СПОСОБ И СРЕДСТВО ДЛЯ БЫСТРОГО ОБНАРУЖЕНИЯ ИНФЕКЦИЙ ВИРУСА ГЕПАТИТА D Российский патент 2023 года по МПК C07K14/02 G01N33/576 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к полипептиду и нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид, для применения в способе обнаружения присутствия вируса гепатита D (HDV) и/или диагностики инфекции HDV, и/или контроля лечения инфекции HDV. Настоящее изобретение также относится к способу in vitro, иммунографическому устройству тестирования, а также к комплекту.

В частности, настоящее изобретение относится к диагностике инфекций HDV по месту лечения.

Уровень техники

Хронические инфекции, вызванные вирусом гепатита дельта (HDV), представляют собой наиболее тяжелую форму вирусного гепатита, ведущую к циррозу и гепатоцеллюлярной карциноме. HDV – это сопутствующий вирус вируса гепатита B (HBV), что означает, что все пациенты, хронически инфицированные HDV, всегда также инфицированы HBV. Во всем мире 250 миллионов человек хронически инфицированы вирусом гепатита В, из которых около 20 миллионов также инфицированы вирусом HDV.

Согласно руководствам, каждый инфицированный вирусом гепатита В человек должен быть проверен на сочетанное инфицирование HDV, так как сочетанное инфицирование HDV значительно ухудшает исход болезни и влечет изменение режимов лечения. На практике, однако, последние исследования показывают, что только 8% (США), 35% (Греция) или 40% (Великобритания) HBV-положительных пациентов проходят тестирование на сочетанное инфицирование HDV (Lempp and Urban, 2017). Причины нежелания проводить тестирование: (1) трудоемкие, длительные по времени и дорогостоящие диагностические тесты, (2) неосведомленность врачей об инфекциях HDV, (3) отсутствие вариантов лечения для людей, инфицированных HDV.

Причины (2) и (3) исчезнут в ближайшем будущем, поскольку агентства по финансированию научных исследований, фармацевтические компании и федеральные учреждения, такие как FDA (Управление США по надзору за качеством пищевых продуктов и лекарственных средств) и EMA (Европейское агентство по лекарственным средствам), признали необходимость улучшения лечения хронических инфекций HBV и HDV, и появляются новые варианты лечения.

В настоящее время проводят исследования трех новых препаратов в рамках исследований фазы II на пациентах с хронической инфекцией HDV. Первый препарат, лонафарниб, перорально вводимый ингибитор пренилирования, предотвращающий выход оболочечных частиц HDV (Koh et al., 2015; Yurdaydin et al., 2015; Koh et al., 2014). Второй препарат, полимеры нуклеиновых кислот, такие как REP2139-Ca, которые вводят внутривенно и которые, как было описано, влияют на HBsAg, но он предположительно проявляет дополнительные механизмы действия (Bazinet et al., 2015; Poutay et al., 2015; Bazinet et al., 2015-2; Vaillant et al., 2016). И третий препарат, Мирклудекс Б (булевиртид), подкожно доставляемый миристоилированный 47-мерный липопептид, производный от L-HBsAg, который был разработан авторами настоящего изобретения и который необратимо блокирует рецептор NTCP (натрий-таурохолат котранспортирующего полипептида) HDV (и HBV), тем самым предотвращая de novo образование РНК- и кзкДНК HDV в наивных и регенерирующих гепатоцитах (Bogomolov et al., 2016; Blank et al., 2016; Urban et al., 2014). Все три лекарственных средства оценивают по отдельности или в комбинации с pegIFNα и/или аналогами нуклеотидов, такими как тенофовир. В ответ на безотлагательную медицинскую потребность в новых препаратах от хронического гепатита D, лонафарнибу и Мирклудексу Б Европейским агентством по лекарственным средствам (EMA) и Управлением США по надзору за качеством пищевых продуктов и лекарственных средств (FDA) был присвоен статус орфанных препаратов. В 2015 году FDA присвоил лонафарнибу «статус ускоренной процедуры рассмотрения заявки». В мае 2017 года EMA присвоил Мирклудексу Б «статус соответствия приоритетного медикамента».

Существует обоснованная надежда, что один или несколько из этих по-прежнему экспериментальных способов лечения будут одобрены в ближайшем будущем, в медицинской сфере возникнет потребность в быстром и удобном тестировании на инфекцию HDV.

Раскрытие изобретения

Согласно настоящему изобретению эта задача решается с помощью полипептида, содержащего или состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO. 1 или SEQ ID NO. 2.

Согласно настоящему изобретению эта задача решается с помощью полипептида, содержащего или состоящего из аминокислотной последовательности, содержащей или состоящей из аминокислотных остатков 1-195 последовательностей SEQ ID NO. 1 или 2.

Согласно настоящему изобретению эта задача решается с помощью полипептида, содержащего или состоящего из аминокислотной последовательности, содержащей или состоящей из аминокислотных остатков 60-214 последовательностей SEQ ID NO. 1 или 2.

Согласно настоящему изобретению эта задача решается с помощью полипептида, содержащего или состоящего из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID NO. 1.

Согласно настоящему изобретению эта задача решается с помощью нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид по настоящему изобретению.

Согласно настоящему изобретению эта задача решается с помощью применения полипептида по настоящему изобретению или нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению в способе обнаружения присутствия вируса гепатита D (HDV) и/или диагностики инфекции HDV, и/или контроля лечения инфекции HDV.

Согласно настоящему изобретению эта задача решается способом in vitro обнаружения присутствия вируса гепатита D (HDV) и/или диагностики инфекции HDV, и/или контроля лечения инфекции HDV в образце пациента, при этом указанный способ включает в себя

обеспечение полипептида по настоящему изобретению; и

обнаружение антител к антигену гепатита дельта (HDAg) в указанном образце.

Согласно настоящему изобретению эта задача решается с помощью иммунографического устройства для обнаружения in vitro присутствия вируса гепатита D (HDV) в образце пациента, диагностики инфекции HDV и/или контроля лечения инфекции HDV, где указанное устройство содержит твердый носитель, покрытый средством, связывающим антитело IgG к HDV,

причем средством, связывающим антитело IgG к HDV, является полипептид по настоящему изобретению.

Согласно настоящему изобретению эта задача решается с помощью комплекта для обнаружения in vitro присутствия вируса гепатита D (HDV) в образце пациента, диагностики инфекции HDV и/или контроля лечения инфекции HDV, при этом указанный комплект включает в себя:

а) иммунографическое устройство по настоящему изобретению; и

b) инструкции по использованию иммунографического устройства для обнаружения присутствия в образце указанных антител IgG к HDV.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1. Схематическое изображение вирионов HBV и HDV.

Фиг. 2. Дизайн консенсусной последовательности L-HDAg.

Фиг. 3. Дизайн конструкции для рекомбинантного HDAg.

Фиг. 4. Макет проведения ИХА по изобретению: прямой ИХА на антитела к HDAg.

Фиг. 5. Сборка для ИХА по изобретению.

Фиг. 6. Выполнение ИХА по изобретению.

Фиг. 7. Скрининг 16 инфицированных и 6 здоровых пациентов при помощи ИХА по изобретению.

Фиг. 8. Макет мультиплексного ИХА с одновременным обнаружением HBsAg и антител к HDAg.

Фиг. 9. Выполнение мультиплексного ИХА с одновременным обнаружением HBsAg и антител к HDAg.

Фиг. 10. Характеризация валидационных образцов.

Фиг. 11. Валидация анализа.

Фиг. 12. Анализ сывороток с различными серотипами HDV.

Осуществление изобретения

Прежде чем более подробно описывать настоящее изобретение, следует понять, что настоящее изобретение не ограничивается частной методологией, протоколами и реагентами, описанными в настоящем документе, так как они могут отличаться от описанных. Также следует понимать, что применяемая в настоящем описании терминология использована только для описания частных вариантов изобретения и не предназначена для ограничения объема настоящего изобретения, который будет ограничен только прилагаемой формулой изобретения. Если не определено иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют значение, обычно понимаемое специалистом с обычной квалификацией в данной области техники. Для целей настоящего изобретения все цитируемые в настоящем описании литературные источники включены посредством ссылки во всей их полноте.

Концентрации, количества и другие числовые данные в настоящем описании могут быть выражены или представлены в формате диапазона. Следует понимать, что такой формат диапазона используется просто для удобства и краткости и, таким образом, его следует гибко толковать таким образом, что он включает в себя не только числовые значения, прямо указанные как пределы диапазона, но также включает в себя все отдельные числовые значения или поддиапазоны, входящие в этот диапазон, как если бы каждое числовое значение и поддиапазон были прямо указаны. Например, числовой диапазон от «1 до 21» следует толковать таким образом, что данный диапазон включает в себя не только явно указанные значения от 1 до 21, но также включает в себя отдельные значения и поддиапазоны в рамках указанного диапазона. Таким образом, в этот числовой диапазон входят отдельные значения, такие как 1, 2, 3, 4, 5…. 17, 18, 19, 20, 21, и поддиапазоны, такие как от 2 до 10, от 8 до 15 и т.д. Этот же принцип применяется к диапазонам, содержащим только одно числовое значение, например «не менее 90%». Кроме того, такое толкование должно применяться независимо от ширины диапазона или описываемых характеристик.

Консенсусная последовательность HDAg

Как указано выше, в настоящем изобретении предложена синтетическая консенсусная последовательность антигена гепатита дельта (HDAg).

В настоящем изобретении предложен полипептид, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO. 1 или SEQ ID NO. 2.

SEQ ID NO. 1 Синтетическая последовательность HDAg (консенсусная), 214 аминокислот

1 MSRSESKKNR GGREEILEQW VSGRKKLEDL ERDLRKVKKK IKKLEDENPW LGNIKGILGK

61 KDKDGEGAPP AKRARTDQME VDSGPRKRPL RGGFTDKERQ DHRRRKALEN KKKQLSAGGK

121 NLSKEEEEEL RRLTEEDERR ERRVAGPRVG GVNPLEGGPR GAPGGGFVPS MQGVPESPFT

181 RTGEGLDIRG NQGFPWDILF PADPPFSPQS CRPQ

SEQ ID NO. 2 Синтетическая последовательность HDAg (консенсусная) с гистидиновой меткой для рекомбинантной экспрессии, 222 аминокислоты

1 MSRSESKKNR GGREEILEQW VSGRKKLEDL ERDLRKVKKK IKKLEDENPW LGNIKGILGK

61 KDKDGEGAPP AKRARTDQME VDSGPRKRPL RGGFTDKERQ DHRRRKALEN KKKQLSAGGK

121 NLSKEEEEEL RRLTEEDERR ERRVAGPRVG GVNPLEGGPR GAPGGGFVPS MQGVPESPFT

181 RTGEGLDIRG NQGFPWDILF PADPPFSPQS CRPQHHHHHH HH

В настоящем изобретении предложен полипептид, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID NO. 1.

Полипептид по настоящему изобретению также содержит полипептиды, содержащие или состоящие из аминокислотной последовательности SEQ ID NO. 1 (или SEQ ID NO. 2), имеющие различия в одном, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти, 11, 12, 13, 14 и до 21 положения аминокислот.

Например, полипептид с разными аминокислотами в двух положениях аминокислотной последовательности SEQ ID NO. 1 означает полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, которая на 99% идентична последовательности SEQ ID NO. 1.

Например, полипептид с разными аминокислотами в одиннадцати положениях аминокислотной последовательности SEQ ID NO. 1 означает полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, которая на 95% идентична последовательности SEQ ID NO. 1.

Например, полипептид с разными аминокислотами в 21 положении аминокислотной последовательности SEQ ID NO. 1 означает полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, которая на 90% идентична последовательности SEQ ID NO. 1.

В настоящем изобретении предложен полипептид, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID NO. 1.

В настоящем изобретении предложен полипептид, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности, содержащей или состоящей из аминокислотных остатков 1-195 последовательностей SEQ ID NO. 1 или 2.

В настоящем изобретении предложен полипептид, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности, содержащей или состоящей из аминокислотных остатков 60-214 последовательностей SEQ ID NO. 1 или 2.

Как указано выше, в настоящем изобретении предложен полипептид, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из

аминокислотной последовательности SEQ ID NO. 1 или SEQ ID NO. 2,

аминокислотной последовательности, содержащей или состоящей из аминокислотных остатков 1-195 последовательностей SEQ ID NO. 1 или 2,

аминокислотной последовательности, содержащей аминокислоты, содержащие или состоящие из аминокислотных остатков 60-214 последовательностей SEQ ID NO. 1 или 2, или

аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID NO. 1.

Как указано выше, в настоящем изобретении предложена нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид по настоящему изобретению.

Авторы настоящего изобретения разработали синтетическую консенсусную последовательность путем компьютерного моделирования для всех генотипов HDV.

К настоящему времени описано восемь генотипов HDV (HDV-1 – HDV-8) с дивергенцией <20% в пределах одного генотипа и дивергенцией до 35% между различными генотипами. Различные генотипы имеют различное географическое распространение: генотип 1 распространен по всему миру, генотип 2 присутствует в основном в Азии, генотип 3 встречается исключительно в регионе Амазонки в Южной Америке, генотип 4 был обнаружен на Тайване, генотипы 5-8 преобладают в Западной и Центральной Африке.

Абсолютно необходимо, чтобы новая диагностика могла надежно обнаруживать инфекции HDV всех 8 генотипов, поэтому в настоящем изобретении описана синтетическая последовательность L-HDAg, которая включает все 8 генотипов.

HDAg по изобретению применим ко всем генотипам.

Медицинское использование

Как указано выше, в настоящем изобретении предложен полипептид по настоящему изобретению или нуклеиновая кислота по настоящему изобретению для использования в способе обнаружения присутствия вируса гепатита D (HDV) и/или диагностики инфекции HDV, и/или контроля лечения инфекции HDV.

В предпочтительном варианте антитела к антигену гепатита дельта (HDAg) обнаруживают в образце пациента.

Указанными антителами к HDAg являются антитела IgG.

В предпочтительном случае образцом является сыворотка, плазма, цельная кровь или слюна.

В предпочтительном случае полипептид или нуклеиновую кислоту используют в иммунографическом устройстве тестирования, например, устройстве для иммунохроматографического анализа на тест-полосках (ИХА), которое в предпочтительном случае является устройством для использования по месту лечения.

В предпочтительном случае могут быть обнаружены HDV и инфекции HDV всех генотипов.

В одном варианте обнаруживают дополнительные инфекции, например, инфекцию HBV.

Способ обнаружения

Как указано выше, в настоящем изобретении предложен способ in vitro для обнаружения присутствия вируса гепатита D (HDV) и/или диагностики инфекции HDV, и/или контроля лечения инфекции HDV в образце пациента.

Способ по настоящему изобретению основан на обнаружении присутствия антител к HDV.

Указанный способ включает в себя:

получение полипептида по настоящему изобретению; и

обнаружение антител к антигену гепатита дельта (HDAg) в указанном образце.

В предпочтительном случае указанный способ представляет собой способ обнаружения по месту лечения или тестирование по месту лечения.

При использовании в настоящем описании «Тестирование по месту лечения» (Point-of-care testing, POCT) означает медицинское диагностическое тестирование по месту лечения или рядом с ним, то есть во время и в месте оказания пациенту медицинской помощи.

Тесты по месту лечения – это простые медицинские тесты, которые можно выполнять, например, у постели пациента. Основная концепция POCT заключается в том, чтобы удобно доставить тест непосредственно к пациенту. Это увеличивает вероятность того, что пациент, врач и медицинская бригада быстрее получат результаты, что позволит немедленно принять более правильные решения по клиническому ведению пациента.

Тесты и способы, применяемые по месту лечения, известны в данной области техники. Это, например, диагностические экспресс-тесты, такие как тесты на выявление антигена малярии.

Основная концепция POCT заключается в том, чтобы удобно доставить тест непосредственно к пациенту. Это увеличивает вероятность того, что пациент, врач и медицинская бригада быстрее получат результаты, что позволит немедленно принять более правильные решения по клиническому ведению пациента.

POCT часто выполняют при помощи переносных, портативных и ручных инструментов и тестовых наборов. Цель состоит в том, чтобы осуществить забор образца и получить результаты за очень короткий период времени в месте нахождения пациента или рядом с ним, чтобы можно было при необходимости скорректировать план лечения до ухода пациента.

Многие диагностические системы, используемые по месту лечения, выполнены в виде простых в использовании тест-полосок на мембранной основе, часто вставленных в пластиковую тест-кассету. Эту концепцию часто реализуют в тест-системах для обнаружения патогенов.

В предпочтительном случае образцом является сыворотка, плазма, цельная кровь или слюна.

В предпочтительном случае могут быть обнаружены HDV и инфекции HDV всех генотипов.

В одном варианте обнаруживают дополнительные инфекции, например, инфекцию HBV.

Тестовое устройство и комплект

Как указано выше, в настоящем изобретении предложено иммунографическое устройство.

Указанное иммунографическое устройство предназначено для обнаружения in vitro присутствия вируса гепатита D (HDV) в образце пациента, диагностики инфекции HDV и/или контроля лечения инфекции HDV.

Указанное иммунографическое устройство содержит твердый носитель, покрытый средством, связывающим антитела IgG к HDV.

В предпочтительном случае средством, связывающим антитело IgG к HDV, является полипептид по настоящему изобретению.

В предпочтительном варианте иммунографическое устройство содержит пористую мембрану, функционально соединенную с

(a) частью/пластиной образца,

(b) частью/пластиной конъюгата,

(c) частью/линией тестирования, содержащей указанное средство, связывающее антитело IgG к HDV,

(d) частью/линией контроля; и

(e) частью/пластиной абсорбента.

В предпочтительном случае иммунографическим устройством является устройство для иммунохроматографического анализа (ИХА), которое в более предпочтительном случае является устройством для использования по месту лечения.

Иммунохроматографические анализы на тест-полосках и соответствующие устройства известны из уровня техники. ИХА также можно назвать иммуноанализом, также известным как иммунохроматографический анализ или анализ на тест-полосках. Иммунохроматографические анализы на тест-полосках, как правило, представляют собой иммуноанализы с возможностью работать вдоль одной оси в соответствии с форматом тест-полосок. Стандартная полоска для иммунохроматографического экспресс-теста состоит из следующих компонентов:

Пластина для образца – адсорбирующая пластина, на которую наносят исследуемый образец.

Пластина с конъюгатом или реагентом – содержит антитела, специфичные к целевому аналиту, конъюгированные с окрашенными частицами (обычно наночастицами коллоидного золота или латексными микросферами).

Реакционная мембрана – обычно мембрана из нитроцеллюлозы или ацетата целлюлозы, на которой иммобилизованы вещества, связывающие аналиты (такие как антитела против целевых аналитов), в линии, которая пересекает мембрану, действуя как зона захвата или линия тестирования (также будет выполнена контрольная зона, содержащая антитела, специфичные для антител конъюгата).

Впитывающий или сбросовый резервуар – дополнительная пластина абсорбента, предназначенная для протягивания образца через реакционную мембрану за счет капиллярного действия и для забора этого образца.

Компоненты полоски обычно прикреплены к инертному материалу подложки и могут быть представлены в формате простой мерной индикаторной полоски или в пластиковом корпусе с отверстием для образца и окном реакции, в котором видны зоны захвата и контроля.

В предпочтительном случае образцом является сыворотка, плазма, цельная кровь или слюна.

В предпочтительном случае могут быть обнаружены HDV и инфекции HDV всех генотипов.

В одном варианте обнаруживают дополнительные инфекции, например, инфекцию HBV.

В одном варианте часть/пластина для конъюгата содержит маркер обнаружения, которым в предпочтительном случае является коллоидный металл, такой как золото, или латексные гранулы.

В одном варианте маркер обнаружения прямо или косвенно связан с антителом, например, антителом к антителам человеческого происхождения, или с белком, связывающим антитело, например, белком A или белком G.

В одном варианте часть/линия контроля содержит агент связывания с маркером обнаружения или фрагментом, несущим маркер обнаружения.

Как указано выше, в настоящем изобретении предложен комплект для обнаружения in vitro присутствия вируса гепатита D (HDV) в образце пациента, диагностики инфекции HDV и/или контроля лечения инфекции HDV.

Указанный комплект включает в себя:

а) иммунографическое устройство по настоящему изобретению; и

b) инструкции по использованию иммунографического устройства для обнаружения присутствия в образце указанных антител IgG к HDV.

В предпочтительном случае образцом является сыворотка, плазма, цельная кровь или слюна.

В предпочтительном случае могут быть обнаружены HDV и инфекции HDV всех генотипов.

В одном варианте обнаруживают дополнительные инфекции, например, инфекцию HBV.

Предпочтительные варианты

Вирус гепатита дельта (HDV) человека уникален среди всех вирусных патогенов. Кодирующий только один белок (антиген гепатита дельта; HDAg) в своей вироидоподобной самокомплементарной РНК, HDV представляет собой наименьший по размерам вирус, известный в животном мире. Для распространения в хозяине HDV необходим вспомогательный вирус – вирус гепатита B (HBV) человека, который создает оболочечные белки, необходимые для сборки HDV (см. фигуру 1). HDV поражает примерно 15-20 миллионов из 240 миллионов хронических носителей HBV и неравномерно распространен в различных географических регионах мира. Вызываемое им заболевание (хронический гепатит D) представляет собой наиболее тяжелую форму вирусного гепатита, которая приводит к ускоренному прогрессированию дисфункции печени, включая цирроз и гепатоцеллюлярную карциному, а также к высокому уровню смертности. Из-за отсутствия одобренных лекарственных средств, препятствующих реализации определенных этапов репликации HDV, трудно понять молекулярную биологию вируса и, следовательно, разработать специфические новые лекарственные средства, которые надежно контролируют репликацию HDV или, в лучшем случае, функционально излечивают инфекцию HDV или сочетанную инфекцию HBV/HDV.

В настоящем изобретении раскрыты решения для преодоления причины (1) – нежелания выполнять тестирование, рассмотренного в настоящем описании, а именно, вследствие того, что существующие на настоящий момент диагностические тесты трудоемкие, длительные по времени и имеют высокую стоимость. Первичную диагностику инфекции HDV выполняют путем обнаружения антител к антигену гепатита дельта (HDAg) в сыворотке крови инфицированных пациентов. Такое обнаружение HDAg-специфических антител в настоящее время выполняют при помощи ручных иммуносорбентных ферментных анализов (ELISA) (предлагаемых лишь очень небольшим количеством компаний по всему миру). Анализ проводится в течение длительного времени (приблизительно 4 часа на анализ), требует наличия полного лабораторного оборудования (например, планшет-ридера) и обученного персонала. Таким образом, диагностику можно выполнять только в центральной лаборатории крупного учреждения, но не по месту лечения.

В нашем изобретении описано устройство для экспресс-тестирования по месту лечения для обнаружения антител к HDAg в сыворотке или даже цельной крови пациентов. Тест основан на методе иммунохроматографического анализа (ИХА), который наиболее широко известен из тестов на беременность (см. фигуру 4).

Для специфического обнаружения антител к HDAg в нашем изобретении использован рекомбинантно экспрессируемый белок HDAg, который основан на искусственной консенсусной последовательности всех генотипов HDV. В мире существует 8 различных генотипов HDV, распространенных в различных географических регионах. При помощи данной синтетической консенсусной конструкции наш ИХА может обнаруживать инфекции HDV всех генотипов и, следовательно, может использоваться во всем мире. В качестве альтернативы мы можем иммобилизовать специфические пептиды, которые были идентифицированы как основные антигенные эпитопы.

Основные преимущества нашего изобретения по сравнению с современными средствами диагностики инфекции HDV:

(1) Быстрый анализ: время анализа менее 30 минут по сравнению с 4 часами в случае использования ручного анализа ELISA.

(2) Простота использования. Не требуется лабораторное оборудование или квалифицированный персонал. Необходимо только нанести на тест-полоску несколько капель сыворотки или цельной крови и подождать 5-10 мин. Благодаря этому, наш анализ ИХА может быть использован во врачебной практике («niedergelassener Arzt») или даже для полевых исследований в отдаленных регионах.

(3) Низкие затраты на производство: в то время как традиционный ручной анализ ELISA стоит около 7 евро за тест, обычные производственные цены составляют около 1 евро за тест-полоску ИХА.

(4) Специфичность для всех генотипов: синтетическая конструкция HDAg разработана как консенсусная последовательность всех генотипов, и, таким образом, тест позволяет диагностировать инфекции всех генотипов. HDAg по изобретению применим ко всем генотипам.

(5) Была создана коллекция образцов сыворотки всех генотипов, и анализ был валидирован.

Анализ характеризуется высокой чувствительностью (94,6%) и высокой специфичностью (100%).

(6) Сочетание теста на обнаружение антител к HDAg с тестом на обнаружение антител HBsAg HBV для одновременного обнаружения инфекции HBV и HDV на одной тест-полоске ИХА (как мультиплексной полоске).

Тест на определение HDV по месту лечения по настоящему изобретению позволяет легко и надежно диагностировать инфекцию HDV в больницах и кабинетах врачей, а также в отдаленных регионах или при эпидемиологических полевых исследованиях.

Следующие примеры и чертежи иллюстрируют настоящее изобретение, но не ограничивают его данными примерами и чертежами.

Фиг. 1. Схематическое изображение вирионов HBV и HDV.

Геном РНК HDV упакован в виде рибонуклеопротеина вместе с антигеном гепатита дельта (HDAg). Оба вириона имеют одни и те же оболочечные белки, S-, M- и L-HBsAg. L-HBsAg состоит из S-HBsAg с двумя элонгациями на N-конце: preS2 и preS1, миристоилированный на N-конце. Из Lempp and Urban, 2017.

Фиг. 2. Дизайн консенсусной последовательности L-HDAg.

Множественное выравнивание последовательностей L-HDAg из нескольких изолятов всех восьми генотипов HDV рассчитали с помощью программного обеспечения VectorNTI и данных секвенирования, представленных в базе данных Национального центра биотехнологической информации (NCBI). Консенсусную последовательность определили на основании множественного выравнивания последовательностей.

Фиг. 3. Дизайн конструкции для рекомбинантного HDAg.

A, Дизайн конструкции для бактериальной экспрессии рекомбинантного HDAg. Гистидиновая метка присоединена к белку на С-конце. Также показана консенсусная последовательность.

B, Анализ бактериальной экспрессии и очистка конструкции электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE).

Белок экспрессировали в E. coli (1). Бактерии лизировали методом микрофлюидизации. Лизат ультрацентрифугировали, и тельца-включения, содержащие рекомбинантный L-HDAg, повторно растворили в 8 М мочевине (3). Белок очистили при помощи аффинной хроматографии на никеле и элюировали линейным градиентом имидазола.

C, Краткое описание, показывающее развитие рекомбинантного HDAg всех генотипов.

D, окрашенные Кумасси образцы в геле SDS до (слева) и после (справа) очистки. Все три полосы белка после очистки представляют HDAg, определенного масс-спектрометрией.

E, Тестирование на антигенность в ELISA.

Очищенный L-HDAg или бычий сывороточный альбумин (БСА) нанесли на планшеты для ELISA и инкубировали с (A) сывороткой пациента с сочетанной инфекцией HBV/HDV с увеличением разведений, начиная с 1:1000000, или (B) двумя сыворотками пациентов с сочетанной инфекцией HBV/HDV или сывороткой здорового пациента (отрицательный контроль), все в разведении 1: 2000. После промывки планшеты инкубировали с меченным пероксидазой хрена вторичным антителом против антител человеческого происхождения и ферментативную реакцию запустили путем инкубации с ТМБ субстратом. Все положительные сыворотки пациентов интенсивно реагировали с покрытым L-HDAg, но не с БСА, при этом сыворотка отрицательного пациента не реагировала с обоими антигенами. Отметим, что положительная сыворотка № 3 получена от пациента с сочетанной инфекцией HBV/HDV с отрицательной вирусемией HDV, которая, следовательно, показывает меньшее количество антител к HDV, но все еще высоко реагирует на L-HDAg.

Фиг. 4. Макет проведения ИХА по изобретению: прямой ИХА на антитела к HDAg.

A, Показан макет проведения ИХА. Отметим, что в ИХА, показанном на макете, обнаруживают аналит при помощи антител, при этом в настоящем изобретении обнаруживают антитела к HDAg при помощи иммобилизованного антигена.

B, Сыворотку пациента, содержащую антитела к HDAg, помещают на пластину для образца (слева). На пластине для конъюгата все антитела человеческого происхождения представляют собой меченные золотом антитела к белкам человека или меченные золотом антитела к белку А. Специфические к HDAg антитела связываются с рекомбинантным HDAg на линии тестирования и дают положительный сигнал. Другие неспецифические к HDAg антитела человеческого происхождения мигрируют в линию контроля, где антитело связывается с меченным золотом антителом конъюгата и образует линию контроля, показывающую достоверность теста.

Фиг. 5. Сборка для ИХА по изобретению.

Пластины для образца и конъюгата предварительно обрабатывают буфером, содержащим блокирующий агент (например, БСА) и поверхностно-активное вещество (например, Полисорбат-20). Предварительно обработанные пластины для конъюгата загружают конъюгатом в буфере с высоким содержанием сахара (например, 20% сахарозы). Наносят линии тестирования и контроля на мембрану, которую затем блокируют и высушивают. ИХА собирают на пластиковой подложке, разрезают на полоски 0,4 см и помещают в пластиковый корпус.

Фиг. 6. Выполнение ИХА по изобретению

ИХА выполняли с сывороткой пациента с сочетанной инфекцией HBV/HDV (положительной, слева) или здорового пациента (отрицательной, справа), или с различными разведениями сыворотки пациента с сочетанными инфекциями с использованием сыворотки здорового пациента в качестве разбавителя (по центру). Изображение выполнено через 10 минут после начала выполнения. Верхняя красная линия представляет собой линию контроля, нижняя линия представляет собой линию тестирования, обнаруживающую антитела к HDAg. Отметим, что даже при разведении 1:100 на линии тестирования виден четкий сигнал, который полностью отсутствует в сыворотке здорового пациента.

Фиг. 7. Скрининг 16 инфицированных и 6 здоровых пациентов при помощи ИХА по изобретению.

ИХА выполняли с сывороткой 16 пациентов с сочетанной инфекцией HBV/HDV (положительные A1-A16) и 6 здоровых пациентов (отрицательные B1-B6). Изображение выполнено через 10 минут после начала выполнения.

Фиг. 8. Макет мультиплексного ИХА с одновременным обнаружением HBsAg и антител к HDAg.

Макет мультиплексного ИХА аналогичен макету ИХА с обнаружением антител к HDAg по настоящему изобретению (фиг. 4B) с добавлением второй линии тестирования с иммобилизованными антителами к HBsAg и второго антитела к HBsAg, связанного с наночастицами золота на пластине конъюгата (оба антитела к HBsAg относятся к разным клонам).

Фиг. 9. Выполнение мультиплексного ИХА с одновременным обнаружением HBsAg и антител к HDAg.

Мультиплексный ИХА выполняли с сывороткой пациента с одной инфекцией HBV (слева), пациента с сочетанной инфекцией HBV/HDV (по центру) или здорового пациента (справа). Фотография сделана через 10 минут после начала выполнения.

Фиг. 10. Характеризация валидационных образцов.

Для валидации анализа была создана коллекция HDV-положительных и HDV-отрицательных образцов. Положительность или отрицательность HDV определяли при помощи ручного анализа ELISA к HD на планшете DiaSorin.

A и B, Анализ всех валидационных образцов на количественные уровни антител к HDV при помощи прямого ELISA на планшете с покрытыми HDAg и увеличением разведения образцов.

Фиг. 11. Валидация анализа.

Все валидационные образцы применили к ИХА по изобретению, т.е. к тесту по месту лечения.

A, При помощи анализа DiaSorin в качестве золотого стандарта рассчитали высокую чувствительность 94,6% для теста по месту лечения.

B – D, Количественные данные по антителами к HDV нанесли на график с результатами теста по месту лечения.

Фиг. 12. Анализ сывороток с различными серотипами HDV.

ИХА (т.е. тест по месту лечения) выполнили с сыворотками пациентов, инфицированных различными генотипами (гт) HDV, для валидации специфичности анализа в отношении всех генотипов. Антитела всех протестированных генотипов могут быть обнаружены в ИХА (т.е. в тесте по месту лечения).

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1 Материалы и способы

1.1 Экспрессия и очистка белка

Открытую рамку считывания L-HDAg-консенсусной последовательности с меткой гистидина клонировали в бактериальный экспрессирующий вектор pET, трансформировали в E.coli BL21 и индуцировали экспрессию белка добавлением 1 мМ изопропилтиогалактозида в течение 3 часов при 37°C. Бактерии лизировали при помощи микрофлюидайзера, рекомбинантный белок растворили в 8М мочевине и очистили при помощи колонки с никель-сефарозой (HisTrap, «GE Healthcare») в системе ВЭЖХ Äkta. Элюирование выполняли с использованием линейного градиента имидазола.

1.2 Иммуносорбентный ферментный анализ (ELISA)

Рекомбинантный белок нанесли на 96-луночный планшет для ELISA («Greiner Bio-One») в концентрации 2 мкг/мл и блокировали 3% БСА/PBS/0,05% Полисорбат-20. Образцы сыворотки человека разбавили в буфере 0,1% БСА/PBS/0,05% Полисорбат-20 в указанных разведениях и инкубировали на планшетах в течение 1 часа при 37°C. После промывки планшеты инкубировали с вторичным козьим антителом к антителам человеческого происхождения с перодоксидазой («Jackson Immuno», разведение 1:5000). После промывки ферментативную реакцию запустили инкубацией с ТМБ субстратом («eBioscience») в течение 5 минут при комнатной температуре и остановили добавлением 1M фосфорной кислоты. Поглощение на длине волны 450 нм измеряли с использованием 96-луночного планшет-ридера («Tecan»).

1.3 Сборка для иммунохроматографического анализа

Выходные данные иммунохроматографических анализов собрали исключительно с материалом из стартового набора ИХА («DCN Diagnostics»). Рекомбинантную консенсусную последовательность L-HDAg с меткой гистидина на линии тестирования и антитело осла к антителам козы («Novo Nordisk») на линии контроля нанесли в концентрации 2 мг/мл при помощи аппликатора AS30 («biostep») в объеме 1 мкл/см. Затем мембрану блокировали 2% БСА, промыли PBS/0,05% Полисорбат-20 и высушили. Пластины с образцом и конъюгатом предварительно обработали буфером для пластины для образца и наносили меченные золотом козьи антитела к антителам человеческого происхождения («BioAssayWorks») на пластину для конъюгата в буфере, содержащем 20% сахарозы и 5% трегалозы. После высушивания отдельных частей образцы для ИХА собрали на пластиковой подложке, разрезали на полоски шириной 0,4 см и поместили в пластиковый корпус.

1.4 Анализ DiaSorin

Ручной анализ ELISA на планшете для обнаружения антител к HDAg ETI-AB-DELTAK-2 anti-HDV (Diasorin, Италия, № заказа P2808) использовали в соответствии с инструкциями производителя.

1.5 Образцы HDV и сыворотки пациентов / сбор образцов сыворотки всех генотипов

Образцы сыворотки/плазмы пациентов, инфицированных HDV, были предоставлены Университетской клиникой Гейдельберга, Ганноверской медицинской школой, Медицинской школой Анкары, банком крови Франции (EFS) и компанией «Biomex» (Гейдельберг, Германия). Все отрицательные образцы были приобретены в компании «Biomex» (Гейдельберг, Германия). Образцы сыворотки пациентов, инфицированных различными генотипами HDV, были охарактеризованы и предоставлены Лабораторией клинической микробиологии больницы Авиценны (APHP, Бобиньи, Франция). Все образцы сыворотки/плазмы хранили при -80°С до использования.

ПРИМЕР 2

2.1 Характеризация валидационных образцов.

Для валидации анализа была создана коллекция HDV-положительных и HDV-отрицательных образцов на основе рутинной клинической диагностики, клинических исследований HDV или путем закупки у коммерческих поставщиков. См. таблицу 1 ниже. Положительность или отрицательность HDV определяли при помощи ручного анализа ELISA к HD на планшете DiaSorin.

Таблица 1 Характеристики валидационных образцов

HDV-положительные
n = 332 HDV-отрицательные
n = 142 Статус HBsAg HBsAg-положительные 332 62 HBsAg-отрицательные 0 80 Статус РНК HDV РНК-положительные 121 0 РНК-отрицательные 33 0 РНК неизвестно 178 142 Матрица образцов Сыворотка 299 42 ЭДТУК-Плазма 21 30 Цитрат-Плазма 12 70

Для получения количественных уровней антител к HDV в валидационных образцах выполнили количественный анализ ELISA: На планшеты для ELISA нанесли рекомбинантные HDAg, инкубировали с различными разведениями образцов и связанные антитела обнаружили при помощи антител, меченных пероксидазой, в порядке, описанном выше. См. Фиг. 10А и В.

2.2 Валидация анализа

Все валидационные образцы применили к ИХА по изобретению, т.е. к тесту по месту лечения.

При помощи анализа DiaSorin в качестве золотого стандарта рассчитали высокую чувствительность 94,6% для теста по месту лечения, см. Фиг. 11А.

При построении графика на основе данных о количестве антител к HDV из тестов по месту лечения становится очевидно, что все РНК-положительные сыворотки HDV могут быть обнаружены при помощи тестирования по месту лечения (см. фиг. 11С), и только образцы с очень низким или неопределяемым уровнем антител к HDV являются отрицательными в тесте по месту лечения (см. фиг. 11D).

ПРИМЕР 3

Анализ сывороток с различными генотипами HDV

Тест по месту лечения выполнили с сыворотками пациентов, инфицированных различными генотипами (гт) HDV, для валидации специфичности анализа в отношении всех генотипов. Как можно видеть на фиг. 12, антитела всех протестированных генотипов 1-8 могут быть обнаружены в тесте по месту лечения.

ПРИМЕР 4

Мультиплексный ИХА для одновременного обнаружения HBsAg и антител к HDV

Экспресс-тесты на HBsAg по месту лечения для диагностики инфекции HBV уже реализуются на рынке. В исследовании на подтверждение концепции анализ антител к HDV по изобретению был объединен с анализом HBsAg на мультиплексной полоске ИХА, как показано на фиг. 8.

Мультиплексные полоски анализировали с использованием сывороток пациентов с сочетанной инфекцией HBV/HDV, пациентов, инфицированных только HBV, или здоровых пациентов. Как можно видеть на фиг. 9, тест ИХА/POC можно проводить мультиплексно для одновременного обнаружения HBsAg и антител к HDV.

Признаки, раскрытые в предшествующем описании, формуле изобретения и/или на прилагаемых чертежах как отдельно, так и в форме любого их сочетания, являются существенными для реализации изобретения в различных его формах.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Bazinet M., Pantea V., Cebotarescu V., Cojuhari L., Jimbei P., Vaillant A. Hdv2 o-09: Rep 2139 monotherapy and combination therapy with pegylated interferon: Safety and potent reduction of HBsAg and HDV RNA in caucasian patients with chronic HBV/HDV co-infection. J. Viral Hepat. 2015;22:5–6.

Bazinet M., Pantea V., Cebotarescu V., Cojuhari L., Jimbei P., Albrecht J., Schmid P., Karimzadeh H., Roggendorf M., Vaillant A. Update on the safety and efficacy of rep 2139 mono-therapy and subsequent combination therapy with pegylated interferon α-2a in chronic HBV/HDV co-infection in caucasian patients. Hepatology. 2015;62:222A.

Blank A, Markert C, Hohmann N, Carls A, Mikus G, Lehr T, Alexandrov A, Haag M, Schwab M, Urban S, Haefeli WE. First-in-human application of the novel hepatitis B and hepatitis D virus entry inhibitor myrcludex B. J Hepatol. 2016 Sep;65(3):483-9.

Bogomolov P, Alexandrov A, Voronkova N, Macievich M, Kokina K, Petrachenkova M, Lehr T, Lempp FA, Wedemeyer H, Haag M, Schwab M, Haefeli WE, Blank A, Urban S. Treatment of chronic hepatitis D with the entry inhibitor myrcludex B: First results of a phase Ib/IIa study. J Hepatol. 2016 Sep;65(3):490-8.

Koh C., Yurdaydin C., Cooper S.L., Cory D., Dahari H., Haynes-Williams V., Winters M., Bys M., Choong I., Idilman R., et al. Prenylation inhibition with lonafarnib decreases hepatitis D levels in humans. Hepatology. 2014;60:1092A.

Koh C., Canini L., Dahari H., Zhao X., Uprichard S.L., Haynes-Williams V., Winters M.A., Subramanya G., Cooper S.L., Pinto P., et al. Oral prenylation inhibition with lonafarnib in chronic hepatitis D infection: A proof-of-concept randomised, double-blind, placebo-controlled phase 2a trial. Lancet. Infect. Dis. 2015;15:1167–1174. doi: 10.1016/S1473-3099(15)00074-2.

Lempp FA, Urban S. Hepatitis Delta Virus: Replication Strategy and Upcoming Therapeutic Options for a Neglected Human Pathogen. Viruses. 2017 ;9(7). pii: E172. doi: 10.3390/v9070172. Review.

Poutay D., Sabra M., Abou-Jaoude G., Chemin I., Trepo C., Vaillant A., Sureau C. P177: Nucleic acid polymers are efficient in blocking hepatitis delta virus entry in vitro. J. Viral Hepat. 2015;22:107.

Urban S, Bartenschlager R, Kubitz R, Zoulim F. Strategies to inhibit entry of HBV and HDV into hepatocytes. Gastroenterology. 2014 Jul;147(1):48-64.

Vaillant A. Nucleic acid polymers: Broad spectrum antiviral activity, antiviral mechanisms and optimization for the treatment of hepatitis B and hepatitis D infection. Antivir. Res. 2016;133:32–40. doi: 10.1016/j.antiviral.2016.07.004.

Yurdaydin C., Idilman R., Choong I., Kalkan C., Keskin O., Karakaya M.F., Tuzun A.E., Karatayli E., Bozdayi M., Cory D., et al. O118: Optimizing the prenylation inhibitor lonafarnib using ritonavir boosting in patients with chronic delta hepatitis. J. Hepatol. 2015;62:S252. doi: 10.1016/S0168-8278(15)30137-9.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Университет Хайдельберг

<120> СПОСОБ И СРЕДСТВО ДЛЯ БЫСТРОГО ОБНАРУЖЕНИЯ ИНФЕКЦИЙ ВИРУСА

ГЕПАТИТА D

<130> U30851WO

<150> EP18172895.7

<151> 2018-05-17

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 214

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая последовательность HDAg (консенсусная)

<400> 1

Met Ser Arg Ser Glu Ser Lys Lys Asn Arg Gly Gly Arg Glu Glu Ile

1 5 10 15

Leu Glu Gln Trp Val Ser Gly Arg Lys Lys Leu Glu Asp Leu Glu Arg

20 25 30

Asp Leu Arg Lys Val Lys Lys Lys Ile Lys Lys Leu Glu Asp Glu Asn

35 40 45

Pro Trp Leu Gly Asn Ile Lys Gly Ile Leu Gly Lys Lys Asp Lys Asp

50 55 60

Gly Glu Gly Ala Pro Pro Ala Lys Arg Ala Arg Thr Asp Gln Met Glu

65 70 75 80

Val Asp Ser Gly Pro Arg Lys Arg Pro Leu Arg Gly Gly Phe Thr Asp

85 90 95

Lys Glu Arg Gln Asp His Arg Arg Arg Lys Ala Leu Glu Asn Lys Lys

100 105 110

Lys Gln Leu Ser Ala Gly Gly Lys Asn Leu Ser Lys Glu Glu Glu Glu

115 120 125

Glu Leu Arg Arg Leu Thr Glu Glu Asp Glu Arg Arg Glu Arg Arg Val

130 135 140

Ala Gly Pro Arg Val Gly Gly Val Asn Pro Leu Glu Gly Gly Pro Arg

145 150 155 160

Gly Ala Pro Gly Gly Gly Phe Val Pro Ser Met Gln Gly Val Pro Glu

165 170 175

Ser Pro Phe Thr Arg Thr Gly Glu Gly Leu Asp Ile Arg Gly Asn Gln

180 185 190

Gly Phe Pro Trp Asp Ile Leu Phe Pro Ala Asp Pro Pro Phe Ser Pro

195 200 205

Gln Ser Cys Arg Pro Gln

210

<210> 2

<211> 222

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая последовательность HDAg (консенсусная) с гистидиновой меткой для рекомбинантной экспрессии

<400> 2

Met Ser Arg Ser Glu Ser Lys Lys Asn Arg Gly Gly Arg Glu Glu Ile

1 5 10 15

Leu Glu Gln Trp Val Ser Gly Arg Lys Lys Leu Glu Asp Leu Glu Arg

20 25 30

Asp Leu Arg Lys Val Lys Lys Lys Ile Lys Lys Leu Glu Asp Glu Asn

35 40 45

Pro Trp Leu Gly Asn Ile Lys Gly Ile Leu Gly Lys Lys Asp Lys Asp

50 55 60

Gly Glu Gly Ala Pro Pro Ala Lys Arg Ala Arg Thr Asp Gln Met Glu

65 70 75 80

Val Asp Ser Gly Pro Arg Lys Arg Pro Leu Arg Gly Gly Phe Thr Asp

85 90 95

Lys Glu Arg Gln Asp His Arg Arg Arg Lys Ala Leu Glu Asn Lys Lys

100 105 110

Lys Gln Leu Ser Ala Gly Gly Lys Asn Leu Ser Lys Glu Glu Glu Glu

115 120 125

Glu Leu Arg Arg Leu Thr Glu Glu Asp Glu Arg Arg Glu Arg Arg Val

130 135 140

Ala Gly Pro Arg Val Gly Gly Val Asn Pro Leu Glu Gly Gly Pro Arg

145 150 155 160

Gly Ala Pro Gly Gly Gly Phe Val Pro Ser Met Gln Gly Val Pro Glu

165 170 175

Ser Pro Phe Thr Arg Thr Gly Glu Gly Leu Asp Ile Arg Gly Asn Gln

180 185 190

Gly Phe Pro Trp Asp Ile Leu Phe Pro Ala Asp Pro Pro Phe Ser Pro

195 200 205

Gln Ser Cys Arg Pro Gln His His His His His His His His

210 215 220

<---

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и медицине. В частности, настоящее изобретение относится к диагностике инфекций HDV по месту лечения. Предложен полипептид, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из аминокислотной последовательности SEQ ID NO. 1 или SEQ ID NO. 2, аминокислотной последовательности, содержащей или состоящей из аминокислотных остатков 1-195 последовательностей SEQ ID NO. 1 или 2, аминокислотной последовательности, содержащей аминокислоты, содержащие или состоящие из аминокислотных остатков 60-214 последовательностей SEQ ID NO. 1 или 2, или аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 99% идентична последовательности SEQ ID NO. 1, и применение заявленного полипептида. Предложена нуклеиновая кислота, кодирующая заявленный полипептид и ее применение. Предложен способ in vitro для обнаружения присутствия вируса гепатита D (HDV) в образце пациента и иммунографическое устройство для in vitro обнаружения присутствия вируса гепатита D (HDV) в образце пациента, а также комплект для in vitro обнаружения присутствия вируса гепатита D (HDV) в образце пациента. Изобретение позволяет обнаружения присутствия вируса гепатита D (HDV), осуществлять диагностику инфекции HDV и контроль лечения инфекции HDV. 7 н. и 29 з.п. ф-лы, 21 ил., 1 табл., 4 пр.

1. Полипептид для обнаружения присутствия вируса гепатита D (HDV), содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из

аминокислотной последовательности SEQ ID NO. 1 или SEQ ID NO. 2,

аминокислотной последовательности, содержащей или состоящей из аминокислотных остатков 1-195 последовательностей SEQ ID NO. 1 или 2,

аминокислотной последовательности, содержащей аминокислоты, содержащие или состоящие из аминокислотных остатков 60-214 последовательностей SEQ ID NO. 1 или 2, или

аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 99% идентична последовательности SEQ ID NO. 1.

2. Нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид по п. 1.

3. Применение полипептида по п. 1 для обнаружения присутствия вируса гепатита D (HDV).

4. Применение по п. 3, в котором антитела IgG к антигену гепатита дельта (HDAg) обнаруживают в образце пациента.

5. Применение по п. 3 или 4, в котором образцом является сыворотка, плазма, цельная кровь или слюна,

и/или при этом могут быть обнаружены HDV и инфекции HDV всех генотипов,

и/или при этом обнаруживают дополнительные инфекции, например инфекцию HBV.

6. Применение по любому из пп. 3-5, в котором обнаружение присутствия вируса гепатита D (HDV) выполняют для диагностики инфекции HDV.

7. Применение по любому из пп. 3-5, в котором обнаружение присутствия вируса гепатита D (HDV) выполняют для контроля лечения инфекции HDV.

8. Применение по любому из пп. 3-7, в котором используют иммунографическое устройство тестирования, такое как устройство для иммунохроматографического анализа (ИФА).

9. Применение по п. 8, в котором иммунографическое устройство тестирования является устройством для оказания медицинской помощи по месту лечения.

10. Применение нуклеиновой кислоты по п. 2 для обнаружения присутствия вируса гепатита D (HDV).

11. Применение по п. 10, в котором антитела IgG к антигену гепатита дельта (HDAg) обнаруживают в образце пациента.

12. Применение по п. 10 или 11, в котором образцом является сыворотка, плазма, цельная кровь или слюна,

и/или при этом могут быть обнаружены HDV и инфекции HDV всех генотипов,

и/или при этом обнаруживают дополнительные инфекции, например инфекцию HBV.

13. Применение по любому из пп. 10-12, в котором обнаружение присутствия вируса гепатита D (HDV) выполняют для диагностики инфекции HDV.

14. Применение по любому из пп. 10-12, в котором обнаружение присутствия вируса гепатита D (HDV) выполняют для контроля лечения инфекции HDV.

15. Применение по любому из пп. 10-12, в котором используют иммунографическое устройство тестирования, такое как устройство для иммунохроматографического анализа (ИФА).

16. Применение по п. 15, в котором иммунографическое устройство тестирования является устройством для оказания медицинской помощи по месту лечения.

17. Способ in vitro для обнаружения присутствия вируса гепатита D (HDV) в образце пациента, при этом указанный способ включает в себя

получение полипептида по п. 1; и

обнаружение антител IgG к антигену гепатита дельта (HDAg) в указанном образце.

18. Способ по п. 17, который представляет собой способ обнаружения по месту лечения.

19. Способ по п. 17 или 18, в котором обнаружение присутствия вируса гепатита D (HDV) выполняют для диагностики инфекции HDV.

20. Способ по п. 17 или 18, в котором обнаружение присутствия вируса гепатита D (HDV) выполняют для контроля лечения инфекции HDV.

21. Способ по п. 17, в котором в качестве образца используют сыворотку, плазму, цельную кровь или слюну,

и/или при этом могут быть обнаружены HDV и инфекции HDV всех генотипов,

и/или при этом обнаруживают дополнительные инфекции, например инфекцию HBV.

22. Иммунографическое устройство для in vitro обнаружения присутствия вируса гепатита D (HDV) в образце пациента, при этом указанное устройство содержит твердый носитель, покрытый средством, связывающим антитело IgG к HDV,

причем средство, связывающее антитело IgG к HDV, представляет собой полипептид по п. 1.

23. Иммунографическое устройство по п. 22, которое включает в себя пористую мембрану, функционально соединенную с

(a) частью/пластиной для образца,

(b) частью/пластиной для конъюгата,

(c) частью/линией для тестирования, содержащей указанное средство, связывающее антитело IgG к HDV,

(d) частью/линией для контроля и

(e) частью/пластиной для абсорбента.

24. Иммунографическое устройство по п. 22 или 23, которое представляет собой устройство для иммунохроматографического анализа (ИФА).

25. Иммунографическое устройство по п. 24, которое представляет собой устройство для использования по месту лечения.

26. Иммунографическое устройство по п. 24 или 25, в котором обнаружение присутствия вируса гепатита D (HDV) выполняют для диагностики инфекции HDV.

27. Иммунографическое устройство по п. 24 или 25, в котором обнаружение присутствия вируса гепатита D (HDV) выполняют для контроля лечения инфекции HDV.

28. Иммунографическое устройство по любому из пп. 22-27, выполненное с возможностью использовать в качестве образца сыворотку, плазму, цельную кровь или слюну,

и/или с возможностью обнаружения HDV и инфекции HDV всех генотипов, и/или с возможностью обнаружения дополнительных инфекций, например инфекции HBV.

29. Иммунографическое устройство по любому из пп. 22-28, в котором часть/пластина для конъюгата включает в себя маркер обнаружения.

30. Иммунографическое устройство по п. 29, в котором маркер обнаружения представляет собой коллоидный металл, такой как золото, или латексные гранулы.

31. Иммунографическое устройство по п. 29 или 30, в котором маркер обнаружения предпочтительно прямо или косвенно связан с антителом, таким как вторичное антитело к антителам человека, или с белком, связывающим антитело, таким как белок А или белок G.

32. Иммунографическое устройство по любому из пп. 22-31, в котором часть/линия для контроля содержит средство связывания с маркером обнаружения или фрагментом, несущим маркер обнаружения.

33. Комплект для in vitro обнаружения присутствия вируса гепатита D (HDV) в образце пациента, при этом комплект включает в себя:

a) иммунографическое устройство по любому из пп. 22-32; и

b) инструкции по использованию иммунографического устройства для обнаружения присутствия в образце указанных антител IgG к HDV.

34. Комплект по п. 33, в котором обнаружение присутствия вируса гепатита D (HDV) выполняют для диагностики инфекции HDV.

35. Комплект по п. 33, в котором обнаружение присутствия вируса гепатита D (HDV) выполняют для контроля лечения инфекции HDV.

36. Комплект по любому из пп. 33-35, в котором образцом является сыворотка, плазма, цельная кровь или слюна,

и/или устройство выполнено с возможностью обнаружения HDV и инфекции HDV всех генотипов,

и/или устройство выполнено с возможностью обнаружения дополнительных инфекций, таких как инфекция HBV.