Набор специфических олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда к фрагменту гена nucleocapsid protein (N) Canine morbillivirus (Canine Distemper Virus, CDV) для детекции Чумы плотоядных (болезнь Карре, чумка) у собак - ПЦР тест-система в режиме реального времени Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/68 

Область техники, к которой относится изобретение:

Изобретение относится к области биотехнологии и касается набора высокоспецифических праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для выявления генетического материала (РНК, кДНК) фрагмента гена nucleocapsid protein (N) Canine morbillivirus (Canine Distemper Virus, CDV) для детекции Чумы плотоядных (болезнь Карре, чумка) у собак. Представленный набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого ДНК-зонда содержит пару олигонуклеотидов, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в полимеразной цепной реакции, а также один флуоресцентно-меченый ДНК-зонд. Представленное изобретение позволяет проводить более достоверное и надежное выявление генетического материала (РНК, кДНК) фрагмента гена nucleocapsid protein (N) Canine morbillivirus (Canine Distemper Virus, CDV) для детекции Чумы плотоядных (болезнь Карре, чумка) у собак и может быть использовано в ветеринарии. Способ позволяет детектировать фрагмент консервативной области гена nucleocapsid protein (N) Canine morbillivirus (Canine Distemper Virus, CDV) – возбудителя Чумы плотоядных (болезнь Карре, чумка) у собак, что позволяет выявлять животных, инфицированных Canine morbillivirus (Canine Distemper Virus, CDV) (Чума плотоядных, болезнь Карре, чумка) у собак на любых стадиях заболевания.

Изобретение относится к наборам праймеров для выявления генетического материала (РНК, кДНК) фрагмента гена nucleocapsid protein (N) Canine morbillivirus (Canine Distemper Virus, CDV) (Чума плотоядных, болезнь Карре, чумка), в клинических образцах, секционных пробах, культуральных жидкостях и прочих биопрепаратах с целью постановки диагноза, коррекции лечения, эпидемиологического расследования, а также для решения научно-исследовательских задач свойств Canine morbillivirus (Canine Distemper Virus, CDV) (Чума плотоядных, болезнь Карре, чумка), и может быть использовано в ветеринарии.

Чума собак (чума плотоядных, болезнь Карре, чумка) - острая или подострая контагиозная вирусная болезнь, проявляющаяся лихорадкой, катаральным воспалением слизистых оболочек, поражениями кожи, центральной нервной системы или сочетанием этих признаков.

Чума известна со времён одомашнивания собак. Распространена повсеместно. В Российской империи появилась в 1762 году в Крыму и получила название «крымской болезни». Вирусную природу чумы собак в 1905 году впервые доказал учёный Карре.

Возбудителем болезни является вирус Canine Distemper, который также называется Canine Morbillivirus. Этот вирус принадлежит семейству парамиксовирусы. Заражение чумой происходит через дыхательные пути и пищеварительный аппарат. Попав в организм, вирус чумы попадает в кровь и ткани. Способствуют и предрасполагают к заболеванию чумой простуда, неполноценное кормление, недостаток витаминов в корме, плохие условия содержания собак. В окружающую среду вирус выделяется с истечениями из глаз, носа и рта, с калом, мочой, отмершим эпителием кожи. Основной источник заражения - больные животные, предметы ухода, кормушки, инвентарь, помещения и подстилка, где содержались больные животные, а также механические переносчики - человек, транспортные средства.

К чуме восприимчивы домашние собаки и дикие собакообразные, а среди кошкообразных - некоторые представители кошачьих и виверровых. В Восточной Африке домашние или одичавшие собаки передают вирус чумы львам, пятнистым гиенам и гиеновидным собакам, что приводит к высокой смертности среди этих диких видов.

От момента заражения до появления первых признаков происходит скрытый период болезни, который продолжается от трех до 21-го дня. В этот период болезни собака кажется здоровой, но может заражать других собак. Начало заболевания определить трудно. Первые признаки: небольшое угнетение, вялость, легкая утомляемость, взъерошенная шерсть, уменьшение аппетита, иногда рвота, частичный отказ от работы, покраснение слизистых оболочек глаз, носа, рта, незначительное прозрачное истечение из носа и глаз, появление небольшого поноса. Эти признаки выражены у одних собак сильнее, у других слабее. В самом начале заболевания температура повышенная (39,5 - 40), держится 2-3 дня, а затем снижается до нормальной. У наиболее крепких собак на этом заканчивается течение болезни и наступает выздоровление. У слабых - повышается температура и ухудшается самочувствие. В разгаре болезни или при начавшемся улучшении появляются поражения нервной системы. К симптомам также относятся периодические судороги у собак.

Чума плотоядных может протекать молниеносно, сверхостро, остро, подостро, абортивно, типично и атипично. По клиническим признакам различают катаральную, легочную, кишечную, кожную, нервную и смешанную (генерализованную) формы болезни. Развитие той или иной формы чумы определяется реактивностью организма животного. Один и тот же штамм возбудителя может вызывать у собак разнотипные клинические признаки.

Чаще заболевание протекает с патологией в различных тканях, так как вирус чумы плотоядных является пантропным вирусом, то есть поражает клетки всех систем организма. Поэтому разделение на различные формы болезни весьма условно.

Летальность среди щенков до 3-месячного возраста составляет 30-100 %.

Вирус чумы, проникнув в организм, вначале попадает в кровяное русло, обусловливает появление лихорадки и угнетённое состояние. С кровью вирус разносится во внутренние органы, центральную нервную систему, вызывая в последних воспалительные и дегенеративные изменения. В дальнейшем развивается катаральное воспаление слизистых оболочек, вследствие чего в организм может проникнуть различная микрофлора и вызвать тяжёлые осложнения

Для лабораторной диагностики чумы плотоядных, в частности для обнаружения (индикации) возбудителя и его идентификации (определение видовой принадлежности) применяют следующие методы:

метод флуоресцирующих антител прямой (МФА) - для установления раннего прижизненного диагноза, материалом служат мазки-отпечатки; в основе люминесцентная микроскопия соединений антигена, с меченным антителом. При исследовании недавно вакцинированных, возможны ложноположительные результаты.

иммуноферментный анализ (ИФА) - для установления раннего прижизненного диагноза; разработаны промышленные диагностикумы на полистироловых пластинах для выявления специфического антигена вируса; материал - пробы крови, смывы из глаз и глотки. При исследовании недавно вакцинированных, возможны ложноположительные результаты.

реакция нейтрализации (РН) - для идентификации вируса в культуре клеток;

реакция диффузной преципитации (РДП) - позволяет обнаруживать возбудитель на 3-4-й день болезни;

реакция связывания комплемента (РСК) - для обнаружения антигена в органах и тканях больных животных и в культуре клеток;

реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) - для выявления специфических антител к возбудителю;

реакция пассивной гемагглютинации (РПГА);

биопроба на восприимчивость животных.

цитологические исследования по обнаружению телец-включений в мазках со слизистых и аутопсийных тканях.

экспресс-тесты на выявление антигена. При исследовании недавно вакцинированных, возможны ложноположительные результаты.

полимеразная цепная реакция (ПЦР) по выделению РНК вируса. Высокая специфичность и чувствительность. При исследовании недавно вакцинированных, возможны ложноположительные результаты.

Уровень техники

При разработке набора олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для детекции РНК, кДНК фрагмента гена nucleocapsid protein (N) Canine morbillivirus (Canine Distemper Virus, CDV) - возбудителя Чумы плотоядных (болезнь Карре, чумка) у собак, был проведен сравнительный анализ структуры нуклеотидных последовательностей гена nucleocapsid protein (N) Canine morbillivirus (Canine Distemper Virus, CDV), размещенных на web-ресурсе NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/, и затем проведено конструирование праймеров и флуоресцентно-меченого зонда методом компьютерного моделирования с применением компьютерных программ Beacon Designer v. 8.14 PREMIER Biosoft International (San Francisco, CA 94131-2175, США) и Vector NTI 11 (Invitrogen, США). Выравнивание геномных последовательностей осуществлялось методом Clustal W, филогенетический анализ выполняли методом невзвешенного попарного среднего - UPGMA. Проверку качества и термодинамический анализ выбранных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда выполняли с помощью программы OLIGO DNA/RNA primer analysis software, v.5.0 и BLAST https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (США).

Амплифицируемый участок кДНК, являясь маркерным, позволяет выявить вирусный агент в исследуемом образце. Для эффективного проведения ПЦР в режиме реального времени необходимы флуоресцентно-меченый ДНК-зонд и ДНК-затравки - праймеры (синтетические олигонуклеотиды) - строго специфичные к кДНК вирусного генома. Сложность выбора праймеров и зонда обусловлена требованием их строгой видоспецифичности. Праймеры должны быть комплементарны нуклеотидным последовательностям ДНК, ограничивая амлифицируемый участок справа и слева таким образом, чтобы синтез ДНК ДНК-полимеразой проходил строго в выбранном регионе. Флуоресцентно-меченый ДНК-зонд, в свою очередь, должен лежать внутри участка ДНК, ограниченного праймерами. Правильный выбор праймеров позволяет осуществить экспоненциальное увеличение количества копий целевого участка ДНК. Правильный выбор сочетания пары праймеров и ДНК-зонда позволяет осуществлять детекцию накопления продуктов амплификации в режиме реального времени. В целом от правильности выбора олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и зондов зависит специфичность проводимой ОТ-ПЦР, а значит, и достоверность исследования.

При компьютерном дизайне праймеров и флуоресцентно-меченого ДНК-зонда главными критериями были: абсолютная степень гомологии (комплементарность) с выбранным участком гена; отсутствие самокоплементарных участков в структуре праймеров и комплементарности их друг другу, чтобы не допускать возникновения устойчивых вторичных структур (димеров); максимальная близость значений температуры отжига праймеров.

Раскрытие сущности изобретения

Техническим результатом заявляемого изобретения является создание набора олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда, позволяющего идентифицировать в реальном времени ДНК фрагмента гена nucleocapsid protein (N) Canine morbillivirus (Canine Distemper Virus, CDV) и обладающего более высокой гомологией к циркулирующим в настоящее время штаммам Canine morbillivirus (Canine Distemper Virus, CDV), что повышает достоверность и надежность анализов.

Указанный технический результат достигается разработкой набора высокоспецифических олигодезоксирибонуклеотидных праймеров для ДНК детекции фрагмента гена Canine morbillivirus (Canine Distemper Virus, CDV), содержащего пару олигонуклеотидов, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в полимеразной цепной реакции, а также флуоресцентно-меченый ДНК-зонд. Указанные олигонуклеотиды имеют следующую структуру:

Последовательности олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда к фрагменту гена Canine morbillivirus (Canine Distemper Virus, CDV).

Прямой праймер (Forward primer) 5'→3'

VT-CDV-F 5'- TCGGAGATGAGAAGGTGGATTA -3'

Обратный (Reverse primer) 5'→3'

VT-CDV-R 5'- TCAGCAATTCTAGGCTTGTTCC -3'

Флуоресцентно-меченый ДНК-зонд (Probe) 5'→3'

VT-CDV-P 5'- (R6G) - CCAAGATGAGTGCTACCATGAACCGCC -(BHQ2) -3'

Таблица 1. Характеристика разработанных праймеров и флуоресцентно-меченого ДНК-зонда Показатель VT-CDV-F VT-CDV-R Флуоресцентно-меченый ДНК-зонд VT-CDV-P Структура от 5’ к 3’ TCGGAGATGAGAAGGTGGATTA TCAGCAATTCTAGGCTTGTTCC (R6G)- CCAAGATGAGTGCTACCATGAACCGCC -(BHQ2) Длина, нуклеотиды 22 22 23 Т отжига с учетом Т плавления, °C 60 60 71 GC состав, % 45 45 56 Т работы фермента, °C 67,1 67,4 76,2

Дизайн предлагаемых к патентованию праймеров и зонда включает все данные международной базы GenBank о нуклеотидных последовательностях гена nucleocapsid protein (N) Canine morbillivirus (Canine Distemper Virus, CDV) по состоянию на май 2022 года. Используемые в работе праймеры и зонд обладают большей гомологией к циркулирующим в настоящее время штаммам Canine morbillivirus (Canine Distemper Virus, CDV), что в свою очередь повышает чувствительность заявляемого набора диагностических праймеров и зонда. Мишенью для используемых в работе праймеров и зонда является высококонсервативная область гена nucleocapsid protein (N) Canine morbillivirus (Canine Distemper Virus, CDV).

Представляемые к патентованию олигодезоксирибонуклеотидные праймеры и флуорсцентно-меченый ДНК-зонд позволяют выявить в образце фргамент РНК, кДНК гена nucleocapsid protein (N) Canine morbillivirus (Canine Distemper Virus, CDV) в режиме реального времени, а также амплифицировать фрагмент ДНК, что дает возможность секвенировать полученный ампликон, с которым можно проводить молекулярно-биологические работы, а следовательно, и более глубокое изучение свойств Canine morbillivirus (Canine Distemper Virus, CDV) - возбудителя Чумы плотоядных (болезнь Карре, чумка) у собак. Помимо этого, использование в качестве положительного контроля плазмидной конструкции несущей специфическую вставку (как описано ниже) позволяет разработать количественную ПЦР, что в свою очередь дает возможность оценить вирусную нагрузку в исследуемом образце.

Апробация праймеров была осуществлена с использованием биотехнологической конструкции, в основе которой лежит плазмида со вставкой специфического ДНК-фрагмента. Экспериментально было показано, что выбранные праймеры и ДНК-зонд обеспечивают надежный синтез целевых ДНК-фрагментов. Специфичность амплификации дополнительно подтверждали секвенированием.

Положительные контрольные образцы были получены методом ТОРО-Т/А клонирования вирусспецифических ДНК-дуплексов в плазмиду PC DNA 3.1 (Invitrogen, США). После чего компетентные клетки E. coli линии TOP 10 (Invitrogen, США) были трансформированы полученной плазмидой, несущей типоспецифический фрагмент гена nucleocapsid protein (N) Canine morbillivirus (Canine Distemper Virus, CDV).

Важно отметить, что оптимизация условий проведения ПЦР осуществлялась с использованием наборов коммерчески доступных реагентов, приборов и ферментов, предназначенных для массового использования в лабораторной практике, что позволяет быстрое и надежное применение данного изобретения в медицинских и научно-исследовательских лабораториях.

Анализ эффективности проведенной трансформации осуществляли проведением ПЦР в режиме реального времени в соответствии с протоколом, описанным ниже, где в реакционную смесь в качестве положительного образца добавляли 1×ТЕ-буфер, содержащий рекомбинантные плазмиды, со встройкой вирусспецифического синтезированного ДНК-дуплекса. В качестве отрицательного контрольного образца в реакционную смесь добавляли 1×ТЕ-буфер.

Условия проведения амплификации оптимизировали по концентрации ионов магния, концентрации праймеров и зондов в реакционной смеси, температуре отжига праймеров.

Состав реакционной смеси моделировали таким образом, чтобы концентрация ионов MgCl₂ обеспечивала оптимальную скорость и точность работы фермента Taq-полимеразы Mut-3, концентрация дНТФ не превышала 0,4 мМ, концентрация праймеров была 10 пмоль/мкл, флуоресцентно-меченого ДНК-зонда 5 пмоль/мкл, а объем пробы составлял 5 мкл (для повышения специфичности реакции).

Таблица 2. ПЦР-смесь для проведения реакции (из расчета на одну пробирку): Компонент Объем на 1 реакцию (20 мкл), мкл ПЦР-буфер ×10 2,5 дНТФ (25 мМ) 0,2 MgCl₂ (50 мМ) 1 Полимераза Taq-pol Mut-3 (5 ед./мкл) 0.5 Прямой праймер - VT-CDV -F (10 пмоль/мкл) 1 Обратный праймер - VT-CDV-R (10 пмоль/мкл) 1 Флуоресцентно-меченый ДНК-зонд VT-CDV-P (5 пмоль/мкл) 1 Образец (проба с ДНК) 5 diH₂O (бидистилированная) 6 Таблица 3. Температурно-временной режим проведения ПЦР Этап Т, °С Время, сек. Количество повторов Амплификатор планшетного типа Амплификатор роторного типа Начальная денатурация 95 300 300 1 Денатурация 95 10 10 45 циклов с флуоресцентной детекцией Отжиг 58 25 измерение 25 измерение Элонгация 72 25 40 Хранение 4 ∞ ∞

Отработку условий ПЦР с использованием разработанных праймеров и флуоресцентно-меченого ДНК-зонда осуществляли на амплификаторах планшетного типа «ДТ-96», «ДТ-Прайм», «ДТ-Лайт» («ДНК-Технология», Россия) и роторного типа «Rotor Gene Q» (QIAGEN, ФРГ).

Для определения чувствительности способа выделенные пробы ДНК (мазки и смывы) подвергали десятикратным разведениям от 10^-1 до 10^-5. Полученные разведения исследовали методом ПЦР с применением разработанных специфических олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого ДНК-зонда.

Специфичность разработанного способа проверяли на образцах Canine morbillivirus (Canine Distemper Virus, CDV), а также на образцах биологического материала, полученных от интактных и серонегативных животных в отношении Canine morbillivirus (Canine Distemper Virus, CDV). а также с помощью метода секвенирования по Сэнгеру на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 3500 (США) фиг.1, фиг.2, фиг.3 в приложении «Схема».

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен набор специфических олигодезоксирибонуклеотидных праймеров VT-CDV-F 5`- TCGGAGATGAGAAGGTGGATTA -3` и VT-CDV-R 5`- TCAGCAATTCTAGGCTTGTTCC -3`, и флуоресцентно-меченого зонда VT-CDV-P 5`- (R6G) - CCAAGATGAGTGCTACCATGAACCGCC -(BHQ2) -3` к фрагменту гена, кодирующего белок нуклеокапсида N вируса Чумы плотоядных для детекции вируса Чумы плотоядных у собак. Набор позволяет идентифицировать в реальном времени РНК, кДНК кодирующего белок нуклеокапсида N вируса Чумы плотоядных, обладающего более высокой гомологией к циркулирующим в настоящее время штаммам Canine morbillivirus, что повышает достоверность и надежность анализов. 3 ил., 3 табл.

Набор специфических олигодезоксирибонуклеотидных праймеров VT-CDV-F 5'- TCGGAGATGAGAAGGTGGATTA -3', VT-CDV-R 5'-TCAGCAATTCTAGGCTTGTTCC -3', и флуоресцентно-меченого зонда VT-CDV-P 5'- (R6G) - CCAAGATGAGTGCTACCATGAACCGCC -(BHQ2) -3', к фрагменту гена, кодирующего белок нуклеокапсида N вируса Чумы плотоядных для детекции вируса Чумы плотоядных у собак.