ОЛИГОДЕНДРОЦИТ-СПЕЦИФИЧНЫЙ ПРОМОТОР, микроРНК, СПЕЦИФИЧНАЯ К ГЕНУ PLP1, ВЕКТОР, СОДЕРЖАЩИЙ УКАЗАННЫЙ ПРОМОТОР И/ИЛИ УКАЗАННУЮ микроРНК, И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ УКАЗАННЫЙ ВЕКТОР Российский патент 2023 года по МПК C12N15/113 A61K35/761 A61K31/7088 A61K48/00 C12N15/861 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0001] Настоящее изобретение относится к олигодендроцит-специфичному промотору, в частности, к олигодендроцит-специфичному промотору, содержащему нуклеиновую кислоту, по меньшей мере на 90% идентичную нуклеотидной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 1. Настоящее изобретение также относится к микроРНК, специфичной к гену PLP1. Кроме того, настоящее изобретение относится к вектору, содержащему указанный промотор и/или указанную миРНК, и к фармацевтической композиции, содержащей такой вектор.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0002] Гипомиелиновая лейкодистрофия представляет собой общий термин, обозначающий заболевания головного мозга у детей, вызванные слабым развитием белого вещества головного мозга, причем в настоящее время известно 11 заболеваний. Типичным заболеванием среди них является болезнь Пелицеуса-Мерцбахера (PMD). PMD характеризуется нарушением миелинизации центральной нервной системы и представляет собой редкое трудноизлечимое заболевание, которое вызывает серьезные нарушения моторного развития и неврологические симптомы сразу после рождения. По оценкам заболеваемость в Японии составляет 1,45 случаев на 100000 новорожденных мальчиков. В настоящее время необходимые средства лечения отсутствуют.

[0003] Миелин продуцируется олигодендроцитами (олигодендроглией), представляющими собой тип глиальных клеток, присутствующих в головном мозге, и имеет многослойную структуру изолирующих фосфолипидов, окружающих аксоны нейронов. Главным белком миелина является протеолипидный белок (PLP), в качестве других компонентов также известны основной белок миелина (MBP) и человеческая 2',3'-фосфодиэстераза циклических нуклеотидов (CNP). PMD вызывается аномалиями в гене протеолипидного белка (ген PLP1). Среди них наиболее частой мутацией является дупликация PLP1 (примерно 60%). Дупликация PLP1 приводит к сверхэкспрессии гена PLP1, поэтому можно ожидать, что нормализация уровня его экспрессии даст терапевтический эффект.

[0004] В непатентном документе 1 раскрыта опосредованная аденоассоциированным вирусом (AAV) экспрессия зеленого флуоресцентного белка (GFP), управляемая промотором основного белка миелина (MBP) или промотором глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) в мозге мышей в процессе развития, и описано, что экспрессия GFP, управляемая промотором GFAP, является высокоспецифичной для астроцитов после введения вектора в мозг новорожденных и взрослых мышей. В непатентном документе 1 также указано, что селективность промотора MBP в отношении олигодендроцитов была низкой после введения AAV новорожденным мышам, но превосходной после введения вектора на 10-е сутки после рождения. В этом документе предполагается, что введение AAV, управляемого клеточно-специфичным промотором, непосредственно в развитый постнатальный мозг приводит к целевой долговременной экспрессии трансгена в глиальных клетках.

[0005] В непатентном документе 2 описывается разработка генной терапии, направленной на олигодендроциты, против Пелицеус-Мерцбахера-подобной болезни, где ген GJC2/Cx47 вставляют ниже промотора основного белка миелина и вводят мышам возрастом 10 дней путем однократной интрацеребральной инъекции во внутреннюю капсулу с использованием вектора на основе аденоассоциированного вируса (AAV.MBP.Cx47myc).

[0006] В непатентных документах 1 и 2 раскрыта генная терапия и соответствующий промотор с использованием вектора AAV, но не описывается какая-либо генная терапия, направленная на аномалии гена PLP1, и подходящие для нее промоторы или микроРНК.

Список литературы

Непатентная литература

[0007] Непатентный документ 1: von Jonquieres G et al., Glial promoter selectivity following AAV-delivery to the immature brain. PLoS One. 2013 Jun 14; 8(6): e65646.

Непатентный документ 2: Georgiou E et al., Gene therapy targeting oligodendrocytes provides therapeutic benefit in a leukodystrophy model. Brain. 2017 Mar 1; 140(3): 599-616.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Техническая задача

[0008] Настоящее изобретение относится к вектору, способному олигодендроцит-специфически подавлять экспрессию гена PLP1 с целью лечения PMD, вызванной аномалией гена PLP1, соответствующему промотору и соответствующей микроРНК, а также к фармацевтической композиции, содержащей вектор.

Решение задачи

[0009] Авторы настоящего изобретения обнаружили, что промотор человеческой фосфодиэстеразы 2',3'-циклических нуклеотидов (CNP), имеющий последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1, может управлять экспрессией гена в олигодендроцит-специфичной и высокоэффективной манере, и что вектор AAV, содержащий данный промотор и микроРНК, специфичную для гена PLP1, находящуюся ниже промотора и функционально связанную с ним, может подавлять экспрессию гена PLP1, и тем самым завершили настоящее изобретение.

[0010] А именно, настоящее изобретение относится к нижеследующим аспектам.

[1] Олигодендроцит-специфичный промотор, содержащий нуклеиновую кислоту, по меньшей мере на 90% идентичную нуклеотидной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 1.

[2] Промотор по п.[1], содержащий нуклеиновую кислоту, имеющую нуклеотидную последовательность, описанную в SEQ ID NO: 1.

[3] Олигодендроцит-специфичный вектор, содержащий промотор по п.[1] или [2].

[4] Вектор по п.[3], дополнительно содержащий последовательность микроРНК, специфичную для человеческого гена PLP1, функционально связанную с промотором.

[5] МикроРНК, специфичная для гена PLP1, содержащая пару нуклеотидных последовательностей, состоящую из антисмысловой последовательности и смысловой последовательности, где пара нуклеотидных последовательностей выбрана из группы, состоящей из пар антисмысловых последовательностей, показанных в левом столбце таблицы 1, и смысловых последовательностей, показанных рядом с антисмысловыми последовательностями в правом столбце таблицы.

[6] МикроРНК по п.[5], содержащая нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2-7 и 24-51.

[7] МикроРНК по п.[5], содержащая нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2-5, 7, 24, 26, 29-32, 35, 36, 42 и 51.

[8] МикроРНК по п.[5], содержащая нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 29, 31 и 32.

[9] Вектор, содержащий последовательность микроРНК по любому из пп.[5]-[8].

[10] Вектор по п.[9], где последовательность микроРНК функционально связана с олигодендроцит-специфичным промотором.

[11] Вектор по п.[10], где олигодендроцит-специфичный промотор представляет собой промотор по п.[1] или [2].

[12] Вектор по любому из пунктов [3], [4] и [9]-[11], где вектор представляет собой вектор на основе аденоассоциированного вируса (AAV).

[13] Фармацевтическая композиция, содержащая вектор по любому из пунктов [3], [4] и [9]-[12].

[14] Фармацевтическая композиция по п.[13], которая представляет собой фармацевтическую композицию для лечения заболевания, связанного с аномалией гена PLP1.

[15] Фармацевтическая композиция по п.[14], где заболевание представляет собой болезнь Пелицеуса-Мерцбахера, спастическую параплегию типа 2 или рассеянный склероз.

[16] Фармацевтическая композиция по п.[14], где заболевание представляет собой болезнь Пелицеуса-Мерцбахера.

[17] Фармацевтическая композиция по п.[13], которая представляет собой ингибитор экспрессии гена PLP1, подавляющий экспрессию гена PLP1.

[18] Способ лечения заболевания, связанного с аномалией гена PLP1, включающий введение эффективного количества вектора по любому из пп.[3], [4] и [9]-[12] пациенту, нуждающемуся в лечении.

[19] Способ по п.[18], где заболевание представляет собой болезнь Пелицеуса-Мерцбахера, спастическую параплегию типа 2 или рассеянный склероз.

[20] Способ по п.[18], где заболевание представляет собой болезнь Пелицеуса-Мерцбахера.

[21] Способ подавления экспрессии гена PLP1, включающий введение эффективного количества вектора по любому из пп.[3], [4] и [9]-[12] пациенту, нуждающемуся в лечении.

[22] Вектор по любому из пп.[3], [4] и [9]-[12] для применения в способе лечения заболевания, связанного с аномалией гена PLP1.

[23] Вектор по п.[22], где заболевание представляет собой болезнь Пелицеуса-Мерцбахера, спастическую параплегию типа 2 или рассеянный склероз.

[24] Вектор по п.[22], где заболевание представляет собой болезнь Пелицеуса-Мерцбахера.

Полезные эффекты изобретения

[0011] Вектор AAV, содержащий промотор по настоящему изобретению, способен обеспечивать экспрессию гена в олигодендроцит-специфичной и высокоэффективной манере и, кроме того, он успешно подавляет экспрессию гена PLP1 благодаря включению последовательности микроРНК, специфичной для человеческого гена PLP1, функционально связанной с промотором, и, следовательно, его можно использовать в качестве терапевтического средства против PMD, вызванной дупликацией PLP1 и др.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0012] [Фиг. 1] На фиг. 1 показана схематическая диаграмма вектора AAV, описанного в примере 1.

[Фиг. 2] На фиг. 2 показаны фотографии, представляющие результат анализа специфичности AAV-экспрессирующих клеток методом иммунофлуоресцентного окрашивания, описанного в примере 2.

[Фиг. 3] На фиг. 3 показан график, демонстрирующий результаты измерения по участкам подавления экспрессии (нокдауна) в пересчете на уровень экспрессии гена PLP1 по интенсивности флуоресценции, генерируемой в процессе иммунофлуоресцентного окрашивания PLP1, как описано в примере 3.

[Фиг. 4] На фиг. 4 показаны графики, демонстрирующие результаты измерения подавления экспрессии (нокдауна) в пересчете на уровень экспрессии гена PLP1 методом количественной ПЦР, как описано в примере 4. На (A) и (B) показаны относительные уровни экспрессии гена PLP1 и относительные уровни экспрессии гена Olig2 соответственно.

[Фиг. 5] На фиг. 5 показаны фотографии, представляющие результаты гистологического анализа методом иммуноокрашивания после введения мышам PLP1-Tg, как описано в примере 5.

[Фиг. 6] На фиг. 6 показаны фотографии, представляющие результаты микроморфологического анализа с помощью электронного микроскопа после введения мышам PLP1-Tg, как описано в примере 5.

[Фиг. 7] На фиг. 7 показан график, демонстрирующий увеличение продолжительности жизни после введения мышам PLP1-Tg, как описано в примере 5.

[Фиг. 8] На фиг. 8 показан график, демонстрирующий увеличение массы тела после введении мышам PLP1-Tg, как описано в примере 5.

[Фиг. 9] На фиг. 9 показан график, демонстрирующий результаты измерения подавления экспрессии (нокдауна) в пересчете на уровень экспрессии гена PLP1 методом количественной ПЦР, как описано в примере 6.

[Фиг. 10] На фиг. 10 показан график, демонстрирующий результаты измерения подавления экспрессии (нокдауна) в пересчете на уровень экспрессии гена PLP1 методом количественной ПЦР, как описано в примере 7.

[Фиг. 11] На фиг. 11 показан график, демонстрирующий результаты измерения подавления экспрессии (нокдауна) в пересчете на уровень экспрессии гена PLP1 методом количественной ПЦР, как описано в примере 8.

[Фиг. 12] На фиг. 12 показан график, демонстрирующий результаты измерения подавления экспрессии (нокдауна) в пересчете на уровень экспрессии гена PLP1 методом количественной ПЦР, как описано в примере 9.

[Фиг. 13] На фиг. 13 показан график, демонстрирующий результаты измерения по участкам подавления экспрессии (нокдауна) в пересчете на уровень экспрессии гена PLP1 по интенсивности флуоресценции, генерируемой в процессе иммунофлуоресцентного окрашивания PLP1, как описано в примере 10.

ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0013] [Промотор]

Промотор по настоящему варианту осуществления представляет собой олигодендроцит-специфичный промотор, содержащий нуклеиновую кислоту, последовательность которой по меньшей мере на 90%, предпочтительно по меньшей мере на 95%, более предпочтительно по меньшей мере на 98% идентична нуклеотидной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 1, наиболее предпочтительно указанный промотор содержит нуклеиновую кислоту, имеющую нуклеотидную последовательность, описанную в SEQ ID NO: 1. Помимо нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90% идентичной нуклеотидной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 1, промотор может содержать на конце нуклеотидных последовательностей участки для клонирования в векторах, такие как участки распознавания рестрикционными ферментами, и последовательность att для шлюзового клонирования.

[0014] Нуклеиновая кислота, имеющая нуклеотидную последовательность, описанную в SEQ ID NO: 1, представляет собой человеческий промотор CNP, который можно получить из chr17:40118309-40120101 стандартной последовательности человеческого генома (GRCh37/hg19). Человеческий ген CNP представляет собой ген, специфически экспрессирующийся в олигодендроцитах головного мозга, причем его специфичность, как полагают, определяется последовательностью указанного промотора. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что последовательность человеческого промотора CNP, описанная в SEQ ID NO: 1, может обеспечивать олигодендроцит-специфическую экспрессию генов, отличных от гена CNP, расположенных ниже этого промотора.

[0015] Промотор согласно настоящему варианту осуществления представляет собой промотор, который специфически функционирует в олигодендроцитах, благодаря чему гены, функционально связанные с промотором и расположенные ниже его, специфически экспрессируются в олигодендроцитах. Промотор настоящего варианта осуществления можно получит с помощью методов генной инженерии. Например, ген человеческого промотора CNP получают из генома человека, а промотор, имеющий желаемую нуклеотидную последовательность, получают путем делеции, вставки или замены некоторых нуклеотидов. Альтернативно промотор, имеющий желаемую нуклеотидную последовательность, можно получить путем частичного или полного синтеза.

[0016] [микроРНК]

микроРНК обычно содержит антисмысловую последовательность и смысловую последовательность и может образовывать структуру шпильки, тем самым превращаясь в зрелую микроРНК. Антисмысловая цепь зрелой микроРНК связывается с мРНК-мишенью, вызывая разложение или подавление трансляции указанной мРНК и тем самым подавление экспрессии целевого гена. микроРНК по настоящему варианту осуществления представляет собой микроРНК, специфичную для гена PLP1, в частности человеческого гена PLP1, содержит антисмысловую последовательность и смысловую последовательность и может подавлять экспрессию гена PLP1.

[0017] Предпочтительно микроРНК по настоящему варианту осуществления содержит 5'-фланкирующую последовательность, антисмысловую последовательность, последовательность петли на стебле, смысловую последовательность и 3'-фланкирующую последовательность в указанном порядке, начиная с 5'-конца. Конфигурация требует, чтобы длина 5'-фланкирующей последовательности составляла 25-100 нуклеотидов, последовательности петли на стебле - 4-30 нуклеотидов, а 3'-фланкирующей последовательности - 25-100 нуклеотидов.

[0018] Фланкирующая последовательность может представлять собой любую последовательность, которая, как известно, обычно экспрессируется в олигодендроцитах, например, можно использовать 5'-фланкирующую последовательность и 3'-фланкирующую последовательность, полученные из miR155. Помимо 5'-фланкирующей последовательности и 3'-фланкирующей последовательности, полученных из miR155, можно использовать 5'-фланкирующую последовательность и 3'-фланкирующую последовательность miR-138, miR-219, miR-9, miR-23a, miR-388 и miR-297c, которые, как известно, экспрессируются в олигодендроцитах.

[0019] Последовательность микроРНК, специфичную для человеческого гена PLP1, можно сконструировать с помощью программного обеспечения, такого как BLOCK-iT(TM) RNAi Designer (ThermoFisher Scientific, США), например, можно использовать описанные ниже кандидатные нуклеотидные последовательности микроРНК человеческого PLP1.

Кандидатная нуклеотидная последовательность 1 микроРНК человеческого PLP1 (SEQ ID NO: 2):

5'-AAAGGAAGAAGAAAGAGGCAGGTTTTTGGCCACTGACTGACCTGCCTCTCTTCTTCCTTT-3'

Кандидатная нуклеотидная последовательность 2 микроРНК человеческого PLP1 (SEQ ID NO: 3):

5'-AACACCAGGAGCCACACAACGGTTTTGGCCACTGACTGACCGTTGTGTCTCCTGGTGTT-3'

Кандидатная нуклеотидная последовательность 3 микроРНК человеческого PLP1 (SEQ ID NO: 4):

5'-TTCCATGGGAGAACACCATACGTTTTGGCCACTGACTGACGTATGGTGCTCCCATGGAA-3'

Кандидатная нуклеотидная последовательность 4 микроРНК человеческого PLP1 (SEQ ID NO: 5):

5'-TGAGCAGGGAAACCAGTGTAGGTTTTGGCCACTGACTGACCTACACTGTTCCCTGCTCA-3'

Кандидатная нуклеотидная последовательность 5 микроРНК человеческого PLP1 (SEQ ID NO: 6)

5'-AGGGCTTTCTGATTGACAGCCGTTTTGGCCACTGACTGACGGCTGTCACAGAAAGCCCT-3'

Кандидатная нуклеотидная последовательность 6 микроРНК человеческого PLP1 (SEQ ID NO: 7):

5'-ACCCCAAAGAAACACAATCCAGTTTTGGCCACTGACTGACtggattgtttctttggggt-3'

Кандидатная нуклеотидная последовательность 7 микроРНК человеческого PLP1 (SEQ ID NO: 24)

5'-ACAAATGCAGCAATAAACAGGGTTTTGGCCACTGACTGACCCTGTTTAGCTGCATTTGT-3'

Кандидатная нуклеотидная последовательность 8 микроРНК человеческого PLP1 (SEQ ID NO: 25):

5'-AATAGACTGGCAGGTGGTCCAGTTTTGGCCACTGACTGACTGGACCACGCCAGTCTATT-3'

Кандидатная нуклеотидная последовательность 9 микроРНК человеческого PLP1 (SEQ ID NO: 26)

5'-AAAGAATGAGCTTGATGTTGGGTTTTGGCCACTGACTGACCCAACATCGCTCATTCTTT-3'

Кандидатная нуклеотидная последовательность 10 микроРНК человеческого PLP1 (SEQ ID NO: 27):

5'-AGATACTCATAGTCTTGGTAGGTTTTGGCCACTGACTGACCTACCAAGTATGAGTATCT-3'

Кандидатная нуклеотидная последовательность 11 микроРНК человеческого PLP1 (SEQ ID NO: 28):

5'-AAGCCCATGTCTTTGGGACTCGTTTTGGCCACTGACTGACGAGTCCCAGACATGGGCTT-3'

[0020] Альтернативно, чтобы сконструировать последовательность микроРНК, специфичную для человеческого гена PLP1, конструируют искусственные миРНК, как описано в разделе Примеры, и выбирают оптимальную последовательность миРНК, которую затем используют для синтеза микроРНК.

[0021] микроРНК по настоящему варианту осуществления содержит пару нуклеотидных последовательностей, состоящую из антисмысловой последовательности и смысловой последовательности, где пара нуклеотидных последовательностей может быть выбрана из группы, состоящей из пар, содержащих антисмысловую последовательность, описанную в левом столбце таблицы 1, и смысловую последовательность, указанную справа от антисмысловой последовательности в правом столбце таблицы.

Таблица 1. Антисмысловые и смысловые последовательности микроРНК, сконструированные для человеческого гена PLP1

Антисмысловая последовательность Смысловая последовательность AAAGGAAGAAGAAAGAGGCAG（SEQ ID NO: 52） CTGCCTCTCTTCTTCCTTT（SEQ ID NO: 53） AACACCAGGAGCCACACAACG（SEQ ID NO: 54） CGTTGTGTCTCCTGGTGTT（SEQ ID NO: 55） TTCCATGGGAGAACACCATAC（SEQ ID NO: 56） GTATGGTGCTCCCATGGAA（SEQ ID NO: 57） TGAGCAGGGAAACCAGTGTAG（SEQ ID NO: 58） CTACACTGTTCCCTGCTCA（SEQ ID NO: 59） AGGGCTTTCTGATTGACAGCC（SEQ ID NO: 60） GGCTGTCACAGAAAGCCCT（SEQ ID NO: 61） ACCCCAAAGAAACACAATCCA（SEQ ID NO: 62） TGGATTGTTTCTTTGGGGT（SEQ ID NO: 63） ACAAATGCAGCAATAAACAGG（SEQ ID NO: 64） CCTGTTTAGCTGCATTTGT（SEQ ID NO: 65） AATAGACTGGCAGGTGGTCCA（SEQ ID NO: 66） TGGACCACGCCAGTCTATT（SEQ ID NO: 67） AAAGAATGAGCTTGATGTTGG（SEQ ID NO: 68） CCAACATCGCTCATTCTTT（SEQ ID NO: 69） AGATACTCATAGTCTTGGTAG（SEQ ID NO: 70） CTACCAAGTATGAGTATCT（SEQ ID NO: 71） AGAAACACAATCCAGTGGCCA（SEQ ID NO: 72） TGGCCACTATTGTGTTTCT（SEQ ID NO: 73） AAATAGGTCTCAATTAGCTTT（SEQ ID NO: 74） AAAGCTAAGAGACCTATTT（SEQ ID NO: 75） AAGAAACACAATCCAGTGGCC（SEQ ID NO: 76） GGCCACTGTTGTGTTTCTT（SEQ ID NO: 77） TAAACAGGTGGAAGGTCATTT（SEQ ID NO: 78） AAATGACCCCACCTGTTTA（SEQ ID NO: 79） TTGTAGTCGCCAAAGATCTGC（SEQ ID NO: 80） GCAGATCTGGCGACTACAA（SEQ ID NO: 81） AATTAGAGCCTCCATTCCTTT（SEQ ID NO: 82） AAAGGAATAGGCTCTAATT（SEQ ID NO: 83） TTAAGGACGGCAAAGTTGTAA（SEQ ID NO: 84） TTACAACTGCCGTCCTTAA（SEQ ID NO: 85） TTTAAGGACGGCAAAGTTGTA（SEQ ID NO: 86） TACAACTTCCGTCCTTAAA（SEQ ID NO: 87） ATGTCTTTGGGACTCTGACTC（SEQ ID NO: 88） GAGTCAGACCCAAAGACAT（SEQ ID NO: 89） TATCTATCCTGTGTCTACCAG（SEQ ID NO: 90） CTGGTAGACAGGATAGATA（SEQ ID NO: 91） AAATTACTTTCTGATCCTCAG（SEQ ID NO: 92） CTGAGGATGAAAGTAATTT（SEQ ID NO: 93） TCTAACAAGCCCATGTCTTTG（SEQ ID NO: 94） CAAAGACAGGCTTGTTAGA（SEQ ID NO: 95） AATTACTTTCTGATCCTCAGG（SEQ ID NO: 96） CCTGAGGAAGAAAGTAATT（SEQ ID NO: 97） AGTAAATGTACACAGGCACAG（SEQ ID NO: 98） CTGTGCCTGTACATTTACT（SEQ ID NO: 99） TAAGTAAGGTTGGCTGAGTTA（SEQ ID NO: 100） TAACTCAGAACCTTACTTA（SEQ ID NO: 101） TTCTGTGGGTGAAAGATCCTT（SEQ ID NO: 102） AAGGATCTCACCCACAGAA（SEQ ID NO: 103） AGAAGATGCTGACAACACCCT（SEQ ID NO: 104） AGGGTGTTCAGCATCTTCT（SEQ ID NO: 105） AATTGTAGCCGGCTGGCTAGT（SEQ ID NO: 106） ACTAGCCACGGCTACAATT（SEQ ID NO: 107） AGATTTGGGCAAACGCTCTTA（SEQ ID NO: 108） TAAGAGCGTGCCCAAATCT（SEQ ID NO: 109） ATTCTACGCTCCCTTATGCTG（SEQ ID NO: 110） CAGCATAAGAGCGTAGAAT（SEQ ID NO: 111） TGGTAATAGAGAGACCAGAAT（SEQ ID NO: 112） ATTCTGGTCTCTATTACCA（SEQ ID NO: 113） TATAGATGGCAAGAGGACCAA（SEQ ID NO: 114） TTGGTCCTTGCCATCTATA（SEQ ID NO: 115） AAACCAGTGTAGCTGCAGCCC（SEQ ID NO: 116） GGGCTGCATACACTGGTTT（SEQ ID NO: 117）

[0022] микроРНК настоящего варианта осуществления предпочтительно содержит одну из приведенных ниже пар нуклеотидных последовательностей.

- Пара нуклеотидных последовательностей, состоящая из SEQ ID NO: 52 в качестве антисмысловой последовательности и SEQ ID NO: 53 в качестве смысловой последовательности.

- Пара нуклеотидных последовательностей, состоящая из SEQ ID NO: 54 в качестве антисмысловой последовательности и SEQ ID NO: 55 в качестве смысловой последовательности.

- Пара нуклеотидных последовательностей, состоящая из SEQ ID NO: 56 в качестве антисмысловой последовательности и SEQ ID NO: 57 в качестве смысловой последовательности.

- Пара нуклеотидных последовательностей, состоящая из SEQ ID NO: 58 в качестве антисмысловой последовательности и SEQ ID NO: 59 в качестве смысловой последовательности.

- Пара нуклеотидных последовательностей, состоящая из SEQ ID NO: 62 в качестве антисмысловой последовательности и SEQ ID NO: 63 в качестве смысловой последовательности.

- Пара нуклеотидных последовательностей, состоящая из SEQ ID NO: 64 в качестве антисмысловой последовательности и SEQ ID NO: 65 в качестве смысловой последовательности.

- Пара нуклеотидных последовательностей, состоящая из SEQ ID NO: 68 в качестве антисмысловой последовательности и SEQ ID NO: 69 в качестве смысловой последовательности.

- Пара нуклеотидных последовательностей, состоящая из SEQ ID NO: 72 в качестве антисмысловой последовательности и SEQ ID NO: 73 в качестве смысловой последовательности.

- Пара нуклеотидных последовательностей, состоящая из SEQ ID NO: 76 в качестве антисмысловой последовательности и SEQ ID NO: 77 в качестве смысловой последовательности.

- Пара нуклеотидных последовательностей, состоящая из SEQ ID NO: 78 в качестве антисмысловой последовательности и SEQ ID NO: 79 в качестве смысловой последовательности.

- Пара нуклеотидных последовательностей, состоящая из SEQ ID NO: 84 в качестве антисмысловой последовательности и SEQ ID NO: 85 в качестве смысловой последовательности.

- Пара нуклеотидных последовательностей, состоящая из SEQ ID NO: 86 в качестве антисмысловой последовательности и SEQ ID NO: 87 в качестве смысловой последовательности.

- Пара нуклеотидных последовательностей, состоящая из SEQ ID NO: 98 в качестве антисмысловой последовательности и SEQ ID NO: 99 в качестве смысловой последовательности.

- Пара нуклеотидных последовательностей, состоящая из SEQ ID NO: 116 в качестве антисмысловой последовательности и SEQ ID NO: 117 в качестве смысловой последовательности.

[0023] Более предпочтительно микроРНК настоящего варианта осуществления содержит одну из нижеследующих пар нуклеотидных последовательностей.

- Пара нуклеотидных последовательностей, состоящая из SEQ ID NO: 52 в качестве антисмысловой последовательности и SEQ ID NO: 53 в качестве смысловой последовательности.

- Пара нуклеотидных последовательностей, состоящая из SEQ ID NO: 72 в качестве антисмысловой последовательности и SEQ ID NO: 73 в качестве смысловой последовательности.

- Пара нуклеотидных последовательностей, состоящая из SEQ ID NO: 76 в качестве антисмысловой последовательности и SEQ ID NO: 77 в качестве смысловой последовательности.

- Пара нуклеотидных последовательностей, состоящая из SEQ ID NO: 78 в качестве антисмысловой последовательности и SEQ ID NO: 79 в качестве смысловой последовательности.

[0024] Кроме того, последовательность микроРНК по настоящему варианту осуществления может содержать нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 29-51, приведенных в таблице 2.

Таблица 2. Последовательности микроРНК, сконструированные для человеческого гена PLP1

SEQ ID NO: pre-miRNA Sequence 29 AGAAACACAATCCAGTGGCCAGTTTTGGCCACTGACTGACTGGCCACTATTGTGTTTCT 30 AAATAGGTCTCAATTAGCTTTGTTTTGGCCACTGACTGACAAAGCTAAGAGACCTATTT 31 AAGAAACACAATCCAGTGGCCGTTTTGGCCACTGACTGACGGCCACTGTTGTGTTTCTT 32 TAAACAGGTGGAAGGTCATTTGTTTTGGCCACTGACTGACAAATGACCCCACCTGTTTA 33 TTGTAGTCGCCAAAGATCTGCGTTTTGGCCACTGACTGACGCAGATCTGGCGACTACAA 34 AATTAGAGCCTCCATTCCTTTGTTTTGGCCACTGACTGACAAAGGAATAGGCTCTAATT 35 TTAAGGACGGCAAAGTTGTAAGTTTTGGCCACTGACTGACTTACAACTGCCGTCCTTAA 36 TTTAAGGACGGCAAAGTTGTAGTTTTGGCCACTGACTGACTACAACTTCCGTCCTTAAA 37 ATGTCTTTGGGACTCTGACTCGTTTTGGCCACTGACTGACGAGTCAGACCCAAAGACAT 38 TATCTATCCTGTGTCTACCAGGTTTTGGCCACTGACTGACCTGGTAGACAGGATAGATA 39 AAATTACTTTCTGATCCTCAGGTTTTGGCCACTGACTGACCTGAGGATGAAAGTAATTT 40 TCTAACAAGCCCATGTCTTTGGTTTTGGCCACTGACTGACCAAAGACAGGCTTGTTAGA 41 AATTACTTTCTGATCCTCAGGGTTTTGGCCACTGACTGACCCTGAGGAAGAAAGTAATT 42 AGTAAATGTACACAGGCACAGGTTTTGGCCACTGACTGACCTGTGCCTGTACATTTACT 43 TAAGTAAGGTTGGCTGAGTTAGTTTTGGCCACTGACTGACTAACTCAGAACCTTACTTA 44 TTCTGTGGGTGAAAGATCCTTGTTTTGGCCACTGACTGACAAGGATCTCACCCACAGAA 45 AGAAGATGCTGACAACACCCTGTTTTGGCCACTGACTGACAGGGTGTTCAGCATCTTCT 46 AATTGTAGCCGGCTGGCTAGTGTTTTGGCCACTGACTGACACTAGCCACGGCTACAATT 47 AGATTTGGGCAAACGCTCTTAGTTTTGGCCACTGACTGACTAAGAGCGTGCCCAAATCT 48 ATTCTACGCTCCCTTATGCTGGTTTTGGCCACTGACTGACCAGCATAAGAGCGTAGAAT 49 TGGTAATAGAGAGACCAGAATGTTTTGGCCACTGACTGACATTCTGGTCTCTATTACCA 50 TATAGATGGCAAGAGGACCAAGTTTTGGCCACTGACTGACTTGGTCCTTGCCATCTATA 51 AAACCAGTGTAGCTGCAGCCCGTTTTGGCCACTGACTGACGGGCTGCATACACTGGTTT

[0025] МикроРНК по настоящему варианту осуществления может содержать нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2-7 и 24-51, предпочтительно она может содержать нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2-5, 7, 24, 26, 29-32, 35, 36, 42 и 51, и более предпочтительно она может содержать нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 29, 31 и 32.

[0026] [Вектор]

Олигодендроцит-специфичный вектор по настоящему варианту осуществления содержит олигодендроцит-специфичный промотор и/или микроРНК, специфичную для гена PLP1. Вектор по настоящему варианту осуществления представляет собой вектор, который можно использовать для лечения заболевания, связанного с аномалией гена PLP1 или с подавлением экспрессии гена PLP1.

[0027] Вектор может представлять собой плазмиду или вектор, способный инфицировать клетки человека и экспрессировать ген, примеры вектора включают аденоассоциированный вирус (AAV), лентивирус, ретровирус, аденовирус, вирус Сендай и плазмиды (включая комплексы с липосомами или полимерами), предпочтительно вектор представляет собой AAV. AAV представляет собой небольшой вирус, не содержащий хелпер-зависимой оболочки, который относят к роду Dependovirus семейства Parvoviridae, и который инфицирует таких животных, как люди, приматы и грызуны. AAV индуцирует очень слабый иммунный ответ, патогенность данного вируса не подтверждена. AAV может инфицировать как делящиеся, так и неделящиеся клетки, причем после заражения клетки-хозяина AAV может выживать вне ядерных хромосом и экспрессировать ген при низкой частоте вставки в хромосомальный геном хозяина.

[0028] В качестве AAV предпочтительно используют, например, любой из серотипов AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 и AAV9, также предпочтительно могут использоваться гибридные мозаичные векторы AAV и химерные векторы AAV. Например, в гибридном мозаичном векторе AAV может присутствовать любое сочетание AAV1-AAV9, включая гибрид AAV1/2. Примеры химерных векторов AAV включают Olig001 (Powell SK et al., Gene Ther. 2016 Nov; 23 (11): 807-814), обладающий высоким тропизмом в отношении олигодендроцитов.

[0029] Олигодендроцит-специфичный промотор, входящий в состав вектора по настоящему варианту осуществления, не ограничивается конкретным промотором и может представлять собой любой промотор, способный специфически функционировать в олигодендроцитах, и предпочтительно промотор по настоящему варианту осуществления, то есть олигодендроцит-специфичный промотор, представляет собой олигодендроцит-специфический промотор, содержащий нуклеиновую кислоту, по меньшей мере на 90% идентичную нуклеотидной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 1. микроРНК, специфичная для гена PLP1, входящая в состав вектора по настоящему варианту осуществления, не ограничивается конкретной микроРНК и может представлять собой любую микроРНК, способную подавлять экспрессию гена PLP1, и предпочтительно она представляет собой микроРНК по настоящему варианту осуществления, то есть микроРНК, содержащую пару нуклеотидных последовательностей, состоящую из антисмысловой последовательности и смысловой последовательности, где пара нуклеотидных последовательностей выбрана из группы, состоящей из пар, содержащих антисмысловую последовательность, указанную в левом столбце таблицы 1, и смысловую последовательность, указанную в правом столбце таблицы рядом с антисмысловой последовательностью.

[0030] Вектор по настоящему варианту осуществления может содержать олигодендроцит-специфичный промотор по настоящему варианту осуществления и трансген, функционально связанный с промотором. Трансген не ограничивается конкретным трансгеном, но предпочтительно используют, например, последовательность микроРНК, специфичную для гена PLP1, в частности последовательность микроРНК, специфичную для человеческого гена PLP1. Последовательность микроРНК, специфичную для человеческого гена PLP1, можно сконструировать с использованием программного обеспечения, такого как BLOCK-iT(TM) RNAi Designer (ThermoFisher Scientific, USA). Альтернативно, чтобы сконструировать последовательность микроРНК, специфичную для человеческого гена PLP1, получают искусственные миРНК, как описано в разделе Примеры, и выбирают из них оптимальную последовательность, которую используют для конструирования микроРНК. В качестве такой микроРНК, специфичной к человеческому гену PLP1, предпочтительно используют, например, описанную выше микроРНК настоящего варианта осуществления.

[0031] Вектор настоящего варианта осуществления может содержать олигодендроцит-специфичный промотор и микроРНК настоящего варианта осуществления, функционально связанную с промотором. Олигодендроцит-специфичный промотор не ограничивается конкретным промотором, а его примеры включают промотор гена основного белка миелина и промотор гена PLP1. В качестве олигодендроцит-специфичного промотора предпочтительно используют описанный выше олигодендроцит-специфичный промотор по данному варианту осуществления. Вектор согласно настоящему варианту осуществления может предпочтительно содержать олигодендроцит-специфичный промотор согласно настоящему варианту осуществления и одну или несколько микроРНК согласно настоящему варианту осуществления, функционально связанные с промотором.

[0032] Вектор настоящего варианта осуществления также может содержать репортерный ген для подтверждения экспрессии гена. Примеры репортерного гена включают, без ограничения, GFP, Venus, и tdTomato.

[0033] Вектор настоящего варианта осуществления можно легко сконструировать методом генной инженерии. Например, гибридный вектор AAV1/2, содержащий промотор hCNP, описанный в SEQ ID NO: 1, и репортерный ген, можно получить следующим способом. Промотор hCNP, кодирующий участок репортерного гена, такого как Venus, 3'-нетранслируемый участок и сигнал поли-A SV40 располагают в указанном порядке между двумя участками распознавания NotI самокомплементарного вектора AAV, и затем в 3'-нетранслируемый участок вставляют нуклеотидную последовательность кассеты экспрессии микроРНК. Вектор можно хранить в замороженном виде при -20°C до использования, а при использовании вектора клетки AAV293 (Takara Bio Inc., Japan) трансфицируют вектором вместе с серотип-специфической хелперной плазмидой и аденовирусной хелперной плазмидой pHelper и культивируют в течение 72 часов, чтобы обеспечить амплификацию в клетках или в культуральной среде. В зависимости от масштаба очистку можно проводить методом колоночной хроматографии, ультрафильтрации, ультрацентрифугирования и т.п. Титр векторного генома полученного вектора AAV можно определить методом количественной ПЦР с использованием набора для титрования AAVpro (Takara Bio Inc., Japan).

[0034] [Фармацевтическая композиция]

Фармацевтическая композиция по настоящему варианту осуществления включает вышеописанный вектор по настоящему варианту осуществления. Фармацевтическая композиция по настоящему варианту осуществления предпочтительно представляет собой фармацевтическую композицию для лечения заболевания, связанного с аномалией гена PLP1. Примеры заболевания, связанного с аномалиями гена PLP1, включают болезнь Пелицеуса-Мерцбахера (PMD) и спастическую параплегию типа 2, каждая из которых вызывается дупликацией гена PLP1, точечной мутацией гена PLP1, мутацией с делецией или вставкой в гене PLP1, или рассеянный склероз. Фармацевтическая композиция по настоящему варианту осуществления также может представлять собой ингибитор экспрессии гена PLP1, способный подавлять экспрессию гена PLP1.

[0035] Фармацевтическая композиция по настоящему варианту осуществления предпочтительно представляет собой водный раствор, содержащий вектор AAV, и может иметь титр от 5×10¹⁰ до 5×10¹⁴ вг/мл, предпочтительно от 5×10¹¹ до 5×10¹³ вг/мл.

[0036] Фармацевтическая композиция по настоящему варианту осуществления может содержать фармацевтически приемлемый вспомогательный компонент, такой как фосфатно-солевой буферный раствор (PBS), и, кроме того, она может содержать другое терапевтическое средство. Фармацевтическую композицию по настоящему варианту осуществления можно получить путем растворения в водном растворе, таком как вода, с добавлением при необходимости других компонентов.

[0037] При лечении болезни Пелицеуса-Мерцбахера фармацевтическую композицию по настоящему варианту воплощения можно вводить непосредственно в мозг, причем примеры такого введения включают введение в один или несколько участков паренхимы головного мозга (например, в белое вещество полушария головного мозга, внутреннюю капсулу, мозжечок) или спинного мозга кроме того, можно вводить интрацеребровентрикулярно/интратекально или внутрисосудисто/внутрибрюшинно. Введение можно проводить в любое время после рождения. Количество вводимого препарата может варьировать в зависимости от участка введения и возраста, но в случае введения в паренхиму головного мозга можно вводить от 0,1 до 2 мл/участок, предпочтительно примерно 0,5 мл/участок. В случае интрацеребровентрикулярного/интратекального введения можно вводить от 0,5 до 2 мл/кг массы тела, предпочтительно до 1 мл/кг массы тела. В случае внутрисосудистого или внутрибрюшинного введения можно вводить от 1 до 10 мл/кг массы тела, предпочтительно до 5 мл/кг массы тела.

[0038] [Способ лечения]

Способ лечения по настоящему варианту осуществления представляет собой способ лечения заболевания, связанного с аномалией гена PLP1, включающий введение эффективного количества описанного выше вектора настоящего варианта осуществления пациенту, нуждающемуся в лечении. Альтернативно способ лечения настоящего варианта осуществления представляет собой способ подавления экспрессии гена PLP1, включающий введение эффективного количества описанного выше вектора настоящего варианта осуществления пациенту, нуждающемуся в лечении.

ПРИМЕРЫ

[0039] Далее настоящее изобретение описывается более детально в разделе Примеры. Однако настоящее изобретение не ограничивается нижеследующими примерами.

[0040] <Пример 1. Конструирование кассеты экспрессии олигодендроцит-специфичного AAV и содержащего ее вектора AAV>

Последовательность пре-микроРНК (микроРНК PLP1, SEQ ID NO: 9), специфичную для мРНК мышиного гена PLP1 (NM_011123.3, SEQ ID NO: 8) и последовательность пре-микроРНК, используемой в качестве отрицательного контроля (miR-neg, SEQ ID NO: 10), конструируют с использованием BLOCK-iT(TM) RNAi Designer (ThermoFisher Scientific, USA). miR-neg представляет собой последовательность микроРНК, которая может образовывать структуру шпильки и таким образом процессировааться в зрелую микроРНК, однако предполагается, что она не является специфичной для известных генов позвоночных.

PLP1-микроРНК (SEQ ID NO: 9):

5'-ACTCCAAAGAAACACAATCCAGTTTTGGCCACTGACTGACTGACTGGATTGTTTCTTTGGAGT-3'

miR-neg (SEQ ID NO: 10):

5'-GTATGCATCGAATGAGATTCCGTTTTGGCCACTGACTGACGGAATCTCTCGATGCATAC-3'

[0041] Последовательность микроРНК PLP1 и последовательность miR-neg синтезируют в соответствии с конструированными последовательностями и клонируют в участке клонирования вектора pcDNA(TM) 6.2-GW/miR (ThermoFisher Scientific, USA), входящего в состав набора для получения вектора экспрессии BLOCK-iT(TM) Pol II miR RNAi. 5'-Фланкирующую последовательность (SEQ ID NO: 11) и 3'-фланкирующую последовательность (SEQ ID NO: 12), полученные из мышиной miR-155, располагают по обе стороны от последовательности микроРНК PLP1 или последовательности miR-neg, соответственно. 5'-Фланкирующая последовательность и 3'-фланкирующая последовательность, полученные из мышиной miR-155, представляют собой 5'-участок и 3'-участок мышиной miR-155, за исключением фрагмента шпилечной структуры, и последовательности пре-микроРНК или miR-neg помещают между 5'-фланкирующей последовательностью и 3'-фланкирующей последовательностью так, чтобы указанные последовательности микроРНК могли экспрессироваться.

5'-фланкирующая последовательность (SEQ ID NO: 11):

5'-CTGGAGGCTTGCTGAAGGCTGTATGCT-3'

3-'фланкирующая последовательность (SEQ ID NO: 12):

5'-CAGGACACAAGGCCTGTTACTAGCACTCACATGGAACAAATGGCC-3'

[0042] С использованием полученного вектора pcDNA(TM) 6.2-GW/miR методом ПЦР амплифицируют фрагмент 5'-фланкирующая последовательность-последовательность микроРНК PLP1 (или последовательность miR-neg)-3'-фланкирующая последовательность, продукт амплификации расщепляют XhoI/BamHI и вставляют во фрагмент ДНК, полученный путем расщепления вектора pW-CAG-Venus-WPRE (SEQ ID NO: 13) с помощью XhoI/BamHI, проводят расщепление на обоих концах WPRE, расположенного на 3'-конце последовательности venus (SEQ ID NO: 14), чтобы удалить последовательность WPRE. Затем полученный вектор расщепляют SpeI/EcoRI для удаления промотора CAG, фрагмент ДНК вставляют в данный участок на 5’-конце последовательности Venus, где фрагмент ДНК получают путем ПЦР-амплификации человеческого промотора CNP (SEQ ID NO: 1) размером 1,8 т.о., и расщепляют на обоих концах SpeI/EcoRI, чтобы обеспечить олигодендроцит-специфичную экспрессию гена. Полученный вектор дополнительно расщепляют NotI, чтобы удалить каркас одноцепочечного AAV, полученного из pW-CAG-Venus-WPRE, соединяют с каркасом самокомплементарного аденоассоциированного вируса (scAAV), полученного путем расщепления pscW-PABPN1 (SEQ ID NO: 15) ферментом NotI, и получают конечные конструкции микроРНК Pscw-hCNP-Venus-PLP1 (SEQ ID NO: 16) и Pscw-hCNP-Venus-miR-neg (SEQ ID NO: 17) (Фиг. 1).

[0043] Гибридный вектор AAV1/2 (вектор scAAV-AAV1/2) получают по способу, описанному в непатентном документе 1. А именно, клетки AAV293 совместно трансфицируют, используя PEI, полученными ранее конструкциями scAAV, микроРНК Pscw-hCNP-Venus-PLP1 или Pscw-hCNP-Venus-miR-neg, серотип-специфичными хелперными плазмидами AAV p5E18RXC1 (Xiao W et al., J Virol (1999) 73: 3994-4003) и pAAV-RC (Agilent Technologies), кодирующими гены rep и cap AAV1 и AAV2, соответственно, и аденовирусной хелперной плазмидой pHelper (Agilent Technology). Клетки собирают через 72 часа после трансфекции и вектор scAAV-AAV1/2 очищают с использованием набора для очистки AAVpro (Takara Bio Inc., Japan). Титры векторных геномов определяют методом количественной ПЦР с использованием набора для титрования AAVpro (Takara Bio Inc., Japan).

[0044] Полученные векторы scAAV-AAV1/2 были сконструированы как вектор микроРНК AAV-hCNP-Venus-PLP1 (или вектор микроРНК PLP1) и вектор AAV-hCNP-Venus-miR-neg (или вектор miR-neg).

[0045] <Пример 2. Введение векторов AAV мышам дикого типа и экспрессия указанных векторов>

Один микролитр раствора вектора микроРНК PLP1 или вектора miR-neg, полученных в примере 1 (титр: 1,2×10¹² вг/мл), вводят в полосатое тело и внутреннюю капсулу каждой мыши Jcl:B6C3F1 дикого типа возрастом 10 дней (n=5/группу). Перед инъекцией мышей анестезируют раствором пентобарбитала. Введение вектора проводят с использованием шприца 33G со скоростью 150 нл/мин. После инъекции каждую мышь оставляют в покое на 1 минуту и затем иглу медленно вытаскивают из мозга. После этого мышей возвращают группой матери и выращивают до 17-го дня после рождения.

[0046] Экспрессию гена, обеспечиваемую каждым вектором, определяют путем детекции зеленого флуоресцентного белка на 17 день после рождения. Типы Venus-экспрессирующих клеток, идентифицируют путем двойного иммуноокрашивания клеточными маркерами, такими как Gst-π (маркер зрелых олигодендроцитов), NeuN (маркер нейронов), Iba1 (маркер микроглии) и GFAP (маркер астроцитов).

[0047] Чтобы провести иммуноокрашивание, мышей Jcl:B6C3F1 анестезируют раствором Форан для ингаляций, после чего их подвергают транскардиальной перфузии PBS и затем свежим 4% раствором параформальдегида. Мозги собирают, фиксируют в течение ночи при 4°C, затем среду заменяют 30% раствором сахарозы в PBS и хранят в замороженном состоянии в заключающей среде OCT Compound (TissueTech, Inc.). Получают коронарные срезы (20 мкм) и подвергают их иммуноокрашиванию для подтверждения специфичности инфицированных клеток, экспрессирующих Venus. Срезы инкубируют с блокирующим раствором (PBS, содержащий 0,05% Triton(TM) X-100 и 5% козьей сыворотки) в течение 3 часов при комнатной температуре, после чего инкубируют при 4°C в течение ночи с Gst-π (Cell Signaling Technology, Inc., 1:300), GFAP (Millipore Corporation, 1:400), NeuN (Chemicon, 1:400) или Iba1 (Biocare Medical, LLC., 1:500) в качестве первичных антител. Затем срезы промывают и инкубируют с соответствующим вторичным антителом (ThermoFisher Scientific, USA) в течение 1 часа при комнатной температуре. Ядра клеток визуализируют 40,60-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI, Sigma-Aldrich Co. LLC). Слайды заключают в гистологическую среду ProLong® Diamond (Thermo Fisher Scientific, USA) и фотографируют с помощью флуоресцентного микроскопа KEYENCE (KEYENCE CORPORATION, Japan).

[0048] Результаты показаны на фиг. 2. Из фиг. 2 видно, что Venus-положительные клетки соответствуют Gst-π-положительным олигодендроцитам, но не соответствуют NeuN-положительным нейронам, GFAP-положительным астроцитам и IbaI-положительной микроглии. Таким образом, фиг. 2 демонстрирует, что вектор miR-neg экспрессируется в олигодендроцит-специфической манере с высокой эффективностью.

[0049] <Пример 3. Оценка 1 эффективности подавления экспрессии (нокдауна) в пересчете на уровень экспрессии гена PLP1 - Часть 1>

Один микролитр раствора каждого из двух векторов scAAV-AAV1/2 (титр: 1,2×10¹² вг/мл), полученных в примере 1, вводят в полосатое тело, внутреннюю капсулу и мозжечок каждой мыши Jcl:B6C3F1 дикого типа возрастом 10 дней (n=3/группу). Используют такой же метод введения, как и в примере 2. Затем, чтобы оценить эффективность нокдауна микроРНК PLP1, определяют экспрессию белка PLP1 в Venus-положительных клетках методом иммуноокрашивания. Иммуноокрашивание проводят таким же способом, как и в примере 2, за исключением того, что в качестве первичного антитела используют кроличье поликлональное антитело против PLP1 (Numata Y et al., J Biol Chem. 2013 Mar 15; 288 (11): 7451-66), а в качестве вторичного антитела используют флуоресцентное антитело против кроличьих иммуноглобулинов (Thermo Fisher Scientific, USA). Каждый участок мозолистого тела, полосатого тела и внутренней капсулы фотографируют с помощью флуоресцентного микроскопа KEYENCE (KEYENCE CORPORATION, Japan).

[0050] Среднюю интенсивность флуоресценции иммуноокрашенного PLP1 количественно определяют с помощью Image J 1.45s (Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA), результаты количественного анализа интенсивности флуоресценции методом иммунофлуоресцентного окрашивания PLP1 показаны на фиг. 3. Из фиг. 3 можно видеть, что почти нет разницы в экспрессии белка PLP1 между стороной, в которую не вводят вектор miR-neg (неинфицированная сторона), и стороной, в которую вводят вектор (инфицированная сторона), тогда как в случае вектора микроРНК PLP1 эффект ингибирования экспрессии белка PLP1, наблюдаемый на инфицированной стороне по сравнению с неинфицированной стороной, составляет 40%. Отсутствие различия в количестве астроцитов и микроглии между неинфицированной стороной и инфицированной стороной указывает на отсутствие реактивной воспалительной реакции при введении AAV.

[0051] <Пример 4. Оценка эффективности подавления экспрессии (нокдауна) в пересчете на уровень экспрессии гена PLP1 - Часть 2>

Один микролитр раствора каждого из двух векторов scAAV-AAV1/2 (титр: 1,2×10¹² вг/мл), полученных в примере 1, вводят в полосатое тело и внутреннюю капсулу каждой мыши Jcl:B6C3F1 дикого типа возрастом 10 дней (n=4/группу). Используют такой же метод введения, как и в примере 2. Затем, чтобы оценить эффективность нокдауна микроРНК PLP1, определяют экспрессию мРНК PLP1 в Venus-положительных клетках методом количественной ПЦР.

[0052] Чтобы провести сортировку Venus-положительных клеток, мышей Jcl:B6C3F1 анестезируют раствором Форан для ингаляций и подвергают транскардиальной перфузии 20 мл PBS. Мозг удаляют и примерно нарезают микроножницами. К каждому мозгу добавляют 1 мл аккутазы (Millipore Corporation) и инкубируют при 37°C в течение 30 минут. К каждому образцу добавляют 2 мл сбалансированного солевого раствора Хенкса (HBSS), содержащего 10% FBS, и ткань гомогенизируют с помощью микропипетки. Каждый образец фильтруют через клеточное сито 100 мкм и собранную суспензию клеток центрифугируют. Чтобы очистить клетки от остатков миелина, их ресуспендируют в HBSS, содержащем 40% перколла (Amersham plc), и центрифугируют при 700 g в течение 25 минут при комнатной температуре. Верхний слой миелина отсасывают, а моноциты ресуспендируют в 1 мл среды DMEM/F12. Клетки разделяют в проточном цитометре FACSCanto (BD Biosciences) и результаты анализируют с помощью программного обеспечения FlowJo (Tree Star Inc., OR, RRID: NIF-0000 to 30575). Результаты представляют в виде процента от общего числа клеток.

[0053] Для проведения количественной ПЦР выделяют общую РНК из Venus-положительных клеток с помощью набора RNeasy Mini (Qiagen), а для синтеза кДНК используют набор с обратной транскриптазой SuperScript® (Thermo Fisher Scientific, USA). Экспрессию генов анализируют методом количественной ОТ-ПЦР с помощью LightCycler® 480 SYBR Green I Master и LightCycler® 480 Instrument, используя нижеследующие специфические праймеры (F. Hoffmann-La Roche Ltd., Switzerland). Результаты нормализуют по гену домашнего хозяйства β-актина и рассчитывают относительные уровни экспрессии PLP1 и Olig2. Значения CP (значения точек пересечения), полученные для каждого образца, преобразуют в логарифмические значения, чтобы нанести на график относительные уровни экспрессии±SD, и полученные графики приводят на фиг. 4.

Прямой праймер PLP1 (SEQ ID NO: 18): 5'-GTTCCAGAGGCCAACATCAAGCTC-3'

Обратный праймер PLP1 (SEQ ID NO: 19): 5'-AGCCATACAACAGTCAGGGCATAG-3'

Прямой праймер Olig2 (SEQ ID NO: 20): 5'-GGGAGGTCATGCCTTACGCGC-3'

Обратный праймер Olig2 (SEQ ID NO: 21): 5'-CTCCAGCGAGTTGGTGAGC-3'

Прямой праймер β-актина (SEQ ID NO: 22): 5'-CACAGCTTCTTTGCAGCTCCTT-3'

Обратный праймер β-актина (SEQ ID NO: 23): 5'-GACGACCAGCGCAGCGATA-3'

[0054] Из фиг. 4 можно видеть, что отсутствуют значительные различия в уровне экспрессии мРНК маркера олигодендроцитов Olig2 между вектором miR-neg и вектором микроРНК PLP1 (B), тогда как уровень экспрессии мРНК PLP1 после введения вектора микроРНК PLP1 свидетельствует о наличии эффекта подавления экспрессии гена PLP1, составляющего примерно 60% (A).

[0055] <Пример 5: Эффект введения PLP1-трансгенным мышам (PLP1-Tg)>

В полосатое тело и внутреннюю капсулу каждого потомка мышей PLP1-Tg/B6C3 возрастом 10 дней (масса тела 5-6 г) со сверхэкспрессией мышиного PLP1 вводят вектор микроРНК PLP1 (группа лечения, n=16) или вектор miR-neg (группа имитации лечения, n=16), чтобы провести тестирование лечения. PLP1-Tg/B6C3 получают путем обратного скрещивания PLP1-Tg/BDF1, подаренных доктором Tetsushi Kagawa из Национального института физиологических наук, со штаммом B6C3 (Kagawa T et al., Neuron. 1994 Aug; 13 (2): 427-42). В случае PLP1-Tg-гомозиготных индивидуумов 1 мкл раствора каждого из двух видов векторов scAAV-AAV1/2 (титр: 1,2×10¹² вг/мл), полученных в примере 1, вводят в полосатое тело и внутреннюю капсулу каждой мыши возрастом 10 дней таким же способом, как и в примере 2. В качестве положительного контроля используют однопометных мышат дикого типа (n=16), которым вводят вектор miR-neg. У некоторых из этих мышей удаляют ткань головного мозга на 25 день после рождения (15 дней после инъекции) и проводят гистологический анализ (иммуноокрашивание и морфометрический анализ) ткани мозга, у остальных мышей регистрируют массу и выживаемость.

[0056] Гистологический анализ методом иммуноокрашивания проводят следующим образом. У мышей дикого типа, мышей PLP1-Tg из группы лечения и мышей PLP1-Tg из группы имитации лечения, где n=5 в каждой группе, каждый из мозолистого тела, полосатого тела и внутренней капсулы подвергают иммуноокрашиванию по способу, описанному в примере 3, на 25 день после рождения (15 день после инъекции). У мышей дикого типа, которые составляют группу положительного контроля, после введения PLP1 наблюдаются фиброзные сильно окрашенные изображения, соответствующие миелиновым оболочкам мозолистого тела, полосатого тела и внутренней капсулы. При анализе мышей PLP1-Tg окрашенные изображения, соответствующие миелиновым оболочкам, практически отсутствуют у мышей, получающих имитацию лечения, хотя было получено окрашенное изображение, свидетельствующее об аномальном накоплении PLP1 в цитоплазме олигодендроцитов. С другой стороны, у мышей из группы лечения почти отсутствуют окрашенные изображения, свидетельствующие о накоплении PLP1 в цитоплазме, но наблюдается окрашивание фиброза, которое соответствует миелиновой оболочке, таким образом, было обнаружено, что введение вектора микроРНК PLP1 дает улучшенные окрашенные изображения PLP1 по сравнению с аномальными. На фиг. 5 показаны микрофотографии мозолистого тела.

[0057] Микроморфологический анализ с использованием электронного микроскопа проводят следующим образом. У мышей дикого типа и мышей PLP1-Tg из группы лечения и группы имитации лечения, где n=2/группу, фиксацию с рефлюксом проводят с использованием 0,1 М фосфатного буфера, содержащего 2% глутаральдегида и 2% параформальдегида, на 25 день после рождения (15 день после инъекции), и затем мозг собирают и дополнительно фиксируют путем пропитывания таким же буфером. Каждый из мозолистого тела, полосатого тела и внутренней капсулы проверяют на AAV-инфицированные участки под стереоскопическим флуоресцентным микроскопом, вырезают квадратный кусок ткани размером 600 мкм и фиксируют его 0,1 М фосфатным буфером, содержащим 1% осмия. После обезвоживания срез ткани погружают в эпоксидную смолу, получают ультратонкий срез размером 70 нм, который наблюдают с помощью электронного микроскопа (Tecnai Spirit, Thermo Fisher Scientific, USA) при увеличении в 7300 раз.

[0058] На фиг. 6 показаны фотографии, сделанные с помощью электронного микроскопа. Очевидно, что в мозолистом теле, полосатом теле и внутренней капсуле мышей дикого типа большинство аксонов являются миелинизированными. У мышей PLP1-Tg из группы имитации лечения доля миелинизированных аксонов была явно низкой, кроме того, аксоны были сужены. С другой стороны, у мышей PLP1-Tg из группы лечения доля миелинизированных аксонов увеличивается, а диаметр аксонов значительно превышает диаметр аксонов у мышей из группы имитации лечения. Из полученных результатов видно, что анализ ультратонкой морфологии свидетельствует о том, что введение вектора микроРНК PLP1 оказывает терапевтический эффект благодаря увеличению доли миелинизированных волокон.

[0059] Мышей из группы лечения и мышей из группы имитации лечения, где n=9/группу, наблюдают в возрасте от 25 дней до смерти, оценивая массу тела и выживаемость в каждой группе. Обнаружено, что введение мышам PLP1-Tg вызывает эффект значительного увеличения выживаемости (продолжительности жизни) (фиг. 7) и эффект увеличения массы тела (фиг. 8), что подтверждает эффективность данного метода лечения.

[0060] Описанные результаты демонстрируют, что олигодендроцит-специфичный промотор и вектор AAV, содержащий данный промотор, можно использовать в качестве фундаментального метода для разработки способа лечения PMD, и что вектор AAV, обеспечивающий экспрессию гена, содержащий PLP1-специфичную микроРНК и указанный промотор, является эффективным средством для лечения PMD.

[0061] <Пример 6: Оценка эффективности подавления экспрессии (нокдауна) в пересчете на уровень экспрессии гена PLP1 - Часть 3>

Чтобы оценить эффективность нокдауна под действием микроРНК человеческого PLP1, сконструированной с использованием BLOCK-iT(TM) RNAi Designer (Thermo Fisher Scientific, USA), плазмиду pcDNA(TM) 6.2-hPLP1, которая может обеспечивать сверхэкспрессию кодирующей последовательности человеческого гена PLP1, и плазмиду pscw.CAG.Venus.PLP1-miRNA, полученную путем клонирования последовательности в 3'-нетранслируемом участке ниже кДНК, кодирующей Venus, флуоресцентный белок, экспрессируемый под контролем промотора CAG, одновременно вводят в клетки HeLa методом трансфекции. Для трансфекции используют TransIt-LT1 (Takara Bio Inc.). Через 24 часа клетки собирают и экстрагируют общую РНК с помощью набора RNeasy Mini (Qiagen). Для проведения количественной ПЦР синтезируют кДНК с помощью набора с обратной транскриптазой SuperScript(R) (Thermo Fisher Scientific, USA). Экспрессию гена анализируют методом количественной ПЦР с помощью LightCycler (R) 480 SYBR Green I Master и LightCycler (R) 480 Instrument, используя нижеследующие специфические праймеры (F. Hoffmann-La Roche Ltd., Switzerland). Праймеры, используемые для определения экспрессии гена PLP1 методом количественной ПЦР, описаны ниже.

Прямой праймер человеческого PLP1 (SEQ ID NO: 280): 5′-GCTCCAACCTTCTGTCCATCT-3′

Обратный праймер человеческого PLP1 (SEQ ID NO: 281): 5′-ACGGCAAAGTTGTAAGTGGC-3′

Прямой праймер человеческого β-актина (SEQ ID NO: 282): 5'-GACAGGATGCAGAAGGAGATTACT-3'

Обратный праймер человеческого β-актина (SEQ ID NO: 283): 5'-TGATCCACATCTGCTGGAAGGT-3'

[0062] На фиг. 9 показаны результаты нокдауна. Эффективность нокдауна рассчитывают, принимая уровень экспрессии PLP1 в клетках, экспрессирующих miR-neg, за 1. Результаты нормализуют по гену домашнего хозяйства β-актина и рассчитывают как относительный уровень экспрессии±SD. Идентифицируют семь последовательностей, которые снижают уровень экспрессии гена PLP1 (SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 7, 24 и 26).

[0063] <Пример 7. Оценка эффективности подавления экспрессии (нокдауна) в пересчете на уровень экспрессии гена PLP1 - Часть 4>

Пару миРНК, состоящую из смысловой цепи и соответствующей антисмысловой цепи, показанных в таблице 3, и раствор для трансфекции (RNAi MAX, Invitrogen) смешивают, полученный раствор добавляют к клеткам U-251MG, после чего клетки культивируют в течение 48 часов.

[Таблица 3]

Таблица 3. Последовательности миРНК, сконструированные для человеческого гена PLP1

№ SEQ ID NO: Смысловая/антисмысловая цепь Последовательность миRNA 1 118 hPLP1-001 UGACCUUCCACCUGUUUAUdTdT 119 hPLP1-001anti AUAAACAGGUGGAAGGUCAdTdT 2 120 hPLP1-002 GUGCCUGUGUACAUUUACUdTdT 121 hPLP1-002anti AGUAAAUGUACACAGGCACdTdT 3 122 hPLP1-003 UUGCCCAAAUCUGCCUAUUdTdT 123 hPLP1-003anti AAUAGGCAGAUUUGGGCAAdTdT 4 124 hPLP1-004 AGGAAUGGAGGCUCUAAUUdTdT 125 hPLP1-004anti AAUUAGAGCCUCCAUUCCUdTdT 5 126 hPLP1-005 UGGCCACUGGAUUGUGUUUdTdT 127 hPLP1-005anti AAACACAAUCCAGUGGCCAdTdT 6 128 hPLP1-006 GCGGGUGUGUCAUUGUUUGdTdT 129 hPLP1-006anti CAAACAAUGACACACCCGCdTdT 7 130 hPLP1-007 GACCUUCCACCUGUUUAUUdTdT 131 hPLP1-007anti AAUAAACAGGUGGAAGGUCdTdT 8 132 hPLP1-008 ACUCCCUUCUCCUUGAUAAdTdT 133 hPLP1-008anti UUAUCAAGGAGAAGGGAGUdTdT 9 134 hPLP1-009 CUGCAAGUCACAAAGGAAUdTdT 135 hPLP1-009anti AUUCCUUUGUGACUUGCAGdTdT 10 136 hPLP1-010 GGUCCUCUUGCCAUCUAUAdTdT 137 hPLP1-010anti UAUAGAUGGCAAGAGGACCdTdT 11 138 hPLP1-011 CCUCGUUAGGGAAGAGAAAdTdT 139 hPLP1-011anti UUUCUCUUCCCUAACGAGGdTdT 12 140 hPLP1-012 GGAGAAGAGGACAAAGAUAdTdT 141 hPLP1-012anti UAUCUUUGUCCUCUUCUCCdTdT 13 142 hPLP1-013 GGCCAACAUCAAGCUCAUUdTdT 143 hPLP1-013anti AAUGAGCUUGAUGUUGGCCdTdT 14 144 hPLP1-014 AGGCCAACAUCAAGCUCAUdTdT 145 hPLP1-014anti AUGAGCUUGAUGUUGGCCUdTdT 15 146 hPLP1-015 CUCCCUUCUCCUUGAUAACdTdT 147 hPLP1-015anti GUUAUCAAGGAGAAGGGAGdTdT 16 148 hPLP1-016 GCCUCUUUCUUCUUCCUUUdTdT 149 hPLP1-016anti AAAGGAAGAAGAAAGAGGCdTdT 17 150 hPLP1-017 CUGUGCCUGUGUACAUUUAdTdT 151 hPLP1-017anti UAAAUGUACACAGGCACAGdTdT 18 152 hPLP1-018 AAGGAAUGGAGGCUCUAAUdTdT 153 hPLP1-018anti AUUAGAGCCUCCAUUCCUUdTdT 19 154 hPLP1-019 AGGGUGUUGUCAGCAUCUUdTdT 155 hPLP1-019anti AAGAUGCUGACAACACCCUdTdT 20 156 hPLP1-020 ACAGCUGAGUUCCAAAUGAdTdT 157 hPLP1-020anti UCAUUUGGAACUCAGCUGUdTdT

№ SEQ ID NO: Смысловая/антисмысловая цепь Последовательность миRNA 21 158 hPLP1-021 GCCACUGGAUUGUGUUUCUdTdT 159 hPLP1-021anti AGAAACACAAUCCAGUGGCdTdT 22 160 hPLP1-022 ACAACUUUGCCGUCCUUAAdTdT 161 hPLP1-022anti UUAAGGACGGCAAAGUUGUdTdT 23 162 hPLP1-023 GCUGAUGCCAGAAUGUAUGdTdT 163 hPLP1-023anti CAUACAUUCUGGCAUCAGCdTdT 24 164 hPLP1-024 UUGCCGUCCUUAAACUCAUdTdT 165 hPLP1-024anti AUGAGUUUAAGGACGGCAAdTdT 25 166 hPLP1-025 CUGCCUCUUUCUUCUUCCUdTdT 167 hPLP1-025anti AGGAAGAAGAAAGAGGCAGdTdT 26 168 hPLP1-026 CCACUGGAUUGUGUUUCUUdTdT 169 hPLP1-026anti AAGAAACACAAUCCAGUGGdTdT 27 170 hPLP1-027 GGAUCAGAAAGUAAUUUCUdTdT 171 hPLP1-027anti AGAAAUUACUUUCUGAUCCdTdT 28 172 hPLP1-028 UAGCCAGCCGGCUACAAUUdTdT 173 hPLP1-028anti AAUUGUAGCCGGCUGGCUAdTdT 29 174 hPLP1-029 AGCGUAGAAUCUGUGUAGAdTdT 175 hPLP1-029anti UCUACACAGAUUCUACGCUdTdT 30 176 hPLP1-030 UCCCUUCUCCUUGAUAACAdTdT 177 hPLP1-030anti UGUUAUCAAGGAGAAGGGAdTdT 31 178 hPLP1-031 UUCCAAGGAGCUGAGAAUAdTdT 179 hPLP1-031anti UAUUCUCAGCUCCUUGGAAdTdT 32 180 hPLP1-032 UGCCAGAAUGUAUGGUGUUdTdT 181 hPLP1-032anti AACACCAUACAUUCUGGCAdTdT 33 182 hPLP1-033 AUGCCUUCCAGUAUGUCAUdTdT 183 hPLP1-033anti AUGACAUACUGGAAGGCAUdTdT 34 184 hPLP1-034 CAACUUUGCCGUCCUUAAAdTdT 185 hPLP1-034anti UUUAAGGACGGCAAAGUUGdTdT 35 186 hPLP1-035 CCAACAUCAAGCUCAUUCUdTdT 187 hPLP1-035anti AGAAUGAGCUUGAUGUUGGdTdT 36 188 hPLP1-036 UGGCCUUACACCUCGUUAGdTdT 189 hPLP1-036anti CUAACGAGGUGUAAGGCCAdTdT 37 190 hPLP1-037 AGGACAUCCCGACAAGUUUdTdT 191 hPLP1-037anti AAACUUGUCGGGAUGUCCUdTdT 38 192 hPLP1-038 GUCAGAGUCCCAAAGACAUdTdT 193 hPLP1-038anti AUGUCUUUGGGACUCUGACdTdT 39 194 hPLP1-039 UUGCAGGAGAAGAGGACAAdTdT 195 hPLP1-039anti UUGUCCUCUUCUCCUGCAAdTdT 40 196 hPLP1-040 GGUAGACACAGGAUAGAUAdTdT 197 hPLP1-040anti UAUCUAUCCUGUGUCUACCdTdT

№ SEQ ID NO: Смысловая/антисмысловая цепь Последовательность миRNA 41 198 hPLP1-041 UCAGCCAACCUUACUUACAdTdT 199 hPLP1-041anti UGUAAGUAAGGUUGGCUGAdTdT 42 200 hPLP1-042 AUGGAACUGCCUCUUUCUUdTdT 201 hPLP1-042anti AAGAAAGAGGCAGUUCCAUdTdT 43 202 hPLP1-043 ACUCAGCCAACCUUACUUAdTdT 203 hPLP1-043anti UAAGUAAGGUUGGCUGAGUdTdT 44 204 hPLP1-044 CUUCCACUGAUGGAAACAAdTdT 205 hPLP1-044anti UUGUUUCCAUCAGUGGAAGdTdT 45 206 hPLP1-045 AUGACCUUCCACCUGUUUAdTdT 207 hPLP1-045anti UAAACAGGUGGAAGGUCAUdTdT 46 208 hPLP1-046 UCUCCUGAGGAUCAGAAAGdTdT 209 hPLP1-046anti CUUUCUGAUCCUCAGGAGAdTdT 47 210 hPLP1-047 GAGGAUCAGAAAGUAAUUUdTdT 211 hPLP1-047anti AAAUUACUUUCUGAUCCUCdTdT 48 212 hPLP1-048 GGAUCUUUCACCCACAGAAdTdT 213 hPLP1-048anti UUCUGUGGGUGAAAGAUCCdTdT 49 214 hPLP1-049 CUGAGGAUCAGAAAGUAAUdTdT 215 hPLP1-049anti AUUACUUUCUGAUCCUCAGdTdT 50 216 hPLP1-050 CUGGUAGACACAGGAUAGAdTdT 217 hPLP1-050anti UCUAUCCUGUGUCUACCAGdTdT 51 218 hPLP1-051 GCAGUUGCUGGUGGCUAAUdTdT 219 hPLP1-051anti AUUAGCCACCAGCAACUGCdTdT 52 220 hPLP1-052 AAGACAUGGGCUUGUUAGAdTdT 221 hPLP1-052anti UCUAACAAGCCCAUGUCUUdTdT 53 222 hPLP1-053 UUGCUGCCACUUACAACUUdTdT 223 hPLP1-053anti AAGUUGUAAGUGGCAGCAAdTdT 54 224 hPLP1-054 UCGUUAGGGAAGAGAAACAdTdT 225 hPLP1-054anti UGUUUCUCUUCCCUAACGAdTdT 55 226 hPLP1-055 UCCACUGAUGGAAACAAAGdTdT 227 hPLP1-055anti CUUUGUUUCCAUCAGUGGAdTdT 56 228 hPLP1-056 AGAGCGUUUGCCCAAAUCUdTdT 229 hPLP1-056anti AGAUUUGGGCAAACGCUCUdTdT 57 230 hPLP1-057 UGAUUGCUGCCACUUACAAdTdT 231 hPLP1-057anti UUGUAAGUGGCAGCAAUCAdTdT 58 232 hPLP1-058 GGAGCGUAGAAUCUGUGUAdTdT 233 hPLP1-058anti UACACAGAUUCUACGCUCCdTdT 59 234 hPLP1-059 UGAGGAUCAGAAAGUAAUUdTdT 235 hPLP1-059anti AAUUACUUUCUGAUCCUCAdTdT 60 236 hPLP1-060 GGUGUUGUCAGCAUCUUCUdTdT 237 hPLP1-060anti AGAAGAUGCUGACAACACCdTdT № SEQ ID NO: Смысловая/антисмысловая цепь Последовательность миRNA 61 238 hPLP1-061 GUCAAAGCAAGGAUCUUUCdTdT 239 hPLP1-061anti GAAAGAUCCUUGCUUUGACdTdT 62 240 hPLP1-062 AGAUCUUUGGCGACUACAAdTdT 241 hPLP1-062anti UUGUAGUCGCCAAAGAUCUdTdT 63 242 hPLP1-063 UGCAGGAGAAGAGGACAAAdTdT 243 hPLP1-063anti UUUGUCCUCUUCUCCUGCAdTdT 64 244 hPLP1-064 UGGUGGCUAAUGGUGUAACdTdT 245 hPLP1-064anti GUUACACCAUUAGCCACCAdTdT 65 246 hPLP1-065 AGCUAAUUGAGACCUAUUUdTdT 247 hPLP1-065anti AAAUAGGUCUCAAUUAGCUdTdT 66 248 hPLP1-066 GUGCUGAUGCCAGAAUGUAdTdT 249 hPLP1-066anti UACAUUCUGGCAUCAGCACdTdT 67 250 hPLP1-067 UUUCCAAGGAGCUGAGAAUdTdT 251 hPLP1-067anti AUUCUCAGCUCCUUGGAAAdTdT 68 252 hPLP1-068 UGUGCCUGUGUACAUUUACdTdT 253 hPLP1-068anti GUAAAUGUACACAGGCACAdTdT 69 254 hPLP1-069 CAGGUACAGAGAAGGAAUGdTdT 255 hPLP1-069anti CAUUCCUUCUCUGUACCUGdTdT 70 256 hPLP1-070 GCAUAAGGGAGCGUAGAAUdTdT 257 hPLP1-070anti AUUCUACGCUCCCUUAUGCdTdT 71 258 hPLP1-071 UCAGGUACAGAGAAGGAAUdTdT 259 hPLP1-071anti AUUCCUUCUCUGUACCUGAdTdT 72 260 hPLP1-072 GCUGCAGCUACACUGGUUUdTdT 261 hPLP1-072anti AAACCAGUGUAGCUGCAGCdTdT 73 262 hPLP1-073 UCUCCCAUGGAAUGCUUUCdTdT 263 hPLP1-073anti GAAAGCAUUCCAUGGGAGAdTdT 74 264 hPLP1-074 UGCCUUCCAGUAUGUCAUCdTdT 265 hPLP1-074anti GAUGACAUACUGGAAGGCAdTdT 75 266 hPLP1-075 GCUGCCACUUACAACUUUGdTdT 267 hPLP1-075anti CAAAGUUGUAAGUGGCAGCdTdT 76 268 hPLP1-076 ACUUUGCCGUCCUUAAACUdTdT 269 hPLP1-076anti AGUUUAAGGACGGCAAAGUdTdT 77 270 hPLP1-077 ACCUUACUUACAGCAUAAGdTdT 271 hPLP1-077anti CUUAUGCUGUAAGUAAGGUdTdT 78 272 hPLP1-078 UGGACUACUGAAGCCCUAAdTdT 273 hPLP1-078anti UUAGGGCUUCAGUAGUCCAdTdT 79 274 hPLP1-079 CUUCCAGUAUGUCAUCUAUdTdT 275 hPLP1-079anti AUAGAUGACAUACUGGAAGdTdT 80 276 hPLP1-080 UCUGGUCUCUCUAUUACCAdTdT 277 hPLP1-080anti UGGUAAUAGAGAGACCAGAdTdT 81 278 hPLP1-081 GUCCCAAAGACAUGGGCUUdTdT 279 hPLP1-081anti AAGCCCAUGUCUUUGGGACdTdT

[0064] Затем из клеток экстрагируют РНК, и экспрессию гена PLP1 оценивают методом количественной ПЦР (n=3). Набор SuperPrep Cell Lysis RT для кПЦР (TOYOBO CO., LTD.) используют для получения РНК и синтеза кДНК. Для проведения количественной ПЦР используют зонд Taqman для гена PLP1 (Hs00166914_m1, Applied Biosystems) и гена S18 (Hs99999901_s1, Applied Biosystems). Результаты экспрессии генов нормализуют по гену домашнего хозяйства S18.

[0065] На фиг. 10 показаны результаты. На вертикальной оси фиг. 10 откладывают эффективность нокдауна для клеток U-251MG, к которым был добавлен только раствор для трансфекции. Эффективность нокдауна гена PLP1 рассчитывают как относительные уровни экспрессии, принимая уровень экспрессии в клетках U-251MG, к которым добавлен только раствор для трансфекции, за 1. Выбраны 24 пары последовательностей миРНК, которые снижают уровень экспрессии гена PLP1 до среднего значения 50% или менее в обоих испытаниях (№ 2, 4, 10, 16, 21, 22, 26, 28, 34 , 38). 40, 43, 45, 47, 48, 52, 56, 59, 60, 62, 65, 70, 72 и 80).

[0066] <Пример 8 Оценка эффективности подавления экспрессии (нокдауна) в пересчете на уровень экспрессии гена PLP1 - Часть 5

Последовательность микроРНК конструируют на основе 24 пар последовательностей миРНК, полученных в примере 7 (таблица 2). Среди них выбирают последовательности микроРНК, специфичные для последовательности, кодирующей последовательность человеческого гена PLP1 (SEQ ID NO: 2, 29, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 42 и 51). Среди них SEQ ID NO: 2, 29, 31, 32 и 33 представляют собой последовательности, специфичные для последовательности, общей мышей и для приматов, таких как обыкновенная мартышка.

[0067] Чтобы оценить 10 последовательностей микроРНК, каждую плазмиду, полученную путем клонирования любой из последовательностей ниже промотора CAG, вводят методом трансфекции в клетки HeLa, в которых обеспечивается сверхэкспрессия кодирующих последовательностей человеческого гена PLP1. Экспериментальные детали праймеров, используемых для анализа экспрессии гена PLP1 методом количественной ПЦР, такие же, как в Примере 6. Результат нокдауна показан на фиг. 11. На вертикальной оси фиг. 11 откладывают уровень экспрессии±SD, по отношению к уровню экспрессии, когда добавлен вектор, содержащий miR-neg, где уровень экспрессии PLP1 принимают за 1. Согласно фиг. 11, микроРНК, имеющие любую из последовательностей SEQ ID NO: 2, 29, 30, 31, 32, 35, 36, 42 и 51, вызывают нокаут человеческого гена PLP1.

[0068] <Пример 9. Оценка эффективности подавления экспрессии (нокдауна) в пересчете на уровень экспрессии гена PLP1 - Часть 6>

Каждый из векторов, используемых в примерах 6 и 8, содержащих микроРНК, имеющую нуклеотидную последовательность, описанную в одном из SEQ ID NO: 2, 29, 31, 32 и 35, трансфицируют в клетки U-251MG, которые эндогенно экспрессируют человеческий ген PLP1, и оценивают эффективность подавления экспрессии гена PLP1. Плазмиду, полученную путем клонирования ниже промотора CAG, вводят в клетки методом трансфекции, и методом FACS отбирают только клетки, экспрессирующие GFP. После этого экспрессию гена PLP1 анализируют методом количественной ПЦР. В качестве праймеров используют нуклеотидные последовательности, описанные в SEQ ID NO: 280-283.

[0069] Результаты показаны на фиг. 12. На вертикальной оси фиг. 12 откладывают относительные уровни экспрессии, принимая за 1 уровень экспрессии PLP1, когда добавлен вектор, содержащий miR-neg. Согласно фиг. 12, векторы, содержащие микроРНК с SEQ ID NO: 2, 29, 31, 32 и 35, также оказывают подавляющий эффект на экспрессию эндогенного гена PLP1.

[0070] <Пример 10 Оценка эффективности подавления экспрессии (нокдауна) в пересчете на уровень экспрессии гена PLP1 - Часть 7>

Один микролитр раствора вектора scAAV-AAV1/2, содержащего микроРНК с SEQ ID NO: 2, полученного в примере 9 (титр: 1,2×10¹² вг/мл), вводят в полосатое тело, внутреннюю капсулу и мозжечок каждой из мышей Jcl:B6C3F1 дикого типа возрастом 10 дней (n=3/группу). Используют такой же метод введения, как и в примере 2. После этого, чтобы оценить эффективность нокдауна микроРНК PLP1, экспрессию белка PLP1 в Venus-положительных клетках определяют методом иммуноокрашивания. Метод иммуноокрашивания включает использование в качестве первичного антитела кроличьего поликлонального антитела против PLP1 (Numata Y et al., J Biol Chem. 2013 Mar 15; 288 (11): 7451-66), а в качестве вторичного антитела - флуоресцентное антитело против кроличьих иммуноглобулинов (Thermo Fisher Scientific, USA). Каждый участок мозолистого тела, полосатого тела и внутренней капсулы фотографируют с помощью флуоресцентного микроскопа KEYENCE (KEYENCE CORPORATION, Japan).

[0071] Среднюю интенсивность флуоресценции иммуноокрашенного PLP1 количественно определяют с использованием изображения J 1.45s (Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA), а на фиг. 13 показаны результаты количественного анализа интенсивности флуоресценции методом иммуноокрашивания. На вертикальной оси фиг. 13 откладывают относительные уровни экспрессии PLP1 на инфицированной стороне по сравнению с неинфицированной стороной. Из фиг. 13 можно видеть, что почти нет различия в экспрессии белка PLP1 между стороной, в которую не вводят вектор miR-neg (неинфицированная сторона), и стороной, в которую вводят вектор (инфицированная сторона), тогда как в случае вектора микроРНК PLP1 наблюдается эффект ингибирования экспрессии белка PLP1 на инфицированной стороне, который по сравнению с неинфицированной стороной составляет 40%.

Применение в промышленности

[0072] Промотор по настоящему изобретению и вектор AAV по настоящему изобретению можно использовать в качестве терапевтических средств против PMD, вызванной дупликацией PLP1. Их также можно использовать в качестве терапевтических средств против PMD, вызванной точечной мутацией PLP1. Кроме того, поскольку PLP1 является одним из антигенов-мишеней при рассеянном склерозе, предположительно их можно использовать в качестве терапевтических средств против рассеянного склероза.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии. Представлены: микроРНК, специфичная для гена PLP1, содержащая пару нуклеотидных последовательностей, состоящую из антисмысловой последовательности и смысловой последовательности, вектор, способный подавлять экспрессию гена PLP1, фармацевтическая композиция для лечения заболевания, связанного с аномалией гена PLP1, и ингибитор экспрессии гена PLP1. Также представлены способ лечения заболевания, связанного с аномалией гена PLP1, и способ подавления экспрессии гена PLP1. Изобретение позволяет применять его с целью лечения заболевания, связанного с аномалией гена PLP1, например, такого как болезнь Пелицеуса-Мерцбахера. 6 н. и 13 з.п. ф-лы, 13 ил., 3 табл., 10 пр.

1. МикроРНК, специфичная для гена PLP1, содержащая пару нуклеотидных последовательностей, состоящую из антисмысловой последовательности и смысловой последовательности, где пара нуклеотидных последовательностей выбрана из группы, состоящей из пар антисмысловых последовательностей, показанных в левом столбце таблицы ниже, и смысловых последовательностей, показанных рядом с антисмысловыми последовательностями в правом столбце таблицы ниже:

Антисмысловая последовательность Смысловая последовательность AAAGGAAGAAGAAAGAGGCAG (SEQ ID NO: 52) CTGCCTCTCTTCTTCCTTT (SEQ ID NO: 53) AACACCAGGAGCCACACAACG (SEQ ID NO: 54) CGTTGTGTCTCCTGGTGTT (SEQ ID NO: 55) TTCCATGGGAGAACACCATAC (SEQ ID NO: 56) GTATGGTGCTCCCATGGAA (SEQ ID NO: 57) TGAGCAGGGAAACCAGTGTAG (SEQ ID NO: 58) CTACACTGTTCCCTGCTCA (SEQ ID NO: 59) ACCCCAAAGAAACACAATCCA (SEQ ID NO: 62) TGGATTGTTTCTTTGGGGT (SEQ ID NO: 63) ACAAATGCAGCAATAAACAGG (SEQ ID NO: 64) CCTGTTTAGCTGCATTTGT (SEQ ID NO: 65) AAAGAATGAGCTTGATGTTGG (SEQ ID NO: 68) CCAACATCGCTCATTCTTT (SEQ ID NO: 69) AGAAACACAATCCAGTGGCCA (SEQ ID NO: 72) TGGCCACTATTGTGTTTCT (SEQ ID NO: 73) AAATAGGTCTCAATTAGCTTT (SEQ ID NO: 74) AAAGCTAAGAGACCTATTT (SEQ ID NO: 75) AAGAAACACAATCCAGTGGCC (SEQ ID NO: 76) GGCCACTGTTGTGTTTCTT (SEQ ID NO: 77) TAAACAGGTGGAAGGTCATTT (SEQ ID NO: 78) AAATGACCCCACCTGTTTA (SEQ ID NO: 79) TTAAGGACGGCAAAGTTGTAA (SEQ ID NO: 84) TTACAACTGCCGTCCTTAA (SEQ ID NO: 85) TTTAAGGACGGCAAAGTTGTA (SEQ ID NO: 86) TACAACTTCCGTCCTTAAA (SEQ ID NO: 87) AGTAAATGTACACAGGCACAG (SEQ ID NO: 98) CTGTGCCTGTACATTTACT (SEQ ID NO: 99) AAACCAGTGTAGCTGCAGCCC (SEQ ID NO: 116) GGGCTGCATACACTGGTTT (SEQ ID NO: 117)

2. МикроРНК по п. 1, содержащая нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2-5, 7, 24, 26, 29-32, 35, 36, 42 и 51.

3. МикроРНК по п. 1, где пара нуклеотидных последовательностей выбрана из группы, состоящей из пар антисмысловой последовательности, указанной в левом столбце таблицы ниже, и смысловой последовательности, указанной справа от антисмысловой последовательности в правом столбце таблицы ниже:

Антисмысловая последовательность Смысловая последовательность AAAGGAAGAAGAAAGAGGCAG (SEQ ID NO: 52) CTGCCTCTCTTCTTCCTTT (SEQ ID NO: 53) AGAAACACAATCCAGTGGCCA (SEQ ID NO: 72) TGGCCACTATTGTGTTTCT (SEQ ID NO: 73) AAGAAACACAATCCAGTGGCC (SEQ ID NO: 76) GGCCACTGTTGTGTTTCTT (SEQ ID NO: 77) TAAACAGGTGGAAGGTCATTT (SEQ ID NO: 78) AAATGACCCCACCTGTTTA (SEQ ID NO: 79)

4. МикроРНК по п. 1, содержащая нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 29, 31 и 32.

5. Вектор для подавления экспрессии гена PLP1, содержащий последовательность микроРНК по любому из пп. 1-4, в котором последовательность микроРНК функционально связана с олигодендроцит-специфичным промотором.

6. Вектор по п. 5, где олигодендроцит-специфичный промотор содержит нуклеиновую кислоту, по меньшей мере на 90% идентичную нуклеотидной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 1.

7. Вектор по п. 6, где олигодендроцит-специфичный промотор содержит нуклеиновую кислоту, имеющую нуклеотидную последовательность, описанную в SEQ ID NO: 1.

8. Вектор по любому из пп. 5-7, который представляет собой вектор на основе аденоассоциированного вируса (AAV).

9. Фармацевтическая композиция для лечения заболевания, связанного с аномалией гена PLP1, содержащая вектор по любому из пп. 5-8 и фармацевтически приемлемый дополнительный компонент.

10. Фармацевтическая композиция по п. 9, где заболевание представляет собой болезнь Пелицеуса-Мерцбахера, спастическую параплегию типа 2 или рассеянный склероз.

11. Фармацевтическая композиция по п. 9, где заболевание представляет собой болезнь Пелицеуса-Мерцбахера.

12. Ингибитор экспрессии гена PLP1, подавляющий экспрессию гена PLP1, содержащий вектор по любому из пп. 5-8.

13. Способ лечения заболевания, связанного с аномалией гена PLP1, включающий введение эффективного количества вектора по любому из пп. 5-8 пациенту, нуждающемуся в лечении.

14. Способ по п. 13, где заболевание представляет собой болезнь Пелицеуса-Мерцбахера, спастическую параплегию типа 2 или рассеянный склероз.

15. Способ по п. 13, где заболевание представляет собой болезнь Пелицеуса-Мерцбахера.

16. Способ подавления экспрессии гена PLP1, включающий введение эффективного количества вектора по любому из пп. 5-8 пациенту, нуждающемуся в лечении.

17. Вектор по любому из пп. 5-8 для применения в способе лечения заболевания, связанного с аномалией гена PLP1.

18. Вектор по п. 17, где заболевание представляет собой болезнь Пелицеуса-Мерцбахера, спастическую параплегию типа 2 или рассеянный склероз.

19. Вектор по п. 17, где заболевание представляет собой болезнь Пелицеуса-Мерцбахера.