Набор специфических олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда к фрагменту гена Pertactin Bordetella parapertussis и Bordetella bronchiseptica для детекции возбудителей бордетеллёза у животных Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/68 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области биотехнологии и касается набора высокоспецифических праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для выявления генетического материала ДНК-фрагмента гена Pertactin (Pertactin autotransporter, prn (omp69A)) Bordetella parapertussis и Bordetella bronchiseptica для детекции возбудителей бордетеллеза у кошек, собак, свиней, кроликов. Представленный набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого ДНК-зонда содержит пару олигонуклеотидов, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в полимеразной цепной реакции, а также один флуоресцентно-меченый ДНК-зонд. Представленное изобретение позволяет проводить более достоверное и надежное выявление генетического материала ДНК-фрагмента гена Pertactin (Pertactin autotransporter, prn (omp69A)) Bordetella parapertussis и Bordetella bronchiseptica для детекции возбудителей бордетеллеза у кошек, собак, свиней, кроликов и может быть использовано в ветеринарии. Способ позволяет детектировать фрагмент консервативной области гена Pertactin (Pertactin autotransporter, prn (omp69A)) Bordetella parapertussis и Bordetella bronchiseptica, что позволяет выявлять животных, инфицированных Bordetella parapertussis и Bordetella bronchiseptica на любых стадиях заболевания.

Изобретение относится к наборам праймеров для выявления генетического материала ДНК-фрагмента гена Pertactin (Pertactin autotransporter, prn (omp69A)) Bordetella parapertussis и Bordetella bronchiseptica, в клинических образцах, секционных пробах, культуральных жидкостях и прочих биопрепаратах с целью постановки диагноза, коррекции лечения, эпидемиологического расследования, а также для решения научно-исследовательских задач свойств Bordetella parapertussis и Bordetella bronchiseptica, и может быть использовано в ветеринарии.

Бордетеллез - инфекционное заболевание собак, кошек, свиней, проявляющееся воспалением трахеи, бронхов и легких. Основным клиническим синдромом является нарушение дыхания: кашлем, одышкой, повышением температуры. Часто наблюдается сочетанное протекание с другими инфекциями. Входит в группу инфекций, называемых «питомниковым кашлем» или инфекционным трахеобронхитом. У кошек Bordetella bronchiseptica, наряду с кошачьим калицивирусом (FCV) и герпесвирусом (FHV), Chlamydophila felis, входит в число возбудителей заболеваний верхних дыхательных путей (URTD).

Bordetella bronchiseptica и Bordetella parapertussis являются распространенной причиной возникновения респираторных заболеваний у домашних животных (кошек, собак, кроликов, свиней).

Bordetella bronchiseptica наиболее часто поражает бездомных кошек, а также животных, содержащихся в питомнике и свободно выходящих на улицу.

К бордетеллезу восприимчивы животные всех возрастов, но наибольшая заболеваемость отмечается среди молодняка, собак и кошек до года.

Источником заражения являются заболевшие и выздоравливающие животные, а также бессимптомные носители бактерии, которые, не проявляя заболевание, клинически выделяют возбудителя из дыхательных путей. Кошки с клиническими проявлениями FHV-1 или калицивиpусной инфекции (FCV) выделяют Bordetella bronchiseptica более длительный период времени, чем моноинфицированные Bordetella bronchiseptica животные.

Попав в респираторный тракт, Bordetella bronchiseptica прикрепляется к реснитчатым клеткам с помощью фимбрий - нитевидных выростов на поверхности бактерии. Прикрепившись, Bordetella bronchiseptica в процессе своей жизнедеятельности вырабатывает токсины, которые нарушают местные защитные механизмы, подавляющие активность ресничек мерцательного эпителия респираторного тракта и фагоцитоз, что в свою очередь вызывает повреждение тканей и облегчает всасывание токсинов в эпителиальные клетки.

Токсин, вырабатываемый Bordetella bronchiseptica и Bordetella parapertussis, подобно многим бактериальным экзотоксинам с ферментативной активностью, содержит две субъединицы - A и В. Субъединица-В, связываясь с рецепторами клеток-мишеней, обеспечивает доставку к ним субъединицы-A. Токсины обладают биологической активностью, в частности, стимулирует пролиферацию Т-лимфоцитов, лимфоцитоз, увеличение выработки простогландинов, сенсибилизацию, усиление ряда функций иммунной системы, к примеру, функции образования IgG- и IgE-антител.

После инфицирования в организме животного происходит быстрый рост числа антител к B Bordetella bronchiseptica и Bordetella parapertussis, однако продолжительность их жизни не изучена.

Болезнь может протекать в острой, подострой и хронической формах. Инкубационный период составляет от 5 - до 20 дней. Вначале отмечают снижение аппетита, вялость , чихание и выделение слизи из носа. Потом появляется кашель, усиливающийся при вставании, движении. Температура тела повышается до 40-41°С, больные животные угнетены, отказываются от корма, неохотно поднимаются и подолгу лежат. Часто симптомы бордетеллеза у взрослых у кошек являются невыраженными, при этом котята страдают более серьезно, чем может показаться, и в некоторых случаях болезнь может быстро прогрессировать до бронхопневмонии и привести к смерти. Бордетеллез может сопровождаться продуктивным кашлем с выделением мокроты.

При хроническом течении у животных отмечается ринит и конъюнктивит с выделениями из глаз и носа. У кошек и собаки набор симптомы бордетеллеза обычно включает: кашель (чаще у кошек, реже у собак), чихание, выделения из носа, глазные симптомы, лихорадка, потеря аппетита, увеличение подчелюстных лимфатических узлов.

Тяжелее заболевание протекает у котят и щенков до 12-недельного возраста.

Основными методами выявления возбудителя являются бактериологический метод и ПЦР. Образцы для диагностики получают путем ротоглоточного мазка или трансназальных/бронхоальвеолярных смывов.

ПЦР. Полимеразная цепная реакция является наиболее перспективным методом диагностики бордетеллеза. Чувствительность метода довольно высока и позволяет обнаружить даже несколько бактерий во взятых образцах образце, а специфичность метода близка к 100 %.

Серологическая диагностика. Этот диагностический метод основан на определении уровня специфических антител к определенным антигенам, но в диагностике бордетеллеза имеет ограниченное значение, т. к. серопозитивными являются практически 100 % популяции животных.

Уровень техники

При разработке набора олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для диагностики ДНК-фрагмента гена Pertactin (Pertactin autotransporter, prn (omp69A)) Bordetella parapertussis и Bordetella bronchiseptica, был проведен сравнительный анализ структуры нуклеотидных последовательностей гена Pertactin (Pertactin autotransporter, prn (omp69A)) Bordetella parapertussis и Bordetella bronchiseptica, размещенных на web-ресурсе NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/, и затем проведено конструирование праймеров и флуоресцентно-меченого зонда методом компьютерного моделирования с применением компьютерных программ Beacon Designer v. 8.14 PREMIER Biosoft International (San Francisco, CA 94131-2175, США) и Vector NTI 11 (Invitrogen, США). Выравнивание геномных последовательностей осуществлялось методом Clustal W, филогенетический анализ выполняли методом невзвешенного попарного среднего - UPGMA. Проверку качества и термодинамический анализ выбранных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда выполняли с помощью программы OLIGO DNA/RNA primer analysis software, v.5.0 и BLAST https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (США).

Амплифицируемый участок кДНК, являясь маркерным, позволяет выявить вирусный агент в исследуемом образце. Для эффективного проведения ПЦР в режиме реального времени необходимы флуоресцентно-меченый ДНК-зонд и ДНК-затравки - праймеры (синтетические олигонуклеотиды) - строго специфичные к кДНК вирусного генома. Сложность выбора праймеров и зонда обусловлена требованием их строгой видоспецифичности. Праймеры должны быть комплементарны нуклеотидным последовательностям ДНК, ограничивая амплифицируемый участок справа и слева таким образом, чтобы синтез ДНК ДНК-полимеразой проходил строго в выбранном регионе. Флуоресцентно-меченый ДНК-зонд, в свою очередь, должен лежать внутри участка ДНК, ограниченного праймерами. Правильный выбор праймеров позволяет осуществить экспоненциальное увеличение количества копий целевого участка ДНК. Правильный выбор сочетания пары праймеров и ДНК-зонда позволяет осуществлять детекцию накопления продуктов амплификации в режиме реального времени. В целом от правильности выбора олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и зондов зависит специфичность проводимой ОТ-ПЦР, а значит, и достоверность исследования.

При компьютерном дизайне праймеров и флуоресцентно-меченого ДНК-зонда главными критериями были: абсолютная степень гомологии (комплементарность) с выбранным участком гена; отсутствие самокоплементарных участков в структуре праймеров и комплементарности их друг другу, чтобы не допускать возникновения устойчивых вторичных структур (димеров); максимальная близость значений температуры отжига праймеров.

Раскрытие сущности изобретения

Техническим результатом заявляемого изобретения является создание набора олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда, позволяющего идентифицировать в реальном времени ДНК-фрагмента гена Pertactin (Pertactin autotransporter, prn (omp69A)) Bordetella parapertussis и Bordetella bronchiseptica и обладающего более высокой гомологией к циркулирующим в настоящее время штаммам и аллельным вариантам Bordetella parapertussis и Bordetella bronchiseptica, что повышает достоверность и надежность анализов.

Указанный технический результат достигается разработкой набора высокоспецифических олигодезоксирибонуклеотидных праймеров для ДНК-детекции фрагмента гена Pertactin (Pertactin autotransporter, prn (omp69A)) Bordetella parapertussis и Bordetella bronchiseptica, содержащего пару олигонуклеотидов, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в полимеразной цепной реакции, а также флуоресцентно-меченый ДНК-зонд. Указанные олигонуклеотиды имеют следующую структуру:

Последовательности олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда к фрагменту гена Pertactin (Pertactin autotransporter, prn (omp69A)) Bordetella parapertussis и Bordetella bronchiseptica.

Прямой праймер (Forward primer) 5'→3'

VT-Bd-F 5'-GGAACAACCAGTCCATSATCAAG-3'

Обратный (Reverse primer) 5'→3'

VT-Bd-R 5'-CTGTCCCGAAGACGTGAC-3'

Флуоресцентно-меченый ДНК-зонд (Probe) 5'→3'

VT-Bd-P 5'- (R6G)-GGAACGACCATCAAGGTAAGCGG-(BHQ2) -3'

Таблица 1. Характеристика разработанных праймеров и флуоресцентно-меченого ДНК-зонда Показатель VT-Bd-F VT-Bd-R Флуоресцентно-меченый ДНК-зонд VT-Bd-P Структура от 5’ к 3’ GGAACAACCAGTCCATSATCAAG CTGTCCCGAAGACGTGAC (R6G)- GGAACGACCATCAAGGTAAGCGG-(BHQ2) Длина, нуклеотиды 23 18 23 Т отжига с учетом Т плавления, °C 60 60 67 GC состав, % 48 61 57 Т работы фермента, °C 68,7 68,5 76,6

Дизайн предлагаемых к патентованию праймеров и зонда включает все данные международной базы GenBank о нуклеотидных последовательностях гена Pertactin (Pertactin autotransporter, prn (omp69A)) Bordetella parapertussis и Bordetella bronchiseptica по состоянию на май 2022 года. Используемые в работе праймеры и зонд обладают большей гомологией к циркулирующим в настоящее время штаммам и аллельным вариантам Bordetella parapertussis и Bordetella bronchiseptica, что в свою очередь повышает чувствительность заявляемого набора диагностических праймеров и зонда. Мишенью для используемых в работе праймеров и зонда является высококонсервативная область гена Pertactin (Pertactin autotransporter, prn (omp69A)) Bordetella parapertussis и Bordetella bronchiseptica.

Представляемые к патентованию олигодезоксирибонуклеотидные праймеры и флуоресцентно-меченый ДНК-зонд позволяют выявить в образце фрагмент ДНК-гена Pertactin (Pertactin autotransporter, prn (omp69A)) Bordetella parapertussis и Bordetella bronchiseptica в режиме реального времени, а также амплифицировать фрагмент ДНК, что дает возможность секвенировать полученный ампликон, с которым можно проводить молекулярно-биологические работы, а следовательно, и более глубокое изучение свойств Bordetella parapertussis и Bordetella bronchiseptica. Помимо этого, использование в качестве положительного контроля плазмидной конструкции несущей специфическую вставку (как описано ниже) позволяет разработать количественную ПЦР, что в свою очередь дает возможность оценить вирусную нагрузку в исследуемом образце.

Апробация праймеров была осуществлена с использованием биотехнологической конструкции, в основе которой лежит плазмида со вставкой специфического ДНК-фрагмента. Экспериментально было показано, что выбранные праймеры и ДНК-зонд обеспечивают надежный синтез целевых ДНК-фрагментов. Специфичность амплификации дополнительно подтверждали секвенированием.

Положительные контрольные образцы были получены методом ТОРО-Т/А клонирования вирусспецифических ДНК-дуплексов в плазмиду PC DNA 3.1 (Invitrogen, США). После чего компетентные клетки E. coli линии TOP 10 (Invitrogen, США) были трансформированы полученной плазмидой, несущей типоспецифический фрагмент гена Pertactin (Pertactin autotransporter, prn (omp69A)) Bordetella parapertussis и Bordetella bronchiseptica.

Важно отметить, что оптимизация условий проведения ПЦР осуществлялась с использованием наборов коммерчески доступных реагентов, приборов и ферментов, предназначенных для массового использования в лабораторной практике, что позволяет быстрое и надежное применение данного изобретения в медицинских и научно-исследовательских лабораториях.

Анализ эффективности проведенной трансформации осуществляли проведением ПЦР в режиме реального времени в соответствии с протоколом, описанным ниже, где в реакционную смесь в качестве положительного образца добавляли 1×ТЕ-буфер, содержащий рекомбинантные плазмиды, со встройкой вирусспецифического синтезированного ДНК-дуплекса. В качестве отрицательного контрольного образца в реакционную смесь добавляли 1×ТЕ-буфер.

Условия проведения амплификации оптимизировали по концентрации ионов магния, концентрации праймеров и зондов в реакционной смеси, температуре отжига праймеров.

Состав реакционной смеси моделировали таким образом, чтобы концентрация ионов MgCl₂ обеспечивала оптимальную скорость и точность работы фермента Taq-полимеразы Mut-3, концентрация дНТФ не превышала 0,4 мМ, концентрация праймеров была 10 пмоль/мкл, флуоресцентно-меченого ДНК-зонда 5 пмоль/мкл, а объем пробы составлял 5 мкл (для повышения специфичности реакции).

Таблица 2. ПЦР-смесь для проведения реакции (из расчета на одну пробирку): Компонент Объем на 1 реакцию (20 мкл), мкл ПЦР-буфер ×10 2,5 дНТФ (25 мМ) 0,2 MgCl₂ (50 мМ) 1 Полимераза Taq-pol Mut-3 (5 ед./мкл) 0.5 Прямой праймер - VT-Bd-F (10 пмоль/мкл) 1 Обратный праймер - VT-Bd-R (10 пмоль/мкл) 1 Флуоресцентно-меченый ДНК-зонд VT-Bd-P (5 пмоль/мкл) 1 Образец (проба с ДНК) 5 diH₂O(бидистиллированная) 6

Таблица 3. Температурно-временной режим проведения ПЦР Этап Т, °С Время, сек. Количество повторов Амплификатор планшетного типа Амплификатор роторного типа Начальная денатурация 95 300 300 1 Денатурация 95 10 10 45 циклов с флуоресцентной детекцией Отжиг 58 25 измерение 25 измерение Элонгация 72 25 40 Хранение 4 ∞ ∞

Отработку условий ПЦР с использованием разработанных праймеров и флуоресцентно-меченого ДНК-зонда осуществляли на амплификаторах планшетного типа «ДТ-96», «ДТ-Прайм», «ДТ-Лайт» («ДНК-Технология», Россия) и роторного типа «Rotor Gene Q» (QIAGEN, ФРГ).

Для определения чувствительности способа выделенные пробы ДНК (мазки и смывы) подвергали десятикратным разведениям от 10^-1 до 10^-5. Полученные разведения исследовали методом ПЦР с применением разработанных специфических олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого ДНК-зонда.

Специфичность разработанного способа проверяли на образцах Bordetella parapertussis и Bordetella bronchiseptica, а также на образцах биологического материала, полученных от интактных и серонегативных животных в отношении Bordetella parapertussis и Bordetella bronchiseptica. а также с помощью метода секвенирования по Сэнгеру на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 3500 (США) фиг.1, фиг.2, фиг.3 в приложении «Схема».

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Последовательности специфических олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и

флуоресцентного зонда к фрагменту гена Pertactin бактерий Bordetella

parapertussis и Bordetella bronchiseptica для детекции возбудителей

бордетеллёза у животных.

Прямой праймер (Forward primer) 5'→3'

VT-Bd-F 5'-GGAACAACCAGTCCATSATCAAG-3'

Обратный (Reverse primer) 5'→3'

VT-Bd-R 5'-CTGTCCCGAAGACGTGAC-3'

Флуоресцентно-меченый ДНК-зонд (Probe) 5'→3'

VT-Bd-P 5'-(R6G)-GGAACGACCATCAAGGTAAGCGG-(BHQ2)-3'

<---

Изобретение относится к биотехнологии. Описан набор высокоспецифических праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для выявления генетического материала ДНК-фрагмента гена Pertactin Bordetella parapertussis и Bordetella bronchiseptica для детекции возбудителей бордетеллеза у кошек, собак, свиней, кроликов. Набор содержит: прямой праймер 5'→3'

VT-Bd-F 5'-GGAACAACCAGTCCATSATCAAG-3', обратный 5'→3'

VT-Bd-R 5'-CTGTCCCGAAGACGTGAC-3', флуоресцентно-меченый ДНК-зонд (Probe) 5'→3'

VT-Bd-P 5'-(R6G)-GGAACGACCATCAAGGTAAGCGG-(BHQ2)-3'. Изобретение позволяет идентифицировать в реальном времени ДНК-фрагмент гена Pertactin Bordetella parapertussis и Bordetella bronchiseptica. Набор обладает более высокой гомологией к штаммам и аллельным вариантам Bordetella parapertussis и Bordetella bronchiseptica, что повышает достоверность и надежность анализов. 3 ил., 3 табл.

Набор специфических олигодезоксирибонуклеотидных праймеров

VT-Bd-F 5'-GGAACAACCAGTCCATSATCAAG-3',

VT-Bd-R 5'-CTGTCCCGAAGACGTGAC-3',

и флуоресцентно-меченого зонда

VT-Bd-P 5'-(R6G)-GGAACGACCATCAAGGTAAGCGG-(BHQ2)-3',

к фрагменту гена Pertactin бактерий Bordetella parapertussis и Bordetella bronchiseptica для детекции возбудителей бордетеллёза у животных.