Модифицированная генетическая конструкция для рекомбинантной экспрессии и кристаллизации человеческого CysLT1 рецептора Российский патент 2020 года по МПК C07K14/705 C12N15/62 C12N15/63 

Изобретение относится к молекулярной биологии, генной инженерии, биотехнологиям и касается новых генетических конструкций и продуцентов, обеспечивающих экспрессию рекомбинантного человеческого цистеинил-лейкотриенового рецептора 1 класса GPCR, пригодного к дальнейшим структурно-функциональным исследованиям.

Известна конструкция дикого типа CysLT1, депонированная в базе данных BLAST Align

Retrieve/ID mapping UniProtKB - Q9Y271 (CLTR1_HUMAN, https://www.uniprot.org/uniprot/Q9Y271).

Существуют патенты на препараты лейкотриеновых рецепторов, гены, конструкции и клеточные линии для получения рецептора в целях фармакологического скрининга и получения антител (https://patents.google.com/patent/US6465212?oq=cyslt1).

Существует большое количество патентов, касающихся создания прототипов лекарственных препаратов, лигандов, антагонистов, имеющих своими мишенями CysLT1 и методов их использования

https://patents.google.com/patent/W02013013490A1/en?oq=cyslt1

www.google.ru/patents/WO2017088725A1?cl=en

www.google.ru/patents/US8980917

Из данных отечественной и зарубежной литературы, патентов и патентных заявок авторам неизвестно, чтобы существовала конструкция CysLT1 рецептора, обеспечивающая кристаллизацию белка методом in meso.

Отличительным признаком изобретения являются: комбинация N-концевых пептидных фрагментов, обеспечивающих рекомбинантную экспрессию в эукариотической системе на клеточной поверхности, а также очистку рецептора; положение партнерного белка в третьей внутриклеточной петле, способствующего повышению выхода белка на цитоплазматическую мембрану при экспрессии, стабилизирующего белок и помогающего образованию кристаллических контактов; транкирование неупорядоченного С-конца CysLT1 рецептора, препятствующего формированию кристаллов.

Техническим результатом изобретения является возможность получения дифрагирующих кристаллов указанной конструкции, полученных методом кристаллизации в липидной кубической фазе, а также проведения функциональных тестов: анализа связывания лигандов, анализа стабилизирующего эффекта различных буферных растворов.

Описание способа получения генетической конструкции заявляемого изобретения.

Способ поясняется чертежами, где на фиг. 1 представлена нуклеотидная последовательность модифицированного CysLT1 рецептора. Мелким регистром показан ген рецептора, курсивом - ген партнера b562RIL. Крупным прямым шрифтом показаны гены N-концевых пептидов и линкеров.

На фиг. 2 представлена схема кристаллизационной конструкции CysLT1R, цветом показаны N-концевые пептидные фрагменты, место вставки BRIL, обрезка С-конца. Схема построена при помощи Интернет базы данных GPCRdb.org.

На фиг. 3 представлен анализ степени агрегации (А) и стабильности (Б) CysLT1R после оптимизации протокола очистки. Микрофотографии в видимом свете характерных кристаллов комплексов с зафирлукастом (В) и пранлукастом (Г).

Ген дикого типа был приобретен в компании cdna.org (США), плазмида, ген белка-партнера был синтезирован компанией GenScript (США). Используемый плазмидный вектор pFastBac1 (Invitrogen, США), модифицировался методом безлигазного клонирования с использованием праймеров, синтезированных в компании Евроген (Россия). Применялась ПЦР-смесь Accuprime-Pfx (Invitrogen, США), для избавления от исходной плазмиды использовалась Dpnl рестриктаза (NEB, США), согласно рекомендациям фирмы-производителя. Для амплификации вектора использовался бактериальный копийный штамм E.coli, ТОР10. Аминокислотная и ДНК-последовательности представлены на фиг 1-2.

Оценка эффективности заявляемой генетической конструкции для реализации указанного назначения проводилась следующим образом. Плазмидой трансформировались бактериальные клетки E.coli штамма DH10Bac, в котором методом сайт-специфичной транспозиции ген интереса встраивался в челночный вектор бакмиду, содержащую геном бакуловируса AcNPV. Клетки Sf9 трансфецировались бакмидой, и формировался вирус, в геноме которого содержался ген CysLT1 рецептора. В результате чего получалась клеточная культура, экспрессирующая белок на клеточной мембране, что проверялось методом проточной цитометрии. После наработки биомассы проводилось выделение мембранной фракции путем лизиса клеток в гипотоническом буфере и отделения цитозольной фракции в гипертоническом буфере, затем солюбилизация белка мягким детергентом и очистка при помощи металл-аффинной хроматографии, белок при этом стабилизировался добавлением лиганда, начиная с шага солюбилизации. Чистота белкового препарата проверялась электрофоретическим методом. Затем исследовалась степень агрегации рецептора методом аналитической гель-фильтрационной ВЭЖХ и стабильность методом анализа кривой плавления с СРМ красителем (С1484, Sigma, США). Чистота препарата составляла более 90%, степень мономерности - более 90%, температура плавления составляла более 70 градусов с лигандом и более 60 градусов для Апо формы. Проводилась кристаллизация в липидной кубической фазе, и были получены белковые кристаллы с антагонистами, зафирлукастом (Z4152, Sigma, США) и пранлукастом (Р0080, Sigma, США), продифрагировавшие до 2,5 и 2,7 ангстрем, соответственно (фиг 3).

Использование заявляемой генетической конструкции позволяет проводить рентгеноструктурный анализ кристаллов CysLT1 рецептора и изучать белок при помощи различных биофизических методов исследования.

--->

SEQUENCE LISTING

<110> федеральное государственное автономное образовательное

учреждение высшего образования "Московский физико-технический

институт (национальный исследовательский университет)"

<120> Модифицированная генетическая конструкция для рекомбинантной

экспрессии и кристаллизации человеческого CysLT1 рецептора.

<130> RU

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1410

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 1

atgaagacga tcatcgccct gagctacatc ttctgcctgg tattcgccga ctacaaggac 60

gatgatgacg ccaaactgca gaccatgcat catcatcatc atcatcatca tcatcatgaa 120

aacctgtatt ttcagggcgg taccatggat gaaacaggaa atctgacagt atcttctgcc 180

acatgccatg acactattga tgacttccgc aatcaagtgt attccacctt gtactctatg 240

atctctgttg taggcttctt tggcaatggc tttgtgctct atgtcctcat aaaaacctat 300

cacaagaagt cagccttcca agtatacatg attaatttag cagtagcaga tctactttgt 360

gtgtgcacac tgcctctccg tgtggtctat tatgttcaca aaggcatttg gctctttggt 420

gacttcttgt gccgcctcag cacctatgct ttgtatgtca acctctattg tagcatcttc 480

tttatgacag ccatgagctt tttccggtgc attgcaattg tttttccagt ccagaacatt 540

aatttggtta cacagaaaaa agccaggttt gtgtgtgtag gtatttggat ttttgtgatt 600

ttgaccagtt ctccatttct aatggccaaa ccacaaaaag atgagaaaaa taataccaag 660

tgctttgagc ccccacaaga caatcaaact aaaaatcatg ttttggtctt gcattatgtg 720

tcattgtttg ttggctttat catccctttt gttattataa ttgtctgtta cacaatgatc 780

attttgacct tactaaaaaa atcaatgaaa tcggctgatc tggaagacaa ttgggaaact 840

ctgaacgaca atctcaaggt gatcgagaag gctgacaatg ctgcacaagt caaagacgct 900

ctgaccaaga tgagggcagc agccctggac gctcagaagg ccactccacc taagctcgag 960

gacaagagcc cagatagccc tgaaatgaaa gactttcggc atggattcga cattctggtg 1020

ggacagattg atgatgcact caagctggcc aatgaaggga aagtcaagga agcacaagca 1080

gccgctgagc agctgaagac cacccggaat gcatacattc agaagtacct gtcgggcaaa 1140

aatctgtcaa gtcataaaaa ggctatagga atgatcatgg tcgtgaccgc tgccttttta 1200

gtcagtttca tgccatatca tattcaacgt accattcacc ttcatttttt acacaatgaa 1260

actaaaccct gtgattctgt ccttagaatg cagaagtccg tggtcataac cttgtctctg 1320

gctgcatcca attgttgctt tgaccctctc ctatatttct tttctggggg taactttagg 1380

aaaaggctgt ctacattcag aaagtaataa 1410

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантному получению человеческого лейкотриенового рецептора типа 1 (human cysteinyl leikotriene receptor 1, CysLTR1), и может быть использовано для экспрессии CysLT1 рецептора. Предложена генетическая конструкция с нуклеотидной последовательностью, которая оптимизирована для экспрессии CysLTR1 в клетках насекомых. Изобретение обеспечивает рекомбинантную экспрессию в эукариотической системе на клеточной поверхности за счет комбинации N-концевых пептидных фрагментов и положения партнерного белка b562RIL в третьей внутриклеточной петле, что также стабилизирует белок и помогает образованию кристаллических контактов. Также проводят дополнительное транкирование неупорядоченного С-конца CysLT1 рецептора, препятствующего формированию кристаллов. 3 ил.

Генетическая конструкция с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:1, кодирующая человеческий лейкотриеновый рецептор типа 1 (human cysteinyl leikotriene receptor 1, CysLTR1).