Настоящая заявка испрашивает приоритет в соответствии с разделом 119(e) предварительной заявки на патент США No. 62/854226, поданной 29 мая 2019 года с названием «EpiAging; Новая экосистема для управления здоровым старением», содержание которой включено в настоящее изобретение путем ссылки.
Список последовательностей
Настоящая заявка содержит Список последовательностей, который был представлен в электронном виде в формате ASCII и полностью включен в настоящее изобретение путем ссылки. Указанная копия ASCII, созданная 28 мая 2020 года, называется TPC57505_Seq List_ST25.txt и имеет размер 4096 байт.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к эпигенетике и сигнатурам метилирования ДНК в ДНК человека в целом и, в частности, к способам определения эпигенетического старения индивидуума и управления здоровым старением на основе сигнатур метилирования ДНК. Более конкретно, настоящее изобретение относится к способу, использующему сигнатуры метилирования ДНК, для молекулярной диагностики, управления здоровьем и изменения образа жизни для персонализированного здорового старения с помощью реализованной в приложении цифровой технологии.
Уровень техники изобретения
Под хронологическим возрастом понимается количество лет, в течение которых человек был жив, в то время как биологический возраст, который также называется физиологическим возрастом, означает, сколько лет человеку кажется на вид. Поскольку люди стареют с разной скоростью, сложно определить биологический возраст человека. Некоторые «выглядят» и «чувствуют себя» старше своего хронологического возраста, в то время как другие выглядят моложе своего хронологического возраста. Хотя в целом хронологический возраст человека коррелирует с биологическим возрастом, это не всегда так. Биологический возраст является лучшим показателем здоровья, благополучия и продолжительности жизни человека, чем хронологический возраст. Как эквивалент физиологического возраста, биологический возраст является отражением и зависит от нескольких факторов образа жизни, включая рацион питания, физические упражнения, привычки сна и т.д. Однако оценка биологического возраста человека остается сложной задачей. Важно отметить, что необходимость определения истинного биологического возраста вызвана мыслью о том, что это может привести к испытаниям и разработке технологий вмешательств, которые замедлят скорость биологического старения. В течение последних десятилетий были предприняты значительные усилия для определения различных параметров, которые могут предсказать биологическое старение и продолжительность жизни, таких как показатели дряхлости (Ferrucci et al., 2002), поседение волос, старение кожи (Yanai, Budovsky, Tacutu, & Fraifeld, 2011), уровни различных видов лейкоцитов. Однако было обнаружено, что большинство этих маркеров не дают никаких преимуществ перед знанием хронологического возраста.
Совсем недавно достижения в области молекулярной биологии позволили ввести новые молекулярные показатели старения. «Длина теломер» (Monaghan, 2010) и «метаболические показатели» (Hertel et al., 2016) использовались для прогнозирования биологического возраста. Однако, хотя длина теломер меняется с возрастом, корреляция между хронологическим возрастом и длиной теломер оказалась слабой, а предсказательная сила продолжительности жизни была низкой. Кроме того, метод измерения длины теломер сложен с технической точки зрения, а технические ошибки затрудняют определение возраста. Еще один показатель, который использовался, - это «показатель метаболического возраста», который измеряет различные метаболиты в моче (Hertel et al., 2016). Эта технология требует сложного способа измерения различных ингредиентов мочи.
Смена парадигмы в поисках маркеров биологического возраста произошла с открытием Хорватом «эпигенетических часов» (Horvath, 2013). Эти часы основаны на измерении часов метилирования ДНК в 353 положениях CG в ДНК. Было обнаружено, что степень метилирования генов, включенных в часы метилирования, коррелирует с хронологическим возрастом человека лучше, чем любой предыдущий показатель, включая длину теломер и другие показатели старения волос, кожи, дряхлости и т.д. Что еще более важно, хотя для большинства людей часы метилирования ДНК очень близки к хронологическим часам, у некоторых людей эти часы идут быстрее, чем хронологические часы, так что эпигенетический возраст человека может быть намного старше его хронологических часов. Недавние исследования показали, что такой прогресс в часах метилирования ДНК предсказывает раннюю смерть по разным причинам. Недавний анализ 13 различных исследований с участием 13089 человек показал, что эпигенетические часы могут предсказывать смертность от всех причин независимо от нескольких факторов риска, таких как возраст, индекс массы тела (ИМТ), образование, курение, физическая активность, употребление алкоголя, курение и некоторые сопутствующие заболевания (Chen et al., 2016).
В недавнем обзоре Jylhävä, Pedersen и Hägg в EBiomedicine сделан вывод, что: «Хотя длина теломер является наиболее хорошо изученным предиктором биологического возраста, но появляется много новых предикторов, эпигенетические часы в настоящее время являются лучшим предиктором биологического возраста, поскольку они хорошо коррелируют с возрастом и прогнозируют смертность (Jylhava, Pedersen, & Hagg, 2017). Техническая погрешность в измерении длины теломер также может способствовать отсутствию согласующихся результатов». Авторы резюмируют, что «В кратком изложении, показатель длина теломер хорошо валидирован, но имеет низкую предсказательную силу. Составной биомаркер недостаточно валидирован, но может быть более сильным предиктором, чем длина теломер, как и метаболический показатель возраста. Эпигенетические часы в настоящее время работают лучше всего, учитывая оба аспекта (Jylhava et al., 2017)».
Сравнение длины теломер и эпигенетических часов в качестве показателей биологического возраста в Берлинском исследовании старения II, в котором участвовало 1895 человек, проведенном Валентином Максом Веттеретом и соавторами, показало, что, хотя «как описано ранее, длина теломер в младшей возрастной группе была значимо короче, чем в старшей возрастной группе в когорте BASE-II, длина теломер и хронологический возраст очень слабо отрицательно коррелированы в BASE-II (Rs 2 = 0,013)». В отличие от этого, это исследование показало, что «наши результаты показали положительную и значимую корреляцию между оценкой возраста по метилированию ДНК (эпигенетические часы) и хронологическим возрастом R2sRs2 = 0,47), которая сохраняется после поправки на независимые переменные (пол, распределение лейкоцитов, употребление алкоголя и курение)». Авторы приходят к выводу, что: «Таким образом, как и ожидалось, мы обнаружили, что возраст ДНК является гораздо более точным показателем хронологического возраста, чем длина теломер (Vetter et al., 2018)».
В шотландском исследовании двух возрастных когорт при комбинированном когортном анализе было обнаружено, что длина теломер объясняла 2,8% вариации в возрасте, в то время как эпигенетические часы объясняли 34,5% вариации в возрасте. В том же исследовании, также в комбинированном когортном анализе, увеличение исходного эпигенетического возраста на одно стандартное отклонение было связано с повышением риска смертности на 25%, в то время как в той же модели увеличение на одно стандартное отклонение исходной длины теломер было независимо связано со снижением риска смертности на 11% (P <0,047) (Marioni et al., 2018).
Хотя становится ясно, что «эпигенетические часы» являются наиболее точным показателем биологического возраста на сегодняшний день, доступные тесты требуют тестирования большого количества сайтов с использованием крови, которая является инвазивным и дорогостоящим образцом, что неприменимо для широкомасштабного использование пациентами по своей инициативе. Хотя доступные способы подходят для научных и клинических исследований, они не подходят для ориентированного на потребителя применения этого теста. Таким образом, существует потребность в точном, надежном, высокопроизводительном и неинвазивном тесте.
Настоящее изобретение относится к решению данной проблемы в форме системы интеграции точного, надежного, основанного на слюне «теста EpiAging» с использованием новых сайтов CG в рамках всей экосистемы здоровья для самообучения, самостоятельного регулируемого здорового старения с использованием выполняемого потребителем доступного ему повторяющегося тестирование эпигенетических часов, интегрированных с машиночитаемым носителем, также называемой приложением (App), которое обеспечивает сбор данных и обмен данными с потребителем, совместное использование данных и технологии машинного обучения. Существующие в настоящее время способы являются дорогостоящими (требуют анализа метилирования ДНК для многих сайтов CG в разных областях генома), инвазивны (используют кровь), автономны и не дают никаких указаний по улучшению возрастных оценок. Хотя в медицинской литературе даются общие советы о поведении, которое оказывает положительное влияние на здоровье, точная персонализированная комбинация изменений образа жизни, которая может быть полезна для конкретного человека, неизвестна. Настоящее изобретение относится к системе, которая объединяет выполняемый потребителем «тест на возраст по метилированию ДНК» с использованием слюны с управляемой приложением средой управления здоровьем и образом жизни, которая сочетает в себе обмен данными, машинное обучение и персонализацию способов вмешательства для обеспечения здорового образа жизни, управляемой потребителем через приложение. Данные полностью скрыты и передаются только потребителям и никаким другим сторонним лицам. Стимул для потребителя делиться данными заключается в том, что он/она получает более качественные советы по улучшению своего здоровья, участвуя в сообществе обмена, таким образом, выгода от обмена данными доставляется потребителю динамично и периодически за счет получения более высокого качества оценки образа жизни и рекомендаций по его улучшению.
Задачи изобретения
Основная задача настоящего изобретения относится к способу вычисления биологического возраста субъекта, включающему в себя этапы извлечения ДНК из субстрата у субъекта, измерения метилирования ДНК в экстрагированной из субстрата ДНК для получения профиля метилирования ДНК, анализа профиля метилирования ДНК для получения полигенной оценки и определения биологического возраста субъекта на основе полигенной оценки, отличающемуся тем, что экстракция ДНК включает в себя извлечение геномной ДНК из слюны или крови, полученной от субъекта.
Другая задача настоящего изобретения относится к способу вычисления биологического возраста субъекта на основе полигенной оценки, полученной из измеренного профиля метилирования ДНК, выполненного для полигенных биомаркеров метилирования ДНК, который включает в себя измерение статуса метилирования сайтов CG в любом из сайтов CG человека и их комбинации, которые расположены в предполагаемой антисмысловой области для гена ElovL2, области ElovL2 AS1, как указано в SEQ ID NO: 1.
Еще одна задача настоящего изобретения относится к способу вычисления биологического возраста нескольких субъектов, включающему в себя этапы извлечения ДНК из нескольких субстратов от нескольких субъектов, измерения метилирования ДНК в экстрагированной ДНК из нескольких субстратов для получения профиля метилирования ДНК, анализа профиля метилирования ДНК для получения полигенной оценки и определения биологического возраста нескольких субъектов на основе полигенной оценки, отличающемуся тем, выделение ДНК включает в себя извлечение геномной ДНК из слюны или крови, полученной от нескольких субъектов.
Еще одна задача настоящего изобретения относится к набору для определения биологического возраста субъекта, содержащему средства и реагенты для сбора и стабилизации субстрата у субъекта; сканер для считывания штрих-кода в комплекте; и инструкции по сбору и стабилизации субстрата, где субстрат представляет собой слюну или кровь субъекта, и где стабилизация субстрата предназначена для отправки собранного субстрата по почте для экстракции ДНК для измерения метилирования ДНК в экстрагированной из субстрата ДНК для получения профиля метилирования ДНК субъекта для определения биологического возраста субъекта.
Еще одна задача настоящего изобретения относится к реализуемому на компьютере способу предоставления рекомендаций по изменению образа жизни, данный способ включает в себя следующие этапы: оценка учетной записи на машиночитаемом носителе, полученной посредством совместного использования пользовательских данных от субъекта, сопоставление указанной учетной записи с набором для определения биологического возраста субъекта, как получено от указанного субъекта, для определения биологического возраста указанного субъекта, вычисление биологического возраста субъекта с использованием способа вычисления биологического возраста субъекта или способа вычисления биологического возраста для нескольких субъектов, чтобы получить рассчитанный биологический возраст, интеграция указанного рассчитанного биологического возраст в модель машинного обучения для указанного субъекта путем выполнения статистического анализа с использованием оценки учетной записи на машиночитаемом носителе, полученной путем обмена пользовательскими данными от субъекта, для получения объединенного отчета по данным, подготовка динамического отчета для указанного субъекта путем анализа объединенного отчета по данным с последовательностью ответов на анкету, полученной путем обмена пользовательскими данными от указанного субъекта, поступающими с течением времени, и сравнения их с рекомендациями национальных ассоциаций, а также обмена динамическим отчетом на машиночитаемом носителе с указанным субъектом для предоставление рекомендаций по изменению образа жизни.
Альтернативная задача настоящего изобретения относится к способу разработки машиночитаемого носителя, данный способ включает в себя следующие этапы: сохранение данных, полученных от нескольких субъектов, анализ сохраненных данных и построение модели, где этап сохранения данных полученных от нескольких пользователей, включает в себя облачную базу данных SQL, где этап анализа сохраненных данных включает в себя группу, выбранную из глубокого машинного обучения, обучения с подкреплением и машинного обучения или их комбинации, и где этап построения модели включает в себя сопоставление входных данных анкетирования и разницы между возрастом по метилированию ДНК и хронологическим возрастом в качестве выходных данных, а также других физиологических и психологических выходных данных, таких как боль, кровяное давление, ИМТ и настроение.
Сущность изобретения
Соответственно, настоящее изобретение относится к способам и материалам, пригодным для оценки прогрессирования возраста, влияния образа жизни и предоставления персонализированных рекомендаций по образу жизни в отношении изменений образа жизни на основе вычисления биологического возраста методом анализа метилирования ДНК сайтов CG или положений CG, находящихся перед геном, кодирующим антисмысловую мРНК, направленную против гена ElovL2 (область ElovL2 AS1) в субстратах от одного субъекта или от нескольких субъектов в ДНК, экстрагированной из субстратов, включая кровь и слюну.
Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу вычисления биологического возраста субъекта, данный способ включает в себя следующие этапы: экстракция ДНК из субстрата, полученного от субъекта, измерение метилирования ДНК в экстрагированной из субстрата ДНК для получения профиля метилирования ДНК, анализ профиля метилирования ДНК для получения полигенной оценки и определение биологического возраста субъекта по полигенной оценке, где экстракция ДНК включает в себя экстракцию геномной ДНК из слюны или крови, полученной от субъекта.
Поскольку в настоящем изобретении было обнаружено, что прогрессирование возраста сильно коррелирует с метилированием позиций CG или сайтов CG, которые находятся или расположены в области перед геном, кодирующим антисмысловую мРНК, направленную против гена ElovL2 (называемую областью ElovL2 AS1), то, таким образом, другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу вычисления биологического возраста субъекта, отличающемуся тем, способ включает в себя этап измерения метилирования ДНК, который выполняется для полигенных биомаркеров метилирования ДНК, который включает в себя измерение статуса метилирования сайтов CG в любом из сайтов CG человека, как описано в Таблице 1, где указаны положения CG на хромосоме 6 человека, как описано здесь, и их комбинации, которые расположены в предполагаемой антисмысловой области для гена ElovL2, области ElovL2 AS1, как указано далее в SEQ ID NO: 1. В настоящем изобретении было обнаружено, что секвенирование целевого ампликона этой области выявило вышеупомянутую новую комбинацию 13 сайтов CG, как описано в Таблице 1, где указаны положения CG на хромосоме 6 человека, как описано здесь в области ElovL2 AS1, как указано в SEQ ID NO: 1, метилирование которых сильно коррелировало с биологическим возрастом, определенным по слюне. Уравнение линейной регрессии в настоящем изобретении выявило коэффициенты регрессии этих участков с возрастом, где комбинированное взвешенное уравнение этих участков точно предсказывает биологический возраст.
Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу вычисления биологического возраста нескольких субъектов, данный способ включает в себя следующие этапы: экстракция ДНК из нескольких субстратов от нескольких субъектов, измерение метилирования ДНК в экстрагированной из нескольких субстратов ДНК для получения профиля метилирования ДНК, анализ профиля метилирования ДНК для получения полигенной оценки и определение биологического возраста нескольких субъектов на основе полигенной оценки, где экстракция ДНК включает в себя извлечение геномной ДНК из слюны или крови, полученной от субъекта. Настоящее изобретение относится к способу, который точно измеряет возраст по метилированию ДНК по слюне путем определения метилирования ДНК в полигенном наборе сайтов CG, как описано в Таблице 1, где указаны положения CG на хромосоме 6 человека, как описано здесь, в области ElovL2 AS1, как указано в SEQ ID NO: 1, у сотен людей одновременно, путем последовательной амплификации со специфичными для мишени праймерами, а затем с штрих-кодирующими праймерами и мультиплексным секвенированием в одной реакции секвенирования следующего поколения Miseq, извлечения данных и количественной оценки метилирования. Настоящее изобретение также относится к измерению метилирования указанных сайтов CG метилирования ДНК, как описано в Таблице 1, где указаны положения CG на хромосоме 6 человека, как описано здесь, в области ElovL2 AS1, как указано в SEQ ID NO: 1. с использованием пиросеквенирования, ПЦР, специфичной для метилирования, или цифровой ПЦР. В настоящем изобретении раскрыт расчет показателя полигенного взвешенного метилирования, который предсказывает возраст.
Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к набору для определения биологического возраста субъекта, содержащему средства и реагенты для сбора и стабилизации субстрата у субъекта; сканер для считывания штрих-кода в комплекте; и инструкции по сбору и стабилизации субстрата, где субстрат представляет собой слюну или кровь субъекта, и где стабилизация субстрата предназначена для отправки собранного субстрата по почте для экстракции ДНК для измерения метилирования ДНК в экстрагированной из субстрата ДНК для получения профиля метилирования ДНК субъекта для определения биологического возраста субъекта.
Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к реализованному на компьютере способу предоставления рекомендаций по изменению образа жизни, данный способ включает в себя следующие этапы: оценка учетной записи на машиночитаемом носителе, полученной посредством совместного использования пользовательских данных от субъекта, сопоставление указанной учетной записи с набором, как раскрыто здесь и получено от указанного субъекта для определения биологического возраста указанного субъекта, вычисление биологического возраста субъекта с использованием способа вычисления биологического возраста субъекта, как раскрыто здесь, или способа вычисления биологического возраста для нескольких субъектов для получения рассчитанного биологического возраста, интеграция рассчитанного биологического возраста в модель машинного обучения для указанного субъекта путем выполнения статистического анализа с использованием оценки учетной записи на машиночитаемом носителе для получения объединенного отчета по данным, подготовка динамического отчета для указанного субъект путем анализа объединенного отчета по данным с последовательностью ответов на анкету, полученную путем обмена пользовательскими данными от указанного субъекта поступающими с течением времени, и сравнения их с рекомендациями национальных ассоциаций, а также совместного использования динамического отчета на машиночитаемом носителе с указанным субъектом для предоставление рекомендаций по изменению образа жизни. Таким образом, настоящее изобретение относится к реализованному на компьютере способу, как раскрыто здесь, который представляет собой новый процесс, объединяющий повторяющиеся измерения возраста по метилированию ДНК в слюне для определения биологического возраста с динамическими изменениями образа жизни с использованием машиночитаемого носителя, альтернативно называемого приложением, которое управляет этими изменениями. Поскольку для определения возраста по метилированию ДНК требуется только слюна, раскрытый способ настоящего изобретения использует заказ тестов по инициативе потребителя через машиночитаемый носитель или приложение, путем помещения образца слюны в набор для сбора слюны, который отправляется по почте в лабораторию для экстракции ДНК с последующим анализом метилирования ДНК. Изменения образа жизни фиксируются в Приложении; данные о метилировании, а также данные об образе жизни фиксируются в базе данных и непрерывно и итеративно анализируются программами машинного обучения, такими как нейронные сети.
Один вариант осуществления настоящего изобретения относится способу разработки машиночитаемого носителя, данный способ включает в себя следующие этапы: сохранение данных, полученных от нескольких субъектов, анализ сохраненных данных и построение модели, где этап сохранения полученных от нескольких пользователей данных содержит облачную базу данных SQL, где этап анализа сохраненных данных включает в себя группу, выбранную из глубокого машинного обучения, обучения с подкреплением и машинного обучения или их комбинации, и где этап построения модели включает в себя сопоставление входных данных анкетирования и разницы между возрастом по метилированию ДНК и хронологическим возрастом в качестве выходных данных, а также других физиологических и психологических выходных данных, таких как боль, артериальное давление, ИМТ и настроение. Данные, совместно используемые множеством потребителей, непрерывно анализируются для построения модели, которая связывает входные изменения образа жизни с выходными данными разницы между возрастом по метилированию ДНК или биологическим возрастом, определяемым способом настоящего изобретения, и хронологическим возрастом. Раскрытая здесь модель применяется к персональным данным, и модель выводит рекомендации по личным изменениям в образе жизни. Входные данные образа жизни и выходной возраст по метилированию ДНК или биологический возраст, как описано здесь, многократно измеряются и используются для дальнейшего обучения с подкреплением с дополнительными советами, передаваемыми в приложения потребителей.
Настоящее изобретение относится к способам, которые может применять любой специалист в данной области техники для измерения биологического возраста и взаимосвязи между изменениями образа жизни и возрастом по метилированию ДНК. Маркеры метилирования ДНК (CGID), как описано в Таблице 1, в которой указаны выбранные положения CG в upstream области на хромосоме 6 человека во вновь обнаруженном гене ElovL2 AS1, как указано в SEQ ID NO: 1, как описанном в настоящем изобретении, пригодны для выполняемых по инициативе потребителей тестов на основе слюны для определения возраста по метилированию ДНК или биологического возраста, а также для составления отчетов и изменения параметров образа жизни с использованием «общего» приложения или машиночитаемого носителя и системы машинного обучения. Показано, что настоящее изобретение можно использовать для измерения «биологического возраста» с использованием полигенной оценки на основе описанных здесь способов измерения метилирования ДНК, которые включают в себя секвенирование целевого ампликона антисмысловой области ELOVL2 AS1, как указано в SEQ ID NO: 1, раскрытой в настоящем изобретении, у сотен людей или субъектов одновременно или с использованием других методов измерения метилирования ДНК, доступных специалистам в данной области техники, таких как бисульфитное секвенирование нового поколения, пиросеквенирование, секвенирование MeDip, секвенирование Ion Torrent, чипы Illumina 450 K и микрочипы Epic и т.д. Настоящее изобретение также относится к применению настоящего изобретения для интеграции измерений метилирования ДНК в комплексный план изменения образа жизни с использованием раскрытого здесь приложения «EpiAging», которое может быть разработано любым специалистом в данной области с использованием программ с открытым исходным кодом и других программ, таких как Build Fire JS, Ionic, Appcelerator's Titanium SDK, Mobile angular UI и Siberian CMS. Данные будут храниться в базе данных, такой как MySQL, на облачном сервере, таком как облако Azure или облако Amazon, с которыми может работать любой специалист в данной области техники. Данные будут анализироваться платформой машинного обучения, такой как нейронные сети, с использованием программ с открытым исходным кодом, таких как Tensor flow или R-статистика, доступных специалистам в данной области техники. Настоящее изобретение относится к применению настоящего изобретения в предоставлении потребителям динамических «персонализированных» отчетов с рекомендациями по комбинации изменений образа жизни, которые могут повлиять на их здоровое старение. Настоящее изобретение также относится к применению теста метилирования ДНК «EpiAging» и приложения для измерения воздействия вмешательств на их биологический возраст путем отправки слюны для измерения возраста по метилированию ДНК до и после рекомендованных изменений образа жизни.
Другие задачи, признаки и преимущества настоящего изобретения станут очевидны специалистам в данной области техники из следующего подробного описания. Однако следует понимать, что подробное описание и конкретные примеры, указывающие на некоторые варианты осуществления настоящего изобретения, приводятся в качестве иллюстрации, а не ограничения. Многие изменения и модификации в пределах объема настоящего изобретения могут быть сделаны без отступления от его сущности, и изобретение включает в себя все такие модификации.
Краткое описание чертежей
Фиг.1. Поскольку метилирование ДНК в сайтах CG в антисмысловой области перед геном ElovL2, называемой областью ElovL2 AS1, коррелирует с возрастом. Показан вид IGV-браузера геномной области человека вокруг сайтов CG и положение двух CG области ElovL2 AS1, а именно cg16867657 и cg21572722, как описано в Таблице 1 ниже. Корреляция Пирсона между состояниями метилирования CGID по геному в клетках крови в общедоступных чипах Illumina 450K и возрастом показала, что верхний CG был cg16867657 с коэффициентом корреляции смешанных моментов Пирсона r = 0,934 (p = 0) и соседний сайт cg21572722, коэффициент корреляции с возрастом которого составлял r = 0,81004 (p = 0), показывая, что состояние метилирования обнаруженных сайтов CG коррелирует с возрастом в области ElovL2 AS1. Исследование геномного положения этого CG показало, что он является членом последовательности из 13 CG (обозначенных), которые находятся в ранее не охарактеризованной области, антисмысловой области гена ElovL2 (ElovL2 AS1).
Фиг.2. Сайты CG области ElovL2 AS1 сильно коррелируют с возрастом в слюне. Показана корреляция между оценкой метилирования взвешенных уровней метилирования сайтов CG в области ElovL2 AS1, а именно cg16867657, cg21572722, расположенных на хромосоме 6, и cg09809672, расположенного на хромосоме 1 (см. Положения в геноме в Таблице 1), и возрастом в общедоступной чипах Illumina 450K для клеток крови (GSE40279 n = 656 и GSE2219, n = 60). Анализ показывает сильную корреляцию между метилированием и возрастом во всех возрастных группах.
Фиг.3. Корреляция метилирования в сайтах CG области ElovL2 AS1 (по анализу слюны) и возраста, а также сравнение с эпигенетическими часами Хорвата. Изображена корреляция метилирования сайтов CG области ElovL2 AS1, а именно cg1687657 и cg21572722, и возраста по анализу слюны и ее сравнение с эпигенетическими часами Хорвата. A. Корреляция между объединенной оценкой метилирования cg1687657 и cg21572722 (HKG) и возрастом с использованием профилей метилирования ДНК из слюны из GSE78874. B. Корреляция между золотым стандартом часами метилирования Хорвата с использованием тех же данных Illumina 450K. C. Сравнение точности двух тестов. Совокупная оценка этих двух сайтов имеет более низкое среднее отклонение в прогнозируемом возрасте, чем в случае являющихся золотым стандартом часов Хорвата.
Фиг.4. Прогнозирование возраста с использованием полигенной оценки 13 CG ElovL2 AS1 по слюне. Показана применимость настоящего изобретения. A. Показатели метилирования, прогнозирующие возраст, рассчитанные с помощью уравнения линейной регрессии, прогнозирующего возраст как функцию взвешенных уровней метилирования сайтов 1, 5, 6, 9 CG в области ElovL2 AS1 (см. Таблицу 1 для положений в геноме) с использованием уровней метилирования ДНК из слюны 65 человек. Область ElovL2 AS1, как описано на Фигуре 1, была амплифицирована из ДНК слюны, обработанной бисульфитом, и подвергнута мультиплексному секвенированию следующего поколения на секвенаторе нового поколения Miseq. B. Показатели метилирования, прогнозирующие возраст, рассчитанные с помощью уравнения линейной регрессии, прогнозирующего возраст как функцию взвешенных уровней метилирования сайтов 1, 2, 5, 6, 9 CG в области ElovL2 AS1 (см. Таблицу 1 для положений в геноме). C. Показатели метилирования, прогнозирующие возраст, рассчитанные с помощью уравнения линейной регрессии, прогнозирующего возраст как функцию взвешенных уровней метилирования сайтов 1, 2 CG в области ElovL2 AS1 (см. Таблицу 1 для положений в геноме). D. Показатели метилирования, прогнозирующие возраст, рассчитанные с помощью уравнения линейной регрессии, прогнозирующего возраст как функцию взвешенных уровней метилирования всех сайтов CG в области ElovL2 AS1 (см. Таблицу 1 для положений в геноме). E. Сравнение прогностической ценности различных оценок метилирования. Уравнение, которое включает все 13 сайтов CG, превосходит любую другую комбинацию.
Фиг.5. Приложение EpiAging. Отображается домашняя страница приложения EpiAging.
Фиг.6. Экосистема здоровья на основе приложения EpiAging. Изображено приложение EpiAging; и управление образом жизни через функцию РЕКОМЕНДАЦИИ НА ОСНОВЕ ДАННЫХ. В центре экосистемы здоровья находится приложение EpiAging. Приложение позволяет потребителям узнать о метилировании ДНК, биологическом старении, пищевых добавках. Приложение позволяет потребителям вводить данные об образе жизни, здоровье сердечно-сосудистой системы, настроении, питании, секса во сне и данные о боли. Приложение позволяет клиенту заказать набор для анализа слюны через торговую площадку. Набор для анализа слюны доставляется по почте, и покупатель сканирует штрих-код, который присваивает покупателю идентификатор, который связывает идентификатор телефона с идентификатором теста. Покупатель отправляет набор для анализа слюны в лабораторию по почте с предоплатой. Лабораторные данные о возрасте по метилированию и повторяющиеся данные об образе жизни передаются из приложения и лаборатории в запрограммированную базу данных SQL. Точно так же другие потребители отправляют данные о своем образе жизни и данные о метилировании ДНК в эту базу данных. Алгоритм машинного обучения анализирует данные с использованием глубокого обучения и повторяющихся входных данных. Рассчитывается модель, определяющая вес каждой учетной записи при определении результата. Персональные данные анализируются моделью, и изменения в образе жизни, которые, согласно прогнозам, могут повлиять на результат (дельта-метилирование ДНК - хронологический возраст), доставляются в приложение. Потребитель меняет образ жизни и заказывает новый анализ слюны, и цикл повторяется с итеративным анализом и дальнейшими рекомендациями, основанными на направлении и диапазоне изменения возраста по метилированию ДНК относительно хронологического возраста.
Фиг.7. Эпиэкосистема здоровья. Изображена эпиэкосистема здоровья и ее полезность для здорового старения. Приложение EpiAging занимает центральное место в экосистеме здоровья. Оно позволяет в режиме реального времени доставлять советы по здоровью от авторитетной Национальной медицинской ассоциации. Создается торговая площадка для поставщиков медицинских услуг и товаров для образа жизни, а также торговая площадка для различных новых тестов. Приложение отправляет данные на общий сервер данных, который итеративно анализирует всю информацию и предоставляет рекомендации по изменению образа жизни, возможные тесты, которые необходимо пройти, а также информацию о поставщиках медицинских услуг и товаров на основе результатов анализа.
Подробное описание изобретения
В описании вариантов осуществления изобретения может быть сделана ссылка на прилагаемые чертежи, которые составляют часть изобретения, и на которых в качестве иллюстрации показан конкретный вариант осуществления, в котором изобретение может быть реализовано на практике. Следует понимать, что могут использоваться другие варианты осуществления и могут быть внесены структурные изменения, не выходящие за рамки объема настоящего изобретения. Многие из методов и процедур, описанных или упомянутых здесь, хорошо понятны и обычно используются специалистами в данной области техники. Если не указано иное, то все термины в данной области техники, обозначения и другие научные термины или терминология, используемые здесь, имеют значения, обычно понимаемые специалистами в данной области, к которой относится настоящее изобретение. В некоторых случаях термины с общепринятыми значениями определены здесь для ясности и/или для облегчения ссылки, и включение таких определений в настоящее изобретение не обязательно должно толковаться как представляющее существенное отличие от того, что обычно понимается в данной области техники.
Все иллюстрации на чертежах предназначены для описания выбранных вариантов осуществления настоящего изобретения и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения.
Все упомянутые в настоящем изобретении публикации включены в него путем ссылки для раскрытия и описания аспектов, способов и/или материалов в связи с процитированными публикациями.
Метилирование ДНК относится к химическим модификациям молекулы ДНК. Было обнаружено, что технологические платформы, такие как микрочип Illumina Infinium или технологии на основе секвенирования ДНК, позволяют проводить высоконадежные и воспроизводимые измерения уровней метилирования ДНК человека. В геноме человека более 28 миллионов локусов CpG или сайтов CG. Следовательно, определенным локусам присваиваются уникальные идентификаторы, такие как те, что находятся в базе данных локусов CpG или сайтов CG компании Illumina. Эти идентификаторы обозначения локуса CG используются в настоящем изобретении.
Определения:
Используемый здесь термин «CG» относится к динуклеотидной последовательности в ДНК, содержащей цитозиновые и гуанозиновые основания. Положение CG, называемое здесь «сайтами CG» представляет собой положения в геноме человека, определяемые хромосомой и положением нуклеотида в эталонном геноме человека hg19.
Используемый здесь термин «бета-значение» относится к вычислению уровня метилирования в положении CGID, полученного путем нормализации и количественной оценки чипов Illumina 450K или EPIC с использованием отношения интенсивностей между метилированными и неметилированными зондами и формулы: бета-значение = интенсивность метилированного C / (интенсивность метилированного C + интенсивность неметилированного C) от 0 до 1, где 0 - полностью неметилированный, а 1 - полностью метилированный.
Используемый здесь термин «деревья принятия решений» представляет собой тип алгоритма интеллектуального анализа данных, который выбирает из множества переменных и взаимодействий между переменными те, которые наиболее предсказывают ответ или результат, который должен быть объяснен (Mann et al., 2008).
Используемый здесь термин «случайные леса» представляет собой тип алгоритма интеллектуального анализа данных, который может выбирать наиболее важные переменные для определения данного результата или ответа (Shi, Seligson, Belldegrun, Palotie, & Horvath, 2005; Svetnik et al., 2003).
Используемый здесь термин «регрессия лассо» представляет собой метод выбора переменных для моделей линейной регрессии, который определяет минимальное подмножество предикторов, необходимых для прогнозирования результата (переменная ответа) с минимальной ошибкой прогнозирования (Kim, Kim, Jeong, Jeong, & Kim, 2018).
Используемый здесь термин «кластерный анализ K-средних» представляет собой неконтролируемый алгоритм машинного обучения, который разделяет наблюдения на меньший набор кластеров, где каждое наблюдение принадлежит одному кластеру (Beauchaine & Beauchaine, 2002; Kakushadze & Yu, 2017).
Используемый здесь термин «обучение с подкреплением» подразумевает получение обратной связи от анализа данных и обучения методом проб и ошибок. Последовательность успешных решений приведет к подкреплению процесса (Zhao, Kosorok, & Zeng, 2009).
Используемый здесь термин «регрессия со штрафом» относится к статистическому методу, направленному на выявление наименьшего количества предикторов, необходимых для прогнозирования результата из большего списка биомаркеров, как реализовано, например, в статистическом пакете R, «штрафуемых», как описано в Goeman, J. J., L1 penalized estimation in the Cox proportional hazards model. Biometrical Journal 52(1), 70-84.
Используемый здесь термин «кластеризация» относится к группировке набора объектов таким образом, что объекты в одной группе (называемой кластером) более похожи (в том или ином смысле) друг на друга, чем на объекты в других группах (кластерах).
Используемый здесь термин «нейронные сети и глубокое обучение» относится к способу машинного обучения, который включает в себя нейронные сети на нескольких уровнях для итеративного обучения на основе данных. Нейронная сеть рассматривает различные входные данные, такие как переменные образа жизни, как совокупность связанных единиц или узлов, называемых искусственными нейронами, которые имеют множество взаимодействий, как нейроны в головном мозге (De Roach, 1989; Mupparapu, Wu, & Chen, 2018; Sherbet, Woo, & Dlay, 2018). Эти взаимодействия определяют результат в виде биологического старения, которое измеряется как ускоренное или замедленное по отношению к хронологическому возрасту.
Используемый здесь термин «множественная или полигенная линейная регрессия» относится к статистическому методу, который оценивает взаимосвязь между множественными «независимыми переменными» или «предикторами», такими как процент метилирования в нескольких идентификаторах CG, и «зависимой переменной», такой как хронологический возраст. Этот метод определяет «вес» или коэффициент каждого идентификатора CG при прогнозировании «результата» (зависимой переменной, такой как возраст), когда в модель включены несколько «независимых переменных», таких как идентификаторы CG.
Используемый здесь термин «корреляция Пирсона» относится к статистическому методу, который оценивает корреляцию между «независимой переменной» или «предиктором», такой как процент метилирования в идентификаторе CG, и «зависимой переменной», такой как хронологический возраст. Коэффициент корреляции момента продукта Пирсона r количественно взвешивает корреляцию между 0, указывающим на отсутствие корреляции, и 1, указывающим на идеальную корреляцию (Hardy & Magnello, 2002).
Раскрытый в настоящем изобретении способ основан на обнаружении сайтов в геноме человека, состояние метилирования которых коррелирует с возрастом, которые были обнаружены путем выполнения серии корреляций Пирсона между возрастом и метилированием ДНК по 450K сайтов в геноме в общедоступных наборах данных (GSE61496, GSE98876) и подтвердили обнаруженные таким образом маркеры метилирования ДНК, используя данные из GSE40729. Анализ определил cg16867637 как верхний сайт, коррелирующий с возрастом (r = 0,934827, p = 0). В настоящем изобретении был обнаружен фрагмент генома человека на хромосоме 6, который представляет собой антисмысловую последовательность для ранее описанного связанного с возрастом гена ElovL2, область ElovL2 AS1, которая содержит 13 CG, называемых здесь сайтами CG, являются положениями динуклеотидной последовательности, как описано здесь ниже в Таблице 1, чьи комбинированные показатели метилирования, вычисленные в уравнении множественной линейной регрессии, обеспечивают полигенную оценку биологического возраста по слюне с более высокой точностью, чем с использованием ранее обнаруженных положений в геноме. Эти сайты ранее не описывались, так как не входили в чипы Illumina. Таким образом, настоящее изобретение относится к новым сайтам CG, комбинированные взвешенные уровни метилирования которых коррелируют с возрастом. Настоящее изобретение дополнительно демонстрирует здесь, что метилирование всех 13 сайтов CG может быть точно измерено путем амплификации одного ампликона и использования индексированного секвенирования следующего поколения для одновременного измерения у сотен людей, что снижает затраты и увеличивает пропускную способность, используя описанный здесь тест «EpiAging». Субъект или потребитель заказывает набор для сбора слюны, сплевывает ее в пробирку для сбора и отправляет набор обратно в лабораторию, где ДНК извлекается, обрабатывается бисульфитом, а область ElovL2 AS1 амплифицируется и индексируется. Ампликоны от 200 субъектов секвенируют в одной реакции Miseq. Анализируют файлы FastQ и определяют уровень метилирования 13 сайтов CG. Используя уравнение, которое соотносит взвешенные значения метилирования 13 сайтов CG и возраст, рассчитывается биологический возраст, который сообщается заказчику.
Настоящее изобретение дополнительно относится и рассматривает применение раскрытых здесь способов при динамическом вычислении биологического возраста, чтобы улучшить здоровое старение потребителя, рекомендуя изменения образа жизни. В настоящем изобретении показано, что эффективные вмешательства могут быть рекомендованы на основе «машинного обучения» взаимосвязи между множеством переменных образа жизни и разницы между возрастом по метилированию ДНК и биологическими изменениями. Поскольку данные об образе жизни и данные о возрасте по метилированию или биологическом возрасте динамически собираются от нескольких субъектов/пользователей, машина узнает, как сочетание изменений в параметрах образа жизни связано с увеличением или уменьшением разницы между метилированием ДНК и биологическим возрастом. Настоящее изобретение объединяет тест метилирования ДНК с ориентированным на субъекта/потребителя совместным использованием данных, обучением и изменением образа жизни. Субъект/потребитель заказывает и сообщает о своих решениях об образе жизни, используя приложение EpiAging или машиночитаемый носитель, как раскрыто здесь в настоящем изобретении. Улучшение здоровья - это двустороннее партнерство и совместные усилия, а не однонаправленный поток инструкций от «образованного всеведущего» специалиста в области здравоохранения (поставщика медицинских услуг) к «послушному» и пассивному пациенту (потребителю медицинских услуг). Лучшие научные советы, полученные от наиболее авторитетных национальных медицинских ассоциаций, представляются потребителю с помощью приложения EpiAging. Потребитель решает, по каким рекомендациям действовать. Потребитель делится своими решениями с помощью «полностью слепого» приложения. Потребитель получает идентификатор, связанный с его мобильным идентификатором, но «отделенный» от личной информации, такой как адрес, имя, адрес электронной почты и т.д. Результаты действий по изменению образа жизни одного и нескольких пользователей анализируются повторно, как и результаты теста возраста по метилирования ДНК, объединяя как физические, так и психические результаты. Данные анализируются с использованием современных алгоритмов машинного обучения, таких как нейронные сети, например, с использованием Tensor Flow. Создана модель, сопоставляющая различные входные параметры с выходной дельтой между возрастом по метилированию ДНК и хронологическим возрастом. В модели используются персональные данные пользователя, а предложения по изменениям персонализируются и доставляются потребителю. Настоящее изобретение относится к большой платформе для создания постоянно развивающейся динамической модели научно обоснованных рекомендаций. Настоящее изобретение предлагает «эволюционную» платформу, которая динамически улучшается с использованием постоянно расширяющегося массива данных. Благополучие потребителя и среда обучения одновременно развиваются в динамическом взаимодействии между тестами на метилирование ДНК, модификациями образа жизни, общими данными и машинным обучением, как раскрыто в настоящем изобретении.
Настоящее изобретение имеет несколько вариантов осуществления. В одном аспекте настоящего изобретения настоящее изобретение относится к полигенным маркерам метилирования ДНК биологического возраста для управления образом жизни при здоровом старении, указанный набор полигенных маркеров метилирования ДНК получают с использованием анализа корреляции Пирсона между возрастом и данными о метилировании ДНК по всему геному, полученными с помощью методов картирования, таких как чипы Illumina 450K или 850K, бисульфитного секвенирования по всему геному с использованием различных платформ секвенирования следующего поколения, секвенирования с помощью иммунопреципитации метилированной ДНК (MeDIP) или гибридизации с чипами олигонуклеотидов или комбинации этих методов.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу вычисления биологического возраста субъекта, данный способ включает в себя этапы: (a) экстракция ДНК из субстрата, полученного от субъекта; (b) измерение метилирования ДНК в экстрагированной из субстрата ДНК для получения профиля метилирования ДНК; (c) анализ профиля метилирования ДНК для получения полигенной оценки; и (d) определение биологического возраста субъекта на основе полигенной оценки, где экстракция ДНК включает в себя экстракцию геномной ДНК из слюны или крови, полученной от субъекта. Раскрытый в настоящем изобретении способ вычисления биологического возраста субъекта, где измерение метилирования ДНК выполняется с использованием способов, включающих в себя пиросеквенирование ДНК, масс-спектрометрию (Epityper™), анализ метилирования на основе ПЦР, бисульфитное секвенирование следующего поколения целевого ампликона на платформе, выбранной из группы секвенаторов HiSeq, MiniSeq, MiSeq и NextSeq, секвенирования Ion Torrent, секвенирования с помощью иммунопреципитации метилированной ДНК (MeDIP) или гибридизации с чипами олигонуклеотидов. Раскрытый здесь способ вычисления биологического возраста субъекта, где измерение метилирования ДНК выполняется для полигенных биомаркеров метилирования ДНК, который включает в себя измерение статуса метилирования сайтов CG в любом из сайтов CG человека и их комбинаций, представляющих собой положения динуклеотидных последовательностей, описанных ниже в Таблице 1, как раскрыто в настоящем изобретении, которые расположены в антисмысловой области гена ElovL2 в хромосоме 6 человека, области ElovL2 AS1, как указано в SEQ ID NO: 1
(CGCCCTCGCGTCCGCGGCGTCCCCTGCCGGCCGGGCGGCGATTTGCAGGTCCAGCCGGCGCCGGTTTCGCGCGGCGGCTCAACGTCCACGGAGCCCCAGGAATACCCACCCGCTGCCCAGATCGGCAGCCGCTGCTGCGGGGAGAAGCAGTATCGTGCAGGGCGGGCACGCTGGTCTTGCTTACAGTTGGGCTTCGGTGGGTTTGAAGCACACATTAGGGGGAAATGGCTCTGTTCCTGCAGGTTTGCGCAGTCTGGGTTTCTTAG).
Таблица 1: Положения, содержащие сайты метилирования CG (сайты CG), соответствующие 13 сайтам CG перед антисмысловым геном ElovL2, области ElovL2 AS1, как указано в SEQ ID NO: 1, и применимые в вариантах осуществления настоящего изобретения.
Положение в геноме человека выбранного из 13 динуклеотида CG в сайтах CG, используемых в различных вариантах осуществления настоящего изобретения, указано в Таблице 1, включенной в настоящую заявку, в которой также указано положение CG в хромосоме 1, как показано на Фигурах и в Примерах настоящей заявки.
вательность
н.д. означает нет данных
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу вычисления биологического возраста субъекта, данный способ включает в себя этапы: (a) экстракция ДНК из субстрата, полученного от субъекта; (b) измерение метилирования ДНК в экстрагированной из субстрата ДНК для получения профиля метилирования ДНК; (c) анализ профиля метилирования ДНК для получения полигенной оценки; и (d) определение биологического возраста субъекта на основе полигенной оценки, где экстракция ДНК включает в себя экстракцию геномной ДНК из слюны или крови, полученной от субъекта, где измерение метилирования ДНК выполняется с использованием пиросеквенирования ДНК, с использованием праймеров, как указано в SEQ ID NO: 2 (AGGGGAGTAGGGTAAGTGAG) для прямого биотинилированного праймера, SEQ ID NO: 3 (ACCATTTCCCCCTAATATATACTT) для обратного праймера и SEQ ID NO: 4 (GGGAGGAGATTTGTAGGTTT) для праймера пиросеквенирования.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению анализа метилирования ДНК при помощи пиросеквенирования для определения возраста по метилированию ДНК с использованием области ElovL2 AS1, содержащей сайты CG и их комбинации, представляющие собой положения динуклеотидной последовательности, как описано в Таблице 1, как раскрыто в настоящем изобретении, с использованием праймеров, как описано в настоящем изобретении, и стандартных условий реакций пиросеквенирования, рекомендованных производителем (Pyromark, Qiagen), где праймеры содержат прямой (биотинилированный) праймер, как указано в SEQ ID NO: 2, праймер Elovl2_Rv, как указано в SEQ ID NO: 3 и праймер Elovl2_Seq, как указано в SEQ ID NO: 4.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу вычисления биологического возраста субъекта, данный способ включает в себя этапы: (a) экстракция ДНК из субстрата, полученного от субъекта; (b) измерение метилирования ДНК в экстрагированной из субстрата ДНК для получения профиля метилирования ДНК; (c) анализ профиля метилирования ДНК для получения полигенной оценки; и (d) определение биологического возраста субъекта на основе полигенной оценки, где экстракция ДНК включает в себя экстракцию геномной ДНК из слюны или крови, полученной от субъекта, где измерение метилирования ДНК выполняется с использованием бисульфитного секвенирования следующего поколения целевого ампликона на платформе, выбранной из группы секвенаторов HiSeq, MiniSeq, MiSeq и NextSeq, с праймерами, указанными в SEQ ID NO:5(ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNYGGGYGGATTTGTAGGTTTAGT) для прямого праймера и SEQ ID NO: 6 (GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCCTACACRATACTACTTCCCCC) для обратного праймера.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению анализа метилирования ДНК с бисульфитным секвенированием полигенного мультиплексного ампликона для определения возраста по метилированию ДНК в слюне с использованием области ElovL2 AS1, содержащей сайты CG и их комбинации, представляющие собой положения динуклеотидной последовательности, как описано в Таблице 1, как раскрыто в настоящем изобретении, с использованием праймеров, как раскрыто в настоящем изобретении, и стандартных условий, которые включают в себя бисульфитную конверсию, последовательную амплификацию, включающую использование: (a) праймеров, специфичных для мишени (ПЦР 1) и (b) праймеров для штрих-кодирования (ПЦР 2), и мультиплексного секвенирования в одном секвенаторе Miseq нового поколения (Illumina), демультиплексирование с использованием программного обеспечения Illumina, извлечение данных и количественную оценку метилирования с использованием стандартных методов анализа метилирования, включая Methylkit, с последующим расчетом взвешенной оценки метилирования ДНК для вычисления биологического возраста субъекта, где специфичные для мишени праймеры (ПЦР 1) имеют последовательности, указанные в SEQ ID NO: 5 (ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNYGGGYGGYGATTTGTAGGTTTAGT) для прямого праймера и SEQ ID NO: 6 (GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCCTACACRATACTACTTCTCCCC) для обратного праймера, и где штрих-кодирующие праймеры (ПЦР 2) имеют последовательности, указанные в SEQ ID NO: 7 (AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC) для прямого праймера и SEQ ID NO: 8 (CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGTCATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTG) для обратного праймера, который является праймером индекса штрих-кода. В раскрытой здесь последовательности SEQ ID NO: 5 ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNYGGGYGGYGATTTGTAGGTTTAGT черные основания являются адаптерами, а красные основания - последовательностями-мишенями. В раскрытой здесь последовательности SEQ ID NO: 6 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCCTACACRATACTACTTCTCCCC черные основания являются адаптерами, а красные основания - последовательностями-мишенями. В раскрытой здесь последовательности SEQ ID NO: 8 штрих-кодирующего праймера CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGTCATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTG, красные основания являются индексом; используются до 200 вариантов этого индекса.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу вычисления биологического возраста субъекта, данный способ включает в себя этапы: (a) экстракция ДНК из субстрата, полученного от субъекта; (b) измерение метилирования ДНК в экстрагированной из субстрата ДНК для получения профиля метилирования ДНК; (c) анализ профиля метилирования ДНК для получения полигенной оценки; и (d) определение биологического возраста субъекта на основе полигенной оценки, где измерение метилирования ДНК выполняется с использованием анализов метилирования на основе ПЦР, выбранных из группы ПЦР, специфичной для метилирования, и цифровой ПЦР.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу вычисления биологического возраста субъекта, данный способ включает в себя этапы: (a) экстракция ДНК из субстрата, полученного от субъекта; (b) измерение метилирования ДНК в экстрагированной из субстрата ДНК для получения профиля метилирования ДНК; (c) анализ профиля метилирования ДНК для получения полигенной оценки; и (d) определение биологического возраста субъекта на основе полигенной оценки, где анализ профиля метилирования ДНК для получения полигенной оценки включает в себя использование уравнений множественной линейной регрессии или нейросетевого анализа.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу вычисления биологического возраста нескольких субъектов, данный способ включает в себя этапы: (a) экстракция ДНК из нескольких субстратов, полученных от нескольких субъектов; (b) измерение метилирования ДНК в экстрагированной из нескольких субстратов ДНК для получения профиля метилирования ДНК; (c) анализ профиля метилирования ДНК для получения полигенной оценки; и определение биологического возраста нескольких субъектов на основе полигенной оценки, где экстракция ДНК включает в себя экстракцию геномной ДНК из слюны или крови, полученной от субъекта.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу вычисления биологического возраста нескольких субъектов, данный способ включает в себя этапы: (a) экстракция ДНК из нескольких субстратов, полученных от нескольких субъектов; (b) измерение метилирования ДНК в экстрагированной из нескольких субстратов ДНК для получения профиля метилирования ДНК; (c) анализ профиля метилирования ДНК для получения полигенной оценки; и определение биологического возраста нескольких субъектов на основе полигенной оценки, где экстракция ДНК включает в себя экстракцию геномной ДНК из слюны или крови, полученной от субъекта, и где измерение метилирования ДНК в экстрагированной из нескольких субстратов ДНК включает в себя этапы: (i) амплификация экстрагированной из нескольких субстратов геномной ДНК с праймерами, специфичными для мишени, для получения продукта ПЦР 1; (ii) амплификация продукта ПЦР 1 этапа (i) с штрих-кодирующими праймерами для получения продукта ПЦР 2; (iii) выполнение мультиплексного секвенирования в одной реакции секвенирования Miseq следующего поколения с использованием продукта ПЦР 2 этапа (ii); (iv) извлечение данных из мультиплексного секвенирования этапа (iii); и количественное определение метилирования ДНК по извлеченным данным на этапе (iv) для получения профиля метилирования ДНК для каждого субстрата. В альтернативном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу вычисления биологического возраста нескольких субъектов, в котором специфичные для мишени праймеры для получения продукта ПЦР 1 праймеры имеют последовательности, указанные в SEQ ID NO: 5 (ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNYGGGYGGYGATTTGTAGGTTTAGT) для прямого праймера и SEQ ID NO: 6 (GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCCTACACRATACTACTTCTCCCC) для обратного праймера, и где штрих-кодирующие праймеры для получения продукта ПЦР 2 включают в себя праймеры, имеющие последовательности указанные в SEQ ID NO: 7 (AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC) для прямого праймера и SEQ ID NO: 8 (CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGTCATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTG) для обратного праймера, который является праймером индекса штрих-кода.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к комбинации биомаркеров метилирования ДНК для вычисления биологического возраста, где комбинация биомаркеров метилирования ДНК включает в себя сайты CG человека и их комбинации, которые расположены в предполагаемой антисмысловой области гена ElovL2, области ElovL2 AS1, как указано в SEQ ID NO: 1. В одном варианте осуществления настоящего изобретения выделены 13 сайтов CG, расположенных в предполагаемой антисмысловой области гена ElovL2, области ElovL2 AS1, как указано в SEQ ID NO: 1, которые можно использовать отдельно или в комбинации для измерения биологического возраста. В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению сайтов CG, и их комбинаций, представляющих собой положения динуклеотидной последовательности, как описано в Таблице 1, как раскрыто в настоящем изобретении.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к набору для определения биологического возраста субъекта, содержащему средства и реагенты для сбора и стабилизации субстрата у субъекта; сканер для считывания штрих-кода в комплекте; и инструкции по сбору и стабилизации субстрата, где субстрат представляет собой слюну или кровь субъекта, и где стабилизация субстрата предназначена для отправки собранного субстрата по почте для экстракции ДНК для измерения метилирования ДНК в экстрагированной из субстрата ДНК для получения профиля метилирования ДНК субъекта для определения биологического возраста субъекта. В альтернативном варианте осуществления настоящее изобретение относится к набору для определения биологического возраста субъекта, где набор представляет собой набор для сбора слюны, который потребитель или субъект заказывает, сплевывает слюну в пробирку для сбора из набора, которая отправляется в лабораторию для экстракции ДНК с последующим анализом метилирования ДНК. В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к набору для сбора образцов слюны заказчиков, содержащему средства и реагенты для сбора и стабилизации слюны заказчиков. В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к набору, содержащему средства и реагенты для измерения метилирования ДНК сайтов CG, и их комбинаций, представляющих собой положения динуклеотидной последовательности, как описано в Таблице 1, как раскрыто в настоящем изобретении.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к приложению (App) для управления заказом, отправкой, получением результатов тестирования и управлением образом жизни при тестировании возраста по метилированию ДНК. В одном варианте осуществления изобретения приложение разрабатывается с использованием инструментов разработки с открытым исходным кодом для хранения информации о тесте, виртуальной корзины для заказа теста, функции сканирования для сканирования штрих-кода набора слюны и функции для получения результатов теста из лаборатории. В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к анкетам для включения в приложение, которые будут исследовать функции образа жизни, которые могут повлиять на «здоровое старение», они включают в себя основные физиологические показатели, вес, рост, артериальное давление, частоту сердечных сокращений и т.д. самооценку настроения, опросник выраженности боли по Мак-Гиллу, опросник по рациону и питанию, опросник по упражнениям и вопросы об образе жизни, например об алкоголе, наркотиках и курении. В одном варианте осуществления изобретения способ включает в себя выполнение статистического анализа ответов на вопросы анкеты и предоставление динамического отчета потребителям в Приложении, который описывает развитие ответов на вопросы анкеты во времени по сравнению с рекомендациями национальных ассоциаций, таких как ассоциации, изучающие вопросы рака, сердечных заболеваний и инсульта и диабета.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к хранению данных, полученных от нескольких пользователей, в облачной базе данных SQL и использование «машинного обучения» для анализа данных и построения модели, соотносящей измерения входных данных анкеты и разницы между возрастом по метилированию ДНК и хронологическим возрастом в качестве выходных данных, а также другими физиологическими и психологическими выходными данными, такими как боль, артериальное давление, ИМТ и настроение. В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения, как раскрыто в здесь, машинное обучение выбрано из группы алгоритмов интеллектуального анализа данных «глубокого машинного обучения», включая нейронные сети, или «обучения с подкреплением» через обратную связь от потребителей, используемую для усиления наиболее эффективных изменений образа жизни, или алгоритма интеллектуального анализа данных «машинное обучение», включающего в себя анализ «случайного леса», или алгоритма интеллектуального анализа данных «машинное обучение», включающего в себя кластерный анализ K-средних, или платформы «машинного обучения», включающей в себя Amazon Machine Learning (AML), или программ «машинного обучения», включающих в себя продукты H2O.ai на таких платформах, как распределенная файловая система Apache Hadoop, Amazon EC2 Google Compute Engine и Microsoft Azure.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к реализованному на компьютере способу предоставления рекомендаций по изменению образа жизни, данный способ включает в себя этапы: (a) оценка учетной записи на машиночитаемом носителе, полученной посредством совместного использования пользовательских данных от субъекта; (b) сопоставление учетной записи этапа (а) с набором для определения биологического возраста субъекта, содержащим средства и реагенты для сбора и стабилизации субстрата, полученного от субъекта; сканер для считывания штрих-кода в комплекте; и инструкции по сбору и стабилизации субстрата, где субстрат представляет собой слюну или кровь субъекта, и где стабилизация субстрата предназначена для отправки собранного субстрата по почте для извлечения из него ДНК для измерения метилирования ДНК в экстрагированной из субстрата ДНК для получения профиля метилирования ДНК субъекта для определения биологического возраста указанного субъекта; (c) вычисление биологического возраста субъекта с использованием способа, включающего в себя: (i) экстракцию ДНК из субстрата, полученного от субъекта; (ii) измерение метилирования ДНК в экстрагированной из субстрата ДНК для получения профиля метилирования ДНК; (iii) анализ профиля метилирования ДНК для получения полигенной оценки; и (iv) определение биологического возраста субъекта по полигенной оценке, где экстракция ДНК включает в себя выделение геномной ДНК из слюны или крови, полученной от субъекта, для получения вычисленного биологического возраста; (d) интегрирование вычисленного биологического возраста этапа (c) в модель машинного обучения для указанного субъекта путем выполнения статистического анализа с использованием оценки этапа (a) для получения объединенного отчета по данным; (e) подготовка динамического отчета для указанного субъекта путем анализа объединенного отчета по данным этапа (d) с последовательностью ответов на вопросы анкеты, полученных путем обмена пользовательскими данными от указанного субъекта, с течением времени и сравнения их с рекомендациями национальной ассоциации; и (f) совместное использование динамического отчета этапа (e) на машиночитаемом носителе с указанным субъектом для предоставления рекомендаций по изменению образа жизни. В дополнительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к реализованному на компьютере способу предоставления рекомендаций по изменению образа жизни, где машиночитаемый носитель содержит инструменты разработки с открытым исходным кодом, содержащие информацию о тесте для вычисления биологического возраста на основе раскрытого здесь способа, виртуальную корзину для покупок для заказа указанного теста, функцию сканирования для сканирования штрих-кода набора для определения биологического возраста субъекта, как раскрыто в настоящем изобретении, функцию для получения результатов теста из лаборатории, где инструменты разработки с открытым исходным кодом включают в себя анкеты, включенные в машиночитаемый носитель, для изучения функций образа жизни, которые влияют на здоровое старение, включая основные физиологические показатели, вес, рост, артериальное давление, частоту сердечных сокращений, самооценку настроения, опросник выраженности боли по Мак-Гиллу, опросник по рациону и питанию, опросник по упражнениям и вопросы об образе жизни, включая употребление алкоголя, наркотиков и курение, а также их комбинацию.
В альтернативном варианте осуществления настоящее изобретение относится к реализованному на компьютере способу предоставления рекомендаций по изменению образа жизни, данный способ включает в себя этапы: (a) оценка учетной записи на машиночитаемом носителе, полученной посредством совместного использования пользовательских данных от субъекта; (b) сопоставление учетной записи этапа (а) с набором для определения биологического возраста субъекта, содержащим средства и реагенты для сбора и стабилизации субстрата, полученного от субъекта; сканер для считывания штрих-кода в комплекте; и инструкции по сбору и стабилизации субстрата, где субстрат представляет собой слюну или кровь субъекта, и где стабилизация субстрата предназначена для отправки собранного субстрата по почте для извлечения из него ДНК для измерения метилирования ДНК в экстрагированной из субстрата ДНК для получения профиля метилирования ДНК субъекта для определения биологического возраста указанного субъекта; (c) вычисление биологического возраста субъекта с использованием способа, включающего в себя: (i) экстракцию ДНК из нескольких субстратов, полученных от нескольких субъектов; (ii) измерение метилирования ДНК в экстрагированной ДНК из нескольких субстратов для получения профиля метилирования ДНК; (iii) анализ профиля метилирования ДНК для получения полигенной оценки; (iv) определение биологического возраста нескольких субъектов на основе полигенной оценки, где экстракция ДНК включает в себя выделение геномной ДНК из слюны или крови, полученной от субъекта, для получения вычисленного биологического возраста; (d) интегрирование вычисленного биологического возраста этапа (c) в модель машинного обучения для указанного субъекта путем выполнения статистического анализа с использованием оценки этапа (a) для получения объединенного отчета по данным; (e) подготовка динамического отчета для указанного субъекта путем анализа объединенного отчета по данным этапа (d) с последовательностью ответов на вопросы анкеты, полученных путем обмена пользовательскими данными от указанного субъекта, с течением времени и сравнения их с рекомендациями национальной ассоциации; и (f) совместное использование динамического отчета этапа (e) на машиночитаемом носителе с указанным субъектом для предоставления рекомендаций по изменению образа жизни. В дополнительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к реализованному на компьютере способу предоставления рекомендаций по изменению образа жизни, где машиночитаемый носитель содержит инструменты разработки с открытым исходным кодом, содержащие информацию о тесте для вычисления биологического возраста на основе раскрытого здесь способа, виртуальную корзину для покупок для заказа указанного теста, функцию сканирования для сканирования штрих-кода набора для определения биологического возраста субъекта, как раскрыто в настоящем изобретении, функцию для получения результатов теста из лаборатории, где инструменты разработки с открытым исходным кодом включают в себя анкеты, включенные в машиночитаемый носитель, для изучения функций образа жизни, которые влияют на здоровое старение, включая основные физиологические показатели, вес, рост, артериальное давление, частоту сердечных сокращений, самооценку настроения, опросник выраженности боли по Мак-Гиллу, опросник по рациону и питанию, опросник по упражнениям и вопросы об образе жизни, включая употребление алкоголя, наркотиков и курение, а также их комбинацию.
В еще одном альтернативном варианте осуществления настоящее изобретение относится к реализованному на компьютере способу предоставления рекомендаций по изменению образа жизни, данный способ включает в себя этапы: (a) оценка учетной записи на машиночитаемом носителе, полученной посредством совместного использования пользовательских данных от субъекта; (b) сопоставление учетной записи этапа (а) с набором для определения биологического возраста субъекта, содержащим средства и реагенты для сбора и стабилизации субстрата, полученного от субъекта; сканер для считывания штрих-кода в комплекте; и инструкции по сбору и стабилизации субстрата, где субстрат представляет собой слюну или кровь субъекта, и где стабилизация субстрата предназначена для отправки собранного субстрата по почте для извлечения из него ДНК для измерения метилирования ДНК в экстрагированной из субстрата ДНК для получения профиля метилирования ДНК субъекта для определения биологического возраста указанного субъекта; (c) вычисление биологического возраста субъекта с использованием способа, включающего в себя: (i) экстракцию ДНК из нескольких субстратов, полученных от нескольких субъектов; (ii) измерение метилирования ДНК в экстрагированной ДНК из нескольких субстратов для получения профиля метилирования ДНК; (iii) анализ профиля метилирования ДНК для получения полигенной оценки; (iv) определение биологического возраста нескольких субъектов на основе полигенной оценки, где экстракция ДНК включает в себя выделение геномной ДНК из слюны или крови, полученной от субъекта, для получения вычисленного биологического возраста, где измерение метилирования ДНК в выделенной из нескольких субстратов ДНК включает в себя этапы: (1) амплификация экстрагированной из нескольких субстратов геномной ДНК с праймерами, специфичными для мишени, для получения продукта ПЦР 1; (2) амплификация продукта ПЦР 1 этапа (1) с штрих-кодирующими праймерами для получения продукта ПЦР 2; (3) выполнение мультиплексного секвенирования в одной реакции секвенирования Miseq следующего поколения с использованием продукта ПЦР 2 этапа (2); (4) извлечение данных из мультиплексного секвенирования этапа (3); (5) количественное определение метилирования ДНК по извлеченным данным на этапе (d) для получения профиля метилирования ДНК для каждого субстрата; (d) интегрирование вычисленного биологического возраста этапа (c) в модель машинного обучения для указанного субъекта путем выполнения статистического анализа с использованием оценки этапа (a) для получения объединенного отчета по данным; (e) подготовка динамического отчета для указанного субъекта путем анализа объединенного отчета по данным этапа (d) с последовательностью ответов на вопросы анкеты, полученных путем обмена пользовательскими данными от указанного субъекта, с течением времени и сравнения их с рекомендациями национальной ассоциации; и (f) совместное использование динамического отчета этапа (e) на машиночитаемом носителе с указанным субъектом для предоставления рекомендаций по изменению образа жизни. В дополнительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к реализованному на компьютере способу предоставления рекомендаций по изменению образа жизни, где машиночитаемый носитель содержит инструменты разработки с открытым исходным кодом, содержащие информацию о тесте для вычисления биологического возраста на основе раскрытого здесь способа, виртуальную корзину для покупок для заказа указанного теста, функцию сканирования для сканирования штрих-кода набора для определения биологического возраста субъекта, как раскрыто в настоящем изобретении, функцию для получения результатов теста из лаборатории, где инструменты разработки с открытым исходным кодом включают в себя анкеты, включенные в машиночитаемый носитель, для изучения функций образа жизни, которые влияют на здоровое старение, включая основные физиологические показатели, вес, рост, артериальное давление, частоту сердечных сокращений, самооценку настроения, опросник выраженности боли по Мак-Гиллу, опросник по рациону и питанию, опросник по упражнениям и вопросы об образе жизни, включая употребление алкоголя, наркотиков и курение, а также их комбинацию.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к реализованному на компьютере способу предоставления рекомендаций по изменению образа жизни, данный способ включает в себя этапы: (a) оценка учетной записи на машиночитаемом носителе, полученной посредством совместного использования пользовательских данных от субъекта; (b) сопоставление учетной записи этапа (а) с набором для определения биологического возраста субъекта, содержащим средства и реагенты для сбора и стабилизации субстрата, полученного от субъекта; сканер для считывания штрих-кода в комплекте; и инструкции по сбору и стабилизации субстрата, где субстрат представляет собой слюну или кровь субъекта, и где стабилизация субстрата предназначена для отправки собранного субстрата по почте для извлечения из него ДНК для измерения метилирования ДНК в экстрагированной из субстрата ДНК для получения профиля метилирования ДНК субъекта для определения биологического возраста указанного субъекта; (c) вычисление биологического возраста субъекта с использованием способа вычисления биологического возраста субъекта, как раскрыто настоящем изобретении; (d) интегрирование вычисленного биологического возраста этапа (c) в модель машинного обучения для указанного субъекта путем выполнения статистического анализа с использованием оценки этапа (a) для получения объединённого отчёта по данным; (e) подготовка динамического отчета для указанного субъекта путем анализа объединенного отчета по данным этапа (d) с последовательностью ответов на вопросы анкеты, полученных путем обмена пользовательскими данными от указанного субъекта, с течением времени и сравнения их с рекомендациями национальной ассоциации; и (f) совместное использование динамического отчета этапа (e) на машиночитаемом носителе с указанным субъектом для предоставления рекомендаций по изменению образа жизни, где способ включает в себя использование мини-программы Android, Apple или WeChat для персонализированных рекомендаций по образу жизни, создание экосистемы здоровья, ориентированной на нормализацию или замедление биологического старения субъекта, или для хранения данных в хранилище объектов на сервере или облачном сервере, включая, Amazon, Ali Cloud или Microsoft Azure с использованием стандартного конвейера данных и систем управления, таких как Cloud dataprep, по нескольким субъектам. В дополнительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к реализованному на компьютере способу предоставления рекомендаций по изменению образа жизни, где данный способ включает в себя использование набора алгоритмов искусственного интеллекта, таких как случайный лес (RF), машина опорных векторов (SVM), линейный дискриминантный анализ (LDA), обобщенная линейная модель (GLM) и глубокое обучение (DL) для вычисления взвешенного вклада различных показателей образа жизни в биологический возраст субъекта или нескольких субъектов, который динамически обновляется для предоставления персонализированных рекомендаций по изменению образа жизни.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к реализованному на компьютере способу предоставления рекомендаций по изменению образа жизни, данный способ включает в себя этапы: (a) оценка учетной записи на машиночитаемом носителе, полученной посредством совместного использования пользовательских данных от субъекта; (b) сопоставление учетной записи этапа (а) с набором для определения биологического возраста субъекта, содержащим средства и реагенты для сбора и стабилизации субстрата, полученного от субъекта; сканер для считывания штрих-кода в комплекте; и инструкции по сбору и стабилизации субстрата, где субстрат представляет собой слюну или кровь субъекта, и где стабилизация субстрата предназначена для отправки собранного субстрата по почте для извлечения из него ДНК для измерения метилирования ДНК в экстрагированной из субстрата ДНК для получения профиля метилирования ДНК субъекта для определения биологического возраста указанного субъекта; (c) вычисление биологического возраста субъекта с использованием способа вычисления биологического возраста нескольких субъектов, как раскрыто настоящем изобретении; (d) интегрирование вычисленного биологического возраста этапа (c) в модель машинного обучения для указанного субъекта путем выполнения статистического анализа с использованием оценки этапа (a) для получения объединенного отчета по данным; (e) подготовка динамического отчета для указанного субъекта путем анализа объединенного отчета по данным этапа (d) с последовательностью ответов на вопросы анкеты, полученных путем обмена пользовательскими данными от указанного субъекта, с течением времени и сравнения их с рекомендациями национальной ассоциации; и (f) совместное использование динамического отчета этапа (e) на машиночитаемом носителе с указанным субъектом для предоставления рекомендаций по изменению образа жизни, где способ включает в себя использование мини-программы Android, Apple или WeChat для персонализированных рекомендаций по образу жизни, создание экосистемы здоровья, ориентированной на нормализацию или замедление биологического старения субъекта, или для хранения данных в хранилище объектов на сервере или облачном сервере, включая, Amazon, Ali Cloud или Microsoft Azure с использованием стандартного конвейера данных и систем управления, таких как Cloud dataprep, по нескольким субъектам. В дополнительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к реализованному на компьютере способу предоставления рекомендаций по изменению образа жизни, где данный способ включает в себя использование набора алгоритмов искусственного интеллекта, таких как случайный лес (RF), машина опорных векторов (SVM), линейный дискриминантный анализ (LDA), обобщенная линейная модель (GLM) и глубокое обучение (DL) для вычисления взвешенного вклада различных показателей образа жизни в биологический возраст субъекта или нескольких субъектов, который динамически обновляется для предоставления персонализированных рекомендаций по изменению образа жизни.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу разработки машиночитаемого носителя, данный способ включает в себя следующие этапы: (a) хранение данных, полученных от нескольких субъектов; (b) анализ сохраненных данных этапа (a); и (c) построение модели, где этап хранения данных, полученных от нескольких пользователей, включает в себя облачную базу данных SQL, где этап анализа сохраненных данных включает в себя группу, выбранную из глубокого машинного обучения, обучения с подкреплением и машинного обучения или их комбинацию, и где этап построения модели включает в себя сопоставление входных данных анкеты и разницы между возрастом по метилированию ДНК и хронологическим возрастом в качестве выходных данных, а также других физиологических и психологических выходных данных, таких как боль, артериальное давление, ИМТ и настроение. В дополнительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу разработки машиночитаемого носителя, где машинное обучение включает в себя группу, выбранную из алгоритма интеллектуального анализа данных, включающего в себя анализ случайного леса или алгоритма интеллектуального анализа данных, включающего в себя кластерный анализ K-средних, или платформы, включающей в себя Amazon Machine Learning (AML) или программного обеспечения, включающего в себя продукты H2O.ai на платформах, включающих в себя распределенную файловую систему Apache Hadoop, Amazon EC2 Google Compute Engine и Microsoft Azure, или их комбинацию.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу вычисления биологического возраста субъекта, данный способ включает в себя этапы: (a) экстракция ДНК из субстрата, полученного от субъекта; (b) измерение метилирования ДНК в экстрагированной из субстрата ДНК для получения профиля метилирования ДНК; (c) анализ профиля метилирования ДНК для получения полигенной оценки; и (d) определение биологического возраста субъекта на основе полигенной оценки, где экстракция ДНК включает в себя экстракцию геномной ДНК из слюны или крови, полученной от субъекта, для применения в способе оценки воздействия биологического вмешательства на биологический возраст субъекта, способ включает в себя этапы: (i) вычисление биологического возраста субъекта с использованием раскрытого здесь способа для получения начального биологического возраста до биологического вмешательства; (ii) выполнение биологического вмешательства в отношении указанного субъекта; (iii) повторение этапа (i) на следующем субстрате, полученном от указанного субъекта после выполнения этапа (ii), чтобы получить биологический возраст после биологического вмешательства; (iv) интегрирование биологического возраста после биологического вмешательства в модель машинного обучения для указанного субъекта, чтобы оценить влияние биологического вмешательства на биологический возраст указанного субъекта, где биологическое вмешательство на этапе (ii) выбрано из группы, состоящей из пищевых добавок, витаминов, терапии, введения исследуемого вещества, диетических манипуляций, метаболических манипуляций, хирургических манипуляций, социальных манипуляций, поведенческих манипуляций, манипуляций с окружающей средой, сенсорных манипуляций, гормональных манипуляций и эпигенетических манипуляций, или их комбинаций, где экстракция ДНК включает в себя экстракцию геномной ДНК из слюны или крови, полученной от субъекта, и где интеграция биологического возраста после биологического вмешательства в модель машинного обучения для указанного субъекта включает в себя биологический возраст, оцененный на этапе (iii), и физиологические параметры, полученные путем обмена пользовательскими данными от указанного субъекта.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу вычисления биологического возраста нескольких субъектов, данный способ включает в себя этапы: (a) экстракция ДНК из нескольких субстратов, полученных от нескольких субъектов; (b) измерение метилирования ДНК в экстрагированной из нескольких субстратов ДНК для получения профиля метилирования ДНК; (c) анализ профиля метилирования ДНК для получения полигенной оценки; и определение биологического возраста нескольких субъектов на основе полигенной оценки, где экстракция ДНК включает в себя экстракцию геномной ДНК из слюны или крови, полученной от субъекта, для применения в способе оценки воздействия биологического вмешательства на биологический возраст субъекта, способ включает в себя этапы: (i) вычисление биологического возраста субъекта с использованием раскрытого здесь способа для получения начального биологического возраста до биологического вмешательства; (ii) выполнение биологического вмешательства в отношении указанного субъекта; (iii) повторение этапа (i) на следующем субстрате, полученном от указанного субъекта после выполнения этапа (ii), чтобы получить биологический возраст после биологического вмешательства; (iv) интегрирование биологического возраста после биологического вмешательства в модель машинного обучения для указанного субъекта, чтобы оценить влияние биологического вмешательства на биологический возраст указанного субъекта, где биологическое вмешательство на этапе (ii) выбрано из группы, состоящей из пищевых добавок, витаминов, терапии, введения исследуемого вещества, диетических манипуляций, метаболических манипуляций, хирургических манипуляций, социальных манипуляций, поведенческих манипуляций, манипуляций с окружающей средой, сенсорных манипуляций, гормональных манипуляций и эпигенетических манипуляций, или их комбинаций, где экстракция ДНК включает в себя экстракцию геномной ДНК из слюны или крови, полученной от субъекта, и где интеграция биологического возраста после биологического вмешательства в модель машинного обучения для указанного субъекта включает в себя биологический возраст, оцененный на этапе (iii), и физиологические параметры, полученные путем обмена пользовательскими данными от указанного субъекта.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу вычисления биологического возраста субъекта, данный способ включает в себя этапы: (a) экстракция ДНК из субстрата, полученного от субъекта; (b) измерение метилирования ДНК в экстрагированной из субстрата ДНК для получения профиля метилирования ДНК; (c) анализ профиля метилирования ДНК для получения полигенной оценки; и (d) определение биологического возраста субъекта на основе полигенной оценки, где экстракция ДНК включает в себя экстракцию геномной ДНК из слюны или крови, полученной от субъекта, для применения в способе скрининга агента на предмет того, обладает ли этот агент антивозрастной активностью, данный способ включает в себя этапы: (i) вычисления возраста по субстрату, полученному от субъекта, с применением способа, раскрытого в настоящем изобретении, для получения начального биологического возраста до биологического вмешательства; (ii) введение тестируемого агента указанному субъекту; (iii) повторение этапа (i) на следующем субстрате, полученном от указанного субъекта после выполнения этапа (ii) для определения биологического возраста после введения тестируемого агента; (iv) интеграция биологического возраста после введения тестируемого агента в модель машинного обучения для указанного субъекта, чтобы оценить, было ли вычислено снижение возраста путем интеграции в модель машинного обучения, чтобы определить тестируемый агент как средство против старения для указанного субъекта, где экстракция ДНК включает в себя экстракцию геномной ДНК из слюны или крови, полученной от субъекта, и где интегрирование биологического возраста после введения тестируемого агента в модели машинного обучения для указанного субъекта включает в себя биологический возраст, оцениваемый на этапе (iii) и физиологические параметры, полученные в результате обмена пользовательскими данными от указанного субъекта.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу вычисления биологического возраста нескольких субъектов, данный способ включает в себя этапы: (a) экстракция ДНК из нескольких субстратов, полученных от нескольких субъектов; (b) измерение метилирования ДНК в экстрагированной из нескольких субстратов ДНК для получения профиля метилирования ДНК; (c) анализ профиля метилирования ДНК для получения полигенной оценки; и определение биологического возраста нескольких субъектов на основе полигенной оценки, где экстракция ДНК включает в себя экстракцию геномной ДНК из слюны или крови, полученной от субъекта, для применения в способе скрининга агента на предмет того, обладает ли этот агент антивозрастной активностью, данный способ включает в себя этапы: (i) вычисления возраста по субстрату, полученному от субъекта, с применением способа, раскрытого в настоящем изобретении, для получения начального биологического возраста до биологического вмешательства; (ii) введение тестируемого агента указанному субъекту; (iii) повторение этапа (i) на следующем субстрате, полученном от указанного субъекта после выполнения этапа (ii) для определения биологического возраста после введения тестируемого агента; (iv) интеграция биологического возраста после введения тестируемого агента в модель машинного обучения для указанного субъекта, чтобы оценить, было ли вычислено снижение возраста путем интеграции в модель машинного обучения, чтобы определить тестируемый агент как средство против старения для указанного субъекта, где экстракция ДНК включает в себя экстракцию геномной ДНК из слюны или крови, полученной от субъекта, и где интегрирование биологического возраста после введения тестируемого агента в модели машинного обучения для указанного субъекта включает в себя биологический возраст, оцениваемый на этапе (iii) и физиологические параметры, полученные в результате обмена пользовательскими данными от указанного субъекта.
Примеры
Следующие ниже примеры приводятся для иллюстрации настоящего изобретения и поэтому не должны рассматриваться как ограничивающие объем настоящего изобретения.
Пример 1: Обнаружение 13 сайтов CG, содержащихся в области ДНК перед геном ElovL2, области ElovL2 AS1, взвешенные уровни метилирования ДНК которых позволяют прогнозировать возраст по ДНК из слюны.
В этом примере настоящее изобретение относится к «эпигенетическим часам», которые на сегодняшний день признаны наиболее точным измерителем биологического возраста. Однако тесты, которые были доступны на сегодняшний день, требуют измерения метилирования ДНК во многих сайтах (~350) с использованием крови, что является инвазивным и дорогостоящим методом, который не применим в качестве широко распространенного потребительского продукта. Несмотря на то, что доступные методы подходят для научных и клинических исследований, они не подходят для широкого использования этого теста потребителями. Таким образом, настоящее изобретение относится к способу, который является точным, надежным, высокопроизводительным и неинвазивным тестом биологического старения, основанным на «эпигенетических часах», в частности, метилировании ДНК. Настоящее изобретение в этом примере относится к маркерам метилирования ДНК polyCG биологического возраста для управления образом жизни и здорового старения.
Обнаружение сайтов CG, которые коррелируют с возрастом, определяемым по анализу ДНК из крови
В соответствии с настоящим изобретением общедоступные чипы для оценки метилирования выделенной из крови ДНК для всего генома Illumina 450K (GSE40729) подверглись корреляционному анализу Пирсона. Было выбрано и проанализировано меньшее количество сайтов CG, о которых ранее не сообщалось. Было обнаружено, что два из этих сайтов CG расположены перед антисмысловой областью гена ElovL2, называемой областью ElovL2 AS1, как показано в форме репрезентативного примера на Фигуре 1, как раскрыто здесь для физической карты, где, как показано здесь, было обнаружено, что они сильно коррелируют с возрастом (с коэффициентом корреляции Пирсона r> 0,9 и p = 0). Затем в соответствии с настоящим изобретением было определено, что комбинированное взвешенное измерение метилирования ДНК для обоих указанных сайтов CG точно предсказывает возраст по ДНК из крови в независимой когорте (GSE40279 n = 656 и GSE2219 n = 60), как показано на Фигуре 2, как раскрыто в настоящем изобретении. Было замечено, что метилирование сайтов CG в области ElovL2 AS1, как указано в SEQ ID NO: 1, как раскрыто здесь, прогрессировало от почти 0% у плодов до почти 90% у людей 90-летнего возраста. Таким образом, эта область ElovL2 AS1, как указано в SEQ ID NO: 1, и сайты CG, обнаруженные в указанной области и являющиеся положениями динуклеотидной последовательности, как описано в Таблице 1, как раскрыто в здесь, при однократном применении продемонстрировали почти идеальную корреляцию с возрастом, предполагающую, что небольшого количества указанных сайтов CG может быть достаточно для определения биологического возраста.
Сайты CG в области ElovL2 AS1 позволяют прогнозировать возраст по ДНК из образцов слюны
Чтобы оценить широкую применимость раскрытых тестов определения возраста по метилированию ДНК, важно, чтобы они не требовали наличия квалифицированных специалистов в области здравоохранения для получения биологического материала. В этом примере в соответствии с настоящим изобретением было определено, можно ли использовать раскрытые сильно коррелирующие сайты CG, которые представляют собой положения динуклеотидной последовательности, как описано в Таблице 1, расположенные в области ElovL2 AS1, как указано в раскрытой здесь SEQ ID NO: 1, в качестве предикторов возраста по слюне путем тестирования общедоступных чипов метилирования ДНК 450K Illumina из слюны (GSE78874, n = 259). В настоящем изобретении раскрыта оценка метилирования, состоящая из взвешенных измерений метилирования для cg16867657 и cg21572722, которые представляют собой положения динуклеотидной последовательности, как описано в Таблице 1, и являются положениями сайтов CG в области, как указано в SEQ ID NO: 1, области ElovL2 AS1 вместе с cg09809672, который является сайтом CG в хромосоме 1, как описано в Таблице 1, как раскрыто здесь, которые предсказывали возраст со средним отклонением 5,62 года и средним отклонением 4,74 года. Затем в настоящем изобретении сравнивается точность описанной здесь модели с золотым стандартом - часами Хорвата. Как видно на Фигуре 3, показатели сайтов области ElovL2 AS1 были немного лучше, чем у часов Хорвата. Следует отметить, что значение гена ElovL2 для определения возраста известно в данной области техники. Однако настоящее изобретение раскрывает, что указанные прошлые знания упускают из виду тот факт, что два сайта CG (а именно, cg16867657 и cg21572722), которые, как предполагалось, находились в гене ElovL2, действительно находятся перед другим геном, находящимся в антисмысловой ориентации по отношению к гену ElovL2, - геном ElovL2-AS1 (см. физическое описание, изображенное на Фигуре 1, как раскрыто здесь), где указанная upstream область упоминается как область ElovL2 AS1 и раскрывается в настоящем изобретении в SEQ ID NO: 1. Эта область перед геном ElovL2-AS1 содержит выбранные 13 сайтов CG (см. Таблицу 1, как раскрыто здесь выше).
Пример 2: Бисульфитное преобразование, мультиплексная амплификация и секвенирование следующего поколения и расчет метилирования для 13 CG в области ElovL2 AS1.
Настоящее изобретение также предусматривает, что слюна, которую должен собрать субъект или потребитель в буфере стабилизации ДНК (Трис 10 мМ ЭДТА 10 мМ, SDS 1%), который они отправят по почте в лабораторию, инкубировалась с протеазой К (200 мкг для 30 минут при 37°C) в лаборатории. Затем геномную ДНК очищают с помощью набора реагентов Qiagen. Очищенную ДНК обрабатывали бисульфитом натрия, используя, например, набор для обработки бисульфитом EZ DNA. Библиотеку целевых последовательностей получают с помощью двухэтапных реакций ПЦР с использованием следующих праймеров в реакции со стандартной Taq полимеразой:
Для ПЦР 1 - амплификация ампликона, соответствующего последовательности, указанной в SEQ ID NO: 1:
Прямой праймер, указанный в SEQ ID NO: 5:
5’ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNYGGGYGGYGATTTGTAGGTTTAGT3’
Обратный праймер, указанный в SEQ ID NO: 6:
5’GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCCTACACRATACTACTTCTCCCC3’
Для ПЦР 2 - для штрих-кодирования образцов была проведена вторая реакция ПЦР со следующими праймерами:
Прямой праймер, указанный в SEQ ID NO: 7:
5’AATgATACggCgACCACCgAgATCTACACTCTTTCCCTACACgAC3 ’
Штрих-кодирующий праймер (обратный), указанный в SEQ ID NO: 8:
5’CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGTCATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTG3’ (красные основания представляют собой индекс; используется до 200 вариантов этого индекса).
Второй набор праймеров вводил индекс для каждого образца, а также праймеры для обратного и прямого секвенирования. Продукт ПЦР 2 из всех образцов объединяли и очищали на частицах AMPpure-XP (NEB). Библиотеку количественно оценивали с помощью QPCR и загружали в проточную кювету MiSeq. Файл fastQ выравнивали с соответствующей областью генома с помощью BisMark или другого программного обеспечения для редактирования.
Пример 3: Превосходные характеристики 13 сайтов CG в области перед областью гена ElovL2-AS1, области ElovL2 AS1, как указано в SEQ ID NO: 1.
Затем в соответствии с настоящим изобретением определяли, обеспечивает ли комбинированная взвешенная оценка метилирования описанных 13 сайтов CG более высокую прогностическую эффективность по сравнению с 2 или 3 сайтами CG. Образцы слюны были собраны у 65 добровольцев в Гонконгском научном парке, и уровни метилирования в 13 сайтах CG (см. Таблицу 1, как раскрыто в настоящем изобретении выше) определяли, как описано в Примере 2. В настоящем изобретении проводили серию поливариабельных линейных регрессий с различными комбинации сайтов CG. Результаты, представленные на Фигуре 4, в настоящем изобретении, показывают, что комбинация из 13 сайтов CG (см. Часть D на Фигуре 4) работает лучше, чем комбинация либо 4 сайтов CG (см. Часть A на Фигуре 4), 5 сайтов CG (см. часть B на Фигуре 4) или 2 CG сайтов Illumina (см. часть C на Фигуре 4). Результат, подтверждающий превосходство комбинации из 13 сайтов CG над меньшими комбинациями из 4, 5 или 2 сайтов CG, был дополнительно продемонстрирован с помощью данных статистического сравнения, как показано на Фигуре 4E. Коэффициент корреляции момента продукта Пирсона r для оценки метилирования 13 CG составлял 0,95 (p = 1,8x10-33).
Пример 4: Определение биологического возраста в образцах слюны потребителей.
Как уже обсуждалось выше, биологический возраст является важным параметром нашего здоровья. Однако, поскольку тест, описанный в настоящем изобретении, предназначен для проведения субъектами, которые являются потребителями у себя дома за пределами профессиональной системы здравоохранения, важно, чтобы тест был простым и не требовал, чтобы медицинский работник брал кровь в качестве предпочтительного варианта осуществления изобретения, поскольку забор крови сам по себе может быть умеренно рискованной процедурой, а также, чтобы тест можно было доставить в центральную современную лабораторию обычной наземной почтой. Таким образом, в настоящем изобретении раскрыто, что 13 сайтов CG в области ElovL2 AS1 составляют основу теста EpiAging, который предоставляет такую возможность. В соответствии с настоящим изобретением потребитель заказывает набор для анализа слюны, который содержит стабилизирующий буфер, который сохраняет стабильность ДНК до 1 месяца, через приложение EpiAging, Интернет или электронную почту. Стабилизирующий буфер содержит 20 мМ Трис-HCl (pH 8,0), 20 мМ EDTA, 0,5% SDS и 1% Triton X-100. Набор со штрих-кодом прибывает по почте к нему домой. Потребитель сканирует штрих-код своим сканером на своем телефоне и регистрирует свой штрих-код в приложении, которое связывает штрих-код с его внутренним идентификатором телефона. Следуя инструкциям, приведенным в наборе для тестирования EpiAging, покупатель сплевывает слюну в пробирку для сбора, а затем переносит слюну в пробирку, содержащую стабилизирующий буфер, помещает пробирку в предварительно оплаченный почтовый конверт и отправляет ее в лабораторию. В лаборатории экстрагируют ДНК, обрабатывают ее бисульфитом (химическая обработка бисульфитом преобразует неметилированный C в T, в то время как метилированный C остается как C), а область ElovL2 AS1 амплифицируют, как описано в Примере 3, и секвенируют с образцами от других пациентов на секвенаторе MiSeq Illumina. Файлы fastQ анализируют и вычислят значения метилирования (m) для 13 сайтов CG: mCGn = количество CGnC / (количество CGnT + количество CGnC).
Затем значения вводятся в следующее уравнение для расчета биологического возраста:
Биологический возраст = (CG1 * 87,5643 + CG2 * 6,3301 + CG3 * -0,8691 + CG4 * 1,9468 + CG5 * 40,0336 + CG6 * 49,4303 + CG7 * -14,7868 + CG8 * 22,9042 + CG9 * -49,7942 + CG10 * 111,7467 + CG11 * 41,8108 + CG12 * 0,4144 + CG13 * -150,8005) -71,6872
Затем значение биологического возраста отправляют потребителю в его приложении EpiAging, или потребитель может получить результаты, используя свой идентификатор штрих-кода. Значительное превышение биологического возраста над хронологическим возрастом (+5 лет) служит «красным флагом» для изменения образа жизни. Потребитель периодически (каждые 6-12 месяцев) измеряет свой биологический возраст и оценивает прогресс в сокращении разрыва между биологическим и хронологическим возрастом.
Пример 5: Приложение EpiAging для управления тестированием биологического возраста и данными об образе жизни.
Настоящее изобретение относится к приложению EpiAging (см. Фигуру 5 с изображением домашней страницы указанного приложения), которое совместимо с операционными системами Apple и Android и предоставляет информацию о «тесте EpiAging», способах заказа, корзине для заказа и ссылке на форму электронной оплаты, такую как PayPal или Alipay. Инновационный аспект раскрытого приложения настоящего изобретения состоит в том, что оно сочетает в себе управление «тестом EpiAging» на основе данных заказчика с системой осуществляемого заказчиком управления изменениями образа жизни на основе динамических рекомендаций авторитетных национальных и международных медицинских групп, «самоотчетность», обмен данными, машинное обучение, итеративные изменения, обусловленные итеративным машинным обучением, персонализированные отчеты для потребителей и повторные оценки (см. Фигуру 6). Система «обучения с подкреплением» предлагает изменения образа жизни, которые имеют наибольшее влияние на замедление старения, что определяется разницей между возрастом по метилированию ДНК и хронологическим возрастом. Представленное здесь приложение создано с помощью программ с открытым исходным кодом, известных любому специалисту в данной области техники, таких как Build Fire JS, Ionic, Appcelerator’s Titanium SDK, Mobile angular UI и Siberian CMS.
Приложение загружается из магазина Apple Store, магазина Google Play или с веб-сайтов. Приложение требует регистрации и присвоения идентификатора потребителя. Приложение активирует сканер, который сканирует штрих-код и связывает тестовый штрих-код с идентификатором потребителя. Данные будут связаны с этими «слепыми» идентификаторами. Персональные данные и данные потребителей разделены, защищены и маркированы, чтобы гарантировать полное обезличивание данных о «старении» и образе жизни. Система управления данными не имеет доступа к личным данным. Система построена для восстановления личных идентификаторов, которые могут быть инициированы только потребителем с использованием его учетной записи электронной почты, но полностью скрыты от системы управления данными. Обезличивание данных является фундаментальной функцией приложения.
На первой странице приложения есть несколько кнопок (см. Фигуру 5). Одна кнопка дает ссылки на основную информацию о тестах на «старение», научные цитаты и ссылки PubMed для более глубокого изучения данной области.
Функция «Info» предоставляет информацию о связи между образом жизни и «старением». Вторая кнопка дает ссылки на страницу, которая содержит ряд кнопок, которые дают ссылки на кнопки областей образа жизни и благополучия, такие как «настроение», «хроническая боль», «питание», включая прием пищевых добавок, таких как S-аденозил-L-метионин, витамины и т.д., «физиологические показатели», такие как артериальное давление, частота пульса, вес, рост, уровень сахара натощак и другие метаболические тесты, прием лекарств, употребление наркотиков и алкоголя, курение и данные физических упражнений, введенные потребителем. Каждому разделу предшествуют рекомендации, составленные из рекомендаций авторитетных ассоциаций, таких как Национальная кардиологическая ассоциация сердца и Национальная ассоциация инсульта или ассоциация диабета, Американское онкологическое общество и т.д. Раздел рекомендаций содержит ссылку на эти ассоциации, чтобы потребитель мог принимать свои собственные суждения и решения. Идея, лежащая в основе раздела управления образом жизни, заключается в самосовершенствовании потребителя и его контроле над решениями, касающимися его образа жизни. Ввод данных осуществляется перемещением по числовой шкале. Записи типа «да-нет» интерпретируются как 0 для «Нет» и 1 для «Да». Другие поддающиеся количественной оценке записи вводятся по их количеству. Поверх каждой шкалы ввода данных представлено оцененное по шкале представление рекомендации, дающее клиенту оценку его эффективности по сравнению с рекомендациями, имеющими цветовую маркировку. Рекомендуемый диапазон обозначен зеленым цветом. Отклонение от рекомендаций обозначается красным цветом, если они находятся выше и синим, если они находятся ниже рекомендованного диапазона. Кнопка «Сохранить», которую нажимает потребитель после завершения каждого ввода данных раздела, позволяет сохранить данные. Сводный аналитический отчет предоставляется после ввода данных. Также представляются диаграммы, описывающие прогресс во времени по отношению к национальной рекомендации. После завершения лабораторного теста на старение тесты доставляются удаленно в приложение. Данные о пользователе, а также данные других пользователей сохраняются в облачной базе данных для дальнейшего анализа.
Пример 6. Анализ данных о состоянии здоровья и метилировании ДНК, основанный на машинном обучении, и персональные рекомендации по улучшению образа жизни.
Данные, полученные от нескольких пользователей, хранятся в облачной базе данных SQL (см. Фигуру 7). Алгоритмы «машинного обучения» используются для анализа данных и построения моделей, соотносящих входные данные анкеты, такие как боль, артериальное давление, ИМТ и настроение, и разницу между возрастом по метилированию ДНК и хронологическим возрастом в качестве результата. Например, с использованием таких методов, как «нейронные сети», деревья решений, регрессия лассо случайных лесов, кластерный анализ K-средних, обучение с подкреплением и «регрессия со штрафом».
Способ настоящего изобретения, включает в себя выполнение статистического анализа ответов на вопросы анкеты и предоставление потребителям динамического отчета в Приложении, который описывает развитие ответов на вопросы анкеты во времени по сравнению с рекомендациями национальных ассоциаций, таких как ассоциации, изучающие вопросы рака, сердечных заболеваний и инсульта и диабета.
Хотя изобретение было объяснено в отношении его предпочтительного варианта осуществления, следует понимать, что можно сделать множество других возможных модификаций и изменений, не выходящих за рамки сущности и объема настоящего изобретения.
Преимущества изобретения
Новаторский аспект способа настоящего изобретения по сравнению с решениями, известными в данной области техники, заключается в том, что комбинация 13 сайтов CG в ранее не описанной области ElovL2 AS1 обеспечивает чрезвычайно высокоточное предсказание возраста по образцам слюны в одном единственном ампликоне. Точность и простота повышаются за счет мультиплексирования и использования надежного секвенирования следующего поколения. Такой подход значительно снижает стоимость и делает тест пригодным для использования в качестве потребительского продукта.
Ссылки
Beauchaine, T. P., & Beauchaine, R. J., 3rd. (2002). A comparison of maximum covariance and K-means cluster analysis in classifying cases into known taxon groups. Psychol Methods, 7(2), 245-261.
Bybee, S. M., Bracken-Grissom, H., Haynes, B. D., Hermansen, R. A., Byers, R. L., Clement, M. J., Crandall, K. A. (2011). Targeted amplicon sequencing (TAS): a scalable next-gen approach to multilocus, multitaxa phylogenetics. Genome Biol Evol, 3, 1312-1323. doi:10.1093/gbe/evr106
Chen, B. H., Marioni, R. E., Colicino, E., Peters, M. J., Ward-Caviness, C. K., Tsai, P. C., Horvath, S. (2016). DNA methylation-based measures of biological age: meta-analysis predicting time to death. Aging (Albany NY), 8(9), 1844-1865. doi:10.18632/aging.101020
Colella, S., Shen, L., Baggerly, K. A., Issa, J. P., & Krahe, R. (2003). Sensitive and quantitative universal Pyrosequencing methylation analysis of CpG sites. Biotechniques, 35(1), 146-150.
De Roach, J. N. (1989). Neural networks--an artificial intelligence approach to the analysis of clinical data. Australas Phys Eng Sci Med, 12(2), 100-106.
Ferrucci, L., Cavazzini, C., Corsi, A., Bartali, B., Russo, C. R., Lauretani, F., Guralnik, J. M. (2002). Biomarkers of frailty in older persons. J Endocrinol Invest, 25(10 Suppl), 10-15.
Freire-Aradas, A., Phillips, C., Mosquera-Miguel, A., Giron-Santamaria, L., Gomez-Tato, A., Casares de Cal, M., Lareu, M. V. (2016). Development of a methylation marker set for forensic age estimation using analysis of public methylation data and the Agena Bioscience EpiTYPER system. Forensic Sci Int Genet, 24, 65-74. doi:10.1016/j.fsigen.2016.06.005
Hardy, A., & Magnello, M. E. (2002). Statistical methods in epidemiology: Karl Pearson, Ronald Ross, Major Greenwood and Austin Bradford Hill, 1900-1945. Soz Praventivmed, 47(2), 80-89.
Hertel, J., Friedrich, N., Wittfeld, K., Pietzner, M., Budde, K., Van der Auwera, S., Grabe, H. J. (2016). Measuring Biological Age via Metabonomics: The Metabolic Age Score. J Proteome Res, 15(2), 400-410. doi:10.1021/acs.jproteome.5b00561
Horvath, S. (2013). DNA methylation age of human tissues and cell types. Genome Biol, 14(10), R115. doi:10.1186/gb-2013-14-10-r115
Jylhava, J., Pedersen, N. L., & Hagg, S. (2017). Biological Age Predictors. EBioMedicine, 21, 29-36. doi:10.1016/j.ebiom.2017.03.046
Kakushadze, Z., & Yu, W. (2017). *K-means and cluster models for cancer signatures. Biomol Detect Quantif, 13, 7-31. doi:10.1016/j.bdq.2017.07.001
Kim, S. M., Kim, Y., Jeong, K., Jeong, H., & Kim, J. (2018). Logistic LASSO regression for the diagnosis of breast cancer using clinical demographic data and the BI-RADS lexicon for ultrasonography. Ultrasonography, 37(1), 36-42. doi:10.14366/usg.16045
Kristensen, L. S., Mikeska, T., Krypuy, M., & Dobrovic, A. (2008). Sensitive Melting Analysis after Real Time - Methylation Specific PCR (SMART-MSP): high-throughput and probe-free quantitative DNA methylation detection. Nucleic Acids Res.
Mann, J. J., Ellis, S. P., Waternaux, C. M., Liu, X., Oquendo, M. A., Malone, K. M., Currier, D. (2008). Classification trees distinguish suicide attempters in major psychiatric disorders: a model of clinical decision making. J Clin Psychiatry, 69(1), 23-31.
Marioni, R. E., Harris, S. E., Shah, S., McRae, A. F., von Zglinicki, T., Martin-Ruiz, C., Deary, I. J. (2018). The epigenetic clock and telomere length are independently associated with chronological age and mortality. Int J Epidemiol, 47(1), 356. doi:10.1093/ije/dyx233
Monaghan, P. (2010). Telomeres and life histories: the long and the short of it. Ann N Y Acad Sci, 1206, 130-142. doi:10.1111/j.1749-6632.2010.05705.x
Mupparapu, M., Wu, C. W., & Chen, Y. C. (2018). Artificial intelligence, machine learning, neural networks, and deep learning: Futuristic concepts for new dental diagnosis. Quintessence Int, 49(9), 687-688. doi:10.3290/j.qi.a41107
Sherbet, G. V., Woo, W. L., & Dlay, S. (2018). Application of Artificial Intelligence-based Technology in Cancer Management: A Commentary on the Deployment of Artificial Neural Networks. Anticancer Res, 38(12), 6607-6613. doi:10.21873/anticanres.13027
Shi, T., Seligson, D., Belldegrun, A. S., Palotie, A., & Horvath, S. (2005). Tumor classification by tissue microarray profiling: random forest clustering applied to renal cell carcinoma. Mod Pathol, 18(4), 547-557. doi:10.1038/modpathol.3800322
Svetnik, V., Liaw, A., Tong, C., Culberson, J. C., Sheridan, R. P., & Feuston, B. P. (2003). Random forest: a classification and regression tool for compound classification and QSAR modeling. J Chem Inf Comput Sci, 43(6), 1947-1958. doi:10.1021/ci034160g
Vetter, V. M., Meyer, A., Karbasiyan, M., Steinhagen-Thiessen, E., Hopfenmuller, W., & Demuth, I. (2018). Epigenetic clock and relative telomere length represent largely different aspects of aging in the Berlin Aging Study II (BASE-II). J Gerontol A Biol Sci Med Sci. doi:10.1093/gerona/gly184
Yanai, H., Budovsky, A., Tacutu, R., & Fraifeld, V. E. (2011). Is rate of skin wound healing associated with aging or longevity phenotype? Biogerontology, 12(6), 591-597. doi:10.1007/s10522-011-9343-6
Yu, M., Heinzerling, T. J., & Grady, W. M. (2018). DNA Methylation Analysis Using Droplet Digital PCR. Methods Mol Biol, 1768, 363-383. doi:10.1007/978-1-4939-7778-9_21
Zhao, Y., Kosorok, M. R., & Zeng, D. (2009). Reinforcement learning design for cancer clinical trials. Stat Med, 28(26), 3294-3315. doi:10.1002/sim.3720
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВОЗРАСТА ЧЕЛОВЕКА ПО ДНК | 2021 |
|
RU2797018C1 |
| БИОМАРКЕРЫ МЕТИЛИРОВАНИЯ ДНК ДЛЯ РАННЕГО ВЫЯВЛЕНИЯ РАКА ШЕЙКИ МАТКИ | 2020 |
|
RU2817569C2 |
| ДЕМЕТИЛИРОВАНИЕ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ГЛАЗНОГО ЗАБОЛЕВАНИЯ | 2019 |
|
RU2804300C2 |
| СПОСОБ АНАЛИЗА НАРУШЕНИЙ, СВЯЗАННЫХ С РАКОМ ЯИЧНИКОВ | 2008 |
|
RU2511408C2 |
| СПОСОБ ОТБОРА ДОЛГОСРОЧНО ПРОДУЦИРУЮЩЕЙ КЛЕТКИ С ПРИМЕНЕНИЕМ АЦИЛИРОВАНИЯ ГИСТОНОВ В КАЧЕСТВЕ МАРКЕРОВ | 2015 |
|
RU2707543C2 |
| ОПУХОЛЕВЫЙ МАРКЕР, РЕАГЕНТ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ МЕТИЛИРОВАНИЯ, НАБОР И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ | 2019 |
|
RU2770928C1 |
| ОПУХОЛЕВЫЙ МАРКЕР, РЕАГЕНТ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ МЕТИЛИРОВАНИЯ, НАБОР И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ | 2019 |
|
RU2775177C1 |
| СПОСОБ АНАЛИЗА ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ | 2008 |
|
RU2492243C2 |
| СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА | 2004 |
|
RU2380423C2 |
| СПОСОБЫ ОБНАРУЖЕНИЯ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА | 2004 |
|
RU2483108C2 |
Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ вычисления биологического возраста субъекта, включающий в себя следующие этапы: (a) экстракция ДНК из субстрата, полученного от субъекта; (b) измерение метилирования ДНК в экстрагированной из субстрата ДНК для получения профиля метилирования ДНК; (c) анализ профиля метилирования ДНК из 13 CG сайтов человека, расположенных в предполагаемой антисмысловой области гена ElovL2, области ElovL2 AS1, как указано в SEQ ID NO: 1, для получения полигенной оценки на основе следующего уравнения вычисления биологического возраста: биологический возраст = (CG1*87.5643+CG2*6.3301+CG3*-0.8691+CG4*1.9468+CG5*40.0336+CG6*49.4303+CG7*-14.7868+CG8*22.9042+CG9*-49.7942+CG10*111.7467+CG11*41.8108+CG12*0.4144+CG13*-150.8005)-71.6872, с использованием уравнений множественной линейной регрессии или нейросетевого анализа; и (d) определение биологического возраста субъекта на основе полигенной оценки, где экстракция ДНК включает в себя экстракцию геномной ДНК из слюны, полученной от субъекта. Также описан набор для определения биологического возраста субъекта для осуществления указанного способа, содержащий средства и реагенты для сбора и стабилизации субстрата от субъекта, сканер для считывания штрихкода в комплекте и инструкции по сбору и стабилизации субстрата, где субстрат представляет собой слюну субъекта и где стабилизация субстрата предназначена для отправки собранного субстрата по почте для экстракции ДНК для измерения метилирования ДНК в экстрагированной из субстрата ДНК для получения профиля метилирования ДНК субъекта для определения биологического возраста субъекта. Изобретение расширяет арсенал средств для вычисления биологического возраста субъекта. 2 н. и 10 з.п. ф-лы, 7 ил., 1 табл., 6 пр.
1. Способ вычисления биологического возраста субъекта, включающий в себя следующие этапы:
(a) экстракция ДНК из субстрата, полученного от субъекта;
(b) измерение метилирования ДНК в экстрагированной из субстрата ДНК для получения профиля метилирования ДНК;
(c) анализ профиля метилирования ДНК из 13 CG сайтов человека, расположенных в предполагаемой антисмысловой области гена ElovL2, области ElovL2 AS1, как указано в SEQ ID NO: 1, для получения полигенной оценки на основе следующего уравнения вычисления биологического возраста:
биологический возраст = (CG1*87.5643+CG2*6.3301+CG3*-0.8691+CG4*1.9468+CG5*40.0336+CG6*49.4303+CG7*-14.7868+CG8*22.9042+CG9*-49.7942+CG10*111.7467+CG11*41.8108+CG12*0.4144+CG13*-150.8005)-71.6872,
с использованием уравнений множественной линейной регрессии или нейросетевого анализа; и
(d) определение биологического возраста субъекта на основе полигенной оценки, где экстракция ДНК включает в себя экстракцию геномной ДНК из слюны, полученной от субъекта.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что измерение метилирования ДНК проводят с использованием способов, включающих в себя пиросеквенирование ДНК, масс-спектрометрию (Epityper™), анализ метилирования на основе ПЦР, бисульфитное секвенирование следующего поколения целевого ампликона на платформе, выбранной из группы секвенаторов HiSeq, MiniSeq, MiSeq и NextSeq, секвенирование Ion Torrent, секвенирование с помощью иммунопреципитации метилированной ДНК (MeDIP) или гибридизации с чипами олигонуклеотидов.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что измерение метилирования ДНК выполняется для полигенных биомаркеров метилирования ДНК, что включает измерение статуса метилирования сайтов CG в указанных 13 CG сайтах человека, которые расположены в предполагаемой антисмысловой области гена ElovL2, области ElovL2 AS1, как указано в SEQ ID NO: 1.
4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что измерение метилирования ДНК проводят с использованием пиросеквенирования ДНК с праймерами, указанными в SEQ ID NO: 2 для прямого биотинилированного праймера, SEQ ID NO: 3 для обратного праймера и SEQ ID NO: 4 для праймера пиросеквенирования.
5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что измерение метилирования ДНК проводят с использованием бисульфитного секвенирования следующего поколения целевого ампликона на платформе, выбранной из группы секвенаторов HiSeq, MiniSeq, MiSeq и NextSeq, с праймерами, указанными в SEQ ID NO: 5 для прямого праймера и SEQ ID NO: 6 для обратного праймера.
6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что измерение метилирования ДНК проводят с использованием анализов метилирования на основе ПЦР, выбранных из группы ПЦР, специфичной для метилирования, и цифровой ПЦР.
7. Способ по п. 1 вычисления биологического возраста среди нескольких субъектов, включающий в себя этапы способа по п. 1 среди нескольких субъектов.
8. Способ по п. 7, отличающийся тем, что измерение метилирования ДНК в экстрагированной из нескольких субстратов ДНК включает следующие этапы:
(a) амплификация экстрагированной от нескольких субстратов геномной ДНК с праймерами, специфичными для мишени, для получения продукта ПЦР 1;
(b) амплификация продукта ПЦР 1 с этапа (a) со штрихкодирующими праймерами для получения продукта ПЦР 2;
(c) выполнение мультиплексного секвенирования в одной реакции секвенирования Miseq следующего поколения с использованием продукта ПЦР 2 с этапа (b);
(d) извлечение данных из мультиплексного секвенирования этапа (c); и
(e) количественное определение метилирования ДНК по данным, извлеченным на этапе (d), для получения профиля метилирования ДНК для каждого субстрата,
где экстракция ДНК включает в себя экстракцию геномной ДНК из слюны, полученной от каждого субъекта из указанных нескольких субъектов.
9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что праймеры, специфичные для мишени, для получения продукта ПЦР 1 содержат праймеры, указанные в SEQ ID NO: 5 для прямого праймера и SEQ ID NO: 6 для обратного праймера, и где штрихкодирующие праймеры для получения продукта ПЦР 2 содержит праймеры, указанные в SEQ ID NO: 7 для прямого праймера и SEQ ID NO: 8 для обратного праймера, который является праймером индекса штрихкода.
10. Набор для определения биологического возраста субъекта для осуществления способа по любому из пп. 1-9, содержащий средства и реагенты для сбора и стабилизации субстрата от субъекта; сканер для считывания штрихкода в комплекте и инструкции по сбору и стабилизации субстрата, где субстрат представляет собой слюну субъекта и где стабилизация субстрата предназначена для отправки собранного субстрата по почте для экстракции ДНК для измерения метилирования ДНК в экстрагированной из субстрата ДНК для получения профиля метилирования ДНК субъекта для определения биологического возраста субъекта.
11. Способ по любому из пп. 1-9 для применения в способе оценки воздействия биологического вмешательства на биологический возраст субъекта, способ включает в себя следующие этапы:
(a) вычисление биологического возраста субъекта с использованием способа по п. 1 для получения начального биологического возраста до биологического вмешательства;
(b) выполнение биологического вмешательства в отношении указанного субъекта;
(c) повторение этапа (a) на следующем субстрате, полученном от указанного субъекта после выполнения этапа (b), для определения биологического возраста после биологического вмешательства;
(d) интегрирование биологического возраста после биологического вмешательства в модель машинного обучения для указанного субъекта, чтобы оценить влияние биологического вмешательства на биологический возраст указанного субъекта,
где биологическое вмешательство на этапе (b) выбрано из группы, состоящей из пищевых добавок, витаминов, терапии, введения исследуемого вещества, диетических манипуляций, метаболических манипуляций, хирургических манипуляций, социальных манипуляций, поведенческих манипуляций, манипуляций с окружающей средой, сенсорных манипуляций, гормональных манипуляций и эпигенетических манипуляций или их комбинаций,
где экстракция ДНК включает в себя экстракцию геномной ДНК из слюны, полученной от субъекта, и
где интеграция биологического возраста после биологического вмешательства в модель машинного обучения для указанного субъекта включает в себя биологический возраст, оцененный на этапе (c), и физиологические параметры, полученные путем обмена данными пользователя от указанного субъекта.
12. Способ по любому из пп. 1-9 для применения в способе скрининга агента на предмет того, обладает ли этот агент антивозрастной активностью, способ включает в себя следующие этапы:
(a) вычисление возраста по субстрату, полученному от субъекта, с применением способа по любому из пп. 1-9 для получения начального биологического возраста до введения тестируемого агента;
(b) введение тестируемого агента указанному субъекту;
(c) повторение этапа (a) на следующем субстрате, полученном от указанного субъекта после выполнения этапа (b), для определения биологического возраста после введения тестируемого агента;
(d) интеграция биологического возраста после введения тестируемого агента в модель машинного обучения для указанного субъекта, чтобы оценить, было ли вычислено снижение возраста путем интеграции в модель машинного обучения, чтобы определить тестируемый агент как средство против старения для указанного субъекта,
где экстракция ДНК включает в себя экстракцию геномной ДНК из слюны, полученной от субъекта, и
где интеграция биологического возраста после введения тестируемого агента в модель машинного обучения для указанного субъекта включает в себя биологический возраст, оцениваемый на этапе (c), и физиологические параметры, полученные в результате обмена данными пользователя от указанного субъекта.
| FREIRE-ARADAS，A | |||
| et al., "Development of a methylation marker set for forensic age estimation using analysis of public methylation data and the Agena Bioscience EpiTYPER system", Forensic Science International: Genetics,Vol | |||
| Пишущая машина для тюркско-арабского шрифта | 1922 |
|
SU24A1 |
| NAUE，J | |||
| et al., "Chronological age prediction based on DNA methylation: Massive parallel | |||
