Способ создания рекомбинантного штамма энтерококка L3-SARS"XBB.1.5" на основе биологически активного штамма Enterococcus faecium L3 Российский патент 2025 года по МПК C12N15/33 C12N15/50 C12N15/62 C12N15/74 C12N1/21 C12R1/01 

Изобретение относится к области медицины, вирусологии, микробиологии, молекулярной генетики и биотехнологии и может быть использовано в медицинской промышленности при производстве живых вакцин для профилактики и лечения инфекций, вызванных коронавирусом.

В настоящий момент разработку вакцины для профилактики и терапии инфекции, вызванной SARS-CoV-2 ведут по всему миру вследствие лавинообразного развития эпидемического процесса, вызванного новым вариантом коронавируса SARS-CoV-2. Переход эпидемии в разряд глобальной пандемии, ограниченные знания относительно биологии и эволюционного потенциала нового варианта коронавируса приводит к необходимости разрабатывать множественные варианты средств профилактики и лечения нового вирусного заболевания.

Пандемия новой коронавирусной инфекции началась еще в 2020 году, однако до сих пор не оставляет человечество в покое. Вирус распространяется волнами: это происходит из-за постоянных мутаций его структуры. Разновидности вирусов ученые называют штаммами, а самым важным из них (как в случае с SARS-CoV-2, новым коронавирусом) дают короткие названия. Штаммы отличаются друг от друга и их определяют в лабораториях по всему миру.

Успехи биоинформатики и молекулярной биологии позволяют за рекордно короткие сроки определить перспективные с точки зрения индукции иммунного ответа антигены возбудителя, достижения генной инженерии и биотехнологии - создать разнообразные вакцинные препараты. Необходимость быстрой разработки средств борьбы ускоряет процедуру лицензирования и облегчает введение в практику принципиально новых вакцинных платформ, как это происходит, например, с РНК, ДНК вакцинами или вакцинами на основе ослабленных вирусов.

Коронавирусы (Coronaviridae) - семейство вирусов, включающее на январь 2020 года более 60 видов РНК-содержащих патогенных вирусов, объединенных в четыре подсемейства, которые поражают человека и животных. Название связано со строением вируса, который имеет шиловидные отростки. Они напоминают солнечную корону и содержат рецептор-связывающие белки, на которые реагируют трансмембранные рецепторы клеток. Коронавирусы имеют сходную организацию генома, представленного цепочкой из положительной цепи однонитевой РНК из 25-30 тысяч нуклеотидов.

Коронавирус человека впервые был выделен в 1965 году от больных ОРВИ Д. Тиррелом из носоглотки при остром рините, позже в 1975 году Э. Каул и С. Кларк выделили коронавирус из испражнений при детском энтероколите. В последующее время коронавирусы почти не привлекали внимание исследователей, пока в Китае в 2002-2003 годах не была зафиксирована вспышка атипичной пневмонии или тяжелого острого респираторного синдрома (ТОРС, SARS). Заболевание было вызвано вирусом SARS-CoV, бета-коронавирусом В.

В результате болезнь распространилась на другие страны, всего заболело 8273 человека, 775 умерло (летальность 9,6%). Вирус MERS-CoV, бета-коронавирус С, является возбудителем ближневосточного респираторного синдрома (MERS), первые случаи которого были зарегистрированы в 2012 году [Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. - СПб: Спец Лит, 2008]. В 2015 году в Южной Корее произошла вспышка ближневосточного респираторного синдрома, в ходе которой заболело 183 человека, умерло 33.

В декабре 2019 года в Китае началась вспышка пневмонии, вызванная ранее неизвестным бета-коронавирусом, обозначенным как SARS-CoV-2. Вскоре данная вспышка преобразовалась в эпидемию, которая распространилась и на другие страны мира, превратившись в пандемию, приведшую к заболеванию более 20 миллионов человек в мире и смерти миллиона человек.

Источниками коронавирусных инфекций может быть, как больной человек, так и различные животные, как промежуточные хозяева. Наиболее вероятным исходным хозяином SARS-CoV-2 были летучие мыши. Возможные механизмы передачи: воздушно-капельный, воздушно-пылевой, фекально-оральный, контактный. Заболеваемость растет зимой и ранней весной. В структуре ОРВИ госпитализированных больных коронавирусная инфекция составляет в среднем 12%. Бета-коронавирусы, разрушая клетки эпителия различных органов, провоцируют возникновение заболеваний, наиболее характерным и тяжелым вариантом которых является развитие двухсторонней пневмонии, блокирующей функцию дыхания, том числе со смертельным исходом.

SARS-CoV-2 использует поверхностный S-белок для прикрепления к своему рецептору - ангиотензинпревращающему ферменту 2 (АСЕ2), как и вирус SARS-CoV (атипичной пневмонии) [Xintian Xu, Ping Chen, Jingfang Wang, Jiannan Feng, Hui Zhou. // SCIENCE CHINA Life Sciences, 2020].

РНК вируса имеет 5'-метилированное начало и 3'-полиаденилированное окончание. Это позволяет вирусу инициировать сборки своих белков и копий в рибосоме клетки, которая не в состоянии отличить РНК вируса от РНК для белков самой клетки.

РНК коронавирусов состоят из 26-30 тысяч пар оснований. Это означает, что коронавирусы обладают крупнейшей несегментированной РНК, то есть являются сложнейшими по структуре среди всех известных вирусов. Геном вируса состоит из 30000 нуклеотидов и кодирует два репликативных полипротеина ppla и pplab, из которых в следующий проход репликации/трансляции формируется копия РНК вируса, а также 8 отдельных мРНК-шаблонов для белков вирусов, которые бесконечно их генерируют [Thiel V. Coronaviruses: Molecular and Cellular Biology. Caister Academic Press (2007); King, Andrew M.Q.; Adams, Michael J.; Carstens, Eric B; Lefkowitz, Elliot J, Virus Taxonomy, 2012]. Генерация белков вируса из мРНК происходит в эндоплазматическом ретикулуме и аппарате Гольджи. После получения РНК вируса и необходимых его белков вирусные нуклеокапсиды собираются из геномной РНК вируса и N-белка в цитоплазме. Вирионы затем высвобождаются из инфицированной клетки через экзоцитоз. После выхода вирионов из клетки она погибает.

С появлением "омикрона" скорость распространения коронавируса увеличилась, а инкубационный период сократился. Новые штаммы обладают высокой заразностью, более легким течением заболевания, но по-прежнему могут вызвать серьезные осложнения. Первым мутациям COVID-19 Всемирная организация здравоохранения давала названия в соответствии с буквами греческого алфавита, но после омикрона сам принцип мутаций изменился, теперь новые штаммы практически не отличаются от "родителя", поэтому их стали называть "цербер", "кентавр", "стеллс" и т.д. Раньше мутации происходили в результате замены одного основания другим в структуре ДНК или РНК, теперь РНК нескольких штаммов встречаются в одной клетке и обмениваются друг с другом частями, в результате появляется новая мутация. Это касается всех штаммов с буквой "X" в официальном названии ("кракен" именуется 'ХВВ.1.5').

Он возник благодаря слиянию двух фрагментов других вариантов - ВА.2.10.1 и ВА.2.75. Это означает, что коронавирус сейчас развивается внутри "омикрона" и не создает новые отдельные варианты вируса. Новые штаммы остаются по своей характеристике близки к "омикрону", их лишь отличает контагиозность. То есть каждое последующее "ответвление" вируса становится более заразным.

Главная опасность нового подвида коронавируса заключается в том, что он способен уходить от иммунного ответа организма. Кроме того, он устойчив к защите, которую обеспечивает вакцина, может заразить повторно тех, кто относительно недавно болел предыдущими формами COVID-19. Его высокая способность передаваться от человека к человеку означает, что тяжелых последствий от "кракена" станет больше. Возникновение вируса совпало со всплеском простудных заболеваний, что может с двойной силой ударить по организму заразившегося. Однако, по данным американских ученых, особых отличий в степени тяжести между новым 'ХВВ.1.5' и предыдущими версиями "омикрона" пока не выявлено. Клиническая картина практически одинаковая.

Эпоха вакцинации, открытая Эдвардом Дженнером в конце 18 века, драматическим образом изменила лицо мировой медицины, начав эру профилактики. Идея использования в качестве защиты от возможной инфекции измененных бактерий или вирусов, способных при введении в организм вызывать образование специфических антител и цитотоксических клеток, вызывающих инактивацию патогенов, оказалась плодотворной и в существенной степени помогла снизить заболеваемость и смертность от инфекций. Однако, появление новой коронавирусной инфекции (COVID-19), охватившей все континенты за считанные недели показало, что современная наука к началу эпидемии была совершенно не готова воспрепятствовать данной инфекции: на 9 ноября 2022 года во всем мире зарегистрировано 637 миллионов случаев заболевания, приведшее к 6,6 миллионов смертей.

В невероятно сжатые сроки были разработаны вакцины против SARS-Cov-2, основанные на самых различных принципах: субъединичные белковые вакцины; РНК-вакцины, реплицирующиеся и нереплицирующиеся вирусные векторные вакцины, инактивированные вакцины, ДНК-вакцины, вакцины с вирусоподобными частицами и живые аттенуированные вакцины. Абсолютное большинство этих вакцин - инъекционные, обеспечивающие специфический иммунный ответ с выработкой иммуноглобулинов класса G, циркулирующих в крови. Таким образом защитный вакцинальный эффект проявляется только после проникновения вируса через слизистые барьеры в легком и бронхиальном дереве. Альтернативой инъекционных вакцин являются мукозальные вакцины, направленные на выработку специфических иммунных реакций непосредственно в воротах инфекции - слизистых оболочках ротовой полости и верхних дыхательных путей.

Одним из альтернативных подходов к созданию вакцин как против вирусов гриппа, так и против коронавирусов, является встраивание консервативных последовательностей вирусных белков в пробиотические векторы. То есть, альтернативой использованию химических адъювантов для вакцинации является применение так называемых живых вакцин на основе пробиотиков. Живые вакцины применяют, как правило, однократно, вводят подкожно, накожно или внутримышечно, а некоторые вакцины перорально и ингаляционно. Главным преимуществом живых вакцин является то, что они активируют все компоненты иммунной системы, вызывая сбалансированный прочный иммунный ответ.

Пробиотические микроорганизмы рассматриваются в настоящее время как хорошая основа для получения рекомбинантных живых вакцин, экспрессирующих вакцинные антигены возбудителей актуальных инфекций Vintini E.O., Medina M.S., BMC Immunol., 12: 46 (2011); Bermudez-Hurnarun L.G., Kharrat P., Chatel J.M., Microb. Cell. Fact. 10: 17-24 (2011); ME Y., Luo Y., Huang X., Song F., Liu G. Microbiology, 158: 498-504 (2012), De Azevedo M., Karczzewski J., Lefeure F. Et al. BMC Microbiol. 12: 299 (2011), [Lei H. et al. Virology. T. 476: 189-195 (2015)].

В 2015 г. Хан Л. со своими коллегами создали химерную конструкцию на основе бактерии Lactococcus lactis, содержащую на своей поверхности NA вируса гриппа А, и показали, что она способна защищать мышей от инфекции вирусами гриппа [Lei Н. et al. Virology. Т. 476: 189-195, (2015)]. Таким образом, они показали, что такая химерная конструкция может быть кандидатом для создания универсальной противогриппозной вакцины.

Известен пробиотический штамм Enterococcus faecium L3 ND-79 ВНИИСХМ, предназначенный для изготовления лечебно-профилактических средств и продуктов питания лечебно-профилактического назначения, обладающий устойчивостью к широкому спектру антибиотиков, более выраженным антагонизмом к патогенным бактериям, высокой жизнеспособностью и высоким уровнем продукции витаминов группы "В" и фолиевой кислоты; известный штамм положен в основу заявляемого изобретения [патент РФ №2220199 на штамм энтерококков Enterococcus faecium L3 для изготовления лечебно-профилактических средств].

Известен способ, основанный на введении bac гена патогенных СГВ в хромосомную ДНК в области кодирования белков пилей пробиотического штамма Enterococcus faecium L3 с последующей экспрессией в пилях белка Вас, кодируемого этим геном. Пили энтерококков выступают за пределы бактериальных клеток и способны проникать сквозь капсулу, которая экранирует большинство бактериальных белков-антигенов. Пили состоят из белковых мономеров, способных к агрегации. За счет этого процесса может увеличиваться доза чужеродного антигена, встроенного в белок пилей. Последнее должно способствовать увеличению титров антител, специфичных к встраиваемому в структуру поверхностного белка энтерококка полипептидного фрагмента штамма патогенного СГВ.

Способ введения гена патогенных стрептококков в пили пробиотического штамма Enterococcus faecium L3 интересен тем, что рекомбинантный белок экспрессируется не в цитоплазме, а на поверхности бактерии [патент РФ №2640250 «Способ введения генов патогенных стрептококков в хромосомную ДНК пробиотического штамма Enterococcus faecium L3 для экспрессии в пилях», авторы - Суворов А.Н. и др.].

Известно, что штамм Enterococcus faecium L3 обладает выраженной антагонистической активностью в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий, способностью восстанавливать микробиоценоз кишечника на фоне дисбиотических состояний [Yermolenko Е., Suvorov А., Chernush A., et al. International Congress Series, 1289: 363-366 (2006)], а также оказывать иммуномодулирующее действие на организм хозяина [Tarasova Е., Yermolenko Е., Donets V., Sundukova Z., Bochkareva A., Borschev I., Suvorova M., Ilyasov. I., Simanenkov V., Suvorov A. The influence of probiotic enetrococci on the microbiota and cytokines expression in rats with dysbiosis induced by antibiotics // Beneficial Microbes. - 2010 - Т. 1. - №3. - C. 265-270].

Осуществлено физическое картирование штамма Enterococcus faecium L3 [Suvorov A., Simanenkov V., Gromova L. et al. Prebiotics and probiotics potential for human health, 104-112, (2011)].

В экспериментах на здоровых самках мышей показано, что интравагинальное введение высоких доз штамма Enterococcus faecium L3 не только не оказывает токсического действия на организм, но не влияет на состояние слизистой оболочки влагалища [Суворов А., Алехина Г., Пигаревский П. и др. Гастробюллетень, 4: 29-31, (2001)] и способствует экспрессии IL-10 клетками слизистой оболочки влагалища крыс с экспериментальным вагинитом, вызванном S.agalactiae и Staphylococcus aureus [Tarasova Е., Yermolenko Е., Donets V., Sundukova Z., Bochkareva A., Borschev I., Suvorova M., Ilyasov I., Simanenkov V., Suvorov A. The influence of probiotic enetrococci on the microbiota and cytokines expression in rats with dysbiosis induced by antibiotics // Beneficial Microbes. - 2010. - Т. 1. - №3. - C. 265-270].

В штамме Enterococcus faecium L3, как и у других грамположительных бактерий, имеются пили, которые представляют собой фимбрии длиной 0,3-3 μm и диаметром 2-10 nm [Telford JL, Barocchi MA, Margarit I, Rappuoli R, Grandi G. Pili in gram-positive pathogens. Nat Rev Microbiol. - 2006 - T.4, №7 - C. 509-519. doi:10.1038/nrmicro1443. PMID:16778837]. Это длинные белок-подобные полимеры, тянущиеся на поверхности бактерий, представляют собой субъединицы белка пилина, соединенные ковалентной связью. Они играют большую роль в адгезии колонизации хозяина. Пили являются высокоиммуногенными структурами, которые находятся под селективным давлением иммунных реакций хозяина [Danne С, Dramsi S. Pili of gram-positive bacteria: roles in host colonization. Res Microbiol. 2012 Nov-Dec; 163(9-10):645-58. doi: 10.1016/j.resmic.2012.10.012. Epub 2012 Oct 29. PMID: 23116627].

Принцип модификации пилей энтерококков вакцинными антигенами является приоритетным подходом при создании эффективных живых вакцин благодаря экспозиции целевого антигена на поверхности энтерококка.

Известен способ создания живой вакцины за счет введения генов патогенных стрептококков в хромосомную ДНК пробиотического штамма Enterococcus faecium L3 для экспрессии в пилях, и живая вакцина на основе модифицированного штамма пробиотиков Enterococcus faecium L3 для профилактики инфекции, вызванной Streptococcus pneumonie [Суворов А.Н., Гупалова Т.В., Кулешевич Е.В., Леонтьева Г.Ф., Крамская Т.А, Патент РФ №2701733]. Недостатком указанного способа является сложность конструирования такой вакцины за счет большого количества стадий, необходимых для создания суммарного фрагмента ДНК, состоящего из двух отдельных фрагментов гена пробиотика Enterococcus faecium L3 и химерного гена Streptococcus pneumonie - pspf.

Упомянутый недостаток устраняется в способе создания живой вакцины за счет замены химерного гена Streptococcus pneumoniae - pspf на фрагмент гена sarsS методом клонирования, что сокращает время получения вакцины, а также позволяет создавать любые другие вакцинные кандидаты на этой платформе. [Суворов А.Н., Гупалова Т.В., Бормотова Е.А., Леонтьева Г.Ф., Крамская Т.А., Дешева Ю.А., 2021].

Существенно, что созданный вакцинный кандидат, предназначен для обеспечения специфической профилактики заболеваний, вызванных вирусом SARS-Cov-2, а не Streptococcus pneumoniae.

Ближайшим аналогом (прототипом) настоящего изобретения является способ создания живой вакцины L3-COVID-19 против коронавирусной инфекции SARS-Cov-2 на основе пробиотического штамма Enterococcus faecium L3 [Суворов А.Н., Гупалова Т.В., Бормотова Е.А., 2022].

Настоящее изобретение отличается тем, что был синтезирован другой фрагмент гена, кодирующего S-белок коронавируса SARS'ХВВ.1.5', в связи с появлением новых штаммов коронавируса.

Заявляемый способ реализуется следующим образом. Выбирают последовательности второго фрагмента гена S-белка коронавируса SARS-Cov-2 [Суворов А.Н., Гупалова Т.В., Бормотова Е.А., 2022] и заменяют аминокислоты, как показано ниже и затем синтезируют измененную последовательность.

В выбранной последовательности были изменены аминокислоты:

• F486P (фенилаланин -пролин), G на А и А на Т

• F484S (фенилаланин -серин), G на Т и G на С

• А3725Т (аланин-треонин) Т на С и Т на С.

• G446S (глицин-серин) Т на С.

Для клонирования использовали синтезированную последовательность фрагмента гена SARS'XBB.1.5', приведенную ниже:

Техническим результатом заявляемого изобретения является значительное упрощение способа получения живой вакцины против коронавирусной инфекции. Указанный технический результат достигается тем, что в способе создания живой вакцины против коронавирусной инфекции SARS-Cov-2 на основе пробиотического штамма Enterococcus faecium L3 (по патенту РФ №2220199), модифицированного в результате электропорации культуры энтерококков штамма Enterococcus faecium L3 рекомбинантной плазмидной ДНК pentF-pspf (нуклеотидная последовательность) (по патенту РФ №2701733), в соответствии с заявленным изобретением, в плазмиде pentF-sars'ХВВ.1.5', участок pspf заменен на фрагмент гена шиловидного белка SARS'XBB.1.5', при этом ДНК pentF-sars'XBB.1.5', кодирует аминокислотную последовательность, которая выполняет функцию шиповидного белка вируса SARS'XBB.1.5', способного осуществлять стимуляцию гуморального и клеточного иммунитета в отношении вируса SARS'XBB.1.5'.

При этом задача генетической части работы состояла в осуществлении интеграции участка ДНК вируса в структуру гена поверхностного белка пробиотика без нарушения открытой рамки считывания и повреждения участков кодирования компонентов, участвующих в процессинге поверхностного белка PilF.

В изобретении, использованном в качестве первого прототипа, согласно известному способу на основе штамма пробиотика Enterococcus faecium L3, была сконструирована генно-инженерная живая вакцина со встроенным в хромосому, в области, кодирующей ген пилей, участком химерного гена pspf сконструированного на основе генов патогенности Streptococcus pneumoniae. Штамм Enterococcus faecium L3-PSPF+ был получен в результате трансформации плазмидой pentF-pspf штамма Enterococcus faecium L3.

В изобретении, использованном в качестве второго прототипа, согласно известному способу на основе штамма пробиотика Enterococcus faecium L3, была сконструирована генно-инженерная живая вакцина со встроенным в хромосому, в области, кодирующей ген пилей, участком фрагмента гена SARS.

Штамм Enterococcus faecium, L3-SARS был получен в результате трансформации плазмидой pentF-sarsS штамма Enterococcus faecium L3.

При реализации заявленного способа создания кандидата живой вакцины на основе пробиотического штамма Enterococcus faecium L3 был использован другой синтезированный фрагмент ДНК шиловидного белка коронавируса, который был смоделирован авторами патента, а затем синтезирован компанией Евроген. При этом в плазмиде pentF-pspf участок гена pspf был заменен на фрагмент гена шиловидного белка вируса SARS'XBB.1.5'.

Таким образом, конечной технической задачей заявленного изобретения является создание кандидата живой вакцины на основе биологически активного штамма Enterococcus faecium L3 за счет замещения в структуре его гена пилей на участок гена коронавируса sars'XBB.1.5'. Создание кандидата такой вакцины против инфекции, вызываемой коронавирусом, основано на введении участка ДНК, кодирующего антигенный фрагмент иммуногенных эпитопов вируса SARS'XBB.1.5' в структуру гена пилей пробиотика.

Реализация указанной технической задачи поясняется конкретными примерами введения гена sars'XBB.1.5' коронавируса в хромосомную ДНК в области, кодирующей ген пилей пробиотического штамма L3 для экспрессии в пилях иммуногенного участка шиловидного белка SARS'XBB.1.5':

а) получение слитого гена entF -sars'XBB. 1.5' и его клонирование,

б) выявление бактериальных клонов, содержащих ген слитого белка L3-SARS'XBB.1.5' в хромосоме.

Конструирование кандидата живой вакцины на основе биологически активного пробиотического штамма Enterococcus faecium L3 за счет включения в его пили антигена SARS'XBB.1.5' позволило объединить в одном препарате эффективность полезных свойств пробиотика и специфического антигенного стимула.

Для получения слитого гена entF-sars'ХВВ.1.5' и его клонирования были сконструированы ДНК-праймеры, представленные в таблице 1, в которой в графе 1 приведены названия праймеров, в графе 2 приведена их ориентация по отношению к положительной цепочке ДНК, а в графе 3 приведены нуклеотидные последовательности, которые были сконструированы в соответствии с направлением цепочки ДНК последовательность от 5' к 3'.

Нуклеотидные последовательности в графе 3 с названиями (в графе 1), с участками, выделенными подчеркиванием, указывают на соответствующие им сайты гидролиза рестрикционными эндонуклеазами.

Фрагмент гена sars'XBB.1.5' был синтезирован с последующим клонированием в векторную плазмидную ДНК pAL2-T, фирмой Евроген. Для удобства последующего клонирования сайты рестрикции для NdEI и EcoRI были вставлены во фрагмент гена sars'XBB.1.5' при его синтезе.

Для настоящей конструкции была использована рекомбинантная плазмидная ДНК pentF-pspf, представляющая собой плазмидную ДНК, полученную в результате вставки суммарного фрагмента ДНК, состоящего из двух отдельных фрагментов гена пробиотика Enterococcus faecium L3 и фрагмента гена pspf описанная в предыдущей заявке на изобретение [патент РФ №2701733 «Создание живой вакцины на основе штамма пробиотиков Enterococcus faecium L3 для профилактики инфекции, вызванной Streptococcus pneumonie», (2018)].

Из плазмидной ДНК pentF-pspf удаляли вставку гена пневмококка pspf и заменяли ее на вставку гена sars'XBB.1.5'. Для этого плазмидную ДНК pentF-pspf гидролизовали ферментами NdEI и EcoRI, сайты для которых ограничивают последовательность гена pspf Такие же сайты рестрикции были заложены в синтезированный фрагмент гена sars'XBB.1.5'. Полученный верхний фрагмент после гидролиза был использован для дальнейшего клонирования. Плазмидная ДНК pAL2-T, содержащая фрагмент гена sarsS, была гидролизована ферментами NdEI и EcoRI. Клонирование рестрицированного фрагмента, кодирующего SARS'XBB.1.5', осуществляли, используя верхний фрагмент после гидролиза плазмиды pentF-pspf Продукты рестрикции разделяли с помощью электрофореза в 1% агарозном геле. ДНК рестрикты выделяли из агарозы с помощью набора «QIAquick Gel Extraction Kit» (Qiagen, USA), лигировали и трансформировали в гетерологичную систему E.coli DH5α. Среда для отбора содержала 500 мкг/мл эритромицина. В результате трансформации было получено 9 клонов. Из одного клона была выделена плазмидная ДНК. Наличие вставки подтверждалось гидролизом плазмиды ферментами NdEI и EcoRI (фиг. 1).

Продукты ПЦР плазмидной ДНК, полученные с праймерами pKR1 и pKR2 и SeqF и pKR2 были просеквенированы. Результаты сиквенса показали правильность последовательности плазмидной ДНК, которая содержала нужные фрагменты ДНК энтерококка и ДНК коронавируса (перечень нуклеотидной последовательности).

Таким образом, в результате клонирования были получена плазмида pentF-sars'XBB.1.5' с прогнозируемой вставкой и геном устойчивости к эритромицину.

В результате электропорации энтерококков созданной интегративной плазмидой было получено 5 трансформантов. Они были проверены в реакции ПЦР с праймерами pKR1 и pKR2. Для этого из трансформантов выделяли ДНК, используя набор ДНК-экспресс (Литех, Россия). Положительный ответ дали 4 трансформанта (фиг. 2).

Для определения интеграции плазмидной ДНК pentF-sars'XBB.1.5' в хромосомную ДНК энтерококка была проведена амплификация ДНК, выделенной из одного из положительных клонов с праймерами В1 и pKR2. У него была обнаружена интеграция плазмидной ДНК pentF-sars'XBB.1.5' в хромосомную ДНК энтерококка (фиг. 3). Секвенирование ДНК, выделенной из этого клона, обозначенного, как L3-SARS'XBB.1.5', было проведено с праймерами, соответствующими последовательности гена sars'XBB.1.5', (праймер pKR2) и последовательности хромосомной ДНК энтерококков (праймер В1) для подтверждения интеграции плазмидной ДНК pentF-sars'ХВВ.1.5' в хромосомную ДНК энтерококка (перечень нуклеотидной последовательности).

Клон L3-SARS'XBB.1.5', экспрессирующий ген L3-SARS'ХВВ.1.5' белка, выбран в качестве кандидата вакцинного препарата для дальнейшего исследования.

Ниже приведены конкретные примеры, подтверждающие экспериментально проведение стадий получения кандидата живой вакцины против коронавирусной инфекции

Пример 1. Синтез фрагмента ДНК коронавируса и его клонирование в плазмидный вектор pAL2-T

Рекомбинантная плазмидная ДНК pentF-pspf, представляющая собой плазмидную ДНК, полученную в результате вставки суммарного фрагмента ДНК, состоящего из двух отдельных фрагментов гена пробиотика Enterococcus faecium L3 и фрагмента гена pspf описанная в предыдущей заявке на патент RU 2701733(13) С1 «Создание живой вакцины на основе штамма пробиотиков Enterococcus faecium L3 для профилактики инфекции, вызванной Streptococcus pneumonie», (2018)] была использована для создания слитого гена entF-sars'XBB.1.5'. Для этого из плазмидной ДНК pentF-pspf вырезали вставку гена пневмококка pspf проведя гидролиз плазмидной ДНК pentF-pspf ферментами NdEI и EcoRI. Полученный верхний фрагмент после гидролиза был использован для дальнейшего клонирования.

Плазмидная ДНК pAL2-T, содержащая фрагмент гена sars'XBB.1.5', была гидролизована ферментами NdEI и EcoRI (фиг. 1). Клонирование рестрицированного фрагмента гена, кодирующего LS-SARS'XBB.l.5', осуществляли, используя верхний фрагмент после гидролиза плазмиды pentF-pspf. Продукты гидролиза рестрикционными эндонуклеазами были разделены с помощью электрофореза в 1% агарозном геле. ДНК гидролизаты выделяли из агарозы с помощью набора «QIAquick Gel Extraction Kit» (Qiagen, USA), лигировали и трансформировали в гетерологичную систему E.coli DH5α. Среда для отбора клонов E.coli с плазмидой содержала 500 мкг/мл эритромицина. В результате трансформации было получено 9 клонов. Из одного клона была выделена плазмидная ДНК. Наличие вставки подтверждалось гидролизом плазмиды ферментами NdEI и EcoRI (фиг. 1).

На фиг. 1 представлена электрофореграмма рестрицированных плазмид NdEI и EcoRI. На указанной иллюстрации цифрами обозначены:

1 - плазмидная ДНК pAL2-T, содержащая фрагмент гена sars"ХВВ.1.5"

2 - плазмидная ДНК pentF- 'ХВВ.1.5'.

3 - 100 п. н. ДНК - маркер (сверху вниз: 3000, 2000, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 и 100 нуклеотидных пар).

Пример 2. Трансформация энтерококков методом электропорации

Для электропорации энтерококков культуру Enterococcus faecium L3 сеяли в 3 мл бульона Tood-Hewitt (ТНВ) («HiMedia», Индия) и выращивали в течение ночи при 37°С, затем пересевали в 50 мл бульона ТНВ 1 мл ночной культуры и выращивали ее до оптической плотности 0.3. при длине волны 650 нм. После этого культуру помещали в лед и затем отмывали трижды в 20 мл 10% глицерола при температуре 4°С, полученный осадок суспендировали в 0.5 мл стерильного раствора глицерола, переосаждали и конечный осадок ресуспендировали в 0.3 мл того же раствора, разливали по 50 мкл в пробирки и проводили электропорацию в кювете с расстоянием между электродами 1 мм при напряжении 2100 В. Во льду к клеткам добавляли ДНК (полученную интегративную плазмиду pentF-sars'ХВВ.1.5', 300 нг). Оптимальная продолжительность импульса составила 4-5 миллисекунд. После проведения разряда тока в кювету добавляли 1 мл ТНВ, инкубировали 1 час и высевали на чашки с селективной средой, которая содержала 10 мкг/мл эритромицина. Затем ожидали появления трансформантов через 24 часа.

В результате электропорации энтерококков созданной интегративной плазмидой было получено 5 трансформантов. Они были проверены в реакции ПЦР с праймерами pKR1 и pKR2. Для этого из трансформантов выделяли ДНК, используя набор ДНК-экспресс (Литех, Россия). Положительный ответ дали 4 трансформанта (фиг. 2).

На фиг. 2 показана электрофореграмма амплифицированного ДНК-фрагмента с праймерами

1, 2, 3, 4, 5 - продукты ПЦР ДНК из полученных клонов.

6 - 100 п. н. ДНК - маркер (сверху вниз: 3000, 2000, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 и 100 нуклеотидных пар).

Была проведена амплификация ДНК, выделенного из одного из положительных клонов для определения интеграции плазмидной ДНК pentF-sars'XBB.1.5' в хромосомную ДНК энтерококка с праймерами В1 и pKR2. Интеграция плазмидной ДНК pentF-sars'ХВВ.1.5' в хромосомную ДНК энтерококка была обнаружена у отобранного трансформанта (фиг. 3).

На фиг. 3 представлена электрофореграмма амплифицированного ДНК-фрагмента с праймерами В1 и pKR2, где цифрами обозначены:

1 - продукт ПЦР ДНК из полученного 2 клона,

2 - 100 п. н. ДНК - маркер (сверху вниз: 3000, 2000, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 и 100 нуклеотидных пар).

Секвенирование ДНК, выделенной из положительного клона, обозначенного, как L3-SARS'XBB.1.5', было проведено с праймерами, соответствующими последовательности гена sars'XBB.1.5', (праймер pKR2) и последовательности хромосомной ДНК энтерококков (праймер В1) для подтверждения интеграции плазмидной ДНК pentF-sars'XBB.1.5' в хромосомную ДНК энтерококка (перечень нуклеотидной последовательности).

На фиг.4 показана нуклеотидная последовательность, показывающая интеграцию плазмидной ДНК pentF-sars'XBB.1.5' в хромосомную ДНК энтерококка. Последовательности праймеров В1 и pKR2 выделены подчеркиванием.

Этот клон энтерококков, L3-SARS'XBB.1.5', экспрессирующий ген sars'XBB.1.5', белка коронавируса, выбран в качестве кандидата вакцинного препарата для дальнейшего исследования.

Изобретения относятся к области молекулярной генетики и биотехнологии. Предложен способ создания рекомбинантного штамма энтерококка L3-SARS"XBB.1.5" путем электропорации культуры энтерококков Enterococcus faecium L3 рекомбинантной плазмидной ДНК pentF-sars"XBB.1.5", полученной из плазмидной ДНК pentF-pspf, в которой удалили вставку гена пневмококка pspf и заменили ее на вставку гена sars"XBB.1.5". Также представлена рекомбинантная плазмида pentF-sars"XBB.1.5". Изобретения могут быть использованы для получения вакцины против коронавирусной инфекции. 2 н.п. ф-лы, 4 ил., 1 табл., 2 пр.

1. Способ создания рекомбинантного штамма энтерококка L3-SARS"XBB.1.5" на основе биологически активного штамма Enterococcus faecium, отличающийся тем, что проводят электропорацию культуры энтерококков Enterococcus faecium L3 рекомбинантной плазмидной ДНК pentF-sars"XBB.1.5", полученной из плазмидной ДНК pentF-pspf, в которой удалили вставку гена пневмококка pspf и заменили ее на вставку гена sars"XBB.1.5", имеющего нуклеотидную последовательность:

GCATTGCATATGGATTATTCTGTCCTATATAATTCCACTTCATTTTCCACTTTTAAGTGTTATGGAGTGTCTCCTACTAAATTAAATGATCTCTGCTTTACTAATGTCTATGCAGATTCATTTGTAATTAGAGGTGATGAAGTCAGACAAATCGCTCCAGGGCAAACTGGAAACATTGCTGATTATAATTATAAATTACCAGATGATTTTACAGGCTGCGTTATAGCTTGGAACTCTAACAATCTTGATTCTAAGGTTTCTGGTAATTATAATTACCTGTATAGATTGTTTAGGAAGTCTAATCTCAAACCTTTTGAGAGAGATATTTCAACTGAAATCTATCAGGCCGGTAGCACACCTTGTAATGGTGTTAAAGGTCCTAATTGTTACTCTCCTTTACAATCGTATGGTTTCCAACCCACTTATGGTGTTGGTTACCAACCATACAGAGTAGTAGTACTTTCTTTTGAACTTCTACATGCACCAGCAACTGTTTGTGGACCTAAAAAGTCTACTAATTTGGAATTCTACGA,

и выбирают клон энтерококка L3-SARS"XBB.1.5", содержащий вставку гена sars"XBB.1.5", продуктом экспрессии которого является белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью:

ALHMDYSVLYNSTSFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVSGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGPNCYSPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLEFY.

2. Рекомбинантная плазмида pentF-sars"XBB.1.5", полученная из плазмидной ДНК pentF-pspf, в которой удалили вставку гена пневмококка pspf и заменили ее на вставку гена sars"XBB.1.5", имеющего нуклеотидную последовательность:

GCATTGCATATGGATTATTCTGTCCTATATAATTCCACTTCATTTTCCACTTTTAAGTGTTATGGAGTGTCTCCTACTAAATTAAATGATCTCTGCTTTACTAATGTCTATGCAGATTCATTTGTAATTAGAGGTGATGAAGTCAGACAAATCGCTCCAGGGCAAACTGGAAACATTGCTGATTATAATTATAAATTACCAGATGATTTTACAGGCTGCGTTATAGCTTGGAACTCTAACAATCTTGATTCTAAGGTTTCTGGTAATTATAATTACCTGTATAGATTGTTTAGGAAGTCTAATCTCAAACCTTTTGAGAGAGATATTTCAACTGAAATCTATCAGGCCGGTAGCACACCTTGTAATGGTGTTAAAGGTCCTAATTGTTACTCTCCTTTACAATCGTATGGTTTCCAACCCACTTATGGTGTTGGTTACCAACCATACAGAGTAGTAGTACTTTCTTTTGAACTTCTACATGCACCAGCAACTGTTTGTGGACCTAAAAAGTCTACTAATTTGGAATTCTACGA,

и предназначенная для получения клона энтерококка L3-SARS"XBB.1.5", содержащего вставку гена sars"XBB.1.5", продуктом экспрессии которого является белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью:

ALHMDYSVLYNSTSFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVSGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGPNCYSPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLEFY.