Способ определения окисления-ферментации микроорганизмами углеводов Советский патент 1984 года по МПК C12Q1/04 

Изобретение относится к микробио логии и касается определения окисле ния-ферментации микроорганизмами углеводов. Известен способ определен-ия ферментации микроорганизмами углеводов путем посева чистой культуры на цветные среды Гисса с углеводами С Ц. Однако этот способ не позволяет .одновременно определять окислениеферментацию углеводов. Известен также способ определени окисления-ферментации :микроорганизмами углеводов путем посева чистой культуры исследуемых микроорганизмо параллельно в двепробирки с питатель ной средой, содержащей источник азо та, углевод, хлористый натрий, фосфорнокислый двузамещенный калий, бромтимоловый Голубой и дистиллированную воду, с последующим создание в одной из пробирок анаэробных условий, инкубированием посевов и определением .окисления-ферментации по изменению окраски среды 2 . Однако известный способ длителен и не обеспечивает высокой точности. Целью изобретения является ускорение и повышение точности способа. Цель достигается тем, что соглас но способу определения окисленияферментации микроорганизмами углево дов путем посева чистой культуры исследуемых микроорганизмов паралле;.оно в две пробирки с питательной средой, содержащей источник азота, углевод, хлористый натрий, фосфорно кислый двузамещенный калий, бромти моловый голубой и дистиллированную воду, с последующим созданием в одн из пробирок анаэробных условий, инк бированием посевов и определением окисления-ферментации по изменению окраски среды, исследуемую культуру высевают в питательную среду, допол нительно содержащую хлористый кальций, сернокислый магний и сернокислее железо, а в качестве источника азота она содержит никотиновую кисл ту при следующем количественном соотношении ингредиентов, мас.%: Хлористый кальций 0,001-0,0015 Никотиновая ккспо та0,0001-0,0005 Сернокислый магний0,01-0.,015 Сернокислое железоО,001-0,00 Фосфорнокислый двузамещенный 0,05-0,055 Хлористый.нат- 0,055-0,65 рий Углевод0,5-1,0 Бромтимоловый голубой0,008-0,01 Дистиллированная Осташьное Причем для создания анаэробных условий используют 1,2-1 5%-ный водный агар-агар. Способ осществляется следующим образом. Чистую культуру микроорганизмов засевают параллельно в две пробирки с питательной средой, полученной путем растворения в дистиллированной воде исходных компонентов, и устанавливают рН 7,2. Среду трехкратно дробно стерилизуют текучим паром при по 10 мин или автоклавируют разово при 0,5 атм в течение 15 мин, после чего разливают по 0,5 1,0 мл в пробирки размерами 0,81,0л10,О см и хранят под ватномарлевыми пробками при не более чем 15 дн. После засева среды исследуемым микроорганизмом чистой культурой в две пробирки, в одной из них создают анаэробные условия наслоением расплавленного 1,2-1,5%ного водного агар-агар (рН до высоть агарового столбика не более 1,5 см,, причем температура агара, наслаиваемого на среду, не должна превышать 45 - . Посевы инкубируют в течение 5 ч и определяют окисление субстрата по изменению травянистой окраски среды в пробирке без слоя агар-агар на светлозеленую (лимонную) , при отсутствии изменения окраски среды в пробирке с изолирующим слоем из агар-агара. Ферментацию определяют по аналогичному изменению окраски и в пробирке,, содержащей -изолирующий слой из агар-агара. Пример. Использование способа для определения окисления глюкозы неферментирующими грамотрицательными бактериями. Чистую культуру микроорганизма Р.aeruginosa засевают параллельно в две пробирки размерами 0,8-1,0x10,0 см с питательной средой, разлитой по 0,5 мл, простерилизованной паром при трехкратно по 10 мин. Среда имеет состав ,мг/л: хлористый кальций 10,0; никотиновая кислота 1,0; сернокислый магний 100,0; сернокислое железо 10,0; фосфорнокислый двузамешенный калий 500,0; хлористый натрий 5500,0; глюкоза 900,0; бромтимоловый голубой 100,0; дистиллированная вода остальное. После засева в одну из пробирок наслаивают расплавленный 1,2%-ный агар-агар (рН 7,2) с температурой в виде столбика высотой 1,0 см, инкубируют при в течение 5 ч, в пробирке без изолирующего слоя из агар-агара травянистая окраска среды к этому времени изменилась на лимонную, а в пробирке с изолирукяцим слоем изменения окраски не произошло Заключение: P. aeruginosа окисляет и не ферментирует глюкозу. П р и ме р 2. Выявление окисле.ния-ферментации Маннита культурой Staphylococcus aureus. Для обнаруже ния данных свойств используют.среду содержащую следующие .вещества, мг/л хлористый кальций 10,0; никотиновая кислота 5,0; сернокислый магний 120,0; сернокислое железо 12,0; фос форнокислый двузамещенный калий 550,0; хлористый натрий 6500,0; маннит 1500,0; бромтимоловый голубой 100,0;вода дистиллированная остальное (рН 7,2У. Посев чистой культурой Staph, aur us и режим учета осуществляют в соответствии с примером 1. В пробирке с изолирующим слоем через 3 ч, а в пробирке без изолирующего слоя через 4 ч окраска среды приобрела лимонный цвет, что расценено как спо собность микроорганизма ферментировать и окислять маннит. Примерз. Сравнение способов определения окисления-ферментации углеводов чистой культуры P.aeruginosa при условии создания анаэробных условий с помощью агар-агара (предлагаемый способ) и вазелина (известный . Чистую культуру микроорганизма засевают параллельно в три пробирки содержащие 0,8 мл питательной среды с количественным составом ингредиентОв,приведенным в примере 1, простерилизованной при 0,5 атм в течение 15 мин. После посева первую пробирку инкубируют без изолирующего слоя, BTopSTO с изолирующим слоем из агар-агара, третью с изолирующим слоем из стерильного вазелина в течение 5 ч. В пробирке Рез изолирующего слоя через 4 чтравянистая окраска среды изменилась на лимонную, а через 5 ч аналогичное изменение окраски среды наступило в пробирке под слоем вазелина. В пробирке, где изолирующим слоем был агар-агар окраска - среды не изменилась. Таким образом, изменение окраски среды под слоем вазелина возникло в результате его расщепления с накоплением КИСЛЫХпродуктов, что привело бы к ошибочному заключению о ферментации глюкозы, если бы не принимать во внимание данные, полученные в пробирке под слоем агар- ; агара. Применение предлагаемого способа позволяет в 100% случаев дифференцировать и идентифицировать: бактерии по тесту окисление-ферментация углевода уже через 5 ч с момента посева.

1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОКИСЛЕНИЯ-ФЕРМЕНТАЦИИ МИКРООРГАНИЗМАМИ УГЛЕВОДОВ путем посева чистой культуры исследуемых микроорганизмов параллельно в две пробирки с питательной средой, содержащей источник азота, углевод, хлористый натрий, фосфорнокислый двузамещенный 1 калий, бромтимоловый голубой и дистиллированную воду, с последукяцим созданием в одной, из пробирок анаэробных условий, I инкубированием посевов и определением окисления-ферментации по изменению окраски среды, о т л и ч а ю m и йс я тем, что, с целью ускорения и повышения точности способа, исследуемую культуру высевают в питательную среду, дополнительно содержащую хлористый кальций, сернокислый магний и сернокислое железо, а в, качестве источника азота она содержит никотиновую кислоту при следующем количественном соотношении ингредиентов, мае.%: 0,001-0,0015 Хлористый кальций 0,0001-0,0005 Никотиновая кислота 0,01-0,015 .Сернокислый магний 0,001-0,002 Сернокислое железо (Л Фосфорнокислый 0,05-0,055 двузамещенный калий 0,55-0,65Хлористый натрий Углерод 0,5-1,0 0,008-0,01 Бромтимоловый голубой Дистиллированная Остальное вода :о 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для создания анаэробных условий используют 1,2-1,5%SI ный водный агар-агар.