УЛУЧШЕННЫЕ ВАРИАБЕЛЬНЫЕ ДОМЕНЫ ИММУНОГЛОБУЛИНА Российский патент 2023 года по МПК C07K16/00 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение имеет отношение к улучшенным вариабельным доменам тяжелой цепи иммуноглобулина.

В частности, изобретение касается улучшенных вариабельных доменов тяжелой цепи иммуноглобулина, которые либо имеют экспонированный C-концевой участок или конец (как описано далее, также см. WO 12/175741), либо используются (или предназначены для использования) в таких применениях, где они имеют экспонированный C-концевой участок или конец (опять же, как описано далее). Некоторые из предпочтительных, без ограничения, примеров таковых представлены одиночными вариабельными доменами иммуноглобулина (которые также именуются здесь “ISV” или “ISVD”), такими как нанотела (включая V_HH, гуманизованные V_HH и камелизованные V_H типа камелизованных V_H человека), (однодоменные) антитела, которые представляют собой домены V_H или получены из доменов V_H, и dAbs, которые представляют собой домены V_H или получены из доменов V_H. Некоторыми из предпочтительных, без ограничения, примеров последних являются домены V_H, которые используются (или предназначены для использования) в одноцепочечных Fv (scFv) или диателах.

Изобретение также касается белков, полипептидов и других конструкций, молекул или химических соединений, содержащих или в основном состоящих из (одного или нескольких) улучшенных вариабельных доменов тяжелой цепи иммуноглобулина по изобретению, как описано здесь; способов экспрессии/получения улучшенных вариабельных доменов тяжелой цепи иммуноглобулина по изобретению и/или экспрессии/получения содержащих их белков, полипептидов и других конструкций, молекул или химических соединений; композиций и продуктов (типа фармацевтических композиций и продуктов), содержащих улучшенные вариабельные домены тяжелой цепи иммуноглобулина по изобретению и/или содержащие их белки, полипептиды и другие конструкции, молекулы или химические соединения; последовательностей нуклеотидов и нуклеиновых кислот, кодирующих улучшенные вариабельные домены тяжелой цепи иммуноглобулина по изобретению и/или кодирующих содержащие их белки или полипептиды; и применения (в частности, терапевтического, профилактического и диагностического применения) улучшенных вариабельных доменов тяжелой цепи иммуноглобулина по изобретению и содержащих их белков, полипептидов и других конструкций, молекул или химических соединений.

Другие аспекты, воплощения, преимущества, приложения и применения данного изобретения станут понятными из приведенного здесь дальнейшего описания.

Уровень техники

В настоящей заявке аминокислотные остатки/положения в вариабельном домене тяжелой цепи иммуноглобулина будут обозначаться нумерацией по Kabat. Для удобства, на фиг. 1 приведена таблица с перечнем некоторых положений аминокислот, которые конкретно будут упоминаться здесь, и их нумерация в соответствии с некоторыми альтернативными системами нумерации типа AHo и IMGT. Примечание: для настоящего описания и формулы изобретения решающей является нумерация по Kabat; другие системы нумерации приводятся только для справки).

Кроме того, в изобретении вариабельный домен иммуноглобулина, как говорят, имеет “экспонированный C-терминальный конец или участок”, если он не связан или не соединен с константным доменом (типа домена C_H1). Сошлемся на приведенные здесь работы из предшествующего уровня техники.

В частности, как описано в заявке WO 12/175741, C-концевой участок (поскольку этот термин также применяется здесь) является частью предполагаемого эпитопа на ISV, который также включает в себя, среди прочих остатков, аминокислотный остаток в положении 14 (и аминокислотные остатки вблизи от него в аминокислотной последовательности, как-то положения 11, 13 и 15), а также может включать аминокислотный остаток в положении 83 (и аминокислотные остатки вблизи от него в аминокислотной последовательности, как-то положения 82, 82а, 82b и 84) и/или аминокислотный остаток в положении 108 (и аминокислотные остатки вблизи от него в аминокислотной последовательности, как-то положение 107). Как и в WO 12/17574, этот предполагаемый эпитоп также собирательно именуется здесь как “C-концевой участок”, причем подразумевается, что этот C-концевой участок как минимум включает C-концевую последовательность VTVSS (т.е. каждое из положений 109, 110, 111, 112 и 113) и аминокислотный остаток в положении 14, а также может содержать аминокислотные остатки в положениях 83 и 108, а возможно, и аминокислотные остатки в положениях 13, 15, 82b, 83, 84 и 107.

В результате исследований одноцепочечных Fv или “scFv” (которые представляют собой конструкции, содержащие вариабельные домены иммуноглобулина, которые, подобно ISVD, не связаны с константными доменами) в этой области было описано, что C-конец вариабельного домена иммуноглобулина содержит гидрофобный участок, который в обычных полноразмерных антителах погружен в интерфейс между вариабельным доменом и константным доменом, но становится доступным растворителям тогда, когда вариабельный домен не связан с константным доменом (например, см. Nieba et al., Protein Engineering, 10, 435-444 (1997) и Harmsen et al., Molecular Immunology (2000), 579-590).

Также хорошо известно, что эпитопы, которые обычно зарыты в структуре белка (также известные как “неоэпитопы” или “криптические эпитопы”), могут запускать иммунную систему, как только они становятся доступны растворителям, например, из-за деградации, неправильной укладки или агрегации данного белка. Например, в случае заглубленных гидрофобных частей биомолекул (так называемых "hyppos") высказывалось предположение, что они составляют часть общего связанного с повреждениями молекулярного шаблона, который приводит к врожденной иммунной реакции, как только hyppos становятся доступны растворителям (к примеру, см. Seong and Matzinger, Nature Reviews 2004, 469), и были описаны различные примеры прежде заглубленных гидрофобных участков, вызывающих иммунные реакции (например, см. David et al., JBC, 2001, 6370-6377; Matsuura et al., International Immunology, 2000, 1183-1192; Rasheed et al., Life Sciences 79 (2000), 2320-2328). В более общем плане также известно, что гидрофобные аминокислоты имеют склонность быть частью B-клеточных эпитопов (например, см. WO 11/07586, page 10; и Kolaskar, FEBS 276, 172-174 (1990)). Так, было описано, что гидрофобный участок на C-конце вариабельного домена тяжелой цепи (как описано в Nieba et al. и Harmsen et al., см. выше) могут образовывать В-клеточные эпитопы, которые могут порождать и/или взаимодействовать с (возникающими и/или предсуществующими) антителами против лекарственных препаратов (WO 11/07586). По этой причине было предложено мутировать некоторые аминокислотные остатки, входящие в состав C-концов вариабельных доменов, чтобы уменьшить гидрофобность и/или удалить B-клеточные эпитопы. К примеру, Nieba et al. предложили мутировать положения 11, 14, 41, 84, 87 и/или 89 в области V_H (нумерация по Kabat), а в WO 11/07586 предложили мутировать положения 99, 101 и/или 148 (нумерация по AHo) домена V_L или положения 12, 97, 98, 99, 103 и/или 144 домена V_H (опять же по AHo - эти положения соответствуют положениям 11, 83, 84, 85, 89 и 103 согласно Kabat). Аналогичным образом Harmsen et al. предложили мутировать положения 12 и 101 (нумерация по IMGT; это положения 11 и 89 согласно Kabat), чтобы компенсировать отсутствие домена C_H1; и они также идентифицировали определенное подсемейство V_HH (названное "V_HH4"), содержащее аминокислоты, которые являются подходящими кандидатами для замен по этим положениям.

Также было описано (к примеру, см. WO 12/175741 и ссылки, приведенные в следующих абзацах), что биологические образцы, взятые у людей, могут содержать (предсуществующие) белки или факторы, которые способны связываться с экспонированным C-концевым участком или концом вариабельного домена иммуноглобулина (например, C-концевым участком или концом ISVD или домена V_H или V_L в scFv или диателах).

Например, в WO 2013/024059 заявлено, что “в сыворотке от некоторых здоровых наивных человеческих субъектов уже присутствуют аутоантитела против V_H, которые могут связывать и антитела против домена V_H, и молекулы V_HH, а также аутоантитела против V_L (например, против V-каппа (VK)), которые могут связывать молекулы V_L”, и что “предсуществующие ADAs, которые связывают dAbs к V_H, подобны антишарнирным антителам в том, что они связывают фрагменты IgG, но не связывают те же самые последовательности, находящиеся in situ на интактных IgG”.

В Holland et al., J. Clin. Immunol. 2013, 33(7):1192-203 описано, что в крови примерно половины нормальных здоровых людей содержатся различные уровни нового класса аутоантител против IgG, которые могут связываться с каркасными последовательностями полностью человеческих антител против домена V_H (которые Holland et al. также именуют “аутоантителами HAVH”). Holland et al. также отмечают, что эти аутоантитела относятся главным образом к изотипу IgG, проявляют сравнительно высокое сродство (около 10⁻¹⁰ M) к последовательностям V_H, а свободный C-конец представляется важным для связывания этих аутоантител HAVH с доменами V_H.

Вопросы касательно предсуществующих антител против биотерапевтических молекул, реагирующих с биотерапевтическими средствами, и их регуляторного воздействия в общем виде также обсуждаются в Xue et al., AAPS J. 2013, 15(3):852-5.

Вышеприведенные работы предшествующего уровня техники также касаются способов, которыми можно модифицировать последовательность вариабельного домена иммуноглобулина с тем, чтобы предотвратить или уменьшить связывание таких предсуществующих антител/факторов с вариабельными доменами. В этом отношении, в WO 2011/07586 предлагается произвести одну или несколько мутаций в аминокислотной последовательности вариабельного домена по некоторым определенным положениям этого домена (эти положения выходят на поверхность). В WO 12/175741 описано, что связывание таких предсуществующих антител/факторов можно уменьшить путем добавления нескольких аминокислотных остатков (даже всего лишь одного остатка аланина) к C-концевому участку домена V_H и/или путем введения одной или нескольких специфических замен или делеций в C-концевом участке вариабельного домена, который в WO 12/175741 описан как включающий по меньшей мере C-концевую аминокислотную последовательность VTVSS и аминокислотный остаток в положении 14 (в отношении этого положения в WO 12/175741 сказано, что присутствие остатка аланина обеспечивает снижение связывания предсуществующих антител по сравнению с присутствием “человеческого” аминокислотного остатка пролина), а возможно также и аминокислотные остатки в положениях 108 и 83 и аминокислотные остатки, близкие к данным положениям (в WO 2013/024059 говорится в основном то же, что и в WO 12/175741).

Например, в исследованиях, проведенных заявителем/правопреемником, которые привели к подаче WO 12/175741, было обнаружено, что добавление всего лишь одного остатка аланина в C-концевой участок или конец экспонированного домена V_H, как правило, предотвращает/устраняет (практически полностью) связывание предсуществующих антител/факторов, присутствующих в образцах, взятых у большинства испытуемых (к примеру, см. стр. 62, строки 20-25, и от строки 30 на стр. 57 до строки 3 на стр. 58 в WO 12/175741); причем эти данные были подтверждены дополнительными результатами, полученными заявителем/правопреемником после подачи WO 12/175741, когда замену на C-концевой аланин из WO 12/175741 применяли к другим нанотелам (данные не приводятся).

Кроме того, в WO 12/175741, а также в WO 12/175400 от заявителя/правопреемника применяли C-концевые удлинения, описанные в WO 12/175741, к определенным нанотелам, связывающим сывороточный альбумин (к примеру, см. WO 12/175741: SEQ ID NOs: 37, 51-53 и 55-64 и конструкции, представленные в SEQ ID NOs: 41, 43 и 44; и WO 12/175400: SEQ ID NOs: 6-11).

На фиг. 9 в WO 12/175741 также приведены две связывающие альбумин последовательности, которые используются в качестве эталонных последовательностей ниже в «Экспериментальной части». Это последовательность SEQ ID NO: 37 на фиг. 9 в WO 12/175741 (которая также приводится здесь как “стандарт B”, эта последовательность приведена здесь как SEQ ID NO: 45) и “SEQ ID NO: 37 без добавленных C-концевых аминокислотных остатков” на фиг. 9 в WO 12/175741 (которая также приводится здесь как “стандарт A”, эта последовательность приведена в SEQ ID NO: 44). Стандарт A и стандарт B происходят из последовательности гуманизованного нанотела против альбумина “Alb-8”, которая приведена как SEQ ID NO: 62 в WO 06/122787 (а также приводится здесь как “Alb-11”), но, по сравнению с последовательностью Alb-11, стандарт A содержит N-концевую His-метку, а стандарт B содержит N-концевую His-метку и C-концевой остаток аланина. Стандарт A, стандарт B и Alb-8/Alb-11 содержат CDRs, приведенные в SEQ ID NOs: 41-43, соответственно.

Другие примеры нанотел и других одиночных вариабельных доменов иммуноглобулина, имеющих C-концевые удлинения и/или мутации в C-концевом участке, можно найти, к примеру, в следующих работах предшествующего уровня техники: WO 06/129843 (например, см. SEQ ID NOs: 4, 6, 8 и 10); WO 03/035695 (например, см. некоторые из последовательностей, приведенных на стр. 61-64); Vu et al., Molecular Immunology, 1121-1131, 1997 (например, см. некоторые из последовательностей, приведенных на фиг. 2); WO 11/003622 (например, см. последовательности, приведенные в SEQ ID NOs: 10-27); WO 09/058383 (например, см. последовательность TAR2h-10-27, упомянутую на стр. 51); WO 10/042815 (например, см. последовательности SEQ ID NOs: 1, 17, 27 и 30); и WO 04/044204 (например, см. последовательности SEQ ID NOs: 31, 35, 37, 47 и 49).

В некоторых из приведенных здесь ссылок также приведены примеры последовательностей ISVD, в которых последняя C-концевая аминокислота ISVD представлена другой аминокислотой, чем серин (S), например, потому, что серин в положении 113 был заменен другой аминокислотой, и/или потому, что серин в положении 113 был удален и была добавлена C-концевая аминокислота (на практике, конечный результат с точки зрения C-концевой аминокислотной последовательности будет таким же).

В некоторых из приведенных здесь ссылок также приводятся примеры нанотел и других одиночных вариабельных доменов иммуноглобулина, в которых аминокислота в положении 112 не представлена серином. К примеру, в WO 12/175741 описаны нанотела, в которых аминокислота в положении 112 представлена глицином (G); в Vu et al. (выше) описаны нанотела, в которых положение 112 представлено аланином (А) или изолейцином (I); в WO 13/024059 представлена замена S112A; а в WO 08/020079, цитированном ниже, представлена замена S112F, а также вообще утверждается, что описанные там нанотела могут содержать ограниченное число аминокислотных остатков, добавляемых в C-концевой участок аминокислотной последовательности нанотела.

В исследованиях, ведущих к настоящему изобретению, после того, как было установлено, что введение C-концевого удлинения (которое может быть представлено всего лишь одним C-концевым остатком аланина, опять же см. WO 12/175741, пример 3) в C-концевой участок или конец нанотела практически предотвращает/устраняет связывание предсуществующих антител/факторов в большинстве образцов испытуемых/пациентов, исследовали, будут ли образцы, полученные от испытуемых (здоровых добровольцев и/или пациентов, страдающих от болезни или заболевания), содержать (другие) предсуществующие антитела или факторы, которые могут связываться с экспонированным C-концевым участком нанотела (или другого домена V_H) даже при наличии C-концевого удлинения. При этом авторы настоящего изобретения обнаружили, что, хотя практически не выявляется связывания таких предсуществующих антител с доменом V_H с C-концевым удлинением в крови или сыворотке здоровых добровольцев или в крови или сыворотке, полученной от больных, страдающих одним из целого ряда различных заболеваний (включая некоторые воспалительные заболевания или аутоиммунные заболевания - данные не приводятся), но в некоторых образцах крови или сыворотки, полученных от некоторых (но не всех) испытуемых, страдающих некоторыми тяжелыми (ауто)иммунными заболеваниями (типа системной красной волчанки; сокращенно “SLE”), содержатся какие-то предсуществующие антитела/факторы, которые могут связываться с нанотелами даже тогда, когда данные нанотела содержат C-концевое удлинение.

Cущность изобретения

Итак, в общем целью настоящего изобретения является получение улучшенных вариабельных доменов тяжелой цепи иммуноглобулина (в частности, улучшенных ISVD тяжелой цепи, более предпочтительно улучшенных нанотел), которые, когда у них есть экспонированный C-концевой участок или конец, будут менее склонны связываться с предсуществующими антителами/факторами типа тех, что обнаружены в образцах крови или сыворотки, полученных от испытуемых.

В частности, целью настоящего изобретения является получение улучшенных вариабельных доменов тяжелой цепи иммуноглобулина, которые, когда у них есть экспонированный C-концевой участок или конец, будут менее склонны связываться с предсуществующими антителами/факторами (опять же типа тех, что обнаруживаются в образцах крови или сыворотки, полученных от испытуемых), которые все-таки могут связываться с экспонированным C-концевым участком или концом вариабельного домена тяжелой цепи и тогда, когда данный домен содержит C-концевое удлинение (к примеру, как описано в WO 12/175741, WO 13/024059 и в других приведенных здесь работах предшествующего уровня техники).

Как уже отмечалось, такие предсуществующие антитела, которые могут связываться с вариабельным доменом тяжелой цепи с C-концевым удлинением, были обнаружены авторами настоящего изобретения в образцах крови или сыворотки, полученных от испытуемых, страдающих определенными (ауто)иммунными заболеваниями, при которых иммунная система подвергается сильному воздействию/активируется (типа SLE).

Итак, более предпочтительно целью настоящего изобретения является получение улучшенных вариабельных доменов тяжелой цепи иммуноглобулина (в частности, улучшенных ISVD тяжелой цепи, более предпочтительно улучшенных нанотел), которые, когда у них есть экспонированный C-концевой участок или конец, будут менее склонны связываться с предсуществующими антителами/факторами типа тех, что обнаружены в образцах крови или сыворотки, полученных от испытуемых, страдающих определенными (ауто)иммунными заболеваниями, при которых иммунная система подвергается сильному воздействию/активируется (типа SLE).

Еще более предпочтительно целью настоящего изобретения является получение улучшенных вариабельных доменов тяжелой цепи иммуноглобулина (в частности, улучшенных ISVD тяжелой цепи, более предпочтительно улучшенных нанотел), которые, когда у них есть экспонированный C-концевой участок или конец, будут менее склонны связываться с такими предсуществующими антителами/факторами, которые обнаружены в образцах крови или сыворотки, полученных от испытуемых, страдающих определенными (ауто)иммунными заболеваниями, которые все-таки могут связываться с экспонированным C-концевым участком или концом вариабельного домена тяжелой цепи и тогда, когда данный домен содержит C-концевое удлинение.

И вот теперь оказалось, что связывание предсуществующих антител/факторов с вариабельным доменом тяжелой цепи с экспонированным C-терминальным концом может (еще больше) снижаться при мутации серина в положении 112 (нумерация по Kabat) на лизин (K) или глутамин (Q). В частности, оказалось, что такая мутация S112K или S112Q может (еще больше) снижать или практически предотвращать/устранять связывание таких предсуществующих антител/факторов, которые могут связываться с вариабельным доменом тяжелой цепи, содержащим C-концевое удлинение (но без мутации S112K или S112Q), типа тех предсуществующих антител/факторов, что обнаружены в крови или сыворотке испытуемых, страдающих тяжелыми аутоиммунными заболеваниями типа SLE).

Также оказалось, что введение определенных мутаций, описанных здесь (в частности, следующих мутации L11V в комбинации с V89L, и необязательно также в комбинации с T110K) может улучшить или способствовать (дальнейшему) улучшению растворимости таких одиночных вариабельных доменов иммуноглобулина, как ISVDs, в общем и в частности раскрытых в настоящем описании (данные не приводятся).

Так, в первом аспекте настоящее изобретение касается вариабельных доменов тяжелой цепи иммуноглобулина (доменов V_H), у которых аминокислотный остаток в положении 112 (нумерация по Kabat) представлен остатком лизина (K) либо остатком глутамина (Q). Такие вариабельные домены тяжелой цепи иммуноглобулина также обозначаются здесь как “домены V_H по изобретению”. А когда домен V_H по изобретению представляет собой одиночный вариабельный домен иммуноглобулина (что предпочтительно), он также обозначается здесь как “ISVD по изобретению”. Точно так же, когда домен V_H по изобретению представляет собой нанотело (что еще более предпочтительно), он также обозначается здесь как “нанотело по изобретению”.

Как правило, домены V_H по изобретению имеют экспонированный C-терминальный конец или участок и/или находятся в белках, полипептидах, соединениях, объектах или конструкциях, в которых они имеют экспонированный C-терминальный конец или участок, и/или предназначены для применения, в котором они имеют экспонированный C-концевой участок (например, для применения в белках, полипептидах, соединениях, объектах или конструкциях, в которых они должны образовывать C-терминальный конец или участок).

В одном аспекте изобретения домен V_H по изобретению представляет собой одиночный вариабельный домен (тяжелой цепи) иммуноглобулина, что означает такой вариабельный домен тяжелой цепи, который может образовывать функциональный сайт связывания антигена без взаимодействия с доменом V_L. Например, домен V_H по изобретению может представлять собой нанотело (включая V_HH, гуманизованные V_HH и камелизованные V_H типа камелизованных V_H человека), (однодоменное) антитело, которое представляет собой домен V_H или получено из домена V_H, либо dAb, которое представляет собой домен V_H или получено из домена V_H. Домен V_H по изобретению предпочтительно представляет собой нанотело (например, домен V_HH, гуманизованный домен V_HH или камелизованный домен V_H типа камелизованного домена V_H человека).

В соответствии с другим аспектом изобретения, домен V_H по изобретению может представлять собой такой вариабельный домен тяжелой цепи, который в том белке, полипептиде, объекте или конструкции, в котором он находится, действительно требует взаимодействия с доменом V_L для образования сайта связывания с антигеном и действительно имеет или образует экспонированный C-терминальный конец или участок. Например, домен V_H в соответствии с этим аспектом изобретения может представлять собой домен V_H, который находится и/или используется в scFv и/или диателах.

В соответствии с более конкретным аспектом изобретения, домен V_H по изобретению имеет C-концевую последовательность (положения 109-113 по Kabat), которая представлена VTVKS (SEQ ID NO: 1) или VTVQS (SEQ ID NO: 2), либо последовательность, которая отличается по одной аминокислоте (то есть в одном из положений 109, 110, 111 или 113) от последовательности VTVKS и/или VTVQS и к тому же содержит лизин (K) или глутамин (Q) в положении 112.

Кроме того, как описано далее, в одном особенно предпочтительном аспекте изобретения, домен V_H по изобретению также содержит C-концевое удлинение (например, как описано в WO 12/175741 и/или WO 13/024059) на C-конце (т.е. оно соединяется с остатком серина на конце VTVKS, VTVQS или аналогичного мотива), в частности, такое C-концевое удлинение, которое определено далее. Однако, как также описано далее, также возможно, что VTVKS, VTVQS или аналогичный мотив образует C-терминальный конец домена V_H (хотя, как правило, это менее предпочтительно) или же домен V_H по изобретению соединяется по C-терминальному концу (необязательно через подходящий линкер) с другой аминокислотной последовательностью, группировкой, доменом или связывающим блоком. Например, когда домен V_H по изобретению представлен ISVD, то домен V_H может соединяться по C-терминальному концу с другим ISVD, необязательно через линкер (причем данный другой ISVD также может представлять собой домен V_H по изобретению).

В целом, как это хорошо известно для вариабельных доменов иммуноглобулина вообще, домены V_H по изобретению должны содержать 4 каркасных участка (FW1, FW2, FW3 и FW4) и 3 участка CDR (CDR1, CDR2 и CDR3). Как и с вариабельными доменами вообще, последовательности участков CDR будут зависеть от того антигена/мишени, к которому домены V_H по изобретению были получены и/или с которыми они должны связываться. Каркасные участки в общем могут представлять собой любые подходящие каркасные участки для доменов V_H (хотя положение 112 и/или положение 89 должно быть таким, как описано далее). Если доменом V_H по изобретению является ISVD, то домен V_H должен иметь каркасные последовательности, которые подходят для ISVD (необязательно в сочетании с одним или несколькими из участков CDR). Например, если доменом V_H по изобретению является нанотело, то каркасные участки в общем должны содержать подходящее количество характерных для V_HH остатков (в отношении которых сошлемся, к примеру, на WO 08/020079 и некоторые другие приведенные здесь патентные заявки заявителя/правопреемника).

Так, например, когда доменами V_H по изобретению являются нанотела, данные нанотела по изобретению могут содержать один или несколько “характерных остатков”, которые характерны для V_HH/нанотел (например, в положениях 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 и/или 108; к примеру, см. таблицы А-3 и от А-5 до А-8 в WO 08/020079); один или несколько других аминокислотных остатков, которые могут присутствовать в V_HH/нанотелах (типа одной или нескольких гуманизирующих замен, которые известны per se для V_HH и нанотел; сошлемся, к примеру, на WO 08/020079, опять же см. упомянутые ранее таблицы А-3 и от А-5 до А-8), и/или один или несколько других подходящих аминокислотных остатков или замен для V_HH/нанотел; или же любые подходящие комбинации таких аминокислотных остатков/замен.

Нанотела по изобретению, у которых в положении 112 находится K или Q (с C-концевым удлинением или без него), предпочтительно в положении 11 содержат аминокислоту, которая выбрана из L (этот аминокислотный остаток чаще всего встречается в V_HH), E, K, M, S, V, W и Y; более предпочтительно из L, E, K, V и Y и еще более предпочтительно из L, K и V (причем наиболее предпочтительным является V). К примеру, и без ограничения, по сравнению с остатком лейцина, который чаще всего встречается в V_HH, они могут содержать мутацию L11K или L11V. К примеру, но без ограничения, они также могут содержать мутацию Q108L (хорошо известная гуманизирующая замена для V_HH/нанотел). Другие аминокислотные остатки, которые могут присутствовать (опять же, без ограничения, к примеру, в этих положениях также могут присутствовать и другие аминокислотные остатки, которые естественным образом встречаются в этом положении в V_H или V_HH человека), представлены, например, одним или несколькими из аланина (A) в положении 14 (этот аминокислотный остаток очень часто встречается в природных V_HH), пролина в положении 14 (это наиболее распространенная аминокислота в этом положении в доменах V_H человека), а также мутаций, предложенных Harmsen et al. (в частности, те, которые Harmsen et al. предложили, исходя из последовательности V_HH класса V_HH4, как-то V89M или V89T), и/или (другие) мутации в положениях, предложенных Nieba (например, в одном или нескольких из положений 11, 87 и/или 89, см. Nieba, стр. 437, правый столбец). Другой подходящей мутацией является, к примеру, T110K или T110Q. А также: (i) в положении 41 может находиться, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-6 в WO 08/020079 для положения 41, в частности, это может быть (или выбран из них) пролин (P), серин (S), треонин (T), аланин (A) или лейцин (L), то есть из числа тех аминокислотных остатков, которые чаще всего встречаются в этом положении у людей или лам, более предпочтительно это может быть пролин (P) или аланин (A); и/или (ii) в положении 42 может находиться, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-6 в WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (E), и/или (iii) в положении 87 может находиться, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-7 в WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (T) или аланин (A).

В соответствии с более конкретным аспектом изобретения, домен V_H по изобретению (такой, как описано далее) имеет последовательность каркасного участка 4 (FW4), которая представлена:

a) одной из последовательностей FW4 по SEQ ID NOs: 3-20, приведенных ниже в табл. 1:

Таблица 1. Последовательности FW4

WGQGTQVTVKS (SEQ ID NO:3) WGKGTLVTVKS (SEQ ID NO:4) RGQGTRVTVKS (SEQ ID NO:5) WGLGTQVTISS (SEQ ID NO:6) GSQGTQVTVKS (SEQ ID NO:7) LRGGTQVTVKS (SEQ ID NO:8) RGQGTLVTVKS (SEQ ID NO:9) RSRGIQVTVKS (SEQ ID NO:10) WGKGTQVTVKS (SEQ ID NO:11) WGQGTQVTVQS (SEQ ID NO:12) WGKGTLVTVQS (SEQ ID NO:13) RGQGTRVTVQS (SEQ ID NO:14) WGLGTQVTISS (SEQ ID NO:15) GSQGTQVTVQS (SEQ ID NO:16) LRGGTQVTVQS (SEQ ID NO:17) RGQGTLVTVQS (SEQ ID NO:18) RSRGIQVTVQS (SEQ ID NO:19) WGKGTQVTVQS (SEQ ID NO:20)

или

b) последовательностью, которая имеет не более 3, предпочтительно не более 2 отличий по аминокислотам по меньшей мере от одной из последовательностей FW4 по SEQ ID Nos 3-20, в которой (i) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 112 по нумерации Kabat, представлен K или Q; а также (ii) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 103 по нумерации Kabat, предпочтительно представлен W или R; (iii) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 104 по нумерации Kabat, предпочтительно представлен G; (iv) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 106 по нумерации Kabat, предпочтительно представлен G; (v) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 107 по нумерации Kabat, предпочтительно представлен T; (vi) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 108 по нумерации Kabat, предпочтительно представлен Q или L (а в гуманизованных нанотелах это предпочтительно L); (vii) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 109 по нумерации Kabat, предпочтительно представлен V; (viii) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 110 по нумерации Kabat, предпочтительно представлен T (или же это может быть K или Q); (ix) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 111 по нумерации Kabat, предпочтительно представлен V. Ниже в табл. 2 приведены некоторые неограничительные примеры аминокислотных остатков, которые могут присутствовать в различных положениях (пронумерованных согласно Kabat) в таких последовательностях FW4.

Таблица 2. Примеры аминокислотных остатков, которые могут присутствовать в последовательностях FW4 доменов V_H по изобретению

Полож. Аминокислотные остатки 103 W, R, G, S, K, A, M, Y, L, F, T, N, V, Q, P, E, C; предпочтительно W 104 G, A, S, T, D, P, N, E, C, L; предпочтительно G 105 Q, K, H, R, P, E, L, T, N, S, V, A, M, G 106 G, R, E 107 T, Q, I, A, S, N, R, V, D 108 Q, L, R, P, E, K, S, T, M, A, H; предпочтительно Q или L 109 V, I, L 110 T, S, N, A, I, F, K, Q 111 V, I, A 112 K или Q (по изобретению) 113 S, T, A, L, P, F, E, V

Предпочтительно домен V_H по изобретению имеет последовательность каркасного участка 4 (FW4), которая представлена:

a) WGQGTQVTVKS (SEQ ID NO: 3) или WGQGTQVTVQS (SEQ ID NO: 12); или

b) последовательностью, которая имеет не более 3, предпочтительно не более 2 отличий по аминокислотам (как-то отличие лишь по одной аминокислоте) от SEQ ID NO: 3 и/или SEQ ID NO: 12, в которой (i) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 112 по нумерации Kabat, представлен K или Q; а также (ii) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 103 по нумерации Kabat, предпочтительно представлен W или R; (iii) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 104 по нумерации Kabat, предпочтительно представлен G; (iv) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 106 по нумерации Kabat, предпочтительно представлен G; (v) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 107 по нумерации Kabat, предпочтительно представлен T; (vi) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 108 по нумерации Kabat, предпочтительно представлен Q или L (а в гуманизованных нанотелах это предпочтительно L); (vii) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 109 по нумерации Kabat, предпочтительно представлен V; (viii) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 110 по нумерации Kabat, предпочтительно представлен T (или же это может быть K или Q); (ix) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 111 по нумерации Kabat, предпочтительно представлен V. Опять же в табл. 2 приведены некоторые неограничительные примеры аминокислотных остатков, которые могут присутствовать в различных положениях (пронумерованных согласно Kabat) в таких последовательностях FW4.

Как описано далее, в соответствии с предпочтительным аспектом изобретения, домены V_H по изобретению, содержащие такую последовательность FW4, как описано выше, предпочтительно также содержат C-концевое удлинение (как описано далее). Однако, тоже как описано далее, также возможно, что последовательность FW4 образует C-терминальный конец домена V_H (хотя это обычно менее предпочтительно) или же домен V_H по изобретению соединяется по C-терминальному концу (необязательно через подходящий линкер) с другой аминокислотной последовательностью, группировкой, доменом или связывающим блоком. Например, когда домен V_H по изобретению представлен ISVD, домен V_H может соединяться по C-терминальному концу с другим ISVD, необязательно через линкер (а данный другой ISVD также может являться доменом V_H по изобретению).

Как указано здесь, в соответствии с предпочтительным, но не ограничительным аспектом изобретения, домены V_H по изобретению содержат C-концевое удлинение, типа такого C-концевого удлинения, которое описано в WO 12/175741 и/или в WO 13/024059, в особенности как описано в WO 12/175741.

Так, в соответствии с этим аспектом, домен V_H по изобретению представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина (домен V_H), в котором: (i) аминокислотный остаток в положении 112 (нумерация по Kabat) не является остатком серина, а предпочтительно представлен либо остатком лизина (K), либо остатком глутамина (Q); а также (ii) соединяется по C-терминальному концу (т.е. с аминокислотным остатком в положении, соответствующем положению 113 по нумерации Kabat) с другой аминокислотной последовательностью (т.е. “C-концевым удлинением”), которое включает от 1 до 5 аминокислотных остатков (как-то 1, 2, 3, 4 или 5, предпочтительно 1, 2 или 3 и наиболее предпочтительно только 1 или 2, как-то лишь 1), каждый из которых независимо выбран из подходящих аминокислотных остатков, а предпочтительно каждый из них независимо выбран из встречающихся в природе аминокислот, а еще более предпочтительно каждый из них независимо выбран из группы, состоящей из аланина (A), глицина (G), валина (V), лейцина (L) или изолейцина (I) (хотя, как это видно из данных, представленных в WO 12/17574, в составе C-концевого удлинения также могут использоваться остатки других аминокислот, таких как серин, пролин, треонин и/или лизин).

В частности, в соответствии с этим аспектом изобретения, домен V_H по изобретению предпочтительно имеет C-концевую последовательность, которая представлена VTVKS(X)_n (SEQ ID NO:21) или VTVQS(X)_n (SEQ ID NO:22) или же такой аминокислотной последовательностью, у которой в положениях мотива VTVKS или мотива VTVQS имеется отличие по одной аминокислоте от последовательности VTVKS и/или VTVQS, но сохраняется лизин (K) или глутамин (Q) в положении 112, при этом (i) аминокислотные остатки мотива VTVKS или VTVQS (либо мотива, подобного VTVKS или VTVQS) соответствуют положениям 109-113 домена V_H по нумерации Kabat; (ii) n равно 1-10, предпочтительно 1-5, как-то 1, 2, 3, 4 или 5 (предпочтительно 1 или 2, как-то 1); и (iii) каждый X означает остаток аминокислоты (предпочтительно встречающейся в природе), которая выбрана независимо, а предпочтительно выбрана независимо из группы, состоящей из аланина (A), глицина (G), валина (V), лейцина (L) и изолейцина (I).

Более предпочтительно, в соответствии с этим аспектом изобретения, домен V_H по изобретению в качестве последовательности FW4 может иметь одну из последовательностей FW4 по SEQ ID NOs 3-20 (или аминокислотную последовательность, которая имеет не более 3, предпочтительно не более 2 отличий по аминокислотам по меньшей мере от одной из последовательностей FW4 по SEQ ID NOs 3-20, причем аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 112 по нумерации Kabat, представлен K или Q), в которой данная последовательность FW4 соединяется по C-терминальному концу с C-концевым удлинением (X)_n, где n равно 1-10, предпочтительно 1-5, как-то 1, 2, 3, 4 или 5 (предпочтительно 1 или 2, как-то 1); а каждый X означает остаток аминокислоты (предпочтительно встречающейся в природе), которая выбрана независимо, а предпочтительно выбрана независимо из группы, состоящей из аланина (A), глицина (G), валина (V), лейцина (L) и изолейцина (I).

Соответственно, в этом аспекте изобретения домен V_H по изобретению может иметь на своем C-терминальном конце:

a) одну из аминокислотных последовательностей, приведенных в виде SEQ ID NOs 23-40 в табл. 3:

Таблица 3. Последовательности FW4 с C-концевым удлинением

WGQGTQVTVKS(X)_n (SEQ ID NO:23) WGKGTLVTVKS(X)_n (SEQ ID NO:24) RGQGTRVTVKS(X)_n (SEQ ID NO:25) WGLGTQVTISS(X)_n (SEQ ID NO:26) GSQGTQVTVKS(X)_n (SEQ ID NO:27) LRGGTQVTVKS(X)_n (SEQ ID NO:28) RGQGTLVTVKS(X)_n (SEQ ID NO:29) RSRGIQVTVKS(X)_n (SEQ ID NO:30) WGKGTQVTVKS(X)_n (SEQ ID NO:31) WGQGTQVTVQS(X)_n (SEQ ID NO:32) WGKGTLVTVQS(X)_n (SEQ ID NO:33) RGQGTRVTVQS(X)_n (SEQ ID NO:34) WGLGTQVTISS(X)_n (SEQ ID NO:35) GSQGTQVTVQS(X)_n (SEQ ID NO:36) LRGGTQVTVQS(X)_n (SEQ ID NO:37) RGQGTLVTVQS(X)_n (SEQ ID NO:38) RSRGIQVTVQS(X)_n (SEQ ID NO:39) WGKGTQVTVQS(X)_n (SEQ ID NO:40)

в которой (i) аминокислотные остатки последовательностей FW4, которые предшествуют (X)_n в C-концевом удлинении по SEQ ID NOs: 23-40, соответствуют положениям аминокислот в FW4 домена V_H (т.е. положениям 103-113 по нумерации Kabat); (ii) n равно 1-10, предпочтительно 1-5, как-то 1, 2, 3, 4 или 5 (предпочтительно 1 или 2, как-то 1); и (iii) каждый Х означает остаток аминокислоты (предпочтительно встречающейся в природе), которая выбрана независимо, а предпочтительно выбрана независимо из группы, состоящей из аланина (A), глицина (G), валина (V), лейцина (L) и изолейцина (I); или

b) аминокислотную последовательность, имеющую не более 3, предпочтительно не более 2 отличий по аминокислотам по меньшей мере от одной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NOs 23-40 (причем данные отличия по аминокислотам приходятся на положения, соответствующие положениям аминокислот в FW4 домена V_H, т.е. на положения 103-113 по нумерации Kabat, без учета каких-либо отличий по аминокислотам в пределах C-концевого удлинения (X)_n), при этом: (i) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 112 по нумерации Kabat, представлен K либо Q; (ii) n равно 1-10, предпочтительно 1-5, как-то 1, 2, 3, 4 или 5 (предпочтительно 1 или 2, как-то 1); и (iii) каждый Х означает остаток аминокислоты (предпочтительно встречающейся в природе), которая выбрана независимо, а предпочтительно выбрана независимо из группы, состоящей из аланина (A), глицина (G), валина (V), лейцина (L) и изолейцина (I). Опять же, в дополнение к пунктам (i)-(iii), приведенным в предыдущем предложении, в такой аминокислотной последовательности: (iv) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 103 по нумерации Kabat, предпочтительно представлен W или R; (v) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 104 по нумерации Kabat, предпочтительно представлен G; (vi) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 106 по нумерации Kabat, предпочтительно представлен G; (vii) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 107 по нумерации Kabat, предпочтительно представлен T; (viii) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 108 по нумерации Kabat, предпочтительно представлен Q или L (а в гуманизованных нанотелах это предпочтительно L); (ix) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 109 по нумерации Kabat, предпочтительно представлен V; (x) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 110 по нумерации Kabat, предпочтительно представлен T (или же это может быть K или Q); (xi) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 111 по нумерации Kabat, предпочтительно представлен V; опять же отсылаем к табл. 2 насчет таких аминокислотных остатков, которые могут присутствовать в каждом положении.

Предпочтительно, в соответствии с этим аспектом изобретения, домен V_H по изобретению может иметь на своем C-терминальном конце:

a) аминокислотную последовательность, представленную WGQGTQVTVKS(X)_n (SEQ ID NO:23) или WGQGTQVTVQS(X)_n (SEQ ID NO:32), где n равно 1-10, предпочтительно 1-5, как-то 1, 2, 3, 4 или 5 (предпочтительно 1 или 2, как-то 1); а каждый Х означает остаток аминокислоты (предпочтительно встречающейся в природе), которая выбрана независимо, а предпочтительно выбрана независимо из группы, состоящей из аланина (A), глицина (G), валина (V), лейцина (L) и изолейцина (I); или

b) аминокислотную последовательность, имеющую не более 3, предпочтительно не более 2 отличий по аминокислотам по меньшей мере от одной из аминокислотных последовательностей WGQGTQVTVKS(X)_n (SEQ ID NO:23) и WGQGTQVTVQS(X)_n (SEQ ID NO:32) (причем данные отличия по аминокислотам приходятся на положения, соответствующие положениям аминокислот в FW4 домена V_H, т.е. на положения 103-113 по нумерации Kabat, без учета каких-либо отличий по аминокислотам в пределах C-концевого удлинения (X)_n), при этом: (i) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 112 по нумерации Kabat, представлен K либо Q; (ii) n равно 1-10, предпочтительно 1-5, как-то 1, 2, 3, 4 или 5 (предпочтительно 1 или 2, как-то 1); и (iii) каждый Х означает остаток аминокислоты (предпочтительно встречающейся в природе), которая выбрана независимо, а предпочтительно выбрана независимо из группы, состоящей из аланина (A), глицина (G), валина (V), лейцина (L) и изолейцина (I). Опять же, в отношении таких аминокислотных последовательностей предпочтительно также применимы пункты (vi)-(xi), описанные в предыдущих абзацах.

Также, как указано здесь, домены V_H по изобретению могут содержать и другие аминокислотные остатки или замены, которые известны per se для доменов V_H и в особенности для ISVD (более предпочтительно для нанотел) в соответствующих положениях. Можно привести некоторые неограничительные примеры, которые включают, к примеру, один или несколько “характерных остатков”, которые характерны для V_HH/нанотел (в том числе, к примеру, лейцин (L) в положении 11), другие аминокислотные остатки, которые обычно встречаются в V_HH (как-то аланин (A) в положении 14), гуманизирующие замены, известные per se для V_HH/нанотел (как-то Q108L и A14P), одну или несколько из мутаций, предложенных Harmsen (как-то V89M или V89T) и/или в положениях, предложенных Nieba (например, 11, 87 или 89); или же любые подходящие комбинации из них; и/или, к примеру, мутации T110K, T110Q или V89L.

Когда домен V_H по изобретению содержит C-концевое удлинение (X)_n, то в соответствии с некоторыми предпочтительными, но неограничительными примерами таких удлинений X и n могут означать:

a) n = 1 и X = Ala;

b) n = 2 и каждый X = Ala;

c) n = 3 и каждый X = Ala;

d) n = 2 и по меньшей мере один X = Ala (а остальные аминокислотные остатки X выбраны независимо из встречающихся в природе аминокислот, но предпочтительно они выбраны независимо из Val, Leu и/или Ile);

e) n = 3 и по меньшей мере один X = Ala (а остальные аминокислотные остатки X выбраны независимо из встречающихся в природе аминокислот, но предпочтительно они выбраны независимо из Val, Leu и/или Ile);

f) n = 3 и по меньшей мере два X = Ala (а остальные аминокислотные остатки X выбраны независимо из встречающихся в природе аминокислот, но предпочтительно они выбраны независимо из Val, Leu и/или Ile);

g) n = 1 и X = Gly;

h) n = 2 и каждый X = Gly;

i) n = 3 и каждый X = Gly;

j) n = 2 и по меньшей мере один X = Gly (а остальные аминокислотные остатки X выбраны независимо из встречающихся в природе аминокислот, но предпочтительно они выбраны независимо из Val, Leu и/или Ile);

k) n = 3 и по меньшей мере один X = Gly (а остальные аминокислотные остатки X выбраны независимо из встречающихся в природе аминокислот, но предпочтительно они выбраны независимо из Val, Leu и/или Ile);

l) n = 3 и по меньшей мере два X = Gly (а остальные аминокислотные остатки X выбраны независимо из встречающихся в природе аминокислот, но предпочтительно они выбраны независимо из Val, Leu и/или Ile);

m) n = 2 и каждый X = Ala или Gly;

n) n = 3 и каждый X = Ala или Gly;

o) n = 3 и по меньшей мере один X = Ala или Gly (а остальные аминокислотные остатки X выбраны независимо из встречающихся в природе аминокислот, но предпочтительно они выбраны независимо из Val, Leu и/или Ile);

p) n = 3 и по меньшей мере два X = Ala или Gly (а остальные аминокислотные остатки X выбраны независимо из встречающихся в природе аминокислот, но предпочтительно они выбраны независимо из Val, Leu и/или Ile);

причем особенно предпочтительны пункты (a), (b), (c), (g), (h), (i), (m) и (n), при этом предпочтительны пункты, в которых n = 1 или 2, и особенно предпочтительны пункты, в которых n = 1.

Следует также отметить, что предпочтительно C-концевое удлинение в домене V_H по изобретению не содержит (свободного) остатка цистеина (если только данный остаток цистеина не используется или не предназначен для дальнейшей функционализации, к примеру, для ПЭГилирования).

Кроме того, предпочтения, приведенные на стр. 35-41 в WO 12/175741 для C-концевых удлинений, используемых в соответствии с WO 12/175741 (которые также являются предпочтительными C-концевыми удлинениями при использовании в доменах V_H по настоящему изобретению), также применимы для C-концевых удлинений, используемых в доменах V_H по изобретению, и эти предпочтения согласно WO 12/175741 также включены сюда путем ссылки.

Предпочтительно, когда домен V_H по изобретению содержит C-концевое удлинение (X)_n, то n = 1, 2 или 3, а каждый X означает Ala или Gly. Более предпочтительно, каждый X означает Ala, а n = 1 или 2, предпочтительно 1.

Когда домены V_H по изобретению содержат C-концевое удлинение, то они, как правило, находятся на (и зачастую образуют) C-терминальном конце белка, полипептида, соединения, конструкции или другой химической субстанции, в которой они находятся. Опять же, такой белок, полипептид, соединение, конструкция или другая химическая субстанция может содержать один или несколько других доменов V_H по изобретению (т.е. не на C-конце); в таком случае такие другие домены V_H по изобретению должны содержать лизин (K) или глутамин (Q) в положении 112 (и быть такими, как описано далее), но не должны содержать C-концевых удлинений (вместо этого, они могут соединяться (необязательно через один или несколько подходящих линкеров) по C-концам с одной или несколькими другими аминокислотными последовательностями, группировками, связывающими доменами или связывающими блоками, присутствующими в белке, полипептиде, соединении, конструкции или другой химической субстанции типа домена V_H по изобретению с C-концевым удлинением на C-терминальном конце)).

Поскольку домены V_H по изобретению (и содержащие их белки, полипептиды, соединения, конструкции и другие химические субстанции, как описано далее) особенно подходят (и предназначены для) фармацевтического применения (как-то профилактики, лечения и/или диагностики заболеваний и расстройств у нуждающихся в этом лиц), они предпочтительно имеют высокую степень гомологии последовательности в каркасных участках с каркасными последовательностями доменов V_H человека. В частности, домены V_H по изобретению предпочтительно имеют общую степень идентичности последовательности (при определении так, как описано далее, принимая во внимание только каркасные участки, но не CDR, а также без учета замены в положении 112 и C-концевых удлинений, если они есть) хотя бы с одной гаметной последовательностью человека (типа DP-47, DP-51 или DP-29) по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, как-то на 90% или больше. Более предпочтительно, домены V_H по изобретению предпочтительно имеют общую степень идентичности последовательности (при определении так, как описано далее, принимая во внимание только каркасные участки, но не CDR, а также без учета замены в положении 112 и C-концевых удлинений, если они есть) по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, как-то на 90% или больше хотя бы с одной из следующих гаметных последовательностей человека: DP-47, DP-51 и/или DP-29.

Как описано далее, в соответствии с одним аспектом изобретения, домен V_H по изобретению может представлять собой вариабельный домен тяжелой цепи, который в белке, полипептиде или конструкции, в которой он находится, взаимодействует/ассоциирует (или предназначен для взаимодействия/ассоциации) с доменом V_L с образованием антигенсвязывающего сайта, в котором по крайней мере домен V_H имеет экспонированный C-терминальный конец или участок. Например, домен V_H в соответствии с этим аспектом изобретения может представлять собой домен V_H, который присутствует и/или используется в scFv и/или диателах, где он будет связываться с доменом V_L с образованием антигенсвязывающего сайта.

Однако, в соответствии с предпочтительным аспектом изобретения, домен V_H по изобретению представляет собой одиночный вариабельный домен (тяжелой цепи) иммуноглобулина, т.е. “ISVD”, а это означает такой вариабельный домен тяжелой цепи, который может образовывать функциональный антигенсвязывающий сайт без взаимодействия с доменом V_L. Например, домен V_H по изобретению может представлять собой нанотело (включая V_HH, гуманизованные V_HH и камелизованные V_H типа камелизованных V_H человека), (однодоменное) антитело, которое представляет собой домен V_H или получено из домена V_H, либо dAb, которое представляет собой домен V_H или получено из домена V_H. Домен V_H по изобретению предпочтительно представляет собой нанотело (более предпочтительно домен V_HH, гуманизованный домен V_HH или камелизованный домен V_H типа камелизованного домена V_H человека).

В настоящем описании:

- термин “нанотело” в общем соответствует определению в WO 08/020079 или WO 09/138519, а в конкретном аспекте вообще означает V_HH, гуманизованные V_HH или камелизованные V_H типа камелизованных V_H человека или же оптимизированные по последовательности V_HH (как-то, например, оптимизированные по химической стабильности и/или растворимости, максимальному перекрыванию с известными каркасными участками человека и максимальной экспрессии). Следует отметить, что термины нанотело или нанотела являются зарегистрированными торговыми марками Ablynx N.V. и поэтому могут приводиться и как нанотело^® и/или нанотела^®;

- термин “ISVD” (или “ISV”) применяется здесь в самом широком смысле и также охватывает “биопрепараты на основе ISVD” и, когда ISVD представляет собой нанотело, “биопрепараты на основе нанотел”. “Биопрепараты на основе ISVD” определяются здесь как белки, полипептиды или другие биологические препараты, которые содержат или в основном состоят по меньшей мере из одного (как-то одного, двух или трех) ISVD. Точно так же “биопрепараты на основе нанотел” определяются здесь как белки, полипептиды или другие биологические препараты, которые содержат или в основном состоят по меньшей мере из одного (как-то одного, двух или трех) нанотел. Как и с термином “ISVD”, всякий раз, когда применяется термин “биопрепараты на основе ISVD”, следует понимать, что такой биопрепарат на основе ISVD предпочтительно представляет собой биопрепарат на основе нанотел. В контексте настоящего изобретения, и “биопрепараты на основе ISVD”, и “биопрепараты на основе нанотел” могут представлять собой, к примеру, моновалентные, бивалентные (или мультивалентные), биспецифичные (или мультиспецифичные) и бипаратопные (или мультипаратопные) конструкции ISVD или конструкции нанотел, соответственно. Кроме того, биопрепараты на основе ISVD или на основе нанотел, к примеру, наряду с одним или несколькими (как-то одним, двумя или тремя) ISVDs или нанотелами, могут необязательно также содержать одну или несколько (как-то одну или две) других дополнительных терапевтических молекул и/или одну или несколько (как-то одну или две) других частей молекул, влияющих на фармакокинетические или фармакодинамические свойства биопрепаратов на основе ISVD или на основе нанотел (типа периода полураспада). Подходящие примеры таких дополнительных терапевтических или других молекул должны быть известны специалистам, например, они в общем могут включать любые терапевтически активные белки, полипептиды или другие связывающие домены или связывающие блоки, а также, к примеру, модификации типа тех, что описаны на стр. 149-152 WO 09/138159. Биопрепараты на основе ISVD или биопрепараты на основе нанотел предпочтительно являются терапевтическими или предназначены для применения в качестве терапевтических средств (включая профилактику и диагностику) и с этой целью они предпочтительно содержат по меньшей мере один ISVD против соответствующей терапевтической мишени (такой, к примеру, как RANK-L, vWF, IgE, RSV, CXCR4, IL-23 или другие интерлейкины и пр.). Насчет некоторых конкретных, но не ограничительных примеров таких биопрепаратов на основе ISVD или на основе нанотел сошлемся на Примеры 8-18, а также, к примеру, на различные заявки фирмы Ablynx N.V. (такие, к примеру, но без ограничения, как WO 2004/062551, WO 2006/122825, WO 2008/020079 и WO 2009/068627), а также, к примеру (и без ограничения), на такие заявки, как WO 06/038027, WO 06/059108, WO 07/063308, WO 07/063311, WO 07/066016 и WO 07/085814. Кроме того, как описано далее, описанные здесь ISVD или нанотела могут быть направлены против сывороточного белка (человека) типа сывороточного альбумина (человека), причем такие ISVD или нанотела тоже могут иметь терапевтическое применение, в частности, при и/или для продления времени полураспада терапевтических молекул и соединений (как-то в или для биопрепаратов на основе ISV, описанных здесь). Сошлемся, к примеру, на WO 2004/041865, WO 2006/122787 и WO 2012/175400, в которых в общем виде описано применение нанотел, связывающих сывороточный альбумин, для продления периода полураспада. Кроме того, в настоящем описании, если прямо не указано иначе, все приводимые термины имеют значения, приведенные в WO 09/138519 (или в работах предшествующего уровня техники, приведенных в WO 09/13851) или в WO 08/020079 (или в работах предшествующего уровня техники, приведенных в WO 08/ 020079). Кроме того, если метод или методика не описаны здесь конкретно, они могут выполняться так, как описано в WO 09/138519 (или в работах предшествующего уровня техники, приведенных в WO 09/138519) или в WO 08/020079 (или в работах предшествующего уровня техники, приведенных в WO 08/020079).

Кроме того, при использовании в настоящем описании или формуле изобретения следующие термины имеют такие же значения, которые приведены в и/или, если это применимо, которые можно определить так, как описано на стр. 62-75 в WO 09/138519: “агонист”, “антагонист”, “обратный агонист”, “неполярный, незаряженный аминокислотный остаток”, “полярный незаряженный аминокислотный остаток”, “полярный, заряженный аминокислотный остаток”, “идентичность последовательностей”, “точно такие же” и “различия по аминокислотам” (когда идет речь о сравнении последовательностей у двух аминокислотных последовательностей), “(в) практически выделенном (виде)”, “домен”, “связывающий домен”, “антигенная детерминанта”, “эпитоп”, “против” или “направлено против” (антигена), “специфичность” и “период полураспада”. Кроме того, термины “модулирующий” и “модулировать”, “сайт взаимодействия”, “специфичный к”, “перекрестно блокировать”, “перекрестно блокируется” и “перекрестно блокирует” и “практически не зависит от рН” соответствуют определениям (и/или могут определяться так, как описано) на стр. 74-79 в WO 10/130832 от заявителя. Кроме того, когда идет речь о конструкциях, соединениях, белках или полипептидах по изобретению, термины типа “моновалентный”, “бивалентный” (или “мультивалентный”), “биспецифичный” (или “мультиспецифичный”) и “бипаратопный” (или “мультипаратопный”) могут иметь значения, приведенные в WO 09/138519, WO 10/130832 или WO 08/020079.

Термин “период полураспада” в применении к ISVD, нанотелам, биопрепаратам на основе ISVD, биопрепаратам на основе нанотел или любым другим аминокислотным последовательностям, соединениям или полипептидам, приведенным здесь, в общем виде может определяться так, как описано в пункте o) на стр. 57 в WO 08/020079 и, как указано там, относится ко времени, которое требуется для снижения концентрации аминокислотной последовательности, соединения или полипептида в сыворотке крови in vivo на 50%, например, вследствие деградации последовательности или соединения и/или клиренса или секвестрирования последовательности или соединения по естественным механизмам. Период полураспада аминокислотной последовательности, соединения или полипептида по изобретению in vivo можно определить любым известным способом per se, например, с помощью фармакокинетического анализа. Подходящие методы должны быть известны специалистам в данной области и могут быть такими, к примеру, как описано в пункте o) на стр. 57 WO 08/020079. Также в пункте o) на стр. 57 WO 08/020079 указано, что период полураспада можно выразить с помощью таких параметров, как t_½-альфа, t_½-бета и площадь под кривой (AUC). В этом отношении следует отметить, что термин “период полураспада” при использовании здесь, в частности, относится к t_½-бета или терминальному полураспаду (при этом t_½-альфа и/или AUC или оба можно исключить из рассмотрения). Сошлемся, к примеру, на приведенную ниже «Экспериментальную часть», а также на стандартные справочники, как-то Kenneth A et al., Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists; и Peters et al., Pharmacokinetic Analysis: A Practical Approach (1996). Сошлемся также на “Pharmacokinetics”, M Gibaldi & D Perron, published by Marcel Dekker, 2nd Rev. edition (1982). Аналогичным образом, термины “увеличение периода полураспада” или “повышенный период полураспада” также соответствуют определениям в пункте o) на стр. 57 WO 08/020079 и, в частности, относятся к повышению t_½-бета, с повышением t_½-альфа и/или AUC или обоих или без него.

Если же термин не определен конкретно здесь, то он имеет свое обычное значение в данной области, которое должно быть известно специалистам. Сошлемся, к примеру,
на стандартные справочники, как-то Sambrook et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (2nd Ed.), Vols.1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); F. Ausubel et al., eds., “Current Protocols in Molecular Biology”, Green Publishing & Wiley Interscience, New York (1987); Lewin, “Genes II”, John Wiley & Sons, New York, N.Y. (1985); Old et al., “Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering”, 2nd edition, University of California Press, Berkeley, CA (1981); Roitt et al., “Immunology” (6th Ed.), Mosby/Elsevier, Edinburgh (2001); Roitt et al., “Roitt’s Essential Immunology”, 10th Ed., Blackwell Publishing, UK (2001); и Janeway et al., “Immunobiology” (6th Ed.), Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, New York (2005), а также на приведенные здесь общие работы в данной области.

Кроме того, как уже было сказано, аминокислотные остатки нанотел пронумерованы в соответствии с общей нумерацией для доменов V_H, изложенной Kabat et al. (“Sequence of proteins of immunological interest”, US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91), а применительно к верблюжьим доменам V_HH в статье Riechmann and Muyldermans, J. Immunol. Methods 2000 Jun 23, 240 (1-2): 185-195; либо приведена здесь. Согласно этой нумерации, FR1 у нанотел включает аминокислотные остатки в положениях 1-30, CDR1 у нанотел включает аминокислотные остатки в положениях 31-35, FR2 у нанотел включает аминокислоты в положениях 36-49, CDR2 у нанотел включает аминокислотные остатки в положениях 50-65, FR3 у нанотел включает аминокислотные остатки в положениях 66-94, CDR3 у нанотел включает аминокислотные остатки в положениях 95-102, а FR4 у нанотел включает аминокислотные остатки в положениях 103-113. [В этой связи следует отметить, что, как это хорошо известно в данной области для доменов V_H и для доменов V_HH, общее количество аминокислотных остатков в каждом из CDR может варьироваться и может не соответствовать общему количеству аминокислотных остатков, указанных по нумерации Kabat (то есть одно или несколько положений по нумерации Kabat могут быть не заняты в фактической последовательности или же фактическая последовательность может содержать больше аминокислотных остатков, чем количество, допустимое по нумерации Kabat). Это означает, что вообще-то нумерация по Kabat может и не соответствовать фактической нумерации аминокислотных остатков в фактической последовательности. Однако в целом можно сказать, что в соответствии с нумерацией Kabat и независимо от количества аминокислотных остатков в CDRs, положение 1 по нумерации Kabat соответствует началу FR1 и наоборот, положение 36 по нумерации Kabat соответствует началу FR2 и наоборот, положение 66 по нумерации Kabat соответствует началу FR3 и наоборот, а положение 103 по нумерации Kabat соответствует началу FR4 и наоборот].

Альтернативные методы нумерации аминокислотных остатков доменов V_H, которые также могут применяться аналогичным образом к верблюжьим доменам V_HH и к нанотелам, - это метод, описанный Chothia et al. (Nature 342, 877-883 (1989)), так называемое “определение AbM” и так называемое “контактное определение”. Однако в настоящем описании, аспектах и фигурах будет применяться нумерация по Kabat, а применительно к доменам VHH - по Riechmann and Muyldermans, если не указано иначе.

Следует также отметить, что фигуры и перечень последовательностей, «Экспериментальная часть» и примеры приводятся только для дальнейшей иллюстрации изобретения и никоим образом не должны интерпретироваться или восприниматься как ограничивающие объем изобретения и/или прилагаемой формулы изобретения, если только прямо не указано иначе.

Домены V_H по изобретению могут быть направлены против любого подходящего или нужного антигена или мишени, включая любые фармацевтически и/или терапевтически значимые мишени, как описано здесь.

В соответствии с одним частным аспектом изобретения, домены V_H по изобретению направлены против сывороточного белка, в частности, сывороточного белка человека. В соответствии с предпочтительным аспектом, когда домен V_H по изобретению направлен против сывороточного белка, то он направлен против сывороточного альбумина, в частности, сывороточного альбумина человека. Итак, изобретение также касается таких доменов V_H по изобретению (как определено здесь, включая предпочтения, приведенные для доменов V_H по изобретению), которые могут специфически связываться с сывороточным белком, в частности, сывороточным белком человека, а предпочтительно могут специфически связываться с сывороточным альбумином, более предпочтительно сывороточным альбумином человека. Опять же, такие домены V_H представляют собой ISVD (как описано выше), более предпочтительно нанотела.

Например, домен V_H по изобретению против сывороточного альбумина может быть одним из нанотел против сывороточного альбумина (человека), которые описаны в WO 2004/041865, в особенности в WO 2006/122787 и WO 2012/175400 (все это заявки от заявителя/правопреемника), в котором аминокислота в положении 112 заменена на K или на Q и которое необязательно содержит C-концевое удлинение, как описано здесь (а также, к примеру, может содержать одну или несколько других специфических замен аминокислотных остатков, приведенных здесь, как-то 11L, L11V, L11K, 14A, P14A, 14P, A14P, 89T, V89T, 89L, V89L, 108L, Q108L, 110Q, T110Q, 110K и/или T110K; хотя обычно наличие дополнительной замены в положении 110 зачастую и не требуется, если в положении 112 находится K или Q, при этом в положении 110 предпочтительно находится T). Кроме того, предусматривается, что настоящее изобретение также применимо и к другим ISVD тяжелой цепи, связывающим сывороточный альбумин, типа тех, которые описаны в WO 03/035694, WO 04/003019, WO 05/118642, WO 06/059106, WO 08/096158, WO 09/121804, WO 10/108937 или US 2013/0129727, т.е. при введении соответствующих замен, описанных здесь (т.е. по меньшей мере одной из S112K, S112Q и/или V89T, а необязательно и одной или нескольких других замен аминокислотных остатков, описанных здесь, как-то L11V), и необязательно (а обычно предпочтительно, как изложено здесь) добавлении C-концевого удлинения (как описано далее).

Некоторые предпочтительные, но без ограничения, примеры таких связывающих сывороточный альбумин нанотел по изобретению - это гуманизованные варианты аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 52 в WO 2006/122787 (именуемой “Alb-1” в WO 2006/122787), в которых аминокислота в положении 112 заменена на K или на Q (и которые необязательно содержат C-концевое удлинение, как описано здесь), типа гуманизованных вариантов Alb-1, приведенных в SEQ ID NOs: 57-64 в WO 2006/122787 (в каждом случае с заменой S112K или S112Q и необязательно с C-концевым удлинением), или гуманизованных вариантов Alb-1, приведенных в SEQ ID NOs: 3-11 WO 2012/175400 (опять же, в каждом случае с заменой S112K или S112Q), из которых SEQ ID NOs 3, 4 и 5 могут необязательно содержать C-концевое удлинение, а SEQ ID NOs 6-11 в самом деле содержат C-концевое удлинение (опять же, такие варианты могут содержать одну или несколько других специфических замен аминокислотных остатков, приведенных здесь, как-то 11L, L11V, L11K, 14A, P14A, 14P, A14P, 89T, V89T, 89L, V89L, 108L, Q108L, 110Q, T110Q, 110K и/или T110K; хотя обычно наличие дополнительной замены в положении 110 зачастую и не требуется, если в положении 112 находится K или Q, при этом в положении 110 предпочтительно находится T). Кроме того: (i) в положении 41 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-6 WO 08/020079 для положения 41, в частности, это может быть (или выбран из них) пролин (Р), серин (S), треонин (Т), аланин (А) или лейцин (L), то есть из числа тех аминокислотных остатков, которые чаще всего встречаются в этом положении у людей или у лам, а более предпочтительно это может быть пролин (P) или аланин (A); и/или (ii) в положении 42 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-6 WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (E); и/или (iii) в положении 87 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-7 WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (T) или аланин (A).

Итак, в следующем аспекте изобретение касается нанотел по изобретению (как определено здесь), которые могут связываться (в частности, специфически связываться) с сывороточным альбумином (в особенности с сывороточным альбумином человека), в которых:

- CDR1 имеет аминокислотную последовательность SFGMS (SEQ ID NO:41);

- CDR2 имеет аминокислотную последовательность SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ ID NO:42);

- CDR3 имеет аминокислотную последовательность GGSLSR (SEQ ID NO:43);

- аминокислотный остаток в положении 112 представлен K или Q;

и которые необязательно содержат на C-терминальном конце C-концевое удлинение (X)_n, где n равно 1-10, предпочтительно 1-5, как-то 1, 2, 3, 4 или 5 (а предпочтительно 1 или 2, как-то 1); а каждый X означает (предпочтительно встречающийся в природе) аминокислотный остаток, который выбран независимо, а предпочтительно выбран независимо из группы, состоящей из аланина (A), глицина (G), валина (V), лейцина (L) или изолейцина (I) (опять же, такое C-концевое удлинение предпочтительно является таким, как описано далее, и опять же, такое нанотело, к примеру, также может содержать одну или несколько других специфических замен аминокислотных остатков, приведенных здесь, как-то 11L, L11V, L11K, 14A, P14A, 14P, A14P, 89T, V89T, 89L, V89L, 108L, Q108L, 110Q, T110Q, 110K и/или T110K; хотя обычно наличие дополнительной замены в положении 110 зачастую не требуется, если в положении 112 находится K или Q, при этом в положении 110 предпочтительно находится T). Кроме того: (i) в положении 41 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-6 WO 08/020079 для положения 41, в частности, это может быть (или выбран из них) пролин (Р), серин (S), треонин (Т), аланин (А) или лейцин (L), то есть из числа тех аминокислотных остатков, которые чаще всего встречаются в этом положении у людей или у лам, а более предпочтительно это может быть пролин (P) или аланин (A); и/или (ii) в положении 42 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-6 WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (E); и/или (iii) в положении 87 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-7 WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (T) или аланин (A).

В предпочтительном аспекте изобретение касается нанотел по изобретению (как определено здесь), которые могут связываться (в частности, специфически связываться)
с сывороточным альбумином (в особенности с сывороточным альбумином человека), которые являются гуманизованными вариантами SEQ ID NO: 52 из WO 2006/122787, в которых:

- CDR1 имеет аминокислотную последовательность SFGMS (SEQ ID NO:41);

- CDR2 имеет аминокислотную последовательность SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ ID NO:42);

- CDR3 имеет аминокислотную последовательность GGSLSR (SEQ ID NO:43);

- аминокислотный остаток в положении 112 представлен K или Q;

которые необязательно содержат на C-терминальном конце C-концевое удлинение (X)_n, где n равно 1-10, предпочтительно 1-5, как-то 1, 2, 3, 4 или 5 (а предпочтительно 1 или 2, как-то 1); а каждый X означает (предпочтительно встречающийся в природе) аминокислотный остаток, который выбран независимо, а предпочтительно выбран независимо из группы, состоящей из аланина (A), глицина (G), валина (V), лейцина (L) и изолейцина (I) (опять же, такое C-концевое удлинение предпочтительно является таким, как описано далее, и опять же, такое нанотело, к примеру, также может содержать одну или несколько других специфических замен аминокислотных остатков, приведенных здесь, как-то 11L, L11V, L11K, 14A, P14A, 14P, A14P, 89T, V89T, 89L, V89L, 108L, Q108L, 110Q, T110Q, 110K и/или T110K; хотя обычно наличие дополнительной замены в положении 110 зачастую не требуется, если в положении 112 находится K или Q, при этом в положении 110 предпочтительно находится T). Кроме того: (i) в положении 41 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-6 WO 08/020079 для положения 41, в частности, это может быть (или выбран из них) пролин (Р), серин (S), треонин (Т), аланин (А) или лейцин (L), то есть из числа тех аминокислотных остатков, которые чаще всего встречаются в этом положении у людей или у лам, а более предпочтительно это может быть пролин (P) или аланин (A); и/или (ii) в положении 42 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-6 WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (E); и/или (iii) в положении 87 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-7 WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (T) или аланин (A).

В предпочтительном аспекте изобретение касается нанотел по изобретению (как определено здесь), которые могут связываться (в частности, специфически связываться) с сывороточным альбумином (в особенности с сывороточным альбумином человека), которые по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, как-то по меньшей мере на 95% идентичны по последовательности хотя бы с одним из Alb-1 (SEQ ID NO: 52, WO 2006/122787), Alb-8 (SEQ ID NO: 46, здесь) и/или Alb-23 (SEQ ID NO:61, здесь) (принимая во внимание и каркасные последовательности, и CDRs, но без учета C-концевого удлинения), в которых аминокислотный остаток в положении 112 представлен K или Q и которые необязательно содержат на C-терминальном конце C-концевое удлинение (X)_n, где n равно 1-10, предпочтительно 1-5, как-то 1, 2, 3, 4 или 5 (а предпочтительно 1 или 2, как-то 1); а каждый X означает (предпочтительно встречающийся в природе) аминокислотный остаток, который выбран независимо, а предпочтительно выбран независимо из группы, состоящей из аланина (A), глицина (G), валина (V), лейцина (L) и изолейцина (I) (опять же, такое C-концевое удлинение предпочтительно является таким, как описано далее, и опять же, такое нанотело, к примеру, также может содержать одну или несколько других специфических замен аминокислотных остатков, приведенных здесь, как-то 11L, L11V, L11K, 14A, P14A, 14P, A14P, 89T, V89T, 89L, V89L, 108L, Q108L, 110Q, T110Q, 110K и/или T110K; хотя обычно наличие дополнительной замены в положении 110 зачастую и не требуется, если в положении 112 находится K или Q, при этом в положении 110 предпочтительно находится T). Кроме того: (i) в положении 41 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-6 WO 08/020079 для положения 41, в частности, это может быть (или выбран из них) пролин (Р), серин (S), треонин (Т), аланин (А) или лейцин (L), то есть из числа тех аминокислотных остатков, которые чаще всего встречаются в этом положении у людей или у лам, а более предпочтительно это может быть пролин (P) или аланин (A); и/или (ii) в положении 42 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-6 WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (E); и/или (iii) в положении 87 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-7 WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (T) или аланин (A).

Такие нанотела по изобретению опять же предпочтительно являются гуманизованными вариантами Alb-1 (но с заменой S112K или S112Q), а более предпочтительно содержат по меньшей мере один, предпочтительно любые два, а более предпочтительно все три из CDR1, CDR2 и/или CDR3, приведенных в SEQ ID NOs 41-43, соответственно.

В соответствии с одним конкретным аспектом, любое связывающее сывороточный альбумин нанотело по изобретению также может содержать аминокислотные остатки, характерные для Alb-23 и его вариантов, как описано в WO 12/175400 (т.е. аминокислотный мотив GP в положениях 44 и 45, аминокислотный мотив SKN в положениях 74-76 и предпочтительно G в положении 16, а также необязательно R в положении 83).

Некоторые предпочтительные, но без ограничения, примеры нанотел по изобретению, направленных против сывороточного альбумина человека, приведены в табл. 4 и Примере 20.

В другом аспекте изобретение касается доменов V_H, в частности ISVD, более предпочтительно нанотел, у которых:

a) последовательность FW4 представлена одной из следующих последовательностей FW4:

Таблица 5. Последовательности FW4

SSQGTLVTVKS (SEQ ID NO:99) SSQGTLVTVQS (SEQ ID NO:100) SSQGTLVKVSS (SEQ ID NO:101) SSQGTLVQVSS (SEQ ID NO:102) SSQGTLVTVKS(X)_n (SEQ ID NO:103) SSQGTLVTVQS(X)_n (SEQ ID NO:104) SSQGTLVKVSS(X)_n (SEQ ID NO:105) SSQGTLVQVSS(X)_n (SEQ ID NO:106)

в которых (i) аминокислотные остатки последовательностей FW4, которые предшествуют C-концевому удлинению (X)_n в SEQ ID NOs: 23-40, соответствуют положениям аминокислот в FW4 домена V_H (т.е. положениям 103-113 по нумерации Kabat); (ii) n равно 1-10, предпочтительно 1-5, как-то 1, 2, 3, 4 или 5 (а предпочтительно 1 или 2, как-то 1); и (iii) каждый X означает остаток (предпочтительно встречающейся в природе) аминокислоты, который выбран независимо, а предпочтительно выбран независимо из группы, состоящей из аланина (A), глицина (G), валина (V), лейцина (L) и изолейцина (I); или

c) аминокислотная последовательность имеет не более 3, предпочтительно не более 2 отличий по аминокислотам по меньшей мере от одной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NOs: 99-106, причем данные отличия по аминокислотам приходятся на положения, соответствующие положениям аминокислот в FW4 домена V_H, т.е. на положения 103-113 по нумерации Kabat, без учета каких-либо отличий по аминокислотам в пределах C-концевого удлинения (X)_n, при этом: (i) если аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 112 по нумерации Kabat, представлен K или Q, то данные отличия по аминокислотам приходятся на другие положения аминокислот, чем 112, и аминокислотный остаток в положении 89 домена V_H предпочтительно выбран из V, T и L (а наиболее предпочтительно это V); (ii) если аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 110 по нумерации Kabat, представлен K или Q, то данные отличия по аминокислотам приходятся на другие положения аминокислот, чем 110, а в положении 89 домена V_H находится L; (iii) n равно 1-10, предпочтительно 1-5, как-то 1, 2, 3, 4 или 5 (а предпочтительно 1 или 2, как-то 1); и (iv) каждый X означает остаток (предпочтительно встречающейся в природе) аминокислоты, который выбран независимо, а предпочтительно выбран независимо из группы, состоящей из аланина (A), глицина (G), валина (V), лейцина (L) и изолейцина (I). Опять же, в дополнение к пунктам (i)-(iv), приведенным в предыдущем предложении, в такой аминокислотной последовательности: (v) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 103 по нумерации Kabat, предпочтительно представлен S; (vi) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 104 по нумерации Kabat, предпочтительно представлен S; (vii) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 106 по нумерации Kabat, предпочтительно представлен G; (viii) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 107 по нумерации Kabat, предпочтительно представлен T; (ix) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 108 по нумерации Kabat, предпочтительно представлен Q или L (а в гуманизованных нанотелах это предпочтительно L); (x) аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 109 по нумерации Kabat, предпочтительно представлен V; опять же отсылаем к табл. 2 насчет таких аминокислотных остатков, которые могут присутствовать в каждом положении.

При этом у таких доменов V_H по изобретению: (a) аминокислотный остаток в положении 11 представлен L, V или K (более предпочтительно V); аминокислотный остаток в положении 14 предпочтительно представлен A или P; аминокислотный остаток в положении 41 предпочтительно представлен A или P. Кроме того, такие домены V_H по изобретению предпочтительно представляют собой ISVD, а более предпочтительно нанотела; причем они могут быть направлены против сывороточного альбумина человека (в этом случае у них предпочтительно CDRl, CDR2 и CDR3, соответственно, соответствуют SEQ ID NOs 41, 42 и 43, соответственно). Кроме того, когда такие домены V_H являются ISVDs или нанотелами против сывороточного альбумина человека, то они тоже могут быть такими, как описано здесь для нанотел по изобретению, направленных против сывороточного альбумина человека.

Домены V_H по изобретению, которые направлены против сывороточного альбумина (в частности, связывающие сывороточный альбумин ISVD по изобретению), могут применяться для повышения периода полураспада терапевтически активных соединений, (поли)пептидов, белков, связывающих доменов, связывающих блоков или других терапевтически активных субстанций или молекул, в основном так, как это описано в WO 2004/041865, WO 2006/122787 и/или WO 2012/175400 для применения связывающих сывороточный альбумин нанотел, раскрытых в данных ссылках (т.е. при соответствующем присоединении связывающих сывороточный альбумин ISVD к белкам, полипептидам, соединениям или другим субстанциям, необязательно через подходящий линкер. Например, в WO 12/175400 на стр. 12 и 13 приведены некоторые примеры того, как можно сконструировать подходящие слитые белки).

В другом аспекте изобретение касается вариабельных доменов тяжелой цепи иммуноглобулина (доменов V_H), в которых аминокислотный остаток в положении 89 (нумерация по Kabat) представлен треонином (T), а аминокислотный остаток в положении 112 представлен остатком серина (S), лизина (K) либо остатком глутамина (Q). Такие вариабельные домены тяжелой цепи иммуноглобулина (домены V_H) с T в положении 89 также охвачены термином “домены V_H по изобретению”, который применяется здесь в самом широком смысле, и тоже могут быть такими, как описано здесь для доменов V_H по изобретению, содержащих K или Q в положении 112. Соответственно, такие вариабельные домены тяжелой цепи иммуноглобулина (домены V_H) могут содержать C-концевое удлинение, как описано далее (включая указанные предпочтения для таких C-концевых удлинений); они могут представлять собой ISVD и в особенности нанотела, как описано далее.

Опять же, если такой домен V_H по изобретению имеет экспонированный C-концевой участок (например, потому, что он образует C-терминальный конец белка, полипептида или иной конструкции, в которой он находится), то предпочтительно он содержит C-концевое удлинение (см. данные, представленные ниже в табл. C).

Кроме того, нанотела по изобретению, в которых положение 89 представлено Т (т.е. с C-концевым удлинением или без него), предпочтительно содержат аминокислоту в положении 11, которая выбрана из L (этот аминокислотный остаток чаще всего встречается в V_HH), E, K, M, S, V, W и Y; более предпочтительно из L, E, K, V и Y и еще более предпочтительно из L, K и V (причем наиболее предпочтительно это V). Например, они могут содержать замену L11K или L11V, а также, к примеру, замену P14A или A14P, замену Q108L и/или замену T110K, T110Q, S112K и/или S112Q (хотя обычно наличие одной или двух дополнительных замен в положении 110 и/или 112 зачастую и не требуется, если в положении 89 находится T, при этом в положении 110 предпочтительно находится T, а в положении 112 предпочтительно S).

В частности, вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина (домен V_H) по изобретению в соответствии с этим частным аспектом содержит T в положении 89 (по Kabat), а C-терминальный конец представлен одним из VTVSS (SEQ ID NO: 77), VTVSS(X)_n (SEQ ID NO: 78), VTVKS (SEQ ID NO: l), VTVKS(X)_n (SEQ ID NO: 21), VTVQS (SEQ ID NO: 2), VTVQS(X)_n (SEQ ID NO: 22), VKVSS (SEQ ID NO: 95), VKVSS(X)_n (SEQ ID NO:97), VQVSS (SEQ ID NO: 96), VQVSS(X)_n (SEQ ID NO: 98), VZVZS (SEQ ID NO: 107, при этом каждый аминокислотный остаток Z независимо означает K или Q) или VZVZS(X)_n (SEQ ID NO: 108, при этом каждый аминокислотный остаток Z независимо означает K или Q), а предпочтительно одним из VTVKS (SEQ ID NO: l), VTVQS (SEQ ID NO: 2), VTVSS (SEQ ID NO: 77), VTVKS(X)_n (SEQ ID NO: 21), VTVQS(X)_n (SEQ ID NO: 22) или VTVSS(X)_n (SEQ ID NO: 78), более предпочтительно это либо VTVSS (SEQ ID NO: 77), либо VTVSS(X)_n (SEQ ID NO: 78), где n и X такие, как описано здесь для доменов V_H по изобретению, у которых в положении 112 находится Q или K (а C-концевое удлинение предпочтительно такое, как описано здесь для доменов V_H по изобретению, у которых в положении 112 находится Q или K). Кроме того, как и в случае доменов V_H по изобретению, у которых в положении 112 находится Q или K, когда такой домен V_H с T в положении 89 представляет собой нанотело, то в положении 11 предпочтительно находится лейцин (L), в положении 14, в частности, может быть аланин (A) или пролин (P), а в положении 108, в частности, может быть Q или L (а в гуманизованных нанотелах это предпочтительно L); причем такие нанотела с T в положении 89 могут содержать один или несколько характерных остатков и/или быть соответственным образом гуманизованными. Кроме того: (i) в положении 41 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-6 WO 08/020079 для положения 41, в частности, это может быть (или выбран из них) пролин (Р), серин (S), треонин (Т), аланин (А) или лейцин (L), то есть из числа тех аминокислотных остатков, которые чаще всего встречаются в этом положении у людей или у лам, а более предпочтительно это может быть пролин (P) или аланин (A); и/или (ii) в положении 42 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-6 WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (E); и/или (iii) в положении 87 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-7 WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (T) или аланин (A).

Такой домен V_H по изобретению с T в положении 89 опять же может представлять собой нанотело к сывороточному альбумину, как уже описано здесь. Например, такое связывающее сывороточный альбумин нанотело может иметь одну из последовательностей SEQ ID NOs: 46-75, но с T в положении 89; или же другое связывающее сывороточный альбумин нанотело с T в положении 89, которое по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, как-то по меньшей мере на 95% идентично по последовательности хотя бы с одним из Alb-1 (SEQ ID NO: 52, WO 2006/122787), Alb-8 (SEQ ID NO: 46, здесь) и/или Alb-23 (SEQ ID NO:61, здесь) (принимая во внимание и каркасные последовательности, и CDRs, но без учета C-концевого удлинения). Некоторые другие примеры таких нанотел с T в положении 89 представлены в SEQ ID NOs: 78-91 (это другие варианты Alb-1/Alb-8 или Alb-23 с T в положении 89 и S в положении 112).

В более общем виде домен V_H против сывороточного альбумина в соответствии с этим аспектом изобретения может быть одним из нанотел против сывороточного альбумина (человека), которые описаны в WO 2004/041865 и в особенности в WO 2006/122787 и WO 2012/175400 (все это заявки от заявителя/правопреемника), в котором аминокислота в положении 89 представлена треонином (T) и которое необязательно содержит C-концевое удлинение, как описано здесь (а также, к примеру, может содержать одну или несколько других специфических замен аминокислотных остатков, приведенных здесь, как-то 11L, L11V, L11K, 14A, P14A, 14P, A14P, 108L, Q108L, 110K, T110K, 110Q, T110Q, S112K и/или S112Q; хотя обычно наличие дополнительных замен в положениях 110 и/или 112 зачастую и не требуется, если в положении 89 находится T, при этом в положении 110 предпочтительно находится T, а в положении 112 предпочтительно S). Кроме того: (i) в положении 41 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-6 WO 08/020079 для положения 41, в частности, это может быть (или выбран из них) пролин (Р), серин (S), треонин (Т), аланин (А) или лейцин (L), то есть из числа тех аминокислотных остатков, которые чаще всего встречаются в этом положении у людей или у лам, а более предпочтительно это может быть пролин (P) или аланин (A); и/или (ii) в положении 42 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-6 WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (E); и/или (iii) в положении 87 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-7 WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (T) или аланин (A). Более того, предусматривается, что настоящее изобретение также применимо и к другим ISVD тяжелой цепи, связывающим сывороточный альбумин, типа тех, что описаны в WO 03/035694, WO 04/003019, WO 05/118642, WO 06/059106, WO 08/096158, WO 09/121804, WO 10/108937 или US 2013/0129727, т.е. при соответствующем введении треонина (T) в положении 89 и необязательно одной или нескольких других замен аминокислотных остатков, описанных здесь, а также необязательно (а обычно предпочтительно, как изложено здесь) добавлении C-концевого удлинения (тоже как описано здесь).

Некоторые предпочтительные, но без ограничения, примеры таких связывающих сывороточный альбумин нанотел по изобретению - это гуманизованные варианты аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 52 в WO 2006/122787 (именуемой “Alb-1” в WO 2006/122787), в которых аминокислота в положении 89 представлена T (и которые необязательно содержат C-концевое удлинение, как описано здесь), типа гуманизованных вариантов Alb-1, приведенных в SEQ ID NOs: 57-64 в WO 2006/122787 (в каждом случае с заменой V89T и необязательно с C-концевым удлинением), или гуманизованных вариантов Alb-1, приведенных в SEQ ID NOs: 3-11 в WO 2012/175400 (опять же, в каждом случае с заменой V89T), из которых SEQ ID NOs 3, 4 и 5 могут необязательно содержать C-концевое удлинение, а SEQ ID NOs 6-11 в самом деле содержат C-концевое удлинение (опять же, такие варианты могут содержать одну или несколько других специфических замен аминокислотных остатков, приведенных здесь, как-то 11L, L11V, L11K, 14A, P14A, 14P, A14P, 108L, Q108L, 110K, T110K, 110Q, T110Q, 112Q, 112K, S112K и/или S112Q; хотя обычно наличие дополнительных замен в положениях 110 и/или 112 зачастую и не требуется, если в положении 89 находится T, при этом в положении 110 предпочтительно находится T, а в положении 112 предпочтительно S). Кроме того: (i) в положении 41 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-6 WO 08/020079 для положения 41, в частности, это может быть (или выбран из них) пролин (Р), серин (S), треонин (Т), аланин (А) или лейцин (L), то есть из числа тех аминокислотных остатков, которые чаще всего встречаются в этом положении у людей или у лам, а более предпочтительно это может быть пролин (P) или аланин (A); и/или (ii) в положении 42 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-6 WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (E); и/или (iii) в положении 87 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-7 WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (T) или аланин (A).

Итак, в следующем аспекте изобретение касается нанотел по изобретению (как определено здесь), которые могут связываться (в частности, специфически связываться)
с сывороточным альбумином (в особенности сывороточным альбумином человека), в которых:

- CDR1 имеет аминокислотную последовательность SFGMS (SEQ ID NO:41);

- CDR2 имеет аминокислотную последовательность SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ ID NO:42);

- CDR3 имеет аминокислотную последовательность GGSLSR (SEQ ID NO:43);

- аминокислотный остаток в положении 89 представлен T;

которые необязательно содержат на C-терминальном конце C-концевое удлинение (X)_n, где n равно 1-10, предпочтительно 1-5, как-то 1, 2, 3, 4 или 5 (а предпочтительно 1 или 2, как-то 1); а каждый X означает (предпочтительно встречающийся в природе) аминокислотный остаток, который выбран независимо, а предпочтительно выбран независимо из группы, состоящей из аланина (A), глицина (G), валина (V), лейцина (L) и изолейцина (I) (опять же, такое C-концевое удлинение предпочтительно является таким, как описано далее, и опять же, такое нанотело, к примеру, также может содержать одну или несколько других специфических замен аминокислотных остатков, приведенных здесь, как-то 11L, L11V, L11K, 14A, P14A, 14P, A14P, 108L, Q108L, 110K, T110K, 110Q, T110Q, 112Q, 112K, S112K и/или S112Q; хотя обычно наличие дополнительных замен в положениях 110 и/или 112 зачастую и не требуется, если в положении 89 находится T, при этом в положении 110 предпочтительно находится T, а в положении 112 предпочтительно S). Кроме того: (i) в положении 41 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-6 WO 08/020079 для положения 41, в частности, это может быть (или выбран из них) пролин (Р), серин (S), треонин (Т), аланин (А) или лейцин (L), то есть из числа тех аминокислотных остатков, которые чаще всего встречаются в этом положении у людей или у лам, а более предпочтительно это может быть пролин (P) или аланин (A); и/или (ii) в положении 42 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-6 WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (E); и/или (iii) в положении 87 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-7 WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (T) или аланин (A).

В предпочтительном аспекте изобретение касается нанотел по изобретению (как определено здесь), которые могут связываться (в частности, специфически связываться)
с сывороточным альбумином (в особенности сывороточным альбумином человека), которые являются гуманизованными вариантами SEQ ID NO: 52 из WO 2006/122787, в которых:

- CDR1 имеет аминокислотную последовательность SFGMS (SEQ ID NO:41);

- CDR2 имеет аминокислотную последовательность SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ ID NO:42);

- CDR3 имеет аминокислотную последовательность GGSLSR (SEQ ID NO:43);

- аминокислотный остаток в положении 89 представлен T;

которые необязательно содержат на C-терминальном конце C-концевое удлинение (X)_n, где n равно 1-10, предпочтительно 1-5, как-то 1, 2, 3, 4 или 5 (а предпочтительно 1 или 2, как-то 1); а каждый X означает (предпочтительно встречающийся в природе) аминокислотный остаток, который выбран независимо, а предпочтительно выбран независимо из группы, состоящей из аланина (A), глицина (G), валина (V), лейцина (L) и изолейцина (I) (опять же, такое C-концевое удлинение предпочтительно является таким, как описано далее, и опять же, такое нанотело, к примеру, также может содержать одну или несколько других специфических замен аминокислотных остатков, приведенных здесь, как-то 11L, L11V, L11K, 14A, P14A, 14P, A14P, 108L, Q108L, 110K, T110K, 110Q, T110Q, 112Q, 112K, S112K и/или S112Q; хотя обычно наличие дополнительных замен в положениях 110 и/или 112 зачастую и не требуется, если в положении 89 находится T, при этом в положении 110 предпочтительно находится T, а в положении 112 предпочтительно S). Кроме того: (i) в положении 41 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-6 WO 08/020079 для положения 41, в частности, это может быть (или выбран из них) пролин (Р), серин (S), треонин (Т), аланин (А) или лейцин (L), то есть из числа тех аминокислотных остатков, которые чаще всего встречаются в этом положении у людей или у лам, а более предпочтительно это может быть пролин (P) или аланин (A); и/или (ii) в положении 42 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-6 WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (E); и/или (iii) в положении 87 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-7 WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (T) или аланин (A).

В предпочтительном аспекте изобретение касается нанотел по изобретению (как определено здесь), которые могут связываться (в частности, специфически связываться)
с сывороточным альбумином (в особенности c сывороточным альбумином человека), которые по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, как-то по меньшей мере на 95% идентичны по последовательности хотя бы с одним из Alb-1 (SEQ ID NO: 52 в WO 2006/122787), Alb-8 (SEQ ID NO: 46, здесь) и/или Alb-23 (SEQ ID NO: 61, здесь) (принимая во внимание и каркасные последовательности, и CDRs, но без учета C-концевого удлинения), у которых аминокислотный остаток в положении 89 представлен T; которые необязательно содержат на C-терминальном конце C-концевое удлинение (X)_n, где n равно 1-10, предпочтительно 1-5, как-то 1, 2, 3, 4 или 5 (а предпочтительно 1 или 2, как-то 1); а каждый X означает (предпочтительно встречающийся в природе) аминокислотный остаток, который выбран независимо, а предпочтительно выбран независимо из группы, состоящей из аланина (A), глицина (G), валина (V), лейцина (L) и изолейцина (I) (опять же, такое C-концевое удлинение предпочтительно является таким, как уже описано здесь, и опять же, такое нанотело, к примеру, также может содержать одну или несколько других специфических замен аминокислотных остатков, приведенных здесь, как-то 11L, L11V, L11K, 14A, P14A, 14P, A14P, 108L, Q108L, 110K, T110K, 110Q, T110Q, 112Q, 112K, S112K и/или S112Q; хотя обычно наличие дополнительных замен в положениях 110 и/или 112 зачастую и не требуется, если в положении 89 находится T, при этом в положении 110 предпочтительно находится T, а в положении 112 предпочтительно S). Кроме того: (i) в положении 41 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-6 WO 08/020079 для положения 41, в частности, это может быть (или выбран из них) пролин (Р), серин (S), треонин (Т), аланин (А) или лейцин (L), то есть из числа тех аминокислотных остатков, которые чаще всего встречаются в этом положении у людей или у лам, а более предпочтительно это может быть пролин (P) или аланин (A); и/или (ii) в положении 42 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-6 WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (E); и/или (iii) в положении 87 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-7 WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (T) или аланин (A).

В соответствии с одним конкретным аспектом, такие связывающие сывороточный альбумин нанотела по изобретению с T в положении 89 также могут содержать аминокислотные остатки, характерные для Alb-23 и его вариантов, как описано в WO 12/175400 (т.е. аминокислотный мотив GP в положениях 44 и 45, аминокислотный мотив SKN в положениях 74-76 и предпочтительно G в положении 16, а также необязательно R в положении 83).

Как и домены V_H по изобретению, содержащие Q или K в положении 112, домены V_H по изобретению, содержащие T в положении 89 (необязательно вместе с Q или K в положении 112 и/или вместе с C-концевым удлинением), проявляют снижение связывания предсуществующих антител, в частности, таких предсуществующих антител (к примеру, таких, которые встречаются в образцах от больных SLE), которые способны связываться с доменами V_H и нанотелами при наличии C-концевого удлинения.

В следующем аспекте изобретение касается вариабельных доменов тяжелой цепи иммуноглобулина (доменов V_H), у которых аминокислотный остаток в положении 89 (нумерация по Kabat) представлен лейцином (L), а аминокислотный остаток в положении 110 представлен остатком лизина (K) или остатком глутамина (Q). Такие вариабельные домены тяжелой цепи иммуноглобулина (домены V_H) с L в положении 89 и K или Q в положении 110 также охвачены термином “домены V_H по изобретению”, который применяется здесь в самом широком смысле, и тоже могут быть такими, как описано здесь для других доменов V_H по изобретению (т.е. содержащих K или Q в положении 112 или содержащих T в положении 89). Соответственно, такие вариабельные домены тяжелой цепи иммуноглобулина (домены V_H) могут содержать C-концевое удлинение, как описано далее (включая указанные предпочтения для таких C-концевых удлинений); они могут представлять собой ISVD и в особенности нанотела, как описано далее.

Опять же, если такой домен V_H по изобретению имеет экспонированный C-концевой участок (например, потому, что он образует C-терминальный конец белка, полипептида или иной конструкции, в которой он находится), то предпочтительно он содержит C-концевое удлинение (см. данные, представленные ниже в табл. C).

Кроме того, нанотела по изобретению, у которых положение 89 представлено L, а в положении 110 находится K или Q (т.е. с C-концевым удлинением или без него), предпочтительно содержат аминокислоту в положении 11, которая выбрана из L (этот аминокислотный остаток чаще всего встречается в V_HH), E, K, M, S, V, W и Y; более предпочтительно из L, E, K, V и Y и еще более предпочтительно из L, K и V (причем наиболее предпочтительно это V). Например, они могут содержать замену L11K или L11V, а также, к примеру, замену P14A или A14P и/или замену Q108L (они также могут содержать мутацию S112K и/или S112Q (хотя обычно наличие дополнительной замены в положении 112 зачастую и не требуется, если в положении 89 находится L, а в положении 110 - K или Q, при этом в положении 112 предпочтительно S). Кроме того: (i) в положении 41 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-6 WO 08/020079 для положения 41, в частности, это может быть (или выбран из них) пролин (Р), серин (S), треонин (Т), аланин (А) или лейцин (L), то есть из числа тех аминокислотных остатков, которые чаще всего встречаются в этом положении у людей или у лам, а более предпочтительно это может быть пролин (P) или аланин (A); и/или (ii) в положении 42 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-6 WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (E); и/или (iii) в положении 87 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-7 WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (T) или аланин (A).

Кроме того, в одном аспекте, у таких доменов V_H по изобретению, в которых 89 представлено L, а 110 представлено K или Q, аминокислотный остаток в положении 112 представлен серином (S). Более предпочтительно C-терминальный конец у таких доменов V_H может быть представлен (а предпочтительно является) одним из VKVSS (SEQ ID NO: 95), VQVSS (SEQ ID NO: 96), VKVSS(X)_n (SEQ ID NO:97) или VQVSS(X)_n (SEQ ID NO: 98), где n и X такие, как описано здесь для доменов V_H по изобретению, в которых положение 112 представлено Q или K (и C-концевое удлинение предпочтительно тоже такое, как описано здесь для доменов V_H по изобретению, в которых положение 112 представлено Q или K). Кроме того, как и в случае доменов V_H по изобретению, у которых в положении 112 находится Q или K либо в положении 89 находится T, когда такой домен V_H с L в положении 89 и K или Q в положении 110 представляет собой нанотело, то в положении 11 предпочтительно находится лейцин (L), в положении 14, в частности, может быть аланин (A) или пролин (P), а в положении 108, в частности, может быть Q или L (а в гуманизованных нанотелах предпочтительно L); причем такое нанотело с L в положении 89 и K или Q в положении 110 может содержать один или несколько характерных для нанотел остатков и/или быть соответствующим образом гуманизованным. Кроме того: (i) в положении 41 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-6 WO 08/020079 для положения 41, в частности, это может быть (или выбран из них) пролин (Р), серин (S), треонин (Т), аланин (А) или лейцин (L), то есть из числа тех аминокислотных остатков, которые чаще всего встречаются в этом положении у людей или у лам, а более предпочтительно это может быть пролин (P) или аланин (A); и/или (ii) в положении 42 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-6 WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (E); и/или (iii) в положении 87 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-7 WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (T) или аланин (A).

Такой домен V_H по изобретению с L в положении 89 и K или Q в положении 110 опять же может представлять собой нанотело к сывороточному альбумину, как уже описано здесь. Например, такое связывающее сывороточный альбумин нанотело может иметь одну из последовательностей SEQ ID NOs: 46-75, но с L в положении 89 и K или Q в положении 110; или же другое связывающее сывороточный альбумин нанотело с L в положении 89 и K или Q в положении 110, которое по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, как-то по меньшей мере на 95% идентично по последовательности хотя бы с одним из Alb-1 (SEQ ID NO: 52, WO 2006/122787), Alb-8 (SEQ ID NO: 46, здесь) и/или Alb-23 (SEQ ID NO:61, здесь) (принимая во внимание и каркасные последовательности, и CDRs, но без учета C-концевого удлинения).

В более общем виде домен V_H против сывороточного альбумина в соответствии с этим аспектом изобретения может быть одним из нанотел против сывороточного альбумина (человека), которые описаны в WO 2004/041865 и в особенности в WO 2006/122787 и WO 2012/175400 (все это заявки от заявителя/правопреемника), в котором аминокислота в положении 89 представлена лейцином (L), а аминокислотный остаток в положении 110 представлен K или Q, и которое необязательно содержит C-концевое удлинение, как описано здесь (а также, к примеру, может содержать одну или несколько других специфических замен аминокислотных остатков, приведенных здесь, как-то 11L, L11V, L11K, 14A, P14A, 14P, A14P, 108L и/или Q108L; а также S112K или S112Q, хотя обычно наличие дополнительной замены в положении 112 зачастую и не требуется, если в положении 89 находится L, а в положении 110 - K или Q, при этом в положении 112 предпочтительно находится S). Более того, предусматривается, что настоящее изобретение также применимо и к другим ISVD тяжелой цепи, связывающим сывороточный альбумин, типа тех, что описаны в WO 03/035694, WO 04/003019, WO 05/118642, WO 06/059106, WO 08/096158, WO 09/121804, WO 10/108937 или US 2013/0129727, т.е. при соответствующем введении лейцина (L) в положении 89 и K либо Q в положении 110, а также необязательно одной или нескольких других замен аминокислотных остатков, описанных здесь, и необязательно (а обычно предпочтительно, как изложено здесь) добавлении C-концевого удлинения (тоже как описано здесь). В таких доменах V_H против сывороточного альбумина аминокислота в положении 112 предпочтительно представлена S, а также в таких доменах V_H предпочтительно C-терминальный конец представлен одним из SEQ ID NOs: 95-98. Кроме того: (i) в положении 41 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-6 WO 08/020079 для положения 41, в частности, это может быть (или выбран из них) пролин (Р), серин (S), треонин (Т), аланин (А) или лейцин (L), то есть из числа тех аминокислотных остатков, которые чаще всего встречаются в этом положении у людей или у лам, а более предпочтительно это может быть пролин (P) или аланин (A); и/или (ii) в положении 42 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-6 WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (E); и/или (iii) в положении 87 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-7 WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (T) или аланин (A).

Некоторые предпочтительные, но без ограничения, примеры таких связывающих сывороточный альбумин нанотел по изобретению - это гуманизованные варианты аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 52 из WO 2006/122787 (именуемой “Alb-1” в WO 2006/122787), в которых аминокислота в положении 89 представлена L, а аминокислотный остаток в положении 110 представлен K или Q (и которые необязательно содержат C-концевое удлинение, как описано здесь), типа гуманизованных вариантов Alb-1, приведенных в SEQ ID NOs: 57-64 в WO 2006/122787 (в каждом случае с заменой V89L и заменой T110Q или T110K и необязательно с C-концевым удлинением), или гуманизованных вариантов Alb-1, приведенных в SEQ ID NOs: 3-11 в WO 2012/175400 (опять же, в каждом случае с заменой V89L и заменой T110Q или T110K), из которых SEQ ID NOs 3, 4 и 5 могут необязательно содержать C-концевое удлинение, а SEQ ID NOs 6-11 в самом деле содержат C-концевое удлинение (опять же, такие варианты могут содержать одну или несколько других специфических замен аминокислотных остатков, приведенных здесь, как-то 11L, L11V, L11K, 14A, P14A, 14P, A14P, 108L и/или Q108L; а также S112K или S112Q, хотя обычно наличие дополнительной замены в положении 112 зачастую и не требуется, если в положении 89 находится L, а в положении 110 - K или Q, при этом в положении 112 предпочтительно находится S). В таких доменах V_H против сывороточного альбумина аминокислота в положении 112 предпочтительно представлена S, а также в таких доменах V_H предпочтительно C-терминальный конец представлен одним из SEQ ID NOs: 95-98. Кроме того: (i) в положении 41 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-6 WO 08/020079 для положения 41, в частности, это может быть (или выбран из них) пролин (Р), серин (S), треонин (Т), аланин (А) или лейцин (L), то есть из числа тех аминокислотных остатков, которые чаще всего встречаются в этом положении у людей или у лам, а более предпочтительно это может быть пролин (P) или аланин (A); и/или (ii) в положении 42 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-6 WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (E); и/или (iii) в положении 87 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-7 WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (T) или аланин (A).

Итак, в следующем аспекте изобретение касается нанотел по изобретению (как определено здесь), которые могут связываться (в частности, специфически связываться)
с сывороточным альбумином (в особенности сывороточным альбумином человека), в которых:

- CDR1 имеет аминокислотную последовательность SFGMS (SEQ ID NO:41);

- CDR2 имеет аминокислотную последовательность SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ ID NO:42);

- CDR3 имеет аминокислотную последовательность GGSLSR (SEQ ID NO:43);

- аминокислотный остаток в положении 89 представлен L;

- аминокислотный остаток в положении 110 представлен K или Q;

которые необязательно содержат на C-терминальном конце C-концевое удлинение (X)_n, где n равно 1-10, предпочтительно 1-5, как-то 1, 2, 3, 4 или 5 (а предпочтительно 1 или 2, как-то 1); а каждый X означает (предпочтительно встречающийся в природе) аминокислотный остаток, который выбран независимо, а предпочтительно выбран независимо из группы, состоящей из аланина (A), глицина (G), валина (V), лейцина (L) и изолейцина (I) (опять же, такое C-концевое удлинение предпочтительно является таким, как описано здесь, и опять же, такое нанотело, к примеру, также может содержать одну или несколько других специфических замен аминокислотных остатков, приведенных здесь, как-то 11L, L11V, L11K, 14A, P14A, 14P, A14P, 108L и/или Q108L; а также S112K или S112Q, хотя обычно наличие дополнительной замены в положении 112 зачастую и не требуется, если в положении 89 находится L, а в положении 110 - K или Q, при этом в положении 112 предпочтительно находится S). В таких доменах V_H против сывороточного альбумина аминокислота в положении 112 предпочтительно представлена S, а также в таких доменах V_H предпочтительно C-терминальный конец представлен одним из SEQ ID NOs: 95-98. Кроме того: (i) в положении 41 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-6 WO 08/020079 для положения 41, в частности, это может быть (или выбран из них) пролин (Р), серин (S), треонин (Т), аланин (А) или лейцин (L), то есть из числа тех аминокислотных остатков, которые чаще всего встречаются в этом положении у людей или у лам, а более предпочтительно это может быть пролин (P) или аланин (A); и/или (ii) в положении 42 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-6 WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (E); и/или (iii) в положении 87 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-7 WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (T) или аланин (A).

В предпочтительном аспекте изобретение касается нанотел по изобретению (как определено здесь), которые могут связываться (в частности, специфически связываться)
с сывороточным альбумином (в особенности с сывороточным альбумином человека), которые являются гуманизованными вариантами SEQ ID NO: 52 из WO 2006/122787, в которых:

- CDR1 имеет аминокислотную последовательность SFGMS (SEQ ID NO:41);

- CDR2 имеет аминокислотную последовательность SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ ID NO:42);

- CDR3 имеет аминокислотную последовательность GGSLSR (SEQ ID NO:43);

- аминокислотный остаток в положении 89 представлен L;

- аминокислотный остаток в положении 110 представлен K или Q;

которые необязательно содержат на C-терминальном конце C-концевое удлинение (X)_n, где n равно 1-10, предпочтительно 1-5, как-то 1, 2, 3, 4 или 5 (а предпочтительно 1 или 2, как-то 1); а каждый X означает (предпочтительно встречающийся в природе) аминокислотный остаток, который выбран независимо, а предпочтительно выбран независимо из группы, состоящей из аланина (A), глицина (G), валина (V), лейцина (L) и изолейцина (I) (опять же, такое C-концевое удлинение предпочтительно является таким, как описано здесь, и опять же, такое нанотело, к примеру, также может содержать одну или несколько других специфических замен аминокислотных остатков, приведенных здесь, как-то 11L, L11V, L11K, 14A, P14A, 14P, A14P, 108L и/или Q108L; а также S112K или S112Q, хотя обычно наличие дополнительной замены в положении 112 зачастую и не требуется, если в положении 89 находится L, а в положении 110 - K или Q, при этом в положении 112 предпочтительно находится S). В таких доменах V_H против сывороточного альбумина аминокислота в положении 112 предпочтительно представлена S, а также в таких доменах V_H предпочтительно C-терминальный конец представлен одним из SEQ ID NOs: 95-98. Кроме того: (i) в положении 41 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-6 WO 08/020079 для положения 41, в частности, это может быть (или выбран из них) пролин (Р), серин (S), треонин (Т), аланин (А) или лейцин (L), то есть из числа тех аминокислотных остатков, которые чаще всего встречаются в этом положении у людей или у лам, а более предпочтительно это может быть пролин (P) или аланин (A); и/или (ii) в положении 42 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-6 WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (E); и/или (iii) в положении 87 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-7 WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (T) или аланин (A).

В предпочтительном аспекте изобретение касается нанотел по изобретению (как определено здесь), которые могут связываться (в частности, специфически связываться)
с сывороточным альбумином (в особенности с сывороточным альбумином человека), которые по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, как-то по меньшей мере на 95% идентичны по последовательности хотя бы с одним из Alb-1 (SEQ ID NO: 52, WO 2006/122787), Alb-8 (SEQ ID NO: 46, здесь) и/или Alb-23 (SEQ ID NO:61, здесь) (принимая во внимание и каркасные последовательности, и CDRs, но без учета C-концевого удлинения), в которых аминокислотный остаток в положении 89 представлен L, а аминокислотный остаток в положении 110 представлен K или Q, и которые необязательно содержат на C-терминальном конце C-концевое удлинение (X)_n, где n равно 1-10, предпочтительно 1-5, как-то 1, 2, 3, 4 или 5 (а предпочтительно 1 или 2, как-то 1); а каждый X означает (предпочтительно встречающийся в природе) аминокислотный остаток, который выбран независимо, а предпочтительно выбран независимо из группы, состоящей из аланина (A), глицина (G), валина (V), лейцина (L) и изолейцина (I) (опять же, такое C-концевое удлинение предпочтительно является таким, как описано здесь, и опять же, такое нанотело также, к примеру, может содержать одну или несколько других специфических замен аминокислотных остатков, приведенных здесь, как-то 11L, L11V, L11K, 14A, P14A, 14P, A14P, 108L и/или Q108L; а также S112K или S112Q, хотя обычно наличие дополнительной замены в положении 112 зачастую и не требуется, если в положении 89 находится L, а в положении 110 - K или Q, при этом в положении 112 предпочтительно находится S). Такие нанотела по изобретению опять же предпочтительно являются гуманизованными вариантами Alb-1 (но с заменой V89L и T110K или T110Q), а более предпочтительно содержат по меньшей мере один, предпочтительно любые два, а более предпочтительно все три из CDR1, CDR2 и/или CDR3, приведенных в SEQ ID NOs 41-43, соответственно. В таких доменах V_H против сывороточного альбумина аминокислота в положении 112 предпочтительно представлена S, а также в таких доменах V_H предпочтительно C-терминальный конец представлен одним из SEQ ID NOs: 95-98. Кроме того: (i) в положении 41 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-6 WO 08/020079 для положения 41, в частности, это может быть (или выбран из них) пролин (Р), серин (S), треонин (Т), аланин (А) или лейцин (L), то есть из числа тех аминокислотных остатков, которые чаще всего встречаются в этом положении у людей или у лам, а более предпочтительно это может быть пролин (P) или аланин (A); и/или (ii) в положении 42 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-6 WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (E); и/или (iii) в положении 87 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-7 WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (T) или аланин (A).

В соответствии с одним конкретным аспектом, любое связывающее сывороточный альбумин нанотело по изобретению с L в положении 89 и K или Q в положении 110 также может содержать аминокислотные остатки, характерные для Alb-23 и его вариантов, как описано в WO 12/175400 (т.е. аминокислотный мотив GP в положениях 44 и 45, аминокислотный мотив SKN в положениях 74-76 и предпочтительно G в положении 16, а также необязательно R в положении 83). Кроме того: (i) в положении 41 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-6 WO 08/020079 для положения 41, в частности, это может быть (или выбран из них) пролин (Р), серин (S), треонин (Т), аланин (А) или лейцин (L), то есть из числа тех аминокислотных остатков, которые чаще всего встречаются в этом положении у людей или у лам, а более предпочтительно это может быть пролин (P) или аланин (A); и/или (ii) в положении 42 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-6 WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (E); и/или (iii) в положении 87 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-7 WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (T) или аланин (A).

Как и домены V_H по изобретению, содержащие Q или K в положении 112 либо содержащие T в положении 89, домены V_H по изобретению, содержащие L в положении 89 и K или Q в положении 110, проявляют снижение связывания предсуществующих антител, в частности, таких предсуществующих антител (к примеру, таких, которые встречаются в образцах от больных SLE), которые способны связываться с доменами V_H и нанотелами при наличии C-концевого удлинения.

Некоторые неограничительные примеры доменов V_H по изобретению, содержащих L в положении 89 и K в положении 110 (а также V в положении 11), представлены на фиг. 2 в виде SEQ ID NOs: 123-136. Эти домены V_H, которые связываются с сывороточным альбумином человека, содержат участки CDR, указанные здесь для предпочтительных доменов V_H по изобретению, связывающихся с сывороточным альбумином.

В следующем аспекте изобретение касается вариабельных доменов тяжелой цепи иммуноглобулина (доменов V_H), у которых аминокислотный остаток в положении 89 (нумерация по Kabat) представлен лейцином (L), а аминокислотный остаток в положении 11 представлен валином (V). Такие вариабельные домены тяжелой цепи иммуноглобулина (домены V_H) с L в положении 89 и V в положении 11 также охвачены термином “домены V_H по изобретению”, который применяется здесь в самом широком смысле, и тоже могут быть такими, как описано здесь для других доменов V_H по изобретению (т.е. содержащих K или Q в положении 112, содержащих T в положении 89 или содержащих L в положении 89 и K или Q в положении 110; хотя у доменов V_H в соответствии с данным аспектом аминокислотный остаток в положении 89 должен быть L, аминокислотный остаток в положении 11 должен быть V, а аминокислотные остатки в положениях 110 и 112, соответственно, могут быть представлены любым аминокислотным остатком, подходящим для этих положений). Соответственно, такие вариабельные домены тяжелой цепи иммуноглобулина (домены V_H) могут содержать C-концевое удлинение, как уже описано здесь (включая указанные предпочтения для таких C-концевых удлинений); они могут представлять собой ISVD и в особенности нанотела, как описано здесь.

Опять же, если такой домен V_H по изобретению имеет экспонированный C-концевой участок (например, потому, что он образует C-терминальный конец белка, полипептида или иной конструкции, в которой он находится), то предпочтительно он содержит C-концевое удлинение (см. данные, представленные ниже в табл. C).

Кроме того, нанотела по изобретению, у которых положение 89 представлено L и положение 11 представлено V (т.е. с C-концевым удлинением или без него): (i) предпочтительно содержат аминокислоту в положении 110, которая выбрана из T, I, A, K и Q (а предпочтительно из T, K и Q, более предпочтительно это может быть Т); (ii) предпочтительно содержат аминокислоту в положении 112, которая выбрана из S, F, K и Q (а предпочтительно из S, K и Q, более предпочтительно это может быть S); и (iii) также могут содержать замену, например, P14A или A14P и/или замену Q108L. В соответствии с одним конкретным воплощением, у доменов V_H в соответствии с этим аспектом изобретения аминокислотный остаток в положении 110 представлен T, аминокислотный остаток в положении 112 представлен S, а C-терминальный конец предпочтительно представлен либо VTVSS (SEQ ID NO: 77), либо VTVSS(X)_n (SEQ ID NO: 78), где X и n такие, как определено здесь для C-концевого удлинения у других доменов V_H по изобретению. Кроме того, у доменов V_H в соответствии с этим аспектом изобретения: (i) в положении 41 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-6 WO 08/020079 для положения 41, в частности, это может быть (или выбран из них) пролин (Р), серин (S), треонин (Т), аланин (А) или лейцин (L), то есть из числа тех аминокислотных остатков, которые чаще всего встречаются в этом положении у людей или у лам, а более предпочтительно это может быть пролин (P) или аланин (A); и/или (ii) в положении 42 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-6 WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (E); и/или (iii) в положении 87 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-7 WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (T) или аланин (A).

Так, например, у таких доменов V_H по изобретению, в которых положение 89 представлено L, а 11 представлено V, C-терминальный конец у таких доменов V_H может быть представлен (а предпочтительно является) одним из VTVSS (SEQ ID NO: 77), VTVSS(X)_n (SEQ ID NO: 78), VTVKS (SEQ ID NO: l), VTVKS(X)_n (SEQ ID NO: 21), VTVQS (SEQ ID NO: 2), VTVQS(X)_n (SEQ ID NO: 22), VKVSS (SEQ ID NO: 95), VKVSS(X)_n (SEQ ID NO:97), VQVSS (SEQ ID NO: 96), VQVSS(X)_n (SEQ ID NO: 98), VZVZS (SEQ ID NO: 107, при этом каждый аминокислотный остаток Z независимо означает K или Q) или VZVZS(X)_n (SEQ ID NO: 108, при этом каждый аминокислотный остаток Z независимо означает K или Q), а предпочтительно одним из VTVSS, VKVSS (SEQ ID NO: 95), VQVSS (SEQ ID NO: 96), VKVSS(X)_n (SEQ ID NO:97) или VQVSS(X)_n (SEQ ID NO: 98), более предпочтительно это либо VTVSS (SEQ ID NO: 77), либо VTVSS(X)_n (SEQ ID NO: 78), где n и X такие, как описано здесь для доменов V_H по изобретению, у которых в положении 112 находится Q или K (и C-концевое удлинение предпочтительно такое, как описано здесь для доменов V_H по изобретению, у которых в положении 112 находится Q или K). Кроме того, как и в случае доменов V_H по изобретению, у которых в положении 112 находится Q или K либо в положении 89 находится T, когда такой домен V_H с L в положении 89 и V в положении 11 представляет собой нанотело, то в положении 11 предпочтительно находится лейцин (L), в положении 14, в частности, может быть аланин (A) или пролин (P), а в положении 108 может быть Q или L (а в гуманизованных нанотелах это предпочтительно L); причем такие нанотела с L в положении 89 и V в положении 11 могут содержать один или несколько характерных для нанотел остатков и/или быть соответственным образом гуманизованными. А также: (i) в положении 41 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-6 WO 08/020079 для положения 41, в частности, это может быть (или выбран из них) пролин (Р), серин (S), треонин (Т), аланин (А) или лейцин (L), то есть из числа тех аминокислотных остатков, которые чаще всего встречаются в этом положении у людей или у лам, а более предпочтительно это может быть пролин (P) или аланин (A); и/или (ii) в положении 42 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-6 WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (E); и/или (iii) в положении 87 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-7 WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (T) или аланин (A).

Такой домен V_H по изобретению с L в положении 89 и V в положении 11 опять же может представлять собой нанотело к сывороточному альбумину, как уже описано здесь. Например, такое связывающее сывороточный альбумин нанотело может иметь одну из последовательностей SEQ ID NOs: 46-75, но с L в положении 89 и V в положении 11; или же другое связывающее сывороточный альбумин нанотело с L в положении 89 и V в положении 11, которое по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, как-то по меньшей мере на 95% идентично по последовательности хотя бы с одним из Alb-1 (SEQ ID NO: 52, WO 2006/122787), Alb-8 (SEQ ID NO: 46, здесь) и/или Alb-23 (SEQ ID NO:61, здесь) (принимая во внимание и каркасные последовательности, и CDRs, но без учета C-концевого удлинения).

В более общем виде домен V_H против сывороточного альбумина в соответствии с этим аспектом изобретения может быть одним из нанотел против сывороточного альбумина (человека), которые описаны в WO 2004/041865 и в особенности в WO 2006/122787 и WO 2012/175400 (все это заявки от заявителя/правопреемника), в котором аминокислота в положении 89 представлена лейцином (L), а аминокислотный остаток в положении 11 представлен V, и которое необязательно содержит C-концевое удлинение, как описано здесь (а также, к примеру, может содержать одну или несколько других специфических замен аминокислотных остатков, приведенных здесь, как-то 14А, P14A, 14P, A14P, 108L, Q108L, V110K, V110Q, S112K и/или S112Q). Более того, предусматривается, что настоящее изобретение также применимо и к другим ISVD тяжелой цепи, связывающим сывороточный альбумин, типа тех, что описаны в WO 03/035694, WO 04/003019, WO 05/118642, WO 06/059106, WO 08/096158, WO 09/121804, WO 10/108937 или US 2013/0129727, т.е. при соответствующем введении лейцина (L) в положении 89 и валина в положении 11, а также необязательно одной или нескольких других замен аминокислотных остатков, описанных здесь, и необязательно (а обычно предпочтительно, как изложено здесь) добавлении C-концевого удлинения (тоже как описано здесь). В таких доменах V_H против сывороточного альбумина аминокислота в положении 112 предпочтительно представлена S, а также в таких доменах V_H предпочтительно C-терминальный конец представлен одним из SEQ ID NOs: 95-98. Кроме того: (i) в положении 41 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-6 WO 08/020079 для положения 41, в частности, это может быть (или выбран из них) пролин (Р), серин (S), треонин (Т), аланин (А) или лейцин (L), то есть из числа тех аминокислотных остатков, которые чаще всего встречаются в этом положении у людей или у лам, а более предпочтительно это может быть пролин (P) или аланин (A); и/или (ii) в положении 42 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-6 WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (E); и/или (iii) в положении 87 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-7 WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (T) или аланин (A).

Некоторые предпочтительные, но без ограничения, примеры таких связывающих сывороточный альбумин нанотел по изобретению - это гуманизованные варианты аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 52 из WO 2006/122787 (именуемой “Alb-1” в WO 2006/122787), в которых аминокислота в положении 89 представлена L, а аминокислота в положении 11 представлена V (и которые необязательно содержат C-концевое удлинение, как описано здесь), типа гуманизованных вариантов Alb-1, приведенных в SEQ ID NOs: 57-64 в WO 2006/122787 (в каждом случае с заменой V89L и заменой L11V и необязательно с C-концевым удлинением), или гуманизованных вариантов Alb-1, приведенных в SEQ ID NOs: 3-11 в WO 2012/175400 (опять же, в каждом случае с заменой V89L и заменой L11V), из которых SEQ ID NOs 3, 4 и 5 могут необязательно содержать C-концевое удлинение, а SEQ ID NOs 6-11 в самом деле содержат C-концевое удлинение (опять же, такие варианты могут содержать одну или несколько других специфических замен аминокислотных остатков, приведенных здесь, как-то 14А, P14A, 14P, A14P, 108L, Q108L, V110K, V110Q, S112K и/или S112Q). В таких доменах V_H против сывороточного альбумина аминокислота в положении 112 предпочтительно представлена S, а также в таких доменах V_H предпочтительно C-терминальный конец представлен одним из SEQ ID NOs: 95-98. Кроме того: (i) в положении 41 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-6 WO 08/020079 для положения 41, в частности, это может быть (или выбран из них) пролин (Р), серин (S), треонин (Т), аланин (А) или лейцин (L), то есть из числа тех аминокислотных остатков, которые чаще всего встречаются в этом положении у людей или у лам, а более предпочтительно это может быть пролин (P) или аланин (A); и/или (ii) в положении 42 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-6 WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (E); и/или (iii) в положении 87 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-7 WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (T) или аланин (A).

Итак, в следующем аспекте изобретение касается нанотел по изобретению (как определено здесь), которые могут связываться (в частности, специфически связываться) с сывороточным альбумином (в особенности сывороточным альбумином человека), в которых:

- CDR1 имеет аминокислотную последовательность SFGMS (SEQ ID NO:41);

- CDR2 имеет аминокислотную последовательность SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ ID NO:42);

- CDR3 имеет аминокислотную последовательность GGSLSR (SEQ ID NO:43);

- аминокислотный остаток в положении 89 представлен L;

- аминокислотный остаток в положении 11 представлен V;

при этом предпочтительно:

- аминокислотный остаток в положении 110 представлен K, Q или T, более предпочтительно T;

- аминокислотный остаток в положении 112 представлен K, Q или S, более предпочтительно S;

которые необязательно содержат на C-терминальном конце C-концевое удлинение (X)_n, где n равно 1-10, предпочтительно 1-5, как-то 1, 2, 3, 4 или 5 (а предпочтительно 1 или 2, как-то 1); а каждый X означает (предпочтительно встречающийся в природе) аминокислотный остаток, который выбран независимо, а предпочтительно выбран независимо из группы, состоящей из аланина (A), глицина (G), валина (V), лейцина (L) и изолейцина (I) (опять же, такое C-концевое удлинение предпочтительно является таким, как описано здесь, и опять же, такое нанотело, к примеру, также может содержать одну или несколько других специфических замен аминокислотных остатков, приведенных здесь, как-то 14A, P14A, 14P, A14P, 108L, Q108L). Опять же, в таких доменах V_H против сывороточного альбумина с L в положении 89 и V в положении 11 аминокислота в положении 110 предпочтительно представлена T, а аминокислота в положении 112 предпочтительно представлена S, а также в таких доменах V_H предпочтительно C-терминальный конец представлен одним из SEQ ID NOs: 95-98. Кроме того: (i) в положении 41 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-6 WO 08/020079 для положения 41, в частности, это может быть (или выбран из них) пролин (Р), серин (S), треонин (Т), аланин (А) или лейцин (L), то есть из числа тех аминокислотных остатков, которые чаще всего встречаются в этом положении у людей или у лам, а более предпочтительно это может быть пролин (P) или аланин (A); и/или (ii) в положении 42 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-6 WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (E); и/или (iii) в положении 87 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-7 WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (T) или аланин (A).

В предпочтительном аспекте изобретение касается нанотел по изобретению (как определено здесь), которые могут связываться (в частности, специфически связываться)
с сывороточным альбумином (в особенности с сывороточным альбумином человека), которые являются гуманизованными вариантами SEQ ID NO: 52 из WO 2006/122787, в которых:

- CDR1 имеет аминокислотную последовательность SFGMS (SEQ ID NO:41);

- CDR2 имеет аминокислотную последовательность SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ ID NO:42);

- CDR3 имеет аминокислотную последовательность GGSLSR (SEQ ID NO:43);

- аминокислотный остаток в положении 89 представлен L;

- аминокислотный остаток в положении 11 представлен V;

а также предпочтительно:

- аминокислотный остаток в положении 110 представлен K, Q или T, более предпочтительно T;

- аминокислотный остаток в положении 112 представлен K, Q или S, более предпочтительно S;

которые необязательно содержат на C-терминальном конце C-концевое удлинение (X)_n, где n равно 1-10, предпочтительно 1-5, как-то 1, 2, 3, 4 или 5 (а предпочтительно 1 или 2, как-то 1); а каждый X означает (предпочтительно встречающийся в природе) аминокислотный остаток, который выбран независимо, а предпочтительно выбран независимо из группы, состоящей из аланина (A), глицина (G), валина (V), лейцина (L) и изолейцина (I) (опять же, такое C-концевое удлинение предпочтительно является таким, как описано здесь, и опять же, такое нанотело, к примеру, также может содержать одну или несколько других специфических замен аминокислотных остатков, приведенных здесь, как-то 11L, L11V, L11K, 14A, P14A, 14P, A14P, 108L и/или Q108L). Опять же, в таких доменах V_H против сывороточного альбумина с L в положении 89 и V в положении 11 аминокислота в положении 110 предпочтительно представлена T, а аминокислота в положении 112 предпочтительно представлена S, а также в таких доменах V_H предпочтительно C-терминальный конец представлен одним из SEQ ID NOs: 95-98. Кроме того: (i) в положении 41 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-6 WO 08/020079 для положения 41, в частности, это может быть (или выбран из них) пролин (Р), серин (S), треонин (Т), аланин (А) или лейцин (L), то есть из числа тех аминокислотных остатков, которые чаще всего встречаются в этом положении у людей или у лам, а более предпочтительно это может быть пролин (P) или аланин (A); и/или (ii) в положении 42 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-6 WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (E); и/или (iii) в положении 87 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-7 WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (T) или аланин (A).

В предпочтительном аспекте изобретение касается нанотел по изобретению (как определено здесь), которые могут связываться (в частности, специфически связываться)
с сывороточным альбумином (в особенности с сывороточным альбумином человека), которые по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, как-то по меньшей мере на 95% идентичны по последовательности хотя бы с одним из Alb-1 (SEQ ID NO: 52, WO 2006/122787), Alb-8 (SEQ ID NO: 46, здесь) и/или Alb-23 (SEQ ID NO:61, здесь) (принимая во внимание и каркасные последовательности, и CDRs, но без учета C-концевого удлинения), в которых аминокислотный остаток в положении 89 представлен L, а аминокислотный остаток в положении 11 представлен V, и которые необязательно содержат на C-терминальном конце C-концевое удлинение (X)_n, где n равно 1-10, предпочтительно 1-5, как-то 1, 2, 3, 4 или 5 (а предпочтительно 1 или 2, как-то 1); а каждый X означает (предпочтительно встречающийся в природе) аминокислотный остаток, который выбран независимо, а предпочтительно выбран независимо из группы, состоящей из аланина (A), глицина (G), валина (V), лейцина (L) и изолейцина (I) (опять же, такое C-концевое удлинение предпочтительно является таким, как описано здесь, и опять же, такое нанотело также, к примеру, может содержать одну или несколько других специфических замен аминокислотных остатков, приведенных здесь, как-то 14A, P14A, 14P, A14P, 108L, Q108L, T110K, T110Q, S112K и/или S112Q). Такие нанотела по изобретению опять же предпочтительно являются гуманизованными вариантами Alb-1 (но с заменой V89L и L11V), а более предпочтительно содержат по меньшей мере один, предпочтительно любые два, а более предпочтительно все три из CDR1, CDR2 и/или CDR3, приведенных в SEQ ID NOs 41-43, соответственно. В таких доменах V_H против сывороточного альбумина аминокислота в положении 112 предпочтительно представлена S, а также в таких доменах V_H предпочтительно C-терминальный конец представлен одним из SEQ ID NOs: 95-98. Кроме того: (i) в положении 41 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-6 WO 08/020079 для положения 41, в частности, это может быть (или выбран из них) пролин (Р), серин (S), треонин (Т), аланин (А) или лейцин (L), то есть из числа тех аминокислотных остатков, которые чаще всего встречаются в этом положении у людей или у лам, а более предпочтительно это может быть пролин (P) или аланин (A); и/или (ii) в положении 42 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-6 WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (E); и/или (iii) в положении 87 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-7 WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (T) или аланин (A).

В соответствии с одним конкретным аспектом, любое связывающее сывороточный альбумин нанотело по изобретению с L в положении 89 и V в положении 11 также может содержать аминокислотные остатки, характерные для Alb-23 и его вариантов, как описано в WO 12/175400 (т.е. аминокислотный мотив GP в положениях 44 и 45, аминокислотный мотив SKN в положениях 74-76 и предпочтительно G в положении 16, а также необязательно R в положении 83). Кроме того: (i) в положении 41 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-6 WO 08/020079 для положения 41, в частности, это может быть (или выбран из них) пролин (Р), серин (S), треонин (Т), аланин (А) или лейцин (L), то есть из числа тех аминокислотных остатков, которые чаще всего встречаются в этом положении у людей или у лам, а более предпочтительно это может быть пролин (P) или аланин (A); и/или (ii) в положении 42 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-6 WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (E); и/или (iii) в положении 87 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-7 WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (T) или аланин (A).

Как и домены V_H по изобретению, содержащие Q или K в положении 112 либо содержащие T в положении 89, домены V_H по изобретению, содержащие L в положении 89 и V в положении 11, проявляют снижение связывания предсуществующих антител, в частности, таких предсуществующих антител (к примеру, таких, которые встречаются в образцах от больных SLE), которые способны связываться с доменами V_H и нанотелами при наличии C-концевого удлинения. И еще следует отметить в отношении доменов V_H по изобретению, у которых в положении 89 находится L и в положении 11 находится V, что эти замены встречаются с определенной частотой в доменах V_H человека (см. табл. A-5 в WO 08/020079 для положения 11 и табл. A-7 в WO 08/020079 для положения 89).

Некоторые неограничительные примеры доменов V_H по изобретению, содержащих V в положении 11 и L в положении 89, представлены на фиг. 2 в виде SEQ ID NOs: 109-136. У этих доменов V_H последовательности, приведенные в SEQ ID NOs: 123-136, наряду с мутациями L11V и V89L, также содержат мутацию T110K. Эти домены V_H, которые связываются с сывороточным альбумином человека, содержат участки CDR, указанные здесь для предпочтительных доменов V_H по изобретению, связывающихся с сывороточным альбумином.

В следующем аспекте изобретение касается доменов V_H (в частности, доменов V_H, представляющих собой ISVD, более предпочтительно доменов V_H, представляющих собой нанотела), в которых:

- аминокислотный остаток в положении 11 представлен V;

- аминокислотный остаток в положении 14 представлен A или P;

- аминокислотный остаток в положении 41 представлен A или P;

- аминокислотный остаток в положении 89 представлен L;

- аминокислотный остаток в положении 108 представлен Q или L;

- аминокислотный остаток в положении 110 представлен T, K или Q; и

- аминокислотный остаток в положении 112 представлен S, K или Q;

причем такие домены V_H необязательно содержат C-концевое удлинение (X)_n, где n равно 1-10, предпочтительно 1-5, как-то 1, 2, 3, 4 или 5 (а предпочтительно 1 или 2, как-то 1); а каждый X означает (предпочтительно встречающийся в природе) аминокислотный остаток, который выбран независимо, а предпочтительно выбран независимо из группы, состоящей из аланина (A), глицина (G), валина (V), лейцина (L) и изолейцина (I) (а C-концевое удлинение предпочтительно является таким, как описано здесь). Кроме того: (i) в положении 42 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-6 WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (E); и/или (ii) в положении 87 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-7 WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (T) или аланин (A). Предпочтительно у доменов V_H согласно этому аспекту аминокислотный остаток в положении 110 представлен T, а аминокислотный остаток в положении 112 представлен S. Опять же, как и с другими доменами V_H по изобретению, такие домены V_H могут быть направлены против любой подходящей мишени (в частности, терапевтически значимой мишени). В соответствии с одним конкретным аспектом, такие домены V_H направлены против сывороточного альбумина.

В следующем аспекте изобретение касается доменов V_H (в частности, доменов V_H, представляющих собой ISVD, более предпочтительно доменов V_H, представляющих собой нанотела), в которых:

- аминокислотный остаток в положении 11 представлен L, V или K;

- аминокислотный остаток в положении 14 представлен A или P;

- аминокислотный остаток в положении 41 представлен A или P;

- аминокислотный остаток в положении 89 представлен T, V или L;

- аминокислотный остаток в положении 108 представлен Q или L;

- аминокислотный остаток в положении 110 представлен T, K или Q; и

- аминокислотный остаток в положении 112 представлен S, K или Q;

причем либо (i) аминокислотный остаток в положении 112 представлен K или Q; и/или (ii) аминокислотный остаток в положении 89 представлен T; и/или (iii) аминокислотный остаток в положении 89 представлен L, а аминокислотный остаток в положении 110 представлен K или Q; и (iv) в каждом из случаев (i)-(iii) аминокислота в положении 11 предпочтительно представлена V;

при этом такие домены V_H необязательно содержат C-концевое удлинение (X)_n, где n равно 1-10, предпочтительно 1-5, как-то 1, 2, 3, 4 или 5 (а предпочтительно 1 или 2, как-то 1); а каждый X означает (предпочтительно встречающийся в природе) аминокислотный остаток, который выбран независимо, а предпочтительно выбран независимо из группы, состоящей из аланина (A), глицина (G), валина (V), лейцина (L) и изолейцина (I) (а C-концевое удлинение предпочтительно является таким, как описано здесь). Кроме того: (i) в положении 42 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-6 WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (E); и/или (ii) в положении 87 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-7 WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (T) или аланин (A). Другой аспект изобретения касается доменов V_H (в частности, доменов V_H, представляющих собой ISVD, более предпочтительно доменов V_H, представляющих собой нанотела), которые являются такими, как описано в данном абзаце, причем аминокислотный остаток в положении 11 представлен V, а аминокислотный остаток в положении 110 представлен K или Q (при этом аминокислотные остатки в положениях 14, 41, 89, 108 и 112 могут быть такими, как указано в приведенном выше маркированном списке, аминокислотные остатки в положениях 42 и 87 могут быть, к примеру, такими, как описано в данном абзаце, а домен V_H может необязательно содержать C-концевое удлинение (X)_n, как описано в данном абзаце).

В следующем аспекте изобретение касается доменов V_H (в частности, доменов V_H, представляющих собой ISVD, более предпочтительно доменов V_H, представляющих собой нанотела), в которых:

- аминокислотный остаток в положении 11 представлен L, V или K;

- аминокислотный остаток в положении 14 представлен A или P;

- аминокислотный остаток в положении 41 представлен A или P;

- аминокислотный остаток в положении 89 представлен T, V или L;

- аминокислотный остаток в положении 108 представлен Q или L;

- аминокислотный остаток в положении 110 представлен T, K или Q; и

- аминокислотный остаток в положении 112 представлен S, K или Q;

причем либо (i) аминокислотный остаток в положении 112 представлен K или Q, в положении 89 находится T, V или L (предпочтительно V), а аминокислотный остаток в положении 110 представлен T, K или Q (предпочтительно T); и/или (ii) аминокислотный остаток в положении 89 представлен T, аминокислотный остаток в положении 112 представлен S, K или Q (предпочтительно S), а аминокислотный остаток в положении 110 представлен T, K или Q (предпочтительно T); и/или (iii) аминокислотный остаток в положении 89 представлен L, аминокислотный остаток в положении 110 представлен K или Q, а аминокислотный остаток в положении 112 представлен S, K или Q (предпочтительно S); и (iv) в каждом из случаев (i)-(iii) аминокислота в положении 11 предпочтительно представлена V;

при этом такие домены V_H необязательно содержат C-концевое удлинение (X)_n, где n равно 1-10, предпочтительно 1-5, как-то 1, 2, 3, 4 или 5 (а предпочтительно 1 или 2, как-то 1); а каждый X означает (предпочтительно встречающийся в природе) аминокислотный остаток, который выбран независимо, а предпочтительно выбран независимо из группы, состоящей из аланина (A), глицина (G), валина (V), лейцина (L) и изолейцина (I) (а C-концевое удлинение предпочтительно является таким, как описано здесь). Кроме того: (i) в положении 42 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-6 WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (E); и/или (ii) в положении 87 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-7 WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (T) или аланин (A). Другой аспект изобретения касается доменов V_H (в частности, доменов V_H, представляющих собой ISVD, более предпочтительно доменов V_H, представляющих собой нанотела), которые являются такими, как описано в данном абзаце, причем аминокислотный остаток в положении 11 представлен V, а аминокислотный остаток в положении 110 представлен K или Q (при этом аминокислотные остатки в положениях 14, 41, 89, 108 и 112 могут быть такими, как указано в приведенном выше маркированном списке, аминокислотные остатки в положениях 42 и 87 могут быть, к примеру, такими, как описано в данном абзаце, а домен V_H может необязательно содержать C-концевое удлинение (X)_n, как описано в данном абзаце).

В следующем аспекте изобретение касается доменов V_H (в частности, доменов V_H, представляющих собой ISVD, более предпочтительно доменов V_H, представляющих собой нанотела), в которых:

- аминокислотный остаток в положении 11 представлен L, V или K;

- аминокислотный остаток в положении 14 представлен A или P;

- аминокислотный остаток в положении 41 представлен A или P;

- аминокислотный остаток в положении 89 представлен T, V или L;

- аминокислотный остаток в положении 108 представлен Q или L;

- аминокислотный остаток в положении 110 представлен T, K или Q; и

- аминокислотный остаток в положении 112 представлен S, K или Q;

причем либо (i) аминокислотный остаток в положении 112 представлен K или Q; либо (ii) аминокислотный остаток в положении 89 представлен T; либо (iii) аминокислотный остаток в положении 89 представлен L, а аминокислотный остаток в положении 110 представлен K или Q; и (iv) в каждом из случаев (i)-(iii) аминокислота в положении 11 предпочтительно представлена V;

при этом такие домены V_H необязательно содержат C-концевое удлинение (X)_n, где n равно 1-10, предпочтительно 1-5, как-то 1, 2, 3, 4 или 5 (а предпочтительно 1 или 2, как-то 1); а каждый X означает (предпочтительно встречающийся в природе) аминокислотный остаток, который выбран независимо, а предпочтительно выбран независимо из группы, состоящей из аланина (A), глицина (G), валина (V), лейцина (L) и изолейцина (I) (а C-концевое удлинение предпочтительно является таким, как описано здесь). Кроме того: (i) в положении 42 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-6 WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (E); и/или (ii) в положении 87 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-7 WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (T) или аланин (A). Другой аспект изобретения касается доменов V_H (в частности, доменов V_H, представляющих собой ISVD, более предпочтительно доменов V_H, представляющих собой нанотела), которые являются такими, как описано в данном абзаце, причем аминокислотный остаток в положении 11 представлен V, а аминокислотный остаток в положении 110 представлен K или Q (при этом аминокислотные остатки в положениях 14, 41, 89, 108 и 112 могут быть такими, как указано в приведенном выше маркированном списке, аминокислотные остатки в положениях 42 и 87 могут быть, к примеру, такими, как описано в данном абзаце, а домен V_H может необязательно содержать C-концевое удлинение (X)_n, как описано в данном абзаце).

В следующем аспекте изобретение касается доменов V_H (в частности, доменов V_H, представляющих собой ISVD, более предпочтительно доменов V_H, представляющих собой нанотела), в которых:

- аминокислотный остаток в положении 11 представлен L, V или K;

- аминокислотный остаток в положении 14 представлен A или P;

- аминокислотный остаток в положении 41 представлен A или P;

- аминокислотный остаток в положении 89 представлен T, V или L;

- аминокислотный остаток в положении 108 представлен Q или L;

- аминокислотный остаток в положении 110 представлен T, K или Q; и

- аминокислотный остаток в положении 112 представлен S, K или Q;

причем либо (i) аминокислотный остаток в положении 112 представлен K или Q, в положении 89 находится T, V или L (предпочтительно V), а аминокислотный остаток в положении 110 представлен T, K или Q (предпочтительно T); либо (ii) аминокислотный остаток в положении 89 представлен T, аминокислотный остаток в положении 112 представлен S, K или Q (предпочтительно S), а аминокислотный остаток в положении 110 представлен T, K или Q (предпочтительно T); либо (iii) аминокислотный остаток в положении 89 представлен L, аминокислотный остаток в положении 110 представлен K или Q, а аминокислотный остаток в положении 112 представлен S, K или Q (предпочтительно S); и (iv) в каждом из случаев (i)-(iii) аминокислота в положении 11 предпочтительно представлена V;

при этом такие домены V_H необязательно содержат C-концевое удлинение (X)_n, где n равно 1-10, предпочтительно 1-5, как-то 1, 2, 3, 4 или 5 (а предпочтительно 1 или 2, как-то 1); а каждый X означает (предпочтительно встречающийся в природе) аминокислотный остаток, который выбран независимо, а предпочтительно выбран независимо из группы, состоящей из аланина (A), глицина (G), валина (V), лейцина (L) и изолейцина (I) (а C-концевое удлинение предпочтительно является таким, как описано здесь). Кроме того: (i) в положении 42 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-6 WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (E); и/или (ii) в положении 87 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-7 WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (T) или аланин (A). Другой аспект изобретения касается доменов V_H (в частности, доменов V_H, представляющих собой ISVD, более предпочтительно доменов V_H, представляющих собой нанотела), которые являются такими, как описано в данном абзаце, причем аминокислотный остаток в положении 11 представлен V, а аминокислотный остаток в положении 110 представлен K или Q (при этом аминокислотные остатки в положениях 14, 41, 89, 108 и 112 могут быть такими, как указано в приведенном выше маркированном списке, аминокислотные остатки в положениях 42 и 87 могут быть, к примеру, такими, как описано в данном абзаце, а домен V_H может необязательно содержать C-концевое удлинение (X)_n, как описано в данном абзаце).

В следующем аспекте изобретение касается доменов V_H (в частности, доменов V_H, представляющих собой ISVD, более предпочтительно доменов V_H, представляющих собой нанотела), в которых:

- аминокислотный остаток в положении 11 представлен L, V или K;

- аминокислотный остаток в положении 14 представлен A или P;

- аминокислотный остаток в положении 41 представлен A или P;

- аминокислотный остаток в положении 89 представлен T, V или L;

- аминокислотный остаток в положении 108 представлен Q или L;

- аминокислотный остаток в положении 110 представлен T, K или Q; и

- аминокислотный остаток в положении 112 представлен S, K или Q;

причем либо (i) аминокислотный остаток в положении 112 представлен K или Q, в положении 89 находится V, а аминокислотный остаток в положении 110 представлен T; либо (ii) аминокислотный остаток в положении 89 представлен T, аминокислотный остаток в положении 112 представлен S, а аминокислотный остаток в положении 110 представлен T; либо (iii) аминокислотный остаток в положении 89 представлен L, аминокислотный остаток в положении 110 представлен K или Q, а аминокислотный остаток в положении 112 представлен S (предпочтительно S); и (iv) в каждом из случаев (i)-(iii) аминокислота в положении 11 предпочтительно представлена V;

при этом такие домены V_H необязательно содержат C-концевое удлинение (X)_n, где n равно 1-10, предпочтительно 1-5, как-то 1, 2, 3, 4 или 5 (а предпочтительно 1 или 2, как-то 1); а каждый X означает (предпочтительно встречающийся в природе) аминокислотный остаток, который выбран независимо, а предпочтительно выбран независимо из группы, состоящей из аланина (A), глицина (G), валина (V), лейцина (L) и изолейцина (I) (а C-концевое удлинение предпочтительно является таким, как описано здесь). Кроме того: (i) в положении 42 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-6 WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (E); и/или (ii) в положении 87 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-7 WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (T) или аланин (A). Другой аспект изобретения касается доменов V_H (в частности, доменов V_H, представляющих собой ISVD, более предпочтительно доменов V_H, представляющих собой нанотела), которые являются такими, как описано в данном абзаце, причем аминокислотный остаток в положении 11 представлен V, а аминокислотный остаток в положении 110 представлен K или Q (при этом аминокислотные остатки в положениях 14, 41, 89, 108 и 112 могут быть такими, как указано в приведенном выше маркированном списке, аминокислотные остатки в положениях 42 и 87 могут быть, к примеру, такими, как описано в данном абзаце, а домен V_H может необязательно содержать C-концевое удлинение (X)_n, как описано в данном абзаце).

В следующем аспекте изобретение касается доменов V_H (в частности, доменов V_H, представляющих собой ISVD, более предпочтительно доменов V_H, представляющих собой нанотела), в которых:

- аминокислотный остаток в положении 11 представлен L, V или K;

- аминокислотный остаток в положении 14 представлен A или P;

- аминокислотный остаток в положении 41 представлен A или P;

- аминокислотный остаток в положении 89 представлен T, V или L;

- аминокислотный остаток в положении 108 представлен Q или L;

- аминокислотный остаток в положении 110 представлен T, K или Q; и

- аминокислотный остаток в положении 112 представлен S, K или Q;

причем либо (i) аминокислотный остаток в положении 112 представлен K или Q; и/или (ii) аминокислотный остаток в положении 89 представлен T; и/или (iii) аминокислотный остаток в положении 89 представлен L, а аминокислотный остаток в положении 110 представлен K или Q; и (iv) в каждом из случаев (i)-(iii) аминокислота в положении 11 предпочтительно представлена V;

при этом такие домены V_H необязательно содержат C-концевое удлинение (X)_n, где n равно 1-10, предпочтительно 1-5, как-то 1, 2, 3, 4 или 5 (а предпочтительно 1 или 2, как-то 1); а каждый X означает (предпочтительно встречающийся в природе) аминокислотный остаток, который выбран независимо, а предпочтительно выбран независимо из группы, состоящей из аланина (A), глицина (G), валина (V), лейцина (L) и изолейцина (I) (а C-концевое удлинение предпочтительно является таким, как описано здесь). Кроме того: (i) в положении 42 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-6 WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (E); и/или (ii) в положении 87 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-7 WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (T) или аланин (A). Другой аспект изобретения касается доменов V_H (в частности, доменов V_H, представляющих собой ISVD, более предпочтительно доменов V_H, представляющих собой нанотела), которые являются такими, как описано в данном абзаце, причем аминокислотный остаток в положении 11 представлен V, а аминокислотный остаток в положении 110 представлен K или Q (при этом аминокислотные остатки в положениях 14, 41, 89, 108 и 112 могут быть такими, как указано в приведенном выше маркированном списке, аминокислотные остатки в положениях 42 и 87 могут быть, к примеру, такими, как описано в данном абзаце, а домен V_H может необязательно содержать C-концевое удлинение (X)_n, как описано в данном абзаце).

В следующем аспекте изобретение касается доменов V_H (в частности, доменов V_H, представляющих собой ISVD, более предпочтительно доменов V_H, представляющих собой нанотела), в которых:

- аминокислотный остаток в положении 11 представлен L, V или K;

- аминокислотный остаток в положении 14 представлен A или P;

- аминокислотный остаток в положении 41 представлен A или P;

- аминокислотный остаток в положении 89 представлен T, V или L;

- аминокислотный остаток в положении 108 представлен Q или L;

- аминокислотный остаток в положении 110 представлен T, K или Q; и

- аминокислотный остаток в положении 112 представлен S, K или Q;

причем либо (i) аминокислотный остаток в положении 112 представлен K или Q, в положении 89 находится T, V или L (предпочтительно V), а аминокислотный остаток в положении 110 представлен T, K или Q (предпочтительно T); и/или (ii) аминокислотный остаток в положении 89 представлен T, аминокислотный остаток в положении 112 представлен S, K или Q (предпочтительно S), а аминокислотный остаток в положении 110 представлен T, K или Q (предпочтительно T); и/или (iii) аминокислотный остаток в положении 89 представлен L, аминокислотный остаток в положении 110 представлен K или Q, а аминокислотный остаток в положении 112 представлен S, K или Q (предпочтительно S); и (iv) в каждом из случаев (i)-(iii) аминокислота в положении 11 предпочтительно представлена V;

при этом такие домены V_H необязательно содержат C-концевое удлинение (X)_n, где n равно 1-10, предпочтительно 1-5, как-то 1, 2, 3, 4 или 5 (а предпочтительно 1 или 2, как-то 1); а каждый X означает (предпочтительно встречающийся в природе) аминокислотный остаток, который выбран независимо, а предпочтительно выбран независимо из группы, состоящей из аланина (A), глицина (G), валина (V), лейцина (L) и изолейцина (I) (а C-концевое удлинение предпочтительно является таким, как описано здесь). Кроме того: (i) в положении 42 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-6 WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (E); и/или (ii) в положении 87 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-7 WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (T) или аланин (A). Другой аспект изобретения касается доменов V_H (в частности, доменов V_H, представляющих собой ISVD, более предпочтительно доменов V_H, представляющих собой нанотела), которые являются такими, как описано в данном абзаце, причем аминокислотный остаток в положении 11 представлен V, а аминокислотный остаток в положении 110 представлен K или Q (при этом аминокислотные остатки в положениях 14, 41, 89, 108 и 112 могут быть такими, как указано в приведенном выше маркированном списке, аминокислотные остатки в положениях 42 и 87 могут быть, к примеру, такими, как описано в данном абзаце, а домен V_H может необязательно содержать C-концевое удлинение (X)_n, как описано в данном абзаце).

В следующем аспекте изобретение касается доменов V_H (в частности, доменов V_H, представляющих собой ISVD, более предпочтительно доменов V_H, представляющих собой нанотела), в которых:

- аминокислотный остаток в положении 11 представлен L, V или K;

- аминокислотный остаток в положении 14 представлен A или P;

- аминокислотный остаток в положении 41 представлен A или P;

- аминокислотный остаток в положении 89 представлен T, V или L;

- аминокислотный остаток в положении 108 представлен Q или L;

- аминокислотный остаток в положении 110 представлен T, K или Q; и

- аминокислотный остаток в положении 112 представлен S, K или Q;

причем либо (i) аминокислотный остаток в положении 112 представлен K или Q; либо (ii) аминокислотный остаток в положении 89 представлен T; либо (iii) аминокислотный остаток в положении 89 представлен L, а аминокислотный остаток в положении 110 представлен K или Q; и (iv) в каждом из случаев (i)-(iii) аминокислота в положении 11 предпочтительно представлена V;

при этом такие домены V_H необязательно содержат C-концевое удлинение (X)_n, где n равно 1-10, предпочтительно 1-5, как-то 1, 2, 3, 4 или 5 (а предпочтительно 1 или 2, как-то 1); а каждый X означает (предпочтительно встречающийся в природе) аминокислотный остаток, который выбран независимо, а предпочтительно выбран независимо из группы, состоящей из аланина (A), глицина (G), валина (V), лейцина (L) и изолейцина (I) (а C-концевое удлинение предпочтительно является таким, как описано здесь). Кроме того: (i) в положении 42 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-6 WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (E); и/или (ii) в положении 87 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-7 WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (T) или аланин (A). Другой аспект изобретения касается доменов V_H (в частности, доменов V_H, представляющих собой ISVD, более предпочтительно доменов V_H, представляющих собой нанотела), которые являются такими, как описано в данном абзаце, причем аминокислотный остаток в положении 11 представлен V, а аминокислотный остаток в положении 110 представлен K или Q (при этом аминокислотные остатки в положениях 14, 41, 89, 108 и 112 могут быть такими, как указано в приведенном выше маркированном списке, аминокислотные остатки в положениях 42 и 87 могут быть, к примеру, такими, как описано в данном абзаце, а домен V_H может необязательно содержать C-концевое удлинение (X)_n, как описано в данном абзаце).

В следующем аспекте изобретение касается доменов V_H (в частности, доменов V_H, представляющих собой ISVD, более предпочтительно доменов V_H, представляющих собой нанотела), в которых:

- аминокислотный остаток в положении 11 представлен L, V или K;

- аминокислотный остаток в положении 14 представлен A или P;

- аминокислотный остаток в положении 41 представлен A или P;

- аминокислотный остаток в положении 89 представлен T, V или L;

- аминокислотный остаток в положении 108 представлен Q или L;

- аминокислотный остаток в положении 110 представлен T, K или Q; и

- аминокислотный остаток в положении 112 представлен S, K или Q;

причем либо (i) аминокислотный остаток в положении 112 представлен K или Q, в положении 89 находится T, V или L (предпочтительно V), а аминокислотный остаток в положении 110 представлен T, K или Q (предпочтительно T); либо (ii) аминокислотный остаток в положении 89 представлен T, аминокислотный остаток в положении 112 представлен S, K или Q (предпочтительно S), а аминокислотный остаток в положении 110 представлен T, K или Q (предпочтительно T); либо (iii) аминокислотный остаток в положении 89 представлен L, аминокислотный остаток в положении 110 представлен K или Q, а аминокислотный остаток в положении 112 представлен S, K или Q (предпочтительно S); и (iv) в каждом из случаев (i)-(iii) аминокислота в положении 11 предпочтительно представлена V;

при этом такие домены V_H необязательно содержат C-концевое удлинение (X)_n, где n равно 1-10, предпочтительно 1-5, как-то 1, 2, 3, 4 или 5 (а предпочтительно 1 или 2, как-то 1); а каждый X означает (предпочтительно встречающийся в природе) аминокислотный остаток, который выбран независимо, а предпочтительно выбран независимо из группы, состоящей из аланина (A), глицина (G), валина (V), лейцина (L) и изолейцина (I) (а C-концевое удлинение предпочтительно является таким, как описано здесь). Кроме того: (i) в положении 42 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-6 WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (E); и/или (ii) в положении 87 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-7 WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (T) или аланин (A). Другой аспект изобретения касается доменов V_H (в частности, доменов V_H, представляющих собой ISVD, более предпочтительно доменов V_H, представляющих собой нанотела), которые являются такими, как описано в данном абзаце, причем аминокислотный остаток в положении 11 представлен V, а аминокислотный остаток в положении 110 представлен K или Q (при этом аминокислотные остатки в положениях 14, 41, 89, 108 и 112 могут быть такими, как указано в приведенном выше маркированном списке, аминокислотные остатки в положениях 42 и 87 могут быть, к примеру, такими, как описано в данном абзаце, а домен V_H может необязательно содержать C-концевое удлинение (X)_n, как описано в данном абзаце).

В следующем аспекте изобретение касается доменов V_H (в частности, доменов V_H, представляющих собой ISVD, более предпочтительно доменов V_H, представляющих собой нанотела), в которых:

- аминокислотный остаток в положении 11 представлен L, V или K;

- аминокислотный остаток в положении 14 представлен A или P;

- аминокислотный остаток в положении 41 представлен A или P;

- аминокислотный остаток в положении 89 представлен T, V или L;

- аминокислотный остаток в положении 108 представлен Q или L;

- аминокислотный остаток в положении 110 представлен T, K или Q; и

- аминокислотный остаток в положении 112 представлен S, K или Q;

причем либо (i) аминокислотный остаток в положении 112 представлен K или Q, в положении 89 находится V, а аминокислотный остаток в положении 110 представлен T; либо (ii) аминокислотный остаток в положении 89 представлен T, аминокислотный остаток в положении 112 представлен S, а аминокислотный остаток в положении 110 представлен T; либо (iii) аминокислотный остаток в положении 89 представлен L, аминокислотный остаток в положении 110 представлен K или Q, а аминокислотный остаток в положении 112 представлен S (предпочтительно S); и (iv) в каждом из случаев (i)-(iii) аминокислота в положении 11 предпочтительно представлена V;

при этом такие домены V_H необязательно содержат C-концевое удлинение (X)_n, где n равно 1-10, предпочтительно 1-5, как-то 1, 2, 3, 4 или 5 (а предпочтительно 1 или 2, как-то 1); а каждый X означает (предпочтительно встречающийся в природе) аминокислотный остаток, который выбран независимо, а предпочтительно выбран независимо из группы, состоящей из аланина (A), глицина (G), валина (V), лейцина (L) и изолейцина (I) (а C-концевое удлинение предпочтительно является таким, как описано здесь). Кроме того: (i) в положении 42 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-6 WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (E); и/или (ii) в положении 87 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-7 WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (T) или аланин (A). Другой аспект изобретения касается доменов V_H (в частности, доменов V_H, представляющих собой ISVD, более предпочтительно доменов V_H, представляющих собой нанотела), которые являются такими, как описано в данном абзаце, причем аминокислотный остаток в положении 11 представлен V, а аминокислотный остаток в положении 110 представлен K или Q (при этом аминокислотные остатки в положениях 14, 41, 89, 108 и 112 могут быть такими, как указано в приведенном выше маркированном списке, аминокислотные остатки в положениях 42 и 87 могут быть, к примеру, такими, как описано в данном абзаце, а домен V_H может необязательно содержать C-концевое удлинение (X)_n, как описано в данном абзаце).

Опять же, в доменах V_H по изобретению, как определено здесь, аминокислотные остатки в положениях, которые прямо не определены здесь, могут быть любые аминокислотные остатки, которые подходят в таких положениях для доменов V_H, в частности, для ISVD, более предпочтительно для нанотел (включая гуманизованные домены V_HH). Сошлемся опять же на приведенные здесь работы предшествующего уровня техники, такие, к примеру, как табл. A-3 и от A-5 до A-8 в WO 08/020079. Предпочтительно, в каждом случае аминокислотный остаток в положении 11 представлен L или V, более предпочтительно V. Кроме того: (i) в положении 41 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-6 WO 08/020079 для положения 41, в частности, это может быть (или выбран из них) пролин (Р), серин (S), треонин (Т), аланин (А) или лейцин (L), то есть из числа тех аминокислотных остатков, которые чаще всего встречаются в этом положении у людей или у лам, а более предпочтительно это может быть пролин (P) или аланин (A); и/или (ii) в положении 42 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-6 WO 08/020079 для положения 42, в частности, это может быть (или выбран из них) глицин (G) или глутаминовая кислота (E); и/или (iii) в положении 87 может быть, к примеру, один из аминокислотных остатков (т.е. остатков V_H3 человека и/или остатков верблюжьих V_HH), приведенных в табл. A-7 WO 08/020079 для положения 87, в частности, это может быть (или выбран из них) треонин (T) или аланин (A).

Кроме того, такие домены V_H по изобретению могут быть направлены против любой подходящей мишени, в особенности терапевтической мишени. В одном аспекте они направлены против сывороточного белка человека типа сывороточного альбумина человека.

Изобретение также касается белков, полипептидов, конструкций, соединений или других химических субстанций, содержащих по меньшей мере один домен V_H по изобретению (собирательно они также упоминаются здесь как “соединения по изобретению”).

Как описано далее, в соответствии с одним конкретным аспектом, у соединений по изобретению домен V_H по изобретению находится на/образует их C-терминальный конец. В таком случае домен V_H по изобретению, образующий/находящийся на C-терминальном конце соединения по изобретению, предпочтительно имеет C-концевое удлинение, как описано здесь.

Также как описано далее, соединения по изобретению могут представлять собой scFv, диатела или другие белки, полипептиды или конструкции, в которых один или несколько доменов V_H по изобретению связаны с одним или несколькими доменами V_L с образованием одного или нескольких функциональных антигенсвязывающих сайтов.

Однако, в соответствии с предпочтительным аспектом изобретения, домены V_H по изобретению представляют собой ISVDs, а соединения по изобретению представляют собой белки, полипептиды, конструкции, соединения или другие химические субстанции, содержащие или в основном состоящие по меньшей мере из одного ISVD по изобретению и необязательно еще одной или нескольких других аминокислотных последовательностей, группировок, связывающих доменов или связывающих блоков (соответственно связанных друг с другом, необязательно через один или несколько линкеров). В частности, такие соединения по изобретению могут содержать или в основном состоять из одного или нескольких ISVDs, из которых хотя бы один представляет собой ISVD по изобретению. Такие соединения по изобретению, в частности, могут иметь ISVD по изобретению на C-терминальном конце, в этом случае ISVD по изобретению также предпочтительно имеет C-концевое удлинение, как описано здесь. Кроме того, если такое соединение по изобретению содержит два или несколько ISVD, то эти два или несколько или практически все ISVD могут быть ISVD по изобретению (т.е. каждый может иметь по меньшей мере одну из следующих замен аминокислотных остатков: 112K, 112Q, S112K, S112Q, 89T и/или V89T или же сочетание V89L с T110K или T110Q; и необязательно еще одну или несколько других замен, приведенных здесь для ISVD по изобретению, как-то L11V). Кроме того, у таких соединений по изобретению ISVD по изобретению предпочтительно представлены нанотелами по изобретению, причем все или практически все ISVD в соединении по изобретению могут быть (а предпочтительно являются) нанотелами (в частности, нанотелами по изобретению, то есть каждое может иметь по меньшей мере одну из следующих замен аминокислотных остатков: 112K, 112Q, S112K, S112Q, 89T и/или V89T или же сочетание V89L с T110K или T110Q; и необязательно еще одну или несколько других замен, приведенных здесь для нанотел по изобретению, как-то L11V). Примеры таких соединений по изобретению должны быть понятны специалистам, исходя из дальнейшего описания.

Некоторые неограничительные примеры белков, полипептидов, конструкций, соединений или других химических субстанций, содержащих один или несколько ISVD (в том числе хотя бы один ISVD по изобретению), - это поливалентные, мультиспецифичные (как-то биспецифичные) или мультипаратопные (как-то бипаратопные) конструкции, содержащие два или несколько ISVD, соединенных непосредственно или через один или несколько подходящих линкеров. Опять же, эти ISVD предпочтительно представлены нанотелами. Насчет некоторых неограничительных примеров таких конструкций и общих сведений о том, как такие конструкции могут быть получены (в частности, на основе нанотел), сошлемся, к примеру, на Conrath et al., JBC 276, 10(9), 7346 (2001), а также на обзорную статью Muyldermans, Reviews in Mol. Biotechnol., 74: 27 (2001).

Например, такое соединение по изобретению, содержащее два или несколько ISVD (из которых хотя бы один является ISVD по изобретению), может быть бивалентной, тривалентной, тетравалентной или пентавалентной конструкцией, и/или может быть моноспецифичной, биспецифичной, триспецифичной конструкцией, и/или может быть бипаратопной или трипаратопной конструкцией. Сошлемся опять же на приведенные здесь работы предшествующего уровня техники по биопрепаратам на основе IVSD и на основе нанотел. Кроме того, такое соединение по изобретению может обладать увеличенным периодом полураспада при функционализации и/или при включении в конструкцию молекулы или связывающего блока, повышающего период полураспада конструкции. Примеры такой функционализации, молекул или связывающих блоков должны быть известны специалистам и могут быть такими, к примеру, как описано здесь, они могут включать, к примеру, ПЭГилирование, слияние с сывороточным альбумином или слияние с пептидом или связывающим блоком, который может связываться с сывороточным белком типа сывороточного альбумина. Такой связывающий сывороточный альбумин пептид или связывающий домен может представлять собой любой подходящий связывающий сывороточный альбумин пептид или связывающий домен, способный повышать период полураспада конструкции (по сравнению с такой же конструкцией без связывающего сывороточный альбумин пептида или связывающего домена), в частности, это могут быть связывающие сывороточный альбумин пептиды, которые описаны в WO 2008/068280 от заявителя (в особенности WO 2009/127691 и в неопубликованной заявке USA 61/301,819, обе от заявителя), или связывающие сывороточный альбумин ISV (типа связывающих сывороточный альбумин нанотел, к примеру, Alb-1 или гуманизированные варианты Alb-1 типа Alb-8, насчет которых сошлемся, к примеру, на WO 06/122787), или же ISVD по изобретению, направленные против сывороточного белка (человека) типа сывороточного альбумина человека (как уже описано здесь). Как правило, любое соединение по изобретению с увеличенным периодом полураспада предпочтительно должно иметь период полураспада (как определено здесь) у людей по меньшей мере в 1 день, предпочтительно по меньшей мере в 3 дня, более предпочтительно по меньшей мере в 7 дней, как-то по меньшей мере в 10 дней.

Когда соединение по изобретению содержит по меньшей мере один (и предпочтительно один) ISVD по изобретению (в особенности нанотело по изобретению), который направлен против сывороточного белка (человека), в частности, против сывороточного альбумина (человека), то соединение по изобретению обычно дополнительно содержит один или несколько других терапевтически активных аминокислотных последовательностей, связывающих доменов или связывающих единиц (т.е. направленных против терапевтически значимой мишени, пути или механизма), и ISVD по изобретению будет работать на увеличение своего периода полураспада (и всего соединения). Опять же, такие дополнительные терапевтически активные молекулы предпочтительно представляют собой ISVD (более предпочтительно нанотела), которыми могут быть IVSD по изобретению (более предпочтительно нанотела по изобретению). У таких соединений по изобретению, ISVD по изобретению, который направлен против сывороточного альбумина человека, опять же может находиться на или образовывать C-терминальный конец соединения, и в этом случае может содержать (и предпочтительно содержит) C-концевое удлинение, как описано здесь. Когда соединение по изобретению содержит ISVD по изобретению, который направлен против сывороточного альбумина (человека), то данное соединение должно иметь период полураспада (как определено здесь) по меньшей мере в 1 день, предпочтительно по меньшей мере в 3 дня, более предпочтительно по меньшей мере в 7 дней, как-то по меньшей мере в 10 дней у тех людей, которым оно вводится. Некоторые неограничительные примеры ISVD по изобретению против сывороточного альбумина человека, которые можно использовать для этой цели, также описаны здесь.

В одном аспекте все ISVD или нанотела, находящиеся в данном соединении по изобретению, представлены ISVD по изобретению (это значит, что они содержат замены аминокислотных остатков, которые характерны для доменов V_H по изобретению, как определено здесь, т. е. по меньшей мере 112K или Q, либо по меньшей мере 89T, либо по меньшей мере 89L в сочетании с 110K или 110Q). Когда все ISVD у соединения по изобретению представлены ISVD по изобретению, то они могут содержать одни и те же замены (например, один может иметь замену S112K или S112Q, а другой может иметь мутацию V89L в сочетании с T110K или T110Q). Кроме того, обычно только ISVD на C-терминальном конце соединения по изобретению содержит C-концевое удлинение (так как остальные должны будут соединяться по C-терминальному концу с другим ISVD, присутствующим в этом соединении).

Итак, в следующем аспекте изобретение касается белков, полипептидов или других соединений или молекул, содержащих или в основном состоящих из ISVD по изобретению (как уже описано здесь).

Изобретение также касается белков, полипептидов или других соединений или молекул, содержащих по меньшей мере один ISVD по изобретению и по меньшей мере еще одну другую терапевтическую молекулу или субстанцию (которая соединяется непосредственно или через подходящий линкер).

Изобретение также касается белков, полипептидов или других соединений или молекул, содержащих по меньшей мере один ISVD по изобретению, направленный против сывороточного белка (человека) (а предпочтительно против сывороточного альбумина человека), и по меньшей мере еще одну другую терапевтическую молекулу или субстанцию (которая соединяется непосредственно или через подходящий линкер).

Изобретение также касается белков, полипептидов или других соединений или молекул, содержащих по меньшей мере два (как-то 2, 3 или 4) одиночных вариабельных домена иммуноглобулина (соединенных непосредственно или через подходящий линкер), из которых по меньшей мере один представлен ISVD по изобретению. В этом аспекте: (i) присутствующие ISVD могут быть одинаковыми или разными; а когда они различны, то они могут быть направлены против одной и той же мишени (к примеру, они могут иметь различные последовательности и/или могут быть направлены против разных эпитопов на той же мишени) или против двух или нескольких различных мишеней (т.е. полученный при этом белок, полипептид, другое соединение или молекула будет би- или мультиспецифичной конструкцией); и/или (ii) ISVD, находящийся на C-терминальном конце белка, полипептида или другого соединения или молекулы, может быть или не быть ISVD по изобретению (но предпочтительно является); и/или (iii) когда ISVD по изобретению находится на C-терминальном конце белка, полипептида или другого соединения или молекулы, то он предпочтительно содержит C-концевое удлинение, как описано здесь; и/или (iv) практически все ISVD из присутствующих в белке, полипептиде или другом соединении или молекуле могут представлять собой ISVD по изобретению. Кроме того, когда ISVD направлены против разных мишеней (из которых по меньшей мере одна является терапевтической мишенью), в соответствии со следующим аспектом, по меньшей мере один из присутствующих ISVD может быть направлен против сывороточного белка (человека) типа сывороточного альбумина человека (причем этот ISVD может быть или не быть ISVD по изобретению; а когда это ISVD по изобретению, то он предпочтительно представлен нанотелом против сывороточного альбумина человека, которое уже описано здесь).

Изобретение также касается таких белков, полипептидов или других соединений или молекул, которые содержат или в основном состоят из двух одиночных вариабельных доменов иммуноглобулина (соединенных непосредственно или через подходящий линкер).

Изобретение также касается таких белков, полипептидов или других соединений или молекул, которые содержат или в основном состоят из трех одиночных вариабельных доменов иммуноглобулина (соединенных непосредственно или через подходящий линкер).

Изобретение также касается таких белков, полипептидов или других соединений или молекул, которые содержат или в основном состоят из четырех одиночных вариабельных доменов иммуноглобулина (соединенных непосредственно или через подходящий линкер).

Изобретение также касается таких белков, полипептидов или других соединений или молекул, которые дополнительно содержат по меньшей мере одну группировку, один связывающий домен или связывающий блок, которые придают повышенное время полураспада данному белку, полипептиду, другому соединению или молекуле (т.е. по сравнению с соответствующим белком, полипептидом, другим соединением или молекулой без такой группировки, связывающего домена или связывающего блока). В соответствии с более конкретным аспектом, данная по меньшей мере одна группировка, связывающий домен или связывающий блок, которые придают повышенное время полураспада данному белку, полипептиду, другому соединению или молекуле, представляет собой одиночный вариабельный домен иммуноглобулина, более предпочтительно такой одиночный вариабельный домен иммуноглобулина, который направлен против сывороточного белка (типа сывороточного альбумина), предпочтительно против сывороточного белка человека (типа сывороточного альбумина человека); которым, как описано здесь, в частности, может быть ISVD по изобретению. Такой ISVD против сывороточного белка может находиться на N-терминальном конце белка, полипептида, другого соединения или молекулы, на C-терминальном конце или (если белок, полипептид или другое соединение или молекула содержат более двух ISVD) в середине молекулы.

Изобретение также касается таких белков, полипептидов или других соединений или молекул, которые содержат или в основном состоят из:

- двух одиночных вариабельных доменов иммуноглобулина (соединенных непосредственно или через подходящий линкер), т.е. (данного) одного одиночного вариабельного домена иммуноглобулина (типа нанотела), придающего повышенное время полураспада, и одного другого вариабельного домена иммуноглобулин (типа нанотела), который, в частности, может быть направлен против терапевтической мишени;

- трех одиночных вариабельных доменов иммуноглобулина (соединенных непосредственно или через подходящий линкер), т.е. (данного) одного одиночного вариабельного домена иммуноглобулина (типа нанотела), придающего повышенное время полураспада, и двух других одиночных вариабельных доменов иммуноглобулина (как-то двух других нанотел), которые, в частности, могут быть направлены против терапевтической мишени (при этом данные два других одиночных вариабельных домена иммуноглобулина могут быть направлены против одной и той же мишени, против двух разных мишеней или против двух разных эпитопов на одной и той же мишени); или

- четырех одиночных вариабельных доменов иммуноглобулина (соединенных непосредственно или через подходящий линкер), т.е. (данного) одного одиночного вариабельного домена иммуноглобулина (типа нанотела), придающего повышенное время полураспада, и трех других одиночных вариабельных доменов иммуноглобулина (как-то трех других нанотел), которые, в частности, могут быть направлены против терапевтической мишени (при этом данные три других одиночных вариабельных домена иммуноглобулина могут быть направлены против одной и той же мишени, против двух или трех разных мишеней и/или против двух или трех разных эпитопов на одной и той же мишени).

Опять же, у таких белков, полипептидов или других соединений или молекул: (i) присутствующие ISVD могут быть одинаковыми или разными; а когда они различны, то они могут быть направлены против одной и той же мишени (к примеру, они могут иметь различные последовательности и/или могут быть направлены против разных эпитопов на той же мишени) или против двух или нескольких различных мишеней (т.е. полученный при этом белок, полипептид, другое соединение или молекула будет би- или мультиспецифичной конструкцией); и/или (ii) ISVD, находящийся на C-терминальном конце белка, полипептида или другого соединения или молекулы, может быть или не быть ISVD по изобретению (но предпочтительно является); и/или (iii) когда ISVD по изобретению находится на C-терминальном конце белка, полипептида или другого соединения или молекулы, то он предпочтительно содержит C-концевое удлинение, как описано здесь; и/или (iv) практически все ISVD из присутствующих в белке, полипептиде или другом соединении или молекуле могут представлять собой ISVD по изобретению.

Изобретение также касается способов экспрессии/продукции/получения доменов V_H по изобретению и соединений по изобретению (которые уже описаны здесь). Например, домен V_H по изобретению можно экспрессировать/получать путем экспрессирования кодирующей его нуклеиновой кислоты в подходящем организме хозяина. Сошлемся, к примеру, на WO 08/020079 (а также на некоторые другие патентные заявки от заявителя/правопреемника, приведенные здесь), где в общих чертах описаны подходящие способы и методики экспрессирования/получения нанотел, которые также можно соответствующим образом использовать для экспрессии/получения нанотел по изобретению. Способы экспрессии других доменов V_H по изобретению, чем нанотела, также должны быть понятны специалистам, исходя из описания и приведенных здесь работ предыдущего уровня техники. Соединения по изобретению можно удобно получать путем соответствующего присоединения (обычно через ковалентные связи) одного или нескольких доменов V_H по изобретению к одному или нескольким другим аминокислотным остаткам (и/или другим группам или группировкам), которые должны присутствовать в конечном соединении по изобретению, необязательно через один или несколько линкеров или спейсеров. С другой стороны, если соединение по изобретению представляет собой белок или полипептид, то оно может быть получено путем подходящей экспрессии кодирующей его нуклеиновой кислоты в подходящем организме хозяина. Опять же сошлемся, к примеру, на общие методы, описанные в WO 08/020079 и в некоторых других приведенных здесь патентных заявках от заявителя/правопреемника.

Изобретение также касается последовательностей нуклеотидов и/или нуклеиновых кислот, кодирующих домены V_H по изобретению или соединения по изобретению. Такие нуклеиновые кислоты могут иметь вид плазмиды или вектора. Опять же сошлемся, к примеру, на WO 08/020079 и некоторые другие приведенные здесь патентные заявки от заявителя/правопреемника.

Изобретение также касается композиций, содержащих по меньшей мере один домен V_H по изобретению, соединение по изобретению или нуклеиновую кислоту, кодирующую то или другое.

Изобретение также касается фармацевтических композиций, содержащих ISV (предпочтительно терапевтические ISV) либо белки или полипептиды, содержащие по меньшей мере один ISV (а предпочтительно по меньшей мере один терапевтический ISV), причем данный ISV, белок или полипептид является таким, как уже описано здесь (т.е. это ISV, белок или полипептид в соответствии с одним или несколькими из описанных здесь аспектов, в частности, в соответствии с одним или несколькими аспектами, описанными на предыдущих страницах; а более предпочтительно это ISV, белок или полипептид, который имеет C-терминальный конец/последовательность в соответствии с одним или несколькими из описанных здесь аспектов), а также по меньшей мере один подходящий носитель, разбавитель или наполнитель (т.е. подходящий для фармацевтического применения) и необязательно одно или несколько других биологически активных веществ. Такие композиции, носители, разбавители или наполнители, к примеру, могут быть такими, как описано в WO 08/020079 для фармацевтических композиций, содержащих нанотела либо белки или полипептиды, содержащие по меньшей мере одно нанотело (как уже было сказано, в соответствии с настоящим изобретением, ISV также предпочтительно является нанотелом).

Изобретение также касается ISVs либо белков или полипептидов, содержащих по меньшей мере один ISV, для применения при терапии заболеваний у людей (например, у нуждающихся в такой терапии пациентов), причем данный ISV, белок или полипептид является таким, как уже описано здесь (т.е. это ISV, белок или полипептид в соответствии с одним или несколькими из описанных здесь аспектов, в частности, в соответствии с одним или несколькими аспектами, описанными на предыдущих страницах; а более предпочтительно это ISV, белок или полипептид, который имеет C-терминальный конец/последовательность в соответствии с одним или несколькими из описанных здесь аспектов).

Изобретение также касается применения ISVs либо белков или полипептидов, содержащих по меньшей мере один ISV, при получении фармацевтических композиций, причем данный ISV, белок или полипептид является таким, как уже описано здесь (т.е. это ISV, белок или полипептид в соответствии с одним или несколькими из описанных здесь аспектов, в частности, в соответствии с одним или несколькими аспектами, описанными на предыдущих страницах; а более предпочтительно это ISV, белок или полипептид, который имеет C-терминальный конец/последовательность в соответствии с одним или несколькими из описанных здесь аспектов).

Изобретение также касается способа лечения, который включает введение человеку (например, нуждающемуся в таком лечении пациенту) ISV либо белка или полипептида, содержащего по меньшей мере один ISV, при приготовлении фармацевтической композиции, причем данный ISV, белок или полипептид является таким, как уже описано здесь (т.е. это ISV, белок или полипептид в соответствии с одним или несколькими из описанных здесь аспектов, в частности, в соответствии с одним или несколькими аспектами, описанными на предыдущих страницах; а более предпочтительно это ISV, белок или полипептид, который имеет C-терминальный конец/последовательность в соответствии с одним или несколькими из описанных здесь аспектов); или фармацевтической композиции (как описано выше), содержащей по меньшей мере один такой ISV, белок или полипептид.

В отношении вышеизложенного должно быть понятно, что терапевтическое применение ISVs, белков и полипептидов, описанных здесь, является очень важным аспектом изобретения, поскольку такое терапевтическое применение (или клиническая разработка таких ISVs, белков и полипептидов для такого терапевтического применения) может включать использование анализов ADA для определения того, является ли данный ISV, белок или полипептид иммуногенным (т.е. может ли вызывать ADA при введении людям). В этой связи также должно быть понятно, что опасения по поводу возможной иммуногенности, в частности, должны рассматриваться, когда терапевтическое средство применяется в течение длительного времени (нескольких недель, месяцев или лет) и/или имеет время полураспада (предпочтительно выраженное в виде t_½-бета) в организме человека по меньшей мере в 3 дня, как-то по меньшей мере в одну неделю и вплоть до 10 дней или больше.

Так, в соответствии с одним конкретным аспектом, изобретение касается ISVs, белков, полипептидов, соединений или молекул по изобретению, как описано здесь (либо их фармацевтических композиций), которые предназначены для лечения хронических заболеваний у человека, и/или же такие ISVs, белки, полипептиды, как описано здесь, должны присутствовать в кровотоке у лиц (т.е. на фармакологически активном уровне), которым они вводятся (т.е. в терапевтически активной дозе) в течение по меньшей мере одной недели, предпочтительно по меньшей мере двух недель, как-то по меньшей мере месяца; и/или же такие ISVs, белки, полипептиды, как описано здесь, имеют время полураспада (предпочтительно выраженное в виде t_½-бета) в организме человека по меньшей мере в 3 дня, как-то по меньшей мере в одну неделю и вплоть до 10 дней или больше; и/или же такие ISVs, белки, полипептиды или фармацевтические композиции, как описано здесь, предназначены для введения человеку в виде двух или нескольких доз, которые вводятся на протяжении по меньшей мере 3 дней, как-то по меньшей мере одной недели, к примеру, по меньшей мере двух недель или по меньшей мере одного месяца и даже больше (т.е. по меньшей мере 3 месяцев, по меньшей мере 6 месяцев или по меньшей мере одного года) или же вводятся хронически.

Кроме того, как должно быть ясно специалистам из приведенного описания, производимые в доменах V_H улучшения, описанные здесь, и полученные при этом улучшенные домены V_H найдут конкретное применение в белках, полипептидах или других соединениях или молекулах, предназначенных для введения таким людям (в частности, больным), у которых в крови/сыворотке содержатся (или предположительно содержатся) предсуществующие антитела такого типа, который - в соответствии с настоящим изобретением - обнаруживается в образцах, полученных от больных SLE, т.е. предсуществующие антитела, которые могут связываться C-концевым участком домена V_H даже при наличии C-концевого удлинения, как описано здесь. В частности, производимые в доменах V_H улучшения, описанные здесь, и полученные при этом улучшенные домены V_H найдут конкретное применение в белках, полипептидах или других соединениях или молекулах, предназначенных для лечения или профилактики заболеваний или нарушений у таких больных. Это могут быть любые заболевания или нарушения, но предпочтительно такие заболевания или нарушения, которые приводят к и/или связаны с наличием или появлением таких предсуществующих антител (одним из примеров является SLE, но ожидается, что и другие тяжелые (ауто)иммунные заболевания тоже могут приводить к появлению таких предсуществующих антител). Это можно легко установить путем тестирования образцов, полученных из соответствующей популяции больных, на наличие таких предсуществующих антител, в основном таким же способом, как и тестирование, проводимое на образцах от больных SLE в приведенной ниже «Экспериментальной части».

Итак, в соответствии с одним конкретным аспектом, изобретение касается ISVs, белков, полипептидов, соединений или молекул по изобретению, как описано здесь (либо их фармацевтических композиций), которые предназначены для введения людям, в крови которых содержатся предсуществующие антитела, которые могут связываться с экспонированным C-концевым участком домена V_H даже тогда, когда данный домен V_H содержит C-концевое удлинение, как описано здесь (или когда C-терминальный конец домена V_H соединен с другим белком или полипептидом, как-то с другим ISV, необязательно через подходящий линкер).

В частности, изобретение касается ISVs, белков, полипептидов, соединений или молекул по изобретению, как описано здесь (либо их фармацевтических композиций), для применения при лечении заболеваний или нарушений у людей, в крови которых содержатся предсуществующие антитела, которые могут связываться с экспонированным C-концевым участком домена V_H даже тогда, когда данный домен V_H содержит C-концевое удлинение, как описано здесь (или когда C-терминальный конец домена V_H соединен с другим белком или полипептидом, как-то с другим ISV, необязательно через подходящий линкер). Это могут быть любые заболевания или нарушения, но предпочтительно такие заболевания или нарушения, которые приводят к, вызывают или иным образом связаны с наличием таких предсуществующих антител в крови у таких больных, как-то SLE или другие (тяжелые) аутоиммунные заболевания.

Так, в соответствии с одним конкретным аспектом, изобретение касается ISVs, белков, полипептидов, соединений или молекул по изобретению, как описано здесь (либо их фармацевтических композиций), для применения при лечении заболеваний или нарушений у людей/больных, причем это такие заболевания или нарушения, которые приводят к, вызывают или иным образом связаны с наличием таких предсуществующих антител в крови у таких лиц/больных, которые могут связываться с экспонированным C-концевым участком домена V_H даже тогда, когда данный домен V_H содержит C-концевое удлинение, как описано здесь (или когда C-терминальный конец домена V_H соединен с другим белком или полипептидом, как-то с другим ISV, необязательно через подходящий линкер). Например, таких ISVs, белков, полипептидов, соединений или молекул по изобретению, как описано здесь (либо их фармацевтических композиций), для применения при лечении SLE или других тяжелых (ауто)иммунных заболеваний у людей/больных.

Как должно быть понятно специалистам, когда белки, полипептиды, соединения или молекулы предназначены для профилактики или лечения таких заболеваний или нарушений, они должны содержать по меньшей мере один (как-то один, два, три или четыре) домен, связывающий блок или молекулу или субстанцию, которая является терапевтически активной против соответствующего заболевания или нарушения (например, направлена против мишени или пути, который является терапевтически значимым для соответствующего заболевания или нарушения). Опять же, такие связывающие домены или связывающие блоки могут представлять собой, к примеру, (другие) ISVDs, а в соответствии с одним аспектом это предпочтительно домены V_H или ISVD по изобретению. Другой общий пример такого белка, полипептида, соединения или молекулы - это белок, полипептид, соединение или молекула, в которых данный один или несколько терапевтических доменов, связывающих блоков или молекул или субстанций могут и не быть ISVDs (а, к примеру, происходить из другого остова), но содержать домен V_H по изобретению, продлевающий их период полураспада (типа связывающих сывороточный альбумин, как описано здесь).

В следующем аспекте домены V_H, ISVDs или соединения по изобретению (как описано здесь) направлены на ионный канал Kv1.3. Некоторые предпочтительные, но без ограничения, примеры таких доменов V_H, ISVDs или соединений приведены в примере 7, причем домены V_H против Kv1.3, описанные в данном примере (а также содержащие их соединения по изобретению), а также конкретные соединения по изобретению против Kv1.3, описанные в данном примере, составляют дополнительные аспекты настоящего изобретения.

Например, и без ограничения, соединение по изобретению, направленное на Kv1.3, может содержать или в основном состоять из одиночного домена V_H, а предпочтительно нанотела по изобретению, направленного против Kv1.3, или же может содержать или в основном состоять по меньшей мере из двух (как-то двух или трех) доменов V_H, а предпочтительно нанотел по изобретению, направленных против Kv1.3. Когда такой полипептид содержит два или несколько доменов V_H по изобретению против Kv1.3, то эти домены V_H могут быть одинаковыми или разными, а когда они разные, то они могут быть направлены против одного и того же эпитопа на Kv1.3 или субъединицы на Kv1.3 или же против различных эпитопов или субъединиц.

Опять же, как в общем описано здесь для соединений по изобретению, такие соединения обычно могут содержать один или несколько линкеров, могут содержать C-концевое удлинение (т.е. как уже описано здесь), а также могут содержать один или несколько дополнительных связывающих блоков или связывающих доменов (или других аминокислотных последовательностей или частей молекул), типа дополнительного ISVD, направленного против другой мишени, чем Kv1.3. Например, и без ограничения, соединения по изобретению могут (также) содержать связывающий домен или связывающий блок, обеспечивающий продленный период полураспада, как-то ISVD против сывороточного белка типа сывороточного альбумина (например, нанотело против сывороточного альбумина человека типа нанотела по изобретению против сывороточного альбумина человека).

В следующих аспектах изобретение касается (синтетических) библиотек последовательностей вариабельных доменов иммуноглобулина, которые являются такими, как описано здесь (т.е. содержат аминокислотные остатки/мутации/замены, которые описаны здесь). Такие библиотеки обычно содержат по меньшей мере 100 различных последовательностей, как-то по меньшей мере 1000 различных последовательностей, предпочтительно более 10⁵ различных последовательностей, более предпочтительно более чем 10⁶, как-то от 10⁸ до 10¹⁰ или больше различных последовательностей (что в самом широком смысле означает отличие по меньшей мере по одной аминокислоте между последовательностями), которые все обычно имеют (практически) одни и те же каркасные последовательности (причем они содержат указанные здесь аминокислотные остатки/мутации), но разные CDRs (это значит, что каждая последовательность в библиотеке имеет по меньшей мере “одно отличие по аминокислотам” по меньшей мере в одном из CDRs по сравнению с другими последовательностями в библиотеке)).

Синтетические библиотеки последовательностей вариабельных доменов иммуноглобулина (к примеру, на основе последовательностей V_H человека или последовательностей верблюжьих V_HH) и методы их получения/построения (включая библиотеки на основе заданного остова и/или содержащие один или несколько специфических аминокислотных остатков/мутаций в каркасных участках), хорошо известны в данной области. Сошлемся, к примеру, на Tanha et al., J. Biol. Chem., Vol. 276, pp. 24774-24780, 2001; Bond et al., J. Mol. Biol. (2003) 332, 643-655; Mandrup et al., PLOS One, October 2013, Volume 8, Issue 10, e76834; Goldman et al., Anal. Chem., 2006, 78, 8245-8255; Hussak et al., Protein Engineering, Design & Selection vol. 25 no. 6 pp. 313- 318, 2012; и Chen et al., Methods Mol. Biol., 2009, 525, 81. Описанные в них методы (и аналогичные методы, известные per se) можно соответствующим образом использовать или адаптировать для создания библиотек одиночных вариабельных доменов иммуноглобулина по изобретению.

Находящиеся в таких библиотеках ISVDs могут соответственно содержать любые подходящие CDRs из любого подходящего источника, как-то CDRs, полученные исходя из иммунного репертуара “наивных” млекопитающих (к примеру, последовательностей верблюжьих или человека), CDR, полученные исходя из иммунного репертуара животных (к примеру, верблюжьих), которые были соответствующим образом иммунизированы антигеном; полностью синтетических репертуаров CDR; или репертуаров, полученных такими методами, как мутагенез (к примеру, случайный мутагенез или сайт-специфичный мутагенез). Такие библиотеки также могут быть получены, к примеру, по методикам созревания аффинности, известным per se.

Каркасные участки находящихся в таких библиотеках ISVDs могут соответственно происходить из любой подходящей исходной последовательности/остова, к примеру, на основе остова, который был получен из исходной последовательности V_H (как-то последовательности V_H человека) или исходной последовательности нанотела (как-то последовательности V_HH или гуманизованной последовательности V_H). Также библиотека может содержать ISVDs, полученные из двух или нескольких разных источников или же на основе двух или нескольких различных остовов (например, потому, что библиотека была получена путем объединения двух или нескольких библиотек, полученных из различных источников или на основе различных остовов).

Кроме того, библиотеки (ISVDs, находящиеся в них) могут быть в виде белков или в виде ДНК или РНК, кодирующей соответствующие ISVDs. Например, библиотеки могут быть в виде экспрессирующей библиотеки, удобной для методов скрининга и/или отбора, и при этом могут быть, к примеру, в таком виде, который подходит для методов дисплея, типа библиотеки фагового дисплея, библиотеки дрожжевого дисплея или библиотеки рибосомного дисплея.

Итак, в общем виде изобретение также касается библиотек (как описано здесь), содержащих домены V_H по изобретению (как уже описано здесь). Предпочтительно, в соответствии с одним конкретным аспектом таких библиотек, все находящиеся в них домены V_H имеют одни и те же (или практически одни и те же) каркасные последовательности, но различные последовательности CDR (опять же, как уже отмечалось, это значит, что каждый из индивидуальных доменов V_H в библиотеке имеет по меньшей мере одно отличие по аминокислотам по меньшей мере в одном CDR по сравнению с другими доменами V_H в библиотеке).

В одном аспекте, такие библиотеки по изобретению представляют собой библиотеки ISVDs по изобретению (как уже описано здесь, включая библиотеки подходящих нуклеиновых кислот, кодирующих данные ISVDs), в которых:

- аминокислотный остаток в положении 11 представлен L, V или K;

- аминокислотный остаток в положении 14 представлен A или P;

- аминокислотный остаток в положении 41 представлен A или P;

- аминокислотный остаток в положении 89 представлен T, V или L;

- аминокислотный остаток в положении 108 представлен Q или L;

- аминокислотный остаток в положении 110 представлен T, K или Q; и

- аминокислотный остаток в положении 112 представлен S, K или Q;

причем либо (i) аминокислотный остаток в положении 112 представлен K или Q; и/или (ii) аминокислотный остаток в положении 89 представлен T; и/или (iii) аминокислотный остаток в положении 89 представлен L, а аминокислотный остаток в положении 110 представлен K или Q; и (iv) в каждом из случаев (i)-(iii) аминокислота в положении 11 предпочтительно представлена V. Необязательно ISVDs, находящиеся в такой библиотеке, также могут содержать C-концевое удлинение (как уже описано здесь для доменов V_H по изобретению) и/или соответственно содержать подходящую метку (типа гистидиновых тегов).

В другом аспекте, такие библиотеки по изобретению представляют собой библиотеки ISVDs по изобретению (как уже описано здесь, включая библиотеки подходящих нуклеиновых кислот, кодирующих данные ISVDs), в которых:

- аминокислотный остаток в положении 11 представлен V;

- аминокислотный остаток в положении 14 представлен A или P;

- аминокислотный остаток в положении 41 представлен A или P;

- аминокислотный остаток в положении 89 представлен L;

- аминокислотный остаток в положении 108 представлен Q или L;

- аминокислотный остаток в положении 110 представлен T, K или Q; и

- аминокислотный остаток в положении 112 представлен S, K или Q.

Необязательно ISVDs, находящиеся в такой библиотеке, также могут содержать C-концевое удлинение (как уже описано здесь для доменов V_H по изобретению) и/или соответственно содержать подходящую метку (типа гистидиновых тегов).

Библиотеки по изобретению могут применяться для любых подходящих целей, известных per se. Например, они могут, к примеру, применяться в целях скрининга и/или отбора (либо как часть процесса скрининга и/или отбора), применяться для/как часть методов созревании аффинности или других процессов, предназначенных для получения улучшенных доменов V_H, или же, к примеру, для сканирования по аланину. На практике, как правило, размер, дизайн и другие особенности библиотеки должны быть адаптированы к её предназначению, что находится в компетенции специалистов.

Далее изобретение будет описано более подробно при помощи нижеследующих неограничительных предпочтительных аспектов, примеров и фигур.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 представлена таблица со списком некоторых положений аминокислот, которые конкретно приводятся здесь, и их нумерация в соответствии с некоторыми альтернативными системами нумерации (как-то AHo и IMGT).

На фиг. 2 представлены приведенные здесь последовательности.

На фиг. 3 представлен график с данными, полученными в примере 4 при тестировании 96 образцов сыворотки на связывание репрезентативного нанотела с мутацией S112K (стандарт A + S112K + C-концевой аланин, что обозначено как (2) на фиг. 3), по сравнению с контрольным нанотелом без мутации S112K (стандарт A, SEQ ID NO: 44, обозначено как (1) на фиг. 3).

На фиг. 4 представлен график с данными, полученными в примере 4 при тестировании 129 образцов сыворотки на связывание репрезентативного нанотела с мутацией V89T (стандарт A + L11V + V89T + C-концевой аланин, что обозначено как (2) на фиг. 4), по сравнению с контрольным нанотелом без мутации V89T (стандарт A, SEQ ID NO: 44, обозначено как (1) на фиг. 4).

На фиг. 5 представлен график с данными, полученными в примере 5 при тестировании 100 образцов сыворотки на связывание репрезентативных нанотел с мутациями V89L, T110K и/или T110Q (стандарт A + L11V + V89L + C-концевой аланин, что обозначено как (2) на фиг. 5; стандарт A + L11V + V89L + T110K + C-концевой аланин, что обозначено как (3) на фиг. 5; стандарт A + L11V + V89L + T110Q + C-концевой аланин, что обозначено как (4) на фиг. 5; стандарт A + L11V + T87A + V89L + C-концевой аланин, что обозначено как (5) на фиг. 5), по сравнению с контрольным нанотелом без таких мутаций (стандарт A, SEQ ID NO: 44, обозначено как (1) на фиг. 5).

На фиг. 6 представлен график с данными, полученными в примере 6 при тестировании 98 образцов сыворотки от здоровых добровольцев на связывание репрезентативных конструкций тривалентных нанотел. Каждая точка представляет данные, полученные при тестировании указанной конструкции на одном из 98 образцов сыворотки. Обозначения: (1) стандарт X (нанотело A-35GS-нанотело A-35GS-нанотело B); (2) стандарт X + C-концевой Ala; (3) стандарт X + L11V + V89L + C-концевой Ala; (4) стандарт X + L11V + T87A + V89L + C-концевой Ala; (5) стандарт X + L11V + V89L + T110K + C-концевой Ala; (6) стандарт X + L11V + V89L + T110Q + C-концевой Ala.

На фиг. 7 представлен график с данными, полученными в примере 6 при тестировании 30 образцов сыворотки от здоровых добровольцев (образцы отбирали по высоким титрам предсуществующих антител или по присутствию предсуществующих антител с высокой степенью связывания даже при наличии C-концевого удлинения аланином) на связывание репрезентативных конструкций тривалентных нанотел. Каждая точка представляет данные, полученные при тестировании указанной конструкции на одном из 30 образцов сыворотки. Обозначения: (1) стандарт X + C-концевой Ala; (2) стандарт X + L11V + V89L + C-концевой Ala; (3) стандарт X + L11V + T87A + V89L + C-концевой Ala; (4) стандарт X + L11V + V89L + T110K + C-концевой Ala.

На фиг. 8 представлен график с данными, полученными в примере 6 при тестировании 98 образцов сыворотки от здоровых добровольцев на связывание репрезентативных конструкций бивалентных нанотел. Каждая точка представляет данные, полученные при тестировании указанной конструкции на одном из 98 образцов сыворотки. Обозначения: (1) стандарт Y (нанотело A-35GS-нанотело B); (2) стандарт Y + C-концевой Ala; (3) стандарт Y + L11V + V89L + C-концевой Ala; (4) стандарт Y + L11V + T87A + V89L + C-концевой Ala; (5) стандарт Y + L11V + V89L + T110K + C-концевой Ala; (6) стандарт Y + L11V + V89L + T110Q + C-концевой Ala.

На фиг. 9A и 9B представлены предпочтительные, но без ограничения, примеры моновалентных нанотел по изобретению (фиг. 9A) и тривалентных биспецифичных соединений с продленным временем полураспада по изобретению (фиг. 9B) против ионного канала Kv1.3; а на фиг. 9C перечислены некоторые предпочтительные CDRs (классификация по Kabat и AbM, соответственно) для ISVDs против Kv1.3.

На фиг. 10 представлен график с данными, полученными в примере 7 при тестировании 47 образцов сыворотки от людей с диабетом на связывание репрезентативных тривалентных биспецифичных соединений с продленным временем полураспада по изобретению против Kv1.3. Каждая точка представляет данные, полученные при тестировании указанной конструкции на одном из 47 образцов сыворотки. SEQ ID NOs относятся к соответствующим последовательностям, приведенным на фиг. 9.

На фиг. 11 представлен график с данными, полученными в примере 7 при тестировании 90 образцов сыворотки от здоровых добровольцев на связывание репрезентативных тривалентных биспецифичных соединений с продленным временем полураспада по изобретению против Kv1.3. Каждая точка представляет данные, полученные при тестировании указанной конструкции на одном из 90 образцов сыворотки. SEQ ID NOs относятся к соответствующим последовательностям, приведенным на фиг. 9.

На фиг. 12A и 12B представлены участки CDR и аминокислотные последовательности некоторых предпочтительных, без ограничения, примеров нанотел по изобретению против IL-23 на основе указанных стандартных последовательностей. См. также пример 8.

На фиг. 13 представлены участки CDR и аминокислотные последовательности некоторых предпочтительных, без ограничения, примеров нанотел по изобретению против OX40-L на основе указанной стандартной последовательности. См. также пример 9.

На фиг. 14 представлены участки CDR и аминокислотные последовательности некоторых предпочтительных, без ограничения, примеров нанотел по изобретению против IgE на основе указанной стандартной последовательности. См. также пример 10.

На фиг. 15A и 15B представлены участки CDR и аминокислотные последовательности некоторых предпочтительных, без ограничения, примеров нанотел по изобретению против CXCR-4 на основе указанных стандартных последовательностей. См. также пример 11.

На фиг. 16A и 16B представлены участки CDR и аминокислотные последовательности некоторых предпочтительных, без ограничения, примеров нанотел по изобретению против HER-3 на основе указанных стандартных последовательностей. См. также пример 12.

На фиг. 17A и 17B представлены участки CDR и аминокислотные последовательности некоторых предпочтительных, без ограничения, примеров нанотел по изобретению против TNF на основе указанных стандартных последовательностей. См. также примеры 13 и 14.

На фиг. 18A и 18B представлены участки CDR и аминокислотные последовательности некоторых предпочтительных, без ограничения, примеров нанотел по изобретению против c-Met на основе указанных стандартных последовательностей. См. также пример 15.

На фиг. 19 представлены участки CDR и аминокислотные последовательности некоторых предпочтительных, без ограничения, примеров нанотел по изобретению против RANK-L на основе указанной стандартной последовательности. См. также пример 16.

На фиг. 20A-20C представлены участки CDR и аминокислотные последовательности некоторых предпочтительных, без ограничения, примеров нанотел по изобретению против CXCR-7 на основе указанных стандартных последовательностей. См. также пример 17.

На фиг. 21A и 21B представлены участки CDR и аминокислотные последовательности некоторых предпочтительных, без ограничения, примеров нанотел по изобретению против A-бета на основе указанных стандартных последовательностей. См. также пример 18.

На фиг. 22 представлены аминокислотные последовательности некоторых предпочтительных, без ограничения, примеров соединений по изобретению против IL-23.

На фиг. 23 представлены аминокислотные последовательности некоторых предпочтительных, без ограничения, примеров соединений по изобретению против OX40-L.

На фиг. 24 представлены аминокислотные последовательности некоторых предпочтительных, без ограничения, примеров соединений по изобретению против IgE.

На фиг. 25 представлены аминокислотные последовательности некоторых предпочтительных, без ограничения, примеров соединений по изобретению против CXCR-4.

На фиг. 26 представлены аминокислотные последовательности некоторых предпочтительных, без ограничения, примеров соединений по изобретению против HER-3.

На фиг. 27 представлены аминокислотные последовательности некоторых предпочтительных, без ограничения, примеров соединений по изобретению против TNF.

На фиг. 28A и 28B представлены аминокислотные последовательности некоторых предпочтительных, без ограничения, примеров соединений по изобретению против c-Met.

На фиг. 29 представлены аминокислотные последовательности некоторых предпочтительных, без ограничения, примеров соединений по изобретению против RANK-L.

На фиг. 30 представлены аминокислотные последовательности некоторых предпочтительных, без ограничения, примеров соединений по изобретению против A-бета.

На фиг. 31A представлен график с данными, полученными в примере 19 при тестировании 92 образцов сыворотки от здоровых добровольцев на связывание репрезентативных тривалентных биспецифичных соединений с продленным временем полураспада по изобретению против A-бета. Каждая точка представляет данные, полученные при тестировании указанной конструкции на одном из 92 образцов сыворотки. Номера соответствуют приведенным в табл. CC-1. А на фиг. 31B представлен график с данными, полученными в примере 19 при тестировании 92 образцов сыворотки от здоровых добровольцев на связывание (моновалентных) C-концевых нанотел, которые присутствуют в конструкциях при тестировании на фиг. 31A. Каждая точка представляет данные, полученные при тестировании указанной конструкции на одном из 92 образцов сыворотки. Номера соответствуют приведенным в табл. CC-2.

Экспериментальная часть

Человеческие образцы, используемые ниже в «Экспериментальной части», были получены либо из коммерческих источников, либо от людей-добровольцев (после того, как были получены все необходимые согласования и разрешения), и использовались в соответствии с применимыми правовыми и регулятивными требованиями (в том числе относящимися к медицинской тайне и неприкосновенности частной жизни пациента).

В приведенных ниже примерах связывание предсуществующих антител, находящихся в используемых образцах (т.е. от здоровых добровольцев, больных ревматоидным артритом (RA) и больных SLE), с исследуемыми нанотелами определяли на установке ProteOn следующим образом.

Связывание предсуществующих антител с нанотелами, посаженными на сывороточный альбумин человека (HSA), определяли на установке ProteOn XPR36 (BioRad Laboratories, Inc.). В качестве рабочего буфера использовали PBS/Tween (фосфатно-солевой буфер, рН 7,4, 0,005% Tween 20) и проводили эксперименты при 25°С. Дорожки c лигандом на сенсорном чипе ProteOn GLC активировали с помощью EDC/NHS (скорость потока 30 мкл/мин) и вводили HSA при 10 мкг/мл в ацетатном буфере ProteOn pH 4,5 (скорость потока 100 мкл/мин), чтобы получить уровень иммобилизации примерно в 3200 RU. После иммобилизации дезактивировали поверхности с помощью этаноламина ·HCl (скорость потока 30 мкл/мин). Нанотела впрыскивали над поверхностью с HSA в течение 2 мин при 45 мкл/мин, чтобы получить уровень захвата нанотел примерно в 200 RU. Образцы, содержащие предсуществующие антитела, центрифугировали 2 мин при 14 000 об/мин, а супернатант разводили 1:10 в PBS-Tween 20 (0005%) и впрыскивали в течение 2 минут при 45 мкл/мин, с последующей стадией диссоциации на 400 сек. После каждого цикла (т.е. перед новым захватом нанотел и операцией впрыска образца крови) поверхности с HSA регенерировали с помощью инъекции НСl (100 мМ) в течение 2 мин при 45 мкл/мин. Обработку сенсограмм и анализ данных проводили с помощью ProteOn Manager 3.1.0 (BioRad Laboratories, Inc.). Сенсограммы, показывающие связывание предсуществующих антител, получали после двойной привязки путем вычитания 1) диссоциации нанотело-HSA и 2) неспецифического связывания с дорожкой контрольного лиганда. Уровень связывания предсуществующих антител определяли при установке регистрации данных на 125 сек (через 5 сек после окончания ассоциации). Рассчитывали снижение связывания предсуществующих антител в процентах относительно уровня связывания контрольного нанотела через 125 сек.

Пример 1. Мутация S112K ингибирует связывание предсуществующих антител

Определяли влияние замены в положении 112 на связывание предсуществующих антител в человеческих образцах с нанотелами и сравнивали с влиянием C-концевого удлинения аланином, как описано в WO 12/175741.

Тестировали два контрольных соединения (стандарт A без C-концевого удлинения аланином и стандарт B с C-концевым удлинением аланином) и варианты этих контрольных соединений с различными мутациями в положении 112 на сыворотках, полученных от 6 различных больных RA, и 8 сыворотках, полученными от различных здоровых людей. Связывание предсуществующих антител в образцах с исследуемыми нанотелами измеряли на установке ProteOn по общей методике, описанной выше. Результаты представлены ниже в табл. A.

Как видим, из мутаций в положении 112, которые были исследованы, мутация S112 вызывала снижение связывания предсуществующих антител, находящихся в исследуемых сыворотках, которое было сравнимо с таковым при C-концевом удлинении аланином (даже без C-концевого удлинения аланином у варианта S112K). Аналогичные результаты были получены с тремя образцами человеческой плазмы (данные не приводятся).

Пример 2. Влияние мутации S112K на связывание предсуществующих антител, находящихся в образцах от больных SLE

Тестировали те же варианты нанотел, что использовались в примере 1, на связывание с предсуществующими антителами в 7 образцах сыворотки, полученных от пациентов, признанных положительными на системную красную волчанку (SLE). Для сравнения включали образцы плазмы от двух здоровых добровольцев.

Связывание предсуществующих антител в образцах с исследуемыми нанотелами измеряли на установке ProteOn по общей методике, изложенной выше. Результаты представлены ниже в табл. B.

Как видно из сравнения данных по связыванию для стандарта A и стандарта B и нанотел по изобретению, образцы, полученные от некоторых больных SLE, явно содержат какие-то предсуществующие антитела, которые все-таки могут связываться с нанотелами даже при наличии C-концевого остатка аланина (C-концевой остаток аланина фактически предотвращал/устранял (частично или практически полностью) всякое связывание предсуществующих антител, находившихся в образцах плазмы от здоровых добровольцев)).

Также видно, что связывание этих предсуществующих антител из образцов SLE сильно снижается при мутациях в положениях 11 и 112 (а в случае положения 112 - в особенности при S112K).

Пример 3. Влияние комбинирования каркасных мутаций и C-концевых удлинений на связывание предсуществующих антител, находящихся в образцах от больных SLE

Тестировали четыре различных нанотела (с определенными каркасными мутациями и с C-концевым удлинением аланином или без него) на связывание предсуществующих антител в 7 образцах сыворотки, полученных от пациентов, признанных положительными на системную красную волчанку (SLE). Для сравнения включали один образец плазмы от здорового добровольца.

Связывание предсуществующих антител в образцах с исследуемыми нанотелами измеряли на установке ProteOn по общей методике, изложенной выше. Результаты представлены ниже в табл. C и D.

Как видно из сравнения данных по связыванию для стандарта A и стандарта B, образцы, полученные от больных SLE, явно содержат какие-то предсуществующие антитела, которые все-таки могут связываться с нанотелами даже при наличии C-концевого остатка аланина (C-концевой остаток аланина фактически предотвращал/устранял всякое связывание предсуществующих антител, находящихся в образцах плазмы от здорового добровольца).

Также видно, что связывание этих предсуществующих антител из образцов SLE сильно снижается при мутациях в положениях 11 и 112 (а в случае положения 112 - в особенности при S112K).

Пример 4. Влияние мутации V89T на связывание предсуществующих антител в образцах от больных SLE

Как описано здесь, образцы, полученные от некоторых больных SLE, явно содержат предсуществующие антитела/факторы, которые могут связываться с экспонированным C-терминальным концом домена V_H, даже при наличии C-концевого удлинения. Исследовали, может ли мутация V89T уменьшить или предотвратить/устранить такое связывание, при наличии C-концевого удлинения или без него. Результаты тоже представлены ниже в табл. C и E.

Как видим, мутация V89T может фактически предотвратить/устранить связывание предсуществующих антител, находящихся в образцах, полученных от больных SLE, в такой же степени, как и мутация S112K. Однако, как видно из сравнения данных, приведенных в табл. C и E для нанотел с мутацией V89T без C-концевого удлинения и аналогичных нанотел с мутацией S112K без C-концевого удлинения, наличие мутации в положении 112 у нанотел без C-концевого удлинения вообще снижает связывание предсуществующих антител в образцах от здорового добровольца в большей степени, чем мутация V89T (а именно, 100%, 85% и 64% у нанотел S112K против 9%, 11% и 16% у нанотел V89T, соответственно). По этой причине использование мутации в положении 112 (в частности, S112K или S112K) зачастую будет предпочтительней, чем использование мутации в положении 89 (типа V89T).

Однако, тоже как видно из данных в табл. C и E, добавление C-концевого аланина к нанотелу V89T полностью предотвращает/устраняет связывание предсуществующих антител в образцах, полученных от здорового добровольца, и по этой причине будет предпочтительней комбинация из мутации V89T и C-концевого удлинения, как описано здесь (т.е. перед использованием V89T без C-концевого удлинения), если нанотело V89T или домен V_H имеет или должен иметь экспонированный C-концевой участок в том белке или полипептиде, в котором он будет присутствовать (например, потому, что он образует его C-терминальный конец).

Для подтверждения того, что результаты/данные из приведенных выше таблиц общеприменимы, тестировали репрезентативные нанотела с мутациями S112K и/или V89T против тест-панели из 96 (S112K) и 129 (V89T) образцов сыворотки человека. Связывание определяли на установке ProteOn по методике, изложенной выше.

Результаты представлены на фиг. 3 и в табл. F (репрезентативное нанотело с мутацией S112K) и на фиг. 4 и в табл. G (репрезентативное нанотело с мутацией V89T).

На фиг. 3 сравнивали нанотело с мутацией S112K (стандарт A + S112 + C-концевой аланин, см. табл. C выше) с контрольным нанотелом (стандарт A; SEQ ID NO:44). И нанотело с мутацией S112K, и стандарт A тестировали на каждом из образцов сыворотки и определяли уровень связывания через 125 сек (RU). Затем эти данные наносили на график на фиг. 3, где каждая точка представляет уровень связывания в одном образце либо для стандарта A (обозначен как (1) на фиг. 3), либо для мутанта S112K (обозначен как (2) на фиг. 3). Пунктирной линией обозначен уровень связывания в 20 RU.

Те же самые данные также представлены в цифровом виде в табл. F, в которой приведено - для стандарта A и мутанта S112K, соответственно - общее количество исследованных образцов, в которых уровень связывания через 125 сек составлял более 20 RU, менее 20 RU (т.е. между 0 и 20 RU) и менее 10 RU.

Как видно из данных, представленных на фиг. 3 и в табл. F, у стандарта A более половины из 96 исследованных образцов давали уровень связывания более 20 RU (в некоторых случаях он достигал 150-200 RU), указывая на то, что предсуществующие антитела, находящиеся в образце, связываются со стандартом A. Для сравнения, у мутанта S112K ни один образец не давал уровня связывания более 20 RU (а большинство давало менее 10 RU), указывая на то, что мутация S122K фактически способна уменьшить/предотвратить связывание предсуществующих антител во всех 96 исследованных образцах.

Аналогичный график и такие же данные представлены на фиг. 4 и в табл. G, соответственно, для репрезентативного нанотела с мутацией V89T (стандарт A + L11V + V89T + C-концевой аланин; см. табл. E выше) при тестировании на 129 образцах сыворотки и тоже по сравнению со стандартом A (обозначен как (1) на фиг. 4; мутант V89T обозначен как (2) на фиг. 4). Опять же, из графика на фиг. 4 и данных в табл. G видно,
что, за некоторыми исключениями (а именно, у менее чем 10% исследованных образцов абсолютные значения связывания через 125 сек составляли 100 RU или меньше), мутация V89T способна уменьшать/предотвращать связывание предсуществующих антител у большинства из 129 исследованных образцов, тогда как стандарт A без мутации V89T связывался с предсуществующими антителами у большей части исследованных образцов.

Таблица F. Тестирование репрезентативного нанотела с мутацией S112K на 96 образцах сыворотки

Нанотело Уровень связывания через 125 сек < 10 RU Уровень связывания через 125 сек < 20 RU Уровень связывания через 125 сек > 20 RU Стандарт A 34 41 55 Стандарт A + S112K + V89T + C-концевой аланин 92 96 0

Таблица G. Тестирование мутантных нанотел с мутациями V89L и/или T100K/Q на 129 образцах сыворотки

Нанотело Уровень связывания через 125 сек < 10 RU Уровень связывания через 125 сек < 20 RU Уровень связывания через 125 сек > 20 RU Стандарт A 27 40 89 Стандарт A + L11V + V89T + C-концевой аланин 110 119 10

Пример 5. Влияние мутации V89L в сочетании с мутацией T110K или T110Q на связывание предсуществующих антител в образцах от больных SLE

Как описано здесь, образцы, полученные от некоторых больных SLE, явно содержат предсуществующие антитела/факторы, которые могут связываться с экспонированным C-терминальным концом домена V_H, даже при наличии C-концевого удлинения. Исследовали, может ли мутация V89L и/или T110Q или T110K (либо их комбинации) уменьшить или предотвратить/устранить такое связывание, при наличии C-концевого удлинения или без него. Результаты также представлены ниже в табл. H и I, в которых представлены данные из двух отдельных экспериментов (в табл. D выше также показаны данные для мутации S112Q с изобретению в сочетании с мутацией V89L). Нанотела, использовавшиеся в табл. I, также использовались при получении данных, представленных на фиг. 5 и в табл. J.

Для подтверждения того, что результаты/данные из приведенных выше таблиц общеприменимы, опять же тестировали репрезентативные нанотела с мутациями V89L, T110K и/или T110Q против тест-панели из 99 образцов сыворотки человека. Тоже получали данные по связыванию и наносили на график, как указано в примере 4 для результатов и данных, приведенных на фиг. 3 и 4 и в табл. F и G.

Тестировали следующие нанотела (номера соответствуют нумерации, использующейся на фиг. 5): (1) стандарт A; (2) стандарт A + L11V + V89L + C-концевой Ala; (3) стандарт A + L11V + V89L + T110K + C-концевой Ala; (4) стандарт A + L11V + V89L + T110Q + C-концевой Ala; (5) стандарт A + L11V + T87A + V89L + C-концевой Ala. Результаты представлены на фиг. 5 и в табл. I.

Как видим, введение исследуемых мутаций опять же сильно уменьшает число образцов, в которых предсуществующие антитела способны связывать исследуемые нанотела. Также видно, что, для нанотела (2) на фиг. 5 (стандарт A + L11V + V89L + C-концевой Ala), некоторые образцы все-таки проявляли связывание предсуществующих антител через 125 сек на уровне более 20 RU (но уже гораздо меньше, чем 100 RU). Однако, когда мутация V89L сочеталась с мутацией T110K (нанотело (3)) или с мутацией T100Q (нанотело (4)), то практически все из 99 исследованных образцов проявляли уровень связывания менее 20RU (а фактически менее 10 RU, см. табл. J).

Таблица J. Тестирование репрезентативных нанотел с мутациями V89L, T110K и/или T110Q на 99 образцах сыворотки

Нанотело Уровень связывания через 125 сек < 10 RU Уровень связывания через 125 сек < 20 RU Уровень связывания через 125 сек > 20 RU Стандарт A 52 64 35 Стандарт A + L11V + V89L + C-концевой аланин 94 95 4 Стандарт A + L11V + V89L + T110K + C-концевой Ala 99 99 0 Стандарт A + L11V + V89L + T110Q + C-концевой Ala 99 99 0 Стандарт A + L11V + T87A + V89L + C-концевой Ala 99 99 0

Пример 6. Тестирование мультивалентных конструкций на связывание предсуществующих антител

Получали мультивалентные конструкции на основе следующих нанотел:

нанотело A (направленное против терапевтической мишени):

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFNNYAMGWFRQAPGKEREFVAAITRSGVRS GVSAIYGDSVKDRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAASAIGSGALRRFEYDY SGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 92)

нанотело B (направленное против сывороточного альбумина):

EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTL YADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 93)

нанотело C (направленное против терапевтической мишени):

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRSIGRLDRMGWYRHRPGEPRELVATITGGSSINY GDSVKGRFTISIDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNFNYVTSRDTWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 94)

Полученные конструкции перечислены ниже в таблице K (при этом в каждом случае введенные замены (если они есть) у соответствующих нанотел приведены в скобках). “HIS6” означает N-концевой His-тег из 6 остатков гистидина, а “-Ala” означает C-концевое удлинение на 1 остаток аланина.

Таблица K. Исследуемые мультивалентные конструкции

HIS6-нанотело A(E1D,L11V, S112K)-35GS-нанотело B-Ala HIS6-нанотело A(E1D,L11V, S112K)-35GS-нанотело B(L11V,S112K)-Ala HIS6-нанотело A(E1D)-35GS-нанотело B HIS6-нанотело A(E1D)-35GS-нанотело B-Ala HIS6-нанотело A(E1D,L11V, S112K)-35GS-нанотело B(L11V, S112K) HIS6-нанотело A(E1D, S112K)-35GS-нанотело B(S112K)-Ala HIS6-нанотело A(E1D, S112Q)-35GS-нанотело B(S112Q)-Ala HIS6-нанотело A(E1D, V89L, S112K)-35GS-нанотело B(V89L, S112K)-Ala HIS6-нанотело A(E1D,L11V, S112Q)-35GS-нанотело B(L11V, S112Q)-Ala HIS6-нанотело B(E1D)-35GS-нанотело A HIS6-нанотело B(E1D)-35GS-нанотело A-Ala HIS6-нанотело A(E1D)-35GS-нанотело B(L11V, S112K)-Ala HIS6-нанотело B(E1D,L11V, S112K)-35GS-нанотело A-Ala HIS6-нанотело B(E1D,)-35GS-нанотело A(L11V, S112K)-Ala HIS6-нанотело A(E1D,V89L, S112Q)-35GS-нанотело B(V89L, S112Q)-Ala HIS6-нанотело B(E1D,L11V, S112K)-35GS-нанотело A(L11V, S112K)-Ala HIS6-нанотело B(S112K)-Ala Нанотело B(L11V, S112K)-Ala Нанотело B(L11V, S112Q)-Ala Нанотело B(S112Q)-Ala HIS6-нанотело A(E1D, S112K)-35GS-нанотело A(S112K)-35GS-нанотело B(S112K)-Ala HIS6-нанотело A(E1D, S112Q)-35GS-нанотело A(S112Q)-35GS-нанотело B(S112Q)-Ala HIS6-нанотело A(E1D,L11V,S112K)-35GS-нанотело A(L11V, S112K)-35GS-нанотело B(L11V, S112K)-Ala HIS6-нанотело A(E1D,V89L, S112K)-35GS-нанотело A(V89L, S112K)-35GS-нанотело B(V89L, S112K)-Ala HIS6-нанотело A(E1D)-35GS-нанотело A-35GS-нанотело B HIS6-нанотело A(E1D)-35GS-нанотело A -35GS-нанотело B-Ala Нанотело C(E1D)-9GS-AlaLB11-9GS-нанотело C HIS6-нанотело A(E1D,L11V, S112K)-35GS-нанотело A(L11V, S112K)-35GS-нанотело B-Ala HIS6-нанотело C(E1D,L11V, S112K)-9GS-нанотело B(L11V, S112K)-9GS-нанотело C(L11V,S112K)-Ala Нанотело C(E1D)-9GS-AlaLB11-9GS-нанотело C-Ala HIS6-нанотело A(E1D,L11V, S112Q)-35GS-нанотело A(L11V, S112Q)-35GS-нанотело B(L11V, S112Q)-Ala HIS6-нанотело A(E1D, V89L, S112Q)-35GS-нанотело A(V89L, S112Q)-35GS-нанотело B(V89L, S112Q)-Ala HIS6-нанотело C(E1D, S112K)-9GS-нанотело B(S112K)-9GS-нанотело C(S112K)-Ala HIS6-нанотело C(E1D, S112Q)-9GS-нанотело B(S112Q)-9GS-нанотело C(S112Q)-Ala HIS6-нанотело C(E1D,L11V, S112Q)-9GS-нанотело B(L11V, S112Q)-9GS-нанотело C(L11V,S112Q)-Ala HIS6-нанотело C(E1D,V89L, S112K)-9GS-нанотело B(V89L, S112K)-9GS-нанотело C(V89L,S112K)-Ala HIS6-нанотело C(E1D, V89L, S112Q)-9GS-нанотело B(V89L, S112Q)-9GS-нанотело C(V89L, S112Q)-Ala HIS6-нанотело A(E1D,L11V,A14P,R39Q,K83R,V89L,T91Y,Q108L)-35GS-нанотело B(L11V,R30S,E44G,P45L,K83R,V89L,Q108L)-Ala HIS6-нанотело A(E1D,L11V,A14P,R39Q,K83R,T87A,V89L,T91Y,Q108L)-35GS-нанотело B(L11V,R30S,E44G,P45L,K83R,T87A,V89L,Q108L)-Ala HIS6-нанотело A(E1D,L11V,A14P,R39Q,K83R,V89L,T91Y,Q108L,T110Q)-35GS-нанотело B(L11V,R30S,E44G,P45L,K83R,V89L,Q108L,T110Q)-Ala HIS6-нанотело A(E1D,L11V,A14P,R39Q,K83R,V89L,T91Y,Q108L,T110K)-35GS-нанотело B(L11V,R30S,E44G,P45L,K83R,V89L,Q108L,T110K)-Ala HIS6-нанотело A(E1D,L11V,A14P,R39Q,K83R,V89L,T91Y,Q108L)-35GS-нанотело A(E1D,L11V,A14P,R39Q,K83R,V89L,T91Y,Q108L)-35GS-нанотело B(L11V,R30S,E44G,P45L,K83R,V89L,Q108L)-Ala HIS6-нанотело A(E1D,L11V,A14P,R39Q,K83R,T87A,V89L,T91Y,Q108L)-35GS-нанотело A(E1D,L11V,A14P,R39Q,K83R,T87A,V89L,T91Y,Q108L)-35GS-нанотело B(L11V,R30S,E44G,P45L,K83R,T87A,V89L,Q108L)-Ala HIS6-нанотело A(E1D,L11V,A14P,R39Q,K83R,V89L,T91Y,Q108L,T110Q)-35GS-нанотело A(E1D,L11V,A14P,R39Q,K83R,V89L,T91Y,Q108L,T110Q)-35GS-нанотело B(L11V,R30S,E44G,P45L,K83R,V89L,Q108L,T110Q)-Ala HIS6-нанотело A(E1D,L11V,A14P,R39Q,K83R,V89L,T91Y,Q108L,T110K)-35GS-нанотело A(E1D,L11V,A14P,R39Q,K83R,V89L,T91Y,Q108L,T110K)-35GS-нанотело B(L11V,R30S,E44G,P45L,K83R,V89L,Q108L,T110K)-Ala

Репрезентативные мультивалентные конструкции тестировали на связывание с предсуществующими антителами, присутствующими в образцах крови или сыворотки, полученных от больных SLE и здоровых добровольцев. Связывание определяли на установке ProteOn в основном, как описано выше.

Данные репрезентативные конструкции приведены в табл. L (тривалентные конструкции) и M (бивалентные конструкции), а результаты представлены на фиг. 6-8 и в табл. N-Q. Исследуемые тривалентные конструкции получали из стандартной конструкции нанотело A-35GS-нанотело A-35GS-нанотело B (“стандарт X”), а бивалентные конструкции получали из стандартной конструкции нанотело A-35GS-нанотело B (“стандарт Y”). Все конструкции (за исключением стандартных конструкций) содержали, если указано, C-концевой остаток аланина, а также, в каждом из строительных блоков “нанотело A” и “нанотело B”, указанные мутации.

Таблица L. Исследуемые тривалентные конструкции

Тривалентные конструкции Мутация Конструкции (кроме стандартной) содержат, если указано, C-концевой остаток аланина, а также, в каждом из блоков, указанные мутации L11V T87A V89L T110K T110Q 114A Стандарт X (= нанотело A-35GS-нанотело A-35GS-нанотело B) Стандарт X + C-концевой Ala x Стандарт X + L11V + V89L + C-концевой Ala x x x Стандарт X + L11V + V89L + T110K + C-концевой Ala x x x x Стандарт X + L11V + T87A + V89L + C-концевой Ala x x x x Стандарт X + L11V + V89L + T110Q + C-концевой Ala x x x x

Таблица M. Исследуемые бивалентные конструкции

Бивалентные конструкции Мутация Конструкции (кроме стандартной) содержат, если указано, C-концевой остаток аланина, а также, в каждом из блоков, указанные мутации L11V T87A V89L T110K T110Q 114A Стандарт Y (= нанотело A-35GS-нанотело B) Стандарт Y + C-концевой Ala x Стандарт Y + L11V + V89L + C-концевой Ala x x x Стандарт Y + L11V + V89L + T110K + C-концевой Ala x x x x Стандарт Y + L11V + T87A+ V89L + C-концевой Ala x x x x Стандарт Y + L11V + V89L + T110Q + C-концевой Ala x x x x

Таблица N. Результаты тестирования тривалентных конструкций на связывание с предсуществующими антителами в 98 образцах сыворотки здоровых лиц. Результаты также представлены на фиг. 6 в виде графика, на котором каждая точка означает точку данных, полученных при тестировании данной конструкции на одном из 98 образцов сыворотки.

Нанотело при тестировании на 98 образцах (здоровых лиц) Номер дорожки на графике на фиг. 6 Уровень связывания через 125 сек < 10 RU Уровень связывания через 125 сек < 20 RU Уровень связывания через 125 сек > 20 RU Стандарт X (1) 38 48 50 Стандарт X + C-концевой Ala (2) 64 75 23 Стандарт X + L11V + V89L + C-концевой Ala (3) 94 95 3 Стандарт X + L11V + V89L + T110K + C-концевой Ala (5) 95 96 2 Стандарт X + L11V + T87A + V89L + C-концевой Ala (6) 95 96 2 Стандарт X + L11V + V89L + T110Q + C-концевой Ala (4) 92 95 3

Таблица O. Результаты тестирования тривалентных конструкций на связывание с предсуществующими антителами в 30 выбранных образцах сыворотки здоровых лиц. Эти 30 образцов отбирали либо по высокому титру предсуществующих антител, либо потому, что предсуществующие антитела в образце проявляли высокий уровень связывания даже при наличии C-концевого остатка аланина. Результаты также представлены на фиг. 7 в виде графика, на котором каждая точка означает точку данных, полученных при тестировании данной конструкции на одном из 30 выбранных образцов сыворотки.

Нанотело при тестировании на 30 выбранных образцах Номер дорожки на графике на фиг. 7 Уровень связывания через 125 сек < 10 RU Уровень связывания через 125 сек < 20 RU Уровень связывания через 125 сек > 20 RU Стандарт X + C-концевой Ala (1) 12 13 17 Стандарт X + L11V + V89L + C-концевой Ala (2) 18 22 8 Стандарт X + L11V + T87A + V89L + C-концевой Ala (3) 27 27 3 Стандарт X + L11V + V89L + T110K + C-концевой Ala (4) 26 26 4

Таблица P. Результаты тестирования бивалентных конструкций на связывание с предсуществующими антителами в 98 образцах сыворотки здоровых лиц. Результаты также представлены на фиг. 8 в виде графика, на котором каждая точка означает точку данных, полученных при тестировании данной конструкции на одном из 98 образцов сыворотки.

Нанотело при тестировании на 98 образцах (здоровых лиц) Номер дорожки на графике на фиг. 8 Уровень связывания через 125 сек < 10 RU Уровень связывания через 125 сек < 20 RU Уровень связывания через 125 сек > 20 RU Стандарт Y (1) 54 67 31 Стандарт Y + C-концевой Ala (2) 90 92 6 Стандарт Y + L11V + V89L + C-концевой Ala (3) 97 98 0 Стандарт Y + L11V + T87A + V89L + C-концевой Ala (4) 98 98 0 Стандарт Y + L11V + V89L + T110K + C-концевой Ala (5) 96 98 0 Стандарт Y + L11V + V89L + T110Q + C-концевой Ala (6) 98 98 0

Три репрезентативные тривалентные конструкции также тестировали на образцах сыворотки, полученных от больных SLE. Результаты представлены в табл. Q.

Пример 7. Нанотела и конструкции из нанотел, направленные против ионного канала Kv1.3

В одном конкретном аспекте, домены V_H по изобретению (в особенности ISVDs по изобретению и более предпочтительно нанотела по изобретению) и соединения по изобретению могут быть направлены против ионного канала Kv1.3.

В поданной совместно предварительной заявке США USSN 62/014,023 (название: “Kv1.3 binding immunoglobulins”; правопреемник: Ablynx N.V.; дата подачи: 18 июня 2014 г.), а также в последующей предварительной заявке США под тем же названием, поданной 16 марта 2015 г. (правопреемник: Ablynx N.V.), среди прочего, описаны одиночные вариабельные домены иммуноглобулина (в частности, нанотела), которые направлены против калий-селективного потенциал-зависимого ионного канала Kv1.3, а также белки, полипептиды и другие конструкции на основе нанотел, которые содержат по меньшей мере одно такое нанотело против Kv1.3.

Мутации, описанные в настоящей заявке (необязательно в сочетании с C-концевым удлинением, как описано здесь и/или в WO 12/175741), также могут быть применимы к нанотелам, белкам, полипептидам и другим конструкциям на основе нанотел, направленным против Kv1.3, которые описаны в этих двух предварительных заявках США.

Так, в одном аспекте изобретение касается доменов V_H, направленных против Kv1.3, которые являются такими, как уже описано здесь для ISVD по изобретению (т.е. содержат аминокислотные остатки/мутации, как описано здесь).

Опять же, как и с другими аспектами и воплощениями изобретения, описанными здесь, когда определенный ISVD (типа ISVD против Kv1.3, описанных в данном примере) или содержащее его соединение, как говорится, “соответствует изобретению” или “как уже описано здесь”, то к данному конкретному ISVD или соединению, соответственно, также определенно применимы предпочтительные аспекты/воплощения и предпочтения, которые вообще описаны здесь для ISVD или соединений по изобретению, если прямо не указано иначе или если конкретный технический контекст не требует иного.

Итак, в предпочтительном аспекте настоящее изобретение касается доменов V_H, направленных против Kv1.3, у которых (i) в положении 112 находится K или Q; или (ii) в положении 110 находится K или Q и в положении 11 находится V; или (iii) в положении 89 находится T; или (iv) в положении 89 находится L и в положении 110 находится K или Q; или (v) в положении 11 находится V и в положении 89 находится L; или любые подходящие комбинации из (i)-(v). В частности, у таких доменов V_H против Kv1.3:

- аминокислотный остаток в положении 11 предпочтительно выбран из L, V и K (наиболее предпочтительно V);

- аминокислотный остаток в положении 14 предпочтительно выбран из A и P;

- аминокислотный остаток в положении 41 предпочтительно выбран из A и P;

- аминокислотный остаток в положении 89 предпочтительно выбран из T, V и L;

- аминокислотный остаток в положении 108 предпочтительно выбран из Q и L;

- аминокислотный остаток в положении 110 предпочтительно выбран из T, K и Q;

- аминокислотный остаток в положении 112 предпочтительно выбран из S, K и Q;

так что либо (i) в положении 112 находится K или Q; либо (ii) в положении 110 находится K или Q и в положении 11 находится V; либо (iii) в положении 89 находится T; либо (iv) в положении 89 находится L и в положении 110 находится K или Q; либо (v) в положении 11 находится V и в положении 89 находится L; или любые подходящие комбинации из (i)-(v).

Домены V_H против Kv1.3, приведенные в этом примере, в частности, могут иметь такие участки CDR, которые описаны на стр. 5-10 в USSN 62/014023 (включая любые предпочтительные аспекты/воплощения таких CDRs), либо их оптимизированные по последовательности варианты, как описано в другой предварительной заявке США, приведенной выше.

В частности, домены V_H против Kv1.3, приведенные в этом примере, могут, в частности, иметь такие комбинации CDR1, CDR2 и CDR3, которые выбраны из одной из комбинаций CDR1, CDR2 и CDR3, перечисленных в качестве предпочтительных аспектов в списке, приведенном на стр. 9 и 10 в USSN 62/014,023.

В некоторых предпочтительных, без ограничения, аспектах изобретения:

в доменах V_H по изобретению: (i) CDR1 (согласно Kabat) имеет последовательность SED ID NO: 166 или такую аминокислотную последовательность, которая отличается по одной или двум аминокислотам от последовательности SEQ ID NO: 166; (ii) CDR2 (согласно Kabat) имеет последовательность SED ID NO: 167 или такую аминокислотную последовательность, которая отличается по одной или двум аминокислотам от последовательности SEQ ID NO: 167; и (iii) CDR3 (согласно Kabat) имеет последовательность SED ID NO: 168 или такую аминокислотную последовательность, которая отличается по одной или двум аминокислотам от последовательности SEQ ID NO: 168; а еще более предпочтительно: (i) CDR1 (согласно Kabat) имеет последовательность SED ID NO: 166; (ii) CDR2 (согласно Kabat) имеет последовательность SED ID NO: 167; и (iii) CDR3 (согласно Kabat) имеет последовательность SED ID NO: 168; и/или

в доменах V_H по изобретению: (i) CDR1 (согласно AbM) имеет последовательность SED ID NO: 169 или такую аминокислотную последовательность, которая отличается по одной или двум аминокислотам от последовательности SEQ ID NO: 169; (ii) CDR2 (согласно AbM) имеет последовательность SED ID NO: 170 или такую аминокислотную последовательность, которая отличается по одной или двум аминокислотам от последовательности SEQ ID NO: 170; и (iii) CDR3 (согласно AbM) имеет последовательность SED ID NO: 171 или такую аминокислотную последовательность, которая отличается по одной или двум аминокислотам от последовательности SEQ ID NO: 171; а еще более предпочтительно: (i) CDR1 (согласно AbM) имеет последовательность SED ID NO: 169; (ii) CDR2 (согласно AbM) имеет последовательность SED ID NO: 170; и (iii) CDR3 (согласно AbM) имеет последовательность SED ID NO: 178.

Домены V_H по изобретению против Kv1.3 тоже могут быть такими, как описано здесь, в частности, опять же это могут быть ISVD (более предпочтительно нанотела) против Kv1.3 либо белки, полипептиды или другие соединения или конструкции, которые содержат по меньшей мере один такой ISVD. Такие белки, полипептиды или другие соединения или конструкции тоже могут быть такими, как уже описано здесь, и могут иметь, к примеру, повышенный период полураспада (т.е. как описано здесь, например, период полураспада - выраженный в виде t_½-бета - в организме человека по меньшей мере в 1 день, предпочтительно по меньшей мере в 3 дня, более предпочтительно по меньшей мере 7 дней, как-то по меньшей мере 10 дней), и с этой целью могут, к примеру, содержать связывающие сывороточный альбумин нанотела, которые также могут быть связывающими сывороточный альбумин нанотелами по изобретению (опять же, как описано здесь).

Кроме того, такие ISVD могут соответственно иметь C-концевое удлинение (как уже описано здесь и в WO 12/175741), в частности, когда данный ISVD образует C-терминальный конец содержащего его белка, полипептида или другого соединения или конструкции (опять же, как уже описано здесь).

Например, и без ограничения, домены V_H по изобретению против Kv1.3 могут иметь одну из последовательностей, перечисленных в табл. A-1 в USSN 62/014023 (SEQ ID NOs: 1-123 в USSN 62/014023), или же одну из последовательностей, перечисленных в табл. A-1 предварительной заявки США под названием “Kv1.3 binding immunoglobulins” (правопреемник: Ablynx N.V.; дата подачи: 16 марта, 2015 г.) (SEQ ID NOs: 1-123, 495, 498-513 или 523-540 в данной предварительной заявке США; в особенности последовательность SEQ ID NO: 495), но с подходящими мутациями/специфическими аминокислотными остатками, описанными здесь для ISVDs по изобретению, необязательно с подходящим C-концевым удлинением.

В одном конкретном аспекте, нанотела по изобретению против Kv1.3 представляют собой варианты нанотела SEQ ID NO:137 (которые по меньшей мере на 90% идентичны по последовательности SEQ ID NO:137), у которых:

- аминокислотный остаток в положении 11 предпочтительно выбран из L, V и K (наиболее предпочтительно V);

- аминокислотный остаток в положении 14 предпочтительно выбран из A и P;

- аминокислотный остаток в положении 41 предпочтительно выбран из A и P;

- аминокислотный остаток в положении 89 предпочтительно выбран из T, V и L;

- аминокислотный остаток в положении 108 предпочтительно выбран из Q и L;

- аминокислотный остаток в положении 110 предпочтительно выбран из T, K и Q;

- аминокислотный остаток в положении 112 предпочтительно выбран из S, K и Q;

так что либо (i) в положении 112 находится K или Q; либо (ii) в положении 110 находится K или Q и в положении 11 находится V; либо (iii) в положении 89 находится T; либо (iv) в положении 89 находится L и в положении 110 находится K или Q; либо (v) в положении 11 находится V и в положении 89 находится L; или любые подходящие комбинации из (i)-(v).

Некоторые особенно предпочтительные, но без ограничения, примеры нанотел по изобретению против Kv1.3 и содержащих их соединений по изобретению представлены на фиг. 9A (моновалентные нанотела: SEQ ID NOs 138-155) и фиг. 9B (тривалентные биспецифичные конструкции с продленным периодом полураспада: SEQ ID NOs 156-164). Соединения по изобретению, которые содержат или в основном состоят из по меньшей мере одного (как-то одного, двух или трех) нанотела против Kv1.3, выбранного из нанотел против Kv1.3 по SEQ ID NOs: 138-155, образуют следующий аспект изобретения. Кроме того, каждое из соединений по SEQ ID NOs: 156-164 образует еще один аспект изобретения. В одном конкретном аспекте такие соединения содержат два таких нанотела по изобретению против Kv1.3 и одно нанотело против сывороточного альбумина человека (которое предпочтительно также является нанотелом по изобретению). Опять же, такие конструкции могут содержать подходящие линкеры и C-концевые удлинения.

Моновалентные нанотела против Kv1.3 по SEQ ID NOs: 138-155 получали путем введения мутаций L11V и V89L по изобретению в исходную последовательность SEQ ID NO: 137 (стандарт). Кроме того, вводили различные комбинации гуманизирующих (или других оптимизирующих последовательности) мутаций, как-то E1D, A14P, G19R, M53A или M53Q или M53Y, T62S, A74S, K83R, S94G и/или T97E). Конкретные мутации, введенные в каждую из последовательностей SEQ ID NOs: 138-155, представлены на фиг. 9A.

Некоторые из моновалентных нанотел против Kv1.3 на фиг. 9А также были представлены в формате тривалентных биспецифичных конструкций, содержащих два нанотела по изобретению против Kv1.3 и одно повышающее период полураспада нанотело по изобретению против сывороточного альбумина человека (SEQ ID NO: 109, оно также именуется “ALB-82” на фиг 9B). Использовали линкеры 35GS, и все конструкции содержали C-концевое удлинение (один C-концевой остаток аланина). Последовательности полученных конструкций приведены в SEQ ID NOs 156-164. Из них три конструкции (SEQ ID NO: 156, 157 и 160) тестировали на связывание с предсуществующими антителами в образцах, полученных от 47 больных диабетом и 90 здоровых лиц, по описанной здесь общей методике. Связывание с предсуществующими антителами в образцах из этих двух групп сравнивали с контрольной конструкцией SEQ ID NO: 165, которая представляет собой соответствующую тривалентную биспецифичную конструкцию на основе стандартного строительного блока против Kv1.3 по SEQ ID NO: 137 и связывающего сывороточный альбумин Alb-8 (SEQ ID NO: 46), опять же в сочетании с C-концевым удлинением аланином. Результаты представлены на фиг. 10 (образцы от 47 больных диабетом) и фиг. 11 (образцы от 90 здоровых добровольцев). В каждом случае конструкции с мутациями V89L и L11V по изобретению проявляли снижение связывания с предсуществующими антителами по сравнению с контрольной конструкцией.

Пример 8. Домены V_H (в частности, нанотела) против IL-23 и содержащие их соединения по изобретению

В одном конкретном аспекте, домены V_H по изобретению (в особенности ISVDs
по изобретению и более предпочтительно нанотела по изобретению) и соединения по изобретению могут быть направлены против IL-23.

Такие домены V_H по изобретению против IL-23 обычно содержат: (i) подходящие каркасные последовательности, которые соответственно включают аминокислотные остатки/мутации по изобретению, как описано здесь; а также (ii) последовательности CDR, которые позволяют доменам V_H по изобретению специфически связываться с IL-23. Кроме того, такие домены V_H по изобретению против IL-23 также могут содержать C-концевое удлинение, как описано здесь, в частности, когда данный домен V_H является моновалентным или образует C-терминальный конец того соединения по изобретению, в котором находится данный домен V_H (опять же, как уже описано здесь). Такие домены V_H по изобретению против IL-23 также могут быть такими, как уже описано здесь, в частности, это могут быть ISVDs.

Опять же, как и с другими аспектами и воплощениями изобретения, описанными здесь, когда определенный ISVD (типа ISVD против IL-23, описанных в данном примере) или содержащее его соединение, как говорится, “соответствует изобретению” или “как уже описано здесь”, то к данному конкретному ISVD или соединению, соответственно, также определенно применимы предпочтительные аспекты/воплощения и предпочтения, которые вообще описаны здесь для ISVD или соединений по изобретению, если прямо не указано иначе или если конкретный технический контекст не требует иного.

Итак, в предпочтительном аспекте настоящее изобретение касается доменов V_H (в особенности ISVD), направленных против IL-23, у которых (i) в положении 112 находится K или Q; или (ii) в положении 110 находится K или Q и в положении 11 находится V; или (iii) в положении 89 находится T; или (iv) в положении 89 находится L и в положении 110 находится K или Q; или (v) в положении 11 находится V и в положении 89 находится L; или любые подходящие комбинации из (i)-(v). В частности, у таких доменов V_H против IL-23:

- аминокислотный остаток в положении 11 предпочтительно выбран из L, V и K (наиболее предпочтительно V);

- аминокислотный остаток в положении 14 предпочтительно выбран из A и P;

- аминокислотный остаток в положении 41 предпочтительно выбран из A и P;

- аминокислотный остаток в положении 89 предпочтительно выбран из T, V и L;

- аминокислотный остаток в положении 108 предпочтительно выбран из Q и L;

- аминокислотный остаток в положении 110 предпочтительно выбран из T, K и Q;

- аминокислотный остаток в положении 112 предпочтительно выбран из S, K и Q;

так что либо (i) в положении 112 находится K или Q; либо (ii) в положении 110 находится K или Q и в положении 11 находится V; либо (iii) в положении 89 находится T; либо (iv) в положении 89 находится L и в положении 110 находится K или Q; либо (v) в положении 11 находится V и в положении 89 находится L; или любые подходящие комбинации из (i)-(v).

Домены V_H по изобретению против IL-23 также могут быть такими, как описано здесь, в частности, опять же это могут быть ISVD (более предпочтительно нанотела) против IL-23 либо белки, полипептиды или другие соединения или конструкции, которые содержат по меньшей мере один такой ISVD. Такие белки, полипептиды или другие соединения или конструкции тоже могут быть такими, как уже описано здесь, и могут иметь, к примеру, повышенный период полураспада (т.е. как описано здесь, например, период полураспада - выраженный в виде t_½-бета - в организме человека по меньшей мере в 1 день, предпочтительно по меньшей мере в 3 дня, более предпочтительно по меньшей мере 7 дней, как-то по меньшей мере 10 дней), и с этой целью могут, к примеру, содержать связывающие сывороточный альбумин нанотела, которые также могут быть связывающими сывороточный альбумин нанотелами по изобретению (опять же, как описано здесь).

Кроме того, такие ISVD могут соответственно иметь C-концевое удлинение (как уже описано здесь и в WO 12/175741), в частности, когда данный ISVD образует C-терминальный конец содержащего его белка, полипептида или другого соединения или конструкции (опять же, как уже описано здесь).

В одном предпочтительном аспекте домены V_H по изобретению против IL-23 включают (i) последовательность CDR1, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 173 (что предпочтительно) или такую аминокислотную последовательность, которая отличается лишь по одной аминокислоте от последовательности SEQ ID NO: 173; (ii) последовательность CDR2, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 174 (что предпочтительно) или такую аминокислотную последовательность, которая отличается лишь по одной или двум аминокислотам от последовательности SEQ ID NO: 174; и (iii) последовательность CDR3, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 175 (что предпочтительно) или такую аминокислотную последовательность, которая отличается лишь по одной или двум аминокислотам от последовательности SEQ ID NO: 175.

Более предпочтительно, у доменов V_H по изобретению против IL-23 согласно этому аспекту: (i) CDR1 представлен SEQ ID NO: 173; (ii) CDR2 представлен SEQ ID NO: 174; и (iii) CDR3 представлен SEQ ID NO: 175.

В одном конкретном аспекте, нанотела по изобретению против IL-23 являются вариантами нанотела по SEQ ID NO: 172 (и по меньшей мере на 90% идентичны по последовательности, как-то по меньшей мере на 95% идентичны по последовательности SEQ ID NO: 172), у которых:

- аминокислотный остаток в положении 11 предпочтительно выбран из L, V и K (наиболее предпочтительно V);

- аминокислотный остаток в положении 14 предпочтительно выбран из A и P;

- аминокислотный остаток в положении 41 предпочтительно выбран из A и P;

- аминокислотный остаток в положении 89 предпочтительно выбран из T, V и L;

- аминокислотный остаток в положении 108 предпочтительно выбран из Q и L;

- аминокислотный остаток в положении 110 предпочтительно выбран из T, K и Q;

- аминокислотный остаток в положении 112 предпочтительно выбран из S, K и Q;

так что либо (i) в положении 112 находится K или Q; либо (ii) в положении 110 находится K или Q и в положении 11 находится V; либо (iii) в положении 89 находится T; либо (iv) в положении 89 находится L и в положении 110 находится K или Q; либо (v) в положении 11 находится V и в положении 89 находится L; или любые подходящие комбинации из (i)-(v). Участки CDR у таких ISVs предпочтительно такие, как определено в двух предыдущих абзацах.

В другом предпочтительном аспекте домены V_H по изобретению против IL-23 включают (i) последовательность CDR1, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 191 (что предпочтительно) или такую аминокислотную последовательность, которая отличается лишь по одной или двум аминокислотам от последовательности SEQ ID NO: 191; (ii) последовательность CDR2, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 192 (что предпочтительно) или такую аминокислотную последовательность, которая отличается лишь по одной аминокислоте от последовательности SEQ ID NO: 192; и (iii) последовательность CDR3, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 193 (что предпочтительно) или такую аминокислотную последовательность, которая отличается лишь по одной или двум аминокислотам от последовательности SEQ ID NO: 193.

Более предпочтительно, у доменов V_H по изобретению против IL-23 согласно этому аспекту: (i) CDR1 представлен SEQ ID NO: 191; (ii) CDR2 представлен SEQ ID NO: 192; и (iii) CDR3 представлен SEQ ID NO: 193.

В одном конкретном аспекте, нанотела по изобретению против IL-23 являются вариантами нанотела по SEQ ID NO: 190 (и по меньшей мере на 90% идентичны по последовательности, как-то по меньшей мере на 95% идентичны по последовательности SEQ ID NO: 190), у которых:

- аминокислотный остаток в положении 11 предпочтительно выбран из L, V и K (наиболее предпочтительно V);

- аминокислотный остаток в положении 14 предпочтительно выбран из A и P;

- аминокислотный остаток в положении 41 предпочтительно выбран из A и P;

- аминокислотный остаток в положении 89 предпочтительно выбран из T, V и L;

- аминокислотный остаток в положении 108 предпочтительно выбран из Q и L;

- аминокислотный остаток в положении 110 предпочтительно выбран из T, K и Q;

- аминокислотный остаток в положении 112 предпочтительно выбран из S, K и Q;

так что либо (i) в положении 112 находится K или Q; либо (ii) в положении 110 находится K или Q и в положении 11 находится V; либо (iii) в положении 89 находится T; либо (iv) в положении 89 находится L и в положении 110 находится K или Q; либо (v) в положении 11 находится V и в положении 89 находится L; или любые подходящие комбинации из (i)-(v). Участки CDR у таких ISVs предпочтительно такие, как определено в двух предыдущих абзацах.

Некоторые особенно предпочтительные, без ограничения, примеры таких нанотел по изобретению против IL-23 представлены на фиг. 12A как SEQ ID NOs: 176-189 и на фиг. 12B как SEQ ID NOs: 194-207, соответственно; и каждое из этих нанотел образует еще один аспект изобретения.

Изобретение также касается соединений по изобретению против IL-23, которые включают по меньшей мере одно (как-то одно, два или три) нанотела по изобретению по SEQ ID NOs: 176-189 и/или 194-207. Такие соединения по изобретению против IL-23 опять же могут быть такими, как уже описано здесь, и поэтому, к примеру, могут содержать подходящие линкеры, могут содержать C-концевое удлинение, как описано здесь, и могут иметь продленный период полураспада (например, потому, что они содержат нанотело против сывороточного альбумина человека, как-то (предпочтительно) нанотело по изобретению против сывороточного альбумина человека). Отсылаем к приведенной ниже табл. R.

Как описано, к примеру, в WO 2009/068627, WO 2010/142534 и WO 2011/135026, один особенно предпочтительный класс соединений на основе нанотел против IL-23 составляют бипаратопные соединения. Так, в одном аспекте изобретения, соединения по изобретению против IL-23 представляют собой бипаратопные конструкции, которые содержат один ISV, который имеет SEQ ID NO: 172 либо (предпочтительно) является таким ISV по изобретению, который был получен из SEQ ID NO: 172 (как описано в данном примере 8), и один ISV, который имеет SEQ ID NO: 190 либо (предпочтительно) является таким ISV по изобретению, который был получен из SEQ ID NO: 190 (как описано в данном примере 8), при условии, что по меньшей мере один (а предпочтительно оба) из этих ISV представляет собой ISV по изобретению. Такие бипаратопные конструкции также могут иметь продленный период полураспада (т.е. при помощи связывающего сывороточный альбумин ISV). Некоторые конкретные примеры таких бипаратопных конструкций приведены в SEQ ID NOs: 514-549.

Некоторые особенно предпочтительные примеры соединений по изобретению против IL-23 представлены на фиг. 22 в виде SEQ ID NOs: 514-549; и каждое из этих соединений образует еще один аспект изобретения. Так, в другом аспекте изобретение касается полипептидов, направленных против IL-23 и имеющих аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 514-549. В более общем смысле соединения по изобретению против IL-23 могут быть такими, как описано в WO 2009/068627, WO 2010/142534 и WO2011/135026, но содержать ISVs по изобретению. Они также могут применяться для целей, описанных в WO 2009/068627, WO 2010/142534 и WO 2011/135026.

Таблица R. Примеры соединений по изобретению против IL-23

Полипептид/ конструкция(¹) Общая формула Звенья/блоки ISV и линкеры Моновалентная [IL-23] [IL-23] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 Моновалентная с C-концевым удлинением [IL-23]-X(n) [IL-23] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 Моновалентная с продленным t полураспада [IL-23]-L₁-[SA]
[SA]-L₁-[IL-23] [IL-23] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495
[SA] = (см. подпись внизу)
L₁ = (см. подпись внизу) Моновалентная с продленным t полураспада и C-концевым удлинением [IL-23]-L₁-[SA]-X(n)
[SA]-L₁-[IL-23]-X(n) [IL-23] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495
[SA] = (см. подпись внизу)
L₁ = (см. подпись внизу)
X(n) = (см. подпись внизу) Бивалентная(²) [IL-23]-L₁-[IL-23] по меньшей мере один из [IL-23]
= одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
L₁ = (см. подпись внизу) Бивалентная с C-концевым удлинением (²) [IL-23]-L₁-[IL-23]-X(n) по меньшей мере один из [IL-23]
= одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
L₁ = (см. подпись внизу)
X(n) = (см. подпись внизу) Бивалентная с продленным t полураспада (²) [IL-23]-L₁-[IL-23]-L₂-[SA]
[IL-23]-L₁-[SA]-L₂-[IL-23]
[SA]-L₁-[IL-23]-L₂-[IL-23] по меньшей мере один из [IL-23]
= одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
[SA] = (см. подпись внизу)
L₁ = (см. подпись внизу)
L₂ = (см. подпись внизу) Бивалентная с продленным t полураспада и C-концевым удлинением (²) [IL-23]-L₁-[IL-23]-L₂-[SA]-X(n)
[IL-23]-L₁-[SA]-L₂-[IL-23]-X(n)
[SA]-L₁-[IL-23]-L₂-[IL-23]-X(n) по меньшей мере один из [IL-23]
= одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
[SA] = (см. подпись внизу)
L₁ = (см. подпись внизу)
L₂ = (см. подпись внизу)
X(n) = (см. подпись внизу) Биспецифичная (³) [IL-23]-L₁-[Nb]
[Nb]-L₁-[IL-23]
[IL-23]-L₁-[IL-23]-L₂-[Nb]
[IL-23]-L₁-[Nb]-L₂-[IL-23]
[Nb]-L₁-[IL-23]-L₂-[IL-23] по меньшей мере один из [IL-23]
= одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
L₁ = (см. подпись внизу)
L₂ = (см. подпись внизу)
[Nb] = (см. подпись внизу) Биспецифичная с C-концевым удлинением (³) [IL-23]-L₁-[Nb]-X(n)
[Nb]-L₁-[IL-23]-X(n)
[IL-23]-L₁-[IL-23]-L₂-[Nb]-X(n)
[IL-23]-L₁-[Nb]-L₂-[IL-23]-X(n)
[Nb]-L₁-[IL-23]-L₂-[IL-23]-X(n) по меньшей мере один из [IL-23]
= одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
L₁ = (см. подпись внизу)
L₂ = (см. подпись внизу)
X(n) = (см. подпись внизу)
[Nb] = (см. подпись внизу) Биспецифичная с продленным t полураспада (³) [IL-23]-L₁-[Nb]-L₂-[SA]
[IL-23]-L₁-[SA]-L₂-[Nb]
[Nb]-L₁-[SA]-L₂-[IL-23]
[Nb]-L₁-[IL-23]-L₂-[SA]
[SA]-L₁-[IL-23]-L₂-[Nb]
[SA]-L₁-[Nb]-L₂-[IL-23]
[IL-23]-L₁-[IL-23]-L₂-[Nb]-L₃-[SA]
[Nb]-L₁-[IL-23]-L₂-[IL-23]-L₃-[SA]
[SA]-L₁-[IL-23]-L₂-[IL-23]-L₃-[Nb]
[SA]-L₁-[IL-23]-L₂-[Nb]-L₃-[IL-23]
[IL-23]-L₁-[Nb]-L₂-[IL-23]-L₃-[SA] по меньшей мере один из [IL-23]
= одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
[SA] = (см. подпись внизу)
L₁, L₂, L₃ (см. подпись внизу)
[Nb] = (см. подпись внизу) Биспецифичная с продленным t полураспада и C-концевым удлинением (³) [IL-23]-L₁-[Nb]-L₂-[SA]-X(n)
[IL-23]-L₁-[SA]-L₂-[Nb]-X(n)
[Nb]-L₁-[SA]-L₂-[IL-23]-X(n)
[Nb]-L₁-[IL-23]-L₂-[SA]-X(n)
[SA]-L₁-[IL-23]-L₂-[Nb]-X(n)
[SA]-L₁-[Nb]-L₂-[IL-23]-X(n)
[IL-23]-L₁-[IL-23]-L₂-[Nb]-L₃-[SA]-X(n)
[Nb]-L₁-[IL-23]-L₂-[IL-23]-L₃-[SA]-X(n)
[SA]-L₁-[IL-23]-L₂-[IL-23]-L₃-[Nb]-X(n)
[SA]-L₁-[IL-23]-L₂-[Nb]-L₃-[IL-23]-X(n)
[IL-23]-L₁-[Nb]-L₂-[IL-23]-L₃-[SA]-X(n) по меньшей мере один из [IL-23]
= одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
[SA] = (см. подпись внизу)
L₁, L₂, L₃ (см. подпись внизу)
X(n) = (см. подпись внизу)
[Nb] = (см. подпись внизу)

Обозначения

- [SA] означает ISV против сывороточного альбумина (человека), предпочтительно ISV по изобретению против сывороточного альбумина (человека), более предпочтительно по SEQ ID NO: 46 или 61, а еще более предпочтительно один из ISVD по изобретению по SEQ ID NOs: 47, 54, 62, 69, 78, 86, 109, 116, 123, 130 или 496-513.

- Каждый из L₁, L₂ и L₃ (независимо) означает соответствующий линкер. Каждый из L₁, L₂ и L₃ может (независимо) присутствовать или отсутствовать. Неограничительные примеры подходящих линкеров - приведенные здесь линкеры Gly-Ser, как-то линкеры 9GS, 30GS или 35GS.

- X(n) = C-концевое удлинение типа описанных здесь и/или в WO 12/175741.

- [Nb] означает ISV против другой терапевтической мишени.

Примечания

(¹) В настоящей таблице:

- “Моновалентный” обычно относится к полипептидам/конструкциям, содержащим одиночный ISV против IL-23. Они также могут содержать ISV, продлевающие t полураспада (типа ISV против сывороточного альбумина).

- “Бивалентный” обычно относится к полипептидам/конструкциям, содержащим два ISV против IL-23 (которые могут быть одинаковыми или разными). Они тоже могут содержать ISV, продлевающие t полураспада (типа ISV против сывороточного альбумина).

- “Биспецифичный” обычно относится к полипептидам/конструкциям, содержащим по меньшей мере один (как-то 1 или 2) ISV против IL-23 и еще по меньшей мере один (как-то 1 или 2) другой ISV против терапевтической мишени. Они также могут содержать ISV, продлевающие t полураспада (типа ISV против сывороточного альбумина).

- В полипептидах/конструкциях, приведенных в данной таблице, по меньшей мере один из ISV против IL-23 представлен ISV по изобретению, а предпочтительно все ISV против IL-23 в таких полипептидах/конструкциях представлены ISV по изобретению. А когда в таких полипептидах/конструкциях присутствует ISV, продлевающий t полураспада, и/или ISV против другой терапевтической мишени, то каждый из них (а предпочтительно все) также может быть представлен (а предпочтительно все они представлены) ISV по изобретению.

(²) Все “бивалентные” конструкции в данной таблице также могут быть бипаратопными, то есть они могут содержать по меньшей мере два (как-то два) ISV против IL-23, которые направлены против разных эпитопов на IL-23.

(³) Специалистам должно быть ясно, что с помощью указанных звеньев/блоков и линкеров могут быть получены и другие/дополнительные биспецифичные конструкции, чем приведенные здесь.

(⁴) Предпочтительно каждый из [IL-23] выбран независимо из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495. К тому же данные [IL-23] могут быть одинаковыми или разными; а в бипаратопных полипептидах/конструкциях они должны быть направлены против разных эпитопов на IL-23.

(⁵) Каждые из полипептидов/конструкций, приведенных в этом столбце при помощи SEQ ID, составляют отдельные конкретные аспекты изобретения.

Пример 9. Домены V_H (в частности, нанотела) против OX40-L и содержащие их соединения по изобретению

В одном конкретном аспекте, домены V_H по изобретению (в особенности ISVDs по изобретению и более предпочтительно нанотела по изобретению) и соединения по изобретению могут быть направлены против OX40-L.

Такие домены V_H по изобретению против OX40-L обычно содержат: (i) подходящие каркасные последовательности, которые соответственно включают аминокислотные остатки/мутации по изобретению, как описано здесь; а также (ii) последовательности CDR, которые позволяют доменам V_H по изобретению специфически связываться с OX40-L. Кроме того, такие домены V_H по изобретению против OX40-L также могут содержать C-концевое удлинение, как описано здесь, в частности, когда данный домен V_H является моновалентным или образует C-терминальный конец того соединения по изобретению, в котором находится данный домен V_H (опять же, как уже описано здесь). Такие домены V_H по изобретению против OX40-L также могут быть такими, как уже описано здесь, в частности, это могут быть ISVDs.

Опять же, как и с другими аспектами и воплощениями изобретения, описанными здесь, когда определенный ISVD (типа ISVD против OX40-L, описанных в данном примере) или содержащее его соединение, как говорится, “соответствует изобретению” или “как уже описано здесь”, то к данному конкретному ISVD или соединению, соответственно, также определенно применимы предпочтительные аспекты/воплощения и предпочтения, которые вообще описаны здесь для ISVD или соединений по изобретению, если прямо не указано иначе или если конкретный технический контекст не требует иного.

Итак, в предпочтительном аспекте настоящее изобретение касается доменов V_H (в особенности ISVD), направленных против OX40-L, у которых (i) в положении 112 находится K или Q; или (ii) в положении 110 находится K или Q и в положении 11 находится V; или (iii) в положении 89 находится T; или (iv) в положении 89 находится L и в положении 110 находится K или Q; или (v) в положении 11 находится V и в положении 89 находится L; или любые подходящие комбинации из (i)-(v). В частности, у таких доменов V_H против OX40-L:

- аминокислотный остаток в положении 11 предпочтительно выбран из L, V и K (наиболее предпочтительно V);

- аминокислотный остаток в положении 14 предпочтительно выбран из A и P;

- аминокислотный остаток в положении 41 предпочтительно выбран из A и P;

- аминокислотный остаток в положении 89 предпочтительно выбран из T, V и L;

- аминокислотный остаток в положении 108 предпочтительно выбран из Q и L;

- аминокислотный остаток в положении 110 предпочтительно выбран из T, K и Q;

- аминокислотный остаток в положении 112 предпочтительно выбран из S, K и Q;

так что либо (i) в положении 112 находится K или Q; либо (ii) в положении 110 находится K или Q и в положении 11 находится V; либо (iii) в положении 89 находится T; либо (iv) в положении 89 находится L и в положении 110 находится K или Q; либо (v) в положении 11 находится V и в положении 89 находится L; или любые подходящие комбинации из (i)-(v).

Домены V_H по изобретению против OX40-L также могут быть такими, как описано здесь, в частности, опять же это могут быть ISVD (более предпочтительно нанотела) против OX40-L либо белки, полипептиды или другие соединения или конструкции, которые содержат по меньшей мере один такой ISVD. Такие белки, полипептиды или другие соединения или конструкции тоже могут быть такими, как уже описано здесь, и могут иметь, к примеру, повышенный период полураспада (т.е. как описано здесь, например, период полураспада - выраженный в виде t_½-бета - в организме человека по меньшей мере в 1 день, предпочтительно по меньшей мере в 3 дня, более предпочтительно по меньшей мере 7 дней, как-то по меньшей мере 10 дней), и с этой целью могут, к примеру, содержать связывающие сывороточный альбумин нанотела, которые также могут быть связывающими сывороточный альбумин нанотелами по изобретению (опять же, как описано здесь).

Кроме того, такие ISVD могут соответственно иметь C-концевое удлинение (как уже описано здесь и в WO 12/175741), в частности, когда данный ISVD образует C-терминальный конец содержащего его белка, полипептида или другого соединения или конструкции (опять же, как уже описано здесь).

В одном предпочтительном аспекте домены V_H по изобретению против OX40-L включают (i) последовательность CDR1, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 209 (что предпочтительно) или такую аминокислотную последовательность, которая отличается лишь по одной аминокислоте от последовательности SEQ ID NO: 209; (ii) последовательность CDR2, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 210 (что предпочтительно) или такую аминокислотную последовательность, которая отличается лишь по одной или двум аминокислотам от последовательности SEQ ID NO: 210; и (iii) последовательность CDR3, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 211 (что предпочтительно) или такую аминокислотную последовательность, которая отличается лишь по одной или двум аминокислотам от последовательности SEQ ID NO: 211.

Более предпочтительно, у доменов V_H по изобретению против OX40-L согласно этому аспекту: (i) CDR1 представлен SEQ ID NO: 209; (ii) CDR2 представлен SEQ ID NO: 210; и (iii) CDR3 представлен SEQ ID NO: 211.

В одном конкретном аспекте, нанотела по изобретению против OX40-L являются вариантами нанотела по SEQ ID NO: 208 (и по меньшей мере на 90% идентичны по последовательности, как-то по меньшей мере на 95% идентичны по последовательности SEQ ID NO: 208), у которых:

- аминокислотный остаток в положении 11 предпочтительно выбран из L, V и K (наиболее предпочтительно V);

- аминокислотный остаток в положении 14 предпочтительно выбран из A и P;

- аминокислотный остаток в положении 41 предпочтительно выбран из A и P;

- аминокислотный остаток в положении 89 предпочтительно выбран из T, V и L;

- аминокислотный остаток в положении 108 предпочтительно выбран из Q и L;

- аминокислотный остаток в положении 110 предпочтительно выбран из T, K и Q;

- аминокислотный остаток в положении 112 предпочтительно выбран из S, K и Q;

так что либо (i) в положении 112 находится K или Q; либо (ii) в положении 110 находится K или Q и в положении 11 находится V; либо (iii) в положении 89 находится T; либо (iv) в положении 89 находится L и в положении 110 находится K или Q; либо (v) в положении 11 находится V и в положении 89 находится L; или любые подходящие комбинации из (i)-(v). Участки CDR у таких ISVs предпочтительно такие, как определено в двух предыдущих абзацах.

Некоторые особенно предпочтительные, без ограничения, примеры таких нанотел по изобретению против OX40-L представлены на фиг. 13 как SEQ ID NOs: 212-225; и каждое из этих нанотел образует еще один аспект изобретения.

Изобретение также касается соединений по изобретению против OX40-L, которые включают по меньшей мере одно (как-то одно, два или три) нанотела по изобретению по SEQ ID NOs: 212-225. Такие соединения по изобретению против OX40-L опять же могут быть такими, как уже описано здесь, и поэтому, к примеру, могут содержать подходящие линкеры, могут содержать C-концевое удлинение, как описано здесь, и могут иметь продленный период полураспада (например, потому, что они содержат нанотело против сывороточного альбумина человека, как-то (предпочтительно) нанотело по изобретению против сывороточного альбумина человека). Отсылаем к приведенной ниже табл. S.

Некоторые особенно предпочтительные примеры соединений по изобретению против OX40-L представлены на фиг. 23 в виде SEQ ID NOs: 550-585; и каждое из этих соединений образует еще один аспект изобретения. Так, в другом аспекте изобретение касается полипептидов, направленных против OX40-L и имеющих аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 550-585. В более общем смысле соединения по изобретению против OX40-L могут быть такими, как описано в WO 2011/073180, но содержать ISVs по изобретению. Они также могут применяться для целей, описанных в WO 2011/073180.

Таблица S. Примеры соединений по изобретению против OX40-L

Полипептид/ конструкция(¹) Общая формула Звенья/блоки ISV и линкеры Моновалентная [OX40-L] [OX40-L] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 Моновалентная с C-концевым удлинением [OX40-L]-X(n) [OX40-L] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 Моновалентная с продленным t полураспада [OX40-L]-L₁-[SA]
[SA]-L₁-[OX40-L] [OX40-L] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495
[SA] = (см. подпись внизу)
L₁ = (см. подпись внизу) Моновалентная с продленным t полураспада и C-концевым удлинением [OX40-L]-L₁-[SA]-X(n)
[SA]-L₁-[OX40-L]-X(n) [OX40-L] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495
[SA] = (см. подпись внизу)
L₁ = (см. подпись внизу)
X(n) = (см. подпись внизу) Бивалентная(²) [OX40-L]-L₁-[OX40-L] по меньшей мере один из [OX40-L] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
L₁ = (см. подпись внизу) Бивалентная с C-концевым удлинением (²) [OX40-L]-L₁-[OX40-L]-X(n) по меньшей мере один из [OX40-L] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
L₁ = (см. подпись внизу)
X(n) = (см. подпись внизу) Бивалентная с продленным t полураспада (²) [OX40-L]-L₁-[OX40-L]-L₂-[SA]
[OX40-L]-L₁-[SA]-L₂-[OX40-L]
[SA]-L₁-[OX40-L]-L₂-[OX40-L] по меньшей мере один из [OX40-L] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
[SA] = (см. подпись внизу)
L₁ = (см. подпись внизу)
L₂ = (см. подпись внизу) Бивалентная с продленным t полураспада и C-концевым удлинением (²) [OX40-L]-L₁-[OX40-L]-L₂-[SA]-X(n)
[OX40-L]-L₁-[SA]-L₂-[OX40-L]-X(n)
[SA]-L₁-[OX40-L]-L₂-[OX40-L]-X(n) по меньшей мере один из [OX40-L] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
[SA] = (см. подпись внизу)
L₁ = (см. подпись внизу)
L₂ = (см. подпись внизу)
X(n) = (см. подпись внизу) Биспецифичная (³) [OX40-L]-L₁-[Nb]
[Nb]-L₁-[OX40-L]
[OX40-L]-L₁-[OX40-L]-L₂-[Nb]
[OX40-L]-L₁-[Nb]-L₂-[OX40-L]
[Nb]-L₁-[OX40-L]-L₂-[OX40-L] по меньшей мере один из [OX40-L] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
L₁ = (см. подпись внизу)
L₂ = (см. подпись внизу)
[Nb] = (см. подпись внизу) Биспецифичная с C-концевым удлинением (³) [OX40-L]-L₁-[Nb]-X(n)
[Nb]-L₁-[OX40-L]-X(n)
[OX40-L]-L₁-[OX40-L]-L₂-[Nb]-X(n)
[OX40-L]-L₁-[Nb]-L₂-[OX40-L]-X(n)
[Nb]-L₁-[OX40-L]-L₂-[OX40-L]-X(n) по меньшей мере один из [OX40-L] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
L₁ = (см. подпись внизу)
L₂ = (см. подпись внизу)
X(n) = (см. подпись внизу)
[Nb] = (см. подпись внизу) Биспецифичная с продленным t полураспада (³) [OX40-L]-L₁-[Nb]-L₂-[SA]
[OX40-L]-L₁-[SA]-L₂-[Nb]
[Nb]-L₁-[SA]-L₂-[OX40-L]
[Nb]-L₁-[OX40-L]-L₂-[SA]
[SA]-L₁-[OX40-L]-L₂-[Nb]
[SA]-L₁-[Nb]-L₂-[OX40-L]
[OX40-L]-L₁-[OX40-L]-L₂-[Nb]-L₃-[SA]
[Nb]-L₁-[OX40-L]-L₂-[OX40-L]-L₃-[SA]
[SA]-L₁-[OX40-L]-L₂-[OX40-L]-L₃-[Nb]
[SA]-L₁-[OX40-L]-L₂-[Nb]-L₃-[OX40-L]
[OX40-L]-L₁-[Nb]-L₂-[OX40-L]-L₃-[SA] по меньшей мере один из [OX40-L] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
[SA] = (см. подпись внизу)
L₁, L₂, L₃ (см. подпись внизу)
[Nb] = (см. подпись внизу) Биспецифичная с продленным t полураспада и C-концевым удлинением (³) [OX40-L]-L₁-[Nb]-L₂-[SA]-X(n)
[OX40-L]-L₁-[SA]-L₂-[Nb]-X(n)
[Nb]-L₁-[SA]-L₂-[OX40-L]-X(n)
[Nb]-L₁-[OX40-L]-L₂-[SA]-X(n)
[SA]-L₁-[OX40-L]-L₂-[Nb]-X(n)
[SA]-L₁-[Nb]-L₂-[OX40-L]-X(n)
[OX40-L]-L₁-[OX40-L]-L₂-[Nb]-L₃-[SA]-X(n)
[Nb]-L₁-[OX40-L]-L₂-[OX40-L]-L₃-[SA]-X(n)
[SA]-L₁-[OX40-L]-L₂-[OX40-L]-L₃-[Nb]-X(n)
[SA]-L₁-[OX40-L]-L₂-[Nb]-L₃-[OX40-L]-X(n)
[OX40-L]-L₁-[Nb]-L₂-[OX40-L]-L₃-[SA]-X(n) по меньшей мере один из [OX40-L] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
[SA] = (см. подпись внизу)
L₁, L₂, L₃ (см. подпись внизу)
X(n) = (см. подпись внизу)
[Nb] = (см. подпись внизу)

Обозначения

- [SA] означает ISV против сывороточного альбумина (человека), предпочтительно ISV по изобретению против сывороточного альбумина (человека), более предпочтительно по SEQ ID NO: 46 или 61, а еще более предпочтительно один из ISVD по изобретению по SEQ ID NOs: 47, 54, 62, 69, 78, 86, 109, 116, 123, 130 или 496-513.

- Каждый из L₁, L₂ и L₃ (независимо) означает соответствующий линкер. Каждый из L₁, L₂ и L₃ может (независимо) присутствовать или отсутствовать. Неограничительные примеры подходящих линкеров - приведенные здесь линкеры Gly-Ser, как-то линкеры 9GS, 30GS или 35GS.

- X(n) = C-концевое удлинение типа описанных здесь и/или в WO 12/175741.

- [Nb] означает ISV против другой терапевтической мишени.

Примечания

(¹) В настоящей таблице:

- “Моновалентный” обычно относится к полипептидам/конструкциям, содержащим одиночный ISV против OX40-L. Они также могут содержать ISV, продлевающие t полураспада (типа ISV против сывороточного альбумина).

- “Бивалентный” обычно относится к полипептидам/конструкциям, содержащим два ISV против OX40-L (которые могут быть одинаковыми или разными). Они тоже могут содержать ISV, продлевающие t полураспада (типа ISV против сывороточного альбумина).

- “Биспецифичный” обычно относится к полипептидам/конструкциям, содержащим по меньшей мере один (как-то 1 или 2) ISV против OX40-L и еще по меньшей мере один (как-то 1 или 2) другой ISV против терапевтической мишени. Они также могут содержать ISV, продлевающие t полураспада (типа ISV против сывороточного альбумина).

- В полипептидах/конструкциях, приведенных в данной таблице, по меньшей мере один из ISV против OX40-L представлен ISV по изобретению, а предпочтительно все ISV против OX40-L в таких полипептидах/конструкциях представлены ISV по изобретению. А когда в таких полипептидах/конструкциях присутствует ISV, продлевающий t полураспада, и/или ISV против другой терапевтической мишени, то каждый из них (а предпочтительно все) также может быть представлен (а предпочтительно все они представлены) ISV по изобретению.

(²) Все “бивалентные” конструкции в данной таблице также могут быть бипаратопными, то есть они могут содержать по меньшей мере два (как-то 2) ISV против OX40-L, которые направлены против разных эпитопов на OX40-L.

(³) Специалистам должно быть ясно, что с помощью указанных звеньев/блоков и линкеров могут быть получены и другие/дополнительные биспецифичные конструкции, чем приведенные здесь.

(⁴) Предпочтительно каждый из [OX40-L] выбран независимо из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495. К тому же данные [OX40-L] могут быть одинаковыми или разными; а в бипаратопных полипептидах/конструкциях они должны быть направлены против разных эпитопов на OX40-L.

(⁵) Каждые из полипептидов/конструкций, приведенных в этом столбце при помощи SEQ ID, составляют отдельные конкретные аспекты изобретения.

Пример 10. Домены V_H (в частности, нанотела) против IgE и содержащие их соединения по изобретению

В одном конкретном аспекте, домены V_H по изобретению (в особенности ISVDs
по изобретению и более предпочтительно нанотела по изобретению) и соединения по изобретению могут быть направлены против IgE.

Такие домены V_H по изобретению против IgE обычно содержат: (i) подходящие каркасные последовательности, которые соответственно включают аминокислотные остатки/мутации по изобретению, как описано здесь; а также (ii) последовательности CDR, которые позволяют доменам V_H по изобретению специфически связываться с IgE. Кроме того, такие домены V_H по изобретению против IgE также могут содержать C-концевое удлинение, как описано здесь, в частности, когда данный домен V_H является моновалентным или образует C-терминальный конец того соединения по изобретению, в котором находится данный домен V_H (опять же, как уже описано здесь). Такие домены V_H по изобретению против IgE также могут быть такими, как уже описано здесь, в частности, это могут быть ISVDs.

Опять же, как и с другими аспектами и воплощениями изобретения, описанными здесь, когда определенный ISVD (типа ISVD против IgE, описанных в данном примере) или содержащее его соединение, как говорится, “соответствует изобретению” или “как уже описано здесь”, то к данному конкретному ISVD или соединению, соответственно, также определенно применимы предпочтительные аспекты/воплощения и предпочтения, которые вообще описаны здесь для ISVD или соединений по изобретению, если прямо не указано иначе или если конкретный технический контекст не требует иного.

Итак, в предпочтительном аспекте настоящее изобретение касается доменов V_H (в особенности ISVD), направленных против IgE, у которых (i) в положении 112 находится K или Q; или (ii) в положении 110 находится K или Q и в положении 11 находится V; или (iii) в положении 89 находится T; или (iv) в положении 89 находится L и в положении 110 находится K или Q; или (v) в положении 11 находится V и в положении 89 находится L; или любые подходящие комбинации из (i)-(v). В частности, у таких доменов V_H против IgE:

- аминокислотный остаток в положении 11 предпочтительно выбран из L, V и K (наиболее предпочтительно V);

- аминокислотный остаток в положении 14 предпочтительно выбран из A и P;

- аминокислотный остаток в положении 41 предпочтительно выбран из A и P;

- аминокислотный остаток в положении 89 предпочтительно выбран из T, V и L;

- аминокислотный остаток в положении 108 предпочтительно выбран из Q и L;

- аминокислотный остаток в положении 110 предпочтительно выбран из T, K и Q;

- аминокислотный остаток в положении 112 предпочтительно выбран из S, K и Q;

так что либо (i) в положении 112 находится K или Q; либо (ii) в положении 110 находится K или Q и в положении 11 находится V; либо (iii) в положении 89 находится T; либо (iv) в положении 89 находится L и в положении 110 находится K или Q; либо (v) в положении 11 находится V и в положении 89 находится L; или любые подходящие комбинации из (i)-(v).

Домены V_H по изобретению против IgE также могут быть такими, как описано здесь, в частности, опять же это могут быть ISVD (более предпочтительно нанотела) против IgE либо белки, полипептиды или другие соединения или конструкции, которые содержат по меньшей мере один такой ISVD. Такие белки, полипептиды или другие соединения или конструкции тоже могут быть такими, как уже описано здесь, и могут иметь, к примеру, повышенный период полураспада (т.е. как описано здесь, например, период полураспада - выраженный в виде t_½-бета - в организме человека по меньшей мере в 1 день, предпочтительно по меньшей мере в 3 дня, более предпочтительно по меньшей мере 7 дней, как-то по меньшей мере 10 дней), и с этой целью могут, к примеру, содержать связывающие сывороточный альбумин нанотела, которые также могут быть связывающими сывороточный альбумин нанотелами по изобретению (опять же, как описано здесь).

Кроме того, такие ISVD могут соответственно иметь C-концевое удлинение (как уже описано здесь и в WO 12/175741), в частности, когда данный ISVD образует C-терминальный конец содержащего его белка, полипептида или другого соединения или конструкции (опять же, как уже описано здесь).

В одном предпочтительном аспекте домены V_H по изобретению против IgE включают (i) последовательность CDR1, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 227 (что предпочтительно) или такую аминокислотную последовательность, которая отличается лишь по одной аминокислоте от последовательности SEQ ID NO: 227; (ii) последовательность CDR2, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 228 (что предпочтительно) или такую аминокислотную последовательность, которая отличается лишь по одной или двум аминокислотам от последовательности SEQ ID NO: 228; и (iii) последовательность CDR3, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 229 (что предпочтительно) или такую аминокислотную последовательность, которая отличается лишь по одной или двум аминокислотам от последовательности SEQ ID NO: 229.

Более предпочтительно, у доменов V_H по изобретению против IgE согласно этому аспекту: (i) CDR1 представлен SEQ ID NO: 227; (ii) CDR2 представлен SEQ ID NO: 228; и (iii) CDR3 представлен SEQ ID NO: 229.

В одном конкретном аспекте, нанотела по изобретению против IgE являются вариантами нанотела по SEQ ID NO: 226 (и по меньшей мере на 90% идентичны по последовательности, как-то по меньшей мере на 95% идентичны по последовательности SEQ ID NO: 226), у которых:

- аминокислотный остаток в положении 11 предпочтительно выбран из L, V и K (наиболее предпочтительно V);

- аминокислотный остаток в положении 14 предпочтительно выбран из A и P;

- аминокислотный остаток в положении 41 предпочтительно выбран из A и P;

- аминокислотный остаток в положении 89 предпочтительно выбран из T, V и L;

- аминокислотный остаток в положении 108 предпочтительно выбран из Q и L;

- аминокислотный остаток в положении 110 предпочтительно выбран из T, K и Q;

- аминокислотный остаток в положении 112 предпочтительно выбран из S, K и Q;

так что либо (i) в положении 112 находится K или Q; либо (ii) в положении 110 находится K или Q и в положении 11 находится V; либо (iii) в положении 89 находится T; либо (iv) в положении 89 находится L и в положении 110 находится K или Q; либо (v) в положении 11 находится V и в положении 89 находится L; или любые подходящие комбинации из (i)-(v). Участки CDR у таких ISVs предпочтительно такие, как определено в двух предыдущих абзацах.

Некоторые особенно предпочтительные, без ограничения, примеры таких нанотел по изобретению против IgE представлены на фиг. 14 как SEQ ID NOs: 230-243; и каждое из этих нанотел образует еще один аспект изобретения.

Изобретение также касается соединений по изобретению против IgE, которые включают по меньшей мере одно (как-то одно, два или три) нанотела по изобретению по SEQ ID NOs: 230-243. Такие соединения по изобретению против IgE опять же могут быть такими, как уже описано здесь, и поэтому, к примеру, могут содержать подходящие линкеры, могут содержать C-концевое удлинение, как описано здесь, и могут иметь продленный период полураспада (например, потому, что они содержат нанотело против сывороточного альбумина человека, как-то (предпочтительно) нанотело по изобретению против сывороточного альбумина человека). Отсылаем к приведенной ниже табл. T.

Некоторые особенно предпочтительные примеры соединений по изобретению против IgE представлены на фиг. 24 в виде SEQ ID NOs: 586-594; и каждое из этих соединений образует еще один аспект изобретения. Так, в другом аспекте изобретение касается полипептидов, направленных против IgE и имеющих аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 586-594.

В более общем смысле соединения по изобретению против IgE могут быть такими, как описано в WO 2012/175740 и соответствующих частях WO 2012/175400, но содержать ISVs по изобретению. Они также могут применяться для целей, описанных в WO 2012/175740.

Таблица T. Примеры соединений по изобретению против IgE

Полипептид/ конструкция(¹) Общая формула Звенья/блоки ISV и линкеры Моновалентная [IgE] [IgE] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 Моновалентная с C-концевым удлинением [IgE]-X(n) [IgE] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 Моновалентная с продленным t полураспада [IgE]-L₁-[SA]
[SA]-L₁-[IgE] [IgE] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495
[SA] = (см. подпись внизу)
L₁ = (см. подпись внизу) Моновалентная с продленным t полураспада и C-концевым удлинением [IgE]-L₁-[SA]-X(n)
[SA]-L₁-[IgE]-X(n) [IgE] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495
[SA] = (см. подпись внизу)
L₁ = (см. подпись внизу)
X(n) = (см. подпись внизу) Бивалентная(²) [IgE]-L₁-[IgE] по меньшей мере один из [IgE]
= одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
L₁ = (см. подпись внизу) Бивалентная с C-концевым удлинением (²) [IgE]-L₁-[IgE]-X(n) по меньшей мере один из [IgE]
= одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
L₁ = (см. подпись внизу)
X(n) = (см. подпись внизу) Бивалентная с продленным t полураспада (²) [IgE]-L₁-[IgE]-L₂-[SA]
[IgE]-L₁-[SA]-L₂-[IgE]
[SA]-L₁-[IgE]-L₂-[IgE] по меньшей мере один из [IgE]
= одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
[SA] = (см. подпись внизу)
L₁ = (см. подпись внизу)
L₂ = (см. подпись внизу) Бивалентная с продленным t полураспада и C-концевым удлинением (²) [IgE]-L₁-[IgE]-L₂-[SA]-X(n)
[IgE]-L₁-[SA]-L₂-[IgE]-X(n)
[SA]-L₁-[IgE]-L₂-[IgE]-X(n) по меньшей мере один из [IgE]
= одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
[SA] = (см. подпись внизу)
L₁ = (см. подпись внизу)
L₂ = (см. подпись внизу)
X(n) = (см. подпись внизу) Биспецифичная (³) [IgE]-L₁-[Nb]
[Nb]-L₁-[IgE]
[IgE]-L₁-[IgE]-L₂-[Nb]
[IgE]-L₁-[Nb]-L₂-[IgE]
[Nb]-L₁-[IgE]-L₂-[IgE] по меньшей мере один из [IgE]
= одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
L₁ = (см. подпись внизу)
L₂ = (см. подпись внизу)
[Nb] = (см. подпись внизу) Биспецифичная с C-концевым удлинением (³) [IgE]-L₁-[Nb]-X(n)
[Nb]-L₁-[IgE]-X(n)
[IgE]-L₁-[IgE]-L₂-[Nb]-X(n)
[IgE]-L₁-[Nb]-L₂-[IgE]-X(n)
[Nb]-L₁-[IgE]-L₂-[IgE]-X(n) по меньшей мере один из [IgE]
= одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
L₁ = (см. подпись внизу)
L₂ = (см. подпись внизу)
X(n) = (см. подпись внизу)
[Nb] = (см. подпись внизу) Биспецифичная с продленным t полураспада (³) [IgE]-L₁-[Nb]-L₂-[SA]
[IgE]-L₁-[SA]-L₂-[Nb]
[Nb]-L₁-[SA]-L₂-[IgE]
[Nb]-L₁-[IgE]-L₂-[SA]
[SA]-L₁-[IgE]-L₂-[Nb]
[SA]-L₁-[Nb]-L₂-[IgE]
[IgE]-L₁-[IgE]-L₂-[Nb]-L₃-[SA]
[Nb]-L₁-[IgE]-L₂-[IgE]-L₃-[SA]
[SA]-L₁-[IgE]-L₂-[IgE]-L₃-[Nb]
[SA]-L₁-[IgE]-L₂-[Nb]-L₃-[IgE]
[IgE]-L₁-[Nb]-L₂-[IgE]-L₃-[SA] по меньшей мере один из [IgE]
= одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
[SA] = (см. подпись внизу)
L₁, L₂, L₃ (см. подпись внизу)
[Nb] = (см. подпись внизу) Биспецифичная с продленным t полураспада и C-концевым удлинением (³) [IgE]-L₁-[Nb]-L₂-[SA]-X(n)
[IgE]-L₁-[SA]-L₂-[Nb]-X(n)
[Nb]-L₁-[SA]-L₂-[IgE]-X(n)
[Nb]-L₁-[IgE]-L₂-[SA]-X(n)
[SA]-L₁-[IgE]-L₂-[Nb]-X(n)
[SA]-L₁-[Nb]-L₂-[IgE]-X(n)
[IgE]-L₁-[IgE]-L₂-[Nb]-L₃-[SA]-X(n)
[Nb]-L₁-[IgE]-L₂-[IgE]-L₃-[SA]-X(n)
[SA]-L₁-[IgE]-L₂-[IgE]-L₃-[Nb]-X(n)
[SA]-L₁-[IgE]-L₂-[Nb]-L₃-[IgE]-X(n)
[IgE]-L₁-[Nb]-L₂-[IgE]-L₃-[SA]-X(n) по меньшей мере один из [IgE]
= одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
[SA] = (см. подпись внизу)
L₁, L₂, L₃ (см. подпись внизу)
X(n) = (см. подпись внизу)
[Nb] = (см. подпись внизу)

Обозначения

- [SA] означает ISV против сывороточного альбумина (человека), предпочтительно ISV по изобретению против сывороточного альбумина (человека), более предпочтительно по SEQ ID NO: 46 или 61, а еще более предпочтительно один из ISVD по изобретению по SEQ ID NOs: 47, 54, 62, 69, 78, 86, 109, 116, 123, 130 или 496-513.

- Каждый из L₁, L₂ и L₃ (независимо) означает соответствующий линкер. Каждый из L₁, L₂ и L₃ может (независимо) присутствовать или отсутствовать. Неограничительные примеры подходящих линкеров - приведенные здесь линкеры Gly-Ser, как-то линкеры 9GS, 30GS или 35GS.

- X(n) = C-концевое удлинение типа описанных здесь и/или в WO 12/175741.

- [Nb] означает ISV против другой терапевтической мишени.

Примечания

(¹) В настоящей таблице:

- “Моновалентный” обычно относится к полипептидам/конструкциям, содержащим одиночный ISV против IgE. Они также могут содержать ISV, продлевающие t полураспада (типа ISV против сывороточного альбумина).

- “Бивалентный” обычно относится к полипептидам/конструкциям, содержащим два ISV против IgE (которые могут быть одинаковыми или разными). Они тоже могут содержать ISV, продлевающие t полураспада (типа ISV против сывороточного альбумина).

- “Биспецифичный” обычно относится к полипептидам/конструкциям, содержащим по меньшей мере один (как-то 1 или 2) ISV против IgE и еще по меньшей мере один (как-то 1 или 2) другой ISV против терапевтической мишени. Они также могут содержать ISV, продлевающие t полураспада (типа ISV против сывороточного альбумина).

- В полипептидах/конструкциях, приведенных в данной таблице, по меньшей мере один из ISV против IgE представлен ISV по изобретению, а предпочтительно все ISV против IgE в таких полипептидах/конструкциях представлены ISV по изобретению. А когда в таких полипептидах/конструкциях присутствует ISV, продлевающий t полураспада, и/или ISV против другой терапевтической мишени, то каждый из них (а предпочтительно все) также может быть представлен (а предпочтительно все они представлены) ISV по изобретению.

(²) Все “бивалентные” конструкции в данной таблице также могут быть бипаратопными, то есть они могут содержать по меньшей мере два (как-то 2) ISV против IgE, которые направлены против разных эпитопов на IgE.

(³) Специалистам должно быть ясно, что с помощью указанных звеньев/блоков и линкеров могут быть получены и другие/дополнительные биспецифичные конструкции, чем приведенные здесь.

(⁴) Предпочтительно каждый из [IgE] выбран независимо из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495. К тому же данные [IgE] могут быть одинаковыми или разными; а в бипаратопных полипептидах/конструкциях они должны быть направлены против разных эпитопов на IgE.

(⁵) Каждые из полипептидов/конструкций, приведенных в этом столбце при помощи SEQ ID, составляют отдельные конкретные аспекты изобретения.

Пример 11. Домены V_H (в частности, нанотела) против CXCR4 и содержащие их соединения по изобретению

В одном конкретном аспекте, домены V_H по изобретению (в особенности ISVDs по изобретению и более предпочтительно нанотела по изобретению) и соединения по изобретению могут быть направлены против CXCR4.

В одном конкретном аспекте, домены V_H по изобретению (в особенности ISVDs по изобретению и более предпочтительно нанотела по изобретению) и соединения по изобретению могут быть направлены против CXCR4.

Такие домены V_H по изобретению против CXCR4 обычно содержат: (i) подходящие каркасные последовательности, которые соответственно включают аминокислотные остатки/мутации по изобретению, как описано здесь; а также (ii) последовательности CDR, которые позволяют доменам V_H по изобретению специфически связываться с CXCR4. Кроме того, такие домены V_H по изобретению против CXCR4 также могут содержать C-концевое удлинение, как описано здесь, в частности, когда данный домен V_H является моновалентным или образует C-терминальный конец того соединения по изобретению, в котором находится данный домен V_H (опять же, как уже описано здесь). Такие домены V_H по изобретению против CXCR4 также могут быть такими, как уже описано здесь, в частности, это могут быть ISVDs.

Опять же, как и с другими аспектами и воплощениями изобретения, описанными здесь, когда определенный ISVD (типа ISVD против CXCR4, описанных в данном примере) или содержащее его соединение, как говорится, “соответствует изобретению” или “как уже описано здесь”, то к данному конкретному ISVD или соединению, соответственно, также определенно применимы предпочтительные аспекты/воплощения и предпочтения, которые вообще описаны здесь для ISVD или соединений по изобретению, если прямо не указано иначе или если конкретный технический контекст не требует иного.

Итак, в предпочтительном аспекте настоящее изобретение касается доменов V_H (в особенности ISVD), направленных против CXCR4, у которых (i) в положении 112 находится K или Q; или (ii) в положении 110 находится K или Q и в положении 11 находится V; или (iii) в положении 89 находится T; или (iv) в положении 89 находится L и в положении 110 находится K или Q; или (v) в положении 11 находится V и в положении 89 находится L; или любые подходящие комбинации из (i)-(v). В частности, у таких доменов V_H против CXCR4:

- аминокислотный остаток в положении 11 предпочтительно выбран из L, V и K (наиболее предпочтительно V);

- аминокислотный остаток в положении 14 предпочтительно выбран из A и P;

- аминокислотный остаток в положении 41 предпочтительно выбран из A и P;

- аминокислотный остаток в положении 89 предпочтительно выбран из T, V и L;

- аминокислотный остаток в положении 108 предпочтительно выбран из Q и L;

- аминокислотный остаток в положении 110 предпочтительно выбран из T, K и Q;

- аминокислотный остаток в положении 112 предпочтительно выбран из S, K и Q;

так что либо (i) в положении 112 находится K или Q; либо (ii) в положении 110 находится K или Q и в положении 11 находится V; либо (iii) в положении 89 находится T; либо (iv) в положении 89 находится L и в положении 110 находится K или Q; либо (v) в положении 11 находится V и в положении 89 находится L; или любые подходящие комбинации из (i)-(v).

Домены V_H по изобретению против CXCR4 также могут быть такими, как описано здесь, в частности, опять же это могут быть ISVD (более предпочтительно нанотела) против CXCR4 либо белки, полипептиды или другие соединения или конструкции, которые содержат по меньшей мере один такой ISVD. Такие белки, полипептиды или другие соединения или конструкции тоже могут быть такими, как уже описано здесь, и могут иметь, к примеру, повышенный период полураспада (т.е. как описано здесь, например, период полураспада - выраженный в виде t_½-бета - в организме человека по меньшей мере в 1 день, предпочтительно по меньшей мере в 3 дня, более предпочтительно по меньшей мере 7 дней, как-то по меньшей мере 10 дней), и с этой целью могут, к примеру, содержать связывающие сывороточный альбумин нанотела, которые также могут быть связывающими сывороточный альбумин нанотелами по изобретению (опять же, как описано здесь).

Кроме того, такие ISVD могут соответственно иметь C-концевое удлинение (как уже описано здесь и в WO 12/175741), в частности, когда данный ISVD образует C-терминальный конец содержащего его белка, полипептида или другого соединения или конструкции (опять же, как уже описано здесь).

В одном предпочтительном аспекте домены V_H по изобретению против CXCR4 включают (i) последовательность CDR1, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 245 (что предпочтительно) или такую аминокислотную последовательность, которая отличается лишь по одной аминокислоте от последовательности SEQ ID NO: 245; (ii) последовательность CDR2, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 246 (что предпочтительно) или такую аминокислотную последовательность, которая отличается лишь по одной или двум аминокислотам от последовательности SEQ ID NO: 246; и (iii) последовательность CDR3, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 247 (что предпочтительно) или такую аминокислотную последовательность, которая отличается лишь по одной или двум аминокислотам от последовательности SEQ ID NO: 247.

Более предпочтительно, у доменов V_H по изобретению против CXCR4 согласно этому аспекту: (i) CDR1 представлен SEQ ID NO: 245; (ii) CDR2 представлен SEQ ID NO: 246; и (iii) CDR3 представлен SEQ ID NO: 247.

В одном конкретном аспекте, нанотела по изобретению против CXCR4 являются вариантами нанотела по SEQ ID NO: 244 (и по меньшей мере на 90% идентичны по последовательности, как-то по меньшей мере на 95% идентичны по последовательности SEQ ID NO: 244), у которых:

- аминокислотный остаток в положении 11 предпочтительно выбран из L, V и K (наиболее предпочтительно V);

- аминокислотный остаток в положении 14 предпочтительно выбран из A и P;

- аминокислотный остаток в положении 41 предпочтительно выбран из A и P;

- аминокислотный остаток в положении 89 предпочтительно выбран из T, V и L;

- аминокислотный остаток в положении 108 предпочтительно выбран из Q и L;

- аминокислотный остаток в положении 110 предпочтительно выбран из T, K и Q;

- аминокислотный остаток в положении 112 предпочтительно выбран из S, K и Q;

так что либо (i) в положении 112 находится K или Q; либо (ii) в положении 110 находится K или Q и в положении 11 находится V; либо (iii) в положении 89 находится T; либо (iv) в положении 89 находится L и в положении 110 находится K или Q; либо (v) в положении 11 находится V и в положении 89 находится L; или любые подходящие комбинации из (i)-(v). Участки CDR у таких ISVs предпочтительно такие, как определено в двух предыдущих абзацах.

В другом предпочтительном аспекте домены V_H по изобретению против CXCR4 включают (i) последовательность CDR1, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 263 (что предпочтительно) или такую аминокислотную последовательность, которая отличается лишь по одной аминокислоте от последовательности SEQ ID NO: 263; (ii) последовательность CDR2, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 264 (что предпочтительно) или такую аминокислотную последовательность, которая отличается лишь по одной или двум аминокислотам от последовательности SEQ ID NO: 264; и (iii) последовательность CDR3, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 265 (что предпочтительно) или такую аминокислотную последовательность, которая отличается лишь по одной или двум аминокислотам от последовательности SEQ ID NO: 265.

Более предпочтительно, у доменов V_H по изобретению против CXCR4 согласно этому аспекту: (i) CDR1 представлен SEQ ID NO: 263; (ii) CDR2 представлен SEQ ID NO: 264; и (iii) CDR3 представлен SEQ ID NO: 265.

В одном конкретном аспекте, нанотела по изобретению против CXCR4 являются вариантами нанотела по SEQ ID NO: 262 (и по меньшей мере на 90% идентичны по последовательности, как-то по меньшей мере на 95% идентичны по последовательности SEQ ID NO: 262), у которых:

- аминокислотный остаток в положении 11 предпочтительно выбран из L, V и K (наиболее предпочтительно V);

- аминокислотный остаток в положении 14 предпочтительно выбран из A и P;

- аминокислотный остаток в положении 41 предпочтительно выбран из A и P;

- аминокислотный остаток в положении 89 предпочтительно выбран из T, V и L;

- аминокислотный остаток в положении 108 предпочтительно выбран из Q и L;

- аминокислотный остаток в положении 110 предпочтительно выбран из T, K и Q;

- аминокислотный остаток в положении 112 предпочтительно выбран из S, K и Q;

так что либо (i) в положении 112 находится K или Q; либо (ii) в положении 110 находится K или Q и в положении 11 находится V; либо (iii) в положении 89 находится T; либо (iv) в положении 89 находится L и в положении 110 находится K или Q; либо (v) в положении 11 находится V и в положении 89 находится L; или же любые подходящие комбинации из (i)-(v). Опять же, участки CDR у таких ISVs предпочтительно такие, как определено в двух предыдущих абзацах.

Некоторые особенно предпочтительные, без ограничения, примеры таких нанотел по изобретению против CXCR4 представлены на фиг. 15A как SEQ ID NOs: 248-261 и на фиг. 15B как SEQ ID NOs: 266-279; и каждое из этих нанотел образует еще один аспект изобретения.

Изобретение также касается соединений по изобретению против CXCR4, которые включают по меньшей мере одно (как-то одно, два или три) нанотела по изобретению по SEQ ID NOs: 248-261 и/или 266-279. Такие соединения по изобретению против CXCR4 опять же могут быть такими, как уже описано здесь, и поэтому, к примеру, могут содержать подходящие линкеры, могут содержать C-концевое удлинение, как описано здесь, и могут иметь продленный период полураспада (например, потому, что они содержат нанотело против сывороточного альбумина человека, как-то (предпочтительно) нанотело по изобретению против сывороточного альбумина человека). Отсылаем к приведенной ниже табл. U.

Как описано, к примеру, в WO 2009/138519, WO 2011/042398 и WO 2011/161266, один особенно предпочтительный класс соединений на основе нанотел против CXCR4 составляют бипаратопные соединения. Так, в одном аспекте изобретения, соединения по изобретению против CXCR4 представляют собой бипаратопные конструкции, которые содержат один ISV, который имеет SEQ ID NO: 244 либо (предпочтительно) является таким ISV по изобретению, который был получен из SEQ ID NO: 244 (как описано в данном примере 11), и один ISV, который имеет SEQ ID NO: 262 или (предпочтительно) является таким ISV по изобретению, который был получен из SEQ ID NO: 262 (как описано в данном примере 11), при условии, что по меньшей мере один (а предпочтительно оба) из этих ISV представляет собой ISV по изобретению. Такие бипаратопные конструкции также могут иметь продленный период полураспада (т.е. при помощи связывающего сывороточный альбумин ISV). Некоторые конкретные примеры таких бипаратопных конструкций приведены в SEQ ID NOs: 595-603.

Некоторые особенно предпочтительные примеры соединений по изобретению против CXCR-4 представлены на фиг. 25 в виде SEQ ID NOs: 595-603; и каждое из этих соединений образует еще один аспект изобретения. Так, в другом аспекте изобретение касается полипептидов, направленных против CXCR-4 и имеющих аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 595-603. В более общем смысле соединения по изобретению против CXCR-4 могут быть такими, как описано в WO 2009/138519, WO 2011/042398 и WO 2011/161266, WO 2011/144749, но содержать ISVs по изобретению. Они также могут применяться для целей, описанных в WO 2009/138519, WO 2011/042398 и WO 2011/161266.

Таблица U. Примеры соединений по изобретению против CXCR-4

Полипептид/ конструкция(¹) Общая формула Звенья/блоки ISV и линкеры Моновалентная [CXCR-4] [CXCR-4] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 Моновалентная с C-концевым удлинением [CXCR-4]-X(n) [CXCR-4] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 Моновалентная с продленным t полураспада [CXCR-4]-L₁-[SA]
[SA]-L₁-[CXCR-4] [CXCR-4] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495
[SA] = (см. подпись внизу)
L₁ = (см. подпись внизу) Моновалентная с продленным t полураспада и C-концевым удлинением [CXCR-4]-L₁-[SA]-X(n)
[SA]-L₁-[CXCR-4]-X(n) [CXCR-4] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495
[SA] = (см. подпись внизу)
L₁ = (см. подпись внизу)
X(n) = (см. подпись внизу) Бивалентная(²) [CXCR-4]-L₁-[CXCR-4] по меньшей мере один из [CXCR-4] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
L₁ = (см. подпись внизу) Бивалентная с C-концевым удлинением (²) [CXCR-4]-L₁-[CXCR-4]-X(n) по меньшей мере один из [CXCR-4] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
L₁ = (см. подпись внизу)
X(n) = (см. подпись внизу) Бивалентная с продленным t полураспада (²) [CXCR-4]-L₁-[CXCR-4]-L₂-[SA]
[CXCR-4]-L₁-[SA]-L₂-[CXCR-4]
[SA]-L₁-[CXCR-4]-L₂-[CXCR-4] по меньшей мере один из [CXCR-4] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
[SA] = (см. подпись внизу)
L₁ = (см. подпись внизу)
L₂ = (см. подпись внизу) Бивалентная с продленным t полураспада и C-концевым удлинением (²) [CXCR-4]-L₁-[CXCR-4]-L₂-[SA]-X(n)
[CXCR-4]-L₁-[SA]-L₂-[CXCR-4]-X(n)
[SA]-L₁-[CXCR-4]-L₂-[CXCR-4]-X(n) по меньшей мере один из [CXCR-4] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
[SA] = (см. подпись внизу)
L₁ = (см. подпись внизу)
L₂ = (см. подпись внизу)
X(n) = (см. подпись внизу) Биспецифичная (³) [CXCR-4]-L₁-[Nb]
[Nb]-L₁-[CXCR-4]
[CXCR-4]-L₁-[CXCR-4]-L₂-[Nb]
[CXCR-4]-L₁-[Nb]-L₂-[CXCR-4]
[Nb]-L₁-[CXCR-4]-L₂-[CXCR-4] по меньшей мере один из [CXCR-4] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
L₁ = (см. подпись внизу)
L₂ = (см. подпись внизу)
[Nb] = (см. подпись внизу) Биспецифичная с C-концевым удлинением (³) [CXCR-4]-L₁-[Nb]-X(n)
[Nb]-L₁-[CXCR-4]-X(n)
[CXCR-4]-L₁-[CXCR-4]-L₂-[Nb]-X(n)
[CXCR-4]-L₁-[Nb]-L₂-[CXCR-4]-X(n)
[Nb]-L₁-[CXCR-4]-L₂-[CXCR-4]-X(n) по меньшей мере один из [CXCR-4] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
L₁ = (см. подпись внизу)
L₂ = (см. подпись внизу)
X(n) = (см. подпись внизу)
[Nb] = (см. подпись внизу) Биспецифичная с продленным t полураспада (³) [CXCR-4]-L₁-[Nb]-L₂-[SA]
[CXCR-4]-L₁-[SA]-L₂-[Nb]
[Nb]-L₁-[SA]-L₂-[CXCR-4]
[Nb]-L₁-[CXCR-4]-L₂-[SA]
[SA]-L₁-[CXCR-4]-L₂-[Nb]
[SA]-L₁-[Nb]-L₂-[CXCR-4]
[CXCR-4]-L₁-[CXCR-4]-L₂-[Nb]-L₃-[SA]
[Nb]-L₁-[CXCR-4]-L₂-[CXCR-4]-L₃-[SA]
[SA]-L₁-[CXCR-4]-L₂-[CXCR-4]-L₃-[Nb]
[SA]-L₁-[CXCR-4]-L₂-[Nb]-L₃-[CXCR-4]
[CXCR-4]-L₁-[Nb]-L₂-[CXCR-4]-L₃-[SA] по меньшей мере один из [CXCR-4] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
[SA] = (см. подпись внизу)
L₁, L₂, L₃ (см. подпись внизу)
[Nb] = (см. подпись внизу) Биспецифичная с продленным t полураспада и C-концевым удлинением (³) [CXCR-4]-L₁-[Nb]-L₂-[SA]-X(n)
[CXCR-4]-L₁-[SA]-L₂-[Nb]-X(n)
[Nb]-L₁-[SA]-L₂-[CXCR-4]-X(n)
[Nb]-L₁-[CXCR-4]-L₂-[SA]-X(n)
[SA]-L₁-[CXCR-4]-L₂-[Nb]-X(n)
[SA]-L₁-[Nb]-L₂-[CXCR-4]-X(n)
[CXCR-4]-L₁-[CXCR-4]-L₂-[Nb]-L₃-[SA]-X(n)
[Nb]-L₁-[CXCR-4]-L₂-[CXCR-4]-L₃-[SA]-X(n)
[SA]-L₁-[CXCR-4]-L₂-[CXCR-4]-L₃-[Nb]-X(n)
[SA]-L₁-[CXCR-4]-L₂-[Nb]-L₃-[CXCR-4]-X(n)
[CXCR-4]-L₁-[Nb]-L₂-[CXCR-4]-L₃-[SA]-X(n) по меньшей мере один из [CXCR-4] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
[SA] = (см. подпись внизу)
L₁, L₂, L₃ (см. подпись внизу)
X(n) = (см. подпись внизу)
[Nb] = (см. подпись внизу)

Обозначения

- [SA] означает ISV против сывороточного альбумина (человека), предпочтительно ISV по изобретению против сывороточного альбумина (человека), более предпочтительно по SEQ ID NO: 46 или 61, а еще более предпочтительно один из ISVD по изобретению по SEQ ID NOs: 47, 54, 62, 69, 78, 86, 109, 116, 123, 130 или 496-513.

- Каждый из L₁, L₂ и L₃ (независимо) означает соответствующий линкер. Каждый из L₁, L₂ и L₃ может (независимо) присутствовать или отсутствовать. Неограничительные примеры подходящих линкеров - приведенные здесь линкеры Gly-Ser, как-то линкеры 9GS, 30GS или 35GS.

- X(n) = C-концевое удлинение типа описанных здесь и/или в WO 12/175741.

- [Nb] означает ISV против другой терапевтической мишени.

Примечания

(¹) В настоящей таблице:

- “Моновалентный” обычно относится к полипептидам/конструкциям, содержащим одиночный ISV против CXCR-4. Они также могут содержать ISV, продлевающие t полураспада (типа ISV против сывороточного альбумина).

- “Бивалентный” обычно относится к полипептидам/конструкциям, содержащим два ISV против CXCR-4 (которые могут быть одинаковыми или разными). Они тоже могут содержать ISV, продлевающие t полураспада (типа ISV против сывороточного альбумина).

- “Биспецифичный” обычно относится к полипептидам/конструкциям, содержащим по меньшей мере один (как-то 1 или 2) ISV против CXCR-4 и еще по меньшей мере один (как-то 1 или 2) другой ISV против терапевтической мишени. Они также могут содержать ISV, продлевающие t полураспада (типа ISV против сывороточного альбумина).

- В полипептидах/конструкциях, приведенных в данной таблице, по меньшей мере один из ISV против CXCR-4 представлен ISV по изобретению, а предпочтительно все ISV против CXCR-4 в таких полипептидах/конструкциях представлены ISV по изобретению. А когда в таких полипептидах/конструкциях присутствует ISV, продлевающий t полураспада, и/или ISV против другой терапевтической мишени, то каждый из них (а предпочтительно все) также может быть представлен (а предпочтительно все они представлены) ISV по изобретению.

(²) Все “бивалентные” конструкции в данной таблице также могут быть бипаратопными, то есть они могут содержать по меньшей мере два (как-то 2) ISV против CXCR-4, которые направлены против разных эпитопов на CXCR-4.

(³) Специалистам должно быть ясно, что с помощью указанных звеньев/блоков и линкеров могут быть получены и другие/дополнительные биспецифичные конструкции, чем приведенные здесь.

(⁴) Предпочтительно каждый из [CXCR-4] выбран независимо из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495. К тому же данные [CXCR-4] могут быть одинаковыми или разными; а в бипаратопных полипептидах/конструкциях они должны быть направлены против разных эпитопов на CXCR-4.

(⁵) Каждые из полипептидов/конструкций, приведенных в этом столбце при помощи SEQ ID, составляют отдельные конкретные аспекты изобретения.

Пример 12. Домены V_H (в частности, нанотела) против HER-3 и содержащие их соединения по изобретению

В одном конкретном аспекте, домены V_H по изобретению (в особенности ISVDs
по изобретению и более предпочтительно нанотела по изобретению) и соединения по изобретению могут быть направлены против HER-3.

Такие домены V_H по изобретению против HER-3 обычно содержат: (i) подходящие каркасные последовательности, которые соответственно включают аминокислотные остатки/мутации по изобретению, как описано здесь; а также (ii) последовательности CDR, которые позволяют доменам V_H по изобретению специфически связываться с HER-3. Кроме того, такие домены V_H по изобретению против HER-3 также могут содержать C-концевое удлинение, как описано здесь, в частности, когда данный домен V_H является моновалентным или образует C-терминальный конец того соединения по изобретению, в котором находится данный домен V_H (опять же, как уже описано здесь). Такие домены V_H по изобретению против HER-3 также могут быть такими, как уже описано здесь, в частности, это могут быть ISVDs.

Опять же, как и с другими аспектами и воплощениями изобретения, описанными здесь, когда определенный ISVD (типа ISVD против HER-3, описанных в данном примере) или содержащее его соединение, как говорится, “соответствует изобретению” или “как уже описано здесь”, то к данному конкретному ISVD или соединению, соответственно, также определенно применимы предпочтительные аспекты/воплощения и предпочтения, которые вообще описаны здесь для ISVD или соединений по изобретению, если прямо не указано иначе или если конкретный технический контекст не требует иного.

Итак, в предпочтительном аспекте настоящее изобретение касается доменов V_H (в особенности ISVD), направленных против HER-3, у которых (i) в положении 112 находится K или Q; или (ii) в положении 110 находится K или Q и в положении 11 находится V; или (iii) в положении 89 находится T; или (iv) в положении 89 находится L и в положении 110 находится K или Q; или (v) в положении 11 находится V и в положении 89 находится L; или любые подходящие комбинации из (i)-(v). В частности, у таких доменов V_H против HER-3:

- аминокислотный остаток в положении 11 предпочтительно выбран из L, V и K (наиболее предпочтительно V);

- аминокислотный остаток в положении 14 предпочтительно выбран из A и P;

- аминокислотный остаток в положении 41 предпочтительно выбран из A и P;

- аминокислотный остаток в положении 89 предпочтительно выбран из T, V и L;

- аминокислотный остаток в положении 108 предпочтительно выбран из Q и L;

- аминокислотный остаток в положении 110 предпочтительно выбран из T, K и Q;

- аминокислотный остаток в положении 112 предпочтительно выбран из S, K и Q;

так что либо (i) в положении 112 находится K или Q; либо (ii) в положении 110 находится K или Q и в положении 11 находится V; либо (iii) в положении 89 находится T; либо (iv) в положении 89 находится L и в положении 110 находится K или Q; либо (v) в положении 11 находится V и в положении 89 находится L; или любые подходящие комбинации из (i)-(v).

Домены V_H по изобретению против HER-3 также могут быть такими, как описано здесь, в частности, опять же это могут быть ISVD (более предпочтительно нанотела) против HER-3 либо белки, полипептиды или другие соединения или конструкции, которые содержат по меньшей мере один такой ISVD. Такие белки, полипептиды или другие соединения или конструкции тоже могут быть такими, как уже описано здесь, и могут иметь, к примеру, повышенный период полураспада (т.е. как описано здесь, например, период полураспада - выраженный в виде t_½-бета - в организме человека по меньшей мере в 1 день, предпочтительно по меньшей мере в 3 дня, более предпочтительно по меньшей мере 7 дней, как-то по меньшей мере 10 дней), и с этой целью могут, к примеру, содержать связывающие сывороточный альбумин нанотела, которые также могут быть связывающими сывороточный альбумин нанотелами по изобретению (опять же, как описано здесь).

Кроме того, такие ISVD могут соответственно иметь C-концевое удлинение (как уже описано здесь и в WO 12/175741), в частности, когда данный ISVD образует C-терминальный конец содержащего его белка, полипептида или другого соединения или конструкции (опять же, как уже описано здесь).

В одном предпочтительном аспекте домены V_H по изобретению против HER-3 включают (i) последовательность CDR1, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 281 (что предпочтительно) или такую аминокислотную последовательность, которая отличается лишь по одной аминокислоте от последовательности SEQ ID NO: 281; (ii) последовательность CDR2, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 282 (что предпочтительно) или такую аминокислотную последовательность, которая отличается лишь по одной или двум аминокислотам от последовательности SEQ ID NO: 282; и (iii) последовательность CDR3, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 283 (что предпочтительно) или такую аминокислотную последовательность, которая отличается лишь по одной или двум аминокислотам от последовательности SEQ ID NO: 283.

Более предпочтительно, у доменов V_H по изобретению против HER-3 согласно этому аспекту: (i) CDR1 представлен SEQ ID NO: 281; (ii) CDR2 представлен SEQ ID NO: 282; и (iii) CDR3 представлен SEQ ID NO: 283.

В одном конкретном аспекте, нанотела по изобретению против HER-3 являются вариантами нанотела по SEQ ID NO: 280 (и по меньшей мере на 90% идентичны по последовательности, как-то по меньшей мере на 95% идентичны по последовательности SEQ ID NO: 280), у которых:

- аминокислотный остаток в положении 11 предпочтительно выбран из L, V и K (наиболее предпочтительно V);

- аминокислотный остаток в положении 14 предпочтительно выбран из A и P;

- аминокислотный остаток в положении 41 предпочтительно выбран из A и P;

- аминокислотный остаток в положении 89 предпочтительно выбран из T, V и L;

- аминокислотный остаток в положении 108 предпочтительно выбран из Q и L;

- аминокислотный остаток в положении 110 предпочтительно выбран из T, K и Q;

- аминокислотный остаток в положении 112 предпочтительно выбран из S, K и Q;

так что либо (i) в положении 112 находится K или Q; либо (ii) в положении 110 находится K или Q и в положении 11 находится V; либо (iii) в положении 89 находится T; либо (iv) в положении 89 находится L и в положении 110 находится K или Q; либо (v) в положении 11 находится V и в положении 89 находится L; или любые подходящие комбинации из (i)-(v). Участки CDR у таких ISVs предпочтительно такие, как определено в двух предыдущих абзацах.

В другом предпочтительном аспекте домены V_H по изобретению против HER-3 включают (i) последовательность CDR1, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 299 (что предпочтительно) или такую аминокислотную последовательность, которая отличается лишь по одной или двум аминокислотам от последовательности SEQ ID NO: 299; (ii) последовательность CDR2, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 300 (что предпочтительно) или такую аминокислотную последовательность, которая отличается лишь по одной аминокислоте от последовательности SEQ ID NO: 300; и (iii) последовательность CDR3, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 301 (что предпочтительно) или такую аминокислотную последовательность, которая отличается лишь по одной или двум аминокислотам от последовательности SEQ ID NO: 301.

Более предпочтительно, у доменов V_H по изобретению против HER-3 согласно этому аспекту: (i) CDR1 представлен SEQ ID NO: 299; (ii) CDR2 представлен SEQ ID NO: 300; и (iii) CDR3 представлен SEQ ID NO: 301.

В одном конкретном аспекте, нанотела по изобретению против HER-3 являются вариантами нанотела по SEQ ID NO: 298 (и по меньшей мере на 90% идентичны по последовательности, как-то по меньшей мере на 95% идентичны по последовательности SEQ ID NO: 298), у которых:

- аминокислотный остаток в положении 11 предпочтительно выбран из L, V и K (наиболее предпочтительно V);

- аминокислотный остаток в положении 14 предпочтительно выбран из A и P;

- аминокислотный остаток в положении 41 предпочтительно выбран из A и P;

- аминокислотный остаток в положении 89 предпочтительно выбран из T, V и L;

- аминокислотный остаток в положении 108 предпочтительно выбран из Q и L;

- аминокислотный остаток в положении 110 предпочтительно выбран из T, K и Q;

- аминокислотный остаток в положении 112 предпочтительно выбран из S, K и Q;

так что либо (i) в положении 112 находится K или Q; либо (ii) в положении 110 находится K или Q и в положении 11 находится V; либо (iii) в положении 89 находится T; либо (iv) в положении 89 находится L и в положении 110 находится K или Q; либо (v) в положении 11 находится V и в положении 89 находится L; или же любые подходящие комбинации из (i)-(v). Опять же, участки CDR у таких ISVs предпочтительно такие, как определено в двух предыдущих абзацах.

Некоторые особенно предпочтительные, без ограничения, примеры таких нанотел по изобретению против HER-3 представлены на фиг. 16A как SEQ ID NOs: 284-297 и на фиг. 16B как SEQ ID NOs: 302-315, соответственно; и каждое из этих нанотел образует еще один аспект изобретения.

Изобретение также касается соединений по изобретению против HER-3, которые включают по меньшей мере одно (как-то одно, два или три) нанотела по изобретению по SEQ ID NOs: 284-297 и/или 302-315. Такие соединения по изобретению против HER-3 опять же могут быть такими, как уже описано здесь, и поэтому, к примеру, могут содержать подходящие линкеры, могут содержать C-концевое удлинение, как описано здесь, и могут иметь продленный период полураспада (например, потому, что они содержат нанотело против сывороточного альбумина человека, как-то (предпочтительно) нанотело по изобретению против сывороточного альбумина человека). Отсылаем к приведенной ниже табл. V.

Как описано, к примеру, в WO 2011/144749, один особенно предпочтительный класс соединений на основе нанотел против HER-3 составляют бипаратопные соединения. Так, в одном аспекте изобретения, соединения по изобретению против HER-3 представляют собой бипаратопные конструкции, которые содержат один ISV, который имеет SEQ ID NO: 280 либо (предпочтительно) является таким ISV по изобретению, который был получен из SEQ ID NO: 280 (как описано в данном примере 12), и один ISV, который имеет SEQ ID NO: 298 либо (предпочтительно) является таким ISV по изобретению, который был получен из SEQ ID NO: 298 (как описано в данном примере 12), при условии, что по меньшей мере один (а предпочтительно оба) из этих ISV представляет собой ISV по изобретению. Такие бипаратопные конструкции также могут иметь продленный период полураспада (т.е. при помощи связывающего сывороточный альбумин ISV). Некоторые конкретные примеры таких бипаратопных конструкций приведены в SEQ ID NOs: 604-639.

Некоторые особенно предпочтительные примеры соединений по изобретению против HER-3 представлены на фиг. 26 в виде SEQ ID NOs: 604-639; и каждое из этих соединений образует еще один аспект изобретения. Так, в другом аспекте изобретение касается полипептидов, направленных против HER-3 и имеющих аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 604-639. В более общем смысле соединения по изобретению против HER-3 могут быть такими, как описано в WO 2011/144749, но содержать ISVs по изобретению. Они также могут применяться для целей, описанных в WO 2011/144749.

Таблица V. Примеры соединений по изобретению против HER-3

Полипептид/ конструкция(¹) Общая формула Звенья/блоки ISV и линкеры Моновалентная [HER-3] [HER-3] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 Моновалентная с C-концевым удлинением [HER-3]-X(n) [HER-3] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 Моновалентная с продленным t полураспада [HER-3]-L₁-[SA]
[SA]-L₁-[HER-3] [HER-3] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495
[SA] = (см. подпись внизу)
L₁ = (см. подпись внизу) Моновалентная с продленным t полураспада и C-концевым удлинением [HER-3]-L₁-[SA]-X(n)
[SA]-L₁-[HER-3]-X(n) [HER-3] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495
[SA] = (см. подпись внизу)
L₁ = (см. подпись внизу)
X(n) = (см. подпись внизу) Бивалентная(²) [HER-3]-L₁-[HER-3] по меньшей мере один из [HER-3] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
L₁ = (см. подпись внизу) Бивалентная с C-концевым удлинением (²) [HER-3]-L₁-[HER-3]-X(n) по меньшей мере один из [HER-3] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
L₁ = (см. подпись внизу)
X(n) = (см. подпись внизу) Бивалентная с продленным t полураспада (²) [HER-3]-L₁-[HER-3]-L₂-[SA]
[HER-3]-L₁-[SA]-L₂-[HER-3]
[SA]-L₁-[HER-3]-L₂-[HER-3] по меньшей мере один из [HER-3] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
[SA] = (см. подпись внизу)
L₁ = (см. подпись внизу)
L₂ = (см. подпись внизу) Бивалентная с продленным t полураспада и C-концевым удлинением (²) [HER-3]-L₁-[HER-3]-L₂-[SA]-X(n)
[HER-3]-L₁-[SA]-L₂-[HER-3]-X(n)
[SA]-L₁-[HER-3]-L₂-[HER-3]-X(n) по меньшей мере один из [HER-3] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
[SA] = (см. подпись внизу)
L₁ = (см. подпись внизу)
L₂ = (см. подпись внизу)
X(n) = (см. подпись внизу) Биспецифичная (³) [HER-3]-L₁-[Nb]
[Nb]-L₁-[HER-3]
[HER-3]-L₁-[HER-3]-L₂-[Nb]
[HER-3]-L₁-[Nb]-L₂-[HER-3]
[Nb]-L₁-[HER-3]-L₂-[HER-3] по меньшей мере один из [HER-3] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
L₁ = (см. подпись внизу)
L₂ = (см. подпись внизу)
[Nb] = (см. подпись внизу) Биспецифичная с C-концевым удлинением (³) [HER-3]-L₁-[Nb]-X(n)
[Nb]-L₁-[HER-3]-X(n)
[HER-3]-L₁-[HER-3]-L₂-[Nb]-X(n)
[HER-3]-L₁-[Nb]-L₂-[HER-3]-X(n)
[Nb]-L₁-[HER-3]-L₂-[HER-3]-X(n) по меньшей мере один из [HER-3] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
L₁ = (см. подпись внизу)
L₂ = (см. подпись внизу)
X(n) = (см. подпись внизу)
[Nb] = (см. подпись внизу) Биспецифичная с продленным t полураспада (³) [HER-3]-L₁-[Nb]-L₂-[SA]
[HER-3]-L₁-[SA]-L₂-[Nb]
[Nb]-L₁-[SA]-L₂-[HER-3]
[Nb]-L₁-[HER-3]-L₂-[SA]
[SA]-L₁-[HER-3]-L₂-[Nb]
[SA]-L₁-[Nb]-L₂-[HER-3]
[HER-3]-L₁-[HER-3]-L₂-[Nb]-L₃-[SA]
[Nb]-L₁-[HER-3]-L₂-[HER-3]-L₃-[SA]
[SA]-L₁-[HER-3]-L₂-[HER-3]-L₃-[Nb]
[SA]-L₁-[HER-3]-L₂-[Nb]-L₃-[HER-3]
[HER-3]-L₁-[Nb]-L₂-[HER-3]-L₃-[SA] по меньшей мере один из [HER-3] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
[SA] = (см. подпись внизу)
L₁, L₂, L₃ (см. подпись внизу)
[Nb] = (см. подпись внизу) Биспецифичная с продленным t полураспада и C-концевым удлинением (³) [HER-3]-L₁-[Nb]-L₂-[SA]-X(n)
[HER-3]-L₁-[SA]-L₂-[Nb]-X(n)
[Nb]-L₁-[SA]-L₂-[HER-3]-X(n)
[Nb]-L₁-[HER-3]-L₂-[SA]-X(n)
[SA]-L₁-[HER-3]-L₂-[Nb]-X(n)
[SA]-L₁-[Nb]-L₂-[HER-3]-X(n)
[HER-3]-L₁-[HER-3]-L₂-[Nb]-L₃-[SA]-X(n)
[Nb]-L₁-[HER-3]-L₂-[HER-3]-L₃-[SA]-X(n)
[SA]-L₁-[HER-3]-L₂-[HER-3]-L₃-[Nb]-X(n)
[SA]-L₁-[HER-3]-L₂-[Nb]-L₃-[HER-3]-X(n)
[HER-3]-L₁-[Nb]-L₂-[HER-3]-L₃-[SA]-X(n) по меньшей мере один из [HER-3] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
[SA] = (см. подпись внизу)
L₁, L₂, L₃ (см. подпись внизу)
X(n) = (см. подпись внизу)
[Nb] = (см. подпись внизу)

Обозначения

- [SA] означает ISV против сывороточного альбумина (человека), предпочтительно ISV по изобретению против сывороточного альбумина (человека), более предпочтительно по SEQ ID NO: 46 или 61, а еще более предпочтительно один из ISVD по изобретению по SEQ ID NOs: 47, 54, 62, 69, 78, 86, 109, 116, 123, 130 или 496-513.

- Каждый из L₁, L₂ и L₃ (независимо) означает соответствующий линкер. Каждый из L₁, L₂ и L₃ может (независимо) присутствовать или отсутствовать. Неограничительные примеры подходящих линкеров - приведенные здесь линкеры Gly-Ser, как-то линкеры 9GS, 30GS или 35GS.

- X(n) = C-концевое удлинение типа описанных здесь и/или в WO 12/175741.

- [Nb] означает ISV против другой терапевтической мишени.

Примечания

(¹) В настоящей таблице:

- “Моновалентный” обычно относится к полипептидам/конструкциям, содержащим одиночный ISV против HER-3. Они также могут содержать ISV, продлевающие t полураспада (типа ISV против сывороточного альбумина).

- “Бивалентный” обычно относится к полипептидам/конструкциям, содержащим два ISV против HER-3 (которые могут быть одинаковыми или разными). Они тоже могут содержать ISV, продлевающие t полураспада (типа ISV против сывороточного альбумина).

- “Биспецифичный” обычно относится к полипептидам/конструкциям, содержащим по меньшей мере один (как-то 1 или 2) ISV против HER-3 и еще по меньшей мере один (как-то 1 или 2) другой ISV против терапевтической мишени. Они также могут содержать ISV, продлевающие t полураспада (типа ISV против сывороточного альбумина).

- В полипептидах/конструкциях, приведенных в данной таблице, по меньшей мере один из ISV против HER-3 представлен ISV по изобретению, а предпочтительно все ISV против HER-3 в таких полипептидах/конструкциях представлены ISV по изобретению. А когда в таких полипептидах/конструкциях присутствует ISV, продлевающий t полураспада, и/или ISV против другой терапевтической мишени, то каждый из них (а предпочтительно все) также может быть представлен (а предпочтительно все они представлены) ISV по изобретению.

(²) Все “бивалентные” конструкции в данной таблице также могут быть бипаратопными, то есть они могут содержать по меньшей мере два (как-то два) ISV против HER-3, которые направлены против разных эпитопов на HER-3.

(³) Специалистам должно быть ясно, что с помощью указанных звеньев/блоков и линкеров могут быть получены и другие/дополнительные биспецифичные конструкции, чем приведенные здесь.

(⁴) Предпочтительно каждый из [HER-3] выбран независимо из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495. К тому же данные [HER-3] могут быть одинаковыми или разными; а в бипаратопных полипептидах/конструкциях они должны быть направлены против разных эпитопов на HER-3.

(⁵) Каждые из полипептидов/конструкций, приведенных в этом столбце при помощи SEQ ID, составляют отдельные конкретные аспекты изобретения.

Пример 13. Домены V_H (в частности, нанотела) против TNF и содержащие их соединения по изобретению

В одном конкретном аспекте, домены V_H по изобретению (в особенности ISVDs
по изобретению и более предпочтительно нанотела по изобретению) и соединения по изобретению могут быть направлены против TNF.

Такие домены V_H по изобретению против TNF обычно содержат: (i) подходящие каркасные последовательности, которые соответственно включают аминокислотные остатки/мутации по изобретению, как описано здесь; а также (ii) последовательности CDR, которые позволяют доменам V_H по изобретению специфически связываться с TNF. Кроме того, такие домены V_H по изобретению против TNF также могут содержать C-концевое удлинение, как описано здесь, в частности, когда данный домен V_H является моновалентным или образует C-терминальный конец того соединения по изобретению, в котором находится данный домен V_H (опять же, как уже описано здесь). Такие домены V_H по изобретению против TNF также могут быть такими, как уже описано здесь, в частности, это могут быть ISVDs.

Опять же, как и с другими аспектами и воплощениями изобретения, описанными здесь, когда определенный ISVD (типа ISVD против TNF, описанных в данном примере) или содержащее его соединение, как говорится, “соответствует изобретению” или “как уже описано здесь”, то к данному конкретному ISVD или соединению, соответственно, также определенно применимы предпочтительные аспекты/воплощения и предпочтения, которые вообще описаны здесь для ISVD или соединений по изобретению, если прямо не указано иначе или если конкретный технический контекст не требует иного.

Итак, в предпочтительном аспекте настоящее изобретение касается доменов V_H (в особенности ISVD), направленных против TNF, у которых (i) в положении 112 находится K или Q; или (ii) в положении 110 находится K или Q и в положении 11 находится V; или (iii) в положении 89 находится T; или (iv) в положении 89 находится L и в положении 110 находится K или Q; или (v) в положении 11 находится V и в положении 89 находится L; или любые подходящие комбинации из (i)-(v). В частности, у таких доменов V_H против TNF:

- аминокислотный остаток в положении 11 предпочтительно выбран из L, V и K (наиболее предпочтительно V);

- аминокислотный остаток в положении 14 предпочтительно выбран из A и P;

- аминокислотный остаток в положении 41 предпочтительно выбран из A и P;

- аминокислотный остаток в положении 89 предпочтительно выбран из T, V и L;

- аминокислотный остаток в положении 108 предпочтительно выбран из Q и L;

- аминокислотный остаток в положении 110 предпочтительно выбран из T, K и Q;

- аминокислотный остаток в положении 112 предпочтительно выбран из S, K и Q;

так что либо (i) в положении 112 находится K или Q; либо (ii) в положении 110 находится K или Q и в положении 11 находится V; либо (iii) в положении 89 находится T; либо (iv) в положении 89 находится L и в положении 110 находится K или Q; либо (v) в положении 11 находится V и в положении 89 находится L; или любые подходящие комбинации из (i)-(v).

Домены V_H по изобретению против TNF также могут быть такими, как описано здесь, в частности, опять же это могут быть ISVD (более предпочтительно нанотела) против TNF либо белки, полипептиды или другие соединения или конструкции, которые содержат по меньшей мере один такой ISVD. Такие белки, полипептиды или другие соединения или конструкции тоже могут быть такими, как уже описано здесь, и могут иметь, к примеру, повышенный период полураспада (т.е. как описано здесь, например, период полураспада - выраженный в виде t_½-бета - в организме человека по меньшей мере в 1 день, предпочтительно по меньшей мере в 3 дня, более предпочтительно по меньшей мере 7 дней, как-то по меньшей мере 10 дней), и с этой целью могут, к примеру, содержать связывающие сывороточный альбумин нанотела, которые также могут быть связывающими сывороточный альбумин нанотелами по изобретению (опять же, как описано здесь).

Кроме того, такие ISVD могут соответственно иметь C-концевое удлинение (как уже описано здесь и в WO 12/175741), в частности, когда данный ISVD образует C-терминальный конец содержащего его белка, полипептида или другого соединения или конструкции (опять же, как уже описано здесь).

В одном предпочтительном аспекте домены V_H по изобретению против TNF включают (i) последовательность CDR1, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 317 (что предпочтительно) или такую аминокислотную последовательность, которая отличается лишь по одной аминокислоте от последовательности SEQ ID NO: 317; (ii) последовательность CDR2, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 318 (что предпочтительно) или такую аминокислотную последовательность, которая отличается лишь по одной или двум аминокислотам от последовательности SEQ ID NO: 318; и (iii) последовательность CDR3, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 319 (что предпочтительно) или такую аминокислотную последовательность, которая отличается лишь по одной или двум аминокислотам от последовательности SEQ ID NO: 319.

Более предпочтительно, у доменов V_H по изобретению против TNF согласно этому аспекту: (i) CDR1 представлен SEQ ID NO: 317; (ii) CDR2 представлен SEQ ID NO: 318; и (iii) CDR3 представлен SEQ ID NO: 319.

В одном конкретном аспекте, нанотела по изобретению против TNF являются вариантами нанотела по SEQ ID NO: 316 (и по меньшей мере на 90% идентичны по последовательности, как-то по меньшей мере на 95% идентичны по последовательности SEQ ID NO: 316), у которых:

- аминокислотный остаток в положении 11 предпочтительно выбран из L, V и K (наиболее предпочтительно V);

- аминокислотный остаток в положении 14 предпочтительно выбран из A и P;

- аминокислотный остаток в положении 41 предпочтительно выбран из A и P;

- аминокислотный остаток в положении 89 предпочтительно выбран из T, V и L;

- аминокислотный остаток в положении 108 предпочтительно выбран из Q и L;

- аминокислотный остаток в положении 110 предпочтительно выбран из T, K и Q;

- аминокислотный остаток в положении 112 предпочтительно выбран из S, K и Q;

так что либо (i) в положении 112 находится K или Q; либо (ii) в положении 110 находится K или Q и в положении 11 находится V; либо (iii) в положении 89 находится T; либо (iv) в положении 89 находится L и в положении 110 находится K или Q; либо (v) в положении 11 находится V и в положении 89 находится L; или любые подходящие комбинации из (i)-(v). Участки CDR у таких ISVs предпочтительно такие, как определено в двух предыдущих абзацах.

Некоторые особенно предпочтительные, без ограничения, примеры таких нанотел по изобретению против TNF представлены на фиг. 17A как SEQ ID NOs: 320-333; и каждое из этих нанотел образует еще один аспект изобретения.

Изобретение также касается соединений по изобретению против TNF, которые включают по меньшей мере одно (как-то одно, два или три) нанотела по изобретению по SEQ ID NOs: 320-333. Такие соединения по изобретению против TNF опять же могут быть такими, как уже описано здесь, и поэтому, к примеру, могут содержать подходящие линкеры, могут содержать C-концевое удлинение, как описано здесь, и могут иметь продленный период полураспада (например, потому, что они содержат нанотело против сывороточного альбумина человека, как-то (предпочтительно) нанотело по изобретению против сывороточного альбумина человека). Отсылаем к приведенной ниже табл. W. В общем, поскольку TNF является мультивалентной мишенью, то предпочтительными являются соединения по изобретению, содержащие два или три ISVs против TNF (а также линкеры соответствующей длины, см. WO 06/122786).

Некоторые особенно предпочтительные примеры соединений по изобретению против TNF представлены на фиг. 27 в виде SEQ ID NOs: 640-675; и каждое из этих соединений образует еще один аспект изобретения. Так, в другом аспекте изобретение касается полипептидов, направленных против TNF и имеющих аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 640-675. В более общем смысле соединения по изобретению против TNF могут быть такими, как описано в WO 2006/122786, но содержать ISVs по изобретению. Они также могут применяться для целей, описанных в WO 2006/122786.

Таблица W. Примеры соединений по изобретению против TNF

Полипептид/ конструкция(¹) Общая формула Звенья/блоки ISV и линкеры Моновалентная [TNF] [TNF] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 Моновалентная с C-концевым удлинением [TNF]-X(n) [TNF] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 Моновалентная с продленным t полураспада [TNF]-L₁-[SA]
[SA]-L₁-[TNF] [TNF] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495
[SA] = (см. подпись внизу)
L₁ = (см. подпись внизу) Моновалентная с продленным t полураспада и C-концевым удлинением [TNF]-L₁-[SA]-X(n)
[SA]-L₁-[TNF]-X(n) [TNF] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495
[SA] = (см. подпись внизу)
L₁ = (см. подпись внизу)
X(n) = (см. подпись внизу) Бивалентная(²) [TNF]-L₁-[TNF] по меньшей мере один из [TNF]
= одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
L₁ = (см. подпись внизу) Бивалентная с C-концевым удлинением (²) [TNF]-L₁-[TNF]-X(n) по меньшей мере один из [TNF]
= одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
L₁ = (см. подпись внизу)
X(n) = (см. подпись внизу) Бивалентная с продленным t полураспада (²) [TNF]-L₁-[TNF]-L₂-[SA]
[TNF]-L₁-[SA]-L₂-[TNF]
[SA]-L₁-[TNF]-L₂-[TNF] по меньшей мере один из [TNF]
= одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
[SA] = (см. подпись внизу)
L₁ = (см. подпись внизу)
L₂ = (см. подпись внизу) Бивалентная с продленным t полураспада и C-концевым удлинением (²) [TNF]-L₁-[TNF]-L₂-[SA]-X(n)
[TNF]-L₁-[SA]-L₂-[TNF]-X(n)
[SA]-L₁-[TNF]-L₂-[TNF]-X(n) по меньшей мере один из [TNF]
= одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
[SA] = (см. подпись внизу)
L₁ = (см. подпись внизу)
L₂ = (см. подпись внизу)
X(n) = (см. подпись внизу) Биспецифичная (³) [TNF]-L₁-[Nb]
[Nb]-L₁-[TNF]
[TNF]-L₁-[TNF]-L₂-[Nb]
[TNF]-L₁-[Nb]-L₂-[TNF]
[Nb]-L₁-[TNF]-L₂-[TNF] по меньшей мере один из [TNF]
= одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
L₁ = (см. подпись внизу)
L₂ = (см. подпись внизу)
[Nb] = (см. подпись внизу) Биспецифичная с C-концевым удлинением (³) [TNF]-L₁-[Nb]-X(n)
[Nb]-L₁-[TNF]-X(n)
[TNF]-L₁-[TNF]-L₂-[Nb]-X(n)
[TNF]-L₁-[Nb]-L₂-[TNF]-X(n)
[Nb]-L₁-[TNF]-L₂-[TNF]-X(n) по меньшей мере один из [TNF]
= одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
L₁ = (см. подпись внизу)
L₂ = (см. подпись внизу)
X(n) = (см. подпись внизу)
[Nb] = (см. подпись внизу) Биспецифичная с продленным t полураспада (³) [TNF]-L₁-[Nb]-L₂-[SA]
[TNF]-L₁-[SA]-L₂-[Nb]
[Nb]-L₁-[SA]-L₂-[TNF]
[Nb]-L₁-[TNF]-L₂-[SA]
[SA]-L₁-[TNF]-L₂-[Nb]
[SA]-L₁-[Nb]-L₂-[TNF]
[TNF]-L₁-[TNF]-L₂-[Nb]-L₃-[SA]
[Nb]-L₁-[TNF]-L₂-[TNF]-L₃-[SA]
[SA]-L₁-[TNF]-L₂-[TNF]-L₃-[Nb]
[SA]-L₁-[TNF]-L₂-[Nb]-L₃-[TNF]
[TNF]-L₁-[Nb]-L₂-[TNF]-L₃-[SA] по меньшей мере один из [TNF]
= одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
[SA] = (см. подпись внизу)
L₁, L₂, L₃ (см. подпись внизу)
[Nb] = (см. подпись внизу) Биспецифичная с продленным t полураспада и C-концевым удлинением (³) [TNF]-L₁-[Nb]-L₂-[SA]-X(n)
[TNF]-L₁-[SA]-L₂-[Nb]-X(n)
[Nb]-L₁-[SA]-L₂-[TNF]-X(n)
[Nb]-L₁-[TNF]-L₂-[SA]-X(n)
[SA]-L₁-[TNF]-L₂-[Nb]-X(n)
[SA]-L₁-[Nb]-L₂-[TNF]-X(n)
[TNF]-L₁-[TNF]-L₂-[Nb]-L₃-[SA]-X(n)
[Nb]-L₁-[TNF]-L₂-[TNF]-L₃-[SA]-X(n)
[SA]-L₁-[TNF]-L₂-[TNF]-L₃-[Nb]-X(n)
[SA]-L₁-[TNF]-L₂-[Nb]-L₃-[TNF]-X(n)
[TNF]-L₁-[Nb]-L₂-[TNF]-L₃-[SA]-X(n) по меньшей мере один из [TNF]
= одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
[SA] = (см. подпись внизу)
L₁, L₂, L₃ (см. подпись внизу)
X(n) = (см. подпись внизу)
[Nb] = (см. подпись внизу)

Обозначения

- [SA] означает ISV против сывороточного альбумина (человека), предпочтительно ISV по изобретению против сывороточного альбумина (человека), более предпочтительно по SEQ ID NO: 46 или 61, а еще более предпочтительно один из ISVD по изобретению по SEQ ID NOs: 47, 54, 62, 69, 78, 86, 109, 116, 123, 130 или 496-513.

- Каждый из L₁, L₂ и L₃ (независимо) означает соответствующий линкер. Каждый из L₁, L₂ и L₃ может (независимо) присутствовать или отсутствовать. Неограничительные примеры подходящих линкеров - приведенные здесь линкеры Gly-Ser, как-то линкеры 9GS, 30GS или 35GS.

- X(n) = C-концевое удлинение типа описанных здесь и/или в WO 12/175741.

- [Nb] означает ISV против другой терапевтической мишени.

Примечания

(¹) В настоящей таблице:

- “Моновалентный” обычно относится к полипептидам/конструкциям, содержащим одиночный ISV против TNF. Они также могут содержать ISV, продлевающие t полураспада (типа ISV против сывороточного альбумина).

- “Бивалентный” обычно относится к полипептидам/конструкциям, содержащим два ISV против TNF (которые могут быть одинаковыми или разными). Они тоже могут содержать ISV, продлевающие t полураспада (типа ISV против сывороточного альбумина).

- “Биспецифичный” обычно относится к полипептидам/конструкциям, содержащим по меньшей мере один (как-то 1 или 2) ISV против TNF и еще по меньшей мере один (как-то 1 или 2) другой ISV против терапевтической мишени. Они также могут содержать ISV, продлевающие t полураспада (типа ISV против сывороточного альбумина).

- В полипептидах/конструкциях, приведенных в данной таблице, по меньшей мере один из ISV против TNF представлен ISV по изобретению, а предпочтительно все ISV против TNF в таких полипептидах/конструкциях представлены ISV по изобретению. А когда в таких полипептидах/конструкциях присутствует ISV, продлевающий t полураспада, и/или ISV против другой терапевтической мишени, то каждый из них (а предпочтительно все) также может быть представлен (а предпочтительно все они представлены) ISV по изобретению.

(²) Все “бивалентные” конструкции в данной таблице также могут быть бипаратопными, то есть они могут содержать по меньшей мере два (как-то 2) ISV против TNF, которые направлены против разных эпитопов на TNF.

(³) Специалистам должно быть ясно, что с помощью указанных звеньев/блоков и линкеров могут быть получены и другие/дополнительные биспецифичные конструкции, чем приведенные здесь.

(⁴) Предпочтительно каждый из [TNF] выбран независимо из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495. К тому же данные [TNF] могут быть одинаковыми или разными; а в бипаратопных полипептидах/конструкциях они должны быть направлены против разных эпитопов на TNF.

(⁵) Каждые из полипептидов/конструкций, приведенных в этом столбце при помощи SEQ ID, составляют отдельные конкретные аспекты изобретения.

Пример 14. Другие домены V_H (в частности, нанотела) против TNF и содержащие их соединения по изобретению

В одном конкретном аспекте, домены V_H по изобретению (в особенности ISVDs
по изобретению и более предпочтительно нанотела по изобретению) и соединения по изобретению могут быть направлены против TNF.

Такие домены V_H по изобретению против TNF обычно содержат: (i) подходящие каркасные последовательности, которые соответственно включают аминокислотные остатки/мутации по изобретению, как описано здесь; а также (ii) последовательности CDR, которые позволяют доменам V_H по изобретению специфически связываться с TNF. Кроме того, такие домены V_H по изобретению против TNF также могут содержать C-концевое удлинение, как описано здесь, в частности, когда данный домен V_H является моновалентным или образует C-терминальный конец того соединения по изобретению, в котором находится данный домен V_H (опять же, как уже описано здесь). Такие домены V_H по изобретению против TNF также могут быть такими, как уже описано здесь, в частности, это могут быть ISVDs.

Опять же, как и с другими аспектами и воплощениями изобретения, описанными здесь, когда определенный ISVD (типа ISVD против TNF, описанных в данном примере) или содержащее его соединение, как говорится, “соответствует изобретению” или “как уже описано здесь”, то к данному конкретному ISVD или соединению, соответственно, также определенно применимы предпочтительные аспекты/воплощения и предпочтения, которые вообще описаны здесь для ISVD или соединений по изобретению, если прямо не указано иначе или если конкретный технический контекст не требует иного.

Итак, в предпочтительном аспекте настоящее изобретение касается доменов V_H (в особенности ISVD), направленных против TNF, у которых (i) в положении 112 находится K или Q; или (ii) в положении 110 находится K или Q и в положении 11 находится V; или (iii) в положении 89 находится T; или (iv) в положении 89 находится L и в положении 110 находится K или Q; или (v) в положении 11 находится V и в положении 89 находится L; или любые подходящие комбинации из (i)-(v). В частности, у таких доменов V_H против TNF:

- аминокислотный остаток в положении 11 предпочтительно выбран из L, V и K (наиболее предпочтительно V);

- аминокислотный остаток в положении 14 предпочтительно выбран из A и P;

- аминокислотный остаток в положении 41 предпочтительно выбран из A и P;

- аминокислотный остаток в положении 89 предпочтительно выбран из T, V и L;

- аминокислотный остаток в положении 108 предпочтительно выбран из Q и L;

- аминокислотный остаток в положении 110 предпочтительно выбран из T, K и Q;

- аминокислотный остаток в положении 112 предпочтительно выбран из S, K и Q;

так что либо (i) в положении 112 находится K или Q; либо (ii) в положении 110 находится K или Q и в положении 11 находится V; либо (iii) в положении 89 находится T; либо (iv) в положении 89 находится L и в положении 110 находится K или Q; либо (v) в положении 11 находится V и в положении 89 находится L; или любые подходящие комбинации из (i)-(v).

Домены V_H по изобретению против TNF также могут быть такими, как описано здесь, в частности, опять же это могут быть ISVD (более предпочтительно нанотела) против TNF либо белки, полипептиды или другие соединения или конструкции, которые содержат по меньшей мере один такой ISVD. Такие белки, полипептиды или другие соединения или конструкции тоже могут быть такими, как уже описано здесь, и могут иметь, к примеру, повышенный период полураспада (т.е. как описано здесь, например, период полураспада - выраженный в виде t_½-бета - в организме человека по меньшей мере в 1 день, предпочтительно по меньшей мере в 3 дня, более предпочтительно по меньшей мере 7 дней, как-то по меньшей мере 10 дней), и с этой целью могут, к примеру, содержать связывающие сывороточный альбумин нанотела, которые также могут быть связывающими сывороточный альбумин нанотелами по изобретению (опять же, как описано здесь).

Кроме того, такие ISVD могут соответственно иметь C-концевое удлинение (как уже описано здесь и в WO 12/175741), в частности, когда данный ISVD образует C-терминальный конец содержащего его белка, полипептида или другого соединения или конструкции (опять же, как уже описано здесь).

В одном предпочтительном аспекте домены V_H по изобретению против TNF включают (i) последовательность CDR1, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 335 (что предпочтительно) или такую аминокислотную последовательность, которая отличается лишь по одной аминокислоте от последовательности SEQ ID NO: 335; (ii) последовательность CDR2, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 336 (что предпочтительно) или такую аминокислотную последовательность, которая отличается лишь по одной или двум аминокислотам от последовательности SEQ ID NO: 336; и (iii) последовательность CDR3, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 337 (что предпочтительно) или такую аминокислотную последовательность, которая отличается лишь по одной или двум аминокислотам от последовательности SEQ ID NO: 337.

Более предпочтительно, у доменов V_H по изобретению против TNF согласно этому аспекту: (i) CDR1 представлен SEQ ID NO: 335; (ii) CDR2 представлен SEQ ID NO: 336; и (iii) CDR3 представлен SEQ ID NO: 337.

В одном конкретном аспекте, нанотела по изобретению против TNF являются вариантами нанотела по SEQ ID NO: 334 (и по меньшей мере на 90% идентичны по последовательности, как-то по меньшей мере на 95% идентичны по последовательности SEQ ID NO: 334), у которых:

- аминокислотный остаток в положении 11 предпочтительно выбран из L, V и K (наиболее предпочтительно V);

- аминокислотный остаток в положении 14 предпочтительно выбран из A и P;

- аминокислотный остаток в положении 41 предпочтительно выбран из A и P;

- аминокислотный остаток в положении 89 предпочтительно выбран из T, V и L;

- аминокислотный остаток в положении 108 предпочтительно выбран из Q и L;

- аминокислотный остаток в положении 110 предпочтительно выбран из T, K и Q;

- аминокислотный остаток в положении 112 предпочтительно выбран из S, K и Q;

так что либо (i) в положении 112 находится K или Q; либо (ii) в положении 110 находится K или Q и в положении 11 находится V; либо (iii) в положении 89 находится T; либо (iv) в положении 89 находится L и в положении 110 находится K или Q; либо (v) в положении 11 находится V и в положении 89 находится L; или любые подходящие комбинации из (i)-(v). Участки CDR у таких ISVs предпочтительно такие, как определено в двух предыдущих абзацах.

Некоторые особенно предпочтительные, без ограничения, примеры таких нанотел по изобретению против TNF представлены на фиг. 17B как SEQ ID NOs: 338-351; и каждое из этих нанотел образует еще один аспект изобретения.

Изобретение также касается соединений по изобретению против TNF, которые включают по меньшей мере одно (как-то одно, два или три) нанотела по изобретению по SEQ ID NOs: 338-351. Такие соединения по изобретению против TNF опять же могут быть такими, как уже описано здесь, и поэтому, к примеру, могут содержать подходящие линкеры, могут содержать C-концевое удлинение, как описано здесь, и могут иметь продленный период полураспада (например, потому, что они содержат нанотело против сывороточного альбумина человека, как-то (предпочтительно) нанотело по изобретению против сывороточного альбумина человека). Отсылаем к приведенной ниже табл. X. В общем, поскольку TNF является мультивалентной мишенью, то предпочтительными являются соединения по изобретению, содержащие два или три ISVs против TNF.

Таблица X. Примеры соединений по изобретению против TNF

Полипептид/ конструкция(¹) Общая формула Звенья/блоки ISV и линкеры Моновалентная [TNF] [TNF] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 Моновалентная с C-концевым удлинением [TNF]-X(n) [TNF] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 Моновалентная с продленным t полураспада [TNF]-L₁-[SA]
[SA]-L₁-[TNF] [TNF] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495
[SA] = (см. подпись внизу)
L₁ = (см. подпись внизу) Моновалентная с продленным t полураспада и C-концевым удлинением [TNF]-L₁-[SA]-X(n)
[SA]-L₁-[TNF]-X(n) [TNF] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495
[SA] = (см. подпись внизу)
L₁ = (см. подпись внизу)
X(n) = (см. подпись внизу) Бивалентная(²) [TNF]-L₁-[TNF] по меньшей мере один из [TNF]
= одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
L₁ = (см. подпись внизу) Бивалентная с C-концевым удлинением (²) [TNF]-L₁-[TNF]-X(n) по меньшей мере один из [TNF]
= одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
L₁ = (см. подпись внизу)
X(n) = (см. подпись внизу) Бивалентная с продленным t полураспада (²) [TNF]-L₁-[TNF]-L₂-[SA]
[TNF]-L₁-[SA]-L₂-[TNF]
[SA]-L₁-[TNF]-L₂-[TNF] по меньшей мере один из [TNF]
= одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
[SA] = (см. подпись внизу)
L₁ = (см. подпись внизу)
L₂ = (см. подпись внизу) Бивалентная с продленным t полураспада и C-концевым удлинением (²) [TNF]-L₁-[TNF]-L₂-[SA]-X(n)
[TNF]-L₁-[SA]-L₂-[TNF]-X(n)
[SA]-L₁-[TNF]-L₂-[TNF]-X(n) по меньшей мере один из [TNF]
= одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
[SA] = (см. подпись внизу)
L₁ = (см. подпись внизу)
L₂ = (см. подпись внизу)
X(n) = (см. подпись внизу) Биспецифичная (³) [TNF]-L₁-[Nb]
[Nb]-L₁-[TNF]
[TNF]-L₁-[TNF]-L₂-[Nb]
[TNF]-L₁-[Nb]-L₂-[TNF]
[Nb]-L₁-[TNF]-L₂-[TNF] по меньшей мере один из [TNF]
= одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
L₁ = (см. подпись внизу)
L₂ = (см. подпись внизу)
[Nb] = (см. подпись внизу) Биспецифичная с C-концевым удлинением (³) [TNF]-L₁-[Nb]-X(n)
[Nb]-L₁-[TNF]-X(n)
[TNF]-L₁-[TNF]-L₂-[Nb]-X(n)
[TNF]-L₁-[Nb]-L₂-[TNF]-X(n)
[Nb]-L₁-[TNF]-L₂-[TNF]-X(n) по меньшей мере один из [TNF]
= одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
L₁ = (см. подпись внизу)
L₂ = (см. подпись внизу)
X(n) = (см. подпись внизу)
[Nb] = (см. подпись внизу) Биспецифичная с продленным t полураспада (³) [TNF]-L₁-[Nb]-L₂-[SA]
[TNF]-L₁-[SA]-L₂-[Nb]
[Nb]-L₁-[SA]-L₂-[TNF]
[Nb]-L₁-[TNF]-L₂-[SA]
[SA]-L₁-[TNF]-L₂-[Nb]
[SA]-L₁-[Nb]-L₂-[TNF]
[TNF]-L₁-[TNF]-L₂-[Nb]-L₃-[SA]
[Nb]-L₁-[TNF]-L₂-[TNF]-L₃-[SA]
[SA]-L₁-[TNF]-L₂-[TNF]-L₃-[Nb]
[SA]-L₁-[TNF]-L₂-[Nb]-L₃-[TNF]
[TNF]-L₁-[Nb]-L₂-[TNF]-L₃-[SA] по меньшей мере один из [TNF]
= одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
[SA] = (см. подпись внизу)
L₁, L₂, L₃ (см. подпись внизу)
[Nb] = (см. подпись внизу) Биспецифичная с продленным t полураспада и C-концевым удлинением (³) [TNF]-L₁-[Nb]-L₂-[SA]-X(n)
[TNF]-L₁-[SA]-L₂-[Nb]-X(n)
[Nb]-L₁-[SA]-L₂-[TNF]-X(n)
[Nb]-L₁-[TNF]-L₂-[SA]-X(n)
[SA]-L₁-[TNF]-L₂-[Nb]-X(n)
[SA]-L₁-[Nb]-L₂-[TNF]-X(n)
[TNF]-L₁-[TNF]-L₂-[Nb]-L₃-[SA]-X(n)
[Nb]-L₁-[TNF]-L₂-[TNF]-L₃-[SA]-X(n)
[SA]-L₁-[TNF]-L₂-[TNF]-L₃-[Nb]-X(n)
[SA]-L₁-[TNF]-L₂-[Nb]-L₃-[TNF]-X(n)
[TNF]-L₁-[Nb]-L₂-[TNF]-L₃-[SA]-X(n) по меньшей мере один из [TNF]
= одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
[SA] = (см. подпись внизу)
L₁, L₂, L₃ (см. подпись внизу)
X(n) = (см. подпись внизу)
[Nb] = (см. подпись внизу)

Обозначения

- [SA] означает ISV против сывороточного альбумина (человека), предпочтительно ISV по изобретению против сывороточного альбумина (человека), более предпочтительно по SEQ ID NO: 46 или 61, а еще более предпочтительно один из ISVD по изобретению по SEQ ID NOs: 47, 54, 62, 69, 78, 86, 109, 116, 123, 130 или 496-513.

- Каждый из L₁, L₂ и L₃ (независимо) означает соответствующий линкер. Каждый из L₁, L₂ и L₃ может (независимо) присутствовать или отсутствовать. Неограничительные примеры подходящих линкеров - приведенные здесь линкеры Gly-Ser, как-то линкеры 9GS, 30GS или 35GS.

- X(n) = C-концевое удлинение типа описанных здесь и/или в WO 12/175741.

- [Nb] означает ISV против другой терапевтической мишени.

Примечания

(¹) В настоящей таблице:

- “Моновалентный” обычно относится к полипептидам/конструкциям, содержащим одиночный ISV против TNF. Они также могут содержать ISV, продлевающие t полураспада (типа ISV против сывороточного альбумина).

- “Бивалентный” обычно относится к полипептидам/конструкциям, содержащим два ISV против TNF (которые могут быть одинаковыми или разными). Они тоже могут содержать ISV, продлевающие t полураспада (типа ISV против сывороточного альбумина).

- “Биспецифичный” обычно относится к полипептидам/конструкциям, содержащим по меньшей мере один (как-то 1 или 2) ISV против TNF и еще по меньшей мере один (как-то 1 или 2) другой ISV против терапевтической мишени. Они также могут содержать ISV, продлевающие t полураспада (типа ISV против сывороточного альбумина).

- В полипептидах/конструкциях, приведенных в данной таблице, по меньшей мере один из ISV против TNF представлен ISV по изобретению, а предпочтительно все ISV против TNF в таких полипептидах/конструкциях представлены ISV по изобретению. А когда в таких полипептидах/конструкциях присутствует ISV, продлевающий t полураспада, и/или ISV против другой терапевтической мишени, то каждый из них (а предпочтительно все) также может быть представлен (а предпочтительно все они представлены) ISV по изобретению.

(²) Все “бивалентные” конструкции в данной таблице также могут быть бипаратопными, то есть они могут содержать по меньшей мере два (как-то 2) ISV против TNF, которые направлены против разных эпитопов на TNF.

(³) Специалистам должно быть ясно, что с помощью указанных звеньев/блоков и линкеров могут быть получены и другие/дополнительные биспецифичные конструкции, чем приведенные здесь.

(⁴) Предпочтительно каждый из [TNF] выбран независимо из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495. К тому же данные [TNF] могут быть одинаковыми или разными; а в бипаратопных полипептидах/конструкциях они должны быть направлены против разных эпитопов на TNF.

(⁵) Каждые из полипептидов/конструкций, приведенных в этом столбце при помощи SEQ ID, составляют отдельные конкретные аспекты изобретения.

Пример 15. Домены V_H (в частности, нанотела) против c-Met и содержащие их соединения по изобретению

В одном конкретном аспекте, домены V_H по изобретению (в особенности ISVDs
по изобретению и более предпочтительно нанотела по изобретению) и соединения по изобретению могут быть направлены против c-Met.

Такие домены V_H по изобретению против c-Met обычно содержат: (i) подходящие каркасные последовательности, которые соответственно включают аминокислотные остатки/мутации по изобретению, как описано здесь; а также (ii) последовательности CDR, которые позволяют доменам V_H по изобретению специфически связываться с c-Met. Кроме того, такие домены V_H по изобретению против c-Met также могут содержать C-концевое удлинение, как описано здесь, в частности, когда данный домен V_H является моновалентным или образует C-терминальный конец того соединения по изобретению, в котором находится данный домен V_H (опять же, как уже описано здесь). Такие домены V_H по изобретению против c-Met также могут быть такими, как уже описано здесь, в частности, это могут быть ISVDs.

Опять же, как и с другими аспектами и воплощениями изобретения, описанными здесь, когда определенный ISVD (типа ISVD против c-Met, описанных в данном примере) или содержащее его соединение, как говорится, “соответствует изобретению” или “как уже описано здесь”, то к данному конкретному ISVD или соединению, соответственно, также определенно применимы предпочтительные аспекты/воплощения и предпочтения, которые вообще описаны здесь для ISVD или соединений по изобретению, если прямо не указано иначе или если конкретный технический контекст не требует иного.

Итак, в предпочтительном аспекте настоящее изобретение касается доменов V_H (в особенности ISVD), направленных против c-Met, у которых (i) в положении 112 находится K или Q; или (ii) в положении 110 находится K или Q и в положении 11 находится V; или (iii) в положении 89 находится T; или (iv) в положении 89 находится L и в положении 110 находится K или Q; или (v) в положении 11 находится V и в положении 89 находится L; или любые подходящие комбинации из (i)-(v). В частности, у таких доменов V_H против c-Met:

- аминокислотный остаток в положении 11 предпочтительно выбран из L, V и K (наиболее предпочтительно V);

- аминокислотный остаток в положении 14 предпочтительно выбран из A и P;

- аминокислотный остаток в положении 41 предпочтительно выбран из A и P;

- аминокислотный остаток в положении 89 предпочтительно выбран из T, V и L;

- аминокислотный остаток в положении 108 предпочтительно выбран из Q и L;

- аминокислотный остаток в положении 110 предпочтительно выбран из T, K и Q;

- аминокислотный остаток в положении 112 предпочтительно выбран из S, K и Q;

так что либо (i) в положении 112 находится K или Q; либо (ii) в положении 110 находится K или Q и в положении 11 находится V; либо (iii) в положении 89 находится T; либо (iv) в положении 89 находится L и в положении 110 находится K или Q; либо (v) в положении 11 находится V и в положении 89 находится L; или любые подходящие комбинации из (i)-(v).

Домены V_H по изобретению против c-Met также могут быть такими, как описано здесь, в частности, опять же это могут быть ISVD (более предпочтительно нанотела) против c-Met либо белки, полипептиды или другие соединения или конструкции, которые содержат по меньшей мере один такой ISVD. Такие белки, полипептиды или другие соединения или конструкции тоже могут быть такими, как уже описано здесь, и могут иметь, к примеру, повышенный период полураспада (т.е. как описано здесь, например, период полураспада - выраженный в виде t_½-бета - в организме человека по меньшей мере в 1 день, предпочтительно по меньшей мере в 3 дня, более предпочтительно по меньшей мере 7 дней, как-то по меньшей мере 10 дней), и с этой целью могут, к примеру, содержать связывающие сывороточный альбумин нанотела, которые также могут быть связывающими сывороточный альбумин нанотелами по изобретению (опять же, как описано здесь).

Кроме того, такие ISVD могут соответственно иметь C-концевое удлинение (как уже описано здесь и в WO 12/175741), в частности, когда данный ISVD образует C-терминальный конец содержащего его белка, полипептида или другого соединения или конструкции (опять же, как уже описано здесь).

В одном предпочтительном аспекте домены V_H по изобретению против c-Met включают (i) последовательность CDR1, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 353 (что предпочтительно) или такую аминокислотную последовательность, которая отличается лишь по одной аминокислоте от последовательности SEQ ID NO: 353; (ii) последовательность CDR2, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 354 (что предпочтительно) или такую аминокислотную последовательность, которая отличается лишь по одной или двум аминокислотам от последовательности SEQ ID NO: 354; и (iii) последовательность CDR3, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 355 (что предпочтительно) или такую аминокислотную последовательность, которая отличается лишь по одной или двум аминокислотам от последовательности SEQ ID NO: 355.

Более предпочтительно, у доменов V_H по изобретению против IL-23 согласно этому аспекту: (i) CDR1 представлен SEQ ID NO: 353; (ii) CDR2 представлен SEQ ID NO: 354; и (iii) CDR3 представлен SEQ ID NO: 355.

В одном конкретном аспекте, нанотела по изобретению против c-Met являются вариантами нанотела по SEQ ID NO: 352 (и по меньшей мере на 90% идентичны по последовательности, как-то по меньшей мере на 95% идентичны по последовательности SEQ ID NO: 352), у которых:

- аминокислотный остаток в положении 11 предпочтительно выбран из L, V и K (наиболее предпочтительно V);

- аминокислотный остаток в положении 14 предпочтительно выбран из A и P;

- аминокислотный остаток в положении 41 предпочтительно выбран из A и P;

- аминокислотный остаток в положении 89 предпочтительно выбран из T, V и L;

- аминокислотный остаток в положении 108 предпочтительно выбран из Q и L;

- аминокислотный остаток в положении 110 предпочтительно выбран из T, K и Q;

- аминокислотный остаток в положении 112 предпочтительно выбран из S, K и Q;

так что либо (i) в положении 112 находится K или Q; либо (ii) в положении 110 находится K или Q и в положении 11 находится V; либо (iii) в положении 89 находится T; либо (iv) в положении 89 находится L и в положении 110 находится K или Q; либо (v) в положении 11 находится V и в положении 89 находится L; или любые подходящие комбинации из (i)-(v). Участки CDR у таких ISVs предпочтительно такие, как определено в двух предыдущих абзацах.

В другом предпочтительном аспекте домены V_H по изобретению против c-Met включают (i) последовательность CDR1, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 371 (что предпочтительно) или такую аминокислотную последовательность, которая отличается лишь по одной или двум аминокислотам от последовательности SEQ ID NO: 371; (ii) последовательность CDR2, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 372 (что предпочтительно) или такую аминокислотную последовательность, которая отличается лишь по одной аминокислоте от последовательности SEQ ID NO: 372; и (iii) последовательность CDR3, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 373 (что предпочтительно) или такую аминокислотную последовательность, которая отличается лишь по одной или двум аминокислотам от последовательности SEQ ID NO: 373.

Более предпочтительно, у таких доменов V_H по изобретению против c-Met по этому аспекту: (i) CDR1 представлен SEQ ID NO: 371; (ii) CDR2 представлен SEQ ID NO: 372; и (iii) CDR3 представлен SEQ ID NO: 373.

В одном конкретном аспекте, нанотела по изобретению против c-Met являются вариантами нанотела по SEQ ID NO: 370 (и по меньшей мере на 90% идентичны по последовательности, как-то по меньшей мере на 95% идентичны по последовательности SEQ ID NO: 370), у которых:

- аминокислотный остаток в положении 11 предпочтительно выбран из L, V и K (наиболее предпочтительно V);

- аминокислотный остаток в положении 14 предпочтительно выбран из A и P;

- аминокислотный остаток в положении 41 предпочтительно выбран из A и P;

- аминокислотный остаток в положении 89 предпочтительно выбран из T, V и L;

- аминокислотный остаток в положении 108 предпочтительно выбран из Q и L;

- аминокислотный остаток в положении 110 предпочтительно выбран из T, K и Q;

- аминокислотный остаток в положении 112 предпочтительно выбран из S, K и Q;

так что либо (i) в положении 112 находится K или Q; либо (ii) в положении 110 находится K или Q и в положении 11 находится V; либо (iii) в положении 89 находится T; либо (iv) в положении 89 находится L и в положении 110 находится K или Q; либо (v) в положении 11 находится V и в положении 89 находится L; или любые подходящие комбинации из (i)-(v). Опять же, участки CDR у таких ISVs предпочтительно такие, как определено в двух предыдущих абзацах.

Некоторые особенно предпочтительные, без ограничения, примеры таких нанотел по изобретению против IL-23 представлены на фиг. 18A как SEQ ID NOs: 356-369 и на фиг. 18B как SEQ ID NOs: 374-387, соответственно; и каждое из этих нанотел образует еще один аспект изобретения.

Изобретение также касается соединений по изобретению против c-Met, которые включают по меньшей мере одно (как-то одно, два или три) нанотела по изобретению по SEQ ID NOs: 356-369 и/или 374-387. Такие соединения по изобретению против c-Met опять же могут быть такими, как уже описано здесь, и поэтому, к примеру, могут содержать подходящие линкеры, могут содержать C-концевое удлинение, как описано здесь, и могут иметь продленный период полураспада (например, потому, что они содержат нанотело против сывороточного альбумина человека, как-то (предпочтительно) нанотело по изобретению против сывороточного альбумина человека). Отсылаем к приведенной ниже табл. Y.

Как описано, к примеру, в WO 2013/045707, один особенно предпочтительный класс соединений на основе нанотел против c-Met составляют бипаратопные соединения. Так, в одном аспекте изобретения, соединения по изобретению против c-Met представляют собой бипаратопные конструкции, которые содержат один ISV, который имеет SEQ ID NO: 352 либо (предпочтительно) является таким ISV по изобретению, который был получен из SEQ ID NO: 352 (как описано в данном примере 15), и один ISV, который имеет SEQ ID NO: 370 либо (предпочтительно) является таким ISV по изобретению, который был получен из SEQ ID NO: 370 (как описано в данном примере 15), при условии, что по меньшей мере один (а предпочтительно оба) из этих ISV представляет собой ISV по изобретению. Такие бипаратопные конструкции также могут иметь продленный период полураспада (т.е. при помощи связывающего сывороточный альбумин ISV). Некоторые конкретные примеры таких бипаратопных конструкций приведены в SEQ ID NOs: 676-693. Кроме того, биспецифичные конструкции против c-Met также могут включать ISV против VEGF или EGFR. Опять же сошлемся на WO 2014/341309.

Некоторые особенно предпочтительные примеры соединений по изобретению против c-Met представлены на фиг. 28A и 28B в виде SEQ ID NOs: 676-694; и каждое из этих соединений образует еще один аспект изобретения. Так, в другом аспекте изобретение касается полипептидов, направленных против c-Met и имеющих аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 676-694. В более общем смысле соединения по изобретению против c-Met могут быть такими, как описано в WO 2013/045707, но содержать ISVs по изобретению. Они также могут применяться для целей, описанных в WO 2013/045707.

Таблица Y. Примеры соединений по изобретению против c-Met

Полипептид/ конструкция(¹) Общая формула Звенья/блоки ISV и линкеры Моновалентная [c-Met] [c-Met] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 Моновалентная с C-концевым удлинением [c-Met]-X(n) [c-Met] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 Моновалентная с продленным t полураспада [c-Met]-L₁-[SA]
[SA]-L₁-[c-Met] [c-Met] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495
[SA] = (см. подпись внизу)
L₁ = (см. подпись внизу) Моновалентная с продленным t полураспада и C-концевым удлинением [c-Met]-L₁-[SA]-X(n)
[SA]-L₁-[c-Met]-X(n) [c-Met] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495
[SA] = (см. подпись внизу)
L₁ = (см. подпись внизу)
X(n) = (см. подпись внизу) Бивалентная(²) [c-Met]-L₁-[c-Met] по меньшей мере один из [c-Met]
= одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
L₁ = (см. подпись внизу) Бивалентная с C-концевым удлинением (²) [c-Met]-L₁-[c-Met]-X(n) по меньшей мере один из [c-Met]
= одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
L₁ = (см. подпись внизу)
X(n) = (см. подпись внизу) Бивалентная с продленным t полураспада (²) [c-Met]-L₁-[c-Met]-L₂-[SA]
[c-Met]-L₁-[SA]-L₂-[c-Met]
[SA]-L₁-[c-Met]-L₂-[c-Met] по меньшей мере один из [c-Met]
= одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
[SA] = (см. подпись внизу)
L₁ = (см. подпись внизу)
L₂ = (см. подпись внизу) Бивалентная с продленным t полураспада и C-концевым удлинением (²) [c-Met]-L₁-[c-Met]-L₂-[SA]-X(n)
[c-Met]-L₁-[SA]-L₂-[c-Met]-X(n)
[SA]-L₁-[c-Met]-L₂-[c-Met]-X(n) по меньшей мере один из [c-Met]
= одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
[SA] = (см. подпись внизу)
L₁ = (см. подпись внизу)
L₂ = (см. подпись внизу)
X(n) = (см. подпись внизу) Биспецифичная (³) [c-Met]-L₁-[Nb]
[Nb]-L₁-[c-Met]
[c-Met]-L₁-[c-Met]-L₂-[Nb]
[c-Met]-L₁-[Nb]-L₂-[c-Met]
[Nb]-L₁-[c-Met]-L₂-[c-Met] по меньшей мере один из [c-Met]
= одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
L₁ = (см. подпись внизу)
L₂ = (см. подпись внизу)
[Nb] = (см. подпись внизу) Биспецифичная с C-концевым удлинением (³) [c-Met]-L₁-[Nb]-X(n)
[Nb]-L₁-[c-Met]-X(n)
[c-Met]-L₁-[c-Met]-L₂-[Nb]-X(n)
[c-Met]-L₁-[Nb]-L₂-[c-Met]-X(n)
[Nb]-L₁-[c-Met]-L₂-[c-Met]-X(n) по меньшей мере один из [c-Met]
= одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
L₁ = (см. подпись внизу)
L₂ = (см. подпись внизу)
X(n) = (см. подпись внизу)
[Nb] = (см. подпись внизу) Биспецифичная с продленным t полураспада (³) [c-Met]-L₁-[Nb]-L₂-[SA]
[c-Met]-L₁-[SA]-L₂-[Nb]
[Nb]-L₁-[SA]-L₂-[c-Met]
[Nb]-L₁-[c-Met]-L₂-[SA]
[SA]-L₁-[c-Met]-L₂-[Nb]
[SA]-L₁-[Nb]-L₂-[c-Met]
[c-Met]-L₁-[c-Met]-L₂-[Nb]-L₃-[SA]
[Nb]-L₁-[c-Met]-L₂-[c-Met]-L₃-[SA]
[SA]-L₁-[c-Met]-L₂-[c-Met]-L₃-[Nb]
[SA]-L₁-[c-Met]-L₂-[Nb]-L₃-[c-Met]
[c-Met]-L₁-[Nb]-L₂-[c-Met]-L₃-[SA] по меньшей мере один из [c-Met]
= одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
[SA] = (см. подпись внизу)
L₁, L₂, L₃ (см. подпись внизу)
[Nb] = (см. подпись внизу) Биспецифичная с продленным t полураспада и C-концевым удлинением (³) [c-Met]-L₁-[Nb]-L₂-[SA]-X(n)
[c-Met]-L₁-[SA]-L₂-[Nb]-X(n)
[Nb]-L₁-[SA]-L₂-[c-Met]-X(n)
[Nb]-L₁-[c-Met]-L₂-[SA]-X(n)
[SA]-L₁-[c-Met]-L₂-[Nb]-X(n)
[SA]-L₁-[Nb]-L₂-[c-Met]-X(n)
[c-Met]-L₁-[c-Met]-L₂-[Nb]-L₃-[SA]-X(n)
[Nb]-L₁-[c-Met]-L₂-[c-Met]-L₃-[SA]-X(n)
[SA]-L₁-[c-Met]-L₂-[c-Met]-L₃-[Nb]-X(n)
[SA]-L₁-[c-Met]-L₂-[Nb]-L₃-[c-Met]-X(n)
[c-Met]-L₁-[Nb]-L₂-[c-Met]-L₃-[SA]-X(n) по меньшей мере один из [c-Met]
= одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
[SA] = (см. подпись внизу)
L₁, L₂, L₃ (см. подпись внизу)
X(n) = (см. подпись внизу)
[Nb] = (см. подпись внизу)

Обозначения

- [SA] означает ISV против сывороточного альбумина (человека), предпочтительно ISV по изобретению против сывороточного альбумина (человека), более предпочтительно по SEQ ID NO: 46 или 61, а еще более предпочтительно один из ISVD по изобретению по SEQ ID NOs: 47, 54, 62, 69, 78, 86, 109, 116, 123, 130 или 496-513.

- Каждый из L₁, L₂ и L₃ (независимо) означает соответствующий линкер. Каждый из L₁, L₂ и L₃ может (независимо) присутствовать или отсутствовать. Неограничительные примеры подходящих линкеров - приведенные здесь линкеры Gly-Ser, как-то линкеры 9GS, 30GS или 35GS.

- X(n) = C-концевое удлинение типа описанных здесь и/или в WO 12/175741.

- [Nb] означает ISV против другой терапевтической мишени.

Примечания

(¹) В настоящей таблице:

- “Моновалентный” обычно относится к полипептидам/конструкциям, содержащим одиночный ISV против c-Met. Они также могут содержать ISV, продлевающие t полураспада (типа ISV против сывороточного альбумина).

- “Бивалентный” обычно относится к полипептидам/конструкциям, содержащим два ISV против c-Met (которые могут быть одинаковыми или разными). Они тоже могут содержать ISV, продлевающие t полураспада (типа ISV против сывороточного альбумина).

- “Биспецифичный” обычно относится к полипептидам/конструкциям, содержащим по меньшей мере один (как-то 1 или 2) ISV против c-Met и еще по меньшей мере один (как-то 1 или 2) другой ISV против терапевтической мишени. Они также могут содержать ISV, продлевающие t полураспада (типа ISV против сывороточного альбумина).

- В полипептидах/конструкциях, приведенных в данной таблице, по меньшей мере один из ISV против c-Met представлен ISV по изобретению, а предпочтительно все ISV против c-Met в таких полипептидах/конструкциях представлены ISV по изобретению. А когда в таких полипептидах/конструкциях присутствует ISV, продлевающий t полураспада, и/или ISV против другой терапевтической мишени, то каждый из них (а предпочтительно все) также может быть представлен (а предпочтительно все они представлены) ISV по изобретению.

(²) Все “бивалентные” конструкции в данной таблице также могут быть бипаратопными, то есть они могут содержать по меньшей мере два (как-то два) ISV против c-Met, которые направлены против разных эпитопов на c-Met.

(³) Специалистам должно быть ясно, что с помощью указанных звеньев/блоков и линкеров могут быть получены и другие/дополнительные биспецифичные конструкции, чем приведенные здесь.

(⁴) Предпочтительно каждый из [c-Met] выбран независимо из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495. К тому же данные [c-Met] могут быть одинаковыми или разными; а в бипаратопных полипептидах/конструкциях они должны быть направлены против разных эпитопов на c-Met.

(⁵) Каждые из полипептидов/конструкций, приведенных в этом столбце при помощи SEQ ID, составляют отдельные конкретные аспекты изобретения.

Пример 16. Домены V_H (в частности, нанотела) против RANK-L и содержащие их соединения по изобретению

В одном конкретном аспекте, домены V_H по изобретению (в особенности ISVDs
по изобретению и более предпочтительно нанотела по изобретению) и соединения по изобретению могут быть направлены против RANK-L.

Такие домены V_H по изобретению против RANK-L обычно содержат: (i) подходящие каркасные последовательности, которые соответственно включают аминокислотные остатки/мутации по изобретению, как описано здесь; а также (ii) последовательности CDR, которые позволяют доменам V_H по изобретению специфически связываться с RANK-L. Кроме того, такие домены V_H по изобретению против RANK-L также могут содержать C-концевое удлинение, как описано здесь, в частности, когда данный домен V_H является моновалентным или образует C-терминальный конец того соединения по изобретению, в котором находится данный домен V_H (опять же, как уже описано здесь). Такие домены V_H по изобретению против RANK-L также могут быть такими, как уже описано здесь, в частности, это могут быть ISVDs.

Опять же, как и с другими аспектами и воплощениями изобретения, описанными здесь, когда определенный ISVD (типа ISVD против RANK-L, описанных в данном примере) или содержащее его соединение, как говорится, “соответствует изобретению” или “как уже описано здесь”, то к данному конкретному ISVD или соединению, соответственно, также определенно применимы предпочтительные аспекты/воплощения и предпочтения, которые вообще описаны здесь для ISVD или соединений по изобретению, если прямо не указано иначе или если конкретный технический контекст не требует иного.

Итак, в предпочтительном аспекте настоящее изобретение касается доменов V_H (в особенности ISVD), направленных против RANK-L, у которых (i) в положении 112 находится K или Q; или (ii) в положении 110 находится K или Q и в положении 11 находится V; или (iii) в положении 89 находится T; или (iv) в положении 89 находится L и в положении 110 находится K или Q; или (v) в положении 11 находится V и в положении 89 находится L; или любые подходящие комбинации из (i)-(v). В частности, у таких доменов V_H против RANK-L:

- аминокислотный остаток в положении 11 предпочтительно выбран из L, V и K (наиболее предпочтительно V);

- аминокислотный остаток в положении 14 предпочтительно выбран из A и P;

- аминокислотный остаток в положении 41 предпочтительно выбран из A и P;

- аминокислотный остаток в положении 89 предпочтительно выбран из T, V и L;

- аминокислотный остаток в положении 108 предпочтительно выбран из Q и L;

- аминокислотный остаток в положении 110 предпочтительно выбран из T, K и Q;

- аминокислотный остаток в положении 112 предпочтительно выбран из S, K и Q;

так что либо (i) в положении 112 находится K или Q; либо (ii) в положении 110 находится K или Q и в положении 11 находится V; либо (iii) в положении 89 находится T; либо (iv) в положении 89 находится L и в положении 110 находится K или Q; либо (v) в положении 11 находится V и в положении 89 находится L; или любые подходящие комбинации из (i)-(v).

Домены V_H по изобретению против RANK-L также могут быть такими, как описано здесь, в частности, опять же это могут быть ISVD (более предпочтительно нанотела) против RANK-L либо белки, полипептиды или другие соединения или конструкции, которые содержат по меньшей мере один такой ISVD. Такие белки, полипептиды или другие соединения или конструкции тоже могут быть такими, как уже описано здесь, и могут иметь, к примеру, повышенный период полураспада (т.е. как описано здесь, например, период полураспада - выраженный в виде t_½-бета - в организме человека по меньшей мере в 1 день, предпочтительно по меньшей мере в 3 дня, более предпочтительно по меньшей мере 7 дней, как-то по меньшей мере 10 дней), и с этой целью могут, к примеру, содержать связывающие сывороточный альбумин нанотела, которые также могут быть связывающими сывороточный альбумин нанотелами по изобретению (опять же, как описано здесь).

Кроме того, такие ISVD могут соответственно иметь C-концевое удлинение (как уже описано здесь и в WO 12/175741), в частности, когда данный ISVD образует C-терминальный конец содержащего его белка, полипептида или другого соединения или конструкции (опять же, как уже описано здесь).

В одном предпочтительном аспекте домены V_H по изобретению против RANK-L включают (i) последовательность CDR1, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 389 (что предпочтительно) или такую аминокислотную последовательность, которая отличается лишь по одной аминокислоте от последовательности SEQ ID NO: 389; (ii) последовательность CDR2, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 390 (что предпочтительно) или такую аминокислотную последовательность, которая отличается лишь по одной или двум аминокислотам от последовательности SEQ ID NO: 390; и (iii) последовательность CDR3, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 391 (что предпочтительно) или такую аминокислотную последовательность, которая отличается лишь по одной или двум аминокислотам от последовательности SEQ ID NO: 391.

Более предпочтительно, у доменов V_H по изобретению против RANK-L согласно этому аспекту: (i) CDR1 представлен SEQ ID NO: 389; (ii) CDR2 представлен SEQ ID NO: 390; и (iii) CDR3 представлен SEQ ID NO: 391.

В одном конкретном аспекте, нанотела по изобретению против RANK-L являются вариантами нанотела по SEQ ID NO: 388 (и по меньшей мере на 90% идентичны по последовательности, как-то по меньшей мере на 95% идентичны по последовательности SEQ ID NO: 388), у которых:

- аминокислотный остаток в положении 11 предпочтительно выбран из L, V и K (наиболее предпочтительно V);

- аминокислотный остаток в положении 14 предпочтительно выбран из A и P;

- аминокислотный остаток в положении 41 предпочтительно выбран из A и P;

- аминокислотный остаток в положении 89 предпочтительно выбран из T, V и L;

- аминокислотный остаток в положении 108 предпочтительно выбран из Q и L;

- аминокислотный остаток в положении 110 предпочтительно выбран из T, K и Q;

- аминокислотный остаток в положении 112 предпочтительно выбран из S, K и Q;

так что либо (i) в положении 112 находится K или Q; либо (ii) в положении 110 находится K или Q и в положении 11 находится V; либо (iii) в положении 89 находится T; либо (iv) в положении 89 находится L и в положении 110 находится K или Q; либо (v) в положении 11 находится V и в положении 89 находится L; или любые подходящие комбинации из (i)-(v). Участки CDR у таких ISVs предпочтительно такие, как определено в двух предыдущих абзацах.

Некоторые особенно предпочтительные, без ограничения, примеры таких нанотел по изобретению против RANK-L представлены на фиг. 19 как SEQ ID NOs: 392-405; и каждое из этих нанотел образует еще один аспект изобретения.

Изобретение также касается соединений по изобретению против RANK-L, которые включают по меньшей мере одно (как-то одно, два или три) нанотела по изобретению по SEQ ID NOs: 392-405. Такие соединения по изобретению против RANK-L опять же могут быть такими, как уже описано здесь, и поэтому, к примеру, могут содержать подходящие линкеры, могут содержать C-концевое удлинение, как описано здесь, и могут иметь продленный период полураспада (например, потому, что они содержат нанотело против сывороточного альбумина человека, как-то (предпочтительно) нанотело по изобретению против сывороточного альбумина человека). Отсылаем к приведенной ниже табл. Z.

Некоторые особенно предпочтительные примеры соединений по изобретению против RANK-L представлены на фиг. 29 в виде SEQ ID NOs: 694-729; и каждое из этих соединений образует еще один аспект изобретения. Так, в другом аспекте изобретение касается полипептидов, направленных против RANK-L и имеющих аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 694-729.

В более общем смысле соединения по изобретению против RANK-L могут быть такими, как описано в WO 2008/142164, но содержать ISVs по изобретению. Они также могут применяться для целей, описанных в WO 2008/142164.

Таблица Z. Примеры соединений по изобретению против RANK-L

Полипептид/ конструкция(¹) Общая формула Звенья/блоки ISV и линкеры Моновалентная [RANK-L] [RANK-L] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 Моновалентная с C-концевым удлинением [RANK-L]-X(n) [RANK-L] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 Моновалентная с продленным t полураспада [RANK-L]-L₁-[SA]
[SA]-L₁-[RANK-L] [RANK-L] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495
[SA] = (см. подпись внизу)
L₁ = (см. подпись внизу) Моновалентная с продленным t полураспада и C-концевым удлинением [RANK-L]-L₁-[SA]-X(n)
[SA]-L₁-[RANK-L]-X(n) [RANK-L] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495
[SA] = (см. подпись внизу)
L₁ = (см. подпись внизу)
X(n) = (см. подпись внизу) Бивалентная(²) [RANK-L]-L₁-[RANK-L] по меньшей мере один из [RANK-L] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
L₁ = (см. подпись внизу) Бивалентная с C-концевым удлинением (²) [RANK-L]-L₁-[RANK-L]-X(n) по меньшей мере один из [RANK-L] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
L₁ = (см. подпись внизу)
X(n) = (см. подпись внизу) Бивалентная с продленным t полураспада (²) [RANK-L]-L₁-[RANK-L]-L₂-[SA]
[RANK-L]-L₁-[SA]-L₂-[RANK-L]
[SA]-L₁-[RANK-L]-L₂-[RANK-L] по меньшей мере один из [RANK-L] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
[SA] = (см. подпись внизу)
L₁ = (см. подпись внизу)
L₂ = (см. подпись внизу) Бивалентная с продленным t полураспада и C-концевым удлинением (²) [RANK-L]-L₁-[RANK-L]-L₂-[SA]-X(n)
[RANK-L]-L₁-[SA]-L₂-[RANK-L]-X(n)
[SA]-L₁-[RANK-L]-L₂-[RANK-L]-X(n) по меньшей мере один из [RANK-L] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
[SA] = (см. подпись внизу)
L₁ = (см. подпись внизу)
L₂ = (см. подпись внизу)
X(n) = (см. подпись внизу) Биспецифичная (³) [RANK-L]-L₁-[Nb]
[Nb]-L₁-[RANK-L]
[RANK-L]-L₁-[RANK-L]-L₂-[Nb]
[RANK-L]-L₁-[Nb]-L₂-[RANK-L]
[Nb]-L₁-[RANK-L]-L₂-[RANK-L] по меньшей мере один из [RANK-L] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
L₁ = (см. подпись внизу)
L₂ = (см. подпись внизу)
[Nb] = (см. подпись внизу) Биспецифичная с C-концевым удлинением (³) [RANK-L]-L₁-[Nb]-X(n)
[Nb]-L₁-[RANK-L]-X(n)
[RANK-L]-L₁-[RANK-L]-L₂-[Nb]-X(n)
[RANK-L]-L₁-[Nb]-L₂-[RANK-L]-X(n)
[Nb]-L₁-[RANK-L]-L₂-[RANK-L]-X(n) по меньшей мере один из [RANK-L] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
L₁ = (см. подпись внизу)
L₂ = (см. подпись внизу)
X(n) = (см. подпись внизу)
[Nb] = (см. подпись внизу) Биспецифичная с продленным t полураспада (³) [RANK-L]-L₁-[Nb]-L₂-[SA]
[RANK-L]-L₁-[SA]-L₂-[Nb]
[Nb]-L₁-[SA]-L₂-[RANK-L]
[Nb]-L₁-[RANK-L]-L₂-[SA]
[SA]-L₁-[RANK-L]-L₂-[Nb]
[SA]-L₁-[Nb]-L₂-[RANK-L]
[RANK-L]-L₁-[RANK-L]-L₂-[Nb]-L₃-[SA]
[Nb]-L₁-[RANK-L]-L₂-[RANK-L]-L₃-[SA]
[SA]-L₁-[RANK-L]-L₂-[RANK-L]-L₃-[Nb]
[SA]-L₁-[RANK-L]-L₂-[Nb]-L₃-[RANK-L]
[RANK-L]-L₁-[Nb]-L₂-[RANK-L]-L₃-[SA] по меньшей мере один из [RANK-L] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
[SA] = (см. подпись внизу)
L₁, L₂, L₃ (см. подпись внизу)
[Nb] = (см. подпись внизу) Биспецифичная с продленным t полураспада и C-концевым удлинением (³) [RANK-L]-L₁-[Nb]-L₂-[SA]-X(n)
[RANK-L]-L₁-[SA]-L₂-[Nb]-X(n)
[Nb]-L₁-[SA]-L₂-[RANK-L]-X(n)
[Nb]-L₁-[RANK-L]-L₂-[SA]-X(n)
[SA]-L₁-[RANK-L]-L₂-[Nb]-X(n)
[SA]-L₁-[Nb]-L₂-[RANK-L]-X(n)
[RANK-L]-L₁-[RANK-L]-L₂-[Nb]-L₃-[SA]-X(n)
[Nb]-L₁-[RANK-L]-L₂-[RANK-L]-L₃-[SA]-X(n)
[SA]-L₁-[RANK-L]-L₂-[RANK-L]-L₃-[Nb]-X(n)
[SA]-L₁-[RANK-L]-L₂-[Nb]-L₃-[RANK-L]-X(n)
[RANK-L]-L₁-[Nb]-L₂-[RANK-L]-L₃-[SA]-X(n) по меньшей мере один из [RANK-L] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
[SA] = (см. подпись внизу)
L₁, L₂, L₃ (см. подпись внизу)
X(n) = (см. подпись внизу)
[Nb] = (см. подпись внизу)

Обозначения

- [SA] означает ISV против сывороточного альбумина (человека), предпочтительно ISV по изобретению против сывороточного альбумина (человека), более предпочтительно по SEQ ID NO: 46 или 61, а еще более предпочтительно один из ISVD по изобретению по SEQ ID NOs: 47, 54, 62, 69, 78, 86, 109, 116, 123, 130 или 496-513.

- Каждый из L₁, L₂ и L₃ (независимо) означает соответствующий линкер. Каждый из L₁, L₂ и L₃ может (независимо) присутствовать или отсутствовать. Неограничительные примеры подходящих линкеров - приведенные здесь линкеры Gly-Ser, как-то линкеры 9GS, 30GS или 35GS.

- X(n) = C-концевое удлинение типа описанных здесь и/или в WO 12/175741.

- [Nb] означает ISV против другой терапевтической мишени.

Примечания

(¹) В настоящей таблице:

- “Моновалентный” обычно относится к полипептидам/конструкциям, содержащим одиночный ISV против RANK-L. Они также могут содержать ISV, продлевающие t полураспада (типа ISV против сывороточного альбумина).

- “Бивалентный” обычно относится к полипептидам/конструкциям, содержащим два ISV против RANK-L (которые могут быть одинаковыми или разными). Они тоже могут содержать ISV, продлевающие t полураспада (типа ISV против сывороточного альбумина).

- “Биспецифичный” обычно относится к полипептидам/конструкциям, содержащим по меньшей мере один (как-то 1 или 2) ISV против RANK-L и еще по меньшей мере один (как-то 1 или 2) другой ISV против терапевтической мишени. Они также могут содержать ISV, продлевающие t полураспада (типа ISV против сывороточного альбумина).

- В полипептидах/конструкциях, приведенных в данной таблице, по меньшей мере один из ISV против RANK-L представлен ISV по изобретению, а предпочтительно все ISV против RANK-L в таких полипептидах/конструкциях представлены ISV по изобретению. А когда в таких полипептидах/конструкциях присутствует ISV, продлевающий t полураспада, и/или ISV против другой терапевтической мишени, то каждый из них (а предпочтительно все) также может быть представлен (а предпочтительно все они представлены) ISV по изобретению.

(²) Все “бивалентные” конструкции в данной таблице также могут быть бипаратопными, то есть они могут содержать по меньшей мере два (как-то 2) ISV против RANK-L, которые направлены против разных эпитопов на RANK-L.

(³) Специалистам должно быть ясно, что с помощью указанных звеньев/блоков и линкеров могут быть получены и другие/дополнительные биспецифичные конструкции, чем приведенные здесь.

(⁴) Предпочтительно каждый из [RANK-L] выбран независимо из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495. К тому же данные [RANK-L] могут быть одинаковыми или разными; а в бипаратопных полипептидах/конструкциях они должны быть направлены против разных эпитопов на RANK-L.

(⁵) Каждые из полипептидов/конструкций, приведенных в этом столбце при помощи SEQ ID, составляют отдельные конкретные аспекты изобретения.

Пример 17. Домены V_H (в частности, нанотела) против CXCR-7 и содержащие их соединения по изобретению

В одном конкретном аспекте, домены V_H по изобретению (в особенности ISVDs
по изобретению и более предпочтительно нанотела по изобретению) и соединения по изобретению могут быть направлены против CXCR-7.

Такие домены V_H по изобретению против CXCR-7 обычно содержат: (i) подходящие каркасные последовательности, которые соответственно включают аминокислотные остатки/мутации по изобретению, как описано здесь; а также (ii) последовательности CDR, которые позволяют доменам V_H по изобретению специфически связываться с CXCR-7. Кроме того, такие домены V_H по изобретению против CXCR-7 также могут содержать C-концевое удлинение, как описано здесь, в частности, когда данный домен V_H является моновалентным или образует C-терминальный конец того соединения по изобретению, в котором находится данный домен V_H (опять же, как уже описано здесь). Такие домены V_H по изобретению против CXCR-7 также могут быть такими, как уже описано здесь, в частности, это могут быть ISVDs.

Опять же, как и с другими аспектами и воплощениями изобретения, описанными здесь, когда определенный ISVD (типа ISVD против CXCR-7, описанных в данном примере) или содержащее его соединение, как говорится, “соответствует изобретению” или “как уже описано здесь”, то к данному конкретному ISVD или соединению, соответственно, также определенно применимы предпочтительные аспекты/воплощения и предпочтения, которые вообще описаны здесь для ISVD или соединений по изобретению, если прямо не указано иначе или если конкретный технический контекст не требует иного.

Итак, в предпочтительном аспекте настоящее изобретение касается доменов V_H (в особенности ISVD), направленных против CXCR-7, у которых (i) в положении 112 находится K или Q; или (ii) в положении 110 находится K или Q и в положении 11 находится V; или (iii) в положении 89 находится T; или (iv) в положении 89 находится L и в положении 110 находится K или Q; или (v) в положении 11 находится V и в положении 89 находится L; или любые подходящие комбинации из (i)-(v). В частности, у таких доменов V_H против CXCR-7:

- аминокислотный остаток в положении 11 предпочтительно выбран из L, V и K (наиболее предпочтительно V);

- аминокислотный остаток в положении 14 предпочтительно выбран из A и P;

- аминокислотный остаток в положении 41 предпочтительно выбран из A и P;

- аминокислотный остаток в положении 89 предпочтительно выбран из T, V и L;

- аминокислотный остаток в положении 108 предпочтительно выбран из Q и L;

- аминокислотный остаток в положении 110 предпочтительно выбран из T, K и Q;

- аминокислотный остаток в положении 112 предпочтительно выбран из S, K и Q;

так что либо (i) в положении 112 находится K или Q; либо (ii) в положении 110 находится K или Q и в положении 11 находится V; либо (iii) в положении 89 находится T; либо (iv) в положении 89 находится L и в положении 110 находится K или Q; либо (v) в положении 11 находится V и в положении 89 находится L; или любые подходящие комбинации из (i)-(v).

Домены V_H по изобретению против CXCR-7 также могут быть такими, как описано здесь, в частности, опять же это могут быть ISVD (более предпочтительно нанотела) против CXCR-7 либо белки, полипептиды или другие соединения или конструкции, которые содержат по меньшей мере один такой ISVD. Такие белки, полипептиды или другие соединения или конструкции тоже могут быть такими, как уже описано здесь, и могут иметь, к примеру, повышенный период полураспада (т.е. как описано здесь, например, период полураспада - выраженный в виде t_½-бета - в организме человека по меньшей мере в 1 день, предпочтительно по меньшей мере в 3 дня, более предпочтительно по меньшей мере 7 дней, как-то по меньшей мере 10 дней), и с этой целью могут, к примеру, содержать связывающие сывороточный альбумин нанотела, которые также могут быть связывающими сывороточный альбумин нанотелами по изобретению (опять же, как описано здесь).

Кроме того, такие ISVD могут соответственно иметь C-концевое удлинение (как уже описано здесь и в WO 12/175741), в частности, когда данный ISVD образует C-терминальный конец содержащего его белка, полипептида или другого соединения или конструкции (опять же, как уже описано здесь).

В одном предпочтительном аспекте домены V_H по изобретению против CXCR-7 включают (i) последовательность CDR1, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 407 (что предпочтительно) или такую аминокислотную последовательность, которая отличается лишь по одной аминокислоте от последовательности SEQ ID NO: 407; (ii) последовательность CDR2, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 408 (что предпочтительно) или такую аминокислотную последовательность, которая отличается лишь по одной или двум аминокислотам от последовательности SEQ ID NO: 408; и (iii) последовательность CDR3, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 409 (что предпочтительно) или такую аминокислотную последовательность, которая отличается лишь по одной или двум аминокислотам от последовательности SEQ ID NO: 409.

Более предпочтительно, у доменов V_H по изобретению против CXCR-7 согласно этому аспекту: (i) CDR1 представлен SEQ ID NO: 407; (ii) CDR2 представлен SEQ ID NO: 408; и (iii) CDR3 представлен SEQ ID NO: 409.

В одном конкретном аспекте, нанотела по изобретению против CXCR-7 являются вариантами нанотела по SEQ ID NO: 406 (и по меньшей мере на 90% идентичны по последовательности, как-то по меньшей мере на 95% идентичны по последовательности SEQ ID NO: 406), у которых:

- аминокислотный остаток в положении 11 предпочтительно выбран из L, V и K (наиболее предпочтительно V);

- аминокислотный остаток в положении 14 предпочтительно выбран из A и P;

- аминокислотный остаток в положении 41 предпочтительно выбран из A и P;

- аминокислотный остаток в положении 89 предпочтительно выбран из T, V и L;

- аминокислотный остаток в положении 108 предпочтительно выбран из Q и L;

- аминокислотный остаток в положении 110 предпочтительно выбран из T, K и Q;

- аминокислотный остаток в положении 112 предпочтительно выбран из S, K и Q;

так что либо (i) в положении 112 находится K или Q; либо (ii) в положении 110 находится K или Q и в положении 11 находится V; либо (iii) в положении 89 находится T; либо (iv) в положении 89 находится L и в положении 110 находится K или Q; либо (v) в положении 11 находится V и в положении 89 находится L; или любые подходящие комбинации из (i)-(v). Участки CDR у таких ISVs предпочтительно такие, как определено в двух предыдущих абзацах.

В другом предпочтительном аспекте домены V_H по изобретению против CXCR-7 включают (i) последовательность CDR1, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 425 (что предпочтительно) или такую аминокислотную последовательность, которая отличается лишь по одной аминокислоте от последовательности SEQ ID NO: 425; (ii) последовательность CDR2, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 426 (что предпочтительно) или такую аминокислотную последовательность, которая отличается лишь по одной или двум аминокислотам от последовательности SEQ ID NO: 426; и (iii) последовательность CDR3, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 427 (что предпочтительно) или такую аминокислотную последовательность, которая отличается лишь по одной или двум аминокислотам от последовательности SEQ ID NO: 427.

Более предпочтительно, у доменов V_H по изобретению против CXCR-7 согласно этому аспекту: (i) CDR1 представлен SEQ ID NO: 425; (ii) CDR2 представлен SEQ ID NO: 426; и (iii) CDR3 представлен SEQ ID NO: 427.

В одном конкретном аспекте, нанотела по изобретению против CXCR-7 являются вариантами нанотела по SEQ ID NO: 424 (и по меньшей мере на 90% идентичны по последовательности, как-то по меньшей мере на 95% идентичны по последовательности SEQ ID NO: 424), у которых:

- аминокислотный остаток в положении 11 предпочтительно выбран из L, V и K (наиболее предпочтительно V);

- аминокислотный остаток в положении 14 предпочтительно выбран из A и P;

- аминокислотный остаток в положении 41 предпочтительно выбран из A и P;

- аминокислотный остаток в положении 89 предпочтительно выбран из T, V и L;

- аминокислотный остаток в положении 108 предпочтительно выбран из Q и L;

- аминокислотный остаток в положении 110 предпочтительно выбран из T, K и Q;

- аминокислотный остаток в положении 112 предпочтительно выбран из S, K и Q;

так что либо (i) в положении 112 находится K или Q; либо (ii) в положении 110 находится K или Q и в положении 11 находится V; либо (iii) в положении 89 находится T; либо (iv) в положении 89 находится L и в положении 110 находится K или Q; либо (v) в положении 11 находится V и в положении 89 находится L; или любые подходящие комбинации из (i)-(v). Опять же, участки CDR у таких ISVs предпочтительно такие, как определено в двух предыдущих абзацах.

Некоторые особенно предпочтительные, без ограничения, примеры таких нанотел по изобретению против CXCR-7 представлены на фиг. 20A как SEQ ID NOs: 410-423 и на фиг. 20B как SEQ ID NOs: 428-441; и каждое из этих нанотел образует еще один аспект изобретения.

Изобретение также касается соединений по изобретению против CXCR-7, которые включают по меньшей мере одно (как-то одно, два или три) нанотела по изобретению по SEQ ID NOs: 410-423 и/или 428-441. Такие соединения по изобретению против CXCR-7 опять же могут быть такими, как уже описано здесь, и поэтому, к примеру, могут содержать подходящие линкеры, могут содержать C-концевое удлинение, как описано здесь, и могут иметь продленный период полураспада (например, потому, что они содержат нанотело против сывороточного альбумина человека, как-то (предпочтительно) нанотело по изобретению против сывороточного альбумина человека). Отсылаем к приведенной ниже табл. AA.

Как описано, к примеру, в WO 2012/130874, один особенно предпочтительный класс соединений на основе нанотел против CXCR-7 составляют бипаратопные соединения. Так, в одном аспекте изобретения, соединения по изобретению против CXCR-7 представляют собой бипаратопные конструкции, которые содержат один ISV, который имеет SEQ ID NO: 406 либо (предпочтительно) является таким ISV по изобретению, который был получен из SEQ ID NO: 406 (как описано в данном примере 17), и один ISV, который имеет SEQ ID NO: 424 или (предпочтительно) является таким ISV по изобретению, который был получен из SEQ ID NO: 424 (как описано в данном примере 17), при условии, что по меньшей мере один (а предпочтительно оба) из этих ISV представляет собой ISV по изобретению. Такие бипаратопные конструкции также могут иметь продленный период полураспада (т.е. при помощи связывающего сывороточный альбумин ISV).

В более общем смысле соединения по изобретению против CXCR-7 могут быть такими, как описано в WO 2012/130874, но содержать ISVs по изобретению. Они также могут применяться для целей, описанных в WO 2012/130874.

Таблица AA. Примеры соединений по изобретению против CXCR-7

Полипептид/ конструкция(¹) Общая формула Звенья/блоки ISV и линкеры Моновалентная [CXCR-7] [CXCR-7] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 Моновалентная с C-концевым удлинением [CXCR-7]-X(n) [CXCR-7] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 Моновалентная с продленным t полураспада [CXCR-7]-L₁-[SA]
[SA]-L₁-[CXCR-7] [CXCR-7] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495
[SA] = (см. подпись внизу)
L₁ = (см. подпись внизу) Моновалентная с продленным t полураспада и C-концевым удлинением [CXCR-7]-L₁-[SA]-X(n)
[SA]-L₁-[CXCR-7]-X(n) [CXCR-7] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495
[SA] = (см. подпись внизу)
L₁ = (см. подпись внизу)
X(n) = (см. подпись внизу) Бивалентная(²) [CXCR-7]-L₁-[CXCR-7] по меньшей мере один из [CXCR-7] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
L₁ = (см. подпись внизу) Бивалентная с C-концевым удлинением (²) [CXCR-7]-L₁-[CXCR-7]-X(n) по меньшей мере один из [CXCR-7] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
L₁ = (см. подпись внизу)
X(n) = (см. подпись внизу) Бивалентная с продленным t полураспада (²) [CXCR-7]-L₁-[CXCR-7]-L₂-[SA]
[CXCR-7]-L₁-[SA]-L₂-[CXCR-7]
[SA]-L₁-[CXCR-7]-L₂-[CXCR-7] по меньшей мере один из [CXCR-7] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
[SA] = (см. подпись внизу)
L₁ = (см. подпись внизу)
L₂ = (см. подпись внизу) Бивалентная с продленным t полураспада и C-концевым удлинением (²) [CXCR-7]-L₁-[CXCR-7]-L₂-[SA]-X(n)
[CXCR-7]-L₁-[SA]-L₂-[CXCR-7]-X(n)
[SA]-L₁-[CXCR-7]-L₂-[CXCR-7]-X(n) по меньшей мере один из [CXCR-7] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
[SA] = (см. подпись внизу)
L₁ = (см. подпись внизу)
L₂ = (см. подпись внизу)
X(n) = (см. подпись внизу) Биспецифичная (³) [CXCR-7]-L₁-[Nb]
[Nb]-L₁-[CXCR-7]
[CXCR-7]-L₁-[CXCR-7]-L₂-[Nb]
[CXCR-7]-L₁-[Nb]-L₂-[CXCR-7]
[Nb]-L₁-[CXCR-7]-L₂-[CXCR-7] по меньшей мере один из [CXCR-7] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
L₁ = (см. подпись внизу)
L₂ = (см. подпись внизу)
[Nb] = (см. подпись внизу) Биспецифичная с C-концевым удлинением (³) [CXCR-7]-L₁-[Nb]-X(n)
[Nb]-L₁-[CXCR-7]-X(n)
[CXCR-7]-L₁-[CXCR-7]-L₂-[Nb]-X(n)
[CXCR-7]-L₁-[Nb]-L₂-[CXCR-7]-X(n)
[Nb]-L₁-[CXCR-7]-L₂-[CXCR-7]-X(n) по меньшей мере один из [CXCR-7] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
L₁ = (см. подпись внизу)
L₂ = (см. подпись внизу)
X(n) = (см. подпись внизу)
[Nb] = (см. подпись внизу) Биспецифичная с продленным t полураспада (³) [CXCR-7]-L₁-[Nb]-L₂-[SA]
[CXCR-7]-L₁-[SA]-L₂-[Nb]
[Nb]-L₁-[SA]-L₂-[CXCR-7]
[Nb]-L₁-[CXCR-7]-L₂-[SA]
[SA]-L₁-[CXCR-7]-L₂-[Nb]
[SA]-L₁-[Nb]-L₂-[CXCR-7]
[CXCR-7]-L₁-[CXCR-7]-L₂-[Nb]-L₃-[SA]
[Nb]-L₁-[CXCR-7]-L₂-[CXCR-7]-L₃-[SA]
[SA]-L₁-[CXCR-7]-L₂-[CXCR-7]-L₃-[Nb]
[SA]-L₁-[CXCR-7]-L₂-[Nb]-L₃-[CXCR-7]
[CXCR-7]-L₁-[Nb]-L₂-[CXCR-7]-L₃-[SA] по меньшей мере один из [CXCR-7] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
[SA] = (см. подпись внизу)
L₁, L₂, L₃ (см. подпись внизу)
[Nb] = (см. подпись внизу) Биспецифичная с продленным t полураспада и C-концевым удлинением (³) [CXCR-7]-L₁-[Nb]-L₂-[SA]-X(n)
[CXCR-7]-L₁-[SA]-L₂-[Nb]-X(n)
[Nb]-L₁-[SA]-L₂-[CXCR-7]-X(n)
[Nb]-L₁-[CXCR-7]-L₂-[SA]-X(n)
[SA]-L₁-[CXCR-7]-L₂-[Nb]-X(n)
[SA]-L₁-[Nb]-L₂-[CXCR-7]-X(n)
[CXCR-7]-L₁-[CXCR-7]-L₂-[Nb]-L₃-[SA]-X(n)
[Nb]-L₁-[CXCR-7]-L₂-[CXCR-7]-L₃-[SA]-X(n)
[SA]-L₁-[CXCR-7]-L₂-[CXCR-7]-L₃-[Nb]-X(n)
[SA]-L₁-[CXCR-7]-L₂-[Nb]-L₃-[CXCR-7]-X(n)
[CXCR-7]-L₁-[Nb]-L₂-[CXCR-7]-L₃-[SA]-X(n) по меньшей мере один из [CXCR-7] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
[SA] = (см. подпись внизу)
L₁, L₂, L₃ (см. подпись внизу)
X(n) = (см. подпись внизу)
[Nb] = (см. подпись внизу)

Обозначения

- [SA] означает ISV против сывороточного альбумина (человека), предпочтительно ISV по изобретению против сывороточного альбумина (человека), более предпочтительно по SEQ ID NO: 46 или 61, а еще более предпочтительно один из ISVD по изобретению по SEQ ID NOs: 47, 54, 62, 69, 78, 86, 109, 116, 123, 130 или 496-513.

- Каждый из L₁, L₂ и L₃ (независимо) означает соответствующий линкер. Каждый из L₁, L₂ и L₃ может (независимо) присутствовать или отсутствовать. Неограничительные примеры подходящих линкеров - приведенные здесь линкеры Gly-Ser, как-то линкеры 9GS, 30GS или 35GS.

- X(n) = C-концевое удлинение типа описанных здесь и/или в WO 12/175741.

- [Nb] означает ISV против другой терапевтической мишени.

Примечания

(¹) В настоящей таблице:

- “Моновалентный” обычно относится к полипептидам/конструкциям, содержащим одиночный ISV против CXCR-7. Они также могут содержать ISV, продлевающие t полураспада (типа ISV против сывороточного альбумина).

- “Бивалентный” обычно относится к полипептидам/конструкциям, содержащим два ISV против CXCR-7 (которые могут быть одинаковыми или разными). Они тоже могут содержать ISV, продлевающие t полураспада (типа ISV против сывороточного альбумина).

- “Биспецифичный” обычно относится к полипептидам/конструкциям, содержащим по меньшей мере один (как-то 1 или 2) ISV против CXCR-7 и еще по меньшей мере один (как-то 1 или 2) другой ISV против терапевтической мишени. Они также могут содержать ISV, продлевающие t полураспада (типа ISV против сывороточного альбумина).

- В полипептидах/конструкциях, приведенных в данной таблице, по меньшей мере один из ISV против CXCR-7 представлен ISV по изобретению, а предпочтительно все ISV против CXCR-7 в таких полипептидах/конструкциях представлены ISV по изобретению. А когда в таких полипептидах/конструкциях присутствует ISV, продлевающий t полураспада, и/или ISV против другой терапевтической мишени, то каждый из них (а предпочтительно все) также может быть представлен (а предпочтительно все они представлены) ISV по изобретению.

(²) Все “бивалентные” конструкции в данной таблице также могут быть бипаратопными, то есть они могут содержать по меньшей мере два (как-то 2) ISV против CXCR-7, которые направлены против разных эпитопов на CXCR-7.

(³) Специалистам должно быть ясно, что с помощью указанных звеньев/блоков и линкеров могут быть получены и другие/дополнительные биспецифичные конструкции, чем приведенные здесь.

(⁴) Предпочтительно каждый из [CXCR-7] выбран независимо из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495. К тому же данные [CXCR-7] могут быть одинаковыми или разными; а в бипаратопных полипептидах/конструкциях они должны быть направлены против разных эпитопов на CXCR-7.

(⁵) Каждые из полипептидов/конструкций, приведенных в этом столбце при помощи SEQ ID, составляют отдельные конкретные аспекты изобретения.

Пример 18. Домены V_H (в частности, нанотела) против A-бета и содержащие их соединения по изобретению

В одном конкретном аспекте, домены V_H по изобретению (в особенности ISVDs по изобретению и более предпочтительно нанотела по изобретению) и соединения по изобретению могут быть направлены против A-бета.

Такие домены V_H по изобретению против A-бета обычно содержат: (i) подходящие каркасные последовательности, которые соответственно включают аминокислотные остатки/мутации по изобретению, как описано здесь; а также (ii) последовательности CDR, которые позволяют доменам V_H по изобретению специфически связываться с A-бета. Кроме того, такие домены V_H по изобретению против A-бета также могут содержать C-концевое удлинение, как описано здесь, в частности, когда данный домен V_H является моновалентным или образует C-терминальный конец того соединения по изобретению, в котором находится данный домен V_H (опять же, как уже описано здесь). Такие домены V_H по изобретению против A-бета также могут быть такими, как уже описано здесь, в частности, это могут быть ISVDs.

Опять же, как и с другими аспектами и воплощениями изобретения, описанными здесь, когда определенный ISVD (типа ISVD против A-бета, описанных в данном примере) или содержащее его соединение, как говорится, “соответствует изобретению” или “как уже описано здесь”, то к данному конкретному ISVD или соединению, соответственно, также определенно применимы предпочтительные аспекты/воплощения и предпочтения, которые вообще описаны здесь для ISVD или соединений по изобретению, если прямо не указано иначе или если конкретный технический контекст не требует иного.

Итак, в предпочтительном аспекте настоящее изобретение касается доменов V_H (в особенности ISVD), направленных против A-бета, у которых (i) в положении 112 находится K или Q; или (ii) в положении 110 находится K или Q и в положении 11 находится V; или (iii) в положении 89 находится T; или (iv) в положении 89 находится L и в положении 110 находится K или Q; или (v) в положении 11 находится V и в положении 89 находится L; или любые подходящие комбинации из (i)-(v). В частности, у таких доменов V_H против A-бета:

- аминокислотный остаток в положении 11 предпочтительно выбран из L, V и K (наиболее предпочтительно V);

- аминокислотный остаток в положении 14 предпочтительно выбран из A и P;

- аминокислотный остаток в положении 41 предпочтительно выбран из A и P;

- аминокислотный остаток в положении 89 предпочтительно выбран из T, V и L;

- аминокислотный остаток в положении 108 предпочтительно выбран из Q и L;

- аминокислотный остаток в положении 110 предпочтительно выбран из T, K и Q;

- аминокислотный остаток в положении 112 предпочтительно выбран из S, K и Q;

так что либо (i) в положении 112 находится K или Q; либо (ii) в положении 110 находится K или Q и в положении 11 находится V; либо (iii) в положении 89 находится T; либо (iv) в положении 89 находится L и в положении 110 находится K или Q; либо (v) в положении 11 находится V и в положении 89 находится L; или любые подходящие комбинации из (i)-(v).

Домены V_H по изобретению против A-бета также могут быть такими, как описано здесь, в частности, опять же это могут быть ISVD (более предпочтительно нанотела) против A-бета либо белки, полипептиды или другие соединения или конструкции, которые содержат по меньшей мере один такой ISVD. Такие белки, полипептиды или другие соединения или конструкции тоже могут быть такими, как уже описано здесь, и могут иметь, к примеру, повышенный период полураспада (т.е. как описано здесь, например, период полураспада - выраженный в виде t_½-бета - в организме человека по меньшей мере в 1 день, предпочтительно по меньшей мере в 3 дня, более предпочтительно по меньшей мере 7 дней, как-то по меньшей мере 10 дней), и с этой целью могут, к примеру, содержать связывающие сывороточный альбумин нанотела, которые также могут быть связывающими сывороточный альбумин нанотелами по изобретению (опять же, как описано здесь).

Кроме того, такие ISVD могут соответственно иметь C-концевое удлинение (как уже описано здесь и в WO 12/175741), в частности, когда данный ISVD образует C-терминальный конец содержащего его белка, полипептида или другого соединения или конструкции (опять же, как уже описано здесь).

В одном предпочтительном аспекте домены V_H по изобретению против A-бета включают (i) последовательность CDR1, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 461 (что предпочтительно) или такую аминокислотную последовательность, которая отличается лишь по одной аминокислоте от последовательности SEQ ID NO: 461; (ii) последовательность CDR2, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 462 (что предпочтительно) или такую аминокислотную последовательность, которая отличается лишь по одной или двум аминокислотам от последовательности SEQ ID NO: 462; и (iii) последовательность CDR3, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 463 (что предпочтительно) или такую аминокислотную последовательность, которая отличается лишь по одной или двум аминокислотам от последовательности SEQ ID NO: 463.

Более предпочтительно, у доменов V_H по изобретению против A-бета согласно этому аспекту: (i) CDR1 представлен SEQ ID NO: 461; (ii) CDR2 представлен SEQ ID NO: 462; и (iii) CDR3 представлен SEQ ID NO: 463.

В одном конкретном аспекте, нанотела по изобретению против A-бета являются вариантами нанотела по SEQ ID NO: 460 (и по меньшей мере на 90% идентичны по последовательности, как-то по меньшей мере на 95% идентичны по последовательности SEQ ID NO: 460), у которых:

- аминокислотный остаток в положении 11 предпочтительно выбран из L, V и K (наиболее предпочтительно V);

- аминокислотный остаток в положении 14 предпочтительно выбран из A и P;

- аминокислотный остаток в положении 41 предпочтительно выбран из A и P;

- аминокислотный остаток в положении 89 предпочтительно выбран из T, V и L;

- аминокислотный остаток в положении 108 предпочтительно выбран из Q и L;

- аминокислотный остаток в положении 110 предпочтительно выбран из T, K и Q;

- аминокислотный остаток в положении 112 предпочтительно выбран из S, K и Q;

так что либо (i) в положении 112 находится K или Q; либо (ii) в положении 110 находится K или Q и в положении 11 находится V; либо (iii) в положении 89 находится T; либо (iv) в положении 89 находится L и в положении 110 находится K или Q; либо (v) в положении 11 находится V и в положении 89 находится L; или любые подходящие комбинации из (i)-(v). Участки CDR у таких ISVs предпочтительно такие, как определено в двух предыдущих абзацах.

В другом предпочтительном аспекте домены V_H по изобретению против A-бета включают (i) последовательность CDR1, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 479 (что предпочтительно) или такую аминокислотную последовательность, которая отличается лишь по одной или двум аминокислотам от последовательности SEQ ID NO: 479; (ii) последовательность CDR2, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 480 (что предпочтительно) или такую аминокислотную последовательность, которая отличается лишь по одной аминокислоте от последовательности SEQ ID NO: 480; и (iii) последовательность CDR3, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 481 (что предпочтительно) или такую аминокислотную последовательность, которая отличается лишь по одной или двум аминокислотам от последовательности SEQ ID NO: 481.

Более предпочтительно, у доменов V_H по изобретению против A-бета согласно этому аспекту: (i) CDR1 представлен SEQ ID NO: 479; (ii) CDR2 представлен SEQ ID NO: 480; и (iii) CDR3 представлен SEQ ID NO: 481.

В одном конкретном аспекте, нанотела по изобретению против A-бета являются вариантами нанотела по SEQ ID NO: 478 (и по меньшей мере на 90% идентичны по последовательности, как-то по меньшей мере на 95% идентичны по последовательности SEQ ID NO: 478), у которых:

- аминокислотный остаток в положении 11 предпочтительно выбран из L, V и K (наиболее предпочтительно V);

- аминокислотный остаток в положении 14 предпочтительно выбран из A и P;

- аминокислотный остаток в положении 41 предпочтительно выбран из A и P;

- аминокислотный остаток в положении 89 предпочтительно выбран из T, V и L;

- аминокислотный остаток в положении 108 предпочтительно выбран из Q и L;

- аминокислотный остаток в положении 110 предпочтительно выбран из T, K и Q;

- аминокислотный остаток в положении 112 предпочтительно выбран из S, K и Q;

так что либо (i) в положении 112 находится K или Q; либо (ii) в положении 110 находится K или Q и в положении 11 находится V; либо (iii) в положении 89 находится T; либо (iv) в положении 89 находится L и в положении 110 находится K или Q; либо (v) в положении 11 находится V и в положении 89 находится L; или же любые подходящие комбинации из (i)-(v). Опять же, участки CDR у таких ISVs предпочтительно такие, как определено в двух предыдущих абзацах.

Некоторые особенно предпочтительные, без ограничения, примеры таких нанотел по изобретению против A-бета представлены на фиг. 21A как SEQ ID NOs: 464-477 и на фиг. 21B как SEQ ID NOs: 482-495, соответственно; и каждое из этих нанотел образует еще один аспект изобретения.

Изобретение также касается соединений по изобретению против A-бета, которые включают по меньшей мере одно (как-то одно, два или три) нанотела по изобретению по SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495. Такие соединения по изобретению против A-бета опять же могут быть такими, как уже описано здесь, и поэтому, к примеру, могут содержать подходящие линкеры, могут содержать C-концевое удлинение, как описано здесь, и могут иметь продленный период полураспада (например, потому, что они содержат нанотело против сывороточного альбумина человека, как-то (предпочтительно) нанотело по изобретению против сывороточного альбумина человека). Отсылаем к приведенной ниже табл. V.

Как описано, к примеру, в WO 2006/040153, и в особенности, как описано в EP 2542579, один особенно предпочтительный класс соединений на основе нанотел против A-бета составляют бипаратопные соединения. Так, в одном аспекте изобретения, соединения по изобретению против A-бета представляют собой бипаратопные конструкции, которые содержат один ISV, который имеет SEQ ID NO: 460 либо (предпочтительно) является таким ISV по изобретению, который был получен из SEQ ID NO: 460 (как описано в данном примере 18), и один ISV, который имеет SEQ ID NO: 478 либо (предпочтительно) является таким ISV по изобретению, который был получен из SEQ ID NO: 478 (как описано в данном примере 18), при условии, что по меньшей мере один (а предпочтительно оба) из этих ISV представляет собой ISV по изобретению. Такие бипаратопные конструкции также могут иметь продленный период полураспада (т.е. при помощи связывающего сывороточный альбумин ISV). Некоторые конкретные примеры таких бипаратопных конструкций приведены в SEQ ID NOs: 730-766.

Некоторые особенно предпочтительные примеры соединений по изобретению против A-бета представлены на фиг. 30 в виде SEQ ID NOs: 730-766; и каждое из этих соединений образует еще один аспект изобретения. Так, в другом аспекте изобретение касается полипептидов, направленных против A-бета и имеющих аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 730-766. В более общем смысле соединения по изобретению против A-бета могут быть такими, как описано в WO 2006/040153, и в особенности, как описано в EP 2542579, но содержать ISVs по изобретению. Они также могут применяться для целей, описанных в WO 2006/040153 и в особенности в EP 2542579.

Таблица BB. Примеры соединений по изобретению против A-бета

Полипептид/ конструкция(¹) Общая формула Звенья/блоки ISV и линкеры Моновалентная [A-бета] [A-бета] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 Моновалентная с C-концевым удлинением [A-бета]-X(n) [A-бета] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 Моновалентная с продленным t полураспада [A-бета]-L₁-[SA]
[SA]-L₁-[A-бета] [A-бета] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495
[SA] = (см. подпись внизу)
L₁ = (см. подпись внизу) Моновалентная с продленным t полураспада и C-концевым удлинением [A-бета]-L₁-[SA]-X(n)
[SA]-L₁-[A-бета]-X(n) [A-бета] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495
[SA] = (см. подпись внизу)
L₁ = (см. подпись внизу)
X(n) = (см. подпись внизу) Бивалентная(²) [A-бета]-L₁-[A-бета] по меньшей мере один из [A-бета] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
L₁ = (см. подпись внизу) Бивалентная с C-концевым удлинением (²) [A-бета]-L₁-[A-бета]-X(n) по меньшей мере один из [A-бета] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
L₁ = (см. подпись внизу)
X(n) = (см. подпись внизу) Бивалентная с продленным t полураспада (²) [A-бета]-L₁-[A-бета]-L₂-[SA]
[A-бета]-L₁-[SA]-L₂-[A-бета]
[SA]-L₁-[A-бета]-L₂-[A-бета] по меньшей мере один из [A-бета] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
[SA] = (см. подпись внизу)
L₁ = (см. подпись внизу)
L₂ = (см. подпись внизу) Бивалентная с продленным t полураспада и C-концевым удлинением (²) [A-бета]-L₁-[A-бета]-L₂-[SA]-X(n)
[A-бета]-L₁-[SA]-L₂-[A-бета]-X(n)
[SA]-L₁-[A-бета]-L₂-[A-бета]-X(n) по меньшей мере один из [A-бета] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
[SA] = (см. подпись внизу)
L₁ = (см. подпись внизу)
L₂ = (см. подпись внизу)
X(n) = (см. подпись внизу) Биспецифичная (³) [A-бета]-L₁-[Nb]
[Nb]-L₁-[A-бета]
[A-бета]-L₁-[A-бета]-L₂-[Nb]
[A-бета]-L₁-[Nb]-L₂-[A-бета]
[Nb]-L₁-[A-бета]-L₂-[A-бета] по меньшей мере один из [A-бета] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
L₁ = (см. подпись внизу)
L₂ = (см. подпись внизу)
[Nb] = (см. подпись внизу) Биспецифичная с C-концевым удлинением (³) [A-бета]-L₁-[Nb]-X(n)
[Nb]-L₁-[A-бета]-X(n)
[A-бета]-L₁-[A-бета]-L₂-[Nb]-X(n)
[A-бета]-L₁-[Nb]-L₂-[A-бета]-X(n)
[Nb]-L₁-[A-бета]-L₂-[A-бета]-X(n) по меньшей мере один из [A-бета] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
L₁ = (см. подпись внизу)
L₂ = (см. подпись внизу)
X(n) = (см. подпись внизу)
[Nb] = (см. подпись внизу) Биспецифичная с продленным t полураспада (³) [A-бета]-L₁-[Nb]-L₂-[SA]
[A-бета]-L₁-[SA]-L₂-[Nb]
[Nb]-L₁-[SA]-L₂-[A-бета]
[Nb]-L₁-[A-бета]-L₂-[SA]
[SA]-L₁-[A-бета]-L₂-[Nb]
[SA]-L₁-[Nb]-L₂-[A-бета]
[A-бета]-L₁-[A-бета]-L₂-[Nb]-L₃-[SA]
[Nb]-L₁-[A-бета]-L₂-[A-бета]-L₃-[SA]
[SA]-L₁-[A-бета]-L₂-[A-бета]-L₃-[Nb]
[SA]-L₁-[A-бета]-L₂-[Nb]-L₃-[A-бета]
[A-бета]-L₁-[Nb]-L₂-[A-бета]-L₃-[SA] по меньшей мере один из [A-бета] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
[SA] = (см. подпись внизу)
L₁, L₂, L₃ (см. подпись внизу)
[Nb] = (см. подпись внизу) Биспецифичная с продленным t полураспада и C-концевым удлинением (³) [A-бета]-L₁-[Nb]-L₂-[SA]-X(n)
[A-бета]-L₁-[SA]-L₂-[Nb]-X(n)
[Nb]-L₁-[SA]-L₂-[A-бета]-X(n)
[Nb]-L₁-[A-бета]-L₂-[SA]-X(n)
[SA]-L₁-[A-бета]-L₂-[Nb]-X(n)
[SA]-L₁-[Nb]-L₂-[A-бета]-X(n)
[A-бета]-L₁-[A-бета]-L₂-[Nb]-L₃-[SA]-X(n)
[Nb]-L₁-[A-бета]-L₂-[A-бета]-L₃-[SA]-X(n)
[SA]-L₁-[A-бета]-L₂-[A-бета]-L₃-[Nb]-X(n)
[SA]-L₁-[A-бета]-L₂-[Nb]-L₃-[A-бета]-X(n)
[A-бета]-L₁-[Nb]-L₂-[A-бета]-L₃-[SA]-X(n) по меньшей мере один из [A-бета] = одна из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495 (⁴)
[SA] = (см. подпись внизу)
L₁, L₂, L₃ (см. подпись внизу)
X(n) = (см. подпись внизу)
[Nb] = (см. подпись внизу)

Обозначения

- [SA] означает ISV против сывороточного альбумина (человека), предпочтительно ISV по изобретению против сывороточного альбумина (человека), более предпочтительно по SEQ ID NO: 46 или 61, а еще более предпочтительно один из ISVD по изобретению по SEQ ID NOs: 47, 54, 62, 69, 78, 86, 109, 116, 123, 130 или 496-513.

- Каждый из L₁, L₂ и L₃ (независимо) означает соответствующий линкер. Каждый из L₁, L₂ и L₃ может (независимо) присутствовать или отсутствовать. Неограничительные примеры подходящих линкеров - приведенные здесь линкеры Gly-Ser, как-то линкеры 9GS, 30GS или 35GS.

- X(n) = C-концевое удлинение типа описанных здесь и/или в WO 12/175741.

- [Nb] означает ISV против другой терапевтической мишени.

Примечания

(¹) В настоящей таблице:

- “Моновалентный” обычно относится к полипептидам/конструкциям, содержащим одиночный ISV против A-бета. Они также могут содержать ISV, продлевающие t полураспада (типа ISV против сывороточного альбумина).

- “Бивалентный” обычно относится к полипептидам/конструкциям, содержащим два ISV против A-бета (которые могут быть одинаковыми или разными). Они тоже могут содержать ISV, продлевающие t полураспада (типа ISV против сывороточного альбумина).

- “Биспецифичный” обычно относится к полипептидам/конструкциям, содержащим по меньшей мере один (как-то 1 или 2) ISV против A-бета и еще по меньшей мере один (как-то 1 или 2) другой ISV против терапевтической мишени. Они также могут содержать ISV, продлевающие t полураспада (типа ISV против сывороточного альбумина).

- В полипептидах/конструкциях, приведенных в данной таблице, по меньшей мере один из ISV против A-бета представлен ISV по изобретению, а предпочтительно все ISV против A-бета в таких полипептидах/конструкциях представлены ISV по изобретению. А когда в таких полипептидах/конструкциях присутствует ISV, продлевающий t полураспада, и/или ISV против другой терапевтической мишени, то каждый из них (а предпочтительно все) также может быть представлен (а предпочтительно все они представлены) ISV по изобретению.

(²) Все “бивалентные” конструкции в данной таблице также могут быть бипаратопными, то есть они могут содержать по меньшей мере два (как-то 2) ISV против A-бета, которые направлены против разных эпитопов на A-бета.

(³) Специалистам должно быть ясно, что с помощью указанных звеньев/блоков и линкеров могут быть получены и другие/дополнительные биспецифичные конструкции, чем приведенные здесь.

(⁴) Предпочтительно каждый из [A-бета] выбран независимо из SEQ ID NOs: 464-477 и/или 482-495. К тому же данные [A-бета] могут быть одинаковыми или разными; а в бипаратопных полипептидах/конструкциях они должны быть направлены против разных эпитопов на A-бета.

(⁵) Каждые из полипептидов/конструкций, приведенных в этом столбце при помощи SEQ ID, составляют отдельные конкретные аспекты изобретения.

Пример 19. Тестирование конструкций против A-бета на связывание с предсуществующими антителами

Тестировали и сравнивали три конструкции против A-бета с продленным периодом полураспада (по общей формуле [A-бета-1]-9GS-ALB8-9GS-[A-бета-2]-A) на связывание с предсуществующими антителами по описанной здесь общей методике. Две конструкции по изобретению имели указанные мутации по изобретению во все трех звеньях/блоках (т.е. в двух нанотелах против A-бета и в нанотеле, связывающем сывороточный альбумин). Контрольная конструкция (SEQ ID NO: 766) не имела мутаций по изобретению ни в одном из звеньев/блоков. Все исследованные конструкции содержали C-концевой аланин. Результаты представлены в табл. CC-1 и на фиг. 31A.

Таблица CC-1. Тестирование конструкций против A-бета на связывание с предсуществующими антителами

Нанотело при тестировании
на 92 образцах (здоровых лиц) Номер на фиг. 31A Уровень связывания через 125 сек < 10 RU Уровень связывания через 125 сек < 20 RU Уровень связывания через 125 сек > 20 RU SEQ ID NO: 766 (контроль) (1) 0 1 91 SEQ ID NO: 733 (по изобретению: L11V + V89L) (2) 11 41 51 SEQ ID NO: 749 (по изобретению: L11V + V89L + T110K) (3) 16 56 36

Также отдельно тестировали нанотела против A-бета, которые находились на C-терминальном конце конструкций, в виде моновалентных конструкций (с C-концевым аланином). Результаты представлены в табл. CC-2 и на фиг. 31A.

Таблица CC-2. Тестирование моновалентных нанотел против A-бета на связывание с предсуществующими антителами

Нанотело при тестировании
на 145 образцах (здоровых лиц) Номер на фиг. 31A Уровень связывания через 125 сек < 10 RU Уровень связывания через 125 сек < 20 RU Уровень связывания через 125 сек > 20 RU SEQ ID NO: 478 (контроль) (*) (1) 67 87 58 SEQ ID NO: 489 (по изобретению: L11V + V89L) (*) (2) 74 103 42 SEQ ID NO: 490 (по изобретению: L11V + V89L + T110K) (*) (3) 116 138 7

(*) Все 3 моновалентных нанотела содержали добавление C-концевого аланина

Пример 20. Обзор связывающих сывороточный альбумин нанотел по изобретению

В приведенных ниже таблицах DD и EE представлены некоторые предпочтительные, но без ограничения, примеры связывающих сывороточный альбумин нанотел по изобретению на основе Alb-8 (табл. DD) и Alb-23 (табл. EE), соответственно.

Как уже отмечалось, изобретение также касается полипептидов, белков, соединений или конструкций (в частности, соединений по изобретению), содержащих одно из связывающих сывороточный альбумин нанотел, перечисленных ниже в табл. DD или EE. Такие полипептиды, белки, соединения или конструкции (в особенности соединения по изобретению) могут дополнительно содержать по меньшей мере один (как-то один, два или три) связывающий домен или связывающий блок (типа ISVD, в особенности ISV по изобретению), направленный против хотя бы одной терапевтической мишени. Опять же, такие полипептиды, белки, соединения или конструкции могут соответственно быть моноспецифичными, биспецифичными или триспецифичными по отношению к терапевтическим мишеням и могут быть бивалентными, тривалентными, тетравалентными или с более высокой валентностью. Обычно они также содержат подходящие линкеры и могут содержать C-концевое удлинение, как описано здесь.

В частности, такие полипептиды, белки, соединения или конструкции могут быть соединениями по изобретению (как описано здесь) и/или могут быть такими, как уже описано здесь для соединений по изобретению (включая предпочтительные воплощения для соединений по изобретению, причем особенно предпочтительны соединения, содержащие ISVDs и в особенности нанотела). Соответственно, соединения по изобретению, содержащие одно из связывающих сывороточный альбумин нанотел, перечисленных в таблице DD или EE, составляют дополнительные аспекты изобретения.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Ablynx NV

<120> Improved Immunoglobulin Variable Domains

<130> 180970

<140> PCT/EP2015/060643

<141> 2015-05-13

<150> US 61/994552

<151> 2014-05-16

<150> US 61/014015

<151> 2014-06-18

<150> US 62/040167

<151> 2014-08-21

<150> US 62/047560

<151> 2014-09-08

<150> US 62/133600

<151> 2015-03-16

<160> 766

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C-terminal amino acid sequence

<400> 1

Val Thr Val Lys Ser

1 5

<210> 2

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C-terminal amino acid sequence

<400> 2

Val Thr Val Gln Ser

1 5

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FR4 sequence

<400> 3

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Lys Ser

1 5 10

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FR4 sequence

<400> 4

Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Ser

1 5 10

<210> 5

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FR4 sequence

<400> 5

Arg Gly Gln Gly Thr Arg Val Thr Val Lys Ser

1 5 10

<210> 6

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FR4 sequence

<400> 6

Trp Gly Leu Gly Thr Gln Val Thr Ile Ser Ser

1 5 10

<210> 7

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FR4 sequence

<400> 7

Gly Ser Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Lys Ser

1 5 10

<210> 8

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FR4 sequence

<400> 8

Leu Arg Gly Gly Thr Gln Val Thr Val Lys Ser

1 5 10

<210> 9

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FR4 sequence

<400> 9

Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Ser

1 5 10

<210> 10

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FR4 sequence

<400> 10

Arg Ser Arg Gly Ile Gln Val Thr Val Lys Ser

1 5 10

<210> 11

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FR4 sequence

<400> 11

Trp Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Lys Ser

1 5 10

<210> 12

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FR4 sequence

<400> 12

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Gln Ser

1 5 10

<210> 13

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FR4 sequence

<400> 13

Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Gln Ser

1 5 10

<210> 14

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FR4 sequence

<400> 14

Arg Gly Gln Gly Thr Arg Val Thr Val Gln Ser

1 5 10

<210> 15

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FR4 sequence

<400> 15

Trp Gly Leu Gly Thr Gln Val Thr Ile Ser Ser

1 5 10

<210> 16

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FR4 sequence

<400> 16

Gly Ser Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Gln Ser

1 5 10

<210> 17

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FR4 sequence

<400> 17

Leu Arg Gly Gly Thr Gln Val Thr Val Gln Ser

1 5 10

<210> 18

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FR4 sequence

<400> 18

Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Gln Ser

1 5 10

<210> 19

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FR4 sequence

<400> 19

Arg Ser Arg Gly Ile Gln Val Thr Val Gln Ser

1 5 10

<210> 20

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FR4 sequence

<400> 20

Trp Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Gln Ser

1 5 10

<210> 21

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C-terminal amino acid sequence

<220>

<221> SITE

<222> (6)..(6)

<223> Xaa stands for (X)n which means C-terminal extension with n amino acids, wherein each position is chosen independently from any amino acids

<400> 21

Val Thr Val Lys Ser Xaa

1 5

<210> 22

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C-terminal amino acid sequence

<220>

<221> SITE

<222> (6)..(6)

<223> Xaa stands for (X)n which means C-terminal extension with n amino acids, wherein each position is chosen independently from any amino acids

<400> 22

Val Thr Val Gln Ser Xaa

1 5

<210> 23

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FR4 sequence

<220>

<221> SITE

<222> (12)..(12)

<223> Xaa stands for (X)n which means C-terminal extension with n amino acids, wherein each position is chosen independently from any amino acids

<400> 23

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Lys Ser Xaa

1 5 10

<210> 24

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FR4 sequence

<220>

<221> SITE

<222> (12)..(12)

<223> Xaa stands for (X)n which means C-terminal extension with n amino acids, wherein each position is chosen independently from any amino acids

<400> 24

Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Ser Xaa

1 5 10

<210> 25

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FR4 sequence

<220>

<221> SITE

<222> (12)..(12)

<223> Xaa stands for (X)n which means C-terminal extension with n amino acids, wherein each position is chosen independently from any amino acids

<400> 25

Arg Gly Gln Gly Thr Arg Val Thr Val Lys Ser Xaa

1 5 10

<210> 26

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FR4 sequence

<220>

<221> SITE

<222> (12)..(12)

<223> Xaa stands for (X)n which means C-terminal extension with n amino acids, wherein each position is chosen independently from any amino acids

<400> 26

Trp Gly Leu Gly Thr Gln Val Thr Ile Ser Ser Xaa

1 5 10

<210> 27

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FR4 sequence

<220>

<221> SITE

<222> (12)..(12)

<223> Xaa stands for (X)n which means C-terminal extension with n amino acids, wherein each position is chosen independently from any amino acids

<400> 27

Gly Ser Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Lys Ser Xaa

1 5 10

<210> 28

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FR4 sequence

<220>

<221> SITE

<222> (12)..(12)

<223> Xaa stands for (X)n which means C-terminal extension with n amino acids, wherein each position is chosen independently from any amino acids

<400> 28

Leu Arg Gly Gly Thr Gln Val Thr Val Lys Ser Xaa

1 5 10

<210> 29

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FR4 sequence

<220>

<221> SITE

<222> (12)..(12)

<223> Xaa stands for (X)n which means C-terminal extension with n amino acids, wherein each position is chosen independently from any amino acids

<400> 29

Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Ser Xaa

1 5 10

<210> 30

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FR4 sequence

<220>

<221> SITE

<222> (12)..(12)

<223> Xaa stands for (X)n which means C-terminal extension with n amino acids, wherein each position is chosen independently from any amino acids

<400> 30

Arg Ser Arg Gly Ile Gln Val Thr Val Lys Ser Xaa

1 5 10

<210> 31

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FR4 sequence

<220>

<221> SITE

<222> (12)..(12)

<223> Xaa stands for (X)n which means C-terminal extension with n amino acids, wherein each position is chosen independently from any amino acids

<400> 31

Trp Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Lys Ser Xaa

1 5 10

<210> 32

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FR4 sequence

<220>

<221> SITE

<222> (12)..(12)

<223> Xaa stands for (X)n which means C-terminal extension with n amino acids, wherein each position is chosen independently from any amino acids

<400> 32

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Gln Ser Xaa

1 5 10

<210> 33

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FR4 sequence

<220>

<221> SITE

<222> (12)..(12)

<223> Xaa stands for (X)n which means C-terminal extension with n amino acids, wherein each position is chosen independently from any amino acids

<400> 33

Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Gln Ser Xaa

1 5 10

<210> 34

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FR4 sequence

<220>

<221> SITE

<222> (12)..(12)

<223> Xaa stands for (X)n which means C-terminal extension with n amino acids, wherein each position is chosen independently from any amino acids

<400> 34

Arg Gly Gln Gly Thr Arg Val Thr Val Gln Ser Xaa

1 5 10

<210> 35

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FR4 sequence

<220>

<221> SITE

<222> (12)..(12)

<223> Xaa stands for (X)n which means C-terminal extension with n amino acids, wherein each position is chosen independently from any amino acids

<400> 35

Trp Gly Leu Gly Thr Gln Val Thr Ile Ser Ser Xaa

1 5 10

<210> 36

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FR4 sequence

<220>

<221> SITE

<222> (12)..(12)

<223> Xaa stands for (X)n which means C-terminal extension with n amino acids, wherein each position is chosen independently from any amino acids

<400> 36

Gly Ser Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Gln Ser Xaa

1 5 10

<210> 37

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FR4 sequence

<220>

<221> SITE

<222> (12)..(12)

<223> Xaa stands for (X)n which means C-terminal extension with n amino acids, wherein each position is chosen independently from any amino acids

<400> 37

Leu Arg Gly Gly Thr Gln Val Thr Val Gln Ser Xaa

1 5 10

<210> 38

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FR4 sequence

<220>

<221> SITE

<222> (12)..(12)

<223> Xaa stands for (X)n which means C-terminal extension with n amino acids, wherein each position is chosen independently from any amino acids

<400> 38

Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Gln Ser Xaa

1 5 10

<210> 39

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FR4 sequence

<220>

<221> SITE

<222> (12)..(12)

<223> Xaa stands for (X)n which means C-terminal extension with n amino acids, wherein each position is chosen independently from any amino acids

<400> 39

Arg Ser Arg Gly Ile Gln Val Thr Val Gln Ser Xaa

1 5 10

<210> 40

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FR4 sequence

<220>

<221> SITE

<222> (12)..(12)

<223> Xaa stands for (X)n which means C-terminal extension with n amino acids, wherein each position is chosen independently from any amino acids

<400> 40

Trp Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Gln Ser Xaa

1 5 10

<210> 41

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CDR sequence

<400> 41

Ser Phe Gly Met Ser

1 5

<210> 42

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CDR sequence

<400> 42

Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 43

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CDR sequence

<400> 43

Gly Gly Ser Leu Ser Arg

1 5

<210> 44

<211> 121

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 44

His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

20 25 30

Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

35 40 45

Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr

50 55 60

Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

65 70 75 80

Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp

85 90 95

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 45

<211> 122

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 45

His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

20 25 30

Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

35 40 45

Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr

50 55 60

Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

65 70 75 80

Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp

85 90 95

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120

<210> 46

<211> 115

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 46

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 47

<211> 115

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 47

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Lys Ser

115

<210> 48

<211> 116

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 48

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Lys Ser Ala

115

<210> 49

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 49

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Lys Ser Ala Ala

115

<210> 50

<211> 118

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 50

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Lys Ser Ala Ala Ala

115

<210> 51

<211> 116

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 51

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Lys Ser Gly

115

<210> 52

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 52

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Lys Ser Gly Gly

115

<210> 53

<211> 118

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 53

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Lys Ser Gly Gly Gly

115

<210> 54

<211> 115

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 54

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Gln Ser

115

<210> 55

<211> 116

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 55

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Gln Ser Ala

115

<210> 56

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 56

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Gln Ser Ala Ala

115

<210> 57

<211> 118

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 57

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Gln Ser Ala Ala Ala

115

<210> 58

<211> 116

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 58

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Gln Ser Gly

115

<210> 59

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 59

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Gln Ser Gly Gly

115

<210> 60

<211> 118

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 60

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Gln Ser Gly Gly Gly

115

<210> 61

<211> 115

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 61

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 62

<211> 115

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 62

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Lys Ser

115

<210> 63

<211> 116

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 63

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Lys Ser Ala

115

<210> 64

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 64

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Lys Ser Ala Ala

115

<210> 65

<211> 118

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 65

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Lys Ser Ala Ala Ala

115

<210> 66

<211> 116

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 66

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Lys Ser Gly

115

<210> 67

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 67

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Lys Ser Gly Gly

115

<210> 68

<211> 118

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 68

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Lys Ser Gly Gly Gly

115

<210> 69

<211> 115

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 69

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Gln Ser

115

<210> 70

<211> 116

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 70

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Gln Ser Ala

115

<210> 71

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 71

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Gln Ser Ala Ala

115

<210> 72

<211> 118

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 72

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Gln Ser Ala Ala Ala

115

<210> 73

<211> 116

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 73

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Gln Ser Gly

115

<210> 74

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 74

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Gln Ser Gly Gly

115

<210> 75

<211> 118

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 75

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Gln Ser Gly Gly Gly

115

<210> 76

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C-terminal sequence

<400> 76

Val Thr Val Ser Ser

1 5

<210> 77

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C-terminal sequence

<220>

<221> SITE

<222> (6)..(6)

<223> Xaa stands for (X)n which means C-terminal extension with n amino acids, wherein each position is chosen independently from any amino acids

<400> 77

Val Thr Val Ser Ser Xaa

1 5

<210> 78

<211> 115

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 78

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 79

<211> 116

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 79

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala

115

<210> 80

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 80

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala Ala

115

<210> 81

<211> 118

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 81

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala Ala Ala

115

<210> 82

<211> 116

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 82

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Gly

115

<210> 83

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 83

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Gly Gly

115

<210> 84

<211> 118

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 84

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Gly Gly Gly

115

<210> 85

<211> 115

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 85

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 86

<211> 116

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 86

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala

115

<210> 87

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 87

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala Ala

115

<210> 88

<211> 118

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 88

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala Ala Ala

115

<210> 89

<211> 116

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 89

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Gly

115

<210> 90

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 90

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Gly Gly

115

<210> 91

<211> 118

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 91

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Gly Gly Gly

115

<210> 92

<211> 128

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 92

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Asn Asn Tyr

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ala Ile Thr Arg Ser Gly Val Arg Ser Gly Val Ser Ala Ile Tyr

50 55 60

Gly Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys

65 70 75 80

Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala

85 90 95

Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ser Ala Ile Gly Ser Gly Ala Leu Arg Arg

100 105 110

Phe Glu Tyr Asp Tyr Ser Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 93

<211> 115

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 93

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 94

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 94

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Ser Ile Gly Arg Leu Asp

20 25 30

Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly Glu Pro Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn Tyr Gly Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn

85 90 95

Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 95

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C-terminal amino acid sequence

<400> 95

Val Lys Val Ser Ser

1 5

<210> 96

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C-terminal amino acid sequence

<400> 96

Val Gln Val Ser Ser

1 5

<210> 97

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C-terminal amino acid sequence

<220>

<221> SITE

<222> (6)..(6)

<223> Xaa stands for (X)n which means C-terminal extension with n amino acids, wherein each position is chosen independently from any amino acids

<400> 97

Val Lys Val Ser Ser Xaa

1 5

<210> 98

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C-terminal amino acid sequence

<220>

<221> SITE

<222> (6)..(6)

<223> Xaa stands for (X)n which means C-terminal extension with n amino acids, wherein each position is chosen independently from any amino acids

<400> 98

Val Gln Val Ser Ser Xaa

1 5

<210> 99

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FR4 sequence

<400> 99

Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Ser

1 5 10

<210> 100

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FR4 sequence

<400> 100

Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Gln Ser

1 5 10

<210> 101

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FR4 sequence

<400> 101

Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Lys Val Ser Ser

1 5 10

<210> 102

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FR4 sequence

<400> 102

Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Gln Val Ser Ser

1 5 10

<210> 103

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FR4 sequence

<220>

<221> SITE

<222> (12)..(12)

<223> Xaa stands for (X)n which means C-terminal extension with n amino acids, wherein each position is chosen independently from any amino acids

<400> 103

Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Ser Xaa

1 5 10

<210> 104

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FR4 sequence

<220>

<221> SITE

<222> (12)..(12)

<223> Xaa stands for (X)n which means C-terminal extension with n amino acids, wherein each position is chosen independently from any amino acids

<400> 104

Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Gln Ser Xaa

1 5 10

<210> 105

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FR4 sequence

<220>

<221> SITE

<222> (12)..(12)

<223> Xaa stands for (X)n which means C-terminal extension with n amino acids, wherein each position is chosen independently from any amino acids

<400> 105

Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Lys Val Ser Ser Xaa

1 5 10

<210> 106

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FR4 sequence

<220>

<221> SITE

<222> (12)..(12)

<223> Xaa stands for (X)n which means C-terminal extension with n amino acids, wherein each position is chosen independently from any amino acids

<400> 106

Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Gln Val Ser Ser Xaa

1 5 10

<210> 107

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C-terminal amino acid sequence

<220>

<221> SITE

<222> (2)..(2)

<223> X is independently K or Q

<220>

<221> SITE

<222> (4)..(4)

<223> X is independently K or Q

<400> 107

Val Xaa Val Xaa Ser

1 5

<210> 108

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C-terminal amino acid sequence

<220>

<221> SITE

<222> (2)..(2)

<223> X is independently K or Q

<220>

<221> SITE

<222> (4)..(4)

<223> X is independently K or Q

<220>

<221> SITE

<222> (6)..(6)

<223> Xaa stands for (X)n which means C-terminal extension with n amino acids, wherein each position is chosen independently from any amino acids

<400> 108

Val Xaa Val Xaa Ser Xaa

1 5

<210> 109

<211> 115

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 109

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 110

<211> 116

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 110

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala

115

<210> 111

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 111

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala Ala

115

<210> 112

<211> 118

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 112

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala Ala Ala

115

<210> 113

<211> 116

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 113

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Gly

115

<210> 114

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 114

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Gly Gly

115

<210> 115

<211> 118

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 115

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Gly Gly Gly

115

<210> 116

<211> 115

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 116

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 117

<211> 116

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 117

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala

115

<210> 118

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 118

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala Ala

115

<210> 119

<211> 118

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 119

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala Ala Ala

115

<210> 120

<211> 116

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 120

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Gly

115

<210> 121

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 121

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Gly Gly

115

<210> 122

<211> 118

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 122

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Gly Gly Gly

115

<210> 123

<211> 115

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 123

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Lys

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 124

<211> 116

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 124

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Lys

100 105 110

Val Ser Ser Ala

115

<210> 125

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 125

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Lys

100 105 110

Val Ser Ser Ala Ala

115

<210> 126

<211> 118

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 126

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Lys

100 105 110

Val Ser Ser Ala Ala Ala

115

<210> 127

<211> 116

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 127

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Lys

100 105 110

Val Ser Ser Gly

115

<210> 128

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody sequence

<400> 128

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Lys

100 105 110

Val Ser Ser Gly Gly

115

<210> 129

<211> 118

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>