Набор специфических олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда к фрагменту гена ORF1 (Non structural Protein 1) РНК (кДНК) калицивируса кошек Feline calicivirus (FCV) для детекции калицивируса кошек Feline calicivirus (FCV). Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/68 

Область техники, к которой относится изобретение:

Изобретение относится к области биотехнологии и касается набора высокоспецифических праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для выявления генетического материала (РНК, кДНК) калицивируса кошек Feline calicivirus (FCV) для детекции калицивируса кошек Feline calicivirus (FCV). Представленный набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого ДНК-зонда содержит пару олигонуклеотидов, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в полимеразной цепной реакции, а также один флуоресцентно-меченый ДНК-зонд. Представленное изобретение позволяет проводить более достоверное и надежное выявление генетического материала (РНК, кДНК) калицивируса кошек Feline calicivirus (FCV) для детекции калицивируса кошек Feline calicivirus (FCV) и может быть использовано в ветеринарии. Способ позволяет детектировать фрагмент консервативной области гена ORF1(Non structural Protein 1) РНК (кДНК) калицивируса кошек Feline calicivirus (FCV), что позволяет выявлять животных, инфицированных калицивирусом кошек Feline calicivirus (FCV) на любых стадиях заболевания.

Изобретение относится к наборам праймеров для выявления генетического материала (РНК, кДНК) фрагмента гена ORF1 (Non structural Protein 1) РНК (кДНК) калицивируса кошек Feline calicivirus (FCV), в клинических образцах, секционных пробах, культуральных жидкостях и прочих биопрепаратах с целью постановки диагноза, коррекции лечения, эпидемиологического расследования, а также для решения научно-исследовательских задач свойств калицивируса кошек Feline calicivirus (FCV), и может быть использовано в ветеринарии.

Калицивирус кошек относится к роду визивирусов (Vesivirus) семейства калицвирусов (Caliciviridae), это малый безоболочечный вирус со сферическим капсидом и чашеобразным углублением в нем (calici - чашка (лат.)). Капсид делает вирус достаточно устойчивым во внешней среде и способствует легкому распространению через фомиты, включая владельцев животных и персонал ветеринарных клиник. Геном вируса представляет собой одноцепочечную молекулу РНК. Калицивирус кошек имеет широкое распространение по всему миру, инфекция им характеризуется длительным носительством и выделением у внешне здоровых кошек (до 25% здорового поголовья). Выделение калицивируса кошек происходит с секретом ротоглотки, конъюнктивы и носа. Передача вируса наиболее эффективна при непосредственном контакте носителя калицивируса и восприимчивого животного, аэрозольная передача играет не значительную роль, поскольку при чихании капли секрета редко распространяются дальше чем на 1 метр. Основным источником калицивироза кошек являются асимптоматические переболевшие кошки, которые могут постоянно выделять калицивирус во внешнюю среду на протяжении многих лет и даже пожизненно.

Калицивирус кошек достаточно устойчив во внешней среде, выживаемость его в благоприятных условиях доходит до 28 дней, в высушенном состоянии может сохранять свою активность в течение нескольких месяцев. В результате повышенной устойчивости калицивируса, фомиты играют значительную роль в заражении восприимчивых кошек. Блохи также способны распространять калицивирус, предположительно, через свои фекалии, заражение кошки происходит во время их поедания при груминге.

Особенности развития калицивироза зависят как от штамма вируса, так и от иммунного статуса животного. Инфекция калицивирусом ведет к развитию проходящей виремии, ведущей к повсеместному распространению вируса, диссеминация вируса, в большинстве случаев, не сопровождается клиническими признаками. Калицивирус кошек первично поражает эпителиальные клетки верхних дыхательных путей, ротовой полости и конъюнктивы, в отличие от герпесвируса кошек - калицивироз не связан с поражением роговицы. Воздействие калицивируса ведет к некрозу эпителия, наиболее характерны поражения обнаруживаются в ротовой полости кошек, они характеризуются образованием везикул перерастающих в язвы (чаще поражаются краевые области языка). Кроме развития калицивируса на слизистых оболочках, он иногда поражает кожу прилегающую к ротовой полости (губы, нос). Калицивирус кошек может также поражать нижние дыхательные пути (эпителий альвеол), некоторые штаммы вируса склонны к формированию тяжелой интерстициальной пневмонии. В редких случаях, вирус может распространяться за пределы дыхательного тракта и поражает суставы кошек, при этом отмечается развитие синовита и хромота. Отдельный штаммы вируса способны вызывать вирулентное системное проявление калицивироза кошек, при этом, заболевают животные вне зависимости от статуса вакцинации, данный синдром характеризуется генерализованным васкулитом, мультиорганной недостаточностью и высокой смертностью. Также, при данном течении калицивироза кошек часто отмечается поражение кожных покровов и кожно-слизистых соединений, сопровождающихся образованием язв на ушах, морде и лапах. Подлежащий патогенез данного вирулентного клинического проявления калицивироза предположительно основан на мутации вируса, ведущей к гипервирулентности, но, точный механизм мутации калицивируса остается не выясненным.

Клинические проявления калицивироза кошек сильно варьируют, от умеренно выраженной инфекции верхних дыхательных путей, до тяжелой вирусной пневмонии со смертельным исходом, это во многом зависит от штамма вируса и иммунного статуса животного. Инкубационный период при калицивирусной инфекции составляет 2-6 дней, на ветеринарном приеме типичными проявлениями являются истечения из глаз и носа (чаще серозные), формирование эрозий язв в ротовой полости с возможным распространением на губы, носовое зеркальце и околоногтевое пространство (вирусная паронихия). Основным поводом обращения владельца в ветеринарную клинику является чихание животного, слезотечение, повышенное отделение слюны, общее угнетение и лихорадка. Характерным поражением для калицивироза кошек является формирование эрозий и язв в ротовой полости, особенно на кончике и по краю языка. Поражения глаз могут заключаться в виде хемоза, блефароспазма и серозных истечений, признаки поражения конъюнктивы при калицивирусной инфекции обычно умеренные и самопроходящие. Поражения слизистой носовой полости при данном заболевании обычно слабо выражены, могут заключаться в чихании и серозных истечениях.

У котят после вакцинации или в период переболевания калицивирозом может отмечаться развитие хромоты по причине воспаления суставов (синовита). Ряд авторов находят взаимосвязь, между инфицированием калицвирусом и развитием хронического лимфоплазмацитарного гингивостоматита, однако, при данном заболевании кроме калицивируса выделяются также и другие патогенны.

При развитии системной инфекции, чаще происходит поражение взрослых кошек вне зависимости от статуса вакцинации, за развитием системных и тяжелых проявлений ответственен отдельный вирулентный штамм калицивируса кошек. В дополнение к характерным признакам калицивироза (язвы ротовой полости, слезотечение, слюнотечение), при системном поражении отмечается высокая лихорадка, отек морды и лап, формирование язв на коже (морде, уши кожа пальцев), одышка по причине развития пневмонии, желтуха по причине поражения печени и кровотечения со слизистой оболочки толстого кишечника по причине синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания (ДВС). Течение калицивироза кошек с системным поражением отличается молниеносностью, гибель животного может отмечаться в течение первых суток с момента развития клинических признаков, смертность достигает 60%. При вскрытии павших от калицивироза кошек с системным вирулентным заболеванием, у них часто отмечается некроз клеток печени, поражение поджелудочной железы, интерстициальная пневмония и выпот в две полости (грудную и брюшную).

При благоприятном течении заболевания, срок клинического выздоровления от калицивироза составляет 2-3 недели. У части кошек, после переболевания калицивирусом отмечается развитие персистирующей инфекции с очень длительным выделением вируса, иногда пожизненным. У данных животных отсутствуют какие либо клинические проявления калицивироза, но, они продолжают являться скрытыми носителями инфекции, и являются важным источником вируса в популяции, а также, могут служить источником нового, мутировавшего вируса.

Наличие эрозий и язв совместно с характерными признаками (лихорадка, угнетение, гиперсаливация и пр.) является важны индикатором калицивирусной инфекции кошек, но, данные признаки могут отмечаться как при обычном течении калицивироза так и при системной вирулентной инфекции. Наличие антител IgG к вирусу в крови больных животных, обычно обладает малой диагностической ценностью, так как большинство кошек серопозитивны. Золотым стандартом диагностики является идентификация и изоляции вируса, но, данный вид исследования доступен не во всех ветеринарных клиниках. Последнее время, все чаще используется идентификация нуклеиновых кислота вирус посредством полимеразоцепной реакции (ПЦР), данный метод исследования обладает высокой чувствительностью и специфичностью. Ни один из методов диагностики не способен различить обычный вирус от вируса системного вирулентного заболевания, разграничение данных форм проводится на основании особенностей клинического течения калицивироза кошек.

Уровень техники: При разработке набора олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для диагностики РНК (кДНК) фрагмента гена ORF1 (Non structural Protein 1) РНК (кДНК) калицивируса кошек Feline calicivirus (FCV), был проведен сравнительный анализ структуры нуклеотидных последовательностей полных геномов калицивируса кошек Feline calicivirus (FCV), размещенных на web-ресурсе NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/, и затем проведено конструирование праймеров и флуоресцентно-меченого зонда методом компьютерного моделирования с применением компьютерных программ Beacon Designer v. 8.14 PREMIER Biosoft International (San Francisco, CA 94131-2175, США) и Vector NTI 11 (Invitrogen, США). Выравнивание геномных последовательностей осуществлялось методом Clustal W, филогенетический анализ выполняли методом невзвешенного попарного среднего - UPGMA. Проверку качества и термодинамический анализ выбранных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда выполняли с помощью программы OLIGO DNA/RNA primer analysis software, v.5.0 и BLAST https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (США).

Амплифицируемый участок кДНК, являясь маркерным, позволяет выявить вирусный агент в исследуемом образце. Для эффективного проведения ПЦР в режиме реального времени необходимы флуоресцентно-меченый ДНК-зонд и ДНК-затравки - праймеры (синтетические олигонуклеотиды) - строго специфичные к кДНК вирусного генома. Сложность выбора праймеров и зонда обусловлена требованием их строгой видоспецифичности. Праймеры должны быть комплементарны нуклеотидным последовательностям ДНК, ограничивая амлифицируемый участок справа и слева таким образом, чтобы синтез ДНК ДНК-полимеразой проходил строго в выбранном регионе. Флуоресцентно-меченый ДНК-зонд, в свою очередь, должен лежать внутри участка ДНК, ограниченного праймерами. Правильный выбор праймеров позволяет осуществить экспоненциальное увеличение количества копий целевого участка ДНК. Правильный выбор сочетания пары праймеров и ДНК-зонда позволяет осуществлять детекцию накопления продуктов амплификации в режиме реального времени. В целом от правильности выбора олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и зондов зависит специфичность проводимой ОТ-ПЦР, а значит, и достоверность исследования.

При компьютерном дизайне праймеров и флуоресцентно-меченого ДНК-зонда главными критериями были: абсолютная степень гомологии (комплементарность) с выбранным участком гена; отсутствие самокоплементарных участков в структуре праймеров и комплементарности их друг другу, чтобы не допускать возникновения устойчивых вторичных структур (димеров); максимальная близость значений температуры отжига праймеров.

Раскрытие сущности изобретения: Техническим результатом заявляемого изобретения является создание набора олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда, позволяющего идентифицировать в реальном времени фрагмент гена ORF1 (Non structural Protein 1) РНК (кДНК) калицивируса кошек Feline calicivirus (FCV) и обладающего более высокой гомологией к циркулирующим в настоящее время штаммам калицивируса кошек Feline calicivirus (FCV), что повышает достоверность и надежность анализов.

Указанный технический результат достигается разработкой набора высокоспецифических олигодезоксирибонуклеотидных праймеров для детекции фрагмента гена ORF1 (Non structural Protein 1) РНК (кДНК) калицивируса кошек Feline calicivirus (FCV), содержащего пару олигонуклеотидов, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в полимеразной цепной реакции, а также флуоресцентно-меченый ДНК-зонд. Указанные олигонуклеотиды имеют следующую структуру:

Последовательности олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда к фрагменту гена ORF1 (Non structural Protein 1) РНК (кДНК) калицивируса кошек Feline calicivirus (FCV).

Прямой праймер (Forward primer) 5`→3`

VT-Z-Ca-F2 5'- gAACTACCCgCCAATCAACATgTg-3'

Обратный (Reverse primer) 5`→3`

VT-Z-Ca-R2 5'- AgCACATCATATgCggCTCTgAT -3'

Флуоресцентно-меченый ДНК-зонд (Probe) 5`→3`

VT-Z-Ca-P2 5'- (R6G)- gTgTTTgATTTggCCTgggCTCTTCg -(BHQ2) -3'

Таблица 1. Характеристика разработанных праймеров и флуоресцентно-меченого ДНК-зонда Показатель VT-Z-Ca-F2 VT-Z-Ca-R2 Флуоресцентно-меченый ДНК-зонд VT-Z-Ca-P2 Структура от 5' к 3' gAACTACCCgCCAATCAACATgTg AgCACATCATATgCggCTCTgAT (R6G)- gTgTTTgATTTggCCTgggCTCTTCg -(BHQ2) Длина, нуклеотиды 24 23 26 Т отжига с учетом Т плавления, °C 60 60 70 GC состав, % 50 48 54 Т работы фермента, °C 68,7 68,8 77,6

Дизайн предлагаемых к патентованию праймеров и зонда включает все данные международной базы GenBank о нуклеотидных последовательностях полных геномов РНК калицивируса кошек Feline calicivirus (FCV) по состоянию на май 2022 года. Используемые в работе праймеры и зонд обладают большей гомологией к циркулирующим в настоящее время штаммам калицивируса кошек Feline calicivirus (FCV), что в свою очередь повышает чувствительность заявляемого набора диагностических праймеров и зонда. Мишенью для используемых в работе праймеров и зонда является высококонсервативная область гена ORF1 (Non structural Protein 1) геномной ДНК.

Представляемые к патентованию олигодезоксирибонуклеотидные праймеры и флуорсцентно-меченый ДНК-зонд позволяют выявить в образце РНК (кДНК) фрагмента гена ORF1 (Non structural Protein 1) геномной РНК (кДНК) калицивируса кошек Feline calicivirus (FCV) в режиме реального времени, а также амплифицировать фрагмент ДНК, что дает возможность секвенировать полученный ампликон, с которым можно проводить молекулярно-биологические работы, а следовательно, и более глубокое изучение свойств калицивируса кошек Feline calicivirus (FCV). Помимо этого, использование в качестве положительного контроля плазмидной конструкции несущей специфическую вставку (как описано ниже) позволяет разработать количественную ПЦР, что в свою очередь дает возможность оценить вирусную нагрузку в исследуемом образце.

Апробация праймеров была осуществлена с использованием биотехнологической конструкции, в основе которой лежит плазмида со вставкой специфического ДНК-фрагмента. Экспериментально было показано, что выбранные праймеры и ДНК-зонд обеспечивают надежный синтез целевых ДНК-фрагментов. Специфичность амплификации дополнительно подтверждали секвенированием.

Положительные контрольные образцы были получены методом ТОРО-Т/А клонирования вирусспецифических ДНК-дуплексов в плазмиду PC DNA 3.1 (Invitrogen, США). После чего компетентные клетки E.coli линии TOP 10 (Invitrogen, США) были трансформированы полученной плазмидой, несущей типоспецифический фрагмент гена ORF1 (Non structural Protein 1) геномной РНК (кДНК) калицивируса кошек Feline calicivirus (FCV).

Важно отметить, что оптимизация условий проведения ПЦР осуществлялась с использованием наборов коммерчески доступных реагентов, приборов и ферментов, предназначенных для массового использования в лабораторной практике, что позволяет быстрое и надежное применение данного изобретения в медицинских и научно-исследовательских лабораториях.

Анализ эффективности проведенной трансформации осуществляли проведением ПЦР в режиме реального времени в соответствии с протоколом, описанным ниже, где в реакционную смесь в качестве положительного образца добавляли 1×ТЕ-буфер, содержащий рекомбинантные плазмиды, со встройкой вирусспецифического синтезированного ДНК-дуплекса. В качестве отрицательного контрольного образца в реакционную смесь добавляли 1×ТЕ-буфер.

Условия проведения амплификации оптимизировали по концентрации ионов магния, концентрации праймеров и зондов в реакционной смеси, температуре отжига праймеров.

Состав реакционной смеси моделировали таким образом, чтобы концентрация ионов MgCl₂ обеспечивала оптимальную скорость и точность работы фермента Taq-полимеразы Mut-3, концентрация дНТФ не превышала 0,4 мМ, концентрация праймеров была 10 пмоль/мкл, флуоресцентно-меченого ДНК-зонда 5 пмоль/мкл, а объем пробы составлял 5 мкл (для повышения специфичности реакции).

Таблица 2. ПЦР-смесь для проведения реакции (из расчета на одну пробирку): Компонент Объем на 1 реакцию (20 мкл), мкл ПЦР-буфер ×10 2,5 дНТФ (25 мМ) 0,2 MgCl₂ (50 мМ) 1 Полимераза Taq-pol Mut-3 (5 ед./мкл) 0.5 Прямой праймер - VT-Z-Ca-F2 (10 пмоль/мкл) 1 Обратный праймер - VT-Z-Ca-R2 (10 пмоль/мкл) 1 Флуоресцентно-меченый ДНК-зонд VT-Z-Ca-P2 (5 пмоль/мкл) 1 Образец (проба с ДНК) 5 diH₂O (бидистилированная) 6

Таблица 3. Температурно-временной режим проведения ПЦР Этап Т, °С Время, сек. Количество повторов Амплификатор планшетного типа Амплификатор роторного типа Начальная денатурация 95 300 300 1 Денатурация 95 10 10 45 циклов с флуоресцентной детекцией Отжиг 58 25 измерение 25 измерение Элонгация 72 25 40 Хранение 4 ∝ ∝

Отработку условий ПЦР с использованием разработанных праймеров и флуоресцентно-меченого ДНК-зонда осуществляли на амплификаторах планшетного типа «ДТ-96», «ДТ-Прайм», «ДТ-Лайт» («ДНК-Технология», Россия) и роторного типа «Rotor Gene Q» (QIAGEN, ФРГ).

Для определения чувствительности способа выделенные пробы ДНК (мазки и смывы) подвергали десятикратным разведениям от 10^-1 до 10^-5. Полученные разведения исследовали методом ПЦР с применением разработанных специфических олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого ДНК-зонда.

Специфичность разработанного способа проверяли на образцах калицивируса кошек Feline calicivirus (FCV), а также на образцах биологического материала, полученных от интактных и серонегативных животных в отношении калицивируса кошек Feline calicivirus (FCV). а также с помощью метода секвенирования по Сэнгеру на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 3500 (США) фиг.1, фиг.2, фиг.3 в приложении «Схема».

Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарии. Предложен набор высокоспецифических праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для выявления генетического материала (РНК, кДНК) калицивируса кошек Feline calicivirus (FCV) для детекции калицивируса кошек Feline calicivirus (FCV). Представленный набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого ДНК-зонда содержит пару олигонуклеотидов, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в полимеразной цепной реакции, а также один флуоресцентно-меченый ДНК-зонд. Представленное изобретение позволяет проводить более достоверное и надежное выявление генетического материала (РНК, кДНК) калицивируса кошек Feline calicivirus (FCV). 3 ил., 3 табл.

Набор специфических олигодезоксирибонуклеотидных праймеров VT-Ca-F2 5'- gAACTACCCgCCAATCAACATgTg-3', VT-Ca-R2 5'-AgCACATCATATgCggCTCTgAT-3' и флуоресцентно-меченого зонда VT-Ca-P2 5'-(R6G)-gTgTTTgATTTggCCTgggCTCTTCg-(BHQ2)-3' к фрагменту гена ORF1 РНК (кДНК) калицивируса кошек Feline calicivirus (FCV) для детекции калицивируса кошек (FCV).