Способ опосредованного определения титра инфекционной активности вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцин с помощью математического двойного дифференциала данных точки crossing point при амплификации вирусной кДНК Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/68 A61K39/135 

Изобретение относится к области биотехнологии и производству противоящурных вакцин, а именно к способу опосредованного определения титра инфекционной активности вируса ящура в неинактивированном сырье вакцины с помощью математического двойного дифференциала данных точки crossing point при амплификации вирусной кДНК.

Ящур является вирусным, наиболее контагиозным, остропротекающим, лихорадочным заболеванием, которому подвержены дикие и домашние парнокопытные и мозоленогие животные [1]. В соответствии с классификацией Международного комитета по таксономии вирус ящура относится к порядку Picornavirales, семейству Picornaviridae, роду Aphthovirus, виду food-and-mouth disease virus (FMDV) [2, 3]. На сегодняшний день известны 7 серотипов вируса ящура: О, А, С, Азия-1, SAT-1, SAT-2, SAT-3 с множеством топотипов и генетических линий [1]. Для вируса ящура при константе седиментации полных вирусных частиц 146 S, константе диффузии 1,41 см²/с молекулярная масса составляет 8,08 × 10⁶ Д. Размер вириона 23-25 нм, масса составляет 8,4 × 10^-18 г [1, 4, 5].

Геном вируса представлен одноцепочечной молекулой РНК (ssRNA(+)) положительной полярности (IV группа микроорганизмов по Балтимору). Вирионная РНК различных штаммов вируса ящура имеют одинаковую длину около 8400-8500 н.о. с молекулярной массой 2,8 × 10⁸МД [4]. Пикорнавирусы не производят субгеномных мРНК. РНК одновременно является матрицей для репликации генома и трансляции вирусных белков. РНК вируса ящура включает три отдельные части, а именно длинную 5'-нетранслируемую область (5'-UTR) (около 1300 и.о., что редко встречается у вирусов), кодирующую область с одной открытой рамкой считывания (ORF) (в этом заключается сходство с мРНК эукариотических клеток) длиной около 7000 н.о. и 3'-нетранслируемую область (3'-UTR) длиной около 90 н.о. (фиг.1).

С 5'-концом генома ковалентно связан пептид VPg, который кодируется генами 3 В_1-3. VPg существует в 3 различных формах, которые играют важную роль в синтезе РНК. 5'-UTR-область включает несколько различных структурных элементов: S-фрагмент, поли(С) тракт (Cn), 3 или 4 псевдоузла (РК), элемент cre/bus, внутренний сайт для рибосомы (IRES) [5].

На 5'-конце расположен стабильный участок «стебель-петля» размером 55 и.о., который необходим для репликации транскрипта. Данный участок назвали цис-действующим элементом репликации (cis-acting replication element (cre) или 3B-site (bus)). Он содержит консервативный мотив (АААСА), который действует как матрица для уридилирования белка VPg вирусной РНК-полимеразой с образованием VPgpU и/или VPgpUpU. Эти продукты действуют как праймеры для инициации синтеза вирусной РНК, что объясняет присутствие VPg на 5'-конце транскриптов РНК как с положительным, так и с отрицательным смыслом [5, 6].

Транслируемая область следует за 5'-UTR. РНК транслируется в виде единой длинной ORF в полипротеин, после этого следует серия посттрансляционных протеолитических расщеплений с образованием как промежуточных, так и зрелых структурных и неструктурных белков. Это основная часть вирусного генома, длина которого составляет около 7000 нуклеотидов и включает 14 генов. Она кодирует большой полипротеин (около 2330 а.о.), который быстро расщепляется вирусными протеазами с образованием четырех различных структурных и одиннадцати неструктурных белков. После трансляции первоначально образуются четыре первичных продукта, а именно Lpro (лидерная протеаза), Р1-2А, Р2 и Р3 [7, 8].

Первым компонентом полипротеина вируса ящура является L-белок (Leader) размером около 200 н.о. Уникальность пикорнавирусов заключается в том, что в качестве белка-лидера используется протеаза. Белок L представляет собой папаин-подобную цистеиновую протеазу. Он автолитически отщепляется от остального вирусного полипротеина на стыке L/P1. L-кодирующая область содержит два отдельных инициирующих кодона AUG (обычно 84 нуклеотида друг от друга), которые приводят к образованию двух разных L-протеаз, названных Lab и Lb и отличающихся друг от друга по длине на 28 а.о. Именно Lpro отвечает за ингибирование синтеза белка в клетке-хозяине, индуцируя расщепление белка-хозяина eIF4G. В результате вирусная РНК может свободно использовать аппарат синтеза белка клетки-хозяина для собственного синтеза белка [5, 8].

Полипептид Р1-2А (предшественник капсидного белка) расщепляется протеазой 3С (3Cpro) на N-конце и С-конце с помощью белка 2А с образованием белков 1АВ (VP₀), 1С (VP₃) и ID (VP₁), 2А [9].

Белки VP₀ (1АВ), VP₃ (1С) и VP₁ (ID) - структурные компоненты естественных пустых капсидов с коэффициентом седиментации 75S. 60 копий каждого из указанных пептидов самособираются, образуя полные вирусные частицы с коэффициентом седиментации 146S [5, 8].

Во время инкапсидации участка генома белок VP₀ расщепляется с образованием протеинов VP₄ и VP₂ автолитически. Белок VP₄ полностью находится внутри вирусной частицы, тогда как VP₁, VP₂ и VP₃ располагаются на поверхности и вносят свой вклад в антигенные свойства вируса. VP₁ содержит, по крайней мере, два важных иммуногенных сайта, петлю G-H (в положениях аминокислот 141-160) и С-конец (остатки 200-213). Петля G-H включает мотив аргинин-глицин-аспарагиновая кислота (RGD), который необходим для прикрепления вируса к клетке-хозяину через рецептор интегрина [5, 9].

Белок VP₁ является наиболее вариабельным, поскольку на него приходится более 90% мутаций всех структурных генов. Самыми вариабельными областями являются участки 40-60, 130-160 и 190-213 а.о. Участок поверхностного белка VP₁ в регионе 130-160 а.о. отличается высокой изменчивостью, поскольку участвует в процессе связывания с рецепторами клетки-хозяина [5]. Изменчивость данного региона дает возможность вирусу ящура взаимодействовать с рецепторами клеток разных типов и облегчает переход от одного вида хозяина к другому. Нуклеотидные последовательности кодирующей области VP₁ используются для генетической характеристики штаммов ящура из-за их значимости для прикрепления и проникновения вируса в клетку, защитного иммунитета и специфичности серотипа. Филогенетический анализ на основе последовательности VP₁ широко используется для вывода эволюционной динамики, эпидемиологических отношений между генетическими линиями и для отслеживания происхождения и перемещения штаммов вируса ящура [8, 9].

Белок 2А - очень короткий пептид размером 18 аминокислотных остатков, являющийся вирусной аутопротеазой. По всей видимости, данный белок отвечает за расщепление сайта 2А/2 В, которое является вторым событием процессинга у вируса ящура [5].

Области Р2 и Р3 полипротеина процессируются в неструктурные белки (NSP) вируса ящура. Полипептид Р2 подвергается расщеплению на белки 2 В длиной около 154 а.о. и 2С размером около 318 а.о. с помощью 3С-протеазы. Функция белка 2 В не известна. Белок 2С определяет устойчивость вирусной частицы к гуанидину. Данный протеин необходим для инициации отрицательной цепи РНК при синтезе [5, 9].

Протеин Р3 с помощью 3С-протеазы расщепляется с образованием 6 основных белков: 3А, трех отдельных копий VPg (3B₁, 3 В₂, 3 В₃), 3Cpro и 3Dpol (3D-РНК-полимеразы), а также промежуточных продуктов, в частности, 3CD. Белок 3А длиной около 143 а.о. имеет гидрофобные последовательности, которые, предположительно, закрепляют его на мембранах. Протеин 3А может также служить для доставки пептидов 3 В к сайтам репликации РНК [5, 7, 8].

Протеаза 3Cpro имеет длину 213 а.о. Данный фермент принадлежит семейству химотрипсиноподобных сериновых протеаз. Он отвечает за большую часть протеолитической обработки вирусного полипептида (10 сайтов расщепления), в частности, за расщепление Р1-2А на белки VP₀, VP₁, VP₃, а также за образование различных неструктурных белок. Кроме того, белок 3С также модифицирует некоторые клеточные белки. Таким образом, для отщепления всех белков ВЯ от первоначального полипротеина требуется 3 протеазы: ведущая протеиназа (L-белок), 2А, 3С [9].

Белок 3Dpol кодируется высококонсервативным 3D-геном, имеет размер 470 а.о. и является РНК-зависимой РНК-полимеразой, которая вместе с другими вирусными и, возможно, клеточными белками осуществляет репликацию РНК из молекул вирусной инфекционной РНК. Происходят два процесса, необходимых для репликации РНК вируса. Первоначально геном с положительным смыслом используется в качестве шаблона для синтеза антисмысловой РНК, и это затем используется для получения новых инфекционных молекул РНК с положительным смыслом [8, 9].

В зрелой вирусной частице находится 60 капсомеров, состоящих из четырех структурных белки VP_1-4, которые связываются друг с другом с образованием икосаэдрической оболочки или капсида. Вирусная частица служит для доставки генома инфекционного агента в цитоплазму клетки. Таким образом, первым шагом в репликации вируса является трансляция вирусной РНК для получения каждого из кодируемых вирусом белков, необходимых для репликации нуклеиновой кислоты и для производства вирусных частиц, способных инициировать новый цикл инфекции [4, 5].

Белки VP₁ (1D), VP₂ (1 В) и VP₃ (1С) находятся на поверхности вируса и вносят вклад в антигенные свойства вируса, a VP₄ (1А) располагается внутри вириона. На поверхности располагается GH-петля, которая характеризуется гипервариабельностью и включает в себя 140-160 а.о. белка VP₁ [5, 7].

3'-UTR-область намного короче 5'-UTR-области, ее длина составляет около 100 нуклеотидов. Данный участок состоит из уникальной гетерогенной части размером около 90-100 и.о. и поли (А)-части около 50 н.о. Гетерогенный участок сворачивается, образуя специфическую структуру «стебель-петля», за которой следует поли(А)-фрагмент переменной длины. 3'-UTR-область играет важную роль в репликации вирусного генома. Между 5'-UTR и 3'-UTR возникают взаимодействия, которые могут влиять на активность IRES и репликацию РНК [1,5].

В процессе репродукции в биологических системах вирус ящура формирует 4 варианта компонентов: 146S компонент (вирион, полная частицы), состоящий из одной цельной молекулы вирусной РНК и 60 копий полипептида, каждая из которых представлена комплексом белков VP₁ (1D-ген), VP₂ (1B-ген), VP3 (1С-ген), VP₄ (1А-ген); 75S частица («пустой» капсид), включающий в себя 60 копий полипептидов VP₀ (1АВ-ген), VP₁ (1D-ген), VP₃ (1С-ген); 12S частица (капсомер), представленный структурными белками VP₁ (1D-ген), VP₂ (1B-ген), VP₃ (1С-ген); 3,8S субъединица, представленная неструктурным белком VP_g. 75S, 12S и 3,8S компоненты не включают в себя РНК вируса ящура [1,5].

Ящур причиняет огромный экономический ущерб, который сопряжен с резким снижением продуктивности скота, значительными затратами на борьбу с болезнью и лишением возможности торговли. По оценкам, только с точки зрения реальных производственных потерь и затрат на вакцинацию в эндемичных регионах ущерб, который ящур причиняет экономике, составляет от 6,5 до 21,0 млрд долл. США в год. Усиление контроля над ящуром и вакцинация восприимчивых животных во всем мире приносит пользу, как свободным, так и эндемичным странам и рассматривается как глобальное экономическое благо [7, 10].

В процессе промышленного производства противоящурных вакцин особое внимание уделяют титру инфекционной активности вируса до инактивации сырья [2]. Исходя из этого, сырье для вакцин исследуют на инфекционную активность с определением титра с применением монослойной перевиваемой клеточной линии почки свиньи IB-RS-2 [3]. Существенными недостатками данного метода являются: 1) длительная процедура титрования, связанная с развитием цитопатического действия (не менее 3 суток),

2) определенная степень субъективности при оценке результатов анализа,

3) высокая стоимость клеточной линии как тест-системы и затраты на ее поддержание.

В связи с этим целесообразно провести поиск способа опосредованного определения титра инфекционной активности вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины с помощью математического двойного дифференциала данных точки crossing point при амплификации вирусной кДНК.

Данный метод позволяет в течение 3 часов достоверно определять титр инфекционной активности вируса ящура в сырье для вакцин. Исходя из этого, целесообразно предложить новый способ опосредованного определения титра вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины на основе альтернативного метода.

Задачей настоящего изобретения является разработка высокочувствительного и высокоспецифичного экспресс-способа опосредованного определения титра инфекционной активности вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины с целью устранения вышеуказанных недостатков.

Данная задача решена благодаря разработке способа опосредованного определения титра инфекционной активности вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины с помощью математического двойного дифференциала данных точки crossing point при амплификации вирусной кДНК. Предложенный способ позволяет:

1) повысить специфичность анализа проб за счет реакции нейтрализации полных частиц вируса ящура штаммоспецифическими антителами;

2) увеличить чувствительность и специфичность анализа за счет применения высокоспецифичных оригинальных праймеров и ДНК-зонда, рассчитанных для 3D-гена вируса ящура в сырье для вакцины;

3) проводить контроль реакции ОТ-ПЦР-РВ с использованием мРНК, синтезированной с применением плазмиды р Jet 1.2 sf GFP и культуры клеток почки новорожденного сирийского хомячка BHK-21/SUSP/ARRIAH [11] для трансфекции;

4) повысить достоверность проводимого анализа благодаря установлению зависимости между титром инфекционной активности вируса ящура (Tfmdv) и точкой графика двойного дифференцирования логистической кривой crossing point (С_р), представленной в виде логарифмической функции: lg T_FMDV=-0,2997 × С_р+11,675 с высокой достоверностью аппроксимации (R²=0,9994) и эффективностью амплификации 99,46%. Предложенная модель позволит опосредованно определять титр инфекционной активности вируса ящура в неинактивированном сырье при производстве противоящурной вакцины.

Сущность изобретения отражена на графических изображениях: Фиг. 1 - Картирование генома вируса ящура.

Фиг. 2 - Процесс модифицирования плазмиды р Jet 1.2 sf GFP для клонирования участка 3D-гена вируса ящура. Вставка проводится между участками Т7 promoter и HDV ribozyme. Модель представлена на участках ДНК. Примечание: А - карта плазмиды со всеми сайтами, Б - условная карта плазмиды до встраивания, В - результат встраивания таргетного участка 3D-гена вируса ящура в плазмиду, Г - концевые участки плазмиды и гена (слева), Д- концевые участки гена и плазмиды (справа).

Фиг. 3 - Модель построения первичной логистической кривой для пробы с титром инфекционной активности соответствующим пороговому циклу амплификации 11,9 (синий цвет), график математического дифференциала (зеленый цвет), график двойного математического дифференциала с точкой crossing point 11,0 (красный цвет).

Фиг. 4 - Зависимость значений точки crossing point логистических кривых после математического дифференцирования от титра инфекционной активности вируса ящура в сырье для вакцин (с указанием стандартной погрешности) (n=3, р<0,005).

Фиг. 5 - Зависимость титра инфекционной активности вируса ящура в сырье для вакцин от значений точки crossing point логистических кривых после математического дифференцирования от (с указанием стандартной погрешности) (n=3, р<0,005).

Фиг. 6 - Дизайн оригинальных олигонуклеотидных праймеров и зонда для опосредованного определения титра инфекционной активности вируса ящура в сырье для вакцин. Примечание: обратный, праймер дан в двух вариантах, а именно, в комплементарном прямом и в формате rev - реверс-комплемент.

Сущность изобретения заключается в новом подходе по опосредованному определению титра инфекционной активности вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцин с помощью математического двойного дифференциала данных точки crossing point при амплификации вирусной кДНК. Заявляемый способ основан на проведении реакции нейтрализации вирионов вируса ящура с использованием очищенных поликлональных антител, получении элюата суммарной РНК, проведении обратной транскрипции и реакции амплификации в режиме реального времени, проведении двойного математического дифференцирования логистических кривых для исследуемых проб сырья для вакцины в реакции амплификации кДНК вируса ящура.

В настоящее время стандартную реакцию амплификации в режиме реального времени применяют для проведения качественного и количественного исследования суспензий вируса ящура, в частности для определения концентрации 146S компонента и титра инфекционной активности [12, 13]. В литературе описан способ количественной оценки вирионов вируса ящура в неинактивированном сырье вакцины при сравнении максимальных экстремумов графиков второй производной для кривых реакции амплификации в режиме реального времени [14]. При этом для определения титра инфекционной активности вируса ящура в сырье для вакцин данный метод не применялся.

В отличие от прототипа разработанный способ включает реакцию нейтрализации вирионов вируса ящура с применением очищенных поликлональных антител из штаммоспецифичных сывороток крови морских свинок против вируса ящура; этап сорбционного экстрагирования суммарной РНК; этап проведения обратной транскрипции и реакции амплификации с применением оригинальных олигонуклеотидных праймеров и зондов; новый подход к методике расчета титра инфекционной активности вируса ящура в сырье для вакцин с учетом значения точки crossing point для логистических кривых, подвергнутых двойному математическому дифференцированию. Применение разработанного способа повышает достоверность анализа по определению титра инфекционной активности вируса ящура в пробах сырья для вакцин. При этом также как и прототип разработанный способ позволяет одновременно исследовать несколько десятков проб неинактивированного сырья для вакцины, при этом время анализа сокращается до 3 ч. Исходя из этого, актуально применять данный способ для опосредованного определения титра инфекционной активности вируса ящура в сырье для вакцины.

Ключевым элементом заявляемого способа является детектирование точек crossing point для логистических кривых исследуемых проб после двойного математического дифференцирования, на основе которых проводится опосредованное определение титра инфекционной активности вируса ящура с использованием разработанной модели зависимости точки С_р и титра инфекционной активности вируса ящура.

Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что новизна и изобретательский уровень заявляемого изобретения заключается в применении способа опосредованного определения титра инфекционной активности вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины с помощью математического двойного дифференциала данных точки crossing point при амплификации вирусной кДНК.

Сведений о разработке предлагаемого способа опосредованного определения титра инфекционной активности вируса ящура в сырье для вакцин авторами не обнаружено.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена на графическом материале - графиках зависимости значений точки crossing point логистических кривых после математического дифференцирования и титра инфекционной активности вируса ящура в сырье для вакцин относительно друг друга (фиг.4, 5).

На подготовительном этапе работы сенсибилизируют иммунологический планшет, очищенными штаммоспецифическими поликлональными антителами против вируса ящура в объеме 2,00 см³ суспензии с концентрацией иммуноглобулинов G 5 мкг/см³. После иммобилизации антител при температуре 4±2°С в течение 18-20 часов лунки планшета подвергают трехкратному промыванию стандартным буферным раствором TBST, открытые сайты связывания блокируют 1,0%-ной суспензией бычьего сывороточного альбумина при температуре 37±0,5°С в течение 30 минут и вновь лунки промывают стандартным буферным раствором TBST 5 раз. Процедуру подготовки планшета к работе с пробами осуществляют заранее, до проведения основного анализа. Планшеты можно подготовить впрок и хранить в холодильнике при температуре 4±2°С.

На первом этапе исследования проводят реакцию нейтрализации вирионов вируса ящура из исследуемых образцов (разведения стандарта, отрицательный контроль, пробы). В качестве стандарта используют не инактивированную суспензию вируса ящура, репродуцированного в суспензионной культуре клеток почки новорожденного сирийского хомячка (BHK-21/SUSP/ARRIAH) с известной концентрацией вирусных частиц. Отрицательным контролем служит не инфицированная вирусами, бактериями, микоплазмами и грибами суспензия клеток линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH с концентрацией 3,0-3,5 млн клеток/см³. Применяют контрольную панель готовых разведений стандарта с содержанием вирусной РНК, эквивалентными следующим титрами инфекционной активности вируса ящура: 0,0, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0 lg ТЦД₅₀/см³. В рамках производственного технологического процесса наибольший интерес представляют суспензии с титрами инфекционной активности вируса ящура выше 6,0 lg ТЦД₅₀/см³. В лунки с сенсибилизированными штаммоспецифическими антителами против вируса ящура вносят по 2,0 см³ суспензий образцов и инкубируют при температуре 37±0,5°С в течение 30 минут. В результате серологической реакции на поверхности лунок формируется иммунные комплексы. Лунки отмывают от балластных компонентов с использованием стандартного буферного раствора TBST 3 раза. Образовавшиеся иммунные комплексы ресуспендируют в 0,5 см³ 1/15 М фосфатного буферного раствора.

На следующем этапе анализа осуществляют выделение РНК из иммунного комплекса твердофазным сорбционным методом. К 100 мкл суспензии иммунного комплекса добавляют 900 мкл 5М ГТЦ, инкубируют содержимое в процессе перемешивания в течение 5 мин., затем продлевают инкубирование в открытом сухом термостате при температуре 60±2°С в течение 2 мин. Полученный лизат пропускают через колонку со стекловолокнистыми фильтрами на установке Promega Vac-Man Vacuum Manifold с поддержанием отрицательного давления, создаваемого вакуумным насосом. На следующем этапе проводят отмывание стекловолокна от балластных составляющих. Для этого в каждую колонку при работающем вакуумном насосе добавляют по 500 мкл 40% раствор пропанола-2, ждут полного прохождения жидкости через фильтр. Для очистки от гидрофобных примесей в каждую пробирку добавляют по 500 мл 80%-ного раствора пропанола-2, затем ту же процедуру со 100%-ным пропанолом-2 дважды. После удаления спирта в колонки добавляют по 50 мкл раствора для элюирования (стандартный буфер ТЕ) и прогревают содержимое при температуре 60±2°С в течение 8-10 мин. После процесса десорбции колонки помещают в пробирки типа эппендорф объемом 1.5 см³ и центрифугируют в течение 1,5 мин при 13500 об/мин на настольной микроцентрифуге, отбирают элюаты РНК. Полученный экстракт суммарной РНК хранят при температуре -20±2°С или сразу используют в дальнейшей работе.

После получения экстракта РНК вируса ящура проводят обратную транскрипцию и реакцию амплификации с использованием специфических оригинальных олигонуклеотидных праймеров и зонда для исследования контрольных образцов и проб. Для постановки реакции готовят реакционную смесь, рецептура приготовления которой представлена в таблице 1. В качестве гомологичных 3D-гену вируса ящура олигонуклеотидов используют:

(фиг.6) в концентрации 5 пМ на реакцию. Следует учесть, что олигонуклеотидный зонд прямой относительно референс-последовательностей нуклеотидов кДНК вирусов ящура всех 7 типов. Для формирования нуклеотидных цепей продуктов реакции применяют дезоксирибонуклеозидтрифосфаты с концентрацией каждого в реакционной смеси по 0,3 мМ. В качестве основы используют ПЦР-буфер следующего состава: 165 мМ (NH₄)₂SO₄, 675 мМ Tris-HCl (рН 8,8), 0.1% Tween-20. В реакционную смесь добавляют 3 мМ хлорида магния, 3 мМ хлорида марганца (II) и диметилсульфооксид в количестве 2% от общего объема без элюата РНК. В качестве растворителя используют деионизированную воду системы очистки Milli Q. В качестве катализатора обратной транскрипции и реакции амплификации применяют Tth (Thermus thermofilus) DNA-полимеразу (2 ед.). Данное количество единиц позволяло увеличить эффективность реакции амплификации без снижения специфичности отжига олигонуклеотидов. Tth ДНК-полимераза представляет собой термостабильный белок весом 92-94 KDa, выделенный из рекомбинантного штамма Е. coli, несущего ген полимеразы Thermus thermophilus КТР. Tth ДНК-полимераза катализирует полимеризацию нуклеотидов в dsДНК в направлении от 5'→3' в присутствии катионов Mg²⁺. Tth ДНК-полимераза также обладает обратно-транскриптазной активностью в присутствии катионов Мn²⁺. С использованием Tth ДНК-полимеразы возможно получение амплификатов от 100 до 8500 н.п.Учитывая, что размер генома вируса ящура составляет 8500 н.п., это послужило стимулом для использования данного фермента в совмещенной реакции обратной транскрипции и амплификации.

Объем реакционной смеси компонентов для проведения одной реакции составляет 20 мкл. Элюаты РНК каждого образца добавляют к смеси по 5 мкл. Общий объем mix составляет 25 мкл.

Постановку реакции осуществляют при температурных и временных параметрах, сведения о которых представлены в таблице 2. Обратную транскрипцию проводят при температуре 50°С в течение 20 мин за 1 цикл, предварительную денатурацию комплементарной ДНК - при температуре 95°С за 2 мин в течение 1 цикла. Реакцию амплификации в режиме реального времени осуществляют в течение 45 циклов, каждый из которых складывается из 3 подэтапов: «денатурации», проводимой при температуре 95°С в течение 20 с, а также подэтапов «отжига праймеров и зонда» и «элонгации и аккумулирования флуоресцентного сигнала», осуществляемых при температурах 57°С за 20 с и 72°С за 20 с, соответственно. Общий процесс термоциклирования занимает 67 мин без учета переходов с одного режима на другой.

Результаты реакции анализируют, оценивая и сравнивая графики накопления флуоресцентного сигнала после проведения двойного дифференцирования по значениям точек crossing point (С_р), определенных с помощью построения графика второй производной функции F1=f (С_р). Величина С_р является важной характеристикой реакции, она прямо пропорциональна количеству копий исходной вирусной РНК и соответственно титру инфекционной активности вируса ящура в сырье для вакцин. Учитывая, что функция от двойного дифференциала f (С_р) (f "(С_р)) непрерывна в некоторой окрестности точки С_р=C_p1 и задана на отрезке циклов амплификации [0; 40], существует определенный участок около точки С_р, для которого во всех координатах на оси 0-С_р двойной математический дифференциал функции f (С_р) будет отрицательным. Поскольку f "(С_р) является первым дифференциалом от функции f '(С_р), то из условия (f '(С_р))'<0, следует, что f'(С_Р) на некотором малом отрезке, содержащем точку С_р=C_p1, будет убывающей. Учитывая, что f '(С_р)=0, на участке при С_р<C_p1 первый дифференциал функции f (С_р)>0, а при С_р>C_p1 получаем, что f '(Ср)<0. Иными словами, первый дифференциал функции f (С_р) при переходе через точку С_р=C_p1 изменяет знак с «+» на «-», следовательно, в точке C_p1 функция, отражающая процесс накопления флуоресцентного сигнала, имеет наибольшее значение [15]. Таким образом, если график реакции амплификации представлен функцией Fl1=f (С_р), f '(С_р)=0 и f "(С_р)<0, то при условии, что С_р=С_Р1 полученная функция имеет наибольшее значение в точке с аргументом C_p1, значение которого учитывают для установления зависимости между титром инфекционной активности вируса ящура в сырье для вакцин и значением С_р функции после проведения двойного математического дифференцирования.

Данный метод имеет преимущество в связи с тем, что при умножении кривой на любые множители положение наибольших значений функции не изменяется. Максимум на графике двойного дифференциала при его исследовании на максимумы располагается внутри экспоненциального участка сигмоиды, где эффективность реакции амплификации является константой. Наибольшие значения первого дифференциала находятся, чаще всего, в зоне искажения значений эффективности амплификации, поэтому их не рекомендуется использовать для анализа. Графики третьей производной дают менее точные результаты, поскольку их координаты во многом сопряжены с шумовыми значениями [15].

Вычислив значения С_р графиков двойного математического дифференциала для кривых, отражающих накопление флуоресцентного сигнала образцов с разным титром инфекционной активности вируса ящура, устанавливают зависимость между титром вируса в неинактивированном сырье для вакцины и значением точки С_р после проведения двойного математического дифференцирования. На основе разработанной модели рассчитывают значение титра инфекционной активности вируса ящура в неинактивированном сырье для противоящурных вакцин.

Пример 1. Получение положительного контроля для опосредованного определения титра инфекционной активности культурального вируса ящура в сырье для вакцин.

Для проведения опосредованного определения титра инфекционной активности культурального вируса ящура в сырье для вакцин был применен метод высокопроцессивного клонирования Golden Gate, позволяющий создать мРНК, кодирующую таргетный участок генома вируса ящура.

В качестве вектора встраивания применяли плазмиду pJet 1.2 sf GFP (размер 3111 п. н.) с геном зеленого флуоресцирующего белка (GFP - green fluorescent protein) для трансфекций в эукариотические клетки. Карта данной плазмиды отражена на фиг.2 А. Данная плазмида может функционировать в бактериальных клетках и обладает устойчивостью к ампициллину (AmpR). Плазмиду pJet 1.2 sf GFP можно применять для встраивания в нее целевых участков генов между Т7 promotor и HDV ribozyme. Рибозим вируса гепатита дельта (HDV) представляет собой не кодирующую РНК, обнаруженную у вируса гепатита дельта, которая необходима для репликации вируса и является единственным известным вирусом человека, который использует активность рибозима для заражения своего хозяина. Данная особенность позволяет проводить синтез мРНК нужной последовательности, которую в последующем можно применять в качестве контроля для количественной реакции амплификации, в частности, для опосредованного определения титра инфекционной активности вируса ящура в сырье для вакцин.

Проводили исследования по конструированию модифицированного участка РНК вируса ящура в позициях 7843…7976 н.о. (участок РНК 3D-гена вируса:

или соответствующий участок ДНК:

Именно для амплификации данного участка РНК были выше разработаны олигонуклеотидные праймеры и зонд.

На концы выбранной последовательности с помощью ПНР «пришивали» адапторные последовательности:

('- сайты для разрезания рестриктазой Bsa I).

Данные адаптеры были необходимы для формирования «липких» концов, образующихся после обработки рестриктазой II S. Данные ферменты вносят разрывы не в сайте рестрикции, а на некотором удалении от него, в частности, для рестриктазы Bsal сайты рестрикции и разрезания следующие: GGTCTCNNNNN.

Адаптор, расположенный на 3'-конце размещается с учетом reverse-complemente в направлении 5'→3'.

Для получения модифицированной последовательности проводили ПЦР с применением двух следующих праймеров (подчеркнуты участки для комплементарности с последовательностями плазмиды):

В результате получили ампликоны, содержащие целевую область и адапторы:

Полученные концевые участки нуклеотидов в таргетной последовательности и плазмиде отражены на фиг.2 Б, 2 В, 2 Г, 2 Д.

На следующем этапе исследования проводили транзиторную трансфекцию клеток. Клетки линии BHK-21/SUSP/ARRIAH подвергали транзиторной трансфекции с помощью высокомолекулярного полиэтиленимина (ПЭИ) (60 000 кДа) (Acros Organics). В качестве контроля применяли трансфекционный реагент TurboFect (Fermentas) в соответствии с инструкцией фирмы-производителя. В качестве репортерных генетических конструкций использовали плазмиду р Jet 1.2 sf GFP (Clontech), кодирующую участок нуклеиновой кислоты вируса ящура. За два дня до трансфекции делали посев клеток линии BHK-21/SUSP/ARRIAH с концентрацией 0,45-0,5 × 10⁶ клеток/см³. Клетки трансфицировали с жизнеспособностью более 95% при содержании 1,5 - 2 × 10⁶ клеток/см³. Плазмидную ДНК и ПЭИ отдельно разводили в полностью свободной от сыворотки среде F12 в количествах 1,0 и 2,0 мкг/см³, соответственно. ПЭИ добавляли по каплям к раствору ДНК. Смесь перемешивали в течение 4 с и инкубировали при комнатной температуре в течение 3 мин. Затем к клеткам добавляли смесь ДНК+ПЭИ. Мелкомасштабные трансфекции были выполнены на шести луночных планшетах. Крупномасштабные трансфекции проводили в 2-литровых колбах для встряхивания. После трансфекции клетки собирали, ресуспендировали в буфере для лизиса (50 мМ HEPES рН 7,4, 150 мМ NaCl, 1% полидоканола (детергент), 0,5% деоксихолат натрия).

Пример 2. Выявление существования зависимости между титром инфекционной активности вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины и значением точки crossing point после расчета двойного математического дифференциала первичных логистических кривых для проб при анализе в реакции амплификации кДНК.

На первом этапе исследования применяли панель готовых разведений стандарта, в качестве которого использовали неинактивированную суспензию культурального вируса ящура с количествами вирусной РНК, эквивалентными следующим титрам инфекционной активности вируса ящура: 0,0, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0 lg ТЦЦ₅₀/см³. В лунки с сенсибилизированными штаммоспецифическими антителами против вируса ящура вносили по 2,0 см³ суспензий образцов и инкубировали при температуре 37±0,5°С в течение 30 минут. В результате реакции нейтрализации на поверхности лунок формировались иммунные комплексы. Лунки отмывали от балластных компонентов с использованием стандартного буферного раствора TBST 3 раза. Образовавшиеся иммунные комплексы ресуспендировали в 0,5 см³ 1/15 М фосфатного буферного раствора.

Проводили выделение РНК из иммунного комплекса твердофазным сорбционным методом в соответствии с процедурой, представленной выше.

Проводили обратную транскрипцию и реакцию амплификации с использованием специфических оригинальных олигонуклеотидных праймеров и зонда для исследования контрольных образцов и проб. Для постановки реакции составляли реакционную смесь. В качестве гомологичных 3D-гену вируса ящура олигонуклеотидов использовали FMD-3D-Titer-F-праймер, FMD-3D-Titer-R-праймер и FMD-3D-Titer-P-ROX/BHQ2-зонд в концентрации 5 пМ на реакцию. Для формирования нуклеотидных цепей продуктов реакции применяли дезоксирибонуклеозидтрифосфаты с концентрацией каждого в реакционной смеси по 0,3 мМ. В качестве основы использовали ПЦР-буфер следующего состава: 165 мМ (NH₄)₂SO₄, 675 мМ Tris-HCl (рН 8,8), 0.1% Tween-20. В реакционную смесь добавляли 3 мМ хлорида магния, 3 мМ хлорида марганца (II) и диметилсульфооксид в количестве 2% от общего объема без элюата РНК. В качестве растворителя использовали деионизированную воду системы очистки Milli Q. В качестве катализатора обратной транскрипции и реакции амплификации применяли Tth (Thermus thermofilus) DNA-полимеразу (2 ед.). Объем реакционной смеси компонентов для проведения одной реакции составлял 20 мкл. Элюаты РНК каждого образца добавляли к смеси по 5 мкл. Общий объем mix составлял 25 мкл.

Обратную транскрипцию проводили при температуре 50°С в течение 20 мин за 1 цикл, предварительную денатурацию комплементарной ДНК - при температуре 95°С за 2 мин в течение 1 цикла. Реакцию амплификации в режиме реального времени осуществляли в течение 45 циклов, каждый из которых складывался из 3 подэтапов: «денатурации», проводимой при температуре 95°С в течение 20 с, а также подэтапов «отжига праймеров и зонда» и «элонгации и аккумулирования флуоресцентного сигнала», осуществляемых при температурах 57°С за 20 с и 72°С за 20 с, соответственно. Общий процесс термоциклирования занимал 67 мин без учета переходов с одного режима на другой.

Результаты реакции анализировали, оценивая и сравнивая графики накопления флуоресцентного сигнала после проведения двойного дифференцирования по значениям точек crossing point (С_р), определенных с помощью построения графика второй производной функции F1=f (С_р).

Полученные данные анализировали с помощью программного обеспечения «Rotor-Gene FRT-Manager», которое позволяет строить графики накопления флуоресцентного сигнала в режиме реального времени на протяжении заданного количества циклов амплификации (С). Применяя технологии компьютерной программы «Maxima» (или аналога), проводили построение графиков после вычисления математического двойного дифференциала для полученных элюатов РНК вируса ящура каждого разведения стандарта с определенными значениями титра вируса ящура и рассчитывали средние значения crossing point с проекцией на ось абсцисс О-С (n=3) (Фиг. 3). Значения точки crossing point для всех разведений стандарта вируса ящура с титрами инфекционной активности от 0,0 до 10,0 lg ТЦД₅₀/см³ находились в диапазоне от 38,94±0,12 до 5,64±0,01, соответственно. Стандартное отклонение при низком титре инфекционной активности (0,00 lg ТЦД₅₀/см³) выше (0,12), чем при высоком (10,0 lg ТЦД₅₀/см³) по причине снижения чувствительности анализа. При исследовании отрицательного контроля накопления флуоресцентного сигнала не наблюдалось, что подтверждает отсутствие вируса ящура в данном образце. В представленных исследованиях р-уровень значимости меньше 0,005, что подтверждает достоверность проводимых количественных исследований. Зависимость титра инфекционной активности вируса ящура и значений точек crossing point для графиков двойного математического дифференциала представлена на фиг.5 и отражена в виде регрессионной логарифмической функции lg T_FMDV=-0,2997 × С_р+11,675 с высокой достоверностью аппроксимации R²=0,9994 и эффективностью амплификации 99,46%. Эффективность реакции амплификации вычислили при анализе углового коэффициента из графика функции С_р=-3,335 × lg T_FMDV+38,95 с высокой достоверностью аппроксимации R²=0,9994, представленного на фиг.4. Таким образом, выявлено существование зависимости титра инфекционной активности вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины и точки crossing point для графика, построенного исходя из функции двойного математического дифференциала первичных логистических кривых. Предложенная модель позволяет опосредованно определять титр инфекционной активности вируса ящура в неинактивированном сырье для противоящурной вакцины.

Пример 3. Опосредованное определение титра инфекционной активности вируса ящура с применением способа математического двойного дифференциала данных точки crossing point при амплификации вирусной кДНК.

Для анализа использовали референтные неинактивированные суспензии культурального вируса ящура штаммов А/Турция/2006, О/Саудовская Аравия/2008, С/Закарпатский/1972, Азия-1/Таджикистан/2011, SAT-1/Ахалкалакский/1962, SAT-2 SAU7/2000, SAT-3 Бечуаналенд 1/65 с разными значениями титров инфекционной активности по данным исследования в монослойной перевиваемой клеточной линии почки свиньи IB-RS-2. В качестве положительного контроля (К+) для количественного анализа применяли неинактивированную суспензию культурального вируса ящура с титром инфекционной активности 7,00 lg ТЦД₅₀/СМ³. Положительным контролем для качественного анализа обратной транскрипции и реакции амплификации использовали матричную РНК, полученную с применением плазмидной системы, полученной в примере 1. Отрицательным контролем (К-) служила неинфицированная вирусом ящура суспензия клеток BHK-21/SUSP/ARRIAH с концентрацией 3,00 млн клеток/см³. Испытуемые пробы и контрольные образцы исследовали в трех повторностях. Все этапы анализа проводили, как представлено в примере 2.

Результаты исследования представлены в таблице 3, из которых следует, что С_{р среднее K+} составляло 15,61±0,01, что соответствовало титру 7,00±0,01 lg ТЦД₅₀/см³ (совпадает с референс-значением). С_р для проб штаммов А/Турция/2006, О/Саудовская Аравия/2008, С/Закарпатский/1972, Азия-1/Таджикистан/2011, SAT-1/Ахалкалакский/1962, SAT-2 SAU7/2000, SAT-3 Бечуаналенд 1/65 составляли 13,87±0,04, 10,77±0,03, 11,44±0,04, 8,13±0,03, 15,67±0,02, 12,17±0,01, 12,94±0,03, соответственно. Пользуясь разработанной моделью:

определили значения титра инфекционной активности вируса ящура, которые были соответственно равны 7,52±0,04, 8,45±0,03, 8,25±0,04, 9,24±0,03, 6,98±0,02, 8,03±0,01, 7,80±0,03, 7,00±0,01 lg ТЦД₅₀/см³, что сочеталось данными анализа в монослойной перевиваемой клеточной линии почки свиньи IB-RS-2. В отрицательном контроле вирус ящура не обнаружен ни одним из указанных методов. Анализ занял не более 3 ч. Таким образом, разработанный способ позволяет быстро опосредованно определять титр инфекционной активности вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины с помощью математического двойного дифференциала данных точки crossing point при амплификации вирусной к ДНК.

Пример 4. Определение степени достоверности опосредованного определения титра инфекционной активности вируса ящура в сырье для вакцин с применением способа математического двойного дифференциала данных точки crossing point при амплификации вирусной кДНК.

Для анализа использовали 460 проб суспензии культурального вируса ящура с титрами инфекционной активности 1,00-10,0 lg ТЦД₅₀/см³. Положительные и отрицательные контроли использовали те же, что и в примерах 2, 3. Количественный анализ проводили, как отражено в примере 2.

С полученными экстрактами РНК вируса ящура проводили обратную транскрипцию и реакцию амплификации кДНК с последующей детекцией продуктов анализа с применением разработанных оригинальных специфических олигонуклеотидных праймеров и зонда, расчеты осуществляли с помощью логарифмической регрессионной функции: lg Tfmdv=-0,2997 × С_р+11,675.

Представленные пробы и контроли также тестировали в монослойной перевиваемой клеточной линии почки свиньи IB-RS-2. Результаты анализа представлены в таблице 4. Выявили, что данные, полученные с помощью разработанного способа, коррелировали с классическим методом на 98,5-100,0% для титров вируса 7,0-10,0 lg ТЦД₅₀/см³ (п=115), на 97,1-98,4% для 6,00-6,99 lg ТЦД₅₀/см³ (n=115), на 95,9-97,0% для 2,00-5,99 lg ТЦД₅₀/см³ (п=115), на 94,3-95,8% для 1,00-1,99 lg ТЦД₅₀/см³ (n=115).

Иными словами, разработанный способ позволяет быстро и достоверно определять титр инфекционной активности культурального вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцин.

Пример 5. Определение диагностических показателей разработанного способа

Для исследования представленного способа (предлагаемое изобретение) для опосредованного определения титра инфекционной активности вируса ящура в сырье для вакцин исследовали стандартные диагностические показатели [16, 17]. Для определения чувствительности разработанного способа анализировали 450 проб вируссодержащего неинактивированного сырья, которые являлись заведомо положительными по данным анализа в чувствительной перевиваемой монослойной перевиваемой клеточной линии почки свиньи IB-RS-2. Титр вируса для исследуемых проб находился в диапазоне 6,0-10,0 lg ТЦЦ₅₀/см³. Постановку реакции и проведение дифференциального математического анализа осуществляли, как отражено в примере 2. Разработанным способом (предлагаемое изобретение) определили, что из 450 образцов проб 450 определены в качестве положительных, 0-в качестве отрицательных. Для исследования специфичности метода тестировали 140 отрицательных проб, не содержащих вирус ящура. В результате исследования с помощью разработанного способа (предлагаемое изобретение) определили, что из 140 отрицательных проб - 140 определены в качестве отрицательных. Пользуясь представленными выше статистическими методами анализа определили, что диагностическая чувствительность (DSe) составила 100% (в 95%-ном доверительном интервале: 99,18-100,0%), диагностическая специфичность (DSp) - 100% (в 95%-ном доверительном интервале: 98,08-100,0%), k-критерий - 1,000; прогностичность положительного результата (PPV) - 100%, прогностичность отрицательного результата (NPV) - 100%, общая точность (DAc) - 100% (в 95%-ном доверительном интервале: 99,43-100,0%) (таблица 5).

Основным преимуществом предлагаемого изобретения является возможность опосредованного определить титр инфекционной активности культурального вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцин. Предлагаемое изобретение сочетает постановку реакции нейтрализации с последующим проведением молекулярно-биологического исследования неинактивированной суспензии культурального вируса ящура, что повышает специфичность и чувствительность способа. В данном изобретении предлагается применение в качестве положительного контроля мРНК целевого участка вируса ящура, полученного за счет экспрессии плазмидного модифицированного вектора pJet 1.2 sf GFP в клетках линии BHK-21/SUSP/ARRIAH после транзиторной трансфекции. В предлагаемом изобретении используются Tth ДНК-полимераза, позволяющая совмещать этапы обратной транскрипции и реакции амплификации, а также оригинальные специфические олигонуклеотидные праймеры и зонд, рассчитанные для таргетного участка 3D-гена вируса ящура разных производственных штаммов, что обуславливает универсальность применяемого способа. В предлагаемом изобретении зависимость титра инфекционной активности вируса ящура и значений точек crossing point для графиков двойного математического дифференциала представлена в виде регрессионной логарифмической функции lg T_FMDV - -0,2997 × С_р+11,675 с высокой достоверностью аппроксимации 0,9994 и эффективностью амплификации 99,46%. Разработанная модель позволяет проводить опосредованное определение титра инфекционной активности культурального вируса ящура в сырье для изготовления вакцин.

Предлагаемое изобретение позволяет быстро (за 3 ч) опосредованно определить титр инфекционной активности культурального вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины на основе математического двойного дифференциала данных точки crossing point при амплификации вирусной кДНК.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Способ опосредованного определения титра инфекционной активности вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины с помощью математического двойного дифференциала данных точки crossing point при амплификации вирусной кДНК»:

1. Пономарев А.П., Узюмов В.Л. Вирус ящура: структура, биологические и физико-химические свойства. Владимир: Фолиант.- 2006. - 250 с.

2. FMDV - Taxonomy. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy/ ?term=FMDV (дата обращения 20.04.2022).

3. OIE. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. 7th ed. Paris.-2018.-Ch. 2.1.8.

4. Pinheiro-de-Oliveira TF, Fonseca AA Jr, Camargos MF, Laguardia-Nascimento M, de Oliveira AM, Cottorello ACP, Goes-Neto A, Barbosa-Stancioli EF. Development of a droplet digital RT-PCR for the quantification of foot-and-mouth virus RNA. J Virol Methods. 2018 Sep;259:129-134.

5. Han SC, Guo HC, Sun SQ. Three-dimensional structure of foot-and-mouth disease virus and its biological functions. Arch Virol. 2015 Jan; 160(1): 1-16.

6. Alexandersen, S. The pathogenesis and diagnosis of foot and mouth disease / S. Alexandersen, Z. Zhang, A.L. Donaldson [et al.] // J. Compr. Pathol. - 2003. - V. 129.-P. 268-282.

7. Lubroth, J., Rodriguez, L. and Dekker, A. Vesicular diseases. In: Straw, B.E., Zimmerman, J.J., D'Allaire, S. and Taylor, D.J., editors. Diseases of Swine. 9^th ed. Blackwell Publishing Professional, Ames, Iowa, USA. - 2006. - P. 517-536.

8. Nishi T, Kanno T, Shimada N, Morioka K, Yamakawa M, Fukai K. Reverse transcription-PCR using a primer set targeting the 3D region detects foot-and-mouth disease virus with high sensitivity. Transbound Emerg Dis. 2019 Jul;66(4):1776-1783.

9. Bi Y, Shen X, Cong G, Liu X, Chang H, Cai X. [Establishment of BHK-21 cell lines stably expressing FMDV 3Dpol gene by retro viral-mediated gene transfer technique]. Wei Sheng Wu Xue Bao. 2008 Aug;48(8):l 115-20.

10. Knight-Jones T.J.D. The economic impacts of FMD - What are they, how big are they and where do they occur? / T.J.D. Knight-Jones, J. Rushton // Prev. Vet. Med.-2013.-V. 112 (3-4).-P. 161-173.

11. Патент РФ №2 722 671, 01.10.2019. BHK-21/SUSP/ARRIAH -перевиваемая суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка, предназначенная для репродукции вирусов ящура, бешенства, парагриппа-3, болезни Ауески при производстве противовирусных вакцин, а также для изготовления диагностических и профилактических ветеринарных биопрепаратов // Заявка №2019131190. 01.10.2019 / Лозовой Д.А., Гусева М.Н., Михалишин Д.В. [и др.].

12. Патент РФ №2619878/13, 18.05.2017. Способ определения концентрации 146S-компонента вируса ящура в вируссодержащем сырье для вакцины с применением метода обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции в режиме реального времени // Заявка №2016140460/15. 2017. Бюл. №14 / Лозовой Д.А., Михалишин Д.В., Доронин М.И. [и др.].

13. Патент РФ №2674076, 25.12.2017. Способ определения титра инфекционной активности вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины с применением метода обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени // Заявка №2017145889 / Лозовой Д.А., Михалишин Д.В., Доронин М.И. [и др.].

14. Патент РФ №2 725 862, 03.09.2019. Способ количественной оценки вирионов вируса ящура в неинактивированном сырье вакцины при сравнении максимальных экстремумов графиков второй производной для кривых реакции амплификации в режиме реального времени // Заявка 2019127830, 03.09.2019 / Лозовой Д.А., Михалишин Д.В., Доронин М.И. [и др.].

15. Rutledge R.G. Mathematics of quantitative kinetic PCR and the application of standard curves / R.G. Rutledge, C. Cote // Nucleic Acide Res. - 2004. - V. 31, N.16. -e.93.P. 1-6.

16. Liu W., Saint D.A. Validation of a quantitative method for real-time PCR kinetics // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2002. - V. 294. - P. 347-353.

17. Peirson S.N., Butler J.M., Foster R.G. Experimantal validation of novel and conventional approaches to quantitative real-time PCR data analysis // Nucleic Acids Res. - 2003. - V. 31:e.73.

Изобретение относится к области биотехнологии и производству противоящурных вакцин, а именно к способу опосредованного определения титра инфекционной активности вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцин с помощью математического двойного дифференциала данных точки crossing point при амплификации вирусной кДНК. Предлагаемое изобретение сочетает осуществление реакции нейтрализации с последующим проведением молекулярно-биологического исследования, что повышает специфичность и чувствительность способа. Предложено применять в качестве положительного контроля мРНК таргетного участка вируса ящура, полученного после транзиторной трансфекции клеток BHK-21/SUSP/ARRIAH генной конструкцией, полученной с применением плазмидного вектора pJet 1.2 sf GFP. Обнаружена зависимость титра инфекционной активности вируса ящура и значений точек crossing point для графиков двойного математического дифференциала, представленная в виде регрессионной логарифмической функции lg T_FMDV=-0,2997×С_р+11,675, с высокой достоверностью аппроксимации и эффективностью реакции амплификации. Предлагаемое изобретение позволяет в течение 3 ч и с высокой степенью достоверности опосредованно определять титр инфекционной активности культурального вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины на основе математического двойного дифференциала данных точки crossing point при амплификации вирусной кДНК. 3 з.п. ф-лы, 6 ил., 5 табл., 5 пр.

1. Способ опосредованного определения титра инфекционной активности вируса ящура в неинактивированном сырье вакцин с помощью математического двойного дифференциала данных точки crossing point при амплификации вирусной кДНК, включающий следующие стадии:

- реакция штаммоспецифической нейтрализации вируса ящура в сырье для вакцин;

- экстрагирование суммарной РНК из иммунных комплексов после реакции нейтрализации с использованием твердофазного сорбционного метода;

- проведение обратной транскрипции и реакции амплификации с детекцией флуоресцентного сигнала логистических кривых исследуемых образцов с использованием разработанных оригинальных олигонуклеотидных:

и молекулярного зонда FMD-30-Тiter-Р(ROХ/ВНQ2)-зонд с дизайном которые рассчитаны на целевой участок 3D-гена вируса ящура;

- расчет точки crossing point с помощью функции двойного математического дифференциала логистических кривых;

- определение титра инфекционной активности культурального вируса ящура в пробах неинактивированного сырья для вакцины на основе разработанной логарифмической регрессионной функции зависимости титра вируса и точки crossing point lg T_FMDV=-0,2997×C_p+11,675 с достоверностью аппроксимации 0,9994 и эффективностью амплификации 99,46%..

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что используется фермент Tth ДНК-полимераза в количестве 2 единиц активности в комплексе с хлоридом марганца (II) в концентрации 3 мМ на 1 реакцию для совмещения обратной транскрипции и реакции амплификации во времени и пространстве.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве положительного контроля применяют мРНК таргетного участка 3D-гена вируса ящура, полученную в результате транзиторной трансфекции суспензионной перевиваемой клеточной линии почки новорожденного сирийского хомячка BHK-21/SUSP/ARRIAH генной конструкцией, полученной с применением модифицированного плазмидного вектора pJet 1.2 sf GFP, сконструированного с помощью технологии Golden Gate.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что сокращается время проведения анализа до 3 ч и при этом достигаются следующие показатели диагностической чувствительности, специфичности, точности и k-критерия в 95% доверительном интервале: 98,5-100%, 98,08-100,0%, 99,43-100,0% и 1,000 соответственно.