Набор специфических олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации фрагмента гена N, кодирующего нуклеокапсидный белок коронавируса кошек/вируса инфекционного перитонита кошек (FCoV, FIP) Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/68 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области биотехнологии и касается набора праймеров для выявления генетического материала (кДНК) коронавируса кошек/вируса инфекционного перитонита кошек - Feline CoronaVirus, Feline InfectiousPeritonitis (FCoV, FIP) в клинических образцах. Представленный набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого ДНК-зонда содержит пару олигонуклеотидов, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в полимеразной цепной реакции, а также один флуоресцентно-меченый ДНК-зонд. Представленное изобретение позволяет проводить более достоверное и надежное выявление генетического материала - РНК/кДНК коронавируса кошек/вируса инфекционного перитонита кошек (FCoV, FIP) и может быть использовано в ветеринарии. Способ позволяет детектировать фрагмент РНК/кДНК консервативной областигена N, кодирующего нуклеокапсидный белок как коронавируса кошек (FCoV), так и вируса инфекционного перитонита кошек (FIP), общий для всех вариантов данного возбудителя, что позволяет выявлять животных, инфицированных любым вариантом вируса коронавируса кошек (FCoV), так и вируса инфекционного перитонита кошек (FIP) на любых стадиях заболевания.

Изобретение относится к наборам праймеров для выявления генетического материала - РНК/кДНК - фрагмента гена коронавируса кошек/вируса инфекционного перитонита кошек - (FCoV, FIP) в клинических образцах, секционных пробах, культуральных жидкостях и прочих биопрепаратах с целью постановки диагноза, коррекции лечения, эпидемиологического расследования, а также для решения научно-исследовательских задач свойств коронавируса кошек (FCoV) и вируса инфекционного перитонита (FIP), может быть использовано в ветеринарии.

Коронавирусная инфекция кошек (Feline CoronaVirus,FCoV) — распространенный по всему миру вирус, поражающий домашних и диких кошек, сопровождающийся бессимптомным течением, либо мягкой диареей с рвотой и легкой лихорадкой.

В силу угнетения иммунитета по причине стресса и/или инфекции вирус инфицированной кошки мутирует от безобидного авирулентного кишечного вируса в высоковирулетное заболевание, вызывающее кошачий инфекционный перитонит (Feline InfectiousPeritonitis, FIP). В силу высокой вирулентности вируса, значительно возрастает скорость его размножения в макрофагах, репликация вируса, а также производство антител. Вирулентные мутировавшие виды FCoV могут вызывать хронический, и зачастую приводящий к летальному исходу кошачий инфекционный перитонит.

Основным источником инфекции в домах, где живут кошки, питомниках и приютах для животных (превалирование до 85%) является использование обычных кошачьих лотков, где инфекционность сохраняется на протяжении недель. Выделение FCoV со слюной встречается редко, однако это возможно, особенно на ранней фазе FCoV.

Уровень техники

При разработке набора олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для диагностики РНК/кДНК фрагмента гена N, кодирующего нуклеокапсидный белок коронавируса кошек (FCoV)/вируса инфекционного перитонита кошек (FIP), был проведён сравнительный анализ структуры нуклеотидных последовательностей полных геномов коронавируса кошек и вируса инфекционного перитонита кошек (FCoV, FIP), размещенных на web-ресурсе NCBIhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/, и затем проведено конструирование праймеров и флуоресцентно-меченого зонда методом компьютерного моделирования с применением компьютерных программ BeaconDesigner v. 8.14 PREMIER Biosoft International (SanFrancisco, CA 94131-2175, США) и Vector NTI 11 (Invitrogen, США). Выравнивание геномных последовательностей осуществлялось методом Clustal W, филогенетический анализ выполняли методом невзвешенного попарного среднего - UPGMA. Проверку качества и термодинамический анализ выбранных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда выполняли с помощью программы OLIGO DNA/RNA primeranalysis software, v.5.0 и BLAST https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (США).

Амплифицируемый участок РНК/кДНК фрагмента гена N, кодирующего нуклеокапсидный белок, являясь маркерным, позволяет выявить вирусный агент в исследуемом образце. Для эффективного проведения ПЦР в режиме реального времени необходимы флуоресцентно-меченый ДНК-зонд и ДНК-затравки - праймеры (синтетические олигонуклеотиды) - строго специфичные к кДНК вирусного генома. Сложность выбора праймеров и зонда обусловлена требованием их строгой видоспецифичности. Праймеры должны быть комплементарны нуклеотидным последовательностям ДНК, ограничивая амлифицируемый участок справа и слева таким образом, чтобы синтез ДНК ДНК-полимеразой проходил строго в выбранном регионе. Флуоресцентно-меченый ДНК-зонд, в свою очередь, должен лежать внутри участка ДНК, ограниченного праймерами. Правильный выбор праймеров позволяет осуществить экспоненциальное увеличение количества копий целевого участка ДНК. Правильный выбор сочетания пары праймеров и ДНК-зонда позволяет осуществлять детекцию накопления продуктов амплификации в режиме реального времени. В целом от правильности выбора олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и зондов зависит специфичность проводимой ОТ-ПЦР, а значит, и достоверность исследования.

При компьютерном дизайне праймеров и флуоресцентно-меченого ДНК-зонда главными критериями были: абсолютная степень гомологии (комплементарность) с выбранным участком гена; отсутствие самокоплементарных участков в структуре праймеров и комплементарности их друг другу, чтобы не допускать возникновения устойчивых вторичных структур (димеров); максимальная близость значений температуры отжига праймеров.

Раскрытие сущности изобретения

Техническим результатом заявляемого изобретения является создание набора олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда, позволяющего идентифицировать в реальном времени фрагмент РНК/кДНК гена N, кодирующего нуклеокапсидный белок коронавируса кошек и вируса инфекционного перитонита кошек (FCoV, FIP) и обладающего более высокой гомологией к циркулирующим в настоящее время штаммам коронавируса кошек/вируса инфекционного перитонита кошек (FCoV, FIP), что повышает достоверность и надежность анализов.

Указанный технический результат достигается разработкой набора высокоспецифических олигодезоксирибонуклеотидных праймеров для детекции фрагмента РНК/кДНК гена N, кодирующего нуклеокапсидный белок коронавируса кошек/вируса инфекционного перитонита кошек (FCoV, FIP), содержащего пару олигонуклеотидов, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в полимеразной цепной реакции, а также флуоресцентно-меченый ДНК-зонд. Указанные олигонуклеотиды имеют следующую структуру последовательности олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда к фрагменту РНК/кДНКгена N, кодирующего нуклеокапсидный белок коронавируса кошек и вируса инфекционного перитонита кошек (FCoV, FIP):

Прямойпраймер (Forwardprimer)

VT-CoII-F 5`-GAGGAATTAMTGGTCATCGCG - 3,`

Обратный (Reverse primer)

VT-CoII-R 5`-CTAGAYCCAGACGTTAGCTCTTCC - 3`,

Флуоресцентно-меченыйДНК-зонд (Probe) 5`- 3`

VT-CoII-P 5`- (R6G)-GCACGTGTAATAGGAGGTACAAGCAAC -(BHQ2) - 3`.

Таблица 1. Характеристика разработанных праймеров и флуоресцентно-меченого ДНК-зонда

Показатель VT-CoII-F VT-CoII-R Флуоресцентно-меченый ДНК-зонд VT-CoII-P Структура от 5’ к 3’ GAGGAATTAMTGGTCATCGCG CTAGAYCCAGACGTTAGCTCTTCC (R6G)- GCACGTGTAATAGGAGGTACAAGCAAC -(BHQ2) Длина, нуклеотиды 21 24 26 Т отжига с учётом Т плавления, ºC 60 60 68 GC состав, % 48-52% 50-54% 48 Т работы фермента, ºC 68,5 68,6 78,4

Дизайн предлагаемых к патентованию праймеров и зонда включает все данные международной базы GenBank о нуклеотидных последовательностях полных геномов РНК коронавируса кошек и вируса инфекционного перитонита кошек (FCoV, FIP) по состоянию на май 2022 года. Используемые в работе праймеры и зонд обладают большей гомологией к циркулирующим в настоящее время штаммам коронавируса кошек/вируса инфекционного перитонита кошек (FCoV, FIP), что в свою очередь повышает чувствительность заявляемого набора диагностических праймеров и зонда. Мишенью для используемых в работе праймеров и зонда является высококонсервативная область гена N, кодирующего нуклеокапсидный белок коронавируса кошек и вируса инфекционного перитонита кошек.

Представляемые к патентованию олигодезоксирибонуклеотидные праймеры и флуорсцентно-меченый ДНК-зонд позволяют выявить в образце РНК/кДНК фрагмента гена N, кодирующего нуклеокапсидный белоккоронавируса кошек/вируса инфекционного перитонита кошек - (FCoV, FIP) в режиме реального времени, а также амплифицировать фрагмент ДНК, что дает возможность секвенировать полученный ампликон, с которым можно проводить молекулярно-биологические работы, а следовательно, и более глубокое изучение свойств коронавируса кошек / вируса инфекционного перитонита кошек (FCoV, FIP). Помимо этого, использование в качестве положительного контроля плазмидной конструкции, несущей специфическую вставку (как описано ниже) позволяет разработать количественную ПЦР, что в свою очередь дает возможность оценить вирусную нагрузку в исследуемом образце.

Апробация праймеров была осуществлена с использованием биотехнологической конструкции, в основе которой лежит плазмида со вставкой специфического ДНК-фрагмента. Экспериментально было показано, что выбранные праймеры и ДНК-зонд обеспечивают надежный синтез целевых ДНК-фрагментов. Специфичность амплификации дополнительно подтверждали секвенированием.

Положительные контрольные образцы были получены методом ТОРО-Т/А клонирования вирусспецифических ДНК-дуплексов в плазмиду PC DNA 3.1 (Invitrogen, США). После чего компетентные клетки E. coli линии TOP 10 (Invitrogen, США) были трансформированы полученной плазмидой, несущей типоспецифический фрагмент гена N, кодирующего нуклеокапсидный белок коронавируса кошек и вируса инфекционного перитонита кошек - (FCoV, FIP).

Важно отметить, что оптимизация условий проведения ПЦР осуществлялась с использованием наборов коммерчески доступных реагентов, приборов и ферментов, предназначенных для массового использования в лабораторной практике, что позволяет быстрое и надежное применение данного изобретения в медицинских и научно-исследовательских лабораториях.

Анализ эффективности проведенной трансформации осуществляли проведением ПЦР в режиме реального времени в соответствии с протоколом, описанным ниже, где в реакционную смесь в качестве положительного образца добавляли 1×ТЕ-буфер, содержащий рекомбинантные плазмиды, со встройкой вирусспецифического синтезированного ДНК-дуплекса. В качестве отрицательного контрольного образца в реакционную смесь добавляли 1×ТЕ-буфер.

Условия проведения амплификации оптимизировали по концентрации ионов магния, концентрации праймеров и зондов в реакционной смеси, температуре отжига праймеров.

Состав реакционной смеси моделировали таким образом, чтобы концентрация ионов MgCl₂ обеспечивала оптимальную скорость и точность работы фермента Taq-полимеразы Mut-3, концентрация дНТФ не превышала 0,4 мМ, концентрация праймеров была 10 пмоль/мкл, флуоресцентно-меченого ДНК-зонда 5 пмоль/мкл, а объем пробы составлял 5 мкл (для повышения специфичности реакции).

Таблица 2. ПЦР-смесь для проведения реакции (из расчета на одну пробирку):

Компонент Объем на 1 реакцию (20 мкл), мкл ПЦР-буфер ×10 2,5 дНТФ (25 мМ) 0,2 MgCl₂ (50 мМ) 1 Полимераза Taq-pol Mut-3 (5 ед./мкл) 0.5 Прямой праймер - VT-CoII-F (10 пмоль/мкл) 1 Обратный праймер - VT-CoII-R (10 пмоль/мкл) 1 Флуоресцентно-меченый ДНК-зонд VT-CoII-P (5 пмоль/мкл) 1 Образец (проба с ДНК) 5 diH₂O (бидистилированная) 6

Таблица 3. Температурно-временной режим проведения ПЦР

Этап Т, °С Время, сек. Количество повторов Амплификатор планшетного типа Амплификатор роторного типа Начальная денатурация 95 300 300 1 Денатурация 95 10 10 45 циклов с флуоресцентной детекцией Отжиг 58 25 измерение 25 измерение Элонгация 72 25 40 Хранение 4 ∞ ∞

Отработку условий ПЦР с использованием разработанных праймеров и флуоресцентно-меченого ДНК-зонда осуществляли на амплификаторах планшетного типа «ДТ-96», «ДТ-Прайм», «ДТ-Лайт» («ДНК-Технология», Россия) и роторного типа «RotorGeneQ» (QIAGEN, ФРГ).

Для определения чувствительности способа выделенные пробы ДНК (мазки и смывы) подвергали десятикратным разведениям от 10^-1 до 10^-5. Полученные разведения исследовали методом ПЦР с применением разработанных специфических олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого ДНК-зонда.

Специфичность разработанного способа проверяли на образцах коронавируса кошек и вируса инфекционного перитонита кошек(FCoV, FIP), а также на образцах биологического материала, полученных от интактных и серонегативных животных в отношении коронавируса кошек и вируса инфекционного перитонита кошек (FCoV, FIP), а также с помощью метода секвенирования по Сэнгеру на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 3500 (США) - фиг.1, фиг.2, фиг.3 в приложении «Схема».

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан набор праймеров для выявления генетического материала коронавируса кошек/вируса инфекционного перитонита кошек (FCoV, FIP) в клинических образцах. Представленный набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого ДНК-зонда содержит пару олигонуклеотидов, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в полимеразной цепной реакции, а также один флуоресцентно-меченый ДНК-зонд. Представленное изобретение позволяет проводить более достоверное и надежное выявление генетического материала коронавируса кошек/вируса инфекционного перитонита кошек (FCoV, FIP). Изобретение позволяет детектировать фрагмент консервативной области гена N, кодирующего нуклеокапсидный белок как коронавируса кошек (FCoV), так и вируса инфекционного перитонита кошек (FIP), общий для всех вариантов данного возбудителя, что позволяет выявлять животных, инфицированных любым вариантом вируса коронавируса кошек (FCoV) и вируса инфекционного перитонита кошек (FIP) на любых стадиях заболевания, повышает достоверность и надежность анализов. 3 табл., 3 ил.

Набор специфических олигодезоксирибонуклеотидных праймеров VT-CoII-F 5`-GAGGAATTAMTGGTCATCGCG-3`, VT-CoII-R 5`-CTAGAYCCAGACGTTAGCTCTTCC-3` и флуоресцентно-меченого зонда VT-CoII-P 5`- (R6G)- GCACGTGTAATAGGAGGTACAAGCAAC -(BHQ2) -3` для идентификации РНК/кДНК фрагмента гена N, кодирующего нуклеокапсидный белок коронавируса кошек/вируса инфекционного перитонита кошек (FCoV, FIP).