Способ выявления ингибиторов синтеза стеринов микробного происхождения Советский патент 1993 года по МПК C12P33/00 

Изобретение относится к микробиологической и медицинской промышленности и биотехнологии и представляет собой способ быстрого и эффективного скрининга микробных метаболитов, обладающих инги- бирующим действием на образование сте- ринов животными и микробными клетками.

Задача выявления продуцентов ингибиторов синтеза стеринов, в частности холестерина, имеет важное практическое значение в связи с разработкой способа получения отечественных гиполипиденими- ческих препаратой, применяемых для лечения атеросклероза.

Способ позволяет определить наличие в культуральной жидкости микроорганизма- продуцента ингибитор синтеза стеринов различной химической природы даже в присутствии других фунгицидных и фунгистатических веществ, так как последние не затрагивают синтез стеринов.

Теоретической предпосылкой предлагаемого решения является способность поли- еновых антибиотиков, в том числе нистатина и амфотерицина В. взаимодействовать со стерйнами клеточных мембран грибов и дрожжей, что приводит к нарушесю

со ч

00

ел

нию их проницаемости, потере клетками К+ и их гибели.

В связи с этим предлагаемый способ выявления ингибиторов синтеза стеринов при наличии в культуральной жидкости мик- роорганизмов нескольких веществ фунги- статического и фунгицидного действия основывается на выявлении устойчивости к полиеновым антибиотикам у чувствительного к ингибиторам синтеза холестерина штамма дрожжей Rhodotoruila rubra ВКПМ Y-1337 после выращивания их в среде с гибиторами синтеза стеринов, возникающей в результате предварительного выращивания дрожжей с ингибиторами синтеза стермнов микробного происхождения, .. Л . / : -:- ; :. , ; ;.. ..-. ; .

При проведений модельных экспериментов способ включает выращивание чув- ствительных к ингибиторам дрожжей Rh. rubra ВКПМ Y-1337 на известной среде, со- держащей глюкозу 0,5%, Yeast nitrogen base фирмы Дифко 0,67% с добавлением ингибитора синтеза стеринов - ловастатина в концентрациях 0,5 - 1,0 мкг/мл (в контро- ле ловастатина нет), при рН 5,3 в условиях умеренной аэрации на качелке при 22 - 24°С. Затем на втором этапе выросшие клетки культивируют в свежей среде того же состава с добавлением нистатина или амфо- терицина В в концентрации 0,5-1,0 мкг/мл. Культивирование осуществляют в тех же ус- ловиях, что и на .первом этапе. Рост клеток дрожжей в присутствии полиеновых антй- биотиков оценивают по приросту оптиче- ской плотности на фбтоэ.лектрокалоримет ре

при:530 нм. л : лу: ;:р :г ., . -.:,:-:,.; .: : .--; ;;/V ,

Как видно из результатов, приведённых втабл, 1, дрожжи, выращенные в присутствии ингибитора синтеза-стеринов (ловаста- тина), -приобретают устойчивость Ч полиеновым антибиотикам (нистатину и ам- фотёрицину В, т. е. в их присутствии наблюдается достаточно интенсивный рост дрожжей в отличие от контроля и прототипа, где рост практически отсутствует.

Предлагаемый способ позволяет выявить наличие ингибиторов синтеза стеринов в культуральной жидкости продуцента даже в случае образования им нескольких соеди- нений фунгйстатического и фунгицидного действия.

Так, клетки, выросшие в присутствии ловастатина и нистатина одновременно, по- еле выращивания их на втором этапе, в бреде с одним нистатином приобретают устойчивость к последнему. Как показывают данные табл. 2, рост наблюдается только у юпытных клеток.

Выявление ингибиторов синтеза стеринов в культуральной жидкости микромице- тов - предлагаемых продуцентов этих соединений включает в себя следующие процедуры. Микромицеты (Asperglllus sp., Penlcllllum sp. и Mucor sp.), предполагаемые продуценты ингибиторов синтеза стеринов, выращивают на скошенном сусле-агаре в течение 10 - 14 дней, затем мицелий со спорами переносят в качалочные колбы со средой известного состава и выращивают в течение двух дней.

Полученный мицелий используют в качестве посевного материала и проводят культивирование микромицетов в качалоч- ных колбах при 28°С в ферментационной среде определенного состава в течение семи дней. -.: .. - . :/ -. v.

Мицелий отделяют фильтрованием и гидрофобные вещества из подкисленной до рН 3 - 4 культуральной жидкости извлекают этилацетатом, упаривают и остаток используют для определения наличия ингибиторов синтеза стеринов, испбльзуют для этого в качестве тест-организма Rh. rubra .ВКПМ Y- 1337, в два этапа. Л -.--.

На первом этапе посевной материал дрожжей выращивают на скошенной среде, содержащей 0,67% Nitrogeo am .in о acid base фирмы Dlfco, 0,5% глюкозы и 1,5% агар-агар, рН 5,3 при комнатной температуре (23 25. С)в течение 48 ч. Клетки отмывают стерильным физиологическим раствором и вносят в опытные среды из расчета № 10е кл/мл. Выращивание проводят глубинным способом, на качалке при 25 С. В опытные варианты вносят по 100, 200 и 300 мкл эти- лацетатного экстракта из культуральной жидкости мйкромицета. Ингибирование роста дрожжей оценивают по оптической плотности при 530 нм по сравнению с контролем (рост дрожжей без испытуемого вещества).. -.;

На втором этапе определяют степень устойчивости дрожжей, выращенных в среде с испытуемым веществом/к нистатину так, как описано в примере 1.

Результаты табл. 3 показывают/что возможны три варианта. 1. Когда микромицет выделяет в среду ингибиторы синтеза стеринов, определяемые по подавлению роста тест-организма на первом этапе и усилению его роста на втором этапе (в присутствии нистатина). 2. Когда микромицет не образует ингибиторы синтеза стеринов, что видно по отсутствию подавления роста тест-организма на первом этапе и отсутствию роста на втором этапе.

3. Когда микромицет образует вещества, ингибирующие рост тест-организма на

первом этапе, но не являющиеся ингибиторами синтеза стеринов, что видно из отсутствия роста тест-организма на втором этапе в присутствии нистатина. (табл. 3).

П ример 1. Дрожжи Rh, rubra ВКПМ Y-1337, выращенные на сусло-агаре, высевают в жидкую среду, содержащую глюкозу 0.5%, Yeast nitrogen base фирмы Дифко 0,67%. с добавлением ловастатина 0,5 мкг/мл (в контроле ловастатина нет). рН 5,3. Культивирование проводят в пробирках объемом 20 мл с 3 мл среды на качалке (100-120 об/мин) при 23°С в течение 48 ч. Клетки стерильно отделяют от среды центрифугированием (3 тыс. об/мин) в течение 10 мин отмывают стерильным физиологиче- ским-раствор ом и переносят в свежую среду того же состава с добавлением нистатина 0,5 мкг/мл и через 30 ч культивирования оценивают рост клеток дрожжей при оптической плотности на фотоэлектроколори- метре при 530 им. Клетки, выращенные на среде с ловастатином, оказываются более устойчивыми к нистатину в концентрации 0,5 мкг/мл (фиг. 1). .

Пример 2. Дрожжи выращивают, как описано в примере 1, но с добавлением в среду на первом этапе 160 мкг/мл ловаста- тина (в контроле ловастатина нет), а на втором этапе - 1,0 мкг/мл нистатина. После 30,50 и 58 ч культивирования дрожжей на втором этапе оценивают рост клеток по оптической плотности на фотоэлектроколориметре при 530 нм. Клетки, выращенные на среде с 1,0 мкг/мл ловастатина, из-за сниженного под его воздействием содержания эргостерина в мембранах клеток оказываются устойчивыми к 1,0 мкг/мл нистатина (фиг. 2).

Пример 3. Дрожжи выращивают, как описано в примере 1, но с добавлением на втором этапе вместо нистатина амфотерицина 0,5 мкг/мл. после чего рост клеток через 60 ч культивирования оценивают по оптической плотности на фотоэлектроко- лориметре при 530 нм. Клетки, выращенные с 1,0 мкг/мл ловастатина, устойчивы к амфотерицину в испытанной концентрации (фиг. 3).

Пример 4. Дрожжи выращивают, как описано в примере 1, но с добавлением на первом этапе 1,0 мкг/мл ловастатина (в контроле ловастатина нет), а на втором этапе 1,0 мкг/мл амфотерицина, после чего оценивают рост через 72 ч культивирования по оптической плотности на фотоэлектроколо- риметре при 530 нм.. Клетки, выращенные на среде с добавлением 1,0 мкг/мл ловастатина, устойчивы к 1,0 мкг/мл амфотерицина (фиг, 4).

Пример 5. Дрожжи выращивают, как описано в примере 1, но с добавлением на первом этапе одновременно с ловастатином (0,5 мкг/мл) нистатина (0,1 мкг/мл), а на 5 втором этапе с добавлением 2,0 мкг/мл нистатина, после чего оценивают рост клеток через 74 - 82 ч культивирования по оптической плотности на фотоэлектроколориметре при 530 нм. Дрожжи, выросшие на среде с

0 ингибитором синтеза стеринов к антибиотикам, приобретают устойчивость к полиено- вым антибиотикам, в данном случае, к нистатину (фиг. 5).

П р и м е р 6. Дрожжи выращивают, как

5 описано в примере 1, но с добавлением на первом этапе вместо ловастатина по 200 и 300 мкл этилацетатного экстракта из культу- ральной жидкости Asperglltus sp.

Ингибирование роста дрожжей оцени0 вают по изменению оптической плотности

при 530 нм на фотоэлектроколориметре по

сравнению с контролем (рост дрожжей без

добавления в среду испытуемого вещества).

На втором этапе определяют степень

5 устойчивости дрожжей, выращенных в среде с испытуемым веществом, к нистатину, как описано в примере 1. Результаты табл. 4 показывают, что этилацетатный экстракт из культуральной жидкости Aspergillus sp.

0 ингибирует рост дрожжей в количестве 200 и 300 мкл и при этом дрожжи приобретают , устойчивость к нистатину, что указывает на наличие в этилацетатном экстракте гриба ингибитора биосинтеза стеринов (табл. 4) k

5

Формул а-изобретения Способ выявления ингибиторов синтеза4 стеринов микробного происхождения, включающий выращивание тест-культуры

0 дрожжей в жидкой питательной среде в присутствии ингибитора синтеза стеринов с последующим определением количества биомассы дрожжей, отличающийся тем, что, с целью повышения селективности

5 способа, предварительно культивируют микроорганизм-продуцент ингибиторов синтеза стеринов, полученную культураль- ную жидкость фил ьтруют и фил ьтрат экстрагируют этилацетатом, в качестве

0 тест-культуры дрожжей используют штамм Rhodotorulla rubra ВКПМ Y-1337, выращивание осуществляют в условиях умеренной аэрации при 22 - 24°С, при этом в качестве ингибитора синтеза стеринов в питатель5 ную среду вводят этилацетатный экстракт, выросшие дрожжи отделяют, переносят в свежую питательную среду с добавлением нистатина или амфотерицина в концентрации 0,5 - 1,0 мкг/мл, проводят культивирование в тех же условиях и выявляют наличие

ингибиторов синтеза стеринов в продуктах по достоверному приросту биомассы дрож- метаболизма микроорганизма-продуцента жей.

Таблица

Использование: микробиологическая и медицинская промышленность, биотехнология. Сущность изобретения: испытуемый микроорганизм-продуцент культивируют в жидкой питательной среде, культуральную жидкость фильтруют и фильтрат экстрагируют этилацетатом. Тест-культуру дрожжи Rhodotonlla glutinls ВКПМ Y-1337 засевают в жидкую среду, содержащую ловастатин или этилацетатный экстракт, и выращивают в условиях умеренной аэрации при 22 - 24°С. Выросшие дрожжи отделяют.и переносят в свежую питательную среду, содержащую 0,5 - 1,0 мкг/мл нистатина или амфотерицина. Наличие ингибиторов синтеза стеринов определяют по достоверному приросту биомассы дрожжей. Способ позволяет выявить в культуральной жидкости микроорганизма-продуцента ингибитор синтеза стеринов различной химической природы даже в присутствии других функциональных и фунгистатических веществ. 4 табл.5 ил. ел С

Устойчивость к полиеновым антибиотикам дрожжей Rh. rubra ВКПМ Y-1337, выращенных в среде с ловастатином.

Устойчивость к полиеновым антибиотикам дрожжей Rh. rubra ВКПМ Y-1337, выращенных в среде с ловастатином и нистатином.

Способ

Вариант

редлагаемый

Прототип

Дрожжи со среды с 0.5 .мкг/мл ловастина и 0,1 мкг/мл ниста- тина (опыт). .

Дрожжи со среды без добавок (контроль).

Дрожжи со среды с 0,5 мкг/мл ловастатина, 0,1 мкг/мл ниста- тина -f-IO мМ мевалоната

Таблица 2

Оптическая плотность, 530 нм.

нистатин 2 мкг/мл

0,22

0,02

0.02

Рост дрожжей Rh. rubra ВКПМ Y-1337 в среде сэтилацетатными экстрактами микромицетов и чувствительность дрожжей к нистатину.

Рост дрожжей Rh. rubra ВКШИ Y-1337 в среде с этилацётатнымэкстрактом Asperglllussp. и изменение чувствительности дрожжей к нистатину.

Таблица 3

Таблица 4