Тест-система для определения уровня антител против антигена вируса ящура генотипа A/ASIA/SEA-97 с помощью жидкофазного блокирующего непрямого "сэндвич"-варианта ИФА Российский патент 2023 года по МПК C12N15/00 G01N33/569 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности, созданию тест-системы для определения уровня антител против антигена вируса ящура генотипа A/ASIA/SEA-97 с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА.

Вирус ящура является представителем рода Aphthovirus семейства Picornaviridae и имеет 7 различных серотипов: О, А, Азия-1, С, SAT-1, SAT-2, SAT-3. Вирион представляет собой частицу с коэффициентом седиментации 146S, состоящую из одноцепочечного позитивного генома в виде РНК и 60 копий каждого из четырех структурных белков (VP₁ [1D-ген], VP₂ [1B-ген], VP₃ [1С-ген] и VP₄ [1А-ген]) [1].

Для вируса ящура вариациям в геноме благоприятствуют высокие частоты мутаций во время репликации возбудителя болезни, а возникающие линии и сублинии обусловлены мутациями и рекомбинацией. Мутации в результате рекомбинации приводят к обмену генетическим материалом и образованию новых антигенных вариантов, которые могут избежать иммунного давления и привести к изменениям тропизма клеток и диапазона хозяев [2, 3, 4]. Одна или несколько аминокислотных замен на поверхности вирусных частиц могут привести к изменению распознавания и использования рецепторов. В результате один и тот же вирус будет приобретать способность проникать в клетки с использованием альтернативных рецепторов [5].

Наиболее вариабельным является белок VP] вируса ящура, поскольку на него приходится не менее 90% мутаций всех структурных генов. Самыми вариабельными областями являются участки 40-60, 130-160 и 190-213 а.о. [6]. Участок поверхностного белка VP₁ в регионе 130-160 а.о. отличается высокой вариабельностью, поскольку участвует в процессе связывания с рецепторами клетки-хозяина [7, 8]. Изменчивость данного региона дает возможность вирусу ящура взаимодействовать с рецепторами клеток разных типов и облегчает переход от одного вида хозяина к другому [6].

Для изолятов вируса ящура серотипа А характерно генетическое разнообразие. Серотип А включает в себя 3 охарактеризованных прототипа ASIA, AFRICA, EURO-SA и одну пока еще малоизученную категорию изолятов. В топотипе ASIA выделяют различные генетические группы, при этом очень распространенной в странах Азии является SEA-97.

Ящур - наиболее важное заболевание, влияющее на животноводство во всех странах с момента его первого обнаружения в 1870 году. Хотя политика забоя скота рассматривалась и применялась в конкретных случаях, основной стратегией, принятой мировым сообществом против ящура, является обязательная массовая вакцинация сельскохозяйственных животных [9].

Известно, что эффективность кампаний вакцинации зависит, среди прочего, от многих факторов, таких как эффективность вакцины, стратегия вакцинации и охват вакцинацией. Из-за размера и территориальной неоднородности многих стран, а также масштабов поголовья сельскохозяйственных животных кампании вакцинации против ящура столкнулись с рядом оперативных проблем [10]. При этом абсолютно всеми доказано, что единственным способом профилактики ящура является массовая вакцинация против того генотипа ящура, который циркулирует в рассматриваемом регионе.

На территории Российской Федерации вспышки ящура имеют спорадический характер и вызваны заносом возбудителя с территории сопредельных стран. Регионы РФ, граничащие с Китаем, Монголией, Азербайджаном и Грузией подвержены очень высокой степени риска заноса ящура. Очень важны также в этом отношения транспортные связи на юге России со странами Ближнего Востока [9, 11].

В настоящее время известны производственные штаммы вируса ящура типа А, которые используются при изготовлении средств специфической профилактики ящура:

- штамм «А №2155/Забайкальский/2013» (генотип A/ASIA/SEA-97),

- штамм «А/Турция/2006» (генотип A/ASIA/Iran-05),

- штамм «А/Иран/2018» (генотип A/ASIA/Iran-05^SIS-13),

- штамм «А/Афганистан/2017» (генотип A/ASIA/Iran-05^FAR-11),

- штамм «А22/Ирак/1964» (генотип A/ASIA/Iraq-64),

- штамм «А/ВНИИЗЖ/2015» (генотип A/ASIA/G-VII).

В последние десятилетия отмечают вспышки ящура генотипа A/ASIA/SEA-97. Страны Азии и Ближнего Востока активно развивают индустрию туризма и имеют торгово-экономические связи с Россией, вследствие этого всегда существует риск заноса заболевания данного генотипа на территорию РФ [1, 9, 12].

В настоящее время в качестве производственного штамма вируса ящура генотипа A/ASIA/SEA-97 применяют «А №2155/Забайкальский/2013», который имеет высокое нуклеотидное и аминокислотное родство со всеми штаммами и изолятами данного генотипа, которые циркулируют в мире, где вакцина не применяется или используется ее применение с грубыми нарушениями. Данный штамм был депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ», под регистрационным номером: штамм ВЯ А №2155/Забайкальский/2013 (справка №14 от 24 декабря 2021 г. Филогенетическая принадлежность штамма «А №2155/Забайкальский/2013» вируса ящура генотипу A/ASIA/SEA-97 представлена на фиг.1.

Филогенетическое дерево выведено с использованием программы MEGA и алгоритма Neighbor-Joining [13]. Процент повторяющихся ветвей, в которых связанные таксоны сгруппированы вместе в тесте начальной загрузки (100 повторов), показан рядом с ветвями [14]. Эволюционные расстояния были рассчитаны с использованием метода Maximum Composite Likelihood [15] и выражены в единицах количества замен оснований на сайт.Этот анализ включал 34 нуклеотидных последовательностей. Все позиции, содержащие пробелы и отсутствующие данные, были удалены (вариант полного удаления). В окончательном наборе данных было всего 639 позиций. Эволюционный анализ проводился в MEGA X [16].

Учитывая интенсивные торговые связи между Российской Федерацией и странами Азии и Ближнего Востока, вероятность риска заноса ящура на территорию нашей страны остается очень высокой. Иммунизация является эффективным инструментом борьбы с болезнью. В связи с циркуляцией вируса ящура генотипа A/ASIA/SEA-97 и необходимостью защиты животных от него в ФГБУ «ВНИИЗЖ» разработали вакцину, в состав которой входит антиген вируса ящура данного штамма.

Возникла необходимость создания диагностической тест-системы для определения уровня антител против антигена вируса ящура генотипа A/ASIA/SEA-97 с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА.

Защита от ящура после вакцинации оценивается количеством специфических антител в сыворотке крови животных [17 - 20]. Уровень гуморального иммунитета вакцинированного поголовья определяется путем выявления антител, специфичных к структурным белкам вируса ящура. В соответствии с рекомендациями МЭБ (OIE) [1], для определения иммунного статуса животных применяют реакцию микронейтрализации (РМН) и иммуноферментный анализ (ИФА). РМН считается чувствительной и специфичной, однако проведение анализа имеет ряд следующих ограничений:

1) большая продолжительность времени постановки реакции (не менее 72 ч), 2) высокая себестоимость процедуры, связанная с применением чувствительной клеточной линии, СО₂-инкубатора и другого оборудования, 3) использование неинактивированного вируса ящура, который является биологическим агентом II группы опасности и предполагает проведение работ только в лабораториях уровня BSL-3.

В свою очередь, ИФА обладает многими преимуществами, включая экспрессность, высокую специфичность и чувствительность, пригодность для крупномасштабного скрининга полевых образцов и отсутствие требований к специальным лабораторным условиям, например, культуре клеток или среде углекислого газа, а также не предполагает проведение работ с микроорганизмами повышенного уровня опасности [1]. Исходя из этого, ИФА целесообразно применять для определения уровня антител против антигена вируса ящура генотипа A/ASIA/SEA-97 с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА.

Выделяют прямой и непрямой варианты ИФА. Непрямой вариант ИФА имеет преимущества, а именно: 1) наличие большого разнообразия меченых вторичных антител, 2) универсальность (многие первичные антитела могут быть получены у одного вида, и одно и то же меченое вторичное антитело может быть использовано для обнаружения), 3) максимальная иммунная активность основного антитела сохраняется, поскольку оно не маркировано, 4) повышение чувствительности, поскольку каждое первичное антитело содержит несколько эпитопов, которые могут быть связаны мечеными вторичными антителами, что обеспечивает усиление детектируемого сигнала. К ограничениям метода относится вероятность появления перекрестной реакции со вторичным антителом, что может привести к возникновению неспецифического сигнала [21-28, 32].

Особым вариантом проведения ИФА является «сэндвич»-вариант, который обычно предполагает применение пар подобранных антител, где каждое антитело специфично для другого, неперекрывающегося эпитопа антигена. Первые антитела принято называть сенсибилизирующими и предназначены они для захвата антигена. Вторые антитела - детекторные, необходимы для обнаружения антигена. Указанный вариант ИФА имеет следующие преимущества: 1) высокая специфичность реакции; 2) подходит для скринингового анализа полевых образцов разной степени очистки; 3) высокая чувствительность реакции.

В зависимости от фазы, в которой находятся иммунные комплексы различают твердофазный и жидкофазные варианты ИФА. На первом этапе реакции для твердофазного варианта адсорбируют антитела на твердой поверхности планшета. При этом не связавшиеся с твердой фазой реагенты легко удаляются отмыванием. В сенсибилизированных лунках инкубируют исследуемый образец. При этом на поверхности твердой фазы формируются иммунные комплексы. Не связавшиеся компоненты удаляют отмыванием. При добавлении конъюгата и связывании его с иммобилизованным иммунным комплексом активный центр фермента остается доступным для последующего взаимодействия с субстратом. Инкубация субстрата в лунках с иммобилизованным конъюгатом приводит к появлению окрашивания, интенсивность которого оценивают по оптической плотности с помощью многоканального спектрофотометра-ридера.

Отдельное место среди вариантов ИФА отводится жидкофазному блокирующему непрямому «сэндвич»-варианту ИФА, который характеризуется рядом преимуществ:

1) данный анализ максимально приближен к классической реакции нейтрализации, поскольку формирование иммунного комплекса происходит в жидкой фазе как наиболее естественных условиях;

2) эпитопы антигена наиболее доступны в пространстве для специфичных антител, что позволяет повысить чувствительность и специфичность реакции.

Robiolo В. и соавторы (2010) разработали способ определения титра антител против антигенов вируса ящура штаммов A₂₄/Cruzeiro, A/Argentina/01, O1/Campos и С₃/Indaial [32]. Против указанных представителей вируса достоверность определения уровня антител составляла не менее 96%, при этом данная тест-система позволяла выявлять антитела против ящура генотипа A/ASIA/SEA-97 с диагностической чувствительностью не более 31% и специфичностью - не более 45%.

Учитывая данные значения, актуально разработать тест-систему для определения уровня антител против антигена вируса ящура генотипа A/ASIA/SEA-97 с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА.

Sharma G.K. и др. (2015) предложили тест-систему для выявления антител против вируса ящура типов А, О, Азия-1 с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА [28]. Данная методика позволяла идентифицировать широкий спектр противоящурных антител, но при этом специфичность по отношению к антигену вируса ящура генотипа A/ASIA/SEA не более 37%, а, следовательно, точное выявление иммуноглобулинов G не представляется возможным. Авторы тест-системы применяли моноклональные антитела, использование которых увеличивало спектр выявления различных генотипов вируса ящура в рамках одного серотипа, но при этом существенно снижалась специфичность относительно выявления антител против изолятов/штаммов конкретного генотипа, в частности генотипа A/ASIA/SEA-97).

Указанные выше тест-системы не представлены на рынке в качестве наборов для детекции противоящурных антител в сыворотках крови животных и остаются в качестве недоступных для широкого потребителя. В свою очередь, на мировом рынке в настоящее время имеются европейские наборы для детекции антител против вируса ящура типа А - IZSLER (Италия) и PrioCHECK (Нидерланды).

Тест-система в наборе IZSLER предназначена для детекции противоящурных антител с помощью твердофазного прямого «сэндвич»-варианта ИФА [29]. Достоинством данного набора является применение моноклональных антител, однако они были получены ранее 2013 года (период, когда появился производственный штамм «А №2155/Забайкальский/2013») и не могут с высокой достоверностью и точностью детектировать специфические антитела в сыворотках крови животных. Специфичность и чувствительность указанной тест-системы для выявления антител против вируса ящура генотипа A/ASIA/2013 ниже 40%, что подтверждают данные РМН. Таким образом, тест-система IZSLER на тип А не позволяет получать достоверных результатов в отношении изолятов и штаммов вируса ящура широко распространенного в Азии и Ближнего Востока генотипа A/ASIA/SEA-97.

Наиболее близким прототипом для разработанной нами тест-системы является тест-система PrioCHECK (Prionics Lelystad B.V., Netherlands) для выявления антител к антигену вирусу ящура типа А [30].

Комплектующие для соответствующего набора представлены ниже:

Компонент 1 - Планшеты иммунологические.

Компонент 2 - Конъюгат (30х). Разбавленный конъюгат не стабилен, готовят непосредственно перед применением.

Компонент 3 - Буфер для разведения (5х).

Компонент 4 - Неиммунная сыворотка крови лошади.

Компонент 5 - Деминерализованная вода.

Компонент 6 - Промывочный буфер (200х).

Компонент 7 - Референтная сыворотка 1 (позитивная) (жидкая).

Компонент 8 - Референтная сыворотка 2 (менее позитивная) (жидкая).

Компонент 9 - Референтная сыворотка 3 (еще менее позитивная) (жидкая).

Компонент 10 - Референтная сыворотка 4 (отрицательный контроль) (жидкая).

Компонент 11 - Субстрат хромогена (ТМВ).

Компонент 12 - Стоп-раствор (1 N раствор серной кислоты). Данные отражены в инструкции производителя.

Тест-система PrioCHECK включает в себя конъюгат, который представляет собой меченые моноклональные антитела против вируса ящура серотипа А, исходя из этого является типоспецифичной, но без более узкой дифференциации. Прототипная тест-система разработана была еще в конце 90-гг. XX в. В ней применяются антитела против антигенов вируса ящура различных генотипов типа А, кроме появившихся позднее, в частности A/ASIA/SEA-97. Изоляты и штаммы данной линии имеют существенные отличия от других линий серотипа А (фиг. 1). Анализируя нуклеотидную и аминокислотную последовательность высоко вариабельного белка VP₁ вируса ящура, ученые пришли к выводу о наличии достаточного количества существенных замен, позволяющих отнести вирус к иному генотипу. Исходя из выше представленного, прототипная тест-система не является высокочувствительной и специфичной по отношению к вирусу ящура генотипа A/ASIA/SEA-97. Данная тест-система выявляет антитела к антигену вируса ящура указанного генотипа не более, чем на 39%. Исходя из этого требуется разработать чувствительную, специфичную тест-систему для определения уровня антител против антигена вируса ящура генотипа A/ASIA/SEA-97 с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА.

Прототипная тест-система основана на твердофазном конкурентном «сэндвич»-варианте ИФА [30], однако эта форма отдалена по своей чувствительности и специфичности от РМН относительно возможностей улавливания антигенных сайтов по сравнению с жидкофазным блокирующим непрямым «сэндвич»-вариантом ИФА.

Прототипный вариант предполагает наличие в своем составе контрольных сывороток крови животных в жидком виде, что снижает сохранность компонентов тест-системы в течение длительного периода времени и создает риски контаминации микроорганизмами.

Для прототипного варианта рабочий раствор конъюгата, который используется в процессе анализа, не стабилен и быстро разрушается. В составе набора он представлен в виде 30-кратного концентрата. В таком состоянии в отличии от лиофилизированного компонента срок хранения заметно сокращается. Следует также отметить, что данная тест-система не предусматривает контроля конъюгата, что не позволяет получать более достоверные данные по оптическим плотностям и уровню гуморального иммунитета против антигена вируса ящура.

В прототипной тест-системе применяется прямой конъюгат, что удобно в применении, однако при этом повышается вероятность шумовых фоновых явлений, что может негативно отражаться на конечных результатах количественного исследования сывороток крови животных.

Учитывая найденные ограничения в применении имеющихся тест-систем, в том числе прототипной, для проведения точного количественного анализа уровня гуморального иммунитета животных после инокуляции противоящурными вакцинами, содержащими инактивированный вирус ящура генотипа A/ASIA/SEA-97, актуальной является разработка тест-системы для определения уровня антител против антигена вируса ящура генотипа A/ASIA/SEA-97 с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА с учетом выше приведенных недостатков.

В РФ на сегодняшний день существует тест-система на основе жидкофазного блокирующего непрямого "сэндвич"-варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма А N2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII в сыворотках крови животных после иммунизации [31].

При этом патентов на тест-систему на основе жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА, которая позволила бы с высокой достоверностью количественно определять уровень антител против антигена вируса ящура генотипа A/ASIA/SEA-97 не зарегистрировано.

Целью изобретения является создание тест-системы для определения уровня антител против антигена вируса ящура генотипа A/ASIA/SEA-97 с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА.

Поставленная цель достигается тем, что предлагаемая тест-система содержит следующие лиофильно высушенные иммуноспецифические компоненты с высокой степенью активности:

1) культуральный инактивированный лиофилизированный вирус ящура генотипа A/ASIA/SEA-97;

2) сенсибилизирующие антитела - иммуноглобулины G кролика против вируса ящура генотипа A/ASIA/SEA-97;

3) детекторные антитела - иммуноглобулины G морской свинки против вируса ящура генотипа A/ASIA/SEA-97;

4) контроль 1 (сильноположительный контроль) - положительная сыворотка крови телят к антигену вируса ящура генотипа A/ASIA/SEA-97 с процентом ингибиции 75-100%;

5) контроль 2 (положительный контроль) - положительная сыворотка крови телят к антигену вируса ящура генотипа A/ASIA/SEA-97 с процентом ингибиции от 50,0% до 74,9%;

6) контроль 3 (отрицательный контроль) - сыворотка крови телят, не содержащая антитела к вирусу ящура;

7) блокирующая сыворотка крови;

8) антивидовой конъюгат - иммуноглобулины кролика против Ig G морской свинки, конъюгированные с ферментом (пероксидаза хрена).

Предлагаемая тест-система содержит также неспецифические компоненты: буферный раствор на основе карбоната и гидрокарбоната натрия (рН 9,5-9,6), 20-кратный концентрат буферного раствора, хромогенный субстрат - ТЕАС (2,20-азинобис (3-этилбензотиазолин-6-сульфоновая кислота) диаммониевая соль), «стоп»-раствор - 1,0%-ный раствор кокосульфата натрия.

Цель достигается благодаря тому, что метод жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА наиболее приближен к классической РМН в культуре клеток IB-RS-2, поскольку все антигенные сайты 146S частиц вируса ящура генотипа A/ASIA/SEA-97 находятся в свободном состоянии в жидкой фазе, открыты для связывания со специфическими сенсибилизирующими и детекторными антителами. Реакция основана на взаимодействии иммуноглобулинов G исследуемой сыворотки крови животного и инактивированного вируса ящура генотипа A/ASIA/SEA-97 в жидкой фазе с образованием иммунных комплексов. Параллельно с этим проводится сенсибилизация лунок плоскодонного планшета антителами кролика против вируса ящура того же генотипа. После этого сенсибилизированные лунки подвергают обработке с помощью блокирующей сыворотки крови, добавляют полученные иммунные комплексы из круглодонного планшета, инкубируют, вносят восстановленную из лиофильного высушенного состояния суспензию детекторных антител. Образовавшийся сложный иммунный комплекс выявляют с помощью антител против иммуноглобулинов G морской свинки, конъюгированных с пероксидазой хрена и хромогенного субстрата.

Технический результат от изобретения заключается в разработке современной, специфической против антигена вируса ящура генотипа A/ASIA/SEA-97 и чувствительной тест-системы, предназначенной для определения антител против указанного антигена методом жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА на основе применения инактивированного вируса ящура генотипа A/ASIA/SEA-97 и при получении иммуноспецифических компонентов реакции.

В отличии от прототипа в разработанной тест-системе применяется культуральный концентрированный в 400 раз инактивированный вирус ящура генотипа A/ASIA/SEA-97, который представлен в виде лиофильно высушенной суспензии. Данный факт дает возможность количественно определять гуморальный иммунитет против вируса ящура указанного штамма с высокими показателями чувствительности (более 99%) и специфичности (100%), что более чем на 60% выше по сравнению с наиболее близким прототипом. Кроме того, лиофилизированный компонент остается стабильным не менее 3 лет по сравнению с антигеном в нативном состоянии, что является преимуществом в использовании данной тест-системы. Активность полученного антигена вируса ящура генотипа A/ASIA/SEA-97 составляет 1:3000.

В отличии от прототипа применяются сенсибилизирующие и детекторные антитела кролика и морской свинки, соответственно, высокоспецифичные по отношению к антигену вируса ящура генотипа A/ASIA/SEA-97. Указанные в тест-системе ИФА иммуноглобулины G кролика и морской свинки против указанного штамма вируса ящура представлены в виде лиофильного компонента, что позволяет иммуноглобулинам G находится в стабильном состоянии не менее 3 лет с активностью не менее 1:9000 и 1:4000, соответственно.

В отличии от прототипа сыворотки крови телят, сильно положительный и положительный контроли получены против высокоочищенного концентрированного инактивированного вируса ящура генотипа A/ASIA/SEA-97, что позволяет достичь высокой специфичности и чувствительности при контроле работы тест-системы. Указанные компоненты представлены в виде лиофильно высушенных суспензий, что позволяет хранить их не менее 3 лет с сохранением высокой активности в ИФА. Для контроля 1 активность составляет не менее 1:4000, для контроля 2 - не менее 1:4000. Активность компонентов высокая, что позволяет экономно расходовать компоненты реакции.

В отличии от прототипа для блокирования открытых сайтов связывания применяется очищенная фетальная сыворотка телят, белковые составляющие которой обеспечивают полное закрытие пустых участков на дне иммунологического планшета. Данный компонент также представлен в лиофильном виде, что позволяет хранить его в данном состоянии не менее 3 лет.

В отличии от прототипного варианта представленная тест-система предусматривает контроль антигена и конъюгата, что дает возможность учитывать фоновые значения и, тем самым, получать достоверные данные по значениям экстинкции и уровню гуморального иммунитета против вируса ящура генотипа A/ASIA/SEA-97.

В отличии от прототипа в предложенной тест-системе применяются антитела кроличьи к иммуноглобулину G морской свинки H&L (HRP), что позволяет повышать специфичность анализа и получать более достоверные результаты количественного определения уровня гуморального иммунитета против вируса ящура генотипа A/ASIA/SEA-97 в сыворотках крови животных. Активность конъюгата составляет 1:3000.

Разработанная тест-система основана на специфическом блокировании антигена вируса ящура генотипа A/ASIA/SEA-97 антителами, содержащимися в исследуемой пробе сыворотки в жидкой фазе. Смесь «исследуемая сыворотка/антиген» переносится в лунки планшета, предварительно иммобилизованного сенсибилизирующими антителами кролика против генотипа A/ASIA/SEA-97. Наличие антител к антигену вируса ящура данного генотипа в исследуемой пробе будет выражаться в формировании иммунного комплекса и уменьшении количества свободного антигена, который связывается сенсибилизирующими антителами. Фиксированный в лунках антиген взаимодействует с детекторными антителами морской свинки, которые выявляются в реакции с иммунопероксидазным конъюгатом против Ig G морской свинки и последующим окрашиванием с помощью хромогенного субстрата. Интенсивность окрашивания обратно пропорциональна количественному значению выявленного уровня гуморального иммунитета животного. Интенсивность цветной реакции учитывают с помощью спектрофотометра-ридера.

Сущность изобретения отражена на графических изображениях: Фиг. 1 - Филогенетическая принадлежность штамма «А №2155/Забайкальский/2013» генотипа A/ASIA/SEA-97.

Фиг. 2 - Седиментационный профиль фракций антигена вируса ящура штамма «А №2155/Забайкальский/2013» генотипа A/ASIA/SEA-97.

Фиг. 3 - Электрофореграмма для антигена вируса ящура штамма «А №2155/Забайкальский/2013» генотипа A/ASIA/SEA-97 в 12% полиакриламидном геле. Примечание: 1: фракции с 50% сахарозы, 3-5: фракции с 40% сахарозы, 6-9: фракции с 30% сахарозы, 10-13: фракции с 20% сахарозы.

Сущность изобретения пояснена в перечне последовательностей, в котором:

SEQ ID NO:1 представляет последовательность нуклеотидов гена, кодирующего белок VP₁ штамма «А №2155/Забайкальский/2013» генотипа A/ASIA/SEA-97 вируса ящура;

SEQ ID NO:2 представляет последовательность аминокислот белка VPi штамма «А №2155/Забайкальский/2013» генотипа A/ASIA/SEA-97 вируса ящура.

На подготовительном этапе исследования лиофилизированные иммуноспецифические компоненты тест-системы (антиген вируса ящура генотипа A/ASIA/SEA-97, иммунопероксидазный конъюгат, положительные и отрицательный контроли, сенсибилизирующие и детекторные антитела) восстанавливают до необходимого объема деионизированной водой.

Проводят приготовление рабочих растворов.

Раствор №1 (солевой буферный раствор карбоната и гидрокарбоната натрия). Готовят по стандартной методике 50 мл раствора с водородным показателем 9,5-9,6.

Раствор №2 (Wash-раствор). Готовят 2 л стандартного буферного раствора TBS с добавлением 0,1% tween-20 с водородным показателем 7,5-7,6. Рабочий Wash-раствор готовят разведением концентрата в 20 раз.

Раствор №3 (буфер для восстановления антител и конъюгата). Рабочий буферный раствор для разведения антител и иммунопероксидазного конъюгата готовится непосредственно перед использованием из рабочего Wash-раствора с добавлением 10% фетальной сыворотки телят.

Этапы проведения жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для количественного определения уровня гуморального иммунитета против антигена вируса ящура генотипа A/ASIA/SEA-97 представлены ниже.

1. Иммобилизация антител кролика против антигена вируса ящура. Восстановленную суспензию сенсибилизирующих антител против антигена вируса ящура генотипа A/ASIA/SEA-97 готовят в разведении 1:9000 в солевом буферном растворе карбоната и гидрокарбоната натрия (раствор №1). Во все лунки иммунологического 96-луночного планшета вносят по 100 мкл суспензии данных антител, накрывают крышкой и инкубируют в течение 18-20 ч при температуре (2-8)°С.

2. Промывание лунок планшета осуществляют с использованием Wash-раствора 2 раза.

3. Образование иммунного комплекса в жидкой фазе. Параллельно с иммобилизацией планшета проводят серологическую реакцию связывания антигена с испытуемыми и контрольными пробами сыворотки крови животных. Готовят следующие разведения сывороток крови животных: 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; 8,5; 9,0; 9,5; 10,0; 10,5; 11,0 log₂ SN₅₀ (1:22-1:2048) в растворе №2. Для этого во все лунки планшета за исключением лунок H1-6, которые оставляют для контроля антигена (КА) и контроля конъюгата (КК), вносят по 0,047 см³ (47 мкл) буферного раствора и 0,003 см³ (3 мкл) пробы. В лунки H1-6 вносят по 0,05 см³ (50 мкл) буферного раствора. Испытуемые и контрольные пробы располагают на планшете согласно таблице 1. Положительной считается сыворотка при уровне гуморального иммунитета ≥5,0 log₂ SN₅₀ (≥1:32).

В качестве контроля 1 используют сильно положительную сыворотку крови КРС/свиней против вируса ящура генотипа A/ASIA/SEA-97 - процент ингибиции (PI) 75-100%, контроля 2 - положительную сыворотку крови КРС/свиней против вируса ящура генотипа A/ASIA/SEA-97 - PI=50,0-74,9%, контроля 3 - нормальную сыворотку КРС/свиней - PI <50%.

Во все лунки планшета добавляют по 0,05 см³ рабочего разведения антигена в растворе №2 в соответствии с разведением 1:3000. После перемешивания содержимого лунок планшета проводят в течение 1 часа при температуре (2-8)°С.

4. Улавливание антигена. В промытые лунки иммобилизованного планшета вносят по 0,05 см³ смеси контрольных и испытуемых проб и антигена, планшет закрывают крышкой и инкубируют в течение 60±2 мин при температуре (37±1)°±С.

5. Промывание лунок планшета. Проводят, как представлено выше (п.2). Процедуру повторяют 3 раза.

6. Внесение детекторных антител. Во все лунки планшета, за исключением лунок с КК (контроль конъюгата), куда добавляют по 0,05 см3 раствора №3, вносят по 0,05 см³ рабочего разведения детекторных антител (1:4000) в растворе №3. Планшет накрывают крышкой и инкубируют в течение 60±2 мин при температуре (37±1)°С.

7. Промывание лунок планшета. Проводят, как представлено выше (п. 2). Процедуру повторяют 3 раза.

8. Внесение конъюгата. Во все лунки планшета вносят по 0,05 см³ рабочего разведения конъюгата (1:3000) в растворе №3. Планшет накрывают крышкой и инкубируют в течение 60±2 мин при температуре (37±1)°С.

9. Промывание лунок планшета. Проводят, как представлено выше (п. 2). Процедуру повторяют 4 раза.

10. Проявление цветной реакции. Во все лунки планшета вносят по 0,05 см³ хромогенного субстрата ТЕАС, закрывают крышкой и выдерживают 15-20 минут при температуре (20±2)°С.

11. Торможение реакции. Реакцию останавливают добавлением в каждую лунку планшета 0,05 см3 1,0%-ного раствора кокосульфата натрия.

12. Определение значения экстинкции и уровня гуморального иммунитета по данным ИФА. Результаты анализа учитывают инструментальным способом. Сразу после остановки реакции измеряют оптическую плотность (D) продуктов реакции в каждой лунке при длине волны 415 нм, используя спектрофотометр-ридер для микропланшетов с вертикальным лучом света. Значения D переводят в значение процента ингибиции (PI, %) по формуле:

PI(%)=(1-(D_{сыворотки}-D_KK)/(D_КА-D_КК))×100,

где D_{сыворотки} - среднее значение оптической плотности смеси сыворотки с инактивированным вирусом ящура генотипа A/ASIA/SEA-97;

D_КА - среднее значение оптической плотности контроля антигена;

D_КК - среднее значение оптической плотности контроля конъюгата.

Достоверность проводимого анализа с помощью предложенной тест-системы определяется при удовлетворении следующим критериям:

- разница между значениями D_КА и D_КК не менее 0,4 оптических единиц (о.е.);

- контроль 1 имеет значение PI>75%;

- контроль 2 имеет значение PI в пределах 50,0-74,9%;

- контроль 3 имеет значение PI<50%.

Сыворотки крови, для которых значение PI≥50%, считают положительными, а животные, от которых они получены, иммунными к ящуру, вызванного вирусом генотипа A/ASIA/SEA-97. Значение PI<50% в сыворотке крови обследуемых животных является отрицательным, что свидетельствует об отсутствии специфических антител к ящуру, вызванного вирусом генотипа A/ASIA/SEA-97. Исходя из полученных данных берут последнее разведение сыворотки, для которого процент ингибиции составляет ≥50%. Данное разведение считают титром антител против ящура, вызванного вирусом генотипа A/ASIA/SEA-97 и выражают в log₂ SN₅₀.

В результате проведенных экспериментов были оттитрованы оригинальные компоненты реакции. Активность детекторных антител в ИФА составила 1:4000, сенсибилизирующих антител - 1:9000, антивидового конъюгата - 1:3000; антигена вируса ящура генотипа A/ASIA/SEA-97 - 1:3000, контроля 1 - 1:4000, контроля 2 - 1:4000. С использованием разработанной тест-системы проведено исследование образцов сывороток крови животных с определением антител и проведен сравнительный анализ с результатами РМН в чувствительной перевиваемой монослойной клеточной линии почки свиньи (IB-RS-2) [2].

Разработанная тест-система дает возможность тестировать одновременно в формате одного 96-луночного планшета 6 проб сывороток в следующих разведениях, выраженных в двоичном логарифме: 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; 8,5; 9,0: 9,5; 10,0; 10,5; 11,0 log2 SN50 (1:22-1:2048).

Для работы применяли инактивированный антиген вируса ящура генотипа A/ASIA/SEA-97. Данный штамм применяют для разработки серологических тест-систем в настоящее время исключительно в РФ.

Контроль штамма «А №2155/Забайкалъский/2013» генотипа A/ASIA/SEA-97 вируса ящура на специфичность.

Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма «А №2155/Забайкальский/2013» генотипа A/ASIA/SEA-97 вируса ящура, был выделен от крупного рогатого скота на территории поселка Молодежный Приаргунского района Забайкальского края РФ в 2013 г. Специфичность определена с помощью ОТ-ПЦР с последующим секвенированием ID-гена, соответствующего белку VP₁, в котором наиболее часто возникают мутации. По результатам исследования нуклеотидной последовательности указанного гена была выявлена принадлежность штамма «А №2155/Забайкальский/2013» к генотипу A/ASIA/SEA-97. Расчет проводился в соответствии с Байесовской теорией вероятности. Специфичность подтверждена также в реакции связывания комплемента со штаммоспецифической сывороткой. Концентрация общего вирусного белка в исследуемом антигене вируса ящура штамма «А №2155/Забайкальский/2013» составила 3,45 мкг/мл, концентрация 146S компонента - 2,24 мкг/мл (65%), 146S+75S компонента - 3,28 мкг/мл (95%), 12 S частиц - 0,17 мкг/мл (5%). Экспериментально подтверждена возможность использования штамма «А №2155/Забайкальский/2013» генотипа A/ASIA/SEA-97 вируса ящура для разработки диагностических тест-систем.

Морфологические признаки.

Штамм «А №2155/Забайкальский/2013» вируса ящура относится к семейству Picornaviridae, роду Aphthovirus, серотипу А, генотипу A/ASIA/SEA-97 и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона икосаэдрическая, размер 24-25 нм. Вирион состоит из молекулы РНК, заключенной в белковую оболочку, которая состоит из 32 капсомеров с кубическим типом симметрии.

Антигенные свойства.

По своим антигенным свойствам штамм «А №2155/Забайкальский/2013» вируса стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. У переболевших животных в сыворотке крови образуются антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе (ИФА) и реакции микронейтрализации (РМН).

При гипериммунизации морских свинок концентрированный антиген из инактивированного вируса ящура штамма «А №2155/Забайкальский/2013» индуцирует образование вирусоспецифических антител, выявляемых в РСК в разведении не менее 1:4000.

Антигенное родство штамма «А №2155/Забайкальский/2013» вируса ящура с имеющимися производственными штаммами вируса ящура серотипа А исследовано серологическим методом в перекрестной РМН. Штамм «А №2155/Забайкальский/2013» антигенно отличается от производственных штаммов «А/Турция/2006» (генотип A/ASIA/Iran-05), «А/Иран/2018» (генотип A/ASIA/Iran-05^SIS-13), «А/Афганистан/2017» (генотип A/ASIA/Iran-05^FAR-11), «А22/Ирак/1964» (генотип A/ASIA/Iraq-64), «А/ВНИИЗЖ/2015» (генотип A/ASIA/G-VII).

Антигенное соответствие (r₁) для штамма «А/Турция/2006» составило 0,16, «А/Иран/2018» - 0,15, «А/Афганистан/2017» - 0,18, «А22/Ирак/1964» - 0,24, «А/ВНИИЗЖ/2015» - 0,28. При значении r₁≥0,3 полевой изолят и производственный штамм являются родственными, и вакцина из производственного штамма будет защищать от эпизоотического полевого вируса, при значении r₁<0,3 полевой изолят отличается от производственного штамма, и вакцина из данного штамма не защищает от эпизоотического полевого вируса.

Биотехнологические характеристики.

Штамм «А №2155/Забайкальский/2013» репродуцируется в перевиваемых монослойных клеточных линиях почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), почки свиньи IB-RS-2, почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/SUSP/ARRIAH, и в течение 13-20 часов инкубирования вирус в указанных культурах клеток накапливается от 6,60 до 8,15 lg ТЦД₅₀/см³.

Генотаксономическая характеристика.

Штамм «А №2155/Забайкальский/2013» вируса ящура типа А является РНК (+) - содержащим вирусом. Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой с молекулярной массой 2,82×10⁶ Да. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех структурных белков VP₁, VP₂, VP₃ и VP₄.

Основным антигенным белком является VP₁. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирионная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Из 8 неструктурных полипептидов, накапливающихся в инфицированных клетках, один является РНК-зависимой РНК-полимеразой, участвующей в репликации РНК новых вирионов.

Физические свойства.

Для данного вируса при константе седиментации полных вирусных частиц 146 S, константе диффузии 1,43 см²/с молекулярная масса составляет 8,08×10⁶ Д. Размер вириона 24-25 нм, масса составляет 8,41×10^-18 г.

Устойчивость к внешним факторам.

Штамм «А №2155/Забайкальский/2013» устойчив к эфиру, хлороформу, ацетону и другим органическим растворителям и детергентам. Наиболее стабилен при рН 7,5-7,8. Сдвиги водородного показателя как в кислую, так и в щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Вирусная частица чувствительна к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам.

Дополнительные признаки и свойства.

Иммуногенная активность - иммуногенен в составе инактивированной вакцины.

Антигенная активность - введение инактивированного вируса ящура штамма «А №2155/Забайкальский/2013» морским свинкам, кроликам, свиньям, овцам, КРС индуцирует образование вирусоспецифических антител.

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - патогенен для парнокопытных животных, новорожденных мышат, морских свинок.

Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при культивировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения).

Сущность изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Получение антигена вируса ящура генотипа A/ASIA/SEA-97.

Для получения антигена вируса ящура генотипа A/ASIA/SEA-97 для диагностических целей проводили суспензионное культивирование вируса в клеточной линии BHK-21/SUSP/ARRIAH в течение 8-10 ч с получением вирусной суспензии с титром инфекционной активности не ниже 6,5 lg ТЦД₅₀/см³. Полученную вирусную суспензию инактивировали с помощью аминоэтилэтиленимина и осветляли полигексаметиленгуанидином.

Инактивированную культуральную суспензию, содержащую антиген вирус ящура, осветляли в течение 30 мин. при 6000 об/мин и 4°С. Надосадочную жидкость отбирали и добавляли в нее полиэтиленгликоль с молекулярным весом 6000 Д (ПЭГ-6000) до конечной концентрации 8,5% и хлорид натри (сухой) до конечной концентрации 0,85%, интенсивно перемешивали и выдерживали при температуре 2±1°С в течение 18-24 часов. Вирусную суспензию осаждали при 6000 об/мин в течение 60 мин., осадок растворяли в 1/15 М растворе фосфатно-солевого буфера, концентрируя в 400 раз (1/400 от первоначального объема).

К полученному преципитату добавляли 50% хлороформа, интенсивно перемешивали и фракционировали с помощью центрифуги в течение 30 мин. при 3000 об/мин. Отбирали верхнюю водную фракцию, содержащую антиген вируса ящура генотипа A/ASIA/SEA-97. Отбирали 100 мкл образца для последующего электрофоретического анализа в 12% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях.

На следующем этапе проводили получение 146S частиц вируса ящура генотипа A/ASIA/SEA-97 (данный компонент является иммуногенным).

Для выделения полных частиц с коэффициентом седиментации 146S готовили линейный градиент сахарозы с концентрациями 50, 40, 30, 20% (по направлению слоев в центрифужной пробирке снизу вверх). Суспензию антигена вируса ящура генотипа A/ASIA/SEA-97 вносили по 15 мл в центрифужные пробирки, затем последовательно подслаивали растворы сахарозы, начиная с 20%-го и заканчивая 50%-м раствором. Пробирки помещали в металлические центрифужные стаканы и после тщательно выполненного уравновешивания центрифугировали при скорости 30000 об/мин и температуре 2±1°С в течение 4 часов. Фракционирование градиента сахарозы производили с помощью перистальтического насоса, отбирая фракции по 1,0 мл в отдельные пробирки. Начало и конец пика 146S компонента определяли по спектральному профилю на спектрограмме, объединяя фракции, входящие в этот диапазон.

При использовании перистальтического насоса сначала оценивали визуально пробирку с градиентом сахарозы. Опалесцирующий слой, содержащий 146S компонент, располагается приблизительно в 30%-м слое сахарозы. 146S компонент переосаждали с помощью ультрацентрифугирования в течение 4 часов при скорости 25000 об/мин. и температуре 2±1°С и ресуспендировали осадок в 1/15 М фосфатно-солевом буферном растворе.

Результаты спектрометрического исследования полученных фракций антигена вируса ящура генотипа A/ASIA/SEA-97 в виде антигенного профиля представлены на фиг. 2. Анализ проводили для 14 фракций, пики наблюдали для фракций №4-7. Проведен электрофорез полученных фракций в 12% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях для 14 фракций, в которых возможно нахождение 146S компонента вируса ящура данного штамма (фиг.3). Данные гель-электрофореза подтверждают результаты спектрального профиля.

Пример 2. Получение гипериммунной сыворотки крови кроликов (сенсибилизирующие антитела) против антигена вируса ящура генотипа A/ASIA/SEA-97.

Для получения специфических сывороток крови против вируса ящура генотипа A/ASIA/SEA-97 применяли клинически здоровых кроликов средней упитанности массой 2,5-3,0 кг.

Для гипериммунизации животных применяли концентрированный очищенный инактивированный антиген вируса ящура генотипа A/ASIA/SEA-97, полученный как описано в примере 1, из которого готовили эмульсию с использованием масляного адъюванта Montanide ISA-71 R VG (в соотношении адъювант/антиген=70/30 по массе). Полученную вакцину вводили в мышцу задних конечностей кролика на 0, 14 и 28 дни в объеме 0,5 см³. Через 7 дней после последней иммунизации у кроликов отбирали кровь, содержащую сенсибилизирующие антитела, которую лиофильно высушивали и хранили при температуре (1-3)°С.

Пример 3. Получение гипериммунной сыворотки крови морских свинок (детекторные антитела) против антигена вируса ящура генотипа A/ASIA/SEA-97.

Для гипериммунизации морских свинок использовали эмульсию очищенного препарата концентрированного инактивированного антигена вируса ящура генотипа A/ASIA/SEA-97, полученного как описано в примере 1. Приготовление вакцины и схема иммунизации такая, как в примере 2.

Пример 4. Определение активности в ИФА антигена вируса ящура генотипа A/ASIA/SEA-97, сенсибилизирующих и детекторных антител к нему.

Образцы сывороток крови животных проверяли на активность и специфичность в жидкофазном блокирующем непрямом «сэндвич»-варианте ИФА. Был проведен подбор оптимальных рабочих разведений указанных компонентов для получения достоверных результатов в ИФА. Полученные данные анализа представлены в таблицах 2, 3, 4.

Для анализа исследовали следующие разведения сенсибилизирующих антител: 1:7000, 1:8000, 1:9000, 1:10000. Разведения остальных компонентов были постоянны: для антигена - 1:3000, для детекторных антител - 1:4000, конъюгата - 1:3000. В качестве контрольных сывороток для анализа применяли сыворотки, специфичные к определенным штаммам вируса ящура с активностью 8,0 log₂ SN₅₀. Их таблицы 2 следует, что при разведении сенсибилизирующих антител 1:9000 достигалось получение достоверного результата (1:256 или 8,0 log₂ SN₅₀). При меньших разведений антител наблюдали высокие фоновые значения, что не позволяло получить корректный результат. При разведении отмечали снижение детектируемых значений уровня гуморального иммунитета в сыворотках крови животных. При исследовании неспецифических и отрицательных сывороток получали отрицательные результаты, что свидетельствовало о высокой специфичности разработанного способа.

Для анализа исследовали следующие разведения детекторных антител: 1:3000, 1:3500, 1:4000, 1:4500. Разведения остальных компонентов были постоянны: для антигена - 1:3000, для сенсибилизирующих антител - 1:9000, конъюгата - 1:3000. В качестве контрольных сывороток для анализа применяли сыворотки, специфичные к определенным штаммам вируса ящура с активностью 8,0 log2 SN50. Их таблицы 3 следует, что при разведении детекторных антител 1:4000 достигалось получение достоверного результата (1:256 или 8,0 log₂ SN₅₀). При меньших разведений антител наблюдали высокие фоновые значения, что не позволяло получить корректный результат. При большем разведении наблюдали снижение детектируемого значения титра антител в сыворотках крови животных. При исследовании неспецифических и отрицательных сывороток отмечали отрицательные результаты, что свидетельствовало о высокой специфичности разработанного способа.

Для анализа исследовали следующие разведения антигена: 1:1500, 1:2000, 1:2500, 1:3000. Разведения остальных компонентов были постоянны: для детекторных антител - 1:4000, для сенсибилизирующих антител - 1:9000, конъюгата - 1:3000. В качестве контрольных сывороток для анализа применяли сыворотки, специфичные к определенным штаммам вируса ящура с активностью 8,0 log₂ SN₅₀. Их таблицы 4 следует, что при разведении антигена 1:3000 достигалось получение достоверного результата (1:256 или 8,0 log₂ SN₅₀). При меньших разведениях наблюдали высокие фоновые значения, что не позволяло получить корректный результат. При разведении наблюдали снижение детектируемого значения титра антител в сыворотках крови животных.

При исследовании неспецифических и отрицательных сывороток отмечали отрицательные результаты, что свидетельствовало о высокой специфичности разработанной тест-системы.

Таким образом, в ходе лабораторных исследований доказано, что рабочие разведения антигена вируса ящура генотипа A/ASIA/SEA-97, сенсибилизирующих и детекторных антител составили 1:3000, 1:9000, 1:4000, соответственно.

Пример 5. Применение тест-системы для определения уровня антител против антигена вируса ящура генотипа A/ASIA/SEA-97 с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА.

Исследовали 12 сывороток крови животных, полученных после иммунизации инактивированными сорбированными вакцинами против ящура, содержащими антиген вируса ящура генотипа A/ASIA/SEA-97. Определены значения титра антител против антигена вируса ящура с применением разработанной тест-системы ИФА, а также данные сыворотки были исследованы в РМН в чувствительной перевиваемой монослойной клеточной линии IB-RS-2, рекомендованной МЭБ (OIE) [2]. Полученные результаты отражены в таблице 5, из которой следует, что степень корреляции результатов разработанной тест-системы ИФА (предлагаемое изобретение) и классического метода РМН высокая (приближено к 100%).

Пример 6. Определение диагностических показателей разработанной тест-системы для определения уровня антител против антигена вируса ящура генотипа A/ASIA/SEA-97 с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА (предлагаемое изобретение).

Для исследования представленной тест-системы (предлагаемое изобретение) для определения уровня антител против антигена вируса ящура генотипа A/ASIA/SEA-97 с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА исследовали стандартные диагностические показатели. Для определения чувствительности предложенной тест-системы анализировали 415 сывороток крови животных, которые являлись заведомо положительными по данным реакции микронейтрализации в чувствительной перевиваемой монослойной клеточной линии почки свиньи IB-RS-2. Уровень антител для данных сывороток крови находилась в диапазоне 5,5-10,5 log₂ SN₅₀. Постановку ИФА проводили, как отражено выше. Разработанной тест-системой (предлагаемое изобретение) определили, что из 415 образцов сывороток крови 414 определены в качестве положительных, а 1 - в качестве отрицательных (уровень гуморального иммунитета по данным ИФА составил 1:22). Для исследования специфичности метода тестировали 185 отрицательных сывороток крови животных. В результате исследования с помощью ИФА (предлагаемое изобретение) определили, что из 185 отрицательных проб - 185 определены в качестве отрицательных. Определили, что в 95%-ном доверительном интервале диагностическая чувствительность (DSe) составила 98,67-99,99%, диагностическая специфичность (DSp) - 98,03-100,00%, k-критерий - 0,998; прогностичность отрицательного результата (NPV) - 96,31-99,92%, общая точность (DAc) - 99,08-100,00% (таблица 6).

Таким образом предлагаемая «Тест-система для определения уровня антител против антигена вируса ящура генотипа A/ASIA/SEA-97 с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА» является специфичной и чувствительной, позволяющей быстро в течение 4 часов провести анализ сывороток крови животных с количественным определением уровня гуморального иммунитета против антигена вируса ящура генотипа A/ASIA/SEA-97. Данный генотип является актуальным и быстро распространяющимся на территории Азии, а также в странах Ближнего Востока. Разработанная тест-система будет направлена на подтверждение высокой эффективности производимых в РФ противоящурных инактивированных вакцин, содержащих антиген данного генотипа, и, тем самым, на защиту территории России и граничащих с ней на юге стран от распространения вируса ящура генотипа A/ASIA/SEA-97.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Тест-система для определения уровня антител против антигена вируса ящура генотипа A/ASIA/SEA-97 с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА»:

1. Борисов, В.В. Вакцинопрофилактика ящура животных в России / В.В. Борисов, A.M. Рахманов // Научные основы производства вет.биол. препаратов: материалы Междунар. науч.- практ. конф.- Щелково, 2009. - С. 165-171.

2. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals. - Paris, 2018.-Chapter 2.1.8.

3. Гуленкин, B.M. Экономическая эффективность проведения профилактической вакцинации животных против ящура на территории Российской Федерации / В.М. Гуленкин // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2012. - Т. 10. - С. 31-41.

4. Brooksby, J. В. 1982. Portraits of viruses: foot-and-mouth disease virus. Intervirology 18:1-23.

5. Rueckert, R. R., and E. Wimmer. 1984. Systematic nomenclature of picornavirus proteins. J. Virol. 50:957-959.

6. Grubman, M. J. 1980. The 5' end of foot-and-mouth disease virion RNA contains a protein covalently linked to the nucleotide pUp.Arch. Virol. 63:311-315.

7. Domingo, E., C. Escarmis, E. Baranowski, С.M. Ruiz-Jarabo, E. Carrillo, J. I. Nunez, and F. Sobrino. 2003. Evolution of foot-and-mouth disease virus. Virus Res. 91:47-63.

8. Sobrino, F., M. Davila, J. Ortin, and E. Domingo. 1983. Multiple genetic variants arise in the course of replication of foot-and-mouth disease virus in cell culture. Virology 128:310-318.

9. Динамика развития противоящурного гуморального иммунитета у крупного рогатого скота, иммунизированного трехвалентной сорбированной вакциной типов А, О, Азия-1 / Д.В. Михалишин, Т.Н. Лезова // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2007. - Т. 5. - С. 75-82.

10. Wong C.L., Yong C.Y., Ong Н.К., Но K.L., Tan W.S. Advances in the Diagnosis of Foot-and-Mouth Disease // Front Vet Sci. - 2020 Aug 21. - V.7. - P. 477.

11. Curry S., Abu-Ghazaleh R., Blakemore W., Fry E., Jackson Т., King A., Lea S., Logan D., Newman J., Stuart D. Crystallization and preliminary X-ray analysis of three serotypes of foot-and-mouth disease virus // J. Mol Biol. - 1992. - V. 228(4). - P. 1263-1268.

12. King, A. M., D. McCahon, K. Saunders, J. W. Newman, and W. R. Slade. 1985. Multiple sites of recombination within the RNA genome of foot-and-mouth disease virus. Virus Res. 3:373-384.

13. Tosh, C, D. Hemadri, and A. Sanyal. 2002. Evidence of recombination in the capsid-coding region of type A foot-and-mouth disease virus. J. Gen. Virol. 83:2455-2460.

14. Fry E.E., Stuart D.I., Rowlands D.J. The structure of foot-and-mouth disease virus // Curr Top Microbiol Immunol - 2005. - V. 288. - P. 71-101/

15. Palmenberg A.C. Proteolytic processing of picornaviral polyprotein // Annu Rev Microbiol. - 1990. - V. 44. - P. 603-623.

16. Curry S., Fry E., Blakemore W., Abu-Ghazaleh R., Jackson Т., King A., Lea S., Newman J., Stuart D. Dissecting the roles of VPo cleavage and RNA packaging in picornavirus capsid stabilization: the structure of empty capsids of foot-and-mouth disease virus // J. Virol. - 1997. - V. 71(12). - P. 9743-9752.

17. Anon N. Global Strategy for control of foot-and-mouth disease. - In, Bangkok, Thailand, - 2012. - P. 27-29.

18. Saitou N. and Nei M. (1987). The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution 4:406-425.

19. Felsenstein J. (1985). Confidence limits onphylogenies: An approach using the bootstrap.Evolution 39:783-791.

20. Tamura K., Nei M., and Kumar S. (2004). Prospects for inferring very large phylogenies by using the neighbor-joining method. Proceedings of the National Academy of Sciences (USA) 101:11030-11035.

21. Kumar S., Stecher G., Li M., Knyaz C, and Tamura K. (2018). MEGA X: Molecular Evolutionary Genetics Analysis across computing platforms. Molecular Biology and Evolution 35:1547-1549.

22. Oem J.K., Park J.H., Lee K.N., Kim Y.J., Kye S.J., Park J.Y., Song H.J. Characterization of recombinant foot-and-mouth disease virus pentamer-like structures expressed by baculovirus and their use as diagnostic antigens in a blocking ELISA // Vaccine. - 2007. - V. 25(20). - P. 4112-112.

23. Lewis S.A., Morgan D.O., Grubman M.J. Expression, processing, and assembly of foot-and-mouth disease virus capsid structures in heterologous systems: induction of a neutralizing antibody response in guinea pigs // J. Virol. - 1991. - V. 65(12). - P. 6572-6580.

24. Cao Y., Lu Z., Sun J., Bai X., Sun P., Bao H., Chen Y., Guo J., Li D., Liu X., Liu Z. Synthesis of empty capsid-like particles of Asia I foot-and-mouth disease virus in insect cells and their immunogenicity in guinea pigs // Vet. Microbiol. - 2009. - V. 137(1-2). - P. 10-17.

25. Hamblin C, Barnett I.Т., Hedger R.S. A new enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of antibodies against foot-and-mouth disease virus. I. Development and method of ELISA // J. Immunol. Methods. - 1986. -V. 93(1).-P. 115-121.

26. Grubman M.J., Moraes M.P., Diaz-San Segundo F., Pena L., de los Santos T. Evading the host immune response: how foot-and-mouth disease virus has become an effective pathogen // FEMS Immunol Med Microbiol. - 2008. - V. 53(1). - P. 8-17.

27. Ma L.N., Zhang J., Chen H.T., Zhou J.H., Ding Y.Z., Liu Y.S. An overview on ELISA techniques for FMD // Virol J. - 2011 Sep 4. - V. 8. - P. 419.

28. Sharma GK, Mahajan S, Matura R, Subramaniam S, Mohapatra JK, Pattnaik B. Quantitative single dilution liquid phase blocking ELISA for sero-monitoring of foot-and-mouth disease in India. Biologicals. 2015 May;43(3): 158-64.

29. IZSLER ELISA. URL: https://www.fao.org/fileadmin/user_upload/eufmd/docs/Open_Session2012/Appendices/75_New_Elisa_for_diagnosis_Brocchi_.pdf (Дата обращения: 25.01.2023).

30. PrioCHECK ELISA. URL: http://vetprofilab.ru/f/priocheck_ fmdv_antibody_elisa_kit_cut.pdf (Дата обращения: 27.01.2023).

31. Патент РФ №2787714, 11.01.2023. Тест-система на основе жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII в сыворотках крови животных после иммунизации // Заявка №2022108324 / Луговская Н.Н., Доронин М.И., Михалишин Д.В., Гочмурадов Ы.М., Оковытая Т.В., Борисов А.В.

32. Robiolo В, La Torre J, Duffy S, Leon E, Seki C, Torres A, Mattion N. Quantitative single serum-dilution liquid phase competitive blocking ELISA for the assessment of herd immunity and expected protection against foot-and-mouth disease virus in vaccinated cattle. J Virol Methods. 2010 Jun;166(l-2):21-7.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="FMDV ELISAA ASIA

SEA-97_1679384561276.xml" softwareName="WIPO Sequence"

softwareVersion="2.1.2" productionDate="2023-03-21">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-03-21</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>495</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-03-21</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">ФГБУ &quot;Федеральный центр охраны

здоровья животных&quot; (ФГБУ &quot;ВНИИЗЖ&quot;)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>FGBI &quot;ARRIAH&quot;</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Доронин Максим

Игоревич</InventorName>

<InventorNameLatin>Doronin Maksim Igorevich </InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Тест-система для определения

уровня антител против антигена вируса ящура генотипа A/ASIA/SEA-97 с

помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА

</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>2</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>639</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..639</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q1">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>accaccgccaccggggaatcagcagaccctgtcacaaccaccgttgaga

actacggtggcgagacacaatacagcggcgttaccacaccgacgtcggcttcttaatggacaggttcgtg

cagatcaagcctgtgggccccacacatgtcattgacctcatgcagacacaccaacacgggctggtgggcg

ccatgttgcgcgcggccacctactacttttctgatcttgagattgtggtgaaccacacgggtaacctaac

gtgggtacccaatggagcacccgaggcagcactgcaaaacacgagcaaccccactgcttaccacaaagcg

ccgttcacgaggcttgcgctcccctacaccgcgccacaccgcgtgctggcaactgtgtacagtgggacga

gcaagtactccgcacctcaaaaccggcgaggtgacttgggtcctctcgcggcgagactcgctgcacagct

ccctgcctccttcaacttcggtgcaattcgggccacggagatctgcgaactccttgtgcgcatgaagcgc

gccgagctctactgccccaggccactgttggcggtggaggtgtcgtcgcaagacagacacaagcagaaaa

tcattgcccctgcaaaacaactcctggagg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>213</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..213</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>TTATGESADPVTTTVENYGGETQYSGVTTPTSASWTGSCRSSLWAAPHM

SLTSCRHTNTGAWWAPCCARPPATTFLILRLAWTTRVTRGYPMEHPRQHCKTRATPLLTTKRRSRGLRSP

TPRHTACWQLCTVGRASTPHLKTGEVTWVLSRRDSLHSSLPPSTSVQFGPRRSANSLCASAPSSTAPGHC

WRWRCRRKTDTSRKSLPLQNNSWR</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к тест-системе для определения уровня антител против антигена вируса ящура генотипа A/ASIA/SEA-97 с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА. Изобретение эффективно для защиты территории России и граничащих с ней на юге стран от распространения изолятов вируса ящура генотипа A/ASIA/SEA-97. 1 з.п. ф-лы, 3 ил., 6 табл., 6 пр.

1. Тест-система для определения уровня антител против антигена вируса ящура генотипа A/ASIA/SEA-97 с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА, содержащая:

- иммуноспецифические лиофилизированные составляющие: культуральный инактивированный вирус ящура генотипа A/ASIA/SEA-97 штамма «А №2155/Забайкальский/2013» серотипа А с активностью в ИФА 1:3000; сенсибилизирующие антитела - иммуноглобулины G кролика против вируса ящура генотипа A/ASIA/SEA-97 с активностью в ИФА 1:9000; детекторные антитела - иммуноглобулины G морской свинки против вируса ящура генотипа A/ASIA/SEA-97 с активностью в ИФА 1:4000; контроль 1 - сильно положительная сыворотка крови телят к антигену вируса ящура генотипа A/ASIA/SEA-97 с процентом ингибиции 75-100%; контроль 2 - положительная сыворотка крови телят к антигену вируса ящура генотипа A/ASIA/SEA-97 с процентом ингибиции от 50 до 74,9%; контроль 3 - отрицательная сыворотка крови телят, не содержащая антитела к вирусу ящура; блокирующая сыворотка крови крупного рогатого скота; антивидовой конъюгат - иммуноглобулины кролика против Ig G морской свинки, конъюгированные с пероксидазой хрена, с активностью в ИФА 1:3000;

- неспецифические составляющие: буферный раствор на основе карбоната и гидрокарбоната натрия с рН 9,5-9,6, 20-кратный концентрат буферного раствора, хромогенный субстрат - ТЕАС, «стоп»-раствор - 1,0%-ный раствор кокосульфата натрия;

отличающаяся тем, что в качестве антигена вируса ящура содержит культуральный инактивированный вирус ящура генотипа A/ASIA/SEA-97 и для определения процента ингибиции используется модифицированная формула: PI, %=(1-(D_{сыворотки}-D_КК)/(D_КА-D_КК))×100, при этом титр противоящурных антител определяется как максимальное разведение сыворотки крови, для которой значение процента ингибиции составляет > 50%.

2. Тест-система по п. 1, отличающаяся тем, что является специфичной и чувствительной, позволяющей быстро, в течение 4 часов, провести анализ сывороток крови животных с определением титра антител против вируса ящура генотипа A/ASIA/SEA-97 и количественно определить уровень гуморального иммунитета в диапазоне разведений сыворотки 1:22 - 1:2048.