Область техники
Изобретение относится к генной инженерии и может быть использовано в биотехнологии, медицине и сельском хозяйстве для создания препаратов генной терапии. То есть, созданный генотерапевтический ДНК-вектор с целевым геном может быть использован для введения в клетки организма животных и человека, характеризующихся сниженной или недостаточной экспрессией белка, кодируемого данным геном, обеспечивая таким образом достижение терапевтического эффекта.
Уровень техники
Генная терапия - это современный медицинский подход к лечению наследственных и приобретенных заболеваний, заключающийся в исправлении генетического дефекта либо компенсации или подавления функции мутантного гена путем введения нового генетического материала в клетки, ткани, органы пациента. Целью генной терапии, в большинстве случаев, является обеспечение необходимого уровня экспрессии (транскрипции и последующей трансляции) белковых молекул, кодируемых этими генами.
Васкуляризация тканей необходима при восстановлении кровообращения в поврежденных или ишимизированных тканях и органах и может осуществляться путем васкулогенеза и ангиогенеза. Васкулогенез представляет собой образование кровеносных сосудов из мезенхимальных клеток в эмбриогенезе (эмбриональный васкулогенез) или эндотелиальных клеток-предшественников, мигрирующих из красного костного мозга в постнатальном периоде (постнатальный васкулогенез). Ангиогенез - процесс образования новых кровеносных сосудов в уже существующей сосудистой системе, играющий важную роль в развитии и нормальном росте тканей, заживлении ран, репродуктивном цикле у женщин (развитие плаценты и желтого тела, овуляции). Васкуляризация также вовлечена в патогенез различных заболеваний.
Существует связь недостаточных концентраций таких белков как фактор роста эндотелия сосудов А, ангиогенин, ангиопоэтин 1, и фактор, индуцируемый гипоксией, с различными заболеваниями. В свою очередь, недостаточные концентрации этих белков обусловлены недостаточной/отсутствующей экспрессией соответствующих генов - VEGFA, ANG, ANGPT1, HIF1α.
Представители семейства белков факторов роста эндотелия сосудов (VEGF) играют ключевую роль в образовании сосудистой сети. Семейство VEGF включает 5 представителей VEGFA, VEGFB, VEGFC, VEGFD. VEGFA связывается с рецепторами VEGFR-1 и VEGFR-2. VEGF-A стимулирует пролиферацию, миграцию и обеспечивает выживание эндотелиальных клеток. Большинство его эффектов связано с активацией рецепторов VEGFR-2. Инактивация одиночного VEGF аллеля у лабораторных животных ведет к связанной с гапло-недостаточностью гибели эмбрионов из-за аномалий развития кровеносных сосудов примерно на 9-й день беременности. При этом дифференцировка ангиобластов не нарушена, но нарушены образование просветов сосудов и анастомозов, а следовательно и эффективный ангиогенез. Инактивация VEGF во время постнатального развития ведет к нарушению постнатального развития сосудов и жизнеспособности эндотелия, увеличивает смертность, задерживает рост и нарушает развитие печени, сердца и почек (Козырева Е.В., Давидян Л.Ю. https://www.science-education.ru/ru/article/view?id=20811). Применение VEGF на экспериментальных животных моделях ишемии нижних конечностей и ишемического повреждения миокарда показало результаты в виде увеличения плотности сети сосудов микроциркуляторного русла за счет образования коллатералей в тканях, поврежденных гипоксией [48-51].
Белок ангиогенин, кодируемый геном ANG, является одним из ключевых факторов ангиогенеза, мощным медиатором образования новых кровеносных сосудов в нормальных и опухолевых тканях. Принадлежит суперсемейству рибонуклеаз А и, в отличие от других факторов ангиогенеза, обладает РНКазной активностью. Зрелый пептид обладает также противомикробной активностью в отношении некоторых бактерий и грибков, в том числе S. pneumoniae, и C. аlbicans. Эндогенный ангиогенин необходим для пролиферации клеток, индуцируемой другими белками, как например VEGF. Как и в случае с VEGF, экспрессия ангиогенина может индуцироваться состоянием гипоксии. Ангиогенин взаимодействует с актином на поверхности эндотелиальных клеток, и путем эндоцитоза транспортируется в клеточное ядро, что в дальнейшем приводит к стимуляции процессов клеточной миграции, инвазии и пролиферации. Его активность in vivo регулируется взаимодействием с рецептором RNH1. Ангиогенин также способен связывать фоллистатин. Отсутствие ANG аллеля у трансгенных мышей усиливает определенные аспекты старения, а именно уровень эндотелиальной дисфункции, ремоделирования сосудов, и инвазии лейкоцитов в сердечно-сосудистые ткани. У мутантных линий также наблюдали брадикинин-индуцированную вазоконстрикцию [PMID: 12429206], [PMID: 11579147], [PMID: 14732290], [PMID: 10754271], [PMID: 18760274].
Ангиопоэтины ANGPT1 и ANGPT2 опосредуют свое действие через рецепторы эндотелиальных клеток Tie-2. ANGPT1 способствует выживанию эндотелиальных клеток, образованию контактов между ними, взаимодействию с перицитами, что стабилизирует образованные сосуды.
Фактор, индуцируемый гипоксией (HIF1α), аналогично VEGF и ANG, активизируется при снижении напряжения кислорода в крови и играет главную роль в системном ответе организма на гипоксию, синтезируется во многих тканях организма, в том числе в нервной ткани, где его экспрессия максимальна в нейронах. HIF1α индуцирует транскрипцию более 60 генов, включая VEGF и эритропоэтин, участвующих как в ангиогенезе, так и в эритропоэзе, что способствует продвижению и увеличению доставки кислорода в гипоксические области. Белок HIF1α также индуцирует транскрипцию генов, участвующих в пролиферации и выживаемости клеток, в метаболизме глюкозы и железа.
Роль генов, выбранных из группы генов ANG, ANGPT1, VEGFA, HIF1α, не ограничивается участием в процессах васкуляризации. Показана связь низких/недостаточных концентраций соответствующих белков (фактор роста эндотелия сосудов А, ангиогенин, ангиопоэтин 1, и фактор, индуцируемый гипоксией), с различными заболеваниями, которая, в ряде случаев, подтверждена нарушениями экспрессии генов, кодирующих эти белки.
У нокаутных по ANG гену мышей наблюдается увеличение продукции форм активного кислорода по сравнению с диким типом, и повышенная чувствительность к агентам оксидативного стресса, пероксиду водорода, склонность к развитию реперфузионного синдрома, и холодовым повреждениям мозга. А также повышенный уровень окислительного повреждения митохондриальной ДНК, структурные аномалии в миоцитах и митохондриях сердца. Предполагается, что ANG играет важную роль в защите митохондрий сердца от повреждений при реоксигенации in vivo [PMID: 12429206], [PMID: 11579147], [PMID: 14732290], [PMID: 10754271], [PMID: 18760274].
Ингибирование функции гена VEGFA может приводить к бесплодию из-за блокировки функции желтого тела (Козырева Е.В., Давидян Л.Ю. https://www.science-education.ru/ru/article/view?id=20811).
Таким образом, предшествующий уровень техники свидетельствует о том, что мутации в генах ANG, ANGPT1, VEGFA, HIF1α, или недостаточная экспрессия белков, кодируемых этими генами, связаны с развитием спектра заболеваний, включающих в себя, но не ограничивающихся такими патологиями, как нарушение гемопоэза, бесплодие, ишемические поражения миокарда, мозга и мышц нижних конечностей, раковые опухоли, нарушения онтогенеза и нейрогенеза, болезнь Паркинсона, фиброз печени, легочная гипертензия, нейродегенеративные заболевания, в частности боковой амиотрофический склероз (БАС) и другими патологическими состояниями. Этим обусловлено объединение генов ANG, ANGPT1, VEGFA, HIF1α, в рамках данного патента в группу генов. Генетические конструкции, обеспечивающие экспрессию белков, кодируемых генами ANG, ANGPT1, VEGFA, HIF1α, входящими в группу генов, в составе того или иного вектора для генной терапии, могут быть использованы для разработки препаратов для терапии различных заболеваний, включающих в себя, но не ограничивающихся такими патологиями, как нарушение гемопоэза, бесплодие, ишемические поражения миокарда, мозга и мышц нижних конечностей, раковые опухоли, нарушения онтогенеза и нейрогенеза, болезнь Паркинсона, фиброз печени, легочная гипертензия, нейродегенеративные заболевания, в частности боковой амиотрофический склероз (БАС) и другими патологическими состояниями.
Более того, приведенные данные свидетельствуют о том, что недостаточная экспрессия белков, кодируемых генами ANG, ANGPT1, VEGFA, HIF1α, входящими в группу генов, связана не только с патологическими состояниями, но и с предрасположенностью к их развитию. Также приведенные данные свидетельствуют о том, что недостаточная экспрессия белков, кодируемых генами ANG, ANGPT1, VEGFA, HIF1α, может не проявляться в явном виде в форме патологии, которая может быть однозначно описана в рамках существующих стандартов клинической практики (например, с применением кода МКБ), однако при этом вызывать состояния, неблагоприятные для человека и животных и связанные с ухудшением качества жизни.
Таким образом, повышение экспрессии гена, выбранного из группы генов ANG, ANGPT1, VEGFA, HIF1α и введенного в организм генотерапевтическим способом, актуально для коррекции состояний человека и животных, связанных с нарушением экспрессии обозначенных выше генов.
Для целей генной терапии используют генотерапевтические векторы, которые подразделяются на вирусные и невирусные. Среди невирусных систем доставки генетического материала лидирующее место принадлежит плазмидным векторам. Плазмидные векторы лишены недостатков, присущих вирусным векторам: 1) Внутриклеточное существование в эписомальной форме исключает интеграцию плазмидного вектора в геном клетки-мишени; 2) Иммунизация и побочные реакции после введения плазмидного вектора отсутствуют (Li L, Petrovsky N. Molecular mechanisms for enhanced DNA vaccine immunogenicity. Expert Rev Vaccines. 2016;15(3):313-29); 3) Производство плазмидного вектора экономически выгодно.
При этом имеются ограничения для использования плазмидных векторов для генной терапии: 1) наличие генов устойчивости к антибиотикам для наработки в штаммах-носителях, 2) наличие различных регуляторных элементов, представленных последовательностями вирусных геномов, 3) размер терапевтического плазмидного вектора, определяющий эффективность проникновения вектора в клетку-мишень.
При разработке плазмидных векторов для генной терапии должны учитываться следующие моменты: 1) Европейское агентство по лекарственным средствам предписывает необходимым избегать введения маркеров устойчивости к антибиотикам в разрабатываемые плазмидные векторы для генной терапии (Reflection paper on design modifications of gene therapy medicinal products during development / 14 December 2011 EMA/CAT/GTWP/44236/2009 Committee for advanced therapies); 2) Рекомендуется избегать наличия в составе терапевтических плазмидных векторов регуляторных элементов для повышения экспрессии целевых генов (промоторов, энхансеров, посттрансляционных регуляторных элементов), являющихся частями вирусных геномов (Guideline on the quality, non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinal products / 23 March 2015, EMA/CAT/80183/2014, Committee for Advanced Therapies); 3) Плазмидный вектор не должен быть перегружен нефункциональными участками, увеличивающими его размер, а следовательно, снижающими эффективность проникновения в клетку-мишень (Mairhofer J, Grabherr R. Rational vector design for efficient non-viral gene delivery: challenges facing the use of plasmid DNA. Mol Biotechnol. 2008.39(2):97-104).
Известен способ накопления плазмидных векторов в штаммах Escherichia coli без использования антибиотиков (Cranenburgh RM, Hanak JA, Williams SG, Sherratt DJ. Escherichia coli strains that allow antibiotic-free plasmid selection and maintenance by repressor titration. Nucleic Acids Res. 2001. 29(5):E26). Были созданы штаммы Escherichia coli DH1lacdapD и DH1lacP2dapD, в которых ген dapD, кодирующий фермент 2,3,4,5-тетрагидропиридин-2,6-дикарбоксилат-N-сукцинилтрансферазу, участвующий в биосинтезе L-лизина, находится под контролем lac-промотора. В отсутствие индуктора IPTG (изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид) эти штаммы подвержены лизису. Однако при введении мультикопийного вектора pORT, содержащего lac-оператор, индуцируется экспрессия гена dapD и, таким образом, трансформированные клоны могут быть отобраны и размножены. Однако эти штаммы характеризуются низким уровнем трансформации и ее нестабильностью.
Известно решение по патентной заявке RU2011152377A, описывающей получение экспрессионного плазмидного вектора без устойчивости к антибиотику, которая содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую белок-репрессор. Экспрессия указанного белка-репрессора регулирует экспрессию токсичного генного продукта, встроенного в участок генома E.coli. Однако, как и все методы селекции, основанные на использовании белков-репрессоров, данный метод отличается нестабильностью трансформации и ее низкой эффективностью.
В патенте US9644211B2 описано получение минимального по размеру вектора. Данный вектор не содержит бактериальных геномных последовательностей и продуцируется путем parA-опосредованной рекомбинации, проходящей в специально полученном штамме E.coli. Недостатком данного метода получения минимального по размеру вектора является невозможность его использования при масштабировании производства.
Известно получение генотерапевтических векторов, в состав которых включены нуклеотидные последовательности, кодирующие белки васкуляризации тканей человека.
В патенте RU2678756 описан генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 размером 3165 п.н., предназначенный для генетической модификации клеток животных и человека, способ получения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, Штамм Escherichia coli SCS110-AF, способ получения штамма Escherichia coli SCS 110-AF для наработки генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17.
Недостатком данного изобретения является значительный размер векторной части, что может негативно отразиться на эффективности доставки ДНК-вектора в клетки.
В патенте РФ 2491097 описана фармацевтическая композиция для терапии нейродегенеративных заболеваний, в частности бокового амиотрофического склероза (БАС), содержащей в эффективном количестве аденовирусный вектор, выполненный в виде нереплицирующейся наночастицы на основе генома аденовируса человека 5-го серотипа со вставкой гена ангиогенина ANG человека, продуцирующей в организме человека ангиогенин и нереплицирующейся наночастицы на основе генома аденовируса человека 5-го серотипа со вставкой гена фактора роста эндотелия сосудов VEGF человека, продуцирующей в организме человека фактор роста эндотелия сосудов. При этом ген ангиогенина человека и ген фактора роста эндотелия сосудов человека клонированы в две экспрессирующих кассеты одной нереплицирующейся наночастицы на основе генома аденовируса человека 5-го серотипа. Также описан способ терапии БАС, заключающийся во введении человеку терапевтически эффективной дозы указанной фармацевтической композиции.
В патенте РФ 2522778 описано средство для лечения ишемических поражений тканей, представляющему собой смесь с соотношением 1÷0,5-3 из двух культур мезенхимальных стволовых клеток, одна из которых модифицирована генетической конструкцией на основе вирусного вектора, обеспечивающего гиперпродукцию фактора роста эндотелия сосудов VEGF, а другая модифицирована генетической конструкцией на основе вирусного вектора, обеспечивающего гиперпродукцию ангиопоэтина ANGPT1. Описан также способ лечения ишемических поражений тканей, который заключается во введении путем нескольких инъекций (обкалывания) прямо в ишемизированную ткань, например, мышцы конечности или миокард, в культуральной среде, не содержащей сыворотки, смеси культур модифицированных мезенхимальных стволовых (стромальных) клеток, гиперпродуцирующих VEGF и ANGPT1 в концентрациях от 3 до 100 млн клеток в 1 мл раствора.
Генетически модифицированные мезенхимальные стромальные клетки жировой ткани получали с помощью трансформации этих клеток рекомбинантным аденоассоциированным вирусным вектором 2 серотипа - AAV Helper-Free System (Stratagene, США), в который были встроены оптимизированный ген VEGF 165 человека и оптимизированный ген ANGPT1.
Изобретение РФ 2170104 относится к новому способу in vivo представления и прямого переноса ДНК, кодирующей нужный заживляющий белок в репарационных клетках млекопитающих. Данный способ включает имплантирование матрицы, содержащей нужную ДНК в свежую рану. Репарационные клетки, обычно возникающие в жизнеспособной ткани, окружающей рану, пролифелируют и мигрируют в активированную генами матрицу, где они сталкиваются, поглощают и экспрессируют ДНК. Поэтому трансфицированные репарационные клетки действуют как биореакторы in situ (локализованные внутри раны), вырабатывающие агенты (РНК, кодированные ДНК, белки и т.д.), заживляющие рану. Данное изобретение относится к фармацевтическим композициям, которые могут быть использованы при осуществлении изобретения, т.е. при переносе нужной ДНК. Такие композиции включают подходящую матрицу в сочетании с нужной ДНК. Молекулы ДНК могут кодировать различные факторы, способствующие заживлению ран, включая внеклеточные, клеточно-поверхностные и внутриклеточные РНК и белки. В качестве целевого гена могут быть использованы, например, ген фактора роста гепацитов (HGF); ген фактора роста тромбоцитов (PDGF); гены основных факторов роста фибробластов (FGF1, FGF2 и т.д.); ген фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и др.
ДНК, кодирующая нужные продукты трансляции или транскрипции, может быть рекомбинантно встроена в многочисленные векторные системы, обеспечивающие широкомасштабную репликацию ДНК с целью получения активированных генами матриц. Используемые векторы включают, но не ограничиваются ими, векторы, полученные из рекомбинантной бактериофаговой ДНК, плазмидной ДНК или космидной ДНК. Например, могут быть использованы плазмидные векторы, такие как pBR322, pUC 19/18, pUC 118, 119 и серия векторов M13 мр. Бактериофаговые векторы могут включать способы переноса генов in vivo для заживления ран, патент № 2170104gt10, способы переноса генов in vivo для заживления ран, патент № 2170104gt11, способы переноса генов in vivo для заживления ран, патент № 2170104gt18-23, способы переноса генов in vivo для заживления ран, патент № 2170104ZAP/R, а также серию бактериофаговых векторов EMBL. Используемые космидные векторы включают, но не ограничиваются ими, pJB8, pCV 103, pCV 107, pCV 108, pTM, pMCS, pNNL, pHSG274, COS202, COS203, pWE15, pWE16 и серию векторов харомида 9. Альтернативно, могут быть сконструированы рекомбинантные вирусные векторы, включающие, но не ограниченные ими, векторы, полученные из вирусов, таких как вирус герпеса, ретровирусы, вакцинные вирусы, аденовирусы, адено-ассоциируемые вирусы или бычий папилломный вирус. Несмотря на то, что могут быть использованы интегрирующие вирусы, предпочтительными для заживления ран являются неинтегрирующие системы, не передающие генный продукт дочерним клеткам в течение многих поколений. Таким образом, генный продукт экспрессируется во время процесса заживления ран, и по мере того, как ген разбавляется в последующих поколениях, количество экспрессируемого генного продукта снижается.
Наиболее близким аналогом настоящего изобретения в части использования рекомбинантных ДНК-векторов для генной терапии является патент, US9550998 (B2), в котором описан способ получения рекомбинантного вектора для генетической иммунизации. Полученный вектор представляет собой суперскрученный плазмидный ДНК-вектор, который предназначен для экспрессии клонированных генов в клетках животных и человека. Вектор состоит из области начала репликации (origin), регуляторных элементов, включающих промотор и энхансер цитомегаловируса человека, регуляторные элементы из Т-лимфотропного вируса человека. Накопление вектора производят в специальном штамме E.coli без использования антибиотиков за счет антисенс-комплементации гена sacB, введенного в штамм посредством бактериофага. Ограничением использования данного ДНК - вектора для генетической терапии является наличие в его составе регуляторных элементов, представляющих собой последовательности вирусных геномов.
Раскрытие изобретения
Задачей изобретения является конструирование генотерапевтических ДНК-векторов для повышения уровня экспрессии группы генов ANG, ANGPT1, VEGFA, HIF1α, что необходимо для лечения заболеваний, характеризующихся нарушениями васкулогенеза и ангиогенеза, при гипоксии и ишемии различных тканей, в том числе головного и спинного мозга, для стимуляции прорастания и образования новых кровеносных сосудов в поврежденных тканях, в том числе при диабете, онкологических и нейродегенеративных заболеваниях, путем повышения уровня экспрессии целевого гена ANG, или ANGPT1, или VEGFA, или HIF1α, в организме человека и животных,
при этом сочетающих в себе следующие свойства:
Эффективность генотерапевтического ДНК-вектора для повышения уровня экспрессии целевых генов в эукариотических клетках.
Возможность безопасного применения для генетической терапии человека и животных за счет отсутствия в составе генотерапевтического ДНК-вектора регуляторных элементов, представляющих собой нуклеотидные последовательности вирусных геномов.
Возможность безопасного применения для генетической терапии человека и животных за счет отсутствия в составе генотерапевтического ДНК-вектора генов антибиотикорезистентности.
Технологичность получения и возможность наработки генотерапевтического ДНК-вектора в промышленных масштабах.
Пункты II и III предусмотрены в данном техническом решении в соответствии с рекомендациями государственных регуляторов к лекарственным средствам для генной терапии, в частности, Европейского Агентства по лекарственным средствам касательно отказа от введения маркеров антибиотикорезистентности в разрабатываемые плазмидные векторы для генной терапии (Reflection paper on design modifications of gene therapy medicinal products during development / 14 December 2011, EMA/CAT/GTWP/44236/2009 Committee for advanced therapies) и касательно отказа от введения в разрабатываемые плазмидные векторы для генной терапии элементов вирусных геномов (Guideline on the quality, non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinal products / 23 March 2015, EMA/CAT/80183/2014, Committee for Advanced Therapies).
Задачей изобретения также является конструирование штаммов, несущих эти генотерапевтические ДНК-вектора, для наработки и производства в промышленных масштабах генотерапевтических ДНК-векторов.
Технический результат достигается за счет того, что создана группа генотерапевтических ДНК-векторов на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 для лечения заболеваний, характеризующихся нарушениями васкулогенеза и ангиогенеза, при гипоксии и ишемии различных тканей, в том числе головного и спинного мозга, для стимуляции прорастания и образования новых кровеносных сосудов в поврежденных тканях, в том числе при диабете, онкологических и нейродегенеративных заболеваниях, путем повышения уровня экспрессии целевого гена ANG, или ANGPT1, или VEGFA, или HIF1α в организме человека и животных.
Это генотерапевтический ДНК-вектор, который содержит кодирующую часть целевого гена ANG, клонированную в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, с получением генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-ANG, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №1;
генотерапевтический ДНК-вектор, который содержит кодирующую часть целевого гена ANGPT1, клонированную в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, с получением генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- ANGPT1, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №2;
генотерапевтический ДНК-вектор, который содержит кодирующую часть целевого гена VEGFA, клонированную в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, с получением генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-VEGFA, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №3;
генотерапевтический ДНК-вектор, который содержит кодирующую часть целевого гена HIF1α, клонированную в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, с получением генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-HIF1α, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №. 4.
Каждый генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 из группы, несущий целевой ген ANG, ANGPT1, VEGFA, HIF1α, а именно, генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12- ANG, или GDTT1.8NAS12- ANGPT1, или GDTT1.8NAS12-VEGFA, или GDTT1.8NAS12-HIF1α за счет ограниченного размера векторной части GDTT1.8NAS12, не превышающей 2600 п.н., обладает способностью эффективно проникать в клетки человека и животных и экспрессировать клонированный в него целевой ген ANG, или ANGPT1, или VEGFA, или HIF1α.
Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущий целевой ген ANG, или ANGPT1, или VEGFA, HIF1α в составе каждого из группы созданных генотерапевтических ДНК-векторов: GDTT1.8NAS12- ANG, или GDTT1.8NAS12- ANGPT1, или GDTT1.8NAS12-VEGFA, или GDTT1.8NAS12- HIF1α, имеет в качестве структурных элементов нуклеотидные последовательности, которые не являются генами антибиотикорезистентности, вирусными генами и регуляторными элементами вирусных геномов, обеспечивая таким образом возможность его безопасного применения для генетической терапии человека и животных.
Создан также способ получения генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген из группы генов ANG, или ANGPT1, или VEGFA, или HIF1α, который заключается в том, что каждый из генотерапевтических ДНК-векторов: GDTT1.8NAS12- ANG, или GDTT1.8NAS12- ANGPT1, или GDTT1.8NAS12- VEGFA, или GDTT1.8NAS12-HIF1α получают следующим образом: кодирующую часть целевого гена ANG, или ANGPT1, или VEGFA, или HIF1α клонируют в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 и получают генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12- ANG, SEQ ID №1, или GDTT1.8NAS12- ANGPT1, SEQ ID №2 или GDTT1.8NAS12- VEGFA, SEQ ID №3, или GDTT1.8NAS12- HIF1α, SEQ ID №4, соответственно, при этом кодирующую часть целевого гена ANG, или ANGPT1, или VEGFA, или HIF1α получают путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации с использованием созданных олигонуклеотидов и расщеплением продукта амплификации соответствующими эндонуклеазами рестрикции, причем клонирование в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 проводят по сайтам рестрикции SalI и KpnI, или BamHI и HindIII, или BamHI и KpnI, причем селекцию проводят без антибиотиков,
при этом при получении генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-ANG, SEQID №1 для проведения реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации, в качестве созданных для этого олигонуклеотидов используют олигонуклеотиды
AN_F TTTGTCGACCACCATGGTGATGGGCCTGGGCGTT
AN_R AATGGTACCTTACGGACGACGGAAAATTGACTG,
а расщепление продукта амплификации и клонирование кодирующей части гена ANG в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 проводят с использованием эндонуклеаз рестрикции SalI и KpnI,
причем при получении генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-ANGPT1, SEQID №2 для проведения реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации, в качестве созданных для этого олигонуклеотидов используют олигонуклеотиды
ANPT_F TTTGTCGACCACCATGACAGTTTTCCTTTCCTTTGCTTTCC
ANPT_R AATGGTACCTCAAAAATCTAAAGGTCGAATCATCATAGTTG,
а расщепление продукта амплификации и клонирование кодирующей части гена ANGPT1 в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 проводят с использованием эндонуклеаз рестрикции SalI и KpnI,
причем при получении генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-VEGFA, SEQID №3 для проведения реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации, в качестве созданных для этого олигонуклеотидов используют олигонуклеотиды
VEG_F GGGGGATCCACCATGACGGACAGACAGACAGACACCGC
VEG_R TTTAAGCTTTCACCGCCTCGGCTTGTCACATCTG,
а расщепление продукта амплификации и клонирование кодирующей части гена VEGFA в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 проводят с использованием эндонуклеаз рестрикции BamHI и HindIII,
причем при получении генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-HIF1α, SEQID №4 для проведения реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации, в качестве созданных для этого олигонуклеотидов используют олигонуклеотиды
HIF_F AGGATCCACCATGGAGGGCGCCGGCGGCGCGA
HIF_R AATGGTACCTCAGTTAACTTGATCCAAAGCTCTGAGTAATTC,
а расщепление продукта амплификации и клонирование кодирующей части гена HIF1α в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 проводят с использованием эндонуклеаз рестрикции BamHI и KpnI.
Способ применения созданного генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген из группы генов ANG, или ANGPT1, или VEGFA, или HIF1α для лечения заболеваний, характеризующихся нарушениями васкулогенеза и ангиогенеза, при гипоксии и ишемии различных тканей, в том числе головного и спинного мозга, для стимуляции прорастания и образования новых кровеносных сосудов в поврежденных тканях, в том числе при диабете, онкологических и нейродегенеративных заболеваниях, путем повышения уровня экспрессии целевого гена ANG, или ANGPT1, или VEGFA, или HIF1α в организме человека и животных, заключается в трансфекции выбранным из группы генотерапевтическим ДНК-вектором, несущим целевой ген на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, или несколькими выбранными из группы генотерапевтическими ДНК-векторами, несущими целевые гены на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, клеток органов и тканей пациента или животного, и/или во введении в органы и ткани пациента или животного аутологичных клеток этого пациента или животного, трансфицированных выбранным из группы генотерапевтическим ДНК-вектором, несущим целевой ген на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 или несколькими выбранными из группы генотерапевтическими ДНК-векторами, несущими целевые гены на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, и/или во введении в органы и ткани пациента или животного выбранного генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевой ген на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 или нескольких выбранных генотерапевтических ДНК-векторов, несущих целевые гены на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, из групы созданных генотерапевтических ДНК-векторов или в сочетании обозначенных способов.
Способ получения штамма для производства генотерапевтического ДНК-вектора для лечения заболеваний, характеризующихся нарушениями васкулогенеза и ангиогенеза, при гипоксии и ишемии различных тканей, в том числе головного и спинного мозга, для стимуляции прорастания и образования новых кровеносных сосудов в поврежденных тканях, в том числе при диабете, онкологических и нейродегенеративных заболеваниях, путем повышения уровня экспрессии целевого гена из группы генов ANG, или ANGPT1, или, VEGFA, ли HIF1α в организме человека и животных, заключается в получении электрокомпетентных клеток штамма EscherichiacoliJM110-NAS с последующим проведением электропорации этих клеток генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-ANG, или ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-ANGPT1, или ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- VEGFA, или ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-HIF1α, после чего клетки высеивают на чашки Петри с агаризованной селективной средой, содержащей дрожжевой экстракт, пептон, 6% сахарозы, а также 10 мкг/мл хлорамфеникола с получением в результате штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-ANG или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-ANGPT1, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-VEGFA, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-HIF1α.
Заявлены штаммы:
EscherichiacoliJM110-NAS/GDTT1.8NAS12-ANG,
EscherichiacoliJM110-NAS/GDTT1.8NAS12-ANGPT1, EscherichiacoliJM110-NAS/GDTT1.8NAS12-VEGFA, EscherichiacoliJM110-NAS/GDTT1.8NAS12-HIF1α, полученные вышеуказанным способом, несущие генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-ANG, GDTT1.8NAS12- ANGPT1, GDTT1.8NAS12- VEGFA, GDTT1.8NAS12-HIF1α, соответственно, для их наработки.
Способ производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой из группы генов ANG, или ANGPT1, или VEGFA, или HIF1α, для лечения заболеваний, характеризующихся нарушениями васкулогенеза и ангиогенеза, при гипоксии и ишемии различных тканей, в том числе головного и спинного мозга, для стимуляции прорастания и образования новых кровеносных сосудов в поврежденных тканях, в том числе при диабете, онкологических и нейродегенеративных заболеваниях, путем повышения уровня экспрессии целевого гена ANG, или ANGPT1, или VEGFA, или HIF1α в организме человека и животных, заключается в том, что генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-ANG, или генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-ANGPT1, или генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-VEGFA, или генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12- HIF1α, получают путем того, что засевают в колбу с приготовленной средой затравочную культуру, выбранную из штамма EscherichiacoliJM110-NAS/GDTT1.8NAS12-ANG, или штамма EscherichiacoliJM110-NAS/GDTT1.8NAS12-ANGPT1, или штамма EscherichiacoliJM110-NAS/GDTT1.8NAS12-VEGFA, или штамма EscherichiacoliJM110-NAS/GDTT1.8NAS12-HIF1α, затем инкубируют затравочную среду в шейкере-инкубаторе и переносят ее в промышленный ферментер, после чего растят до достижения стационарной фазы, затем выделяют фракцию, содержащую целевой ДНК-продукт, многостадийно фильтруют и очищают хроматографическими методами.
Изобретение поясняется чертежами, где:
На фиг.1
приведена схема генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген, выбранный из группы генов ANG, или ANGPT1, или VEGFA, или HIF1α, который представляет собой кольцевую двуцепочечную молекулу ДНК, способную к автономной репликации в клетках бактерии Escherichia coli.
На фиг.1 приведены схемы, соответствующие:
A - генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-ANG,
B - генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-ANGPT1,
C - генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-VEGFA,
D - генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12- HIF1α.
На схемах отмечены следующие структурные элементы вектора:
EF1a pr - промоторная область гена человеческого фактора элонгации EF1A с собственным энхансером, содержащимся в первом интроне гена. Служит для обеспечения высокого уровня транскрипции рекомбинантного гена в большинстве тканей человека;
рамка считывания целевого гена, соответствующая кодирующей части гена ANG (фиг. 1A), или ANGPT1 (фиг. 1B), или VEGFA (фиг. 1C), или HIF1α (фиг. 1D) соответственно;
hGH TA - терминатор транскрипции;
pUCori - ориджин репликации, служащий для автономной репликации с однонуклеотидной заменой для повышения копийности плазмиды в клетках большинства штаммов Escherichia coli;
Отмечены уникальные сайты рестрикции.
На фиг.2
Представлены графики накопления мРНК целевого гена, а именно, гена ANG человека, в первичной культуре клеток скелетной мускулатуры человека (HSkMC) до их трансфекции и через 48 часов после трансфекции этих клеток ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- ANG, с целью подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- ANG, несущего целевой ген ANG, где,
21 - кДНК гена ANG до трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- ANG;
22 - кДНК гена ANG после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- ANG;
23 - кДНК гена B2M до трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- ANG;
24 - кДНК гена B2M после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- ANG.
В качестве референтного гена использовали ген B2M (Бета-2-микроглобулин) приведенного в базе данных GenBank под номером NM 004048.2.
На фиг.3
Представлены графики накопления мРНК целевого гена, а именно гена ANGPT1 человека, в клетках культуры фибробластов кожи человека (CCD-1079Sk) до их трансфекции и через 48 часов после трансфекции этих клеток ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- ANGPT1, с целью подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- ANGPT1, несущего целевой ген ANGPT1, где,
31 - кДНК гена ANGPT1 до трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- ANGPT1;
32 - кДНК гена ANGPT1 после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- ANGPT1;
33 - кДНК гена B2M до трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- ANGPT1;
34 - кДНК гена B2M после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- ANGPT1.
В качестве референтного гена использовали ген B2M (Бета-2-микроглобулин) приведенного в базе данных GenBank под номером NM 004048.2.
На фиг.4
Представлены графики накопления мРНК целевого гена, а именно гена VEGFA человека в клетках эпителия толстой кишки человека (FHC) до их трансфекции и через 48 часов после трансфекции этих клеток ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- VEGFA с целью подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- VEGFA, несущего целевой ген VEGFA, где,
41 - кДНК гена VEGFA до трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- VEGFA;
42 - кДНК гена VEGFA после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- VEGFA;
43 - кДНК гена B2M до трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- VEGFA;
44 - кДНК гена B2M после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- VEGFA.
В качестве референтного гена использовали ген B2M (Бета-2-микроглобулин) приведенного в базе данных GenBank под номером NM 004048.2.
На фиг.5
Представлены графики накопления мРНК целевого гена, а именно гена HIF1α человека, в культуре фибробластов молочной железы человека (Hs578 Bst) до их трансфекции и через 48 часов после трансфекции этих клеток ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- HIF1α с целью подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- HIF1α, несущего целевой ген HIF1α, где,
51 - кДНК гена HIF1α до трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- HIF1α;
52 - кДНК гена HIF1α после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- HIF1α;
53 - кДНК гена B2M до трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- HIF1α;
54 - кДНК гена B2M в клетках после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- HIF1α.
В качестве референтного гена использовали ген B2M (Бета-2-микроглобулин) приведенного в базе данных GenBank под номером NM 004048.2.
На фиг. 6
Представлена диаграмма концентрации белка ангиогенина в культуральной среде первичной культуры клеток скелетной мускулатуры человека (HSkMC) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-ANG, с целью оценки изменения количества белка ангиогенина в культуральной среде первичной культуры клеток скелетной мускулатуры человека (HSkMC), при трансфекции этих клеток ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-ANG, несущим ген ANG, где,
культура А 6- первичная культура клеток скелетной мускулатуры человека (HSkMC), трансфицированных водным раствором без плазмидной ДНК (контроль);
культура B 6- первичная культура клеток скелетной мускулатуры человека (HSkMC), трансфицированных ДНК-вектором GDTT1.8NAS12;
культура C 6- первичная культура клеток скелетной мускулатуры человека (HSkMC), трансфицированных ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-ANG, несущим ген ANG.
На фиг. 7
Представлена диаграмма концентрации белка ангиопоэтина 1 в культуральной среде фибробластов кожи человека (CCD-1079Sk) человека после трансфекции этих клеток ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- ANGPT1, с целью оценки изменения количества белка ангиопоэтина 1 в культуральной среде фибробластов кожи человека (CCD-1079Sk), при трансфекции этих клеток ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- ANGPT1, несущим ген ANGPT1, где,
культура А 7- культура фибробластов кожи человека (CCD-1079Sk), трансфицированных водным раствором без плазмидной ДНК (контроль);
культура B 7- культура фибробластов кожи человека (CCD-1079Sk), трансфицированных ДНК-вектором GDTT1.8NAS12;
культура C 7- культура фибробластов кожи человека (CCD-1079Sk), трансфицированных ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- ANGPT1, несущим ген ANGPT1.
На фиг. 8
Представлена диаграмма концентрации белка фактора роста эндотелия сосудов А в культуральной среде клеткок эпителия толстой кишки человека (FHC) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- VEGFA, с целью оценки изменения количества белка фактора роста эндотелия сосудов А в культуральной среде клеткок эпителия толстой кишки человека (FHC), при трансфекции этих клеток ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-VEGFA, несущим ген VEGFA где,
культура А 8- культура клеткок эпителия толстой кишки человека (FHC), трансфицированных водным раствором без плазмидной ДНК (контроль);
культура B 8- культура клеткок эпителия толстой кишки человека (FHC), трансфицированных ДНК-вектором GDTT1.8NAS12;
культура C 8- культура клеткок эпителия толстой кишки человека (FHC), трансфицированных ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-VEGFA, несущим ген VEGFA.
На фиг. 9
Представлена диаграмма концентрации белка гипоксией индуцированного фактора 1α в культуральной среде фибробластов молочной железы человека (Hs578 Bst) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- HIF1α, с целью оценки изменения количества белка гипоксией индуцированного фактора 1α в культуральной среде фибробластов молочной железы человека (Hs578 Bst), при трансфекции этих клеток ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- HIF1α, несущим ген HIF1α, где,
культура А 9- культура фибробластов молочной железы человека (Hs578 Bst), трансфицированных водным раствором без плазмидной ДНК (контроль);
культура B 9 - культура фибробластов молочной железы человека (Hs578 Bst), трансфицированных ДНК-вектором GDTT1.8NAS12;
культура C 9- культура фибробластов молочной железы человека (Hs578 Bst), трансфицированных ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- HIF1α, несущим ген HIF1α.
На фиг. 10
Представлена диаграмма концентрации белка ангиогенина ANG в биоптатах кожи трех пациентов после введения в кожу этих пациентов генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- ANG с целью оценки функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне белка, и возможности повышения уровня экспрессии белка ангиогенина с помощью генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген ANG.
На фиг.10 отмечены следующие элементы:
П1I - биоптат кожи пациента П1 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12- ANG;
П1II - биоптат кожи пациента П1 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо);
П1III - биоптат кожи пациента П1 из интактного участка;
П2I - биоптат кожи пациента П2 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12- ANG;
П2II - биоптат кожи пациента П2 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо);
П2III - биоптат кожи пациента П2 из интактного участка;
П3I - биоптат кожи пациента П3 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12- ANG;
П3II - биоптат кожи пациента П3 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо);
П3III - биоптат кожи пациента П3 из интактного участка.
На фиг. 11
показана диаграмма концентрации белка VEGFA в биоптатах икроножной мышцы трех пациентов после введения в икроножную мышцу этих пациентов генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- VEGFA, с целью оценки функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне белка, и возможности повышения уровня экспрессии белка с помощью генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген VEGFA.
На фиг.11 отмечены следующие элементы:
П1I - биоптат икроножной мышцы пациента П1 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12- VEGFA;
П1II - биоптат икроножной мышцы пациента П1 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо);
П1III - биоптат интактного участка икроножной мышцы пациента П1;
П2I - биоптат икроножной мышцы пациента П2 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12- VEGFA;
П2II - биоптат икроножной мышцы пациента П2 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо);
П2III - биоптат интактного участка икроножной мышцы пациента П2;
П3I - биоптат икроножной мышцы пациента П3 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12- VEGFA;
П3II - биоптат икроножной мышцы пациента П3 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо);
П3III - биоптат интактного участка икроножной мышцы пациента П3.
На фиг.12
показана диаграмма концентрации белка HIF1α в биоптатах кожи трех пациентов после введения в кожу этих пациентов генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- HIF1α с целью оценки функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне белка, и возможности повышения уровня экспрессии белка с помощью генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген HIF1α.
На фиг.12 отмечены следующие элементы:
П1I - биоптат кожи пациента П1 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12- HIF1α;
П1II - биоптат кожи пациента П1 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо);
П1III - биоптат кожи пациента П1 из интактного участка;
П2I - биоптат кожи пациента П2 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12- HIF1α;
П2II - биоптат кожи пациента П2 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо);
П2III - биоптат кожи пациента П2 из интактного участка;
П3I - биоптат кожи пациента П3 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12- HIF1α;
П3II - биоптат кожи пациента П3 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо);
П3III - биоптат кожи пациента П3 из интактного участка.
На фиг. 13
показана диаграмма концентрации белка ANGPT1 в биоптатах кожи человека после введения в кожу культуры аутогенных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-ANGPT1 с целью демонстрации способа применения путем введения аутологичных клеток, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-ANGPT1
На фиг.13 отмечены следующие элементы:
П1А - биоптат кожи пациента П1 в зоне введения культуры аутогенных фибробластов пациента, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-ANGPT1;
П1B - биоптат кожи пациента П1 в зоне введения аутогенных фибробластов пациента, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12;
П1C - биоптат кожи пациента П1 из интактного участка.
На фиг. 14
показана диаграмма концентраций белков: белка ANG человека, белка ANGPT1 человека, белка VEGFA человека, белка HIF1α человека в кожных биоптатах крыс в зоне инъекционного введения смеси генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-ANG, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-ANGPT1, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-VEGFA, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- HIF1α с целью оценки эффективности и демонстрации способа сочетанного применения генотерапевтических ДНК-векторов.
На фиг.14 отмечены следующие элементы:
К1I - биоптат кожи крысы К1 в зоне введения смеси генотерапевтических ДНК векторов: GDTT1.8NAS12-ANG, GDTT1.8NAS12- ANGPT1, GDTT1.8NAS12- VEGFA и GDTT1.8NAS12- HIF1α;
К1II - биоптат кожи крысы К1 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо);
К1III - биоптат контрольного интактного участка кожи крысы К1;
К2I - биоптат кожи крысы К2 в зоне введения смеси генотерапевтических ДНК векторов: GDTT1.8NAS12-ANG, GDTT1.8NAS12-ANGPT1, GDTT1.8NAS12-VEGFA и GDTT1.8NAS12- HIF1α;
К2II - биоптат кожи крысы К2 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо);
К2III - биоптат контрольного интактного участка кожи крысы К2;
К3I - биоптат кожи крысы К3 в зоне введения смеси генотерапевтических ДНК векторов: GDTT1.8NAS12-ANG, GDTT1.8NAS12- ANGPT1, GDTT1.8NAS12- VEGFA и GDTT1.8NAS12- HIF1α;
К3II - биоптат кожи крысы К3 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо);
К3III - биоптат контрольного интактного участка кожи крысы К3.
На фиг. 15
показаны графики накопления ампликонов кДНК целевого гена VEGFA в клетках эпителия почки собаки (MDCK) до и через 48 часов после трансфекции этих клеток ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- VEGFA с целью демонстрации способа применения путем введения генотерапевтического ДНК-вектора животным.
На фиг.15 отмечены кривые накопления ампликонов в ходе реакции, соответствующие:
151 - кДНК гена VEGFA в клетках эпителия почки собаки (MDCK) до трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- VEGFA;
152 - кДНК гена VEGFA в клетках эпителия почки собаки (MDCK) после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- VEGFA;
153 - кДНК гена ACT в клетках эпителия почки собаки (MDCK) до трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- VEGFA;
154 - кДНК гена ACT в клетках эпителия почки собаки (MDCK) после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- VEGFA.
В качестве референтного гена использовали ген бета актина собаки, приведенного в базе данных GenBank под номером AF484115.1.
Реализация изобретения
На основе ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 размером 2591 п.н. созданы генотерапевтические ДНК-векторы, несущие целевые гены человека, предназначенные для повышения уровня экспрессии этих целевых генов в тканях человека и животных. При этом способ получения каждого генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевые гены заключается в том, что в полилинкер генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 клонируют белок-кодирующую последовательность целевого гена, выбранного из группы генов: ген ANG (кодирует белок ANG), ген ANGPT1 (кодирует белок ANGPT1), ген VEGFA (кодирует белок VEGFA), ген HIF1α (кодирует белок HIF1α) человека. Известно, что способность ДНК-векторов проникать в эукариотические клетки обусловлена, главным образом, размером вектора. При этом ДНК-вектора с наименьшим размером обладают более высокой проникающей способностью. Таким образом, предпочтительным является отсутствие в составе вектора элементов, которые не несут функциональной нагрузки, но при этом увеличивают размер ДНК-вектора. Данные особенности ДНК-векторов были учтены при получении генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген, выбранный из группы генов ANG, ANGPT1, VEGFA, HIF1α путем отсутствия в составе вектора крупных нефункциональных последовательностей и генов антибиотикорезистентности, что позволило, помимо технологических преимуществ и преимуществ в плане безопасности применения, значительно уменьшить размер полученного генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген, выбранный из группы генов ANG, ANGPT1, VEGFA, HIF1α. Таким образом, способность проникать в эукариотические клетки полученного генотерапевтического ДНК-вектора обусловлена его небольшими размерами.
Каждый из группы генотерапевтических ДНК-векторов: ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-ANG, или GDTT1.8NAS12-ANGPT1, или GDTT1.8NAS12-VEGFA, или GDTT1.8NAS12- HIF1α получали следующим образом: кодирующую часть целевого гена ANG, или ANGPT1, или VEGFA, или HIF1α клонировали в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 и получали генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-ANG, SEQ ID №1, или GDTT1.8NAS12-ANGPT1, SEQ ID №2 или GDTT1.8NAS12-VEGFA, SEQ ID №3, или GDTT1.8NAS12- HIF1α, SEQ ID №4, соответственно. Кодирующую часть гена ANG размером 448 п.н., или гена ANGPT1 размером 1501 п.н., или гена VEGFA размером 1242 п.н., или гена HIF1α размером 2484 п.н. получали путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани здорового человека. Для получения первой цепи кДНК генов ANG, или ANGPT1, или VEGFA, или HIF1α человека использовали реакцию обратной транскрипции. Амплификацию проводили с использованием созданных для этого методом химического синтеза олигонуклеотидов. Расщепление продукта амплификации специфическими эндонуклеазами рестрикции проводили с учетом оптимальной процедуры дальнейшего клонирования, причем клонирование в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 проводили по сайтам рестрикции SalI и KpnI, или BamHI и HindIII, или BamHI и KpnI, расположенными в полилинкере вектора GDTT1.8NAS12. Выбор сайтов рестрикции проводили таким образом, чтобы клонированный фрагмент попадал в рамку считывания экспрессионной кассеты вектора GDTT1.8NAS12, при этом белок-кодирующая последовательность не содержала сайты рестрикции для выбранных эндонуклеаз. При этом специалистам в данной области техники понятно, что методическая реализация получения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-ANG, или GDTT1.8NAS12-ANGPT1, или GDTT1.8NAS12-VEGFA, или GDTT1.8NAS12- HIF1α может варьировать в рамках выбора известных методов молекулярного клонирования генов, при этом эти способы подпадают под объем настоящего изобретения. Так, например, могут быть использованы различные последовательности олигонуклеотидов для амплификации гена ANG, или ANGPT1, или VEGFA, или HIF1α различные эндонуклеазы рестрикции или такие лабораторные техники как безлигазное клонирование генов.
Генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-ANG, или GDTT1.8NAS12-ANGPT1, или GDTT1.8NAS12-VEGFA, или GDTT1.8NAS12-HIF1α обладает нуклеотидной последовательностью SEQ ID №1 или SEQ ID №2 или SEQ ID №3 или SEQ ID №4 соответственно. При этом специалистам в данной области техники известно свойство вырожденности генетического кода, из которого следует, что под объем настоящего изобретения также подпадают варианты нуклеотидных последовательностей, отличающихся инсерцией, делецией или заменой нуклеотидов, которые не приводят к изменению полипептидной последовательности, кодируемой целевым геном, и/или не приводят к потере функциональной активности регуляторных элементов вектора GDTT1.8NAS12. При этом специалистам в данной области техники известно явление генетического полиморфизма, из которого следует, что под объем настоящего изобретения также подпадают варианты нуклеотидных последовательностей генов из группы генов ANG, ANGPT1, VEGFA, HIF1α, которые при этом кодируют различные варианты аминокислотных последовательностей белков ANG, ANGPT1, VEGFA, HIF1α, не отличающихся от приведенных по своей функциональной активности при физиологических условиях.
Способность проникать в эукариотические клетки и функциональную активность, то есть способность экспрессировать целевой ген, полученного генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-ANG, или GDTT1.8NAS12-ANGPT1, или GDTT1.8NAS12-VEGFA, или GDTT1.8NAS12- HIF1α подтверждают путем введения в эукариотические клетки полученного вектора и последующим анализом экспрессии специфической мРНК и/или белкового продукта целевого гена. Наличие специфической мРНК в клетках, в которые был введен генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-ANG, или GDTT1.8NAS12-ANGPT1, или GDTT1.8NAS12-VEGFA, или GDTT1.8NAS12- HIF1α свидетельствует как о способности полученного вектора проникать в эукариотические клетки, так и о его способности экспрессировать мРНК целевого гена. При этом, как известно специалистам в данной области техники, наличие мРНК гена является обязательным условием, но не доказательством трансляции белка, кодируемого целевым геном. Поэтому для подтверждения свойства генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-ANG, или GDTT1.8NAS12-ANGPT1, или GDTT1.8NAS12-VEGFA, или GDTT1.8NAS12- HIF1α экспрессировать целевой ген на уровне белка в эукариотических клетках, в которые был введен генотерапевтический ДНК-вектор, проводят анализ концентрации белков, кодируемых целевыми генами, с использованием иммунологических методов. Наличие белка ANG, или ANGPT1, или VEGFA, или HIF1α подтверждает эффективность экспрессии целевых генов в эукариотических клетках и возможность повышения уровня концентрации белка с помощью генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген, выбранный из группы генов ANG, ANGPT1, VEGFA, HIF1α. Таким образом, для подтверждения эффективности экспрессии созданного генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-ANG, несущего целевой ген, а именно, ген ANG, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-ANGPT1, несущего целевой ген, а именно, ген ANGPT1, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-VEGFA, несущего целевой ген, а именно, ген VEGFA, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-HIF1α, несущего целевой ген, а именно, ген HIF1α, использовали следующие методы:
А) ПЦР в реальном времени - изменение накопления ампликонов кДНК целевых генов в лизате клеток человека и животного, после трансфекции различных клеточных линий человека и животного генотерапевтическим ДНК-векторами;
B) Иммуноферментный анализ - изменение количественного уровня целевых белков в лизате клеток человека, после трансфекции различных клеточных линий человека генотерапевтическими ДНК-векторами;
C) Иммуноферментный анализ - изменение количественного уровня целевых белков в супернатанте биоптатов тканей человека и животного, после введения в эти ткани генотерапевтических ДНК-векторов;
D) Иммуноферментный анализ - изменение количественного уровня целевых белков в супернатанте биоптатов тканей человека, после введения в эти ткани аутологичных клеток этого человека, трансфицированных генотерапевтическими ДНК-векторами.
Для подтверждения реализуемости способа применения созданного генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-ANG, несущего целевой ген, а именно, ген ANG, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-ANGPT1, несущего целевой ген, а именно, ген ANGPT1, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-VEGFA, несущего целевой ген, а именно, ген VEGFA, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- HIF1α, несущего целевой ген, а именно, ген HIF1α выполняли:
А) трансфекцию генотерапевтическими ДНК-векторами различных клеточных линий человека и животного;
B) введение генотерапевтических ДНК-векторов в различные ткани человека и животного;
С) введение в ткани животного смеси генотерапевтических ДНК-векторов;
D) введение в ткани человека аутологичных клеток, трансфицированных генотерапевтическими ДНК-векторами.
Указанные способы применения характеризуются отсутствием потенциальных рисков для генетической терапии человека и животных за счет отсутствия в составе генотерапевтического ДНК-вектора регуляторных элементов, представляющих собой нуклеотидные последовательности вирусных геномов, и за счет отсутствия в составе генотерапевтического ДНК-вектора генов устойчивости к антибиотикам, что подтверждается отсутствием участков, гомологичных вирусным геномам и генам антибиотикорезистентности в нуклеотидных последовательностях генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-ANG, или генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-ANGPT1, или генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-VEGFA, или генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- HIF1α (SEQ ID №1 или SEQ ID №2 или SEQ ID №3 или SEQ ID №4 соответственно).
Как известно специалистам в данной области техники, гены антибиотикорезистентности в составе генотерапевтических ДНК-векторов используются с целью получения этих векторов в препаративных количествах путем наращивания бактериальной биомассы в питательной среде, содержащей селективный антибиотик. В рамках настоящего изобретения в целях возможности безопасного применения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген ANG или ANGPT1, или VEGFA или HIF1α, использование селективных питательных сред, содержащих антибиотик, не представляется возможным. В качестве технологического решения для получения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген, выбранный из группы генов ANG, ANGPT1, VEGFA, HIF1α для возможности масштабирования до промышленных масштабов получения генотерапевтических векторов предлагается способ получения штаммов для наработки указанных генотерапевтических векторов на основе бактерии Escherichia coli JM110-NAS. Способ получения штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-ANG или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-ANGPT1, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-VEGFA, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12- HIF1α заключается в получении компетентных клеток штамма Escherichia coli JM110-NAS с введением в эти клетки генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-ANG, или ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-ANGPT1, или ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-VEGFA, или ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- HIF1α соответственно с помощью методов трансформации (электропорации), общеизвестных специалистам в данной области техники. Полученный штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-ANG, или штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-ANGPT1, или штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-VEGFA, или штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-HIF1α используется для наработки генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-ANG, или GDTT1.8NAS12-ANGPT1, или GDTT1.8NAS12-VEGFA, или GDTT1.8NAS12- HIF1α соответственно с возможностью использования сред без содержания антибиотиков.
Для подтверждения получения штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-ANG, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-ANGPT1, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-VEGFA, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12- HIF1α проводили трансформацию, селекцию и последующее наращивание с выделением плазмидной ДНК.
Для подтверждения технологичности получения и возможности масштабирования до промышленного производства генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-ANG, несущего целевой ген, а именно, ген ANG, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-ANGPT1, несущего целевой ген, а именно, ген ANGPT1, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-VEGFA, несущего целевой ген, а именно, ген VEGFA генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-HIF1α, несущего целевой ген, а именно, ген HIF1α, выполняли ферментацию в промышленном масштабе штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-ANG или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-ANGPT1 или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-VEGFA, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-HIF1α, каждый из которых содержит генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, несущий целевой ген, а именно ANG, или ANGPT1, или VEGFA, или HIF1α.
Способ масштабирования получения бактериальной массы до промышленных масштабов для выделения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген, выбранный из группы генов ANG, ANGPT1, VEGFA, HIF1α, заключается в том, что затравочную культуру штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-ANG, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-ANGPT1, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-VEGFA, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12- HIF1α инкубируют в объеме питательной среды без содержания антибиотика обеспечивающим подходящую динамику накопления биомассы, по достижению достаточного количества биомассы в логарифмической фазе роста, бактериальную культуру переносят в промышленный ферментер, после чего растят до достижения стационарной фазы роста, затем выделяют фракцию, содержащую целевой ДНК-продукт - генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-ANG, или генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-ANGPT1, или генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-VEGFA, или генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-HIF1α многостадийно фильтруют и очищают хроматографическими методами. При этом специалистам в данной области техники понятно, что условия культивирования штаммов, состав питательных сред (за исключением содержания антибиотиков), используемое оборудование, методы очистки ДНК могут варьировать в рамках стандартных операционных процедур в зависимости от отдельно взятой производственной линии, но известные подходы к масштабированию, промышленному получению и очистке ДНК-векторов с использованием штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-ANG, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-ANGPT1, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-VEGFA, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-HIF1α, или подпадают под объем настоящего изобретения.
Описанное раскрытие изобретения подтверждается примерами реализации настоящего изобретения.
Изобретение поясняется следующими примерами.
Пример 1.
Получение генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-ANG, несущего целевой ген, а именно, гена ANG.
Генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-ANG конструировали клонированием кодирующей части гена ANG размером 448 п.н. в ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 размером 2591 п.н. по сайтам рестрикции SalI и KpnI. Кодирующую часть гена ANG размером 448 п.н. получали путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции с использованием коммерческого набора Mint-2 (Евроген, Россия) и ПЦР-амплификации с использованием олигонуклеотидов:
AN_F TTTGTCGACCACCATGGTGATGGGCCTGGGCGTT
AN_R AATGGTACCTTACGGACGACGGAAAATTGACTG
и коммерческого набора Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, США).
Генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 конструировали объединением шести фрагментов ДНК, полученных из разных источников:
(а) ориджин репликации получали путем ПЦР-амплификации участка коммерческой плазмиды pUC19 с использованием олигонуклеотидов UCori-Bam, UCori-Nco (перечень последовательностей, (1) -(2));
(б) терминатор транскрипции hGH-TA получали путем ПЦР-амплификации участка геномной ДНК человека с использованием олигонуклеотидов hGH-F и hGH-R (перечень последовательностей, (3) и (4));
(в) регуляторный участок транспозона Tn10 РНК-out получали путем синтеза из олигонуклеотидов RO-F, RO-R, RO-1, RO-2, RO-3 (перечень последовательностей, (5) -(9));
(г) ген устойчивости к канамицину получали путем ПЦР-амплификации участка коммерческой плазмиды pET-28 человека с использованием олигонуклеотидов Kan-F и Kan-R (перечень последовательностей, (10) и (11));
(д) полилинкер получали кинированием и отжигом четырех синтетических олигонуклеотидов MCS1, MCS2, MCS3 и MCS4 (перечень последовательностей, (12) - (15));
(е) промоторно-регуляторный участок человеческого гена фактора элонгации EF1а с собственным энхансером получали путем ПЦР-амплификации участка геномной ДНК человека с использованием олигонуклеотидов EF1-Xho и EF1-R (перечень последовательностей, (16) - (17)).
ПЦР-амплификацию проводили с использованием коммерческого набора Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs) в соответствии с инструкцией производителя. Фрагменты (б), (в) и (г) имели перекрывающиеся области для возможности их объединения с последующей ПЦР-амплификацией. Объединяли фрагменты (б), (в) и (г) с использованием олигонуклеотидов hGH-F и Kan-R (список последовательностей, (3) и (11)). Далее, полученные фрагменты ДНК объединялись путем рестрикции с последующим лигированием по сайтам BamHI и NcoI. В результате получали вектор, пока еще не содержащий полилинкер. Для его введения проводили расщепление плазмиды эндонуклеазами рестрикции по сайтам BamHI и EcoRI с последующим лигированием с фрагментом (д). В результате получали промежуточный вектор размером 2408 п.н, несущий ген устойчивости к канамицину, пока еще не содержащий промоторно-регуляторный участок гена фактора элонгации EF1а с собственным энхансером. Полученный вектор расщепляли эндонуклеазами рестрикции по сайтам SalI и BamHI с последующим лигированием с фрагментом (е). В результате получали вектор размером 3608 п.н., несущий ген устойчивости к канамицину и промоторно-регуляторный участок гена гена фактора элонгации EF1а с собственным энхансером. Далее ген устойчивости к канамицину выщепляли по сайтам рестрикции SpeI, после чего оставшийся фрагмент лигировали сам на себя. Таким образом получали генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 размером 2591 п.н., который является рекомбинантным, с возможностью селекции без антибиотиков. Расщепление продукта амплификации кодирующей части гена ANG и ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 проводили эндонуклеазами рестрикции SalI и KpnI (New England Biolabs, США).
В результате получали ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-ANG размером 3033 п.н. с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №1 и общей структурой изображенной на фиг. 1A.
Пример 2.
Получение генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-ANGPT1, несущего целевой ген, а именно, гена ANGPT1.
Генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-ANGPT1 конструировали клонированием кодирующей части гена ANGPT1 размером 1501 п.н. в ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 размером 2591 п.н. по сайтам рестрикции SalI и KpnI. Кодирующую часть гена ANGPT1 размером 1501 п.н. получали путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции с использованием коммерческого набора Mint-2 (Евроген, Россия) и ПЦР-амплификации с использованием олигонуклеотидов:
ANPT_F TTTGTCGACCACCATGACAGTTTTCCTTTCCTTTGCTTTCC
ANPT_R AATGGTACCTCAAAAATCTAAAGGTCGAATCATCATAGTTG
и коммерческого набора Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, США), расщепление продукта амплификации и ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 проводили эндонуклеазами рестрикции SalI и KpnI (New England Biolabs, США).
В результате получали ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-ANGPT1 размером 4086 п.н. с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №2 и общей структурой изображенной на фиг.1B.
При этом генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 конструировали по Примеру 1.
Пример 3
Получение ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-VEGFA, несущего целевой ген, а именно, гена VEGFA человека.
Генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-VEGFA конструировали клонированием кодирующей части гена VEGFA размером 1242 п.н. в ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 размером 2591 п.н. по сайтам рестрикции BamHI и HindIII. Кодирующую часть гена VEGFA размером 1242 п.н. получали путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции с использованием коммерческого набора Mint-2 (Евроген, Россия) и ПЦР-амплификации с использованием олигонуклеотидов:
VEG_F GGGGGATCCACCATGACGGACAGACAGACAGACACCGC
VEG_R TTTAAGCTTTCACCGCCTCGGCTTGTCACATCTG
и коммерческого набора Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, США), расщепление продукта амплификации и ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 проводили эндонуклеазами рестрикции BamHI и HindIII (New England Biolabs, США).
В результате получали ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-VEGFA размером 3821 п.н. с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №3 и общей структурой изображенной на фиг. 1C.
При этом генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 конструировали по Примеру 1.
Пример 4.
Получение генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- HIF1α, несущего целевой ген, а именно, гена HIF1α.
Генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-HIF1α конструировали клонированием кодирующей части гена HIF1α размером 2484 п.н. в ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 размером 2591 п.н. по сайтам рестрикции BamHII и EcoRI. Кодирующую часть гена HIF1α размером 2484 п.н. получали путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции с использованием коммерческого набора Mint-2 (Евроген) и ПЦР-амплификации с использованием олигонуклеотидов:
HIF_F AGGATCCACCATGGAGGGCGCCGGCGGCGCGA
HIF_R AATGGTACCTCAGTTAACTTGATCCAAAGCTCTGAGTAATTC
и коммерческого набора Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, США), расщепление продукта амплификации и ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 проводили эндонуклеазами рестрикции BamHI и KpnI (New England Biolabs, США).
В результате получали ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-HIF1α размером 5057 п.н. с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №4 и общей структурой изображенной на фиг. 1D.
При этом генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 конструировали по Примеру 1.
Пример 5.
Подтверждение эффективности генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-ANG, несущего целевой ген ANG. Данный пример также демонстрирует реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевой ген ANG.
Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- ANG оценивали изменения накопления мРНК целевого гена ANG, в первичной культуре клеток скелетной мускулатуры человека HSkMC (ATCC PCS950010) через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- ANG.
Клетки первичной культуры скелетной мускулатуры человека HSkMC выращивали в среде Mesenchymal Stem Cell Basal Medium (ATCC PCS500030) с добавлением компонентов, входящих в набор Primary Skeletal Cell Muscle Growth Kit (ATCC PCS950040) в атмосфере 5% CO2 при 37°С. Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки трансфекции клетки высевали в 24-луночный планшет из расчета 5×104 клеток/лунку.
Для трансфекции использовали реагент Lipofectamine 3000 (ThermoFisher Scientific, США). Трансфекцию генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- ANG проводили следующим образом. В пробирке №1 к 25 мкл среды Opti-MEM (Gibco) добавляли 1 мкл раствора ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- ANG (концентрация 500 нг/мкл) и 1 мкл реагента Р3000. Аккуратно перемешивали легким встряхиванием. В пробирке №2 к 25 мкл среды Opti-MEM (Gibco) добавляли 1 мкл раствора Lipofectamine 3000. Аккуратно перемешивали легким встряхиванием. Добавляли содержимое пробирки №1 к содержимому пробирки №2, инкубировали 5 мин при комнатной температуре. Полученный раствор по каплям добавляли к клеткам в объеме 40 мкл.
В качестве контроля использовали клетки первичной культуры скелетной мускулатуры человека HSkMC, трансфицированные генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12, не содержащим вставку целевого гена (кДНК гена ANG до и после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12, не содержащим вставку целевого гена на фигурах не показано). Подготовку контрольного вектора GDTT1.8NAS12 для трансфекции проводили как описано выше.
Суммарную РНК из трансфицированных клеток выделяли следующим образом. В лунку с клетками добавляли 1 мл Trizol Reagent (ThermoFisher Scientific) и гомогенизировали с последующим прогреванием в течении 5 мин при 65°С. Далее образец центрифугировали при 14000g в течении 10 мин и снова прогревали в течении 10 мин при 65°С. Далее добавляли 200 мкл хлороформа, плавно перемешивали и центрифугировали при 14000g в течении 10 мин. Затем отбирали водную фазу, добавляли к ней 1/10 объема 3М ацетата натрия рН5.2 и равный объем изопропилового спирта. Инкубировали образец при -20°С в течении 10 мин с последующим центрифугированием при 14000g в течении 10 мин. Осадок промывали 1 мл 70% этилового спирта, высушивали на воздухе и растворяли в 10 мкл воды, свободной от РНКаз. Для определения уровня экспрессии мРНК гена ANG после трансфекции использовали метод ПЦР в режиме реального времени (SYBR GreenRealTimePCR). Для амплификации кДНК, специфичной для гена ANG человека, использовали олигонуклеотиды:
AN_rtF CGACCCTGGCTCAGGATAAC
AN_rtR TGTCTTTGCAGGGTGAGGTC.
Длина продукта амплификации - 135 п.н. В качестве референтного гена использовали ген бета-2-микроглобулина B2M.
ПЦР-амплификацию проводили с помощью набора реагентов SYBR GreenQuantitect RT-PCR Kit (Qiagen, США) в режиме реального времени в 20 мкл амплификационной смеси, содержащей: 25 мкл QuantiTect SYBR Green RT-PCR MasterMix, 2,5 mM хлорида магния, по 0,5 мкМ каждого праймера, 5 мкл суммарной РНК. Реакцию осуществляли на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad, USA) при следующих условиях: 1 цикл обратной транскрипции при 42°С 30 минут, денатурация 98°С - 15 мин, затем 40 циклов, включающих денатурацию 94°С - 15 сек, отжиг праймеров 60°C - 30 сек и элонгацию 72°С - 120 сек. В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности кДНК генов ANG и B2M. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество ПЦР продуктов - кДНК генов ANG и B2M, полученных в результате амплификации, оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio-RadCFXManager 2.1.
С целью подтверждения увеличения экспрессии гена ANG в клетках первичной культуры скелетной мускулатуры человека HSkMC после трансфекции данных клеток генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-ANG на фиг.2 приведены графики накопления ПЦР-продуктов, из которых следует, что в результате трансфекции первичной культуры скелетной мускулатуры человека HSkMC генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-ANG, уровень специфической мРНК гена ANG человека вырос многократно. Это свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- ANG. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- ANG для повышения уровня экспрессии гена ANG в эукариотических клетках.
Пример 6.
Подтверждение эффективности генотерапевтического ДНК-вектора ANGPT1, несущего целевой ген ANGPT1. Данный пример также демонстрирует реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевой ген ANGPT1.
Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-ANGPT1, оценивали изменения накопления мРНК целевого гена ANGPT1, в клетках культуры фибробластов кожи человека CCD-1079Sk (ATCC® CRL-2097) через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- ANGPT1.
Клетки первичной культуры фибробластов кожи человека CCD-1079Sk выращивали в среде Minimum essential medium (Eagle) (Gibco) с добавлением 2 мМ глутамина в атмосфере 5% CO2 при 37°С. Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки трансфекции клетки высевали в 24-луночный планшет из расчета 5×104 клеток/лунку.
Клетки первичной культуры фибробластов кожи человека CCD-1079Sk трансфицировали как описано в Примере 5.
Трансфекцию проводили генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- ANGPT1.
В качестве контроля использовали фибробласты кожи человека CCD-1079Sk, трансфицированные генотерапевтическим ДНК-вектором ANGPT1, не содержащим вставку целевого гена (кДНК гена ANGPT1 до и после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12, не содержащим вставку целевого гена на фигурах не показано). Подготовку контрольного вектора GDTT1.8NAS12 для трансфекции проводили, как описано в Примере 5.
Суммарную РНК из трансфицированных клеток выделяли, как описано в Примере 5. Для определения уровня экспрессии мРНК гена ANGPT1 после трансфекции использовали метод ПЦР в режиме реального времени (SYBR GreenRealTimePCR). Для амплификации кДНК, специфичной для гена ANGPT1 человека, использовали олигонуклеотиды:
ANPT_rtF TGCAGAGAGATGCTCCACAC
ANPT_rtR TGTATCTGGGCCATCTCCGA.
Длина продукта амплификации - 148 п.н. В качестве референтного гена использовали ген бета-2-микроглобулина человека B2M.
ПЦР-амплификацию проводили как описано в Примере 12 при следующих условиях: 1 цикл обратной транскрипции при 42°С 30 минут, денатурация 98°С - 15 мин, затем 40 циклов, включающих денатурацию 94°С - 15 сек, отжиг праймеров 60°C - 30 сек и элонгацию 72°С - 120 сек. В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности кДНК генов ANGPT1 и B2M. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество ПЦР продуктов - кДНК генов ANGPT1 и B2M, полученных в результате амплификации, оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio-RadCFXManager 2.1.
С целью подтверждения увеличения экспрессии гена ANGPT1 в культуре клеток фибробластов кожи человека CCD-1079Sk после трансфекции данных клеток генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- ANGPT1 на фиг.3 приведены графики накопления ПЦР-продуктов, из которых следует, что в результате трансфекции первичной культуры фибробластов кожи человека CCD-1079Sk генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- ANGPT1, уровень специфической мРНК гена ANGPT1 человека вырос многократно. Это свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- ANGPT1. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-ANGPT1 для повышения уровня экспрессии гена ANGPT1 в эукариотических клетках.
Пример 7.
Подтверждение эффективности генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-VEGFA, несущего целевой ген VEGFA. Данный пример также демонстрирует реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевой ген VEGFA.
Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- VEGFA, оценивали изменения накопления мРНК целевого гена VEGFA, в клетках в клетках эпителия толстой кишки человека FHC (АТСС CRL-1831) через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- VEGFA.
Клетки эпителия толстой кишки человека FHC выращивали в среде DMEM:F12 Medium (ATCC 30-2006 согласно методики производителя (https://www.lgcstandards-atcc.org/products/all/CRL-1831.aspx#culturemethod) в атмосфере при 37°С. Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки трансфекции клетки высевали в 24-луночный планшет из расчета 5×104 клеток/лунку.
Клетки эпителия толстой кишки человека FHC трансфицировали, как описано в Примере 5.
Трансфекцию проводили генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- VEGFA.
В качестве контроля использовали клетки эпителия толстой кишки человека FHC, трансфицированные генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12, не содержащим вставку целевого гена (кДНК гена VEGFA до и после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12, не содержащим вставку целевого гена на фигурах не показано). Подготовку контрольного вектора GDTT1.8NAS12 для трансфекции проводили как описано в Примере 5.
Суммарную РНК из трансфицированных клеток выделяли как описано в Примере 5. Для определения уровня экспрессии мРНК гена VEGFA после трансфекции использовали метод ПЦР в режиме реального времени (SYBR GreenRealTimePCR). Для амплификации кДНК, специфичной для гена VEGFA человека, использовали олигонуклеотиды:
VEG_rtF CTTGCCTTGCTGCTCTACCT
VEG_rtR GCAGTAGCTGCGCTGATAGA.
Длина продукта амплификации - 123 п.н. В качестве референтного гена использовали ген бета-2-микроглобулина человека B2M.
ПЦР-амплификацию проводили как описано в Примере 12 при следующих условиях: 1 цикл обратной транскрипции при 42°С 30 минут, денатурация 98°С - 15 мин, затем 40 циклов, включающих денатурацию 94°С - 15 сек, отжиг праймеров 60°C - 30 сек и элонгацию 72°С - 120 сек. В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности кДНК генов VEGFA и B2M. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество ПЦР продуктов - кДНК генов VEGFA и B2M, полученных в результате амплификации, оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio-RadCFXManager 2.1.
С целью подтверждения увеличения экспрессии гена VEGFA в культуре клеток эпителия толстой кишки человека FHC после трансфекции данных клеток генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- VEGFA на фиг.4 приведены графики накопления ПЦР-продуктов, из которых следует, что в результате трансфекции клеток эпителия толстой кишки человека FHC генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- VEGFA, уровень специфической мРНК гена VEGFA человека вырос многократно. Это свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- VEGFA. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- VEGFA для повышения уровня экспрессии гена VEGFA в эукариотических клетках.
Пример 8.
Подтверждение эффективности генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-HIF1α, несущего целевой ген HIF1α. Данный пример также демонстрирует реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевой ген HIF1α.
Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-HIF1α, оценивали изменения накопления мРНК целевого гена HIF1α, в культуре фибробластов молочной железы человека Hs578 Bst (ATCC HTB-125) через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- HIF1α.
Фибробласты молочной железы человека Hs578 Bst выращивали в среде ATCC Hybri-Care Medium (АТСС Catalog No. 46-X) согласно методики производителя (https://www.lgcstandards-atcc.org/products/all/HTB-125.aspx#culturemethod) в атмосфере 5% CO2 при 37°С. Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки трансфекции клетки высевали в 24-луночный планшет из расчета 5×104 клеток/лунку.
Фибробласты молочной железы человека Hs578 трансфицировали, как описано в Примере 5.
Трансфекцию проводили генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- HIF1α.
В качестве контроля использовали фибробласты молочной железы человека Hs578, трансфицированные генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12, не содержащим вставку целевого гена (кДНК гена HIF1α до и после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12, не содержащим вставку целевого гена на фигурах не показано). Подготовку контрольного вектора GDTT1.8NAS12 для трансфекции проводили как описано в Примере 5.
Суммарную РНК из трансфицированных клеток выделяли как описано в Примере 5. Для определения уровня экспрессии мРНК гена HIF1α после трансфекции использовали метод ПЦР в режиме реального времени (SYBR GreenRealTimePCR). Для амплификации кДНК, специфичной для гена HIF1α человека, использовали олигонуклеотиды:
HIF_rtF TTTTGGCAGCAACGACACAG
HIF_rtR GTGCAGGGTCAGCACTACTT.
Длина продукта амплификации - 173 п.н. В качестве референтного гена использовали ген бета-2-микроглобулина человека B2M.
ПЦР-амплификацию проводили как описано в Примере 12 при следующих условиях: 1 цикл обратной транскрипции при 42°С 30 минут, денатурация 98°С - 15 мин, затем 40 циклов, включающих денатурацию 94°С - 15 сек, отжиг праймеров 60°C - 30 сек и элонгацию 72°С - 120 сек. В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности кДНК генов HIF1α и B2M. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество ПЦР продуктов - кДНК генов HIF1α и B2M, полученных в результате амплификации, оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio-RadCFXManager 2.1.
С целью подтверждения увеличения экспрессии гена HIF1α в фибробластах молочной железы человека Hs578 после трансфекции данных клеток генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- HIF1α на фиг.5 приведены графики накопления ПЦР-продуктов, из которых следует, что в результате трансфекции фибробластов молочной железы человека Hs578 генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- HIF1α, уровень специфической мРНК гена HIF1α человека вырос многократно. Это свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-HIF1α. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- HIF1α для повышения уровня экспрессии гена HIF1α в эукариотических клетках.
Пример 9.
Подтверждение эффективности генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-ANG, несущего целевой ген, а именно, ген ANG и реализуемости способа его использования.
Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- ANG, несущего целевой ген, а именно, ген ANG и реализуемости способа его использования оценивали изменение количества белка ангиогенина в культуральной среде первичной культуры скелетной мускулатуры человека (HSkMC) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- ANG, несущим ген ANG человека, как описано в Примере 5.
Для оценки изменения количества белка ангиогенина, использовали клетки первичной культуры скелетной мускулатуры человека (HSkMC), которые выращивали по примеру 5.
После трансфекции к 0,5 мл культуральной жидкости приливали 0,1 мл 1N HCl, тщательно перемешивали и инкубировали 10 минут при комнатной температуре. Затем нейтрализовали смесь, добавляя 0,1 мл 1.2N NaOH/0.5M HEPES (pH 7-7,6) и тщательно перемешивали. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка.
Количественное определение продукта кДНК гена ANG проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор ELISA Kit for Angiogenin (ANG) (Cloud-Clone Corp., США) согласно методике производителя (http://cloud-clone.com/products/SEA007Hu.html). Оптическая плотность образцов измерялась при длине волны 450 нм при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness TechNology Inc., США) и пропорциональна концентрации белка ANG в пробе. Численное значение концентрации определяется с помощью калибровочной кривой, построенной по калибраторам с известной концентрацией белка ANG, входящим в состав набора. Разница между значениями оптической плотности (ОП) калибраторов поставленных в трех повторностях не превышала 10%.
Статистическую обработку полученных результатов, осуществляли с помощью программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных R, версия 3.0.2 (https://www.r-project.org/).
Диаграмма, полученная в результате анализа представлена на фиг. 6, из которой следует, что трансфекция клеток первичной культуры скелетной мускулатуры человека (HSkMC) генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-ANG, несущим ген ANG, приводит к увеличению количества белка ангиогенина по сравнению с контрольными образцами, что свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-ANG и подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген ANG на уровне белка. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-ANG для повышения уровня экспрессии ANG в эукариотических клетках.
Пример 10.
Подтверждение эффективности генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- ANGРТ1, несущего целевой ген, а именно, ген ANGРТ1 и реализуемости способа его использования.
Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- ANGРТ1, несущего целевой ген, а именно, ген ANGРТ1 и реализуемости способа его использования оценивали изменение количества белка ангиопоэтина 1 в культуральной среде фибробластов кожи человека (CCD-1079Sk) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- ANGРТ1, несущим ген ANGРТ1 человека, как описано в Примере 5.
Для оценки изменения количества белка ангиопоэтина 1, использовали клетки фибробластов кожи человека (CCD-1079Sk), которые выращивали по примеру 5.
Количественное определение продукта кДНК гена ANGРТ1 проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор ELISA Kit for Angiopoietin 1 (Cloud-Clone Corp., США) согласно методике производителя (http://cloud-clone.com/products/SEA008Hu.html)
Оптическая плотность образцов измерялась при длине волны 450 нм при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness TechNology Inc., США) и пропорциональна концентрации белка ANGPT1 в пробе. Численное значение концентрации определяется с помощью калибровочной кривой, построенной по калибраторам с известной концентрацией белка ANGPT1, входящим в состав набора. Разница между значениями оптической плотности (ОП) калибраторов поставленных в трех повторностях не превышала 10%.
Статистическую обработку полученных результатов, осуществляли с помощью программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных R, версия 3.0.2 (https://www.r-project.org/).
Диаграмма, полученная в результате анализа представлена на фиг. 7, из которой следует, что трансфекция фибробластов кожи человека (CCD-1079Sk) генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-ANGPT1, несущим ген ANGPT1, приводит к увеличению количества белка ангиопоэтина по сравнению с контрольными образцами, что свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-ANGРТ1 и подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген ANGРТ1 на уровне белка. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-ANGРТ1 для повышения уровня экспрессии ANGРТ1 в эукариотических клетках.
Пример 11.
Подтверждение эффективности генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- VEGFA, несущего целевой ген, а именно, ген VEGFA и реализуемости способа его использования.
Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- VEGFA, несущего целевой ген, а именно, ген VEGFA и реализуемости способа его использования оценивали изменение количества белка фактора роста эндотелия сосудов в культуральной среде клеток эпителия толстой кишки человека (FHC) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- VEGFA, несущим ген VEGFA человека, как описано в Примере 5.
Для оценки изменения количества белка фактора роста эндотелия сосудов, использовали клетки эпителия толстой кишки человека (FHC), которые выращивали по примеру 5.
Количественное определение продукта кДНК гена VEGFA проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор ELISA Kit for Vascular Endothelial Growth Factor A (Cloud-Clone Corp., США) согласно методике производителя (http://cloud-clone.com/products/SEA143Hu.html). Оптическая плотность образцов измерялась при длине волны 450 нм при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness TechNology Inc., США) и пропорциональна концентрации белка VEGFA в пробе. Численное значение концентрации определяется с помощью калибровочной кривой, построенной по калибраторам с известной концентрацией белка VEGFA, входящим в состав набора. Разница между значениями оптической плотности (ОП) калибраторов поставленных в трех повторностях не превышала 10%.
Статистическую обработку полученных результатов, осуществляли с помощью программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных R, версия 3.0.2 (https://www.r-project.org/).
Диаграмма, полученная в результате анализа представлена на фиг. 8, из которой следует, что трансфекция клеток эпителия толстой кишки человека (FHC) генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- VEGFA, несущим ген VEGFA, приводит к увеличению количества белка фактора роста эндотелия сосудов по сравнению с контрольными образцами, что свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-VEGFA и подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген VEGFA на уровне белка. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- VEGFA для повышения уровня экспрессии VEGFA в эукариотических клетках.
Пример 12.
Подтверждение эффективности генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- HIF1α, несущего целевой ген, а именно, ген HIF1α и реализуемости способа его использования.
Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- HIF1α, несущего целевой ген, а именно, ген HIF1α и реализуемости способа его использования оценивали изменение количества белка гипоксией индуцированного факторa альфа в культуральной среде фибробластов молочной железы человека (Hs578 Bst) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- HIF1α, несущим ген HIF1α человека, как описано в Примере 5.
Для оценки изменения количества белка гипоксией индуцированного факторa альфа, использовали фибробласты молочной железы человека (Hs578 Bst), которые выращивали по примеру 5.
Количественное определение продукта кДНК гена HIFα проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор ELISA Kit for Hypoxia Inducible Factor 1 Alpha (Cloud-Clone Corp., США) согласно методике производителя (http://cloud-clone.com/products/SEA798Hu.html).
Оптическая плотность образцов измерялась при длине волны 450 нм при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness TechNology Inc., США) и пропорциональна концентрации белка HIF1α в пробе. Численное значение концентрации определяется с помощью калибровочной кривой, построенной по калибраторам с известной концентрацией белка HIF1α, входящим в состав набора. Разница между значениями оптической плотности (ОП) калибраторов поставленных в трех повторностях не превышала 10%.
Статистическую обработку полученных результатов, осуществляли с помощью программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных R, версия 3.0.2 (https://www.r-project.org/).
Диаграмма, полученная в результате анализа представлена на фиг. 9, из которой следует, что трансфекция фибробластов молочной железы человека (Hs578 Bst) генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- HIF1α, несущим ген HIF1α, приводит к увеличению количества белка гипоксией индуцированного факторa альфа по сравнению с контрольными образцами, что свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- HIF1α и подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген HIF1α на уровне белка. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-HIF1α для повышения уровня экспрессии HIF1α в эукариотических клетках.
Пример 13.
Подтверждение эффективности и реализуемости способа применения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- ANG, несущего ген ANG, для повышения экспрессии белка ANG в тканях человека.
Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- ANG, несущего целевой ген, а именно, ген ANG и реализуемости способа его применения оценивали изменения количества белка ANG в коже человека при введении в кожу человека генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- ANG, несущего ген человека ANG.
С целью анализа изменения количества белка ангиогенина трем пациентам вводили в кожу предплечья генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12- ANG, несущий ген ANG и параллельно вводили плацебо, представляющее собой генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, не содержащий ген ANG.
Пациент 1, женщина 47 лет, (П1); пациент 2, женщина 65 лет, (П2); пациент 3, мужчина, 52 года, (П3). В качестве транспортной системы использовали полиэтиленимин Transfection reagent cGMP grade in-vivo-jetPEI (Polyplus Transfection, Франция). Генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12- ANG, который содержит ген ANG и генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, используемый в качестве плацебо, растворяли в стерильной воде степени очистки Nuclease-Free. Комплексы ДНК- cGMP grade in-vivo-jetPEI готовили в соответствии с рекомендациями производителя.
Генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 (плацебо) и генотерапевтический ДНК вектор GDTT1.8NAS12- ANG вводили в количестве 1 мг для каждой генетической конструкции тоннельным методом иглой 30G на глубину 3 мм. Объем вводимого раствора генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо) и генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12- ANG - 0,3 мл для каждой генетической конструкции. Очаги введения каждой генетической конструкции располагались на участке предплечья на расстоянии 8-10 см друг от друга.
Биопсийные образцы отбирали на 2-е сутки после введения генетических конструкций генотерапевтических ДНК-векторов. Взятие биопсии осуществляли из участков кожи пациентов в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12- ANG, несущего ген ANG (I), генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо) (II), а также из интактных участков кожи (III), используя устройство для взятия биопсии Epitheasy 3.5 (Medax SRL, Италия). Кожу пациентов в зоне отбора биоптата предварительно промывали стерильным физиологическим раствором и анестезировали раствором лидокаина. Размер биопсийного образца составлял около 10 куб. мм, масса - около 11 мг. Образец помещали в буферный раствор, содержащий 50 мМ Трис-HCl рН 7.6, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА и 1 мМ фенилметилсульфонилфторид, и гомогенизировали до получения однородной суспензии. Полученную суспензию центрифугировали в течение 10 мин при 14000g. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка ангиогенина методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор ELISA Kit for Angiopoietin 1 (Cloud-Clone Corp., США), как описано в Примере 10 с детекцией оптической плотности при длине волны 450 нм при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness Technology Inc., США).
Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белка ангиогенина, входящим в состав набора. Диаграммы, полученные в результате анализа представлены на фиг. 10.
Из фигуры 10 следует, что в коже всех трех пациентов в области введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12- ANG, несущего целевой ген ANG человека, произошло увеличение количества белка ангиогенина в сравнении с количеством белка ангиогенина в области введения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо), не содержащего ген ANG человека, что свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- ANG и подтверждает реализуемость способа его применения, в частности при введении генотерапевтического ДНК-вектора в органы человека.
Пример 14.
Подтверждение эффективности и реализуемости способа применения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-VEGFA, несущего ген VEGFA, для повышения экспрессии белка VEGFA в тканях человека.
Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-VEGFA, несущего целевой ген VEGFA и реализуемости способа его применения оценивали изменение количества белка VEGFA в мышечной ткани человека при введении генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-VEGFA, несущего целевой ген, а именно, ген VEGFA человека.
С целью анализа изменения количества белка VEGFA трем пациентам вводили в ткань икроножной мышцы генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-VEGFA, несущий ген VEGFA с транспортной молекулой, и параллельно вводили плацебо, представляющее собой генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, не содержащий кДНК гена VEGFA с транспортной молекулой.
Пациент 1, мужчина 52 года, (П1); пациент 2, женщина 52 года (П2); пациент 3, мужчина, 63 года, (П3). В качестве транспортной системы использовали полиэтиленимин Transfection reagent cGMP grade in-vivo-jetPEI (Polyplus Transfection, Франция), пробоподготовку проводили в соответствии с рекомендациями производителя.
Генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 (плацебо) и генотерапевтический ДНК вектор GDTT1.8NAS12-VEGFA, несущий ген VEGFA вводили в количестве 1 мг для каждой генетической конструкции тоннельным методом иглой 30G на глубину около 10 мм. Объем вводимого раствора генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо) и генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12-VEGFA, несущего ген VEGFA - 0,3 мл для каждой генетической конструкции. Очаги введения каждой генетической конструкции располагали медиально на расстоянии 8-10 см друг от друга.
Биопсийные образцы отбирали на 2-е сутки после введения генетических конструкций генотерапевтических ДНК-векторов. Взятие биопсии осуществляли из участков мышечной ткани пациентов в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12-VEGFA, несущего ген VEGFA (I), генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо) (II), а также из интактного участка икроножной мышцы (III), используя устройство для взятия биопсии MAGNUM (BARD, США). Кожу пациентов в зоне отбора биоптата предварительно промывали стерильным физиологическим раствором и анестезировали раствором лидокаина. Размер биопсийного образца составлял около 20 куб. мм, масса - около 22 мг. Образец помещали в буферный раствор, содержащий 50 мМ Трис-HCl рН 7.6, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА и 1 мМ фенилметилсульфонилфторид, и гомогенизировали до получения однородной суспензии. Полученную суспензию центрифугировали в течение 10 мин при 14000g. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка.
Количественное определение белка VEGFA проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор используя набор набор ELISA Kit for Vascular Endothelial Growth Factor A (Cloud-Clone Corp., США) согласно методике производителя с детекцией оптической плотности при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness Technology Inc., США).
Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белка VEGFA, входящим в состав набора. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных R, версия 3.0.2 (https://www.r-project.org/). Графики, полученные в результате анализа представлены на фиг. 11.
Из фигуры 11 следует, что в икроножной мышце всех трех пациентов в области введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12-VEGFA, несущего целевой ген, а именно, ген VEGFA человека, произошло увеличение количества белка VEGFA в сравнении с количеством белка VEGFA в области введения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо), не содержащего ген VEGFA человека, что свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-VEGFA и подтверждает реализуемость способа его применения, в частности при внутримышечном введении генотерапевтического ДНК-вектора в ткани человека.
Пример 15.
Подтверждение эффективности и реализуемости способа применения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- HIF1α, несущего ген HIF1α, для повышения экспрессии белка HIF1α в тканях человека.
Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- HIF1α, несущего целевой ген, а именно, ген HIF1α и реализуемости способа его применения оценивали изменения количества белка HIF1α в коже человека при введении в кожу человека генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- HIF1α, несущего ген человека HIF1α.
С целью анализа изменения количества белка HIF1α трем пациентам вводили в кожу предплечья генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12- HIF1α, несущий ген HIF1α и параллельно вводили плацебо, представляющее собой генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, не содержащий кДНК гена HIF1α.
Пациент 1, женщина 45 лет (П1); пациент 2, мужчина 59 лет (П2); пациент 3, мужчина, 47 лет (П3). В качестве транспортной системы использовали полиэтиленимин Transfection reagent cGMP grade in-vivo-jetPEI (Polyplus Transfection, Франция). Генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12- HIF1α, который содержит кДНК гена HIF1α и генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, используемый в качестве плацебо, который не содержит кДНК гена HIF1α, каждый из которых растворяли в стерильной воде степени очистки Nuclease-Free. Для получения генетической конструкции готовили комплексы ДНК- cGMP grade in-vivo-jetPEI в соответствии с рекомендациями производителя.
Генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 (плацебо) и генотерапевтический ДНК вектор GDTT1.8NAS12- HIF1α, несущий ген HIF1α вводили в количестве 1 мг для каждой генетической конструкции тоннельным методом иглой 30G на глубину 3 мм. Объем вводимого раствора генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо) и генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12- HIF1α, несущего ген HIF1α - 0,3 мл для каждой генетической конструкции. Очаги введения каждой генетической конструкции располагались на участке предплечья на расстоянии 8-10 см друг от друга.
Биопсийные образцы отбирали на 2-е сутки после введения генетических конструкций генотерапевтических ДНК-векторов. Взятие биопсии осуществляли из участков кожи пациентов в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12- HIF1α, несущего ген HIF1α (I), генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо) (II), а также из интактных участков кожи (III), используя устройство для взятия биопсии Epitheasy 3.5 (Medax SRL, Италия). Кожу пациентов в зоне отбора биоптата предварительно промывали стерильным физиологическим раствором и анестезировали раствором лидокаина. Размер биопсийного образца составлял около 10 куб. мм, масса - около 11 мг. Образец помещали в буферный раствор, содержащий 50 мМ Трис-HCl рН 7.6, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА и 1 мМ фенилметилсульфонилфторид, и гомогенизировали до получения однородной суспензии. Полученную суспензию центрифугировали в течение 10 мин при 14000g. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор используя набор ELISA Kit for Hypoxia Inducible Factor 1 Alpha (Cloud-Clone Corp., США)согласно методике производителя с детекцией оптической плотности при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness Technology Inc., США).
Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белка HIF1α, входящим в состав набора. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных R, версия 3.0.2 (https://www.r-project.org/). Графики, полученные в результате анализа, представлены на фиг. 12.
Из фигуры 12 следует, что в коже всех трех пациентов в области введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12- HIF1α, несущего целевой ген HIF1α человека, произошло увеличение количества белка HIF1α в сравнении с количеством белка HIF1α в области введения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо), не содержащего ген HIF1α человека, что свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- HIF1α и подтверждает реализуемость способа его применения, в частности при внутрикожном введении генотерапевтического ДНК-вектора в ткани человека.
Пример 16.
Подтверждение эффективности генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-ANGPT1, несущего ген ANGPT1 и реализуемости способа его применения для повышения уровня экспрессии белка ANGPT1 в тканях человека путем введения аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-ANGPT1.
Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-ANGPT1, несущего ген ANGPT1 и реализуемости способа его применения оценивали изменения количества белка ANGPT1 в коже человека при введении в кожу пациента культуры аутогенных фибробластов этого пациента, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-ANGPT1.
Пациенту вводили в кожу предплечья соответствующую культуру аутогенных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-ANGPT1, несущим ген ANGPT1, и параллельно вводили плацебо, представляющее собой культуру аутогенных фибробластов пациента, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12, не несущим ген ANGPT1.
Первичную культуру фибробластов человека выделяли из биоптатов кожи пациента. Используя устройство для взятия биопсии кожи Epitheasy 3.5 (Medax SRL, Италия) брали образец биоптата кожи из зоны, защищенной от действия ультрафиолета, а именно за ушной раковиной или с боковой внутренней поверхности в зоне локтевого сустава, размером около 10 кв. мм, массой - около 11 мг. Кожу пациента предварительно промывали стерильным физиологическим раствором и анестезировали раствором лидокаина. Культивирование первичной культуры клеток осуществляли при 37 °С в атмосфере, содержащей 5 % СО2 в среде DMEM с 10 % фетальной телячьей сывороткой и ампициллином 100 Ед/мл. Пересев культуры и смену культуральной среды осуществляли каждые 2 дня. Общая продолжительность роста культуры не превышала 25-30 дней. Из культуры клеток отбирали аликвоту, содержащую 5×104 клеток. Культуру фибробластов пациента трансфицировали генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-ANGPT1, несущим ген ANGPT1 или плацебо - вектор GDTT1.8NAS12, не несущий целевой ген ANGPT1.
Трансфекцию осуществляли с помощью катионного полимера полиэтиленимина JETPEI (Polyplus Transfection, Франция), согласно инструкции фирмы-производителя. Клетки культивировали 72 часа и затем вводили пациенту. Введение пациенту культуры аутогенных фибробластов этого пациента, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-ANGPT1, и плацебо, представляющее собой культуру аутогенных фибробластов пациента, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12, осуществляли туннельным методом в область предплечья иглой 30G длиной 13 мм на глубину около 3 мм. Концентрация модифицированных аутогенных фибробластов в вводимой суспензии составляла примерно 5 млн клеток на 1 мл суспензии, количество вводимых клеток не превышало 15 млн. Очаги введения культуры аутогенных фибробластов располагались на расстоянии 8-10 см друг от друга.
Биопсийные образцы отбирали на 4-е сутки после введения культуры аутогенных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-ANGPT1, несущим целевой ген, а именно, ген ANGPT1 и плацебо. Взятие биопсии осуществляли из участков кожи пациента в зоне введения культуры аутогенных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-ANGPT1, несущим целевой ген, а именно, ген ANGPT1 (C), культуры аутогенных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12, не несущим целевой ген ANGPT1 (плацебо) (B), а также из участков интактной кожи (A), используя устройство для взятия биопсии Epitheasy 3.5 (Medax SRL, Италия). Кожу в зоне отбора биоптата пациентов предварительно промывали стерильным физиологическим раствором и анестезировали раствором лидокаина. Размер биопсийного образца составлял около 10 куб. мм, масса - около 11 мг. Образец помещали в буферный раствор, содержащий 50 мМ Трис-HCl рН 7.6, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА и 1 мМ фенилметилсульфонилфторид, и гомогенизировали до получения однородной суспензии. Полученную суспензию центрифугировали в течение 10 мин при 14000g. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка как это описано в примере 10.
Графики, полученные в результате анализа, представлены на фиг. 13.
Из фигуры 13 следует, что в коже пациента в области введения культуры аутогенных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-ANGPT1, несущим ген ANGPT1, произошло увеличение количества белка ANGPT1 в сравнении с количеством белка ANGPT1 в области введения культуры аутогенных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12, не несущим ген ANGPT1 (плацебо), что свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-ANGPT1 и подтверждает реализуемость способа его применения для повышения уровня экспрессии ANGPT1 в тканях человека, в частности при введении аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-ANGPT1.
Пример 17.
Подтверждение эффективности и реализуемости способа сочетанного применения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-ANG, несущего ген ANG, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-ANGPT1, несущего ген ANGPT1, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-VEGFA, несущего ген VEGFA, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- HIF1α, несущего ген HIF1α, для повышения уровня экспрессии белков ANG, ANGPT1, VEGFA и HIF1α в тканях млекопитающих.
Для подтверждения эффективности и реализуемости способа сочетанного применения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-ANG, несущего ген ANG, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-ANGPT1, несущего ген ANGPT1, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-VEGFA, несущего ген VEGFA, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- HIF1α, несущего ген HIF1α оценивали изменение количества белков ANG, ANGPT1, VEGFA и HIF1α в зонах внутрикожных инъекций крысы Вистар (самцы, в возрасте 22-24 недель) при введении в эту зону смеси генотерапевтических векторов.
Была приготовлена смесь генотерапевтических ДНК-векторов в соотношении 1:1:1:1 (по массе) из лиофилизата ДНК-векторов GDTT1.8NAS12-ANG, GDTT1.8NAS12-ANGPT1, GDTT1.8NAS12-VEGFA, GDTT1.8NAS12- HIF1α. В качестве транспортной системы использовали полиэтиленимин Transfection reagent cGMP grade in-vivo-jetPEI (Polyplus Transfection, Франция). Эквимолярную смесь генотерапевтических ДНК-векторов растворяли в стерильной воде степени очистки Nuclease-Free. Для получения генетической конструкции готовили комплексы ДНК- cGMP grade in-vivo-jetPEI в соответствии с рекомендациями производителя.
Было сформировано 3 группы животных по 10 особей в каждой. Всем животным под анестезией были сделаны внутрикожные инъекции:
в 1-й группе (KI) смесью генотерапевтических ДНК-векторов GDTT1.8NAS12-ANG, GDTT1.8NAS12-ANGPT1, GDTT1.8NAS12-VEGFA, GDTT1.8NAS12-HIF1α в объеме 200 мкл. (концентрация каждого генотерапевтического ДНК-вектора 1 мкг/мкл);
во 2-й группе (KII) - раствором ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 в объеме 200 мкл, с концентрацией ДНК-вектора 1 мкг/мкл, (плацебо);
в 3-й группе (KIII) - физраствором в объеме 200 мкл.
Биопсийные образцы отбирали через 72 часа после введения смеси генотерапевтических ДНК-векторов и плацебо. Взятие биопсии осуществляли после некропсии животных из участков инъекций в зоне введения смеси четырех генотерапевтических ДНК-векторов, несущих целевые гены: ANG, ANGPT1, VEGFA, HIF1α (зона I), генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо) (зона II), а также в зоне введения физраствора ( зона III), используя устройство для взятия биопсии кожи Epitheasy 3.5 (Medax SRL). Зону отбора биоптата предварительно промывали стерильным физиологическим раствором и анестезировали раствором лидокаина. Размер каждого биопсийного образца составлял около 10 куб. мм, масса - около 11 мг. Каждый образец помещали в буферный раствор, содержащий 50 мМ Трис-HCl рН 7.6, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА и 1 мМ фенилметилсульфонилфторид, и гомогенизировали до получения однородной суспензии. Полученную суспензию центрифугировали в течение 10 мин при 14000g. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевых белков, измерения и обработки результатов как это описано в примере 9 (количественное определение белка ANG), примере 10 (количественное определение белка ANGPT1), примере 11 (количественное определение белка VEGFA), примере 12 (количественное определение белка HIF1α). Графики, полученные в результате анализа, представлены на фиг. 14.
Из фигуры 14 следует, что в зоне инъекций в коже у животных (зона I), в которую вводилась смесь генотерапевтических векторов: генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-ANG, несущего целевой ген ANG, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-ANGPT1, несущего целевой ген ANGPT1, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-VEGFA, несущего целевой ген VEGFA, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- HIF1α, несущего целевой ген HIF1α, произошло увеличение количества белков ANG, ANGPT1, VEGFA и HIF1α по сравнению с зоной II (зона плацебо) и зоной III (интактная зона). Полученные результаты свидетельствуют об эффективности сочетанного применения генотерапевтических ДНК-векторов и подтверждает реализуемость способа применения для повышения уровня экспрессии целевых белков в тканях млекопитающих.
Пример 18.
Подтверждение эффективности генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-VEGFA, несущего ген VEGFA и реализуемости способа его применения для повышения уровня экспрессии белка VEGFA в клетках млекопитающих.
Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-VEGFA, несущего ген VEGFA оценивали изменение накопления мРНК целевого гена VEGFA в клетках эпителия почки собаки (MDCK) через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- VEGFA, несущим ген VEGFA человека.
Клетки эпителия почки собаки (MDCK) выращивали в среде DMEM (Gibco) с добавлением 10% сыворотки эмбрионов коров. Трансфекцию генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- VEGFA, несущим ген VEGFA человека и ДНК-вектором GDTT1.8NAS12, не несущим ген VEGFA человека (контороль), выделение РНК, реакцию обратной транскрипции, ПЦР амплификации и анализ данных проводили как описано в примере 5. В качестве референтного гена использовали ген бета-актина собаки (АСТ), приведенного в базе данных GenBank под номером AF484115.1. В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности генов VEGFA и ACT. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество ПЦР продуктов - кДНК генов VEGFA и ACT, полученных в результате амплификации, оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio-RadCFXManager 2.1. (Bio-Rad, USA).
Графики, полученные в результате анализа, представлены на фиг. 15.
Из фигуры 15 следует, что в результате трансфекции клеток эпителия почки собаки (MDCK) генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-VEGFA, уровень специфической мРНК гена VEGFA человека вырос многократно, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген VEGFA на уровне мРНК. Представленные результаты подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-VEGFA для повышения уровня экспрессии гена VEGFA в клетках млекопитающих.
Пример 19.
Штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-ANG или штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-ANGPT1 или штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-VEGFA или штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-HIF1α, несущий генотерапевтический ДНК-вектор, и способ его получения.
Конструирование штамма для наработки в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген, выбранный из группы генов: ANG, ANGPT1, VEGFA, HIF1α, а именно штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-ANG, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-ANGPT1, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-VEGFA, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-HIF1α, несущего генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-ANG, или GDTT1.8NAS12-ANGPT1, или GDTT1.8NAS12-VEGFA, или GDTT1.8NAS12-HIF1α соответственно для его наработки с возможностью селекции без использования антибиотиков заключается в получении электрокомпетентных клеток штамма Escherichia coli JM110-NAS с проведением электропорации этих клеток генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-ANG, или ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-ANGPT1, или ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-VEGFA, или ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-HIF1α, после чего клетки высеваются на чашки Петри с агаризованной селективной средой, содержащей дрожжевой экстракт, пептон, 6% сахарозы, а также 10 мкг/мл хлорамфеникола. При этом штамм Escherichia coli JM110-NAS для наработки генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 или генотерапевтических ДНК-векторов на его основе с возможностью положительной селекции без использования антибиотиков получали путем конструирования линейного фрагмента ДНК, содержащего регуляторный элемент RNA-in транспозона Tn10 для селекции без применения антибиотиков размером 64 п.н., ген левансахаразы sacB, продукт которого обеспечивает селекцию на сахарозо-содержащей среде размером 1422 п.н., ген устойчивости к хлорамфениколу catR, необходимый для отбора клонов штамма, в которых прошла гомологичная рекомбинация размером 763 п.н. и две гомологичные последовательности, обеспечивающие процесс гомологичной рекомбинации в области гена recA с одновременной его инактивацией размером 329 п.н. и 233 п.н., после чего проводили трансформацию клеток Escherichia coli путем электропорации и отбирали клоны, выжившие на среде, содержащей 10 мкг/мл хлорамфеникола.
Пример 20.
Способ масштабирования получения генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген, выбранный из группы генов: ANG, ANGPT1, VEGFA, HIF1α до промышленного масштаба.
Для подтверждения технологичности получения и возможности производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-ANG (SEQ ID №1), или GDTT1.8NAS12-ANGPT1 (SEQ ID №2), или GDTT1.8NAS12-VEGFA (SEQ ID №3), или GDTT1.8NAS12-HIF1α (SEQ ID №4), или проводили масштабную ферментацию штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-ANG, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-ANGPT1, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-VEGFA, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-HIF1α, каждый из которых содержит генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, несущий целевой ген, а именно ANG, или ANGPT1, или VEGFA, или HIF1α. Каждый штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-ANG, или Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-ANGPT1, или Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-VEGFA, или Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12- HIF1α получали на базе штамма Escherichia coli JM110-NAS (Genetic Diagnostics and Therapy 21 Ltd, Великобритания) по примеру 19 путем электропорации компетентных клеток этого штамма генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-ANG, или GDTT1.8NAS12-ANGPT1, или GDTT1.8NAS12-VEGFA, или GDTT1.8NAS12-HIF1α, несущим целевой ген, а именно, ANG, или ANGPT1, или VEGFA, или HIF1α с последующим высевом трансформированных клеток на чашки Петри с агаризованной селективной средой, содержащей дрожжевой экстракт, пептон, 6% сахарозы и отбором отдельных клонов.
Ферментацию полученного штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-ANG, несущего генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-ANG проводили в ферментере объемом 10 л с последующим выделением генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-ANG.
Для ферментации штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-ANG готовили среду, содержащую на 10 л: 100 г триптон, 50 г дрожжевой экстракт (Becton Dickinson, США), доводили водой до 8800 мл и автоклавировали при 121 0С 20 мин, затем добавляли 1200 мл 50% (вес/объем) сахарозы. Далее засевали в колбу затравочную культуру штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-ANG в объеме 100 мл. Инкубировали в шейкере-инкубаторе 16 ч при 30°С. Переносили затравочную культуру в ферментер Techfors S (Infors HT, Швейцария), растили до достижения стационарной фазы. Контроль осуществляли измерением оптической плотности культуры при длине волны 600 нм. Клетки осаждали центрифугированием 30 мин при 5000-10000 g. Супернатант удаляли, клеточную массу ресуспендировали в 10% по объему фосфатно-солевого буфера. Повторно центрифугировали 30 мин при 5000-10000g. Супернатант удаляли, к клеточной массе добавляли раствор 20 мМ TrisCl, 1 мМ ЭДТА, 200 г/л сахароза, рН 8,0 в объеме 1000 мл, тщательно перемешивали до образования гомогенной суспензии. Добавляли раствор яичного лизоцима до конечной концентрации 100мкг/мл. Инкубировали 20 мин на льду при бережном перемешивании. Далее, добавляли 2500 мл раствора 0,2 М NaOH, 10 г/л додецилсульфат натрия, инкубировали 10 мин на льду при бережном перемешивании, затем добавляли 3500 мл раствора 3M ацетат натрия, 2М уксусная кислота, рН 5-5,5, инкубировали 10 мин на льду при бережном перемешивании. Полученный образец центрифугировали 20-30 мин при 15000 g или более. Раствор аккуратно декантировали, от остатков осадка избавлялись фильтрацией через грубый фильтр (фильтровальную бумагу). Добавляли РНКазу А (Sigma, США) до конечной концентрации 20 нг/мл, инкубировали ночь 16 ч при комнатной температуре. Раствор центрифугировали 20-30 мин при 15000g, затем фильтровали через мембранный фильтр с порами 0,45 мкм (Millipore, США). Далее проводили ультрафильтрацию через мембрану размером отсечения 100кДа (Millipore, США) и разбавляли до начального объема буфером 25 мМ TrisCl, pH 7.0. Операцию повторяли три - четыре раза. Наносили раствор, на колонку с 250 мл сорбента DEAE sepharose HP (GE, США), уравновешенную раствором 25 мМ TrisCl, pH 7.0. После нанесения образца колонку промывали тремя объемами этого же раствора, а затем проводили элюцию генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-ANG линейным градиентом от раствора 25 мМ TrisCl, pH 7.0 до раствора 25 мМ TrisCl, pH 7.0, 1М NaCl в объеме пяти объемов колонки. Контроль элюции осуществляли по оптической плотности сходящего раствора при 260 нм. Хроматографические фракции, содержащие генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-ANG, объединяли и проводили гель-фильтрацию на сорбенте Superdex 200 (GE, США). Колонку уравновешивали фосфатно-солевым буфером. Контроль элюции осуществляли по оптической плотности сходящего раствора при 260 нм, фракции анализировали электрофорезом в агарозном геле. Фракции, содержащие генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-ANG объединяли и хранили при -20°С. Для оценки воспроизводимости техпроцесса обозначенные технологические операции повторяли пятикратно. Все технологические операции для штаммов Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-ANGPT1, или Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-VEGFA, или Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12- HIF1α проводили аналогичным образом.
Воспроизводимость техпроцесса и количественные характеристики выхода конечного продукта подтверждают технологичность получения и возможность производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-ANG, или GDTT1.8NAS12-ANGPT1, или GDTT1.8NAS12-VEGFA, или GDTT1.8NAS12-HIF1α.
Таким образом, задача, поставленная в данном изобретении,
а именно:
конструирование генотерапевтических ДНК-векторов для повышения уровня экспрессии группы генов ANG, ANGPT1, VEGFA, HIF1α, что необходимо для лечения заболеваний, характеризующихся нарушениями васкулогенеза и ангиогенеза, при гипоксии и ишемии различных тканей, в том числе, головного и спинного мозга, для стимуляции прорастания и образования новых кровеносных сосудов в поврежденных тканях, в том числе при диабете, онкологических и нейродегенеративных заболеваниях, путем повышения уровня экспрессии целевого гена ANG, или ANGPT1, или VEGFA, или HIF1α, в организме человека и животных,
при этом сочетающих в себе следующие свойства:
Эффективность повышения экспрессии целевых генов в эукариотических клетках за счет полученных генотерапевтических векторов с минимальным размером;
Возможность безопасного применения для генетической терапии человека и животных за счет отсутствия в составе генотерапевтического ДНК-вектора регуляторных элементов, представляющих собой нуклеотидные последовательности вирусных геномов и генов антибиотикорезистентности;
Технологичность получения и возможность наработки в штаммах в промышленных масштабах;
также задача по конструированию штаммов, несущих эти генотерапевтические ДНК-вектора для производства этих генотерапевтических ДНК-векторов решена, что подтверждается примерами:
для п. I - пример 1, 2, 3, 4, 5; 6; 7; 8; 9; 10; 11; 12; 13; 14; 15; 16; 17; 18
для п. II - пример 1, 2, 3, 4
для п. III и п. IV - пример 19, 20.
Промышленная применимость:
Все представленные выше примеры подтверждают промышленную применимость предлагаемого генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген, выбранный из группы генов: ген ANG, ген ANGPT1, ген VEGFA, ген HIF1α для повышения уровня экспрессии этих целевых генов, штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-ANG или Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-ANGPT1 или Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-VEGFA или Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12- HIF1α, несущего генотерапевтический ДНК-вектор, способа получения генотерапевтического ДНК-вектора, способа производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора.
Перечень сокращений
GDTT1.8NAS12 - вектор генотерапевтический, не содержащий последовательностей вирусных геномов и маркеров антибиотико-резистентности (vector therapeutic virus-antibiotic-free)
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
кДНК - комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота
РНК - рибонуклеиновая кислота
мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота
п.н. - пар нуклеотидов
ПЦР - полимеразная цепная реакция
мл - миллилитр, мкл - микролитр
куб. мм - кубический миллиметр
л - литр
мкг - микрограмм
мг - миллиграмм
г - грамм
мкМ - микромоль
мМ - миллимоль
мин - минута
сек - секунда
об/мин - обороты в минуту
нм - нанометр
см - сантиметр
мВт - милливатт
о.е. ф-относительная единица флуоресценции
РВС - фосфатно-солевой буфер
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>ГЕНЕТИК ДИАГНОСТИКС ЭНД ТЕРАПИ 21 ЛТД (GENETIC DIAGNOSTICS AND THERAPY
21 LTD), Общество с ограниченной ответственностью «РЕКОМБИТЕХ»
<120>ДНК-вектор GDTT1.8NAS12- ANGPT1 для повышения уровня экспрессии
целевого гена ANGPT1, способ его получения и применения
<160>37
<170>BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211>3033
<212>DNA
<213>HomoSapiens
<400> 1
ataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccagggaccgtaaaaagg 60
ccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgac 120
gctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctg 180
gaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcct 240
ttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcgg 300
tgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgct 360
gcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccac 420
tggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagt 480
tcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctc 540
tgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaacca 600
ccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggat 660
ctcaagaagatcctttgatcttttctacctcgaccgtgaggctccggtgcccgtcagtgg 720
gcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaacc 780
ggtgcctagagaaagtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgc 840
ctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctt 900
tttcgcaacgggtttgccgccagaacacaggtaagtgccgtgtgtggttcccgcgggcct 960
ggcctctttacgggttatggcccttgcgtgccttgaattacttccacgcccctggctgca 1020
gtacgtgattcttgatcccgagcttcgggttggaagtgggtgggagagttcgaggccttg 1080
cgcttaaggagccccttcgcctcgtgcttgagttgaggcctggcctaggcgctggggccg 1140
ccgcgtgcgaatctggtggcaccttcgcgcctgtctcgctgctttcgataagtctctagc 1200
catttaaaatttttgatgacctgctgcgacgctttttttctggcaagatagtcttgtaaa 1260
tgcgggccaagatctgcacactggtatttcggtttttggggccgcgggcggcgacggggc 1320
ccgtgcgtcccagcgcacatgttcggcgaggcggggcctgcgagcgcggccaccgagaat 1380
cggacgggggtagtctcaagctggccggcctgctctggtgcctggcctcgcgccgccgtg 1440
tatcgccccgccctgggcggcaaggctggcccggtcggcaccagttgcgtgagcggaaag 1500
atggccgcttcccggccctgctgcagggagctcaaaatggaggacgcggcgctcgggaga 1560
gcgggcgggtgagtcacccgcacaaaggaaaagggcctttccgtcctcagccgtcgcttc 1620
atgtgactccacggagtaccgggcgccgtccaggcacctcgattagttctcgagcttttg 1680
gagtacgtcgtctttaggttggggggaggggttttatgcgatggagtttccccacactga 1740
gtgggtggagactgaagttaggccagcttggcacttgatgtaattctccttggaatttgc 1800
cctttttgagtttggatcttggttcattctcaagcctcagacagtggttcaaagtttttt 1860
tcttccatttcaggtgtcgtgaaaactacccctaaaagccaggatccgatatcgtcgacc 1920
accatggtgatgggcctgggcgttttgttgttggtcttcgtgctgggtctgggtctgacc 1980
ccaccgaccctggctcaggataactccaggtacacacacttcctgacccagcactatgat 2040
gccaaaccacagggccgggatgacagatactgtgaaagcatcatgaggagacggggcctg 2100
acctcaccctgcaaagacatcaacacatttattcatggcaacaagcgcagcatcaaggcc 2160
atctgtgaaaacaagaatggaaaccctcacagagaaaacctaagaataagcaagtcttct 2220
ttccaggtcaccacttgcaagctacatggagggtccccctggcctccatgccagtaccga 2280
gccacagcggggttcagaaacgttgttgttgcttgtgaaaatggcttacctgtccacttg 2340
gatcagtcaattttccgtcgtccgtaaggtacctccggagcggccgctctagagctagcg 2400
acgtcgaattccctgtgacccctccccagtgcctctcctggccctggaagttgccactcc 2460
agtgcccaccagccttgtcctaataaaattaagttgcatcattttgtctgactaggtgtc 2520
cttctataatattatggggtggaggggggtggtatggagcaaggggcaagttgggaagac 2580
aacctgtagggcctgcggggtctattgggaaccaagctggagtgcagtggcacaatcttg 2640
gctcactgcaatctccgcctcctgggttcaagcgattctcctgcctcagcctcccgagtt 2700
gttgggattccaggcatgcatgaccaggctcagctaatttttgtttttttggtagagacg 2760
gggtttcaccatattggccaggctggtctccaactcctaatctcaggtgatctacccacc 2820
ttggcctcccaaattgctgggattacaggcgtgaaccactgctcccttccctgtccttac 2880
gcgtagaattggtaaagagagtcgtgtaaaatatcgagttcgcacatcttgttgtctgat 2940
tattgatttttggcgaaaccatttgatcatatgacaagatgtgtatctaccttaacttaa 3000
tgattttgat aaaaatcatt aactagtcca tgg 3033
<210> 2
<211>4086
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<400> 2
ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccagggac cgtaaaaagg 60
ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac 120
gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg 180
gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct 240
ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg 300
tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct 360
gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac 420
tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt 480
tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc 540
tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca 600
ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat 660
ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacct cgaccgtgag gctccggtgc ccgtcagtgg 720
gcagagcgca catcgcccac agtccccgag aagttggggg gaggggtcgg caattgaacc 780
ggtgcctaga gaaagtggcg cggggtaaac tgggaaagtg atgtcgtgta ctggctccgc 840
ctttttcccg agggtggggg agaaccgtat ataagtgcag tagtcgccgt gaacgttctt 900
tttcgcaacg ggtttgccgc cagaacacag gtaagtgccg tgtgtggttc ccgcgggcct 960
ggcctcttta cgggttatgg cccttgcgtg ccttgaatta cttccacgcc cctggctgca 1020
gtacgtgatt cttgatcccg agcttcgggt tggaagtggg tgggagagtt cgaggccttg 1080
cgcttaagga gccccttcgc ctcgtgcttg agttgaggcc tggcctaggc gctggggccg 1140
ccgcgtgcga atctggtggc accttcgcgc ctgtctcgct gctttcgata agtctctagc 1200
catttaaaat ttttgatgac ctgctgcgac gctttttttc tggcaagata gtcttgtaaa 1260
tgcgggccaa gatctgcaca ctggtatttc ggtttttggg gccgcgggcg gcgacggggc 1320
ccgtgcgtcc cagcgcacat gttcggcgag gcggggcctg cgagcgcggc caccgagaat 1380
cggacggggg tagtctcaag ctggccggcc tgctctggtg cctggcctcg cgccgccgtg 1440
tatcgccccg ccctgggcgg caaggctggc ccggtcggca ccagttgcgt gagcggaaag 1500
atggccgctt cccggccctg ctgcagggag ctcaaaatgg aggacgcggc gctcgggaga 1560
gcgggcgggt gagtcacccg cacaaaggaa aagggccttt ccgtcctcag ccgtcgcttc 1620
atgtgactcc acggagtacc gggcgccgtc caggcacctc gattagttct cgagcttttg 1680
gagtacgtcg tctttaggtt ggggggaggg gttttatgcg atggagtttc cccacactga 1740
gtgggtggag actgaagtta ggccagcttg gcacttgatg taattctcct tggaatttgc 1800
cctttttgag tttggatctt ggttcattct caagcctcag acagtggttc aaagtttttt 1860
tcttccattt caggtgtcgt gaaaactacc cctaaaagcc aggatccgat atcgtcgacc 1920
accatgacag ttttcctttc ctttgctttc ctcgctgcca ttctgactca catagggtgc 1980
agcaatcagc gccgaagtcc agaaaacagt gggagaagat ataaccggat tcaacatggg 2040
caatgtgcct acactttcat tcttccagaa cacgatggca actgtcgtga gagtacgaca 2100
gaccagtaca acacaaacgc tctgcagaga gatgctccac acgtggaacc ggatttctct 2160
tcccagaaac ttcaacatct ggaacatgtg atggaaaatt atactcagtg gctgcaaaaa 2220
cttgagaatt acattgtgga aaacatgaag tcggagatgg cccagataca gcagaatgca 2280
gttcagaacc acacggctac catgctggag ataggaacca gcctcctctc tcagactgca 2340
gagcagacca gaaagctgac agatgttgag acccaggtac taaatcaaac ttctcgactt 2400
gagatacagc tgctggagaa ttcattatcc acctacaagc tagagaagca acttcttcaa 2460
cagacaaatg aaatcttgaa gatccatgaa aaaaacagtt tattagaaca taaaatctta 2520
gaaatggaag gaaaacacaa ggaagagttg gacaccttaa aggaagagaa agagaacctt 2580
caaggcttgg ttactcgtca aacatatata atccaggagc tggaaaagca attaaacaga 2640
gctaccacca acaacagtgt ccttcagaag cagcaactgg agctgatgga cacagtccac 2700
aaccttgtca atctttgcac taaagaaggt gttttactaa agggaggaaa aagagaggaa 2760
gagaaaccat ttagagactg tgcagatgta tatcaagctg gttttaataa aagtggaatc 2820
tacactattt atattaataa tatgccagaa cccaaaaagg tgttttgcaa tatggatgtc 2880
aatgggggag gttggactgt aatacaacat cgtgaagatg gaagtctaga tttccaaaga 2940
ggctggaagg aatataaaat gggttttgga aatccctccg gtgaatattg gctggggaat 3000
gagtttattt ttgccattac cagtcagagg cagtacatgc taagaattga gttaatggac 3060
tgggaaggga accgagccta ttcacagtat gacagattcc acataggaaa tgaaaagcaa 3120
aactataggt tgtatttaaa aggtcacact gggacagcag gaaaacagag cagcctgatc 3180
ttacacggtg ctgatttcag cactaaagat gctgataatg acaactgtat gtgcaaatgt 3240
gccctcatgt taacaggagg atggtggttt gatgcttgtg gcccctccaa tctaaatgga 3300
atgttctata ctgcgggaca aaaccatgga aaactgaatg ggataaagtg gcactacttc 3360
aaagggccca gttactcctt acgttccaca actatgatga ttcgaccttt agatttttga 3420
ggtacctccg gagcggccgc tctagagcta gcgacgtcga attccctgtg acccctcccc 3480
agtgcctctc ctggccctgg aagttgccac tccagtgccc accagccttg tcctaataaa 3540
attaagttgc atcattttgt ctgactaggt gtccttctat aatattatgg ggtggagggg 3600
ggtggtatgg agcaaggggc aagttgggaa gacaacctgt agggcctgcg gggtctattg 3660
ggaaccaagc tggagtgcag tggcacaatc ttggctcact gcaatctccg cctcctgggt 3720
tcaagcgatt ctcctgcctc agcctcccga gttgttggga ttccaggcat gcatgaccag 3780
gctcagctaa tttttgtttt tttggtagag acggggtttc accatattgg ccaggctggt 3840
ctccaactcc taatctcagg tgatctaccc accttggcct cccaaattgc tgggattaca 3900
ggcgtgaacc actgctccct tccctgtcct tacgcgtaga attggtaaag agagtcgtgt 3960
aaaatatcga gttcgcacat cttgttgtct gattattgat ttttggcgaa accatttgat 4020
catatgacaa gatgtgtatc taccttaact taatgatttt gataaaaatc attaactagt 4080
ccatgg 4086
<210> 3
<211>3821
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<400> 3
ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccagggac cgtaaaaagg 60
ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac 120
gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg 180
gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct 240
ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg 300
tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct 360
gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac 420
tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt 480
tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc 540
tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca 600
ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat 660
ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacct cgaccgtgag gctccggtgc ccgtcagtgg 720
gcagagcgca catcgcccac agtccccgag aagttggggg gaggggtcgg caattgaacc 780
ggtgcctaga gaaagtggcg cggggtaaac tgggaaagtg atgtcgtgta ctggctccgc 840
ctttttcccg agggtggggg agaaccgtat ataagtgcag tagtcgccgt gaacgttctt 900
tttcgcaacg ggtttgccgc cagaacacag gtaagtgccg tgtgtggttc ccgcgggcct 960
ggcctcttta cgggttatgg cccttgcgtg ccttgaatta cttccacgcc cctggctgca 1020
gtacgtgatt cttgatcccg agcttcgggt tggaagtggg tgggagagtt cgaggccttg 1080
cgcttaagga gccccttcgc ctcgtgcttg agttgaggcc tggcctaggc gctggggccg 1140
ccgcgtgcga atctggtggc accttcgcgc ctgtctcgct gctttcgata agtctctagc 1200
catttaaaat ttttgatgac ctgctgcgac gctttttttc tggcaagata gtcttgtaaa 1260
tgcgggccaa gatctgcaca ctggtatttc ggtttttggg gccgcgggcg gcgacggggc 1320
ccgtgcgtcc cagcgcacat gttcggcgag gcggggcctg cgagcgcggc caccgagaat 1380
cggacggggg tagtctcaag ctggccggcc tgctctggtg cctggcctcg cgccgccgtg 1440
tatcgccccg ccctgggcgg caaggctggc ccggtcggca ccagttgcgt gagcggaaag 1500
atggccgctt cccggccctg ctgcagggag ctcaaaatgg aggacgcggc gctcgggaga 1560
gcgggcgggt gagtcacccg cacaaaggaa aagggccttt ccgtcctcag ccgtcgcttc 1620
atgtgactcc acggagtacc gggcgccgtc caggcacctc gattagttct cgagcttttg 1680
gagtacgtcg tctttaggtt ggggggaggg gttttatgcg atggagtttc cccacactga 1740
gtgggtggag actgaagtta ggccagcttg gcacttgatg taattctcct tggaatttgc 1800
cctttttgag tttggatctt ggttcattct caagcctcag acagtggttc aaagtttttt 1860
tcttccattt caggtgtcgt gaaaactacc cctaaaagcc aggatccacc atgacggaca 1920
gacagacaga caccgccccc agccccagct accacctcct ccccggccgg cggcggacag 1980
tggacgcggc ggcgagccgc gggcaggggc cggagcccgc gcccggaggc ggggtggagg 2040
gggtcggggc tcgcggcgtc gcactgaaac ttttcgtcca acttctgggc tgttctcgct 2100
tcggaggagc cgtggtccgc gcgggggaag ccgagccgag cggagccgcg agaagtgcta 2160
gctcgggccg ggaggagccg cagccggagg agggggagga ggaagaagag aaggaagagg 2220
agagggggcc gcagtggcga ctcggcgctc ggaagccggg ctcatggacg ggtgaggcgg 2280
cggtgtgcgc agacagtgct ccagccgcgc gcgctcccca ggccctggcc cgggcctcgg 2340
gccggggagg aagagtagct cgccgaggcg ccgaggagag cgggccgccc cacagcccga 2400
gccggagagg gagcgcgagc cgcgccggcc ccggtcgggc ctccgaaacc atgaactttc 2460
tgctgtcttg ggtgcattgg agccttgcct tgctgctcta cctccaccat gccaagtggt 2520
cccaggctgc acccatggca gaaggaggag ggcagaatca tcacgaagtg gtgaagttca 2580
tggatgtcta tcagcgcagc tactgccatc caatcgagac cctggtggac atcttccagg 2640
agtaccctga tgagatcgag tacatcttca agccatcctg tgtgcccctg atgcgatgcg 2700
ggggctgctg caatgacgag ggcctggagt gtgtgcccac tgaggagtcc aacatcacca 2760
tgcagattat gcggatcaaa cctcaccaag gccagcacat aggagagatg agcttcctac 2820
agcacaacaa atgtgaatgc agaccaaaga aagatagagc aagacaagaa aaaaaatcag 2880
ttcgaggaaa gggaaagggg caaaaacgaa agcgcaagaa atcccggtat aagtcctgga 2940
gcgtgtacgt tggtgcccgc tgctgtctaa tgccctggag cctccctggc ccccatccct 3000
gtgggccttg ctcagagcgg agaaagcatt tgtttgtaca agatccgcag acgtgtaaat 3060
gttcctgcaa aaacacagac tcgcgttgca aggcgaggca gcttgagtta aacgaacgta 3120
cttgcagatg tgacaagccg aggcggtgaa agcttggtac ctccggagcg gccgctctag 3180
agctagcgac gtcgaattcc ctgtgacccc tccccagtgc ctctcctggc cctggaagtt 3240
gccactccag tgcccaccag ccttgtccta ataaaattaa gttgcatcat tttgtctgac 3300
taggtgtcct tctataatat tatggggtgg aggggggtgg tatggagcaa ggggcaagtt 3360
gggaagacaa cctgtagggc ctgcggggtc tattgggaac caagctggag tgcagtggca 3420
caatcttggc tcactgcaat ctccgcctcc tgggttcaag cgattctcct gcctcagcct 3480
cccgagttgt tgggattcca ggcatgcatg accaggctca gctaattttt gtttttttgg 3540
tagagacggg gtttcaccat attggccagg ctggtctcca actcctaatc tcaggtgatc 3600
tacccacctt ggcctcccaa attgctggga ttacaggcgt gaaccactgc tcccttccct 3660
gtccttacgc gtagaattgg taaagagagt cgtgtaaaat atcgagttcg cacatcttgt 3720
tgtctgatta ttgatttttg gcgaaaccat ttgatcatat gacaagatgt gtatctacct 3780
taacttaatg attttgataa aaatcattaa ctagtccatg g 3821
<210> 4
<211>5057
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<400> 4
ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccagggac cgtaaaaagg 60
ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac 120
gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg 180
gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct 240
ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg 300
tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct 360
gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac 420
tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt 480
tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc 540
tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca 600
ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat 660
ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacct cgaccgtgag gctccggtgc ccgtcagtgg 720
gcagagcgca catcgcccac agtccccgag aagttggggg gaggggtcgg caattgaacc 780
ggtgcctaga gaaagtggcg cggggtaaac tgggaaagtg atgtcgtgta ctggctccgc 840
ctttttcccg agggtggggg agaaccgtat ataagtgcag tagtcgccgt gaacgttctt 900
tttcgcaacg ggtttgccgc cagaacacag gtaagtgccg tgtgtggttc ccgcgggcct 960
ggcctcttta cgggttatgg cccttgcgtg ccttgaatta cttccacgcc cctggctgca 1020
gtacgtgatt cttgatcccg agcttcgggt tggaagtggg tgggagagtt cgaggccttg 1080
cgcttaagga gccccttcgc ctcgtgcttg agttgaggcc tggcctaggc gctggggccg 1140
ccgcgtgcga atctggtggc accttcgcgc ctgtctcgct gctttcgata agtctctagc 1200
catttaaaat ttttgatgac ctgctgcgac gctttttttc tggcaagata gtcttgtaaa 1260
tgcgggccaa gatctgcaca ctggtatttc ggtttttggg gccgcgggcg gcgacggggc 1320
ccgtgcgtcc cagcgcacat gttcggcgag gcggggcctg cgagcgcggc caccgagaat 1380
cggacggggg tagtctcaag ctggccggcc tgctctggtg cctggcctcg cgccgccgtg 1440
tatcgccccg ccctgggcgg caaggctggc ccggtcggca ccagttgcgt gagcggaaag 1500
atggccgctt cccggccctg ctgcagggag ctcaaaatgg aggacgcggc gctcgggaga 1560
gcgggcgggt gagtcacccg cacaaaggaa aagggccttt ccgtcctcag ccgtcgcttc 1620
atgtgactcc acggagtacc gggcgccgtc caggcacctc gattagttct cgagcttttg 1680
gagtacgtcg tctttaggtt ggggggaggg gttttatgcg atggagtttc cccacactga 1740
gtgggtggag actgaagtta ggccagcttg gcacttgatg taattctcct tggaatttgc 1800
cctttttgag tttggatctt ggttcattct caagcctcag acagtggttc aaagtttttt 1860
tcttccattt caggtgtcgt gaaaactacc cctaaaagcc aggatccacc atggagggcg 1920
ccggcggcgc gaacgacaag aaaaagataa gttctgaacg tcgaaaagaa aagtctcgag 1980
atgcagccag atctcggcga agtaaagaat ctgaagtttt ttatgagctt gctcatcagt 2040
tgccacttcc acataatgtg agttcgcatc ttgataaggc ctctgtgatg aggcttacca 2100
tcagctattt gcgtgtgagg aaacttctgg atgctggtga tttggatatt gaagatgaca 2160
tgaaagcaca gatgaattgc ttttatttga aagccttgga tggttttgtt atggttctca 2220
cagatgatgg tgacatgatt tacatttctg ataatgtgaa caaatacatg ggattaactc 2280
agtttgaact aactggacac agtgtgtttg attttactca tccatgtgac catgaggaaa 2340
tgagagaaat gcttacacac agaaatggcc ttgtgaaaaa gggtaaagaa caaaacacac 2400
agcgaagctt ttttctcaga atgaagtgta ccctaactag ccgaggaaga actatgaaca 2460
taaagtctgc aacatggaag gtattgcact gcacaggcca cattcacgta tatgatacca 2520
acagtaacca acctcagtgt gggtataaga aaccacctat gacctgcttg gtgctgattt 2580
gtgaacccat tcctcaccca tcaaatattg aaattccttt agatagcaag actttcctca 2640
gtcgacacag cctggatatg aaattttctt attgtgatga aagaattacc gaattgatgg 2700
gatatgagcc agaagaactt ttaggccgct caatttatga atattatcat gctttggact 2760
ctgatcatct gaccaaaact catcatgata tgtttactaa aggacaagtc accacaggac 2820
agtacaggat gcttgccaaa agaggtggat atgtctgggt tgaaactcaa gcaactgtca 2880
tatataacac caagaattct caaccacagt gcattgtatg tgtgaattac gttgtgagtg 2940
gtattattca gcacgacttg attttctccc ttcaacaaac agaatgtgtc cttaaaccgg 3000
ttgaatcttc agatatgaaa atgactcagc tattcaccaa agttgaatca gaagatacaa 3060
gtagcctctt tgacaaactt aagaaggaac ctgatgcttt aactttgctg gccccagccg 3120
ctggagacac aatcatatct ttagattttg gcagcaacga cacagaaact gatgaccagc 3180
aacttgagga agtaccatta tataatgatg taatgctccc ctcacccaac gaaaaattac 3240
agaatataaa tttggcaatg tctccattac ccaccgctga aacgccaaag ccacttcgaa 3300
gtagtgctga ccctgcactc aatcaagaag ttgcattaaa attagaacca aatccagagt 3360
cactggaact ttcttttacc atgccccaga ttcaggatca gacacctagt ccttccgatg 3420
gaagcactag acaaagttca cctgagccta atagtcccag tgaatattgt ttttatgtgg 3480
atagtgatat ggtcaatgaa ttcaagttgg aattggtaga aaaacttttt gctgaagaca 3540
cagaagcaaa gaacccattt tctactcagg acacagattt agacttggag atgttagctc 3600
cctatatccc aatggatgat gacttccagt tacgttcctt cgatcagttg tcaccattag 3660
aaagcagttc cgcaagccct gaaagcgcaa gtcctcaaag cacagttaca gtattccagc 3720
agactcaaat acaagaacct actgctaatg ccaccactac cactgccacc actgatgaat 3780
taaaaacagt gacaaaagac cgtatggaag acattaaaat attgattgca tctccatctc 3840
ctacccacat acataaagaa actacaagtg ccacatcatc accatataga gatactcaaa 3900
gtcggacagc ctcaccaaac agagcaggaa aaggagtcat agaacagaca gaaaaatctc 3960
atccaagaag ccctaacgtg ttatctgtcg ctttgagtca aagaactaca gttcctgagg 4020
aagaactaaa tccaaagata ctagctttgc agaatgctca gagaaagcga aaaatggaac 4080
atgatggttc actttttcaa gcagtaggaa ttggaacatt attacagcag ccagacgatc 4140
atgcagctac tacatcactt tcttggaaac gtgtaaaagg atgcaaatct agtgaacaga 4200
atggaatgga gcaaaagaca attattttaa taccctctga tttagcatgt agactgctgg 4260
ggcaatcaat ggatgaaagt ggattaccac agctgaccag ttatgattgt gaagttaatg 4320
ctcctataca aggcagcaga aacctactgc agggtgaaga attactcaga gctttggatc 4380
aagttaactg aggtacctcc ggagcggccg ctctagagct agcgacgtcg aattccctgt 4440
gacccctccc cagtgcctct cctggccctg gaagttgcca ctccagtgcc caccagcctt 4500
gtcctaataa aattaagttg catcattttg tctgactagg tgtccttcta taatattatg 4560
gggtggaggg gggtggtatg gagcaagggg caagttggga agacaacctg tagggcctgc 4620
ggggtctatt gggaaccaag ctggagtgca gtggcacaat cttggctcac tgcaatctcc 4680
gcctcctggg ttcaagcgat tctcctgcct cagcctcccg agttgttggg attccaggca 4740
tgcatgacca ggctcagcta atttttgttt ttttggtaga gacggggttt caccatattg 4800
gccaggctgg tctccaactc ctaatctcag gtgatctacc caccttggcc tcccaaattg 4860
ctgggattac aggcgtgaac cactgctccc ttccctgtcc ttacgcgtag aattggtaaa 4920
gagagtcgtg taaaatatcg agttcgcaca tcttgttgtc tgattattga tttttggcga 4980
aaccatttga tcatatgaca agatgtgtat ctaccttaac ttaatgattt tgataaaaat 5040
cattaactagtccatgg 5057
<210>5
<211> 42
<212>DNA
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223> Олигонуклеотид UCori-Bam
<400> 5
ggatccagatctactcgaggtagaaaagatcaaaggatcttc 42
<210>6
<211>31
<212>DNA
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223> Олигонуклеотид UCori-Nco
<400>6
agtccatggataacgcaggaaagaacatgtg31
<210>7
<211>31
<212>DNA
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223> Олигонуклеотид hGH-F
<400>7
aggatccgaattccctgtgacccctccccag31
<210>8
<211>40
<212>DNA
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>Олигонуклеотид hGH-R
<400>8
ctctttaccaattctacgcgtaaggacagggaagggagca40
<210>9
<211> 40
<212>DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Олигонуклеотид RO-F
<400>9
cttccctgtccttacgcgtagaattggtaaagagagtcgt40
<210>10
<211> 41
<212>DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Олигонуклеотид RO-R
<400>10
ccgtagaaaactagttaatgatttttatcaaaatcattaag41
<210>11
<211> 49
<212>DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Олигонуклеотид RO-1
<400>11
gaattggtaaagagagtcgtgtaaaatatcgagttcgcacatcttgttg49
<210>12
<211> 47
<212>DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Олигонуклеотид RO-2
<400> 12
gatttttggc gaaaccattt gatcatatga caagatgtgt atctacc 47
<210>13
<211> 47
<212>DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Олигонуклеотид RO-3
<400> 13
atgatttttatcaaaatcattaagttaaggtagatacacatcttgtc 47
<210>14
<211>34
<212>DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Олигонуклеотид Kan-F
<400> 14
aaatcattaactagttttctacggggtctgacgc34
<210>15
<211>33
<212>DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Олигонуклеотид Kan-R
<400> 15
cagccatggactagtggtggcacttttcgggga33
<210>16
<211>30
<212>DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Олигонуклеотид MCS1
<400> 16
gatccgatatcgtcgacaagcttggtacct30
<210>17
<211>20
<212>DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Олигонуклеотид MCS2
<400> 17
caagcttgtcgacgatatcg20
<210>18
<211>32
<212>DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Олигонуклеотид MCS3
<400> 18
ccggagcggccgctctagagctagcgacgtcg32
<210> 19
<211>42
<212>DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Олигонуклеотид MCS4
<400> 19
aattcgacgtcgctagctctagagcggccgctccggaggtac42
<210>20
<211>25
<212>DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Олигонуклеотид EF1-Xho
<400>20
atctcgagcgtgaggctccggtgcc25
<210>21
<211>29
<212>DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Олигонуклеотид EF1-R
<400>21
tcggatcctggcttttaggggtagttttc29
<210>22
<211>34
<212>DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Олигонуклеотид AN_F
<400>22
tttgtcgaccaccatggtgatgggcctgggcgtt34
<210>23
<211>33
<212>DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Олигонуклеотид AN_R
<400>23
aatggtaccttacggacgacggaaaattgactg33
<210> 24
<211>20
<212>DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Олигонуклеотид AN_rtF
<400> 24
cgaccctggctcaggataac 20
<210> 25
<211> 20
<212>DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Олигонуклеотид AN_rtR
<400> 25
tgtctttgcagggtgaggtc 20
<210> 26
<211>41
<212>DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Олигонуклеотид ANPT_F
<400> 26
tttgtcgaccaccatgacagttttcctttcctttgctttcc 41
<210> 27
<211> 41
<212>DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Олигонуклеотид ANPT_R
<400> 27
aatggtacct caaaaatcta aaggtcgaat catcatagtt g 41
<210> 28
<211>20
<212>DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Олигонуклеотид ANPT_rtF
<400> 28
tgcagagagatgctccacac20
<210> 29
<211>20
<212>DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Олигонуклеотид ANPT_rtR
<400> 29
tgtatctgggccatctccga20
<210>30
<211>38
<212>DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Олигонуклеотид VEG_F
<400> 30
gggggatccaccatgacggacagacagacagacaccgc 38
<210>31
<211>34
<212>DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Олигонуклеотид VEG_R
<400> 31
tttaagctttcaccgcctcggcttgtcacatctg 34
<210>32
<211>20
<212>DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Олигонуклеотид VEG_rtF
<400> 32
cttgccttgctgctctacct20
<210>33
<211>20
<212>DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Олигонуклеотид VEG_rtR
<400> 33
gcagtagctg cgctgataga20
<210> 34
<211>32
<212>DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Олигонуклеотид HIF_F
<400> 34
aggatccacc atggagggcg ccggcggcgc ga32
<210> 35
<211>42
<212>DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Олигонуклеотид HIF_R
<400> 35
aatggtacctcagttaacttgatccaaagctctgagtaattc42
<210> 36
<211>20
<212>DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Олигонуклеотид HIF_rtF
<400> 36
ttttggcagcaacgacacag20
<210> 37
<211> 20
<212>DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Олигонуклеотид HIF_rtR
<400> 37
gtgcagggtcagcactactt20
<---
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению генно-инженерных терапевтических препаратов, и может быть использовано в медицине для повышения уровня экспрессии целевого гена ANGPT1 в организме человека и животных. Сконструирован ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-ANGPT1 размером 4086 п.н. с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 2 и общей структурой, изображенной на фиг.1B. Изобретение обеспечивает достижение терапевтического эффекта путем введения генотерапевтического ДНК-вектора с целевым геном ANGPT1 в клетки организма животных и человека, характеризующиеся сниженной или недостаточной экспрессией белка, кодируемого данным геном. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 15 ил., 20 пр.
1. ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-ANGPT1 для повышения уровня экспрессии целевого гена ANGPT1 в организме человека и животных размером 4086 п.н. с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 2 и общей структурой, изображенной на фиг.1B.
2. ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-ANGPT1 по п.1, отличающийся тем, что в качестве структурных элементов используют нуклеотидные последовательности, которые не являются генами антибиотикорезистентности, вирусными генами и регуляторными элементами вирусных геномов, обеспечивая возможность его безопасного применения для человека и животных.
3. Способ применения ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-ANGPT1 по п. 1 для повышения уровня экспрессии целевого гена ANGPT1 в организме человека и животных, заключающийся в трансфекции ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-ANGPT1, SEQ ID NO: 2, клеток органов и тканей пациента или животного, и/или во введении в органы и ткани пациента или животного аутологичных клеток этого пациента или животного, трансфицированных ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-ANGPT1, SEQ ID NO: 2, и/или во введении в органы и ткани пациента или животного ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-ANGPT1, SEQ ID NO: 2, или в сочетании обозначенных способов.
