СПОСОБЫ СТРАТИФИКАЦИИ ПАЦИЕНТОВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ АГОНИСТАМИ РЕЦЕПТОРОВ-α РЕТИНОЕВОЙ КИСЛОТЫ Российский патент 2023 года по МПК A61K31/196 A61K48/00 A61P35/00 G01N33/574 C12Q1/6886 

Уровень техники изобретения

Ретиноиды представляют собой класс соединений, структурно относящихся к витамину A, включая натуральные и синтетические соединения. Как было обнаружено, ретиноиды являются клинически пригодными при лечении дерматологических и онкологических заболеваний. Ретиноевая кислота и ее другие встречающиеся в природе аналоги ретиноидов (9-цисретиноевая кислота, полностью транс-3,4-дидегидроретиноевая кислота, 4-оксоретиноевая кислота и ретинол) представляют собой плейотропные регуляторные соединения, которые модулируют структуру и функцию широкого ряда воспалительных, иммунных и структурных клеток. Они являются важными регуляторами пролиферации, дифференцировки и морфогенеза эпителиальных клеток в легких. Ретиноиды оказывают свое биологическое действие через ряд ядерных гормональных рецепторов, которые представляют собой индуцируемые лигандом транскрипционные факторы, принадлежащие к суперсемейству стероидных/тиреоидных рецепторов.

Ретиноидные рецепторы делятся на два семейства, рецепторы ретиноевой кислоты (RAR) и ретиноидные X рецепторы (RXR), каждый из которых состоит из трех отдельных подтипов (α, β и γ). Каждый подтип семейства генов RAR кодирует различное число изоформ, возникающих в результате дифференцированного сплайсинга двух первичных РНК-транскриптов. Полностью трансретиноевая кислота представляет собой физиологический гормон для рецепторов ретиноевой кислоты и связывается с приблизительно равной аффинностью со всеми тремя подтипами RAR, но не связывается с рецепторами RXR, для которых 9-цисретиноевая кислота является природным лигандом. Ретиноиды обладают противовоспалительным действием, изменяют прохождение дифференцировки эпителиальных клеток, и подавляют выработку матрикса стромальных клеток. Эти свойства привели к развитию местной и системной ретиноидной терапии дерматологических расстройств, таких как псориаз, акне и гипертрофические рубцы кожи. Другое использование включает контроль острого промиелоцитарного лейкоза, аденокарциномы и плоскоклеточной карциномы, и фиброза печени.

Ограничение терапевтического применения ретиноидов обусловлено относительной токсичностью, наблюдаемой у встречающихся в природе ретиноидов, полностью трансретиноевой кислоты и 9-цисретиноевой кислоты. Эти природные лиганды не являются селективными по отношению к подтипу RAR и поэтому обладают плейотропным действием во всем организме, которое часто токсично.

Описан ряд ретиноидов, которые селективно или специализированно взаимодействуют с RAR или RXR рецепторами или с особыми подтипами (α, β и γ) в пределах класса. Специфические агонисты RARA являются высоко перспективными для лечения видов рака, и многие из них вошли в клинические испытания на человеке. Однако, только один специфический агонист RARA, тамибаротен, был когда-либо одобрен для лечения рака. Более того, несмотря на испытания в США и Европе, в Японии одобрен только тамибаротен и только для лечения острого промиелоцитарного лейкоза. Разрыв между теоретической эффективностью агонистов RARA при раке и дефицитом разрешений контролирующих органов для таких агентов ставит вопрос о том, почему такие агонисты не эффективны и не безопасны для людей. Поэтому необходимо лучше понять, почему агонисты RARA не достигли своего лечебного потенциала.

Недавние достижения в области геномной технологии и понимание генных регуляторных цепей привели к открытию суперэнхансеров. В то время как многие гены в данной ткани или в типе рака могут регулироваться присутствием энхансеров вблизи зоны кодирования гена, незначительная их часть отображает очень асимметричную и непропорционально большую нагрузку на метки и механизмы транскрипции по отношению ко всем другим активным генам. Недавние открытия подтверждают, что такие энхансеры связаны с генами, имеющими особое отношение к функционированию и выживаемости содержащей их клетки. Как таковая, ассоциация суперэнхансера с геном указывает на относительную важность указанного гена для выживаемости такой клетки. Эти наблюдения могут быть полезными в прогнозировании эффективности различных видов терапии.

Сущность изобретения

Настоящее раскрытие предоставляет методики выявления одного или более из активности или порядкового ранга суперэнхансера RARA, или уровня мРНК RARA, который равен или превышает пороговое значение. Настоящее раскрытие демонстрирует, что клетки (напр., раковые клетки или клетки больного, страдающего MDS, напр., клетки AML, клетки MDS, клетки рака молочной железы), содержащие одно или более из активности или порядкового ранга суперэнхансера RARA или уровня мРНК RARA, который равен или превышает пороговое значение, являются более чувствительными к противораковому действию агониста RARA (напр., мутации с приобретением функции агониста RARA; или RARA-специфического агониста (напр., агониста, который по меньшей мере в 10X, 100X, 1000X, 10000X или более специфичен для RAR-α, чем для RAR-β или RAR-γ)), чем клетки с более низким пороговым значением.

Различные варианты осуществления, аспекты и альтернативы данного изобретения решают проблему определения, какие популяции клеток чувствительны к агонистам рецептора-альфа ретиноевой кислоты («RARA»), с выделением подгрупп пациентов, которые получат пользу от лечения агонистами RARA (напр., со стратификацией пациентов для лечения агонистом RARA; с отделением пациентов с ответом на лечение агонистом RARA и пациентов с отсутствием ответа) и с предоставлением видов терапии, направленных на такие подгруппы пациентов. Решение основывается, по меньшей мере, частично, на открытии авторов изобретения, что суперэнхансер, имеющий активность или порядковый ранг, равные или превышающие пороговое значение, и ассоциированный с геном, кодирующим рецептор-альфа ретиноевой кислоты («RARA») в некоторых раковых клетках, указывает на то, что такая клетка будет реагировать на лечение агонистом RARA. Авторы изобретения также открыли, что уровни транскрипции первичной РНК RARA, в частности уровни мРНК, равные или превышающие пороговый уровень в определенных раковых клетках, также указывают на то, что такие раковые клетки будут реагировать на лечение агонистом RARA. В обоих случаях пороговые значения, ассоциированные с данными параметрами, по всей видимости, являются значительно более прогностическими, чем уровни белка RARA.

В первом варианте осуществления изобретение относится к способу лечения больного, страдающего от рака, при этом было определено, что раковые клетки больного имеют одно или более из:

a. cуперэнхансера, ассоциированного с геном RARA, при этом суперэнхансер имеет активность или порядковый ранг, который равен или превышает предварительно определенный пороговый уровень; или

b. уровня первичного РНК-транскрипта из гена RARA и/или связанного с ним участка суперэнхансера, который равен или превышает предварительно определенный пороговый уровень,

при этом способ включает стадию введения больному агониста RARA.

В некоторых аспектах первого варианта осуществления агонист RARA вводят, только если суперэнхансер имеет активность или порядковый ранг, который равен или превышает предварительно определенный пороговый уровень; или уровень первичного РНК-транскрипта равен или превышает предварительно определенный пороговый уровень.

В некоторых аспектах первого варианта осуществления, когда было определено, что раковые клетки больного имеют:

a. энхансер или суперэнхансер, ассоциированный с геном RARA, при этом энхансер или суперэнхансер имеет активность или порядковый ранг, который ниже предварительно определенного порогового уровня; или

b. уровень первичного РНК-транскрипта из гена RARA и/или связанного с ним участка суперэнхансера, который ниже предварительно определенного порогового уровня,

способ включает стадию введения больному лекарственного средства, не являющегося агонистом RARA.

В некоторых аспектах первого варианта осуществления было определено, что раковые клетки больного имеют суперэнхансер, ассоциированный с геном RARA, который по меньшей мере в 1,75 раза активнее, чем участок суперэнхансера, ассоциированного с MALAT1, при измерении посредством ChIp-seq, при этом участок расположен в chr11:65263724-65266724 в геномной конструкции hg19, или по меньшей мере эквивалентное количество, более активное, чем в другом локусе с референсным энхансером или суперэнхансером.

В других аспектах первого варианта осуществления, когда выявлено, что раковые клетки больного соответствуют либо a. Либо b., способ включает введение больному лекарственного средства (напр., лекарственного препарата или стандартной терапии), не являющегося агонистом RARA, напр., химиотерапевтического препарата или трансплантацию. В некоторых вариантах осуществления больной страдает раком, напр., лейкозом (напр., острым миелоидным лейкозом). Иллюстративные лекарственные средства включают химиотерапевтические препараты (напр., цитарабин, гемцитабин, азацитидин, децитабин, фторурацил или антрациклин (напр., даунорубицин, доксорубицин, эпирубицин или идаруцибин)) или трансплантацию (напр., трансплантацию стволовых клеток).

В альтернативных аспектах первого варианта осуществления выявлено, что раковые клетки больного имеют одно из следующего:

a. суперэнхансера, ассоциированного с геном RARA, который по меньшей мере в 1,5 раза выше по активности, чем соответствующий энхансер, ассоциированный с геном RARA в клетке человека или клеточной линии человека, для которых известно, что они не дают ответ на агонист RARA; и/или

b. уровня первичного транскрипта РНК RARA, который по меньшей мере в 1,5 раза выше, чем соответствующий уровень первичного транскрипта РНК RARA в клетке человека или клеточной линии человека, для которых известно, что они не дают ответ на агонист RARA.

В других альтернативных аспектах первого варианта осуществления выявлено, что раковые клетки больного имеют одно из следующего:

a. суперэнхансера, ассоциированного с геном RARA, который имеет активность, соответствующую рангу распространенности, который равен или выше предварительно определенного предела распространенности для активности суперэнхансера гена RARA; и/или

b. суперэнхансера, ассоциированного с геном RARA, который имеет активность, равную или превышающую предварительно определенный предел активности гена RARA; и/или

c. суперэнхансера, ассоциированного с геном RARA, который имеет порядковое число активности, соответствующее рангу распространенности, который равен или выше предварительно определенного предела распространенности порядкового числа активности гена RARA; и/или

d. суперэнхансера, ассоциированного с геном RARA, который имеет порядковое число активности, равное или превышающее предварительно определенный предел порядкового числа активности гена RARA; и/или

е. уровня мРНК RARA, который равен или выше предварительно определенного предела уровня мРНК; и/или

f. уровня мРНК RARA, соответствующего рангу распространенности, который равен или выше предварительно определенного предела распространенности мРНК RARA.

В определенных более конкретных аспектах любой из предварительно определенных пределов распространенности, изложенных выше, определяют:

а. из порядка ранжирования активности суперэнхансера RARA в популяции образцов из одного и того же типа раковых клеток, у которых определено, что по меньшей мере один образец реагирует на агонист RARA; и/или

b. из порядка ранжирования порядкового числа активности суперэнхансера RARA в популяции образцов из одного и того же типа раковых клеток, у которых определено, что по меньшей мере один образец реагирует на агонист RARA; и/или

с. из порядка ранжирования уровней мРНК RARA в популяции образцов одного и того же типа раковых клеток, у которых определено, что по меньшей мере один образец реагирует на агонист RARA.

Во втором варианте осуществления изобретение предоставляет способ лечения больного, страдающего от рака, включающий стадии:

а. получения информации, относящейся к одному или более из:

i. активности, порядкового ранга или ранга распространенности суперэнхансера, ассоциированного с геном RARA в раковой клетке больного; или

ii. уровня первичного РНК-транскрипта из гена RARA и/или связанного с ним участка суперэнхансера в раковой клетке больного; и

b. введения больному агониста RARA, если информация указывает на одно или более из:

i. суперэнхансер имеет активность, порядковый ранг или ранг распространенности, который равен или превышает предварительно определенный пороговый уровень; или

ii. уровень транскрипта РНК равен или превышает предварительно определенный пороговый уровень.

В одном аспекте второго варианта осуществления больному вводят лекарственное средство, не являющегося агонистом RARA, если информация указывает:

iii. суперэнхансер имеет активность, порядковый ранг или ранг распространенности, который ниже предварительно определенного порогового уровня; или

iv. Уровень транскрипта РНК ниже предварительно определенного порогового уровня.

В одном аспекте второго варианта осуществления стадия a. Включает получение информации, относящейся к одному или более из:

i. активности суперэнхансера, ассоциированного с геном RARA, по сравнению с контрольным энхансером или суперэнхансером в том же виде рака; и/или

ii. степени уровня первичного транскрипта РНК RARA по сравнению с соответствующим уровнем первичного транскрипта РНК RARA в клетке человека или клеточной линии человека, для которых известно, что они не дают ответ на агонист RARA.

В одном аспекте второго варианта осуществления стадия b включает введение больному агониста RARA, если информация указывает на одно или более из:

i. суперэнхансер, ассоциированный с геном RARA, по меньшей мере в 1,75 рана активнее, чем участок суперэнхансера, ассоциированного с MALAT1, расположенного в chr11:65263724-65266724 в геномной конструкции hg19, или по меньшей мере эквивалентное количество активнее, чем в другом локусе с референсным энхансером или суперэнхансером; и/или

ii. уровень первичного транскрипта РНК RARA, по меньшей мере в 1,5 раза выше, чем соответствующий уровень первичного транскрипта РНК RARA в клетке человека или клеточной линии человека, для которых известно, что они не дают ответ на агонист RARA.

В альтернативном аспекте второго варианта осуществления стадия a. Включает получение информации, относящейся к одному или более из:

i. активности суперэнхансера, ассоциированного с геном RARA, и/или рангу распространенности активности суперэнхансера гена RARA в популяции, которой соответствует активность; и/или

ii. порядковому рангу активности суперэнхансера, ассоциированного с геном RARA, по сравнению с другими суперэнхансерами в клетке, и/или рангу распространенности порядкового числа активности суперэнхансера гена RARA в популяции, которой соответствует порядковый ранг; и/или

iii. уровню мРНК RARA и/или рангу распространенности уровня мРНК RARA в популяции, которой соответствует уровень мРНК; а

стадия b. включает введение больному агониста RARA, если информация указывает на одно или более из:

i. активность суперэнхансера, ассоциированного с геном RARA, равна или превышает предварительно определенное значение предела активности суперэнхансера гена RARA в популяции; и/или

ii. активность суперэнхансера, ассоциированного с геном RARA, соответствует рангу распространенности, который равен или выше предварительно определенного предела распространенности активности суперэнхансера гена RARA в популяции; и/или

iii. порядковый ранг активности суперэнхансера, ассоциированного с геном RARA, равен или превышает предварительно определенное порядковое значение предела порядкового числа активности суперэнхансера гена RARA в популяции; и/или

iv. порядковый ранг активности суперэнхансера соответствует рангу распространенности, который равен или выше предварительно определенного предела распространенности порядкового числа активности суперэнхансера гена RARA в популяции; и/или

v. уровень мРНК RARA равен или превышает уровень мРНК RARA, который соответствует предварительно определенному значению предела уровня мРНК RARA в популяции; и/или

vi. уровень мРНК RARA соответствует рангу распространенности, который равен или выше предварительно определенного предела распространенности уровня мРНК RARA в популяции.

В третьем варианте осуществления изобретение предоставляет упакованную фармацевтическую композицию, содержащую:

a. агонист RARA; и

b. письменный вкладыш или этикетку, содержащую инструкции по использованию агониста RARA у страдающего от рака больного, и у которого определено, что раковые клетки имеют одно или более из:

i. суперэнхансера, ассоциированного с геном RARA, при этом суперэнхансер имеет активность, порядковый ранг или ранг распространенности, который равен или превышает предварительно определенный пороговый уровень; или

ii. уровня первичного РНК-транскрипта из гена RARA и/или связанного с ним участка суперэнхансера, который равен или превышает предварительно определенный пороговый уровень.

В некоторых аспектах третьего варианта осуществления письменный вкладыш или этикетка содержит инструкции по использованию агониста RARA для больного, у которого определено, что раковые клетки имеют одно или более из:

i. суперэнхансера, ассоциированного с геном RARA, который по меньшей мере в 1,75 раза активнее, чем участок суперэнхансера, ассоциированного с MALAT1, расположенного в chr11:65263724-65266724 в геномной конструкции hg19, или по меньшей мере эквивалентное количество активнее, чем в другом локусе с референсным энхансером или суперэнхансером; и/или

ii. уровня первичного транскрипта РНК RARA, который по меньшей мере в 1,5 раза выше, чем соответствующий уровень первичного транскрипта РНК RARA в клетке человека или клеточной линии человека, для которых известно, что они не дают ответ на агонист RARA.

В некоторых аспектах третьего варианта осуществления письменный вкладыш или этикетка содержит инструкции по использованию агониста RARA для больного, у которого определено, что раковые клетки имеют одно или более из:

i. суперэнхансера, ассоциированного с геном RARA, который имеет активность, равную или превышающую предварительно определенное значение предела активности суперэнхансера гена RARA в популяции; и/или

ii. суперэнхансера, ассоциированного с геном RARA, который имеет активность, соответствующую рангу распространенности, который равен или выше предварительно определенного предела распространенности активности суперэнхансера гена RARA в популяции; и/или

iii. суперэнхансера, ассоциированного с геном RARA, который имеет порядковый ранг активности, равный или превышающий предварительно определенное значение предела порядкового числа активности суперэнхансера гена RARA в популяции; и/или

iv. суперэнхансера, ассоциированного с геном RARA, который имеет порядковый ранг активности, соответствующий рангу распространенности, который равен или превышает предварительно определенный предел распространенности порядкового числа активности суперэнхансера гена RARA в популяции; и/или

v. уровня мРНК RARA, который равен или выше предварительно определенного значения предела уровня мРНК RARA в популяции; и/или

vi. уровня мРНК RARA, соответствующего рангу распространенности, который равен или выше предварительно определенного предела распространенности мРНК RARA в популяции.

В четвертом варианте осуществления изобретение предоставляет способ прогнозирования эффективности агониста RARA при лечении рака у больного, включающий стадию определения, была ли определена информация, или получения информации, что:

a. суперэнхансер, ассоциированный с геном RARA, при раке имеет активность, порядковый ранг или ранг распространенности, который равен или превышает предварительно определенный пороговый уровень; или

b. уровень первичного РНК-транскрипта из гена RARA и/или связанного с ним участка суперэнхансера, при раке равен или превышает предварительно определенный пороговый уровень, при этом любое из a. Или b. Прогнозирует эффективность агониста RARA при лечении.

В некоторых аспектах четвертого варианта осуществления прогнозирование эффективности агониста RARA при лечении рака у больного включает стадию определения, характеризуется ли рак одним или более из:

а. суперэнхансера, ассоциированного с геном RARA, по меньшей мере в 1,75 раза активнее, чем участок суперэнхансера, ассоциированного с MALAT1, расположенного в chr11:65263724-65266724 в геномной конструкции hg19, или по меньшей мере эквивалентное количество активнее, чем в другом локусе с референсным энхансером или суперэнхансером; и/или

b. уровня первичного транскрипта РНК RARA, который по меньшей мере в 1,5 раза выше, чем соответствующий уровень первичного транскрипта РНК RARA в клетке человека или клеточной линии человека, для которых известно, что они не дают ответ на агонист RARA;

при этом любое из a. или b. прогнозирует эффективность агониста RARA при лечении.

В некоторых аспектах четвертого варианта осуществления прогнозирование эффективности агониста RARA при лечении рака у больного включает стадию определения, характеризуется ли рак одним или более из:

а. суперэнхансера, ассоциированного с геном RARA, который имеет активность, равную или превышающую предварительно определенное значение предела активности суперэнхансера гена RARA в популяции; и/или

b. суперэнхансера, ассоциированного с геном RARA, который имеет активность, соответствующую рангу распространенности, который равен или выше предварительно определенного предела распространенности активности суперэнхансера гена RARA в популяции; и/или

c. суперэнхансера, ассоциированного с геном RARA, который имеет порядковый ранг активности, который равен или выше предварительно определенного значения предела порядкового числа активности суперэнхансера гена RARA в популяции; и/или

d. суперэнхансера, ассоциированного с геном RARA, который имеет порядковый ранг активности, соответствующий рангу распространенности, который равен или выше предварительно определенного предела распространенности порядкового числа активности суперэнхансера гена RARA в популяции; и/или

е. уровня мРНК RARA, который равен или выше предварительно определенного значения предела уровня мРНК RARA в популяции; и/или

f. уровня мРНК RARA, который соответствует рангу распространенности, который равен или выше предварительно определенного предела распространенности уровня мРНК RARA в популяции.

В пятом варианте осуществления изобретение предоставляет способ диагностики, прогнозирования или лечения больного, страдающего от рака, включающий стадии:

а. получения образца раковых клеток больного;

b. определения, была ли определена информация, или получения информации, об одном или более из:

i. активности, порядкового ранга или ранга распространенности суперэнхансера, ассоциированного с геном RARA в образце; или

ii. уровня первичного РНК-транскрипта из гена RARA и/или связанного с ним участка суперэнхансера в образце; и

с. введения терапевтической композиции, содержащей агонист RARA, в случае одного или более из:

i. суперэнхансер имеет активность, порядковый ранг или ранг распространенности, который равен или превышает предварительно определенный пороговый уровень; или

ii. уровень первичного РНК-транскрипта равен или превышает предварительно определенный пороговый уровень.

В одном аспекте пятого варианта осуществления стадия b. включает определение в образце одного или более из:

i. активности суперэнхансера, ассоциированного с геном RARA, по сравнению с контрольным энхансером или суперэнхансером при том же виде рака; и/или

ii. степени уровня первичного транскрипта РНК RARA по сравнению с соответствующим уровнем первичного транскрипта РНК RARA в клетке человека или клеточной линии человека, для которых известно, что они не дают ответ на агонист RARA.

В другом аспекте пятого варианта осуществления стадия c. включает введение или рекомендацию введения терапевтической композиции, содержащей агонист RARA, в случае одного или более из:

i. суперэнхансера, ассоциированного с геном RARA, по меньшей мере в 1,75 раза более активного, чем участок суперэнхансера, ассоциированного с MALAT1, расположенного в chr11:65263724-65266724 в геномной конструкции hg19, или по меньшей мере эквивалентного количества более активного, чем в другом локусе с референсным энхансером или суперэнхансером;

ii. уровня первичного транскрипта РНК RARA, который по меньшей мере в 1,5 раза выше, чем соответствующий уровень первичного транскрипта РНК RARA в клетке человека или клеточной линии человека, для которых известно, что они не дают ответ на агонист RARA; и/или

iii. уровня мРНК RARA, по меньшей мере в 1,5 раза более высокого, чем уровень мРНК RARA в клетке человека или клеточной линии человека, для которых известно, что они не дают ответ на агонист RARA.

В другом аспекте пятого варианта осуществления стадия b. включает определение в образце одного или более из:

i. активности суперэнхансера, ассоциированного с геном RARA, и/или ранга распространенности активности суперэнхансера, ассоциированного с геном RARA, в популяции, которой соответствует активность; и/или

ii. порядкового ранга активности суперэнхансера, ассоциированного с геном RARA, по сравнению с другими суперэнхансерами в клетке и/или ранга распространенности порядкового ранга активности суперэнхансера, ассоциированного с геном RARA, в популяции, которой соответствует порядковый ранг; и/или

iii. уровня первичного транскрипта мРНК RARA и/или ранга распространенности первичного транскрипта мРНК RARA в популяции, которой соответствует уровень мРНК.

В другом аспекте пятого варианта осуществления стадия c. включает введение или рекомендацию введения терапевтической композиции, содержащей агонист RARA, в случае одного или более из:

a. суперэнхансера, ассоциированного с геном RARA, имеющего активность, равную или превышающую предварительно определенное значение предела активности суперэнхансера гена RARA в популяции; и/или

b. суперэнхансера, ассоциированного с геном RARA, который имеет активность, соответствующую рангу распространенности, который равен или выше предварительно определенного предела распространенности активности суперэнхансера гена RARA в популяции; и/или

c. суперэнхансера, ассоциированного с геном RARA, который имеет порядковый ранг активности, равный или превышающий предварительно определенное значение предела порядкового числа активности суперэнхансера гена RARA в популяции; и/или

d. суперэнхансера, ассоциированного с геном RARA, который имеет порядковый ранг активности, соответствующий рангу распространенности, который равен или выше предварительно определенного предела распространенности порядкового числа активности суперэнхансера гена RARA в популяции; и/или

e. уровня мРНК RARA, равного или превышающего предварительно определенное значение предела уровня мРНК RARA в популяции; и/или

f. уровня мРНК RARA, который соответствует рангу распространенности, который равен или выше предварительно определенного предела распространенности уровня мРНК RARA в популяции.

В шестом варианте осуществления изобретение предоставляет способ определения уровня мРНК RARA у больного, включающий стадии: a) получения общей мРНК из биологического образца больного; b) присоединения к каждой молекуле мРНК дополнительных нуклеотидов, в природе не соединенных с такими молекулами мРНК, чтобы обеспечить возможность молекулам мРНК связываться с твердой подложкой; c) секвенирования молекул мРНК; и d) определения уровня мРНК RARA.

В альтернативном шестом варианте осуществления изобретение предоставляет способ определения уровня мРНК RARA у больного, включающий стадии: a) получения общей мРНК из биологического образца больного; b) создания библиотеки кДНК из общей мРНК; и c) комбинирования библиотеки кДНК с (i) парой праймеров, которая специфична для кДНК, созданной из мРНК RARA; (ii) ДНК-полимеразой; и (iii) компонентом для определения любой из молекул ДНК, полученных из пары праймеров и ДНК-полимеразы. В некоторых аспектах этого альтернативного шестого варианта осуществления компонентом для определения является краситель. В других аспектах этого альтернативного шестого варианта осуществления компонентом для определения является меченый (напр., меченый радиоактивным изотопом или меченный красителем) олигонуклеотид.

В некоторых аспектах любого из шестых вариантов осуществления уровень мРНК, определяемый у больного, сравнивают с предварительно определенным пороговым уровнем.

В некоторых аспектах любого из шестых вариантов осуществления пациент страдает от рака, выбранного из AML, рака молочной железы или MDS. В более конкретных аспектах больной страдает одним из указанных выше заболеваний и ему вводят агонист RARA (напр., тамибаротен), если определенный уровень мРНК RARA равен или превышает предварительно определенный порог.

В некоторых аспектах любого из шестых вариантов осуществления предварительно определенный порог представляет собой предел уровень мРНК RARA, определенный посредством измерения уровней мРНК RARA в популяции или популяции образцов, имеющих или представляющих один и тот же вид рака; и идентификации по меньшей мере одного члена популяции, который отвечает на агонист RARA. В некоторых аспектах этого шестого варианта осуществления предварительно определенный порог представляет собой предельный уровень мРНК RARA, который определяют посредством вычисления предела распространенности, исходя из порядкового ранга суперэнхансера RARA в популяции или популяции образцов, в которой по меньшей мере один член популяции идентифицирован как отвечающий на агонист RARA; и использования вычисленного предела распространенности для определения уровня предела уровней мРНК RARA в той же или иной популяции или популяции образцов.

В седьмом варианте осуществления изобретение предоставляет композицию, содержащую (i) кДНК, обратно транскрибированную из мРНК, полученной из популяции раковых клеток у больного (напр., клеток костного мозга больного, страдающего AML или MDS, клеток рака молочной железы и т.д.); (ii) пару праймеров, специфичную для кДНК, транскрибированной из мРНК RARA; (iii) ДНК-полимеразу; и (iv) компонент для определения любой из молекул ДНК, полученной из пары праймеров и ДНК-полимеразы. В некоторых аспектах этого седьмого варианта осуществления компонентом для определения является краситель. В других аспектах этого седьмого варианта осуществления компонентом для определения является меченый (напр., меченный радиоактивным изотопом или меченный красителем) олигонуклеотид. В некоторых аспектах этого седьмого варианта осуществления композицию используют для определения уровня мРНК RARA у больного. В более конкретных аспектах этого седьмого варианта осуществления определенные уровни мРНК RARA сравнивают со значением предела, и сравнение используют для определения, следует ли вводить пациенту агонист RARA (напр., тамибаротен).

В восьмом варианте осуществления изобретение предоставляет дифференцированный способ лечения группы больных, страдающих от рака, включающий введение агониста RARA подмножеству больных, у которых рак характеризуется уровнем мРНК RARA, который равен или превышает предварительно определенный порог; и не введение агониста RARA подмножеству больных, у которых рак характеризуется уровнем мРНК RARA, который ниже предварительно определенного порога.

В некоторых аспектах этого восьмого варианта осуществления группа больных страдает одним и тем же видом рака, и рак выбран из AML, рака молочной железы или MDS. В некоторых аспектах седьмого варианта осуществления агонистом RARA является тамибаротен. В некоторых аспектах этого седьмого варианта осуществления предварительно определенный порог представляет собой предельный уровень мРНК, определенный посредством измерения уровней мРНК RARA в популяции или популяции образцов, имеющих или представляющих один и тот же вид рака; и идентификации по меньшей мере одного члена популяции, который реагирует на агонист RARA. В некоторых аспектах этого седьмого варианта осуществления предварительно определенный порог представляет собой предельный уровень мРНК, определенный посредством вычисления предела распространенности на основании порядкового ранга суперэнхансера RARA в популяции или популяции образцов, в которой по меньшей мере один член популяции идентифицирован как отвечающий на агонист RARA; и использования вычисленного предела распространенности для определения предельного уровня уровней мРНК RARA в одной и той же или другой популяции или популяции образцов.

В девятом варианте осуществления изобретение предоставляет способ, включающий стадии:

a. получения раковых клеток больного, страдающего от рака; и

b. измерения в раковых клетках:

i. активности, порядкового ранга или ранга распространенности суперэнхансера, ассоциированного с геном RARA, в образце; или

ii. уровня первичного РНК-транскрипта из гена RARA и/или связанного с ним участка суперэнхансера в образце; и

с. сравнения измерения, полученного на стадии b., с пороговым значением.

В любом и во всех вариантах осуществления, в некоторых аспектах настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для использования при лечении больного, страдающего от рака, при этом композиция включает агонист RARA.

Подробности одного или более вариантов осуществления изобретения изложены в данном документе. Другие признаки, цели и преимущества изобретения будут очевидны из подробного описания, фигур, примеров и вариантов осуществления.

Краткое Описание Чертежей

Фиг. 1A-1B графически изображают log₂ насыщение суперэнхансера RARA при измерении посредством ChIP-qPCR.

Фиг. 2 изображает уровень ридов H3K27Ac через локус RARA, определяемый посредством Chip-seq в 5 различных клеточных линиях рака молочной железы. «RARA» обозначает локализацию гена RARA во фрагменте проанализированной ДНК.

Фиг. 3 представляет собой список результатов ChIP-seq для большого множества клеточных линий и образцов пациентов. Он показывает относительную активность суперэнхансера RARA по сравнению с участком суперэнхансера MALAT1 в каждой из этих клеток или образцов пациентов.

Фиг. 4A показывает порядок ранжирования активности SE RARA, выраженной как log₁₀ RARA/MALAT1 для всех клеточных линий рака молочной железы и образцов пациентов, проанализированных посредством ChIP-seq на фиг. 3. Фиг. 4B показывает порядок ранжирования активности SE RARA, выраженный как log₁₀ RARA/MALAT1 для всех клеточных линий рака AML и образцов пациентов, проанализированных посредством ChIP-seq на фиг. 3.

Фиг. 5 показывает порядок ранжирования активности SE RARA, выраженной как log₁₀ RARA/MALAT1 для всех нормальных гематологических клеточных линий и образцов пациентов, проанализированных посредством ChIP-seq на фиг. 3.

Фиг. 6 показывает диаграмму рассеяния активности SE RARA, выраженной как log₁₀ RARA/MALAT1 для образцов пациентов против клеточных линий в различных клетках AML и рака молочной железы, проанализированных посредством ChIP-seq на фиг. 3.

Фиг. 7 показывает жизнеспособность различных клеточных линий рака молочной железы в присутствии изменяющихся доз тамибаротена после 5 дней лечения.

Фиг. 8 показывает корреляцию между log₁₀ EC50 тамибаротена против активности SE RARA (кратное насыщение RARA/MALAT1) для семи различных клеточных линий рака молочной железы.

Фиг. 9 показывает жизнеспособность различных клеточных линий AML в присутствии изменяющихся доз тамибаротена после 5 дней лечения.

Фиг. 10 показывает корреляцию между log₁₀ EC50 тамибаротена против одиннадцати различных клеточных линий AML.

Фиг. 11 показывает уровни экспрессии мРНК трех различных подтипов RAR (RaR-α («RARA»); RaR-β («RARB»); и RaR-γ («RARG»)), при измерении посредством аффиметрического анализа на основе матриц для клеточной линии рака молочной железы, реагирующей (Au565) и нереагирующей (HCC1143) на тамибаротен.

Фиг. 12 показывает корреляцию между экспрессией мРНК (log₂(1+FPKM)) и активностью SE RARA (кратное насыщение RARA/MALAT1) для 48 различных образцов пациентов с AML при использовании секвенирования РНК.

Фиг. 13 показывает уровень обратной экспрессии мРНК при измерении посредством количественной ПЦР в реальном времени и выраженной как dCt для 5 различных клеточных линий рака молочной железы.

Фиг. 14A показывает корреляцию между уровнями экспрессии мРНК при измерении посредством количественной ПЦР в реальном времени и активностью SE RARA (кратное насыщение RARA/MALAT1) для семи различных клеточных линий рака молочной железы. Фиг. 14B показывает корреляцию между уровнями экспрессии мРНК при измерении посредством количественной ПЦР в реальном времени и реакцией на тамибаротен (при измерении посредством log₁₀ EC₅₀) для семи различных клеточных линий рака молочной железы.

Фиг. 15 представляет собой вестерн-блоттинг, отображающий уровень белка трех различных известных изоформ RARA в 5 различных клеточных линиях рака молочной железы.

Фиг. 16 изображает HER2 и число копий гена RARA в клеточной линии рака молочной железы, слабо реагирующей (T47D, Фиг. 16A) и сильно реагирующей (AU565, Фиг. 16B) на тамибаротен.

Фиг. 17 изображает уровень ридов H3K27Ac через локус RARA, определяемый посредством ChIP-seq для образцов пациентов с глиобластомой, нейробластомой и колоректальным раком.

Фиг. 18 изображает ответ на различные суточные дозировки тамибаротена в мышиной ксенографической модели рака молочной железы, полученной из клеточной линии рака молочной железы (HCC1945).

Фиг. 19 изображает log₁₀ ранжированный график порядкового числа активности суперэнхансера RARA в 80 образцах рака молочной железы, включая клеточную линию рака молочной железы HCC1945.

Фиг. 20A изображает log₁₀ ранжированный график порядкового числа активности суперэнхансера RARA в 48 образцах пациентов с раком молочной железы. Светлые окрашенные полосы представляют образцы, порядковое число активности суперэнхансера RARA которых было равно или выше предела распространенности. Темные окрашенные полосы представляют образцы, порядковое число активности суперэнхансера RARA которых было ниже предела распространенности. Фиг. 20B изображает такой же ранжированный график, как на панели A, а кроме того показывает конкретный подтип рака молочной железы (гормон-рецептор-положительный (HR⁺), HER2 положительный (HER2⁺) или трижды негативный (TN)), а также расчетный предел распространенности для каждого подтипа.

Фиг. 21A-B изображают ответ на суточное введение тамибаротена (SY1425) в мышиных ксенографических моделях рака молочной железы, полученных из образцов двух различных пациентов.

Фиг. 22 изображает уровни мРНК RARA в мышиных ксенографических моделях рака молочной железы, полученных из образцов девяти различных пациентов. Белая полоса представляет значение для CTG-1124, а также предел распространенности 55,3% в этой популяции.

Фиг. 23A изображает активность суперэнхансера RARA в 6 клеточных линиях AML. Фиг. 23B изображает ответную реакцию тех же самых 6 клеточных линий AML на лечение тамибаротеном. Фиг. 23C изображает log₁₀ ранжированный график порядкового числа активности суперэнхансера RARA в 94 образцах AML, включая четыре из шести клеточных линий AML, проанализированных на фиг. 20A и 20B -- Sig-M5, MV411, HEL и Kasumi.

Фиг. 24 изображает log₁₀ ранжированный график порядкового числа активности суперэнхансера RARA в 70 образцах пациентов с AML. Светлые окрашенные полосы представляют образцы, порядковое число активности суперэнхансера RARA которых было равно или выше предела распространенности. Темные окрашенные полосы представляют образцы, порядковое число активности суперэнхансера RARA которых было ниже предела распространенности.

Фиг. 25 изображает уровни мРНК RARA в 70 образцах пациентов с AML, использованных на фиг. 24 и сгруппированных согласно тому, было ли их порядковое число активности суперэнхансера RARA выше (или равно) предела распространенности («высокий RARA») или ниже предела распространенности («низкий RARA»).

Фиг. 26A и 26D изображают ответ при измерении посредством % клеток CD45+ на суточное введение тамибаротена в полученных от двух разных пациентов мышиных ксенографических моделях AML. Фиг. 26B и 26E изображают % клеток CD45+ в разных органах и биологических жидкостях, а Фиг. 26C и 26F показывают время жизни мышиных моделей.

Фиг. 27A-B изображают ответ при измерении посредством % клеток CD45+ на суточное введение тамибаротена в двух полученных у дополнительных пациентов мышиных ксенографических моделях AML. Фиг. 27C изображает % клеток CD45+ в разных органах и биологических жидкостях в одной из этих моделей, а Фиг. 27D изображает время жизни в этой модели.

Фиг. 28 изображает уровни мРНК RARA в 64 образцах пациентов с AML, включая четыре, использованные для создания мышиных ксенографических моделей (см. Фиг. 26 и 27). Светлые окрашенные полосы представляют образцы, мРНК RARA которых была равна или выше предела распространенности при определении из порядкового числа активности суперэнхансера RARA. Темные окрашенные полосы представляют образцы, уровни мРНК RARA которых были ниже этого предела распространенности.

Фиг. 29A изображает ответ мышей с ксенотрансплантатом AM5512 на 4 мг/кг ATRA BID, 3 мг/кг тамибаротена BID и контроль носителем при измерении посредством % клеток CD45+. Фиг. 29B изображает уровень выживания таких мышей в ходе эксперимента.

Фиг. 30 представляет собой таблицу разных типов рака, где больше чем 5% протестированных образцов имели уровни мРНК RARA по меньшей мере на 2 стандартных отклонения выше среднего.

Фиг. 31 изображает уровни мРНК RARA в образцах пациентов с MDS против клеток здоровых («нормальных») пациентов.

Фиг. 32 изображает корреляцию между активностью энхансера RARA и чувствительностью к тамибаротену в 11 различных клеточных линиях AML.

Фиг. 33 изображает корреляцию между уровнями мРНК RARA и чувствительностью к тамибаротену в 11 различных клеточных линиях AML.

Определения

Если не указано иное, подразумевается, что структуры, изображенные в данном документе, включают все изомерные (напр., энантиомерные, диастереомерные и геометрические (или конформационные)) формы структуры; например, конфигурации R и S для каждого ассиметричного центра, изомеры Z и E с двойными связями и конформационные изомеры Z и E. Вследствие этого, одиночные стереохимические изомеры, а также энантиомерные, диастереомерные и геометрические (или конформационные) смеси настоящих соединений находятся в пределах объема правовых притязаний изобретения. Если не указано иное, все таутомерные формы соединений изобретения находятся в пределах объема правовых притязаний изобретения. Кроме того, если не указано иное, подразумевается, что структуры, изображенные в данном документе, включают соединения, которые отличаются только в присутствии одного или более изотопно обогащенных атомов. Например, в пределах объема правовых притязаний данного изобретения находятся соединения, имеющие настоящие структуры, включая замещение водорода дейтерием или тритием или замещение углерода ¹³C- или ¹⁴C-обогащенным углеродом. Такие соединения используются, например, в качестве аналитических инструментов, в качестве зондов в биологических испытаниях или в качестве лекарственных препаратов в соответствии с настоящим изобретением.

Как используется в данном документе, термин «фармацевтически приемлемая соль» относится к тем солям, которые в рамках медицинской точки зрения подходят для использования в контакте с тканями людей и низших животных без чрезмерного токсичного, раздражающего, аллергического ответа и т.п., и соизмеримы с разумным соотношением пользы/риска. Фармацевтически приемлемые соли хорошо известны в данной области. Например, Berge et al., подробно описывают фармацевтически приемлемые соли в J. Pharmaceutical Sciences, 1977, 66, 1-19, включенном в данный документ посредством ссылки. Фармацевтически приемлемые соли соединений данного изобретения включают соли, полученные из подходящих неорганических и органических кислот и оснований. Примерами фармацевтически приемлемых, нетоксичных солей присоединения кислоты являются соли аминогруппы, образованной неорганическими кислотами, такими как соляная кислота, бромистоводородная кислота, фосфорная кислота, серная кислота и хлорная кислота, или органическими кислотами, такими как уксусная кислота, щавелевая кислота, малеиновая кислота, винная кислота, лимонная кислота, янтарная кислота или малоновая кислота или за счет использования других способов, известных в данной области, таких как ионный обмен. Другие фармацевтически приемлемые соли включают соли адипинат, альгинат, аскорбат, аспартат, бензенсульфонат, бензоат, бисульфат, борат, битурат, камфорат, камфорсульфонат, цитрат, циклопентанпропионат, диглюконат, додецилсульфат, этансульфонат, формат, фумарат, глюкогептонат, глицерофосфат, глюконат, гемисульфат, гептаноат, гексаноат, гидройодид, 2-гидрокси-этансульфонат, лактобионат, лактат, лаурат, лаурил сульфат, малат, малеат, малонат, метансульфонат, 2-нафталенсульфонат, никотинат, нитрат, олеат, оксалат, пальминат, памоат, пектинат, персульфат, 3-фенилпропионат, фосфат, пиркат, пивалат, пропионат, стеарат, сукцинат, сульфат, тартрат, тиоцианат, p толуенсульфонат, ундеканоат, валерат, и т.п. Соли, полученные из соответствующих оснований, включают соли щелочных металлов, щелочноземельных металлов, аммония и N⁺(C_1-4 алкил)₄^-. Типичные соли щелочных и щелочноземельных металлов включают натрия, лития, калия, кальция, магния и т.п. Дополнительные фармацевтически приемлемые соли при необходимости включают нетоксичные катионы аммония, четвертичного аммония и амина, образованные при использовании противоионов, таких как галид, гидроксид, карбоксилат, сульфат, фосфат, нитрат, низший алкилсульфонат и арилсульфонат.

Термин «сольват» относится к формам соединения, которые связываются с растворителем, обычно посредством реакции сольволиза. Такая физическая связь может представлять собой водородную связь. Традиционные растворители включают воду, метанол, этанол, уксусную кислоту, DMSO, THF, диэтиловый эфир и т.п. Соединения, описанные в данном документе, например, с формулой (I), могут быть получены, напр., в кристаллической форме, и могут быть сольватированы. Подходящие сольваты включают фармацевтически приемлемые сольваты и дополнительно включают как стехиометрические сольваты, так и нестехиометрические сольваты. В некоторых случаях сольват будет способен к изоляции, например, когда одна или более молекул растворителя заключены в кристаллическую решетку кристаллического твердого вещества. «Сольват» охватывает как жидкую фазу, так и поддающиеся изоляции сольваты. Типичные сольваты включают гидраты, этанолаты и метанолаты.

Термин «гидрат» относится к соединению, которое связано с водой. Обычно, число молекул воды, содержащихся в гидрате соединения, находится в определенном соотношении с числом молекул соединения в гидрате. Вследствие этого, гидрат соединения может быть представлен, например, общей формулой R⋅x H₂O, в которой R представляет собой соединение и в которой x составляет число больше чем 0. Данное соединение может образовывать более чем один тип гидратов, включая, напр., моногидраты (x составляет 1), низшие гидраты (x составляет число больше чем 0 и меньше чем 1, напр., полугидраты (R⋅0,5 H₂O)), и полигидраты (x составляет число больше чем 1, напр., дигидраты (R⋅2 H₂O) и гексагидраты (R⋅6 H₂O)).

«Больной», которому предусматривается введение, включает, но без ограничения, людей (т.е., мужчин или женщин любой возрастной группы, напр., педиатрического больного (напр., младенца, ребенка, подростка) или взрослого человека (напр., молодого человека, человека средних лет или пожилого человека)) и/или других, не являющихся людьми животных, например, млекопитающих (напр., приматов (напр., макак-крабоедов, макак-резус); имеющих коммерческое значение млекопитающих, таких как крупный рогатый скот, свиньи, лошади, овцы, козы, кошки и/или собаки) и птиц (напр., имеющих коммерческое значение птиц, таких как куры, утки, гуси и/или индейки). В некоторых вариантах осуществления животным является млекопитающее. Животными могут быть самцы или самки в любой стадии развития. Не являющимися людьми животными могут быть трансгенные животные. В некоторых вариантах осуществления больным является человек.

Термины «давать лекарство», «введение» или «применение», как используется в данном документе, относится к имплантации, абсорбции, глотанию, инъекции, ингаляции или введению соединения изобретения или его фармацевтической композиции иным образом.

Как используется в данном документе, термины «лечение», «лечить» и «обработка» относятся к купированию, ослаблению, откладыванию наступления или ингибированию развития «патологического состояния» (напр., заболевания, расстройства или состояния, или одного или более его признаков или симптомов), описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления «лечение», «лечить» и «обработка» требуют, чтобы признаки или симптомы заболевания, расстройства или состояния развились или были очевидны. В других вариантах осуществления лечение может проводиться в отсутствии признаков или симптомов заболевания или состояния. Например, лечение может быть назначено восприимчивому человеку до появления симптомов (напр., на основании симптомов истории болезни и/или на основании генетических или других факторов восприимчивости). Лечение также может продолжаться после исчезновения симптомов, например, для отсрочки или предотвращения рецидива.

Как используется в данном документе, термины «состояние», «заболевание» и «расстройство» используются взаимозаменяемо.

«Эффективное количество» соединения, описанного в данном документе, например, с формулой (I), относится к количеству, достаточному, чтобы добиться желательного биологического ответа, т.е., лечения состояние. Как будет понятно рядовым специалистам в данной области, эффективное количество соединения, описанного в данном документе, например, с формулой (I), может варьировать в зависимости от таких факторов, как желательное биологическое конечное состояние, фармакокинетика соединения, подлежащее лечению состояние, режим введения, и возраст и здоровье больного. Эффективное количество охватывает терапевтическое и профилактическое лечение. Например, при лечении рака эффективное количество соединения изобретения может уменьшать опухолевую массу или остановку роста или распространения опухоли.

«Терапевтически эффективным количеством» соединения, описанного в данном документе, например, с формулой (I), является количество, достаточное для обеспечения пользы от лекарственного средства при лечении состояния или для отсрочки или минимизации одного или более симптомов, связанных с состоянием. В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективным количеством является количество, достаточное для обеспечения терапевтической пользы при лечении состояния или для минимизации одного или более симптомов, связанных с состоянием. Терапевтически эффективное количество соединения означает количество лекарственного препарата отдельно или в комбинации с другими видами терапии, которое обеспечивает терапевтическую пользу при лечении состояния. Термин «терапевтически эффективное количество» может охватывать количество, которое улучшает общую терапию, уменьшает или устраняет симптомы или причины состояния, или усиливает терапевтическую эффективность другого лекарственного препарата.

Термины «новообразование» и «опухоль» используются в данном документе взаимозаменяемо и относятся к массе атипичной ткани, при этом рост массы обгоняет и не соответствует росту нормальной ткани. Новообразование или опухоль может быть «доброкачественной» или «злокачественной» в зависимости от следующих характеристик: степени клеточной дифференцировки (включая морфологию и функциональность), скорости роста, местного прорастания и метастазов. «Доброкачественное новообразование» обычно хорошо дифференцировано, имеет характерно более медленный рост, чем злокачественное новообразование, и остается локализованным в месте происхождения. В дополнение, доброкачественное новообразование не имеет возможности инфильтрации, прорастания или метастазирования в удаленные участки. Иллюстративные доброкачественные новообразования включают, но без ограничения, липому, хондрому, аденомы, акрохордон, сенильные ангиомы, себорейный кератоз, лентиго и гиперплазию сальных желез. В некоторых случаях определенные «доброкачественные» опухоли позже могут давать начало злокачественным новообразованиям, что может быть обусловлено дополнительными генетическими изменениями в субпопуляции опухолевых неопластических клеток, и эти опухоли называются «предраковыми новообразованиями». Иллюстративным предраковым новообразованием является тератома. В отличие от этого «злокачественное новообразование» обычно слабо дифференцировано (анаплазия) и имеет характерно быстрый рост, сопровождающийся постепенной инфильтрацией, прорастанием и разрушением окружающей ткани. Кроме того, злокачественное новообразование обычно обладает способностью давать метастазы в удаленные участки.

Как используется в данном документе, термин «рак» относится к злокачественному новообразованию (Stedman's Medical Dictionary, 25th ed.; Hensly ed.; Williams & Wilkins: Philadelphia, 1990). Иллюстративные виды рака включают, но без ограничения неврому слухового нерва; аденокарциному; рак надпочечников; рак анального канала; ангиосаркому (напр., лимфангиосаркому, лимфангиоэндотелиосаркому, гемангиосаркому); рак червеобразного отростка; доброкачественноую моноклональную гаммапатию; рак билиарной системы (напр., холангиокарциному); рак мочевого пузыря; рак молочной железы (напр., аденокарциному молочной железы, папиллярную карциному молочной железы, рак молочной железы, медуллярную карциному молочной железы); рак головного мозга (напр., менингиому, глиобластомы, глиому (напр., астроцитому, олигодендроглиому), медуллобластому); рак бронхов; карциноидную опухоль; рак шейки матки (напр., аденокарциному шейки матки); хориокарциному; хордому; краниофарингиому; рак соединительной ткани; эпителиальную карциному; эпендимому; эндотелиосаркому (напр., саркому Капоши, множественную идиопатическую геморрагическую саркому); рак эндометрия (напр., рак матки, саркому матки); рак пищевода (напр., аденокарциному пищевода, аденокарциному Баретта); саркому Юинга; рак глазного яблока (напр., внутриглазную меланому, ретинобластому); семейную гиперэозинофилию; рак желчного пузыря; рак желудка (напр., аденокарциному желудка); гастроинтестинальную стромальную опухоль (GIST); рак половых клеток; рак головы и шеи (напр., плоскоклеточный рак головы и шеи, рак полости рта (напр., плоскоклеточный рак полости рта), рак горла (напр., рак гортани, рак глотки, рак носоглотки, рак ротоглотки)); гемопоэтические виды рака (напр., лейкоз, такой как острый лимфоцитарный лейкоз (ALL) (напр., B-клеточный ALL, T-клеточный ALL), острый миелоцитарный лейкоз (AML) (напр., B-клеточный AML, T-клеточный AML), хронический миелоцитарный лейкоз (CML) (напр., B-клеточный CML, T-клеточный CML), и хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL) (напр., B-клеточный CLL, T-клеточный CLL)); лимфому, такую как лимфома Ходжкина (HL) (напр., B-клеточная HL, T-клеточная HL) и неходжкинская лимфома (NHL) (напр., B-клеточная NHL, такая как диффузная крупноклеточная лимфома (DLCL) (напр., диффузная крупноклеточная B-клеточная лимфома), фолликулярную лимфому, хронический лимфоцитарный лейкоз/мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому (CLL/SLL), лимфому из клеток мантии (MCL), В-клеточные лимфомы маргинальной зоны (напр., лимфомы из лимфоидной ткани слизистых оболочек (MALT), узловую B-клеточную лимфому маргинальной зоны, В-клеточную лимфому маргинальной зоны селезенки), первичную медиастинальную В-крупноклеточную лимфому, лимфому Беркитта, лимфоплазмоцитарную лимфому (т.е., макроглобулинемию Вальденстрема), волосатоклеточный лейкоз (HCL), иммунобластную крупноклеточную лимфому, B-лимфобластную лимфому из клеток-предшественников и первичную лимфому центральной нервной системы (ЦНС); и T-клеточную NHL, такую как T-лимфобластная лимфома/лейкоз из клеток-предшественников, периферическая T-клеточная лимфома (PTCL) (напр., кожная T-клеточная лимфома (CTCL) (напр., грибовидный микоз, синдром Сезари), ангиоиммунобластная Т-клеточная лимфома, внеузловая T-клеточная лимфома из натуральных киллеров, Т-клеточная лимфома энтеропатического типа, Т-клеточная лимфома типа подкожного панникулита и анапластическая крупноклеточная лимфома); сочетание одного или более лейкоза/лимфомы, как описано выше; и миеломную болезнь (MM)), болезнь тяжелых цепей (напр., болезнь альфа-цепей, болезнь гамма-цепей, болезнь мю-цепей); гемангиобластому; рак гортанной части глотки; воспалительные миофибробластические опухоли; иммуноцитарный амилоидоз; рак почки (напр., нефробластому, также известную как опухоль Вильмса, почечноклеточную карциному); рак печени (напр., печеночноклеточный рак (HCC), злокачественную гепатому); рак легкого (напр., бронхогенную карциному, мелкоклеточный рак легкого (SCLC), немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), аденокарциному легкого); лейомиосаркому (LMS); мастоцитоз (напр., системный мастоцитоз); рак мышц; миелодиспластический синдром (MDS); мезотелиому; миелопролиферативное нарушение (MPD) (напр., истинную полицититемию (PV), эссенциальный тромбоцитоз (ET), агногенную миелоидную метаплазию (AMM), также известную как миелофиброз (MF), хронический идиопатический миелофиброз, хронический миелоцитарный лейкоз (CML), хронический нейтрофильный лейкоз (CNL), гиперэозинофильный синдром (HES)); нейробластому; нейрофиброму (напр., нейрофиброматоз (NF) 1 типа или 2 типа, шванноматоз); нейроэндокринный рак (напр., нейроэндокринную опухоль желудочно-кишечного тракта и поджелудочной железы (GEP NET), карциноидную опухоль); остеосаркому (напр., рак кости); рак яичников (напр., цистаденокарциному, эмбриональную карциному яичников, аденокарциному яичников); папиллярную аденокарциному; рак поджелудочной железы (напр., аденокарциному поджелудочной железы, внутрипротоковую. Папиллярную муцинозную опухоль (IPMN), опухоли островковых клеток); пенильный рак (напр., болезнь Педжета полового члена и мошонки); пинеалому; примитивную нейроэктодермальную опухоль (PNT); плазмоклеточную опухоль; паранеопластические синдромы; интраэпителиальные новообразования; рак простаты (напр., аденокарциному простаты); рак прямой кишки; рабдомиосаркому; рак слюнных желез; рак кожи (напр., плоскоклеточный рак (SCC), кератоакантому (KA), меланому, базальноклеточную карциному (BCC)); рак тонкой кишки (напр., рак червеобразного отростка); саркому мягких тканей (напр., злокачественную фиброзную гистиоцитому (MFH), липосаркому, злокачественную опухоль оболочек периферических нервов (MPNST), хондросаркому, фибросаркому, миксосаркому); карциному сальных желез; рак тонкой кишки; карциному потовых желез; синовиому; рак яичка (напр., семиному, тестикулярную эмбриональную карциному); рак щитовидной железы (напр., папиллярную карциному щитовидной железы, папиллярную карциному щитовидной железы (PTC), медуллярный рак щитовидной железы); рак мочеиспускательного канала; рак влагалища; и рак вульвы (напр., болезнь Педжета вульвы).

Термин «биологический образец» относится к любому образцу, включая образцы тканей (такие как срезы тканей и пункционные биоптаты ткани); образцы клеток (напр., цитологические мазки (такие как мазок по Папаниколау или мазки крови) или образцы клеток, полученные посредством миниразрезов); образцы целых организмов (такие как образцы дрожжей или бактерий); или фракции, фрагменты или органеллы клеток (такие как полученные посредством лизиса клеток и разделения их компонентов путем центрифугирования или подобным). Другие примеры биологических образцов включают кровь, сыворотку, мочу, семенную жидкость, фекалии, цереброспинальную жидкость, интерстициальную жидкость, слизь, слезную жидкость, пот, гной, биоптированную ткань (напр., полученную посредством хирургической биопсии или пункционной биопсии), аспираты из соска, молоко, вагинальную жидкость, слюну, мазки (такие как буккальные мазки) или любой материал, содержащий биомолекулы, который получен из первого биологического образца. Биологические образцы также включают те биологические образцы, которые являются трансгенными, такие как трансгенный ооцит, сперматозоид, бластоциста, эмбрион, плод, донорская клетка или клеточное ядро. В некотором аспекте биологический образец больного, страдающего AML или MDS, представляет собой пункционный аспират костного мозга.

Термин «ген RARA» относится к последовательности геномной ДНК, которая кодирует функциональный ген рецептора-α ретиноевой кислоты, и конкретно исключает слияния генов, которые содержат весь ген RARA или его части. В некоторых вариантах осуществления ген RARA расположен в chr17:38458152-38516681 в геномной конструкции hg19.

Термин «энхансер» относится к области геномной ДНК, действующей с регуляцией генов до 1 миллиона пар оснований. Энхансер может перекрывать, но часто не состоит из кодирующих областей гена. Энхансер часто связывается факторами транскрипции и обозначается конкретными гистонными метками.

Термин «суперэнхансер» относится к подмножеству энхансеров, которые содержат непропорционально большую долю гистонных меток и/или транскрипционных белков относительно других энхансеров в конкретной клетке. По причине этого ген, регулируемый суперэнхансером, как ожидается, будет иметь большую важность для функционирования этой клетки. Суперэнхансеры обычно определяются по порядку ранжирования всех энхансеров в клетке на основании активности и определения при использовании доступного программного обеспечения, такого как ROSE (https://bitbucket.org/young_computation/rose), подмножества энхансеров, которые имеют значительно более высокую активность, чем у среднего энхансера в клетке (см., напр., патент США 9181580, который включен в данный документ посредством ссылки.

Термин «первичный РНК-транскрипт», как используется в данном документе, относится к продукту транскрипции РНК из последовательности ДНК, которая содержит одно или более из кодирующей области гена и энхансера или суперэнхансера, связанного с этим геном. В некоторых вариантах осуществления термин «первичный РНК-транскрипт» является взаимозаменяемым с термином «эРНК» или «энхансерной РНК», когда такая РНК содержит РНК, полученную из ДНК, соответствующей области энхансера. В других вариантах осуществления термин «первичный РНК-транскрипт» относится к мРНК, транскрибированной из кодирующей области гена.

Термин «активность» при ссылке на участок энхансера или суперэнхансера, как используется в данном документе, означает площадь под кривой ряда ридов H3K27Ac или других геномных маркеров, нанесенных на графике напротив длины проанализированного сегмента геномной ДНК. Таким образом, «активность» представляет собой интеграцию сигнала, возникающего в результате измерения метки в данной паре оснований на протяжении пар оснований, образующих область, выбранную для измерения.

Термин «ранг распространенности» для указанного значения (напр., активности суперэнхансера, связанного с геном RARA) означает процентную долю популяции, которая равна или больше чем это конкретное значение. Например, ранг распространенности 35% для активности суперэнхансера, связанного с геном RARA в тестируемой клетке, означает, что 35% популяции имеют энхансер гена RARA с активностью, равной или больше чем в тестируемой клетке.

Термин «предел распространенности» для указанного значения (напр., активности суперэнхансера, связанного с геном RARA) означает ранг распространенности, который определяет разделительную линию между двумя подмножествами популяции (напр., пациентов с ответом на лечение и пациентов с отсутствием ответа). Таким образом, ранг распространенности, который равен или выше (т.е., более низкое процентное значение) предела распространенности, образует одно подмножество популяции; а ранг распространенности, который ниже (напр., более высокое процентное значение) предела распространенности, образует другое подмножество популяции.

Термины «предел» и «значение предела» подразумевает значение, измеренное в испытании, которое определяет разделительную линию между двумя подмножествами популяции (напр., пациентов с ответом на лечение и пациентов с отсутствием ответа). Таким образом, значение, которое равно или выше значения предела, образует одно подмножество популяции; а значение, которое ниже значения предела, образует другое подмножество популяции.

Термины «порог» и «пороговый уровень» означают уровень, который определяет разделительную линию между двумя подмножествами популяции (напр., пациентов с ответом на лечение и пациентов с отсутствием ответа). Пороговым уровнем может быть предел распространенности или значение предела.

Термин «популяция» или «популяция образцов» означает достаточное число (напр., по меньшей мере 30, 40, 50 или более) различных образцов, которое достаточно отражает распределение значения, измеряемого в большой группе. Каждый образец в популяции образцов может представлять собой клеточную линию, биологический образец, полученный из живого существа (напр., биопсию или образец текучей среды организма), или образец, полученный из ксенотрансплантата (напр., опухоли, растущей в мыши за счет имплантации клеточной линии или образца пациента), при этом каждый образец происходит из живого существа, страдающего от клеточной линии или ксенотрансплантата, представляющего такое же заболевание, состояние или расстройство.

Термин «порядковый ранг» указанного значения означает ранговый порядок этого значения по сравнению с набором других значений. Например, порядковый ранг, равный 100, в показателях активности суперэнхансера, связанного с геном RARA в тестируемой клетке по сравнению с другими суперэнхансерами в тестируемой клетке, означает, что 99 других суперэнхансеров в тестируемой клетке имели большую активность чем суперэнхансер, связанный с геном RARA.

Термин «порядок ранжирования» означает порядок значений от самого высокого до самого низкого или от самого низкого до самого высокого.

Подробное Описание Некоторых Вариантов Осуществления Изобретения

Идентификация и Определение Пороговых Уровней Суперэнхансера RARA

Идентификация энхансера или суперэнхансера может достигаться различными способами, известными в данной области, например, как описано в Cell 2013, 155, 934-947 и PCT/US2013/066957, которые обе включены в данный документ посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления идентификация суперэнхансера достигается посредством получения клеточного материала и ДНК из образца рака у пациента (напр., из биопсии). Важные показатели для измерения энхансера бывают в двух измерениях - длина ДНК, в которой обнаруживаются смежные геномные маркеры (напр., H3K27Ac) - и скомпилированная частота геномного маркера в каждой паре оснований на протяжении ДНК, составляющей величину. Измерение площади под кривой («AUC»), обусловленной интеграцией длины и анализ величины определяет активность энхансера. Именно активность суперэнхансера RARA относительно контроля используется в одном аспекте настоящего изобретения для определения, будет ли больной реагировать на агонист RARA или нет. Специалистам в данной области будет весьма очевидно, что если длина ДНК, на протяжении которой выявлены геномные маркеры, одинакова и для RARA и для контроля, то соотношение величины суперэнхансера RARA относительно контроля будет эквивалентно активности и может также использоваться для определения, будет ли больной реагировать на агонист RARA или нет.

С помощью методов ChIP-seq H3K27Ac авторы изобретения определили, что в chr17:38458152-38516681 (геномная конструкция hg19) имеется локус с суперэнхансером, связанным с геном RARA. Такой локус фактически перекрывает сам локус гена RARA и, вследствие этого, как считается, является локусом суперэнхансера, связанного с этим геном по причине близости/перекрывания. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления определение активности суперэнхансера, связанного с геном RARA, согласно настоящему изобретению требует анализа только данного конкретного участка генома, в отличие от требования анализа всего генома.

ChIP-секвенирование, также известное как ChIP-seq, используется для анализа взаимодействия белков с ДНК. ChIP-seq объединяет иммунопреципитацию хроматина (ChIP) с массивно-параллельным секвенированием ДНК для идентификации участков связывания ассоциированных с ДНК белков. Его можно использовать для точного картирования глобальных участков связывания для любого интересующего белка. До этого наиболее обычной технологией, используемой для исследования этих связей белков с ДНК, была ChIP-on-chip. Успех ChIP-seq зависит от множества факторов, включая силу и метод обработки ультразвуком, буферные составы, качество антител и число клеток; см., напр., T. Furey, Nature Reviews Genetics 13, 840-852 (December 2012); M.L. Metzker, Nature Reviews Genetics 11, 31-46 (January 2010); и P.J Park, Nature Reviews Genetics 10, 669-680 (October 2009)). Другие геномные маркеры вместо H3K27Ac, которые можно использовать для идентификации суперэнхансеров при использовании ChIP-seq, включают P300, CBP, BRD2, BRD3, BRD4, компоненты медиаторного комплекса (J Loven, et al., Cell, 153(2):320-334, 2013), гистон 3 лизин 4 монометилированный (H3K4mel) или другие тканеспецифичные связанные с энхансером факторы транскрипции (E Smith & A Shilatifard, Nat Struct Mol Biol, 21(3):210-219, 2014) (S Pott & Jason Lieb, Nature Genetics, 47(1):8-12, 2015).

В некоторых вариантах осуществления уже существуют карты суперэнхансеров всего генома клеточной линии или образца пациента по данным ChIP-seq H3K27ac или другого маркера. В этих вариантах осуществления можно просто определить, была ли активность или порядковый ранг энхансера или суперэнхансера на таких картах в локусе chr17:38458152-38516681 (геномная конструкция hg19) равна или выше предварительно определенного порогового уровня.

В некоторых вариантах осуществления определение, равна или выше активность энхансера или суперэнхансера в локусе chr17:38458152-38516681 предварительно определенного порогового уровня, требует сравнения ридов ChIP-seq в этой области с областью, которая, как известно, содержит общераспространенный суперэнхансер или энхансер, который присутствует с аналогичными уровнями во всех клетках. Один пример такой области общераспространенного суперэнхансера является локус с суперэнхансером MALAT1 (chr11:65263724-65266724). Посредством сравнения ридов ChIP-seq в локусе RARA с ридами в локусе MALAT1, можно определить, равна или выше активность суперэнхансера в локусе RARA предварительно определенного порогового уровня или нет, и будут ли клетки в нем реагировать на агонист RARA или нет.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения пороговый уровень равен log₁₀ (AUC ридов ChIP-seq в локусе RARA («R»)/AUC ридов ChIP-seq в локусе с суперэнхансером MALAT1 («M»)), составляющему 0,25 или более. В некоторых аспектах этих вариантов осуществления пороговый уровень для идентификации пациентов с ответом на лечение агонистом RARA равен log₁₀ (R/M), составляющему 0,3 или более, 0,35 или более, или 0,4 или более.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения пороговый уровень равен (AUC ридов ChIP-seq в локусе RARA («R»)/AUC ридов ChIP-seq в локусе с суперэнхансером MALAT1 («M»)), составляющему 1,75 или больше. В некоторых аспектах этих вариантов осуществления пороговый уровень для идентификации пациентов с ответом на лечение агонистом RARA равен log₁₀ (R/M), составляющему 2,0 или более, 2,25 или более, или 2,75 или более.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения R по определению выше сравнивают с локусом с контрольным энхансером или суперэнхансером, не являющимся MALAT1 (число ридов ChIP-seq в этом другом контрольном энхансере или суперэнхансере называется «C»). При использовании другого локуса, C, с контрольным энхансером или суперэнхансером, для того, чтобы вычислить относительную активность C по сравнению с M, пороговые значения, выраженные как log₁₀ («V»), упоминавшиеся выше для сравнения с M, напр., log₁₀(R/M)≥0,25, log₁₀(R/M)≥0,3, log₁₀(R/M)≥0,35, или log₁₀(R/M)≥0,4, необходимо отрегулировать до эквивалентного значения для сравнения с C. Такое «эквивалентно отрегулированное пороговое значение» («A») рассчитывают следующим образом:

A=log₁₀(M/C)+V

В качестве неограничивающего примера, если расчетная активность суперэнхансера MALAT1 (M) в 10 раз больше, чем у контрольного энхансера или суперэнхансера, использованного в качестве сравнения (C), а пороговое значение (V) составляет 0,25, то A=log₁₀(10)+0,25=1,25, а отрегулированное пороговое значение составляет 1,25. Для этого примера, когда в качестве сравнения используется C, то log₁₀(R/C), равный или больше чем 1,25, считается эквивалентом log₁₀(R/M), равному или больше чем 0,25, когда в качестве сравнения используется M. Должно быть легко понятно, что отрегулированное пороговое значение может быть рассчитано аналогичным образом для любого дополнительного сравнения на основании его относительной активности либо к MALAT1, либо к любому другому сравнению, для которого уже было определено отрегулированное пороговое значение.

Такие же регулировки, как выше, могут быть проделаны, когда в качестве пороговых уровней используются линейные значения, сравненные с M (напр., ≥1,75 раза, ≥2,0 раза, ≥2,25 раза или 2,5 раза). В этом случае для получения соответствующих пороговых значений при сравнении R с C можно получить отношение M к C, а затем умножить пороговое значение на это отношение (т.е., (пороговое значение)_C=(M/C)(пороговое значение)_M)

Должно быть понятно, что конкретная хромосомная локализация как RARA, так и MALAT1 может отличаться для разных геномных конструкций и/или для разных типов клеток. Однако, специалист в данной области может определять такие разные локализации по локализации в таких других геномных конструкциях конкретных последовательностей, соответствующих локусам RARA и/или MALAT1 в геномной конструкции hg 19.

Другие способы идентификации суперэнхансеров включают иммунопреципитацию хроматина (JE Delmore, et al., Cell, 146(6)904-917, 2011) и набор чипов (ChIP-chip), и иммунопреципитацию хроматина с последующей количественной ПЦР (ChIP-qPCR) с использованием тех же иммунопреципитированных геномных маркеров и олигонуклеотидных последовательностей, которые гибридизируют с локусом RARA chr17:38458152-38516681 (геномная конструкция hg19). В случае ChIP-chip сигнал обычно обнаруживают по интенсивности флуоресценции, обусловленной гибридизацией зонда и входного образца для испытания, как в других методиках на основе матриц. Для ChIP-qPCR для измерения амплификации матрицы используется краситель, который становится флуоресцентным только после интеркаляции двухнитевой ДНК, генерируемой в реакции ПЦР.

В некоторых вариантах осуществления определение, имеет ли клетка суперэнхансер RARA выше необходимого порогового уровня, выполняется посредством сравнения активности энхансера RARA в тестируемой клетке с соответствующей активностью RARA в клетке, которая, как известно, не реагирует на RARA («контрольная клетка»). Предпочтительно контрольная клетка относится к тому же клеточному типу, что и тестируемая клетка. В одном аспекте этих вариантов осуществления контрольной клеткой является такая клетка в HCC1143. В другом аспекте этих вариантов осуществления контрольной клеткой является любая клетка, перечисленная на фигуре 3, в которой log₁₀(RARA/MALAT1) менее чем 0,25, менее чем 0,2, менее чем 0,15, менее чем 0,1 или менее чем 0.

В некоторых вариантах осуществления больного определяют как реагирующего на агонист RARA, если активность суперэнхансера RARA в клетке больного по меньшей мере в 1,5 раза больше, чем активность соответствующего энхансера/суперэнхансера RARA в контрольной клетке. В некоторых аспектах этих вариантов осуществления пороговый уровень активности по меньшей мере в 2,0 раза больше, по меньшей мере в 2,5 раза больше, по меньшей мере в 3 раза больше, по меньшей мере в 4 раза больше или по меньшей мере в 5 раз больше, чем в контрольной клетке. В некоторых аспектах этих вариантов осуществления активность суперэнхансера RARA как в тестируемой клетке, так и в контрольной клетке перед сравнением нормируют. Нормирование включает регулирование определенной активности суперэнхансера RARA посредством сравнения либо с другим энхансером или суперэнхансером, который является нативным и представлен с эквивалентными уровнями в обеих клетках (напр., MALAT1), либо с фиксированным уровнем экзогенной ДНК, которую «вводят» в образцы каждой из клеток перед определением активности суперэнхансера (DA Orlando et al., Cell Rep. 2014 Nov 6, 9(3):1163-70 (2014); N Bonhoure et al., Геном Res, 24:1157-68 (2014)).

В некоторых вариантах осуществления определение, имеет ли клетка активность суперэнхансера RARA выше необходимого порогового уровня, выполняется посредством сравнения активности энхансера RARA в тестируемой клетке с соответствующей активностью RARA в популяции образцов клеток, при этом каждый из образцов клеток получали из другого источника (т.е. от другого больного, из другой клеточной линии, другого ксенотрансплантата). В некоторых аспектах этих вариантов осуществления для определения порогового уровня используются образцы клеток только первичной опухоли от больных. В некоторых аспектах этих вариантов осуществления по меньшей мере несколько образцов в популяции будут протестированы на реакцию на конкретный агонист RARA для того, чтобы установить: a) самую низкую активность энхансера RARA образца в популяции, который реагирует на тот конкретный агонист RARA («наиболее слабо отвечающий»); и, необязательно, b) самую высокую активность энхансера RARA образца в популяции, который не отвечает на этот конкретный агонист RARA («наиболее сильно не отвечающий»). В этих вариантах осуществления предел активности энхансера RARA, выше которого тестируемая клетка будет считаться отвечающей на тот конкретный агонист RARA, установлен: i) равным или вплоть до на 5% выше активности энхансера RARA у наиболее слабо отвечающего в популяции; или ii) равным или вплоть до на 5% выше активности энхансера RARA у наиболее сильно не отвечающего в популяции; или iii) значение между активностью энхансера RARA наиболее слабо отвечающего и наиболее сильно не отвечающего в популяции.

Должно быть понятно, что в описанных выше вариантах осуществления обычно не все образцы в популяции необходимо тестировать на реакцию на агонист RARA, но все образцы оценивают на активность энхансера RARA. В некоторых вариантах осуществления образцы ранжируют на основании активности энхансера RARA. Выбор, какой из трех изложенных выше способов использовать для установления предела, будет зависеть от разницы в активности энхансера RARA между наиболее слабо отвечающим и наиболее сильно не отвечающим в популяции, и будет ли цель минимизировать число ложноположительных результатов или минимизировать шанс потери потенциально отвечающего образца или больного. Когда разница между наиболее слабо отвечающим и наиболее сильно не отвечающим является большой (напр., когда множество образцов не протестированы на ответную реакцию, которая попадает между наиболее слабо отвечающим и наиболее сильно не отвечающим по порядку ранжирования активности энхансера RARA), предел обычно устанавливают равным или вплоть до на 5% выше активности энхансера RARA у наиболее слабо отвечающего в популяции. Такой предел максимально увеличивает число потенциальных пациентов с ответом на лечение. Когда такая разница является небольшой (напр., когда имеется мало или нет образцов, не протестированных на ответную реакцию, которые не попадают между наиболее слабо отвечающим и наиболее сильно не отвечающим по порядку ранжирования активности энхансера RARA), предел обычно устанавливают как значение между активностью энхансера RARA наиболее слабо отвечающего и наиболее сильно не отвечающего. Такой предел минимизирует количество ложноположительных результатов. Когда наиболее сильно не отвечающий имеет активность энхансера RARA, которая больше, чем у наиболее слабо отвечающего, предел обычно устанавливают как значение, равное или вплоть до на 5% выше активности энхансера RARA у наиболее сильно не отвечающего в популяции. Такой способ также минимизирует число ложноположительных результатов.

В некоторых вариантах осуществления определение, имеет ли клетка суперэнхансер RARA выше необходимого порогового уровня, выполняется посредством сравнения порядкового числа активности энхансера RARA в тестируемой клетке с порядковым числом активности энхансера RARA в популяции образцов клеток, при этом каждый из образцов клеток получали из другого источника (т.е. от другого больного, другой клеточной линии, другого ксенотрансплантата). В этих вариантах осуществления по меньшей мере несколько образцов в популяции будут протестированы на реакцию на конкретный агонист RARA для того, чтобы установить: a) самое низкое порядковое число активности энхансера RARA образца в популяции, который отвечает на тот конкретный агонист RARA («отвечающий с наиболее низким порядковым числом»); и необязательно b) самое высокое порядковое число активности энхансера RARA образца в популяции, который не отвечает на тот конкретный агонист RARA («не отвечающий с наиболее высоким порядковым числом»). В этих вариантах осуществления предел порядкового числа активности энхансера RARA, выше которого тестируемая клетка будет считаться отвечающей на тот конкретный агонист RARA, установлен: i) равным или вплоть до на 5% выше порядкового числа активности энхансера RARA у отвечающего с наиболее низким порядковым числом в популяции; или ii) равным или вплоть до на 5% выше порядкового числа активности энхансера RARA у не отвечающего с наиболее высоким порядковым числом в популяции; или iii) значение между порядковым числом активности энхансера RARA отвечающего с наиболее низким порядковым числом и не отвечающего с наиболее высоким порядковым числом в популяции.

В описанных выше вариантах осуществления должно быть понятно, что обычно не все образцы в популяции необходимо тестировать на реакцию на агонист RARA, но все образцы оценивают на активность энхансера RARA и устанавливают порядковое число активности энхансера RARA по сравнению с другими энхансерами в одном и том же образце. Порядковое число обычно получали посредством измерения активности всех других энхансеров в клетке и определения, какой ранг (т.е., порядковое число) в показателях активности имеет энхансер RARA по сравнению с другими энхансерами.

В некоторых вариантах осуществления образцы ранжированы на основании порядкового числа активности энхансера RARA. Выбор, какой из трех изложенных выше способов использовать для установления предела, будет зависеть от разницы в порядковом числе активности энхансера RARA между отвечающим с наиболее низким порядковым числом и не отвечающим с наиболее высоким порядковым числом в популяции и рассчитан ли предел для минимизации ложноположительных результатов или максимального увеличения числа пациентов с ответом на лечение. Когда такая разница является большой (напр., когда множество образцов не протестировано на ответную реакцию, которые не попадают между отвечающим с наиболее низким порядковым числом и не отвечающим с наиболее высоким порядковым числом по порядку ранжирования порядковых чисел активности энхансера RARA), предел обычно устанавливают равным или вплоть до на 5% выше порядкового числа активности энхансера RARA у отвечающего с наиболее низким порядковым числом в популяции. Когда такая разница является небольшой (напр., когда имеется мало или нет образцов, не протестированных на ответную реакцию, которые попадают между отвечающим с наиболее низким порядковым числом и не отвечающим с наиболее высоким порядковым числом по порядку ранжирования порядкового числа активности энхансера RARA), предел обычно устанавливают в виде значения между порядковым числом активности энхансера RARA, отвечающего с наиболее низким порядковым числом и не отвечающего с наиболее высоким порядковым числом. Когда не отвечающий с наиболее высоким порядковым числом имеет порядковое число активности энхансера RARA, которое больше чем порядковое число активности энхансера RARA наиболее слабо отвечающего, предел обычно устанавливают как значение, равное или вплоть до на 5% выше порядкового числа активности энхансера RARA у не отвечающего с наиболее высоким порядковым числом в популяции.

В некоторых аспектах вариантов осуществления, где тестируемую клетку или образец сравнивают с популяцией, значение предела(пределов), полученное для популяции (напр., активность энхансера RARA или порядковое число энхансера RARA) преобразуют в ранг распространенности и предел выражают в виде процента популяции, имеющей значение предела или более высокое, т.е. предел распространенности. Не связывая себя теорией, заявители считают, что ранг распространенности тестируемого образца будет аналогичным, независимо от методологии, используемой для определения активности энхансера RARA. Таким образом, предел распространенности, определенный для одного параметра (напр., порядковое число активности энхансера RARA) является мобильным и может применяться в отношении к другому параметру (напр., уровня мРНК RARA) для определения значения предела для иного подобного параметра. Это делает возможным определение значения предела для любого параметра без необходимости экспериментального определения корреляция между уровнями такого параметра и ответа на агонист RARA. Все, что необходимо определить, это какой уровень иного подобного параметра соответствует ранее определенному пределу распространенности в популяции.

Определение Уровня мРНК RARA

Идентификация авторами изобретения локус с суперэнхансера RARA позволяет использовать транскрипты РНК для определения чувствительности вместо уровня суперэнхансера для определения чувствительности к агонисту RARA. Транскрипты РНК из самого локуса суперэнхансера могут быть определены количественно и очень хорошо коррелируют с уровнями суперэнхансера в этом локусе. Авторы изобретения также показали, что транскрипты мРНК, кодирующие RARA, также коррелируют с чувствительностью к агонистам RARA, и таким образом мРНК уровни может использоваться для идентификации клеток, которые будут реагировать на агонисты RARA.

В некоторых вариантах осуществления уровень РНК-транскрипта из локуса суперэнхансера определяют количественно при использовании количественных методов, которые сравнивают уровни РНК-транскрипта энхансера RARA в образце с соответствующими уровнями РНК-транскрипта энхансера RARA в клетке или клеточной линии, для которых известно, что они не дают ответ на агонист RARA. Такие способы включают матрицу РНК или секвенирование, основанное на способах считывания эРНК, связанных со сквозным считыванием энхансера (N Hah et al., PNAS, 112(3):E297-302, 2015), а также РНК количественную ПЦР.

В некоторых аспектах этих вариантов осуществления для идентификации чувствительности к агонисту RARA в качестве порогового используется уровень РНК-транскрипта RARA, по меньшей мере в 1,5 раза более высокий по сравнению со степенью уровня РНК-транскрипта соответствующего энхансера RARA в клетке или клеточной линии, для которых известно, что они не дают ответ на агонист RARA. В других аспектах этих вариантов осуществления порог для идентификации пациентов с ответом на лечение агонистом RARA по меньшей мере в 2,0 раза выше, по меньшей мере в 2,5 раза выше, по меньшей мере в 3 раза выше, по меньшей мере в 4 раза выше или по меньшей мере в 5 раз выше уровня РНК-транскрипта RARA по сравнению с уровнем РНК-транскрипта RARA в контрольной клетке.

В некоторых вариантах осуществления уровни мРНК RARA используются для идентификации пациентов с ответом на лечение агонистом RARA. В одном аспекте этих вариантов осуществления уровни мРНК определяют количественно при использовании технологий секвенирования РНК или количественной ПЦР РНК. В каждой из этих технологий уровень мРНК RARA определяется в тестируемой клетке и по сравнению с мРНК RARA в клетке, которая, как известно, не дает ответ на агонист RARA («контрольная клетка»), напр., клетки HCC1143. В одном аспекте этих вариантов осуществления реакцию на агонист RARA обозначает уровень мРНК RARA в тестируемой клетке, по меньшей мере в 1,5 раза более высокий по сравнению с контрольной клеткой (т.е. предварительно определенное пороговое значение по меньшей мере в 1,5 раза выше по сравнению с контрольной клеткой). В других аспектах этих вариантов осуществления реакцию на агонист RARA обозначает уровень мРНК RARA в тестируемой клетке, по меньшей мере 2 раза, по меньшей мере 2,5 раза, по меньшей мере 3 раза, по меньшей мере 4 раза или по меньшей мере 5 раза выше по сравнению с контрольной клеткой. В другом аспекте этих вариантов осуществления контрольной клеткой является любая клетка, перечисленная на фигуре 3, в которой log₁₀(RARA/MALAT1) менее 0,25, менее 0,2, менее 0,15, менее 0,1 или менее 0.

В альтернативных вариантах осуществления для идентификации пациентов с ответом на лечение агонистом RARA уровни мРНК RARA у больного (т.е. в образце опухоли, в образце раковых клеток, в образце крови и т.д.) сравнивают с использованием такого же анализа, с уровнями мРНК RARA в популяции больных, имеющих такое же заболевание или патологическое состояние. В этих вариантах осуществления по меньшей мере несколько образцов в популяции будут протестированы на реакцию на конкретный агонист RARA для того, чтобы установить: a) самый низкий уровень мРНК RARA образца в популяции, который отвечает на тот конкретный агонист RARA («наиболее слабо отвечающий на мРНК»); и необязательно, b) самый высокий уровень мРНК RARA образца в популяции, который не отвечает на тот конкретный агонист RARA («наиболее сильно не отвечающий на мРНК»). В этих вариантах осуществления предел уровня мРНК RARA, выше которого тестируемая клетка будет считаться реагирующей на тот конкретный агонист RARA, установлен: i) равным или вплоть до на 5% выше уровня мРНК RARA у наиболее слабо отвечающего на мРНК в популяции; или ii) равным или вплоть до на 5% выше уровня мРНК RARA у наиболее сильно не отвечающего на мРНК в популяции; или iii) значение между уровнями мРНК RARA наиболее слабо отвечающего на мРНК и наиболее сильно не отвечающего на мРНК в популяции.

В некоторых вариантах осуществления не нужно тестировать все образцы в популяции на реакцию на агонист RARA, но все образцы оценивают на уровни мРНК RARA. В некоторых вариантах осуществления образцы ранжированы на основании уровней мРНК RARA. Выбор, какой из трех изложенных выше способов использовать для установления предела, будет зависеть от разницы в уровнях мРНК RARA между наиболее слабо отвечающим на мРНК и наиболее сильно не отвечающим на мРНК в популяции, и рассчитан ли предел для минимизации ложноположительных результатов или максимального увеличения возможного числа пациентов с ответом на лечение. Когда такая разница является большой (напр., когда множество образцов не протестированы на ответную реакцию, которые попадают между наиболее слабо отвечающим на мРНК и наиболее сильно не отвечающим на мРНК в порядке ранжирования уровней мРНК RARA), предел обычно устанавливают равным или вплоть до на 5% выше уровня мРНК RARA у наиболее слабо отвечающего на мРНК в популяции. Когда такая разница является небольшой (напр., когда имеется мало или нет образцов, не протестированных на ответную реакцию, которые попадают между наиболее слабо отвечающим на мРНК и наиболее сильно не отвечающим на мРНК в порядке ранжирования уровней мРНК RARA), предел обычно устанавливают как значение между уровнями мРНК RARA наиболее слабо отвечающего на мРНК и наиболее сильно не отвечающего на мРНК. Когда наиболее сильно не отвечающий на мРНК имеет уровни мРНК RARA, которые больше, чем у наиболее слабо отвечающего на мРНК, предел обычно устанавливают как значение, равное или вплоть до на 5% выше уровней мРНК RARA у наиболее сильно не отвечающего на мРНК в популяции.

В некоторых вариантах осуществления популяция ранжирована на основании уровня мРНК RARA. В этих вариантах осуществления уровень мРНК RARA в каждом образце измеряют и сравнивают с уровнями мРНК всех других мРНК в клетке, чтобы получить ранжирование порядка уровня мРНК RARA. Предел на основании ранжирования порядка мРНК RARA затем определяют на основании образцов в популяции, протестированных на реакцию на агонист RARA одним и тем же способом, как описано ранее, для определения предела порядкового числа активности суперэнхансера RARA. Определенный предел порядкового числа мРНК RARA затем используют либо непосредственно, либо для определения предела распространенности, каждый из которых затем используют для стратификации дополнительных образцов на возможную реакцию на агонист RARA.

В некоторых вариантах осуществления предел для уровней мРНК RARA определяется с использованием предела распространенности, установленного на основании активности энхансера RARA или порядкового числа активности энхансера RARA, как описано выше. В некоторых аспектах этих вариантов осуществления популяцию оценивают на уровни мРНК и ранее определенный предел распространенности используют для той популяции для определения предельного уровня мРНК. В некоторых аспектах этих вариантов осуществления получают ранжированную стандартную кривую уровней мРНК RARA в популяции, и для этой стандартной кривой для определения предельного уровня мРНК RARA используют предварительно определенный предел распространенности.

В некоторых аспектах вариантов осуществления, где тестируемую клетку или образец сравнивают с популяцией, значение (значения) предельного уровня мРНК, полученное для популяции, трансформируют в ранг распространенности, и предел уровня мРНК выражают как процент популяции, имеющей значение предела или более высокое, т.е. предел распространенности.

Не связывая себя теорией, заявители надеются, что ранг распространенности тестируемого образца и предел распространенности в популяции будут аналогичными независимо от методики, используемой для определения уровней мРНК RARA.

В некоторых аспектах этих вариантов осуществления больного идентифицируют как отвечающего на агонист RARA, если его уровень мРНК RARA соответствует рангу распространенности в популяции, составляющему 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71%, 70%, 69%, 68%, 67%, 66%, 65%, 64%, 63%, 62%, 61%, 60%, 59%, 58%, 57%, 56%, 55%, 54%, 43%, 42%, 51%, 50%, 49%, 48%, 47%, 46%, 45%, 44%, 43%, 42%, 41%, 40%, 39%, 38%, 37%, 36%, 35%, 34%, 33%, 32%, 31%, 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21% или 20%, как определено посредством уровней мРНК RARA в популяции. В одном аспекте этих вариантов осуществления значение предела устанавливается на основании предела распространенности, установленного для активности энхансера RARA. В альтернативном аспекте этих вариантов осуществления значение предела установлено на основании предела распространенности, установленного для порядкового числа активности энхансера RARA. В альтернативном аспекте этих вариантов осуществления значение предела установлено на основании уровней мРНК RARA. В более конкретных аспектах этих вариантов осуществления значение предела для рака молочной железы пациентов установлено на основании предела распространенности, определенного для порядкового числа активности энхансера RARA, и это значение предела распространенности используется в отношении определения значение предела для уровней мРНК RARA. В еще более конкретных аспектах этих вариантов осуществления значение предела для рака молочной железы пациентов представляет собой значение, определенное при использовании значения распространенности, составляющее между 50% и 60%, напр., 50-55%, 55-60%, 50-56%, 50-57%, 51-55%, 51-56%, 51-57%, 52-55%, 52-56%, 52-57%, 53-55%, 54-56%, 53-56% или 54-55%. В других более конкретных аспектах этих вариантов осуществления значение предела устанавливают при использовании значения распространенности, составляющего 55% или 56%. В других более конкретных аспектах этих вариантов осуществления значение предела для пациентов с AML установлено на основании значения распространенности, определенного для порядкового числа активности энхансера RARA, и это значение распространенности используют для определения значения предела для уровней мРНК RARA. В более конкретных аспектах этих вариантов осуществления значение предела для пациентов с AML определяется с использованием предела распространенности, составляющего между 25-45%,напр., между 25-30%, 25-35%, 25-40%, 30-35%, 30-40%, 35-45%, 35-40%, 31-35%, 32-35%, 33-35%, 34-35%, 31-36%, 32-36%, 33-36%, 34-36% или 35-36%. В других более конкретных аспектах этих вариантов осуществления значение предела для пациентов с AML определяется с использованием значения распространенности, составляющего 36%. В других более конкретных аспектах этих вариантов осуществления значение предела для пациентов с AML определяется с использованием значения распространенности, составляющего 25%.

В других вариантах осуществления популяцию можно разделить на три группы - пациентов с ответом на лечение, пациентов с частичным ответом на лечение и пациентов с отсутствием ответа, и устанавливают два предельных значения или предела распространенности. Группа частично ответивших на лечение может включать пациентов с ответом на лечение и пациентов с отсутствием ответа, а также тех членов популяции, ответ которых на агонист RARA не был таким сильным, как в группе ответивших на лечение. В этих вариантах осуществления определены два значения предела или предела распространенности. Такой тип стратификации может быть отчасти полезным, когда в популяции наиболее сильно не отвечающий на мРНК RARA имеет уровни мРНК RARA, более высокие, чем наиболее слабо отвечающий на мРНК RARA. В этом сценарии предельный уровень или предел распространенности между пациентами с ответом на лечение и пациентов с частичным ответом на лечение устанавливается равным или вплоть до на 5% выше уровня мРНК RARA наиболее сильно не отвечающего на мРНК RARA; и предельный уровень или предел распространенности между пациентами с частичным ответом на лечение и пациентов с отсутствием ответа устанавливается равным или вплоть до на 5% ниже уровня мРНК RARA наиболее слабо отвечающего на мРНК RARA. Определение, следует ли вводить агонист RARA пациентам с частичным ответом на лечение, будет зависеть от оценки лечащим врачом и/или одобрения регулирующим агентством.

Способы количественного определения специфических последовательностей РНК в клетке или биологическом образце известны в данной области и включают, но не ограничиваются, флуоресцентную гибридизацию, такую как используется в услугах и продуктах, предоставляемых NanoString Technologies, основанную на матрице технологию (Affymetrix), количественную ПЦР с обратной транскриптaзой, как, например, с технологией SYBR® Green (Life Technologies) или технологией TaqMan® (Life Technologies), секвенирование РНК (напр., RNA-seq), РНК гибридизацию и усилением сигнала, как используется с RNAscope® (Advanced Cell Diagnostics), или нозерн-блот.

В некоторых аспектах этих вариантов осуществления уровень РНК-транскрипта (либо мРНК, либо или другого транскрипта RARA) как в тестируемой клетке, так и в контрольной клетке, или все элементы популяции нормируют перед сравнением. Нормирование включает регулирование определенного уровня РНК-транскрипта RARA посредством сравнения с любым другим РНК-транскриптом, который происходит и присутствует с эквивалентными уровнями в обеих клетках (напр., GADPH мРНК, 18S РНК), или до фиксированного уровня экзогенной РНК, которая «добавлена» в образцы каждой из клеток перед определением активности суперэнхансера (J Lovén et al., Cell, 151(3):476-82 (2012); J Kanno et al., BMC Genomics 7:64 (2006); J Van de Peppel et al., EMBO Rep 4:387-93 (2003)).

Виды рака и другие заболевания

Способы и упакованные фармацевтические препараты настоящего изобретения теоретически полезны для лечения любого рака, который характеризуется связью суперэнхансера с геномом RARA в таком раке. Ассоциированные с суперэнхансером гены RARA могут быть превалирующими при определенных типах рака, нежели другие. Изобретатели раскрыли суперэнхансеры, ассоциированные с RARA, при видах рака кожи, молочной железы, прямой кишки, пищевода, лимфатических узлов, легкого, яичника, матки, поджелудочной железы, простаты, почки и селезенки; и в частности при AML (особенно при AML, не являющемся APL, и при других формах AML, которые не характеризуются хромосомной транслокацией, затрагивающей геном RARA), миелодиспластическом синдроме (MDS), колоректальном раке, раке молочной железы HER2+, раке молочной железы ER+, трижды-негативном раке молочной железы, глиобластоме, глиоме, раке желудка, ренальной светлоклеточной карциноме, немелкоклеточном раке легкого, меланоме, миеломной болезни, карциноме поджелудочной железы, феохромоцитоме, параганглиоме и аденокарциноме простаты. Не связывая себя теорией, изобретатели надеются, что SE-ассоциированные гены RARA будут обнаружены в подмножествах всех видов рака, и что больные в пределах тех подмножеств будут сильнее отвечать на агонист RARA, чем другие больные, имеющие такой же тип рака без SE-ассоциированного гена RARA.

Авторы изобретения также надеются, что открытие SE-ассоциированного RARA в тканях при заболевании, не являющемся раком, предлагает потенциал для эффективного использования агонистов RARA для лечения таких заболеваний. Авторы изобретения обнаружили присутствие суперэнхансера RARA в жировой ткани, предлагая способ идентификации пациентов, страдающих диабетом или ожирением, которых можно эффективно лечить агонистом RARA. Ретиноевая кислота имеет установленную роль в дифференцировке жировой ткани (J Mercader, et al., Endocrinology, 147(100):5325-5332, 2006). В дополнение, показано отношение между PPAR-γ и RARA (A Redonnet, et al., Int J Obesity, (26)920-927, 2002).

Суперэнхансер, связанный с локусом RARA, также был определен в ряду типов гематологических клеток. Он включает гемопоэтические стволовые клетки CD133⁺, моноциты CD14⁺, ранние B-клетки CD19⁺, B-клетки CD20, зрелые T-клетки CD3⁺, гематопоэтические клетки-предшественники CD34⁺, T-хелперные клетки CD4⁺, клетки натуральные киллеры CD56 и цитотоксические T-клетки CD8⁺. Присутствие ассоциированных с RARA суперэнхансеров в этих клетках предполагает, что агонисты RARA могут быть полезны в лечении подмножеств пациентов, страдающих от определенных аутоиммунных заболеваний, включая, но не ограничиваясь, псориаз, рассеяный склероз, ревматоидный артрит, анкилозирующий спондилоартрит, целиакию, миастению, системную красную волчанку и склеродермию.

Также было обнаружено, что клетки от пациентов, страдающих аутосомно-доминантной поликистозной болезнью почек, имеют RARA-ассоциированный суперэнхансер и, таким образом, могут быть кандидатами для эффективного лечения агонистом RARA. Есть некоторые доказательства того, что ADPKD может отвечать на ретиноиды (Q Qian, et al., Kidney International, (59): 2005-2022, 2001), поэтому идентификация тех пациентов, которые также имеют SE, связанные с локусом RARA, можно использовать в качестве метода стратификации, чтобы лучше подбирать тех пациентов, которые с большей вероятностью будут отвечать на селективный агонист RARA.

В некоторых вариантах осуществления заболевание, подлежащее лечению, в способах и посредством упакованных фармацевтических композиций изобретения, представляет собой рак. В некоторых аспектах этих вариантов осуществления заболевание, подлежащее лечению, выбирают из рака молочной железы, глиобластомы, нейробластомы и AML. В некоторых более конкретных аспектах этих вариантов осуществления заболевание, подлежащее лечению, выбирают из рака молочной железы, глиомы, карциномы шейки метки и канала шейки метки, аденокарциномы ободочной и прямой кишки, плоскоклеточной карциномы головы и шеи, ренальной папиллярно-клеточной карциномы, аденокарциномы легкого, аденокарциномы поджелудочной железы, феохромоцитомы, параганглиомы, меланомы кожи, карциномы матки, MDS и AML. В некоторых более конкретных аспектах этих вариантов осуществления заболевание, подлежащее лечению, выбирают из рака молочной железы, MDS и AML. В некоторых более конкретных аспектах этих вариантов осуществления заболевание, подлежащее лечению, выбирают из рака молочной железы и AML. В даже более конкретных аспектах этих вариантов осуществления заболевание, подлежащее лечению, представляет собой AML, не являющийся APL, или AML, который не характеризуется хромосомной транслокацией, затрагивающей геном RARA.

В некоторых вариантах осуществления больной, подлежащий лечению агонистом RARA (напр., тамибаротен), страдает от рецидивирующего или рефрактерного AML. Больного классифицируют как имеющего рецидивирующий или рефрактерный AML, если он: a) не демонстрирует частичного ответа после первого цикла индукционной химиотерапии; или b) не демонстрируют полного ответ после второго цикла индукционной химиотерапии; или c) рецидив после традиционной химиотерапии; или d) при рецидиве проводят однократную трансплантацию стволовых клеток.

В некоторых вариантах осуществления больной, подлежащий лечению агонистом RARA (напр., тамибаротен), страдает от рефрактерного MDS. Больного классифицируют как имеющего рефрактерный MDS, если они: a) классифицируются как имеющие MDS с высоким риском или промежуточный-2 (при определении с использованием Международной системы прогнозирования стадии заболевания («IPPS»)) и не могут достичь какого-либо гематологического улучшения (при измерении посредством критериев IWG 2006) после по меньшей мере 4 циклов индукционной терапии гипометилирующими препаратами (напр., азацитидином, децитабином), или имеют рецидив после полного или частичного ответа любой продолжительности; или b) классифицируются как MDS промежуточный-1 по IPSS или низкого риска и либо зависят от гемотрансфузий, либо лечение препаратами, стимулирующими эритропоэз (ESA), неэффективно.

В других вариантах осуществления больным, подлежащим лечению агонистом RARA (напр., тамибаротеном), является пожилой не подходящий больной. Термин «пожилой не подходящий», как используется в данном документе, означает что больной представляет собой человека по меньшей мере 60 лет и который по определению врача не является кандидатом для стандартной индукционной терапии.

Агонисты RARА

Выбор агониста RARA, которым лечить пациента, идентифицированного как имеющего суперэнхансер, связанный с геном RARA, можно сделать из любого агониста RARA, известного в данной области. Является предпочтительным, чтобы агонист RARA, используемый в способах изобретения, был специфичен для RARA и имел агонистическую активность, значительно меньшую (по меньшей мере 10X меньше, по меньшей мере 100X меньше, по меньшей мере 1000X меньше, по меньшей мере 10,000X меньше, по меньшей мере 100000X меньше) по сравнению с другими формами RaR, напр., RaR-β и RaR-γ.

В некоторых вариантах осуществления агонист RARA выбирают из раскрытого соединения или любого соединения, попадающего в классы, указанное в любом из следующих патентов США: US 4703110, US 5081271, US 5089509, US 5455265, US 5759785, US 5856490, US 5965606, US 6063797, US 6071924, US 6075032, US 6187950, US 6355669, US 6358995 и US 6387950, каждый из которых включен посредством ссылки.

В некоторых вариантах осуществления агонист RARA выбирают из любого из следующих известных агонистов RARA, изложенных в Таблице 1, или его фармацевтически приемлемой соли, или сольвата или гидрата приведенных выше:

Таблица 1. Иллюстративные агонисты RARA, пригодные для изобретения.

Структура кодовое наименование (наименования) Am-580; CD-336; Ro-40-6055 AM-80; INNO-507; NSC-608000; OMS-0728; TM-411; TOS-80; TOS-80T; Z-208; тамибаротен Am-555S; TAC-101; амсиларотен ER-34617 ER-38930 ER-65250 ER-38925 ER-35368 E-6060 ER-41666 AGN-195183; NRX-195183; VTP-195183; VTP-5183
IRX-5183 BMS-228987 BMS-276393 BMS-231974 ABPN; CBG-41 PTB A-112 BD-4; BJ-1 тазаротен; AGN-190168 Ch-55

В некоторых вариантах осуществления агонистом RARA является тамибаротен. В некоторых вариантах осуществления агонистом RARA является (AGN-195183).

Упакованные фармацевтические композиции

Упакованные фармацевтические композиции настоящего изобретения содержат письменный вкладыш или этикетку, содержащую инструкции по использованию агониста RARA у страдающего от рака больного и который, как было определено, имеет суперэнхансер, связанный с геном RARA, имеющий активность или порядковый ранг, равные или превышающие пороговый уровень, или уровень мРНК RARA, равный или превышающий пороговый уровень. Как подробно описано выше, пороговый уровень определяется в популяции образцов либо от больных, страдающих, как диагностировано, от такого же заболевания, либо клеточных линий или ксенографических моделей такого же заболевания, как то, для лечения которого показана фармацевтическая композиция. Инструкции могут быть приклеены или иным образом прикреплены к сосуду, содержащему агонист RARA. В качестве альтернативы, инструкции и сосуд, содержащий агонист RARA, будут отделены друг от друга, но находиться вместе в одной упаковке, коробке или другом типе контейнера.

Инструкции в упакованной фармацевтической композиции обычно должны быть санкционированы или рекомендованы правительственным учреждением, одобряющим терапевтическое использование агониста RARA. Инструкции могут содержать конкретные способы определения, связан ли суперэнхансер с геном RARA, а также количественные способы определения, является ли энхансер, связанный с геном RARA, суперэнхансером, количественные способы определения уровней мРНК RARA; и/или пороговые уровни суперэнхансеров или мРНК RARA, при которых лечение упакованным агонистом RARA рекомендуется и/или предполагается терапевтически эффективным. В некоторых аспектах инструкции указывают, что композицию вводят больному, уровни мРНК RARA которого совпадают по меньшей мере с 30-ой перцентилью популяции, в которой измерены уровни мРНК RARA. В некоторых аспектах этих вариантов осуществления больной идентифицирован как отвечающий на агонист RARA, если ранг распространенности его уровня мРНК RARA составляет 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71%, 70%, 69%, 68%, 67%, 66%, 65%, 64%, 63%, 62%, 61%, 60%, 59%, 58%, 57%, 56%, 55%, 54%, 43%, 42%, 51%, 50%, 49%, 48%, 47%, 46%, 45%, 44%, 43%, 42%, 41%, 40%, 39%, 38%, 37%, 36%, 35%, 34%, 33%, 32%, 31%, 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21% или 20% в популяции, в которой измерены уровни мРНК RARA. В некоторых аспектах инструкции указывают, что композицию надо вводить больному, уровни мРНК RARA которого измерены посредством конкретного анализа.

Инструкции могут необязательно содержать информацию о схеме применения, типы рака, для которых было одобрено лечение агонистом RARA, физико-химическую информацию об агонисте RARA; фармакокинетическую информацию об агонисте RARA, информацию о взаимодействии лекарственных средств. В некоторых аспектах инструкции указывают, что композицию вводят больному, страдающему, как диагностировано, AML, не являющимся APL. В других аспектах инструкции указывают, что композицию вводят больному, страдающему, как диагностировано, от рака молочной железы. В некоторых аспектах инструкции указывают, что композицию вводят больному, страдающему, как диагностировано, MDS. В некоторых аспектах фармацевтическая композиция включает тамибаротен. В некоторых аспектах фармацевтическая композиция включает AGN-195183.

Примеры

Для того, чтобы изобретение, описанное в данном документе, можно было понять более полно, изложены следующие примеры. Синтетические и биологические примеры, описанные в этой заявке, предложены для иллюстрации соединений, фармацевтических композиций и способов, предоставленных в данном документе, и их никоим образом не следует истолковывать как ограничение объема правовых притязаний.

Пример 1. Анализ Chip-seq для идентификации RARA-ассоциированного суперэнхансера.

I. Поперечное сшивание клеток. Для культивируемых клеток авторы изобретения обычно единовременно сшивают между 5×10⁷ и 1×10⁸ клеток (эквивалентно 70-80% заселенности для адгезивных клеток в 8-12 15 см² планшетах или для клеток в суспензии в 8-12 175 см² колбах). Для каждой реакции анализа локализации авторы изобретения используют 20-50 миллионов клеток. Для адгезивных клеток авторы изобретения добавляли в планшеты 1/10 объема свежего 11% раствора формальдегида (0,1 M NaCl, 1 мМ EDTA, pH 8, 0,5 мМ EGTA pH 8, 50 мМ Hepes), кратковременно центрифугировали планшеты и давали им отстоятся при комнатной температуре («RT») в течение 8 мин. Затем авторы изобретения добавляли 1/20 объема 2,5 M глицина или 1/2 объема 1 М Tris pH 7,5 для гашения формальдегида и инкубировали в течение по меньшей мере 1 мин. Затем авторы изобретения промывали клетки 3X 20 мл холодного 1X забуференного фосфатом физиологического раствора («PBS»); собирали клетки с использованием силиконового скребка; и центрифугировали клетки при 2k в течение 10 минут при 4°C на настольной центрифуге. Затем клетки переносили в 15 мл конические пробирки и центрифугировали при 2k в течение 10 минут при 4°C. Осажденные центрифугированием клетки быстро замораживали в жидком азоте и хранили при -80°C.

Для клеток в суспензии авторы изобретения добавляли в клеточную суспензию 1/10 объема свежего 11% раствора формальдегида, перемешивали и давали смеси отстоятся при RT в течение 8 мин. Затем авторы изобретения добавляли 1/20 объема 2,5 M глицина или 1/2 объема 1 M Tris pH 7,5 для гашения формальдегида и инкубировали в течение по меньшей мере 1 мин. Затем авторы изобретения промывали клетки 3X 20-50 мл холодного 1X PBS, центрифугируя в течение 5 мин при 2000 об/мин для осаждения клеток перед и после каждого промывания. Затем клетки переносили в 15 мл конические пробирки и центрифугировали при 2k в течение 5 минут при 4°C. Супернатант удаляли, оставшуюся жидкость удаляли посредством прикладывания Kimwipe, а затем осажденные центрифугированием клетки быстро замораживали в жидком азоте и хранили при -80°C.

Для клеток, полученных из первичной крови, авторы изобретения сшивают между 2×10⁵ и 1×10⁷ клеток на образец посредством добавления 1/10 объема свежего 11% раствора формальдегида (0,1 М NaCl, 1 мМ EDTA, pH 8, 0,5 мМ EGTA pH 8, 50 мМ Hepes), обеспечивая возможность проведения сшивания при RT в течение 8 мин. Затем авторы изобретения добавляли 1/20 объема 2,5 M глицина или 1/2 объема 1 M Tris pH 7,5 для гашения формальдегида и инкубировали в течение по меньшей мере 1 мин. Затем авторы изобретения промывали клетки 3X с 1-2 мл холодного 1X PBS; и собирали клетки посредством центрифугирования. Затем сгустки клеток непосредственно подвергали анализу ChIP-seq, как описано.

Для клеток, полученных из первичной солидной ткани, авторы изобретения используют 250-500 мкг замороженной ткани на ChIP. Замороженные ткани нарезали кубиками с помощью лезвия бритвы (на холодной поверхности, <-80°C) и ножниц в течение 2 мин в 1% растворе формальдегида (1% Формальдегид; 0,1 М NaCl, 1 мМ EDTA, pH 8, 0,5 мМ EGTA pH 8, 50 мМ Hepes). Ткани нарезали в мелкую кашицу в течение 2 мин, и в кашицу добавляли 9 мл 1% раствора формальдегида. Обеспечивали возможность проведения сшивания до общего времени, равного 8 мин. Затем авторы изобретения добавляли 1/20 объема 2,5 M глицина или 1/2 объема 1 M Tris pH 7,5 для гашения формальдегида и инкубировали в течение по меньшей мере 1 мин. Затем авторы изобретения промывали клетки 3X 1-2 мл холодного 1X PBS; и собирали клетки посредством центрифугирования. Клетки ресуспендировали в 6 мл PBS (ингибиторы протеаз Containing Complete™) и гомогенизировали в гомогенизаторе Даунса ~40X со свободным пестиком. Клетки извлекали посредством центрифугирования при 3000 об/мин в течение 2 мин. Супернатант удаляли, а осажденные центрифугированием клетки быстро замораживали в жидком азоте для анализа ChIP-seq, как описано.

II. Связывание антител с магнитным шариками. Авторы изобретения используют 60 мкл Белка G Dynabeads® на 2 мл иммунопреципитата (Invitrogen). Шарики промывали 3 раза в течение 5 минут каждый 1,0 мл блокирующего буфера (0,5% BSA м/о в PBS) в 1,5 мл пробирке Eppendorf. После каждого промывания для сбора шариков использовали магнит (Invitrogen) (авторы изобретения допускают связывание магнитом в течение по меньшей мере 1 полной минуты), а затем супернатант отсасывали. Промытые шарики ресуспендировали в 250 мкл блокирующего буфера, в который добавляли 6 мкг антител, и смеси обеспечивали возможность инкубации с перемешиванием с переворачиванием в течение ночи (минимум 6 часов). Шарики со связанными антителами промывали 3X в течение 5 мин каждый 1 мл блокирующего буфера и ресуспендировали в блокирующем буфере (60 мкл на исследуемый продукт). Эти последние промывания и ресуспендирования проводили после того, как клетки обработали ультразвуком (см. следующий этап) и непосредственно перед иммунопреципитацией в течение ночи.

III. Подготовка Клеток и Геномная Фрагментация. Перед использованием авторы изобретения добавляли 1X во все лизирующие буферы ингибиторы протеаз (Complete, Roche; получали посредством растворения одной таблетки в 1 мл H₂O для 50X раствора и хранили в аликвотах при -20°C). Каждую пробирку с клетками (приблизительно 5×10⁷ клеток) ресуспендировали в 5-10 мл лизирующего буфера 1 (LB1; 140 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 10% глицерин, 0,5% NP-40, 0,25% Triton X-100) и покачтвалипри 4°C в течение 10 минут. Клетки центрифугировали при 2000 об/мин x 5 мин в настольной центрифуге при 4°C, и супернатант отсасывали. Клетки ресуспендировали в 5 мл лизирующего буфера 2 (LB2; 200 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 0,5 мМ EGTA, 10 мМ Tris pH 8) и инкубировали с переворачиванием при 4°C в течение 10 минут. Клетки снова осаждали центрифугированием при 2000 об/мин x 5 мин в настольной центрифуге при 4°C и промывали в 2-5 мл ультразвукового буфера Covaris (10 мМ Tris pH 8,0, 1 мМ EDTA, 0,1% SDS). Сгустки центрифугировали при 2000 об/мин x 5 мин в настольной центрифуге при 4°C. Клетки осаждали центрифугированием при 2000 об/мин x 5 мин в настольной центрифуге при 4°C и ресуспендировали с концентрацией 20-50 миллионов клеток/1 мл ультразвукового буфера Covaris.

Один мл клеточного лизата помещали в 12×12 микропробирки Covaris и обрабатывали ультразвуком всего в течение 5 минут (пиковая мощность 140, коэффициент загрузки 5,0, циклов/пакет 200). Авторы изобретения воссоединяли соникаты в одну 15 мл пробирку, добавляли 1 объем 2X смеси для разведения (300 мМ NaCl, 2 мМ EDTA, 50 мМ Tris pH 8,0, 1,5% Triton-X, 0,1% SDS), осаждали центрифугированием нерастворимую фракцию при 14000 об/мин в течение 10 мин при 4°C и собирали супернатант в одну пробирку. Супернатант использовали в качестве входа для ChIP для иммунопреципитации хроматина. Авторы изобретения также собирали 50 мкл клеточного лизата для контроля образцов всего клеточного экстракта («вход»).

IV. Иммунопреципитация хроматина. Пятьдесят мкл конъюгированных с антителами шариков из стадии II добавляли в очищенный раствор клеточного экстракта (полученный на этапе III) в 1,5 мл пробирках и покачивали в течение ночи при 4°C (минимум 8 часов) для образования иммунопреципитата комплексов ДНК-белок.

V. Промывание, элюирование и обратное поперечное сшивание. Все буферы, использованные на этих этапах, очень холодные. Авторы изобретения использовали магнитный стенд для осаждения магнитных шариков, промытых 3 раза по 5 минут каждый с мягким перемешиванием с переворачиванием 1 мл промывочного буфера 1 (50 мМ HEPES pH 7,5; 140 мМ NaCl; 1 мМ EDTA; 1 мМ EGTA; 0,75% Triton-X; 0,1% SDS; 0,05% DOC); промывали один раз в течение 5 минут 1 мл промывочного буфера 2 (50 мМ HEPES pH 7,5; 500 мМ NaCl; 1 мМ EDTA; 1 мМ EGTA; 0,75% Triton-X; 0,1% SDS; 0,05% DOC); и один раз в течение 5 минут 1 мл промывочного буфера 3 (10 мМ Tris pH 8,0; 1 мМ EDTA; 50 мМ NaCl). Авторы изобретения отсасывали весь оставшийся промывочный буфер, шарики плавно центрифугировали при 2000 об/мин в течение 1 мин; помещали пробирки назад на магнит и удаляли все следы буфера. Затем авторы изобретения добавляли 210 мкл элюирующего буфера (50 мМ Tris pH8; 10 мМ EDTA; 1% SDS) и элюировали при 65°C в течение 60 мин с кратковременным интенсивным перемешиванием для ресуспендирования шариков каждые 15 мин. Авторы изобретения отделяли шарики от супернатанта с использованием магнита; удаляли 200 мкл супернатанта и помещали в чистую пробирку для обратного поперечного сшивания. Авторы изобретения разворачивали х-связь как исследуемого продукта, так и всех фракций клеточного экстракта в течение ночи при 65°C (минимум 8 часов, но максимум 18 часов). Затем авторы изобретения использовали нагревание для раздельного обратного поперечного сшивания как образца для иммунопреципитации, так и всех фракций клеточного экстракта посредством инкубирования в течение ночи при 65°C (минимум 8 часов, но максимум 18 часов). Нагревание облегчает гидролиз поперечных связей формальдегида.

VI. Промывание и очистка ДНК. Авторы изобретения добавляли в каждый образец 200 мкл TE (50 мМ Tris pH8; 1 мМ EDTA) и 2,7 мкл 30 мг/мл РНКазы А (итоговая концентрация 0,2 мг/мл), перемешивали и инкубировали при 37°C в течение 2 часов. Затем авторы изобретения добавляли в каждый образец 5 мкл раствора хлорида кальция (300 мМ CaCl₂ в 10 мМ Tris pH8,0) наряду с 4 мкл 20 мг/мл протеиназы K (итоговая концентрация 0,2 мг/мл), перемешивали и инкубировали при 55°C в течение 60 минут. Затем авторы изобретения в каждую пробирку добавляли 400 мкл фенола:хлороформа:изоамилового спирта в соотношении 25:24:1 (Sigma Aldrich #P3803), перемешивали в вихревом смесителе с низкой настройкой (5/10) и каждую пробирку переворачивали для дополнительного перемешивания.

Для каждого образца авторы изобретения получали пробирку PhaseLock Gel^TM (Qiagen, 3 Prime) посредством центрифугирования пробирки при комнатной температуре в течение 30 секунд при 10000 об/мин. Далее авторы изобретения добавляли в пробирку PhaseLock Gel^TM образец ДНК в феноле:хлороформе:изоамиловом спирте и центрифугировали при 12000-16000xg в течение 2 минут при комнатной температуре. Авторы изобретения переносили водный раствор в новую 1,6 мл пробирку (верхнюю фракцию), добавляли 20 мкл 5M NaCl и 1,5 мкл 20 мкг/мкл гликогена (всего 30 мкг), затем добавляли 1 мл EtOH и перемешивали посредством интенсивного перемешивания или переворачивания. Затем образец инкубировали при -20°C в течение ночи (6-16 часов). Затем авторы изобретения для осаждения ДНК центрифугировали смесь при 20000xg в течение 20 минут при 4°C, удаляли супернатант кончиком 1 мл пипетки, промывали сгустки в 800 мкл 80% EtOH, центрифугировали при 20000xg в течение 20 минут при 4°C и удаляли супернатант кончиком 1 мл пипетки. Авторы изобретения снова центрифугировали образец в течение 1 мин при 20000xg, удаляли все следы супернатанта и обеспечивали воздушную сушку в течение 5-20 минут. Сгустки не должны иметь вокруг них ободка воды и должны быть прозрачными или сухими чешуйками. Затем авторы изобретения растворяли сгусток в 60 мкл воды с использованием 10 мкл для проверки количественной ПЦР и 50 мкл для секвенирования. Для ChIP-qPCR проводили амплификацию с использованием 1 мкл образца на лунку с 0,8 мкМ прямого (F) и обратного (R) праймеров, каждый перемешивали с 2x Power SYBR Green PCR Master Mix от Life Technologies, следуя протоколу производителя. Использованы праймеры, которые показаны в таблице ниже, где V1, V2 и V3 представляют собой пары праймеров, предназначенных для гибридизации в различные области внутри энхансера RARA и «down» представляют собой пару праймеров, предназначенную для гибридизации с расположенной дальше неацетилированной, не кодирующей гены контрольной областью.

V1 V3 F AAACGTGTCCCCACCTCTC (SEQ ID NO:1) F TTCCTAGTGGTCCCCCTTCC (SEQ ID NO:5) R CCAGCCAGGCACATAGGG (SEQ ID NO:2) R TGAAGATTGTTTGCACCCCCT (SEQ ID NO:6) V2 down F GTCACCGCACTCACTTCCAT (SEQ ID NO:3) F CTGCTGGTACCCAGAAGTGAG (SEQ ID NO:7) R AAATAGCGCTCGGTGGAGAA (SEQ ID NO:4) R TGTTGAGTTTTGCCAGTCTCTT (SEQ ID NO:8)

Результаты ChIP-qPCR для клеточной линии с сильной реакцией (Au565) и со слабой реакцией (T47D) по сравнению со всем клеточным экстрактом («WCE») из каждой клетки показаны на фиг. 1A-B. Эта фигура иллюстрирует, что эти праймеры являются эффективными при измерении сильного обогащения для метки H3K27ac в энхансере для этих клеточных линий при осаждении, но не для WCE после нормирования до соседней межгенной контрольной области.

VII. Анализ ChIP-Seq и Количественное определение суперэнхансера RARA. Авторы изобретения использовали описанную выше методику использования H3K27ac Chip-seq для идентификации локуса с суперэнхансером, перекрывающего ген RARA в chr17:38458152-38516681 (геномная конструкция hg19). Эта область хромосомы была определена консенсусом по исследуемым образцам, но может до некоторой степени варьировать на основании того, какой геномный маркер обнаружен или какой тип ткани используется. Для оценки активности этого локуса с суперэнхансером в различных образцах авторы изобретения провели H3K27ac Chip-seq в каждом образце, а также определили последовательность совпадения с входным образцом для ChIP. Все H3K27ac и входные образцы выравнивали с геномом hg19, используя Bowtie2 (используя чувствительный параметр). Визуализация пути гена, показанная на фиг. 2, демонстрирует типичный образец клеток, показывая подсчеты выровненных ридов с протяженностями 1 пары оснований, где каждый рид продолжается 200 пар оснований в направлении выравнивания. Подсчеты ридов выражены в количестве выровненных ридов на миллион выровненных ридов (RPM). AUC подсчитывают путем суммирования ридов в каждой паре оснований в пределах определенного локуса. На основании локализации локуса с суперэнхансером RARA, авторы изобретения также оценивали уровень суперэнхансера RARA относительно локуса с суперэнхансером MALAT1 на существующих H3K27ac ChIP-seq картах для различных клеточных линий и образцов пациентов.

Для каждой пары H3K27Ac/входной образец (ряды в таблице на фиг. 3) подсчитывали число H3K27Ac или входных ридов, выравнивая либо с суперэнхансером RARA (chr17:38458152-38516681), либо с суперэнхансером положительного контроля в MALAT1 (chr11:65263724-65266724). Все подсчеты ридов проводили в RPM. Затем авторы изобретения вычитали входной сигнал из сигнала H3K27Ac в обоих локусах для получения обогащения H3K27ac ридов ChIP-seq по сравнению с исходным уровнем (столбец DIFF). В заключение, для оценки активности суперэнхансера RARA относительно суперэнхансера положительного контроля MALAT1 авторы изобретения рассчитывали отношение сигнала обогащения H3K27Ac суперэнхансера RARA к сигналу обогащения H3K27Ac в суперэнхансере MALAT1 и показали это отношение в столбце RARA/MALAT1. Более высокое значение означало показатель более активного суперэнхансера RARA. Авторы изобретения также рассчитывали отношение log₁₀(RARA/MALAT1). Все эти значения для каждого протестированного образца показаны на фиг. 3.

log₁₀ отношения RARA/MALAT1 для всех клеточных линий рака молочной железы и AМЛ и образцов пациентов отражен на графике, как показано на фиг. 4A и 4B, соответственно. Порог 0,4 log₁₀, показанный на каждом графике, является самой низкой активностью SE, которая, как обнаружено, является чувствительной к тамибаротену в клеточных линиях in vitro. Как можно видеть на этих графиках, определенная процентная доля образцов каждого типа рака находится выше этого порога. Фиг. 5 показывает log₁₀ отношения RARA/MALAT1 для нормальных гематологических клеточных линий и протестированных образцов пациентов. Как можно видеть, определенная процентная доля образцов каждой протестированной гематологической клетки находится выше порога, можно предположить, что этот тип стратификации пациентов был бы полезным для идентификации больных с гематологическими расстройствами, которые реагировали бы на агонист RARA.

Ранг SE RARA подсчитывают с использованием ROSE, как описано в патенте США 9181580, раскрытие которого включено в данный документ посредством ссылки. Сначала ROSE используется для расчета баллов энхансеров для всех клеточных линий рака молочной железы и AML и образцов пациентов. Внутри каждого образца энхансеры ранжируют по баллам, и рангом суперэнхансера RARA является ранг энхансера, перекрывающего ген RARA (chr17:38465444-38513094) с наивысшим баллом.

Фиг. 6 показывает сравнение log₁₀ отношения RARA/MALAT1 для клеточных линий с образцами пациентов с раком молочной железы и AML. Как можно видеть на этой фигуре, образцы пациентов с обоими типами рака имеют статистически значимо более высокий уровень RARA, чем соответствующие клеточные линии. Это демонстрирует, что высокие уровни суперэнхансера RARA не являются явлением in vitro, ограниченным клеточными линиями. В дополнение, это иллюстрирует, что ожидается более высокая доля образцов пациентов, которая будет давать ответ на агонист RARA, чем клеточные линии.

Пример 2. Скрининг Различных Соединений Модуляторов RaR против панели клеток рака молочной железы.

I. Материалы. Все клеточные линии получали из ATCC и культивировали при 37°C в 5% CO₂. Все выращивали в RPMI1640 с дополнением 10 мМ буфера HEPES, 2 мМ L-глютамина, 50 ед/мл пенициллина, 50 ед/мл стрептомицина и 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS, все из Invitrogen). Клеточные линии включали AU565, SKBR3, T47D, HCC1143, MCF7, ZR-75-1 и HCC1569.

Тамибаротен, AM580 и третиноин получали из Sigma Aldrich. Тазаротеновую кислоту получали из Carbosynth. Адапален, BMS195614, BMS493, BMS961 получали из Tocris. Этретинат получали из Santa Cruz. Тазаротен получали из Selleckchem.

Специфичность агонистов различных тестируемых соединений для каждого типа RaR оценивали по Life Technologies с использованием их SelectScreen® Nuclear Profiling Services. Полученные значения показаны в таблице ниже:

RARальфа RARбета RARгамма RAR-a/RAR-g Избирательность Соединение Указанная специфичность EC50 %макс EC50 %макс EC50 %макс EC50 %макс адапален RAR 5,011 102,2 9,732 69,36 17,26 87,7 3,4444 1,1653 BMS753 RARa 1,434 122,2 700,8 6 136 19,83 94,8396 6,1624 тамибаротен RARa 0,2334 187,6 417,8 114,9 48,59 106,1 208,1834 1,7681 AM580 RARa 0,2515 199 144,8 78,24 4,951 87,06 19,6859 2,2858 тазаротеник RAR 0,3532 121,4 5,171 71,88 1,101 78,33 3,1172 1,5499 третиноин RA 1,095 149,4 1,076 92,77 1,732 99,37 1,5817 1,5035 BMS961 RARg 1169 53,22 33510 149,8 3,74 114,2 0,0032 0,4660 BMS493 антагонист 27,42 -3,417 0 0 511,5 -13,41 BMS195614 антагонист 1339 -31,01 0 0 433,6 -14,57

Как можно видеть в таблице выше, тамибаротен, BMS753 и AM580 имеют наибольшую специфичность для RARA по сравнению с RaR-γ, подтверждая таким образом их статус как специфических к RARA агонистов. Такая специфичность является важной, потому что агонизм RaR-γ связан с токсичностью. Неизвестно, что агонизм RaR-β вносит вклад в эффективность или токсичность и, вследствие этого, не должен влиять на терапевтический потенциал агониста.

II. Скрининг средней эффективности. В день эксперимента клетки гомогенизировали с использованием Accumax (EMD Millipore), подсчитывали и доводили до 40000 клеток/мл для линий рака молочной железы и до 60000 клеток/мл для AML в соответствующей ростовой среде. Используя Biotek EL406, 50 мкл клеток распределяли в белый (ATPlite) или черный (CyQuant) 384-луночные планшеты (Thermo). Чтобы обеспечить адгезию, клетки возвращали в инкубатор при 37°C. Спустя три часа соединения добавляли на планшеты, используя 20 нл 384-луночную многоканальную пипетирующую головку на рабочей станции Janus. Маточные растворы помещали в 384-луночные планшеты для соединений в маточном растворе DMSO для построения кривой доза-ответ по 10 точкам в четырех повторениях. После добавления соединений планшеты инкубировали в течение пяти или десяти дней в инкубаторе при 37°C.

Жизнеспособность клеток считывали, используя ATPlite (Perkin Elmer) или CyQuant (Life Technologies). Для ATPlite планшеты извлекали из инкубатора и перед использованием переносили в комнатную температуру. Лиофилизированный порошок реагента ATPlite ресуспендировали в лизирующем буфере и разводили 1:2 дистиллированной водой. Используя жидкостный манипулятор Biotek, в каждую лунку добавляли 25 мкл этого раствора. Планшеты инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре перед считыванием люминисцентного сигнала на люминисцентном планшетном ридере Envision (Perkin Elmer). Для CyQuant реагенты перемешивали по инструкции производителя в PBS (Gibco). Реагент добавляли, используя многоканальную пипетку, и планшеты перемещали в инкубатор за 30 минут перед считыванием на люминисцентном планшетном ридере Envision (Perkin Elmer).

Полученные данные, как описано, хранили и группировали в Microsoft Excel и анализировали, используя программное обеспечение GraphPad Prism. Проводили подбор кривой для расчета EC50 и Emax в GraphPad Prism version 6,0, используя четырехпараметрические нелинейные регрессии (угловой коэффициент Хилла принимается неравным 1) с log₁₀ преобразованными данными концентраций соединений, нанесенными на график против жизнеспособности клеток в процентах при нормировании в DMSO только обработанных лунок, содержащихся на планшете. Крайние лунки исключили.

Как показано на фиг. 7, четыре различные клеточные линии рака молочной железы демонстрируют разные ответы на тамибаротен с порядком чувствительности SKBR3>Au565>ZR75>Hcc1143. Как показано на фиг. 2, это очень хорошо коррелирует с уровнем суперэнхансера на участке RARA. Корреляция чувствительности к тамибаротену и активности суперэнхансера (log₁₀ EC₅₀ vs отношение суперэнхансеров RARA/MALAT1) для 7 различных клеточных линий рака молочной железы, как показано на фиг. 8, имеет значение корреляции (R²) 0,7086.

Как показано на фиг. 9, три разные клеточные линии AML демонстрируют разные ответы на тамибаротен с порядком чувствительности SigM5>OCI M1>HEL. Как показано на фиг. 23A-B, две дополнительные клеточные линии AML, MV411 и Kasumi, наряду с SigM5 и HEL, испытывали на чувствительность к тамибаротену и демонстрировали порядок чувствительности SigM5>MV411>HEL=Kasumi. Корреляция чувствительности к тамибаротену и активности суперэнхансера (log₁₀ EC₅₀ vs отношение суперэнхансеров RARA/MALAT1 («IEA») для 11 различных клеточных линий AML, как показано на фиг. 10, имеет значение корреляции (R²) 0,3635, но это значение увеличивается до 0,5680, когда не учитывают одну клеточную линию, HEL, которая показывает значительное отклонение от нормы (более высокий SE, но более низкая, чем ожидалось, чувствительность).

Пример 3. Измерение Уровней экспрессии РНК и Белка RARA

Измерения уровней экспрессии используют для определения уровня мРНК для меченого гена RARA. Уровни мРНК хорошо коррелируют с уровнями энхансеров и, вследствие этого, также прогнозируют чувствительность к агонистам RARA. Авторы изобретения использовали различные средства измерения РНК, как изложено ниже.

I. Методика на основе матриц. Уровни экспрессии в HCC1143 и AU565 оценивали в серии опытов с тройным повторением 1×10⁶ клеток. РНК извлекали из клеток, используя Trizol®, и очищали, используя набор для очистки РНК mirVana^TM (оба от Life Technologies), следуя протоколу производителя. Уровни РНК считывали на матрицах Affymetrix PrimeView^TM в Dana Farber Cancer Institute Microarray Core (http://mbcf.dfci.harvard.edu/).

Фиг. 11 показывает уровни экспрессии мРНК разных подтипов RAR в реагирующей (Au565) и нереагирующей (HCC1143) на тамибаротен клеточной линии, измеренные с использованием протокола выше. Экспрессия мРНК RARA в 8 раз выше в реагирующей клеточной линии против нереагирующей клеточной линии, тогда как экспрессия RaR-β и RaR-γ между клеточными линиями отличается не значительно. Это подтверждает, что анализ экспрессии мРНК RARA коррелирует с активностью суперэнхансера RARA и чувствительностью к агонисту RARA, а также демонстрирует, что уровень мРНК RARA может использоваться для прогнозирования чувствительности к такому агонисту.

II. Секвенирование РНК. Уровни экспрессии RARA количественно определяли посредством секвенирования РНК. Проводили секвенирование РНК Poly-A, и риды выравнивали с транскриптoмом HG19, используя программное обеспечение RSEM (параметры=--samtools-sort-mem 3G--ci-memory 3072--bowtie-chunkmbs 1024--quiet--output-genome-bam--bowtie2--strand-specific), а затем проводили количественное определение мРНК, используя RSEM и представляли в Транскриптах на Миллион (TPM). Нанесенные на график значения показывают, что log2(FPKM+1) уровни для RARA (ось y) против балл суперэнхансеров (RARA/MALAT1) для 48 пациентов с первичной AML (Фиг. 12) имеют корреляцию Спирмена 0,589 и значение R² 0,0457.

III. Количественная ПЦР. Также исследовали экспрессию, используя количественную ПЦР в реальном времени. Клетки подсчитывали и помещали на планшет по 200000 клеток на мл для каждой клеточной линии. Затем клетки обрабатывали 500 нМ тамибаротена или носителя в течение 48 часов. РНК экстрактировали из клеток, используя Trizol®, и очищали, используя набор для очистки РНК mirVana^TM (оба от Life Technologies), следуя протоколу производителя. Очищенную РНК преобразовывали в кДНК, используя обратную транскриптазу SuperScript® Vilo^TM (Life Technologies), следуя протоколу производителя. Затем измеряли численность транскриптов, используя зонды Taqman® (Life Technologies) с RARA и с 18s рРНК для нормирования. Для RARA использовали зонд Hs00940446_m1 с длиной ампликона 68 и охватывающие экзоны 6-7. Для 18S рРНК использовали зонд 4319413E с ампликоном 187 пар оснований. Количественную ПЦР проводили, используя Master Mix для Экспрессии Генов Taqman® (Life Technologies), следуя протоколу производителя. Анализ данных проводили, используя метод дельта Ct. Значение Ct 18s рРНК вычитали из каждого образца для нормирования по численности клеток. Значения dCt показывают относительные кратные различия численности транскриптов РНК. Более низкие значения dCt показывают более высокую экспрессию мРНК. На фиг. 13 показаны результаты значений количественной ПЦР в реальном времени для 6 разных клеточных линий рака молочной железы, нанесенные на график в порядке активности их SE (от самого высокого (SKBR3) до самого низкого (HCC1143). Как можно видеть, значение количественной ПЦР в реальном времени хорошо коррелирует с активностью суперэнхансера в локусе RARA. Фиг. 14A-B показывают, что значения dCT имеют большую корреляцию с активностью SE и с чувствительностью при измерении посредством EC₅₀.

IV. Вестерн-блоттинг. Клетки подсчитывали и доводили до 2 миллионов на клеточную линию, и осаждали центрифугированием. Клеточные сгустки лизировали, используя буфер RIPA (Life Technologies) плюс смесь протеаз Roche в объеме 100 мкл. Образцы очищали посредством центрифугирования при 20000xg в течение 5 минут. Десять мкл образца загружали на 4-12% гели Bis-Tris (Life Technologies). Для загрузки контроля и Sigma Aldrich SAB1404298 для RARA использовали антитела Abcam 1791 гистон H3. Результаты показаны на фиг. 15. Не похоже, что существует хорошая корреляция между уровнями белка RARA и либо размером суперэнхансера, либо чувствительностью клеток к агонисту RARA. Это подтверждает предыдущие результаты другой группы, которые также демонстрировали отсутствие корреляции между экспрессией белка RARA и чувствительностью к ретиноидам (G Paroni et al., Oncogene, 31:3431-43 (2012); см. Фиг. 1C в ссылке).

V. Z-балл из TCGA. Z-баллы экспрессии из наборов данных TCGA получали с cBio Portal for Cancer Genomics (http://www.cbioportal.org/public-portal/).

VI. Измерения экспрессии MDS. Из NCBI Gene Expression Omnibus (GSE58831) загрузили исходные данные экспрессии Affymetrix 159 пациентов с MDS и 17 здоровых, связанные с Gerstung et. al (PMID: 25574665). Данные экспрессии нормировали в R, используя функцию «justRMA» с параметрами по умолчанию для получения нормированных значений уровней зондов по всем образцам. Для отображения уровня мРНК RARA использовали значение зонда Affymetrix '203749_s_at'. Подсчитывали среднее и стандартное отклонение уровней RARA в 17 нормальных образцах, а затем использовали для получения Z-баллов мРНК RARA.

Пример 4. Число копий гена RARA не коррелирует с чувствительностью к тамибаротену.

Для исключения вероятности, что чувствительность к тамибаротену была основана на числе копий гена HER2 и что амплификация RARA и HER2 были взаимозависимыми, как предполагали G. Paroni et al., supra., авторы изобретения анализировали число копий генов RARA и HER2 в двух отвечающих клеточных линиях рака молочной железы - Au565 и T47D. ДНК экстрактировали, используя мини набор ДНК QIAamp® (Qiagen), следуя инструкциям производителя. Очищенную ДНК анализировали, используя микроматрицу Human Cytoscan® HD от Affymetrix. Данные обрабатывали, используя пакет Aroma от Bioconductor в статистической среде R, и наносили на график, используя базовые графики R. Как показано на фиг. 16A-B, при том, что клеточная линия Au565 имеет более высокое число копий гена HER2 (Box 1), чем RARA (Box 2), этого не видно у также отвечающей на тамибаротен линии T47D. Более того, между двумя клеточными линиями существует небольшая разница числа копий гена RARA. Это демонстрирует, что амплификация числа копий гена RARA не зависит от числа копий HER2 и что чувствительность к агонисту RARA не зависит от числа копий HER2.

Пример 5. Идентификация ассоциированных с RARA суперэнхансеров в других видах рака

Авторы изобретения использовали известные локализации домена суперэнхансера RARA для зондирования дополнительных образцов пациентов с раком для определения, имели ли такие виды рака суперэнхансер RARA. Авторы изобретения обнаружили большой суперэнхансер, связанный с RARA, в образцах пациентов как с глиобластомой, так и с нейробластомой, но не в образцах с колоректальным раком (см. Фиг. 17). Это говорит о том, что стратификация пациентов для лечения агонистом RARA также может осуществляться у пациентов, страдающих либо от глиобластомы, либо от нейробластомы. Более того, анализ Z-баллов уровней мРНК RARA говорит о том, что некоторые больные, страдающие колоректальным раком, могут отвечать на агонист RARA вопреки результатам этих суперэнхансеров (см. Фиг. 30).

Пример 6. Чувствительность Ксенотрансплантата Клеток Рака молочной железы HCC1954 к Тамибаротену.

Ксенотрансплантатные модели, полученные из клеточной линии рака молочной железы (HCC1954) на BALB/c голых с ослабленным иммунитетом мышах, получены Crown Biosciences (Beijing, China) по существу следующим образом.

Для развития опухоли BALB/c голых с ослабленным иммунитетом мышам в возрасте шесть-восемь недель, весящим 18-20 г, подкожно инокулировали в правой боковой области клетки опухоли HCC1954 (5×10⁶) в 0,1 мл PBS (матригель 1:1). Когда средний размер опухоли достигал объема 100-200 мм³, животных подбирали по объему опухоли на группы лечения для использования для дозы и инициирующей дозы. Тамибаротен вводили перорально в PBS с доведенным до 8 pH, 1% DMSO по ежедневному графику (QD, PO) в течение до 21 дня. Итоговая дозировка у мышей составляла 6 мг на кг в день в группе высокой дозы (n=10) и 3 мг на кг в день в группе низкой дозы (n=10) в объеме 10 мл/кг. Мышам в группе носителя (n=10) давали такие же схему, объем и готовую форму, но без лекарственного средства. Объем опухоли измеряли дважды в неделю посредством измерения каверномером.

Результаты этих экспериментов демонстрируют, что тамибаротен уменьшает объем опухоли в этой модели дозозависимым образом (Фиг. 18). Уменьшение объема опухоли немного ниже статистически значимого в группе низкой дозы (p=0,0552) и статистически значимо в группе высокой дозы (p=0,0048) по t-критерию с использованием коррекции Уэлша. Результаты в этой ксенографической модели подтверждают чувствительность к тамибаротену клеток HCC1945 в культуре.

Пример 7. Предел Ранга порядкового числа активности суперэнхансера RARA при Раке молочной железы

Общий профиль энхансера/суперэнхансера сто семидесяти образцов рака молочной железы (как образцов пациентов, так и клеточных линий рака молочной железы, включая HCC1954) анализировали, используя H3K27Ac и ChIP-seq, как описано в примере 1. В каждом из образцов ранг порядкового числа, ассоциированного с RARA энхансера в показателях активности (при измерении посредством H3K27Ac), определяли по сравнению с другими энхансерами и суперэнхансерами в одной и той же клетке, и определенные ранги порядковых чисел наносили на упорядоченную столбчатую диаграмму (Фиг. 19). В HCC1954 определили, что суперэнхансер RARA был 204^ым самым активным энхансером в этой клетке (см. Фиг. 19). На основании этого результата и ответной реакции HCC1954 на тамибаротен авторы изобретения установили предел порядкового числа для пациентов с раком молочной железы с потенциальной реакцией на тамибаротен для тех, кто имеет в своей опухоли суперэнхансер RARA, активность которого является по меньшей мере 200^ой. Как определено из анализа 48 образцов клеток опухоли первичного рака молочной железы у больных людей, 55,3% этих образцов имели суперэнхансер RARA, активность которого в этих клетках была по меньшей мере 200^ой (Фиг. 20A). Вследствие этого авторы изобретения установили предел распространенности 55,3%. Такой же предел распространенности также использован в качестве предела распространенности мРНК RARA при идентификации пациентов с раком молочной железы с потенциальным ответом на лечение тамибаротеном на основании измерений мРНК RARA.

Когда образцы первичного рака молочной железы дополнительно разбивают по подтипу, для каждого подтипа получают разные пределы распространенности, используя предел порядкового числа того же суперэнхансера RARA, равный 200. Эти пределы распространенности составляют 78,6% для гормон-рецептор-положительного; 56,3% для HER2-положительного; и 35,2% для трижды негативного рака молочной железы (Фиг. 20B).

Пример 8. Уровни мРНК RARA коррелируют с Реакцией на Тамибаротен в PDX Рака молочной железы

Модели Low Passage TumorGraft® рака молочной железы человека у самок мышей с ослабленным иммунитетом (Harlan; nu/nu nude) созданы Champions Oncology (Baltimore, Maryland) с использованием следующего протокола.

Мышам данной породы имплантировали образцы опухоли рака молочной железы пациентов (n=3 для каждого образца отдельного пациента и для контроля), которым позволили вырасти до 1-1,5 см³. Затем у мышей породы собирали опухоли и их фрагменты повторно имплантировали унилатерально с левой стороны предварительно обследованных мышей (самки; Harlan; nu/nu голые, 5-8 недель; n=3 для каждого отдельного образца пациента и для контроля). Когда опухоли достигает приблизительно 100-300 мм³, предварительно обследованных животных сопоставляют по объему опухоли с группами лечения, подлежащими использованию для дозы и инициирующей дозы в 0 день. Тамибаротен вводили перорально в PBS с доведенным до 8 pH, 1% DMSO по суточному графику с итоговой дозой 6 мг на кг массы тела в объеме 10 мл/кг. Мышам в группе носителя давали такие же схему, объем и готовую форму, но без тамибаротена.

Объемы опухолей измеряли каверномером два раза в неделю. Итоговое измерение объема опухоли проводили в последний день лечения. Фиг. 21A-B показывают ответную реакцию этих обеих PDX (CTG-1059 (высокий мРНК RARA) и CTG-0012 (низкий мРНК RARA) на тамибаротен («SY1425»). CTG-1059 демонстрирует статистически значимое уменьшение объема опухоли после 25 дней лечения тамибаротеном по сравнению только с контрольным носителем. CTG-0012 не показал какого-либо значимого различия между тамибаротеном и контролем.

Уровни мРНК RARA в обоих этих PDX, а также 7 других PDX рака молочной железы определяли, используя секвенирование РНК, как описано в примере 3. Авторы изобретения принимают, что эти 9 PDX представляют популяцию, имеющую нормальное распределение уровней мРНК RARA, и, используя предел распространенности 55,3% при определении на основании порядкового числа активности SE RARA, реагирующая на тамибаротен CTG-1059 имеет значение распространенности уровня мРНК RARA выше 55,3%, тогда как нереагирующая CTG-0012 имеет значение распространенности уровня мРНК RARA ниже 55,3% (Фиг. 22).

Пример 9. Предел Ранга порядкового числа активности суперэнхансера RARA при AML

Общий профиль энхансера/суперэнхансера 95 образцов AML (как образцов пациентов, так и клеточных линий AML, включая SigM5, MV411, HEL и Kasumi) анализировали, используя H3K27Ac и ChIP-seq, как описано в примере 1. В каждом из образцов ранг порядкового числа ассоциированного с RARA энхансера в показателях активности (при измерении посредством H3K27Ac) определяют по сравнению с другими энхансерами и суперэнхансерами в одной и той же клетке, и определенные ранги порядкового числа наносят на упорядоченную столбчатую диаграмму (Фиг. 23A-C). В MV411 определили, что ассоциированным с RARA энхансером был 133^ий по активности энхансер. MV411 представляет собой клеточную линию с подтвержденной реакцией на тамибаротен, имеющую самое низкое порядковое число активности суперэнхансера. В HEL определили, что ассоциированным с RARA энхансером был 155^ый по активности энхансер. HEL представляет собой клеточную линию с подтвержденным отсутствием реакции на тамибаротен, имеющую самое высокое порядковое число активности суперэнхансера. На основе этих значений авторы изобретения установили предел порядкового числа активности энхансера RARA на 150, значение между порядковым числом HEL и порядковым числом MV411.

Как определено из анализа авторов изобретения 70 первичных образцов клеток AML у больных людей, 36% этих образцов имели суперэнхансер RARA, который было по меньшей мере 150^ым по активности в этих клетках (Фиг. 24). Вследствие этого, авторы изобретения установили предел распространенности на 36%. Такой же предел распространенности также использовали в качестве предела распространенности мРНК RARA при идентификации потенциальных пациентов с AML с ответом на лечение тамибаротеном на основании измерений мРНК RARA.

Авторы изобретения также количественно определили энхансеры для расширенной панели клеточных линий AML посредством отношения энхансера RARA к энхансеру MALAT1. Нанося на график это значение отношения активности энхансеров против чувствительности к тамибаротену, авторы изобретения подтвердили, что у клеточных линий, имеющих отношения активности энхансера RARA выше 1, реагируют 5 из 6, в то время как у клеточных линий, имеющих энхансеры ниже этого уровня, реагируют только 4 из 7 (Фиг. 32). Когда предел сдвигается к отношению энхансеров RARA/MALAT 1,4 или выше, реагируют все клеточные линии (4 из 4).

Пример 10. Предел Ранга порядкового числа активности суперэнхансера RARA при AML Коррелирует с Уровнями мРНК RARA

Образцы пациентов с AML, использованные для определения 36% предела распространенности порядкового числа активности суперэнхансера RARA, сгруппировали в две группы - образцы, имеющие ранг распространенности 36% или выше (т.е. более низкое % значение), и образцы, имеющие ранг распространенности ниже 36% (т.е., более высокое % значение) - и оценили на уровень мРНК RARA, используя секвенирование РНК, как описано в примере 3. Результаты показаны на фиг. 25. Группа с рангом распространенности 36% или выше с порядковым числом активности суперэнхансера RARA имеет статистически значимо более высокий уровень мРНК RARA, чем группа ниже ранга распространенности (p<0,001). Это вновь подтвердило, что предел распространенности, определенный на уровне суперэнхансера, также может использоваться в качестве предела распространенности на уровне мРНК.

Авторы изобретения также определили уровни мРНК RARA в 11 разных клеточных линиях AML, используя секвенирование РНК, и сравнили уровни мРНК с чувствительностью к тамибаротену. Протестированные клеточные линии AML разделили на две отдельные группы на основании их чувствительности или нечувствительности к тамибаротену. Все чувствительные к тамибаротену клеточные линии имели мРНК RARA, измеренный посредством РНКseq, >10 TPM, тогда как три нечувствительные клеточные линии имели уровни ниже этого предельного уровня (Фиг. 33).

Пример 11. Чувствительность к Тамибаротену разных Ксенотрансплантатов, Полученных из Образцов Пациентов с AML.

Разные ксенографические модели, полученные из образцов пациентов с AML (AM8096, AM5512, AM7577 и AM7440) BALB/c голых с ослабленным иммунитетом мышей получены Crown Biosciences (Beijing, China) по существу следующим образом.

Приблизительно 2×10⁶ клеток из каждого образца пациента суспендировали в 100 мкл PBS и инъецировали отдельным мышам (n=3 для каждого образца разных пациентов и для контроля) посредством в/в инъекции в хвост. Для ксенотрансплантатов AM5512, AM7577 и AM7440 опухолевая масса считается достаточно высокой для начала лечения, когда концентрация клеток CD45+ человека достигает ~1-5% в периферической крови животного. Клетки CD45+ человека обнаруживали в крови мышей (полученных посредством ослепления глаз), используя клеточный сортер с активацией флуоресценции и ФИТЦ античеловеческий CD45 (Biolegend, Cat# 304037). Для ксенотрансплантатов AM8096 лечение начинали через 40 дней после инъекции клеток.

Тамибаротен вводили перорально в PBS с доведенным до 8 pH, 1% DMSO по суточному графику с итоговой дозой 6 мг на кг массы тела в объеме 10 мл/кг. Мышам в группе носителя давали такие же схему, объем и готовую форму, но без тамибаротена. Уровни клеток человека CD45⁺ в периферической крови обработанных животных и контрольных животных измеряли один раз в неделю.

Ксенотрансплантаты AM5512 и AM8096 показали значимое снижение общего % клеток CD45+, а также % клеток CD45+ в крови, костном мозге и селезенке при обработке тамибаротеном по сравнению с контролем носителем после 35 дней лечения (Фиг. 26A-F). С другой стороны, AM7577 и AM7440 не показали значимого уменьшения объема опухоли между обработанными тамибаротеном и обработанными носителем животными либо общего или в любом из крови, костного мозга или селезенки (Фиг. 27A-D).

Фиг. 28 показывает порядок ранжирования уровней мРНК RARA из образцов отдельных пациентов, использованных в начале анализа, показанного на фиг. 25. В дополнение, Фиг. 28 содержит уровни мРНК RARA каждого из образцов пациентов, использованных при исследовании ксенотрансплантатов. Два пациента с отсутствием ответа при исследовании ксенотрансплантатов AM7577 и AM7440 имеют уровни мРНК RARA, которые находятся значительно ниже 36% предела распространенности. Один из пациентов с ответом на лечение, AM8096, имеет уровень мРНК RARA выше предела распространенности 36%. Другой пациент с ответом на лечение, AM5512, находится немного ниже предела распространенности 36% (значение распространенности 46,9%). Эти результаты мРНК RARA говорят о том, что предел распространенности может быть отрегулирован вниз (напр., до 46,9%), чтобы сделать максимальным число потенциальных пациентов с ответом на лечение.

Пример 12. AM5512 является Чувствительным к Тамибаротену, но не ATRA.

Мышей с ксенотрансплантатом AM5512 получали, как описано выше. Когда концентрация клеток CD45+ человека в периферической крови животного достигает ~1-5%, их обрабатывали либо тамибаротеном (n=7; 3 мг/кг, BID), полностью трансретиноевой кислотой (ATRA; n=7; 4 мг/кг BID) или контролем носителем (n=5). Тогда как тамибаротен представляет собой RARA-специфический агонист, ATRA выступает в роли агониста всех рецепторов ретиноевой кислоты (RAR-α, RAR-β и RAR-γ). Как показано на фиг. 29A-B, мышь с ксенотрансплантатом AM5512, обработанная тамибаротеном, демонстрирует значительное снижение % клеток CD45+ после 28 дней лечения по сравнению с животными, обработанными как контролем носителем, так и ATRA, и 5 из 7 животных уцелели в ходе эксперимента. Неожиданно, тогда как мышь с ксенотрансплантатом AM5512, обработанная ATRA, демонстрирует снижение % клеток CD45+ по сравнению с контролем носителем после 14 дней лечения, ни одна из этих мышей не пережила 21 день.

Пример 13. Подмножества Образцов Пациентов с Другими Видами Рака Имеют Высокие Уровни мРНК RARA

Для ряда разных типов рака авторы изобретения использовали z-баллы уровней мРНК RARA, обеспеченные с помощью TCGA, как описано в примере 3. В нормальном распределении популяции 5% образцов должны иметь уровень мРНК RARA больше чем 2 стандартных отклонения от среднего. Фиг. 30 представляет собой таблицу, показывающую эти конкретные типы рака, имеющие больше чем 5% образцов с уровнями мРНК RARA больше чем 2 стандартных отклонения от среднего. Не связывая себя теорией, авторы изобретения полагают, что каждый из этих видов рака будет восприимчив к способам стратификации и лечения, изложенными в данном документе.

Авторы изобретения также конкретно осмотрели образцы пациентов, страдающих миелодиспластическим синдромом, который, как полагают, является раком, тесно связанным с AML. Уровни мРНК RARA у 176 пациентов (17 нормальных; 159 MDS) получали, как описано в примере 3. Образцы группировали на основании состояния заболевания, и уровни мРНК RARA наносили на график, как показано на фиг. 31. Статистический анализ результатов (T-критерий) показывает, что уровни мРНК RARA значительно повышены в образцах пациентов с MDS по сравнению с образцами нормальных пациентов (p=0,08751).

Для дополнительной проверки наличия повышенных RARA в MDS проводили анализ энхансера ChIP-seq H3K27ac в образцах костного мозга, собранных у двух пациентов с MDS. Для обоих этих пациентов локус гена RARA имел значительно более сильный сигнал H3K27ac в двух образцах костного мозга пациентов с MDS по сравнению с сигналом, обнаруженным в бластных клетках здоровых доноров. Активность суперэнхансера RARA у пациентов с MDS была аналогична активности в бластных клетках у подмножества пациентов с AML, которые имеют активные суперэнхансеры RARA и высокие уровни мРНК RARA. Кроме того, суперэнхансер RARA в клетках пациентов с MDS имел высокое порядковое число активности энхансера RARA (9 и 60, соответственно) по сравнению с бластными и незрелыми типами клеток здоровых больных.

Не связывая себя теорией, авторы изобретения полагают, что пациенты с MDS также подвержены способам стратификации и лечения, изложенным в данном документе.

Эквиваленты и Объем Правовых Притязаний

В вариантах осуществления артикли, такие как «a», «an» и «the» могут означать один или более чем один, если не указано обратное или из контекста ясно не видно иное. Варианты осуществления или описания, которые содержат «или» между одним или более элементами группы, считаются удовлетворительными, если один, более чем один, или все элементы группы присутствуют, задействованы или иным образом имеют отношение к данному продукту или процессу, если не указано противоположное или из контекста не очевидно иное. Изобретение включает варианты осуществления, в которых точно один элемент из группы присутствует, задействован или иным образом имеют отношение к данному продукту или процессу. Изобретение включает варианты осуществления, в которых более чем один, или все элементы группы присутствуют, задействованы или иным образом имеют отношение к данному продукту или процессу.

Кроме того, изобретение охватывает все варианты, комбинации и изменения, в которых одно или более ограничений, элементов, положений и описательных терминов из одного или более перечисленных вариантов осуществления вводят в другой вариант осуществления. Например, любой вариант осуществления, который зависит от другого варианта осуществления, может быть видоизменен с включением одного или более ограничений, найденных в любом другом варианте осуществления, который зависит от такого же базового варианта осуществления. Когда элементы представлены в виде списка, напр., в формате группы Маркуши, каждая подгруппа элементов также раскрыта, и любой элемент (элементы) может быть удален из группы. Должно быть понятно, что в целом, когда изобретение, или аспекты изобретения, называется/называются включающими конкретные элементы и/или признаки, некоторые варианты осуществления изобретения или аспекты изобретения состоят, или по существу состоят, из таких элементов и/или признаков. С целью упрощения, такие варианты осуществления отдельно не излагаются в данном документе в тех же выражениях. Также следует заметить, что термины «содержащий» и «заключающий в себе» предназначены быть открытыми и допускают включение дополнительных элементов или этапов. Когда указаны диапазоны, включаются конечные точки. Кроме того, если не указано иное или иное не очевидно из контекста и понимания рядового специалиста в данной области, значения, которые выражены в виде диапазонов, могут принимать любое конкретное значение или поддиапазон внутри указанных диапазонов в разных вариантах осуществления изобретения, до десятой части нижнего предела, если в контексте явно не указано иное.

Данная заявка связана с разными выданными патентами, опубликованными патентными заявками, журнальными статьями и другими публикациями, которые все включены в данный документ посредством ссылки. Если между любой из включенных ссылок и настоящим описанием имеется конфликт, приоритет имеет описание. В дополнение, любой конкретный вариант осуществления настоящего изобретения, который попадает в пределы предшествующего уровня техники, может быть явно исключен из любого одного или более вариантов осуществления. Поскольку такие варианты осуществления считаются известными рядовому специалисту в данной области, они могут быть исключены, даже если исключение явно здесь не указано. Любой конкретный вариант осуществления изобретения может быть исключен из любого варианта осуществления, по любой причине, независимо от того, связано ли это или нет с существованием предшествующего уровня техники.

Специалисты в данной области техники узнают или смогут установить, используя не более чем обычные эксперименты, многие эквиваленты конкретных вариантов осуществления, описанных здесь. Объем правовых притязаний настоящих вариантов осуществления, описанных здесь, не ограничивается приведенным выше описанием, а скорее соответствует изложенному в дополнительных вариантах осуществления. Специалисты в данной области техники поймут, что различные изменения и модификации этого описания могут быть сделаны без отклонения от сущности или объема настоящего изобретения, как определено в следующих вариантах осуществления.

Предложенная группа изобретений относится к области медицины. Предложены способ лечения субъекта-человека, страдающего от гематопоэтической злокачественной опухоли, и способ прогнозирования эффективности агониста RARA у субъекта-человека, страдающего от гематопоэтической злокачественной опухоли, где способ включает стадию определения гематопоэтической злокачественной клетки от субъекта. Предложенная группа изобретений обеспечивает эффективное лечение больного, страдающего от рака. 2 н. и 42 з.п. ф-лы, 33 ил., 3 табл., 13 пр.

1. Способ лечения субъекта-человека, страдающего от гематопоэтической злокачественной опухоли, при этом выявлено, что раковые клетки от субъекта имеют одно или более из:

a) суперэнхансера, связанного с геном альфа-рецептора ретиноевой кислоты (RARA), расположенным в chr17:38458152-38516681 в геномной конструкции hg19, при этом суперэнхансер имеет активность, ранг порядкового числа или ранг распространенности, который равен или превышает предварительно определенный пороговый уровень, активность суперэнхансера определяется посредством оценки площади под кривой ряда модификаций гистона H3K27Ac, нанесенных на графике напротив длины проанализированного сегмента геномной ДНК; или

b) уровня первичного РНК-транскрипта из гена RARA, который равен или превышает предварительно определенный пороговый уровень,

при этом предварительно определенный пороговый уровень определяет разделительную линию между двумя подмножествами популяции пациентов с гемопоэтической злокачественной опухолью, где первая подгруппа включает пациентов, отвечающих на агонист RARA, а вторая подгруппа включает пациентов, не отвечающих на агонист RARA,

где способ включает стадию введения субъекту терапевтически эффективного количества агониста RARA.

2. Способ по п. 1, в котором первичный РНК-транскрипт представляет собой мРНК, транскрибируемую из кодирующей области гена RARA.

3. Способ по п. 1, в котором активность суперэнхансера, связанного с геном RARA, определили посредством ChIp-seq.

4. Способ по п. 1, в котором уровень первичного РНК-транскрипта определяют посредством:

(а) получения общей мРНК из биологического образца субъекта; присоединения к каждой молекуле мРНК дополнительных нуклеотидов, в природе не соединенных с такими молекулами мРНК, чтобы обеспечить возможность молекулам мРНК связываться с твердой подложкой; секвенирования молекул мРНК и определения уровня мРНК RARA; или

(b) получения общей мРНК из биологического образца субъекта; создания библиотеки кДНК из общей мРНК и комбинирования библиотеки кДНК с (i) парой праймеров, которая специфична для кДНК, созданной из мРНК RARA; (ii) ДНК-полимеразой и (iii) компонентом, необязательно красителем или меченым олигонуклеотидом, для определения любой из молекул ДНК, полученных из пары праймеров и ДНК-полимеразы.

5. Способ по любому из пп. 1-4, в котором агонист RARA представляет собой АМ580 или тамибаротен.

6. Способ по любому из пп. 1-4, в котором агонистом RARA является тамибаротен.

7. Способ по любому из пп. 1-4, в котором гематопоэтическая злокачественная опухоль выбрана из лейкоза, лимфомы, множественной миеломы и миелодиспластического синдрома (MDS).

8. Способ по п. 7, в котором лейкоз представляет собой острый лимфоцитарный лейкоз (ALL), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), острый миелоцитарный лейкоз (AML) или хронический миелоцитарный лейкоз (CML) и лимфому Ходжкина или неходжкинскую лимфому.

9. Способ по п. 7, в котором гематопоэтическая злокачественная опухоль представляет собой острый миелоцитарный лейкоз, не являющийся острым промиелоцитарным лейкозом (AML, не являющийся APL), или MDS.

10. Способ по п. 6, в котором гематопоэтическая злокачественная опухоль выбрана из лейкоза, лимфомы, множественной миеломы и миелодиспластического синдрома (MDS).

11. Способ по п. 10, в котором лейкоз представляет собой острый лимфоцитарный лейкоз (ALL), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), острый миелоцитарный лейкоз (AML) или хронический миелоцитарный лейкоз (CML) и лимфому Ходжкина или неходжкинскую лимфому.

12. Способ по п. 10, в котором гематопоэтическая злокачественная опухоль представляет собой острый миелоцитарный лейкоз, не являющийся острым промиелоцитарным лейкозом (AML, не являющийся APL), или MDS.

13. Способ по п. 1, дополнительно включающий стадию:

получения информации, относящейся к одному или более из:

(a) активности, порядкового ранга или ранга распространенности суперэнхансера, связанного с геном RARA, в раковой клетке от субъекта; или

(b) уровня первичного транскрипта мРНК из гена RARA в раковой клетке от субъекта, где получение информации происходит до введения субъекту агониста RARA.

14. Способ по п. 1, в котором определено, что опухолевые клетки от субъекта содержат суперэнхансер, связанный с геном RARA.

15. Способ по п. 14, в котором суперэнхансер, связанный с геном RARA, имеет активность, равную или превышающую предварительно определенный пороговый уровень.

16. Способ по п. 14, в котором суперэнхансер, связанный с геном RARA, имеет ранг распространенности или ранг порядкового числа, который равен или превышает предварительно определенный пороговый уровень.

17. Способ по п. 8, в котором у субъекта присутствует AML и предварительно определенный пороговый уровень составляет 25-45%.

18. Способ по любому из пп. 1-4, в котором определено, что опухолевые клетки от субъекта имеют уровень первичного РНК-транскрипта из гена RARA, который равен или превышает предварительно определенный пороговый уровень.

19. Способ по п. 18, в котором первичный РНК-транскрипт представляет собой мРНК, транскрибируемую из кодирующей области гена RARA.

20. Способ по п. 19, в котором уровень мРНК соответствует рангу распространенности в популяции, равному 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71%, 70%, 69%, 68%, 67%, 66%, 65%, 64%, 63%, 62%, 61%, 60%, 59%, 58%, 57%, 56%, 55%, 54%, 53%, 52%, 51%, 50%, 49%, 48%, 47%, 46%, 45%, 44%, 43%, 42%, 41%, 40%, 39%, 38%, 37%, 36%, 35%, 34%, 33%, 32%, 31%, 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24% 23%, 22%, 21% или 20%.

21. Способ по любому из пп. 1-4, в котором предварительно определенный пороговый уровень представляет собой уровень, который (i) равен или вплоть до значения на 5% выше активности суперэнхансера или уровня РНК-транскрипта у наиболее слабо отвечающего в популяции; (ii) равен или вплоть до значения на 5% выше активности суперэнхансера или уровня РНК-транскрипта у наиболее сильно не отвечающего в популяции; или (iii) значение между (i) и (ii), где популяция включает образцы клеточных линий, представляющих гематопоэтическую злокачественную опухоль, ксенотрансплантат, представляющий гематопоэтическую злокачественную опухоль, или биологический образец от пациента, страдающего от гематопоэтической злокачественной опухоли, при этом количество образцов в популяции достоверно отражает распределение суперэнхансера или первичных РНК-транскриптов у пациентов с гематопоэтическими злокачественными опухолями.

22. Способ по п. 18, в котором агонистом RARA является тамибаротен.

23. Способ прогнозирования эффективности агониста RARA у субъекта человека, страдающего от гематопоэтической злокачественной опухоли, где способ включает стадию определения гематопоэтической злокачественной клетки от субъекта, характеризующейся одним или более из:

(a) суперэнхансера, связанного с геном RARA, расположенным в chr17:38458152-38516681 в геномной конструкции hg19, при этом суперэнхансер имеет активность, ранг порядкового числа или ранг распространенности, который равен или превышает предварительно определенный пороговый уровень, активность суперэнхансера определяется посредством оценки площади под кривой ряда модификаций гистона H3K27Ac, нанесенных на графике напротив длины проанализированного сегмента геномной ДНК; или

(b) уровня первичного РНК-транскрипта мРНК из гена RARA, который равен или превышает предварительно определенный пороговый уровень, при этом предварительно определенный пороговый уровень определяет разделительную линию между двумя подмножествами популяции пациентов с гемопоэтической злокачественной опухолью, где первая подгруппа включает пациентов, отвечающих на агонист RARA, а вторая подгруппа включает пациентов, не отвечающих на агонист RARA, при этом (а) или (b) прогнозирует эффективность агониста RARA при лечении субъекта.

24. Способ по п. 23, в котором первичный РНК-транскрипт представляет собой мРНК, транскрибируемую из кодирующей области гена RARA.

25. Способ по п. 23, в котором активность суперэнхансера, связанного с геном RARA, определили посредством ChIp-seq.

26. Способ по п. 23, в котором уровень первичного РНК-транскрипта определяют посредством:

(a) получения общей мРНК из биологического образца субъекта; присоединения к каждой молекуле мРНК дополнительных нуклеотидов, в природе не соединенных с такими молекулами мРНК, чтобы обеспечить возможность молекулам мРНК связываться с твердой подложкой; секвенирования молекул мРНК и определения уровня мРНК RARA; или

(b) получения общей мРНК из биологического образца от субъекта; создания библиотеки кДНК из общей мРНК и комбинирования библиотеки кДНК с (i) парой праймеров, которая специфична для кДНК, созданной из мРНК RARA; (ii) ДНК-полимеразой и (iii) компонентом, необязательно красителем или меченым олигонуклеотидом, для определения любой из молекул ДНК, полученных из пары праймеров и ДНК-полимеразы.

27. Способ по любому из пп. 23-26, в котором агонист RARA представляет собой АМ580 или тамибаротен.

28. Способ по любому из пп. 23-26, в котором агонистом RARA является тамибаротен.

29. Способ по любому из пп. 23-26, в котором гематопоэтическая злокачественная опухоль представляет собой лейкоз, лимфому, множественную миелому или миелодиспластический синдром (MDS).

30. Способ по п. 29, в котором лейкоз представляет собой острый лимфоцитарный лейкоз (ALL), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), острый миелоцитарный лейкоз (AML) или хронический миелоцитарный лейкоз (CML) и лимфома представляет собой лимфому Ходжкина или неходжкинскую лимфому.

31. Способ по п. 29, в котором гематопоэтическая злокачественная опухоль представляет собой острый миелоцитарный лейкоз, не являющийся острым промиелоцитарным лейкозом (AML, не являющийся APL), или MDS.

32. Способ по п. 28, в котором гематопоэтическая злокачественная опухоль представляет собой лейкоз, лимфому, множественную миелому или миелодиспластический синдром (MDS).

33. Способ по п. 32, в котором лейкоз представляет собой острый лимфоцитарный лейкоз (ALL), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), острый миелоцитарный лейкоз (AML) или хронический миелоцитарный лейкоз (CML) и лимфома представляет собой лимфому Ходжкина или неходжкинскую лимфому.

34. Способ по п. 32, в котором гематопоэтическая злокачественная опухоль представляет собой острый миелоцитарный лейкоз, не являющийся острым промиелоцитарным лейкозом (AML, не являющийся APL), или MDS.

35. Способ по п. 23, дополнительно включающий стадию:

получения информации, относящейся к одному или более из:

(a) активности, порядкового ранга или ранга распространенности суперэнхансера, связанного с геном RARA, в раковой клетке субъекта; или

(b) уровня первичного РНК-транскрипта из гена RARA в раковой клетке от субъекта, где получение информации происходит до введения агониста RARA субъекту.

36. Способ по любому из пп. 23-26, в котором было определено, что в раковых клетках субъекта имеется суперэнхансер, связанный с геном RARA.

37. Способ по п. 36, в котором суперэнхансер, связанный с геном RARA, имеет активность, равную или превышающую предварительно определенный пороговый уровень.

38. Способ по п. 36, в котором суперэнхансер, связанный с геном RARA, имеет ранг распространенности или ранг порядкового числа, равный или превышающий предварительно определенный пороговый уровень.

39. Способ по п. 38, в котором субъект страдает AML и предварительно определенный пороговый уровень находится между 25-45%.

40. Способ по любому из пп. 23-26, в котором было определено, что опухолевые клетки субъекта имеют уровень первичного РНК-транскрипта из гена RARA, равный или превышающий предварительно определенный пороговый уровень.

41. Способ по п. 40, в котором первичный РНК-транскрипт представляет собой мРНК, транскрибируемую из кодирующей области гена RARA.

42. Способ по п. 40, в котором уровень мРНК соответствует рангу распространенности в популяции, равному 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71%, 70%, 69%, 68%, 67%, 66%, 65%, 64%, 63%, 62%, 61%, 60%, 59%, 58%, 57%, 56%, 55%, 54%, 53%, 52%, 51%, 50%, 49%, 48%, 47%, 46%, 45%, 44%, 43%, 42%, 41%, 40%, 39%, 38%, 37%, 36%, 35%, 34%, 33%, 32%, 31%, 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24% 23%, 22%, 21% или 20%.

43. Способ по любому из пп. 23-26, в котором предварительно определенный пороговый уровень представляет собой уровень, который (i) равен или вплоть до значения на 5% выше активности суперэнхансера или уровня РНК-транскрипта у наиболее слабо отвечающего в популяции; (ii) равен или вплоть до значения на 5% выше активности суперэнхансера или уровня РНК-транскрипта наиболее сильно не отвечающего в популяции; или (iii) значение между (i) и (ii), где популяция включает образцы клеточных линий, представляющих гематопоэтическую злокачественную опухоль, ксенотрансплантат, представляющий гематопоэтическую злокачественную опухоль, или биологический образец от пациента, страдающего от гематопоэтической злокачественной опухоли, и количество образцов в популяции достоверно отражает распределение суперэнхансера или первичных РНК-транскриптов у пациентов с гематопоэтической злокачественной опухолью.

44. Способ по п. 40, в котором агонистом RARA является тамибаротен.