Способ определения снижения радиационно-индуцированной миграции клеток рака молочной железы человека линии MCF-7 Российский патент 2023 года по МПК A61K31/4184 A61P35/04 A61N5/10 C12M3/04 G01N33/58 C12Q1/6886 

Изобретение относится к области медицины, в частности онкологии, и может быть использовано для снижения радиационно-индуцированной миграции опухолевых клеток.

Лучевая терапия широко используется в качестве одного из основных методов лечения злокачественных новообразований. Но несмотря на достигнутый прогресс современных методов лечения, таких как химиотерапия, хирургия, радиотерапия и их комбинации, у части больных наблюдается развитие резистентности к противоопухолевой терапии с последующим рецидивированием опухолевого процесса и метастазированием, которое является одной из основных причин гибели онкологических больных. Более того, в многочисленных исследованиях показано, что ионизирующее излучение, несмотря на всю свою эффективность в отношении первичного опухолевого очага, может усиливать метастатические свойства опухоли (Sundahi N., Duprez F., Ost P., De Neve W., Marell M. Effects of radiation on the metastatic process // Molecular Medicine. – 2018. – V. 24. – N. 16. – P. 1-20; Vilalta M., Rafat M., Graves E. Effects of radiation on metastasis and tumor cell migration // Cellular and Molecular Life Science. – 2016. – V. 73. – N. 16. – P. 2999-3007). Поэтому активно ведутся исследования механизмов миграции и метастазирования опухолевых клеток, а также разрабатываются новые способы ингибирования метастатической активности опухолевых клеток, в том числе индуцированной под влиянием радиационного воздействия.

Метастазирование – это многоступенчатый процесс, в основе которого лежит миграция опухолевых клеток. Известно несколько традиционных способов определения миграционной активности клеток в условиях in vitro, одним из которых является тест заживления раны (в англоязычной литературе wound healing test), принцип которого заключается в создании искусственного промежутка – раны на непрерывном клеточном монослое и оценке степени зарастания этого промежутка в результате миграции клеток (Ling C.-C., Park A., Guan J.-L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro // Nature Protocols. – 2007. – V. 2. – N. 2. – P. 329-333). Вторым достаточно широко используемым методом является трансвелл анализ, способный в некоторой степени приблизить экспериментальные условия к естественной среде организма. Он основан на способности опухолевых клеток мигрировать из бедной питательными веществами среды к хемоаттрактанту через поры в специальной трансвелл камере (Justus C.R., Leffler N., Ruiz-Echevarria M., Yang L.V. In vitro Cell Migration and Invasion Assays // J. Vis. Exp. - 2014. – V. 88: 51046). Одновременно с определением миграционной активности на клеточном уровне часто анализируют изменения маркеров мигрирующих клеток на генном уровне; в частности, оценивают экспрессию ряда генов, продукты которых контролируют различные этапы клеточной миграции (OCLN – ген окклюдина, VIM – ген виментина, CDH1 – ген E-кадгерина, CDH2 – ген N- кадгерина и др.). Для определения уровня экспрессии генов используют полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в реальном времени в комбинации с обратной транскрипцией, принцип которой заключается в преобразовании РНК в комплементарную ДНК (кДНК), в создании двуцепочечной кДНК, детектировании и количественной оценке продуктов амплификации в реальном времени (Nolan T., Hands R.E., Bustin S.A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR // Nature protocols. – 2006. – V. 1. – N.3. – P. 1559-1582).

Ключевым этапом миграции является потеря межклеточной адгезии, в результате чего клетки эпителиального происхождения, образующие плотные контакты, изменяют свою морфологию на мезенхимальную /фибробластоподобную и приобретают способность к миграции. С этими изменениями связан ряд молекулярных процессов, в ходе которых происходит ослабление/разрушение плотных межклеточных контактов вследствие снижения экспрессии основных составляющих их белков – клаудина и окклюдина (Lemieux E., Bergeron S., Durand V., Asselin C., Saucier C., Rivard N. Constitutively active MEK1 is sufficient to induce epithelial-to-mesenchymal transition in intestinal epithelial cells and to promote tumor invasion and metastasis // International Journal of Cancer. – 2009. – V. 125. – N. 7. – P. 1575-1586; Kaufhold S., Bonavida B. Central role of Snail1 in the regulation of EMT and resistance in cancer: a target for therapeutic intervention // Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. – 2014. – V. 33. – N. 62. – P. 1-19). Доказано, что пониженная экспрессия окклюдина является маркером снижения межклеточной адгезии и повышения миграционного потенциала опухолевых клеток, в том числе клеток рака молочной железы (Martin T., Mansel R., Jang W. Loss of occluding leads to the progression of human breast cancer // International journal of molecular medicine. – 2010. – V. 26. – P. 723-734).

Известно, что воздействие γ-излучения индуцирует специфические изменения в экспрессии белков плотных межклеточных контактов. В частности, доказано, что однократное облучение в дозах 4Гр и более приводит к снижению экспрессии белков плотных контактов, в первую очередь окклюдина (Gruber S., Cini N., Kowald L.-M., Mayer J., Rohorzhka A., Kuess P., Dörr W. Upregulated epithelial junction expression represents a novel parameter of the epithelial radiation response to fractionated irradiation in oral mucosa // Strahlenther Onkol. – 2018. – V. 194. – P. 771-779). Учитывая данные о функциональной роли низкой экспрессии окклюдина в миграции опухолевых клеток, в том числе в ответ на облучение, увеличение экспрессии окклюдина может являться потенциальной целью противоопухолевых препаратов.

Такой подход к подавлению миграции клеток путем повышения экспрессии окклюдина реализован в ряде исследований. Так, известен способ снижения миграции клеток рака молочной железы линии MDA-MB-231 in vitro при помощи соединения BCI 121 – известного ингибитора гистоновой метилазы SMYD3. BCI 121 приводит к нокдауну SMYD3 и увеличению экспрессии эпителиальных маркеров окклюдина и клаудина 6, в результате чего наблюдается снижение способности опухолевых клеток к миграции по результатам теста заживления раны ( Bottino C., Peserico A., Simone C., Caretti G. SMYD3 promotes the epithelial–mesenchymal transition in breast cancer // Cancers. – 2019. – V. 12. – N. 142. – P. 1-18). Недостатком этого соединения является отсутствие данных об их действии на миграцию опухолевых клеток, вызванную ионизирующим излучением.

Известен способ снижения миграции и инвазии опухолевых клеток, основанный на стимуляции экспрессии окклюдина синтетическими ретиноидами. Показано, что полностью транс-ретиноевая кислота (ATRA) при добавлении к опухолевым клеткам эпителиального происхождения различных линий in vitro cтимулирует рецептор ретиноевой кислоты α, который индуцирует эндогенный окклюдин в количестве достаточном для снижения клеточной миграции (Osanai M., Murata M., Nishikori N., Chiba H., Kojima T., Sawada N. Epigenetic Silencing of Occludin Promotes Tumorigenic and Metastatic Properties of Cancer Cells via Modulations of Unique Sets of Apoptosis-Associated Genes // Cancer Research. – 2006. – V. 66. – N. 18. – P. 9125-9133).

Однако, использование ретиноидов имеет три основных ограничения: плохое растворение в водных растворах, короткое время жизни (несколько часов) из-за их деградации под действием системы цитохром Р450-зависимой монооксигеназы, нежелательные побочные эффекты (сухость слизистых оболочек, головная боль и гипертриглицеридемия) (Ferreira R., Napoli J., Enver T., Bernardino L., Ferreira L. Advances and challenges in retinoid delivery systems in regenerative and therapeutic medicine // Nature communications. – 2020. – V. 26. – N. 11. – P. 4265-4278).

В настоящее время известен ряд других механизмов повышения миграционной активности опухолевых клеток в ответ на действие ионизирующего излучения (помимо снижения экспрессии окклюдина). Эта информация явилась основой для разработки различных способов подавления миграционной активности опухолевых клеток.

Так, известно вещество цетуксимаб – моноклональное антитело изотипа IgG1, которое обладает высокой специфичностью к рецептору эпидермального фактора роста (EGFR). Цетуксимаб с высоким сродством ингибирует внеклеточный участок связывания лиганда, тем самым блокируя передачу сигнала на рецептор. Показано, что ингибирование EGFR цетуксимабом значительно уменьшает миграцию клеток трех линий плоскоклеточного рака головы и шеи (Pickhard A.C., Margraf J., Knopf A., Stark T., Piontek G., Beck C., Boulesteix A.-L., Scherer E.Q., Pigorsch S., Schlegel J., Arnold W., Reiter R. Inhibition of radiation induced migration of human head and neck squamous cell carcinoma cells by blocking of EGF receptor pathways // BMS Cancer. – 2011. – V. 11. – N. – 388. – P. 1-12).

Недостатком цетуксимаба является его низкая эффективность при использовании в качестве монотерапии (Neal J.W., Heist R.S., Fidias P., Temel J.S., Huberman M., Marcoux P., Muzikansky A., Lynch T. J., Sequist L. Cetuximab Monotherapy in Patients with Advanced Non-small Cell Lung Cancer After Prior Epidermal Growth Factor Receptor Tyrosine Kinase Inhibitor Therapy // Journal of Thoracic Oncology. – 2010. – V. 5. – N.11 – P. 1855-1858).

Известно вещество куркумин – природный полифенол, полученный из корневищ Curcuma longa. Показано, что куркумин обладает рядом противоопухолевых свойств, в том числе ингибированием радиационно-индуцированного метастазирования различных типов рака, включая рак молочной железы (Gallardo M., Calaf G.M. Curcumin inhibits invasive capabilities through epithelial mesenchymal transition in breast cancer cell lines // International Journal of Oncology. – 2016. – V. 49. – P. 1019-1027). Вероятным механизмом его действия является подавление экспрессии матриксных металлопротеиназ 2 и 9, которые как известно, аномально высоко экспрессируются в опухолевых клетках и способствуют их миграции и инвазии.

Недостатком этого соединения является его низкая растворимость в воде, плохая биодоступность и недостаточная стабильность in vivo (Kocaadam B., Sanlier N. Curcumin, an active component of turmeric (Curcuma longa), and its effects on health // Critical reviews in food science and nutrition. – 2017. – V.57. – N. 13. – P. 2889-2895).

Известно вещество трихостатин А – антибиотик, выделенный из Streptomyces sp., с доказанной ингибирующей активностью в отношении гистоновых деацетилаз I и II типов. Показано, что трихостатин A ослабляет миграцию и инвазию клеток MCF-7 in vitro (Wang X., Chen S., Shen T., Lu H., Xiao D., Zhao Y., Li X., Zhang G., Zhou X., Jiang X., Cheng Z. Trichostatin A reverses epithelial-mesenchymal transition and attenuates invasion and migration in MCF-7 breast cancer cells // Experimental and therapeutic medicine. – 2020. – V. 19. – P.1687-1694). Кроме того, это вещество подавляет радиационно-индуцированный эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) и снижает миграцию опухолевых клеток (Nagarajam D., Wang L., Han X. Trichostatin A inhibits radiation-induced epithelial-to-mesenchymal transition in the alveolar epithelial cells // Oncotarget. – 2017. – V. 8. – N. 60. – P. 101745-101759).

К недостаткам трихостатина A относится его высокая токсичность и неэффективность в отношении солидных опухолей, а также способность вызывать апоптоз не только опухолевых, но и нормальных клеток (Akentieva N., Gazatullin A., Goncharova S., Raevskaya T., Goryachev N., Shkondina N., Prichodchenko T., Vystrop I., Shushanov S. Anticancer activity of spirocyclic hydroxamic acids (derivatives of 1-Hydroxy-1,4,8-Triazaspiro[4,5] Decan-2-One), histone deacetylase inhibitors // Biochemistry. – 2019. – V. 35. – N. 6. – P. 424-437). Кроме того, известно, что ингибиторы гистоновых деацетилаз, в том числе трихостатин А, могут индуцировать экспрессию ряда генов множественной лекарственной устойчивости, что может отрицательно сказаться на эффективности противоопухолевой терапии (Hausald S., Duque-Afonso J., Wagner M., Schertl F.M., Lubbert M., Peschel C., Keller U., Licht T. Histone Deacetylase Inhibitors Induce a Very Broad, Pleiotropic Anticancer Drug Resistance Phenotype in Acute Myeloid Leukemia
Cells by Modulation ofMultiple ABC Transporter Genes // Clinical Cancer Research. – 2009. – V. 15. – N. 11. – P. 3705-3715).

Известно вещество α-липоевая кислота (тиоктовая кислота), мощный антиоксидант, который является кофактором митохондриальных ферментов, таких как пируватдегидрогеназа и глициндекарбоксилаза. Показано, что предварительная инкубация клеток рака молочной железы человека линии MCF-7 с α- липоевой кислотой приводит к их сенсибилизации к ионизирующему излучению и ингибированию радиационно-индуцированной миграции. Механизм действия α-липоевой кислоты связан с ингибированием радиационно-индуцированной передачи сигналов TGF-β и транслокации NF-kB (Tripathy J., Chowdhury A. R., Prusty M., Muduli K., Priyadarshini N., Reddy S.K., Banerjee B., Elangovan S. α-Lipoic acid prevents the ionizing radiation-induced epithelial-mesenchymal transition and enhances the radiosensitivity in breast cancer cells // European Journal of pharmacology. – 2020. – V.871. – P. 1-9).

Недостатком этого соединения является ряд фармакокинетических ограничений: короткий период полувыведения и биодоступность около 30% (Salehi B., Yilmaz Y., Antika G., Tumer T. B., Mahomoodally M. F., Lobine D., Akram M., Riaz M., Caponoglu E., Sharopov F., Martins N., Cho W.C., Sharifi-Rad J. Insights on the use of α-Lipoic acid for therapeutic purposes // Biomolecules. – 2019. – V.9. – N. 356. – P. 1-25).

Известны и другие способы снижения/блокирования миграции опухолевых клеток. Так в патенте на изобретение WO 2008/031820 (Arts J., Khellermans P., Zhaniko M., Pehjdzh M. Combinations of specific class I histone deacetylase inhibitors and proteasome inhibitors) применяется комбинация протеасомного ингибитора и ингибитора гистоновой деацетилазы для снижения миграции опухолевых клеток. В изобретении WO 2007/126799 (Stover D.R., Prassler J., Berger C., Brocks B. Compositions and methods of use for antibodies of c-MET) используется фармацевтическая композиция, основной составляющей которой является антитело или его функциональный фрагмент, включающий антигенсвязывающий участок, который специфически связывается с рецепторами c-Met на клеточной поверхности, тем самым препятствуя или ослабляя метастазирование. Вещество сурфактин (KR1020130012855, Kim Y. H., Park S. Y., Joon J. L. Cancer metastasis inhibitor containing surfactin) - циклический липопептид, полученный из штамма Bacillus subtilis, ингибирует метастазирование клеток рака молочной железы MCF-7 путем блокирования экспрессии матриксной металлопротеиназы – 9 и способности активировать экспрессию тканевого ингибитора металлопротеиназ (TIMP) (Park S., Kim J., Lee S., Kim Y. Surfactin suppresses TPA-induced breast cancer cell invasion through the inhibition of MMP-9 expression // International Journal of Oncology. – 2013. – V. 42. – P. 287-296). Известен способ ингибирования радиационно-индуцированной миграции опухолевых клеток с использованием алкалоида растительного происхождения галафугинона, механизмом действия которого является ингибирование передачи сигналов TGF-β1 (Chen Y., Liu W., Wang P., Hou H., Liu N., Gong L., Wang Y., Ji K., Zhao L., Wang P. Halofuginone inhibits radiotherapy-induced epithelialmesenchymal transition in lung cancer // Oncotarget. – 2016. – V. 7. – N. 44. – P. 71341-71352). Еще один способ ингибирования радиационно-индуцированной миграции заключается в подавлении экспрессии микроРНК-21 путем трансфекции ее ингибитора (Lui Z., Liang X., Li X., Liu X., Zhu M., Gu Y., Zhou P. MiRNA-21 functions in ionizing radiation-induced epithelium-to-mesenchymal transition (EMT) by downregulating PTEN // Toxicology research. – 2019. – V. 8. – P. 328-340).

Однако во всех известных способах в качестве ингибиторов миграции, в том числе радиационно-индуцированной, не используются димерные бисбензимидазолы, получаемые методом химического синтеза.

Известны соединения RP-11 и RP-15, являющиеся производными бисбензимидазолов. Показано, что они проявляют противоопухолевую активность в отношении большого количества линий опухолевых клеток, включая рак молочной железы человека линии MCF-7. Также установлено, что эти синтетические бисбензимидазолы ингибируют АТФазу вакуолярного типа (V-ATФазу) – протонный насос, экспрессирующийся в мембранах клеток, в том числе опухолевых, и выполняющий специализированные функции при метастазировании. Экспрессия V-АТФазы в опухолевых клетках имеет важное значение для приобретения инвазивности и метастазирования рака молочной железы (Patil R., Kulshrestha A., Tikoo A., Fleetwood S., Katara G., Kolli B., Seibel W., Gilman-Sachs A., Patil S., Beaman K. Identification of Novel Bisbenzimidazole Derivatives as Anticancer Vacuolar (H+)-ATPase Inhibitors // Molecules. – 2017. – V. 22. – N. 1559. – P. 1-14). Следовательно, V-АТФаза является потенциальной мишенью для блокирования миграции клеток рака молочной железы.

Недостатком этих соединений является отсутствие данных об их действии непосредственно на миграцию опухолевых клеток, в том числе вызванную ионизирующим излучением.

Прототипами предлагаемого технического решения являются:

- Способ ингибирования радиационно-индуцированного ЭМП опухолевых клеток рака молочной железы человека in vitro, основанный на применении синтетических водонерастворимых димерных бисбензимидазолов (dimeric bisbenzimidazoles – DB) (Zamulaeva I., Churyukina K., Matchuk O., Ivanov A., Saburov V., Zhuze A. Dimeric bisbenzimidazoles DB(n) in combination with ionizing radiation decrease number and clonogenic activity of MCF-7 breast cancer stem cells // AIMS Biophysics. – 2020. – V. 7. – N. 4. – P. 339-361). Эти соединения представляют собой флуоресцентные химические производные бисбензимидазолов, в структуре которых присутствуют два 2,6-замещенных бензимидазола, соединенные олигометиленовым линкером разной длины – DB(n), где n - число метиленовых групп в линкере (Фиг.1) (Иванов А. А., Салянов В.И., Стрельцов С.А., Черепанова Н.А., Громова Е.С., Жузе А.Л. Лиганды, специфичные к определенным последовательностям пар оснований ДНК. XIV. Синтез флуоресцентных биологически активных димерных бисбензимидазолов – DB (3, 4, 5, 7, 11) // Биоорганическая химия. – 2011. – Т. 37. – № 4. – С. 530–541; Иванов А.А., Салянов В.И., Жузе А.Л. Лиганды, специфичные к определенным последовательностям пар оснований ДНК. XV. Синтез и спектральные характеристики новой серии димерных бисбензимидазолов – DB (1, 2, 6, 8, 9, 10, 12) // Биоорганическая химия. – 2016. – Т. 42. – № 2. – С. 205–213). Способ доказывает способность DB(5) и DB(7) уменьшать радиационно-индуцированный ЭМП опухолевых клеток линии MCF-7 по критерию снижения экспрессии виментина – белка промежуточных филаментов клеток соединительной ткани.

- Способ снижения клоногенной активности стволовых клеток рака молочной железы под влиянием DB(5) и DB(7) при их одиночном применении или в комбинации с ионизирующим излучением in vitro (Патент на изобретение №2700695. Замулаева И.А., Чурюкина К.А., Жузе А.Л., Иванов А.А. Способ снижения клоногенной активности стволовых клеток рака молочной железы). Способ включает инкубацию предварительно отсортированных стволовых клеток с указанными соединениями в течение 72 ч, отмывку от этих соединений и подсчет числа выросших колоний через 8 суток. При комбинированном воздействии время инкубации с соединениями остается тем же – 72 ч, но через 24 после начала инкубации клетки облучают в дозе 4Гр и через 8 суток после окончания инкубации (10 суток после облучения) регистрируют синергическое снижение клоногенной активности опухолевых стволовых клеток.

Однако, в известных способах отсутствуют данные о влиянии водонерастворимых димерных бисбензимидазолов, в том числе DB(5) и DB(7), на миграционную активность опухолевых клеток линии MCF-7.

Технический результат заявляемого изобретения заключается определении снижения миграционной активности опухолевых клеток, стимулированной под влиянием ионизирующего излучения.

Технический результат достигается тем, что так же, как и в известных способах в течение 72 часов воздействуют на опухолевые клетки in vitro с помощью ДНК-связывающих лигандов – водонерастворимых димерных бисбензимидазолов DB(n) и через 24 часа, после введения указанных соединений, клетки подвергают воздействию ионизирующего излучения.

Особенность данного способа заключается в том, что:

- миграционную активность опухолевых клеток in vitro определяют с помощью теста заживления раны: клетки инкубируют до достижения ими 100% монослоя, добавляют водонерастворимый димерный бисбензимидазол с 5 метиленовыми группами в составе линкера (DB(5) или водонерастворимый димерный бисбензимидазол с 7 метиленовыми группами (DB(7), через 24 часа создают рану на непрерывном клеточном монослое в виде свободной от клеток полосы и облучают оставшиеся клетки в дозе 4 Гр, инкубируют клетки в течение 48 часов при температуре +37⁰С в CO2-инкубаторе с 5% содержанием CO2, определяют ширину свободной от клеток полосы через 24 и 48 часов после облучения в сравнении с исходным значением, принятым за 100%, рассчитывают коэффициент К подавления миграционной активности после комбинированного воздействия по сравнению с одиночным облучением по формуле:

,

где:

Шкомб. – ширина полосы после комбинированного воздействия,

Шобл. – ширина полосы после одиночного облучения,

и при значении К, равном 26,8% через 24 часа и 19,9% через 48 часов комбинированного воздействия DB(5) регистрируют снижение радиационно-индуцированной миграции клеток под воздействием DB(5); при значении К, равном 17,9% через 24 часа комбинированного воздействия DB(7) регистрируют снижение радиационно-индуцированной миграции клеток под воздействием DB(7);

- миграционную активность опухолевых клеток определяют с помощью трансвелл анализа: клетки инкубируют при температуре +37⁰С с водонерастворимым димерным бисбензимидазолом с 5 метиленовыми группами в составе линкера (DB(5) или водонерастворимым димерным бисбензимидазолом с 7 метиленовыми группами (DB(7) в течение 24 часов, далее клетки облучают в дозе 4 Гр, через 48 часов клетки отмывают от DB(5) или DB(7) и высевают в транслуночные вставки, инкубируют в течение трех суток при температуре +37⁰С в CO2-инкубаторе с 5% содержанием CO2, после чего подсчитывают количество мигрировавших клеток с помощью светового микроскопа в сравнении с одиночным облучением в дозе 4 Гр; и при снижении количества мигрировавших клеток в 2,3 раза под воздействием DB(5) и облучения регистрируют снижение радиационно-индуцированной миграции клеток; при снижении количества мигрировавших клеток в 3,5 раза под воздействием DB(7) и облучения регистрируют снижение радиационно-индуцированной миграции клеток по сравнению с одиночным облучением в дозе 4 Гр;

- определяют уровень экспрессии гена OCLN: инкубируют клетки при температуре +37⁰С с водонерастворимым димерным бисбензимидазолом с 5 метиленовыми группами в составе линкера (DB(5) или водонерастворимым димерным бисбензимидазолом с 7 метиленовыми группами (DB(7) в течение 24 часов, далее клетки облучают в дозе 4 Гр, через 48 часов выделяют мРНК, которую путём реакции обратной транскрипции переводят в комплементарную ДНК (кДНК), далее проводят полимеразную цепную реакцию в реальном времени, определяют пороговые циклы амплификации (Ct), при помощи расчетного метода ΔΔCt анализируют изменение относительного уровня экспрессии гена OCLN, нормированного на уровень экспрессии референсного гена ALAS1, и при определении увеличения радиационно-индуцированного уровня экспрессии гена OCLN в 2,4 раза под воздействием DB(5) и в 1,9 раз под воздействием DB(7) по сравнению с одиночным облучением в дозе 4 Гр регистрируют снижение радиационно-индуцированной миграции клеток.

Изобретение иллюстрируется подробным описанием, примерами и иллюстрациями, на которых изображено:

Фиг. 1 – Химическая структура синтетических водонерастворимых димерных бисбензимидазолов DB(n), где n может варьировать от 1 до 11.

Фиг. 2 – Фотоиллюстрация раневых полос в образцах клеток линии MCF-7 до и в разные сроки после облучения в дозе 4 Гр при комбинированном воздействии DB(5) или DB(7) и ионизирующего излучения в сравнении с контролем и только облучением. Световая микроскопия, объектив 20х.

Фиг. 3 – Фотоиллюстрация транслуночных вставок с наружной стороны (со стороны нижней трансвелл-камеры) с мигрировавшими клетками после их фиксации и окрашивания. Световая микроскопия, объектив 10х: а) 4Гр; б) DB(5) + 4Гр; в) DB(7)+4 Гр.

Фиг. 4 – Диаграмма: динамика зарастания раны (полосы без клеток) в культурах линии MCF-7 через 24 и 48 часов после облучения в группах «Контроль», «4Гр», «DB(5)+4Гр и «DB(7)+4Гр»; *p<0,05 при сравнении с контролем, ^{^}p<0,05 при сравнении с облучением.

Фиг. 5 – Диаграмма: изменение доли мигрировавших клеток линии MCF-7 через транслуночные вставки с диаметром пор 8мкм, после комбинированного действия DB(5) или DB(7) и ионизирующего излучения в сравнении с таковой после одиночного облучения, принятой за 1; *p<0,05 при сравнении с облучением.

Фиг. 6 – Диаграмма: изменение уровня экспрессии гена OCLN в клетках линии MCF-7 после комбинированного действия DB(5) или DB(7) и облучения. Уровень OCLN в контроле принят за 1. *p<0,05 при сравнении с контролем, ^{^}p<0,05 при сравнении с облучением.

Способ осуществляют следующим образом.

I. Этап определения снижения миграционной активности, регистрируемой с помощью теста заживления раневой полосы.

Клетки рака молочной железы линии MCF-7 рассевают в культуральные чашки Петри (площадь дна 6 см²) с добавлением 4 мл полной питательной среды DMEM, содержащей 10% фетальной сыворотки крови крупного рогатого скота (ФСКРС), пенициллин (50000 ед/л), стрептомицин (50 мг/л) и глютамин (292 мг/л). При достижении клетками 100% монослоя, в часть чашек Петри добавляют AT-специфичные ДНК-связывающие лиганды DB(n), в которых два бисбензимидазольных блока соединены между собой линкером с числом метиленовых групп (n) 5 или 7, растворенные в диметилсульфоксиде (ДМСО), до конечной концентрации 20 мкМ. Через 24 часа после добавления соединений удаляют узкую полосу монослоя (наносят рану) с помощью 200 мкл наконечника автоматической пипетки и фотографируют случайно выбранные поля зрения с помощью цифровой камеры светового микроскопа при увеличении объектива 10х. Далее часть чашек Петри с клетками подвергают γ-облучению от источника ⁶⁰Со в дозе 4 Гр, мощность дозы 0,8 Гр/мин. Таким образом, формируют группы «Контроль», «4Гр», «DB(5)+4Гр» и «DB(7)+4Гр». Через 24 и 48 часов после облучения делают фотографии тех же выбранных полей зрения в каждой чашке Петри из контрольной и опытных групп. Скорость зарастания раневой полосы в результате миграции клеток анализируют путем сравнения с первоначальной шириной полосы, которая принимается за 100% в каждой исследуемой группе (Фиг. 2). Также рассчитывают коэффициент К подавления миграционной активности после комбинированного воздействия по сравнению с одиночным облучением по формуле

,

где:

Ш_комб. – ширина полосы после комбинированного воздействия,

Ш_обл. – ширина полосы после одиночного облучения.

Расчеты выполняют на сроках 24 и 48 часов после нанесения раневой полосы.

II. Этап определения снижения миграционной активности, регистрируемой с помощью трансвелл анализа.

Клетки рака молочной железы линии MCF-7 рассевают в культуральные флаконы (площадь дна 25 см²) с добавлением 6 мл полной питательной среды (культуральная среда DMEM, содержащая 10% ФСКРС, пенициллин (50000 ед/л), стрептомицин (50 мг/л) и глютамин (292 мг/л). Через сутки в часть флаконов с клетками добавляют AT-специфичные ДНК-связывающие лиганды DB(n), в которых два бисбензимидазольных блока соединены между собой линкером с числом метиленовых групп (n) 5 или 7, растворенные в диметилсульфоксиде (ДМСО), до конечной концентрации 20 мкМ. Через 24 часа после добавления DB(n) производят однократное γ-облучение клеточных культур от источника ⁶⁰Со в дозе 4 Гр, мощность дозы 0,8 Гр/мин. Таким образом, формируют группы «4Гр», «DB(5)+4Гр» и «DB(7)+4Гр».

После облучения клетки культивируют в стандартных условиях в CO₂ инкубаторе в течение 48 часов, после чего клетки снимают со дна флакона с помощью смеси растворов версена и трипсина (1:1) в бессывороточную питательную среду. Далее производят подсчет количества клеток в полученной суспензии с помощью камеры Горяева и разводят до концентрации 1 млн клеток в 1 мл среды. Высевают по 10⁵ клеток в 100 мкл бессывороточной среды в верхнюю часть трансвелл-камер (коммерчески доступные транслуночные вставки с порами диаметром 8 мкм 24-хлуночного планшета). В нижнюю часть камер добавляют 700 мкл полной питательной среды DMEM, содержащей 10% ФСКРС в качестве хемоаттрактанта.

Затем клетки инкубируют в течение 72 часов в стандартных условиях в CO₂ инкубаторе и оценивают миграционную активность клеток. Для этого клетки, мигрировавшие в нижнюю часть камеры на наружную сторону транслуночных вставок, фиксируют 4% раствором параформальдегида в течение 10 минут при комнатной температуре и окрашивают в 0,4% растворе трипанового синего в течение 10 минут при комнатной температуре. С помощью светового микроскопа производят подсчет количества мигрировавших через поры клеток (Фиг. 3).

Для статистического анализа среднее количество мигрировавших клеток в образцах после облучения принимают за единицу. Количество мигрировавших клеток после комбинированного действия DB(n) и гамма-облучения выражают в долях от среднего количества мигрировавших клеток в облученных образцах, принятого за 1.

III. Этап измерения увеличения экспрессии гена OCLN, регистрируемой при помощи ПЦР в реальном времени.

Клетки рака молочной железы линии MCF-7 рассевают в культуральные чашки Петри (диаметр дна 3,5 см) с добавлением 2 мл полной питательной среды (культуральная среда DMEM, содержащая 10% ФСКРС, пенициллин (50000 ед/л), стрептомицин (50 мг/л) и глютамин (292 мг/л). Через сутки в часть чашек Петри с клетками добавляют AT-специфичные ДНК-связывающие лиганды DB(n), в которых два бисбензимидазольных блока соединены между собой линкером с числом метиленовых групп (n) 5 или 7, растворенные в диметилсульфоксиде (ДМСО), до конечной концентрации 20 мкМ. Через 24 часа после добавления DB(n) производят однократное γ-облучение клеточных культур от источника ⁶⁰Со в дозе 4 Гр, мощность дозы 0,8 Гр/мин. Таким образом, формируют группы «Контроль», «4Гр», «DB(5)+4Гр» и «DB(7)+4Гр».

После облучения клетки культивируют в стандартных условиях в CO₂ инкубаторе в течение 48 часов, после чего удаляют культуральную среду, а клетки лизируют при помощи коммерчески доступных реагентов для выделения РНК. Очищенную из полученных лизатов РНК переводят в кДНК путём реакции обратной транскрипции. Полученную кДНК используют в качестве матрицы для проведения ПЦР «в реальном времени» и определения пороговых циклов амплификации (Ct) для каждого анализируемого гена в каждом образце.

В ходе анализа при помощи метода ΔΔCt анализируют изменение относительного уровня экспрессии гена OCLN (нормированного на уровень экспрессии референсного гена ALAS1) в опытных группах «4 Гр», «DB(5)+4Гр» и «DB(7)+4Гр» по отношению к таковому в группе сравнения «Контроль». При этом среднее значение относительного уровня экспрессии гена OCLN в группе «Контроль» принимают за 1, а кратность изменения относительного уровня экспрессии гена OCLN в остальных группах сравнения выражают в долях.

Пример 1 – определение снижения миграционной активности, регистрируемой с помощью теста заживления раневой полосы.

Установлено, что одиночное облучение приводит к увеличению миграционной активности клеток линии MCF-7 через 24 и 48 часов после радиационного воздействия по сравнению с контролем, что регистрируется по уменьшению ширины раневой полосы, более выраженному после облучения, чем в контроле в одинаковые сроки после нанесения раны (Фиг.2, Фиг.4). Сравнение динамики зарастания раневой полосы опухолевыми клетками после комбинированных воздействий и одиночного облучения показало, что в группах клеток, облученных на фоне как DB(5), так и DB(7) миграционная активность значимо снижается по сравнению с одиночным действием облучения, как через 24 часа после облучения для обоих соединений, так и через 48 часов для соединения DB(5) (p=0,005). Так, средняя ширина раневой полосы в контрольной группе составила (76,5±2,4)% от исходного значения через 24 часа после проведения полосы и (62,8±2,5)% через 48 часов, в облученной группе – (61,5±1,9)% через 24 часа и (51,7±2,3)% через 48 часов, а в группе клеток, облученных на фоне DB(5) – (78,0±1,9)% через 24 часа и (62,0±2,2)% через 48 часов, на фоне DB(7) – (72,3±1,9)% и (58,3±2,1)% соответственно (Фиг. 4).

В итоге, коэффициент подавления миграционной активности после комбинированного воздействия DB(5) и γ-излучения составил 26,8% на сроке 24 часа после облучения и 19,9% на сроке 48 часов. Для комбинированного воздействия DB(7) и γ-излучения этот показатель был равен 17,9% и 12,8% , соответственно.

Пример подтверждает данные многих исследований о том, что ионизирующее излучение приводит к увеличению миграционной активности опухолевых клеток. И впервые доказывает, что применение DB(5) или DB(7) приводит к снижению радиационно-индуцированной миграции.

Пример 2 – определение снижения миграционной активности, регистрируемой с помощью трансвелл анализа.

По результатам трансвелл анализа установлено, что соединение DB(5) в комбинации с облучением значительно снижает количество мигрировавших клеток (в 2,3 раза) по сравнению с одиночным действием облучения в дозе 4 Гр (p=0,01). В использованной тест-системе при комбинированном действии DB(7) и γ-излучения количество мигрировавших клеток снижается в большей степени – в 3,5 раза по сравнению с одиночным облучением (p=0,007). Доля мигрирующих клеток в группе «4Гр» – (1,00±0,05), «DB(5)+4Гр» – (0,43±0,05), «DB(7)+4Гр» – (0,28±0,04) (Фиг. 5).

Пример 3 – определение увеличения уровня экспрессии гена OCLN после комбинированного воздействия DB(5) или DB(7) и ионизирующего излучения.

Уровень экспрессии гена OCLN, который кодирует белок окклюдин, играющий важную роль в формировании плотных межклеточных контактов и развитии миграционной активности опухолевых клеток, оценивали по результатам ПЦР в реальном времени с последующим расчетом методом ΔΔCt. Установлено, что однократное облучение снижает экспрессию гена OCLN в 1,3 раза по сравнению с контролем (p=0,05). При комбинированном применении DB(5) и облучения уровень OCLN увеличивается в 2,4 раза по сравнению с одиночным действием облучения в дозе 4 Гр (p=0,03). DB(7) в комбинации с облучением также значимо увеличивает экспрессию OCLN (в 1,9 раз) по сравнению с одиночным облучением (p=0,03). Относительный уровень экспрессии гена OCLN в группе «Контроль» - (1,00±0,04), «4Гр» – (0,78±0,05), «DB(5)+4Гр» – (1,86±0,18), «DB(7)+4Гр» – (1,55±0,05) (Фиг. 6).

Пример 3 на уровне мРНК показывает тенденцию к снижению экспрессии OCLN после одиночного облучения, что подтверждает результаты примера №1 и данные литературы о молекулярных механизмах увеличении миграции опухолевых клеток после облучения. Пример №3 проясняет механизм снижения радиационно-индуцированной миграции опухолевых клеток с помощью DB(5) или DB(7).

В целом, примеры 1-3 показывают, что новый способ, заключающийся в 72 часовом воздействии на клетки синтетических водонерастворимых димерных бисбензимидазолов DB(5) или DB(7) в комбинации с ионизирующим излучением, позволяет значительно снижать радиационно-индуцированную миграцию опухолевых клеток вследствие повышения экспрессии гена, кодирующего интегральный белок плотных межклеточных контактов - окклюдин.

Учитывая, что, несмотря на всю эффективность в отношении первичного опухолевого очага, облучение активирует в клетках злокачественных новообразований ряд сигнальных путей и механизмов, приводящих к усилению миграции и метастазированию опухолевых клеток, подавление радиационно-индуцированной миграции является столь же важной частью противоопухолевого лечения, как и основная терапия.

Предложенный способ ингибирования миграции опухолевых клеток может стать новым инструментом в борьбе со злокачественными новообразованиями и повысить эффективность лечения.

Предложенная группа изобретений относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использована для определения снижения радиационно-индуцированной миграции клеток рака молочной железы человека линии MCF-7. Предложен способ, в котором миграционную активность опухолевых клеток in vitro определяют с помощью теста заживления раны: клетки инкубируют, добавляют водонерастворимый димерный бисбензимидазол с 5 метиленовыми группами в составе линкера (DB(5) или водонерастворимый димерный бисбензимидазол с 7 метиленовыми группами (DB(7), через 24 часа создают рану на непрерывном клеточном монослое и облучают оставшиеся клетки в дозе 4 Гр, инкубируют в течение 48 часов при температуре +37°С, определяют ширину свободной от клеток полосы через 24 и 48 часов после облучения в сравнении с исходным значением, принятым за 100%. Рассчитывают коэффициент К подавления миграционной активности. При значении К, равном 26,8% через 24 часа и 19,9% через 48 часов комбинированного воздействия DB(5) регистрируют снижение радиационно-индуцированной миграции клеток под воздействием DB(5). При значении К, равном 17,9% через 24 часа комбинированного воздействия DB(7) регистрируют снижение радиационно-индуцированной миграции клеток под воздействием DB(7). Предложен способ, в котором миграционную активность опухолевых клеток определяют с помощью трансвелл анализа: клетки инкубируют при температуре +37°С с DB(5) или DB(7) в течение 24 часов, далее клетки облучают в дозе 4 Гр, через 48 часов клетки отмывают от DB(5) или DB(7) и высевают в транслуночные вставки, инкубируют в течение трех суток при температуре +37°С, после чего подсчитывают количество мигрировавших клеток с помощью светового микроскопа в сравнении с одиночным облучением в дозе 4 Гр. При снижении количества мигрировавших клеток в 2,3 раза под воздействием DB(5) и облучения и в 3,5 раза под воздействием DB(7) и облучения регистрируют снижение радиационно-индуцированной миграции клеток по сравнению с одиночным облучением в дозе 4 Гр. Предложен способ, в котором определяют уровень экспрессии гена OCLN: инкубируют клетки при температуре +37°С с DB(5) или DB(7) в течение 24 часов, далее клетки облучают в дозе 4 Гр, через 48 часов выделяют мРНК, далее проводят ПЦР в реальном времени, определяют пороговые циклы амплификации (Ct), при помощи расчетного метода ΔΔCt анализируют изменение относительного уровня экспрессии гена OCLN. При определении увеличения радиационно-индуцированного уровня экспрессии гена OCLN в 2,4 раза под воздействием DB(5) и в 1,9 раз под воздействием DB(7) по сравнению с одиночным облучением в дозе 4 Гр регистрируют снижение радиационно-индуцированной миграции клеток. Способы обеспечивают эффективное определение снижения радиационно-индуцированной миграции клеток рака молочной железы человека линии MCF-7 за счет использования соединения DB(5) или DB(7) в комбинации с ионизирующим излучением. 3 н.п. ф-лы, 6 ил., 3 пр.

1. Способ определения снижения радиационно-индуцированной миграции клеток рака молочной железы человека линии MCF-7, включающий 72-х часовое воздействие на опухолевые клетки ДНК-связывающих лигандов – водонерастворимых димерных бисбензимидазолов, и облучения, отличающийся тем, что миграционную активность опухолевых клеток in vitro определяют с помощью теста заживления раны: клетки инкубируют до достижения ими 100% монослоя, добавляют водонерастворимый димерный бисбензимидазол с 5 метиленовыми группами в составе линкера (DB(5) или водонерастворимый димерный бисбензимидазол с 7 метиленовыми группами (DB(7), через 24 часа создают рану на непрерывном клеточном монослое в виде свободной от клеток полосы и облучают оставшиеся клетки в дозе 4 Гр, инкубируют клетки в течение 48 часов при температуре +37°С в CO₂-инкубаторе с 5% содержанием CO₂, определяют ширину свободной от клеток полосы через 24 и 48 часов после облучения в сравнении с исходным значением, принятым за 100%, рассчитывают коэффициент К подавления миграционной активности после комбинированного воздействия по сравнению с одиночным облучением по формуле

,

где:

Ш_комб. – ширина полосы после комбинированного воздействия,

Ш_обл. – ширина полосы после одиночного облучения,

и при значении К, равном 26,8% через 24 часа и 19,9% через 48 часов комбинированного воздействия DB(5) регистрируют снижение радиационно-индуцированной миграции клеток под воздействием DB(5); при значении К, равном 17,9% через 24 часа комбинированного воздействия DB(7) регистрируют снижение радиационно-индуцированной миграции клеток под воздействием DB(7).

2. Способ определения снижения радиационно-индуцированной миграции клеток рака молочной железы человека линии MCF-7, характеризующийся тем, что миграционную активность опухолевых клеток определяют с помощью трансвелл анализа: клетки инкубируют при температуре +37°С с водонерастворимым димерным бисбензимидазолом с 5 метиленовыми группами в составе линкера (DB(5) или водонерастворимым димерным бисбензимидазолом с 7 метиленовыми группами (DB(7) в течение 24 часов, далее клетки облучают в дозе 4 Гр, через 48 часов клетки отмывают от DB(5) или DB(7) и высевают в транслуночные вставки, инкубируют в течение трех суток при температуре +37°С в CO₂-инкубаторе с 5% содержанием CO₂, после чего подсчитывают количество мигрировавших клеток с помощью светового микроскопа в сравнении с одиночным облучением в дозе 4 Гр; и при снижении количества мигрировавших клеток в 2,3 раза под воздействием DB(5) и облучения регистрируют снижение радиационно-индуцированной миграции клеток; при снижении количества мигрировавших клеток в 3,5 раза под воздействием DB(7) и облучения регистрируют снижение радиационно-индуцированной миграции клеток по сравнению с одиночным облучением в дозе 4 Гр.

3. Способ определения снижения радиационно-индуцированной миграции клеток рака молочной железы человека линии MCF-7, характеризующийся тем, что определяют уровень экспрессии гена OCLN: инкубируют клетки при температуре +37°С с водонерастворимым димерным бисбензимидазолом с 5 метиленовыми группами в составе линкера (DB(5) или водонерастворимым димерным бисбензимидазолом с 7 метиленовыми группами (DB(7) в течение 24 часов, далее клетки облучают в дозе 4 Гр, через 48 часов выделяют мРНК, которую путём реакции обратной транскрипции переводят в комплементарную ДНК (кДНК), далее проводят полимеразную цепную реакцию в реальном времени, определяют пороговые циклы амплификации (Ct), при помощи расчетного метода ΔΔCt анализируют изменение относительного уровня экспрессии гена OCLN, нормированного на уровень экспрессии референсного гена ALAS1, и при определении увеличения радиационно-индуцированного уровня экспрессии гена OCLN в 2,4 раза под воздействием DB(5) и в 1,9 раз под воздействием DB(7) по сравнению с одиночным облучением в дозе 4 Гр регистрируют снижение радиационно-индуцированной миграции клеток.