Тест-система для выявления антител к структурным белкам вируса ящура штамма "SAT-1/Кения/2017" с помощью жидкофазного блокирующего непрямого "сэндвич"-варианта ИФА Российский патент 2024 года по МПК C12N15/00 G01N33/569 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности, созданию тест-системы для выявления антител к структурным белкам вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА.

По данным Международного эпизоотического бюро в последние годы отмечается ухудшение эпизоотической ситуации по ящуру в мире. Крупные вспышки ящура были зарегистрированы в Монголии, Северной и Южной Корее, Японии, Тайване, Афганистане, Индии, Китае, Киргизии, Таджикистане, Казахстане, Турции. Имеется тенденция к осложнению эпизоотической ситуации на территории Российской Федерации. Наиболее подвержены инфекции молодые парнокопытные сельскохозяйственные животные (крупный рогатый скот, свиньи, козы, овцы, олени). Животноводству ящур наносит большой экономический ущерб. За считанные часы от одного больного животного могут заразиться сотни. Больные животные подлежат уничтожению.

Ящур вызывается вирусом со следующей таксономией: сфера Riboviria, царство Orthornavirae, тип Pisuviricota, класс Pisoniviricetes, отряд Picornavirales, семейство Picornaviridae, род Aphthovirus, вид Foot-and-mouth disease virus [1].

Геном вируса ящура представлен молекулой РНК длиной нуклеиновой кислоты около 8400-8500 н.о. и положительным смыслом [1, 2]. При репродукции вируса ящура в биологических системах формируются 146S компонент (главный иммуногенный компонент), состоящий из одной молекулы вирусной РНК и 60 копий полипептида, каждая из которых представлена комплексом белков VP₁-VP₂-VP₃-VP₄ [1].

Существует 7 серотипов ящура: O, A, C, Азия-1, SAT-1, SAT-2 и SAT-3. Серотип SAT-1 является весьма разнообразным, в его пределах выделяют 13 топотипов. Различия между ними определяют при анализе нуклеотидной последовательности 1D-гена (белок VP₁), который характеризуется высокой геномной и антигенной вариабельностью [1, 2]. Антитела против одного генотипа в пределах серотипа SAT-1 не обеспечивают иммунную защиту против другого генотипа.

В РНК-содержащих вирусах, вариациям в геноме благоприятствуют высокие частоты мутаций во время репликации вируса, а возникающие линии и сублинии обусловлены мутациями и рекомбинацией. Мутации в результате рекомбинации приводят к обмену генетическим материалом и образованию новых антигенных вариантов, которые могут избежать иммунного давления и привести к изменениям тропизма клеток и диапазона хозяев [3, 4, 5, 6]. Одна или несколько аминокислотных замен на поверхности вирусных частиц могут привести к изменению распознавания и использования рецепторов. В результате один и тот же вирус будет приобретать способность проникать в клетки с использованием альтернативных рецепторов [7].

Наличие семи серотипов и множества подтипов и вариантов усложняют лабораторную диагностику ящура и борьбу с ним. Появление новых вариантов неизбежно вызвано продолжающейся циркуляцией вируса в полевых условиях и квазивидовым характером РНК-генома [8]. Большая часть этих вариаций происходит в кодирующей капсид области генома (область полипептида P₁) и приводит к антигенной вариации.

Наиболее вариабельным является белок VP₁ вируса ящура, поскольку на него приходится не менее 90% мутаций всех структурных генов. Самыми вариабельными областями являются участки 40-60, 130-160 и 190-213 а.о. [9]. Участок поверхностного белка VP₁ в регионе 130-160 а.о. отличается высокой вариабельностью, поскольку участвует в процессе связывания с рецепторами клетки-хозяина [10, 11]. Изменчивость данного региона дает возможность вирусу ящура взаимодействовать с рецепторами клеток разных типов и облегчает переход от одного вида хозяина к другому [10].

Для вируса ящура серотипа SAT-1 характерна высокая генетическая изменчивость, а именно он включает в себя следующие 13 топотипов: I (NORTHWEST ZIMBABWE, NWZ), II (SOUTHEAST ZIMBABWE, SEZ), III (WESTERП ZIMBABWE, WZ), IV (EAST AFRICA1, EA-1), V, VI, VII (EAST AFRICA 2, EA-2), VIII (EAST AFRICA 3, EA-3), IX, X, XI, XII, XIII. Такое высокое генетическое и антигенное разнообразие приводит к проблемам при специфической профилактике ящура с применением культуральных инактивированных противоящурных вакцин, а также затрудняет штаммоспецифическую диагностику выделенных изолятов вируса ящура. В результате возникает необходимость создания новых средств диагностики и специфической иммунопрофилактики в отношении вируса ящура серотипа SAT-1.

На территории Восточной Африки, в частности, в Нигерии, Кении, Танзании, Эфиопии вспышки ящура серотипа SAT-1 имеют спорадический характер и вызваны заносом возбудителя с территорий сопредельных стран. С увеличением торгово-экономических связей со странами Африканского континента, в частности, с Восточной Африкой, имеются риски заноса изолятов данного серотипа на территорию Российской Федерации.

Анализируя вспышки, которые регистрировались на территории Африки, обнаружено, что были выявлены изоляты разных топотипов серотипа SAT-1, в частности, II (SAT-1 RV 11 37), III (SAT-1 BOT 1 68), IV (SAT-1 UGA BUFF 21 70), V (SAT-1 NIG 11 75), VI (SAT-1 SUD 3 76), VII (SAT-1 UGA 13 74), VIII (SAT-1 UGA 1 97), IX (SAT-1 ETH 3 2007), X (SAT-1/X), XI (SAT-1 TCH 1/72), XII (SAT-1/ANG/9/74), XIII (SAT 1 MOZP132010 B16). В последние годы, начиная с 2012 г. стали широко распространяться изоляты вируса ящура серотипа SAT-1 топотипа NWZ. В частности, вспышки ящура данного генотипа фиксировались в Кении, Танзании, Уганде, Эфиопии [9-11].

Известны производственные штаммы вируса ящура типа SАT-1, которые применяются или применялись в мире для производства средств специфической профилактики ящура:

- штамм «SAT-1 ZIM 23 2003» (генотип SAT-1/I),

- штамм «SAT-1 RV 11 37» (генотип SAT-1/II),

- штамм «SAT-1 BOT 1 68» (генотип SAT-1/III),

- штамм «SAT-1 UGA BUFF 21 70» (генотип SAT-1/IV),

- штамм «SAT-1 NIG 11 75» (генотип SAT-1/V),

- штамм «SAT-1 SUD 3 76» (генотип SAT-1/VI),

- штамм «SAT-1 UGA 13 74» (генотип VII),

- штамм «SAT-1 UGA 1 97» (генотип VIII),

- штамм «SAT-1 ETH 3 2007» (генотип IX),

- штамм «SAT-1/NIG/2015» (генотип X),

- штамм «SAT-1 TCH 1/72» (генотип XI),

- штамм «SAT-1/ANG/9/74» (генотип XII),

- штамм «SAT 1 MOZP132010 B16» (генотип XIII).

Изолят «SAT-1 / KEN / 8 / 2017» вируса ящура был выделен от крупного рогатого скота на территории населенного пункта Subukia в регионе Nakuru Республики Кения в 2017 г. и поступил в ФГБУ «ВНИИЗЖ» для проведения научных исследований в 2021 г. В результате научно-исследовательской работы путем адаптации изолята к репродукции в первично-трипсинизированной монослойной клеточной линии почки свиньи СП, в перевиваемых культурах клеток BHK-21/SUSP/ARRIAH, IB-RS-2, ПСГК-30 и в организме крупного рогатого скота был получен штамм «SAT-1/Кения/2017». Штамм «SAT-1/Кения/2017» депонирован в Всероссийской коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №451 - деп/23-1-ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».

По результатам сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей выделенный изолят принадлежит к топотипу NWZ (Northwest Zimbabwe) серотипа SAT-1 вируса ящура (фиг. 1), который значительно отличается от производственных штаммов вируса ящура типа SAT-1, в том числе штамма «SAT-1 ZIM 23 2003» (генотип SAT-1/I (NWZ)).

Иммунизация является эффективным инструментом борьбы с болезнью. В связи с распространением в мире генотипа SAT-1/NWZ (штамм «SAT-1/Кения/2017») вируса ящура и необходимостью защиты животных от него в ФГБУ «ВНИИЗЖ» разработана вакцина, в состав которой входит антиген вируса ящура данного генотипа. В результате возникает необходимость создания диагностической тест-системы для выявления антител к структурным белкам вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА.

Защита от ящура после вакцинации определяется уровнем специфических антител в сыворотке крови животных [12 - 19]. Уровень гуморального иммунитета вакцинированного поголовья определяется путем выявления антител, специфичных к структурным белкам вируса ящура. В соответствии с рекомендациями МЭБ (OIE) [2], для определения иммунного статуса животных применяют реакцию микронейтрализации (РМН) и иммуноферментный анализ (ИФА). РМН считается чувствительной и специфичной, однако проведение анализа имеет ряд следующих ограничений: 1) большая продолжительность времени постановки реакции, 2) высокая себестоимость процедуры, связанная с применением чувствительной клеточной линии, наличием CO₂-инкубатора и другого оборудования, 3) использование не инактивированного вируса ящура, который является биологическим агентом II группы опасности и предполагает проведение работ только в лабораториях уровня BSL-3.

В свою очередь, ИФА обладает многими преимуществами, включая экспрессность, высокую специфичность и чувствительность, пригодность для крупномасштабного скрининга полевых образцов и отсутствие требований к специальным лабораторным условиям, например, культуре клеток или среде углекислого газа, а также не предполагает проведение работ с микроорганизмами повышенного уровня опасности [20]. Исходя из этого, ИФА целесообразно применять для исследования уровня гуморального иммунитета у вакцинированных животных.

Особым способом проведения ИФА является «сэндвич»-вариант, который обычно предполагает применение пар подобранных антител, где каждое антитело специфично для другого, неперекрывающегося эпитопа антигена. Первые антитела принято называть сенсибилизирующими и предназначены они для захвата антигена. Вторые антитела - детекторные, необходимы для обнаружения антигена. Указанный вариант ИФА имеет следующие преимущества: 1) высокая специфичность реакции; 2) подходит для скринингового анализа полевых образцов разной степени очистки; 3) высокая чувствительность реакции.

В зависимости от фазы, в которой находятся иммунные комплексы различают твердофазный и жидкофазные варианты ИФА. Особое внимание уделяют жидкофазному блокирующему непрямому «сэндвич»-варианту ИФА, который характеризуется рядом преимуществ: 1) данный анализ максимально приближен к классической реакции микронейтрализации, поскольку формирование иммунного комплекса происходит в жидкой фазе как наиболее естественных условиях; 2) эпитопы антигена наиболее доступны в пространстве для специфичных антител, что позволяет повысить чувствительность и специфичность реакции.

На мировом рынке в настоящее время имеются европейские наборы для детекции антител против вируса ящура типа SAT-1 - IZSLER (Италия) и PrioCHECK (Нидерланды).

Тест-система в наборе IZSLER предназначена для детекции противоящурных антител с помощью твердофазного прямого «сэндвич»-варианта ИФА [21]. Достоинством данного набора является применение моноклональных антител, однако они были получены ранее 2017 года (период, когда появился производственный штамм «SAT-1/Кения/2017») и не могут с высокой достоверностью и точностью детектировать специфические антитела в сыворотках крови животных. Специфичность и чувствительность указанной тест-системы выявления антител к структурным белкам вируса ящура штамма
«SAT-1/Кения/2017» ниже 32%, что подтверждают данные реакции микронейтрализации в чувствительной перевиваемой монослойной клеточной линии почки свиньи IB-RS-2. Таким образом, применяемая тест-система не позволяет получать достоверных результатов именно в отношении изолятов и штаммов вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017».

Наиболее близким прототипом для разработанной нами тест-системы является тест-система PrioCHECK (Prionics Lelystad B.V., Netherlands) для выявления антител к вирусу ящура типа SAT-1 [22].

Комплектующие для соответствующего набора представлены ниже:

Компонент 1 - Планшеты иммунологические.

Компонент 2 - Конъюгат (30х). Разбавленный конъюгат не стабилен, готовят непосредственно перед применением.

Компонент 3 - Буфер для разведения (5x).

Компонент 4 - Неиммунная сыворотка крови лошади.

Компонент 5 - Деминерализованная вода.

Компонент 6 - Промывочный буфер (200х).

Компонент 7 - Референтная сыворотка 1 (позитивная) (жидкая).

Компонент 8 - Референтная сыворотка 2 (менее позитивная) (жидкая).

Компонент 9 - Референтная сыворотка 3 (еще менее позитивная) (жидкая).

Компонент 10 - Референтная сыворотка 4 (отрицательный контроль) (жидкая).

Компонент 11 - Субстрат хромогена (TMB).

Компонент 12 - Стоп-раствор (1 N раствор серной кислоты). Данные отражены в инструкции производителя.

Данная тест-система включает в себя конъюгат, который представляет собой меченые моноклональные антитела против вируса ящура серотипа SAT-1, исходя из этого является типоспецифичной, но без более узкой дифференциации. Прототипная тест-система разработана была еще в конце 90-гг XX в. В ней применяются антитела против антигенов вируса ящура различных штаммов серотипа SAT-1, кроме «SAT-1/Кения/2017». Анализируя нуклеотидную и аминокислотную последовательность высоко вариабельного белка VP₁ вируса ящура, ученые пришли к выводу о наличии достаточного количества существенных замен для данного штамма. Таким образом, прототипная тест-система не является высокочувствительной и специфичной по отношению к вирусу ящура штамма «SAT-1/Кения/2017». Данная тест-система выявляет антитела к данному штамму не более, чем на 40%. Исходя из этого требуется разработать чувствительную, специфичную тест-систему для выявления антител к структурным белкам вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА.

Прототипная тест-система основана на твердофазном конкурентном «сэндвич»-варианте ИФА, однако эта форма удалена от реакции микронейтрализации относительно возможностей улавливания антигенных сайтов по сравнению с жидкофазным блокирующим непрямым «сэндвич»-вариантом ИФА.

В прототипном варианте используются контрольные сыворотки крови животных в жидком виде, что снижает сохранность компонентов тест-системы в течение длительного периода времени и создает риски контаминации микроорганизмами.

Прототипная тест-система не предусматривает контроля конъюгата, что не позволяет получать более достоверные данные по оптическим плотностям и уровню гуморального иммунитета против антигена вируса ящура.

В прототипной тест-системе применяется прямой конъюгат, что удобно в применении, однако при этом повышается вероятность шумовых фоновых явлений, что может негативно отражаться на конечных результатах количественного исследования сывороток крови животных.

Учитывая найденные ограничения в применении имеющихся тест-систем, в том числе наиболее близкого прототипа, для проведения точного количественного анализа уровня гуморального иммунитета животных после введения противоящурных вакцин, содержащими антиген вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» генотипа SAT-1/NWZ, актуальной является разработка тест-системы для выявления антител к структурным белкам вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА с учетом выше приведенных недостатков.

В РФ на сегодняшний день существуют следующие тест-системы на основе жидкофазного блокирующего непрямого "сэндвич"-варианта ИФА: 1) тест-система на основе жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма «А №2269/ВНИИЗЖ/2015» генотипа A/ASIA/G-VII в сыворотках крови животных после иммунизации [23]; 2) тест-система на основе жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма «О №2047/Саудовская Аравия/2008» генотипа O/ME-SA/PanAsia2 в сыворотках крови животных после иммунизации [24]; 3) способ быстрого количественного определения уровня гуморального иммунитета животных к штамму «О №2311/Забайкальский/2016» генотипа O/ME-SA/Ind-2001 вируса ящура после вакцинации с помощью жидкофазного «сэндвич»-варианта ИФА [25]; 4) тест-система для количественного определения уровня гуморального иммунитета животных против антигена вируса ящура «А №2205/G-IV» с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА [26]. При этом в настоящее время ветеринарная служба Российской Федерации не располагает современной отечественной тест-системой ИФА для выявления антител к структурным белкам вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА.

Целью изобретения является создание тест-системы для выявления антител к структурным белкам вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА.

Поставленная цель достигается тем, что предлагаемая тест-система содержит следующие лиофильно высушенные иммуноспецифические компоненты с высокой степенью активности:

1) культуральный инактивированный лиофилизированный вирус ящура штамма «SAT-1/Кения/2017»;

2) сенсибилизирующие антитела - иммуноглобулины G кролика против структурных белков вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017»;

3) детекторные антитела - иммуноглобулины G морской свинки против структурных белков вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017»;

4) контроль 1 (сильноположительный контроль) - положительная сыворотка крови телят к структурным белкам вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» с процентом ингибиции 75-100%;

5) контроль 2 (положительный контроль) - положительная сыворотка крови телят к структурным белкам вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» с процентом ингибиции от 50,0% до 74,9%;

6) контроль 3 (отрицательный контроль) - сыворотка крови телят, не содержащая антитела к антигену вируса ящура;

7) блокирующая сыворотка крови;

8) антивидовой конъюгат - иммуноглобулины кролика против Ig G морской свинки, конъюгированные с пероксидазой хрена.

Предлагаемая тест-система содержит также неспецифические компоненты: буферный раствор на основе карбоната и гидрокарбоната натрия (рН 9,5-9,6), 20-кратный концентрат буферного раствора, хромогенный субстрат - диаммониевая соль 2,2′-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоната), «стоп»-раствор - 0,7%-ный раствор натриевой соли лаурилсерной кислоты (CH₃(CH₂)₁₁OSO₃Na).

Цель достигается благодаря тому, что метод жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА наиболее приближен к классической реакции микронейтрализации в культуре клеток IB-RS-2, поскольку все антигенные сайты полных частиц вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» находятся в свободном состоянии в жидкой фазе, открыты для связывания со специфическими сенсибилизирующими и детекторными антителами. Реакция основана на взаимодействии иммуноглобулинов G исследуемой сыворотки крови животного и инактивированного вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» в жидкой фазе с образованием иммунных комплексов. Проводится сенсибилизация лунок плоскодонного планшета антителами кролика против вируса ящура того же генотипа. Сенсибилизированные лунки обрабатывают с помощью блокирующей сыворотки крови, добавляют полученные иммунные комплексы из круглодонного планшета, инкубируют, вносят восстановленную из лиофильного высушенного состояния суспензию детекторных антител. Образовавшийся сложный иммунный комплекс выявляют с помощью антител против иммуноглобулинов G морской свинки, конъюгированных с пероксидазой хрена и хромогенного субстрата.

Технический результат от изобретения заключается в разработке современной, специфической тест-системы, предназначенной для выявления антител к структурным белкам вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА.

В отличии от прототипа в разработанной тест-системе применяется культуральный концентрированный в 1500 раз инактивированный вирус ящура штамма «SAT-1/Кения/2017», который представлен в виде лиофильно высушенной суспензии. Данный факт дает возможность количественно определять гуморальный иммунитет против вируса ящура указанного штамма с высокими показателями чувствительности (более 99%) и специфичности (100%), что более чем на 60% выше по сравнению с наиболее близким прототипом. Кроме того, лиофилизированный компонент с протектором (3,0% хлорида натрия) остается стабильным не менее 5 лет по сравнению с антигеном в нативном состоянии, что является преимуществом в использовании данной тест-системы. Активность полученного антигена вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» составляет 1:4000.

В отличии от прототипа применяются сенсибилизирующие и детекторные антитела лабораторных животных, соответственно, высокоспецифичные по отношению к структурным белкам вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017». Указанные в тест-системе ИФА иммуноглобулины G кролика и морской свинки против штамма «SAT-1/Кения/2017» вируса ящура представлены в виде лиофильного компонента с протектором (3,0% хлорида натрия), что позволяет иммуноглобулинам G находится в стабильном состоянии не менее 5 лет и с активностью не менее 1:8000 и 1:4000, соответственно.

В отличии от прототипа сыворотки крови КРС, сильноположительный и положительный контроли получены против высокоочищенного концентрированного инактивированного вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017», что позволяет достичь высокой специфичности и чувствительности при контроле работы тест-системы. Указанные компоненты представлены в виде лиофильно высушенных суспензий, что позволяет хранить их не менее 5 лет с сохранением высокой активности в ИФА. Для контроля 1 активность составляет не менее 1:5000, для контроля 2 - не менее 1:5000. Данная активность удобна для получения большого объема контролей в рабочем нативном состоянии для проведения оператором ИФА.

В отличии от прототипа для блокирования открытых сайтов связывания применяется 1% раствор бычьего сывороточного альбумина, белковые составляющие которой обеспечивают полное закрытие пустых участков на дне иммунологического планшета. Данный компонент также представлен в лиофильном виде с протектором (3,0% хлорида натрия), что позволяет хранить его в данном состоянии не менее 5 лет.

В отличии от прототипного варианта представленная тест-система предусматривает контроль антигена и конъюгата, что дает возможность учитывать фоновые значения и, тем самым, получать достоверные данные по значениям оптической плотности и уровню антител против структурных белков вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017».

В отличии от прототипа в предложенной тест-системе применяются антитела кроличьи к иммуноглобулину G морской свинки, что позволяет повышать специфичность анализа и получать более достоверные результаты количественного определения титра антител против структурных белков вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» в сыворотках крови животных. Активность конъюгата составляет 1:4000.

Разработанная тест-система основана на специфическом блокировании антигена вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» антителами, содержащимися в исследуемой пробе сыворотки в жидкой фазе. Смесь «исследуемая сыворотка/антиген» переносят в лунки планшета, предварительно иммобилизованного сенсибилизирующими антителами кролика против штамма «SAT-1/Кения/2017». Наличие антител к структурным белкам вируса ящура данного штамма в исследуемой пробе будет выражаться в формировании иммунного комплекса и уменьшении количества свободного антигена, который связывается сенсибилизирующими антителами. Фиксированный в лунках антиген взаимодействует с детекторными антителами морской свинки, которые выявляются в реакции с иммунопероксидазным конъюгатом против иммуноглобулинов G морской свинки и последующим окрашиванием с помощью хромогенного субстрата. Интенсивность окрашивания учитывают с помощью спектрофотометра-ридера, и она обратно пропорциональна количественному значению выявленного уровня гуморального иммунитета животного.

Сущность изобретения отражена на графических изображениях:

Фиг. 1 - Седиментационный профиль фракций антигена вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017».

Фиг. 2 - Электрофореграмма для антигена вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» в 12% полиакриламидном геле. Примечание: 1 - белковый маркер молекулярного веса, 2 - антиген вируса ящура.

Фиг. 3 - Филогенетическая принадлежность штамма «SAT-1/Кения/2017» вируса ящура.

Сущность изобретения пояснена в перечне последовательностей, в котором:

SEQ ID NO:1 представляет последовательность нуклеотидов гена, кодирующего белок VP₁ штамма «SAT-1/Кения/2017» вируса ящура;

SEQ ID NO:2 представляет последовательность аминокислот белка VР₁ штамма «SAT-1/Кения/2017» вируса ящура.

На подготовительном этапе исследования лиофилизированные иммуноспецифические компоненты тест-системы (антиген вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017», иммунопероксидазный конъюгат, положительные и отрицательный контроли, сенсибилизирующие и детекторные антитела) восстанавливают до необходимого объёма деионизированной водой.

Проводят приготовление рабочих растворов.

Раствор №1 (солевой буферный раствор карбоната и гидрокарбоната натрия). Готовят по стандартной методике 50 мл раствора с водородным показателем 9,5-9,6.

Раствор №2 (Wash-раствор). Готовят 2 л стандартного буферного раствора TBS с добавлением 0,1% Tween-20 с водородным показателем 7,5-7,7. Рабочий Wash-раствор готовят разведением концентрата в 20 раз.

Раствор №3 (буфер для восстановления антител и конъюгата). Рабочий буферный раствор для разведения антител и иммунопероксидазного конъюгата готовится непосредственно перед использованием из рабочего Wash-раствора с добавлением 0,7% раствора бычьего сывороточного альбумина.

Этапы проведения жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для количественного определения уровня гуморального иммунитета против антигена вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» представлены ниже.

1. Иммобилизация антител кролика против антигена вируса ящура. Восстановленную суспензию сенсибилизирующих антител против антигена вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» готовят в разведении 1:8000 в солевом буферном растворе карбоната и гидрокарбоната натрия (раствор №1). Во все лунки иммунологического 96-луночного планшета вносят по 100 мкл суспензии данных антител, накрывают крышкой и инкубируют в течение 18-20 ч при температуре (2-4)°С.

2. Промывание лунок планшета осуществляют с использованием Wash-раствора 2 раза.

3. Образование иммунного комплекса в жидкой фазе. Готовят следующие разведения сывороток крови животных: 4,0; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; 8,5; 9,0; 9,5; 10,0; 11,0; 12,0 log₂ SN₅₀ (1:16-1:4096) в растворе №2. Для этого во все лунки планшета за исключением лунок H1-6, которые оставляют для контроля антигена (КА) и контроля конъюгата (КК), вносят по 0,047 см³ (47 мкл) буферного раствора и 0,003 см³ (3 мкл) пробы. В лунки H1-6 вносят по 0,05 см³ (50 мкл) буферного раствора. Испытуемые и контрольные пробы располагают на планшете согласно таблице 1. Положительной сыворотка считается при уровне гуморального иммунитета ≥ 5,0 log₂ SN₅₀ (≥1:32).

В качестве контроля 1 используют сильноположительную сыворотку крови КРС/свиней против вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» - процент ингибиции (PI) 75-100%, контроля 2 - положительную сыворотку крови КРС/свиней против вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» - PI = 50,0-74,9%, контроля 3 - нормальную сыворотку КРС/свиней - процент ингибиции < 50%.

Во все лунки планшета добавляют по 0,05 см³ рабочего разведения антигена в растворе №2 в соответствии с разведением 1:4000. После перемешивания содержимого лунок планшета проводят в течение 1 часа при температуре (2-4)°С.

4. Улавливание антигена. В промытые сенсибилизированные лунки планшета вносят по 0,05 см³ смеси контрольных и испытуемых проб и антигена, планшет закрывают крышкой и инкубируют в течение 60±2 мин при температуре (37±1)°С.

5. Промывание лунок планшета. Проводят, как представлено выше (п. 2). Процедуру повторяют 3 раза.

6. Внесение детекторных антител. Во все лунки планшета, за исключением лунок с КК (контроль конъюгата), куда добавляют по 0,05 см³ раствора №3, вносят по 0,05 см³ рабочего разведения детекторных антител (1:4000) в растворе №3. Планшет накрывают крышкой и инкубируют в течение 60±2 мин при температуре (37±1)°С.

7. Промывание лунок планшета. Проводят, как представлено выше (п. 2). Процедуру повторяют 3 раза.

8. Внесение конъюгата. Во все лунки планшета вносят по 0,05 см³ рабочего разведения конъюгата (1:4000) в растворе №3. Планшет накрывают крышкой и инкубируют в течение 60±2 мин при температуре (37±1)°С.

9. Промывание лунок планшета. Проводят, как представлено выше (п. 2). Процедуру повторяют 4 раза.

10. Проявление цветной реакции. Во все лунки планшета вносят по 0,05 см³ диаммониевой соли 2,2′-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоната), закрывают крышкой и выдерживают 15 минут при температуре (20±2)°С.

11. Торможение реакции. Реакцию останавливают добавлением в каждую лунку планшета 0,05 см³ 0,7%-ного раствора натриевой соли лаурилсерной кислоты (CH₃(CH₂)₁₁OSO₃Na).

12. Определение значения экстинкции и уровня гуморального иммунитета по данным ИФА. Сразу после остановки реакции измеряют значение декадного коэффициента экстинкции (ε) продуктов реакции в каждой лунке при длине волны 410 нм, используя спектрофотометр-ридер для микропланшетов с вертикальным лучом света. Значения ε переводят в значение процента ингибиции (J, %) по формуле:

J (%) = (1- (ε_{сыворотки} - ε_КК)/(ε_КА - ε_КК)) × 100,

где, ε_{сыворотки} - среднее значение декадного коэффициента экстинкции смеси сыворотки с инактивированным вирусом ящура штамма «SAT-1/Кения/2017»;

ε_КА - среднее значение декадного коэффициента экстинкции контроля антигена;

ε_КК - среднее значение декадного коэффициента экстинкции контроля конъюгата.

Достоверность проводимого анализа с помощью предложенной тест-системы определяется при удовлетворении следующим критериям:

- разница между значениями ε _КА и ε _КК не менее 0,4 оптических единиц (о.е.);

- контроль 1 имеет значение J>75%;

- контроль 2 имеет значение J в пределах 50,0-74,9%;

- контроль 3 имеет значение J<50%.

Сыворотки крови, для которых значение J≥50%, считают положительными, содержащими антитела к структурным белкам вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017». Значение процента ингибиции <50% в сыворотке крови обследуемых животных является отрицательным. Исходя из полученных данных, берут последнее разведение сыворотки, для которого значение J составляет ≥50%. Данное разведение считают титром антител против структурных белков вируса ящура, вызванного вирусом штамма «SAT-1/Кения/2017» и выражают в log₂ SN₅₀.

В результате проведенных исследований были оттитрованы оригинальные компоненты реакции. Активность детекторных антител в ИФА составила 1:4000, сенсибилизирующих антител - 1:8000, антивидового конъюгата - 1:4000; антигена вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» - 1:4000, контроля 1 - 1:5000, контроля 2 - 1:5000. С использованием разработанной тест-системы проведено исследование образцов сывороток крови животных с количественным определением титра антител против структурных белков вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» и проведен сравнительный анализ с результатами реакции микронейтрализации в чувствительной перевиваемой монослойной клеточной линии почки свиньи (IB-RS-2) [2].

Разработанная тест-система дает возможность тестировать одновременно в формате одного 96-луночного планшета 6 проб сывороток в разведениях, указанных выше.

Контроль суспензий антигена вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» на специфичность.

Специфичность суспензий антигена вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» определена с помощью ОТ-ПЦР с последующим секвенированием 1D-гена, соответствующего белку VP₁, в котором наиболее часто возникают мутации. По результатам исследования нуклеотидной последовательности указанного гена была выявлена принадлежность штамма «SAT-1/Кения/2017» к генотипу SAT-1/NWZ. Расчет проводился в соответствии с Байесовской теорией вероятности. Специфичность подтверждена также в реакции связывания комплемента со штаммоспецифической сывороткой. Концентрация общего вирусного белка в исследуемом антигене вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» составила 2,05 мкг/мл, концентрация 146S компонента - 1,48 мкг/мл (71%). Данное содержание полных вирусных частиц (146S компонент) достаточно для проведения дальнейших работ по концентрированию и получению готового лиофильно высушенного антигена для изготовления тест-системы.

Морфологические признаки.

Штамм «SAT-1/Кения/2017» вируса ящура относится к семейству Picornaviridae, роду Aphthovirus, серотипу SAT-1, генотипу SAT-1/NWZ и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона икосаэдрическая, размер 25 нм. Вирион состоит из молекулы РНК, заключенной в белковую оболочку, которая состоит из 32 капсомеров с кубическим типом симметрии.

Антигенные свойства.

По своим антигенным свойствам штамм «SAT-1/Кения/2017» вируса стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой, не проявляет гемагглютинирующей активности. У переболевших животных в сыворотке крови образуются антитела, выявляемые в РМН и ИФА. При гипериммунизации морских свинок концентрированный антиген из инактивированного вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» индуцирует образование вирусоспецифических антител, выявляемых в РСК в разведении не менее 1:4000.

Антигенное родство (r₁) штамма «SAT-1/Кения/2017» вируса ящура изучено в РМН в перекрестном исследовании штамма со специфическими сыворотками, полученными на следующие штаммы вируса ящура, представленные выше. Титр референтных сывороток крови КРС, полученных путем иммунизации животных моновалентными вакцинами из производственных штаммов вируса ящура серотипа SAT-1, против 10² ТЦД₅₀ гомологичного и гетерологичного вируса определяли в РМН при перекрестном титровании, рассчитывая значения с использованием уравнения линейной регрессии, и выражали в lg. Значение r₁ определяли, как антилогарифм разности lg титров сыворотки против гетерологичного и гомологичного вируса [2].

Значение r₁ в РМН интерпретировали следующим образом:

при ≥ 0,3 - исследуемый и производственный штаммы вируса ящура являются близкородственными;

при < 0,3 - исследуемый образец штамма вируса ящура отличается от производственного штамма.

Показатели антигенного родства при изучении штамма «SAT-1/Кения/2017» составили r₁ от 0,02 до 0,23, а именно

для штамма «SAT-1 ZIM 23 2003» (генотип SAT-1/NWZ) - 0,23,

для «SAT-1 RV 11 37» (генотип SAT-1/II) - 0,22,

для «SAT-1 BOT 1 68» (генотип SAT-1/III) - 0,20,

для «SAT-1 UGA BUFF 21 70» (генотип SAT-1/IV) - 0,19,

для «SAT-1 NIG 11 75» (генотип SAT-1/V) - 0,05,

для «SAT-1 SUD 3 76» (генотип SAT-1/VI) - 0,11,

для «SAT-1 UGA 13 74» (генотип VII) - 0,10,

для «SAT-1 UGA 1 97» (генотип VIII) - 0,15,

для «SAT-1 ETH 3 2007» (генотип IX) - 0,12,

для «SAT-1/NIG/2015» (генотип X) - 0,06,

для «SAT-1 TCH 1/72» (генотип XI) - 0,02,

для «SAT-1/ANG/9/74» (генотип XII) - 0,07,

для «SAT 1 MOZP132010 B16» (генотип XIII) - 0,21.

Полученные данные свидетельствуют об отсутствии антигенного родства с производственными штаммами вируса ящура серотипа SAT-1.

Гено- и хемотаксономическая характеристики

Штамм «SAT-1/Кения/2017» вируса ящура является РНК(+) -содержащим вирусом с молекулярной массой 8,08×10⁶ Д. Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой молекулярной массой 2,8×10⁶ Д. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех структурных белков VP₁, VP₂, VP₃ и VP₄. Липопротеидная оболочка отсутствует.

Основным антигенным белком является VP₁. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирусная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Из 8 неструктурных полипептидов, накапливающихся в инфицированных клетках, особо выделяют РНК-зависимую РНК-полимеразу (3D-ген), участвующую в репликации вирусной РНК.

Физические свойства

Масса вириона составляет 8,4×10^-18 г. Плавучая плотность 1,44 г/см³.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм «SAT-1/Кения/2017» вируса ящура устойчив к детергентам и органическим растворителям, таким как эфир, хлороформ, фреон, ацетон. Наиболее стабилен при pH 7,44-7,64. Сдвиги pH как в кислую, так и в щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам (выше 38,0°С).

Дополнительные признаки и свойства

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - патогенен для парнокопытных животных.

Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения) на перевиваемых культурах.

Биотехнологические характеристики

Штамм «SAT-1/Кения/2017» вируса ящура репродуцируется в перевиваемых культурах клеток: почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), почки свиньи (IB-RS-2), почки сирийского хомячка (ВНК-21).

При испытании было проведено 5 последовательных пассажей штамма «SAT-1/Кения/2017» вируса ящура в перевиваемых культурах клеток ПСГК-30, ВНК-21, IB-RS-2. Биологические свойства характеризовали путем определения инфекционной активности вируса каждого пассажа в перевиваемой клеточной линии IB-RS-2 и на естественно восприимчивых животных - крупном рогатом скоте (КРС) и свиньях.

Сущность изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Получение антигена вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017».

Для получения антигена вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» для изготовления тест-системы проводили суспензионное культивирование вируса в клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в течение 12-14 ч с получением вирусной суспензии с титром инфекционной активности не ниже 7,0 lg ТЦД₅₀/см³. Полученную вирусную суспензию инактивировали с помощью 0,030% 1,2-аминоэтилэтиленимина и осветляли 0,020% полигексаметиленгуанидином.

Инактивированную культуральную суспензию, содержащую антиген вирус ящура, осветляли в течение 30 мин. при 6000 об/мин и 2-4°С. Надосадочную жидкость отбирали и добавляли в нее полиэтиленгликоль с молекулярным весом 6000 Д (ПЭГ-6000) до конечной концентрации 8% и хлорид натри (сухой) до конечной концентрации 0,85%, интенсивно перемешивали и выдерживали при температуре 4±2°С в течение 24 часов. Вирусную суспензию осаждали при 6000 об/мин в течение 60 мин., осадок растворяли в 1/15 М фосфатном буферном растворе, концентрируя в 1500 раз (1/1500 от первоначального объёма).

К полученному преципитату добавляли 50% хлороформа, интенсивно перемешивали и фракционировали с помощью центрифуги в течение 30 мин. при 3000 об/мин. Отбирали верхнюю водную фракцию, содержащую антиген вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017». Отбирали 100 мкл образца для последующего электрофоретического анализа в 12% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях.

На следующем этапе проводили получение 146S частиц вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017», необходимого для получения антигена как одного из важнейших специфических компонентов ИФА и иммунизации животных.

Для выделения полных частиц с коэффициентом седиментации 146S готовили линейный градиент сахарозы с концентрациями 40 и 30%. Опалесцирующий слой, содержащий 146S компонент, располагается приблизительно в 40-30%-м слое сахарозы, которые отбирали и переосаждали с помощью ультрацентрифугирования в течение 4 часов при скорости 30000 об/мин. и температуре 4±2°С и ресуспендировали осадок в 1/15 М фосфатно-солевом буферном растворе.

Результаты спектрометрического исследования полученных фракций антигена вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» в виде антигенного профиля представлены на фиг. 2. Пики наблюдали для фракций №№ 2-6 (оптическая плотность составила ≥2,000 у.е.). Проведен электрофорез полученных фракций в 12% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (фиг. 3), который подтвердил, степень чистоты полученного антигена.

Пример 2. Получение гипериммунной сыворотки крови кроликов (сенсибилизирующие антитела) против структурных белков вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017».

Для получения специфических сывороток крови против вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» применяли клинически здоровых кроликов средней упитанности массой 2,5-3,0 кг.

Для гипериммунизации животных применяли концентрированный очищенный инактивированный антиген вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017», полученный как описано в примере 1, из которого готовили эмульсию с использованием масляного адъюванта Montanide ISA-28 R VG (в соотношении адъювант/антиген = 65/35 по массе). Полученную вакцину вводили в мышцу задних конечностей кролика на 0, 14 и 28 дни в объеме 0,5 см³. Через 7 дней после последней иммунизации у кроликов отбирали кровь, содержащую сенсибилизирующие антитела, которую лиофильно высушивали и хранили при температуре (2-4)°С.

Пример 3. Получение гипериммунной сыворотки крови морских свинок (детекторные антитела) против структурных белков вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017».

Для гипериммунизации морских свинок использовали эмульсию очищенного препарата концентрированного инактивированного вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017», полученного как описано в примере 1. Приготовление вакцины и схема иммунизации такая, как в примере 2.

Пример 4. Определение активности в ИФА антигена вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017», сенсибилизирующих и детекторных антител к нему.

Полученные образцы сывороток крови животных проверяли на активность и специфичность в жидкофазном блокирующем непрямом «сэндвич»-варианте ИФА. Проведен подбор оптимальных рабочих разведений указанных компонентов для получения достоверных результатов в ИФА. Полученные данные анализа представлены в таблицах 2, 3, 4.

Для анализа исследовали следующие разведения сенсибилизирующих антител: 1:6000, 1:7000, 1:8000, 1:9000. Разведения остальных компонентов были постоянны: для антигена - 1:4000, для детекторных антител - 1:4000, конъюгата - 1:4000. В качестве контрольных сывороток для анализа применяли сыворотки, специфичные к определенным штаммам вируса ящура с активностью 8,0 log₂ SN₅₀. Их таблицы 2 следует, что при разведении сенсибилизирующих антител 1:8000 достигалось получение достоверного результата (1:256 или 8,0 log₂ SN₅₀). При меньших разведений антител наблюдали высокие фоновые значения, что не позволяло получить корректный результат. При бóльшем разведении отмечали снижение детектируемых значений уровня гуморального иммунитета в сыворотках крови животных. При исследовании неспецифических и отрицательных сывороток получали отрицательные результаты, что свидетельствовало о высокой специфичности разработанного способа.

Для анализа исследовали следующие разведения детекторных антител: 1:2000, 1:3000, 1:4000, 1:5000. Разведения остальных компонентов были постоянны: для антигена - 1:4000, для сенсибилизирующих антител - 1:8000, конъюгата - 1:4000. В качестве контрольных сывороток для анализа применяли сыворотки, специфичные к определенным штаммам вируса ящура с активностью 8,0 log₂ SN₅₀. Их таблицы 3 следует, что при разведении детекторных антител 1:4000 достигалось получение достоверного результата (1:256 или 8,0 log₂ SN₅₀). При меньших разведений антител наблюдали высокие фоновые значения, что не позволяло получить корректный результат. При бóльшем разведении наблюдали снижение детектируемого значения титра антител в сыворотках крови животных. При исследовании неспецифических и отрицательных сывороток отмечали отрицательные результаты, что свидетельствовало о высокой специфичности разработанной тест-системы.

Для анализа исследовали следующие разведения антигена: 1:2000, 1:3000, 1:3000, 1:4000. Разведения остальных компонентов были постоянны: для детекторных антител - 1:4000, для сенсибилизирующих антител - 1:8000, конъюгата - 1:4000. В качестве контрольных сывороток для анализа применяли сыворотки, специфичные к определенным штаммам вируса ящура с активностью 8,0 log₂ SN₅₀. Их таблицы 4 следует, что при разведении антигена 1:4000 достигалось получение достоверного результата (1:256 или 8,0 log₂ SN₅₀). При меньших разведениях наблюдали высокие фоновые значения, что не позволяло получить корректный результат. При бóльшем разведении наблюдали снижение детектируемого значения титра антител в сыворотках крови животных.

При исследовании неспецифических и отрицательных сывороток отмечали отрицательные результаты, что свидетельствовало о высокой специфичности разработанной тест-системы.

Таким образом, в ходе лабораторных испытаний определено, что рабочие разведения антигена вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017», сенсибилизирующих и детекторных антител составили 1:4000, 1:8000, 1:4000, соответственно.

Пример 5. Применение тест-системы жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для выявления антител к структурным белкам вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА.

Исследовали 12 сывороток крови животных, полученных после иммунизации инактивированными сорбированными моновалентными вакцинами против ящура, содержащими антиген вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017». Определены значения уровня гуморального иммунитета с применением разработанной тест-системы ИФА, а также данные сыворотки были исследованы в РМН в чувствительной перевиваемой монослойной клеточной линии IB-RS-2, рекомендованной МЭБ (OIE) [2]. Полученные результаты отражены в таблице 5, из которой следует, что степень корреляции результатов разработанной тест-системы ИФА (предлагаемое изобретение) и классического метода РМН высокая (приближено к 100%).

Пример 6. Определение диагностических показателей разработанной тест-системы для выявления антител к структурным белкам вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА.

Для исследования представленной тест-системы для выявления антител к структурным белкам вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА исследовали стандартные диагностические показатели. Для определения чувствительности предложенной тест-системы анализировали 456 сывороток крови животных, которые являлись заведомо положительными по данным РМН в чувствительной перевиваемой монослойной клеточной линии почки свиньи IB-RS-2. Уровень антител для данных сывороток крови находилась в диапазоне 5,5-12,0 log₂ SN₅₀. Постановку ИФА проводили, как отражено выше. Разработанной тест-системой (предлагаемое изобретение) определили, что из 456 образцов сывороток крови 453 определены в качестве положительных, а 3 - в качестве отрицательных (уровень гуморального иммунитета по данным ИФА составил 1:16).

Для исследования специфичности метода тестировали 250 отрицательных сывороток крови животных. В результате исследования с помощью ИФА (предлагаемое изобретение) определили, что из 250 отрицательных проб - все определены в качестве отрицательных.

Определили, что в 95%-ном доверительном интервале диагностическая чувствительность (DSe) составила 98,10-99,87%, диагностическая специфичность (DSp) - 98,54-100,00%, k-критерий - 0,991; общая точность (DAc) - 98,77-99,91%.

Таким образом предлагаемая «Тест-система для выявления антител к структурным белкам вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА» является специфичной и чувствительной, позволяющей проводить анализ сывороток крови животных с количественным определением титра антител против антигена вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017». Данный штамм и соответствующий ему генотип является актуальным и быстро распространяющимся на территории Африканского континента, а также в странах Ближнего Востока. Разработанная тест-система будет направлена на подтверждение высокой эффективности производимых в РФ противоящурных инактивированных вакцин, содержащих антиген данного штамма, и, тем самым, на защиту территории России и других стран.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Тест-система для выявления антител к структурным белкам вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА»:

1. Diagnostic assays developed for the control of foot-and-mouth disease in India / Sharma G.K., Mahajan S., Matura R. [et al.] // World J Virology. - 2015. - V. 4(3). - P. 295-302.

2. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals. - Paris, 2018. - Chapter 2.1.8.

3. Гуленкин, В.М. Экономическая эффективность проведения профилактической вакцинации животных против ящура на территории Российской Федерации / В.М. Гуленкин // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2012. - Т. 10. - С. 31-41.

4. Brooksby, J. B. 1982. Portraits of viruses: foot-and-mouth disease virus. Intervirology 18:1-23.

5. Rueckert, R. R., and E. Wimmer. 1984. Systematic nomenclature of picornavirus proteins. J. Virol. 50:957-959,

6. Grubman, M. J. 1980. The 5′ end of foot-and-mouth disease virion RNA contains a protein covalently linked to the nucleotide pUp. Arch. Virol. 63:311-315.

7. Domingo, E., C. Escarmis, E. Baranowski, C. M. Ruiz-Jarabo, E. Carrillo, J. I. Nunez, and F. Sobrino. 2003. Evolution of foot-and-mouth disease virus. Virus Res. 91:47-63.

8. Sobrino, F., M. Davila, J. Ortin, and E. Domingo. 1983. Multiple genetic variants arise in the course of replication of foot-and-mouth disease virus in cell culture. Virology 128:310-318.

9. Динамика развития противоящурного гуморального иммунитета у крупного рогатого скота, иммунизированного трехвалентной сорбированной вакциной типов А, О, Азия-1 / Д.В. Михалишин, Т.Н. Лезова // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2007. - Т. 5. - С. 75-82.

10. Wong C.L., Yong C.Y., Ong H.K., Ho K.L., Tan W.S. Advances in the Diagnosis of Foot-and-Mouth Disease // Front Vet Sci. - 2020 Aug 21. - V.7. - P. 477.

11. Curry S., Abu-Ghazaleh R., Blakemore W., Fry E., Jackson T., King A., Lea S., Logan D., Newman J., Stuart D. Crystallization and preliminary X-ray analysis of three serotypes of foot-and-mouth disease virus // J. Mol Biol. - 1992. - V. 228(4). - P. 1263-1268.

12. King, A. M., D. McCahon, K. Saunders, J. W. Newman, and W. R. Slade. 1985. Multiple sites of recombination within the RNA genome of foot-and-mouth disease virus. Virus Res. 3:373-384.

13. Tosh, C., D. Hemadri, and A. Sanyal. 2002. Evidence of recombination in the capsid-coding region of type A foot-and-mouth disease virus. J. Gen. Virol. 83:2455-2460.

14. Fry E.E., Stuart D.I., Rowlands D.J. The structure of foot-and-mouth disease virus // Curr Top Microbiol Immunol - 2005. - V. 288. - P. 71-101/

15. Palmenberg A.C. Proteolytic processing of picornaviral polyprotein // Annu Rev Microbiol. - 1990. - V. 44. - P. 603-623.

16. Curry S., Fry E., Blakemore W., Abu-Ghazaleh R., Jackson T., King A., Lea S., Newman J., Stuart D. Dissecting the roles of VP₀ cleavage and RNA packaging in picornavirus capsid stabilization: the structure of empty capsids of foot-and-mouth disease virus // J. Virol. - 1997. - V. 71(12). - P. 9743-9752.

17. Anon N. Global Strategy for control of foot-and-mouth disease. - In, Bangkok, Thailand, - 2012. - P. 27-29.

18. Saitou N. and Nei M. (1987). The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution 4:406-425.

19. Felsenstein J. (1985). Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap. Evolution 39:783-791.

20. Tamura K., Nei M., and Kumar S. (2004). Prospects for inferring very large phylogenies by using the neighbor-joining method. Proceedings of the National Academy of Sciences (USA) 101:11030-11035.

21. IZSLER ELISA. URL: https://www.fao.org/fileadmin/user_ upload/eufmd/docs/Open_Session2012/Appendices/75_New_Elisa_for_diagnosis__Brocchi_.pdf (Дата обращения: 14.08.2023).

22. Наборы для определения антител к антигену вируса ящура (FMDV) PrioCHECK. URL: vetprofilab.ru/f/rus_priochek_fmdv.pdf (Дата обращения: 24.03.2023).

23. Патент РФ № 2787714, 11.01.2023. Тест-система на основе жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII в сыворотках крови животных после иммунизации // Заявка № 2022108324 / Луговская Н.Н., Доронин М.И., Михалишин Д.В., Гочмурадов Ы.М., Оковытая Т.В., Борисов А.В.

24. Патент РФ № 2791614, 13.03.2023. Тест-система на основе жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 генотипа O/ME-SA/PanAsia2 в сыворотках крови животных после иммунизации // Заявка № 2022119118 / Луговская Н.Н., Доронин М.И., Михалишин Д.В., Оковытая Т.В., Борисов А.В., Воеводина М.Э.

25. Патент РФ № 2796393, 23.05.2023. Способ быстрого количественного определения уровня гуморального иммунитета животных к штамму О №2311/Забайкальский/2016 генотипа O/ME-SA/Ind-2001 вируса ящура после вакцинации с помощью жидкофазного «сэндвич»-варианта ИФА // Заявка № 2022113420 / Луговская Н.Н., Доронин М.И., Михалишин Д.В., Гочмурадов Ы.М., Оковытая Т.В., Борисов А.В.

26. Патент РФ № 2798510, 23.06.2023. Тест-система для количественного определения уровня гуморального иммунитета животных против антигена вируса ящура А №2205/G-IV с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА // Заявка № 2022122687 / Доронин М.И., Луговская Н.Н., Михалишин Д.В., Гочмурадов Ы.М., Борисов А.В., Воеводина М.Э.

Таблица 5
Корреляция результатов анализа сывороток крови животных с применением тест-системы для выявления антител к структурным белкам вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА (предлагаемое изобретение) и в реакции микронейтрализации № п/п Характеристика пробы Уровень гуморального иммунитета Степень корреляции, % в ИФА (предлагаемое изобретение) в РМН, log₂ SN₅₀ 1 Сыворотка 1 свиная против ВЯ штамма
«SAT-1/Кения/2017», 14 ДПВ 1:128 7,0 100% 2 Сыворотка 1 свиная против ВЯ штамма
«SAT-1/Кения/2017», 21 ДПВ 1:128 7,0 100% 3 Сыворотка 1 свиная против ВЯ штамма
«SAT-1/Кения/2017», 28 ДПВ 1:362 8,5 100% 4 Сыворотка 2 КРС против ВЯ штамма
«SAT-1/Кения/2017», 14 ДПВ 1:64 6,0 100% 5 Сыворотка 2 КРС против ВЯ штамма
«SAT-1/Кения/2017», 21 ДПВ 1:362 8,5 100% 6 Сыворотка 2 КРС против ВЯ штамма
«SAT-1/Кения/2017», 28 ДПВ 1:512 9,0 100% 7 Сыворотка 3 КРС против ВЯ штамма
«SAT-1/Кения/2017», 14 ДПВ 1:32 5,0 100% 8 Сыворотка 4 КРС против ВЯ штамма
«SAT-1/Кения/2017», 28 ДПВ 1:512 9,0 100% 9 Сыворотка 5 КРС против ВЯ штамма
«SAT-1/Кения/2017», 21 ДПВ 1:128 7,0 100% 10 Сыворотка 6 КРС против ВЯ штамма
«SAT-1/Кения/2017», 21 ДПВ 1:181 7,5 100% 11 Сыворотка 7 КРС против ВЯ штамма
«SAT-1/Кения/2017», 28 ДПВ 1:512 9,0 100% 12 Сыворотка 8 КРС против ВЯ штамма
«SAT-1/Кения/2017», 35 ДПВ 1:2048 11,0 100% 13 КА ОП=1,125 - соответствует 14 КК ОП=0,039 - соответствует 15 К1 (PI > 75%) PI = 97,20% - соответствует 16 К2 (50%<PI < 75%) PI = 65,66% - соответствует 17 К3 (PI<50%) PI = 7,56% - соответствует

Примечание: условие: ОП_КА - ОП _КК>0,400

КА - контроль антигена,

КК - контроль конъюгата,

К1 - положительный контроль-1,

К2 - положительный контроль-2,

К3 - отрицательный контроль-3,

ДПВ - день после вакцинации, ВЯ - вирус ящура.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Описана тест-система для выявления антител к структурным белкам вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА, содержащая: иммуноспецифические лиофилизированные составляющие: культуральный инактивированный лиофилизированный вирус ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» с активностью в ИФА 1:4000; сенсибилизирующие антитела - иммуноглобулины G кролика против структурных белков вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» с активностью в ИФА 1:8000; детекторные антитела - иммуноглобулины G морской свинки против структурных белков вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» с активностью в ИФА 1:4000; контроль 1 - сильноположительная сыворотка крови телят против структурных белков вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» с процентом ингибиции 75-100%; контроль 2 - положительная сыворотка крови телят к структурным белкам вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» с процентом ингибиции от 50% до 74,9%; контроль 3 - отрицательная сыворотка крови телят, не содержащая антител к антигену вирусу ящура; блокирующая сыворотка крови крупного рогатого скота; антивидовой конъюгат - иммуноглобулины кролика против Ig G морской свинки, конъюгированные с пероксидазой хрена, с активностью в ИФА 1:4000; неспецифические компоненты: буферный раствор на основе карбоната и гидрокарбоната натрия с рН 9,5-9,6; 20-кратный концентрат буферного раствора, хромогенный субстрат - диаммониевая соль 2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоната), «стоп»-раствор - 0,7 %-ный раствор натриевой соли лаурилсерной кислоты. Преимуществом разработанной тест-системы является продолжительный срок хранения (не менее 5 лет) за счет получения лиофильно высушенных иммуноспецифических составляющих. Предложенная тест-система является первой в Российской Федерации, современной, специфической и чувствительной, предназначенной для количественного определения титра антител против структурных белков вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» в широком диапазоне 1:16 - 1:4096 для последующего анализа иммунного статуса животных в отношении ящура. Данный штамм и соответствующий ему генотип является актуальным и быстро распространяющимся на территории Африканского континента и Ближнего Востока. Созданная тест-система направлена на подтверждение высокой эффективности производимых в РФ противоящурных инактивированных вакцин, содержащих антиген данного генотипа вируса ящура, и, тем самым, на защиту территории России и граничащих с ней на юге стран от распространения изолятов вируса ящура штамма «SAT-2/Кения/2017». 1 з.п. ф-лы, 3 ил., 5 табл., 6 пр.

1. Тест-система для выявления антител к структурным белкам вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА, содержащая:

- иммуноспецифические лиофилизированные составляющие: культуральный инактивированный лиофилизированный вирус ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» с активностью в ИФА 1:4000; сенсибилизирующие антитела - иммуноглобулины G кролика против структурных белков вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» с активностью в ИФА 1:8000; детекторные антитела - иммуноглобулины G морской свинки против структурных белков вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» с активностью в ИФА 1:4000; контроль 1 - сильноположительная сыворотка крови телят против структурных белков вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» с процентом ингибиции 75-100%; контроль 2 - положительная сыворотка крови телят к структурным белкам вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» с процентом ингибиции от 50% до 74,9%; контроль 3 - отрицательная сыворотка крови телят, не содержащая антител к антигену вирусу ящура; блокирующая сыворотка крови крупного рогатого скота; антивидовой конъюгат - иммуноглобулины кролика против Ig G морской свинки, конъюгированные с пероксидазой хрена, с активностью в ИФА 1:4000;

- неспецифические компоненты: буферный раствор на основе карбоната и гидрокарбоната натрия с рН 9,5-9,6; 20-кратный концентрат буферного раствора, хромогенный субстрат - диаммониевая соль 2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоната), «стоп»-раствор - 0,7 %-ный раствор натриевой соли лаурилсерной кислоты.

2. Тест-система по п. 1 является специфичной и чувствительной, позволяющей проводить анализ сывороток крови животных с количественным определением титра антител против структурных белков вируса ящура штамма «SAT-1/Кения/2017» в диапазоне 1:16 - 1:4096 или 4,0-12,0 log₂ SN₅₀.