Способ опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для культуральных вакцин с помощью реакции амплификации целевого участка UL26.5-гена вирусной ДНК Российский патент 2025 года по МПК G01N33/50 C12Q1/6876 

Изобретение относится к области биотехнологии и производству культуральных вакцин, а именно к способу опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для культуральных вакцин с помощью реакции амплификации целевого участка UL26.5-гена вирусной ДНК.

Возбудитель инфекционного ринотрахеита кошек (FHV-1) является важным инфекционным заболеванием семейства кошачьих, впервые выделенным в 1957 году Крэнделлом и Маурером. На долю FHV-1 приходится примерно 50% всех диагностированных вирусных инфекций верхних дыхательных путей у кошек, а также он является важной причиной поражений глаз [1, 2].

После проникновения в эпителий слизистых оболочках верхних дыхательных путей FHV-1 интенсивно размножается, что приводит к повышению температуры тела, депрессии, анорексии, чиханию, конъюнктивиту, кератиту и выделениям из глаз и носа. За острой фазой заболевания следует пожизненная латентность, отличительная черта герпесвирусных инфекций. Во время латентной стадии вирусная ДНК, по-видимому, сохраняется главным образом в сенсорных ганглиях. Различные биологические стрессы или введение кортикостероидов могут индуцировать необходимые биохимические стимулы в латентно инфицированных клетках, которые приводят к возобновлению выработки инфекционного вируса, который может распространяться на периферию и является потенциальным источником передачи вируса. В дополнение к основному заболеванию вирус ИРТ также является причиной хронического риносинусита у кошек [1].

FHV-1 является членом семейства Herpesviridae, подсемейства Alphaherpesvirinae, рода Varicellovirus [2]. Все изоляты FHV-1, относительно схожи и принадлежат к одному серотипу. Геном FHV-1, картированный методами расщепления эндонуклеазой рестрикции, составляет приблизительно 134000 п.н. [3].

Геном представлен двухцепочечной ДНК, которая состоит из двух сегментов уникальных последовательностей, известных как уникальные длинные (UL) и уникальные короткие (US). Альфагерпесвирусы обычно кодируют 65-80 открытых рамок считывания (ORF). Было показано, что FHV-1 содержит 23 белка, ассоциированных с вирионами. Восемь гликопротеинов ранее были идентифицированы и обозначены как gB, gC, gD, gE, gG, gH, gI и gL [1, 4].

Инфекционный ринотрахеит был зарегистрирован у многих представителей семейства кошачьих, таких как европейских дикие кошки, песчаные кошки, леопардовые кошки, гепарды, горные львы, оцелоты и др. [4]. К инфекции восприимчивы как взрослые кошки всех пород, так и котята, но у молодых животных, зараженных FHV-1, нередок летальный исход в результате осложнения пневмонией. В литературе описаны также случаи развития менингоэнцефалита в результате заражения FHV-1 [5]. После острой фазы заболевание часто переходит в латентную форму с пожизненным вирусоносительством. Исследователи из Австралии определили серопревалентность FHV-1 на уровне 11-17% у диких представителей семейства кошачьих и 37% у домашних кошек, однако, по другим оценкам около 90% кошек считаются серопозитивными по отношению к FHV-1, из них 45% выделяют вирус в течение всей жизни [6].

Система мер для борьбы с инфекционным ринотрахеитом кошек и его профилактики предусматривает иммунизацию домашних животных [7]. Для этой цели применяют вакцинные препараты. При их изготовлении не инактивированное вируссодержащее сырье исследуют на определение титра инфекционной активности вируса для оценки его активности в клетках. В 1,0 см³ суспензии вируса определяют количество клеточных культуральных инфекционных доз, вызывающих 50%-ное поражение клеток, что фактически отражает концентрацию полных вирусных частиц, содержащих двуцепочечную ДНК вируса инфекционного ринотрахеита кошек в активном состоянии.

Традиционно для определения титра инфекционной активности данного вируса применяют метод титрования в перевиваемой монослойной культуре клеток почки кошки (CRFK), с помощью которой вычисляют минимальную дозу вируса, способную вызвать лизис 50% клеток (прототип) [7]. Данный метод имеет некоторые недостатки: 1) длительная процедура титрования, связанная с формированием цитопатического действия (ЦПД) в течение 72 ч; 2) субъективность при оценке результатов исследования; 3) высокая стоимость клеточной линии как тест-системы и затраты на ее поддержание; 4) наличие вероятности риска контаминации культуры клеток.

В связи с этим целесообразно провести поиск альтернативного способа определения титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для вакцины.

С конца 80-х гг. XX в. активно применяются методы молекулярной биологии и генетики для филогенетической характеристики микроорганизмов и качественного анализа проб в диагностике. В последние годы стали появляться публикации, в которых представлена возможность применения данной группы методов для количественного анализа. В связи с этим целесообразно провести поиск альтернативного способа опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для вакцин с применением методов молекулярной биологии, в частности, полимеразной цепной реакции в режиме реального времени при амплификации целевых участков вирусных генов.

Предложенный метод является высокочувствительным и специфичным, объективным и позволяет определять титр инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в вируссодержащих суспензиях в течение 2 часов, что в 36 раз быстрее по сравнению с прототипным вариантом [7], не требует использования клеточной линии для количественного анализа, не предполагает контаминации исследуемых образцов.

Задачей настоящего изобретения является разработка высокочувствительного, высокоспецифичного, экспрессного, объективного, не предполагающего применения линии клеток способа опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для культуральных вакцин с помощью реакции амплификации целевого участка UL26.5-гена вирусной ДНК с целью устранения вышеуказанных недостатков.

Данная задача решена благодаря созданию нового способа опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для культуральных вакцин с помощью реакции амплификации целевого участка UL26.5-гена вирусной ДНК.

Разработанный способ дает возможность: 1) сократить время проведения анализа вируссодержащих суспензий для определения титра инфекционной активности вируса до 2,0 ч; 2) исключить вероятность контаминации исследуемого образца; 3) увеличить чувствительность и специфичность анализа за счет применения высокоспецифичных оригинальных праймеров и ДНК-зонда, рассчитанных на консервативный участок UL26.5-гена, который кодирует поверхностный капсид-каркасный белок; 4) повысить достоверность проводимого анализа благодаря установлению зависимости между титром инфекционной активности вируса инфекционного ринотрахеита кошек (T_FHV) и циклом количественной оценки (C_Q-UL26.5), представленной в виде логарифмической функции

lg T_FHV = -0,2996 × C_Q-UL26.5 + 9,4529

с высокой достоверностью аппроксимации (R² = 0,9999) и эффективностью амплификации 99,35%. Предложенная модель позволяет опосредованно определять титр инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для культуральных вакцин с помощью реакции амплификации целевого участка UL26.5-гена вирусной ДНК.

Сущность изобретения отражена на графических изображениях:

Фиг. 1 - Позиции гена UL26.5 в геноме вируса инфекционного ринотрахеита кошек. Примечание: А - общий вид, Б - позиции в соответствии с порядковыми номерами нуклеотидов в ДНК вируса.

Фиг. 2 - Зависимость титра инфекционной активности вируса инфекционного ринотрахеита кошек (T_FHV) и цикла количественной оценки (C_Q-UL26.5) с применением реакции амплификации целевого участка UL26.5-гена вирусной нуклеиновой кислоты (n=7, отмечены точки, отображающие средние значения C_Q-UL26.5).

Сущность изобретения пояснена в перечне последовательностей, в котором:

SEQ ID NO:1 представляет участок последовательности нуклеотидов UL26.5-гена ДНК вируса инфекционного ринотрахеита кошек;

SEQ ID NO:2 представляет участок последовательности аминокислот белка, соответствующего UL26.5-гену вируса инфекционного ринотрахеита кошек.

SEQ ID NO:3 представляет перечень последовательности нуклеотидов праймера FHV- UL26.5-T-F целевого участка UL26.5-гена вирусной ДНК возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек.

SEQ ID NO:4 представляет перечень последовательности нуклеотидов обратного праймера FHV- UL26.5-T-R целевого участка UL26.5-гена вирусной ДНК возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек.

SEQ ID NO:5 представляет перечень последовательности нуклеотидов молекулярного зонда FHV- UL26.5-T-P (Hoechst-Cy5/BHQ-3) меченого флуоресцентным красителем Hoechst-Cy5.

Сущность изобретения заключается в подходе по опосредованному определению титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для вакцин с помощью реакции амплификации целевого участка UL26.5-гена вирусной ДНК (фиг. 1). Заявляемый способ основан на: 1) экстрагировании ДНК возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек с применением набора «ДНК-сорб» (ООО «Интерлабсервис»); 2) амплификации целевого участка UL26.5-гена вирусной ДНК возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек с применение оригинальных специфических прямого и обратного праймеров, а также молекулярного зонда, меченного флуоресцентным красителем Hoechst-Cy5 (λ_max флуоресценции = 705 нм) и тушителем свечения BHQ-3 (λ_max гашения = 620-730 нм); 3) проведении реакции амплификации с детекцией ампликонов с помощью флуоресцентного свечения и отображения накопления сигнала в виде экспоненты; 4) определении титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек с применением логарифмической функции, выраженной в виде уравнения

lg T_FHV = -0,2996 × C_Q-UL26.5 + 9,4529

с высокой достоверностью аппроксимации (R² = 0,9999) и эффективностью амплификации 99,35% (фиг. 2).

В настоящее время метод ПЦР в режиме реального времени применяют для индикации нуклеиновых кислот различных инфекционных агентов, в том числе возбудителя ринотрахеита кошек. Для опосредованного определения титра инфекционной активности вируса ринотрахеита кошек ранее данный метод с применением разработанной системы оригинальных праймеров и молекулярного зонда не использовался. Таким образом, сведений об аналогах предлагаемого способа опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для культуральных вакцин с помощью реакции амплификации целевого участка UL26.5-гена вирусной ДНК авторами не обнаружено.

Разработанный способ опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для культуральных вакцин с помощью реакции амплификации целевого участка UL26.5-гена вирусной ДНК по сравнению с прототипом отличается более высокой чувствительностью и специфичностью, объективностью и экспрессностью выполнения анализа и значительным снижением риска контаминации.

В отличие от прототипа разработанный способ включает этап экстрагирования ДНК возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек; амплификации целевого участка UL26.5-гена вирусной ДНК возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек с применение оригинальных специфических прямого и обратного праймеров, а также молекулярного зонда, меченого флуоресцентным красителем Hoechst-Cy5 и тушителем свечения BHQ-3; проведения реакции амплификации с детекцией ампликонов с помощью флуоресцентного свечения и отображения накопления сигнала в виде экспоненты; подход к методике опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя ринотрахеита кошек с применением модели зависимости порогового цикла амплификации для кривой флуоресценции и титра инфекционной активности вируса в виде логарифмической функции.

Применение предложенного способа позволит сократить время проведения анализа вируссодержащих суспензий для определения титра инфекционной активности возбудителя ринотрахеита кошек до 2,0 ч; исключить вероятность контаминации и использование клеточных линий; повысить специфичность и чувствительность анализа; увеличить достоверность проводимого анализа. Таким образом, актуально применять предложенный способ опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для культуральных вакцин с помощью реакции амплификации целевого участка UL26.5-гена вирусной ДНК.

Ключевым элементом заявляемого способа является определение значений циклов количественной оценки кривых ПЦР и расчет титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек с использованием разработанной логарифмической модели зависимости C_Q и титра инфекционной активности вируса при амплификации целевого участка UL26.5-гена ДНК возбудителя (фиг. 1).

Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что новизна и изобретательский уровень заявляемого изобретения заключается в применении способа на основе количественной реакции амплификации в режиме реального времени, оригинальных специфичных праймеров и молекулярного зонда, рассчитанных на целевой участок UL26.5-гена ДНК возбудителя, и разработанной логарифмической функции зависимости величины цикла количественной оценки и титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита для опосредованного определения титра инфекционной активности данного вируса в неинактивированном сырье для вакцин.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена на графическом материале - графике зависимости титра инфекционной активности вируса инфекционного ринотрахеита кошек (T_FHV) и цикла количественной оценки (C_Q-UL26.5) с применением реакции амплификации целевого участка UL26.5-гена вирусной ДНК (n=7, отмечены точки, отображающие средние значения C_Q-UL26.5) (фиг. 2).

С целью определения титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек подготавливают контрольную панель стандартов данного вируса, в качестве которых используют лиофильно высушенные суспензии с титрами инфекционной активности: 0,0; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0 lg ТЦД₅₀/см³, которые разводят 1/15 М фосфатно-буферным раствором до требуемого объема и титра инфекционной активности. В качестве отрицательных контролей применяют суспензию клеток CRFK, не контаминированную микроорганизмами.

Из всех стандартных положительных образцов и отрицательных контролей, а также тестируемых проб выделяют ДНК с помощью коммерческого набора «ДНК»-сорб (ООО «Интерлабсервис»). Элюируют полученную ДНК в стандартном буфере TE в объеме 50 мкл.

На следующем этапе проводят реакцию амплификации целевого участка UL26.5-гена в режиме реального времени для исследования контрольных образцов и проб. Для постановки реакции готовят реакционную смесь, рецептура которой представлена в таблице 1. Дизайн праймеров и молекулярного зонда отражены в таблице 2. Расчет праймеров и зонда проводили на основании нуклеотидных последовательностей ДНК возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек штаммов, опубликованных в базах данных GenBank [3].

В качестве гомологичных участку UL26.5-гена возбудителя ринотрахеита кошек используют следующие олигонуклеотиды:

FHV- UL26.5-T-F с дизайном 5'-CAACATCAGGCGGCGAATGTTCCT-3',

FHV- UL26.5-T-R с дизайном 5'-CAGAATCCATTGGCTCCATGCGC-3',

FHV- UL26.5-T-P (Hoechst-Cy5/BHQ-3) с дизайном 5'-Hoechst-Cy5- GAGTGGTCTCGAAGCGCAAATTAGC-BHQ-3-3' в концентрации 6 пМ на реакцию. Для элонгации применяют дезоксирибонуклеозидтрифосфаты с их концентрацией в реакционной смеси по 0,25 мМ. В качестве основы используют буферный раствор (5х), содержание которого составляет 20% от общего объема реакционной смеси. Буферный раствор включает в свой состав ионы калия (К⁺) (5×10⁻² M) и диметилсульфооксид (DMSO) (2,0 %). В смесь также добавляют хлорид магния до концентрации 3,0 мМ. В качестве катализатора ПЦР Tag ДНК-зависимую ДНК-полимеразу (1 ед.). Элюаты ДНК возбудителя ринотрахеита кошек каждого образца добавляют к реакционной смеси по 5 мкл. Итоговый объем смеси для проведения одной реакции составляет 25 мкл.

Олигонуклеотиды для ДНК-матрицы подбирали в соответствии с рядом общих правил, которые отражены в работах B. Deiman и R. Sooknanan [8]. Физические, термодинамические константы и расчет температур плавления разработанных олигонуклеотидных ДНК-праймеров и молекулярного зонда представлены в таблице 3. Длины FHV-UL26.5-T-F, FHV- UL26.5-T-P (Hoechst-Cy5/BHQ-3) и FHV-UL26.5-T-R составляют 24, 25 и 23 н.о., что соответствует требованиям. Молекулярный вес олигонуклеотидов прямого, обратного праймеров и зонда равен 7337,8; 7731,1; 7104,7, соответственно. Праймеры и зонд очищены в полиакриламидном геле и с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, соответственно. Нуклеотидная последовательность зонда не комплементарна олигонуклеотидным праймерам. Отсутствуют 4 и более подряд одинаковых нуклеотидов в цепи праймеров и зонда. Флуорофор присоединен к 5'-концу, а гаситель флуоресценции BHQ-3 - к 3'-концу. Данные условия соответствуют требованиям, предъявляемым к олигонуклеотидным праймерам и молекулярному зонду, которые участвуют в ПЦР в режиме реального времени.

При анализе нуклеотидных последовательностей олигонуклеотидов установили, что для праймеров и зонда не характерно образование «шпилек», а также не выявлено 3'-комплементарности и сайтов, отжигающих сами на себя. Расчет вероятности образования «шпилек» и димеров олигонуклеотидов проводили при условии, что минимальное количество пар оснований, необходимых для димеризации, - 5, а для образования «шпилек», - 4.

Проведено определение температур плавления (T_m) для олигонуклеотидных праймеров и зонда. Точное определение температуры плавления играет важную роль в молекулярно-биологических исследованиях, в том числе при подборе ДНК-праймеров и зонда для ПЦР в режиме реального времени ДНК возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек. Для оценки температуры плавления олигонуклеотидов применяли метод, учитывающий концентрацию солей в буферном растворе и метод ближайших соседей [9].

Из таблицы 3 следует, что энтропия, энергия Гиббса и энтальпия для прямого праймера составили 203,7 ккал/моль, 34,2 ккал/моль, 530,4 ккал/(°K×моль), соответственно. Энтропия, энергия Гиббса и энтальпия для обратного праймера составили 189,4 ккал/моль, 32,1 ккал/моль, 431,1 кал/(°K×моль), соответственно. Энтропия, энергия Гиббса и энтальпия для зонда - 207 ккал/моль, 34,6 ккал/моль, 539,4 ккал/(K×моль), соответственно. Данные значения необходимы для расчета температур плавления представленных олигонуклеотидов. При использовании алгоритма ближайших соседей для прямого, обратного праймеров и зонда T_m составили 61, 61 и 60°С, соответственно.

Экспериментально было выявлено, что оптимальная температура отжига рассматриваемых олигонуклеотидов составляет 61°С. Для проведения ПЦР в режиме реального времени было решено проводить гибридизацию праймеров и зонда с участком в целевом гене ДНК вируса инфекционного ринотрахеита кошек при температуре 61°С.

Последовательности разработанных праймеров и молекулярного зонда проверили на наличие нежелательных совпадений с другими последовательностями нуклеиновых кислот с использованием Банка данных последовательности нуклеиновых кислот возбудителя FHV. Последовательности праймеров и зонда также проанализировали на наличие внутренних вторичных структур с помощью программы сворачивания нуклеиновых кислот с помощью программы Mfold. Выявлено, что для разработанных олигонуклеотидов нежелательных совпадений с другими последовательностями нуклеиновых кислот, а также наличия внутренних вторичных структур не обнаружено.

Постановку реакции осуществляли в детектирующем термоциклере любой марки при температурных и временных параметрах, сведения о которых представлены в таблице 4.

Перед проведением ПЦР в режиме реального времени осуществляют предварительный прогрев смеси при температуре 97°С в течение 3 мин для активации фермента Taq ДНК-полимеразы.

ПЦР в режиме реального времени включает в себя 3 подэтапа: денатурацию, отжиг олигонуклеотидов, элонгацию. Денатурацию проводят при температуре 97°С в течение 10 с, отжиг олигонуклеотидов и элонгацию - при температуре 61°С в течение 35 с (табл. 4).

Результаты ПЦР анализируют, оценивая и сравнивая графики накопления флуоресцентного сигнала по значениям пороговых циклов амплификации C_Q-UL26.5, определенных с помощью пересечения пороговой линии и логарифмическим отображением функции Fl = f (C_Q-UL26.5). Учет результатов в реакции происходит на каждом цикле. Флуориметр определяет уровень флуоресценции и строит кинетическую кривую в координатах: уровень флуоресценции - цикл реакции амплификации. В случае присутствия в исследуемой пробе специфической ДНК-матрицы кинетическая кривая имеет экспоненциальную зависимость. Положительными считаются пробы, которым соответствуют сигмоиды, полученные при анализе флуоресценции красителя, входящего в состав молекулярного зонда. Пробы считаются отрицательными, если при их анализе отсутствует экспоненциальная кривая.

Устанавливают зависимость между циклом количественной оценки при амплификации UL26.5-гена и титром инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для вакцины в процессе построения логарифмической функции. Оценивают величину эффективности реакции амплификации (Е) по формуле:

Е=(10^-1/k-1),

где k - угловой коэффициент в зависимости C_Q-UL26.5 = -k × lg T_FHV + b, а также достоверность аппроксимации (R²). На основе разработанной модели рассчитывают значение титра инфекционной активности вируса инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для вакцины.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Выявление зависимости титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для вакцин и цикла количественной оценки по результатам ПЦР в виде логарифмической функции

С целью определения титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек подготовили контрольную панель стандартов данного вируса, в качестве которых использовали лиофильно высушенные суспензии с титрами инфекционной активности: 0,0; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0 lg ТЦД₅₀/см³, которые разводили 1/15 М фосфатно-буферным раствором до требуемого объема и титра инфекционной активности. В качестве отрицательных контролей применяли суспензию клеток CRFK, не контаминированную микроорганизмами.

Из всех стандартных положительных образцов и отрицательных контролей, а также тестируемых проб выделяли ДНК с помощью набора «ДНК-сорб» (ООО «Интерлабсервис»). Элюировали полученную ДНК в стандартный буфер TE в объеме 50 мкл.

Результаты реакции анализировали, оценивая и сравнивая графики накопления флуоресцентного сигнала по значениям циклов количественной оценки реакции амплификации C_Q-UL26.5, определенных с помощью пересечения пороговой линии и логарифмическим отображением функции Fl = f (C_Q-UL26.5). Устанавливали зависимость между циклом количественной оценки и титром инфекционной активности вируса инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для вакцины в процессе построения логарифмической функции. Полученные данные выражены в виде логарифмического уравнения:

lg T_FHV = -0,2996 × C_Q-UL26.5 + 9,4529

с высокой достоверностью аппроксимации (R² = 0,9999) и эффективностью амплификации 99,35% (фиг. 2). Предложенная модель позволяет опосредованного определять титр инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для культуральных вакцин с помощью реакции амплификации целевого участка UL26.5-гена вирусной ДНК.

Пример 2. Применение способа опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для культуральных вакцин с помощью реакции амплификации целевого участка UL26.5-гена вирусной ДНК

В исследовании использовали 6 суспензий культурального вируса инфекционного ринотрахеита кошек с титрами инфекционной активности 6,25; 6,50; 6,75; 7,00; 7,25; 7,50 lg ТЦД₅₀/см³, соответственно (пробы №1-6). В качестве положительного контроля применяли суспензию культурального вируса инфекционного ринотрахеита кошек с титром 7,00 lg ТЦД₅₀/см³. В качестве отрицательных контролей применяли суспензию клеток CRFK, не контаминированную микроорганизмами. Испытуемые пробы и контрольные образцы исследовали в пяти повторностях. Этапы выделения ДНК, и постановку ПЦР в режиме реального времени проводили, как описано в примере 1.

Средние значения пороговых циклов амплификации для проб №1-6 составляли 10,76±0,01, 9,96±0,02, 8,95±0,02, 8,19±0,01, 7,32±0,01, 6,42±0,01, соответственно. Пользуясь разработанной логарифмической функцией

lg T_FHV = -0,2996 × C_Q-UL26.5 + 9,4529

с высокой достоверностью аппроксимации (R² = 0,9999) и эффективностью амплификации 99,35%, рассчитали средние значения титра инфекционной активности вируса инфекционного ринотрахеита кошек для проб №1-6, которые составили 6,23; 6,47; 6,77; 7,00; 7,26; 7,53 lg ТЦД₅₀/см³, соответственно. Для положительного контроля значение порогового цикла амплификации составило 8,19±0,01, что соответствовало титру инфекционной активности вируса инфекционного ринотрахеита кошек, равному 7,00 lg ТЦД₅₀/см³. Для отрицательных контролей экспоненциальные графики не были сформированы, что означало отсутствие возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в данных образцах.

Исследуемые образцы параллельно тестировали классическим методом титрования в монослойной клеточной линии CRFK. Обнаружили, что данные, полученные с помощью разработанного способа, коррелировали с методом титрования в культуре клеток на 99-100% (n=5). Полученные результаты свидетельствовали о высокой степени точности разработанного способа опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для культуральных вакцин с помощью реакции амплификации целевого участка UL26.5-гена вирусной ДНК.

Таким образом, разработанный способ позволяет опосредованно определять титр инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для культуральных вакцин с помощью реакции амплификации целевого участка UL26.5-гена вирусной ДНК.

Пример 3. Выявление степени достоверности определения титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для культуральных вакцин с помощью реакции амплификации целевого участка UL26.5-гена вирусной ДНК

Для анализа использовали 665 суспензий культурального вируса инфекционного ринотрахеита кошек с титром инфекционной активности от 0,00 до 8,00 lg ТЦД₅₀/см³. В качестве положительного контроля применяли суспензию культурального FHV с титром инфекционной активности вируса 7,00 lg ТЦД₅₀/см³. В качестве отрицательных контролей применяли суспензию клеток CRFK, не зараженную микроорганизмами. Испытуемые пробы и контрольные образцы исследовали в трех повторностях. Этапы экстрагирования нуклеиновых кислот и постановку ПЦР в режиме реального времени проводили, как отражено в примере 1. Результаты анализа представлены в таблице 5.

Интерпретацию результатов проводили, пользуясь разработанной логарифмической функцией

lg T_FHV = -0,2996 × C_Q-UL26.5 + 9,4529

с высокой достоверностью аппроксимации (R² = 0,9999) и эффективностью амплификации 99,35% с получением значений T_FHV для каждой из 665 проб. Для положительного контроля значение порогового цикла амплификации составило 8,19±0,01, что соответствовало титру инфекционной активности вируса, равному 7,00 lg ТЦД₅₀/см³. Для отрицательных контролей экспоненциальные графики не были сформированы, что означало отсутствие возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в данных образцах.

Анализируемые пробы и контроли также тестировали классическим методом титрования в монослойной клеточной линии CRFK и в ПЦР в режиме реального времени. Выявили, что данные, полученные с помощью разработанного способа, коррелировали с методом титрования в культуре клеток CRFK на 99,45-100,00% для 8,0-6,0 lg ТЦД₅₀/см³ (n=95), на 98,59-100,00% для 5,9-4,0 lg ТЦД₅₀/см³ (n=95), на 98,12-100,00% для 3,9-2,0 lg ТЦД₅₀/см³ (n=95), на 97,45-99,88% для 2,0-1,5 lg ТЦД₅₀/см³ (n=95), на 96,55-99,45% для 1,4-1,0 lg ТЦД₅₀/см³ (n=95), на 94,87-97,56% для 0,5-0,9 lg ТЦД₅₀/см³ (n=95), на 92,99-95,66% для 0,0-0,4 lg ТЦД₅₀/см³ (n=95). Полученные результаты свидетельствовали о высокой степени точности разработанного способа опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для культуральных вакцин с помощью реакции амплификации целевого участка UL26.5-гена вирусной ДНК.

Таким образом, разработанный способ позволяет с высокой степенью достоверности оценивать титр инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для вакцины методом ПЦР в реальном времени.

Пример 4. Оценка аналитической чувствительности способа опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для культуральных вакцин с помощью реакции амплификации целевого участка UL26.5-гена вирусной ДНК

При определении аналитической чувствительности разработанного способа (предлагаемое изобретение) подготавливали серию стандартов вируса разных штаммов с T_FHV, равными 1,00-8,00 lg ТЦД₅₀/см³ с шагом 0,1 lg ТЦД₅₀/см³. Контрольные образцы тестировали в 5 повторностях. Этапы элюирования нуклеиновой кислоты и постановку ПЦР в режиме реального времени, как описано в примере 1. Выявлено, что аналитическая чувствительность разработанного способа составила не менее 0,5 lg ТЦД₅₀/см³ с достоверностью результатов исследования не менее 95,87%. С титрами инфекционной активности вируса 1,0-8,0 lg ТЦД₅₀/см³ достоверность находилась в диапазоне 96,55-100,00%.

Пример 5. Оценка специфичности способа опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для культуральных вакцин с помощью реакции амплификации целевого участка UL26.5-гена вирусной ДНК

При оценке специфичности способа исследовали суспензии вируса инфекционного ринотрахеита кошек, вируса бешенства, коронавируса кошек, калицивируса кошек и чумы плотоядных животных. Количество инфекционных доз вирусов в суспензиях составлял не менее 6,0 lg ТЦД₅₀/см³. Исследования проводили в 5 повторностях.

Этапы элюирования нуклеиновых кислот и постановку ПЦР в режиме реального времени проводили, как описано в примере 1. Для проб, содержащих другие вирусы, не наблюдалось формирования графиков экспоненты, и они не выходили за пороговый уровень флуоресцентного сигнала (0,005 у.е.) (табл. 6). Таким образом, разработанный способ является специфичным по отношению к возбудителю инфекционного ринотрахеита кошек и может быть использован для определения титра инфекционной активности данного вируса в неинактивированном сырье для вакцин.

Пример 6. Определение диагностических показателей разработанного способа опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для культуральных вакцин с помощью реакции амплификации целевого участка UL26.5-гена вирусной ДНК

Для определения диагностической чувствительности разработанного способа анализировали 350 культуральных суспензий возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек с разными значениями инфекционной активности вируса (1,0-8,0 lg ТЦД₅₀/см³). Данные пробы являлись заведомо положительными. Проведение анализа осуществляли, как отражено выше. С помощью разработанного способа (предлагаемое изобретение) определили, что из 350 исследуемых образцов в 348 пробах концентрация определена верно, в 2-х отличия были существенными (значения титра инфекционной активности составили ниже аналитической чувствительности способа).

Для исследования специфичности метода тестировали 210 отрицательных суспензий клеток линии CRFK, не содержащих возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек. В результате исследования с помощью разработанного способа (предлагаемое изобретение) определили, что все 210 проб были отрицательными. Пользуясь представленными выше статистическими методами анализа определили, что в 95%-ном доверительном интервале диагностическая чувствительность (DSe) составила 97,96-99,93%, диагностическая специфичность (DSp) - 98,26-100,00%, k-критерий - 0,992; общая точность (DAc) - 98,72-99,96%.

Основными преимуществами предлагаемого изобретения является возможность снизить время проведения анализа неинактивированного вируссодержащего сырья для вакцины до 2,0 ч; увеличить специфичность и чувствительность анализа по определению титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек. В предлагаемом изобретении между титром инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек (T_FHV) и циклом количественной оценки (C_Q-UL26.5) установлена зависимость, отраженная в виде логарифмической функции

lg T_FHV = -0,2996 × C_Q-UL26.5 + 9,4529

с высокой достоверностью аппроксимации (R² = 0,9999) и эффективностью амплификации 99,35%. Разработанная математическая модель дает возможность оценивать титр инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье при производстве вакцин.

Предлагаемое изобретение позволяет быстро и с высокой степенью достоверности опосредованного определять титр инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для культуральных вакцин с помощью реакции амплификации целевого участка UL26.5-гена вирусной ДНК.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Способ опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для культуральных вакцин с помощью реакции амплификации целевого участка UL26.5-гена вирусной ДНК»:

1. Slaviero M, Ehlers LP, de Almeida BA, Pereira PR, Panziera W, da Costa FVA, Pavarini SP, Sonne L. Generalized and fatal felid alphaherpesvirus-1 natural infection with liver involvement in a feline leukaemia virus-positive adult cat: a case report. Vet Res Commun. 2022 Dec;46(4):1319-1324. doi: 10.1007/s11259-022-09977-6. Epub 2022 Jul 20. PMID: 35854050.

2. Taxonomy. Felid alphaherpesvirus-1. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy/?term=Felid+alphaherpesvirus-1 (Дата обращения: 14.04.2023).

3. GenBank. [Электронный ресурс] / URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov. (Дата обращения: 02.04.2023).

4. Pennington MR, Voorhees IEH, Callaway HM, Dehghanpir SD, Baines JD, Parrish CR, Van de Walle GR. The HIV Integrase Inhibitor Raltegravir Inhibits Felid Alphaherpesvirus 1 Replication by Targeting both DNA Replication and Late Gene Expression. J Virol. 2018 Sep 26;92(20):e00994-18. doi: 10.1128/JVI.00994-18. PMID: 30045987; PMCID: PMC6158441.

5. Shi L, Huang S, Lu Y, Su Y, Guo L, Guo L, Xie W, Li X, Wang Y, Yang S, Chai H, Wang Y. Cross-species transmission of feline herpesvirus 1 (FHV-1) to chinchillas. Vet Med Sci. 2022 Nov;8(6):2532-2537. doi: 10.1002/vms3.914. Epub 2022 Aug 29. PMID: 36037318; PMCID: PMC9677351.

6. Summers SC, McLeland SM, Hawley JR, Quimby JM, Lappin MR. Effect of repeated administration of a parenteral feline herpesvirus-1, calicivirus, and panleukopenia virus vaccine on select clinicopathologic, immunological, renal histologic, and immunohistochemical parameters in healthy adult cats. Am J Vet Res. 2022 May 21;83(7):ajvr.21.07.0087. doi: 10.2460/ajvr.21.07.0087. PMID: 35930783.

7. Bergmann M, Speck S, Rieger A, Truyen U, Hartmann K. Antibody response to feline herpesvirus-1 vaccination in healthy adult cats. J Feline Med Surg. 2020 Apr;22(4):329-338. doi: 10.1177/1098612X19845702. Epub 2019 May 13. PMID: 31079527.

8. Sooknanan R., van Gemen B., Malek L. Nucleis acid sequence-based amplification // Molecular methods for virus deteCqion-London: Academic press, 1995. - P. 261-285.

9. Эверитт, Брайан С.; Ландау, Сабина; Лиз, Морвен; и Шталь, Дэниел (2011) "Разные методы кластеризации", в кластерном анализе, 5-е издание, John Wiley & Sons, Ltd., Чичестер, Великобритания.

Таблица 1

Состав реакционной смеси для опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для культуральных вакцин с помощью реакции амплификации целевого участка UL26.5-гена вирусной ДНК

Наименование компонента смеси Концентрация компонента FHV-UL26.5-T-F 6 пМ FHV- UL26.5-T-R 6 пМ FHV- UL26.5-T-P (Hoechst-Cy5/BHQ-3) 6 пМ Дезоксирибоаденозинтрифосфат (dATP) по 0,25 мМ каждого Дезоксирибогуанозинтрифосфат (dGTP) Дезоксирибоцитидинтрифосфат (dCQP) Дезоксириботимидинтрифосфат (dTTP) Хлорид магния 3,0 мМ Taq-буферный раствор Colorless Flexi (х 5) 20% от объема реакционной смеси Taq ДНК-зависимая ДНК-полимераза 1 ед.

Примечание: объем вносимого элюата ДНК - 5 мкл,

объем реакционной смеси - 25 мкл.

Таблица 2

Дизайн оригинальных олигонуклеотидов для опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для культуральных вакцин с помощью реакции амплификации целевого участка UL26.5-гена вирусной ДНК

Наименование олигонуклеотидов Дизайн олигонуклеотидов (5'…3') FHV- UL26.5-T-F CAACATCAGGCGGCGAATGTTCCT FHV- UL26.5-T-R CAGAATCCATTGGCTCCATGCGC FHV- UL26.5-T-P (Hoechst-Cy5/BHQ-3) Hoechst-Cy5-GAGTGGTCTCGAAGCGCAAATTAGC -BHQ-3

Таблица 3

Физические, термодинамические параметры и температура плавления олигонуклеотидных праймеров и молекулярного зонда для определения титра инфекционной активности FHV в неинактивированном сырье для вакцины

Параметры олигонуклеотидов Характеристики олигонуклеотидов FHV- UL26.5-T-F FHV- UL26.5-T-P FHV- UL26.5-T-R Длина (L), н.о. 24 25 23 Молекулярный вес (Mw) 7337,8 7731,1 7104,7 Дифференциал энтропии (dH), ккал/моль 203,7 207,0 189,4 Дифференциал энергии Гиббса (dG), ккал/моль 34,2 34,6 32,1 Дифференциал энтальпии (dS), кал/°К×моль 530,4 539,4 439,1 Температура плавления (Tm), °С:
- по алгоритму ближайших соседей 61 61 60

Примечание: термодинамические параметры разработанных олигонуклеотидных праймеров рассчитаны при условии: концентрация NaCl 1 М, температура 25°С, водородный показатель (рН) 7,0.

Таблица 4

Временные и температурные режимы ПЦР для опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для культуральных вакцин с помощью реакции амплификации целевого участка UL26.5-гена вирусной ДНК

Этап реакции Подэтап реакции Температура, ° Время реакции Количество циклов Предварительный прогрев - 97 3 мин 1 ПЦР в режиме реального времени Денатурация 97 10 с 40 Отжиг праймеров и зонда/элонгация* 61 35 с

Примечание: * - на данном подэтапе регистрируют степень флуоресцентного сигнала.

Таблица 5

Достоверность способа опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для культуральных вакцин с помощью реакции амплификации целевого участка UL26.5-гена вирусной ДНК

(n=5)

Значения титра инфекционной активности вируса инфекционного ринотрахеита кошек (стандарты), lg ТЦД₅₀/см³ Достоверность (%) определения Т вируса инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для вакцины разработанным способом 8,0-6,0 99,45-100,00 5,9-4,0 98,59-100,00 3,9-2,0 98,12-100,00 2,0-1,5 97,45-99,88 1,4-1,0 96,55-99,45 0,5-0,9 95,87-97,56 0,0-0,4 92,99-95,86

Примечание: CRFK - монослойная перевиваемая клеточная линия из почки кошки; Т - титр инфекционной активности FHV.

Таблица 6

Специфичность способа для опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для культуральных вакцин с помощью реакции амплификации целевого участка UL26.5-гена вирусной ДНК

(n=5)

Наименование вируса Результаты ПЦР в режиме реального времени Вирус инфекционного ринотрахеита кошек + Вирус бешенства - Коронавирус кошек - Вирус чумы плотоядных животных - Калицивирус кошек -

Примечание: «+» - наличие экспоненциального графика (положительный образец), «-» - отсутствие экспоненциального графика (отрицательный образец).

--->

<?xml version="1.0" encoding="ISO-8859-1"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing SYSTEM "ST26SequenceListing_V1_3.dtd"

PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing 1.3//EN">

<ST26SequenceListing productionDate="2024-07-02"

softwareVersion="2.1.2" softwareName="WIPO Sequence"

fileName="FHV-UL265.xml" dtdVersion="V1_3">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-11-07</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>552</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-11-07</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">ФГБУ "Федеральный центр охраны

здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ")</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin> Federal State-Financed Institution Federal

Centre for Animal Health (FGBI ARRIAH)</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Доронин Максим

Игоревич</InventorName>

<InventorNameLatin>Doronin Maksim Igorevich </InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ опосредованного определения

титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита

кошек в неинактивированном сырье для культуральных вакцин с помощью

реакции амплификации целевого участка UL26.5-гена вирусной

ДНК</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>5</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>924</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..924</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q1">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FHV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atggcatcccaggggaattctaccataagccatccacaacccccaaacactg

gagattatatcttggtcccaacagcacagtataatcaactcgtggttaatcaacatcaggcggcgaatgt

tcctatccaataccccccggcctctacattcccacctaatatatttccctctactgctatctaccatcca

cccctccctccaaaccatttccatccatatggatttactccatcgtcgagtggtctcgaagcgcaaatta

gcgcattgctcggggcattaacatcagaccgtagaatttcccagcgcatggagccaatggattctggata

tacacaggcgctggccacctccccgtcccaagaacgtagatacgctcgcaagaggagacatgattgggat

tcttctggccaacgtgatgaatacgatcatcagtgttattatccgggagaaagcccaccacaacaaacac

agcgtagtgggacaaataatgccattatagcagaactggcaggggttgtgtcctcattacaacaagaaaa

tacacaactgagagcattgcgttcgattggtgtttatcaacaacccagacaggatctacatccgaataat

cagaatcagcaatacccaagcggagcattacaaccctgtgtgggaacgccaccagtctgtgtttcacaac

ctcctacaaatattaacagtcagaatgtccccattacatcaaatattcaaacaaacgatatcacaccgaa

aatagatgtggctattgctggaaccaatcactcccaaaatatcgcagcaacggtggatgccagtaccgtg

acaggtctcggagtacgtgatgatacggatttctttgtatctcagatgatgaacgctcgctgatacatcc

cacccatcggtttattaaaaatattaataata</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>308</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..308</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FHV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>MASQGNSTISHPQPPNTGDYILVPTAQYNQLVVNQHQAANVPIQYPPASTFP

PNIFPSTAIYHPPLPPNHFHPYGFTPSSSGLEAQISALLGALTSDRRISQRMEPMDSGYTQALATSPSQE

RRYARKRRHDWDSSGQRDEYDHQCYYPGESPPQQTQRSGTNNAIIAELAGVVSSLQQENTQLRALRSIGV

YQQPRQDLHPNNQNQQYPSGALQPCVGTPPVCVSQPPTNINSQNVPITSNIQTNDITPKIDVAIAGTNHS

QNIAATVDASTVTGLGVRDDTDFFVSQMMNARDYIPPIGLLKILII</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>24</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FHV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>caacatcaggcggcgaatgttcct</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q5">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FHV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cagaatccattggctccatgcgc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="5">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>25</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..25</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FHV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gagtggtctcgaagcgcaaattagc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для культуральных вакцин с помощью реакции амплификации целевого участка UL26.5-гена вирусной ДНК, предполагающий применение разработанных олигонуклеотидов. Технический результат заключается в разработке высокочувствительного, высокоспецифичного, быстрого, объективного, не предполагающего применения линии клеток способа опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для культуральных вакцин с помощью реакции амплификации целевого участка UL26.5-гена вирусной ДНК. 1 з.п. ф-лы, 2 ил., 6 табл., 6 пр.

1. Способ опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для культуральных вакцин с помощью реакции амплификации целевого участка UL26.5-гена вирусной ДНК, включающий следующие стадии:

- выделение ДНК вируса инфекционного ринотрахеита кошек с помощью набора «ДНК-сорб»;

- проведение количественной реакции амплификации в режиме реального времени c применением оригинальных специфических прямого и обратного праймеров, а также молекулярного зонда, меченного флуоресцентным красителем Hoechst-Cy5 и тушителем свечения BHQ-3:

FHV- UL26.5-T-F с дизайном 5'-CAACATCAGGCGGCGAATGTTCCT-3',

FHV- UL26.5-T-R с дизайном 5'-CAGAATCCATTGGCTCCATGCGC-3',

FHV- UL26.5-T-P Hoechst-Cy5/BHQ-3 с дизайном 5'-Hoechst-Cy5-GAGTGGTCTCGAAGCGCAAATTAGC-BHQ-3-3', которые рассчитаны на участок UL26.5-гена ДНК вируса инфекционного ринотрахеита кошек;

- расчет значений цикла количественной оценки по данным ПЦР в режиме реального времени C_Q-UL26.5;

- определение титра инфекционной активности вируса инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для вакцин на основе логарифмической регрессионной функции: lg Т_FHV = -0,2996 × C_Q-UL26.5 + 9,4529,

с достоверностью аппроксимации 0,9999, и эффективностью амплификации 99,35%.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что время проведения анализа сокращается до 2 ч, аналитическая чувствительность составляет не менее 0,5 lg ТЦД₅₀/см³.