Способ определения титра инфекционной активности возбудителя чумы плотоядных животных в сырье для изготовления культуральных инактивированных вакцин Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/68 C12Q1/6876 

Изобретение относится к области биотехнологии и производству культуральных вакцин, а именно к способу определения титра инфекционной активности возбудителя чумы плотоядных животных в сырье для изготовления культуральных инактивированных вакцин с помощью количественной транскрипционной амплификации таргетного участка гена CDVgp7 вирусной РНК.

Возбудитель чумы плотоядных животных, в настоящее время называемый собачьим морбилливирусом, является чрезвычайно заразным заболеванием, поражающим многих плотоядных, преимущественно собак [1]. Данное заболевание известно с 1760 года [2]. Попадание вируса в организм животных связано с множественным тропизмом клеток (эпителиальных, лимфоидных и неврологических), что приводит к системной инфекции, включая заболевания органов дыхания, пищеварения, мочевыделительной системы, лимфатической системы, кожи, скелета и центральной нервной системы (ЦНС) [3].

Возбудитель чумы плотоядных животных относится к порядку Mononegavirales, семейству Paramyxoviridae, подсемейству Orthoparamyxoviridae, роду Morbillivirus, виду Canine Distemper virus (CDV). [4].

CDV представляет собой оболочечный несегментированный одноцепочечный РНК-содержащий вирус длиной около 15690 н.о. с количеством GC (содержание гуанина и цитозина) равным 43%. РНК вируса с отрицательным смыслом включает в себя семь генов CDVgp1-7, которые кодируют семь следующих белков: N-, P-, C-, М-, F-, H- и L-белки (РНК-зависимая РНК-полимераза) [4, 5] соответственно. Схематическое строение CDVgp7-гена отражено на фиг. 1А и 1Б, из которых видно, что он занимает в РНК позиции в диапазоне 9030…15584 (6555 н.о.) и кодирует РНК-зависимую РНК-полимеразу (L-белок) размером 2185 а.о. Данный ген является высококонсервативным и перспективным для анализа при количественном определении содержания вирусных частиц в суспензии с помощью современных методов молекулярной биологии. Референтные нуклеотидные и аминокислотные последовательности представлены в GenBank под общим регистрационным номером GCF_000854065.1.

Система мер для борьбы с чумой плотоядных животных и его профилактики предусматривает иммунизацию домашних животных [6, 7, 8]. Для этой цели применяют вакцинные препараты. При их изготовлении вируссодержащее сырье исследуют на определение титра инфекционной активности возбудителя чумы плотоядных животных для оценки его активности в клетках. В 1,0 см³ суспензии вируса определяют количество тканевых цитопатических доз, вызывающих 50%-ное поражение клеток (ТЦД₅₀/кл.).

Традиционно для определения титра инфекционной активности возбудителя чумы плотоядных применяют метод титрования в перевиваемой монослойной культуре клеток почки африканской зеленой мартышки (Vero), с помощью которой вычисляют минимальную дозу вируса, способную вызвать лизис 50% клеток (прототип) [1]. Данный метод имеет некоторые недостатки: 1) длительная процедура титрования, связанная с поражением клеток возбудителем чумы плотоядных (не менее 72 ч);

2) определенная степень субъективности при оценке результатов исследования;

3) высокая стоимость клеточной линии Vero как тест-системы и затраты на ее поддержание;

4) высокая вероятность риска контаминации культуры клеток Vero.

В связи с этим целесообразно провести поиск способа определения титра инфекционной активности возбудителя чумы плотоядных животных в сырье для изготовления культуральных инактивированных вакцин.

В мировой практике известен такой метод, как амплификация на основе последовательности нуклеиновых кислот - высокочувствительная изотермическая система амплификации на основе транскрипции РНК-мишеней. Данный анализ зависит от дизайна праймеров, а обнаружение ампликонов основано на связывании зонда с таргетным участком РНК. Представлен обзор различных целевых нуклеиновых кислот, которые были успешно амплифицированы с использованием NASBA. Для обнаружения РНК-ампликона в конце амплификации ранее проводили электрохемилюминесценцию. В настоящее время стали применять молекулярные маяки, позволяющие обнаруживать ампликон в режиме реального времени во время амплификации. Данный подход позволяет осуществлять количественный анализ нуклеиновых кислот и полных вирусных частиц [9, 10].

Данный метод является объективным, экспрессным, высокочувствительным и высокоспецифичным, более дешевым по сравнению с прототипом, характеризуется применением стандартизированных компонентов реакции, не создает ситуаций риска контаминации, отличается высокими значениями правильности и позволяет определять титр инфекционной активности, в частности, вирусов чумы плотоядных в течение 2-3 часов. Исходя из этого, целесообразно разработать способ определения титра инфекционной активности возбудителя чумы плотоядных животных в сырье для изготовления культуральных инактивированных вакцин.

Задачей настоящего изобретения является разработка высокочувствительного и высокоспецифичного экспресс-способа определения титра инфекционной активности возбудителя чумы плотоядных животных в сырье для изготовления культуральных инактивированных вакцин.

Данная задача решена благодаря разработке способа определения титра инфекционной активности возбудителя чумы плотоядных животных в сырье для изготовления культуральных инактивированных вакцин при количественной транскрипционной амплификации таргетного участка гена CDVgp7 вирусной РНК. Предложенный способ позволяет:

1) сократить время проведения анализа вируссодержащих суспензий для определения титра инфекционной активности возбудителя чумы плотоядных животных до 2 ч;

2) исключить вероятность контаминации;

3) повысить объективность анализа;

4) увеличить специфичность анализа за счет применения РНК-праймеров и молекулярного зонда, меченого флуорофором FAM (карбоксифлуоресцеином) (максимальная длина волны поглощения - 520 нм) и гасителем свечения RTQ1 (максимальная длина волны поглощения - 520 нм);

5) увеличить чувствительность анализа за счет амплификации только молекул вирусной РНК;

6) удешевить способ анализа за счет отсутствия использования клеточных культур в качестве тест-систем;

7) повысить достоверность проводимого анализа благодаря установлению зависимости между значениями титра инфекционной активности возбудителя чумы плотоядных животных (Т_CDV) и циклами количественной оценки реакции амплификации РНК (C_Q-РНК-CDV), представленной в виде логарифмической функции:

lg Т_CDV = -0,3003×C_Q-_РНК-CDV + 9,9009

с высокой достоверностью аппроксимации (R² = 0,9946) и эффективностью амплификации 99,66 %.

Предложенная модель позволяет количественно оценивать инфекционный титр возбудителя чумы плотоядных животных в сырье для изготовления культуральных инактивированных вакцин.

Сущность изобретения отражена на графических изображениях:

Фиг. 1 - Модель гена CDVgp7 РНК возбудителя чумы плотоядных животных. Примечание: А - общий вид, Б - детальное положение в геноме.

Фиг. 2 - Зависимость цикла количественной оценки реакции амплификации вирусной РНК и титра инфекционной активности возбудителя чумы плотоядных животных (n=3, отмечены точки, отображающие средние значения цикла количественной оценки реакции амплификации вирусной РНК).

Фиг. 3 - Дизайн праймеров и молекулярного зонда для разработки способа определения титра инфекционной активности возбудителя чумы плотоядных животных в сырье для изготовления культуральных инактивированных вакцин с помощью количественной транскрипционной амплификации таргетного участка гена CDVgp7 вирусной РНК. Примечание: А - прямой праймер, Б - молекулярный зонд и обратный праймер, rev-comlp - реверсивная комплементарная форма обратного праймера.

Сущность изобретения пояснена в перечне последовательностей, в котором:

SEQ ID NO:1 представляет последовательность нуклеотидов гена CDVgp7 РНК возбудителя чумы плотоядных животных;

SEQ ID NO:2 представляет последовательность аминокислот L-белка, который кодируется геном CDVgp7 РНК возбудителя чумы плотоядных животных.

SEQ ID NO:3 представляет последовательность нуклеотидов прямого праймера CDV-F10476;

SEQ ID NO:4 представляет последовательность нуклеотидов зонда CDV-P10561 (FAM/RTQ-1);

SEQ ID NO:5 представляет последовательность нуклеотидов обратного праймера CDV-R10624.

Сущность изобретения заключается в подходе по определению титра инфекционной активности возбудителя чумы плотоядных животных с помощью количественной транскрипционной амплификации таргетного участка гена CDVgp7 вирусной РНК в сырье для изготовления культуральных инактивированных вакцин.

Заявляемый способ основан на: 1) элюировании РНК возбудителя чумы плотоядных; 2) амплификации специфического фрагмента гена CDVgp7 РНК возбудителя чумы плотоядных животных с применением олигонуклеотидов праймеров CDV-F10476 с дизайном 5'-AAT-TCT-AAT-ACG-ACT-CAC-TAT-AGG-G-CTCCACTGAGTCTCGGAGACT-3' и CDV-R10624 с дизайном 5'- ATTTTAGCGAATAATCTCCCTACCTC-3', зонда CDV-P10561 (FAM/RTQ-1) с дизайном 5'- FAM-CAA-AGC-GGTCAATATCTAGAAGATCCTGATTTCA-GCU-UUG-RTQ-1-3' для получения РНК-ампликона размером 174 н.о.; 3) обнаружении РНК-ампликонов с помощью флуоресцентного свечения и отображения накопления сигнала в виде сигмоиды; 4) расчете титра инфекционной активности возбудителя чумы плотоядных животных в сырье неинактивированном сырье для культуральных вакцин с применением логарифмической функции, выраженной в виде уравнения:

lg Т_CDV = -0,3003×C_Q-_РНК-CDV + 9,9009

с высокой достоверностью аппроксимации 0,9946 и эффективностью амплификации 99,66 %.

В настоящее время реакцию транскрипционной амплификации РНК применяют для выявления генома возбудителей различных инфекционных агентов, в частности, возбудителя парагриппа-1, 2, 3, 4; гриппа птиц А; энтеровирусной инфекции; цитомегаловирусной инфекции; аспергиллеза; кандидоза; хламидиоза; микобактериоза КРС; сальмонеллеза животных и др. патогенов [9, 10]. В настоящее время данный метод применяется для определения титра инфекционной активности вируса ящура и бешенства в сырье для вакцин [11, 12]. При этом сведений об аналогах предлагаемого способа определения титра инфекционной активности возбудителя чумы плотоядных животных в сырье для изготовления культуральных инактивированных вакцин с помощью количественной транскрипционной амплификации таргетного участка гена CDVgp7 вирусной РНК авторами не обнаружено.

Разработанный способ определения титра инфекционной активности возбудителя чумы плотоядных животных в сырье для изготовления культуральных инактивированных вакцин по сравнению с прототипом отличается быстротой выполнения анализа, его объективностью, более высокой чувствительностью и специфичностью.

В отличие от прототипа разработанный способ включает следующие этапы: 1) элюирование РНК возбудителя чумы плотоядных; 2) денатурация РНК возбудителя чумы плотоядных; 3) амплификация специфического фрагмента гена CDVgp7 РНК возбудителя чумы плотоядных животных с применением прямого и обратного праймеров, а также молекулярного зонда, меченого флуорофором FAM и тушителем свечения RTQ1; 4) детекция РНК-ампликонов с помощью флуоресцентного свечения и отображение накопления сигнала в виде сигмоиды; 5) расчет титра инфекционной активности возбудителя чумы плотоядных животных с применением логарифмической функции.

Применение разработанного способа позволит сократить время проведения анализа вируссодержащего сырья для культуральных инактивированных вакцин для определения титра инфекционной активности возбудителя чумы плотоядных животных до 2 ч; повысить степень объективности получаемого результата; исключить вероятность контаминации; увеличить специфичность и чувствительность анализа; повысить достоверность и правильность проводимого анализа. Исходя из этого, актуально применять разработанный способ для определения титра инфекционной активности возбудителя чумы плотоядных животных в сырье для изготовления культуральных инактивированных вакцин.

Ключевым элементом заявляемого способа является проведение этапов денатурации, обратной транскрипции, разрушения гетеродуплекса РНК/кДНК и амплификации вирусной РНК с последующим отжигом молекулярного зонда-beacon, детектирования пороговых циклов сигмоид для исследуемых проб и определения титра инфекционной активности возбудителя чумы плотоядных животных с применением логарифмической модели зависимости цикла количественной оценки реакции амплификации РНК-мишени для сигмоиды накопления сигнала флуоресценции и титра инфекционной активности вируса.

Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что новизна и изобретательский уровень заявляемого изобретения заключается в разработке и апробации способа определения титра инфекционной активности возбудителя чумы плотоядных животных в сырье для изготовления культуральных инактивированных вакцин с помощью количественной транскрипционной амплификации таргетного участка гена CDVgp7 вирусной РНК.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена на графическом материале - «Зависимость цикла количественной оценки реакции амплификации вирусной РНК и титра инфекционной активности возбудителя чумы плотоядных животных (n=3, отмечены точки, отображающие средние значения цикла количественной оценки реакции амплификации вирусной РНК)» (фиг. 2).

Технический результат изобретения заключается в том, что разработанный способ дает возможность: 1) повысить чувствительность и специфичность за счет применения олигонуклеотидных праймеров и молекулярного зонда, рассчитанных для целевого участка гена CDVgp7 РНК CDV; 2) увеличить достоверность проводимого анализа благодаря подбору оптимальных температурного и временного режимов термоциклирования; 3) в 36 раз быстрее по сравнению с прототипом определять титр инфекционной активности CDV в сырье для культуральных вакцин, что в рамках производственного процесса важно с экономической точки зрения.

На первом этапе работы подготавливают панель положительных стандартов возбудителя чумы плотоядных, в качестве которых используют не инактивированные вируссодержащие суспензии с инфекционными титрами: 0,0; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0 lg ТЦД₅₀/см³. Для получения данных разведений применяли охарактеризованную очищенную с помощью фильтра на 0,22 мкм культуральную суспензию возбудителя чумы плотоядных животных с титром инфекционной активности 6,0 lg ТЦД₅₀/см³. Репродукция вируса проводилась в монослойной клеточной линии Vero. В данном анализе взят широкий диапазон возможных значений титра инфекционной активности возбудителя чумы плотоядных, применяемого при исследовании. Для производства культуральных вакцин используют сырье с титрами ≥ 3,0 lg ТЦД₅₀/см³. Отрицательным контролем служила суспензия клеток Vero, не зараженная CDV.

Из всех стандартных положительных образцов и отрицательного контроля выделяют РНК возбудителя чумы плотоядных животных с помощью набора «РИБО-сорб» («Интерлабсервис», РФ).

На следующем этапе исследования проводят реакцию амплификации РНК для исследования контрольных образцов и исследуемых проб. Для постановки реакции готовят реакционную смесь, рецептура приготовления которой представлена в таблице 1. Дизайн олигонуклеотидов отражены в таблице 2 и на фиг. 3. Расчет олигонуклеотидных праймеров и зонда-beacon осуществляли на основании нуклеотидных последовательностей гена CDVgp7 возбудителя чумы плотоядных, опубликованных в базах данных GenBank и полученных в рамках исследований в ФГБУ «Федеральном центре охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»).

В качестве гомологичных гену CDVgp7 РНК возбудителя чумы плотоядных животных олигонуклеотидов используют праймеры CDV-F10476 с дизайном 5'-AAT-TCT-AAT-ACG-ACT-CAC-TAT-AGG-G-CTCCACTGAGTCTCGGAGACT-3' и CDV-R10624 с дизайном 5'- ATTTTAGCGAATAATCTCCCTACCTC-3', зонд CDV-P10561 (FAM/RTQ-1) с дизайном 5'-FAM-CAA-AGC-GGTCAATATCTAGAAGATCCTGATTTCA-GCU-UUG-RTQ-1-3', для получения РНК-ампликона размером 174 н.о. в концентрации 0,30 пМ на реакцию. Для синтеза нуклеотидных цепей РНК-ампликонов применяют дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dNTP) и рибонуклеозидтрифосфаты (NTP) с их концентрацией в реакционной смеси по 2,5 мМ. В качестве основы используют буферный раствор (5х), содержание которого составляет 20% от общего объема реакционной смеси. Буферный раствор включает в свой состав ионы калия (К⁺) (5∙10⁻²M) и диметилсульфооксид (DMSO) (0,5%). В качестве ко-фактора добавляют 12 мМ хлорида магния. В качестве катализаторов реакции амплификации РНК применяют следующие ферменты: AMV-обратную транскриптазу (3 ед.), РНКаза Н E. сoli (3 ед.) и Т7 ДНК-зависимую РНК-полимеразу (3 ед.). Данные ферменты добавляют в реакционную смесь после прогревания до температуры 65^°С и снижения температуры до 41^°С, поскольку эти компоненты реакции термолабильны.

Элюаты РНК возбудителя чумы плотоядных животных каждого образца добавляют к реакционной смеси по 5 мкл. Итоговый объем реакционной смеси для проведения одной реакции составляет 25 мкл.

При анализе нуклеотидных последовательностей гибридизационной части установили, что для олигонуклеотидов не характерно образование «шпилек» (за исключением «стеблевой» части зонда), а также не выявлено 3'-комплементарности и сайтов, отжигающих сами на себя при условии, когда минимальное количество пар оснований, необходимое для димеризации праймера, и минимальное количество пар оснований, необходимое для образования шпильки - 4 [13-18].

Проведено определение температур плавления (T_m) для гибридизационной части олигонуклеотидов. Точное определение температуры плавления играет очень важную роль в молекулярно-биологических исследованиях, в том числе при подборе РНК-праймеров и зонда для реакции амплификации РНК возбудителя чумы плотоядных. В соответствии с требованиями к реакции транскрипционной амплификации с последующей детекцией РНК-ампликонов температура плавления олигонуклеотидов (гибридной их части) должна быть выше температуры реакции (41^°С) не менее чем на 7-10С [15-18].

T_m при использовании алгоритма ближайших соседей для прямого, обратного праймеров и зонда-beacon составили 55-56^°С, что более чем на 7-10 °С ниже, чем температура амплификации РНК (41 °С) и соответствует общепринятым требованиям, предъявляемым к олигонуклеотидам, используемым для данной реакции [14-17].

Последовательности олигонуклеотидов исследованы на наличие нежелательных совпадений с другими последовательностями нуклеиновых кислот с использованием Банка данных последовательности РНК. Последовательности праймеров также проанализировали на наличие внутренних вторичных структур с помощью программы сворачивания нуклеиновых кислот с помощью программы Mfold [18]. Было выявлено, что для олигонуклеотидов нежелательных совпадений с другими последовательностями нуклеиновых кислот, а также наличия внутренних вторичных структур не обнаружено.

Постановку реакции осуществляют в амплификаторе с наличием флуориметра любой марки при температурных и временных параметрах, сведения о которых отражены в таблице 3. Стадию денатурации РНК проводят при температуре 65^°С в течение 5 мин за 1 цикл. Реакцию амплификации РНК осуществляют в течение 40 циклов в изотермических условиях при температуре 41^°С. Каждый условный цикл длится 2 минуты и складывается из 7 подэтапов: отжиг CDV-F10476 на вирусной РНК, элонгация комплементарной ДНК (кДНК), разрушение гибрида РНК/кДНК, отжиг CDV-R10624, элонгация второй цепи кДНК, активация промотора Т7 ДНК-зависимой РНК-полимеразы, синтез вирусной РНК, отжиг CDV-P10561 (FAM/RHQ1).

Принцип применяемого метода основан на проведении реакции транскрипционной амплификации нуклеиновой кислоты при фиксированной температуре 41^°С (изотермические условия) с участием трех ферментов: AMV-ревертазы (ревертаза вируса миелобластоза птиц), РНКазы (RNase) Н E. coli и Т7 ДНК-зависимой РНК-полимеразы, полученной рекомбинантным способом из бактериофага Т7, специфических прямого и обратного олигонуклеотидных праймеров и молекулярного зонда для амплификации целевого участка гена CDVgp7 РНК возбудителя чумы плотоядных. В результате этого процесса в ходе реакции происходит накопление миллиардов специфических фрагментов вирусной РНК-мишени. После инкубации РНК возбудителя чумы плотоядных животных при температуре 65 °С в течение 5 мин, при котором осуществляется денатурация нуклеиновой кислоты, начинается линейная стадия реакции амплификации, при которой специфический CDV-F10476 гибридизируется с участком вирусной РНК. Данный олигонуклеотидный праймер включает в свой состав специфическую гибридизационную часть, а также промоторную последовательность T7 ДНК-зависимой РНК-полимеразы. При температуре 41^°С AMV-ревертаза осуществляет элонгацию, создавая комплементарную ДНК с вирусной РНК-мишени. В результате формируется гетеродуплекс РНК/кДНК. Для РНКазы Н E. coli данный гибрид выступает в качестве субстрата. Фермент гидролизует РНК CDV, тем самым разрушает гибрид РНК/кДНК, оставляя одноцепочечную кДНК. С кДНК гибридизуется CDV-R10624. AMV-ревертаза вновь удлиняет кДНК до 5-конца с образованием двуцепочечной кДНК (дц кДНК), что приводит промотор T7 ДНК-зависимой РНК-полимеразы в функциональное состояние. Данный фермент воспринимает дц кДНК с активным промотором в качестве субстрата. В результате производится множество копий целевого фрагмента РНК возбудителя чумы плотоядных размером 174 н.о. Молекулярный зонд, комплементарный таргетному участку гена CDVgp7 РНК-мишени возбудителя чумы плотоядных, гибридизуется с ним. В отсутствии мишени флуорофор и гаситель флуоресценции в составе молекулярного зонда сближены за счет максимального использования водородных связей между атомами H, O и N олигонуклеотида. Благодаря механизму флуоресцентно-резонансного переноса энергии свечение подавлено. После линейной стадии реакция амплификации РНК вступает в циклический процесс. CDV-R10624 гибридизуется с вновь синтезированной молекулой РНК возбудителя чумы плотоядных. AMV-ревертаза проводит элонгацию кДНК CDV. В результате образуется гетеродуплекс РНК/кДНК. За счет активности РНКазы Н E. coli после отжига зонда происходит разрушение гибрида РНК/кДНК за счет гидролиза РНК CDV, наблюдается пространственное разделение флуорофора и гасителя свечения, что приводит к росту детектируемого сигнала при длине волны 520 нм. CDV-P10561 гибридизируется с кДНК, а AMV-ревертаза удлиняет его с образованием двуцепочечной кДНК. Фермент T7 ДНК-зависимая РНК-полимераза синтезирует РНК возбудителя чумы плотоядных. После этого запускается следующий цикл амплификации РНК CDV.

Результаты реакции амплификации РНК CDV в режиме реального времени с каждого цикла анализируют, оценивая и сравнивая графики накопления флуоресцентного сигнала по значениям циклов количественной оценки реакции амплификации вирусной РНК C_Q-РНК-CDV, определенных с помощью пересечения пороговой линии и логарифмическим отображением функции Fl = f (C_Q-РНК-CDV). Флуориметр определяет уровень свечения и строит кинетическую кривую в координатах: уровень флуоресценции - цикл амплификации РНК. В случае присутствия в исследуемой пробе специфической РНК-матрицы кинетическая кривая имеет экспоненциальную зависимость в виде графика сигмоиды.

Выявляют зависимость между C_Q-РНК-CDV и значением десятичного логарифма титра инфекционной активности возбудителя чумы плотоядных животных в сырье для изготовления культуральных инактивированных вакцин. Оценивают величину эффективности реакции амплификации (Е), а также достоверность аппроксимации (R²). На основе данной модели рассчитывают значение титра инфекционной активности возбудителя чумы плотоядных животных в неинактивированном сырье для вакцин.

Пример 1. Выражение функции зависимости титра инфекционной активности возбудителя чумы плотоядных животных в сырье для изготовления культуральных инактивированных вакцин и цикла количественной оценки реакции амплификации вирусной РНК.

Для определения значения титра инфекционной активности возбудителя чумы плотоядных животных подготавливали серию разведений положительных стандартных образцов возбудителя чумы плотоядных, в качестве которых применяли неинактивированные суспензии возбудителя чумы плотоядных животных с титрами: 0,0; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0 lg ТЦД₅₀/см³.

Выделение нуклеиновой кислоты осуществляли, как представлено выше. Проводили постановку реакции амплификации РНК для исследования контролей, как описано выше. Полученные данные реакции амплификации РНК, анализировали, оценивая и сравнивая графики накопления флуоресцентного сигнала по значениям циклов количественной оценки реакции амплификации вирусной РНК CDV. Установили зависимость между C_Q-РНК-CDV и значением десятичного логарифма титра инфекционной активности возбудителя чумы плотоядных животных в сырье для изготовления культуральных инактивированных вакцин. Полученные результаты отражены на фиг. 2 и выражены в виде логарифмической функции:

lg Т_CDV = -0,3003×C_Q-_РНК-CDV + 9,9009

с высокой достоверностью аппроксимации (R² = 0,9946) и эффективностью амплификации 99,66 %, что соответствует мировым требованиям [13, 14].

Пример 2. Применение способа определения титра инфекционной активности возбудителя чумы плотоядных животных в сырье для изготовления культуральных инактивированных вакцин.

В исследовании использовали 6 суспензий культурального CDV с титрами инфекционной активности 3,25, 3,46, 3,98, 4,15, 4,88, 5,26 lg ТЦД₅₀/см³, соответственно (пробы № 1-6). В качестве положительного контроля применяли суспензию культурального CDV с титром инфекционной активности 4,00 lg ТЦД₅₀/см³. В качестве отрицательных контролей применяли суспензию клеток Vero, не зараженную микроорганизмами. Испытуемые пробы и контрольные образцы исследовали в 5 повторностях. Этап элюирования РНК, и постановку реакции амплификации вирусной РНК проводили, как описано выше.

Средние значения циклов количественной оценки реакции амплификации РНК CDV для проб № 1-6 составляли 15,49±0,01, 14,75±0,01, 13,12±0,01, 12,59±0,01, 9,99±0,01, 8,79±0,02, соответственно. Пользуясь разработанной логарифмической функцией, рассчитали средние значения титра инфекционной активности CDV для проб № 1-6, которые составили 3,25; 3,47; 3,96; 4,12; 4,90; 5,26 lg ТЦД₅₀/см³ соответственно. Для положительного контроля значение порогового цикла амплификации составило 12,99±0,00, что соответствовало титру инфекционной активности CDV, равному 4,00 lg ТЦД₅₀/см³. Для отрицательных контролей экспоненциальные графики не были сформированы, что означало отсутствие CDV в данных образцах. Полученные результаты свидетельствовали о высокой степени точности разработанного способа определения титра инфекционной активности возбудителя чумы плотоядных животных в сырье для изготовления культуральных инактивированных вакцин. Таким образом, разработанный способ позволяет рассчитывать титр инфекционной активности CDV в сырье для культуральных вакцин.

Пример 3. Выявление степени достоверности определения титра инфекционной активности CDV в сырье для вакцин с применением разработанного способа.

Для анализа использовали 525 суспензий культурального CDV с титрами инфекционной активности от 1,00 до 6,00 lg ТЦД₅₀/см³. В качестве положительного контроля применяли суспензию культурального CDV с титром инфекционной активности вируса 4,00 lg ТЦД₅₀/см³. В качестве отрицательных контролей применяли суспензию клеток Vero, не зараженную микроорганизмами. Испытуемые пробы и контрольные образцы исследовали в трех повторностях. Этапы анализа проводили как отражено выше. По результатам исследования для положительного контроля значение порогового цикла амплификации составило 12,99±0,00, что соответствовало титру инфекционной активности CDV, равному 4,00 lg ТЦД₅₀/см³. Для отрицательных контролей экспоненциальные графики не были сформированы, что означало отсутствие CDV в данных образцах.

Выявили, что данные, полученные с помощью разработанного способа, коррелировали со значениями стандартов на 99,74-100,00% для 5,9-4,0 lg ТЦД₅₀/см³ (n=105), на 98,66-99,78% для 3,9-1,5 lg ТЦД₅₀/см³ (n=105), на 97,56-99,02% для 1,4-1,0 lg ТЦД₅₀/см³ (n=105), на 97,00-98,62% для 0,99-0,50 lg ТЦД₅₀/см³ (n=105), на 94,56-97,00% для 0,49-0,00 lg ТЦД₅₀/см³ (n=105), (табл. 4). Полученные результаты свидетельствовали о высокой степени точности разработанного способа определения титра инфекционной активности возбудителя чумы плотоядных животных в сырье для изготовления культуральных инактивированных вакцин с помощью количественной транскрипционной амплификации таргетного участка гена CDVgp7 вирусной РНК. Таким образом, разработанный способ позволяет с высокой степенью достоверности рассчитывать титр инфекционной активности CDV в сырье для изготовления культуральных инактивированных вакцин.

Пример 4. Определение аналитической чувствительности способа определения титра инфекционной активности возбудителя чумы плотоядных животных в сырье для изготовления культуральных инактивированных вакцин.

При определении аналитической чувствительности способа определения титра инфекционной активности возбудителя чумы плотоядных животных в сырье для изготовления культуральных инактивированных вакцин с помощью количественной транскрипционной амплификации таргетного участка гена CDVgp7 вирусной РНК подготавливали серию стандартов CDV разных штаммов с титрами инфекционной активности_, равными 0,00-6,00 lg ТЦД₅₀/см³ с шагом 0,1 lg ТЦД₅₀/см³. Контрольные образцы тестировали в 5 повторностях. Этапы анализа проводили как описано выше.

Выявлено, что с достоверностью 97,00-100,00% разработанным способом определены титры инфекционной активности возбудителя чумы плотоядных животных со значениями от 0,50 до 6,00 lg ТЦД₅₀/см. При исследовании вируссодержащего сырья с титрами от 0,0 до 0,5 lg ТЦД₅₀/см³ обнаружили, что аналитическая чувствительность разработанного способа составляет 0,5 lg ТЦД₅₀/см³ с достоверностью определения аналита равной 97,00% (n = 105, p<0,005).

Пример 5. Исследование специфичности способа определения титра инфекционной активности возбудителя чумы плотоядных животных в сырье для изготовления культуральных инактивированных вакцин.

При анализе специфичности способа определения титра инфекционной активности возбудителя чумы плотоядных животных в сырье для изготовления культуральных инактивированных вакцин, исследовали суспензии CDV, а также вируса бешенства, ящура, инфекционного ринотрахеита кошек, возбудителя парвовирусного энтерита, коронавирусного энтерита собак, аденовируса собак первого серотипа. Количество инфекционных доз вирусов в суспензиях составлял не менее 6,0 lg ТЦД₅₀/см³. Исследования проводили в 5 повторностях.

Этапы анализа проводили как описано выше. Для проб, содержащих другие вирусы, не наблюдалось формирования графиков экспоненты и они не выходили за пороговый уровень флуоресцентного сигнала (0,005 у.е.). Таким образом, разработанный способ является специфичным по отношению к РНК возбудителя чумы плотоядных животных и может быть использован для его количественного определения.

Пример 6. Определение диагностических показателей разработанного способа определения титра инфекционной активности возбудителя чумы плотоядных животных в сырье для изготовления культуральных инактивированных вакцин.

Для определения диагностической чувствительности разработанного способа анализировали 420 культуральных суспензий CDV с разными значениями инфекционной активности вируса (0,5-6,0 lg ТЦД₅₀/см³). Данные пробы являлись заведомо положительными. Проведение анализа осуществляли как отражено выше. С помощью разработанного способа (предлагаемое изобретение) определили, что из 420 исследуемых образцов в 417 пробах концентрация определена верно, в 3 - отличия были существенными (значения титра инфекционной активности составили ниже аналитической чувствительности способа).

Для исследования специфичности метода тестировали 317 отрицательных суспензий клеток линии Vero, не содержащих CDV. В результате исследования с помощью разработанного способа (предлагаемое изобретение) определили, что все 317 проб были отрицательными. Пользуясь представленными выше статистическими методами анализа определили, что в 95%-ном доверительном интервале диагностическая чувствительность (DSe) составила 97,94-99,85%, диагностическая специфичность (DSp) - 98,84-100,00%, прогностичность положительного результата (PPV) - 99,13-100,00%, прогностичность отрицательного результата (NPV) - 98,82-99,69%, k-критерий - 0,992; общая точность (DAc) - 98,82-99,92% (табл. 5).

Основными преимуществами предлагаемого изобретения является возможность сократить время проведения анализа вируссодержащих суспензий для определения титра инфекционной активности возбудителя чумы плотоядных животных до 2 ч; исключить вероятность контаминации; повысить объективность анализа; увеличить специфичность анализа за счет применения РНК-праймеров и молекулярного зонда; увеличить чувствительность анализа за счет амплификации только молекул вирусной РНК; удешевить способ анализа за счет отсутствия использования клеточных культур в качестве тест-систем; повысить достоверность проводимого анализа благодаря установлению зависимости между значениями титра инфекционной активности возбудителя чумы плотоядных животных (Т_CDV) и циклами количественной оценки реакции амплификации РНК (C_Q-РНК-CDV), представленной в виде логарифмической функции:

lg Т_CDV = -0,3003 × C_Q-_РНК-CDV + 9,9009

с высокой достоверностью аппроксимации (R² = 0,9946) и эффективностью амплификации 99,66 %, что соответствует мировым требованиям.

Предложенная модель позволяет количественно рассчитывать титр инфекционной активности возбудителя чумы плотоядных животных в сырье для изготовления культуральных инактивированных вакцин.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Способ определения титра инфекционной активности возбудителя чумы плотоядных животных в сырье для изготовления культуральных инактивированных вакцин»:

1. Elia G, et al. Virological and serological findings in dogs with naturally occurring distemper. J. Virol. Methods. 2015;213:123-130. doi: 10.1016/j.jviromet.2014.12.004.

2. Beineke A, Puff C, Seehusen F, Baumgartner W. Pathogenesis and immunopathology of systemic and nervous canine distemper. Vet. Immunol. Immunopathol. 2009;127:1-18. doi: 10.1016/j.vetimm.2008.09.023.

3. Abd-Eldaim MM, Wilkes RP, Thomas KV, Kennedy MA. Development and validation of a TaqMan real-time reverse transcription-PCR for rapid detection of feline calicivirus. Arch Virol. 2009;154(4):555-60. doi: 10.1007/s00705-009-0337-5. Epub 2009 Mar 1. PMID: 19253013; PMCID: PMC7086925.

4. Rendon-Marin S, da Fontoura Budaszewski R, Canal CW, Ruiz-Saenz J. Tropism and molecular pathogenesis of canine distemper virus. Virol J. 2019 Mar 7;16(1):30. doi: 10.1186/s12985-019-1136-6. PMID: 30845967; PMCID: PMC6407191.

5. Zhao J, Ren Y. Multiple Receptors Involved in Invasion and Neuropathogenicity of Canine Distemper Virus: A Review. Viruses. 2022 Jul 12;14(7):1520. doi: 10.3390/v14071520. PMID: 35891500; PMCID: PMC9317347.

6. Elia G, et al. Virological and serological findings in dogs with naturally occurring distemper. J. Virol. Methods. 2015;213:123-130. doi: 10.1016/j.jviromet.2014.12.004.

7. Beineke A, Puff C, Seehusen F, Baumgartner W. Pathogenesis and immunopathology of systemic and nervous canine distemper. Vet. Immunol. Immunopathol. 2009;127:1-18. doi: 10.1016/j.vetimm.2008.09.023.

8. Rendon-Marin S, Budaszewski RF, Canal CW, Ruiz-Saenz J. Tropism and molecular pathogenesis of canine distemper virus. Virol. J. 2019;16:30. doi: 10.1186/s12985-019-1136-6.

9. Morre S., Sillekens P., Jacobs M.V., et al. RNA amplification by nucleic acid sequence-based amplification with an internal standard enables reliable detection of Chlamydia trachomatis in cervical scrapings and urine samples // J. Clin. Microbiol. - 1996. - Vol. 34. - P. 3108-3114.

10. Шипицина Е.В. Применение метода NUCLEIC ACID SEQUENCE -BASED AMPLIFICATION в реальном времени (NASBA-REAL-TIME) для диагностики урогенитальной хламидийной инфекции // Журнал Акушерства и женских болезней. - Т. LIV выпуск 4/2005. - С. 17-21.

11. Патент РФ № 2 756 557, 10.01.2021 Способ опосредованного определения титра вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины при амплификации вирусной нуклеиновой кислоты и детекции РНК-ампликонов с применением технологии молекулярных биконов» // Заявка 2020136076, Бюл. 28 от 02.11.2020 / Доронин М.И., Михалишин Д.В., Стариков В.А., Борисов А.В., Гуева М.Н.

12. Патент РФ № 2756 472, 10.09.2020 Способ опосредованного определения инфекционного титра вируса бешенства в неинактивированном сырье для антирабических вакцин при транскрипционной амплификации и детекции продуктов реакции с применением beacon-технологии // Заявка 2020129954, Бюл. № 28 от 30.09.2021 / Доронин М.И., Михалишин Д.В., Борисов А.В., Мудрак Н.С.

13. Deiman B., van Aarle P., Sillekens P. Characteristics and applications of nucleic acid sequence based amplification // Mol. Biotech. - 2002. - Vol. 20. - P. 163-179.

14. Sooknanan R., van Gemen B., Malek L. Nucleis acid sequence-based amplification // Molecular methods for virus detection-London: Academic press, 1995. - P. 261-285.

15. Nicolas von Ahsen, Carl T. Wittwer, Ekkehard Schütz. Oligonucleotide melting temperatures under PCR conditions: nearest-neighbor corrections for Mg2+, deoxynucleotide triphosphate, and dimethyl sulfoxide concentrations with comparison to alternative empirical formulas (англ.) // Clinical Chemistry: journal. - 2001. - Vol. 47, no. 11. - P. 1956-1961.

16. SantaLucia J. J. A unified view of polymer, dumbbell, and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics (англ.) // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America : journal. - 1998. - Vol. 95, no. 4. - P. 1460-1465.

17. SantaLucia J. J., Hicks D. The thermodynamics of DNA structural motifs // Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure: journal. - 2004. - Vol. 33. - P. 11-14.

18. The RNA Institute college of arts and science university at Albany. The mfold Web Server. RNA Folding Form. [Электронный ресурс] / URL: http://bioinfo.math.rpi.edu/~mfold/dna/form1.cgi (Дата обращения: 25.12.2023).

Таблица 1

Состав реакционной смеси для определения титра инфекционной активности возбудителя чумы плотоядных животных в сырье для изготовления культуральных инактивированных вакцин (разработанный способ)

Наименование реагента Концентрация компонента на 1 реакцию CDV-F10476 0,30 пМ CDV-P10561 (FAM/RTQ-1) 0,30 пМ CDV-R10624 0,30 пМ Дезоксирибонуклеотиды 2,5 мМ Рибонуклеотиды 2,5 мМ Хлорид магния 12 мМ Буферный раствор (10-кратный) 10 % от объема
реакционной смеси AMV-обратная транскриптаза 3 ед. РНКаза Н E. сoli 3 ед. Т7 ДНК-зависимая РНК-полимераза 3 ед.

Примечание: объем вносимого элюата РНК - 5 мкл,

объем реакционной смеси - 25 мкл.

Таблица 2

Дизайн олигонуклеотидов для определения титра инфекционной активности возбудителя чумы плотоядных животных в сырье для изготовления культуральных инактивированных вакцин (разработанный способ)

Наименование олигонуклеотидов Дизайн олигонуклеотидов (5'…3') CDV-F10476 AAT-TCT-AAT-ACG-ACT-CAC-TAT-AGG-G-CTCCACTGAGTCTCGGAGACT* CDV-P10561 (FAM/RTQ-1) FAM-CAA-AGC-GGTCAATATCTAGAAGATCCTGATTTCA-GCU-UUG-RTQ-1** CDV-R10624 ATTTTAGCGAATAATCTCCCTACCTC

Примечание: * - курсивом обозначена 5'-промоторная часть T7 ДНК-зависимой РНК-полимеразы

** - выделены флуорофор и гаситель свечения, подчеркнута гибридизационная часть в центре.

Таблица 3

Временные и температурные режимы для определения титра инфекционной активности возбудителя чумы плотоядных животных в сырье для изготовления культуральных инактивированных вакцин (разработанный способ)

Этап реакции Подэтап реакции Температура, ^°С Время реакции, мин Количество циклов Стадия плавления РНК (денатурация) - 65 5 1 Амплификация РНК отжиг прямого праймера 41 2 40 элонгация кДНК разрушение гибрида РНК/кДНК отжиг обратного праймера элонгация кДНК активация промотора Т7 ДНК-зависимой-РНК-полимеразы и синтез вирусной РНК отжиг зонда-beacon

Таблица 4

Достоверность способа определения титра инфекционной активности возбудителя чумы плотоядных животных в сырье для изготовления культуральных инактивированных вакцин (разработанный способ)

(n_{каждого измерения}=3, p<0,001)

Значения титра инфекционной активности возбудителя чумы плотоядных животных (стандарты), lg ТЦД₅₀/см³ Достоверность (%) определения титра инфекционной активности CDV в сырье для вакцин с помощью разработанного способа 5,9-4,0 (n = 105) 99,74-100,00 3,9-1,5 (n = 105) 98,66-99,78 1,4-1,0 (n = 105) 97,56-99,02 0,50-0,99 (n = 105) 97,00-98,62 0,00-0,49 (n = 105) 94,56-97,00

Таблица 5

Пределы диагностических возможностей способа определения титра инфекционной активности возбудителя чумы плотоядных животных в сырье для изготовления культуральных инактивированных вакцин

(разработанный способ)

Диагностические показатели Результаты обработки данных
(95%-ный доверительный интервал) DSe (n = 420) 97,94-99,85% DSp (n = 317) 98,84-100,00% PPV (n = 420) 99,13-100,00% NPV (n = 317) 97,16-99,69% k-критерий 0,992 DAc (n = 737) 98,82-99,92%

Примечание: DSe - диагностическая чувствительность,

DSp - диагностическая специфичность,

PPV - прогностичность положительного результата,

NPV - прогностичность отрицательного результата,

k-критерий - индекс Каппа Коэна,

DAc - общая точность.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="CDV NASBA.xml"

softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.1.2"

productionDate="2024-08-06">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-12-29</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>564</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-12-29</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">ФГБУ &quot;Федеральный центр охраны

здоровья животных&quot; (ФГБУ &quot;ВНИИЗЖ&quot;)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin> Federal State-Financed Institution Federal

Centre for Animal Health (FGBI ARRIAH)</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Доронин Максим

Игоревич</InventorName>

<InventorNameLatin>Doronin Maksim Igorevich </InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ опосредованного определения

титра инфекционной активности возбудителя чумы плотоядных животных в

сырье для изготовления культуральных инактивированных вакцин

</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>5</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>6555</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..6555</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q1">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>CDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atggactctgtttcggtgaaccagattttataccctgaggtccatctag

atagcccaattgtgaccaataagctagtggctattttagagtatgcacgaattagacataactatcgact

ccttgacacaacgttagtgcgtaatatcaaagagagaatttcagaagggttatcaaaccagatgatcatt

aactgtatcgaaactgggagtattgttaatcagaccttgttatcttatcccaaacacaatcatgtgatat

atccaaattgcaacaaacttctgtttcatgcacaggatcgagtcatctctctgaggttgagaaatatatt

caaaagaggaaatagcatctatagtaaaataacagacggggtcaaaaaatgcttaaacgatattaatctt

agtattggtttaggaggtgtattggataagactattggggccaaagttgatgaagcaggtataattatgc

aaagctcacagtggttcgaacctttccttctgtggtttacaattaagacagaaatgagatcagtgattaa

atcctctactcacaactgtcgcaaacgaaggcagaatcctgtctttgtaagaggtgaatcatttaatgtg

ttagtgtctcgggatcttgtatgtatcattgacatcaccagtcacaatgtttactacctaacatttgaaa

tggtcctgatgtattgtgatgtgatagaagggagattaatgactgataccgctatggcaattgatcaccg

ttactcaaccttacatgtcagaatcaggtatctttgggatctaattgatggatttttcctggacttagga

aattcgacctatcaactggtagctctgctggagcctctttcattggcttacttgcaattaaaagacatca

ccttctctctcaggggtgcttttttgagtcactgctttgctgaaatccaggagattttacaggacaatgg

cttctatactgaagagacattccaaaccttaacccaggctctagactttgttttcatcacagaggatata

catataacaggagagatcttttccttttttaggagtttcggtcacccaagattagaagcaataacagcag

cagaaaatgtacggaaacacatgaatcaacccaaagttgtctcctatgagaccatgatgaagggacacgc

tattttctgtgggataatcattaacggttatcgggatagacatggagggacctggcctccaatggatctt

cctgtccatgcatctcctatcatcaggaatgctcatgcctcaggagagggaatcacctatagtcaatgta

tagaaaattggaaatcctttgcaggaattcgatttaaatgctttatgcccctcagcctagacagtgatct

gaccatgtatttgaaagataaggctttagcagcccttaaaaaagagtgggattcagtgtacccaaaagaa

ttcctcaggtacaacccacctcgttccactgaatctcggagacttgttaatgtgtttctagaggactctc

agtttgacccttataatatgattatgtacgttatctcaggacaatatctagacgatcctgacttcaacct

atcatacagtcttaaagagaaagagattaaagaggtggggaggttattcgctaaaatgacatacaaaatg

cgagcctgtcaagtcatagcagaaaacttaatatctaatggaattgggaagtacttcaaggacaatggga

tggcaaaggatgaacacgatctcactaaagcattgcacactctggctgtgtccggggttcctaaagacaa

gaaagactcccatcgcggcctcactaaccagtgtaagtctaaaaaaccgacaccttatcgaggagccctt

cactccgtctcttctccaagtagtagatatatggacccaaacccaaatttttgcaccagtagaagagaag

acaatgacatagagatctatgagaccgtaagtgcatttataactacagatctcaaaaagtactgtctgaa

ttggcgatatgagaccattagtatatttgctcagagattaaatgaaatctacggtctcccctcatttttc

caatggttgcacagaagattggaacagtcgatcctatacgtaagtgacccccactgccctccagatctcg

atcgccatgtggacttgaacacagcccctaactctcaaatattcatcaaatacccaatgggaggagtaga

gggatattgtcaaaagttatggactattagcacaataccttatctgtacttggcagcacatgaaagcggt

gtcaggattgcatcacttgttcaaggtgataaccaaaccattgctgtcactaaaagagttccaagcacct

ggtcatatgccttgaagaaggctgaagccagccgagtcaccacagaatattttatagctttaagacagag

attacatgatgtcggacatcatttgaaagcaaatgaaacaataatatcttcccacttttttgtatactca

aaaggaatctattatgatgggatgttaatttcgcaatccttgaaaagtatagctaggtgcgtattttggt

cagaaacaatagtggatgagacccgagccgcctgtagcaacatttcaacaacattggcaaaagccattga

gaaagggtttgaccggtatttagcctatgcgctgaatattttaaaaatcattcaacaagtattaatttca

ttaggattcactatcaattcagctatgacgcgggatgtgatagaaccccttttacaagatcactgtctct

tgaccaagatggcaattcttcctgcacccataggtggtcttaattacctcaatatgagtaggctttttgt

caggaacatcggggatcccgtgacatcttctattgctgacctcaaacgaatgatccgatcaggccttctc

ggagtggagattttacatcaagtcatgacccaatacccaggtgactcttcgtatttagattgggcaagtg

acccttattctgctaatctgccctgtgtccagagcataacccgactccttaaaaatattacggccaggca

tgtccttatcaacagtccaaatcccatgctgaaaggattgttccatgatgaaagtcaggatgaggatgaa

gctttagcagctttcttgatggataggaaaatcattatcccaagagctgcacatgaaattctagacaaca

cgatcactggtgcgagggaggcaattgctggaatgctagataccacaaaggggttgataagagcaagcat

gaaaagaggagggctaacccctagaataataaaccgtttgtcaacttatgattatgagcaatttagggca

ggtatcagactattgtcagggaagggacatgacccactcatcgatcaagactcatgctctgtccagttag

cgagagcattaaggaaccacatgtgggctaagttggcgaagggtcgtcctatttatggtctagaagtccc

ggatatccttgaatcaatgaagggctatatgataagaagacatgagtcttgtttgctttgcgcatcaggc

tctcataactatggttggttttttgtaccggcaaattgccaattagatagtattacagagggaacatctg

cactgagggtaccatacattgggtccacaacagaagaaagaacagacatgaaattagcattcgtcaaatc

tcctagtaggtctctaaaatcagcagtgagaatagcaaccgtgtactcatgggcctatggtgatgatgac

gaatcttggcaagaggcttggactttggcaaaacaaagagcgaacatctcacttgaagaattacggatga

ttaccccaatttctacctctactaatctagctcaccgactcagggacaagagtactcaagtcaaatactc

agggacctctcttatcagagtagcacgttatgcaacaatctcgaatgataatctttcctttgtgatagct

gacaagaaagtggacacgaactttatttatcagcagggtatgctcctggggctggggattctcgagcact

tgtttagactgtcttcaactactggcgacaccaacaccgtactgcatttacatgttgaaacagattgttg

cgtaatacccatgagtgaccatccaagggtcccagggctcagaaaggtcgttataccaagaaatatttgt

acaaatcctttgatctatgacagtaaccctattattgagaaagatgcagtcaggctttataaccagagtc

acaggaagcacattgtagagtttgtcacatggacaacggggcagctttatcatgtactagctaaatctac

tgctatgtctatggttgagatgattacaaagtttgaaaaagaccacctaaatgaagtctccgcgttaatt

ggcgatgacgatatcaatagctttatcactgagtttcttctcgtagagcccaggttatttactgtgtatc

taggtcaatgtgctgcaatcaactggggctttgaaatccattatcaccgaccttctgggaagtatcaaat

gggtgaattgttgttttctttcttgagtagaatgagtaaaggagtcttcaaaattttaaccaatgcattg

agtcatcccaaagtatatagacgattttgggacagtgggatgattgaacctgtacacggaccctctcttg

actcccagaacctacacataactgtatgcaacctgatctataactgttacatgatttacctagaccttct

gttaaatgatgagttagatgatttctcattcattttatgcgaaagtgatgaggatgtcatacccgaaaga

tttgacaacatacaagctaggcacctatgcatcctgtctgacctttattgtaaccctcgtgattgtcccc

agattcgtgggttgacaccaacacagaaatgtgctgtgttatcgaggtacttaaaatcaaaagctctaga

gtcccatgttggtctgacatggaatgacaaacctatcctgatagatcagtattcatgttccttgacatat

ctgagaagaggctcaatcaagcagataagattgagagtggaccccgggttcatcactgatgctgttggat

gcttagaaaagcgacctctgaggaaaagtcctatctctaacgcctcagaattaaaatcagaatttgaccc

accgaaagatgacctggttaaactcctgagtcagctatcaacaaggacacacaacttacctattacagga

ttaggagtccgaaactatgaggttcactcattcagaagaattgggatcaattcaacggcatgttacaagg

cagttgaaatagtctctgttattaagaacgaattcacgtctgaagaacatggattattcctaggagaggg

ttcaggtgcaatgctgacagtatataaagagctattgaggttgtcaagatgttattataacagtggtgtg

tcagcagaggctagaactggacaacgagagatttcaccttacccttctgaggtcagccttgtggaacatc

aattaggactcgataaattggtgactgtgcttttcaatgggagaccagaggtaacttgggttgggagtgt

tgattgttacaagtacatactaagtcagatatctgctagcagtcttggattgattcactcggatatcgag

tcactacctgataaagacataattgaaaaattggaagaactgtctgccatattatcgatgactttgatat

tagggaaggtagggtcagtgttagtaatcaagatcatgcccgctagtggcgactgggttcaaggatttat

tctgtatgcactcccacattttcttcgaagttacataatttacccaagatacagcaattttgtgtcaaca

gaggcctacctcgttttcactggtcttagagcagggagactagtcaatccggaggggattaaacaacaga

ttttgcgagtcggtattcgaacttcacccggattggtagggcacatcctttcatcaaagcagacagcatg

tgtgcaatctttgcatggacctccatttcaagctaaatcttttaatccttacctccagggtttaacgagt

attgagaagattttgatcaattgtgggcttacaattaacggtcttaaagtatgcaaaaacctgcttcacc

atgatatctcgtcaggcgaggaagggctgaaaggatctatcacaatcctttatagggaactcgcacggtt

caaggataaccaccaattttcacatggaatgttccatgcatacccagttttaatcgcaagtcaggaaagg

gagctcgtatccatcattgcaaggaagtattgtggttatattttgctttactcgggagacttatacgaaa

ttaccaggatagttcgagacctgaaagccaaccacataatttttgacttacaccggaatttatttatgaa

taacctatccagatctgaccggtctctcatcctgacgacaatcccaaaaaggaattggctctttcaactt

gagacaaaagagataaaagagtggttcaaactgttggggtatagtgcactgattagaaaccaccac</IN

SDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>2185</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..2185</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q3">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>CDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>MDSVSVNQILYPEVHLDSPIVTNKLVAILEYARIRHNYRLLDTTLVRNI

KERISEGLSNQMIINCIETGSIVNQTLLSYPKHNHVIYPNCNKLLFHAQDRVISLRLRNIFKRGNSIYSK

ITDGVKKCLNDINLSIGLGGVLDKTIGAKVDEAGIIMQSSQWFEPFLLWFTIKTEMRSVIKSSTHNCRKR

RQNPVFVRGESFNVLVSRDLVCIIDITSHNVYYLTFEMVLMYCDVIEGRLMTDTAMAIDHRYSTLHVRIR

YLWDLIDGFFLDLGNSTYQLVALLEPLSLAYLQLKDITFSLRGAFLSHCFAEIQEILQDNGFYTEETFQT

LTQALDFVFITEDIHITGEIFSFFRSFGHPRLEAITAAENVRKHMNQPKVVSYETMMKGHAIFCGIIING

YRDRHGGTWPPMDLPVHASPIIRNAHASGEGITYSQCIENWKSFAGIRFKCFMPLSLDSDLTMYLKDKAL

AALKKEWDSVYPKEFLRYNPPRSTESRRLVNVFLEDSQFDPYNMIMYVISGQYLDDPDFNLSYSLKEKEI

KEVGRLFAKMTYKMRACQVIAENLISNGIGKYFKDNGMAKDEHDLTKALHTLAVSGVPKDKKDSHRGLTN

QCKSKKPTPYRGALHSVSSPSSRYMDPNPNFCTSRREDNDIEIYETVSAFITTDLKKYCLNWRYETISIF

AQRLNEIYGLPSFFQWLHRRLEQSILYVSDPHCPPDLDRHVDLNTAPNSQIFIKYPMGGVEGYCQKLWTI

STIPYLYLAAHESGVRIASLVQGDNQTIAVTKRVPSTWSYALKKAEASRVTTEYFIALRQRLHDVGHHLK

ANETIISSHFFVYSKGIYYDGMLISQSLKSIARCVFWSETIVDETRAACSNISTTLAKAIEKGFDRYLAY

ALNILKIIQQVLISLGFTINSAMTRDVIEPLLQDHCLLTKMAILPAPIGGLNYLNMSRLFVRNIGDPVTS

SIADLKRMIRSGLLGVEILHQVMTQYPGDSSYLDWASDPYSANLPCVQSITRLLKNITARHVLINSPNPM

LKGLFHDESQDEDEALAAFLMDRKIIIPRAAHEILDNTITGAREAIAGMLDTTKGLIRASMKRGGLTPRI

INRLSTYDYEQFRAGIRLLSGKGHDPLIDQDSCSVQLARALRNHMWAKLAKGRPIYGLEVPDILESMKGY

MIRRHESCLLCASGSHNYGWFFVPANCQLDSITEGTSALRVPYIGSTTEERTDMKLAFVKSPSRSLKSAV

RIATVYSWAYGDDDESWQEAWTLAKQRANISLEELRMITPISTSTNLAHRLRDKSTQVKYSGTSLIRVAR

YATISNDNLSFVIADKKVDTNFIYQQGMLLGLGILEHLFRLSSTTGDTNTVLHLHVETDCCVIPMSDHPR

VPGLRKVVIPRNICTNPLIYDSNPIIEKDAVRLYNQSHRKHIVEFVTWTTGQLYHVLAKSTAMSMVEMIT

KFEKDHLNEVSALIGDDDINSFITEFLLVEPRLFTVYLGQCAAINWGFEIHYHRPSGKYQMGELLFSFLS

RMSKGVFKILTNALSHPKVYRRFWDSGMIEPVHGPSLDSQNLHITVCNLIYNCYMIYLDLLLNDELDDFS

FILCESDEDVIPERFDNIQARHLCILSDLYCNPRDCPQIRGLTPTQKCAVLSRYLKSKALESHVGLTWND

KPILIDQYSCSLTYLRRGSIKQIRLRVDPGFITDAVGCLEKRPLRKSPISNASELKSEFDPPKDDLVKLL

SQLSTRTHNLPITGLGVRNYEVHSFRRIGINSTACYKAVEIVSVIKNEFTSEEHGLFLGEGSGAMLTVYK

ELLRLSRCYYNSGVSAEARTGQREISPYPSEVSLVEHQLGLDKLVTVLFNGRPEVTWVGSVDCYKYILSQ

ISASSLGLIHSDIESLPDKDIIEKLEELSAILSMTLILGKVGSVLVIKIMPASGDWVQGFILYALPHFLR

SYIIYPRYSNFVSTEAYLVFTGLRAGRLVNPEGIKQQILRVGIRTSPGLVGHILSSKQTACVQSLHGPPF

QAKSFNPYLQGLTSIEKILINCGLTINGLKVCKNLLHHDISSGEEGLKGSITILYRELARFKDNHQFSHG

MFHAYPVLIASQERELVSIIARKYCGYILLYSGDLYEITRIVRDLKANHIIFDLHRNLFMNNLSRSDRSL

ILTTIPKRNWLFQLETKEIKEWFKLLGYSALIRNHH</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>46</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..46</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>CDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>aattctaatacgactcactatagggctccactgagtctcggagact</I

NSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>40</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..40</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q5">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>CDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>caaagcggtcaatatctagaagatcctgatttcagctttg</INSDSeq

_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="5">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>26</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..26</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>CDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>attttagcgaataatctccctacctc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ определения титра инфекционной активности возбудителя чумы плотоядных животных в сырье для изготовления культуральных инактивированных вакцин, предполагающий применение олигонуклеотидных праймеров и зонда, которые рассчитаны для таргетного участка гена CDVgp7 вирусной РНК размером 174 н.о. Технический результат заключается в разработке высокочувствительного и высокоспецифичного экспресс-способа определения титра инфекционной активности возбудителя чумы плотоядных животных в сырье для изготовления культуральных инактивированных вакцин. 1 з.п. ф-лы, 3 ил., 5 табл., 6 пр.

1. Способ определения титра инфекционной активности возбудителя чумы плотоядных животных в сырье для изготовления культуральных инактивированных вакцин, включающий применение олигонуклеотидных праймеров и зонда, которые рассчитаны для таргетного участка гена CDVgp7 вирусной РНК размером 174 н.о.:

CDV-F10476 с дизайном 5'-AAT-TCT-AAT-ACG-ACT-CAC-TAT-AGG-G- CTCCACTGAGTCTCGGAGACT-3',

зонд CDV-P10561 (FAM/RTQ-1) с дизайном 5'- FAM-CAA-AGC-GGTCAATATCTAGAAGATCCTGATTTCA-GCU-UUG-RTQ-1-3',

CDV-R10624 с дизайном 5'- ATTTTAGCGAATAATCTCCCTACCTC-3',

и использование логарифмической функции, выраженной в виде уравнения:

lg Т_CDV = -0,3003 x C_Q-РНК-CDV + 9,9009

с высокой достоверностью аппроксимации R²=0,9946 и эффективностью амплификации 99,66 %.

2. Способ по п. 1, где сокращается время проведения анализа вируссодержащих суспензий для определения титра инфекционной активности возбудителя чумы плотоядных животных до 2 ч.