Способ получения молекулярных STR-маркеров Y-хромосомы человека для идентификации неизвестного индивида и определения биологического родства методом мультиплексной амплификации, набор олигонуклеотидов для осуществления способа Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к области молекулярной биологии, биотехнологии, судебной медицины и криминалистики, генетическим исследованиям в области идентификации человека.

В настоящее время ДНК-анализ относится к наиболее доказательным методам исследования биологического материала при производстве судебно-медицинской идентификационной экспертизы и используется в криминалистике с 1985 года. ДНК-анализ позволяет исследовать специфичные для каждого человека участки генома, и получить, таким образом, уникальный генетический "паспорт" или генетически профиль индивида. Индивидуализирующие признаки, определяемые на уровне ДНК, характеризуются почти абсолютной устойчивостью, то есть сохраняются в организме человека неизменными на продолжении всей жизни. В последние десятилетия для целей генетической идентификации личности широко применяется различные маркерные системы, локализованных как на аутосомах, так и на нерекомбинирующих участках Y-хромосомы и Х-хромосом и в митохондриальной ДНК.

В начале 1990-х годов короткие тандемные повторы (STR) были введены в качестве нового типа полиморфного ДНК-маркера и с тех пор стали золотым стандартом идентификации человека в базах данных ДНК, уголовных дел, анализа отцовства и родства, а также идентификации пропавших без вести лиц. Аутосомные STR и STR Y-хромосомы (Y-STR) успешно применяются в судебно-медицинском анализе ДНК в течение многих лет.

Исследование нерекомбинирующей части Y-хромосомы, специфичной только для мужчин, широко применяется в криминалистических и археологических исследованиях, особенно в случаях, когда анализ стандартных аутосомных маркеров оказывается малоинформативным. На сегодняшний день в криминалистике широко распространен анализ маркеров, состоящих из коротких тандемных повторов в нерекомбинирующем участке Y хромосомы (Y-STR), который позволяет специфично охарактеризовать отцовскую линию мужчины, чей образец исследуется. Более того, генотипы Y-STR-маркеров могут быть применены при исследовании образца смешанной мужской и женской ДНК, что проблематично при анализе аутосомных маркеров. Подобная задача часто возникает при изучении смешанных образцов [1-4].

Таким образом, анализ Y-STR-маркеров позволяет:

- Определить отцовскую линию исследуемого образца;

- предоставить материал для следствия при поиске и идентификации личности неизвестного мужчины [1, 2, 5].

Кроме того, анализ Y-STR-маркеров применяется при установлении факта родства по мужской линии, что актуально при исследовании спорных исторических и археологических случаев, а также в ситуациях пропажи людей и идентификации жертв бедствий мужского пола. Более того, с применением разрабатываемых сегодня баз данных, по маркерам Y-STR можно предположить также географическую принадлежность по отцовской линии неизвестного мужчины [1, 2].

Основным методом генотипирования STR-маркеров является метод капиллярного электрофореза. На основе этого метода используется большое количество коммерческих наборов, содержащих различное количество стандартных STR маркеров Y хромосомы. В настоящее время существует целый ряд коммерческих наборов, позволяющих определять Y-STR гаплотип с помощью мультиплексной ПЦР. Данные наборы различаются по составу и количеству STR-маркеров, включают в себя высокополиморфные, стандартизированные маркеры с низкой частотой мутаций. С их использованием были созданы современные базы данных, содержащие в себе частоты Y-STR гаплотипов. Наиболее крупной из таких баз данных является база YHRD [Y-STR Haplotype Reference Database (YHRD) v4.0 [6]. Ниже приводятся наиболее известные наборы, содержащие различное количество STR маркеров Y хромосомы:

- Yfiler (компания Thermo Fisher) - 16 STR маркеров Y хромосомы

- Yfiler Plus (компания Thermo Fisher) - 24 STR маркеров Y хромосомы

- PowerPlexY23 (компания Promega) - 23 STR маркеров Y хромосомы

- Powerplex 35GY 8C (компания Promega) - 11 STR маркеров Y хромосомы

- SurelD (компания Compass/ Health Gene Tehcnologies, Китай) - 17 STR маркеров Y хромосомы

Expressmarker 16+10Y (компания AGCU Scien Tech, Китай) - 10 STR маркеров Y хромосомы

Expressmarker 16+18Y (AGCU Scien Tech., Китай) - 18 STR маркеров Y хромосомы.

В последнее время появились разработки наборов для идентификации, в которых использован наиболее современный и технологичный подход, основанный на применении "массового параллельного секвенирования" (NGS). Такой подход, например, используется в наборе DNA Signature Prep Kit (Verogen, San Diego, CA, USA) [7], который содержит 24 STR-маркеров Y хромосомы, амплифицирующихся в наборе с большим количеством других молекулярных маркеров. К недостаткам существующих импортных наборов для ДНК-идентификации относится их значительная дороговизна, обусловленная необходимостью использования дорогостоящих расходных материалов (специфических ДНК-полимераз, растворов для ПЦР, буферных растворов). Для устранения указанных недостатков необходимым условием является повышение информативности предлагаемого набора и его экономичности, а также адаптации для специфики используемых в криминалистических экспертизах образцов биологического материала

Для успешного применения STR-маркеров Y хромосомы в криминалистике и судебной медицине, необходима разработка композиций олигонуклеотидных праймеров, обеспечивающих одновременную амплификацию (путем проведения мультиплексной ПЦР) локусов минимально возможного размера, содержащих только STR-маркеры для Y-хромосомы для секвенирования методом "массового параллельного секвенирования" (NGS).

Для решения поставленной задачи авторами предложен набор из 15 пар синтетических олигонуклеотидных праймеров, содержащих 17 STR-маркеров Y-хромосомы человека для анализа методом мультиплексной амплификации, с последующим секвенированием методом "массового параллельного секвенирования" (NGS). Изобретение раскрывает разработанные оригинальные синтетические олигонуклеотидные праймеры, позволяющие амплифицировать STR-локусы, Y-хромосомы человека.

Набор для генотипирования включает композицию, образованную 15 парами синтетическими оригинальными олигонуклеотидными праймерами для локусов в геноме человека, включающих 17 локусов с STR-маркерами на Y-хромосоме, позволяющую проводить мультиплексную ПЦР (нуклеотидная последовательность праймеров SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO 30 (приведена в таблице 1).

Преимущества данного набора состоит в том, что авторами изобретения разработана система олигонуклеотидных праймеров с минимальным размером ПЦР-продуктов, позволяющая одновременно анализировать множество образцов методом "массового параллельного секвенирования" и включающая только STR-маркеры Y-хромосомы человека.

Осуществление изобретения

Пример генотипирования биологического образца

В примере показан способ получения выбранных STR-маркеров Y-хромосомы человека из биологических образцов, содержащих геномную ДНК человека, путем проведения мультиплексного ПЦР-анализа с последующим "массовым параллельным секвенированием" полученных мультиплексных ПЦР-продуктов и генотипированием выбранных маркеров с использованием адаптированной программы STRinNGS [8].

Получение ДНК

ДНК может быть получена из любого биологического материала человека, любой ткани человека, содержащей клеточные ядра, например, лейкоцитов, волосяных фолликулов, клеток буккального эпителия и др. Пригодная для проведения ПЦР ДНК может быть выделена из образа при помощи любого ранее широко применяемого метода выделения ДНК. Авторы рекомендуют использовать готовые наборы для выделения ДНК из различных тканей человека (например, представленных фирмой Qiagen).

Получение молекулярных STR-маркеров Y-хромосомы включает в себя четыре этапа:

- Мультиплексная ПЦР геномной ДНК с использованием смеси специфических олигонуклеотидных праймеров;

- Приготовление фрагментных библиотек из полученных ПЦР-продуктов для секвенирования на платформе Illumina;

- Проведение широкомасштабного параллельного секвенирования полученных библиотек;

Набор олигонуклеотидных праймеров адаптирован для использования ДНК в количестве от от 10 нг до 1 нг ДНК. При необходимости образец ДНК следует развести в буфере ЕВ. Также необходимо проводить параллельно контрольную реакцию (отрицательный контроль), где вместо ДНК добавляется деионизированная вода.

Амплификация участков генома, содержащих исследуемые маркеры

Амплификация участков генома, содержащих исследуемые маркеры, может быть осуществлена с помощью любого набора, предназначенного для проведения мультиплексной ПЦР, авторы использовали набор Multiplex PCR kit компании «Qiagen». Мультиплексную ПЦР проводили на приборе GeneAmp PCR System 9700 Thermal Cycler компании «Applied Biosystems».

Состав реакционной смеси для мультиплексной ПЦР:

- Раствор олигонуклеотидов для мультиплексной ПЦР (в конечной концентрации от 1 нМ до 0,5 мкМ

- Смесь полимеразы и буфера

- Деионизированная вода

- исследуемая ДНК.

Амплификацию следует проводить в пробирках, стрипах, или планшетах предназначенных для ПЦР.

В отдельной стерильной пробирке смешать из расчета на одну реакцию все необходимые компоненты, согласно расчетной таблице (пробирка с раствором MasterMix).

* Предлагаемый расчет для подготовки реакционной смеси подходит для работ с образцами ДНК с концентрацией выше 10 нг/мкл. При работе с образцами ДНК с меньшей концентрацией расчет количества вносимой в реакционную смесь деионизированной воды следует проводить по формуле (23-Х), где X - объем анализируемого препарата ДНК, который обеспечивает необходимое количества ДНК в реакционной смеси. Например, образец ДНК с концентрацией 250 пг/мкл. Необходимо внести в реакционную смесь минимум 4 мкл препарата ДНК (суммарно 1 нг) и 19 мкл деионизированной воды.

При использовании такой системы для амплификации (2-х смесь буфера и полимеразы), минимальная возможная для использования концентрация ДНК составляет 40 пг/мкл.

После приготовления, смесь для амплификации помещают в амплификатор и выставляется программа:

95°С 15 минут

94°С - 30 секунд

57°С - 90 секунд 35 циклов

72°С - 90 секунд

72°С - 10 минут

4°С ∞.

Наличие продуктов амплификации исследуемой ДНК и отсутствие продуктов амплификации в отрицательном контроле проверяют с помощью электрофореза в агарозном геле. Продукты амплификации очищают с помощью соответствующих мини-колонок (например, Qiagen MinElute system) в соответствии с инструкцией к используемому набору реагентов. Полученные в результате мультиплексной амплификации очищенные ПЦР продукты, содержащие STR-маркеры Y хромосомы используются в качестве матрицы для приготовления фрагментных геномных библиотек для секвенирования.

Приготовление фрагментных библиотек

Предварительно необходимо провести измерение концентрации очищенных ПЦР-фрагментов, полученных на предыдущем этапе мультиплексной амплификации на приборах NanoDrop или Qubit (ThermoFisher) в соответствии с инструкцией к прибору. Для приготовления фрагментных библиотек оптимально использовать около 300 нг ДНК очищенных ПЦР-продуктов мультиплексной амплификации. Приготовление фрагментных геномных библиотек проводят с использованием наборов реагентов Illumina®. TruSeq® DNA PCR-Free library prep kit в соответствии с инструкцией к набору. Для секвенирования нескольких образцов фрагментных библиотек одновременно необходимо использовать индексированные адаптеры (например, Dual index adaptors Illumina). Для каждого образца библиотеки используется отдельный индексируемый адаптер, который необходимо записать в таблицу для дальнейшего учета при анализе результатов секвенирования нескольких образцов фрагментных библиотек. Для приготовления фрагментных библиотек рекомендуется/возможно использовать 1/2 от объема всех реагентов, входящих в набор Illumina®. TruSeq® DNA PCR-Free library prep kit, прописанного в инструкции к набору.

Этапы 1-3 являются рекомендованными, но не обязательными.

1. Очистка фрагментных библиотек: необходимо нанести весь объем элюата в одну лунку 2% агарозного геля с красителем SYBR Gold (например, с использованием готового 2%-ного E-gel (Invitrogen)). Провести электрофорез с использованием маркера молекулярных весов 50 bp Ladder в течение 10 минут (в случае использования системы e-gel (Invitrigen)).

2. с использованием стерильного одноразового скальпеля вырезать кусочки геля, с фрагментами библиотеки от 220 п. н. и больше. Светящиеся фрагменты длиной меньше 150 п. н. соответствуют димерам адаптеров и не должны быть использованы для дальнейшего анализа.

3. Провести очистку вырезанных фрагментов ДНК с использованием набора реагентов MinElute gele extraction kit (Qiagen). Эллюировать в 20-22 мкл буфера ЕВ (Qiagen).

Приготовленные описанным выше способом фрагментные библиотеки можно напрямую использовать для секвенирования на технологической платформе Illumina, предварительно проведя оценку качества полученных фрагментных библиотек.

Качественную и количественную оценку фрагментных библиотек можно проводить стандартными методами, рекомендованными фирмой производителем платформ для секвенирования Illumina. Для оптимизации рабочего процесса рекомендуем использовать следующие этапы: измерить концентрации фрагментных библиотек на приборе Qubit с использованием набора реагентов HS. Для дальнейшего секвенирования рекомендуется использовать фрагментные библиотеки с концентрацией не менее 2 нМ/мкл.

Перед секвенированием необходимо провести мультиплексирование библиотек в эквимолярных количествах (объединение библиотек для нескольких образцов). Не допускается объединение в один пул библиотек с одинаковыми индексами.

Приготовленные фрагментные библиотеки секвенируют методом параллельного широкомасштабного секвенирования на технологической платформе Illumina в режиме одноконцевого секвенирования с длинной прочтения не менее 350 и.о. Рекомендуемый прибор настольный секвенатор MiSeq (Illumina). Определение генотипов проводили с помощью адаптированной программы STRinNGS[8].

Авторами были проанализированы 10 образцов ДНК индивидов и контрольная ДНК М2800 (Promega) в различных разведениях ДНК. В результате работы, у всех исследованных образцов были амплифицированные все выбранные локусы. Генотипы локусов STR-маркеров Y-хромосомы для контрольной ДНК М2800 (Promega), определенные с помощью адаптированной программы STRinNGS совпали.

Список литературы

1. Roewer L.Y chromosome STR typing in crime casework // Forensic Sci. Med. Pathol. 2009. Vol. 5, №2. P. 77-84.

2. Kayser M. Forensic use of Y-chromosome DNA: a general overview // Hum. Genet. Springer Berlin Heidelberg, 2017. Vol. 136, №5. P. 621-635.

3. Hall A., Ballantyne J. The development of an 18-locus Y-STR system for forensic casework // Anal. Bioanal. Chem. 2003. Vol. 376, №8. P. 1234-1246.

4. Purps J. et al. A global analysis of Y-chromosomal haplotype diversity for 23 STR loci // Forensic Sci. Int. Genet. 2014. Vol. 12. P. 12-23.

5. Willuweit S., Roewer L. The new у chromosome haplotype reference database // Forensic Sci. Int. Genet. Elsevier Ireland Ltd, 2015. Vol. 15. P. 43-48.

6. http://www.yhrd.org.]

7. et al. Developmental validation of the MiSeq FGx Forensic Genomics System for Targeted Next Generation Sequencing in Forensic DNA Casework and Database Laboratories DNA typing Forensic DNA SWGDAM validation Next-Generation Sequencing (NGS) Massively parallel seq. 2017.

8. Carina Jonck, Xiaoqin Qian, Halimureti Simayijiang, Claus STRinNGS v2.0: Improved tool for analysis and reporting of STR sequencing data, Forensic Science International: Genetics, Volume 48, 2020, 102331, ISSN 1872-4973, https://doi.org/10.1016/j.fsigen.2020.102331.

Перечень олигонуклеотидных последовательностей

SEQ ID NO:1

TAATACTTCGGGCCATGG

SEQ ID NO:2

GACTACTGAGTTTCTGTTATA

SEQ ID NO:3

GCATGGGTGACAGAGCTAG

SEQ ID NO:4

CCAATTACATAGTCCTCCTTTC

SEQ ID NO:5

CCAACTCTCATCTGTATTATCT

SEQ ID NO:6

TTATCCCTGAGTAGTAGAAGA

SEQ ID NO:7

AGTGGGAGAAATGGATGACAG

SEQ ID NO:8

TATATTTTACACATTTTTGGGCC

SEQ ID NO:9

TTCATTCAATCATACACCCATA

SEQ ID NO:10

GAGGGATAGGTAGGCAGGC

SEQ ID NO:11

ACCTACCAATCCCATTCCTTA

SEQ ID NO:12

AGAGGCAGTCATCGCAGTG

SEQ ID NO:13

TGGTCTTCTACTTGTGTCAATACAG

SEQ ID NO:14

AACTCAAGTCCAAAAAATGAGGT

SEQ ID NO:15

TGGGACTATGGGCGTGAG

SEQ ID NO:16

AGACCCTGTCATTCACAGATG

SEQ ID NO:17

TGGGGAATAGTTGAACGGTAAA

SEQ ID NO: 18

GAGGTTGTGGTGAGTCGAG

SEQ ID NO:19

TCGAGTTGTTATGGTTTTAGGTC

SEQ ID NO:20

GCTTGGAATTCTTTTACCCATCA

SEQ ID NO:21

AGAAAGGGAGATAGAGACATGG

SEQ ID NO:22

CTTCCTTAACGTGAATTTCCTCA

SEQ ID NO:23

GGGACCTTGTGATAATGTAAGATA

SEQ ID NO:24

CCATCAACTCAGCCCAAAACT

SEQ ID NO:25

GAGCAACAGGAATGAAACTCC

SEQ ID NO:26

GCCACCACGCCCACCCT

SEQ ID NO:27

ACCAGCCCAAATATCCATCA

SEQ ID NO:28

TGGAATGCTCTCTTGGCTTC

SEQ ID NO:29

TATGCTGAGGAGAATTTCCAA

SEQ ID NO:30

TATTCATCCATCTAATCTATC.

Изобретение относится к области молекулярной биологии, биотехнологии, судебной медицины и криминалистики, генетическим исследованиям в области идентификации человека. Предложен способ получения молекулярных STR-маркеров Y-хромосомы человека для идентификации неизвестного индивида и определения биологического родства методом мультиплексной амплификации и набор синтетических олигонуклеотидных праймеров для проведения мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР). Набор для генотипирования включает композицию, образованную 15 парами синтетических оригинальных олигонуклеотидных праймеров для локусов в геноме человека, включающих 17 STR-маркеров Y хромосомы, позволяющую проводить мультиплексную ПЦР с использованием праймеров с последовательностями SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO 30. Синтетические олигонуклеотидные праймеры подобраны таким образом, чтобы успешно амплифицировать выбранные локусы в ходе одной мультиплексной реакции и последующего секвенирования методом "массового параллельного секвенирования " (NGS). Изобретение может быть также использовано для исследования ДНК с целью идентификации неизвестного индивида и определения биологического родства в российской популяции с высокой чувствительностью, специфичностью и точностью по сравнению с существующими аналогами. 3 н. и 3 з.п. ф-лы, 1 табл., 1 пр.

1. Способ получения молекулярных STR-маркеров Y-хромосомы человека для идентификации неизвестного индивида и определения биологического родства методом мультиплексной амплификации, характеризующийся тем, что для генотипирования используют композицию, образованную 15 парами синтетических оригинальных олигонуклеотидных праймеров для проведения мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) с нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 30, фланкирующих участки ДНК, содержащих 17 STR-маркеров Y-хромосомы человека; ПЦР-продукты, соответствующие выбранным праймерам, представляют собой маркеры.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что полученные в результате мультиплексной амплификации ПЦР-продукты, содержащие маркеры для идентификации неизвестного индивида и определения биологического родства, используют в качестве матрицы для приготовления геномных библиотек для определения нуклеотидной последовательности.

3. Способ по п. 1, где определение нуклеотидной последовательности продуктов амплификации (ПЦР-продуктов) проводят секвенированием по методу "массового параллельного секвенирования" (NGS).

4. Способ по п. 1 для идентификации неизвестного индивида и определения биологического родства индивида, происходящего из российских популяций.

5. Способ идентификации неизвестного индивида и определения биологического родства, включающий генетическое исследования биологического образца, содержащего ДНК, выделенную из любого биологического материала в соответствии со стандартными методами, обеспечивающими качественную очистку ДНК от белков и примесей, с использованием мультиплексной полимеразной цепной реакции (мультиплексной ПЦР) и последующего определения нуклеотидной последовательности продуктов амплификации, содержащих специфичные для локусов в геноме человека STR-маркеры Y-хромосомы, полученные способом по п. 1.

6. Набор олигонуклеотидов для осуществления способа по п. 1, используемый для детектирования присутствия молекулярных STR-маркеров Y-хромосомы, предназначенных для идентификации неизвестного индивида и определения биологического родства, включающий синтетические оригинальные праймеры с нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 30.