СПОСОБ СКРИНИНГА ЦЕРЕБРОСУХОЖИЛЬНОГО КСАНТОМАТОЗА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГЛЮКУРОНИДОВ ЖЕЛЧНЫХ СПИРТОВ И СООТНОШЕНИЙ МЕТАБОЛИТОВ Российский патент 2023 года по МПК G01N33/68 G01N30/72 

Область применения изобретения

Описанные в настоящем документе концепции относятся к способам и наборам, связанным со скринингом или диагностикой церебросухожильного ксантоматоза в пробах крови.

Предпосылки создания изобретения

Церебросухожильный ксантоматоз (CTX) представляет собой редкое аутосомно-рецессивное расстройство, вызванное дефицитом 27-стеролгидроксилазы (кодируемой геном CYP27A1), что играет решающую роль в синтезе желчных кислот. CTX у взрослых характеризуется прогрессирующим неврологическим фенотипом. Симптомы во время младенчества и детства включают в себя неонатальный холестаз, хроническую диарею (может быть характерным признаком, проявляющимся клинически вскоре после рождения), двустороннюю катаракту и задержку развития. После десяти или двадцати лет появляются ксантомы сухожилия и нейропсихиатрические симптомы, включая пирамидальные и мозжечковые признаки, периферическую нейропатию и деменцию (1, 2). Метаболический блок в пути синтеза желчных кислот приводит к дефициту первичных желчных кислот, таких как холевая кислота (ХК) и особенно хенодезоксихолевая кислота (ХДХК), в дополнение к накоплению 7α-гидрокси-4-холестен-3-она. 7α-гидрокси-4-холестен-3-он дополнительно превращается в различные метаболиты, включая холестанол и характерные желчные спирты. Холестанол вместе с холестерином накапливается в тканях. Хотя патофизиология CTX по-прежнему плохо изучена, считается, что холестанол вызывает большую часть наблюдаемых патологических изменений. Было показано, что холестанол индуцирует апоптоз нейронных клеток, и считается, что его накопление является причиной наблюдаемой нейродегенерации (3, 4). Развитие симптомов и признаков можно остановить или предотвратить путем добавления ХДХК, что снижает синтез желчных кислот посредством механизма обратной связи и, в результате, приводит к ингибированию холестерин-7α-гидроксилазы, таким образом предотвращая выработку и накопление холестанола (5). Прогноз CTX является хорошим в случае раннего начала терапии, но менее благоприятным при начале лечения в более позднем возрасте (6–9 лет). Раннее начало терапии может полностью предотвратить развитие неврологического фенотипа, и ожидается, что у пациентов будут отсутствовать симптомы, если лечение начинается сразу же после установления диагноза в неонатальном периоде (7, 10). С использованием аллельных частот патогенных вариантов CTX в базе данных ExAC было рассчитано, что частота возникновения CTX в различных этнических группах составляет от 1 : 36072 до 1 : 263222 (11). Это и другие исследования позволяют предположить, что CTX может быть недостаточно диагностирован (11, 12). Все вышеперечисленное указывает на то, что CTX является отличным потенциальным заболеванием для скрининга, особенно у новорожденных. Однако обнаружение новорожденных пациентов с CTX затрудняется отсутствием подходящего способа неонатального скрининга в сухих каплях крови (DBS). DeBarber с соавторами опубликовали потенциальный высокоэффективный способ скрининга CTX у новорожденных, основанный на количественном определении промежуточного соединения кетостерола в DBS с использованием способа ЖХ-ИЭР/МС/МС (13, 14). Потенциальным недостатком является то, что перед анализом необходима стадия дериватизации, осложняющая внедрение неонатального скрининга в существующие программы и увеличивающая затраты.

Целью настоящего изобретения является создание скринингового диагностического теста, который не требует стадии дериватизации и является достаточно чувствительным и специфичным для обнаружения CTX при больших масштабах скрининга.

Изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение основано на неожиданном обнаружении того, что путем определения интенсивности масс-спектральных сигналов глюкуронида желчного спирта и желчной кислоты C24 или С27 или ее конъюгата в биологической пробе, взятой у человека, можно точно определить, страдает ли этот человек от дефицита 27-гидроксилазы (CYP27A1), с использованием способа, который не требует стадии дериватизации. Хотя известно, что глюкурониды желчных спиртов повышены в плазме пациентов CTX (15), концентрации этих метаболитов различаются у разных людей. Более того, концентрации этих метаболитов также отклоняются от нормальных уровней у пациентов, страдающих синдромом Цельвегера, и у пациентов с холестазом. Таким образом, невозможно предсказать, будут ли интенсивности масс-спектральных сигналов информативными в отношении дифференцировки между пациентами с CTX и нормальными контрольными группами или пациентами, страдающими от других заболеваний.

Сначала исследовали, достаточно ли измерения только тетрола для того, чтобы отличить сухие капли крови (DBS) новорожденных (и взрослых) с CTX без проведения лечения от DBS контрольных новорожденных. В продаже отсутствует внутренний стандарт тетрола, меченный стабильным изотопом, и в качестве потенциального внутреннего стандарта исследовали несколько доступных в продаже соединений, а именно ²H₄-т-ХДХК, ²H₄-г-ХДХК, ²H₄-т-ХК, ²H₄-г-ХК и прегнандиола глюкуронид (фиг. 2). Отклик тетрола у большинства пациентов была явно повышен, но не был полностью отделен от доношенных/недоношенных контрольных новорожденных. Как сообщалось ранее, у пациентов с синдромом Цельвегера и пациентов с холестатическим заболеванием печени также наблюдались повышенные концентрации желчных спиртов (16, 17), и в этом эксперименте пациентов с синдромом Цельвегера невозможно было отличить от пациентов с CTX исключительно путем измерения отклика тетрола, независимо от используемого внутреннего стандарта (фиг. 2).

В протокол было добавлено определение концентрации четырех желчных кислот (т-ХК, г-ХК, т-ХДХК, г-ХДХК) и тауринового конъюгата промежуточного соединения желчной кислоты тригидроксихолестаноевой кислоты (т-ТГХК) для выяснения того, позволит ли комбинация глюкуронида желчного спирта и желчной кислоты отличить пациентов с CTX от пациентов с синдромом Цельвегера и пациентов с другими причинами холестатического заболевания печени. На фиг. 3 показано, что эти пять метаболитов можно измерить в DBS с использованием соответствующих внутренних стандартов, меченных стабильным изотопом. Концентрации желчных кислот и т-ТГХК у пациентов с CTX находились на нижней границе контрольного диапазона, и т-ТГХК явно накапливалась у пациентов с синдромом Цельвегера. Другие комбинации с другими конъюгатами первичных желчных кислот показаны на фиг. 4. Можно было дифференцировать пациентов с CTX от контрольных испытуемых на основании соотношения между концентрациями глюкуронида желчных спиртов и конъюгатов желчных кислот C24 или С27.

Таким образом, в изобретении предложен способ диагностики или скрининга дефицита 27-гидроксилазы (CYP27A1), включающий: a) определение интенсивности сигнала в биологической пробе путем масс-спектрометрического анализа по меньшей мере глюкуронида желчного спирта и желчных кислот С24 или С27 или их конъюгата, b) сравнение соотношения интенсивности указанных сигналов с контрольной пробой или контрольным значением и c) определение дефицита 27-гидроксилазы (CYP27A1) на основании указанного сравнения.

Было обнаружено, что тетрол обеспечивает наилучшую дифференцирующую способность при использовании плазмы, крови или сыворотки. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления указанный глюкуронид желчных спиртов содержит холестерантетрола глюкуронид (тетрол).

Предпочтительно указанная желчная кислота C24 или С27 или ее конъюгат выбраны из: холевой кислоты (ХК), таурохолевой кислоты (т-ХК), гликохолевой кислоты (г-ХК), хенодезоксихолевой кислоты (ХДХК), таурохенодезоксихолевой кислоты (т-ХДХК), гликохенодезоксихолевой кислоты (г-ХДХК), тригидроксихолестаноевой кислоты (ТГХК), тауротригидроксихолестаноевой кислоты (т-ТГХК), гликотригидроксихолестаноевой кислоты (г-ТГХК), дигидроксихолестаноевой кислоты (ДГХК), тауродигидроксихолестаноевой кислоты (т-ДГХК) и гликодигидроксихолестаноевой кислоты (г-ДГХК). Преимущество заключается в том, что эти соединения обеспечивают очень хорошую дифференцирующую способность в способе настоящего изобретения.

Предпочтительно определять по меньшей мере интенсивность сигнала первого и второго соединений, причем указанное первое соединение выбрано из:

холевой кислоты (ХК), таурохолевой кислоты (т-ХК), гликохолевой кислоты (г-ХК), хенодезоксихолевой кислоты (ХДХК), таурохенодезоксихолевой кислоты (т-ХДХК) и гликохенодезоксихолевой кислоты (г-ХДХК),

а указанное второе соединение выбрано из:

тригидроксихолестаноевой кислоты (ТГХК), тауротригидроксихолестаноевой кислоты (т-ТГХК), гликотригидроксихолестаноевой кислоты (г-ТГХК), дигидроксихолестаноевой кислоты (ДГХК), тауродигидроксихолестаноевой кислоты (т-ДГХК) и гликодигидроксихолестаноевой кислоты (г-ДГХК). С помощью интенсивности масс-спектральных сигналов указанных первого и указанного соединений определяют по меньшей мере первое соотношение между интенсивностями масс-спектральных сигналов указанного глюкуронида желчного спирта и интенсивностями масс-спектральных сигналов указанного первого соединения и определяют второе соотношение между интенсивностями масс-спектральных сигналов указанного глюкуронида желчного спирта и интенсивностями масс-спектральных сигналов указанного первого соединения. Преимущество использования по меньшей мере двух соотношений состоит в том, что это приводит к меньшему числу ложноположительных результатов.

Наиболее предпочтительными желчными кислотами являются т-ХДХК и т-ТГХК, поскольку они имеют наибольшую дифференцирующую способность при определении в комбинации с тетролом.

Дополнительно было обнаружено, что соотношение т-ТГХК/тетрола имеет высокую специфичность обнаружения CTX по отношению к синдрому Цельвегера и холестатическому заболеванию печени (см. фиг. 1a). Действительно, соотношение т-ТГХК/тетрол позволяло отделить все случаи CTX от трех случаев синдрома Цельвегера и контрольных испытуемых в пилотном исследовании (таблица 2A). Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления способ включает определение соотношения т-ТГХК/тетрол.

Кроме того, было дополнительно обнаружено, что при CTX концентрации тетрола являются высокими, а концентрации т-ХДХК низкими, что приводит к заметному увеличению соотношения тетрол/т-ХДХК в DBS CTX, тогда как ожидается, что это соотношение будет (почти) нормальным у пациентов с синдромом Цельвегера или уменьшится у пациентов с холестатическим заболеванием печени. Это соотношение показало отличную способность к отделению всех DBS CTX от DBS всех контрольных испытуемых (фиг. 1B), включая пациентов с гиперхоланемией и синдромом Цельвегера. Контрольная проба с наибольшим соотношением тетрол/т-ХДХК была в 13,1 раза ниже самого низкого соотношения тетрол/т-ХДХК при CTX. Это указывает на то, что это соотношение является отличным потенциальным биомаркером для обнаружения пациентов с CTX в DBS в рамках скрининга новорожденных. Таким образом, в другом предпочтительном варианте осуществления способ включает определение соотношения тетрол/т-ХДХК.

В предпочтительном варианте осуществления указанное первое и указанное второе соотношения представляют собой соотношения тетрол/т-ХДХК и т-ТГХК/тетрол. Соотношения т-ХДХК/тетрол и тетрол/т-ТГХК считаются эквивалентными и также включены.

Дополнительным преимуществом этих отношений является то, что они являются другими при холестатическом заболевании печени, дополнительно увеличивая специфичность к CTX. На фиг. 1 представлено научное обоснование для двух соотношений (фиг. 1A), а также результаты оценки соотношения метаболитов у доношенных (n = 150) и недоношенных (n = 50) контрольных испытуемых, пациентов с синдромом Цельвегера (n = 3) и пациентов с CTX (n = 14) (фиг. 1B и таблица 2(А)).

При использовании соотношения тетрол/т-ХДХК было достигнута 100% дифференцировка между пациентами с CTX (в сухих каплях крови (DBS) новорожденных и старших пациентов) и контрольными (доношенными/недоношенными) субъектами и пациентами с синдромом Цельвегера. Соотношение т-ТГХК/тетрол позволило отделить DBS CTX от DBS пациентов с синдромом Цельвегера и DBS контрольных испытуемых. Кроме того, гиперхоланемические контрольные пробы были правильно отделены от проб пациентов с CTX с использованием как соотношения тетрол/т-ХДХК (гиперхоланемический диапазон: 0,000–0,018), так и соотношения т-ТГХК/тетрол (гиперхоланемический диапазон: 2,5–311), тем самым увеличивая специфичность к CTX за счет исключения субъектов с гиперхоланемией.

Для исследования точности способа соотношения метаболита (-ов) настоящего изобретения использовали DBS пациента с CTX (P9) с соотношением тетрол/т-ХДХК на нижней границе спектра. В отношении анализа DBS межаналитическая точность соотношения тетрол/т-ХДХК была приемлемой и составляла 14% (0,64 ± 0,09, n = 10). Межаналитическая точность соотношения т-ТГХК/тетрол была выше (63%) из-за низкой концентрации т-ТГХК в пробе CTX, что приводило к низким значениям т-ТГХК/тетрол (0,07 ± 0,04, n = 10), но это изменение было небольшим по сравнению с различием между контрольной группой DBS и DBS CTX, и, следовательно, оно не должно влиять на специфичность способа в отношении CTX. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления способ включает определение соотношения между интенсивностями сигналов тетрола и т-ТГХК в пробах сухой капли крови с помощью масс-спектрометрического анализа.

Предпочтительно указанный масс-спектрометрический анализ включает МС, МС-ИЭР, проточно-инжекционную МС.

В другом предпочтительном варианте осуществления определяют интенсивность соединения, меченного стабильным изотопом, выбранного из тетрола, глюкуронида желчного спирта, желчной кислоты C24 или C27 или ее конъюгата, и при этом указанную интенсивность указанного стабильного изотопа сравнивают с указанной интенсивностью сигнала указанного глюкуронида желчного спирта и указанной желчной кислоты С24 или С27 или ее конъюгата. Преимущество заключается в том, что стабильный изотоп можно использовать для точного количественного определения концентраций указанного глюкуронида желчного спирта и желчной кислоты C24 или С27 или ее конъюгата.

В изобретении дополнительно предложен набор для диагностики или скрининга дефицита 27-гидроксилазы (CYP27A1), содержащий меченный стабильным изотопом тетрол и меченную стабильным изотопом желчную кислоту С24 или С27 или ее конъюгат, выбранные из группы, состоящей из холевой кислоты (ХК), таурохолевой кислоты (т-ХК), гликохолевой кислоты (г-ХК), хенодезоксихолевой кислоты (ХДХК), таурохенодезоксихолевой кислоты (т-ХДХК), гликохенодезоксихолевой кислоты (г-ХДХК), тригидроксихолестаноевой кислоты (ТГХК), тауротригидроксихолестаноевой кислоты (т-ТГХК), гликотригидроксихолестаноевой кислоты (г-ТГХК), дигидроксихолестаноевой кислоты (ДГХК), тауродигидроксихолестаноевой кислоты (т-ДГХК) и гликодигидроксихолестаноевой кислоты (г-ДГХК).

Предпочтительно указанный набор дополнительно содержит положительную контрольную пробу, предпочтительно пробу крови пациента с CTX.

Краткое описание графических материалов

На фиг. 1 показано, что соотношения повышают селективность и специфичность скринингового анализа CTX. (A) Научное обоснование двух выбранных соотношений. Соотношение тетрол/т-ХДХК. При CTX тетрол накапливается, а ХДХК снижается, что приводит к сильному повышению соотношения. При синдроме Цельвегера тетрол повышен, но ХДХК остается на нормальном уровне, что приводит к нормальному или слегка повышенному соотношению, в то время как во время холестаза ХДХК (и ХК) повышена, поддерживая низкое соотношение. Соотношение т-ТГХК/тетрол. При CTX это соотношение значительно снижено, в то время как при синдроме Цельвегера и холестазе — является нормальным или повышено. (B) Соотношения тетрол/т-ХДХК и т-ТГХК/тетрол у доношенных/недоношенных контрольных испытуемых (треугольник), пациентов с синдромом Цельвегера (ромб), новорожденных с CTX и пациентов с CTX без проведения лечения (незаштрихованный/заштрихованный кружок). Соотношение тетрол/т-ХДХК имеет высокую дифференцирующую способность, также в отношении синдрома Цельвегера и CTX. Соотношение т-ТГХК/тетрол также позволяет дифференцировать синдром Цельвегера и CTX.

На фиг. 2 показан отклик тетрола у доношенных/недоношенных контрольных испытуемых (треугольник), пациентов с синдромом Цельвегера (ромб), новорожденных с CTX и пациентов с CTX без проведения лечения (незаштрихованный/заштрихованный кружок), рассчитанный с использованием различных внутренних стандартов: (А) прегнандиола глюкуронид, (B) ²H₄-т-ХК, (C) ²H₄-г-ХК, (D) ²H₄-т-ХДХК и (E) ²H₄-г-ХДХК. Несмотря на явный подъем отклика тетрола для всех используемых внутренних стандартов, разделение контрольных испытуемых и пациентов с CTX было неудовлетворительным. У пациентов с синдромом Цельвегера наблюдался значительно повышенный отклик тетрола, который перекрывался с диапазоном при CTX.

На фиг. 3 показаны концентрации желчной кислоты и промежуточного соединения желчной кислоты т-ТГХК у доношенных/недоношенных контрольных испытуемых (треугольники), пациентов с синдромом Цельвегера (ромб), новорожденных с CTX и пациентов с CTX без проведения лечения (незаштрихованный/заштрихованный кружок), рассчитанные с использованием различных внутренних стандартов: (А) т-ХК, (B) г-ХК, (C) т-ТГХК, (D) т-ХДХК и (E) г-ХДХК. Концентрации желчных кислот и т-ТГХК у пациентов с CTX находились на нижней границе контрольного диапазона. Как и ожидалось, т-ТГХК явно накапливался у пациентов с синдромом Цельвегера.

На фиг. 4 показаны другие исследованные соотношения метаболитов у доношенных/недоношенных контрольных испытуемых (треугольник), пациентов с синдромом Цельвегера (ромб), новорожденных с CTX и пациентов с CTX без проведения лечения (незаштрихованный/заштрихованный кружок): (A) тетрол/т-ХК, (B) тетрол/г-ХК и (C) тетрол/г-ХДХК. Соотношение тетрол/т-ХДХК обладает наилучшей дифференцирующей способностью.

На фиг. 5 показаны общие концентрации желчных кислот у доношенных/недоношенных контрольных испытуемых (треугольник), пациентов с синдромом Цельвегера (ромб), новорожденных с CTX и пациентов с CTX без проведения лечения (незаштрихованный/заштрихованный кружок).

На фиг. 6 показаны 10 000 капель крови, прошедших скрининг посредством анализа CВЭЖХ-МС/МС. Следует отметить логарифмическую шкалу для соотношения тетрол/т-ХДХК, низкие результаты для подвергнутых скринингу пятен крови (•) и положительный контроль от пациента с подтвержденным CTX (X).

Подробное описание

Определения

В контексте настоящего документа термины «диагностика», «диагностировать» и «диагностирование» относятся к попыткам определения или выявления, страдает ли субъект от данного заболевания или состояния или нет. Термин «диагностика» не относится к способности определять наличие или отсутствие конкретного заболевания со 100%-й точностью или даже определять, будет ли данное течение или исход скорее всего иметь место. Вместо этого специалисту в данной области будет понятно, что термин «диагностика» относится к повышенной вероятности наличия у субъекта определенного заболевания. В контексте настоящего документа диагностика также включает способы предварительной диагностики, которые могут быть подтверждены путем диагностики с использованием других известных в данной области способов. Кроме того, предполагается, что способы, описанные в настоящем документе, можно применять для контроля прогрессирования состояния и/или эффективности терапии, используемой для лечения состояния.

Используемый в настоящем документе термин «желчная кислота» включает стероидные кислоты (и/или их карбоксилат-анион) и их соли, присутствующие в желчи животных (например, человека), включая в качестве не имеющего ограничительного характера примера холевую кислоту, холат, дезоксихолевую кислоту, дезоксихолат, гиодезоксихолевую кислоту, гиодезоксихолат, гликохолевую кислоту, гликохолат, таурохолевую кислоту, таурохолат, хенодезоксихолевую кислоту, хенодезоксихолат, литохолевую кислоту, литохолат и т.п.

Термин «первичная» желчная кислота относится к любой из холевой кислоты (3α,7α,12α-тригидрокси-5β-холановая кислота) и хенодезоксихолевой кислоты (3α,7α-дигидрокси-5β-холановая кислота).

Используемый в настоящем документе термин «вторичная желчная кислота» относится к любой из первичных желчных кислот и их конъюгатов, которые были модифицированы бактериями в кишечнике, включая, без ограничений, литохолевую кислоту и дезоксихолевую кислоту.

Используемый в настоящем документе термин «желчная кислота С24» относится к любой первичной и вторичной желчной кислоте и ее конъюгатам, имеющим 24 атома углерода.

Используемый в настоящем документе термин «желчная кислота С27» относится к любому промежуточному соединению желчной кислоты и его конъюгату, имеющему 27 атомов углерода, которые могут быть образованы при синтезе желчной кислоты до и во время пероксисомального бета-окисления.

Термин «конъюгат желчной кислоты» относится к любой первичной желчной кислоте, конъюгированной с аминокислотами глицином и таурином.

Термин «промежуточное соединение желчной кислоты» относится к любому метаболиту между холестерином и первичными желчными кислотами, образованному посредством нормального или патологического метаболизма/синтеза желчной кислоты.

В настоящем документе термин «глюкуронид желчного спирта» относится к конъюгату желчного спирта с глюкуроновой кислотой.

Используемый в настоящем документе термин «тетрол» относится к 5β-холестан-3α,7α,12α,25-тетрола глюкурониду и изомерам глюкуронида холестантетрола. Предпочтительно тетрол представляет собой 5β-холестан-3α,7α,12α,25-тетрола глюкуронид.

Используемый в настоящем документе термин «контрольная проба» относится к биологической пробе или пробам пациента, страдающего от CTX, или другой положительной или отрицательной контрольной пробе для определения интенсивности контрольных сигналов.

Используемый в настоящем документе термин «контрольное значение» относится к предварительно определенной интенсивности сигнала или соотношению указанного по меньшей мере глюкуронида желчного спирта и желчной кислоты C27 или С24 или ее конъюгата и/или заданному пороговому уровню.

Предпочтительно контрольное значение относится к контрольной концентрации указанного глюкуронида желчного спирта и желчной кислоты C27 или C24 или ее конъюгата и/или предварительно заданному уровню интенсивности сигнала или соотношению интенсивности сигналов между по меньшей мере указанным глюкуронидом желчного спирта и желчной кислотой С27 или С24 или ее конъюгатом и/или предварительно заданному пороговому уровню. Контрольное значение может, например, представлять собой эталонную интенсивность сигнала, с которой сравнивают интенсивности сигнала исследуемой пробы, и/или предварительно заданную интенсивность сигнала или сигналов, например в виде числового значения и/или диапазона (например, контрольного диапазона), соответствующие уровням интенсивности сигнала в такой пробе или пробах. Например, как показано в настоящем документе, контрольные пробы с известным диагнозом (например, от пациентов, страдающих дефицитом CYP27A1, синдромом Цельвегера, холестазом или от здоровых контрольных испытуемых) можно использовать для определения порогового уровня, выход за пределы которого будет расцениваться как наличие у субъекта дефицита CYP27A1. Затем исследуемые пробы сравнивают с предварительно заданным значением, определенным с использованием контрольных проб. Контрольное значение может представлять собой среднее, медианное или расчетное пороговое значение интенсивности (например, предельно допустимое значение) для указанного глюкуронида желчного спирта и желчной кислоты C27 или С24 или ее конъюгата и/или их комбинацию (например, соотношение, сумму), выход за пределы которого будет расцениваться как наличие или отсутствие у субъекта определенного состояния, например дефицита CYP27A1.

В одном варианте осуществления контрольное значение может представлять собой соотношение интенсивностей указанного глюкуронида желчного спирта и желчной кислоты C27 или С24 или ее конъюгата и интенсивности масс-спектрального сигнала одного или более внутренних маркеров стандартизации в контрольной пробе. Контрольное соотношение сравнивают с соответствующим соотношением, определенным для пробы.

Используемый в настоящем документе термин «соотношение» относится к математической взаимосвязи между двумя количествами. Например, соотношение количеств А и B представляет собой частное от деления значения А на значение В или от деления значения В на значение А. В настоящем документе соотношения A/B и B/A могут использоваться взаимозаменяемо. Таким образом, если в настоящем документе указано, что определено соотношение между интенсивностями масс-спектральных сигналов желчной кислоты C24 и С27 или ее конъюгата, указанное соотношение содержит интенсивность масс-спектрального сигнала указанной желчной кислоты C24, деленную на интенсивность масс-спектрального сигнала указанной желчной кислоты C27, и интенсивность масс-спектрального сигнала указанной желчной кислоты C27, деленную на интенсивность масс-спектрального сигнала указанной желчной кислоты С24.

Варианты осуществления

На основе интенсивностей масс-спектральных сигналов накапливающегося холестантетрола глюкуронида (тетрола) и определенных желчных кислот / промежуточных соединений желчных кислот был разработан новый скрининговый анализ на CTX в DBS, который подходит для скрининга новорожденных. С помощью настоящего анализа было достигнуто хорошее разделение между DBS пациентов с CTX и DBS контрольных испытуемых, пациентов с синдромом Цельвегера и новорожденных с (потенциальным) холестазом. Первоначально измеряли только тетрол у пациентов с CTX без проведения лечения. Однако, несмотря на довольно неплохое разделение между средним откликом у контрольных испытуемых и пациентов с CTX, наблюдали перекрытие между откликами пациентов и контрольных групп (см. фиг. 2). Кроме того, другие расстройства, такие как синдром Цельвегера (16) и холестатическое заболевание печени (17), также приводят к накоплению тетрола или подобных глюкуронидов изобарного стероидного спирта, что также происходило в трех DBS с синдромом Цельвегера, в которых были обнаружены повышенные концентрации тетрола. Таким образом, поскольку данный способ не обладает чувствительностью и недостаточно специфичен для обнаружения только пациентов с CTX, количественное определение только тетрола не подходит в качестве неонатального скринингового анализа на CTX.

Было обнаружено, что комбинация измерений масс-спектра глюкуронида желчных спиртов и желчной кислоты C24 или С27 или ее конъюгата обеспечивала хорошие чувствительность и специфичность.

Таким образом, в настоящем изобретении предложен способ диагностики или скрининга дефицита 27-гидроксилазы (CYP27A1) у животного, включающий:

a) определение интенсивности сигнала в биологической пробе путем масс-спектрометрического анализа по меньшей мере глюкуронида желчного спирта и желчной кислоты C27 или C24 или ее конъюгата,

b) определение соотношения между указанным глюкуронидом желчного спирта и указанной желчной кислотой С24 или С27 или ее конъюгатом,

c) сравнение указанного соотношения с соотношением контрольной пробы или контрольным значением,

d) определение дефицита 27-гидроксилазы (CYP27A1) на основании указанного сравнения.

Этот способ подходит для диагностики или скрининга животных, в частности млекопитающих, и предпочтительно его использование для людей. Предпочтительные варианты осуществления, как описано в настоящем документе, включают способы диагностики или скрининга новорожденных. Однако способы, описанные в настоящем документе, в равной степени применимы для других популяций и типов скрининга/диагностики, например для детей в возрасте 1–3 лет и взрослых.

Настоящие концепции предлагают способы определения относительной концентрации аналитов, выбранных из глюкуронидов желчных спиртов и желчных кислот C24 или С27 или их конъюгата, в одной или более пробах и предлагают способы, с помощью которых можно определить относительную или абсолютную концентрацию, используя масс-спектрометрию.

Предпочтительно применяют соотношения между интенсивностями масс-спектральных сигналов глюкуронидов желчных спиртов и желчных кислот C24 или С27 и их конъюгатов, более предпочтительно между интенсивностями масс-спектральных сигналов желчной кислоты и т-ХДХК и тетрола и промежуточного соединения т-ТГХК и тетрола. В альтернативном варианте осуществления можно провести поиск справочной таблицы результатов и использовать ее в качестве входных данных для формулы, которая включает другие параметры, например плазменный холестанол, или системы оценки клинических данных.

В способе настоящего изобретения можно использовать любую биологическую пробу, которая содержит метаболиты синтеза желчной кислоты. Например, подходящими являются моча и другие биологические жидкости. Предпочтительно, чтобы указанная биологическая проба представляла собой кровь, сыворотку или плазму. В частности, предпочтительно использовать сухие капли крови (DBS), так как эти пробы часто используют в скрининговых анализах новорожденных.

Наиболее подходящая биологическая проба содержит кружок DBS диаметром четверть дюйма (6,4 мм) (или для большинства DBS с CTX два кружка DBS диаметром одна восьмая дюйма, каждый из которых содержит половину материала, находящегося в DBS диаметром четверть дюйма), в то время как большинство лабораторий неонатального скрининга отдают предпочтение кружку DBS диаметром одна восьмая дюйма (3,2 мм). Современные трехквадрупольные тандемные масс-спектрометры легко обнаружат три метаболита, используемых в настоящем анализе, в полученном с помощью перфоратора кружке DBS диаметром одна восьмая дюйма. Кроме того, настоящее изобретение также показывает, что лаборатории с более старыми аппаратами все же могут проводить скрининг CTX с помощью настоящего способа при использовании кружка DBS диаметром четверть дюйма (или двух DBS диаметром одна восьмая дюйма).

В предпочтительном варианте осуществления указанная биологическая проба представляет собой DBS размером не более 1/4 дюйма, 1/8 дюйма.

Биологическую пробу можно подвергать хроматографическому разделению, например, с помощью ЖХ, такой как ВЭЖХ, с последующим масс-спектрометрическим анализом.

Способ также может включать стадию экстракции аналита путем экстракции жидкость-жидкость, экстракции твердое вещество-жидкость или осаждения белка с использованием гидрофобных растворителей, таких как метанол, перед стадией масс-спектрометрического анализа.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления масс-спектрометр можно использовать в тандемном МС-режиме с мониторингом множественных реакций (MRM) для обнаружения переходов аналитов, таких как предпочтительно, но без ограничений данными вариантами, глюкурониды желчных спиртов и желчные кислоты C24 или С27 или их конъюгат, перечисленные в таблице 2. В этих вариантах осуществления и в других предпочтительных вариантах осуществления для расчета концентрации или относительного содержания этих метаболитов предпочтительно применяют внутренний стандарт, меченный стабильным изотопом, соответствующий немеченому иону.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления используют масс-спектрометр с высоким разрешением, который позволяет измерять точную массу в режиме полного сканирования для непосредственного определения относительного содержания требуемых ионов с точной массой. В ходе анализа для обнаружения метаболитов желчных кислот можно использовать точные массы ионов, перечисленных в таблице 3, но не следует ограничиваться ими. В этих вариантах осуществления и в других предпочтительных вариантах осуществления для расчета концентрации или относительного содержания этих метаболитов предпочтительно применяют внутренний стандарт, меченный стабильным изотопом, соответствующий немеченому иону.

В предпочтительном варианте осуществления относительное содержание каждого перехода (или, в случае масс-спектрометра с высокой разрешающей способностью, точный масс-спектр) во время элюирования/инфузии пробы может быть усреднено с последующей коррекцией на фоновый сигнал путем вычитания средней интенсивности до или после элюирования/инфузии пробы. Это позволяет получить интенсивность/ относительное содержание выбранных аналитов.

Затем интенсивность/относительное содержание аналитов можно использовать для расчета соотношений метаболитов. В этих вариантах осуществления и в других предпочтительных вариантах осуществления при использовании специальных (меченных стабильным изотопом) внутренних стандартов эти внутренние стандарты можно использовать для коррекции на эффекты матрицы, после чего полученный отклик можно использовать для расчетов метаболитов.

В предпочтительных вариантах осуществления энергию столкновения фрагмента выбирают так, чтобы она находилась в диапазоне 35–60 эВ.

В предпочтительном варианте осуществления используют проточно-инжекционную масс-спектрометрию (FIA). Преимущество этого метода заключается в том, что оборудование FIA относится к стандартному оборудованию для скрининга новорожденных.

Количественное определение может быть выполнено путем относительного или абсолютного измерения сигнала, полученного от одного или более аналитов и стандартов. Отрицательный заряд может быть сообщен аналиту, который функционирует в качестве фрагментного иона, обнаруживаемого с помощью масс-спектрометрии.

В предпочтительном варианте осуществления к пробе, содержащей аналит, добавляют раствор внутреннего стандарта. Предпочтительно, чтобы указанный раствор содержал одно или более из прегнандиола глюкуронида, меченного стабильным изотопом (¹³C, ²H и т.п.) тетрола глюкуронида, ²H₄-т-ХДХК, ²H₄-г-ХК, ²H₄-г-ХДХК, предпочтительно растворенных в метаноле.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления в качестве способа анализа и оценки состояния рабочего процесса используют «мониторинг перехода от родительского к дочернему иону» или PDITM. PDITM относится к методике, в соответствии с которой переданный диапазон отношения массы к заряду (m/z) первого масс-сепаратора (часто называемого «МС» или первым уровнем масс-спектрометрии) специально выбирают для передачи молекулярного иона (часто называемого «родительским ионом» или «ионом-предшественником») на фрагментор ионов (например, столкновительная ячейка, область фотодиссоциации и т.д.) для получения фрагментных ионов (часто называемых «дочерними ионами»), а переданный диапазон m/z второго масс-сепаратора (часто называемого «МС/МС» или вторым уровнем масс-спектрометрии) выбирают для передачи одного или более дочерних ионов на детектор, который измеряет сигнал дочернего иона. Эта методика обладает уникальными преимуществами, если обнаружение дочерних ионов в спектре сфокусировано путем «закрепления» детектора на предполагаемой массе дочернего иона. Комбинация отслеживаемых масс родительского иона и дочернего иона называется мониторингом «перехода от родительского к дочернему иону». Сигнал дочернего иона на детекторе для данной комбинации родительского иона и дочернего иона называется «сигналом перехода от родительского к дочернему иону». Комбинации родительского иона и дочернего иона, используемые в способе, описанном в настоящем документе, приведены в таблице 2.

В одном варианте осуществления мониторинг перехода от родительского к дочернему иону представляет собой мониторинг множественных реакций (MRM) (также называемый селективным мониторингом реакции). В различных вариантах осуществления MRM наблюдение за данным переходом от родительского к дочернему иону включает использование первого масс-сепаратора (например, первого квадруполя, закрепленного на интересующем m/z родительского иона) для передачи интересующего родительского иона и использование второго масс-сепаратора (например, второго квадруполя, закрепленного на интересующем m/z родительского иона) для передачи одного или более интересующих дочерних ионов. В различных вариантах осуществления PDITM можно выполнить с применением первого масс-сепаратора (например, квадруполя, закрепленного на отношении m/z родительского иона) для передачи родительских ионов и сканирования второго масс-сепаратора в диапазоне m/z, включающем значение m/z одного или более интересующих дочерних ионов.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления для выполнения PDITM, например MRM, используется тандемный масс-спектрометр (МС/МС) или, в более широком смысле, многомерный масс-спектрометр. Примеры подходящих масс-анализаторных систем включают, без ограничений, системы, которые содержат один или более из тройного квадруполя, квадрупольной линейной ионной ловушки, квадрупольного времяпролетного (TOF) детектора и детектора TOF-TOF, ионной ловушки, орбитрэпа, квадрупольной ионной ловушки, квадрупольного орбитрэпа.

В одном варианте осуществления используют стадию, на которой по меньшей мере часть комбинированной пробы подвергают PDITM, и эта стадия включает введение комбинированной пробы непосредственно в систему масс-анализатора, например, посредством введения комбинированной пробы в подходящий раствор с использованием источника ионизации электрораспылением (ИЭР) или источника ионизации при атмосферном давлении (APCI).

В соответствии с различными предпочтительными вариантами осуществления пробы, содержащие одно или более соединений, перед анализом могут быть обогащены различными способами. Способ обогащения может зависеть от типа пробы, например кровь (свежая или высушенная), плазма, сыворотка и т.п. Примеры способов обогащения могут включать, без ограничений, осаждение белка, экстракцию жидкость-жидкость, экстракцию твердое вещество-жидкость и ультрафильтрацию. Можно использовать и другие способы обогащения или комбинацию двух или более способов обогащения.

Обработка пробы в настоящем способе не вызывает затруднений, так как не требуется дериватизация, а поскольку используется стандартное экстрагирование метанолом, анализ можно соответствующим образом комбинировать с другими скрининговыми анализами новорожденных. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления указанный способ комбинируют с другими скрининговыми анализами новорожденных. Для измерения предпочтительно используют проточную инъекцию, поскольку для одного анализа требуется всего несколько минут.

Предпочтительно способ включает стадию измерения специфических переходов для холестантетрола глюкуронида, таурохенодезоксихолевой кислоты (т-ХДХК) и тауротригидроксихолестаноевой кислоты (т-ТГХК).

В изобретении дополнительно предложен набор для диагностики или скрининга дефицита 27-гидроксилазы (CYP27A1), содержащий меченный стабильным изотопом тетрол и меченную стабильным изотопом желчную кислоту С24 или С27 или ее конъюгат, выбранные из группы, состоящей из холевой кислоты (ХК), таурохолевой кислоты (т-ХК), гликохолевой кислоты (г-ХК), хенодезоксихолевой кислоты (ХДХК), таурохенодезоксихолевой кислоты (т-ХДХК), гликохенодезоксихолевой кислоты (г-ХДХК), тригидроксихолестаноевой кислоты (ТГХК), тауротригидроксихолестаноевой кислоты (т-ТГХК), гликотригидроксихолестаноевой кислоты (г-ТГХК), дигидроксихолестаноевой кислоты (ДГХК), тауродигидроксихолестаноевой кислоты (т-ДГХК) и гликодигидроксихолестаноевой кислоты (г-ДГХК). Специалист в данной области знает, как синтезировать меченную стабильным изотопом желчную кислоту. Способы синтеза тетрола известны в данной области (19).

Предпочтительно набор дополнительно содержит положительную контрольную пробу, предпочтительно пробу крови пациента с CTX.

В дополнительном аспекте лиц с диагностированным дефицитом 27-гидроксилазы (CYP27A1), предпочтительно в неонатальном периоде, можно эффективно лечить с применением способа настоящего изобретения пероральным введением пищевой добавки хенодезоксихолевой кислоты (ХДХК), таким образом предотвращая развитие каких-либо симптомов, связанных с церебросухожильным ксантоматозом (CTX, дефицит 27-гидроксилазы (CYP27A1)). В предпочтительном варианте осуществления пищевую добавку ХДХК вводят в количестве 5 мг/кг/день, разделенном на три равные дозы. В другом предпочтительном варианте осуществления пищевую добавку ХДХК вводят в количестве 15 мг/кг/день, разделенном на три равные дозы. Этот режим является предпочтительным для детей. В другом предпочтительном варианте осуществления пищевую добавку ХДХК вводят в количестве 250 мг три раза в день. Этот режим является предпочтительным для взрослых пациентов.

Хотя в описании выше приведены примеры и конкретная информация о различных вариантах осуществления, следует понимать, что некоторые признаки и/или функции описанных вариантов осуществления могут быть модифицированы без отклонения от объема описанных вариантов осуществления. Приведенное выше описание предназначено для иллюстрации концепций, изложенных в настоящем документе, объем которых ограничен только текстом формулы изобретения, приложенной к настоящему документу.

Пример

Пробы пациентов и контрольные пробы

Анонимизированные DBS от 150 доношенных (средний гестационный возраст (диапазон): 39,9 (37,0–42,0) недель) и 50 недоношенных новорожденных (средний гестационный возраст (диапазон): 34,5 (26,7–36,9) недель) были получены из биобанка голландской программы скрининга новорожденных (Голландский национальный институт общественного здравоохранения и окружающей среды, г. Билтовен, Нидерланды). Все родители предоставили информированное согласие на анонимное использование DBS с карты Гутри своего ребенка во время сбора (стандартная процедура в голландской программе скрининга новорожденных; все карты скрининга новорожденных Гутри в Нидерландах хранятся в течение пяти лет, после чего их уничтожают). Пятнадцать DBS, включая 2 свежих DBS новорожденных, были собраны у 14 отдельных пациентов с CTX без проведения лечения. В их число входили DBS, полученные от участников, включенных в исследования, одобренные Экспертным советом организации, в Орегонском медицинском университете. Участники предоставили письменное информированное согласие на использование DBS. Деидентифицированные диагностические пробы, переданные в лабораторию стеролов для биохимического подтверждения CTX, также использовали с разрешения Экспертного совета организации. В таблице 1 перечислена все необходимая информация относительно пациентов с CTX и их DBS. Все пациенты или их родители / законные представители предоставили письменное информированное согласие на использование своих DBS / DBS своих детей. Три анонимизированных DBS от пациентов с синдромом Цельвегера были получены из биобанка в Академическом медицинском центре (г. Амстердам).

Материалы

Растворители: метанол и ацетонитрил были приобретены у компании Biosolve. ²H₄-г-ХДХК, ²H₄-г-ХК, ²H₄-т-ХДХК и ²H₄-т-ХК были приобретены у компании CDN Isotopes. H₂O представляла собой очищенную воду MilliQ®. Глюкуронид 5β-прегнан-3α,20α-диола (прегнандиола глюкуронид) был приобретен у компании Sigma-Aldrich, а фильтровальная бумага Whatman 903 — у компании Drukkerij PAL.

Получение пробы

Полученный путем перфорации кружок (диаметр четверть дюйма (6,4 мм)) DBS использовали для всех проб, кроме DBS с CTX под номерами 1–8, 12 и 13, для которых использовали две DBS диаметром 3,2 мм (в этих случаях результат корректировали путем умножения результата на два). DBS переносили в пробирку объемом 1,5 мл, в которую добавляли 500 мкл метанола и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре в ультразвуковой ванне (Branson 3510). Фильтровальную бумагу удаляли, а экстрагент переносили в стеклянную пробирку объемом 4 мл с последующим добавлением 20 мкл смеси внутреннего стандарта [1 мкМ прегнандиола глюкуронида, 0,25 мкМ ²H₄-т-ХК, 0,25 мкМ ²H₄-т-ХДХК, 0,25 мкМ ²H₄-г-ХК, 0,25 мкМ ²H₄-г-ХДХК, растворенного в смеси метанол/H₂O (3 : 1 об./об.)]. Внутренний стандартный раствор намеренно не добавляли во время стадии обработки ультразвуком, поскольку этот раствор содержит воду, которая экстрагирует нежелательные соли / создающие помехи соединения, которые оказывают влияние на МС измерение. После перемешивания в вихревом смесителе пробу доводили до сухого состояния в потоке азота при 40°C. Остаток разводили в 120 мкл метанола/H₂O (3 : 1 об./об.), переносили во флакон для пробы и закрывали крышкой.

Проточно-инжекционная МС/МС

В тандемный масс-спектрометр (МС/МС) Waters Premier-XE (Waters Cooperation), работающий в режиме ионизации электрораспылением вводили 10 мкл с использованием ацетонитрила/H₂O (9 : 1, об./об.) в качестве подвижной фазы. В качестве распыляющего и десольватирующего газа использовали азот. Газ для столкновений представлял собой аргон, а давление в ячейке составляло 2,7 * 10^-3 мбар. Температуру источника устанавливали на уровне 120°C, а напряжение в капилляре поддерживали на уровне 2,5 кВ. Детектор использовали в тандемном режиме МС с функцией мониторинга множественных реакций для обнаружения перехода конкретного иона-предшественника к фрагментному иону для каждого аналита. Переходы, напряжения на конусе и энергии столкновения, установленные для каждого соединения, приведены в таблице 2. Время аналитического исследования (от инъекции до инъекции) составляло 2 минуты. Количественное определение проводили с использованием ПО Masslynx 4.2 и NeoLynx™. Программа NeoLynx объединяла и усредняла отдельные интенсивности перехода при MRM в пределах проточно-инжекционного профиля, а затем выполняла коррекцию на фоновый сигнал путем вычитания средней интенсивности перед инфузией пробы. Полученные значения высоты пика измеренных соединений экспортировали для дальнейших расчетов в MS Excel (Microsoft).

Таблица 1. Информация о DBS и пациентах с CTX

DBS Пациент^a Возраст DBS (лет) Условия хранения Возраст пациента при отборе проб (лет) Холеста-нол в плазме (мг/дл) Холеста-нол в плазме (мкМ) Диаг-ноз^b Фенотип на момент постановки диагноза 1 P1 0,5 9 1,62 42 G/B Неизвестен 2 P2 0,5 12 2,57 66 G/B Неизвестен 3 P3 4 17 1,84 47 B Желтуха новорожденного, хроническая диарея, ксантомы 4 P4 9 16 3,23 83 G/B Ювенильная катаракта, задержка в развитии, аутистическое поведение, нарушение когнитивных функций 5 P5 4 31 1,65 42 G/B Ксантомы, спастическая походка, парапарез 6 P6 0,17 45 3,44 88 B Снижение когнитивных функций, психическое расстройство, деменция 7 P7 0,17 46 4,79 123 B Депрессия, парапарез, мозжечковая атаксия, дистония 8 P8 7,5 36 4,52 116 G/B Катаракта, ксантома, судорожные приступы, хроническая диарея 9 P9 0,5 6,2 1,52 39 G Задержка развития речи, измененный режим дефекации 10 P10 0,1 9 2,06 53 B Катаракты 11 P11 0,5 11 4,52 116 G Катаракты, задержка развития, аутистическое поведение, измененный режим дефекации 12 P12 6 56 0,84 22 G/B Катаракты, ксантомы 13 NB1 16 Неизвест-ны, пос-ледние 8 лет хра-нили при 0,01 – – G/B Ювенильные катаракты, ксантомы, хроническая диарея 14 NB2 4 0,01 0,86 22 G Отсутствует, см. (10)

^aNB: свежая DBS, полученная при скрининге новорожденного

^bG: генетический, B: биохимический

Таблица 2. Переходы, напряжения на конусе и энергии столкновения для измеренных соединений

Соединение MRM
(m/z) Напряжение на конусе (В) Энергия столкновения
(эВ) т-ХДХК 498→80 90 60 ²H₄-т-ХДХК 502→80 90 60 т-ХК 514→80 90 60 ²H₄-т-ХК 518→80 90 60 т-ТГХК 556→80 90 60 г-ХДХК 448→74 60 40 ²H₄-г-ХДХК 452→74 60→ 40 г-ХК 464→74 60 40 ²H₄-г-ХК 468→74 60 40 Прегнандиола глюкуронид 495→75 45 35 Холестантетрола глюкуронид 611→75 80 48

Таблица 2(A). Таблица индивидуальных соотношений тетрол/т-ХДХК и т-ТГХК/тетрол для пациентов с CTX и диапазоны для контрольных испытуемых (доношенных/недоношенных) и пациентов с синдромом Цельвегера

DBS Пациент Тетрол/т-ХДХК т-ТГХК/тетрол 1 P1 5 0,028 2 P2 12 0,035 3 P3 233 0,004 4 P4 702 0,003 5 P5 328 0,001 6 P6 866 0,005 7 P7 101 0,001 8 P8 94 0,002 9 P9 0,8 0,048 10 P10 18 0,018 11 P11 21 0,026 12 P12 25 0,023 13 NB1 22 0,047 14 NB2 138 0,004 Доношенные (диапазон) 0,000–0,057 0,19–250 Недоношенные (диапазон) 0,000–0,061 0,09–377 Синдром Цельвегера (диапазон) 0,023–0,101 10,5–38,0

Таблица 3. Обзор выбранных (точных) масс желчных кислот, желчных спиртов и промежуточных соединений желчных кислот

Номи-нальная масса Точная масса Название соединения 375 375,2905 3β-гидрокси-5-холановая кислота (литохолевая кислота) 389 389,2697 дигидроксихоленовая кислота 391 391,2885 дигидроксихолановые кислоты (например, хенодезоксихолевая кислота) 405 405,2646 тригидроксихоленовые кислоты, 3β,7α,12α-тригидрокси-5-холеновая кислота 407 407,2803 тригидроксихолановые кислоты (например, холевая кислота) 431 431,3169 3β,7α-дигидроксихолестеновая кислота 432 432,3119 3β-гидрокси-5-холановая кислота (литохолевая кислота) глицин 433 433,3323 дигидроксихолестановая кислота (например, ДГХК) 444 444,2755 7α-гидрокси-3-оксо-4-холеновая кислота глицин 446 446,2912 3β,7α-дигидрокси-5-холеновая кислота глицин 447 447,3116 3β,7α,12α-тригидроксихолестеновая кислота 448 448,3069 дигидроксихолановые кислоты (например, хенодезоксихолевая кислота, дезоксихолевая кислота) глицин 449 449,3273 тригидроксихолестановая кислота (например, ТГХК) 453 453,2316 3β-гидрокси-5-холеновая кислота сульфат 460 460,2705 7α,12α-дигидрокси-3-оксо-4-холеновая кислота глицин 462 462,2861 3β,7α,12α-тригидрокси-5-холеновая кислота глицин 464 464,3018 тригидроксихолановые кислоты глицин (например, холевая кислота) 465 465,3222 тетрагидроксихолестановая кислота (например, OH-ТГХК, варановая кислота) 465 465,3044 холестерин сульфат 469 469,2265 3β,7α-дигидрокси-5-холеновая кислота сульфат 471 471,2422 дигидроксихолановая кислота сульфат 472 472,3432 3β-гидрокси-5-холестановая кислота глицин 480 480,2789 3β-гидрокси-5-холеновая кислота таурин 480 480,2967 тетрагидроксихолановые кислоты глицин 482 482,2946 3β-гидрокси-5-холановая кислота (литохолевая кислота) таурин 485 485,2215 3β,7α,12α-тригидрокси-5-холеновая кислота сульфат 487 487,2371 тригидроксихолановая кислота сульфат 488 488,3381 3β,7α-дигидроксихолестеновая кислота глицин 490 490,3538 дигидроксихолестановая кислота (например, ДГХК) глицин 494 494,2582 7α-гидрокси-3-оксо-4-холеновая кислота таурин 498 498,2895 дигидроксихолановые кислоты (хенодезоксихолевая кислота) таурин 506 506,3487 тригидроксихолестановая кислота (например, ТГХК) глицин 507 507,3327 C₂₉-дикарбоновая кислота 510 510,2531 7α,12α-дигидрокси-3-оксо-4-холеновая кислота таурин 510 510,2531 3β-гидрокси-5-холеновая кислота глицин и сульфат 514 514,2844 тригидроксихолановые кислоты (холевая кислота) таурин 522 522,3259 3β-гидрокси-5-холестановая кислота таурин 526 526,2480 3β,7α-дигидрокси-5-холеновая кислота глицин и сульфат 528 528,2637 дигидроксихолановые кислоты (например, хенодезоксихолевая кислота) глицин и сульфат 530 530,2793 тетрагидроксихолановые кислоты таурин 540 540,3364 дигидроксихолестановая кислота (например, ДГХК) таурин 542 542,2429 3β,7α,12α-тригидрокси-5-холеновая кислота глицин и сульфат 552 552,3000 7α,12α-дигидрокси-3-оксо-4-холестановая кислота таурин 554 554,3157 тригидроксихолестеновая кислота (например, ТГХК:1) таурин 556 556,3313 тригидроксихолестановая кислота (например, ТГХК) таурин 567 567,3175 дигидроксихолановые кислоты глюкуронид 570 570,3106 тетрагидроксихолестеновые кислоты (например, OH-ТГХК:1) таурин 572 572,3263 тетрагидроксихолестановые кислоты (например, OH-ТГХК) таурин 583 583,3124 тригидроксихолановые кислоты глюкуронид 586 586,3055 пентагидроксихолестеновые кислоты (например, диOH-ТГХК:1) таурин 588 588,3212 пентагидроксихолестановая кислота таурин 609 609,3644 5β-холестантриол-?-она глюкуронид, 5β-холестентетрола глюкуронид 611 611,3801 5β-холестантетрола глюкуронид 611 611,3437 тетрагидрокси-27-нор-5β-холестан-24-она глюкуронид 613 613,3593 27-нор-5β-холестанпентола глюкуронид 625 625,3593 тетрагидрокси-5β-холестан-?-она глюкуронид, 5β-холестенпентола глюкуронид 627 627,3750 5β-холестанпентола глюкуронид 627 627,3386 пентагидрокси-27-нор-5β-холестан-24-она глюкуронид 629 629,3543 27-нор-5β-холестангексола глюкуронид 641 641,3543 5β-холестанпентол-?-она глюкуронид, 5β-холестенгексола глюкуронид 643 643,3699 5β-холестангексола глюкуронид 643 643,3335 гексагидрокси-27-нор-5β-холестан-24-она глюкуронид 645 645,3492 27-нор-5β-холестангептола глюкуронид 651 651,3862 дигидроксихолановая кислота глицин и N-ацетилглюкозамин 659 659,3648 5β-холестангептола глюкуронид 701 701,3689 дигидроксихолановая кислота таурин и N-ацетилглюкозамин

Пример 2

С помощью СВЭЖХ-МС/МС определяли соотношения тетрол/т-ХДХК и т-ТГХК/тетрол в приблизительно 10 000 каплях крови новорожденных. Отсутствовали положительные и, следовательно, ложноположительные реакции. Пороговый уровень был основан на 5 пациентах с подтвержденным CTX. Результаты показаны на фиг. 6.

Пример 3

Проводили пилотное исследование с использованием проточно-инжекционного МС-анализа, который также используется для стандартного скрининга новорожденных. Официальная лаборатория скрининга новорожденных в Академическом медицинском центре (Academisch Medisch Centrum) провела стандартное извлечение кружков диаметром 1/8 дюйма с использованием применяемого в настоящее время набора Neobase II из кровяных капель 10 пациентов с CTX (включая 2 свежих проб, полученных при скрининге новорожденных), 3 пациентов с синдромом Цельвегера и 200 контрольных испытуемых (150 доношенных и 50 недоношенных младенцев) (см. таблицу ниже). Анализ извлеченных проб выполняли в лаборатории генетических метаболических заболеваний на 11-летнем масс-спектрометре Premier-XE (Waters), который технически был менее совершенным по сравнению с используемыми в настоящее время масс-спектрометрами в современных лабораториях скрининга новорожденных. Это означает, что этот метод, безусловно, можно использовать с текущей системой неонатального скрининга. Для анализа использовали стандартный проточно-инжекционный анализ и программное обеспечение Neolynx для расчета относительного содержания т-ТГХК (m/z 556,2), тетролглюкуронида (m/z 611,3) и т-ХДХК (m/z 498,2) с последующим расчетом соотношений. Результаты очень ясны, соотношения тетрол/т-ХДХК и т-ТГХК/тетрол позволяют четко идентифицировать пациентов с CTX без перекрытия с контрольными испытуемыми (доношенными и недоношенными). Совмещение этих двух соотношений позволяет однозначно выявить пробы CTX и избежать возможных ложноположительных результатов (у пациентов с синдромом Цельвегера может быть повышен тетролглюкуронид).

Проба т-ТГХК/тетрол Тетрол/т-ХДХК Свежая карточка неонатального скрининга CTX 0,001 1919,00 Свежая карточка неонатального скрининга CTX 0,001 121,45 CTX 0,003 351,00 CTX 0,003 332,00 CTX 0,003 63,00 CTX 0,003 62,40 CTX 0,004 264,00 CTX 0,005 2,92 CTX 0,007 2,31 CTX 0,032 3,00 Синдром Цельвегера 1 4,5 0,33 Синдром Цельвегера 2 15,3 0,09 Синдром Цельвегера 3 17,2 0,08 Доношенные (N = 150) 0,059–134 0–1,0 Недоношенные (N = 50) 0,080–124 0–0,21

Ссылки

1. Pierre, G., K. Setchell, J. Blyth, M. A. Preece, A. Chakrapani, and P. McKiernan. 2008. Prospective treatment of cerebrotendinous xanthomatosis with cholic acid therapy. J. Inherit. Metab. Dis. 31.

2. Verrips, A., L. H. Hoefsloot, G. C. Steenbergen, J. P. Theelen, R. A. Wevers, F. J. Gabreëls, B. G. van Engelen, and L. P. van den Heuvel. 2000. Clinical and molecular genetic characteristics of patients with cerebrotendinous xanthomatosis. Brain. 123: 908–19.

3. Inoue, K., S. Kubota, and Y. Seyama. 1999. Cholestanol induces apoptosis of cerebellar neuronal cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 256: 198–203.

4. Seyama, Y. 2003. Cholestanol metabolism, molecular pathology, and nutritional implications. J. Med. Food. 6: 217–24.

5. Salen, G., T. W. Meriwether, and G. Nicolau. 1975. Chenodeoxycholic acid inhibits increased cholesterol and cholestanol synthesis in patients with cerebrotendinous Xanthomatosis. Biochem. Med. 14: 57–74.

6. Berginer, V. M., G. Salen, and S. Shefer. 1984. Long-Term Treatment of Cerebrotendinous Xanthomatosis with Chenodeoxycholic Acid. N. Engl. J. Med. 311: 1649–1652.

7. Berginer, V. M., B. Gross, K. Morad, N. Kfir, S. Morkos, S. Aaref, and T. C. Falik-Zaccai. 2009. Chronic Diarrhea and Juvenile Cataracts: Think Cerebrotendinous Xanthomatosis and Treat. Pediatrics. 123: 143–147.

8. van Heijst, A. F., A. Verrips, R. A. Wevers, J. R. Cruysberg, W. O. Renier, and J. J. Tolboom. 1998. Treatment and follow-up of children with cerebrotendinous xanthomatosis. Eur. J. Pediatr. 157: 313–6.

9. Yahalom, G., R. Tsabari, N. Molshatzki, L. Ephraty, H. Cohen, and S. Hassin-Baer. 2013. Neurological outcome in cerebrotendinous xanthomatosis treated with chenodeoxycholic acid: early versus late diagnosis. Clin. Neuropharmacol. 36: 78–83.

10. Huidekoper, H. H., F. M. Vaz, A. Verrips, and A. M. Bosch. 2016. Hepatotoxicity due to chenodeoxycholic acid supplementation in an infant with cerebrotendinous xanthomatosis: implications for treatment. Eur. J. Pediatr. 175: 143–6.

11. Appadurai, V., A. DeBarber, P.-W. Chiang, S. B. Patel, R. D. Steiner, C. Tyler, and P. E. Bonnen. 2015. Apparent underdiagnosis of Cerebrotendinous Xanthomatosis revealed by analysis of ~60,000 human exomes. Mol. Genet. Metab. 116: 298–304.

12. Lorincz, M. T., S. Rainier, D. Thomas, and J. K. Fink. 2005. Cerebrotendinous Xanthomatosis. Arch. Neurol. 62: 1459.

13. Bleyle, L., H. H. Huidekoper, F. M. Vaz, R. Singh, R. D. Steiner, and A. E. Debarber. 2016. Update on newborn dried bloodspot testing for cerebrotendinous xanthomatosis: An available high-throughput liquid-chromatography tandem mass spectrometry method. Mol. Genet. Metab. Reports. 7: 11–15.

14. Debarber, A. E., J. Luo, M. Star-Weinstock, S. Purkayastha, M. T. Geraghty, J. P.-W. Chiang, L. S. Merkens, A. S. Pappu, and R. D. Steiner. 2014. A blood test for cerebrotendinous xanthomatosis with potential for disease detection in newborns. J. Lipid Res. 55: 146–154.

15. Batta, A. K., G. Salen, S. Shefer, G. S. Tint, and M. Batta. 1987. Increased plasma bile alcohol glucuronides in patients with cerebrotendinous xanthomatosis: effect of chenodeoxycholic acid. J. Lipid Res. 28: 1006–1012.

16. Ferdinandusse, S., and S. M. Houten. 2006. Peroxisomes and bile acid biosynthesis. Biochim. Biophys. Acta. 1763: 1427–40.

17. Nakagawa, M., M. Une, S. Takenaka, Y. Tazawa, S. Nozaki, T. Imanaka, and T. Kuramoto. 2001. Urinary bile alcohol profiles in healthy and cholestatic children. Clin. Chim. Acta. 314: 101–6.

18. Mills, K. A., I. Mushtaq, A. W. Johnson, P. D. Whitfield, and P. T. Clayton. 1998. A method for the quantitation of conjugated bile acids in dried blood spots using electrospray ionization-mass spectrometry. Pediatr. Res. 43: 361–8.

19. Dayal, B., Salen, G., Padia, J., Shefer, S., Tint, G. S., Sasso, G., & Williams, T. H. (1993). Bile alcohol glucuronides: regioselective O-glucuronidation of 5β-cholestane-3α,7α,12α,25-tetrol and 24-nor-5β-cholestane-3α,7α,12α,25-tetrol. Carbohydrate Research, 240(C), 133–142. http://doi.org/10.1016/0008-6215(93)84178-9

Группа изобретений относится к способу скрининга или диагностики церебросухожильного ксантоматоза (СТХ). Способ диагностики или скрининга дефицита 27-гидроксилазы (CYP27A1) у животного, включающий: a) определение интенсивности сигнала в биологической пробе, которая представляет собой кровь, сыворотку или плазму, путем масс-спектрометрического анализа, по меньшей мере, глюкуронида желчного спирта и желчной кислоты C27 или C24 или ее конъюгата, b) определение соотношения между указанным глюкуронидом желчного спирта и указанной желчной кислотой С24 или С27 или ее конъюгатом, c) сравнение указанного соотношения с контрольным значением, представляющим собой отношение средних, медианных или расчетных пороговых значений интенсивностей указанного глюкуронида спирта и С27- или С24-желчных кислот или их конъюгатов, причем контрольное значение определяют с использованием контрольных проб, которые представляют собой биологические пробы пациента, страдающего от церебросухожильного ксантоматоза (CTX), d) определение дефицита 27-гидроксилазы (CYP27A1) на основании указанного сравнения, причем выход за пределы которого будет расцениваться как наличие у субъекта дефицита CYP27A1. Набор для диагностики или скрининга дефицита 27-гидроксилазы (CYP27A1) с помощью вышеописанного способа, содержащий меченный стабильным изотопом тетрол и меченную стабильным изотопом желчную кислоту С24 или С27 или ее конъюгат, выбранные из группы, состоящей из: холевой кислоты (ХК), таурохолевой кислоты (т-ХК), гликохолевой кислоты (г-ХК), хенодезоксихолевой кислоты (ХДХК), таурохенодезоксихолевой кислоты (т-ХДХК), гликохенодезоксихолевой кислоты (г-ХДХК), тригидроксихолестаноевой кислоты (ТГХК), тауротригидроксихолестаноевой кислоты (т-ТГХК), гликотригидроксихолестаноевой кислоты (г-ТГХК), дигидроксихолестаноевой кислоты (ДГХК), тауродигидроксихолестаноевой кислоты (т-ДГХК) и гликодигидроксихолестаноевой кислоты (г-ДГХК). Вышеописанный способ диагностики или скрининга дефицита 27-гидроксилазы (CYP27A1) у животного является чувствительным и специфичным для обнаружения СТХ при больших масштабах скрининга, не требует стадии дериватизации. 2 н. и 11 з.п. ф-лы, 6 ил., 3 табл., 3 пр.

1. Способ диагностики или скрининга дефицита 27-гидроксилазы (CYP27A1) у животного, включающий:

a) определение интенсивности сигнала в биологической пробе, которая представляет собой кровь, сыворотку или плазму, путем масс-спектрометрического анализа, по меньшей мере, глюкуронида желчного спирта и желчной кислоты C27 или C24 или ее конъюгата,

b) определение соотношения между указанным глюкуронидом желчного спирта и указанной желчной кислотой С24 или С27 или ее конъюгатом,

c) сравнение указанного соотношения с контрольным значением, представляющим собой отношение средних, медианных или расчетных пороговых значений интенсивностей указанного глюкуронида спирта и С27- или С24-желчных кислот или их конъюгатов, причем контрольное значение определяют с использованием контрольных проб, которые представляют собой биологические пробы пациента, страдающего от церебросухожильного ксантоматоза (CTX),

d) определение дефицита 27-гидроксилазы (CYP27A1) на основании указанного сравнения, причем выход за пределы которого будет расцениваться как наличие у субъекта дефицита CYP27A1.

2. Способ по п. 1, в котором указанный глюкуронид желчного спирта представляет собой холестантетрола глюкуронид (тетрол).

3. Способ по п. 1 или 2, в котором указанная желчная кислота C27 или C24 или ее конъюгат выбраны из: холевой кислоты (ХК), таурохолевой кислоты (т-ХК), гликохолевой кислоты (г-ХК), хенодезоксихолевой кислоты (ХДХК), таурохенодезоксихолевой кислоты (т-ХДХК), гликохенодезоксихолевой кислоты (г-ХДХК), тригидроксихолестаноевой кислоты (ТГХК), тауротригидроксихолестаноевой кислоты (т-ТГХК), гликотригидроксихолестаноевой кислоты (г-ТГХК), дигидроксихолестаноевой кислоты (ДГХК), тауродигидроксихолестаноевой кислоты (т-ДГХК) и гликодигидроксихолестаноевой кислоты (г-ДГХК).

4. Способ по любому из пп. 1-3, который дополнительно включает определение интенсивности соединения, меченного стабильным изотопом, выбранного из: тетрола, желчной кислоты C24 или C27 или ее конъюгата, и указанную интенсивность указанного соединения, меченного стабильным изотопом, сравнивают с указанной интенсивностью указанного глюкуронида желчного спирта и указанной желчной кислоты С24 или С27 или ее конъюгата.

5. Способ по любому из пп. 1-4, в котором определяют, по меньшей мере, интенсивность сигнала первого и второго соединений, причем указанное первое соединение выбрано из:

холевой кислоты (ХК), таурохолевой кислоты (т-ХК), гликохолевой кислоты (г-ХК), хенодезоксихолевой кислоты (ХДХК), таурохенодезоксихолевой кислоты (т-ХДХК) и гликохенодезоксихолевой кислоты (г-ХДХК),

а указанное второе соединение выбрано из:

тригидроксихолестаноевой кислоты (ТГХК), тауротригидроксихолестаноевой кислоты (т-ТГХК), гликотригидроксихолестаноевой кислоты (г-ТГХК), дигидроксихолестаноевой кислоты (ДГХК), тауродигидроксихолестаноевой кислоты (т-ДГХК) и гликодигидроксихолестаноевой кислоты (г-ДГХК).

6. Способ по любому из пп. 1-5, в котором указанный масс-спектрометрический анализ включает МС, МС высокого разрешения, ЖХ-МС, MALDI-TOF, Q-TOF, Orbitrap-MS, проточно-инжекционную МС.

7. Способ по любому из пп. 1-6, в котором указанное животное является человеком.

8. Способ по любому из пп. 1-7, в котором указанное животное является новорожденным.

9. Способ по любому из пп. 1-8, который дополнительно включает измерение интенсивности указанного глюкуронида желчного спирта или желчной кислоты C24 или С27 или ее конъюгата относительно интенсивности меченного изотопом стандарта.

10. Способ по п. 9, в котором указанный меченный изотопом стандарт содержит меченный стабильным изотопом тетрол или меченную стабильным изотопом желчную кислоту С24 или С27 или ее конъюгат, выбранные из группы, состоящей из:

холевой кислоты (ХК), таурохолевой кислоты (т-ХК), гликохолевой кислоты (г-ХК), хенодезоксихолевой кислоты (ХДХК), таурохенодезоксихолевой кислоты (т-ХДХК), гликохенодезоксихолевой кислоты (г-ХДХК), тригидроксихолестаноевой кислоты (ТГХК), тауротригидроксихолестаноевой кислоты (т-ТГХК), гликотригидроксихолестаноевой кислоты (г-ТГХК), дигидроксихолестаноевой кислоты (ДГХК), тауродигидроксихолестаноевой кислоты (т-ДГХК) и гликодигидроксихолестаноевой кислоты (г-ДГХК).

11. Способ по п. 10, включающий стадию ионизации аналита с использованием напряжения на конусе в диапазоне от 60 до 90 В.

12. Набор для диагностики или скрининга дефицита 27-гидроксилазы (CYP27A1) с помощью способа по п. 1, содержащий меченный стабильным изотопом тетрол и меченную стабильным изотопом желчную кислоту С24 или С27 или ее конъюгат, выбранные из группы, состоящей из:

холевой кислоты (ХК), таурохолевой кислоты (т-ХК), гликохолевой кислоты (г-ХК), хенодезоксихолевой кислоты (ХДХК), таурохенодезоксихолевой кислоты (т-ХДХК), гликохенодезоксихолевой кислоты (г-ХДХК), тригидроксихолестаноевой кислоты (ТГХК), тауротригидроксихолестаноевой кислоты (т-ТГХК), гликотригидроксихолестаноевой кислоты (г-ТГХК), дигидроксихолестаноевой кислоты (ДГХК), тауродигидроксихолестаноевой кислоты (т-ДГХК) и гликодигидроксихолестаноевой кислоты (г-ДГХК).

13. Набор по п. 12, дополнительно содержащий положительную контрольную пробу, предпочтительно пробу крови пациента с церебросухожильным ксантоматозом (CTX).