Тест-система для определения титра антител против полных вирусных частиц штамма "О/Кения/2017" вируса ящура с применением жидкофазного "сэндвич"-варианта ИФА Российский патент 2024 года по МПК A61K39/135 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности, созданию тест-системы для определения титра антител против полных вирусных частиц штамма «О/Кения/2017» вируса ящура с применением жидкофазного «сэндвич»-варианта ИФА.

Самым контагиозным инфекционным заболеванием животных является ящур, который вызывает РНК-содержащий вирус с положительной цепью длиной около 8400-8500 н.о. Таксономия вируса ящура следующая: семейство Picornaviridae, род Aphthovirus, вид Foot-and-mouth disease virus [1].

Выделяют 7 серотипов вируса ящура: О, А, С, Азия-1, SAT-1, SAT-2, SAT-3. При репродукции вируса ящура образуется основной иммуногенный компонент - полные вирусные частицы, состоящие из одной молекулы вирусной РНК и 60 копий полипептида, каждый из которых представлен белками VP₂, VP₄, VP₃, VP₁ [2].

В соответствии с Руководством МЭБ (OIE) для борьбы с ящуром рекомендуется вакцинопрофилактика [3]. В ФГБУ «ВНИИЗЖ» производят инактивированные сорбированные и эмульсионные противоящурные вакцины из штаммов всех 7 серотипов вируса [4].

Учитывая, что возбудитель ящура является РНК-содержащим вирусом, для него от пассажа к пассажу во время репликации вируса в организме животного характерна высокая частота мутаций, что приводит к возникновению новых генотипов. Антигенные вариации возникают из-за аминокислотных изменений, которые изменяют распознавание вирусных белков иммунной системой организма.

Максимально вариабельным белком вируса ящура является поверхностный протеин VP₁, на долю которого приходится не менее 90% мутаций всех структурных генов. Наиболее вариабельными областями данного протеина являются участки в диапазонах 40-60, 130-160 и 190-213 а.о. [5]. Участок поверхностного белка VP₁ в регионе 130-160 а.о. отличается максимальной вариабельностью, поскольку участвует в процессе связывания с рецепторами клетки-хозяина [6]. Изменчивость данного региона дает возможность вирусу ящура взаимодействовать с рецепторами клеток разных типов и облегчает переход от одного вида хозяина к другому. Нуклеотидные последовательности кодирующей области VP₁ используются для генетической характеристики штаммов ящура из-за их значимости для прикрепления и проникновения вируса в клетку, защитного иммунитета и специфичности серотипа.

В последние годы в мире и преимущественно на Африканском континенте циркулирует вирус ящура генотипа О/ЕА-2. Изолят «О / KEN / 4 / 2017» вируса ящура был выделен от крупного рогатого скота на территории Республики Кении в 2017 году и в 2022 году поступил в ФГБУ «ВНИИЗЖ» из Всемирной справочной лаборатории института Пирбрайта (the World Reference Laboratory for Foot-and-Mouth Disease, the Pirbright institute, Великобритания) для проведения научных исследований.

В ФГБУ «ВНИИЗЖ» данный изолят был адаптирован к различным чувствительным клеточным линиям, в том числе, к монослойной и суспензионной перевиваемой клеточной линии почки новорожденного сирийского хомячка BHK-21/SUSP/ARRIAH. При проведении научных исследований в ФГБУ «ВНИИЗЖ» изолят был охарактеризован и получил название - штамм «О/Кения/2017». Проанализировали первичную структуру 1D-гена нуклеиновой кислоты данного вируса с помощью двух систем праймеров O-1C244F/EUR-2B52R и O-1C272BF/EUR-2B52R. Выделен фрагмент кДНК полученного изолята размером 639 п. н. По результатам секвенирования определено, что полученный штамм принадлежит генотипу О/ЕА-2.

Штамм вируса ящура «О/Кения/2017» депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вирусов ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ», под регистрационным номером: №412 - деп / 22-46 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Экспериментально подтверждена возможность использования штамма «О/Кения/2017» вируса ящура для изготовления средств диагностики ящура генотипа О/ЕА-2 [19].

Филогенетическая принадлежность выделенного изолята и полученного на его основе штамма «О/Кения/2017» генотипа О/ЕА-2 представлена на фиг. 1.

Иммунизация животных является эффективным инструментом борьбы с ящуром. В связи с активным распространением данного генотипа вируса ящура на территории Африки и соседних регионов, а также угрозой проникновения изолятов на территорию Российской Федерации и необходимостью защиты нашей территории от данного инфекционного агента, в ФГБУ «ВНИИЗЖ» разработали вакцину, в состав которой входит антиген вируса ящура данного штамма.

Возникла необходимость создания высокоспецифичных и высокочувствительных диагностических тест-систем для определения титра антител против полных вирусных частиц штамма «О/Кения/2017» вируса ящура.

Степень защиты животных от ящура после вакцинации определяется титром антител против полных вирусных частиц возбудителя данного заболевания в сыворотке крови животных [6-8]. В соответствии с рекомендациями МЭБ (OIE) [3] для определения иммунного статуса животных применяют реакцию микронейтрализации (РМН) и иммуноферментный анализ (ИФА).

РМН является чувствительным и специфичным методом, однако проведение анализа имеет ряд серьезных ограничений: 1) длительность проведения анализа (не менее 3 суток), 2) высокая стоимость процедуры, связанная с применением чувствительной клеточной линии, 3) использование неинактивированного вируса ящура, который является биологическим агентом II группы патогенности [8].

При этом ИФА обладают многими преимуществами, включая экспрессность, высокую специфичность и чувствительность, возможность проведения крупномасштабного скрининга полевых образцов и отсутствие требований к специальным лабораторным условиям, например, культуре клеток [9-13]. Исходя из этого, для определения титра антител против полных вирусных частиц штамма «О/Кения/2017» вируса ящура целесообразно применять ИФА.

Особое внимание уделяют жидкофазному «сэндвич»-варианту ИФА, который обладает рядом преимуществ: 1) поверхностные эпитопы антигена наиболее доступны в пространстве для специфичных антител, что позволяет получать наиболее приближенные результаты к реакции нейтрализации в клеточной линии; 2) анализ максимально из всех модификаций данного анализа приближен к классической реакции нейтрализации, поскольку серологическая реакция связывания антигена и антитела происходит в жидкой фазе; 3) обладает высокими показателями аналитической и диагностической чувствительности и специфичности [11, 12].

Sharma G.K. et al. предложили тест-систему определения антител против вируса ящура серотипов А, О, Азия-1 с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА [13]. Данная методика позволяла проводить идентификацию широкого спектра противоящурных антител, но при этом специфичность по отношению к вирусу ящура штамма «О/Кения/2017» составила не более 21%, следовательно, достоверное выявление всего количества специфических антител в сыворотке крови с помощью данного способа именно относительно антигена данного штамма не представляется возможным.

В тест-системе Sharma G.K. et al. [13] предполагал применение в качестве блокирующего компонента не иммунную сыворотку лошади, которая содержит различные белковые соединения, в том числе, возможно, гомологичные участки аминокислотных последовательностей относительно антигенных детерминант. Авторы тест-системы использовали моноклональные антитела, которые позволяли увеличивать спектр выявляемых генетических линий вируса ящура в рамках одного серотипа, но при этом существенно снижалась специфичность относительно выявления антител против штамма «О/Кения/2017», что крайне затрудняло достоверность проведения ретроспективной диагностики ящура.

На мировом рынке в настоящее время имеются европейские наборы для детекции антител против вируса ящура типа О - «IZSLER» (Италия) и «PrioCHECK» (Нидерланды).

Набор компонентов «IZSLER» (Instituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell'Emilia Romagna Brescia, Italy The Pirbright Institute) предназначена для детекции противоящурных антител с помощью твердофазного прямого «сэндвич»-варианта ИФА [14].

Достоинством данного набора является применение моноклональных антител, однако они были получены ранее 2017 года (период, когда появился штамм «О/Кения/2017») и не могут с высокой достоверностью и точностью детектировать специфические антитела в сыворотках крови животных. Специфичность и чувствительность указанного набора для выявления антител против вируса ящура генотипа О/ЕА-2 не выше 25%, что подтверждают данные РМН в чувствительной перевиваемой монослойной клеточной линии почки свиньи IB-RS-2. Таким образом, данный набор компонентов не позволяет получать точных результатов именно в отношении штамма «О/Кения/2017» вируса ящура.

Наиболее близким прототипом для разработанной нами тест-системы является тест-система «РriоСНЕСК» [15] (Prionics Lelystad B.V., Netherlands) для выявления антител к вирусу ящура типа О. Набор компонентов удобен в применении и позволяет за 5-6 ч получить результаты исследования. Данная тест-система включает в себя конъюгат, который представляет собой меченые моноклональные антитела против вируса ящура серотипа О, исходя из этого является типоспецифичной, но без более узкой дифференциации. Прототипная тест-система разработана в конце 90-гг XX в. и получены соответствующие антитела против антигенов вируса ящура различных генотипов, созданных с использованием изолятов, на том момент циркулирующих среди животных. Т.е. кроме активно циркулирующего с 2017 г. генотипа О/ЕА-2.

Изоляты и штаммы данной линии имеют существенные отличия от других линий серотипа О. Анализируя нуклеотидную и аминокислотную последовательность высоко вариабельного пептида вируса ящура VP₁, ученые пришли к выводу о наличии достаточного количества существенных замен, позволяющих отнести вирус к иному генотипу. Исходя из выше отраженного, прототипная тест-система не является высокочувствительной и специфичной по отношению к штамму «О/Кения/2017» вирусу ящура, поскольку выявляет антитела к данному штамму не более, чем на 28%. Исходя из этого, требуется разработать высокочувствительную, специфичную тест-систему для количественной детекции антител против 146S компонента вируса ящура генотипа О/ЕА-2 в сыворотках крови животных на основе жидкофазного иммуноферментного анализа.

Прототипная тест-система основана на твердофазном конкурентном «сэндвич»-варианте ИФА, однако эта форма значительно отдалена по пространственным преимуществам связывания антигена и антител в отличие от реакции микронейтрализации.

Прототипная тест-система имеет также некоторое ограничение в применении, а именно, рабочий раствор конъюгата не стабилен и быстро разрушается. В составе набора он представлен в виде 30-кратного концентрата. В таком состоянии в отличии от лиофилизированного компонента срок хранения заметно сокращается. Следует также отметить, что данная тест-система не предусматривает контроля конъюгата, что не позволяет получать более достоверные данные по оптическим плотностям и титру антител против вируса ящура.

Учитывая найденные ограничения в применении имеющихся тест-систем, в том числе прототипной, для проведения точного анализа гуморального иммунитета животных после инокуляции противоящурными вакцинами, содержащими инактивированный вирус ящура штамма «О/Кения/2017» генотипа О/ЕА-2, актуальной является разработка серологической тест-системы для определения титра антител против полных вирусных частиц штамма «О/Кения/2017» вируса ящура с применением жидкофазного «сэндвич»-варианта ИФА с учетом выше приведенных недостатков.

На сегодняшний день с помощью жидкофазного блокирующего «сэндвич»-варианта ИФА с особенностями проведения реакции и определенным составом компонентов реакции разработаны «Тест-система на основе жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII в сыворотках крови животных после иммунизации», «Тест-система на основе жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 генотипа О/МЕ-SA/PanAsia2 в сыворотках крови животных после иммунизации» и «Способ быстрого количественного определения уровня гуморального иммунитета животных к штамму О №2311/Забайкальский/2016 генотипа O/ME-SA/Ind-2001 вируса ящура после вакцинации с помощью жидкофазного «сэндвич»-варианта ИФА» [16-18].

При этом на сегодняшний день ветеринарная служба Российской Федерации не располагает современной отечественной тест-системой ИФА для определения титра антител против полных вирусных частиц вируса ящура генотипа О/ЕА-2 штамма «О/Кения/2017», антиген которого применяется для изготовления вакцин.

Целью изобретения является создание тест-системы для определения титра антител против полных вирусных частиц штамма «О/Кения/2017» вируса ящура с применением жидкофазного «сэндвич»-варианта ИФА.

Поставленная цель достигается тем, что предлагаемая тест-система содержит следующие иммуноспецифические компоненты:

1) культуральные лиофилизированные полные частицы вируса ящура штамма «О/Кения/2017» генотипа О/ЕА-2;

2) сенсибилизирующие антитела - лиофилизированные иммуноглобулины G кролика против полных частиц вируса ящура «О/Кения/2017» генотипа О/ЕА-2;

3) детекторные антитела - лиофилизированные иммуноглобулины G морской свинки против вирусных частиц вируса ящура штамма «О/Кения/2017» генотипа О/ЕА-2;

4) контроль 1 - лиофилизированная положительная сыворотка крови телят к полным частицам вируса ящура штамма «О/Кения/2017» генотипа О/ЕА-2 с процентом ингибиции >80%;

5) контроль 2 - лиофилизированная положительная сыворотка крови телят к полным частицам вируса ящура штамма «О/Кения/2017» генотипа О/ЕА-2 с процентом ингибиции от 50% до 80%;

6) контроль 3 - лиофилизированная сыворотка крови телят, не содержащая антитела к антигену вирусу ящура - отрицательный контроль;

7) лиофилизированный 0,5%-ный бычий сывороточный альбумин для блокирования открытых сайтов связывания на дне лунок планшета;

8) антивидовой конъюгат - лиофилизированные иммуноглобулины кролика против Ig G морской свинки, конъюгированные с пероксидазой хрена.

Предлагаемая тест-система содержит также неспецифические компоненты: карбонатно-бикарбонатный буфер (рН 9,5-9,6) для разведения антигена, 20-кратный концентрат буферного раствора, хромогенный субстрат -ABTS, «стоп»-раствор - 0,6%-ный раствор SDS.

Цель достигается благодаря тому, что метод жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА наиболее приближен к классической реакции микронейтрализации в естественных условиях, поскольку полные частицы вируса ящура штамма «О/Кения/2017» генотипа О/ЕА-2 находятся в свободном состоянии и открыты для связывания со специфическими антителами.

Жидкофазный «сэндвич»-вариант ИФА основан на взаимодействии исследуемой сыворотки крови животного и антигена вируса ящура штамма «О/Кения/2017» генотипа О/ЕА-2 в жидкой фазе с формированием иммунных комплексов. Параллельно с этим проводится сенсибилизация лунок плоскодонного планшета иммуноглобулинами G кролика против полных частиц вируса ящура того же штамма. Сенсибилизированные лунки блокируют с помощью 0,5%-ного бычьего сывороточного альбумина, добавляют полученные иммунные комплексы из круглодонного планшета, инкубируют, вносят восстановленную суспензию детекторных антител. Образовавшийся сложный иммунный комплекс выявляют с помощью антител против иммуноглобулинов G морской свинки, конъюгированных с пероксидазой хрена и ABTS.

Технический результат от изобретения заключается в разработке высокоспецифической и чувствительной тест-системы, предназначенной для определения титра антител против полных вирусных частиц штамма «О/Кения/2017» вируса ящура с применением жидкофазного «сэндвич»-варианта ИФА, вследствие применения инактивированных полных частиц вируса ящура штамма «О/Кения/2017» генотипа О/ЕА-2 при получении специфических компонентов данного анализа.

В состав разработанной тест-системы входят следующие иммуноспецифические компоненты:

1. культуральные лиофилизированные полные частицы вируса ящура штамма «О/Кения/2017» генотипа О/ЕА-2 - 1 флакон (1,0 см³);

2. сенсибилизирующие лиофилизированные антитела - иммуноглобулины G кролика против полных частиц вируса ящура штамма «О/Кения/2017» генотипа О/ЕА-2 - 1 флакон (1,0 см³);

3. детекторные лиофилизированные антитела - иммуноглобулины G морской свинки против полных частиц вируса ящура штамма «О/Кения/2017» генотипа О/ЕА-2 - 1 флакон (1,0 см³);

4. контроль 1 - положительная лиофилизированная сыворотка крови крупного рогатого скота к полным частицам вируса ящура штамма «О/Кения/2017» генотипа О/ЕА-2, с процентом ингибиции >70% - 1 флакон (0,4 см³);

5. контроль 2 - положительная лиофилизированная сыворотка крови крупного рогатого скота к полным частицам вируса ящура штамма «О/Кения/2017» генотипа О/ЕА-2, с процентом ингибиции от 50% до 80% - 1 флакон (0,4 см³);

6. контроль 3 - нормальная лиофилизированная сыворотка крови крупного рогатого скота, не содержащая антител к антигену вируса ящура - 1 флакон (0,4 см³);

7. 0,5%-ный раствор бычьего сывороточного альбумина лиофилизированный - 2 флакона (по 4,0 см³);

8. антивидовой лиофилизированный конъюгат - иммуноглобулины кролика против IgG морской свинки, конъюгированные с пероксидазой хрена - 1 флакон (0,5 см³).

Предлагаемая тест-система содержит неспецифические компоненты:

1. карбонатно-бикарбонатный буфер (рН 9,5-9,6);

2. 20-кратный концентрат буферного раствора;

3. хромогенный субстрат - ABTS;

4. «стоп»-раствор - 0,6%-ный раствор SDS.

В состав тест-системы также входят 3 иммунологических 96-луночных плоскодонных полистироловых планшета для проведения ИФА и 3 полимерных 96-луночных круглодонных планшетов для проведения реакции в жидкой фазе.

В отличии от прототипа в разработанной тест-системе применяется культуральные инактивированные полные частицы вируса ящура штамма «О/Кения/2017» генотипа О/ЕА-2 со стабилизатором 1,8% хлорида натрия, которые представлены в виде лиофилизированной суспензии. Данный факт дает возможность выявлять именно антитела против полных частиц вируса ящура указанного генотипа с высокими показателями чувствительности (более 99,8%) и специфичности (100,0%), что более чем на 72% выше по сравнению с наиболее близким прототипом. Кроме того, лиофилизированный компонент остается стабильным не менее 5 лет по сравнению с антигеном в нативном состоянии, что является преимуществом в использовании данной тест-системы. Активность полных частиц вируса ящура штамма «О/Кения/2017» генотипа О/ЕА-2 составляет 1:7000.

В отличии от прототипа применяются сенсибилизирующие и детекторные антитела кролика и морской свинки, соответственно, высокоспецифичные по отношению к полным частицам вируса ящура штамма «О/Кения/2017» генотипа О/ЕА-2, поскольку были получены с применением высокоочищенных полных частиц возбудителя ящура с высокой активностью. Указанные в тест-системе ИФА иммуноглобулины G кролика и морской свинки против полных частиц вируса ящура штамма «О/Кения/2017» генотипа О/ЕА-2 представлены в виде лиофильного компонента, что позволяет антителам находится в стабильном состоянии не менее 5 лет с активностью не менее 1:12000 и 1:8000, соответственно.

В отличии от прототипа сыворотки крови КРС, контроль 1 и 2, получены против высокоочищенных инактивированных полных частиц возбудителя ящура штамма «О/Кения/2017» генотипа О/ЕА-2, что позволяет достичь высокой специфичности и чувствительности при контроле работы тест-системы. Указанные компоненты представлены в виде лиофилизата, что позволяет хранить их не менее 5 лет благодаря применению 1,8% хлорида натрия с сохранением высокой активности в ИФА. Для контроля 1 активность составляет не менее 1:5000, для контроля 2 - не менее 1:5000.

В отличии от прототипа для блокирования открытых сайтов связывания применяется 0,5%-ный бычий сывороточный альбумин, белковые составляющие которой обеспечивают полное закрытие открытых участков на дне иммунологического планшета. Данный компонент также представлен в лиофильном виде, что позволяет хранить его в данном состоянии не менее 5 лет благодаря использованию в качестве консерванта 1,8% хлорида натрия.

В отличии от прототипного варианта представленная тест-система предусматривает контроль антигена и конъюгата, что дает возможность учитывать фоновые показания и получать достоверные абсолютные данные по экстинкции и значению титра антител против полных частиц штамма «О/Кения/2017» вируса ящура.

В отличии от прототипа в предложенной тест-системе применяется непрямой конъюгат, что позволяет снижать вероятность шумовых фоновых явлений и получать более достоверные результаты определения титра антител против полных частиц вируса ящура штамма «О/Кения/2017» генотипа О/ЕА-2 в сыворотках крови животных. Активность конъюгата составляет 1:3000. Сущность изобретения отражена на графических изображениях: Фиг. 1 - Филогенетическая принадлежность штамма «О/Кения/2017» генотипа О/ЕА-2 вируса ящура. Примечание: наименование штамма на филогенетической дереве указано как «O/KENIA/2017».

Фиг. 2 - Спектральный профиль фракций полных частиц вируса ящура штамма «О/Кения/2017» генотипа О/ЕА-2.

Фиг. 3 - Электрофореграмма для полных частиц вируса ящура штамма «О/Кения/2017» генотипа О/ЕА-2 в 12% полиакриламидном геле. Примечание: М - белковый маркер молекулярного веса, 1 - фракция полных частиц вируса ящура штамма «О/Кения/2017».

Сущность изобретения пояснена в перечне последовательностей, в котором:

SEQ ID NO:1 представляет последовательность нуклеотидов 1D-гена штамма «О/Кения/2017» генотипа О/ЕА-2 вируса ящура;

SEQ ID NO:2 представляет последовательность аминокислот белка VP₁ штамма «О/Кения/2017» генотипа О/ЕА-2 вируса ящура.

Разработанная тест-система на основе жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА основана на специфическом блокировании антигена вируса ящура штамма «О/Кения/2017» генотипа О/ЕА-2 антителами, содержащимися в исследуемой пробе сыворотки крови в жидкой фазе. Смесь «исследуемая сыворотка/антиген» переносится в лунки планшета, предварительно иммобилизованного сенсибилизирующими антителами кролика против полных частиц вируса ящура штамма «О/Кения/2017» генотипа О/ЕА-2.

Наличие антител к полным частицам вируса ящура генотипа О/ЕА-2 в исследуемой пробе будет выражаться в формировании иммунного комплекса и уменьшении количества свободного антигена, который связывается сенсибилизирующими антителами. Фиксированный в лунках антиген взаимодействует с детекторными антителами морской свинки, которые выявляются в реакции с иммунопероксидазным конъюгатом против иммуноглобулинов G морской свинки и последующим окрашиванием с помощью субстрата ABTS. Интенсивность окрашивания обратно пропорциональна концентрации специфических антител в исследуемой пробе.

Перед началом анализа проводят приготовление рабочих растворов.

Раствор №1 (карбонатно-бикарбонатный буфер - КББ). Готовят по стандартной методике 100 мл КББ раствора (рН 9,5-9,6) для сенсибилизации планшетов.

Раствор №2 (промывочный раствор). Раствор используется для приготовления рабочего раствора для межэтапной промывки планшетов и подготовки проб для исследования, а так же как основа для приготовления рабочего буферного раствора для разведения детекторных антител и иммунопероксидазного конъюгата. Готовят 2 л стандартного буферного раствора TBS с добавлением 0,05% Tween-20 (рН 7,4-7,6).

Раствор №3 (буфер для восстановления антител и конъюгата). Рабочий буферный раствор для разведения детекторных антител и иммунопероксидазного конъюгата (рН 7,4-7,6) готовится из раствора №2 с добавлением 1% бычьего сывороточного альбумина. Для этого к 36 см³ раствора №2 следует добавить 4,0 см³ бычьего сывороточного альбумина, восстановленной из лиофилизированного препарата с помощью дистиллированной воды. Готовится непосредственно перед использованием.

Этапы проведения реакции для представленного изобретения представлены ниже.

1. Сенсибилизация планшетов. Восстановленную суспензию сенсибилизирующих антител готовят в разведении 1:12000 в растворе №1 (КББ). Во все лунки иммунологического полистиролового 96-луночного планшета для ИФА вносят по 100 мкл суспензии сенсибилизирующих антител, накрывают крышкой и инкубируют в течение 18-20 часов при температуре (2-8)°С.

2. Промывание лунок планшета осуществляют с использованием Washer любой марки, либо вручную раствором №2. Процедуру повторяют два раза.

3. Серологическая реакция в жидкой фазе. Параллельно с сенсибилизацией планшета проводят иммунную реакцию связывания антигена с испытуемыми и контрольными пробами сыворотки крови. Готовят следующие разведения сывороток крови животных: 4,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; 9,0; 10,0; 11,0; 12,0; 13,0; 14,0; 15,0 log₂ SN₅₀ (1:16-1:32 768) в растворе №2. Для этого во все лунки полимерного планшета за исключением лунок H1-6, которые оставляют для контроля антигена (КА) и контроля конъюгата (КК), вносят по 0,047 см³ (47 мкл) буферного раствора и 0,003 см³ (3 мкл) пробы. В лунки H1-6 вносят по 0,05 см³ (50 мкл) буферного раствора. Испытуемые и контрольные пробы располагают на планшете согласно таблице 1.

В качестве контроля 1 используют положительную сыворотку крови свиней против полных частиц вируса ящура штамма «О/Кения/2017» генотипа О/ЕА-2 - процент ингибиции больше 80%, контроля 2 - положительную сыворотку крови свиней против полных частиц вируса ящура штамма «О/Кения/2017» генотипа О/ЕА-2 - процент ингибиции 50-80%, контроля 3 - нормальную сыворотку свиней - процент ингибиции меньше 50%.

Во все лунки планшета добавляют по 0,05 см³ рабочего разведения антигена (полные частицы вируса ящура штамма «О/Кения/2017») в растворе №2 в соответствии с разведением 1:7000. После перемешивания содержимого лунок планшета при помощи шейкера или легким встряхиванием вручную планшет закрывают крышкой и инкубируют в течение 18-20 часов при температуре (2-8)°С.

4. Улавливание антигена. В промытые лунки сенсибилизированного планшета вносят по 0,05 см³ смеси контрольных и испытуемых проб и антигена, планшет закрывают крышкой и инкубируют в течение 60±2 мин при температуре (37±0,5)°С.

5. Промывание лунок планшета. Проводят, как представлено выше (п.2). Процедуру повторяют 4 раза.

6. Внесение детекторных антител. Во все лунки планшета, за исключением лунок с КК (контроль конъюгата), куда добавляют по 0,05 см³ раствора №3, вносят по 0,05 см³ рабочего разведения детекторных антител (1:8000) в растворе №3. Планшет накрывают крышкой и инкубируют в течение 60±2 мин при температуре (37±0,5)°С.

7. Промывание лунок планшета. Проводят, как представлено выше (п.2). Процедуру повторяют 4 раза.

8. Внесение конъюгата. Во все лунки планшета вносят по 0,05 см³ рабочего разведения конъюгата (1:3000) в растворе №3. Планшет накрывают крышкой и инкубируют в течение 60±2 мин при температуре (37±0,5)°С.

9. Промывание лунок планшета. Проводят, как представлено выше (п.2). Процедуру повторяют 4 раза.

10. Проявление цветной реакции. Во все лунки планшета вносят по 0,05 см³ субстрата ABTS, закрывают крышкой и выдерживают 15-20 минут при температуре (18-23)°С.

11. Остановка реакции. Реакцию останавливают добавлением в каждую лунку планшета 0,05 см³ 0,6% раствора SDS.

12. Учет результатов ИФА. Сразу после остановки реакции измеряют значение показателя ослабления интенсивности окрашивания (μ) продуктов реакции в каждой лунке при длине волны 413 нм, используя спектрофотометр для микропланшетов с вертикальным лучом света. Значения μ контрольных и исследуемых проб переводят в значение процента ингибиции (PI, %) по формуле:

где μ_{сыворотки} - среднее значение показателя ослабления интенсивности окрашивания смеси сыворотки с инактивированными полными частицами вируса ящура штамма «О/Кения/2017»;

μ_КА - среднее значение оптической плотности контроля антигена (полные частицы вируса ящура штамма «О/Кения/2017»);

μ_КК - среднее значение оптической плотности контроля конъюгата.

Результаты реакции достоверны в том случае, если данные удовлетворяют следующим критериям:

- разница между значениями контроля антигена и контроля конъюгата не менее 0,35 оптических единиц (о.е.);

- контроль 1 имеет значение PI>70%;

- контроль 2 имеет значение PI в пределах 50-80%;

- контроль 3 имеет значение PI<50%.

Исходя из полученных данных берут последнее разведение сыворотки, для которого процент ингибиции составляет ≥50%. Такое разведение считают титром антител против полных частиц штамма «О/Кения/2017» вируса ящура.

В результате проведенных экспериментов были оптимизированы условия постановки реакции. Активность детекторных антител, определенная в непрямом варианте ИФА, составила 1:8000, антивидового конъюгата - 1:3000; сенсибилизирующих антител - 1:12000, антигена (полные частицы) вируса ящура штамма «О/Кения/2017» генотипа О/ЕА-2 - 1:7000, контроля 1 - 1:5000, контроля 2 - 1:5000, контроля 3 - 1:5000.

С использованием разработанной тест-системы проведено исследование образцов сывороток крови животных с определением титра антител и проведен сравнительный анализ с результатами реакции микронейтрализации в чувствительной перевиваемой монослойной клеточной линии почки свиньи (IB-RS-2) [1].

Разработанная тест-система позволяет тестировать одновременно в формате 96-луночного планшета 6 проб сывороток в разведениях, 4,0-12,0 log₂ SN₅₀ (1:16-1:32768).

В качестве рабочего антигена применяли инактивированные полные частицы штамма «О/Кения/2017» вируса ящура.

Контроль штамма «О/Кения/2017» генотипа О/ЕА-2 вируса ящура на специфичность. Специфичность штамма «О/Кения/2017» генотипа О/ЕА-2 определена с помощью ОТ-ПЦР с последующим секвенированием 1D-гена, соответствующего белку VP₁, отвечающему за изменчивость вируса ящура. По результатам исследования нуклеотидной последовательности указанного гена была выявлена принадлежность штамма «О/Кения/2017» к генотипу О/ЕА-2. Расчет проводился в соответствии с Байесовской теорией вероятности. Специфичность подтверждена также в реакции связывания комплемента со штаммоспецифической сывороткой. Концентрация общего вирусного белка в исследуемом антигене вируса ящура штамма «О/Кения/2017» генотипа О/ЕА-2 составила 3,22 мкг/мл, концентрация 146S компонента - 2,16 мкг/мл, 146S+75S компонента - 3,03 мкг/мл, 12S - 0,19 мкг/мл.

Экспериментально подтверждена возможность использования штамма «О/Кения/2017» генотипа О/ЕА-2 вируса ящура для изготовления биопрепаратов для диагностики ящура типа О [19].

По антигенным свойствам штамм «О/Кения/2017» вируса ящура относится к серотипу О. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. У переболевших животных в сыворотке крови образуются типоспецифические антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе (ИФА) и реакции микронейтрализации (РМН).

Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура ID-гена белка VP₁ штамма «О/Кения/2017» вируса ящура. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм «О/Кения/2017» вируса ящура принадлежит к генотипу О/ЕА-2 (Фиг. 1).

Антигенное родство (r₁) штамма «О/Кения/2017» вируса ящура изучено в РМН, в перекрестном исследовании штамма со специфическими сыворотками, полученными на производственные штаммы вируса ящура. Титр референтных сывороток крови КРС, полученных путем иммунизации животных моновалентными вакцинами из производственных штаммов вируса ящура серотипа О, против 10² ТЦД₅₀ гомологичного и гетерологичного вируса определяли в РМН при перекрестном титровании, рассчитывая значения с использованием уравнения линейной регрессии, и выражали в lg. Значение r₁ определяли, как антилогарифм разности lg титров сыворотки против гетерологичного и гомологичного вируса [1,4].

Значение r₁ в РМН интерпретировали следующим образом:

при ≥0,3 - исследуемый и производственный штаммы вируса ящура являются родственными;

при <0,3 - исследуемый образец штамма вируса ящура значительно отличается от производственного штамма.

Максимальное родство отмечается при значении r₁ в РМН, стремящимся к 1,0.

Показатели антигенного родства при изучении штамма «О/Кения/2017» составили r₁ от 0,04 до 0,22, что свидетельствует об отсутствии явного антигенного родства с производственными штаммами вируса ящура серотипа О, а именно для штамма «О/Тайвань/1997» (генотип O/CATHAY/CAM 94) - 0,04, штамма «О/Приморский/2014» (генотип O/SEA/Mya-98) - 0,05, штамма «О/Саудовская Аравия/2008» (генотип 0/ME-SA/PanAsia2) - 0,06, штамма «О/Оренбургский/2021» (генотип O/ME-SA/Ind-2001e) - 0,08, штамма «О №2241/Эфиопия/2011» (генотип О/ЕА-3) - 0,22.

Полученные данные свидетельствуют об отсутствии антигенного родства с производственными штаммами вируса ящура серотипа О.

Сущность изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Получение инактивированных полных частиц вируса ящура штамма «О/Кения/2017» генотипа О/ЕА-2.

Для получения инактивированных полных частиц вируса ящура штамма «О/Кения/2017» генотипа О/ЕА-2 для диагностических целей проводили суспензионное культивирование вируса в клеточной линии ВНК-21 в течение 10-11 ч с получением вирусной суспензии с титром инфекционной активности не ниже 7,0 lg ТЦД₅₀/см³. Полученную вирусную суспензию инактивировали с помощью аминоэтилэтиленимина и осветляли с применением полигексаметиленгуанидина.

Инактивированную культуральную суспензию, содержащую полные частицы вируса ящура, осветляли в течение 30 мин. при 6000 об/мин и температуре 4±1°С. Надосадочную жидкость отбирали и добавляли в нее полиэтиленгликоль с молекулярным весом 6000 Д (ПЭГ-6000) до конечной концентрации 8% и хлорида натрия (сухой) до конечной концентрации 0,90%, интенсивно перемешивали и выдерживали при температуре 2,0±0,2°С в течение 24 часов. Вирусную суспензию осаждали при 6000 об/мин в течение 60 мин., осадок растворяли в 1/15 М фосфатно-солевом буферном растворе, концентрируя в 3000 раз (1/3000 от первоначального объема).

К полученному преципитату добавляли 50% хлороформа, интенсивно перемешивали и фракционировали с помощью центрифуги в течение 30 мин. при 3000 об/мин. Отбирали верхнюю водную фракцию, содержащую полные частицы вируса ящура штамма «О/Кения/2017» генотипа О/ЕА-2. Отбирали 100 мкл образца для последующего электрофоретического анализа в 12% полиакриламидном геле.

Перед помещением в градиент сахарозы антиген (полные частицы) вируса ящура обрабатывали NP-40 в концентрации 2,2%.

Для выделения полных частиц готовили линейный градиент сахарозы с концентрациями 10, 20, 30, 40, 50%. Обработанный с помощью NP-40 антиген вируса ящура штамма «О/Кения/2017» генотипа О/ЕА-2 наливали в центрифужные пробирки, затем последовательно подслаивали растворы сахарозы. Пробирки помещали в металлические центрифужные стаканы и после тщательно выполненного уравновешивания центрифугировали при скорости 25000 об/мин и температуре 2,0±0,1°С в течение 3 часов. Фракционирование градиента сахарозы производили с помощью перистальтического насоса, отбирая фракции по 1 мл в отдельные пробирки. Начало и конец пика 146S компонента определяли по спектральному профилю, объединяя фракции, входящие в этот диапазон.

Полные частицы вируса ящура штамма «О/Кения/2017» переосаждали с помощью ультрацентрифугирования в течение 4 часов при скорости 25000 об/мин. и температуре 2±0,5°С и ресуспендировали осадок в 1/15 М фосфатно-солевом буферном растворе.

Результаты спектрометрического исследования полученных фракций антигена вируса ящура штамма «О/Кения/2017» генотипа О/ЕА-2 в виде антигенного профиля представлены на фиг. 2. Проведен электрофорез в 12% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях, в которых находятся полные частицы вируса ящура данного штамма (фиг. 3).

Пример 2. Получение гипериммунной сыворотки крови кроликов (сенсибилизирующие антитела) против полных частиц вируса ящура генотипа О/ЕА-2.

Для получения специфических сывороток крови против полных частиц вируса ящура штамма «О/Кения/2017» генотипа О/ЕА-2 использовали клинически здоровых кроликов средней упитанности массой 2,5-3,0 кг.

Для гипериммунизации животных применяли концентрированные очищенные инактивированные полные частицы вируса ящура штамма «О/Кения/2017» генотипа О/ЕА-2, полученный как описано в примере 1, из которого готовили эмульсию с использованием масляного адъюванта Montanide ISA-201R VG (в соотношении адъювант/антиген=70/30 по массе). Полученную вакцину вводили в мышцу задних конечностей кролика на 0,21 и 42 дни в объеме 0,5 см³. Через 7 дней после последней иммунизации кроликов тотально обескровливали и получали сыворотку крови - содержащую сенсибилизирующие антитела, которую лиофильно высушивали и хранили при температуре 4-8°С.

Пример 3. Получение гипериммунной сыворотки крови морских свинок (детекторные антитела) против полных частиц вируса ящура штамма «О/Кения/2017» генотипа О/ЕА-2.

Для гипериммунизации морских свинок использовали суспензию очищенного препарата концентрированных инактивированных полных частиц вируса ящура штамма «О/Кения/2017» генотипа О/ЕА-2, полученного как описано в примере 1. Приготовление вакцины и схема иммунизации такая, как в примере 2.

Пример 4. Определение активности полных частиц штамма «О/Кения/2017» вируса ящура, сенсибилизирующих и детекторных антител.

Индивидуальные пробы сывороток проверяли на активность и специфичность в жидкофазном блокирующем непрямом «сэндвич»-варианте варианте ИФА. Провели подбор оптимальных рабочих разведений указанных компонентов для получения достоверных результатов в ИФА. Полученные данные анализа представлены в таблицах 2, 3, 4.

Для анализа исследовали следующие разведения сенсибилизирующих антител: 1:10000, 1:11000, 1:12000, 1:13000. Разведения остальных компонентов были постоянны: для антигена - 1:7000, для детекторных антител - 1:8000, конъюгата - 1:3000. В качестве контрольных сывороток для анализа применяли сыворотки, специфичные к полным частицам вируса ящура с активностью 1:256. Их таблицы 2 следует, что при разведении сенсибилизирующих антител 1:12000 достигалось получение достоверного результата (1:256 или 8,0 log₂ SN₅₀). При меньших разведениях антител наблюдали высокие фоновые значения, что не позволяло получить корректный результат. При большем разведении наблюдали снижение детектируемого значения титра антител в сыворотках крови животных. При исследовании неспецифических и отрицательных сывороток отмечали отрицательные результаты, что свидетельствовало о высокой специфичности разработанной тест-системы.

Для анализа исследовали следующие разведения детекторных антител: 1:6000, 1:7000, 1:8000, 1:9000. Разведения остальных компонентов были постоянны: для антигена - 1:7000, для сенсибилизирующих антител - 1:12000, конъюгата - 1:3000. В качестве контрольных сывороток для анализа применяли сыворотки, специфичные к определенным штаммам вируса ящура с активностью 1:256. Их таблицы 3 следует, что при разведении детекторных антител 1:8000 достигалось получение достоверного результата (1:256 или 8,0 log₂ SN₅₀). При меньших разведений антител наблюдали высокие фоновые значения, что не позволяло получить корректный результат. При большем разведении наблюдали снижение детектируемого значения титра антител в сыворотках крови животных. При исследовании неспецифических и отрицательных сывороток отмечали отрицательные результаты, что свидетельствовало о высокой специфичности разработанной тест-системы.

Для анализа исследовали следующие разведения антигена: 1:5000, 1:6000, 1:7000, 1:8000. Разведения остальных компонентов были постоянны: для детекторных антител - 1:8000, для сенсибилизирующих антител - 1:12000, конъюгата - 1:3000. В качестве контрольных сывороток для анализа применяли сыворотки, специфичные к определенным штаммам вируса ящура с активностью 1:256. Их таблицы 4 следует, что при разведении антигена 1:7000 достигалось получение достоверного результата (1:256 или 8,0 log₂ SN₅₀). При меньших разведениях наблюдали высокие фоновые значения, что не позволяло получить корректный результат. При большем разведении наблюдали снижение детектируемого значения титра антител в сыворотках крови животных.

При исследовании неспецифических и отрицательных сывороток отмечали отрицательные результаты, что свидетельствовало о высокой специфичности разработанной тест-системы. Таким образом, в ходе лабораторных исследований доказано, что рабочие разведения полных частиц штамма «О/Кения/2017», сенсибилизирующих и детекторных антител составили 1:7000, 1:12000, 1:8000, соответственно.

Пример 5. Применение тест-системы для определения титра антител против полных вирусных частиц штамма «О/Кения/2017» вируса ящура с применением жидкофазного «сэндвич»-варианта ИФА.

Исследовали 12 сывороток крови животных, полученных после иммунизации инактивированными сорбированными вакцинами против ящура, содержащими антиген штамма «О/Кения/2017» вируса ящура. Определили значения титра специфических антител с применением разработанной тест-системы, а также данные сыворотки были исследованы в реакции микронейтрализации в чувствительной перевиваемой монослойной клеточной линии IB-RS-2, рекомендованной OIE [3]. Полученные результаты отражены в таблице 5, из которой следует, что степень корреляции результатов, полученных с помощью разработанной тест-системы ИФА (предлагаемое изобретение) и классического метода (РМН - реакция микронейтрализации) высокая.

Пример 6. Определение диагностических показателей разработанной тест-системы для определения титра антител против полных вирусных частиц штамма «О/Кения/2017» вируса ящура с применением жидкофазного «сэндвич»-варианта ИФА.

Для определения чувствительности предложенной тест-системы анализировали 459 сывороток крови животных, которые являлись заведомо положительными по данным РМН. Титр антител для данных сывороток крови находился в диапазоне 1:32-1:32768 (пробы имеют защитный титр антител по данным OIE (МЭБ) - не менее 1:32). Постановку ИФА проводили, как отражено выше. Разработанной тест-системой (предлагаемое изобретение) определили, что из 459 образцов сывороток крови 457 определены в качестве положительных, а 2 - в качестве отрицательных (определен титр - 1:16).

Для исследования диагностической специфичности метода тестировали 350 отрицательных сывороток крови животных. В результате исследования с помощью ИФА (предлагаемое изобретение) определили, что из 350 отрицательных проб - 350 определены в качестве отрицательных. Пользуясь представленными выше статистическими методами анализа определили, что в 95%-ном доверительном интервале диагностическая чувствительность (DSe) составила 98,44-99,95%, диагностическая специфичность (DSp) - 98,95-100,00%, k-критерий - 0,995; прогностичность отрицательного результата (NPV) - 97,96-99,93%, общая точность (DAc) - 99,11-99,97% (таблица 6).

Таким образом предлагаемая «Тест-система для определения титра антител против полных вирусных частиц штамма «О/Кения/2017» вируса ящура с применением жидкофазного «сэндвич»-варианта ИФА» является специфичной и чувствительной, позволяющей проводить анализ сывороток крови животных с определением титра антител против полных частиц вируса ящура штамма «О/Кения/2017», который входит в состав вакцин против ящура.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Тест-система для определения титра антител против полных вирусных частиц штамма «О/Кения/2017» вируса ящура с применением жидкофазного «сэндвич»-варианта ИФА»:

1. Taxonomy. FMDV. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy/ ?term=FMDV (Дата обращения: 05.06.2023).

2. Han SC, Guo НС, Sun SQ. Three-dimensional structure of foot-and-mouth disease virus and its biological functions. Arch Virol. 2015 Jan; 160(1): 1-16. doi: 10.1007/s00705-014-2278-x. Epub 2014 Nov 7. PMID: 25377637.

3. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals. -Paris, 2022. - Chapter 2.1.8.

4. Вакцины против ящура ФГБУ «ВНИИЗЖ». URL: https://shop.arriah.ru/catalog/vaktsiny/vaktsiny-protiv-yashchura/vaktsina-protiv-yashchura-kulturalnaya-inaktivirovannaya-emulsionnaya-arriakh-vak (Дата обращения: 14.06.2023).

5. Anon Global Strategy for control of foot-and-mouth disease. - In, Bangkok, Thailand, - 2012. - P. 27-29.

6. Di Giacomo S, Bucafusco D, Schammas JM, Pega J, Miraglia MC, Barrionuevo F, Capozzo AV, Perez-Filgueira DM. Assessment on Different Vaccine Formulation Parameters in the Protection against Heterologous Challenge with FMDV in Cattle. Viruses. 2022 Aug 15; 14(8): 1781. doi: 10.3390/v14081781. PMID: 36016403; PMCID: PMC9416185.

7. Wong C.L., Yong C.Y., Ong H.K., Ho K.L., Tan W.S. Advances in the Diagnosis of Foot-and-Mouth Disease // Front Vet Sci. - 2020 Aug 21. - V.7. - P. 477.

8. Fry E.E., Stuart D.I., Rowlands D.J. The structure of foot-and-mouth disease virus // Curr Top Microbiol Immunol - 2005. - V. 288. - P. 71-101.

9. Cao Y., Lu Z., Sun J., Bai X., Sun P., Bao H., Chen Y., Guo J., Li D., Liu X., Liu Z. Synthesis of empty capsid-like particles of Asia I foot-and-mouth disease virus in insect cells and their immunogenicity in guinea pigs // Vet. Microbiol. - 2009. -V. 137(1-2).-P. 10-17.

10. Hamblin C, Barnett I.T., Hedger R.S. A new enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of antibodies against foot-and-mouth disease virus. I. Development and method of ELISA // J. Immunol. Methods. - 1986. -V. 93(1).-P. 115-121.

11. Grubman M.J., Moraes M.P., Diaz-San Segundo F., Pena L., de los Santos T. Evading the host immune response: how foot-and-mouth disease virus has become an effective pathogen // FEMS Immunol Med Microbiol. - 2008. - V. 53(1). - P. 8-17.

12. Ma L.N., Zhang J., Chen H.T, Zhou J.H., Ding Y.Z., Liu Y.S. An overview on ELISA techniques for FMD // Virol J. - 2011 Sep 4. - V. 8. - P. 419.

13. Diagnostic assays developed for the control of foot-and-mouth disease in India / Sharma G.K., Mahajan S., Matura R., Subramaniam S., Ranjan R., Biswal J., Rout M., Mohapatra J.K., Dash B.B., Sanyal A., Pattnaik B. Diagnostic assays developed for the control of foot-and-mouth disease in India // World J Virology. -2015.-V. 4(3).-P. 295-302.

14. IZSLER ELISA. URL: https://www.fao.org/fileadmin/user_upload/eufmd/docs/Open_Session2012/Appendices/75_New_Elisa_for_diagnosis_Brocchi_.pdf (Дата обращения: 20.02.2023).

15. PrioCHECK ELISA. URL: http://vetprofilab.ru/f/priocheck_ fmdv_antibody_elisa_kit_cut.pdf (Дата обращения: 27.01.2023).

16. Патент РФ №2787714, 11.01.2023. Тест-система на основе жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII в сыворотках крови животных после иммунизации // Заявка №2022108324.

17. Патент РФ №2791614, 13.03.2023. Тест-система на основе жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 генотипа O/ME-SA/PanAsia2 в сыворотках крови животных после иммунизации // Заявка №2022119118.

18. Патент РФ №2796393,23.05.2023. Способ быстрого количественного определения уровня гуморального иммунитета животных к штамму О №2311/Забайкальский/2016 генотипа O/ME-SA/Ind-2001 вируса ящура после вакцинации с помощью жидкофазного «сэндвич»-варианта ИФА // Заявка №2022113420.

19. Патент РФ №2793828, 14.12.2022. Штамм "О/Кения/2017" вируса ящура Aphtae epizooticae генотипа О/ЕА-2 для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа О/ЕА-2 // Заявка №2022132950.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing originalFreeTextLanguageCode="ru"

dtdVersion="V1_3" fileName="ELISA FMDV O Kenia 2017.xml"

softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.1.2"

productionDate="2023-07-06">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-07-06</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>522</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-07-06</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">ФГБУ &quot;Федеральный центр охраны

здоровья животных&quot; (ФГБУ &quot;ВНИИЗЖ&quot;)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>FGBI &quot;ARRIAH&quot;</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Доронин Максим

Игоревич</InventorName>

<InventorNameLatin>Doronin Maksim Igorevich </InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Тест-система для определения титра

антител против полных вирусных частиц штамма «О/Кения/2017» вируса

ящура с применением жидкофазного «сэндвич»-варианта

ИФА</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>2</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>639</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..639</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q1">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>accacctccccgggtgagtcggctgaccctgtgactgccactgtggaga

actacggtggcgcaactcaggcccagagacgccaacacacggatgtctcgttcattctggacagatttgt

gaaggttacaccccaagaccaaatcaatgttctggacctgatgcagatccctgcccacacactggtgggc

gcgctcttgcgcgcatccacttactactttgctgatttggaagtggcagtgaaacacgagggcaacctca

cttgggtcccgaacggagcacccgaagttgcactggataacaccaccaacccaacagcataccacaaggc

acctctcactcgccttgcattgccttacacggcaccacaccgcgtgttggcaaccgtgtacaacgggaac

tgcaagtacagtggctcctcagtgactaacgtgaggggtgaccttcaagtgttggcccagaaggctgcga

gagcgctgcccacctccttcaactacggtgccgtcaaggccactcgggtgacagaactgctttaccgcat

gaagagggctgaaacatactgcccccggcccctcttggccatccacccgagtgatgctagacacaaacaa

aagattgtggcacctgtcaaacaactccta</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>213</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..213</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>TTSPGESADPVTATVENYGGATQAQRRQHTDVSFILDRFVKVTPQDQIN

VLDLMQIPAHTLVGALLRASTYYFADLEVAVKHEGNLTWVPNGAPEVALDNTTNPTAYHKAPLTRLALPY

TAPHRVLATVYNGNCKYSGSSVTNVRGDLQVLAQKAARALPTSFNYGAVKATRVTELLYRMKRAETYCPR

PLLAIHPSDARHKQKIVAPVKQLL</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Описана тест-система для определения титра антител против полных вирусных частиц штамма «О/Кения/2017» вируса ящура с применением жидкофазного «сэндвич»-варианта ИФА. Преимуществом разработанной тест-системы является продолжительный срок хранения, не менее 5 лет, за счет получения лиофильно высушенных иммуноспецифических и неиммуноспецифических компонентов и применения 1,8% хлорида натрия. Предложенная тест-система обеспечивает создание высокоспецифической и высокочувствительной тест-системы, предназначенной для количественной детекции антител против полных частиц штамма «О/Кения/2017» вируса ящура в сыворотках крови животных на основе жидкофазного иммуноферментного анализа в широком диапазоне 4,0-15,0 log₂ SN₅₀ (1:16-1:32 768) для проведения ретроспективной диагностики ящура. 2 з.п. ф-лы, 3 ил., 6 табл., 6 пр.

1. Тест-система для определения титра антител против полных вирусных частиц штамма «О/Кения/2017» вируса ящура для жидкофазного «сэндвич»-варианта ИФА, содержащая:

- специфические компоненты: культуральные лиофилизированные полные частицы вируса ящура штамма «О/Кения/2017» генотипа О/ЕА-2 с активностью 1:7000; сенсибилизирующие антитела - лиофилизированные иммуноглобулины G кролика против полных частиц вируса ящура «О/Кения/2017» генотипа О/ЕА-2, с активностью 1:12000; детекторные антитела - лиофилизированные иммуноглобулины G морской свинки против полных частиц вируса ящура штамма «О/Кения/2017» генотипа О/ЕА-2, с активностью 1:8000; контроль 1 - лиофилизированная положительная сыворотка крови телят против полных частиц вируса ящура штамма «О/Кения/2017» генотипа О/ЕА-2 с процентом ингибиции >80%, с активностью 1:5000; контроль 2 - лиофилизированная положительная сыворотка крови телят против полных частиц вируса ящура штамма «О/Кения/2017» генотипа О/ЕА-2 с процентом ингибиции от 50% до 80%, с активностью 1:5000; контроль 3 - лиофилизированная сыворотка крови телят, не содержащая антитела к антигену вирусу ящура - отрицательный контроль, с активностью 1:5000; лиофилизированный 0,5%-ный бычий сывороточный альбумин; антивидовой конъюгат - лиофилизированные иммуноглобулины кролика против Ig G морской свинки, конъюгированные с пероксидазой хрена, с активностью 1:3000;

- неспецифические компоненты: карбонатно-бикарбонатный буфер с рН 9,5-9,6 для разведения антигена; 20-кратный концентрат буферного раствора; хромогенный субстрат - ABTS; «стоп»-раствор - 0,6%-ный раствор SDS.

2. Тест-система по п. 1, которая является специфичной и чувствительной, позволяющей проводить анализ сывороток крови животных для определения титра антител против полных частиц штамма «О/Кения/2017» вируса ящура в расширенном диапазоне титра антител 4,0-15,0 log₂ SN₅₀, от 1:16 до 1:32768.

3. Тест-система по п. 2, где при проведении анализа сывороток для определения процента ингибиции используется расчетная формула

титром антител является максимальное разведение исследуемой сыворотки крови, для которой значение процента ингибиции составляет ≥50%, при этом

μ_{сыворотки} - среднее значение показателя ослабления интенсивности окрашивания смеси сыворотки с инактивированными полными частицами вируса ящура штамма «О/Кения/2017»;

μ_КА - среднее значение оптической плотности контроля антигена (полные частицы вируса ящура штамма «О/Кения/2017»);

μ_КК - среднее значение оптической плотности контроля конъюгата.