Способ опосредованного определения концентрации вирионов возбудителя чумы плотоядных животных в сырье для вакцин с помощью двойного математического дифференциала для точки crossing point сигмоиды при амплификации участка гена CDVgp1 Российский патент 2025 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к области биотехнологии и производству вакцин против чумы плотоядных животных, а именно к способу опосредованного определения концентрации вирионов возбудителя чумы плотоядных животных в сырье для вакцин с помощью двойного математического дифференциала для точки crossing point сигмоиды при амплификации участка гена CDVgp1.

Чума плотоядных - высококонтагиозное вирусное заболевание, поражающее многих диких и домашних плотоядных, приводящее к высокой заболеваемости и смертности у невосприимчивых хозяев [1]. Передача вирусных частиц происходит при контакте или вдыхании загрязненных жидкостей, хотя недавно сообщалось, что блохи являются переносчиками инфекции [2]. Проявление чумы плотоядных варьирует от легких до тяжелых симптомов в зависимости от иммунного статуса хозяина [3].

Возбудитель чумы плотоядных животных относится к порядку Mononegavirales, семейству Paramyxoviridae, подсемейству Orthoparamyxoviridae, роду Morbillivirus, виду Canine Distemper virus (CDV). [4].

CDV представляет собой оболочечный несегментированный одноцепочечный РНК-содержащий вирус длиной около 15690 н.о. с количеством GC (содержание гуанина и цитозина), равным 43%. РНК вируса с отрицательным смыслом, включает в себя семь генов CDVgp1-7, которые кодируют семь следующих белков: N-, Р-, С-, М-, F-, Н- и L-белки (РНК-зависимая РНК-полимераза) [5, 6], соответственно (табл. 1). Схематическое строение CDVgp1-гена отражено на фиг. 1, из которой видно, что он занимает в РНК позиции в диапазоне 108…1679 (1572 н.о.) и кодирует нуклеопротеин (N-белок) размером 523 а.о. Данный ген является высококонсервативным и перспективным для анализа при количественном определении содержания вирусных частиц в суспензии с помощью современных методов молекулярной биологии. Референтные нуклеотидные и аминокислотные последовательности представлены в GenBank под общим регистрационным номером GCF_000854065.1.

Система мер для борьбы с чумой плотоядных и ее профилактики предусматривает иммунизацию домашних животных [7-11]. Для этой цели применяют вакцинные препараты. При изготовлении культуральных вакцин против данного заболевания вируссодержащее сырье до инактивации исследуют на определение концентрации важнейшего иммуногенного компонента вакцины - вирионов CDV (полных собранных вирусных частиц), каждый из которых содержит одну молекулу вирусной РНК.

Как правило, для определения концентрации вирионов CDV применяют анализ на гемагглютинацию (CDV-HA). Данный метод является серологическим, количественным анализом вирусных частиц, основанным на их способности связываться с поверхностным рецептором эритроцитов и приводящий к агглютинации вируса. Тест проводят путем последовательного разбавления вирусной суспензии и титрования постоянным количеством эритроцитов [4] {прототип). Данный метод имеет некоторые недостатки: трудоемкость и продолжительность проводимого анализа (48 ч), высокая степень субъективности при анализе результатов, невозможность одновременного исследования большого количества проб в рамках крупномасштабного производственного процесса, достаточно высокая себестоимость процедуры за счет использования продуктов животного происхождения, недостаточно высокая чувствительность и специфичность анализа.

В связи с этим целесообразно провести поиск альтернативного способа опосредованного определения концентрации вирионов возбудителя чумы плотоядных животных в сырье для вакцин.

В настоящее время развиваются методы молекулярной биологии, в частности, модифицированные варианты полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием формул математического анализа результатов реакции амплификации, в частности, двойного математического дифференциала для точки crossing point сигмоиды при амплификации целевого участка кДНК. Разработанный способ на основе данного метода является более чувствительным и специфичным, объективным и позволяет определять концентрацию вирионов CDV в вируссодержащих суспензиях в течение 2 часов, что в 24 раза быстрее по сравнению с прототипным вариантом, не требует отбора крови от барана для получения эритроцитов, качество которых напрямую зависит от состояния здоровья и самочувствия животного.

Задачей настоящего изобретения является разработка высокочувствительного, высокоспецифичного и быстрого способа опосредованного определения концентрации вирионов возбудителя чумы плотоядных животных в сырье для вакцин с целью устранения вышеуказанных недостатков.

Данная задача решена благодаря разработке способа опосредованного определения концентрации вирионов возбудителя чумы плотоядных животных в сырье для вакцин с помощью двойного математического дифференциала для точки crossing point сигмоиды при амплификации участка гена CDVgp1.

Технический результат изобретения заключается в том, что разработанный способ дает возможность: 1) повысить специфичность анализа проб за счет применения олигонуклеотидных праймеров, рассчитанных на целевой участок гена CDVgp1 кДНК возбудителя чумы плотоядных животных; 2) увеличить чувствительность анализа за счет применения молекулярного зонда, конъюгированного с красителем цианином Су5.5, который представляет собой флуоресцентное соединение с пиком возбуждения при 683 нм и пиком излучения при 703 нм (фиг. 2), и гасителем флуоресценции BHQ3; 3) повысить достоверность проводимого анализа благодаря установлению зависимости между концентрацией вирионов CDV (C_CDV) и crossing point сигмоиды при амплификации участка гена CDVgp1 (C_p-CDVgp1), представленной в виде математической функции (фиг. 3):

с высокой достоверностью аппроксимации (R²=0,9953) и эффективностью амплификации 100,08%. Предложенная модель позволит опосредованно определять концентрацию вирионов возбудителя чумы плотоядных животных в сырье для вакцин.

Сущность изобретения отражена на графических изображениях: Фиг. 1 - Модель строения гена CDVgp1 вируса чумы плотоядных животных, кодирующего N-белок.

Фиг. 2 - Спектр с пиками возбуждения и излучения для флуоресцентного красителя цианин Су5.5.

Фиг. 3 - График зависимости концентрации вирионов CDV (C_CDV) и crossing point сигмоиды при амплификации участка гена CDVgp1 (C_p-CDVgp1) возбудителя чумы плотоядных животных (n=5, р<0,005).

Фиг. 4 - Дизайн олигонуклеотидных праймеров и зонда для опосредованного определения концентрации вирионов возбудителя чумы плотоядных животных в сырье для вакцин с помощью двойного математического дифференциала для точки crossing point сигмоиды при амплификации участка гена CDVgp1. Примечание: представлены прямой праймер, молекулярный зонд, обратный праймер, который дан в двух вариантах, а именно, в комплементарном прямом и в формате reverce-complement - обратно-комплементарном. В качестве модели взята референтная нуклеотидная последовательность из GenBank под регистрационным номером GCF_000854065.1.

Сущность изобретения пояснена в перечне последовательностей, в котором:

SEQ ID NO: 1 представляет последовательность нуклеотидов гена CDVgp1, кодирующего N-белок вируса чумы плотоядных животных;

SEQ ID NO: 2 представляет последовательность аминокислот N-белка вируса чумы плотоядных животных.

SEQ ID NO: 3 представляет последовательность нуклеотидов прямого праймера CDV-Cvirus-F358;

SEQ ID NO: 4 представляет последовательность нуклеотидов обратного праймера CDV-Cvirus-R414;

SEQ ID NO: 5 представляет последовательность нуклеотидов молекулярного зонда CDV-Cvirus-P384-Cy5.5/BHQ3.

Сущность изобретения заключается в подходе по опосредованному определению концентрации вирионов CDV в неинактивированном сырье для вакцин с помощью двойного математического дифференциала для точки crossing point сигмоиды при амплификации участка гена CDVgp1. Заявляемый способ основан на получении элюата РНК, проведении реакции амплификации целевого участка гена CDVgp1 вирусной кДНК и определения точки crossing point сигмоиды при амплификации участка данного гена для расчета по регрессионной формуле концентрации вирионов CDV в сырье для культуральных вакцин против чумы плотоядных животных.

В настоящее время применяется анализ на гемагглютинацию (прототип), ограничения применения которого в производственном процессе отражены выше. Для решения поставленной задачи способ опосредованного определения концентрации вирионов возбудителя чумы плотоядных животных в сырье для вакцин с помощью двойного математического дифференциала для точки crossing point сигмоиды при амплификации участка гена CDVgp1 ранее не применялся и в мировой научной литературе не представлен.

В отличие от прототипа разработанный способ включает этапы сорбционного экстрагирования РНК, реакцию амплификации кДНК с применением олигонуклеотидных праймеров и зондов; определение точки crossing point сигмоиды при амплификации целевого участка гена CDVgp1 для расчета по математической формуле концентрации вирионов CDV в сырье для культуральных вакцин против чумы плотоядных животных.

Применение разработанного способа повышает достоверность анализа по определению концентрации вирионов CDV в пробах сырья для культуральных вакцин. Исходя из этого, актуально применять данный способ для опосредованного определения концентрации вирионов возбудителя чумы плотоядных животных в сырье для вакцин с помощью двойного математического дифференциала для точки crossing point сигмоиды при амплификации участка гена CDVgp1.

Ключевым элементом заявляемого способа является определение значений по оси абсцисс графика точки crossing point сигмоиды при амплификации участка гена CDVgp1 и расчет по математической формуле концентрации вирионов CDV в сырье для культуральных вакцин против данного заболевания.

Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что новизна и изобретательский уровень заявляемого изобретения заключается в применении способа опосредованного определения концентрации вирионов возбудителя чумы плотоядных животных в сырье для вакцин с помощью двойного математического дифференциала для точки crossing point сигмоиды при амплификации участка гена CDVgp1.

Сведений о разработке предлагаемого способа опосредованного определения концентрации вирионов возбудителя чумы плотоядных животных в сырье для вакцин с помощью двойного математического дифференциала для точки crossing point сигмоиды при амплификации участка гена CDVgp1 авторами не обнаружено.

На первом этапе исследования составляют контрольную панель готовых разведений стандарта с содержанием вирусной РНК, эквивалентными следующим концентрациям вирионов CDV (положительные контроли): 0,01; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0 мкг/мл. В рамках производственного технологического процесса наиболее часто получают суспензии с концентрациями вирионов CDV 1-3 мкг/мл.

На следующем этапе анализа осуществляют выделение РНК из культуральных проб твердофазным сорбционным методом с применением набора «РИБО-сорб» («Интерлабсервис», РФ) в соответствии с инструкцией производителя [12].

После получения экстракта РНК возбудителя чумы плотоядных животных проводят обратную транскрипцию и ПЦР в режиме реального времени с использованием олигонуклеотидных праймеров и зонда для исследования контрольных образцов и проб. Обратную транскрипцию проводят с использованием гексамерных праймеров в концентрации 10 пМ и MMLV-ревертазы в количестве 5 е.а. Удержание температуры, равной 42°С для реакции, проводят в течение 20 мин.

Для постановки реакции амплификации готовят реакционную смесь, рецептура приготовления которой представлена в таблице 2. В качестве гомологичных гену CDVgp1 возбудителя чумы плотоядных животных олигонуклеотидов используют:

CDV-Cvirus-F358-праймер

CDV-Cvirus-R414-праймер

CDV-Cvirus-P384-Cy5.5/BHQ3-зонд

в диапазоне 358…438 п.н. (81 п.н.) (фиг. 4) в концентрации 5 пМ на реакцию. Для формирования нуклеотидных цепей продуктов реакции применяют дезоксирибонуклеозидтрифосфаты с концентрацией каждого в реакционной смеси по 2,5 мМ. В реакционную смесь добавляют 2,5 мМ хлорида магния и диметилсульфооксид в количестве 1% от общего объема без элюата кДНК. В качестве катализатора реакции амплификации применяют Taq ДНК-полимеразу (1 е.а.). Термодинамические показатели для разработанных праймеров и зонда представлены в таблице 3, по которым они полностью удовлетворяют общим требованиям мировых стандартов, предъявляемых к олигонуклеотидам [12].

Объем реакционной смеси компонентов для проведения одной реакции составляет 20 мкл. Элюаты к ДНК каждого образца добавляют к смеси по 5 мкл. Общий объем смеси составляет 25 мкл.

Постановку реакции осуществляют при температурных и временных параметрах, сведения о которых представлены в таблице 4. Предварительную денатурацию комплементарной ДНК проводят при температуре 97°С за 3 мин в течение 1 цикла. Реакцию амплификации в режиме реального времени осуществляют в течение 40 циклов, каждый из которых складывается из 3 подэтапов: «денатурации», проводимой при температуре 97°С в течение 10 с, «отжига праймеров и зонда» - при температуре 55°С в течение 20 с и «элонгации и аккумулирования флуоресцентного сигнала», осуществляемого при температуре 72°С за 20 с.

Результаты реакции анализируют, оценивая и сравнивая графики накопления флуоресцентного сигнала с помощью определения точки crossing point сигмоиды при амплификации участка гена CDVgp1, определенных с помощью построения графика второй производной функции Fl=f × (C_p-CDVgp1)- Величина С_р является важной характеристикой реакции, она прямо пропорциональна количеству копий исходной вирусной кДНК и соответственно вирионов CDV в сырье для вакцин.

Используемый в данном случае метод имеет преимущество в связи с тем, что при умножении любой точки сигмоиды в экспоненциальном участке на любые множители положение наибольших значений функции не изменяется. Максимум на графике второй производной при его исследовании на максимумы располагается внутри экспоненциального участка сигмоиды, где эффективность реакции амплификации является константой. Наибольшие значения первого дифференциала находятся, чаще всего, в зоне искажения значений эффективности амплификации, поэтому их не рекомендуется использовать для анализа. Графики третьей и четвертой производной дают менее точные результаты, поскольку их координаты во многом сопряжены с шумовыми значениями [13].

Вычислив значения C_p-CDVgp1 для кривых, отражающих накопление флуоресцентного сигнала образцов с разными концентрациями вирионов возбудителя чумы плотоядных животных, устанавливают зависимость между концентрацией вирионов CDV в неинактивированном сырье для культуральных вакцин и значением точки C_p-CDVgp1 после получения графика второй производной. На основе разработанной модели рассчитывают значение концентрации вирионов CDV в неинактивированном сырье для культуральных вакцин.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Выявление существования зависимости между концентрацией вирионов возбудителя чумы плотоядных животных в неинактивированном сырье для вакцины и значением точки C_p-CDVgp1.

На первом этапе исследования применяли панель готовых разведений стандарта, в качестве которого использовали неинактивированную суспензию культурального возбудителя чумы плотоядных животных с количествами вирусной РНК, эквивалентными следующим концентрациям вирионов CDV (положительные контроли): 0,01; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0 мкг/мл.

Проводили выделение РНК из культуральных суспензий CDV твердофазным сорбционным методом в соответствии с процедурой, представленной выше.

Осуществляли постановку обратной транскрипции и ПЦР в режиме реального времени с использованием олигонуклеотидных праймеров и зонда для исследования контрольных образцов и проб. Для проведения реакции составляли реакционную смесь, рецептура которой представлена выше.

Постановку ПЦР в режиме реального времени осуществляли, как описано выше. Результаты реакции анализировали, оценивая и сравнивая графики накопления флуоресцентного сигнала после определения значений точек C_p-CDVgp1 на графиках второй производной функции сигмоиды реакции амплификации целевого участка CDVgp1-гена.

Полученные данные анализировали с помощью программного обеспечения «Rotor-Gene FRT-Manager», которое позволяет строить графики накопления флуоресцентного сигнала в режиме реального времени на протяжении заданного количества циклов амплификации (С). Применяя систему компьютерной алгебры «Maxima - GPL CAS based on DOE-MACSYMA Code» (версия 5.46.0), проводили построение графиков после вычисления математического дифференциала второй степени для полученных элюатов РНК CDV каждого разведения стандарта с определенными значениями концентрации вирионов CDV и рассчитывали средние значения C_p-CDVgp1 с проекцией на ось абсцисс О-С (n=5). При исследовании отрицательного контроля накопления флуоресцентного сигнала не наблюдалось, что подтверждает отсутствие возбудителя чумы плотоядных животных в данном образце. В представленных исследованиях р-уровень значимости меньше 0,005, что подтверждает достоверность проводимых количественных исследований. Зависимость концентрации вирионов CDV и значений точек C_p-CDVgp1 представлена на фиг. 3 и отражена в виде математической функции:

с высокой достоверностью аппроксимации (R²=0,9953) и эффективностью амплификации 100,08%. Предложенная модель позволит опосредованно определять концентрацию вирионов возбудителя чумы плотоядных животных в сырье для вакцин.

Пример 2. Апробация способа опосредованного определения концентрации вирионов возбудителя чумы плотоядных животных в сырье для вакцины с помощью двойного математического дифференциала для точки crossing point сигмоиды при амплификации участка гена CDVgp1.

В исследовании использовали 6 суспензий культурального CDV со следующими концентрациями вирионов: 0,45; 1,12; 2,25; 3,22; 4,21; 5,02 мкг/мл, соответственно (пробы №1-6). В качестве положительного контроля применяли суспензию культурального CDV с концентрацией вирионов 2,00 мкг/мл. В качестве отрицательных контролей применяли суспензию монослойной культуры клеток почки африканской зеленой мартышки (Vero), не контаминированную микроорганизмами. Испытуемые пробы и контрольные образцы исследовали в пяти повторностях. Этапы выделения РНК, и постановку ПЦР в режиме реального времени проводили, как описано в примере 1.

Средние значения C_p-CDVgp1 для проб №1-6 составляли 32,87±0,01, 30,74±0,01, 27,13±0,02, 23,81±0,01, 20,49±0,01, 17,73±0,01, соответственно. Пользуясь разработанной регрессионной функцией, представленной выше, рассчитали средние значения концентрации вирионов CDV для проб №1-6, которые составили 0,47, 1,11, 2,20, 3,20, 4,20, 5,03 мкг/мл, соответственно. Полученные значения соответствовали референтным данным. Для положительного контроля значение порогового цикла амплификации составило 27,79±0,01, что соответствовало концентрации вирионов CDV, равной 2,00 мкг/мл. Для отрицательных контролей экспоненциальные графики не были сформированы, что означало отсутствие возбудителя CDV в данных образцах. Таким образом, разработанный способ позволяет определять концентрацию вирионов CDV в неинактивированном сырье для культуральных вакцин.

Пример 3. Выявление степени достоверности опосредованного определения концентрации вирионов возбудителя чумы плотоядных животных в сырье для вакцин с помощью двойного математического дифференциала для точки crossing point сигмоиды при амплификации участка гена CDVgp1.

Для анализа использовали 350 суспензий культурального возбудителя чумы плотоядных животных с концентрациями вирионов CDV от 0,01 до 8,00 мкг/мл. В качестве положительных и отрицательных контролей использовали те же образцы, которые представлены в примерах 1 и 2. Испытуемые пробы и контрольные образцы исследовали в трех повторностях. Этапы экстрагирования нуклеиновых кислот и проведение реакции амплификации в режиме реального времени осуществляли, как отражено в примере 1. Результаты анализа представлены в таблице 5.

Интерпретацию результатов проводили, пользуясь разработанной регрессионной функцией, с получением значений C_CDV для каждой из 350 проб. Для положительного контроля значение порогового цикла амплификации составило 27,79±0,01, что соответствовало концентрации вирионов CDV, равной 2,00 мкг/мл. Для отрицательных контролей экспоненциальные графики не были сформированы, что означало отсутствие CDV в данных образцах.

Выявили, что данные, полученные с помощью разработанного способа, коррелировали с анализом на гемагглютинацию (CDV-HA) на 99,42-100,00% для 2,01-8,00 мкг/мл (n=70), на 98,98-100,00% для 1,01-2,00 мкг/мл (n=70), на 98,13-99,50% для 0,51-1,00 (n=70), на 97,32-98,99% для 0,11-0,50 мкг/мл (n=70), на 95,96-98,58% для 0,01-0,10 (n=70). Каждый из 350 образцов исследовали в 10 повторностях. Полученные результаты свидетельствовали о высокой степени точности разработанного способа. Для концентрации 0,01 мкг/мл достоверность проводимого анализа с помощью разработанного способа составляет 95,96%, исходя из этого, аналитическая чувствительность разработанного способа составила не менее 0,10 мкг/мл с достоверностью не менее 98,58% (n=70, р<0,005). Таким образом, разработанный способ опосредованного определения концентрации вирионов возбудителя чумы плотоядных животных в сырье для вакцин с помощью двойного математического дифференциала для точки crossing point сигмоиды при амплификации участка гена CDVgp1 является достоверным.

Пример 4. Исследование специфичности способа опосредованного определения концентрации вирионов возбудителя чумы плотоядных животных в сырье для вакцин с помощью двойного математического дифференциала для точки crossing point сигмоиды при амплификации участка гена CDVgp1.

При оценке специфичности способа (предлагаемое изобретение) исследовали суспензии возбудителей ящура, бешенства, коронавирусной, калицивирозной инфекций и инфекционного ринотрахеита кошек. Количество инфекционных доз вирусов в суспензиях составлял не менее 6,0 lg ТЦД₅₀/см³ или 6,0 lg ККИД₅₀/см³. Исследования проводили в 5 повторностях.

Этапы элюирования нуклеиновых кислот и постановку ПЦР в режиме реального времени проводили, как описано в примере 1. Для проб, содержащих другие вирусы, не наблюдалось формирования графиков экспоненты, и они не выходили за пороговый уровень флуоресцентного сигнала (0,005 у.е.). Таким образом, разработанный способ является специфичным по отношению к возбудителю чумы плотоядных животных и может быть использован для определения концентрации вирионов CDV в неинактивированном сырье для культуральных вакцин.

Основным преимуществом предлагаемого изобретения является возможность опосредованно определить концентрацию вирионов CDV в неинактивированном сырье для культуральных вакцин. Предлагаемое изобретение предполагает сочетание молекулярно-биологического исследования неинактивированной вирусной суспензии возбудителя чумы плотоядных животных с методами математического анализа данных, что повышает точность, специфичность и чувствительность способа. В предлагаемом изобретении зависимость концентрации вирионов CDV и значений точек C_p-CDVgp1 представлена в виде математической функции:

с высокой достоверностью аппроксимации (R²=0,9953) и эффективностью амплификации 100,08%. Предложенная модель позволит опосредованно определять концентрацию вирионов возбудителя чумы плотоядных животных в сырье для вакцин.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Способ опосредованного определения концентрации вирионов возбудителя чумы плотоядных животных в сырье для вакцин с помощью двойного математического дифференциала для точки crossing point сигмоиды при амплификации участка гена CDVgp1»:

1. Rendon-Marin S, da Fontoura Budaszewski R, Canal CW, Ruiz-Saenz J. Tropism and molecular pathogenesis of canine distemper virus. Virol J. 2019 Mar 7; 16(1):30. doi: 10.1186/s12985-019-l 136-6. PMID: 30845967; PMCID: PMC6407191.

2. Zhao J, Ren Y. Multiple Receptors Involved in Invasion and Neuropathogenicity of Canine Distemper Virus: A Review. Viruses. 2022 Jul 12; 14(7):1520. doi: 10.3390/v14071520. PMID: 35891500; PMCID: PMC9317347.

3. Elia G, et al. Virological and serological findings in dogs with naturally occurring distemper. J. Virol. Methods. 2015; 213:123-130. doi: 10.1016/j.j viromet.2014.12.004.

4. Beineke A, Puff C, Seehusen F, Baumgartner W. Pathogenesis and immunopathology of systemic and nervous canine distemper. Vet. Immunol. Immunopathol. 2009; 127:1-18. doi: 10.1016/j.vetimm.2008.09.023.

5. Rendon-Marin S, Budaszewski RF, Canal CW, Ruiz-Saenz J. Tropism and molecular pathogenesis of canine distemper virus. Virol. J. 2019; 16:30. doi: 10.1186/s12985-019-1136-6.

6. Han G-Z, Liu X-P, Li S-S. Cross-species recombination in the haemagglutinin gene of canine distemper virus. Virus Res. 2008;136:198-201. doi: 10.1016/j.virusres.2008.04.022.

7. Lempp C., et al. New aspects of the pathogenesis of canine distemper leukoencephalitis. Viruses. 2014; 6:2571-2601. doi: 10.3390/v6072571.

8. Anis E, Holford AL, Galyon GD, Wilkes RP. Antigenic analysis of genetic variants of canine distemper virus. Vet. Microbiol. 2018; 219:154-160. doi: 10.1016/j.vetmic.2018.03.014.

9. Carina R, et al. Virus isolation and full-length genome sequencing of a representative canine distemper virus wild type strain of the South America 2 clade. J. Virol. Methods. 2020; 279:113857.

10. Freitas LA, Leme RA, Saporiti V, Alfieri AA, Alfieri AF. Molecular analysis of the full-length F gene of Brazilian strains of canine distemper virus shows lineage co-circulation and variability between field and vaccine strains. Virus. Res. 2019; 264:8-15. doi: 10.1016/j.virusres.2019.02.009.

11. Sarute N, et al. Molecular typing of canine distemper virus strains reveals the presence of a new genetic variant in South America. Virus Gene. 2014;48:474-478. doi: 10.1007/s11262-014-1054-z.

12. Sooknanan R., van Gemen В., Malek L. Nucleis acid sequence-based amplification // Molecular methods for virus detection-London: Academic press, 1995. - P. 261-285.

13. Bar T, Kubista M, Tichopad A. Validation of kinetics similarity in qPCR. Nucleic Acids Res. 2012 Feb; 40(4): 1395-406. doi: 10.1093/nar/gkr778. Epub 2011 Oct 19. PMID: 22013160; PMCID: PMC3287174.

Изобретение относится к области биотехнологии и производству вакцин против чумы плотоядных животных, а именно к способу опосредованного определения концентрации вирионов возбудителя чумы плотоядных животных в сырье для вакцин с помощью двойного математического дифференциала для точки crossing point сигмоиды при амплификации участка гена CDVgp1. Основным преимуществом предлагаемого изобретения является возможность опосредованно определить концентрацию вирионов CDV в неинактивированном сырье для культуральных вакцин. Предлагаемое изобретение предполагает сочетание молекулярно-биологического исследования неинактивированной вирусной суспензии возбудителя чумы плотоядных животных с методами математического анализа данных, что повышает точность, специфичность и чувствительность способа. В предлагаемом изобретении зависимость концентрации вирионов CDV и значений точек C_p-NSI представлена в виде математической функции: C_CDV=-0,3012 × C_p-CDVgp1 + 10,37 с высокой достоверностью аппроксимации (R²=0,9953) и эффективностью амплификации 100,08%. Предложенная модель позволит опосредованно определять концентрацию вирионов возбудителя чумы плотоядных животных в сырье для вакцин. 1 з.п. ф-лы, 4 ил., 5 табл., 4 пр.

1. Способ опосредованного определения концентрации вирионов возбудителя чумы плотоядных животных в сырье для вакцин, включающий следующие этапы:

- выделение РНК возбудителя чумы плотоядных животных твердофазным методом;

- проведение реакции амплификации целевого участка гена CDVgp1 вирусной кДНК с использованием олигонуклеотидов, рассчитаных на целевой участок гена CDVgp1 возбудителя чумы плотоядных животных в диапазоне 358-438 п.н. для амплификации фрагмента размером 81 пл.: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5;

- определение точки crossing point сигмоиды при амплификации участка гена CDVgp1 вирусной кДНК возбудителя чумы плотоядных животных - C_p-CDVgp1;

- расчет концентрации вирионов CDV по точке C_p-CDVgp1 с помощью математической функции C_CDV=-0,3012 × C_p-CDVgp1 + 10,37 с достоверностью аппроксимации 0,9953 и эффективностью амплификации 100,08%.

2. Способ по п. 1, где время проведения анализа сокращается до 2,0 ч, аналитическая чувствительность составляет не менее 0,1 мкг/мл.