 1991, и поздние версии). Существует три CDR тяжелой цепи и три CDR легкой цепи. В зависимости от ситуации, термин одна CDR или более CDR, используемый в настоящем описании, используется для обозначения одной из этих областей или нескольких или даже всех этих областей, которые содержат большинство аминокислотных остатков, ответственных за связывание за счет аффинности антитела к антиген или его узнающий эпитоп.

В настоящем описании предложен способ модификации гуманизации антитела, в котором целесообразный дизайн гуманизации антитела осуществляется путем обращения к мульти-матрице для выполнения трансплантации FR, тем самым получая гуманизированное антитело с аффинностью, эквивалентной таковой у мышиного антитела.

Способ получения гуманизированного моноклонального антитела против Aβ, предложенный в настоящем описании, включает:

Стадия 1: получение гибридомы, полученной от мыши, получение последовательности антитела через 5'RACE;

Стадия 2: гуманизация антитела, при которой выравнивание последовательностей выполняется с помощью инструмента NCBI для завершения модификации гуманизации, а модифицированные антитела подвергаются скринингу.

В частности, способ включает следующее.

Способ получения гуманизированного моноклонального антитела против Aβ включает: использование мышиного антитела 066-4.26.14 в качестве матрицы, выполнение ПЦР-амплификации для получения гена VH вариабельной области тяжелой цепи и гена VL вариабельной области легкой цепи антитела, и перевод их в аминокислотные последовательности, а затем выравнивание аминокислотных последовательностей с последовательностями человеческих антител в базе данных NCBI и выбор 5 последовательностей человеческих антител с наибольшим сходством с VH и VL вариабельных областей в качестве эталонных матриц для модификации гуманизации, определение областей CDR мышиного антитела 066-4.26.14, оставление областей CDR неизменными, трансплантация областей FR из 5 эталонных матриц вышеуказанных VH и VL, соответственно, в 066-4.26.14 для получения гуманизированных последовательностей, которые оптимизированы по кодонам и затем отдельно подвергаются конструированию экспрессирующих векторов для транзиторной трансфекции; перенос экспрессирующих векторов в клетки 293E для экспрессии с целью получения гуманизированных антител, которые специфически связываются с Aβ; определение аффинности гуманизированных антител, определение величины ЕС50 связывания антигена, тест ингибирования полимеризации Aβ и тест защиты от цитотоксичности и, наконец, получение гуманизированных антител Aβ.

Гуманизированное моноклональное антитело против Aβ, предложенное в настоящем описании, может ингибировать полимеризацию мономеров Aβ, защищать нервные клетки от токсичности Aβ, оказывать определенный эффект на улучшение когнитивных способностей к обучению и памяти у мышей с моделью деменции Альцгеймера и может быть используется для лечения и диагностики заболеваний и расстройств, связанных с амилоидозом, таких как болезнь Альцгеймера.

Краткое описание чертежей

Для более ясного объяснения примеров настоящего описания или технических решений в предшествующем уровне техники ниже будут кратко описаны чертежи, которые необходимо использовать в описании примеров или предшествующего уровня техники.

На Фиг.1 показаны результаты детектирования в SDS-PAGE и WB смеси мономера Aβ и полимера; в котором дорожка M: маркер молекулярной массы белка; полоса 1: мономер Aβ; полоса 2: смесь полимеров Aβ; Фиг. 1 (A): результаты детектирования в SDS-PAGE смеси мономера Aβ и полимера; Фиг. 1 (B): результаты определения WB смеси мономера Aβ и полимера;

На Фиг. 2 показаны результаты детектирования очищенных положительных антител в SDS-PAGE; в котором дорожка M: маркер молекулярной массы белка; полоса 1: 066-P01 (невосстанавливающие условия); полоса 2: 066-P01 (восстанавливающие условия); полоса 3: 066-P02 (невосстанавливающие условия); полоса 4: 066-P02 (восстанавливающие условия); Фиг. 2 (A): результаты детектирования очищенного положительного антитела 066-P01 в SDS-PAGE; Фиг. 2 (B): результаты детектирования очищенного положительного антитела 066-P02 в SDS-PAGE;

На Фиг.3 показаны результаты детектирования моноклональных антител против Aβ при ингибировании полимеризации Aβ; абсцисса представляет различные группы образцов, ордината представляет относительную интенсивность флуоресценции, и все моноклональные антитела против Aβ, такие как 066-4.22.1, 066-4.26.14, 066-5.4.1, могут ингибировать полимеризацию Aβ; на фиг. 3 (A) показаны результаты детектирования групп образцов IgG, моноклональных антител против Aβ 066-P01, 066-5.4.1, 066-6.1.1, 066-6.1.3, 066-6.2. 1, 066-6.7.2 по ингибированию полимеризации Aβ, соответственно; На Фиг.3 (B) показаны результаты детектирования групп образцов PBS, IgG, моноклональных антител против Aβ 066-4.21.13, 066-4.26.14, 066-4.6.8, 066-4.22.1, 066-4.18. .2, 066-P01 в ингибировании полимеризации Aβ, соответственно;

На Фиг. 4 показаны результаты определения активности моноклональных антител против Aβ в стимулировании макрофагального фагоцитоза Aβ; абсцисса представляет различные группы образцов, ордината представляет интенсивность флуоресценции, и моноклональные антитела против Aβ 066-5.4.1, 066-7.17.2 обладают активностью, способствующей фагоцитозу Aβ макрофагами;

На Фиг.5 показаны результаты определения защитной активности моноклональных антител против Aβ против цитотоксичности; абсцисса представляет различные группы образцов, ордината представляет относительное значение высвобождения LDH, антитела 066-4.26.14, 066-5.4.1, 066-6.1.1, 066-6.1.3, 066-6.2.1, 066- 6.7.2, 066-7.17.2 все обладают защитным действием против цитотоксичности, и их защитное действие эквивалентно таковому 066-P02; на Фиг. 5 (A) показаны результаты определения защитной активности групп образцов: Наполнитель, IgG, моноклональные антитела против Aβ 066-4.21.13, 066-4.17.28, 066-4.6.8, 066-4.22.1 , 066-4.26.14, 066-4.18.2, 066-P02 против цитотоксичности, соответственно; На фиг. 5 (B) показаны результаты определения защитной активности групп образцов: Носитель, IgG, моноклональные антитела против Aβ 066-6.2.1, 066-7.17.2, 066-5.4.1, 066-6.1.1, 066- 6.1.3, 066-6.7.2, 066-P02 против цитотоксичности, соответственно;

На Фиг.6 показаны результаты детектирования эксперимента с водным лабиринтом Морриса; на котором абсцисса представляет время после обработки (дни 1, 2, 3, 4 и 5), а ордината представляет время, чтобы найти скрытую платформу под поверхностью воды (единица измерения: секунды);

На Фиг.7 показаны результаты детектирования электрофореза в агарозном геле с суммарной РНК; в какой полосе М: маркер молекулярной массы DL2000; полоса 1: суммраная РНК 066-4,26,14;

На Фиг. 8 показаны результаты детектирования с помощью электрофореза в агарозном геле продуктов ПЦР вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи антитела-кандидата; полоса M: маркер молекулярной массы DL2000; полоса 1: продукт ПЦР вариабельной области тяжелой цепи 066-4.26.14; полоса 2: продукт ПЦР вариабельной области легкой цепи 066-4.26.14; на фиг. 8 (A) показаны результаты ПЦР вариабельной области тяжелой цепи 066-4.26.14; 8 (B) показаны результаты ПЦР вариабельной области легкой цепи 066-4,26,14;

На Фиг. 9 показаны результаты детектирования в SDS-PAGE очищенного химерного антитела мыши и человека 066-4.26.14-chAb; полоса M: маркер молекулярной массы белка; полоса 1: химерное антитело мышь-человек 066-4.26.14-chAb (невосстанавливающие условия); полоса 2: химерное антитело мышь-человек 066-4.26.14-chAb (восстанавливающие условия); 9 (A) показаны результаты электрофореза в невосстанавливающих условиях химерного антитела мышь-человек 066-4.26.14-chAb; 9 (B) показаны результаты электрофореза в восстанавливающих условиях химерного антитела мышь-человек 066-4.26.14-chAb;

На Фиг.10 показаны результаты детектирования очищенных гуманизированных антител-кандидатов в SDS-PAGE; полоса M: маркер молекулярной массы белка; на фиг.10 (A) дорожки с 1 по 6 представляют собой гуманизированные антитела 066-4.26.14H2L2, 066-4.26.14H2L3, 066-4.26.14H4L2, 066-4.26.14H5L1, 066-4.26.14H5L2, 066-4.26.14H5L3. (невосстанавливающие условия) соответственно; на фиг.10 (B) дорожки с 1 по 6 представляют собой гуманизированные антитела 066-4.26.14H2L2, 066-4.26.14H2L3, 066-4.26.14H4L2, 066-4.26.14H5L1, 066-4.26.14H5L2, 066-4.26.14H5L3 (восстанавливающие условия), соответственно;

На Фиг.11 показаны результаты детектирования гуманизированных антител против Aβ при ингибировании полимеризации Aβ; абсцисса представляет различные группы образцов, а ордината представляет относительную интенсивность флуоресценции; все гуманизированные антитела 066-4.26.14 могут ингибировать полимеризацию Aβ;

На Фиг.12 показаны результаты определения защитной активности гуманизированных антител против цитотоксичности; абсцисса представляет различные группы образцов, а ордината представляет относительное значение высвобождения LDH, все гуманизированные антитела-кандидаты 066-4.26.14 обладают защитным действием против цитотоксичности, а защитный эффект эквивалентен таковому 066-P02, в котором 066 -4.26.14H5L2 показывает лучшую производительность.

Конкретные модели для осуществления настоящего описания

В настоящем описании раскрыто гуманизированное моноклональное антитело против Aβ и его применение, и специалисты в данной области могут реализовать их, изучив содержание настоящего описания и соответствующим образом улучшив параметры процесса. В частности, следует отметить, что все аналогичные замены и модификации очевидны для специалистов в данной области техники, и все они считаются включенными в настоящее описание. Способы и использование настоящего описания были описаны с помощью предпочтительных примеров, и очевидно, что специалисты в данной области техники могут внести изменения или соответствующие изменения и комбинации в способы и использование, описанные в настоящей заявке, без отступления от содержания, сущности и объема настоящего описания, чтобы реализовать и применить технологию настоящего описания.

Гуманизированные моноклональные антитела против Aβ, предложенные в настоящем описании, а также исходные материалы и реагенты, используемые при применении, были коммерчески доступны.

Настоящее описание дополнительно проиллюстрировано в сочетании со следующими примерами:

Пример 1: Получение антигена Aβ и антитела положительного контроля.

Приготовление смеси мономера Aβ и полимера

Полипептиды Aβ_1-42, Aβ_1-16 и Aβ_14-29 были синтезированы Ji’er Biochemical (Shanghai) Co., Ltd. Аминокислотная последовательность полипептида Aβ_1-42 соответствует: DAEFRHDSGYEVHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA (SEQ ID: 35), аминокислотная последовательность полипептида Aβ_1-16 соответствует: DAEFRHDSGYEVHHQK (SEQ ID: 36), а последовательность аминокислот Aβ_14-29: HQKLVFFAEDVGSNKGA (SEQ ID: 37).

Способ получения мономера Aβ_1-42 (сокращенно мономера Aβ): 1 мл гексафторизопропанола (HFIP) добавляли к 1 мг сухого порошка полипептида Aβ_1-42, подвергали вортексированию и встряхиванию в течение 1 мин и обрабатывали ультразвуком на водяной бане в течение 1-5 мин до полного растворения; помещали в инкубатор со встряхиванием при 37 °С, 200 об/мин и встряхивали в течение 1,5 часов; вакуумную роторную сушилку использовали для улетучивания гексафторизопропанола; 192 мкл безводного диметилсульфоксида (ДМСО) добавляли к высушенному полипептиду Aβ_1-42 для растворения полипептида, затем добавляли 27 мкл 20-кратного раствора PBS, 54 мкл 2% SDS, 267 мкл ddH₂O, хорошо перемешивали, упаковывали в небольших количествах, хранили в холодильнике при -80 °С, что представляло собой мономер Aβ_1-42; и его детектирование выполняли с помощью SDS-PAGE и WB (детектирование гибридизации выполняли с использованием положительного антитела 066-P02, которое специфически распознает Aβ_1-42) (см. Фиг. 1).

Метод приготовления смеси полимеров Aβ_1-42 (сокращенно Aβ полимерная смесь): 1 мл гексафторизопропанола (HFIP) добавляли к 1 мг сухого порошка полипептида Aβ_1-42, подвергали вортексированию и встряхивали в течение 1 мин, обрабатывали ультразвуком на водяной бане в течение 1-5 мин до полного растворения; помещали в инкубатор со встряхиванием при 37 °С, 200 об/мин и встряхивали в течение 1,5 ч; вакуумную роторную сушилку использовали для улетучивания гексафторизопропанола; 192 мкл ДМСО добавляли к сухому полипептиду Aβ_1-42 для растворения полипептида, затем добавляли 27 мкл раствора 20×PBS, 54 мкл 2% SDS, 267 мкл ddH₂O, хорошо перемешивали и помещали в водяную баню при 37 °С на 18-24 ч; добавляли 1,62 мл ddH₂O, тщательно перемешивали и помещали в водяную баню при 37 °С на 18-24 ч; переносили в PBS с использованием ультрафильтрационной трубки 10 кДа для замены буфера, упаковывали в небольших количествах, хранили в холодильнике при -80 °C, что представляло собой смесь полимеров Aβ_1-42; и их детектирование выполняли с помощью SDS-PAGE и WB (детектирование гибридизации выполняли с использованием положительного антитела 066-P02, которое специфически распознает Aβ_1-42) (см. Фиг. 1).

2. Конструирование экспрессирующего вектора антител положительного контроля

pGS003-hIgG1CH и pGS003-hIgKCL были отдельно выбраны в качестве экспрессирующих векторов для конструирования тяжелой цепи и легкой цепи анти-человеческих Aβ-положительных антител (066-P01: Solanezumab, Eli lily; 066-P02: Aducanumab, Biogen); после оптимизации кодонов аминокислотных последовательностей вариабельных областей положительных антител, гены VH и VL положительных антител были отдельно клонированы в pGS003-hIgG1CH и pGS003-hIgKCL с использованием метода расщепления рестрикционным ферментом для получения экспрессирующих векторов для транзиторной трансфекции pGS003-066-P01VH -hIgG1CH, pGS003-066-P01VL-hIgKCL, pGS003-066-P02VH-hIgG1CH и pGS003-066-P02VL-hIgKCL тяжелой цепи и легкой цепи положительного антитела. Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи положительного антитела 066-P01 (SEQ ID: 38):

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYSMSWVRQAPGKGLELVAQINSVGNSTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASGDYWGQGTLVTVSS

Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи положительного антитела 066-P01 (SEQ ID: 39):

DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLIYSDGNAYLHWFLQKPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPWTFGQGTKVEIK

Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи положительного антитела 066-P02 (SEQ ID: 40):

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFAFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWFDGTKKYYTDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNTLRAEDTAVYYCARDRGIGARRGPYYMDVWGKGTTVTVSS

Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи положительного антитела 066-P02 (SEQ ID: 41):

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIK

3. Экспрессия с помощью транзиторной трансфекции

pGS003-066-P01VH-hIgG1CH и pGS003-066-P01VL-hIgKCL;

pGS003-066-P02VH-hIgG1CH и pGS003-066-P02VL-hIgKCL экспрессировались транзиторно.

Клетки FreeStyle™ 293E использовали для экспрессии путем транзиторной трансфекции в среде Freestyle. За 24 часа до трансфекции 30 мл клеток 293E инокулировали при концентрации 0,5×10⁶ клеток/мл в конической колбе на 125 мл и культивировали на шейкере при 130 об/мин в инкубаторе с 5% CO2 при 37 °C. Во время трансфекции сначала брали 60 мкл 293E Фектин и добавляли к 1 мл Opti-MEM, хорошо перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 5 минут; тем временем всего 30 мкг плазмидной ДНК экспрессирующих векторов транзиторной трансфекции (рекомбинантные векторы) растворяли в 1 мл Opti-MEM. Затем плазмидную ДНК и 293E Фектин тщательно перемешивали до общего объема 2 мл, инкубировали при комнатной температуре в течение 15 минут, а затем всю смесь добавляли в лунки для культур клеток, перемешивали и инкубировали на шейкере в 37 °C, в инкубаторе с 5% CO2 при 130 об/мин в течение 7 дней. Культуральный бульон центрифугировали на высокой скорости, супернатант отбирали и подвергали вакуумной фильтрации через микропористую мембрану.

4. Очистка белка

В соответствии с рабочим методом, предоставленным производителем, для получения очищенных положительных антител 066-P01 и 066-P02 использовали колонку с протеином A (система жидкостной хроматографии для очистки белков/AKTA Purifier 10, GE) и никелевую колонку. Как показано на Фиг. 2.

Пример 2: Получение моноклональной гибридомы против Aβ.

Иммунизация мышей BALB/c

Полипептидный антиген Aβ_1-42 и полный адъювант Фрейнда встряхивали и смешивали в соответствии с их дозами, после завершения эмульгирования первую иммунизацию проводили самкам мышей BALB/c в возрасте 6 недель. Каждой мыши внутрибрюшинно вводили 200 мкг антигена, всего иммунизировали 3 группы мышей, по 5 мышей в каждой группе. Через две недели после первой иммунизации мышам проводили вторую внутрибрюшинную иммунизацию, в которой использовали неполный адъювант Фрейнда, в то время как доза иммунного антигена была такой же, как при первой иммунизации. После этого мышей иммунизировали внутрибрюшинно два раза в месяц, и дозы адъюванта и антигена были такими же, как при второй иммунизации.

После первой иммунизации из глазницы мыши собирали небольшое количество крови и каждые шесть недель проверяли титр сыворотки. После того, как титр сыворотки достигал 1:200000 или выше с помощью непрямого метода ИФА, мышей, используемых для слияния, подвергали бустерной иммунизации.

Подготовка миеломных клеток к слиянию

Клетки миеломы P3X63Ag8.653, используемые для слияния, восстанавливали за три недели, культивировали в среде DMEM, содержащей 1×8-азагуанин и 10% фетальной телячьей сыворотки, в течение двух недель и культивировали с DMEM, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки, за одну неделю до слияния, в котором плотность P3X63Ag8.653 поддерживалась на уровне от 70% до 80% до дня слияния.

Слияние клеток и скрининг HA

Получение и подготовка клеток селезенки: забирали 2 мышей после бустерной иммунизации, умерщвляли после сбора иммунной сыворотки и вымачивали в 75% спирте на 2-3 минуты. Кожу и брюшину на брюшной стороне иммунизированных мышей разрезали, чтобы обнажить селезенку. Селезенку получали путем удаления окружающих тканей с помощью ножничного наконечника, измельчения шлифовальным стержнем и фильтрации через клеточное сито для приготовления суспензии отдельных клеток. После центрифугирования супернатант отбрасывали.

Обработка перед слиянием клеток: P3X63Ag8.653 в культуральной колбе собирали, центрифугировали при 1000 об/мин/5 мин, затем супернатант удаляли, клетки ресуспендировали и подсчитывали количество живых миеломных клеток. Суспензию клеток селезенки центрифугировали для удаления супернатанта, добавляли лизат ACK, инкубировали и центрифугировали для удаления супернатанта для удаления эритроцитов, ресуспендировали в DMED и подсчитывали количество жизнеспособных клеток селезенки.

Слияние клеток: клетки смешивали при соотношении клеток селезенки: P3X63Ag8.653=1:2, центрифугировали при 2000 об/мин/5 мин для удаления супернатанта, встряхивали для диспергирования осадка клеток, добавляли 1 мг/мл проназы в концентрации 400 мкл/1×10⁸ клеток селезенки; после инкубации в течение 15 секунд для остановки реакции добавляли 10 мл фетальной бычьей сыворотки, добавляли раствор для электропорации (ECF) до 50 мл, центрифугировали при 2500 об/мин в течение 5 минут для удаления супернатанта, ресуспендировали с помощью ECF и подсчитывали жизнеспособные клетки и доводили плотность клеток селезенки до 2×10⁶/мл. Суспензию клеток с хорошо отрегулированной плотностью добавляли в резервуар для электрослияния и запускали электропоратор для слияния клеток. После слияния суспензию клеток переносили из резервуара для слияния в среду 1/2 НА, давали постоять в течение 3 часов, а затем проводили посев клеток.

Выбор среды HA: была приготовлена среда для селекции AT, содержащая 1/2 HA, 1×пенициллин-стрептомицин, 20% фетальной бычьей сыворотки и 80% среду DMEM. Клетки гибридомы мыши ресуспендировали в указанной выше селективной среде 1/2 НА и хорошо перемешивали. Суспензию клеток добавляли в 96-луночный планшет для культивирования клеток в количестве 200 мкл/лунку, 1×10⁶ клеток селезенки/планшет, помещали в инкубатор для клеток и культивировали при 37°C. После 1 недели культивирования среду 1/2 HA использовали для первого обновления среды, и культивирование продолжали в инкубаторе клеток при 37°C. После 3 дней культивирования среду 1/2 HA использовали для второго обновления среды.

Скрининг положительных клеточных линий

Через две недели после слияния брали клеточный супернатант и подвергали эксперименту ИФА для детектирования связывания клеточного супернатанта с человеческим Aβ_1-42, и после того, как клетки с положительным результатом ИФА были отобраны, второй эксперимент ИФА был тестировали повторно. Супернатант клеток с положительными результатами повторного тестирования отбирали для субклонирования и экспансии культуры.

Экспансия культуры

Клеточные линии с положительным результатом теста ИФА переносили из 96-луночного планшета в 24-луночный планшет и культивировали после того, как клетки росли по всему планшету, и их переносили в культуральную колбу на 25 см² и культивировали.

Субклонирование методом лимитирующего разведения

Положительные клеточные линии хорошо перемешивали взбиванием и пипетированием, и небольшое их количество забирали для подсчета жизнеспособных клеток. Примерно 200 клеток забирали пипеткой и добавляли к 80 мл полной среды, хорошо перемешивали и высевали на 4 планшета. Кроме того, забирали пипеткой примерно 400 клеток, добавляли к 80 мл полной среды, хорошо перемешивали и высевали на 4 планшета. Кроме того, отбирали пипеткой примерно 1000 клеток, добавляли к 20 мл полной среды, хорошо перемешивали и высевали на 1 планшет. Всего засевали 9 планшетов с 3 различными плотностями клеток, соответственно 0,5 клеток/лунку, 1 клетка/лунку и 10 клеток/лунку. 96-луночные планшеты помещали в инкубатор для культивирования при 37°C, 5% CO2.

Детектирование клонов и экспансия культуры

Супернатанты лунок моноклональных клеток отбирали для ИФА для детектирования связывания клонированного полноразмерного антитела с Aβ_1-42, а также с N-концевым, C-концевым и средним пептидными фрагментами Aβ_1-42, соответственно.

Покрытие: Стрептавидин разбавляли CBS (pH 9,6) до 1 мкг/мл, добавляли в 96-луночный микропланшет, 50 мкл на лунку, инкубировали в течение ночи при 2-8°C.

Блокирование: после однократного промывания планшета PBST его блокировали 1% BSA, 200 мкл на лунку, и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре.

Антиген: после трехкратного промывания планшета PBST, биотинилированные полипептиды Aβ_1-42, Aβ_1-16 и Aβ_14-29, соответственно, отбирали, разбавляли PBS (pH 7,2) до 1 мкг/мл и добавляли к ферментно-меченному 96-луночному планшету, 50 мкл на лунку, и инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре.

Добавление первичного антитела: после трехкратной промывки планшета PBST добавляли антитело-кандидат мыши, 50 мкл/лунку, и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов.

Добавление вторичного антитела: после трехкратной промывки планшета PBST добавляли антитело против мышиного IgG Fc-HRP в разбавителе 1:5000, 50 мкл/лунку, и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре.

Проявление цвета: после шестикратной промывки планшета PBST добавляли раствор для проявления цвета TMB, 50 мкл на лунку, и проявляли его в темноте в течение 10 минут при комнатной температуре.

Остановка реакции: непосредственно добавляли стоп-раствор для остановки реакции, 50 мкл на лунку.

Детектирование: после остановки реакции планшет для микротитрования немедленно помещали в считывающее устройство для микропланшетов, значение OD измеряли при 450 нм и сохраняли исходные данные.

Обработка данных: исходные данные были введены в программное обеспечение SoftMax Pro 6.2.1 для обработки данных. См. конкретные данные в Таблице 1. Результаты показали, что 12 мышиных антител-кандидатов содержат три разных антигенсвязывающих эпитопа, а именно N-концевой (Aβ_1-16), C-концевой (Aβ_30-42) и средний (Aβ_14-29) пептидные фрагменты, в которых антиген-связывающий эпитоп 066-4.26.14 был сгруппирован в С-концевой пептидный фрагмент Aβ_1-42 (поскольку 066-4.26.14 мог связываться с полноразмерным Aβ_1-42, но не связывался с Aβ_1-16, Aβ_14-29, было установлено, что он связан с областью Aβ30-42).

Клеточные линии с положительным результатом ИФА переносили из 96-луночного планшета в 24-луночный планшет для культивирования, и после того, как клетки наращивались в планшете, их переносили в культуральную колбу на 25 см² и культивировали.

Таблица 1: Группирование результатов детектирования антигенсвязывающих эпитопов мышиного антитела-кандидата

Название антитела Полноразмерный Aβ_1-42 Aβ_1-16(N-концевой пептидный фрагмент) Aβ_14-29(средний пептидный фрагмент) Эпитоп 066-4.6.8 1,2944 0,0561 0,5115 Средний пептидный фрагмент 066-4.17.28 1,4540 0,0690 1,1238 Средний пептидный фрагмент 066-4.18.2 1,0925 1,2210 0,0848 N-концевой пептидный фрагмент 066-4.21.13 1,3647 0,056 1,1457 Средний пептидный фрагмент 066-4.22.1 1,2517 0,0773 1,0401 Средний пептидный фрагмент 066-4.26.14 1,9312 0,0602 0,0674 C-концевой пептидный фрагмент 066-5.4.1 1,2483 0,0540 1,1566 Средний пептидный фрагмент 066-6.1.1 1,3752 0,1001 0,1180 C-концевой пептидный фрагмент 066-6.1.3 1,3665 0,0618 0,0803 C-концевой пептидный фрагмент 066-6.2.1 1,3085 0,0975 0,1003 C-концевой пептидный фрагмент 066-6.7.2 1,4707 1,6608 0,3058 N-концевой пептидный фрагмент 066-7.17.2 1,0833 0,9197 0,0612 N-концевой пептидный фрагмент

Идентификация подтипов

Козьи антитела против мышиных IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c, IgG3, IgM и IgGA наносили в виде покрытия , 50 нг/100 мкл/лунка, 4°C в течение ночи, блокировали BSA при комнатной температуре, добавляли тестируемый клеточный супернатант, инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов, добавляли меченое ферментом вторичное козье антитело против мышиного IgG, κ, λ, после проявления цвета, остановки реакции и считывания при 450 нм, было решено, что тестируемая клеточная линия относится к подтипу IgG1, κ или IgG2a, κ или IgG2b, κ. Результаты показаны в Таблице 2, в которой для антитела 066-4.26.14 его константная область тяжелой цепи соответствовала мышиному IgG2a, а константная область легкой цепи соответствовала константной области мышиной цепи κ.

Таблица 2: Результаты детектирования мышиных подтипов-кандидатов

Название антитела Подтип 066-4.6.8 IgG1, Каппа 066-4.17.28 IgG1, Каппа 066-4.18.2 IgG2b, Каппа 066-4.21.13 IgG1, Каппа 066-4.22.1 IgG1, Каппа 066-4.26.14 IgG2a, Каппа 066-5.4.1 IgG1, Каппа 066-6.1.1 IgG2a, Каппа 066-6.1.3 IgG2a, Каппа 066-6.2.1 IgG2a, Каппа 066-6.7.2 IgG2a, Каппа 066-7.17.2 IgG1, Каппа

Криоконсервация клеток

Приготовление раствора для криоконсервации: 90% фетальная бычья сыворотка, 10% ДМСО.

Клетки в культуральной колбе ресуспендировали; после подсчета клеток клетки центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5 минут, супернатант отбрасывали и суспензию перемешивали пипетированием с фетальной телячьей сывороткой, содержащей 10% DMSO, хранили в количестве 5×10⁶ клеток/пробирка в боксе для криоконсервации при -80°C в течение ночи, а на следующий день переносили в жидкий азот.

Консервация гена моноклональной гибридомы

Положительные моноклональные клеточные линии собирали, добавляли TRizol для лизиса клеток и извлечения РНК, которая подвергалась обратной транскрипции в кДНК, и хранили при -80 °C.

Получение антител методом культивирования in vitro

Приготовленные клеточные линии гибридомы восстанавливали следующим способом. Клеточные линии гибридомы восстанавливали в среде DMEM, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% стрептомицина пенициллина, и культивировали во флаконе; после того, как слияние клеток составило около 90%, проводили пассаж для наращивания, наращивание проводили до тех пор, пока общий супернатант клеточной культуры не достигал примерно 200 мл, затем супернатант собирали, центрифугировали и фильтровали для очистки.

Пример 3: Детектирование моноклонального антитела против Aβ при ингибировании полимеризации Aβ

8,2% раствор DMSO/DPBS (DMSO: sigma; DPBS: Hyclone) использовали для растворения сухого порошка Aβ до 1 мг/мл, раствор Aβ разбавляли DPBS до 33 мкг/мл, моноклональные антитела против Aβ 066-4,6.8, 066-4.18.2, 066-4.22.1, 066-4.26.14, 066-5.4.1, 066-6.1.1, 066-6.1.3, 066-6.2.1, 066-6.7.2 были разбавлены до 450 мкг/мл (IC100), а ThT (сигма) был разбавлен сверхчистой водой до 20 мкМ. Отбирали 50 мкл разбавителя антител и добавляли в 96-луночный черный планшет (Corning), затем добавляли 50 мкл разбавителя Aβ, наконец добавляли 100 мкл ThT, инкубировали в течение 24 часов при комнатной температуре в темноте и определяли интенсивность флуоресценции (Ex/Em=440/485) с помощью многофункционального ридера для микропланшетов. По оси абсцисс представлены различные группы образцов, а по оси ординат - относительная интенсивность флуоресценции. Результаты представлены на Фиг.3. На Фиг. 3 (A), когда относительная интенсивность флуоресценции группы IgG составляла 1,0, относительная интенсивность флуоресценции группы моноклональных антител против Aβ 066-5.4.1 составляла 0,59; на Фиг. 3 (B), когда относительная интенсивность флуоресценции группы PBS составляла 1,0, относительная интенсивность флуоресценции группы моноклональных антител против Aβ 066-4,22.1 составляла 0,44, а относительная интенсивность флуоресценции группы моноклональных антител против Aβ 066-4.26.14 составила 0,46; можно видеть, что все моноклональные антитела против Aβ, такие как 066-4.22.1, 066-4.26.14 и 066-5.4.1, могут ингибировать полимеризацию Aβ.

Пример 4: Детектирование активности моноклонального антитела против Aβ в стимулировании макрофагального фагоцитоза Aβ

Первичные перитонеальные макрофаги мыши, которые были в хорошем состоянии после 3 дней культивирования прикрепленной культуры, гидролизовали 0,25% трипсином и подсчитывали. Плотность клеток доводили до 2×10⁵/мл с помощью среды DMEM (Gibco), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, и клетки инокулировали в 96-луночный планшет для культивирования клеток, 100 мкл/лунку; моноклональные антитела против Aβ 066-4.6.8, 066-4.17.28, 066-4.18.2, 066-4.21.13, 066-4.22.1, 066-4.26.14, 066-5.4.1, 066- 6.1.1, 066-6.1.3, 066-6.2.1, 066-6.7.2, 066-7.17.2 разводили средой DMEM, содержащей 1% фетальной бычьей сыворотки, до 20 мкг/мл и использовали в качестве рабочих растворов, Aβ разбавляли до 240 мкг/мл, а ThT (sigma) разбавляли до 20 мкМ сверхчистой водой. Культуральную среду в культуральном планшете отбрасывали, сначала добавляли 50 мкл разбавителя антител, затем добавляли 50 мкл разбавителя Aβ, устанавливали несколько лунок; инкубацию проводили в инкубаторе при 37 °C, 5% CO2 в течение 6 часов; Отбирали 50 мкл супернатанта и добавляли в 96-луночный черный планшет, затем добавляли 50 мкл ThT и определяли интенсивность флуоресценции (Ex/Em=440/485) с помощью многофункционального ридера для микропланшетов. По оси абсцисс представлены различные группы образцов, а по оси ординат - интенсивность флуоресценции. Результаты представлены в Фиг. 4. Среди них интенсивность флуоресценции группы моноклонального антитела против Aβ 066-5.4.1 составляла 650000, а интенсивность флуоресценции группы моноклонального антитела Aβ 066-7.17.2 составляла 600000. Можно видеть, что моноклональные антитела против Aβ 066-5.4.1, 066-7.17.2 обладают активностью, способствующей фагоцитозу Aβ макрофагами.

Пример 5: Детектирование защитной активности моноклонального антитела против Aβ против цитотоксичности

Клетки SHSY5Y в логарифмической фазе роста гидролизовали 0,25% трипсином, подсчитывали, доводили средой EMEM (ATCC), содержащей 10% эмбриональной сыворотки теленка до плотности клеток 3×10⁴/мл, инокулировали на 96-луночный планшет для культивирования клеток, 100 мкл /на лунку; моноклональные антитела против Aβ 066-4.6.8, 066-4.17.28, 066-4.18.2, 066-4.21.13, 066-4.22.1, 066-4.26.14, 066-5.4.1, 066-6.1.1, 066-6.1.3, 066-6.2.1, 066-6.7.2, 066-7.17.2 разводили средой EMEM, содержащей 1% фетальной бычьей сыворотки, до 200 мкг/мл (IC100), и использовали в качестве рабочего раствора, Aβ разбавляли до 240 мкг/мл. Культуральную среду в культуральном планшете отбрасывали, добавляли 50 мкл разбавителя антител, затем добавляли 50 мкл разбавителя Aβ, устанавливали несколько лунок; инкубацию проводили в инкубаторе при 37 °C, 5% CO2 в течение 48 часов; Отбирали 50 мкл супернатанта и добавляли в новый 96-луночный планшет, затем добавляли 50 мкл буфера для анализа LDH, проводили реакцию в темноте при комнатной температуре в течение 30 минут, добавляли 50 мкл стоп-раствора и измеряли значение оптической плотности. с использованием многофункционального ридера микропланшетов. По оси абсцисс представлены различные группы образцов, а по оси ординат представлены относительные значения высвобождения LDH. Результаты представлены на Фиг. 5. Среди них, когда относительное значение высвобождения LDH в группе носителя составляло 1,0, относительная интенсивность флуоресценции группы моноклонального антитела против Aβ 066-4.26.14 составляло 1,2, относительное значение высвобождения LDH группы моноклонального антитела против Aβ 066-5.4.1 составляло 1,37, относительное значение высвобождения LDH группы моноклональных антител против Aβ 066-6.1.1 составляло 1,43, относительное значение высвобождения LDH группы моноклональных антител против Aβ 066-6.1.3 составляло 1,35, относительное значение высвобождения LDH в группе моноклональных антител против Aβ 066-6.2.1 составляло 1,34, относительное значение высвобождения LDH в группе моноклональных антител против Aβ 066-6.7.2 составляло 1,44, относительное значение высвобождение LDH группы положительного контрольного антитела 066-P02 составляло 1,26 (A) и 1,53 (B). Видно, что антитела 066-4.26.14, 066-5.4.1, 066-6.1.1, 066-6.1.3, 066-6.2.1, 066-6.7.2, 066-7.17.2 имели защитный эффект против цитотоксичности, и защитный эффект был эквивалентен 066-P02.

Пример 6: эксперимент с водным лабиринтом Морриса

1. Экспериментальный метод и стадии:

Экспериментальные животные Мыши 3×Tg были приобретены у Beijing Weitong Lihua Experimental Animal Technology Co., Ltd. и выращены Центром экспериментальных животных медицинского колледжа Цзилиньского университета. Ситуация группировки была следующей:

в соответствии с различными лекарственными средствами, которые должны были вводиться, они были разделены на группу обработки антитела 066-4.26.14, группу обработки антитела 066-5.4.1, группу обработки антитела 066-7.17.2, контрольную группу 3×Tg, группу дикого типа с инъекцией PBS, контрольную группу с положительными антителами 066-P02, по 8 животных в каждой группе.

Согласно литературному методу (Nabeshima, 2007), 6-месячным самцам мышей 3×Tg (500 г/мышь) внутрибрюшинно вводили моноклональные антитела 066-4.26.14, 066-5.4.1, 066-7.17.2 , один раз в неделю, непрерывно вводили в течение 10 недель, а тест в водном лабиринте Морриса проводили через 8 недель после инъекции.

Стадии теста в водном лабиринте Морриса:

(1) Специально разработанный водный лабиринт в основном состоял из цилиндрического бассейна и подвижной платформы. Бассейн имел высоту 45 см и диаметр 100 см, платформа имела диаметр 9 см и регулируемую высоту от 15 до 40 см, а цифровая камера была установлена над бассейном и подключена к компьютеру.

(2) Заранее в бассейн налили чистую воду. Стены и дно бассейна были полностью черными. В воду бассейна добавляли белый пигмент для еды, чтобы мыши не видели платформу под поверхностью воды. Глубина воды составляла 30 см, а поверхность воды была на 1 см выше платформы.

(3) Температура воды поддерживалась на уровне 19 ± 1 °С, и, кроме квадранта, в котором находилась платформа, другие квадранты в бассейне были отмечены точками входа в воду. На боковинах, соответствующих каждому квадранту, наклеены маркеры разной формы. Положение платформы во время эксперимента не менялось.

(4) Каждый тест проводился в звукоизолированном помещении, и положение лабораторных объектов, таких как бассейн, источники света и клетки, оставалось неизменным.

(5) На 8-й неделе начиналось обучение на 3-й день после введения. Эксперимент длился 5 дней (тест на платформе, скрытой в водном лабиринте), 4 раза в день. Когда мышь вошла в воду, ее повернули к стене бассейна и осторожно опустили в воду. Пять тренировочных сессий (экспериментов) в день проводились случайным образом в областях, отличных от квадранта, в котором находилась платформа, а первые две тренировочные сессии в первые два дня эксперимента выполнялись в виде упражнений. Если мышь находила платформу в течение 60 секунд, ей позволяли оставаться на платформе в течение 15 секунд. Если мышь не могла найти платформу в течение 60 секунд (латентный период был записан как 60 секунд), экспериментатор направлял ее к платформе и она оставалась на ней в течение 15 секунд. Среднее значение четырех латентных периодов мыши принимали за суточную производительность мыши.

2. Результаты экспериментов (см. Фиг. 6):

На второй день теста скрытой платформы время поиска скрытой платформы под водой (латентный период побега) было значительно сокращено для всех групп введения антител по сравнению с группой контроля 3×Tg, что было статистически значимым. На 3 день группе моноклонального антитела против Aβ 066-7.17.2 потребовалось 18 секунд на латентный период спасения, группе моноклонального антитела против Aβ 066-4.26.14 потребовалось 27 секунд на латентный период спасения, группе моноклонального антитела против Aβ 066-5.4.1 потребовалось 30 с для латентного периода спасения, а в контрольной группе - 39 с для латентного периода спасения, в которых группы введения 066-7.17.2 и 066-4.26.14 имели значительно более короткий латентный период спасения по сравнению с группой пустого контроля 3×Tg, и была статистическая значимость. Можно видеть, что моноклональные антитела против Aβ 066-7.17.2 и 066-4.26.14 оказали определенное влияние на улучшение когнитивных способностей к обучению и памяти у мышей с моделью деменции Альцгеймера.

Пример 7: Секвенирование гена моноклонального антитела и получение химерного антитела

1. Секвенирование гена моноклональных антител

После иммунизации, слияния и моноклонализации, на основании экспериментальных результатов связывания эпитопа, обнаружения ингибирования полимеризации Aβ, обнаружения защитной активности против цитотоксичности, водного лабиринта Морриса и т. д., была выбрана линия клеток моноклональных антител 066-4.26.14. для выделения РНК, которая была обратно транскрибирована в кДНК, а затем кДНК была использована в качестве матрицы для ПЦР-амплификации вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи антитела.

Использовали набор реагентов TRIzol (15596-026) Invitrogen, и суммарную РНК выделяли из клеточной линии моноклональных антител 066-4.26.14 в соответствии с его инструкциями. Результаты представлены на Фиг.7.

Затем использовали набор 5'RACE FULL (D315) Takara, суммарную РНК подвергали обратной транскрипции в кДНК первой цепи с использованием случайных праймеров в наборе, а затем проводили ПЦР-амплификацию тяжелой цепи с использованием праймера константной области. mIgGR (5'-CTCAGGGAARTARCCYTTGAC-3', SEQ ID NO:42) и праймер RACE в наборе, а ПЦР-амплификацию легкой цепи проводили с использованием праймера константной области mIgKR (5'-TCACTGCCATCAATCTTCCAC-3', SEQ ID №: 43) и праймера RACE в наборе. Результаты показаны на Фиг. 8.

Фрагменты ПЦР выделяли с помощью набора для извлечения из агарозного геля и подвергали клонированию ТА, а затем отбирали отдельные клоны для ПЦР колоний. Праймеры для ПЦР колоний представляли собой M13F (5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3', SEQ ID NO:44) и M13R (5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3', SEQ ID NO:45). Часть образцов, выбранных из правильных штаммов при идентификации, были отправлены в Invitrogen для секвенирования. Окончательно было определено, что нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи соответствует SEQ ID NO:46, нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи соответствует SEQ ID NO:47, аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи соответствует SEQ ID NO:48, а аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи соответствует SEQ ID NO:49, см. Таблицу 3.

Таблица 3: Конкретные последовательности вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи антитела 066-4.26.14

Антитело Нуклеотидная последовательность Аминокислотная последовательность Вариабельная область тяжелой цепи Вариабельная область легкой цепи Вариабельная область тяжелой цепи Вариабельная область легкой цепи 066-4.26.14 SEQ ID NO:46 SEQ ID NO:47 SEQ ID NO:48 SEQ ID NO:49

Нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела 066-4.26.14 соответствует следующей (SEQ ID NO:46):

GAAGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGAAGTTATGCCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATCCATTAGTACTACTAGTAACACCTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGCCGATTCACCACCTCCAGAGATAACGCCAGGAACATCGTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGACGACACGGCCATGTATTACTGTGGAAGAGGCGTGATTACGAACCAGGCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA

Нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела 066-4.26.14 соответствует следующей (SEQ ID NO:47):

GATATTGTGCTAACTCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGACTCCAGGAGATAGCGTCAGTCTTTCCTGCAGGGCCAGCCAAAGTATTAGCAACAACCTACACTGGTATCAGCAAAAATCACATGAGTCTCCAAGGCTTCTCATCAAGTATGCTTCCCAGTCCATCTCTGGGATCCCCTCCAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACTCTCAGTGTCAACAATGTGGGGACTGAAGATTTTGGAATGTATTTCTGTCAACAGAGTAACAGCTGGCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA

Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела 066-4.26.14 соответствует следующей (SEQ ID NO:48):

EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFRSYAMSWVRQTPEKRLEWVASISTTSNTYYPDSVKGRFTTSRDNARNIVYLQMSSLRSDDTAMYYCGRGVITNQAWFAYWGQGTLVTVSA

Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела 066-4.26.14 соответствует следующей (SEQ ID NO:49):

DIVLTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASQSISNNLHWYQQKSHESPRLLIKYASQSISGIPSRFSGSGSGTDFTLSVNNVGTEDFGMYFCQQSNSWPLTFGAGTKLELK

2. 066-4.26.14 Конструкция экспрессирующего вектора химерного антитела мышь-человек

PGS003-hIgG1CH и pGS003-hIgKCL были выбраны в качестве экспрессирующих векторов для конструирования тяжелой цепи и легкой цепи химерного антитела мыши и человека против человеческого Aβ, соответственно. Используя синтезированную последовательность мышиного антитела 066-4.26.14 в качестве матрицы, гены мышиного антитела VH и VL были амплифицированы с помощью ПЦР и клонированы в pGS003-hIgG1CH и pGS003-hIgKCL с использованием методов гидролиза рестрикционным ферментом и лигирования для получения экспрессирующих векторов для транзиторной трансфекции pGS003-066-4.26.14-chAbVH-hIgG1CH и pGS003-066-4.26.14-chAbVL-hIgKCL химерного антитела мышь-человек.

Аминокислотная последовательность тяжелой цепи химерного антитела 066-4.26.14 мышь-человек соответствует следующей (SEQ ID NO:50):

EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFRSYAMSWVRQTPEKRLEWVASISTTSNTYYPDSVKGRFTTSRDNARNIVYLQMSSLRSDDTAMYYCGRGVITNQAWFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

Аминокислотная последовательность легкой цепи химерного антитела 066-4.26.14 мышь-человек соответствует следующей (SEQ ID NO:51):

DIVLTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASQSISNNLHWYQQKSHESPRLLIKYASQSISGIPSRFSGSGSGTDFTLSVNNVGTEDFGMYFCQQSNSWPLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

3. Экспрессия с помощью транзиторной трансфекции

pGS003-066-4.26.14-chAbVH-hIgG1CH и pGS003-066-4.26.14-chAbVL-hIgKCL подвергали транзиторной экспрессии.

Использовали клетки FreeStyle™ 293E, которые подвергали транзиторной экспрессии в среде Freestyle. За 24 часа до трансфекции 30 мл клеток 293E инокулировали при концентрации 0,5×10⁶ клеток/мл в конической колбе на 125 мл и культивировали на шейкере при 130 об/мин в инкубаторе с 5% CO2 при 37 °C. Во время трансфекции сначала отбирали 60 мкл 293E Fectin и добавляли к 1 мл Opti-MEM, хорошо перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 5 минут; тем временем суммарную плазмидную ДНК рекомбинантного вектора в количестве 30 мкг растворяли в 1 мл Opti-MEM. Затем плазмидную ДНК и фектин 293E тщательно перемешивали до общего объема 2 мл, инкубировали при комнатной температуре в течение 15 минут, а затем всю смесь добавляли в лунки для культур клеток, перемешивали и инкубировали при 37°C в инкубаторе с 5% CO2 на шейкере при 130 об/мин в течение 7 дней. Культуральный бульон центрифугировали на высокой скорости и супернатант отбирали для вакуумной фильтрации с микропористой мембраной.

4. Очистка белка

В соответствии с рабочим методом, предоставленным производителем, колонку с Протеином A (система жидкостной хроматографии для очистки белка/AKTA Purifier 10, GE) и никелевую колонку использовали для очистки для получения очищенного химерного антитела мыши и человека 066-4.26.14-chAb, как показано на Фиг. 9.

Пример 8: Гуманизация антител

Мышиное антитело 066-4.26.14 было выбрано для гуманизации. Процесс гуманизации заключался в основном в поиске и изменении человеческой матрицы.

Основной целью гуманизации была последовательность FR в вариабельной области. Используя аминокислотные последовательности мышиного антитела 066-4.26.14 VH и VL в качестве матриц, выравнивание последовательностей было выполнено на веб-сайте NCBI, и были найдены 5 гуманизированных эталонных последовательностей, которые были использованы в качестве эталонных матриц для гуманизации областей FR антитела для разработки гуманизированных последовательностей.

Конкретные последовательности областей CDR показаны в Таблице 4, а последовательности гуманизированных антител после изменения формы показаны в Таблице 5.

Таблица 4: Последовательности областей CDR антитела 066-4.26.14

Антитело CDR1 последовательность CDR2 последовательность CDR3 последовательность 066-4.26.14
H цепь SYAMS
(SEQ ID NO:1) SISTTSNTYYPDSVKG
(SEQ ID NO:2) GVITNQAWFAY
(SEQ ID NO:3) 066-4.26.14
L цепь RASQSISNNLH
(SEQ ID NO:4) YASQSIS
(SEQ ID NO:5) QQSNSWPLT
(SEQ ID NO:6)

Таблица 5: Гуманизированные последовательности антитела 066-4.26.14

Гуманизированная последовательность 066-4.26.14
H1 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFRSYAMSWVRQAPGKGLEWVASISTT
SNTYYPDSVKGRFTTSRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCGRGVITNQAWFA
YWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:15) 066-4.26.14
H2 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFRSYAMSWVRQTPEKRLEWVASISTTS
NTYYPDSVKGRFTTSRDNAKNSVYLQMSSLRAEDTAVYYCGRGVITNQAWFAY
WGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:16) 066-4.26.14
H3 EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFRSYAMSWVRQMPGKGLEWVASISTTS
NTYYPDSVKGRVTTSRDKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCGRGVITNQAWFAYW
GQGTLVTVSS(SEQ ID NO:17) 066-4.26.14
H4 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRSYAMSWVRQAPGKGLEWVASISTTSN
TYYPDSVKGRFTTSRDNAKNSVYLQMSSLRDEDTAMYYCGRGVITNQAWFAYWG
QGILVTVSS(SEQ ID NO:18) 066-4.26.14
H5 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGFTFRSYAMSWVRQAPGKGLEWVASISTTSNT
YYPDSVKGRFTTSRDNSKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCGRGVITNQAWFAYWGQG
TLVTVSS(SEQ ID NO:19) 066-4.26.14
L1 DIVLTQSPATLSVSPGERVTLSCRASQSISNNLHWYQQKSGQAPRLLIKYASQSISGIPS
RFSGSGSGTDFTLTISSLQSEDFAVYFCQQSNSWPLTFGGGTQVEIK(SEQ ID NO:20) 066-4.26.14
L2 DIVLTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSISNNLHWYQQKPGQAPRLLIKYASQSISGIPAR
FSGSGSGTDFTLTISSLQSEDFAVYFCQQSNSWPLTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:21) 066-4.26.14
L3 DIVLTQSPDFQSVTPKEKVTISCRASQSISNNLHWYQQKPDQSPKLLIKYASQSISGIPSR
FSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAAAYFCQQSNSWPLTFGPGTKVEIK(SEQ ID NO:22) 066-4.26.14
L4 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSISNNLHWYQQKPGQAPRLLIKYASQSISGIPDR
FSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQSNSWPLTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:23) 066-4.26.14
L5 EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSISNNLHWYQQKPDQSPKLLIKYASQSISGVPSR
FSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQSNSWPLTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:24)

066-4.26.14H1 (SEQ ID NO:25)

gaggtgcagctggtggaatcaggaggaggactggtgaagccaggcggatctctgagactgtcttgcgccgccagcggctttaccttcagatcttacgccatgtcttgggtccggcaggcaccaggaaaaggactggagtgggtggccagcatcagcaccaccagcaacacctactaccccgacagcgtgaagggcagattcaccaccagccgggacaacgccaagaacagcctgtacctgcagatgaacagcctgagggccgaggataccgccgtgtactattgcggacggggagtgatcaccaaccaggcttggttcgcctattgggggcagggaacactggtgaccgtgtctagc

>066-4.26.14H2 (SEQ ID NO:26)

gaggtgcagctggtggaatcaggaggaggactggtgaagccaggcggatctctgagactgtcttgcgccgccagcggctttaccttcagaagctacgccatgtcttgggtccggcagacaccagagaagagactggagtgggtggcctctatcagcaccaccagcaacacctactaccccgacagcgtgaagggcagattcaccaccagccgggacaacgccaagaacagcgtgtacctgcagatgagcagcctgagagccgaggacacagcagtgtactattgcggcaggggcgtgatcaccaaccaggcttggttcgcctattgggggcagggaacaaccgtgaccgtgtctagc

>066-4.26.14H3 (SEQ ID NO:27)

gaagtgcagctggtgcagagcggagcagaagtgaagaagcccggcgagtccctgaagatctcttgcaagggcagcggctacagcttcaggagctacgccatgtcttgggtccggcagatgccaggaaaaggactggagtgggtggcctctatcagcaccaccagcaacacctactaccccgacagcgtgaagggcagagtgacaaccagcagggacaagagcatcagcaccgcctacctgcagtggtctagcctgaaggccagcgataccgccatgtactattgcggccggggagtgatcaccaaccaggcttggttcgcctattgggggcagggaacactggtgaccgtgtctagc

>066-4.26.14H4 (SEQ ID NO:28)

gaggtgcagctggtggaatcaggaggaggactggtgcagccaggaggatctctgagactgtcttgcgccgccagcggctttaccttcagatcttacgccatgtcttgggtccggcaggcaccaggaaaaggactggagtgggtggccagcatcagcaccaccagcaacacctactaccccgacagcgtgaagggcagattcaccaccagccgggacaacgccaagaacagcgtgtacctgcagatgagcagcctgagggacgaggataccgccatgtactattgcggccggggagtgatcaccaaccaggcttggttcgcctattgggggcagggaatcctggtgaccgtgtctagc

>066-4.26.14H5 (SEQ ID NO:29)

gaggtgcagctggtggaatcaggaggaggactggtgcagccaggaggatctctgagactgtcttgcgtggccagcggcttcaccttcagatcttacgccatgtcttgggtccggcaggcaccaggaaaaggactggagtgggtggccagcatcagcaccaccagcaacacctactaccccgacagcgtgaagggcagattcaccaccagccgggacaacagcaagaacaccgtgtacctgcagatgagcagcctgagagccgaggacacagcagtgtactattgcggcaggggcgtgatcaccaaccaggcttggttcgcctattgggggcagggaacactggtgaccgtgtctagc

>066-4.26.14L1 (SEQ ID NO:30)

gacatcgtgctgacccagtctccagccacactgagcgtgtctccaggagagagagtgaccctgtcttgcagagccagccagagcatcagcaacaacctgcattggtaccagcagaagtccggccaggctcctaggctgctgatcaagtacgccagccagagcattagcggcatcccttctagattcagcggcagcggaagcggcacagatttcaccctgaccatcagcagcctgcagagcgaggacttcgccgtctacttctgccagcagagcaactcttggcccctgacctttggcggaggcacccaggtggagatcaag

>066-4.26.14L2 (SEQ ID NO:31)

gacatcgtgctgacccagtctccagccacactgagcgtgtctccaggagagagagccacactgtcttgcagagccagccagagcatcagcaacaacctgcattggtaccagcagaagccaggccaggctcctaggctgctgatcaagtacgcctctcagtctatcagcggcatcccagctagattcagcggcagcggaagcggcacagacttcaccctgaccatcagcagcctgcagagcgaggacttcgccgtctacttctgccagcagagcaactcttggcccctgacctttggcggaggcaccaaggtggagatcaag

>066-4.26.14L3 (SEQ ID NO:32)

gacatcgtgctgacccagagcccagacttccagtcagtgacccccaaggagaaggtcaccatcagctgcagagccagccagagcatcagcaacaacctgcattggtaccagcagaagcccgaccagagccccaagctgctgatcaagtacgccagccagtctatcagcggcatcccttctagattcagcggcagcggaagcggcacagatttcaccctgaccatcaacagcctggaggccgaagacgcagccgcctacttttgccagcagagcaactcttggcccctgacctttggccctggcaccaaggtggagatcaag

>066-4.26.14L4 (SEQ ID NO:33)

gagatcgtgctgacccagtctccaggcacactgtctctgagcccaggagagagagccacactgtcttgcagagccagccagagcatcagcaacaacctgcattggtaccagcagaagccaggccaggctcctaggctgctgatcaagtacgccagccagagcattagcggcatcccagatagattcagcggcagcggaagcggcacagatttcaccctgaccatcagcagactggagcccgaggacttcgccgtgtactattgccagcagagcaactcttggcccctgacctttggcggaggcaccaaggtggagatcaag

>066-4.26.14L5 (SEQ ID NO:34)

gagatcgtgctgacccagagcccagacttccagtcagtgacccccaaggagaaggtcaccatcacttgcagggccagccagagcatcagcaacaacctgcattggtaccagcagaagcccgaccagagccccaagctgctgatcaagtacgccagccagtctatcagcggagtgccttctagattcagcggcagcggaagcggcacagatttcaccctgaccatcaacagcctggaggcagaggacgcagccacctactattgccagcagagcaactcttggcccctgaccttcggacagggcaccaaggtggagatcaag

Пример 9: Получение гуманизированного полноразмерного антитела против Aβ.

1. Конструирование экспрессирующих векторов для транзиторной трансфекции полноразмерных антител

PGS003-hIgG1CH и pGS003-hIgKCL были выбраны в качестве экспрессирующих векторов для конструирования тяжелой цепи и легкой цепи гуманизированного полноразмерного антитела против Aβ, соответственно. Оптимизацию кодонов выполняли для последовательности гуманизированного антитела 066-4.26.14. После ПЦР-амплификации тяжелую цепь гидролизовали HindIII и NheI, а легкую цепь гидролизовали HindIII и NarI, а затем 5 генов антитела VH и 5 VL клонировали в pGS003-hIgG1CH и pGS003-hIgKCL, соответственно, как показано на Таблица 6. После секвенирования для определения правильной вставки гена антитела рекомбинантный экспрессирующий вектор трансформировали в E. coli TOP10F', и одну колонию отбирали и инокулировали в среду LB, содержащую 100 мкг/мл ампициллина, и культивировали при встряхивании при 37°C 16 часов. Плазмиды экстрагировали с использованием набора для крупномасштабной экстракции без эндотоксинов от Zymo Research, и, наконец, плазмиды растворяли в 1 мл сверхчистой воды, и концентрацию плазмид и OD260/280 измеряли с помощью спектрофотометра. Плазмидная ДНК с OD260/280 от 1,8 до 1,9 имела относительно высокую чистоту.

Таблица 6: Список экспрессирующих векторов для транзиторной трансфекции тяжелой цепи и легкой цепи

Название экспрессирующего вектора для тяжелой цепи Название экспрессирующего вектора для легкой цепи H1 L1 H2 L2 H3 L3 H4 L4 H5 L5

2. Трансфекция, экспрессия и детектирование в клетках млекопитающих 293E

Вышеупомянутые 5 векторов экспрессии тяжелой цепи и 5 векторов экспрессии легкой цепи 066-4.26.14 объединяли попарно (всего 25 комбинаций), а затем оценивали экспрессию транзиторной трансфекции в 2 мл системы 293E, и оценивали уровни экспрессии и значения ИФА для 25 комбинаций. Результаты показаны в Таблице 7. Среди них предпочтительно были отобраны 6 полноразмерных антител, которые представляли собой 066-4.26.14-H2L2, 066-4.26.14-H2L3, 066-4.26.14-H4L2, 066-4.26. 14-H5L1, 066-4.26.14-H5L2, 066-4.26.14-H5L3, соответственно.

Таблица 7: Значения детектирования уровня экспрессии и EC50 для экспрессии транзиторной трансфекции гуманизированных полноразмерных антител 066-4.26.14 в комбинации 5×5

No. Комбинация тяжелой цепи и легкой цепи Уровень экспрессии (мг/л) Значение EC50 мономера Aβ₄₂ 1 066-4.26.14H1L1 60 -- 2 066-4.26.14H1L2 61 -- 3 066-4.26.14H1L3 68,2 -- 4 066-4.26.14H1L4 32,1 -- 5 066-4.26.14H1L5 68,4 -- 6 066-4.26.14H2L1 89,7 0,02135 7 066-4.26.14H2L2 86,6 0,01291 8 066-4.26.14H2L3 51,8 0,01532 9 066-4.26.14H2L4 7,72 -- 10 066-4.26.14H2L5 6,14 -- 11 066-4.26.14H3L1 5,42 -- 12 066-4.26.14H3L2 0 -- 13 066-4.26.14H3L3 6,78 -- 14 066-4.26.14H3L4 3,88 -- 15 066-4.26.14H3L5 3,68 -- 16 066-4.26.14H4L1 69,1 0,04948 17 066-4.26.14H4L2 71,2 0,01685 18 066-4.26.14H4L3 25,3 0,1406 19 066-4.26.14H4L4 3,96 -- 20 066-4.26.14H4L5 0 -- 21 066-4.26.14H5L1 118,5 0,004218 22 066-4.26.14H5L2 113,2 0,00772 23 066-4.26.14H5L3 103,3 0,01075 24 066-4.26.14H5L4 3,12 -- 25 066-4.26.14H5L5 0 --

Примечание: «-» в таблице означает отсутствие комбинации.

293E использовали для транзиторной трансфекции и экспрессии 6 антител-кандидатов в среде Freestyle. За 24 часа до трансфекции 300 мл клеток 293E инокулировали из расчета 0,5×10⁶ клеток/мл в колбу для культивирования клеток объемом 1 л и культивировали в инкубаторе при 37 °C, 5% CO2 с шейкером при 120 об/мин. Во время трансфекции сначала отбирали 300 мкл фектина 293 и добавляли к 5,7 мл Opti-MEM, хорошо перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 минут; тем временем экспрессирующие плазмиды для тяжелой цепи и легкой цепи в количестве 300 мкг разбавляли до 6 мл с помощью Opti-MEM, соответственно. Разбавленный выше реагент для трансфекции и плазмиду тщательно перемешивали, инкубировали при комнатной температуре в течение 15 минут, затем всю смесь добавляли к клеткам, хорошо перемешивали и инкубировали в инкубаторе 37 °C, 5% CO2 с шейкером при 120 об/мин в течение 7 дней.

3. Очистка и детектирование антител

Среду для культивирования клеток центрифугировали при 2000 g в течение 20 мин, супернатант собирали и уровень экспрессии антител в супернатанте определяли с помощью Octet. См. Таблицу 8.

Таблица 8: Определение уровня экспрессии 6 антител-кандидатов, экспрессированных с помощью транзиторной трансфекции в 300 мл

Название антитела Последовательность тяжелой цепи Последовательность легкой цепи Уровень экспрессии транзиторной трансфекции (мг/л) 066-4.26.14H2L2 066-4.26.14H2 066-4.26.14L2 146 066-4.26.14H2L3 066-4.26.14H2 066-4.26.14L3 56 066-4.26.14H4L2 066-4.26.14H4 066-4.26.14L2 101 066-4.26.14H5L1 066-4.26.14H5 066-4.26.14L1 164 066-4.26.14H5L2 066-4.26.14H5 066-4.26.14L2 128 066-4.26.14H5L3 066-4.26.14H5 066-4.26.14L3 135

Супернатант фильтровали через фильтр 0,22 мкм, а затем пропускали через колонку для аффинной хроматографии MabSelect SuRe (GE), элюируя 20 мМ цитрат-цитрат натрия, pH 3, и pH доводили до нейтрального с помощью 1 M Tris-основания, и раствор доводили до изотонического раствора, добавляя 10×PBS. Очищенный белок детектировали с помощью SDS-PAGE с 4-20% градиентным гелем (Nanjing Jinsirui Biotechnology Co., Ltd.). Результаты показаны на Фиг. 10 ниже.

Пример 10: Определение значения ЕС50 гуманизированного антитела-кандидата

Покрытие: мономер Aβ42 человека разбавляли CBS (pH 9,4) до 1 мкг/мл, добавляли в 96-луночный микропланшет по 50 мкл на лунку и инкубировали в течение ночи при 2-8 °C.

Блокирование: после трехкратной промывки планшета PBST, для блокирования использовали 3% BSA, 200 мкл на лунку, и инкубировали в течение 1 часа при 25 °C.

Обработка образца: отбирали гуманизированное антитело-кандидат и химерное антитело, соответственно, подвергали 2-кратному градиентному разбавлению с использованием 10 мкг/мл в качестве начальной концентрации (2⁰-2^-11), 50 мкл/лунку и инкубировали при 25°C в течение 1 часа.

Добавление антитела: после четырехкратной промывки планшета PBST добавляли антитело против человеческого IgG (H+L) -HRP в разбавителе 1:5000, 50 мкл/лунку, и инкубировали при 25°C в течение 1 часа.

Проявление цвета: после четырехкратного промывания планшета добавляли раствор для проявления цвета TMB, 50 мкл на лунку, и проявляли его в темноте в течение 3 минут при комнатной температуре.

Остановка реакции: стоп-раствор добавляли непосредственно для остановки реакции, 50 мкл на лунку.

Детектирование: после остановки реакции планшет для микротитрования немедленно помещали в ридер для микропланшетов для измерения значения OD при 450 нм, и исходные данные сохраняли.

Обработка данных: исходные данные были введены в программное обеспечение SoftMax Pro 6.2.1 для обработки данных. См. конкретные данные в Таблице 9. Результаты показали, что способность связывания 6 гуманизированных антител-кандидатов с человеческим Aβ была эквивалентна способности химерного антитела.

Таблица 9: Значения ЕС50 для 6 антител-кандидатов, связывающихся с антигеном

Название антитела Значение EC50 мономера Aβ₄₂ 066-4.26.14H2L2 0,0129 066-4.26.14H2L3 0,0153 066-4.26.14H4L2 0,0168 066-4.26.14H5L1 0,0042 066-4.26.14H5L2 0,0077 066-4.26.14H5L3 0,0108 066-4.26.14-chAb 0,0255

Пример 11: Определение значения KD гуманизированного антитела-кандидата

Выполняли детектирование Biacore-T200, использовали чип ProteinA для захвата антител-кандидатов или положительных антител, для протекания через чип использовали различные концентрации человеческого антигена Aβ, и на основе собранных данных проводили анализ соответствия. Образец антигена подвергали 2-кратному градиентному разведению с использованием HBS-EP+буфер для получения растворов с градиентными концентрациями 400 нмоль/л, 200 нмоль/л, 100 нмоль/л, 50 нмоль/л, 25 нмоль/л, 12,5 нмоль./Л, 6,25 нмоль/л, 3,125 нмоль/л, 1,56 нмоль/л, 0,78 нмоль/л, 0 нмоль/л. Образец 25 нмоль/л использовали для определения повторной концентрации. Условия детектирования: время захвата: 30 с; время связывания антигена: 120 с; время диссоциации: 900 с; скорость потока: 30 мкл/мин. Условия регенерации: 20 мМ раствор NaOH, скорость потока 30 мкл/мин. Конкретные экспериментальные результаты показаны в Таблице 10. Из экспериментальных результатов видно, что по сравнению с химерным антителом мышь-человек значение KD гуманизированного антитела может быть эквивалентным значению мышиного антитела.

Таблица 10: Определение значения KD для 6 антител-кандидатов

Название антитела Ka (1/Мс) Kd (1/с) KD (M) 066-4.26.14H2L2 1,92E+04 4,33E-04 2,25E-08 066-4.26.14H2L3 1,83E+04 4,72E-04 2,58E-08 066-4.26.14H4L2 1,28E+04 4,63E-04 3,63E-08 066-4.26.14H5L1 1,89E+04 4,69E-04 2,48E-08 066-4.26.14H5L2 1,34E+04 2,78E-04 2,08E-08 066-4.26.14H5L3 1,42E+04 4,60E-04 3,25E-08 066-4.26.14-chAb 2,65E+04 3,33E-04 1,26E-08

Примечание: E+04:×10⁴; E-04:×10^-4; E-08:×10^-8.

Пример 12: Детектирование эффекта гуманизированного антитела против Aβ, ингибирующего полимеризацию Aβ

8,2% раствор DMSO/DPBS (ДМСО: sigma; DPBS: Hyclone) использовали для растворения сухого порошка Aβ до 1 мг/мл, DPBS использовали для разбавления раствора Aβ до 33 мкг/мл и гуманизированного антитела-кандидата 066-4,26.14 разбавляли до 450 мкг/мл (IC100), а ThT (сигма) разбавляли до 20 мкМ сверхчистой водой. Отбирали 50 мкл разбавителя антител-кандидатов и добавляли в 96-луночный черный планшет (corning), затем добавляли 50 мкл разбавителя Aβ и, наконец, добавляли 100 мкл ThT, инкубировали при комнатной температуре в течение 24 часов в темноте и измеряли с помощью многофункционального микропланшетного ридера для определения интенсивности флуоресценции (Ex/Em=440/485). По оси абсцисс представлены различные группы образцов, а по оси ординат - относительная интенсивность флуоресценции. Результаты показаны на Фиг.11. Относительная интенсивность флуоресценции hIgG составляла 1,00, относительная интенсивность флуоресценции группы 066-4,26,14-mAb составляла 0,70, относительная интенсивность флуоресценции группы 066-4,26,14-chAb составляла 0,71, относительная интенсивность флуоресценции группы 066-4.26.14H2L2 составляла 0,62, относительная интенсивность флуоресценции группы 066-4.26.14H2L3 составляла 0,67, относительная интенсивность флуоресценции группы 066-4.26.14H4L2 составляла 0,70, относительная интенсивность флуоресценции группы 066-4.26.14H5L1 составляла 0,68, относительная интенсивность флуоресценции группы 066-4.26.14H5L2 составляла 0,67, а относительная интенсивность флуоресценции группы 066-4.26.14H5L3 составляла 0,78. Можно видеть, что гуманизированные антитела 066-4.26.14 могут ингибировать полимеризацию Aβ.

Пример 13: Детектирование защитной активности гуманизированного антитела против Aβ против цитотоксичности.

Клетки SHSY5Y в логарифмической фазе роста гидролизовали 0,25% трипсином, подсчитывали, доводили средой EMEM (ATCC), содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки, до плотности клеток 3×10⁴/мл, инокулировали на 96-луночный планшет для культивирования клеток, 100 мкл/лунку; гуманизированные антитела-кандидаты 066-4.26.14 разбавляли средой EMEM, содержащей 1% фетальной бычьей сыворотки, до 200 мкг/мл (IC100) и использовали в качестве рабочих растворов, Aβ разбавляли до 240 мкг/мл. Культуральную среду в культуральном планшете отбрасывали, сначала добавляли 50 мкл разбавителя антител-кандидатов, затем добавляли 50 мкл разбавителя Aβ, устанавливали несколько лунок; инкубацию проводили в инкубаторе при 37 °C, 5% CO2 в течение 48 часов; Отбирали 50 мкл супернатанта и добавляли в новый 96-луночный планшет, затем добавляли 50 мкл буфера для анализа LDH, проводили реакцию в темноте при комнатной температуре в течение 30 минут, добавляли 50 мкл стоп-раствора и измеряли с помощью многофункционального ридера для микропланшетов для определения оптической плотности. По оси абсцисс представлены различные группы образцов, а по оси ординат представлены относительные значения высвобождения LDH. Результаты показаны на Фиг. 12. Относительное значение высвобождения LDH для hIgG составляло 1,00, относительное значение высвобождения LDH в группе 066-P02 составляло 1,26, относительное значение высвобождения LDH в группе 066-4,26,14-mAb составляло 1,20, относительное значение высвобождения LDH в группе 066-4.26.14-chAb составляло 1,32, относительное значение высвобождения LDH в группе 066-4.26.14H2L2 составляло 1,41, относительное значение высвобождения LDH в группе 066-4.26.14H2L3 составляло 1,42, относительное значение высвобождения LDH в группе 066-4.26.14H2L3 составляло значение высвобождения LDH в группе 066-4.26.14H4L2 составляло 1,30, относительное значение высвобождения LDH в группе 066-4.26.14H5L1 составляло 1,37, относительное значение высвобождения LDH в группе 066-4.26.14H5L2 составляло 1,26, и относительное значение высвобождения LDH в группе 066-4.26.14H5L3 составляло 1,41. Можно видеть, что все гуманизированные антитела-кандидаты 066-4.26.14 обладают защитным действием против цитотоксичности, и защитный эффект был эквивалентен таковому 066-P02, в котором 066-4.26.14H5L2 показал лучшую производительность.

Гуманизированное моноклональное антитело против Aβ и его применение, предложенные настоящим описанием, были подробно описаны выше. Принцип и реализация настоящего описания проиллюстрированы конкретными примерами, в то время как описание приведенных выше примеров используется только для того, чтобы помочь понять способ и основную идею настоящего описания. Следует отметить, что для специалистов в данной области, не выходя за рамки принципа настоящего описания туда могут быть внесены несколько улучшений и модификаций, и эти улучшения и модификации также подпадают под объем защиты формулы изобретения настоящего описания.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ЧАНЧУНЬ ДЖИНСАЙЕНС ФАРМАСЬЮТИКАЛ КО., ЛТД.

<120> Гуманизированное моноклональное антитело против Aβ и его применение

<130> IEC210121PRU

<150> 201910104326.1

<151> 2019-02-01

<160> 51

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5

<212> Белок

<213> область CDR тяжелой цепи

<400> 1

Ser Tyr Ala Met Ser

1 5

<210> 2

<211> 16

<212> Белок

<213> область CDR тяжелой цепи

<400> 2

Ser Ile Ser Thr Thr Ser Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly

1 5 10 15

<210> 3

<211> 11

<212> Белок

<213> область CDR тяжелой цепи

<400> 3

Gly Val Ile Thr Asn Gln Ala Trp Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 11

<212> Белок

<213> область CDR легкой цепи

<400> 4

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn Leu His

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> Белок

<213> область CDR легкой цепи

<400> 5

Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> Белок

<213> область CDR легкой цепи

<400> 6

Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu Thr

1 5

<210> 7

<211> 30

<212> Белок

<213> область FR тяжелой цепи

<400> 7

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg

20 25 30

<210> 8

<211> 14

<212> Белок

<213> область FR тяжелой цепи

<400> 8

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala

1 5 10

<210> 9

<211> 32

<212> Белок

<213> область FR тяжелой цепи

<400> 9

Arg Phe Thr Thr Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Arg

20 25 30

<210> 10

<211> 11

<212> Белок

<213> область FR тяжелой цепи

<400> 10

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 11

<211> 23

<212> Белок

<213> область FR легкой цепи

<400> 11

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys

20

<210> 12

<211> 15

<212> Белок

<213> область FR легкой цепи

<400> 12

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Lys

1 5 10 15

<210> 13

<211> 32

<212> Белок

<213> область FR легкой цепи

<400> 13

Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

1 5 10 15

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys

20 25 30

<210> 14

<211> 10

<212> Белок

<213> область FR легкой цепи

<400> 14

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

1 5 10

<210> 15

<211> 119

<212> Белок

<213> 066-4.26.14 H1

<400> 15

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Thr Thr Ser Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Thr Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly

85 90 95

Arg Gly Val Ile Thr Asn Gln Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 16

<211> 119

<212> Белок

<213> 066-4.26.14 H2

<400> 16

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Thr Thr Ser Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Thr Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly

85 90 95

Arg Gly Val Ile Thr Asn Gln Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 17

<211> 119

<212> Белок

<213> 066-4.26.14 H3

<400> 17

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Arg Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Thr Thr Ser Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Val Thr Thr Ser Arg Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Gly

85 90 95

Arg Gly Val Ile Thr Asn Gln Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 18

<211> 119

<212> Белок

<213> 066-4.26.14 H4

<400> 18

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Thr Thr Ser Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Thr Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Ser Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Gly

85 90 95

Arg Gly Val Ile Thr Asn Gln Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Ile Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 19

<211> 119

<212> Белок

<213> 066-4.26.14 H5

<400> 19

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Thr Thr Ser Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Thr Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly

85 90 95

Arg Gly Val Ile Thr Asn Gln Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 20

<211> 107

<212> Белок

<213> 066-4.26.14 L1

<400> 20

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Gln Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 21

<211> 107

<212> Белок

<213> 066-4.26.14 L2

<400> 21

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 22

<211> 107

<212> Белок

<213> 066-4.26.14 L3

<400> 22

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala

65 70 75 80

Glu Asp Ala Ala Ala Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 23

<211> 107

<212> Белок

<213> 066-4.26.14 L4

<400> 23

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 24

<211> 107

<212> Белок

<213> 066-4.26.14 L5

<400> 24

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala

65 70 75 80

Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 25

<211> 357

<212> ДНК

<213> 066-4.26.14 H1

<400> 25

gaggtgcagc tggtggaatc aggaggagga ctggtgaagc caggcggatc tctgagactg 60

tcttgcgccg ccagcggctt taccttcaga tcttacgcca tgtcttgggt ccggcaggca 120

ccaggaaaag gactggagtg ggtggccagc atcagcacca ccagcaacac ctactacccc 180

gacagcgtga agggcagatt caccaccagc cgggacaacg ccaagaacag cctgtacctg 240

cagatgaaca gcctgagggc cgaggatacc gccgtgtact attgcggacg gggagtgatc 300

accaaccagg cttggttcgc ctattggggg cagggaacac tggtgaccgt gtctagc 357

<210> 26

<211> 357

<212> ДНК

<213> 066-4.26.14 H2

<400> 26

gaggtgcagc tggtggaatc aggaggagga ctggtgaagc caggcggatc tctgagactg 60

tcttgcgccg ccagcggctt taccttcaga agctacgcca tgtcttgggt ccggcagaca 120

ccagagaaga gactggagtg ggtggcctct atcagcacca ccagcaacac ctactacccc 180

gacagcgtga agggcagatt caccaccagc cgggacaacg ccaagaacag cgtgtacctg 240

cagatgagca gcctgagagc cgaggacaca gcagtgtact attgcggcag gggcgtgatc 300

accaaccagg cttggttcgc ctattggggg cagggaacaa ccgtgaccgt gtctagc 357

<210> 27

<211> 357

<212> ДНК

<213> 066-4.26.14 H3

<400> 27

gaagtgcagc tggtgcagag cggagcagaa gtgaagaagc ccggcgagtc cctgaagatc 60

tcttgcaagg gcagcggcta cagcttcagg agctacgcca tgtcttgggt ccggcagatg 120

ccaggaaaag gactggagtg ggtggcctct atcagcacca ccagcaacac ctactacccc 180

gacagcgtga agggcagagt gacaaccagc agggacaaga gcatcagcac cgcctacctg 240

cagtggtcta gcctgaaggc cagcgatacc gccatgtact attgcggccg gggagtgatc 300

accaaccagg cttggttcgc ctattggggg cagggaacac tggtgaccgt gtctagc 357

<210> 28

<211> 357

<212> ДНК

<213> 066-4.26.14 H4

<400> 28

gaggtgcagc tggtggaatc aggaggagga ctggtgcagc caggaggatc tctgagactg 60

tcttgcgccg ccagcggctt taccttcaga tcttacgcca tgtcttgggt ccggcaggca 120

ccaggaaaag gactggagtg ggtggccagc atcagcacca ccagcaacac ctactacccc 180

gacagcgtga agggcagatt caccaccagc cgggacaacg ccaagaacag cgtgtacctg 240

cagatgagca gcctgaggga cgaggatacc gccatgtact attgcggccg gggagtgatc 300

accaaccagg cttggttcgc ctattggggg cagggaatcc tggtgaccgt gtctagc 357

<210> 29

<211> 357

<212> ДНК

<213> 066-4.26.14 H5

<400> 29

gaggtgcagc tggtggaatc aggaggagga ctggtgcagc caggaggatc tctgagactg 60

tcttgcgtgg ccagcggctt caccttcaga tcttacgcca tgtcttgggt ccggcaggca 120

ccaggaaaag gactggagtg ggtggccagc atcagcacca ccagcaacac ctactacccc 180

gacagcgtga agggcagatt caccaccagc cgggacaaca gcaagaacac cgtgtacctg 240

cagatgagca gcctgagagc cgaggacaca gcagtgtact attgcggcag gggcgtgatc 300

accaaccagg cttggttcgc ctattggggg cagggaacac tggtgaccgt gtctagc 357

<210> 30

<211> 321

<212> ДНК

<213> 066-4.26.14 L1

<400> 30

gacatcgtgc tgacccagtc tccagccaca ctgagcgtgt ctccaggaga gagagtgacc 60

ctgtcttgca gagccagcca gagcatcagc aacaacctgc attggtacca gcagaagtcc 120

ggccaggctc ctaggctgct gatcaagtac gccagccaga gcattagcgg catcccttct 180

agattcagcg gcagcggaag cggcacagat ttcaccctga ccatcagcag cctgcagagc 240

gaggacttcg ccgtctactt ctgccagcag agcaactctt ggcccctgac ctttggcgga 300

ggcacccagg tggagatcaa g 321

<210> 31

<211> 321

<212> ДНК

<213> 066-4.26.14 L2

<400> 31

gacatcgtgc tgacccagtc tccagccaca ctgagcgtgt ctccaggaga gagagccaca 60

ctgtcttgca gagccagcca gagcatcagc aacaacctgc attggtacca gcagaagcca 120

ggccaggctc ctaggctgct gatcaagtac gcctctcagt ctatcagcgg catcccagct 180

agattcagcg gcagcggaag cggcacagac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagagc 240

gaggacttcg ccgtctactt ctgccagcag agcaactctt ggcccctgac ctttggcgga 300

ggcaccaagg tggagatcaa g 321

<210> 32

<211> 321

<212> ДНК

<213> 066-4.26.14 L3

<400> 32

gacatcgtgc tgacccagag cccagacttc cagtcagtga cccccaagga gaaggtcacc 60

atcagctgca gagccagcca gagcatcagc aacaacctgc attggtacca gcagaagccc 120

gaccagagcc ccaagctgct gatcaagtac gccagccagt ctatcagcgg catcccttct 180

agattcagcg gcagcggaag cggcacagat ttcaccctga ccatcaacag cctggaggcc 240

gaagacgcag ccgcctactt ttgccagcag agcaactctt ggcccctgac ctttggccct 300

ggcaccaagg tggagatcaa g 321

<210> 33

<211> 321

<212> ДНК

<213> 066-4.26.14 L4

<400> 33

gagatcgtgc tgacccagtc tccaggcaca ctgtctctga gcccaggaga gagagccaca 60

ctgtcttgca gagccagcca gagcatcagc aacaacctgc attggtacca gcagaagcca 120

ggccaggctc ctaggctgct gatcaagtac gccagccaga gcattagcgg catcccagat 180

agattcagcg gcagcggaag cggcacagat ttcaccctga ccatcagcag actggagccc 240

gaggacttcg ccgtgtacta ttgccagcag agcaactctt ggcccctgac ctttggcgga 300

ggcaccaagg tggagatcaa g 321

<210> 34

<211> 321

<212> ДНК

<213> 066-4.26.14 L5

<400> 34

gagatcgtgc tgacccagag cccagacttc cagtcagtga cccccaagga gaaggtcacc 60

atcacttgca gggccagcca gagcatcagc aacaacctgc attggtacca gcagaagccc 120

gaccagagcc ccaagctgct gatcaagtac gccagccagt ctatcagcgg agtgccttct 180

agattcagcg gcagcggaag cggcacagat ttcaccctga ccatcaacag cctggaggca 240

gaggacgcag ccacctacta ttgccagcag agcaactctt ggcccctgac cttcggacag 300

ggcaccaagg tggagatcaa g 321

<210> 35

<211> 42

<212> Белок

<213> Aβ1-42

<400> 35

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys

1 5 10 15

Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile

20 25 30

Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala

35 40

<210> 36

<211> 16

<212> Белок

<213> Aβ1-16

<400> 36

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys

1 5 10 15

<210> 37

<211> 17

<212> Белок

<213> Aβ14-29

<400> 37

His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly

1 5 10 15

Ala

<210> 38

<211> 112

<212> Белок

<213> Вариабельная область тяжелой цепи положительного антитела 066-P01

<400> 38

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val

35 40 45

Ala Gln Ile Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 39

<211> 112

<212> Белок

<213> Вариабельная область легкой цепи положительного антитела 066-P01

<400> 39

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Ile Tyr Ser

20 25 30

Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser

85 90 95

Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 40

<211> 124

<212> Белок

<213> Вариабельная область тяжелой цепи положительного антитела 066-P02

<400> 40

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Phe Asp Gly Thr Lys Lys Tyr Tyr Thr Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Arg Gly Ile Gly Ala Arg Arg Gly Pro Tyr Tyr Met Asp

100 105 110

Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 41

<211> 107

<212> Белок

<213> Вариабельная область легкойцепи положительного антитела 066-P02

<400> 41

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 42

<211> 21

<212> ДНК

<213> mIgGR

<400> 42

ctcagggaar tarccyttga c 21

<210> 43

<211> 21

<212> ДНК

<213> mIgKR

<400> 43

tcactgccat caatcttcca c 21

<210> 44

<211> 18

<212> ДНК

<213> M13F

<400> 44

tgtaaaacga cggccagt 18

<210> 45

<211> 18

<212> ДНК

<213> M13R

<400> 45

caggaaacag ctatgacc 18

<210> 46

<211> 357

<212> ДНК

<213> Вариабельная область тяжелой цепи антитела 066-4.26.14

<400> 46

gaagtgaagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cactttcaga agttatgcca tgtcttgggt tcgccagact 120

ccagagaaga ggctggagtg ggtcgcatcc attagtacta ctagtaacac ctactatcca 180

gacagtgtga agggccgatt caccacctcc agagataacg ccaggaacat cgtgtacctg 240

caaatgagca gtctgaggtc tgacgacacg gccatgtatt actgtggaag aggcgtgatt 300

acgaaccagg cctggtttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgca 357

<210> 47

<211> 321

<212> ДНК

<213> Вариабельная область легкой цепи антитела 066-4.26.14

<400> 47

gatattgtgc taactcagtc tccagccacc ctgtctgtga ctccaggaga tagcgtcagt 60

ctttcctgca gggccagcca aagtattagc aacaacctac actggtatca gcaaaaatca 120

catgagtctc caaggcttct catcaagtat gcttcccagt ccatctctgg gatcccctcc 180

aggttcagtg gcagtggatc agggacagat ttcactctca gtgtcaacaa tgtggggact 240

gaagattttg gaatgtattt ctgtcaacag agtaacagct ggccgctcac gttcggtgct 300

gggaccaagc tggagctgaa a 321

<210> 48

<211> 119

<212> Белок

<213> Вариабельная область тяжелой цепи антитела 066-4.26.14

<400> 48

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Thr Thr Ser Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Thr Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Gly

85 90 95

Arg Gly Val Ile Thr Asn Gln Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 49

<211> 107

<212> Белок

<213> Вариабельная область легкой цепи антитела 066-4.26.14

<400> 49

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Val Asn Asn Val Gly Thr

65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 50

<211> 448

<212> Белок

<213> тяжелая цепь мышиного химерного антитела 066-4.26.14

<400> 50

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Thr Thr Ser Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Thr Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Gly

85 90 95

Arg Gly Val Ile Thr Asn Gln Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

<210> 51

<211> 214

<212> Белок

<213> легкая цепь мышиного химерного антитела 066-4.26.14

<400> 51

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Val Asn Asn Val Gly Thr

65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<---

Изобретение относится к гуманизированному моноклональному антителу против Aβ, а также к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей моноклональное антитело, вектору экспрессии, клетке-хозяину для получения моноклонального антитела, способу получения моноклонального антитела, применению моноклонального антитела, лекарственному средству для профилактики или лечения заболевания, где заболевание включает амилоидоз, выбранный из вторичного амилоидоза и возрастного амилоидоза, и неврологическое заболевание, которое представляет собой болезнь Альцгеймера, и к набору для детекции Aβ экспрессии. Предложенное гуманизированное моноклональное антитело может ингибировать полимеризацию мономеров Aβ, защищать нервные клетки от токсичности Aβ и оказывать определенное влияние на улучшение когнитивных способностей к обучению и памяти у мышей с моделью деменции Альцгеймера. 8 н. и 5 з.п. ф-лы, 13 пр., 12 ил., 10 табл.

1. Гуманизированное моноклональное антитело против Aβ, где

(I) аминокислотные последовательности трех областей CDR тяжелой цепи моноклонального антитела представляют собой аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1, 2 и 3 соответственно; и

(II) аминокислотные последовательности трех областей CDR легкой цепи моноклонального антитела представляют собой аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 4, 5 и 6 соответственно.

2. Моноклональное антитело по п.1, где

(V) аминокислотные последовательности 4 областей FR тяжелой цепи моноклонального антитела представляют собой аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 7, 8, 9 и 10 соответственно; и

(VI) аминокислотные последовательности 4 областей FR легкой цепи моноклонального антитела представляют собой аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 11, 12, 13 и 14 соответственно;

или

(VII) аминокислотные последовательности представляют собой аминокислотные последовательности, полученные из аминокислот (V) или (VI) посредством замены, делеции или вставки одной или более аминокислот, и представляют собой аминокислотные последовательности, имеющие ту же функцию, что и аминокислотная последовательность (V) или (VI);

или

(VIII) аминокислотные последовательности представляют собой аминокислотные последовательности, которые по меньшей мере на 97% гомологичны аминокислотным последовательностям (V), (VI) или (VII).

3. Моноклональное антитело по п.1, где

(IX) его вариабельная область тяжелой цепи имеет любую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15-19; и

(X) его вариабельная область легкой цепи имеет любую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20-24;

или

(XI) его вариабельная область тяжелой цепи или вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, полученную из аминокислот (IX) или (X) посредством замены, делеции или добавления одной или более аминокислот, и представляет собой аминокислотную последовательность, имеющую ту же функцию, что и аминокислотная последовательность (IX) или (X);

или

(XII) его вариабельная область тяжелой цепи или вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 97% гомологична аминокислотной последовательности (IX), (X) или (XI).

4. Моноклональное антитело по п.1 или 3, где моноклональное антитело отличается одним или двумя из следующего:

(1) моноклональное антитело имеет антигенсвязывающий эпитоп Aβ30-42;

(2) его вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, и его вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21; или

его вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, и его вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22; или

его вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, и его вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21; или

его вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и его вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20; или

его вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и его вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21; или

его вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и его вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22.

5. Моноклональное антитело по любому из пп.1-4, где моноклональное антитело отличается одним или двумя из следующего:

(1) больше аминокислот относится к 2, 3, 4 или 5 аминокислотам;

(2) моноклональное антитело, дополнительно содержащее константную область, где моноклональное антитело имеет константную область тяжелой цепи, которая относится к любому из человеческих IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4; и моноклональное антитело имеет константную область легкой цепи, которая относится к типу κ или типу λ.

6. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая моноклональное антитело по любому из пп.1-5.

7. Вектор экспрессии, содержащий нуклеотиды, кодирующие моноклональное антитело по любому из пп.1-5.

8. Клетка-хозяин для получения моноклонального антитела по любому из пп.1-5, где клетка трансформирована или трансфицирована вектором экспрессии по п.7.

9. Способ получения моноклонального антитела по любому из пп.1-5, включающий культивирование клетки-хозяина по п.8 и индукцию экспрессии гуманизированного моноклонального антитела против Aβ.

10. Применение моноклонального антитела по любому из пп.1-5 при производстве анти-Аβ средства, где анти-Аβ средство используется для борьбы с когнитивными нарушениями, ингибирования прогрессирования болезни Альцгеймера, ингибирования образования сенильных бляшек, ингибирования накопления Aβ, борьбы с нейротоксичностью, ингибирования образования амилоидных фибрилл Aβ борьбы с синаптической токсичностью, предотвращения или лечения заболевания и/или детектирования экспрессии Aβ;

где заболевание включает амилоидоз, выбранный из вторичного амилоидоза и возрастного амилоидоза, и неврологическое заболевание, которое представляет собой болезнь Альцгеймера.

11. Лекарственное средство для профилактики или лечения заболевания, отличающееся содержанием моноклонального антитела по любому из пп.1-5 и фармацевтически приемлемого носителя,

где заболевание включает амилоидоз, выбранный из вторичного амилоидоза и возрастного амилоидоза, и неврологическое заболевание, которое представляет собой болезнь Альцгеймера.

12. Набор для детекции Aβ экспрессии, отличающийся тем, что содержит моноклональное антитело по любому из пп.1-5 и буфер.

13. Набор по п.12, который используется для диагностики заболевания, отличающийся детектированием экспрессии Aβ набором по п.12, определяя наличие заболевания в соответствии с количеством экспрессии Aβ;

где заболевание включает амилоидоз, выбранный из вторичного амилоидоза и возрастного амилоидоза, и неврологическое заболевание, которое представляет собой болезнь Альцгеймера.