Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение имеет отношение к улучшенным вариабельным доменам тяжелой цепи иммуноглобулина.

В частности, изобретение касается улучшенных вариабельных доменов тяжелой цепи иммуноглобулина, которые либо имеют экспонированный С-концевой участок или конец (как описано далее, также см. WO 12/175741), либо используются (или предназначены для использования) в таких применениях, где они имеют экспонированный С-концевой участок или конец (опять же, как описано далее). Некоторые из предпочтительных, без ограничения, примеров таковых представлены одиночными вариабельными доменами иммуноглобулина (которые также именуются здесь "ISV" или "ISVD"), такими как нанотела (включая V_HH, гуманизованные V_HH и камелизованные V_H типа камелизованных V_H человека), (однодоменные) антитела, которые представляют собой домены V_H или получены из доменов V_H, и dAbs, которые представляют собой домены V_H или получены из доменов V_H. Некоторыми из предпочтительных, без ограничения, примеров последних являются домены V_H, которые используются (или предназначены для использования) в одноцепочечных Fv (scFv) или диателах.

Изобретение также касается белков, полипептидов и других конструкций, молекул или химических соединений, содержащих или в основном состоящих из (одного или нескольких) улучшенных вариабельных доменов тяжелой цепи иммуноглобулина по изобретению, как описано здесь; способов экспрессии/получения улучшенных вариабельных доменов тяжелой цепи иммуноглобулина по изобретению и/или экспрессии/получения содержащих их белков, полипептидов и других конструкций, молекул или химических соединений; композиций и продуктов (типа фармацевтических композиций и продуктов), содержащих улучшенные вариабельные домены тяжелой цепи иммуноглобулина по изобретению и/или содержащие их белки, полипептиды и другие конструкции, молекулы или химические соединения; последовательностей нуклеотидов и нуклеиновых кислот, кодирующих улучшенные вариабельные домены тяжелой цепи иммуноглобулина по изобретению и/или кодирующих содержащие их белки или полипептиды; и применения (в частности, терапевтического, профилактического и диагностического применения) улучшенных вариабельных доменов тяжелой цепи иммуноглобулина по изобретению и содержащих их белков, полипептидов и других конструкций, молекул или химических соединений.

Другие аспекты, воплощения, преимущества, приложения и применения данного изобретения станут понятными из приведенного здесь дальнейшего описания. Уровень техники

В настоящей заявке аминокислотные остатки/положения в вариабельном домене тяжелой цепи иммуноглобулина будут обозначаться нумерацией по Kabat. Для удобства, на фиг. 1 приведена таблица с перечнем некоторых положений аминокислот, которые конкретно будут упоминаться здесь, и их нумерация в соответствии с некоторыми альтернативными системами нумерации типа АНо и IMGT. Примечание: для настоящего описания и формулы изобретения решающей является нумерация по Kabat; другие системы нумерации приводятся только для справки).

Кроме того, в изобретении вариабельный домен иммуноглобулина, как говорят, имеет "экспонированный C-терминальный конец или участок", если он не связан или не соединен с константным доменом (типа домена C_H1). Сошлемся на приведенные здесь работы из предшествующего уровня техники.

В частности, как описано в заявке WO 12/175741, С-концевой участок (поскольку этот термин также применяется здесь) является частью предполагаемого эпитопа на ISV, который также включает в себя, среди прочих остатков, аминокислотный остаток в положении 14 (и аминокислотные остатки вблизи от него в аминокислотной последовательности, как-то положения 11, 13 и 15), а также может включать аминокислотный остаток в положении 83 (и аминокислотные остатки вблизи от него в аминокислотной последовательности, как-то положения 82, 82а, 82b и 84) и/или аминокислотный остаток в положении 108 (и аминокислотные остатки вблизи от него в аминокислотной последовательности, как-то положение 107). Как и в WO 12/17574, этот предполагаемый эпитоп также собирательно именуется здесь как "С-концевой участок", причем подразумевается, что этот С-концевой участок как минимум включает С-концевую последовательность VTVSS (т.е. каждое из положений 109, 110, 111, 112 и 113) и аминокислотный остаток в положении 14, а также может содержать аминокислотные остатки в положениях 83 и 108, а возможно, и аминокислотные остатки в положениях 13,15, 82b, 83, 84 и 107.

В результате исследований одноцепочечных Fv или "scFv" (которые представляют собой конструкции, содержащие вариабельные домены иммуноглобулина, которые, подобно ISVD, не связаны с константными доменами) в этой области было описано, что С-конец вариабельного домена иммуноглобулина содержит гидрофобный участок, который в обычных полноразмерных антителах погружен в интерфейс между вариабельным доменом и константным доменом, но становится доступным растворителям тогда, когда вариабельный домен не связан с константным доменом (например, см. Nieba et al., Protein Engineering, 10, 435-444 (1997) и Harmsen et al., Molecular Immunology (2000), 579-590).

Также хорошо известно, что эпитопы, которые обычно зарыты в структуре белка (также известные как "неоэпитопы" или "критические эпитопы"), могут запускать иммунную систему, как только они становятся доступны растворителям, например, из-за деградации, неправильной укладки или агрегации данного белка. Например, в случае заглубленных гидрофобных частей биомолекул (так называемых "hyppos") высказывалось предположение, что они составляют часть общего связанного с повреждениями молекулярного шаблона, который приводит к врожденной иммунной реакции, как только hyppos становятся доступны растворителям (к примеру, см. Seong and Matzinger, Nature Reviews 2004, 469), и были описаны различные примеры прежде заглубленных гидрофобных участков, вызывающих иммунные реакции (например, см. David et al., JBC, 2001, 6370-6377; Matsuura et al., International Immunology, 2000, 1183-1192; Rasheed et al., Life Sciences 79 (2000), 2320-2328). В более общем плане также известно, что гидрофобные аминокислоты имеют склонность быть частью B-клеточных эпитопов (например, см. WO 11/07586, page 10; и Kolaskar, FEBS 276, 172-174 (1990)). Так, было описано, что гидрофобный участок на С-конце вариабельного домена тяжелой цепи (как описано в Nieba et al. и Harmsen et al., см. выше) могут образовывать B-клеточные эпитопы, которые могут порождать и/или взаимодействовать с (возникающими и/или предсуществующими) антителами против лекарственных препаратов (WO 11/07586). По этой причине было предложено мутировать некоторые аминокислотные остатки, входящие в состав С-концов вариабельных доменов, чтобы уменьшить гидрофобность и/или удалить B-клеточные эпитопы. К примеру, Nieba et al. предложили мутировать положения 11, 14, 41, 84, 87 и/или 89 в области V_H (нумерация по Kabat), а в WO 11/07586 предложили мутировать положения 99, 101 и/или 148 (нумерация по АНо) домена V_L или положения 12, 97, 98, 99, 103 и/или 144 домена V_H (опять же по АНо - эти положения соответствуют положениям 11, 83, 84, 85, 89 и 103 согласно Kabat). Аналогичным образом Harmsen et al. предложили мутировать положения 12 и 101 (нумерация по IMGT; это положения 11 и 89 согласно Kabat), чтобы компенсировать отсутствие домена C_H1; и они также идентифицировали определенное подсемейство V_HH (названное "V_HH4"), содержащее аминокислоты, которые являются подходящими кандидатами для замен по этим положениям.

Также было описано (к примеру, см. WO 12/175741 и ссылки, приведенные в следующих абзацах), что биологические образцы, взятые у людей, могут содержать (предсуществующие) белки или факторы, которые способны связываться с экспонированным С-концевым участком или концом вариабельного домена иммуноглобулина (например, С-концевым участком или концом ISVD или домена V_H или V_L в scFv или диателах).

Например, в WO 2013/024059 заявлено, что "в сыворотке от некоторых здоровых наивных человеческих субъектов уже присутствуют аутоантитела против V_H, которые могут связывать и антитела против домена V_H, и молекулы V_HH, а также аутоантитела против V_L (например, против V-каппа (VK)), которые могут связывать молекулы V_L", и что "предсуществующие ADAs, которые связывают dAbs к V_H, подобны антишарнирным антителам в том, что они связывают фрагменты IgG, но не связывают те же самые последовательности, находящиеся in situ на интактных IgG".

В Holland et al., J. Clin. Immunol. 2013, 33(7): 1192-203 описано, что в крови примерно половины нормальных здоровых людей содержатся различные уровни нового класса аутоантител против IgG, которые могут связываться с каркасными последовательностями полностью человеческих антител против домена V_H (которые Holland et al. также именуют "аутоантителами HAVH"). Holland et al. также отмечают, что эти аутоантитела относятся главным образом к изотипу IgG, проявляют сравнительно высокое сродство (около 10^-10 М) к последовательностям V_H, а свободный С-конец представляется важным для связывания этих аутоантител HAVH с доменами V_H.

Вопросы касательно предсуществующих антител против биотерапевтических молекул, реагирующих с биотерапевтическими средствами, и их регуляторного воздействия в общем виде также обсуждаются в Xue et al., AAPS J. 2013, 15(3): 852-5.

Вышеприведенные работы предшествующего уровня техники также касаются способов, которыми можно модифицировать последовательность вариабельного домена иммуноглобулина с тем, чтобы предотвратить или уменьшить связывание таких предсуществующих антител/факторов с вариабельными доменами. В этом отношении, в WO 2011/07586 предлагается произвести одну или несколько мутаций в аминокислотной последовательности вариабельного домена по некоторым определенным положениям этого домена (эти положения выходят на поверхность). В WO 12/175741 описано, что связывание таких предсуществующих антител/факторов можно уменьшить путем добавления нескольких аминокислотных остатков (даже всего лишь одного остатка аланина) к С-концевому участку домена V_H и/или путем введения одной или нескольких специфических замен или делеций в С-концевом участке вариабельного домена, который в WO 12/175741 описан как включающий по меньшей мере С-концевую аминокислотную последовательность VTVSS и аминокислотный остаток в положении 14 (в отношении этого положения в WO 12/175741 сказано, что присутствие остатка аланина обеспечивает снижение связывания предсуществующих антител по сравнению с присутствием "человеческого" аминокислотного остатка пролина), а возможно также и аминокислотные остатки в положениях 108 и 83 и аминокислотные остатки, близкие к данным положениям (в WO 2013/024059 говорится в основном то же, что и в WO 12/175741).

Например, в исследованиях, проведенных заявителем/правопреемником, которые привели к подаче WO 12/175741, было обнаружено, что добавление всего лишь одного остатка аланина в С-концевой участок или конец экспонированного домена V_H, как правило, предотвращает/устраняет (практически полностью) связывание предсуществующих антител/факторов, присутствующих в образцах, взятых у большинства испытуемых (к примеру, см. стр. 62, строки 20-25, и от строки 30 на стр. 57 до строки 3 на стр. 58 в WO 12/175741); причем эти данные были подтверждены дополнительными результатами, полученными заявителем/правопреемником после подачи WO 12/175741, когда замену на С-концевой аланин из WO 12/175741 применяли к другим нанотелам (данные не приводятся).

Кроме того, в WO 12/175741, а также в WO 12/175400 от заявителя/правопреемника применяли С-концевые удлинения, описанные в WO 12/175741, к определенным нанотелам, связывающим сывороточный альбумин (к примеру, см. WO 12/175741: SEQ ID NOs: 37, 51-53 и 55-64 и конструкции, представленные в SEQ ID NOs: 41, 43 и 44; и WO 12/175400: SEQ ID NOs: 6-11).

На фиг. 9 в WO 12/175741 также приведены две связывающие альбумин последовательности, которые используются в качестве эталонных последовательностей ниже в «Экспериментальной части». Это последовательность SEQ ID NO: 37 на фиг. 9 в WO 12/175741 (которая также приводится здесь как "стандарт В", эта последовательность приведена здесь как SEQ ID NO: 45) и "SEQ ID NO: 37 без добавленных С-концевых аминокислотных остатков" на фиг. 9 в WO 12/175741 (которая также приводится здесь как "стандарт А", эта последовательность приведена в SEQ ID NO: 44). Стандарт А и стандарт В происходят из последовательности гуманизованного нанотела против альбумина "Alb-s'', которая приведена как SEQ ID NO: 62 в WO 06/122787 (а также приводится здесь как "Alb-11"), но, по сравнению с последовательностью Alb-11, стандарт А содержит N-концевую His-метку, а стандарт В содержит N-концевую His-метку и С-концевой остаток аланина. Стандарт А, стандарт В и Alb-8/Alb-11 содержат CDRs, приведенные в SEQ ID NOs: 41-43, соответственно.

Другие примеры нанотел и других одиночных вариабельных доменов иммуноглобулина, имеющих С-концевые удлинения и/или мутации в С-концевом участке, можно найти, к примеру, в следующих работах предшествующего уровня техники: WO 06/129843 (например, см. SEQ ID NOs: 4, 6, 8 и 10); WO 03/035695 (например, см. некоторые из последовательностей, приведенных на стр. 61-64); Vu et al., Molecular Immunology, 1121-1131, 1997 (например, см. некоторые из последовательностей, приведенных на фиг. 2); WO 11/003622 (например, см. последовательности, приведенные в SEQ ID NOs: 10-27); WO 09/058383 (например, см. последовательность TAR2h-10-27, упомянутую на стр. 51); WO 10/042815 (например, см. последовательности SEQ ID NOs: 1, 17, 27 и 30); и WO 04/044204 (например, см. последовательности SEQ ID NOs: 31, 35, 37, 47 и 49).

В некоторых из приведенных здесь ссылок также приведены примеры последовательностей ISVD, в которых последняя С-концевая аминокислота ISVD представлена другой аминокислотой, чем серии (S), например, потому, что серии в положении 113 был заменен другой аминокислотой, и/или потому, что серии в положении 113 был удален и была добавлена С-концевая аминокислота (на практике, конечный результат с точки зрения С-концевой аминокислотной последовательности будет таким же).

В некоторых из приведенных здесь ссылок также приводятся примеры нанотел и других одиночных вариабельных доменов иммуноглобулина, в которых аминокислота в положении 112 не представлена серином. К примеру, в WO 12/175741 описаны нанотела, в которых аминокислота в положении 112 представлена глицином (G); в Vu et al. (выше) описаны нанотела, в которых положение 112 представлено аланином (А) или изолейцином (I); в WO 13/024059 представлена замена S112A; а в WO 08/020079, цитированном ниже, представлена замена S112F, а также вообще утверждается, что описанные там нанотела могут содержать ограниченное число аминокислотных остатков, добавляемых в С-концевой участок аминокислотной последовательности нанотела.

В исследованиях, ведущих к настоящему изобретению, после того, как было установлено, что введение С-концевого удлинения (которое может быть представлено всего лишь одним С-концевым остатком аланина, опять же см. WO 12/175741, пример 3) в С-концевой участок или конец нанотела практически предотвращает/устраняет связывание предсуществующих антител/факторов в большинстве образцов испытуемых/пациентов, исследовали, будут ли образцы, полученные от испытуемых (здоровых добровольцев и/или пациентов, страдающих от болезни или заболевания), содержать (другие) предсуществующие антитела или факторы, которые могут связываться с экспонированным С-концевым участком нанотела (или другого домена V_H) даже при наличии С-концевого удлинения. При этом авторы настоящего изобретения обнаружили, что, хотя практически не выявляется связывания таких предсуществующих антител с доменом V_H с С-концевым удлинением в крови или сыворотке здоровых добровольцев или в крови или сыворотке, полученной от больных, страдающих одним из целого ряда различных заболеваний (включая некоторые воспалительные заболевания или аутоиммунные заболевания - данные не приводятся), но в некоторых образцах крови или сыворотки, полученных от некоторых (но не всех) испытуемых, страдающих некоторыми тяжелыми (ауто)иммунными заболеваниями (типа системной красной волчанки; сокращенно "SLE"), содержатся какие-то предсуществующие антитела/факторы, которые могут связываться с нанотелами даже тогда, когда данные нанотела содержат С-концевое удлинение.

Сущность изобретения

Итак, в общем целью настоящего изобретения является получение улучшенных вариабельных доменов тяжелой цепи иммуноглобулина (в частности, улучшенных ISVD тяжелой цепи, более предпочтительно улучшенных нанотел), которые, когда у них есть экспонированный С-концевой участок или конец, будут менее склонны связываться с предсуществующими антителами/факторами типа тех, что обнаружены в образцах крови или сыворотки, полученных от испытуемых.

В частности, целью настоящего изобретения является получение улучшенных вариабельных доменов тяжелой цепи иммуноглобулина, которые, когда у них есть экспонированный С-концевой участок или конец, будут менее склонны связываться с предсуществующими антителами/факторами (опять же типа тех, что обнаруживаются в образцах крови или сыворотки, полученных от испытуемых), которые все-таки могут связываться с экспонированным С-концевым участком или концом вариабельного домена тяжелой цепи и тогда, когда данный домен содержит С-концевое удлинение (к примеру, как описано в WO 12/175741, WO 13/024059 и в других приведенных здесь работах предшествующего уровня техники).

Как уже отмечалось, такие предсуществующие антитела, которые могут связываться с вариабельным доменом тяжелой цепи с С-концевым удлинением, были обнаружены авторами настоящего изобретения в образцах крови или сыворотки, полученных от испытуемых, страдающих определенными (ауто)иммунными заболеваниями, при которых иммунная система подвергается сильному воздействию/активируется (типа SLE).

Итак, более предпочтительно целью настоящего изобретения является получение улучшенных вариабельных доменов тяжелой цепи иммуноглобулина (в частности, улучшенных ISVD тяжелой цепи, более предпочтительно улучшенных нанотел), которые, когда у них есть экспонированный С-концевой участок или конец, будут менее склонны связываться с предсуществующими антителами/факторами типа тех, что обнаружены в образцах крови или сыворотки, полученных от испытуемых, страдающих определенными (ауто)иммунными заболеваниями, при которых иммунная система подвергается сильному воздействию/активируется (типа SLE).

Еще более предпочтительно целью настоящего изобретения является получение улучшенных вариабельных доменов тяжелой цепи иммуноглобулина (в частности, улучшенных ISVD тяжелой цепи, более предпочтительно улучшенных нанотел), которые, когда у них есть экспонированный С-концевой участок или конец, будут менее склонны связываться с такими предсуществующими антителами/факторами, которые обнаружены в образцах крови или сыворотки, полученных от испытуемых, страдающих определенными (ауто)иммунными заболеваниями, которые все-таки могут связываться с экспонированным С-концевым участком или концом вариабельного домена тяжелой цепи и тогда, когда данный домен содержит С-концевое удлинение.

И вот теперь оказалось, что связывание предсуществующих антител/факторов с вариабельным доменом тяжелой цепи с экспонированным С-терминальным концом может (еще больше) снижаться при мутации серина в положении 112 (нумерация по Kabat) на лизин (K) или глутамин (Q). В частности, оказалось, что такая мутация S112K или S112Q может (еще больше) снижать или практически предотвращать/устранять связывание таких предсуществующих антител/факторов, которые могут связываться с вариабельным доменом тяжелой цепи, содержащим С-концевое удлинение (но без мутации S112K или S112Q), типа тех предсуществующих антител/факторов, что обнаружены в крови или сыворотке испытуемых, страдающих тяжелыми аутоиммунными заболеваниями типа SLE).

Также оказалось, что введение определенных мутаций, описанных здесь (в частности, следующих мутации L11V в комбинации с V89L, и необязательно также в комбинации с T110K) может улучшить или способствовать (дальнейшему) улучшению растворимости таких одиночных вариабельных доменов иммуноглобулина, как ISVDs, в общем и в частности раскрытых в настоящем описании (данные не приводятся).

Так, в первом аспекте настоящее изобретение касается вариабельных доменов тяжелой цепи иммуноглобулина (доменов V_H), у которых аминокислотный остаток в положении 112 (нумерация по Kabat) представлен остатком лизина (K) либо остатком глутамина (Q). Такие вариабельные домены тяжелой цепи иммуноглобулина также обозначаются здесь как "домены V_H по изобретению". А когда домен V_H по изобретению представляет собой одиночный вариабельный домен иммуноглобулина (что предпочтительно), он также обозначается здесь как "ISVD по изобретению". Точно так же, когда домен V_H по изобретению представляет собой нанотело (что еще более предпочтительно), он также обозначается здесь как "нанотело по изобретению".

Как правило, домены V_H по изобретению имеют экспонированный С-терминальный конец или участок и/или находятся в белках, полипептидах, соединениях, объектах или конструкциях, в которых они имеют экспонированный С-терминальный конец или участок, и/или предназначены для применения, в котором они имеют экспонированный С-концевой участок (например, для применения в белках, полипептидах, соединениях, объектах или конструкциях, в которых они должны образовывать С-терминальный конец или участок).

В одном аспекте изобретения домен V_H по изобретению представляет собой одиночный вариабельный домен (тяжелой цепи) иммуноглобулина, что означает такой вариабельный домен тяжелой цепи, который может образовывать функциональный сайт связывания антигена без взаимодействия с доменом V_L. Например, домен V_H по изобретению может представлять собой нанотело (включая V_HH, гуманизованные V_HH и камелизованные V_H типа камелизованных V_H человека), (однодоменное) антитело, которое представляет собой домен V_H или получено из домена V_H, либо dAb, которое представляет собой домен V_H или получено из домена V_H. Домен V_H по изобретению предпочтительно представляет собой нанотело (например, домен V_HH, гуманизованный домен V_HH или камелизованный домен V_H типа камелизованного домена V_H человека).

В соответствии с другим аспектом изобретения, домен V_H по изобретению может представлять собой такой вариабельный домен тяжелой цепи, который в том белке, полипептиде, объекте или конструкции, в котором он находится, действительно требует взаимодействия с доменом V_L для образования сайта связывания с антигеном и действительно имеет или образует экспонированный С-терминальный конец или участок. Например, домен V_H в соответствии с этим аспектом изобретения может представлять собой домен V_H, который находится и/или используется в scFv и/или диателах.

В соответствии с более конкретным аспектом изобретения, домен V_H по изобретению имеет С-концевую последовательность (положения 109-113 по Kabat), которая представлена VTVKS (SEQ ID NO: 1) или VTVQS (SEQ ID NO: 2), либо последовательность, которая отличается по одной аминокислоте (то есть в одном из положений 109, 110, 111 или 113) от последовательности VTVKS и/или VTVQS и к тому же содержит лизин (K) или глутамин (Q) в положении 112.

Кроме того, как описано далее, в одном особенно предпочтительном аспекте изобретения, домен V_H по изобретению также содержит С-концевое удлинение (например, как описано в WO 12/175741 и/или WO 13/024059) на С-конце (т.е. оно соединяется с остатком серина на конце VTVKS, VTVQS или аналогичного мотива), в частности, такое С-концевое удлинение, которое определено далее. Однако, как также описано далее, также возможно, что VTVKS, VTVQS или аналогичный мотив образует С-терминальный конец домена V_H (хотя, как правило, это менее предпочтительно) или же домен V_H по изобретению соединяется по С-терминальному концу (необязательно через подходящий линкер) с другой аминокислотной последовательностью, группировкой, доменом или связывающим блоком. Например, когда домен V_H по изобретению представлен ISVD, то домен V_H может соединяться по С-терминальному концу с другим ISVD, необязательно через линкер (причем данный другой ISVD также может представлять собой домен V_H по изобретению).

В целом, как это хорошо известно для вариабельных доменов иммуноглобулина вообще, домены V_H по изобретению должны содержать 4 каркасных участка (FW1, FW2, FW3 и FW4) и 3 участка CDR (CDR1, CDR2 и CDR3). Как и с вариабельными доменами вообще, последовательности участков CDR будут зависеть от того антигена/мишени, к которому домены V_H по изобретению были получены и/или с которыми они должны связываться. Каркасные участки в общем могут представлять собой любые подходящие каркасные участки для доменов V_H (хотя положение 112 и/или положение 89 должно быть таким, как описано далее). Если доменом V_H по изобретению является ISVD, то домен V_H должен иметь каркасные последовательности, которые подходят для ISVD (необязательно в сочетании с одним или несколькими из участков CDR). Например, если доменом V_H по изобретению является нанотело, то каркасные участки в общем должны содержать подходящее количество характерных для V_HH остатков (в отношении которых сошлемся, к примеру, на WO 08/020079 и некоторые другие приведенные здесь патентные заявки заявителя/правопреемника).

Так, например, когда доменами V_H по изобретению являются нанотела, данные нанотела по изобретению могут содержать один или несколько "характерных остатков", которые характерны для V_HH/нанотел (например, в положениях 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 и/или 108; к примеру, см. таблицы А-3 и от А-5 до А-8 в WO 08/020079); один или несколько других аминокислотных остатков, которые могут присутствовать в V_HH/нанотелах (типа одной или нескольких гуманизирующих замен, которые известны per se для V_HH и нанотел; сошлемся, к примеру, на WO 08/020079, опять же см. упомянутые ранее таблицы А-3 и от А-5 до А-8), и/или один или несколько других подходящих аминокислотных остатков или замен для V_HH/нанотел; или же любые подходящие комбинации таких аминокислотных остатков/замен.

Нанотела по изобретению, у которых в положении 112 находится K или Q (с С-концевым удлинением или без него), предпочтительно в положении 11 содержат аминокислоту, которая выбрана из L (этот аминокислотный остаток чаще всего встречается в V_HH), Е, K, М, S, V, W и Y; более предпочтительно из L, Е, K, V и Y и еще более предпочтительно из L, K и V (причем наиболее предпочтительным является V). К примеру, и без ограничения, по сравнению с остатком лейцина, который чаще всего встречается в V_HH, они могут содержать мутацию L11K или L11V. К примеру, но без ограничения, они также могут содержать мутацию Q108L (хорошо известная гуманизирующая замена для V_HH/нанотел). Другие аминокислотные остатки, которые могут присутствовать (опять же, без ограничения, к примеру, в этих положениях также могут присутствовать и другие аминокислотные остатки, которые естественным образом встречаются в этом положении в V_H или V_HH человека), представлены, например, одним или несколькими из аланина (А) в положении 14 (этот аминокислотный остаток очень часто встречается в природных V_HH), пролина в положении 14 (это наиболее распространенная аминокислота в этом положении в доменах V_H человека), а также мутаций, предложенных Harmsen et al. (в частности, те, которые Harmsen et al. предложили, исходя из последовательности V_HH класса V_HH4, как-то V89M или V89T), и/или (другие) мутации в положениях, предложенных Nieba (например, в одном или нескольких из положений 11, 87 и/или 89, см. Nieba, стр. 437, правый столбец). Другой подходящей мутацией является, к примеру, T110K или T110Q. А также: (i) в положении 41 может находиться, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-6 в WO 08/020079 для положения 41, в частности, это может быть (или выбран из них) пролин (Р), серии (S), треонин (Т), аланин (А) или лейцин (L), то есть из числа тех аминокислотных остатков, которые чаще всего встречаются в этом положении у людей или лам, более предпочтительно это может быть пролин (Р) или аланин (А); и/или (ii) в положении 42 может находиться, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-6 в WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (Е), и/или (iii) в положении 87 может находиться, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-7 в WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (Т) или аланин (А).

В соответствии с более конкретным аспектом изобретения, домен V_H по изобретению (такой, как описано далее) имеет последовательность каркасного участка 4 (FW4), которая представлена:

а) одной из последовательностей FW4 по SEQ ID NOs: 3-20, приведенных ниже в табл.1:

или

b) последовательностью, которая имеет не более 3, предпочтительно не более 2 отличий по аминокислотам по меньшей мере от одной из последовательностей FW4 по SEQ ID Nos: 3-20, в которой (i) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 112 по нумерации Kabat, представлен K или Q; а также (ii) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 103 по нумерации Kabat, предпочтительно представлен W или R; (iii) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 104 по нумерации Kabat, предпочтительно представлен G; (iv) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 106 по нумерации Kabat, предпочтительно представлен G; (v) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 107 по нумерации Kabat, предпочтительно представлен Т; (vi) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 108 по нумерации Kabat, предпочтительно представлен Q или L (а в гуманизованных нанотелах это предпочтительно L); (vii) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 109 по нумерации Kabat, предпочтительно представлен V; (viii) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 110 по нумерации Kabat, предпочтительно представлен Т (или же это может быть K или Q); (ix) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 111 по нумерации Kabat, предпочтительно представлен V. Ниже в табл. 2 приведены некоторые неограничительные примеры аминокислотных остатков, которые могут присутствовать в различных положениях (пронумерованных согласно Kabat) в таких последовательностях FW4.

Предпочтительно домен V_H по изобретению имеет последовательность каркасного участка 4 (FW4), которая представлена:

a) WGQGTQVTVKS (SEQ ID NO: 3) или WGQGTQVTVQS (SEQ ID NO: 12); или

b) последовательностью, которая имеет не более 3, предпочтительно не более 2 отличий по аминокислотам (как-то отличие лишь по одной аминокислоте) от SEQ ID NO: 3 и/или SEQ ID NO: 12, в которой (i) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 112 по нумерации Kabat, представлен K или Q; а также (ii) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 103 по нумерации Kabat, предпочтительно представлен W или R; (iii) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 104 по нумерации Kabat, предпочтительно представлен G; (iv) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 106 по нумерации Kabat, предпочтительно представлен G; (v) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 107 по нумерации Kabat, предпочтительно представлен Т; (vi) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 108 по нумерации Kabat, предпочтительно представлен Q или L (а в гуманизованных нанотелах это предпочтительно L); (vii) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 109 по нумерации Kabat, предпочтительно представлен V; (viii) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 110 по нумерации Kabat, предпочтительно представлен Т (или же это может быть K или Q); (ix) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 111 по нумерации Kabat, предпочтительно представлен V. Опять же в табл. 2 приведены некоторые неограничительные примеры аминокислотных остатков, которые могут присутствовать в различных положениях (пронумерованных согласно Kabat) в таких последовательностях FW4.

Как описано далее, в соответствии с предпочтительным аспектом изобретения, домены V_H по изобретению, содержащие такую последовательность FW4, как описано выше, предпочтительно также содержат С-концевое удлинение (как описано далее). Однако, тоже как описано далее, также возможно, что последовательность FW4 образует С-терминальный конец домена V_H (хотя это обычно менее предпочтительно) или же домен V_H по изобретению соединяется по С-терминальному концу (необязательно через подходящий линкер) с другой аминокислотной последовательностью, группировкой, доменом или связывающим блоком. Например, когда домен V_H по изобретению представлен ISVD, домен V_H может соединяться по С-терминальному концу с другим ISVD, необязательно через линкер (а данный другой ISVD также может являться доменом V_H по изобретению).

Как указано здесь, в соответствии с предпочтительным, но не ограничительным аспектом изобретения, домены V_H по изобретению содержат С-концевое удлинение, типа такого С-концевого удлинения, которое описано в WO 12/175741 и/или в WO 13/024059, в особенности как описано в WO 12/175741.

Так, в соответствии с этим аспектом, домен V_H по изобретению представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина (домен V_H), в котором: (i) аминокислотный остаток в положении 112 (нумерация по Kabat) не является остатком серина, а предпочтительно представлен либо остатком лизина (K), либо остатком глутамина (Q); а также (ii) соединяется по С-терминальному концу (т.е. с аминокислотным остатком в положении, соответствующем положению 113 по нумерации Kabat) с другой аминокислотной последовательностью (т.е. "С-концевым удлинением"), которое включает от 1 до 5 аминокислотных остатков (как-то 1, 2, 3, 4 или 5, предпочтительно 1, 2 или 3 и наиболее предпочтительно только 1 или 2, как-то лишь 1), каждый из которых независимо выбран из подходящих аминокислотных остатков, а предпочтительно каждый из них независимо выбран из встречающихся в природе аминокислот, а еще более предпочтительно каждый из них независимо выбран из группы, состоящей из аланина (А), глицина (G), валина (V), лейцина (L) или изолейцина (I) (хотя, как это видно из данных, представленных в WO 12/17574, в составе С-концевого удлинения также могут использоваться остатки других аминокислот, таких как серии, пролин, треонин и/или лизин).

В частности, в соответствии с этим аспектом изобретения, домен V_H по изобретению предпочтительно имеет С-концевую последовательность, которая представлена VTVKS(X)_n (SEQ ID NO: 21) или VTVQS(X)_n (SEQ ID NO: 22) или же такой аминокислотной последовательностью, у которой в положениях мотива VTVKS или мотива VTVQS имеется отличие по одной аминокислоте от последовательности VTVKS и/или VTVQS, но сохраняется лизин (K) или глутамин (Q) в положении 112, при этом (i) аминокислотные остатки мотива VTVKS или VTVQS (либо мотива, подобного VTVKS или VTVQS) соответствуют положениям 109-113 домена V_H по нумерации Kabat; (ii) n равно 1-10, предпочтительно 1-5, как-то 1, 2, 3, 4 или 5 (предпочтительно 1 или 2, как-то 1); и (iii) каждый X означает остаток аминокислоты (предпочтительно встречающейся в природе), которая выбрана независимо, а предпочтительно выбрана независимо из группы, состоящей из аланина (А), глицина (G), валина (V), лейцина (L) и изолейцина (I).

Более предпочтительно, в соответствии с этим аспектом изобретения, домен V_H по изобретению в качестве последовательности FW4 может иметь одну из последовательностей FW4 по SEQ ID NOs 3-20 (или аминокислотную последовательность, которая имеет не более 3, предпочтительно не более 2 отличий по аминокислотам по меньшей мере от одной из последовательностей FW4 по SEQ ID NOs 3-20, причем аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 112 по нумерации Kabat, представлен K или Q), в которой данная последовательность FW4 соединяется по С-терминальному концу с С-концевым удлинением (Х)_n, где n равно 1-10, предпочтительно 1-5, как-то 1, 2, 3, 4 или 5 (предпочтительно 1 или 2, как-то 1); а каждый X означает остаток аминокислоты (предпочтительно встречающейся в природе), которая выбрана независимо, а предпочтительно выбрана независимо из группы, состоящей из аланина (А), глицина (G), валина (V), лейцина (L) и изолейцина (I).

Соответственно, в этом аспекте изобретения домен V_H по изобретению может иметь на своем С-терминальном конце:

а) одну из аминокислотных последовательностей, приведенных в виде SEQ ID NOs: 23-40 в табл. 3:

в которой (i) аминокислотные остатки последовательностей FW4, которые предшествуют (Х)_n в С-концевом удлинении по SEQ ID NOs: 23-40, соответствуют положениям аминокислот в FW4 домена V_H (т.е. положениям 103-113 по нумерации Kabat); (ii) n равно 1-10, предпочтительно 1-5, как-то 1, 2, 3, 4 или 5 (предпочтительно 1 или 2, как-то 1); и (iii) каждый X означает остаток аминокислоты (предпочтительно встречающейся в природе), которая выбрана независимо, а предпочтительно выбрана независимо из группы, состоящей из аланина (А), глицина (G), валина (V), лейцина (L) и изолейцина (I); или

b) аминокислотную последовательность, имеющую не более 3, предпочтительно не более 2 отличий по аминокислотам по меньшей мере от одной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NOs: 23-40 (причем данные отличия по аминокислотам приходятся на положения, соответствующие положениям аминокислот в FW4 домена V_H, т.е. на положения 103-113 по нумерации Kabat, без учета каких-либо отличий по аминокислотам в пределах С-концевого удлинения (Х)_n), при этом: (i) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 112 по нумерации Kabat, представлен K либо Q; (ii) n равно 1-10, предпочтительно 1-5, как-то 1, 2, 3, 4 или 5 (предпочтительно 1 или 2, как-то 1); и (iii) каждый X означает остаток аминокислоты (предпочтительно встречающейся в природе), которая выбрана независимо, а предпочтительно выбрана независимо из группы, состоящей из аланина (А), глицина (G), валина (V), лейцина (L) и изолейцина (I). Опять же, в дополнение к пунктам (i)-(iii), приведенным в предыдущем предложении, в такой аминокислотной последовательности: (iv) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 103 по нумерации Kabat, предпочтительно представлен W или R; (v) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 104 по нумерации Kabat, предпочтительно представлен G; (vi) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 106 по нумерации Kabat, предпочтительно представлен G; (vii) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 107 по нумерации Kabat, предпочтительно представлен Т; (viii) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 108 по нумерации Kabat, предпочтительно представлен Q или L (а в гуманизованных нанотелах это предпочтительно L); (ix) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 109 по нумерации Kabat, предпочтительно представлен V; (х) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 110 по нумерации Kabat, предпочтительно представлен Т (или же это может быть K или Q); (xi) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 111 по нумерации Kabat, предпочтительно представлен V; опять же отсылаем к табл. 2 насчет таких аминокислотных остатков, которые могут присутствовать в каждом положении.

Предпочтительно, в соответствии с этим аспектом изобретения, домен V_H по изобретению может иметь на своем С-терминальном конце:

а) аминокислотную последовательность, представленную WGQGTQVTVKS(X)_n (SEQ ID NO: 23) или WGQGTQVTVQS(X)_n (SEQ ID NO: 32), где n равно 1-10, предпочтительно 1-5, как-то 1, 2, 3, 4 или 5 (предпочтительно 1 или 2, как-то 1); а каждый X означает остаток аминокислоты (предпочтительно встречающейся в природе), которая выбрана независимо, а предпочтительно выбрана независимо из группы, состоящей из аланина (А), глицина (G), валина (V), лейцина (L) и изолейцина (I); или

b) аминокислотную последовательность, имеющую не более 3, предпочтительно не более 2 отличий по аминокислотам по меньшей мере от одной из аминокислотных последовательностей WGQGTQVTVKS(X)_n (SEQ ID NO: 23) и WGQGTQVTVQS(X)_n (SEQ ID NO: 32) (причем данные отличия по аминокислотам приходятся на положения, соответствующие положениям аминокислот в FW4 домена V_H, т.е. на положения 103-113 по нумерации Kabat, без учета каких-либо отличий по аминокислотам в пределах С-концевого удлинения (Х)_n), при этом: (i) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 112 по нумерации Kabat, представлен K либо Q; (ii) n равно 1-10, предпочтительно 1-5, как-то 1, 2, 3, 4 или 5 (предпочтительно 1 или 2, как-то 1); и (iii) каждый X означает остаток аминокислоты (предпочтительно встречающейся в природе), которая выбрана независимо, а предпочтительно выбрана независимо из группы, состоящей из аланина (А), глицина (G), валина (V), лейцина (L) и изолейцина (I). Опять же в отношении таких аминокислотных последовательностей предпочтительно также применимы пункты (vi)-(xi), описанные в предыдущих абзацах.

Также, как указано здесь, домены V_H по изобретению могут содержать и другие аминокислотные остатки или замены, которые известны per se для доменов V_H и в особенности для ISVD (более предпочтительно для нанотел) в соответствующих положениях. Можно привести некоторые неограничительные примеры, которые включают, к примеру, один или несколько "характерных остатков", которые характерны для V_HH/нанотел (в том числе, к примеру, лейцин (L) в положении 11), другие аминокислотные остатки, которые обычно встречаются в V_HH (как-то аланин (А) в положении 14), гуманизирующие замены, известные per se для V_HH/нанотел (как-то Q108L и А14Р), одну или несколько из мутаций, предложенных Harmsen (как-то V89M или V89T) и/или в положениях, предложенных Nieba (например, 11, 87 или 89); или же любые подходящие комбинации из них; и/или, к примеру, мутации T110K, T110Q или V89L.

Когда домен V_H по изобретению содержит С-концевое удлинение (Х)_n, то в соответствии с некоторыми предпочтительными, но неограничительными примерами таких удлинений X и n могут означать:

a) n=1 и Х=Ala;

b) n=2 и каждый X=Ala;

c) п=3 и каждый X=Ala;

d) n=2 и по меньшей мере один X=Ala (а остальные аминокислотные остатки X выбраны независимо из встречающихся в природе аминокислот, но предпочтительно они выбраны независимо из Val, Leu и/или Ile);

e) n=3 и по меньшей мере один X=Ala (а остальные аминокислотные остатки X выбраны независимо из встречающихся в природе аминокислот, но предпочтительно они выбраны независимо из Val, Leu и/или Ile);

f) n=3 и по меньшей мере два X=Ala (а остальные аминокислотные остатки X выбраны независимо из встречающихся в природе аминокислот, но предпочтительно они выбраны независимо из Val, Leu и/или Ile);

g) n=1 и X=Gly;

h) n=2 и каждый X=Gly;

i) n=3 и каждый X=Gly;

j) n=2 и по меньшей мере один X=Gly (а остальные аминокислотные остатки X выбраны независимо из встречающихся в природе аминокислот, но предпочтительно они выбраны независимо из Val, Leu и/или Ile);

k) n=3 и по меньшей мере один X=Gly (а остальные аминокислотные остатки X выбраны независимо из встречающихся в природе аминокислот, но предпочтительно они выбраны независимо из Val, Leu и/или Ile);

l) n=3 и по меньшей мере два X=Gly (а остальные аминокислотные остатки X выбраны независимо из встречающихся в природе аминокислот, но предпочтительно они выбраны независимо из Val, Leu и/или Ile);

m) n=2 и каждый X=Ala или Gly;

n) n=3 и каждый X=Ala или Gly;

о) n=3 и по меньшей мере один X=Ala или Gly (а остальные аминокислотные остатки X выбраны независимо из встречающихся в природе аминокислот, но предпочтительно они выбраны независимо из Val, Leu и/или Ile);

р) n=3 и по меньшей мере два X=Ala или Gly (а остальные аминокислотные остатки X выбраны независимо из встречающихся в природе аминокислот, но предпочтительно они выбраны независимо из Val, Leu и/или Ile);

причем особенно предпочтительны пункты (а), (b), (с), (g), (h), (i), (m) и (n), при этом предпочтительны пункты, в которых n=1 или 2, и особенно предпочтительны пункты, в которых n=1.

Следует также отметить, что предпочтительно С-концевое удлинение в домене V_H по изобретению не содержит (свободного) остатка цистеина (если только данный остаток цистеина не используется или не предназначен для дальнейшей функционализации, к примеру, для ПЭГилирования).

Кроме того, предпочтения, приведенные на стр. 35-41 в WO 12/175741 для С-концевых удлинений, используемых в соответствии с WO 12/175741 (которые также являются предпочтительными С-концевыми удлинениями при использовании в доменах V_H по настоящему изобретению), также применимы для С-концевых удлинений, используемых в доменах V_H по изобретению, и эти предпочтения согласно WO 12/175741 также включены сюда путем ссылки..

Предпочтительно, когда домен V_H по изобретению содержит С-концевое удлинение (Х)_n, то n=1, 2 или 3, а каждый X означает Ala или Gly. Более предпочтительно, каждый X означает Ala, a n=1 или 2, предпочтительно 1.

Когда домены V_H по изобретению содержат С-концевое удлинение, то они, как правило, находятся на (и зачастую образуют) C-терминальном конце белка, полипептида, соединения, конструкции или другой химической субстанции, в которой они находятся. Опять же, такой белок, полипептид, соединение, конструкция или другая химическая субстанция может содержать один или несколько других доменов V_H по изобретению (т.е. не на С-конце); в таком случае такие другие домены V_H по изобретению должны содержать лизин (K) или глутамин (Q) в положении 112 (и быть такими, как описано далее), но не должны содержать C-концевых удлинений (вместо этого, они могут соединяться (необязательно через один или несколько подходящих линкеров) по С-концам с одной или несколькими другими аминокислотными последовательностями, группировками, связывающими доменами или связывающими блоками, присутствующими в белке, полипептиде, соединении, конструкции или другой химической субстанции типа домена V_H по изобретению с С-концевым удлинением на C-терминальном конце)).

Поскольку домены V_H по изобретению (и содержащие их белки, полипептиды, соединения, конструкции и другие химические субстанции, как описано далее) особенно подходят (и предназначены для) фармацевтического применения (как-то профилактики, лечения и/или диагностики заболеваний и расстройств у нуждающихся в этом лиц), они предпочтительно имеют высокую степень гомологии последовательности в каркасных участках с каркасными последовательностями доменов V_H человека. В частности, домены V_H по изобретению предпочтительно имеют общую степень идентичности последовательности (при определении так, как описано далее, принимая во внимание только каркасные участки, но не CDR, а также без учета замены в положении 112 и С-концевых удлинений, если они есть) хотя бы с одной гаметной последовательностью человека (типа DP-47, DP-51 или DP-29) по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, как-то на 90% или больше. Более предпочтительно, домены V_H по изобретению предпочтительно имеют общую степень идентичности последовательности (при определении так, как описано далее, принимая во внимание только каркасные участки, но не CDR, а также без учета замены в положении 112 и С-концевых удлинений, если они есть) по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, как-то на 90% или больше хотя бы с одной из следующих гаметных последовательностей человека: DP-47, DP-51 и/или DP-29.

Как описано далее, в соответствии с одним аспектом изобретения, домен V_H по изобретению может представлять собой вариабельный домен тяжелой цепи, который в белке, полипептиде или конструкции, в которой он находится, взаимодействует/ассоциирует (или предназначен для взаимодействия/ассоциации) с доменом V_L с образованием антигенсвязывающего сайта, в котором по крайней мере домен V_H имеет экспонированный С-терминальный конец или участок. Например, домен V_H в соответствии с этим аспектом изобретения может представлять собой домен V_H, который присутствует и/или используется в scFv и/или диателах, где он будет связываться с доменом V_L с образованием антигенсвязывающего сайта.

Однако, в соответствии с предпочтительным аспектом изобретения, домен V_H по изобретению представляет собой одиночный вариабельный домен (тяжелой цепи) иммуноглобулина, т.е. "ISVD", а это означает такой вариабельный домен тяжелой цепи, который может образовывать функциональный антигенсвязывающий сайт без взаимодействия с доменом V_L. Например, домен V_H по изобретению может представлять собой нанотело (включая V_HH, гуманизованные V_HH и камелизованные V_H типа камелизованных V_H человека), (однодоменное) антитело, которое представляет собой домен V_H или получено из домена V_H, либо dAb, которое представляет собой домен V_H или получено из домена V_H. Домен V_H по изобретению предпочтительно представляет собой нанотело (более предпочтительно домен V_HH, гуманизованный домен V_HH или камелизованный домен V_H типа камелизованного домена V_H человека).

В настоящем описании:

- термин "нанотело" в общем соответствует определению в WO 08/020079 или WO 09/138519, а в конкретном аспекте вообще означает V_HH, гуманизованные V_HH или камелизованные V_H типа камелизованных V_H человека или же оптимизированные по последовательности V_HH (как-то, например, оптимизированные по химической стабильности и/или растворимости, максимальному перекрыванию с известными каркасными участками человека и максимальной экспрессии). Следует отметить, что термины «нанотело» или «нанотела» являются зарегистрированными торговыми марками Ablynx N.V. и поэтому могут приводиться и как нанотело® и/или нанотела®;

- термин "ISVD" (или "ISV") применяется здесь в самом широком смысле и также охватывает "биопрепараты на основе ISVD" и, когда ISVD представляет собой нанотело, "биопрепараты на основе нанотел". "Биопрепараты на основе ISVD" определяются здесь как белки, полипептиды или другие биологические препараты, которые содержат или в основном состоят по меньшей мере из одного (как-то одного, двух или трех) ISVD. Точно так же "биопрепараты на основе нанотел" определяются здесь как белки, полипептиды или другие биологические препараты, которые содержат или в основном состоят по меньшей мере из одного (как-то одного, двух или трех) нанотел. Как и с термином "ISVD", всякий раз, когда применяется термин "биопрепараты на основе ISVD", следует понимать, что такой биопрепарат на основе ISVD предпочтительно представляет собой биопрепарат на основе нанотел. В контексте настоящего изобретения, и "биопрепараты на основе ISVD", и "биопрепараты на основе нанотел" могут представлять собой, к примеру, моновалентные, бивалентные (или мультивалентные), биспецифичные (или мультиспецифичные) и бипаратопные (или мультипаратопные) конструкции ISVD или конструкции нанотел, соответственно. Кроме того, биопрепараты на основе ISVD или на основе нанотел, к примеру, наряду с одним или несколькими (как-то одним, двумя или тремя) ISVDs или нанотелами, могут необязательно также содержать одну или несколько (как-то одну или две) других дополнительных терапевтических молекул и/или одну или несколько (как-то одну или две) других частей молекул, влияющих на фармакокинетические или фармакодинамические свойства биопрепаратов на основе ISVD или на основе нанотел (типа периода полураспада). Подходящие примеры таких дополнительных терапевтических или других молекул должны быть известны специалистам, например, они в общем могут включать любые терапевтически активные белки, полипептиды или другие связывающие домены или связывающие блоки, а также, к примеру, модификации типа тех, что описаны на стр. 149-152 WO 09/138159. Биопрепараты на основе ISVD или биопрепараты на основе нанотел предпочтительно являются терапевтическими или предназначены для применения в качестве терапевтических средств (включая профилактику и диагностику) и с этой целью они предпочтительно содержат по меньшей мере один ISVD против соответствующей терапевтической мишени (такой, к примеру, как RANK-L, vWF, IgE, RSV, CXCR4, IL-23 или другие интерлейкины и пр.). Насчет некоторых конкретных, но не ограничительных примеров таких биопрепаратов на основе ISVD или на основе нанотел сошлемся на Примеры 8-18, а также, к примеру, на различные заявки фирмы Ablynx N.V. (такие, к примеру, но без ограничения, как WO 2004/062551, WO 2006/122825, WO 2008/020079 и WO 2009/068627), а также, к примеру (и без ограничения), на такие заявки, как WO 06/038027, WO 06/059108, WO 07/063308, WO 07/063311, WO 07/066016 и WO 07/085814. Кроме того, как описано далее, описанные здесь ISVD или нанотела могут быть направлены против сывороточного белка (человека) типа сывороточного альбумина (человека), причем такие ISVD или нанотела тоже могут иметь терапевтическое применение, в частности, при и/или для продления времени полураспада терапевтических молекул и соединений (как-то в или для биопрепаратов на основе ISV, описанных здесь). Сошлемся, к примеру, на WO 2004/041865, WO 2006/122787 и WO 2012/175400, в которых в общем виде описано применение нанотел, связывающих сывороточный альбумин, для продления периода полураспада. Кроме того, в настоящем описании, если прямо не указано иначе, все приводимые термины имеют значения, приведенные в WO 09/138519 (или в работах предшествующего уровня техники, приведенных в WO 09/13851) или в WO 08/020079 (или в работах предшествующего уровня техники, приведенных в WO 08/ 020079). Кроме того, если метод или методика не описаны здесь конкретно, они могут выполняться так, как описано в WO 09/138519 (или в работах предшествующего уровня техники, приведенных в WO 09/138519) или в WO 08/020079 (или в работах предшествующего уровня техники, приведенных в WO 08/020079).

Кроме того, при использовании в настоящем описании или формуле изобретения следующие термины имеют такие же значения, которые приведены в и/или, если это применимо, которые можно определить так, как описано на стр. 62-75 в WO 09/138519: "агонист", "антагонист", "обратный агонист", "неполярный, незаряженный аминокислотный остаток", "полярный незаряженный аминокислотный остаток", "полярный, заряженный аминокислотный остаток", "идентичность последовательностей", "точно такие же" и "различия по аминокислотам" (когда идет речь о сравнении последовательностей у двух аминокислотных последовательностей), "(в) практически выделенном (виде)", "домен", "связывающий домен", "антигенная детерминанта", "эпитоп", "против" или "направлено против" (антигена), "специфичность" и "период полураспада". Кроме того, термины "модулирующий" и "модулировать", "сайт взаимодействия", "специфичный к", "перекрестно блокировать", "перекрестно блокируется" и "перекрестно блокирует" и "практически не зависит от рН" соответствуют определениям (и/или могут определяться так, как описано) на стр. 74-79 в WO 10/130832 от заявителя. Кроме того, когда идет речь о конструкциях, соединениях, белках или полипептидах по изобретению, термины типа "моновалентный", "бивалентный" (или "мультивалентный"), "биспецифичный" (или "мультиспецифичный") и "бипаратопный" (или "мультипаратопный") могут иметь значения, приведенные в WO 09/138519, WO 10/130832 или WO 08/020079.

Термин "период полураспада" в применении к ISVD, нанотелам, биопрепаратам на основе ISVD, биопрепаратам на основе нанотел или любым другим аминокислотным последовательностям, соединениям или полипептидам, приведенным здесь, в общем виде может определяться так, как описано в пункте о) на стр. 57 в WO 08/020079 и, как указано там, относится ко времени, которое требуется для снижения концентрации аминокислотной последовательности, соединения или полипептида в сыворотке крови in vivo на 50%, например, вследствие деградации последовательности или соединения и/или клиренса или секвестрирования последовательности или соединения по естественным механизмам. Период полураспада аминокислотной последовательности, соединения или полипептида по изобретению in vivo можно определить любым известным способом per se, например, с помощью фармакокинетического анализа. Подходящие методы должны быть известны специалистам в данной области и могут быть такими, к примеру, как описано в пункте о) на стр. 57 WO 08/020079. Также в пункте о) на стр. 57 WO 08/020079 указано, что период полураспада можно выразить с помощью таких параметров, как -альфа, -бета и площадь под кривой (AUC). В этом отношении следует отметить, что термин "период полураспада" при использовании здесь, в частности, относится к -бета или терминальному полураспаду (при этом -альфа и/или AUC или оба можно исключить из рассмотрения). Сошлемся, к примеру, на приведенную ниже «Экспериментальную часть», а также на стандартные справочники, как-то Kenneth A et al., Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists; и Peters et al., Pharmacokinetic Analysis: A Practical Approach (1996). Сошлемся также на "Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron, published by Marcel Dekker, 2^nd Rev. edition (1982). Аналогичным образом, термины "увеличение периода полураспада" или "повышенный период полураспада" также соответствуют определениям в пункте о) на стр. 57 WO 08/020079 и, в частности, относятся к повышению -бета, с повышением -альфа и/или AUC или обоих или без него.

Если же термин не определен конкретно здесь, то он имеет свое обычное значение в данной области, которое должно быть известно специалистам. Сошлемся, к примеру, на стандартные справочники, как-то Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2^nd Ed.), Vols.1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); F. Ausubel et al., eds., "Current Protocols in Molecular Biology", Green Publishing & Wiley Interscience, New York (1987); Lewin, "Genes II", John Wiley & Sons, New York, N.Y. (1985); Old et al., "Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering", 2^nd edition, University of California Press, Berkeley, CA (1981); Roitt et al., "Immunology" (6^thEd.), Mosby/Elsevier, Edinburgh (2001); Roitt et al., "Roitt's Essential Immunology", 10th Ed., Blackwell Publishing, UK (2001); и Janeway et al., "Immunobiology" (6^th Ed.), Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, New York (2005), а также на приведенные здесь общие работы в данной области.

Кроме того, как уже было сказано, аминокислотные остатки нанотел пронумерованы в соответствии с общей нумерацией для доменов V_H, изложенной Kabat et al. ("Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91), а применительно к верблюжьим доменам V_HH в статье Riechmann and Muyldermans, J. Immunol. Methods 2000 Jun 23, 240 (1-2): 185-195; либо приведена здесь. Согласно этой нумерации, FR1 у нанотел включает аминокислотные остатки в положениях 1-30, CDR1 у нанотел включает аминокислотные остатки в положениях 31-35, FR2 у нанотел включает аминокислоты в положениях 36-49, CDR2 у нанотел включает аминокислотные остатки в положениях 50-65, FR3 у нанотел включает аминокислотные остатки в положениях 66-94, CDR3 у нанотел включает аминокислотные остатки в положениях 95-102, a FR4 у нанотел включает аминокислотные остатки в положениях 103-113. [В этой связи следует отметить, что, как это хорошо известно в данной области для доменов V_H и для доменов V_HH, общее количество аминокислотных остатков в каждом из CDR может варьироваться и может не соответствовать общему количеству аминокислотных остатков, указанных по нумерации Kabat (то есть одно или несколько положений по нумерации Kabat могут быть не заняты в фактической последовательности или же фактическая последовательность может содержать больше аминокислотных остатков, чем количество, допустимое по нумерации Kabat). Это означает, что вообще-то нумерация по Kabat может и не соответствовать фактической нумерации аминокислотных остатков в фактической последовательности. Однако в целом можно сказать, что в соответствии с нумерацией Kabat и независимо от количества аминокислотных остатков в CDRs, положение 1 по нумерации Kabat соответствует началу FR1 и наоборот, положение 36 по нумерации Kabat соответствует началу FR2 и наоборот, положение 66 по нумерации Kabat соответствует началу FR3 и наоборот, а положение 103 по нумерации Kabat соответствует началу FR4 и наоборот].

Альтернативные методы нумерации аминокислотных остатков доменов V_H, которые также могут применяться аналогичным образом к верблюжьим доменам V_HH и к нанотелам, - это метод, описанный Chothia et al. (Nature 342, 877-883 (1989)), так называемое "определение AbM" и так называемое "контактное определение". Однако в настоящем описании, аспектах и фигурах будет применяться нумерация по Kabat, а применительно к доменам V_HH - по Riechmann and Muyldermans, если не указано иначе.

Следует также отметить, что фигуры и перечень последовательностей, «Экспериментальная часть» и примеры приводятся только для дальнейшей иллюстрации изобретения и никоим образом не должны интерпретироваться или восприниматься как ограничивающие объем изобретения и/или прилагаемой формулы изобретения, если только прямо не указано иначе.

Домены V_H по изобретению могут быть направлены против любого подходящего или нужного антигена или мишени, включая любые фармацевтически и/или терапевтически значимые мишени, как описано здесь.

В соответствии с одним частным аспектом изобретения, домены V_H по изобретению направлены против сывороточного белка, в частности, сывороточного белка человека. В соответствии с предпочтительным аспектом, когда домен V_H по изобретению направлен против сывороточного белка, то он направлен против сывороточного альбумина, в частности, сывороточного альбумина человека. Итак, изобретение также касается таких доменов V_H по изобретению (как определено здесь, включая предпочтения, приведенные для доменов V_H по изобретению), которые могут специфически связываться с сывороточным белком, в частности, сывороточным белком человека, а предпочтительно могут специфически связываться с сывороточным альбумином, более предпочтительно сывороточным альбумином человека. Опять же, такие домены V_H представляют собой ISVD (как описано выше), более предпочтительно нанотела.

Например, домен V_H по изобретению против сывороточного альбумина может быть одним из нанотел против сывороточного альбумина (человека), которые описаны в WO 2004/041865, в особенности в WO 2006/122787 и WO 2012/175400 (все это заявки от заявителя/правопреемника), в котором аминокислота в положении 112 заменена на K или на Q и которое необязательно содержит С-концевое удлинение, как описано здесь (а также, к примеру, может содержать одну или несколько других специфических замен аминокислотных остатков, приведенных здесь, как-то 11L, L11V, L11K, 14А, Р14А, 14Р, А14Р, 89Т, V89T, 89L, V89L, 108L, Q108L, 110Q, T110Q, 110K и/или T110K; хотя обычно наличие дополнительной замены в положении 110 зачастую и не требуется, если в положении 112 находится K или Q, при этом в положении 110 предпочтительно находится Т). Кроме того, предусматривается, что настоящее изобретение также применимо и к другим ISVD тяжелой цепи, связывающим сывороточный альбумин, типа тех, которые описаны в WO 03/035694, WO 04/003019, WO 05/118642, WO 06/059106, WO 08/096158, WO 09/121804, WO 10/108937 или US 2013/0129727, т.е. при введении соответствующих замен, описанных здесь (т.е. по меньшей мере одной из S112K, S112Q и/или V89T, а необязательно и одной или нескольких других замен аминокислотных остатков, описанных здесь, как-то L11V), и необязательно (а обычно предпочтительно, как изложено здесь) добавлении С-концевого удлинения (как описано далее).

Некоторые предпочтительные, но без ограничения, примеры таких связывающих сывороточный альбумин нанотел по изобретению - это гуманизованные варианты аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 52 в WO 2006/122787 (именуемой "Alb-1" в WO 2006/122787), в которых аминокислота в положении 112 заменена на K или на Q (и которые необязательно содержат С-концевое удлинение, как описано здесь), типа гуманизованных вариантов Alb-1, приведенных в SEQ ID NOs: 57-64 в WO 2006/122787 (в каждом случае с заменой S112K или S112Q и необязательно с С-концевым удлинением), или гуманизованных вариантов Alb-1, приведенных в SEQ ID NOs: 3-11 WO 2012/175400 (опять же, в каждом случае с заменой S112K или S112Q), из которых SEQ ID NOs 3, 4 и 5 могут необязательно содержать С-концевое удлинение, a SEQ ID NOs 6-11 в самом деле содержат С-концевое удлинение (опять же, такие варианты могут содержать одну или несколько других специфических замен аминокислотных остатков, приведенных здесь, как-то 11L, L11V, L11K, 14А, Р14А, 14Р, А14Р, 89Т, V89T, 89L, V89L, 108L, Q108L, 110Q, T110Q, 110K и/или T110K; хотя обычно наличие дополнительной замены в положении 110 зачастую и не требуется, если в положении 112 находится K или Q, при этом в положении 110 предпочтительно находится Т). Кроме того: (i) в положении 41 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-6 WO 08/020079 для положения 41, в частности, это может быть (или выбран из них) пролин (Р), серии (S), треонин (Т), аланин (А) или лейцин (L), то есть из числа тех аминокислотных остатков, которые чаще всего встречаются в этом положении у людей или у лам, а более предпочтительно это может быть пролин (Р) или аланин (А); и/или (n) в положении 42 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-6 WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (Е); и/или (iii) в положении 87 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-7 WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (Т) или аланин (А).

Итак, в следующем аспекте изобретение касается нанотел по изобретению (как определено здесь), которые могут связываться (в частности, специфически связываться) с сывороточным альбумином (в особенности с сывороточным альбумином человека), в которых:

- CDR1 имеет аминокислотную последовательность SFGMS (SEQ ED NO: 41);

- CDR2 имеет аминокислотную последовательность SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ ID NO: 42);

- CDR3 имеет аминокислотную последовательность GGSLSR (SEQ ID NO: 43);

- аминокислотный остаток в положении 112 представлен K или Q;

и которые необязательно содержат на С-терминальном конце С-концевое удлинение (Х)_n, где n равно 1-10, предпочтительно 1-5, как-то 1, 2, 3, 4 или 5 (а предпочтительно 1 или 2, как-то 1); а каждый X означает (предпочтительно встречающейся в природе) аминокислотный остаток, который выбран независимо, а предпочтительно выбран независимо из группы, состоящей из аланина (А), глицина (G), валина (V), лейцина (L) или изолейцина (I) (опять же, такое С-концевое удлинение предпочтительно является таким, как описано далее, и опять же, такое нанотело, к примеру, также может содержать одну или несколько других специфических замен аминокислотных остатков, приведенных здесь, как-то 11L, L11V, L11K, 14А, Р14А, 14Р, А14Р, 89Т, V89T, 89L, V89L, 108L, Q108L, 110Q, T110Q, 110K и/или T110K; хотя обычно наличие дополнительной замены в положении 110 зачастую не требуется, если в положении 112 находится K или Q, при этом в положении 110 предпочтительно находится Т). Кроме того: (i) в положении 41 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-6 WO 08/020079 для положения 41, в частности, это может быть (или выбран из них) пролин (Р), серии (S), треонин (Т), аланин (А) или лейцин (L), то есть из числа тех аминокислотных остатков, которые чаще всего встречаются в этом положении у людей или у лам, а более предпочтительно это может быть пролин (Р) или аланин (А); и/или (ii) в положении 42 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-6 WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (Е); и/или (iii) в положении 87 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-7 WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (Т) или аланин (А).

В предпочтительном аспекте изобретение касается нанотел по изобретению (как определено здесь), которые могут связываться (в частности, специфически связываться) с сывороточным альбумином (в особенности с сывороточным альбумином человека), которые являются гуманизованными вариантами SEQ ID NO: 52 из WO 2006/122787, в которых:

- CDR1 имеет аминокислотную последовательность SFGMS (SEQ ID NO: 41);

- CDR2 имеет аминокислотную последовательность SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ ID NO: 42);

- CDR3 имеет аминокислотную последовательность GGSLSR (SEQ ID NO: 43);

- аминокислотный остаток в положении 112 представлен K или Q;

которые необязательно содержат на С-терминальном конце С-концевое удлинение (Х)_n, где n равно 1-10, предпочтительно 1-5, как-то 1, 2, 3, 4 или 5 (а предпочтительно 1 или 2, как-то 1); а каждый X означает (предпочтительно встречающийся в природе) аминокислотный остаток, который выбран независимо, а предпочтительно выбран независимо из группы, состоящей из аланина (А), глицина (G), валина (V), лейцина (L) и изолейцина (I) (опять же, такое С-концевое удлинение предпочтительно является таким, как описано далее, и опять же, такое нанотело, к примеру, также может содержать одну или несколько других специфических замен аминокислотных остатков, приведенных здесь, как-то 11L, L11V, L11K, 14А, Р14А, 14Р, А14Р, 89Т, V89T, 89L, V89L, 108L, Q108L, 110Q, T110Q, 110K и/или T110K; хотя обычно наличие дополнительной замены в положении 110 зачастую не требуется, если в положении 112 находится K или Q, при этом в положении 110 предпочтительно находится Т). Кроме того: (i) в положении 41 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-6 WO 08/020079 для положения 41, в частности, это может быть (или выбран из них) пролин (Р), серии (S), треонин (Т), аланин (А) или лейцин (L), то есть из числа тех аминокислотных остатков, которые чаще всего встречаются в этом положении у людей или у лам, а более предпочтительно это может быть пролин (Р) или аланин (А); и/или (ii) в положении 42 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-6 WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (Е); и/или (iii) в положении 87 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-7 WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (Т) или аланин (А).

В предпочтительном аспекте изобретение касается нанотел по изобретению (как определено здесь), которые могут связываться (в частности, специфически связываться) с сывороточным альбумином (в особенности с сывороточным альбумином человека), которые по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, как-то по меньшей мере на 95% идентичны по последовательности хотя бы с одним из Alb-1 (SEQ ID NO: 52, WO 2006/122787), Alb-8 (SEQ ID NO: 46, здесь) и/или Alb-23 (SEQ ID NO: 61, здесь) (принимая во внимание и каркасные последовательности, и CDRs, но без учета С-концевого удлинения), в которых аминокислотный остаток в положении 112 представлен K или Q и которые необязательно содержат на С-терминальном конце С-концевое удлинение (Х)_n, где n равно 1-10, предпочтительно 1-5, как-то 1, 2, 3, 4 или 5 (а предпочтительно 1 или 2, как-то 1); а каждый X означает (предпочтительно встречающийся в природе) аминокислотный остаток, который выбран независимо, а предпочтительно выбран независимо из группы, состоящей из аланина (А), глицина (G), валина (V), лейцина (L) и изолейцина (I) (опять же, такое С-концевое удлинение предпочтительно является таким, как описано далее, и опять же, такое нанотело, к примеру, также может содержать одну или несколько других специфических замен аминокислотных остатков, приведенных здесь, как-то 11L, L11V, L11K, 14А, Р14А, 14Р, А14Р, 89Т, V89T, 89L, V89L, 108L, Q108L, 110Q, T110Q, 110K и/или T110K; хотя обычно наличие дополнительной замены в положении 110 зачастую и не требуется, если в положении 112 находится K или Q, при этом в положении 110 предпочтительно находится Т). Кроме того: (i) в положении 41 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-6 WO 08/020079 для положения 41, в частности, это может быть (или выбран из них) пролин (Р), серии (S), треонин (Т), аланин (А) или лейцин (L), то есть из числа тех аминокислотных остатков, которые чаще всего встречаются в этом положении у людей или у лам, а более предпочтительно это может быть пролин (Р) или аланин (А); и/или (ii) в положении 42 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-6 WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (Е); и/или (iii) в положении 87 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-7 WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (Т) или аланин (А).

Такие нанотела по изобретению опять же предпочтительно являются гуманизованными вариантами Alb-1 (но с заменой S112K или S112Q), а более предпочтительно содержат по меньшей мере один, предпочтительно любые два, а более предпочтительно все три из CDR1, CDR2 и/или CDR3, приведенных в SEQ ID NOs 41-43, соответственно.

В соответствии с одним конкретным аспектом, любое связывающее сывороточный альбумин нанотело по изобретению также может содержать аминокислотные остатки, характерные для Alb-23 и его вариантов, как описано в WO 12/175400 (т.е. аминокислотный мотив GP в положениях 44 и 45, аминокислотный мотив SKN в положениях 74-76 и предпочтительно G в положении 16, а также необязательно R в положении 83).

Некоторые предпочтительные, но без ограничения, примеры нанотел по изобретению, направленных против сывороточного альбумина человека, приведены в табл. 4 и Примере 20.

В другом аспекте изобретение касается доменов V_H, в частности ISVD, более предпочтительно нанотел, у которых:

а) последовательность FW4 представлена одной из следующих последовательностей FW4:

в которых (i) аминокислотные остатки последовательностей FW4, которые предшествуют С-концевому удлинению (Х)_n в SEQ ID NOs: 23-40, соответствуют положениям аминокислот в FW4 домена V_H (т.е. положениям 103-113 по нумерации Kabat); (ii) n равно 1-10, предпочтительно 1-5, как-то 1, 2, 3, 4 или 5 (а предпочтительно 1 или 2, как-то 1); и (iii) каждый X означает остаток (предпочтительно встречающейся в природе) аминокислоты, который выбран независимо, а предпочтительно выбран независимо из группы, состоящей из аланина (А), глицина (G), валина (V), лейцина (L) и изолейцина (I); или

с) аминокислотная последовательность имеет не более 3, предпочтительно не более 2 отличий по аминокислотам по меньшей мере от одной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NOs: 99-106, причем данные отличия по аминокислотам приходятся на положения, соответствующие положениям аминокислот в FW4 домена V_H, т.е. на положения 103-113 по нумерации Kabat, без учета каких-либо отличий по аминокислотам в пределах С-концевого удлинения (X)_n, при этом: (i) если аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 112 по нумерации Kabat, представлен K или Q, то данные отличия по аминокислотам приходятся на другие положения аминокислот, чем 112, и аминокислотный остаток в положении 89 домена V_H предпочтительно выбран из V, Т и L (а наиболее предпочтительно это V); (ii) если аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 110 по нумерации Kabat, представлен K или Q, то данные отличия по аминокислотам приходятся на другие положения аминокислот, чем 110, а в положении 89 домена V_H находится L; (iii) n равно 1-10, предпочтительно 1-5, как-то 1, 2, 3, 4 или 5 (а предпочтительно 1 или 2, как-то 1); и (iv) каждый X означает остаток (предпочтительно встречающейся в природе) аминокислоты, который выбран независимо, а предпочтительно выбран независимо из группы, состоящей из аланина (А), глицина (G), валина (V), лейцина (L) и изолейцина (I). Опять же, в дополнение к пунктам (i)-(iv), приведенным в предыдущем предложении, в такой аминокислотной последовательности: (v) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 103 по нумерации Kabat, предпочтительно представлен S; (vi) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 104 по нумерации Kabat, предпочтительно представлен S; (vii) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 106 по нумерации Kabat, предпочтительно представлен G; (viii) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 107 по нумерации Kabat, предпочтительно представлен Т; (ix) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 108 по нумерации Kabat, предпочтительно представлен Q или L (а в гуманизованных нанотелах это предпочтительно L); (х) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 109 по нумерации Kabat, предпочтительно представлен V; опять же отсылаем к табл. 2 насчет таких аминокислотных остатков, которые могут присутствовать в каждом положении.

При этом у таких доменов V_H по изобретению: (а) аминокислотный остаток в положении 11 представлен L, V или K (более предпочтительно V); аминокислотный остаток в положении 14 предпочтительно представлен А или Р; аминокислотный остаток в положении 41 предпочтительно представлен А или Р. Кроме того, такие домены V_H по изобретению предпочтительно представляют собой ISVD, а более предпочтительно нанотела; причем они могут быть направлены против сывороточного альбумина человека (в этом случае у них предпочтительно CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, соответствуют SEQ ID NOs 41, 42 и 43, соответственно). Кроме того, когда такие домены V_H являются ISVDs или нанотелами против сывороточного альбумина человека, то они тоже могут быть такими, как описано здесь для нанотел по изобретению, направленных против сывороточного альбумина человека.

Домены V_H по изобретению, которые направлены против сывороточного альбумина (в частности, связывающие сывороточный альбумин ISVD по изобретению), могут применяться для повышения периода полураспада терапевтически активных соединений, (поли)пептидов, белков, связывающих доменов, связывающих блоков или других терапевтически активных субстанций или молекул, в основном так, как это описано в WO 2004/041865, WO 2006/122787 и/или WO 2012/175400 для применения связывающих сывороточный альбумин нанотел, раскрытых в данных ссылках (т.е. при соответствующем присоединении связывающих сывороточный альбумин ISVD к белкам, полипептидам, соединениям или другим субстанциям, необязательно через подходящий линкер. Например, в WO 12/175400 на стр. 12 и 13 приведены некоторые примеры того, как можно сконструировать подходящие слитые белки).

В другом аспекте изобретение касается вариабельных доменов тяжелой цепи иммуноглобулина (доменов V_H), в которых аминокислотный остаток в положении 89 (нумерация по Kabat) представлен треонином (Т), а аминокислотный остаток в положении 112 представлен остатком серина (S), лизина (K) либо остатком глутамина (Q). Такие вариабельные домены тяжелой цепи иммуноглобулина (домены V_H) с Т в положении 89 также охвачены термином "домены V_H по изобретению", который применяется здесь в самом широком смысле, и тоже могут быть такими, как описано здесь для доменов V_H по изобретению, содержащих K или Q в положении 112. Соответственно, такие вариабельные домены тяжелой цепи иммуноглобулина (домены V_H) могут содержать С-концевое удлинение, как описано далее (включая указанные предпочтения для таких С-концевых удлинений); они могут представлять собой ISVD и в особенности нанотела, как описано далее.

Опять же, если такой домен V_H по изобретению имеет экспонированный С-концевой участок (например, потому, что он образует С-терминальный конец белка, полипептида или иной конструкции, в которой он находится), то предпочтительно он содержит С-концевое удлинение (см. данные, представленные ниже в табл. С).

Кроме того, нанотела по изобретению, в которых положение 89 представлено Т (т.е. с С-концевым удлинением или без него), предпочтительно содержат аминокислоту в положении 11, которая выбрана из L (этот аминокислотный остаток чаще всего встречается в V_HH), Е, K, М, S, V, W и Y; более предпочтительно из L, Е, K, V и Y и еще более предпочтительно из L, K и V (причем наиболее предпочтительно это V). Например, они могут содержать замену L11K или L11V, а также, к примеру, замену Р14А или А14Р, замену Q108L и/или замену T110K, T110Q, S112K и/или S112Q (хотя обычно наличие одной или двух дополнительных замен в положении 110 и/или 112 зачастую и не требуется, если в положении 89 находится Т, при этом в положении 110 предпочтительно находится Т, а в положении 112 предпочтительно S).

В частности, вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина (домен V_H) по изобретению в соответствии с этим частным аспектом содержит Т в положении 89 (по Kabat), а С-терминальный конец представлен одним из VTVSS (SEQ ID NO: 77), VTVSS(X)_n (SEQ ID NO: 78), VTVKS (SEQ ID NO: 1), VTVKS(X)_n (SEQ ID NO: 21), VTVQS (SEQ ID NO: 2), VTVQS(X)_n (SEQ ID NO: 22), VKVSS (SEQ ID NO: 95), VKVSS(X)_n (SEQ ID NO: 97), VQVSS (SEQ ID NO: 96), VQVSS(X)_n (SEQ ID NO: 98), VZVZS (SEQ ID NO: 107, при этом каждый аминокислотный остаток Z независимо означает K или Q) или VZVZS(X)_n (SEQ ID NO: 108, при этом каждый аминокислотный остаток Z независимо означает K или Q), а предпочтительно одним из VTVKS (SEQ ID NO: 1), VTVQS (SEQ ID NO: 2), VTVSS (SEQ ID NO: 77), VTVKS(X)_n (SEQ ID NO: 21), VTVQS(X)_n (SEQ ID NO: 22) или VTVSS(X)_n (SEQ ID NO: 78), более предпочтительно это либо VTVSS (SEQ ID NO: 77), либо VTVSS(X)_n (SEQ ID NO: 78), где n и X такие, как описано здесь для доменов V_H по изобретению, у которых в положении 112 находится Q или K (а С-концевое удлинение предпочтительно такое, как описано здесь для доменов V_H по изобретению, у которых в положении 112 находится Q или K). Кроме того, как и в случае доменов V_H по изобретению, у которых в положении 112 находится Q или K, когда такой домен V_H с Т в положении 89 представляет собой нанотело, то в положении 11 предпочтительно находится лейцин (L), в положении 14, в частности, может быть аланин (А) или пролин (Р), а в положении 108, в частности, может быть Q или L (а в гуманизованных нанотелах это предпочтительно L); причем такие нанотела с Т в положении 89 могут содержать один или несколько характерных остатков и/или быть соответственным образом гуманизованными. Кроме того: (i) в положении 41 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-6 WO 08/020079 для положения 41, в частности, это может быть (или выбран из них) пролин (Р), серии (S), треонин (Т), аланин (А) или лейцин (L), то есть из числа тех аминокислотных остатков, которые чаще всего встречаются в этом положении у людей или у лам, а более предпочтительно это может быть пролин (Р) или аланин (А); и/или (ii) в положении 42 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-6 WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (Е); и/или (iii) в положении 87 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-7 WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (Т) или аланин (А).

Такой домен V_H по изобретению с Т в положении 89 опять же может представлять собой нанотело к сывороточному альбумину, как уже описано здесь. Например, такое связывающее сывороточный альбумин нанотело может иметь одну из последовательностей SEQ ID NOs: 46-75, но с Т в положении 89; или же другое связывающее сывороточный альбумин нанотело с Т в положении 89, которое по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, как-то по меньшей мере на 95% идентично по последовательности хотя бы с одним из Alb-1 (SEQ ID NO: 52, WO 2006/122787), Alb-8 (SEQ ID NO: 46, здесь) и/или Alb-23 (SEQ ID NO: 61, здесь) (принимая во внимание и каркасные последовательности, и CDRs, но без учета С-концевого удлинения). Некоторые другие примеры таких нанотел с Т в положении 89 представлены в SEQ ID NOs: 78-91 (это другие варианты Alb-1/Alb-8 или Alb-23 с Т в положении 89 и S в положении 112).

В более общем виде домен V_H против сывороточного альбумина в соответствии с этим аспектом изобретения может быть одним из нанотел против сывороточного альбумина (человека), которые описаны в WO 2004/041865 и в особенности в WO 2006/122787 и WO 2012/175400 (все это заявки от заявителя/правопреемника), в котором аминокислота в положении 89 представлена треонином (Т) и которое необязательно содержит С-концевое удлинение, как описано здесь (а также, к примеру, может содержать одну или несколько других специфических замен аминокислотных остатков, приведенных здесь, как-то 11L, L11V, L11K, 14А, Р14А, 14Р, А14Р, 108L, Q108L, 110K, T110K, 110Q, T110Q, S112K и/или S112Q; хотя обычно наличие дополнительных замен в положениях 110 и/или 112 зачастую и не требуется, если в положении 89 находится Т, при этом в положении 110 предпочтительно находится Т, а в положении 112 предпочтительно S). Кроме того: (i) в положении 41 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-6 WO 08/020079 для положения 41, в частности, это может быть (или выбран из них) пролин (Р), серии (S), треонин (Т), аланин (А) или лейцин (L), то есть из числа тех аминокислотных остатков, которые чаще всего встречаются в этом положении у людей или у лам, а более предпочтительно это может быть пролин (Р) или аланин (А); и/или (ii) в положении 42 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-6 WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (Е); и/или (iii) в положении 87 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-7 WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (Т) или аланин (А). Более того, предусматривается, что настоящее изобретение также применимо и к другим ISVD тяжелой цепи, связывающим сывороточный альбумин, типа тех, что описаны в WO 03/035694, WO 04/003019, WO 05/118642, WO 06/059106, WO 08/096158, WO 09/121804, WO 10/108937 или US 2013/0129727, т.е. при соответствующем введении треонина (Т) в положении 89 и необязательно одной или нескольких других замен аминокислотных остатков, описанных здесь, а также необязательно (а обычно предпочтительно, как изложено здесь) добавлении С-концевого удлинения (тоже как описано здесь).

Некоторые предпочтительные, но без ограничения, примеры таких связывающих сывороточный альбумин нанотел по изобретению - это гуманизованные варианты аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 52 в WO 2006/122787 (именуемой "Alb-1" в WO 2006/122787), в которых аминокислота в положении 89 представлена Т (и которые необязательно содержат С-концевое удлинение, как описано здесь), типа гуманизованных вариантов Alb-1, приведенных в SEQ ID NOs: 57-64 в WO 2006/122787 (в каждом случае с заменой V89T и необязательно с С-концевым удлинением), или гуманизованных вариантов Alb-1, приведенных в SEQ ID NOs: 3-11 в WO 2012/175400 (опять же в каждом случае с заменой V89T), из которых SEQ ID NOs: 3, 4 и 5 могут необязательно содержать С-концевое удлинение, a SEQ ID NOs: 6-11 в самом деле содержат С-концевое удлинение (опять же, такие варианты могут содержать одну или несколько других специфических замен аминокислотных остатков, приведенных здесь, как-то 11L, L11V, L11K, 14А, Р14А, 14Р, А14Р, 108L, Q108L, 110K, T110K, 110Q, T110Q, 112Q, 112K, S112K и/или S112Q; хотя обычно наличие дополнительных замен в положениях 110 и/или 112 зачастую и не требуется, если в положении 89 находится Т, при этом в положении 110 предпочтительно находится Т, а в положении 112 предпочтительно S). Кроме того: (i) в положении 41 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-6 WO 08/020079 для положения 41, в частности, это может быть (или выбран из них) пролин (Р), серии (S), треонин (Т), аланин (А) или лейцин (L), то есть из числа тех аминокислотных остатков, которые чаще всего встречаются в этом положении у людей или у лам, а более предпочтительно это может быть пролин (Р) или аланин (А); и/или (ii) в положении 42 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-6 WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (Е); и/или (iii) в положении 87 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-7 WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (Т) или аланин (А).

Итак, в следующем аспекте изобретение касается нанотел по изобретению (как определено здесь), которые могут связываться (в частности, специфически связываться) с сывороточным альбумином (в особенности сывороточным альбумином человека), в которых:

- CDR1 имеет аминокислотную последовательность SFGMS (SEQ ID NO: 41);

- CDR2 имеет аминокислотную последовательность SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ ID NO: 42);

- CDR3 имеет аминокислотную последовательность GGSLSR (SEQ ID NO: 43);

- аминокислотный остаток в положении 89 представлен Т;

которые необязательно содержат на С-терминальном конце С-концевое удлинение (Х)_n, где n равно 1-10, предпочтительно 1-5, как-то 1, 2, 3, 4 или 5 (а предпочтительно 1 или 2, как-то 1); а каждый X означает (предпочтительно встречающийся в природе) аминокислотный остаток, который выбран независимо, а предпочтительно выбран независимо из группы, состоящей из аланина (А), глицина (G), валина (V), лейцина (L) и изолейцина (I) (опять же, такое С-концевое удлинение предпочтительно является таким, как описано далее, и опять же, такое нанотело, к примеру, также может содержать одну или несколько других специфических замен аминокислотных остатков, приведенных здесь, как-то 11L, L11V, L11K, 14А, Р14А, 14Р, А14Р, 108L, Q108L, 110K, T110K, 110Q, T110Q, 112Q, 112K, S112K и/или S112Q; хотя обычно наличие дополнительных замен в положениях 110 и/или 112 зачастую и не требуется, если в положении 89 находится Т, при этом в положении 110 предпочтительно находится Т, а в положении 112 предпочтительно S). Кроме того: (i) в положении 41 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-6 WO 08/020079 для положения 41, в частности, это может быть (или выбран из них) пролин (Р), серии (S), треонин (Т), аланин (А) или лейцин (L), то есть из числа тех аминокислотных остатков, которые чаще всего встречаются в этом положении у людей или у лам, а более предпочтительно это может быть пролин (Р) или аланин (А); и/или (ii) в положении 42 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-6 WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (Е); и/или (iii) в положении 87 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-7 WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (Т) или аланин (А).

В предпочтительном аспекте изобретение касается нанотел по изобретению (как определено здесь), которые могут связываться (в частности, специфически связываться) с сывороточным альбумином (в особенности сывороточным альбумином человека), которые являются гуманизованными вариантами SEQ ID NO: 52 из WO 2006/122787, в которых:

- CDR1 имеет аминокислотную последовательность SFGMS (SEQ ID NO: 41);

- CDR2 имеет аминокислотную последовательность SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ ID NO: 42);

- CDR3 имеет аминокислотную последовательность GGSLSR (SEQ ID NO: 43);

- аминокислотный остаток в положении 89 представлен Т;

которые необязательно содержат на С-терминальном конце С-концевое удлинение (X)_n, где n равно 1-10, предпочтительно 1-5, как-то 1, 2, 3, 4 или 5 (а предпочтительно 1 или 2, как-то 1); а каждый X означает (предпочтительно встречающийся в природе) аминокислотный остаток, который выбран независимо, а предпочтительно выбран независимо из группы, состоящей из аланина (А), глицина (G), валина (V), лейцина (L) и изолейцина (I) (опять же, такое С-концевое удлинение предпочтительно является таким, как описано далее, и опять же, такое нанотело, к примеру, также может содержать одну или несколько других специфических замен аминокислотных остатков, приведенных здесь, как-то 11L, L11V, L11K, 14А, Р14А, 14Р, А14Р, 108L, Q108L, 110K, T110K, 110Q, T110Q, 112Q, 112K, S112K и/или S112Q; хотя обычно наличие дополнительных замен в положениях 110 и/или 112 зачастую и не требуется, если в положении 89 находится Т, при этом в положении 110 предпочтительно находится Т, а в положении 112 предпочтительно S). Кроме того: (i) в положении 41 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-6 WO 08/020079 для положения 41, в частности, это может быть (или выбран из них) пролин (Р), серии (S), треонин (Т), аланин (А) или лейцин (L), то есть из числа тех аминокислотных остатков, которые чаще всего встречаются в этом положении у людей или у лам, а более предпочтительно это может быть пролин (Р) или аланин (А); и/или (ii) в положении 42 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-6 WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (Е); и/или (iii) в положении 87 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-7 WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (Т) или аланин (А).

В предпочтительном аспекте изобретение касается нанотел по изобретению (как определено здесь), которые могут связываться (в частности, специфически связываться) с сывороточным альбумином (в особенности с сывороточным альбумином человека), которые по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, как-то по меньшей мере на 95% идентичны по последовательности хотя бы с одним из Alb-1 (SEQ ID NO: 52 в WO 2006/122787), Alb-8 (SEQ ID NO: 46, здесь) и/или Alb-23 (SEQ ID NO: 61, здесь) (принимая во внимание и каркасные последовательности, и CDRs, но без учета С-концевого удлинения), у которых аминокислотный остаток в положении 89 представлен Т; которые необязательно содержат на С-терминальном конце С-концевое удлинение (Х)_n, где n равно 1-10, предпочтительно 1-5, как-то 1, 2, 3, 4 или 5 (а предпочтительно 1 или 2, как-то 1); а каждый X означает (предпочтительно встречающийся в природе) аминокислотный остаток, который выбран независимо, а предпочтительно выбран независимо из группы, состоящей из аланина (А), глицина (G), валина (V), лейцина (L) и изолейцина (I) (опять же, такое С-концевое удлинение предпочтительно является таким, как уже описано здесь, и опять же, такое нанотело, к примеру, также может содержать одну или несколько других специфических замен аминокислотных остатков, приведенных здесь, как-то 11L, L11V, L11K, 14А, Р14А, 14Р, А14Р, 108L, Q108L, 110K, T110K, 110Q, T110Q, 112Q, 112K, S112K и/или S112Q; хотя обычно наличие дополнительных замен в положениях 110 и/или 112 зачастую и не требуется, если в положении 89 находится Т, при этом в положении 110 предпочтительно находится Т, а в положении 112 предпочтительно S). Кроме того: (i) в положении 41 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-6 WO 08/020079 для положения 41, в частности, это может быть (или выбран из них) пролин (Р), серии (S), треонин (Т), аланин (А) или лейцин (L), то есть из числа тех аминокислотных остатков, которые чаще всего встречаются в этом положении у людей или у лам, а более предпочтительно это может быть пролин (Р) или аланин (А); и/или (ii) в положении 42 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-6 WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (Е); и/или (iii) в положении 87 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-7 WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (Т) или аланин (А).

В соответствии с одним конкретным аспектом, такие связывающие сывороточный альбумин нанотела по изобретению с Т в положении 89 также могут содержать аминокислотные остатки, характерные для Alb-23 и его вариантов, как описано в WO 12/175400 (т.е. аминокислотный мотив GP в положениях 44 и 45, аминокислотный мотив SKN в положениях 74-76 и предпочтительно G в положении 16, а также необязательно R в положении 83).

Как и домены V_H по изобретению, содержащие Q или K в положении 112, домены V_H по изобретению, содержащие Т в положении 89 (необязательно вместе с Q или K в положении 112 и/или вместе с С-концевым удлинением), проявляют снижение связывания предсуществующих антител, в частности, таких предсуществующих антител (к примеру, таких, которые встречаются в образцах от больных SLE), которые способны связываться с доменами V_H и нанотелами при наличии С-концевого удлинения.

В следующем аспекте изобретение касается вариабельных доменов тяжелой цепи иммуноглобулина (доменов V_H), у которых аминокислотный остаток в положении 89 (нумерация по Kabat) представлен лейцином (L), а аминокислотный остаток в положении 110 представлен остатком лизина (K) или остатком глутамина (Q). Такие вариабельные домены тяжелой цепи иммуноглобулина (домены V_H) с L в положении 89 и K или Q в положении 110 также охвачены термином "домены V_H по изобретению", который применяется здесь в самом широком смысле, и тоже могут быть такими, как описано здесь для других доменов V_H по изобретению (т.е. содержащих K или Q в положении 112 или содержащих Т в положении 89). Соответственно, такие вариабельные домены тяжелой цепи иммуноглобулина (домены V_H) могут содержать С-концевое удлинение, как описано далее (включая указанные предпочтения для таких С-концевых удлинений); они могут представлять собой ISVD и в особенности нанотела, как описано далее.

Опять же, если такой домен V_H по изобретению имеет экспонированный С-концевой участок (например, потому, что он образует С-терминальный конец бежа, полипептида или иной конструкции, в которой он находится), то предпочтительно он содержит С-концевое удлинение (см. данные, представленные ниже в табл. С).

Кроме того, нанотела по изобретению, у которых положение 89 представлено L, а в положении 110 находится K или Q (т.е. с С-концевым удлинением или без него), предпочтительно содержат аминокислоту в положении 11, которая выбрана из L (этот аминокислотный остаток чаще всего встречается в V_HH), Е, K, М, S, V, W и Y; более предпочтительно из L, Е, K, V и Y и еще более предпочтительно из L, K и V (причем наиболее предпочтительно это V). Например, они могут содержать замену L11K или L11V, а также, к примеру, замену Р14А или А14Р и/или замену Q108L (они также могут содержать мутацию S112K и/или S112Q (хотя обычно наличие дополнительной замены в положении 112 зачастую и не требуется, если в положении 89 находится L, а в положении 110 - K или Q, при этом в положении 112 предпочтительно S). Кроме того: (i) в положении 41 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-6 WO 08/020079 для положения 41, в частности, это может быть (или выбран из них) пролин (Р), серии (S), треонин (Т), аланин (А) или лейцин (L), то есть из числа тех аминокислотных остатков, которые чаще всего встречаются в этом положении у людей или у лам, а более предпочтительно это может быть пролин (Р) или аланин (А); и/или (ii) в положении 42 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-6 WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (Е); и/или (iii) в положении 87 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-7 WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (Т) или аланин (А).

Кроме того, в одном аспекте, у таких доменов V_H по изобретению, в которых 89 представлено L, а 110 представлено K или Q, аминокислотный остаток в положении 112 представлен серином (S). Более предпочтительно С-терминальный конец у таких доменов V_H может быть представлен (а предпочтительно является) одним из VKVSS (SEQ ID NO: 95), VQVSS (SEQ ID NO: 96), VKVSS(X)_n (SEQ ID NO: 97) или VQVSS(X)_n (SEQ ID NO: 98), где n и X такие, как описано здесь для доменов V_H по изобретению, в которых положение 112 представлено Q или K (и С-концевое удлинение предпочтительно тоже такое, как описано здесь для доменов V_H по изобретению, в которых положение 112 представлено Q или K). Кроме того, как и в случае доменов V_H по изобретению, у которых в положении 112 находится Q или K либо в положении 89 находится Т, когда такой домен V_H с L в положении 89 и K или Q в положении 110 представляет собой нанотело, то в положении 11 предпочтительно находится лейцин (L), в положении 14, в частности, может быть аланин (А) или пролин (Р), а в положении 108, в частности, может быть Q или L (а в гуманизованных нанотелах предпочтительно L); причем такое нанотело с L в положении 89 и K или Q в положении 110 может содержать один или несколько характерных для нанотел остатков и/или быть соответствующим образом гуманизованным. Кроме того: (i) в положении 41 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-6 WO 08/020079 для положения 41, в частности, это может быть (или выбран из них) пролин (Р), серии (S), треонин (Т), аланин (А) или лейцин (L), то есть из числа тех аминокислотных остатков, которые чаще всего встречаются в этом положении у людей или у лам, а более предпочтительно это может быть пролин (Р) или аланин (А); и/или (ii) в положении 42 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-6 WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (Е); и/или (iii) в положении 87 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-7 WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (Т) или аланин (А).

Такой домен V_H по изобретению с L в положении 89 и K или Q в положении 110 опять же может представлять собой нанотело к сывороточному альбумину, как уже описано здесь. Например, такое связывающее сывороточный альбумин нанотело может иметь одну из последовательностей SEQ ID NOs: 46-75, но с L в положении 89 и K или Q в положении 110; или же другое связывающее сывороточный альбумин нанотело с L в положении 89 и K или Q в положении 110, которое по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, как-то по меньшей мере на 95% идентично по последовательности хотя бы с одним из Alb-1 (SEQ ID NO: 52, WO 2006/122787), Alb-8 (SEQ ID NO: 46, здесь) и/или Alb-23 (SEQ ID NO: 61, здесь) (принимая во внимание и каркасные последовательности, и CDRs, но без учета С-концевого удлинения).

В более общем виде домен V_H против сывороточного альбумина в соответствии с этим аспектом изобретения может быть одним из нанотел против сывороточного альбумина (человека), которые описаны в WO 2004/041865 и в особенности в WO 2006/122787 и WO 2012/175400 (все это заявки от заявителя/правопреемника), в котором аминокислота в положении 89 представлена лейцином (L), а аминокислотный остаток в положении 110 представлен K или Q, и которое необязательно содержит С-концевое удлинение, как описано здесь (а также, к примеру, может содержать одну или несколько других специфических замен аминокислотных остатков, приведенных здесь, как-то 11L, L11V, L11K, 14А, Р14А, 14Р, А14Р, 108L и/или Q108L; а также S112K или S112Q, хотя обычно наличие дополнительной замены в положении 112 зачастую и не требуется, если в положении 89 находится L, а в положении 110 - K или Q, при этом в положении 112 предпочтительно находится S). Более того, предусматривается, что настоящее изобретение также применимо и к другим ISVD тяжелой цепи, связывающим сывороточный альбумин, типа тех, что описаны в WO 03/035694, WO 04/003019, WO 05/118642, WO 06/059106, WO 08/096158, WO 09/121804, WO 10/108937 или US 2013/0129727, т.е. при соответствующем введении лейцина (L) в положении 89 и K либо Q в положении 110, а также необязательно одной или нескольких других замен аминокислотных остатков, описанных здесь, и необязательно (а обычно предпочтительно, как изложено здесь) добавлении С-концевого удлинения (тоже как описано здесь). В таких доменах V_H против сывороточного альбумина аминокислота в положении 112 предпочтительно представлена S, а также в таких доменах V_H предпочтительно С-терминальный конец представлен одним из SEQ ID NOs: 95-98. Кроме того: (i) в положении 41 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл.А-6 WO 08/020079 для положения 41, в частности, это может быть (или выбран из них) пролин (Р), серии (S), треонин (Т), аланин (А) или лейцин (L), то есть из числа тех аминокислотных остатков, которые чаще всего встречаются в этом положении у людей или у лам, а более предпочтительно это может быть пролин (Р) или аланин (А); и/или (ii) в положении 42 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-6 WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (Е); и/или (iii) в положении 87 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-7 WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (Т) или аланин (А).

Некоторые предпочтительные, но без ограничения, примеры таких связывающих сывороточный альбумин нанотел по изобретению - это гуманизованные варианты амино- кислотной последовательности SEQ ID NO: 52 из WO 2006/122787 (именуемой "Alb-1" в WO 2006/122787), в которых аминокислота в положении 89 представлена L, а аминокислотный остаток в положении 110 представлен K или Q (и которые необязательно содержат С-концевое удлинение, как описано здесь), типа гуманизованных вариантов Alb-1, приведенных в SEQ ID NOs: 57-64 в WO 2006/122787 (в каждом случае с заменой V89L и заменой T110Q или T110K и необязательно с С-концевым удлинением), или гуманизованных вариантов Alb-1, приведенных в SEQ ID NOs: 3-11 в WO 2012/175400 (опять же, в каждом случае с заменой V89L и заменой T110Q или T110K), из которых SEQ ID NOs 3, 4 и 5 могут необязательно содержать С-концевое удлинение, a SEQ ID NOs 6-11 в самом деле содержат С-концевое удлинение (опять же, такие варианты могут содержать одну или несколько других специфических замен аминокислотных остатков, приведенных здесь, как-то 11L, L11V, L11K, 14А, Р14А, 14Р, А14Р, 108L и/или Q108L; а также S112K или S112Q, хотя обычно наличие дополнительной замены в положении 112 зачастую и не требуется, если в положении 89 находится L, а в положении 110 - K или Q, при этом в положении 112 предпочтительно находится S). В таких доменах V_H против сывороточного альбумина аминокислота в положении 112 предпочтительно представлена S, а также в таких доменах V_H предпочтительно С-терминальный конец представлен одним из SEQ ID NOs: 95-98. Кроме того: (i) в положении 41 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-6 WO 08/020079 для положения 41, в частности, это может быть (или выбран из них) пролин (Р), серии (S), треонин (Т), аланин (А) или лейцин (L), то есть из числа тех аминокислотных остатков, которые чаще всего встречаются в этом положении у людей или у лам, а более предпочтительно это может быть пролин (Р) или аланин (А); и/или (ii) в положении 42 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-6 WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (Е); и/или (iii) в положении 87 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-7 WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (Т) или аланин (А).

Итак, в следующем аспекте изобретение касается нанотел по изобретению (как определено здесь), которые могут связываться (в частности, специфически связываться) с сывороточным альбумином (в особенности сывороточным альбумином человека), в которых:

- CDR1 имеет аминокислотную последовательность SFGMS (SEQ ID NO: 41);

- CDR2 имеет аминокислотную последовательность SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ ID NO: 42);

- CDR3 имеет аминокислотную последовательность GGSLSR (SEQ ID NO: 43);

- аминокислотный остаток в положении 89 представлен L;

- аминокислотный остаток в положении 110 представлен K или Q;

которые необязательно содержат на С-терминальном конце С-концевое удлинение (X)_n, где n равно 1-10, предпочтительно 1-5, как-то 1, 2, 3, 4 или 5 (а предпочтительно 1 или 2, как-то 1); а каждый X означает (предпочтительно встречающийся в природе) аминокислотный остаток, который выбран независимо, а предпочтительно выбран независимо из группы, состоящей из аланина (А), глицина (G), валина (V), лейцина (L) и изолейцина (I) (опять же, такое С-концевое удлинение предпочтительно является таким, как описано здесь, и опять же, такое нанотело, к примеру, также может содержать одну или несколько других специфических замен аминокислотных остатков, приведенных здесь, как-то 11L, L11V, L11K, 14А, Р14А, 14Р, А14Р, 108L и/или Q108L; а также S112K или S112Q, хотя обычно наличие дополнительной замены в положении 112 зачастую и не требуется, если в положении 89 находится L, а в положении 110 - K или Q, при этом в положении 112 предпочтительно находится S). В таких доменах V_H против сывороточного альбумина аминокислота в положении 112 предпочтительно представлена S, а также в таких доменах V_H предпочтительно С-терминальный конец представлен одним из SEQ ID NOs: 95-98. Кроме того: (i) в положении 41 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-6 WO 08/020079 для положения 41, в частности, это может быть (или выбран из них) пролин (Р), серии (S), треонин (Т), аланин (А) или лейцин (L), то есть из числа тех аминокислотных остатков, которые чаще всего встречаются в этом положении у людей или у лам, а более предпочтительно это может быть пролин (Р) или аланин (А); и/или (ii) в положении 42 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-6 WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (Е); и/или (iii) в положении 87 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-7 WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (Т) или аланин (А).

В предпочтительном аспекте изобретение касается нанотел по изобретению (как определено здесь), которые могут связываться (в частности, специфически связываться) с сывороточным альбумином (в особенности с сывороточным альбумином человека), которые являются гуманизованными вариантами SEQ ID NO: 52 из WO 2006/122787, в которых:

- CDR1 имеет аминокислотную последовательность SFGMS (SEQ ID NO: 41);

- CDR2 имеет аминокислотную последовательность SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ ID NO: 42);

- CDR3 имеет аминокислотную последовательность GGSLSR (SEQ ID NO: 43);

- аминокислотный остаток в положении 89 представлен L;

- аминокислотный остаток в положении 110 представлен K или Q;

которые необязательно содержат на С-терминальном конце С-концевое удлинение (X)_n, где n равно 1-10, предпочтительно 1-5, как-то 1, 2, 3, 4 или 5 (а предпочтительно 1 или 2, как-то 1); а каждый X означает (предпочтительно встречающийся в природе) аминокислотный остаток, который выбран независимо, а предпочтительно выбран независимо из группы, состоящей из аланина (А), глицина (G), валина (V), лейцина (L) и изолейцина (I) (опять же, такое С-концевое удлинение предпочтительно является таким, как описано здесь, и опять же, такое нанотело, к примеру, также может содержать одну или несколько других специфических замен аминокислотных остатков, приведенных здесь, как-то 11L, L11V, L11K, 14А, Р14А, 14Р, А14Р, 108L и/или Q108L; а также S112K или S112Q, хотя обычно наличие дополнительной замены в положении 112 зачастую и не требуется, если в положении 89 находится L, а в положении 110 - K или Q, при этом в положении 112 предпочтительно находится S). В таких доменах V_H против сывороточного альбумина аминокислота в положении 112 предпочтительно представлена S, а также в таких доменах V_H предпочтительно С-терминальный конец представлен одним из SEQ ID NOs: 95-98. Кроме того: (i) в положении 41 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-6 WO 08/020079 для положения 41, в частности, это может быть (или выбран из них) пролин (Р), серии (S), треонин (Т), аланин (А) или лейцин (L), то есть из числа тех аминокислотных остатков, которые чаще всего встречаются в этом положении у людей или у лам, а более предпочтительно это может быть пролин (Р) или аланин (А); и/или (ii) в положении 42 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-6 WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (Е); и/или (iii) в положении 87 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-7 WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (Т) или аланин (А).

В предпочтительном аспекте изобретение касается нанотел по изобретению (как определено здесь), которые могут связываться (в частности, специфически связываться) с сывороточным альбумином (в особенности с сывороточным альбумином человека), которые по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, как-то по меньшей мере на 95% идентичны по последовательности хотя бы с одним из Alb-1 (SEQ ID NO: 52, WO 2006/122787), Alb-8 (SEQ ID NO: 46, здесь) и/или Alb-23 (SEQ ID NO: 61, здесь) (принимая во внимание и каркасные последовательности, и CDRs, но без учета С-концевого удлинения), в которых аминокислотный остаток в положении 89 представлен L, а аминокислотный остаток в положении 110 представлен K или Q, и которые необязательно содержат на С-терминальном конце С-концевое удлинение (Х)_n, где n равно 1-10, предпочтительно 1-5, как-то 1, 2, 3, 4 или 5 (а предпочтительно 1 или 2, как-то 1); а каждый X означает (предпочтительно встречающийся в природе) аминокислотный остаток, который выбран независимо, а предпочтительно выбран независимо из группы, состоящей из аланина (А), глицина (G), валина (V), лейцина (L) и изолейцина (I) (опять же, такое С-концевое удлинение предпочтительно является таким, как описано здесь, и опять же, такое нанотело также, к примеру, может содержать одну или несколько других специфических замен аминокислотных остатков, приведенных здесь, как-то 11L, L11V, L11K, 14А, Р14А, 14Р, А14Р, 108L и/или Q108L; а также S112K или S112Q, хотя обычно наличие дополнительной замены в положении 112 зачастую и не требуется, если в положении 89 находится L, а в положении 110 - K или Q, при этом в положении 112 предпочтительно находится S). Такие нанотела по изобретению опять же предпочтительно являются гуманизованными вариантами Alb-1 (но с заменой V89L и T110K или T110Q), а более предпочтительно содержат по меньшей мере один, предпочтительно любые два, а более предпочтительно все три из CDR1, CDR2 и/или CDR3, приведенных в SEQ ID NOs: 41-43, соответственно. В таких доменах V_H против сывороточного альбумина аминокислота в положении 112 предпочтительно представлена S, а также в таких доменах V_H предпочтительно С-терминальный конец представлен одним из SEQ ID NOs: 95-98. Кроме того: (i) в положении 41 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-6 WO 08/020079 для положения 41, в частности, это может быть (или выбран из них) пролин (Р), серии (S), треонин (Т), аланин (А) или лейцин (L), то есть из числа тех аминокислотных остатков, которые чаще всего встречаются в этом положении у людей или у лам, а более предпочтительно это может быть пролин (Р) или аланин (А); и/или (ii) в положении 42 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-6 WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (Е); и/или (iii) в положении 87 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-7 WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (Т) или аланин (А).

В соответствии с одним конкретным аспектом, любое связывающее сывороточный альбумин нанотело по изобретению с L в положении 89 и K или Q в положении 110 также может содержать аминокислотные остатки, характерные для Alb-23 и его вариантов, как описано в WO 12/175400 (т.е. аминокислотный мотив GP в положениях 44 и 45, аминокислотный мотив SKN в положениях 74-76 и предпочтительно G в положении 16, а также необязательно R в положении 83). Кроме того: (i) в положении 41 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-6 WO 08/020079 для положения 41, в частности, это может быть (или выбран из них) пролин (Р), серии (S), треонин (Т), аланин (А) или лейцин (L), то есть из числа тех аминокислотных остатков, которые чаще всего встречаются в этом положении у людей или у лам, а более предпочтительно это может быть пролин (Р) или аланин (А); и/или (ii) в положении 42 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-6 WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (Е); и/или (iii) в положении 87 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-7 WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (Т) или аланин (А).

Как и домены V_H по изобретению, содержащие Q или K в положении 112 либо содержащие Т в положении 89, домены V_H по изобретению, содержащие L в положении 89 и K или Q в положении 110, проявляют снижение связывания предсуществующих антител, в частности, таких предсуществующих антител (к примеру, таких, которые встречаются в образцах от больных SLE), которые способны связываться с доменами V_H и нанотелами при наличии С-концевого удлинения.

Некоторые неограничительные примеры доменов V_H по изобретению, содержащих L в положении 89 и K в положении 110 (а также V в положении 11), представлены на фиг. 2 в виде SEQ ID NOs: 123-136. Эти домены V_H, которые связываются с сывороточным альбумином человека, содержат участки CDR, указанные здесь для предпочтительных доменов V_H по изобретению, связывающихся с сывороточным альбумином.

В следующем аспекте изобретение касается вариабельных доменов тяжелой цепи иммуноглобулина (доменов V_H), у которых аминокислотный остаток в положении 89 (нумерация по Kabat) представлен лейцином (L), а аминокислотный остаток в положении 11 представлен валином (V). Такие вариабельные домены тяжелой цепи иммуноглобулина (домены V_H) с L в положении 89 и V в положении 11 также охвачены термином "домены V_H по изобретению", который применяется здесь в самом широком смысле, и тоже могут быть такими, как описано здесь для других доменов V_H по изобретению (т.е. содержащих K или Q в положении 112, содержащих Т в положении 89 или содержащих L в положении 89 и K или Q в положении 110; хотя у доменов V_H в соответствии с данным аспектом аминокислотный остаток в положении 89 должен быть L, аминокислотный остаток в положении 11 должен быть V, а аминокислотные остатки в положениях 110 и 112, соответственно, могут быть представлены любым аминокислотным остатком, подходящим для этих положений). Соответственно, такие вариабельные домены тяжелой цепи иммуноглобулина (домены V_H) могут содержать С-концевое удлинение, как уже описано здесь (включая указанные предпочтения для таких С-концевых удлинений); они могут представлять собой ISVD и в особенности нанотела, как описано здесь.

Опять же, если такой домен V_H по изобретению имеет экспонированный С-концевой участок (например, потому, что он образует С-терминальный конец белка, полипептида или иной конструкции, в которой он находится), то предпочтительно он содержит С-концевое удлинение (см. данные, представленные ниже в табл. С).

Кроме того, нанотела по изобретению, у которых положение 89 представлено L и положение 11 представлено V (т.е. с С-концевым удлинением или без него): (i) предпочтительно содержат аминокислоту в положении 110, которая выбрана из Т, I, А, K и Q (а предпочтительно из Т, K и Q, более предпочтительно это может быть Т); (ii) предпочтительно содержат аминокислоту в положении 112, которая выбрана из S, F, K и Q (а предпочтительно из S, K и Q, более предпочтительно это может быть S); и (iii) также могут содержать замену, например, Р14А или А14Р и/или замену Q108L. В соответствии с одним конкретным воплощением, у доменов V_H в соответствии с этим аспектом изобретения аминокислотный остаток в положении 110 представлен Т, аминокислотный остаток в положении 112 представлен S, а С-терминальный конец предпочтительно представлен либо VTVSS (SEQ ID NO: 77), либо VTVSS(X)_n (SEQ ID NO: 78), где X и n такие, как определено здесь для С-концевого удлинения у других доменов V_H по изобретению. Кроме того, у доменов V_H в соответствии с этим аспектом изобретения: (i) в положении 41 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-6 WO 08/020079 для положения 41, в частности, это может быть (или выбран из них) пролин (Р), серии (S), треонин (Т), аланин (А) или лейцин (L), то есть из числа тех аминокислотных остатков, которые чаще всего встречаются в этом положении у людей или у лам, а более предпочтительно это может быть пролин (Р) или аланин (А); и/или (ii) в положении 42 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-6 WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (Е); и/или (iii) в положении 87 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-7 WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (Т) или аланин (А).

Так, например, у таких доменов V_H по изобретению, в которых положение 89 представлено L, а 11 представлено V, С-терминальный конец у таких доменов V_H может быть представлен (а предпочтительно является) одним из VTVSS (SEQ ID NO: 77), VTVSS(X)_n (SEQ ID NO: 78), VTVKS (SEQ ID NO: 1), VTVKS(X)_n (SEQ ID NO: 21), VTVQS (SEQ ID NO: 2), VTVQS(X)_n (SEQ ID NO: 22), VKVSS (SEQ ID NO: 95), VKVSS(X)_n (SEQ ID NO: 97), VQVSS (SEQ ID NO: 96), VQVSS(X)_n (SEQ ID NO: 98), VZVZS (SEQ ID NO: 107, при этом каждый аминокислотный остаток Z независимо означает K или Q) или VZVZS(X)_n (SEQ ID NO: 108, при этом каждый аминокислотный остаток Z независимо означает K или Q), а предпочтительно одним из VTVSS, VKVSS (SEQ ID NO: 95), VQVSS (SEQ ID NO: 96), VKVSS(X)_n (SEQ ID NO: 97) или VQVSS(X)_n (SEQ ID NO: 98), более предпочтительно это либо VTVSS (SEQ ID NO: 77), либо VTVSS(X)_n (SEQ ID NO: 78), где n и X такие, как описано здесь для доменов V_H по изобретению, у которых в положении 112 находится Q или K (и С-концевое удлинение предпочтительно такое, как описано здесь для доменов V_H по изобретению, у которых в положении 112 находится Q или K). Кроме того, как и в случае доменов V_H по изобретению, у которых в положении 112 находится Q или K либо в положении 89 находится Т, когда такой домен V_H с L в положении 89 и V в положении 11 представляет собой нанотело, то в положении 11 предпочтительно находится лейцин (L), в положении 14, в частности, может быть аланин (А) или пролин (Р), а в положении 108 может быть Q или L (а в гуманизованных нанотелах это предпочтительно L); причем такие нанотела с L в положении 89 и V в положении 11 могут содержать один или несколько характерных для нанотел остатков и/или быть соответственным образом гуманизованными. А также: (i) в положении 41 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-6 WO 08/020079 для положения 41, в частности, это может быть (или выбран из них) пролин (Р), серии (S), треонин (Т), аланин (А) или лейцин (L), то есть из числа тех аминокислотных остатков, которые чаще всего встречаются в этом положении у людей или у лам, а более предпочтительно это может быть пролин (Р) или аланин (А); и/или (ii) в положении 42 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-6 WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (Е); и/или (iii) в положении 87 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-7 WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (Т) или аланин (А).

Такой домен V_H по изобретению с L в положении 89 и V в положении 11 опять же может представлять собой нанотело к сывороточному альбумину, как уже описано здесь. Например, такое связывающее сывороточный альбумин нанотело может иметь одну из последовательностей SEQ ID NOs: 46-75, но с L в положении 89 и V в положении 11; или же другое связывающее сывороточный альбумин нанотело с L в положении 89 и V в положении 11, которое по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, как-то по меньшей мере на 95% идентично по последовательности хотя бы с одним из Alb-1 (SEQ ID NO: 52, WO 2006/122787), Alb-8 (SEQ ID NO: 46, здесь) и/или Alb-23 (SEQ ID NO: 61, здесь) (принимая во внимание и каркасные последовательности, и CDRs, но без учета С-концевого удлинения).

В более общем виде домен V_H против сывороточного альбумина в соответствии с этим аспектом изобретения может быть одним из нанотел против сывороточного альбумина (человека), которые описаны в WO 2004/041865 и в особенности в WO 2006/122787 и WO 2012/175400 (все это заявки от заявителя/правопреемника), в котором аминокислота в положении 89 представлена лейцином (L), а аминокислотный остаток в положении 11 представлен V, и которое необязательно содержит С-концевое удлинение, как описано здесь (а также, к примеру, может содержать одну или несколько других специфических замен аминокислотных остатков, приведенных здесь, как-то 14А, Р14А, 14Р, А14Р, 108L, Q108L, V110K, V110Q, S112K и/или S112Q). Более того, предусматривается, что настоящее изобретение также применимо и к другим ISVD тяжелой цепи, связывающим сывороточный альбумин, типа тех, что описаны в WO 03/035694, WO 04/003019, WO 05/118642, WO 06/059106, WO 08/096158, WO 09/121804, WO 10/108937 или US 2013/0129727, т.е. при соответствующем введении лейцина (L) в положении 89 и валина в положении 11, а также необязательно одной или нескольких других замен аминокислотных остатков, описанных здесь, и необязательно (а обычно предпочтительно, как изложено здесь) добавлении С-концевого удлинения (тоже как описано здесь). В таких доменах V_H против сывороточного альбумина аминокислота в положении 112 предпочтительно представлена S, а также в таких доменах V_H предпочтительно С-терминальный конец представлен одним из SEQ ID NOs: 95-98. Кроме того: (i) в положении 41 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-6 WO 08/020079 для положения 41, в частности, это может быть (или выбран из них) пролин (Р), серии (S), треонин (Т), аланин (А) или лейцин (L), то есть из числа тех аминокислотных остатков, которые чаще всего встречаются в этом положении у людей или у лам, а более предпочтительно это может быть пролин (Р) или аланин (А); и/или (ii) в положении 42 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-6 WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (Е); и/или (iii) в положении 87 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-7 WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (Т) или аланин (А).

Некоторые предпочтительные, но без ограничения, примеры таких связывающих сывороточный альбумин нанотел по изобретению - это гуманизованные варианты аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 52 из WO 2006/122787 (именуемой "Alb-1" в WO 2006/122787), в которых аминокислота в положении 89 представлена L, а аминокислота в положении 11 представлена V (и которые необязательно содержат С-концевое удлинение, как описано здесь), типа гуманизованных вариантов Alb-1, приведенных в SEQ ID NOs: 57-64 в WO 2006/122787 (в каждом случае с заменой V89L и заменой L11V и необязательно с С-концевым удлинением), или гуманизованных вариантов Alb-1, приведенных в SEQ ID NOs: 3-11 в WO 2012/175400 (опять же, в каждом случае с заменой V89L и заменой L11V), из которых SEQ ID NOs: 3, 4 и 5 могут необязательно содержать С-концевое удлинение, a SEQ ID NOs: 6-11 в самом деле содержат С-концевое удлинение (опять же, такие варианты могут содержать одну или несколько других специфических замен аминокислотных остатков, приведенных здесь, как-то 14А, Р14А, 14Р, А14Р, 108L, Q108L, V110K, V110Q, S112K и/или S112Q). В таких доменах VH против сывороточного альбумина аминокислота в положении 112 предпочтительно представлена S, а также в таких доменах V_H предпочтительно С-терминальный конец представлен одним из SEQ ID NOs: 95-98. Кроме того: (i) в положении 41 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-6 WO 08/020079 для положения 41, в частности, это может быть (или выбран из них) пролин (Р), серии (S), треонин (Т), аланин (А) или лейцин (L), то есть из числа тех аминокислотных остатков, которые чаще всего встречаются в этом положении у людей или у лам, а более предпочтительно это может быть пролин (Р) или аланин (А); и/или (ii) в положении 42 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-6 WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (Е); и/или (iii) в положении 87 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-7 WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (Т) или аланин (А).

Итак, в следующем аспекте изобретение касается нанотел по изобретению (как определено здесь), которые могут связываться (в частности, специфически связываться) с сывороточным альбумином (в особенности сывороточным альбумином человека), в которых:

- CDR1 имеет аминокислотную последовательность SFGMS (SEQ ID NO: 41);

- CDR2 имеет аминокислотную последовательность SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ ID NO: 42);

- CDR3 имеет аминокислотную последовательность GGSLSR (SEQ ID NO: 43);

- аминокислотный остаток в положении 89 представлен L;

- аминокислотный остаток в положении 11 представлен V; при этом предпочтительно:

- аминокислотный остаток в положении 110 представлен K, Q или Т, более предпочтительно Т;

- аминокислотный остаток в положении 112 представлен K, Q или S, более предпочтительно S;

которые необязательно содержат на С-терминальном конце С-концевое удлинение (Х)_n, где n равно 1-10, предпочтительно 1-5, как-то 1, 2, 3, 4 или 5 (а предпочтительно 1 или 2, как-то 1); а каждый X означает (предпочтительно встречающийся в природе) аминокислотный остаток, который выбран независимо, а предпочтительно выбран независимо из группы, состоящей из аланина (А), глицина (G), валина (V), лейцина (L) и изолейцина (I) (опять же, такое С-концевое удлинение предпочтительно является таким, как описано здесь, и опять же, такое нанотело, к примеру, также может содержать одну или несколько других специфических замен аминокислотных остатков, приведенных здесь, как-то 14А, Р14А, 14Р, А14Р, 108L, Q108L). Опять же в таких доменах V_H против сывороточного альбумина с L в положении 89 и V в положении 11 аминокислота в положении 110 предпочтительно представлена Т, а аминокислота в положении 112 предпочтительно представлена S, а также в таких доменах V_H предпочтительно С-терминальный конец представлен одним из SEQ ID NOs: 95-98. Кроме того: (i) в положении 41 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-6 WO 08/020079 для положения 41, в частности, это может быть (или выбран из них) пролин (Р), серии (S), треонин (Т), аланин (А) или лейцин (L), то есть из числа тех аминокислотных остатков, которые чаще всего встречаются в этом положении у людей или у лам, а более предпочтительно это может быть пролин (Р) или аланин (А); и/или (ii) в положении 42 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-6 WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (Е); и/или (iii) в положении 87 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-7 WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (Т) или аланин (А).

В предпочтительном аспекте изобретение касается нанотел по изобретению (как определено здесь), которые могут связываться (в частности, специфически связываться) с сывороточным альбумином (в особенности с сывороточным альбумином человека), которые являются гуманизованными вариантами SEQ ID NO: 52 из WO 2006/122787, в которых:

- CDR1 имеет аминокислотную последовательность SFGMS (SEQ ID NO: 41);

- CDR2 имеет аминокислотную последовательность SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ ID NO: 42);

- CDR3 имеет аминокислотную последовательность GGSLSR (SEQ ID NO: 43);

- аминокислотный остаток в положении 89 представлен L;

- аминокислотный остаток в положении 11 представлен V; а также предпочтительно:

- аминокислотный остаток в положении 110 представлен K, Q или Т, более предпочтительно Т;

- аминокислотный остаток в положении 112 представлен K, Q или S, более предпочтительно S;

которые необязательно содержат на С-терминальном конце С-концевое удлинение (Х)_n, где n равно 1-10, предпочтительно 1-5, как-то 1, 2, 3, 4 или 5 (а предпочтительно 1 или 2, как-то 1); а каждый X означает (предпочтительно встречающийся в природе) аминокислотный остаток, который выбран независимо, а предпочтительно выбран независимо из группы, состоящей из аланина (А), глицина (G), валина (V), лейцина (L) и изолейцина (I) (опять же, такое С-концевое удлинение предпочтительно является таким, как описано здесь, и опять же, такое нанотело, к примеру, также может содержать одну или несколько других специфических замен аминокислотных остатков, приведенных здесь, как-то 11L, L11V, L11K, 14А, Р14А, 14Р, А14Р, 108L и/или Q108L). Опять же, в таких доменах VH против сывороточного альбумина с L в положении 89 и V в положении 11 аминокислота в положении 110 предпочтительно представлена Т, а аминокислота в положении 112 предпочтительно представлена S, а также в таких доменах V_H предпочтительно С-терминальный конец представлен одним из SEQ ID NOs: 95-98. Кроме того: (i) в положении 41 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-6 WO 08/020079 для положения 41, в частности, это может быть (или выбран из них) пролин (Р), серии (S), треонин (Т), аланин (А) или лейцин (L), то есть из числа тех аминокислотных остатков, которые чаще всего встречаются в этом положении у людей или у лам, а более предпочтительно это может быть пролин (Р) или аланин (А); и/или (ii) в положении 42 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-6 WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (Е); и/или (iii) в положении 87 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-7 WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (Т) или аланин (А).

В предпочтительном аспекте изобретение касается нанотел по изобретению (как определено здесь), которые могут связываться (в частности, специфически связываться) с сывороточным альбумином (в особенности с сывороточным альбумином человека), которые по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, как-то по меньшей мере на 95% идентичны по последовательности хотя бы с одним из Alb-1 (SEQ ID NO: 52, WO 2006/122787), Alb-8 (SEQ ID NO: 46, здесь) и/или Alb-23 (SEQ ID NO: 61, здесь) (принимая во внимание и каркасные последовательности, и CDRs, но без учета С-концевого удлинения), в которых аминокислотный остаток в положении 89 представлен L, а аминокислотный остаток в положении 11 представлен V, и которые необязательно содержат на С-терминальном конце С-концевое удлинение (Х)_n, где n равно 1-10, предпочтительно 1-5, как-то 1, 2, 3, 4 или 5 (а предпочтительно 1 или 2, как-то 1); а каждый X означает (предпочтительно встречающийся в природе) аминокислотный остаток, который выбран независимо, а предпочтительно выбран независимо из группы, состоящей из аланина (А), глицина (G), валина (V), лейцина (L) и изолейцина (I) (опять же, такое С-концевое удлинение предпочтительно является таким, как описано здесь, и опять же, такое нанотело также, к примеру, может содержать одну или несколько других специфических замен аминокислотных остатков, приведенных здесь, как-то 14А, Р14А, 14Р, А14Р, 108L, Q108L, T110K, T110Q, S112K и/или S112Q). Такие нанотела по изобретению опять же предпочтительно являются гуманизованными вариантами Alb-1 (но с заменой V89L и L11V), а более предпочтительно содержат по меньшей мере один, предпочтительно любые два, а более предпочтительно все три из CDR1, CDR2 и/или CDR3, приведенных в SEQ ID NOs: 41-43, соответственно. В таких доменах V_H против сывороточного альбумина аминокислота в положении 112 предпочтительно представлена S, а также в таких доменах V_H предпочтительно С-терминальный конец представлен одним из SEQ ID NOs: 95-98. Кроме того: (i) в положении 41 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-6 WO 08/020079 для положения 41, в частности, это может быть (или выбран из них) пролин (Р), серии (S), треонин (Т), аланин (А) или лейцин (L), то есть из числа тех аминокислотных остатков, которые чаще всего встречаются в этом положении у людей или у лам, а более предпочтительно это может быть пролин (Р) или аланин (А); и/или (ii) в положении 42 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-6 WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (Е); и/или (iii) в положении 87 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-7 WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (Т) или аланин (А).

В соответствии с одним конкретным аспектом, любое связывающее сывороточный альбумин нанотело по изобретению с L в положении 89 и V в положении 11 также может содержать аминокислотные остатки, характерные для Alb-23 и его вариантов, как описано в WO 12/175400 (т.е. аминокислотный мотив GP в положениях 44 и 45, аминокислотный мотив SKN в положениях 74-76 и предпочтительно G в положении 16, а также необязательно R в положении 83). Кроме того: (i) в положении 41 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-6 WO 08/020079 для положения 41, в частности, это может быть (или выбран из них) пролин (Р), серии (S), треонин (Т), аланин (А) или лейцин (L), то есть из числа тех аминокислотных остатков, которые чаще всего встречаются в этом положении у людей или у лам, а более предпочтительно это может быть пролин (Р) или аланин (А); и/или (ii) в положении 42 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-6 WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (Е); и/или (iii) в положении 87 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-7 WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (Т) или аланин (А).

Как и домены V_H по изобретению, содержащие Q или K в положении 112 либо содержащие Т в положении 89, домены V_H по изобретению, содержащие L в положении 89 и V в положении 11, проявляют снижение связывания предсуществующих антител, в частности, таких предсуществующих антител (к примеру, таких, которые встречаются в образцах от больных SLE), которые способны связываться с доменами V_H и нанотелами при наличии С-концевого удлинения. И еще следует отметить в отношении доменов V_H по изобретению, у которых в положении 89 находится L и в положении 11 находится V, что эти замены встречаются с определенной частотой в доменах V_H человека (см. табл.А-5 в WO 08/020079 для положения 11 и табл. А-7 в WO 08/020079 для положения 89).

Некоторые неограничительные примеры доменов V_H по изобретению, содержащих V в положении 11 и L в положении 89, представлены на фиг.2 в виде SEQ ID NOs: 109-136. У этих доменов V_H последовательности, приведенные в SEQ ID NOs: 123-136, наряду с мутациями L11V и V89L, также содержат мутацию T110K. Эти домены V_H, которые связываются с сывороточным альбумином человека, содержат участки CDR, указанные здесь для предпочтительных доменов V_H по изобретению, связывающихся с сывороточным альбумином.

В следующем аспекте изобретение касается доменов V_H (в частности, доменов V_H, представляющих собой ISVD, более предпочтительно доменов V_H, представляющих собой нанотела), в которых:

- аминокислотный остаток в положении 11 представлен V;

- аминокислотный остаток в положении 14 представлен А или Р;

- аминокислотный остаток в положении 41 представлен А или Р;

- аминокислотный остаток в положении 89 представлен L;

- аминокислотный остаток в положении 108 представлен Q или L;

- аминокислотный остаток в положении 110 представлен Т, K или Q; и

- аминокислотный остаток в положении 112 представлен S, K или Q;

причем такие домены V_H необязательно содержат С-концевое удлинение (Х)_n, где n равно 1-10, предпочтительно 1-5, как-то 1, 2, 3, 4 или 5 (а предпочтительно 1 или 2, как-то 1); а каждый X означает (предпочтительно встречающийся в природе) аминокислотный остаток, который выбран независимо, а предпочтительно выбран независимо из группы, состоящей из аланина (А), глицина (G), валина (V), лейцина (L) и изолейцина (I) (а С-концевое удлинение предпочтительно является таким, как описано здесь). Кроме того: (i) в положении 42 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-6 WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (Е); и/или (ii) в положении 87 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-7 WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (Т) или аланин (А). Предпочтительно у доменов V_H согласно этому аспекту аминокислотный остаток в положении 110 представлен Т, а аминокислотный остаток в положении 112 представлен S. Опять же, как и с другими доменами V_H по изобретению, такие домены V_H могут быть направлены против любой подходящей мишени (в частности, терапевтически значимой мишени). В соответствии с одним конкретным аспектом, такие домены V_H направлены против сывороточного альбумина.

В следующем аспекте изобретение касается доменов V_H (в частности, доменов V_H, представляющих собой ISVD, более предпочтительно доменов V_H, представляющих собой нанотела), в которых:

- аминокислотный остаток в положении 11 представлен L, V или К;

- аминокислотный остаток в положении 14 представлен А или Р;

- аминокислотный остаток в положении 41 представлен А или Р;

- аминокислотный остаток в положении 89 представлен Т, V или L;

- аминокислотный остаток в положении 108 представлен Q или L;

- аминокислотный остаток в положении 110 представлен Т, K или Q; и

- аминокислотный остаток в положении 112 представлен S, K или Q;

причем либо (i) аминокислотный остаток в положении 112 представлен K или Q; и/или (ii) аминокислотный остаток в положении 89 представлен Т; и/или (iii) аминокислотный остаток в положении 89 представлен L, а аминокислотный остаток в положении 110 представ лен K или Q; и (iv) в каждом из случаев (i)-(iii) аминокислота в положении 11 предпочтительно представлена V;

при этом такие домены V_H необязательно содержат С-концевое удлинение (Х)_n, где n равно 1-10, предпочтительно 1-5, как-то 1, 2, 3, 4 или 5 (а предпочтительно 1 или 2, как-то 1); а каждый X означает (предпочтительно встречающийся в природе) аминокислотный остаток, который выбран независимо, а предпочтительно выбран независимо из группы, состоящей из аланина (А), глицина (G), валина (V), лейцина (L) и изолейцина (I) (а С-концевое удлинение предпочтительно является таким, как описано здесь). Кроме того: (i) в положении 42 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-6 WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (Е); и/или (ii) в положении 87 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-7 WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (Т) или аланин (А). Другой аспект изобретения касается доменов V_H (в частности, доменов V_H, представляющих собой ISVD, более предпочтительно доменов V_H, представляющих собой нанотела), которые являются такими, как описано в данном абзаце, причем аминокислотный остаток в положении 11 представлен V, а аминокислотный остаток в положении 110 представлен K или Q (при этом аминокислотные остатки в положениях 14, 41, 89, 108 и 112 могут быть такими, как указано в приведенном выше маркированном списке, аминокислотные остатки в положениях 42 и 87 могут быть, к примеру, такими, как описано в данном абзаце, а домен V_H может необязательно содержать С-концевое удлинение (Х)_n, как описано в данном абзаце).

В следующем аспекте изобретение касается доменов V_H (в частности, доменов V_H, представляющих собой ISVD, более предпочтительно доменов V_H, представляющих собой нанотела), в которых:

- аминокислотный остаток в положении 11 представлен L, V или K;

- аминокислотный остаток в положении 14 представлен А или Р;

- аминокислотный остаток в положении 41 представлен А или Р;

- аминокислотный остаток в положении 89 представлен Т, V или L;

- аминокислотный остаток в положении 108 представлен Q или L;

- аминокислотный остаток в положении 110 представлен Т, K или Q; и

- аминокислотный остаток в положении 112 представлен S, K или Q;

причем либо (i) аминокислотный остаток в положении 112 представлен K или Q, в положении 89 находится Т, V или L (предпочтительно V), а аминокислотный остаток в положении 110 представлен Т, K или Q (предпочтительно Т); и/или (ii) аминокислотный остаток в положении 89 представлен Т, аминокислотный остаток в положении 112 представлен S, K или Q (предпочтительно S), а аминокислотный остаток в положении 110 представлен Т, K или Q (предпочтительно Т); и/или (iii) аминокислотный остаток в положении 89 представлен L, аминокислотный остаток в положении 110 представлен K или Q, а аминокислотный остаток в положении 112 представлен S, K или Q (предпочтительно S); и (iv) в каждом из случаев (i)-(iii) аминокислота в положении 11 предпочтительно представлена V;

при этом такие домены V_H необязательно содержат С-концевое удлинение (Х)_n, где n равно 1-10, предпочтительно 1-5, как-то 1, 2, 3, 4 или 5 (а предпочтительно 1 или 2, как-то 1); а каждый X означает (предпочтительно встречающийся в природе) аминокислотный остаток, который выбран независимо, а предпочтительно выбран независимо из группы, состоящей из аланина (А), глицина (G), валина (V), лейцина (L) и изолейцина (I) (а С-концевое удлинение предпочтительно является таким, как описано здесь). Кроме того: (i) в положении 42 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-6 WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (Е); и/или (ii) в положении 87 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. А-7 WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (Т) или аланин (А). Другой аспект изобретения касается доменов V_H (в частности, доменов V_H, представляющих собой ISVD, более предпочтительно доменов V_H, представляющих собой нанотела), которые являются такими, как описано в данном абзаце, причем аминокислотный: остаток в положении 11 представлен V, а аминокислотный остаток в положении 110 представлен K или Q (при этом аминокислотные остатки в положениях 14, 41, 89, 108 и 112 могут быть такими, как указано в приведенном выше маркированном списке, аминокислотные остатки в положениях 42 и 87 могут быть, к примеру, такими, как описано в данном абзаце, а домен V_H может необязательно содержать С-концевое удлинение (Х)_n, как описано в данном абзаце).