СПОСОБ ЭКСПРЕСС-АНАЛИЗА ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ДРОЖЖЕЙ К ИНГИБИТОРАМ Российский патент 2023 года по МПК C12N1/16 C12Q1/04 

Область техники

Изобретение относится к пищевой промышленности, микробиологии, лабораторной диагностике, а именно к средствам определения чувствительности дрожжей к ингибиторам, сопутствующим при производстве пищевой и алкогольной продукции, которые формируются в зависимости от особенностей технологических схем производства и состава поступающего сельскохозяйственного сырья и может быть использовано преимущественно в пищевой, алкогольной промышленностях и в сельском хозяйстве.

Уровень техники

Сельскохозяйственное сырье, направляемое на ферментацию может содержать ряд факторов - ингибиторов, угнетающих активность дрожжей, таких как: высокие концентрации титруемых кислот, Сахаров, фенольных соединений, остаточные количества пестицидов и антибиотиков, в концентрациях, не превышающих максимально допустимый уровень (МДУ).

Класические методы исконно, применяемые в микробиологии для селекции и отбора дрожжей устойчивых к высоким концентрациям Сахаров, фенольных соединений, титруемых кислот, низких и высоких температур проводиться путем культивирования на жидких питательных средах на основании данных интенсивности брожения и дыхания, концентрации несброженных Сахаров (Бурьян Н.И. Практическая микробиология виноделия/ Н.И. Бурьян. - Симферополь: Таврида, 2003 - 560 с.). Токсическое действие пестицидов на дрожжи, определялось подобным образом (Антоненко М.В. Технологические приемы производства столовых вин без остаточных количеств триазолов: автореф. дис. канд. техн. наук: 05.18.01/. Антоненко Михаил Владимирович - Краснодар, 2012. - 25 с.). Это трудоемкие и длительные эксперименты, требующие больших количеств лабораторной посуды и питательных сред, позволяющие оценить свойства только одной культуры.

Наиболее близкими по технической сущности к заявленому изобретению являются: метод «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам» (Клинические рекомендации «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам / Ассоциация специалистов и организаций лабораторной службы «Федерация лабораторной медицины». - Владимир, 2008. - 91 с.), который проводится путем инокуляции дисков на плотные питательные среды с последующим измерением зон подавления роста. Данный метод обладает высокой эффективностью, но не позволяет оценивать несколько микроорганизмов в одном исследовании и метод «Испытания фунгицидной активности химических веществ», принцип которого заключается в вычислении угнетения роста колоний тест-объектов - фитопатогенных и сапрофитных грибов, растущих на средах с фунгицидом (Голышин, М.Н. Фунгициды в сельском хозяйстве/ М.Н. Голышин, - М.: Колос, 1970. - 183 с.). Данные методы не подходят для исследований дрожжей из-за значительно меньших размеров колоний по сравнению с сапрофитными грибами.

Технической проблемой, на решение которой направлено заявляемое изобретение является совершенствование методик, позволяющих одновременно оценивать чувствительность к заданным ингибиторам нескольких штаммов дрожжей и давать числовой показатель угнетения роста.

Раскрытие сущности изобретения

Техническим результатом заявляемого изобретения является возможность одновременного определения чувствительности к ингибиторам до шести штаммов дрожжей, при уменьшении количества используемой лабораторной посуды и питательных сред.

Для достижения технического результата предложен способ экспресс-анализа чувствительности дрожжей к ингибиторам включающий подготовку тест-организмов, приготовление питательных сред, проведение посевов, культивирование тест-организмов, вычисление результатов, отличающийся в тем, что для подготовки тест-организмов используют биомассу двухсуточной культуры дрожжей толщиной не менее 1 мм, которая содержит не менее 50-60% почкующихся клеток и не более 5% мертвых, при этом, в одном тестировании используют от 1-го до 6-ти тест-организмов одновременно, осуществляют приготовление питательных сред в агаризированной питательной среде, представляющей собой виноградное сусло или солодовое сусло или среда YPD или среду YPDF, нагревая ее до температуры 55°С, вносят в нее расчетное количество ингибитора, предварительно растворенного в стерильной воде, перемешивают, а затем немедленно разливают в три стерильные чашки Петри, проводят посевы путем укола иглой со споровой суспензией, отбирают тест-организмы уколом в биомассу перенося их в чашку Петри, при этом, делают десять последовательных уколов в толщу плотной среды на 1-2 мм вдоль одной линии на расстоянии 6-7 мм друг от друга, при этом, при одновременном использовании двух и более тест-организмов, расстояние между посевом следующего тест-организма должно быть не менее 10 мм, проводят культивирование тест-организмов при температуре 25±2°С, в течение 2-х суток, в зависимости от интенсивности роста, при этом, при слишком слабом росте тест-организмов и затруднении измерения диаметров колоний до 1 мм, проводят дополнительный период культивирования в течении 48 ч, проводят учет результатов путем измерения и сумирования диаметров колонии, выросших на средах с ингибитором и без него, вычисляют угнетение роста дрожжей, относительно контроля.

Реализация отличительных признаков изобретения дает числовой показатель угнетения роста, обеспечивает достаточно быструю предварительную оценку чувствительности к ингибиторам среди больших массивов культур дрожжей.

Существенно новым в заявленном способе является то обстоятельство, что использование разработанного метода дает возможность предварительной оценке эффективности применения витаминных и питательных препаратов в заданных условиях культивирования.

Метод основан на фиксации разности роста дрожжей на плотных средах с ингибитором по отношению к контролю (среды без ингибиторов). Инокуляция проводится серией десяти последовательных уколов на плотную среду. Показатель угнетения роста получают путем измерения выросших колоний на плотных средах, после двух- или трех-суточного культивирования, в зависимости от интенсивности роста культуры дрожжей при температуре 25°. К питательной среде могут быть добавлены витамины, и/или аминокислоты, и/или иные пищевые добавки.

Новым принципом, положенным в основу заявленного способа, является использование нового способа посева - серии последовательных уколов. Известный метод посева одного укола, используемый при определении угнетения роста сапрофитных грибов на средах с фунгицидами, для дрожжей не подходит из-за значительно меньших размеров колоний по сравнению с сапрофитными грибами. При посеве способом серии последовательных уколов, при каждом последующем уколе количество клеток, вносимых в среду, уменьшается, и тем самым увеличивается площадь контакта клеток с питательной средой, при этом увеличивается токсическое влияние среды на дрожжи. Использование двухсуточной культуры дрожжей для анализа повышает чувствительность метода, из-за более высокой чувствительности дрожжей на данной стадии лаг-фазе. Культивирование при температуре 25°С обеспечивает быстрый рост дрожжей и достаточно высокую чувствительность к ингибиторам.

Осуществление изобретения

Способ экспресс-анализа чувствительности дрожжей к ингибиторам включает: подготовку дрожжевой культуры, введение в питательную среду исследуемого компонента-ингибитора, посев и культивирование на питательной среде с последующей оценкой результата: для культивирования дрожжей используют плотную богатую питательную среду; исследуемый ингибитор вводится в питательную среду до начала культивирования, а также проводится контрольный посев дрожжей в среду без ингибитора, оценку чувствительности проводят при появлении видимого роста колоний в контрольном посеве; в качестве питательной среды используют виноградное и солодовое агаризированное сусло, Агар YPD, среду Сабуро; к питательной среде могут быть добавлены витаминные и питательные добавки; для анализа используются двухсуточные культуры дрожжей, обладающие более высокой чувствительностью; посевы проводятся разработанным способом серии десяти последовательных уколов; культивирование дрожжей при 25°С, также исследования можно проводить при различных температурных режимах для оценки токсичности ингибиторов при заданных температурах; возможна оценка одного или нескольких ингибиторов; культивирование проводиться в чашках Петри; в одном эксперименте допустимо исследовать от 1 до 6 культур дрожжей.

Приготовление питательных сред.

Навеска или объем препарата ингибитора рассчитывают на 60 см³ питательной среды. В зависимости от препаративной формы ингибитора отбор осуществляют нижеуказанными способами. В виде порошка или гранул взвешивают на весах, растворы и суспензии отбирают микродозатором или пипеткой. При низких значениях расчетных концентраций или высокой плотности суспензии, проводят разбавление стерильной дистиллированной водой до состояния, позволяющего отбору микродозатором или пипеткой, в дальнейшем учитывают разбавление. Препарат ингибитора первоначально растворяют в небольшом количестве стерильной дистиллированной воды, а затем переносят в общий объем питательной среды.

Пастеризованное виноградное или солодовое сусло в количестве 60 см³ наливают в стерильную колбу или стакан и нагревают на водяной бане до 55°С, к нему добавляют 1,8 г агара, доводят до полного его растворения, вносят расчетное количество (навеску или объем) ингибитора, перемешивают, а затем немедленно разливают в три стерильные чашки Петри по 20 см³. Толщина слоя сусло-агара в чашке Петри - от 3 до 4 мм. При необходимости, чашки Петри подсушивают в термостате, перевернув дном верх

Агаризованое виноградное сусло без ингибитора (контроль) готовят аналогично предыдущему, но без внесения ингибитора.

Среды, предназначенные для тестирования, должны быть использованы без задержек, чтобы исключить изменения первоначального состава.

Проведение посевов, культивирование тест-организмов.

Посевы в подготовленные питательные среды проводят рядом с горелкой. Стерильной микробиологической иглой отбирают тест-организм уколом в биомассу, не глубже 1-2 мм, и переносят в чашку Петри, делая десять последовательных уколов в толщу плотной среды на 1-2 мм вдоль одной линии на расстоянии друг от друга 6-7 мм. При одновременном использовании двух и более тест-организм в испытании, расстояние между посевом следующего тест-организма должно быть не менее 10 мм. Затем аналогичным образом проводят посев в следующую чашку Петри. Исследование проводиться в 3-х повторностях на 3-х чашках Петри. После посевов чашки Петри помещают в термостат дном вверх. Посевы термостатируют при температуре (25±2)°С, в течение 2-х суток. При слишком слабом росте тест-организмов и затруднении измерения диаметров колоний d до 1 мм, допускается дополнительный период культивирования в течении 48 ч.

Вычисление результатов.

Учет результатов проводят путем измерения диаметра каждой колонии. Для измерения выросших колоний чашку Петри с закрытой крышкой располагают дном кверху на темную матовую поверхность, так чтобы свет падал на нее под углом 45°. Измерение диаметров выросших колоний проводят на расстоянии примерно 30 см от глаз, с точностью до миллиметра, при помощи линейки. Величина одного посева равна сумме десяти диаметров выросших колоний из десяти сделанных уколов, которую определяют по формуле:

где: -величина одного посева исследуемой тест культуры, мм;

d1 - диаметр первой колонии, d2 - диаметр второй и так далее, мм. Если выросло меньшее количество колоний, например, семь, то за результат принимается сумма семи диаметров колоний.

Итоговым результатом является средняя величина одного посева трех параллельных посевов, которая определяют по формуле:

где: С - средняя величина суммы диаметров колоний одного посева 3-х параллельных посевов исследуемой культуры дрожжей, мм;

и - величина первого, второго и третьего посева, соответственно, исследуемой культуры дрожжей, мм.

Если расхождение между результатами параллельных посевов более 10% от среднего значения (относительная ошибка > 10%), необходимо проводить повторное исследование.

Угнетение роста дрожжей рассчитывают по формуле 3, результат округляют до целого числа:

где: УР - значение угнетения роста дрожжей, %;

С - средняя величина суммы диаметров колоний одного посева 3-х параллельных определений, выросших на среде без ингибитора, мм;

Си - средняя величина суммы диаметров колоний одного посева 3-х параллельных определений, выросших на среде с ингибитором, мм;

100 - коэффициент перевода из относительных единиц в проценты.

Пример 1. Определение чувствительности штамма дрожжей 1-657 НКМВ «Магарач» к пестициду фунгицидного действия Фалькон, КЭ.

Для посевов использовали двухсуточную биомассу дрожжей (толщина слоя биомассы дрожжей - не менее 1 мм).

Питательная среда: виноградное сусло-агар (3% агара). В расплавленную среду предварительно вносили пестицид, в перерасчете на действующее вещество спироксамин 1, 0 мг/дм³.

Посев биомассы проводили микробиологической иглой уколом в исходную биомассу, не глубже 1-2 мм, и переносили в чашку Петри, делая десять последовательных уколов в толщу плотной среды на 1-2 мм вдоль одной линии на расстоянии друг от друга 6-7 мм. Расстояние между посевом следующей культуры должно быть не менее 10 мм. Затем аналогичным образом проводили посев в следующую чашку Петри. После культивирования в термостате, при температуре 25±2°С в течении 72 ч, проводили замеры и вычисления результатов.

Угнетение роста составило 45%, следовательно, исследуемый штамм чувствителен к данному пестициду.

Пример 2. Определение эффективности препаратов для стимулирования активности дрожжей ВитаФерм ультра (препарат веществ, освобожденных из дрожжевых клеток) и ВитаСал (питательная соль) на сусло-агаре с фунгицидом Фалькон, КЭ.

Способ осуществляли аналогично описанному в примере 1

Питательная среда: виноградное сусло-агар (3% агара). В расплавленную среду предварительно вносили пестицид в перерасчете на действующее вещество спироксамин 1, 0 мг/дм³ и по одному препарату для стимулирования активности дрожжей. Контролем служила среда с пестицидом, без препарата для стимулирования активности дрожжей.

В результате проведенных исследований было установлено снижение токсичности фунгицида Фалькон, КЭ на дрожжи препаратами для стимулирования активности дрожжей, наибольшей эффективностью обладал препарат ВитаФерм ультра.

Пример 3. Сравнительная оценка холодоустойчивости пяти природных изолятов 7, 10, 12, 44, 48.

Посевы проводили способом описанным в примере 1. Культивирование проводили при 15°С. Контролем служили культуры, культивируемые при 25±2°С После культивирования в течении 72 ч, проводили замеры и вычисления результатов. Самой низкой чувствительностью к пониженным температурам, характеризовались 10 и 48 изоляты (таблица 2).

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ экспресс-анализа чувствительности дрожжей к ингибиторам, сопутствующим при производстве пищевой и алкогольной продукции, включающий подготовку тест-организмов, приготовление агаризированной питательной среды, представляющей собой виноградное или солодовое сусло, или среду YPD, или среду YPDF, нагревание ее до температуры 55°С, внесение в нее расчетного количества ингибитора и последующий розлив в стерильные чашки Петри. Посевы проводят путем десяти последовательных уколов иглой со споровой суспензией в толщу плотной среды на 1-2 мм вдоль одной линии на расстоянии 6-7 мм друг от друга. При одновременном использовании двух и более тест-организмов расстояние между посевом следующего тест-организма должно быть не менее 10 мм. Культивирование тест-организмов проводят при температуре 25±2°С в течение 2-х суток в зависимости от интенсивности роста и осуществляют учет результатов путем измерения и суммирования диаметров колонии, выросших на средах с ингибитором и без него; вычисляют угнетение роста дрожжей по представленной формуле. Изобретение обеспечивает возможность предварительной оценки чувствительности дрожжей к ингибиторам и эффективности применения витаминных и питательных препаратов в заданных условиях культивирования. 2 табл., 3 пр.

Способ экспресс-анализа чувствительности дрожжей к ингибиторам, сопутствующим при производстве пищевой и алкогольной продукции, включающий подготовку тест-организмов, приготовление питательных сред, проведение посевов, культивирование тест-организмов, вычисление результатов, отличающийся в тем, что для подготовки тест-организмов используют биомассу двухсуточной культуры дрожжей толщиной не менее 1 мм, которая содержит не менее 50-60% почкующихся клеток и не более 5% мертвых, при этом в одном тестировании используют от 1-го до 6-ти тест-организмов одновременно, осуществляют приготовление питательных сред в агаризированной питательной среде, представляющей собой виноградное сусло, или солодовое сусло, или среду YPD, или среду YPDF, нагревая ее до температуры 55°С, вносят в нее расчетное количество ингибитора, предварительно растворенного в стерильной воде, перемешивают, а затем немедленно разливают в три стерильные чашки Петри, проводят посевы путем укола иглой со споровой суспензией, отбирают тест-организмы уколом в биомассу, перенося их в чашку Петри, при этом делают десять последовательных уколов в толщу плотной среды на 1-2 мм вдоль одной линии на расстоянии 6-7 мм друг от друга, при этом при одновременном использовании двух и более тест-организмов расстояние между посевом следующего тест-организма должно быть не менее 10 мм, проводят культивирование тест-организмов при температуре 25±2°С в течение 2-х суток в зависимости от интенсивности роста, при этом при слишком слабом росте тест-организмов и затруднении измерения диаметров колоний до 1 мм проводят дополнительный период культивирования в течение 48 ч, проводят учет результатов путем измерения и суммирования диаметров колонии, выросших на средах с ингибитором и без него, вычисляют угнетение роста дрожжей по формуле

где УР - значение угнетения роста дрожжей, %;

С - средняя величина суммы диаметров колоний одного посева 3-х параллельных определений, выросших на среде без ингибитора, мм;

Си - средняя величина суммы диаметров колоний одного посева 3-х параллельных определений, выросших на среде с ингибитором, мм;

100 - коэффициент перевода из относительных единиц в проценты.