Тест-система для количественного определения уровня гуморального иммунитета животных против антигена вируса ящура A N 2205/G-IV генотипа A/AFRICA/G-IV с помощью жидкофазного блокирующего непрямого "сэндвич"-варианта ИФА Российский патент 2023 года по МПК C12N7/00 G01N33/53 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности, созданию тест-системы для количественного определения уровня гуморального иммунитета животных против антигена вируса ящура штамма A №2205/G-IV генотипа A/AFRICA/G-IV с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА.

Ящур - очень заразное заболевание парнокопытных животных. Данная болезнь была впервые описана в 16 веке и инфекционным агентом животных, который впервые был идентифицирован как вирус. Недавние вспышки данного заболевания в развитых странах и их значительные экономические последствия усилили обеспокоенность правительств во всем мире [1].

Вспышки возникали во всех животноводческих регионах мира, за исключением Новой Зеландии. В настоящее время болезнь является энзоотической на всех континентах, кроме Австралии и Северной Америки. Ящур поражает домашних парнокопытных животных, включая крупный рогатый скот, свиней, овец и коз, а также более 70 видов диких животных, включая оленей, и характеризуется лихорадкой, хромотой и везикулярными поражениями на языке, ногах, морде и сосках. У овец и коз заболевание, как правило, протекает в легкой форме, и его трудно отличить от других распространенных заболеваний. Кроме того, иные везикулярные заболевания, такие как везикулярная болезнь свиней, везикулярный стоматит и везикулярная экзантема свиней, вызывают признаки, настолько схожие с признаками ящура, что дифференциальная клиническая диагностика сама по себе может быть затруднена. Решением данной проблемы являются серологические и молекулярно-генетические методы исследования [2, 3].

Хотя ящур не приводит к высокой смертности взрослых животных, болезнь имеет изнурительные последствия, включая потерю веса, снижение молочной продуктивности и потерю тягловой силы, что приводит к потере продуктивности на значительное время. Смертность, однако, может быть высокой у молодых животных, у которых вирус поражает сердце. Кроме того, крупный рогатый скот, овцы и козы могут стать переносчиками, в частности, КРС может переносить вирус на срок от 2 до 3 лет [4].

Вирус ящура является представителем рода Aphthovirus семейства Picornaviridae и имеет 7 различных серотипов: О, А, Азия-1, С, SAT-1, SAT-2, SAT-3. Вирион представляет собой частицу с коэффициентом седиментации 146S, состоящую из одноцепочечного позитивного генома в виде РНК и 60 копий каждого из четырех структурных белков (VP₁ [1D-ген], VP₂ [1B-ген], VP₃ [1С-ген] и VP₄ [1А-ген]) [2].

Геном вируса ящура имеет базовую организацию, сходную с таковой у других представителей семейства Picornaviridae, номенклатура вирусных белков была установлена Рюккертом и Виммером [5]. Внутри вириона имеются небольшие количества предшественника расщепления VP₂ и VP₄, называемого VP₀ (1АВ), и одна копия белка VPg [3В-ген], ковалентно связанного с 5'-концом РНК и состоящего из 23-24 аминокислот [6]. РНК транслируется в виде единственной длинной открытой рамки считывания (ORF) в полипротеин, за которым следует серия посттрансляционных протеолитических расщеплений для получения как промежуточных, так и зрелых структурных и неструктурных вирусных белков [7].

В РНК-содержащих вирусах вариациям в геноме благоприятствуют высокие частоты мутаций во время репликации вируса, а возникающие линии и сублинии обусловлены мутациями и рекомбинацией. Мутации в результате рекомбинации приводят к обмену генетическим материалом и образованию новых антигенных вариантов, которые могут избежать иммунного давления и привести к изменениям тропизма клеток и диапазона хозяев [8, 9, 10]. Одна или несколько аминокислотных замен на поверхности вирусных частиц могут привести к изменению распознавания и использования рецепторов. В результате один и тот же вирус будет приобретать способность проникать в клетки с использованием альтернативных рецепторов [11].

Наличие семи серотипов и множества подтипов и вариантов усложняют лабораторную диагностику ящура и борьбу с ним. Появление новых вариантов неизбежно вызвано продолжающейся циркуляцией вируса в полевых условиях и квазивидовым характером РНК-генома [7]. РНК-вирусы в целом и вирус ящура в частности имеют очень высокую частоту мутаций, в диапазоне от 10^-3 до 10^-5 на нуклеотидный сайт в процессе репликации генома по причине отсутствия механизмов исправления ошибок во время репликации РНК. Эта высокая частота ошибок приводит к отличиям реплицированных геномов вируса ящура от исходного родительского генома от 0,1 до 10 базовых позиций. Квазивидовая природа генома ящура была описана более 30 лет назад [8], и хотя концепция изучается на уровне нуклеотидов, изменчивость популяций вируса ящура проявляется, когда мутации приводят к изменениям кодонов, приводящим к изменению вирусного фенотипа. Большая часть этих вариаций происходит в кодирующей капсид области генома (область полипептида Р1) и приводит к антигенной вариации.

Мутации также происходят в областях генома, кодирующих неструктурные белки, но они менее переносимы, поскольку белки, кодируемые этими областями, необходимы для репликации вируса, и изменения в них, скорее всего, будут летальными. В дополнение к вариациям, вызванным мутацией, было показано, что вирус ящура подвергается рекомбинации РНК в культуре тканей [12]. Интересно, что эти исследования показали, что рекомбинация с большей вероятностью происходит в областях генома, кодирующих неструктурные белки, при этом данные процессы происходят в для РНК в области Р1, что способствует генетическому разнообразию изолятов вируса ящура, изолированных в полевых условиях [13].

Наиболее вариабельным является белок VP₁ вируса ящура, поскольку на него приходится не менее 90% мутаций всех структурных генов. Самыми вариабельными областями являются участки 40-60, 130-160 и 190-213 а.о. [14]. Участок поверхностного белка VP₁ в регионе 130-160 а.о. отличается высокой вариабельностью, поскольку участвует в процессе связывания с рецепторами клетки-хозяина [15, 16]. Изменчивость данного региона дает возможность вирусу ящура взаимодействовать с рецепторами клеток разных типов и облегчает переход от одного вида хозяина к другому [14].

На территории Российской Федерации вспышки ящура имеют спорадический характер и вызваны заносом возбудителя с территории сопредельных стран. Регионы РФ, граничащие с Китаем, Монголией, Азербайджаном и Грузией подвержены очень высокой степени риска заноса ящура. Очень важны также в этом отношения транспортные связи на юге России со странами Ближнего Востока и Африканского континента [1, 17].

В настоящее время известны производственные штаммы вируса ящура типа А, которые используются при производстве средств специфической профилактики ящура:

- штамм А/Танзания/2013 (генотип A/AFRICA/G-I),

- штамм A/EGY/1/72 (генотип A/AFRICA/G-II),

- штамм A21/Lumbwa/KEN/3/64 (генотип A/AFRICA/G-III),

- штамм A/SUD/3/77 (генотип A/AFRICA/G-V),

- штамм A/NGR/2/73 (генотип A/AFRICA/G-VI),

- штамм A/GHA/16/73 (генотип A/AFRICA/G-VII),

- штамм А №550/Азербайджан/64 (генотип A/ASIA/Iraq-64),

- штамм А₂₂ Ирак 24/64 (генотип A/ASIA/Iraq-64),

- штамм А №2029/Турция/2006 (генотип A/ASIA/Iran-05),

- штамм А №2166 /Краснодарский/2013 (A/ASIA/Iran-05^SIS-10),

- штамм А №2155 /Забайкальский/2013 (генотип A/ASIA/Sea-97),

- штамм А №2269/ВНИИЗЖ/2015 (A/ASIA/G-VII).

В 2017-2018 гг. в некоторых странах Северо-Восточной Африки отмечали вспышки ящура типа А. Страны указанного региона активно развивают индустрию туризма и имеют торгово-экономические связи с Россией, вследствие этого всегда существует риск заноса заболевания на территорию РФ [1, 2, 3].

После проведения необходимых лабораторных исследований изолятов вируса ящура, особое внимание было обращено на один изолят, который получен от крупного рогатого скота. По результатам ОТ-ПЦР и нуклеотидного секвенирования с последующим филогенетическим анализом, проведенных специалистами Всемирной справочной лаборатории по ящуру (Пирбрайт, Великобритания) и ФГБУ «ВНИИЗЖ» (Владимир, Россия), определили, что изолят принадлежит к топотипу AFRICA, генетической линии G-IV.

По результатам сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей выделенный изолят «A/EGY/2/2018» принадлежит к топотипу AFRICA генетической линии G-IV вируса ящура типа А, который значительно отличается от производственных штаммов вируса ящура типа А.

В ФГБУ «ВНИИЗЖ» данный изолят был адаптирован к различным чувствительным клеточным линиям, в том числе, к монослойной и суспензионной перевиваемой клеточной линии почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/SUSP/ARRIAH и получен штамм A №2205/G-IV (генотип A/AFRICA/G-IV). Данный штамм был депонирован 24.06.2021 года в Государственной коллекции штаммов микроорганизмов ФГБУ «ВНИИЗЖ», под регистрационным номером: №339-деп/20-127 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ». Филогенетическая принадлежность изолята/штамма A №2205/G-IV вируса ящура серотипа А генотипа A/AFRICA/G-IV представлена на фиг. 4.

Филогенетическое дерево выведено с использованием программы MEGA и алгоритма Neighbor-Joining [18]. Процент повторяющихся ветвей, в которых связанные таксоны сгруппированы вместе в тесте начальной загрузки (100 повторов), показан рядом с ветвями [19]. Эволюционные расстояния были рассчитаны с использованием метода Maximum Composite Likelihood [20] и выражены в единицах количества замен оснований на сайт. Этот анализ включал 31 нуклеотидную последовательность. Все позиции, содержащие пробелы и отсутствующие данные, были удалены (вариант полного удаления). В окончательном наборе данных было всего 632 позиции. Эволюционный анализ проводился в MEGA X [21].

Учитывая интенсивные торговые связи между Российской Федерацией и странами Северо-Восточной Африки, вероятность риска заноса ящура на территорию нашей страны остается очень высокой. Иммунизация является эффективным инструментом борьбы с болезнью. В связи с появлением представителя нового генотипа вируса ящура и необходимостью защиты животных от него в ФГБУ «ВНИИЗЖ» разработали вакцину, в состав которой входит антиген вируса ящура данного штамма [22].

Возникла необходимость создания диагностической тест-системы, которая позволила бы количественного определять уровень гуморального иммунитета против антигена вируса ящура штамма A №2205/G-IV (генотип A/AFRICA/G-IV).

Защита от ящура после вакцинации определяется уровнем специфических антител в сыворотке крови животных [23, 24, 25]. Уровень гуморального иммунитета вакцинированного поголовья определяется путем выявления антител, специфичных к структурным белкам вируса ящура. В соответствии с рекомендациями МЭБ (OIE) [2], для определения иммунного статуса животных применяют реакцию микронейтрализации (РМН) и иммуноферментный анализ (ИФА). Реакция микронейтрализации считается чувствительной и специфичной, однако проведение анализа имеет ряд следующих ограничений: 1) большая продолжительность времени постановки реакции (не менее 72 ч), 2) высокая себестоимость процедуры, связанная с применением чувствительной клеточной линии, наличием СО₂-инкубатора и другого оборудования, 3) использование неинактивированного вируса ящура, который является биологическим агентом II группы опасности и предполагает проведение работ только в лабораториях уровня BSL-3.

В свою очередь, ИФА обладает многими преимуществами, включая экспрессность, высокую специфичность и чувствительность, пригодность для крупномасштабного скрининга полевых образцов и отсутствие требований к специальным лабораторным условиям, например, культуре клеток или среде углекислого газа, а также не предполагает проведение работ с микроорганизмами повышенного уровня опасности [2]. Исходя из этого, ИФА целесообразно применять для исследования уровня гуморального иммунитета у вакцинированных животных.

Выделяют прямой и непрямой варианты ИФА. Преимущества прямого варианта ИФА заключаются в экспрессности проводимого анализа, поскольку используется только один вариант иммуноглобулинов G и устраняется перекрестная реактивность вторичных антител. Недостатками данного варианта ИФА являются: 1) снижение иммунной активности первичных антител в следствие отрицательного влияния ферментов или меток, 2) отсутствие гибкости в выборе первичной метки антител в зависимости от задачи исследования, 3) минимальное усиление сигнала.

Непрямой вариант ИФА имеет заметные преимущества по сравнению с прямым, а именно: 1) наличие большого разнообразия меченых вторичных антител, 2) универсальность (многие первичные антитела могут быть получены у одного вида, и одно и то же меченое вторичное антитело может быть использовано для обнаружения), 3) максимальная иммунная активность основного антитела сохраняется, поскольку оно не маркировано, 4) повышение чувствительности, поскольку каждое первичное антитело содержит несколько эпитопов, которые могут быть связаны мечеными вторичными антителами, что обеспечивает усиление детектируемого сигнала. К ограничениям метода относится вероятность появления перекрестной реакции со вторичным антителом, что может привести к возникновению неспецифического сигнала [26, 27, 28, 29, 30].

Особым вариантом проведения ИФА является «сэндвич»-вариант, который обычно предполагает применение пар подобранных антител, где каждое антитело специфично для другого, неперекрывающегося эпитопа антигена. Первые антитела принято называть сенсибилизирующими и предназначены они для захвата антигена. Вторые антитела - детекторные, необходимы для обнаружения антигена. Указанный вариант ИФА имеет следующие преимущества: 1) высокая специфичность реакции; 2) подходит для скринингового анализа полевых образцов разной степени очистки; 3) высокая чувствительность реакции.

В зависимости от фазы, в которой находятся иммунные комплексы различают твердофазный и жидкофазные варианты ИФА. На первом этапе реакции для твердофазного варианта адсорбируют антитела на твердой поверхности планшета. При этом не связавшиеся с твердой фазой реагенты легко удаляются отмыванием. В сенсибилизированных лунках инкубируют исследуемый образец. При этом на поверхности твердой фазы формируются иммунные комплексы. Не связавшиеся компоненты удаляют отмыванием. При добавлении конъюгата и связывании его с иммобилизованным иммунным комплексом активный центр фермента остается доступным для последующего взаимодействия с субстратом. Инкубация субстрата в лунках с иммобилизованным конъюгатом приводит к появлению окрашивания, интенсивность которого оценивают по оптической плотности с помощью многоканального спектрофотометра-ридера.

Особое внимание следует уделить жидкофазному блокирующему непрямому «сэндвич»-варианту ИФА, который характеризуется рядом преимуществ: 1) данный анализ максимально приближен к классической реакции нейтрализации, поскольку формирование иммунного комплекса происходит в жидкой фазе как наиболее естественных условиях; 2) эпитопы антигена наиболее доступны в пространстве для специфичных антител, что позволяет повысить чувствительность и специфичность реакции.

Robiolo В., La Torre J., Duffy S., Leon E., Seki C., Torres A., Mattion N. (2010) разработали способ определения титра антител против антигенов вируса ящура штаммов A₂₄/Cruzeiro, A/Argentina/01, O1/Campos и С₃/Indaial [30]. Против указанных представителей вируса достоверность определения уровня антител составляла не менее 96%, при этом данная тест-система позволяла выявлять антитела против штамма A №2205/G-IV с диагностической чувствительностью не более 45% и специфичностью - не более 50%. Учитывая данные значения, актуально разработать тест-систему для количественного исследования уровня гуморального иммунитета животных против антигена вируса ящура штамма A №2205/G-IV генотипа A/AFRICA/G-IV с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА.

Sharma G.K. и др. (2015) предложили тест-систему для выявления антител против вируса ящура типов А, О, Азия-1 с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА [29]. Данная методика позволяла идентифицировать широкий спектр противоящурных антител, но при этом специфичность по отношению к антигену вируса ящура генотипа A/AFRICA/G-IV не более 40%, а, следовательно, точное выявление иммуноглобулинов G не представляется возможным. Авторы тест-системы применяли моноклональные антитела, использование которых увеличивало спектр выявления различных генотипов вируса ящура в рамках одного серотипа, но при этом существенно снижалась специфичность относительно выявления антител против изолятов/штаммов конкретного генотипа, в частности A №2205/G-IV (генотип A/AFRICA/G-IV).

Указанные выше тест-системы не представлены на рынке в качестве наборов для детекции противоящурных антител в сыворотках крови животных и остаются в качестве недоступных для широкого потребителя. В свою очередь, на мировом рынке в настоящее время имеются европейские наборы для детекции антител против вируса ящура типа А - IZSLER (Италия) и PrioCHECK (Нидерланды).

Тест-система в наборе IZSLER предназначена для детекции противоящурных антител с помощью твердофазного прямого «сэндвич»-варианта ИФА. Достоинством данного набора является применение моноклональных антител, однако они были получены ранее 2018 года (период, когда появился производственный штамм A №2205/G-IV) и не могут с высокой достоверностью и точностью детектировать специфические антитела в сыворотках крови животных. Специфичность и чувствительность указанной тест-системы для выявления антител против вируса ящура генотипа A/AFRICA/G-IV ниже 45%, что подтверждают данные реакции микронейтрализации в чувствительной перевиваемой монослойной клеточной линии почки свиньи IB-RS-2. Иными словами, применяемая тест-система не позволяет получать достоверных результатов именно в отношении изолятов и штаммов вируса ящура вновь появившегося генотипа A/AFRICA/G-IV.

Наиболее близким прототипом для разработанной нами тест-системы является тест-система PrioCHECK (Prionics Lelystad B.V., Netherlands) для выявления антител к вирусу ящура типа А.

Комплектующие для соответствующего набора представлены ниже:

Компонент 1 - Планшеты иммунологические.

Компонент 2 - Конъюгат (30х). Разбавленный конъюгат не стабилен, готовят непосредственно перед применением.

Компонент 3 - Буфер для разведения (5х).

Компонент 4 - Неиммунная сыворотка крови лошади.

Компонент 5 - Деминерализованная вода.

Компонент 6 - Промывочный буфер (200х).

Компонент 7 - Референтная сыворотка 1 (позитивная) (жидкая).

Компонент 8 - Референтная сыворотка 2 (менее позитивная) (жидкая).

Компонент 9 - Референтная сыворотка 3 (еще менее позитивная) (жидкая).

Компонент 10 - Референтная сыворотка 4 (отрицательный контроль) (жидкая).

Компонент 11 - Субстрат хромогена (ТМВ).

Компонент 12 - Стоп-раствор (1 N раствор серной кислоты). Данные отражены в инструкции производителя.

Данная тест-система включает в себя конъюгат, который представляет собой меченые моноклональные антитела против вируса ящура серотипа А, исходя из этого является типоспецифичной, но без более узкой дифференциации. Прототипная тест-система разработана была еще в конце 90-гг XX в. В ней применяются антитела против антигенов вируса ящура различных генотипов типа А, кроме вновь появившихся, в частности A/AFRICA/G-IV. Изоляты и штаммы данной линии имеют существенные отличия от других линий серотипа А. Анализируя нуклеотидную и аминокислотную последовательность высоко вариабельного белка VP₁ вируса ящура, ученые пришли к выводу о наличии достаточного количества существенных замен, позволяющих отнести вирус к иному генотипу. Исходя из выше отраженного, прототипная тест-система не является высокочувствительной и специфичной по отношению к вирусу ящура штамма A №2205/G-IV генотипа A/AFRICA/G-IV. Данная тест-система выявляет антитела к данному штамму не более, чем на 45%. Исходя из этого требуется разработать чувствительную, специфичную тест-систему для детекции и количественного анализа уровня гуморального иммунитета против антигена вируса ящура штамма A №2205/G-IV генотипа A/AFRICA/G-IV.

Прототипная тест-система основана на твердофазном конкурентном «сэндвич»-варианте ИФА, однако эта форма находится дальше от реакции микронейтрализации относительно возможностей улавливания антигенных сайтов по сравнению с жидкофазным блокирующим непрямым «сэндвич»-вариантом ИФА.

Прототипный вариант предполагает наличие в своем составе контрольных сывороток крови животных в жидком виде, что снижает сохранность компонентов тест-системы в течение длительного периода времени и создает риски контаминации микроорганизмами.

Прототипный вариант имеет также некоторое ограничение в применении, а именно, рабочий раствор конъюгата не стабилен и быстро разрушается. В составе набора он представлен в виде 30-кратного концентрата. В таком состоянии в отличии от лиофилизированного компонента срок хранения заметно сокращается. Следует также отметить, что данная тест-система не предусматривает контроля конъюгата, что не позволяет получать более достоверные данные по оптическим плотностям и уровню гуморального иммунитета против антигена вируса ящура.

В прототипной тест-системе применяется прямой конъюгат, что удобно в применении, однако при этом повышается вероятность шумовых фоновых явлений, что может негативно отражаться на конечных результатах количественного исследования сывороток крови животных.

Учитывая найденные ограничения в применении имеющихся тест-систем, в том числе прототипной, для проведения точного количественного анализа уровня гуморального иммунитета животных после инокуляции противоящурными вакцинами, содержащими инактивированный вирус ящура штамма A №2205/G-IV генотипа A/AFRICA/G-IV, актуальной является разработка тест-системы для количественного определения уровня гуморального иммунитета животных против антигена вируса ящура штамма A №2205/G-IV генотипа A/AFRICA/G-IV с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА с учетом выше приведенных недостатков.

В настоящее время ветеринарная служба Российской Федерации не располагает современной отечественной тест-системой ИФА, которая позволила бы с высокой достоверностью количественно определять уровень гуморального иммунитета против антигена вируса ящура штамма A №2205/G-IV генотипа A/AFRICA/G-IV в сыворотках крови животных.

Целью изобретения является создание тест-системы для количественного определения уровня гуморального иммунитета животных против антигена вируса ящура штамма A №2205/G-IV генотипа A/AFRICA/G-IV с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА.

Поставленная цель достигается тем, что предлагаемая тест-система содержит следующие лиофильно высушенные иммуноспецифические компоненты с высокой степенью активности:

1) культуральный инактивированный лиофилизированный вирус ящура штамма A №2205/G-IV генотипа A/AFRICA/G-IV;

2) сенсибилизирующие антитела - иммуноглобулины G кролика против вируса ящура штамма A №2205/G-IV генотипа A/AFRICA/G-IV;

3) детекторные антитела - иммуноглобулины G морской свинки против вируса ящура штамма A №2205/G-IV генотипа A/AFRICA/G-IV;

4) контроль 1 (сильноположительный контроль) - положительная сыворотка крови телят к антигену вируса ящура штамма A №2205/G-IV генотипа A/AFRICA/G-IV с процентом ингибиции 75-100%;

5) контроль 2 (положительный контроль) - положительная сыворотка крови телят к антигену вируса ящура штамма A №2205/G-IV генотипа A/AFRICA/G-IV с процентом ингибиции от 50,0% до 74,9%;

6) контроль 3 (отрицательный контроль) - сыворотка крови телят, не содержащая антитела к вирусу ящура;

7) блокирующая сыворотка крови;

8) антивидовой конъюгат - иммуноглобулины кролика против Ig G морской свинки, конъюгированные с ферментом (пероксидаза хрена).

Предлагаемая тест-система содержит также неспецифические компоненты: буферный раствор на основе карбоната и гидрокарбоната натрия (рН 9,5-9,6), 20-кратный концентрат буферного раствора, хромогенный субстрат - 2,2-азино-ди-(3-этилбензоаминосульфоновая кислота), «стоп»-раствор - 0,5%-ный раствор кокосульфата натрия.

Цель достигается благодаря тому, что метод жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА наиболее приближен к классической реакции микронейтрализации в культуре клеток IB-RS-2, поскольку все антигенные сайты 146S частиц вируса ящура штамма A №2205/G-IV генотипа A/AFRICA/G-IV находятся в свободном состоянии в жидкой фазе, открыты для связывания со специфическими сенсибилизирующими и детекторными антителами. Реакция основана на взаимодействии иммуноглобулинов G исследуемой сыворотки крови животного и инактивированного вируса ящура штамма A №2205/G-IV генотипа A/AFRICA/G-IV в жидкой фазе с образованием иммунных комплексов. Параллельно с этим проводится сенсибилизация лунок плоскодонного планшета антителами кролика против вируса ящура того же генотипа. После этого сенсибилизированные лунки подвергают обработке с помощью блокирующей сыворотки крови, добавляют полученные иммунные комплексы из круглодонного планшета, инкубируют, вносят восстановленную из лиофильного высушенного состояния суспензию детекторных антител. Образовавшийся сложный иммунный комплекс выявляют с помощью антител против иммуноглобулинов G морской свинки, конъюгированных с пероксидазой хрена и хромогенного субстрата.

Технический результат от изобретения заключается в разработке современной, специфической против антигена вируса ящура штамма A №2205/G-IV генотипа A/AFRICA/G-IV и чувствительной тест-системы, предназначенной для количественного определения уровня гуморального иммунитета против указанного антигена методом жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА на основе применения инактивированного вируса ящура штамма A №2205/G-IV генотипа A/AFRICA/G-IV и при получении иммуноспецифических компонентов реакции.

В отличии от прототипа в разработанной тест-системе применяется культуральный концентрированный в 300-350 раз инактивированный вирус ящура штамма A №2205/G-IV генотипа A/AFRICA/G-IV, который представлен в виде лиофильно высушенной суспензии. Данный факт дает возможность количественно определять гуморальный иммунитет против вируса ящура указанного штамма с высокими показателями чувствительности (более 99%) и специфичности (100%), что более чем на 55% выше по сравнению с наиболее близким прототипом. Кроме того, лиофилизированный компонент остается стабильным не менее 3 лет по сравнению с антигеном в нативном состоянии, что является преимуществом в использовании данной тест-системы. Активность полученного антигена вируса ящура штамма A №2205/G-IV генотипа A/AFRICA/G-IV составляет 1:2500.

В отличии от прототипа применяются сенсибилизирующие и детекторные антитела кролика и морской свинки, соответственно, высокоспецифичные по отношению к антигену вируса ящура штамма A №2205/G-IV генотипа A/AFRICA/G-IV. Указанные в тест-системе ИФА иммуноглобулины G кролика и морской свинки против указанного штамма вируса ящура представлены в виде лиофильного компонента, что позволяет иммуноглобулинам G находится в стабильном состоянии не менее 3 лет с активностью не менее 1:9000 и 1:4000, соответственно.

В отличии от прототипа сыворотки крови КРС, сильноположительный и положительный контроли получены против высокоочищенного концентрированного инактивированного вируса ящура штамма A №2205/G-IV генотипа A/AFRICA/G-IV, что позволяет достичь высокой специфичности и чувствительности при контроле работы тест-системы. Указанные компоненты представлены в виде лиофильно высушенных суспензий, что позволяет хранить их не менее 3 лет с сохранением высокой активности в ИФА. Для контроля 1 активность составляет не менее 1:3500, для контроля 2 - не менее 1:4000. Данная активность удобна для получения большого объема контролей в рабочем нативном состоянии для непосредственного проведения реакции.

В отличии от прототипа для блокирования открытых сайтов связывания применяется очищенная фетальная сыворотка телят, белковые составляющие которой обеспечивают полное закрытие пустых участков на дне иммунологического планшета. Данный компонент также представлен в лиофильном виде, что позволяет хранить его в данном состоянии не менее 3 лет.

В отличии от прототипного варианта представленная тест-система предусматривает контроль антигена и конъюгата, что дает возможность учитывать фоновые значения и, тем самым, получать достоверные данные по значениям экстинкции и уровню гуморального иммунитета против вируса ящура штамма A №2205/G-IV генотипа A/AFRICA/G-IV.

В отличии от прототипа в предложенной тест-системе применяются антитела кроличьи к иммуноглобулину G морской свинки H&L (HRP), что позволяет повышать специфичность анализа и получать более достоверные результаты количественного определения уровня гуморального иммунитета против вируса ящура штамма A №2205/G-IV генотипа A/AFRICA/G-IV в сыворотках крови животных. Активность конъюгата составляет 1:2500.

Разработанная тест-система основана на специфическом блокировании антигена вируса ящура штамма A №2205/G-IV генотипа A/AFRICA/G-IV (фиг. 1) антителами, содержащимися в исследуемой пробе сыворотки в жидкой фазе. Смесь «исследуемая сыворотка/антиген» переносится в лунки планшета, предварительно иммобилизованного сенсибилизирующими антителами кролика против штамма A №2205/G-IV генотипа A/AFRICA/G-IV. Наличие антител к вирусу ящура штамма A №2205/G-IV генотипа A/AFRICA/G-IV в исследуемой пробе будет выражаться в формировании иммунного комплекса и уменьшении количества свободного антигена, который связывается сенсибилизирующими антителами. Фиксированный в лунках антиген взаимодействует с детекторными антителами морской свинки, которые выявляются в реакции с иммунопероксидазным конъюгатом против Ig G морской свинки и последующим окрашиванием с помощью хромогенного субстрата. Интенсивность окрашивания обратно пропорциональна количественному значению выявленного уровня гуморального иммунитета животного. Интенсивность цветной реакции учитывают с помощью спектрофотометра-ридера.

Сущность изобретения отражена на графических изображениях:

Фиг. 1 - Место жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для применения относительно генома вируса ящура штамма A №2205/G-IV.

Фиг. 2 - Седиментационный профиль фракций антигена вируса ящура штамма A №2205/G-IV генотипа A/AFRICA/G-IV.

Фиг. 3 - Электрофореграмма для антигена вируса ящура штамма A №2205/G-IV генотипа A/AFRICA/G-IV в 12% полиакриламидном геле. Примечание: 1-5: фракции с 50% сахарозы, 6-10: фракции с 40% сахарозы, 11-15: фракции с 30% сахарозы, 16-18: фракции с 20% сахарозы; целевой белок с молекулярным весом 25 кDa (два слота на треке).

Фиг. 4 - Филогенетическая принадлежность штамма A №2205/G-IV генотипа A/AFRICA/G-IV.

Сущность изобретения пояснена в перечне последовательностей, в котором:

SEQ ID NO:1 представляет последовательность нуклеотидов гена, кодирующего белок VP₁ штамма A №2205/G-IV генотипа A/AFRICA/G-IV вируса ящура;

SEQ ID NO:2 представляет последовательность аминокислот белка VP₁ штамма A №2205/G-IV генотипа A/AFRICA/G-IV вируса ящура.

На подготовительном этапе исследования лиофилизированные иммуноспецифические компоненты тест-системы (антиген вируса ящура штамма A №2205/G-IV генотипа A/AFRICA/G-IV, иммунопероксидазный конъюгат, положительные и отрицательный контроли, сенсибилизирующие и детекторные антитела) восстанавливают до необходимого объема деионизированной водой.

Проводят приготовление рабочих растворов.

Раствор №1 (солевой буферный раствор карбоната и гидрокарбоната натрия). Готовят по стандартной методике 50 мл раствора с водородным показателем 9,5-9,6.

Раствор №2 (Wash-раствор). Готовят 2 л стандартного буферного раствора TBS с добавлением 0,1% tween-20 с водородным показателем 7,5-7,6. Рабочий Wash-раствор готовят разведением концентрата в 20 раз.

Раствор №3 (буфер для восстановления антител и конъюгата). Рабочий буферный раствор для разведения антител и иммунопероксидазного конъюгата готовится непосредственно перед использованием из рабочего Wash-раствора с добавлением 10% фетальной сыворотки телят.

Этапы проведения жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для количественного определения уровня гуморального иммунитета против антигена вируса ящура штамма A №2205/G-IV генотипа A/AFRICA/G-IV представлены ниже.

1. Иммобилизация антител кролика против антигена вируса ящура. Восстановленную суспензию сенсибилизирующих антител против антигена вируса ящура штамма A №2205/G-IV генотипа A/AFRICA/G-IV готовят в разведении 1:9000 в солевом буферном растворе карбоната и гидрокарбоната натрия (раствор №1). Во все лунки иммунологического 96-луночного планшета вносят по 100 мкл суспензии данных антител, накрывают крышкой и инкубируют в течение 18-20 ч при температуре (2-8)°С.

2. Промывание лунок планшета осуществляют с использованием Wash-раствора 2 раза.

3. Образование иммунного комплекса в жидкой фазе. Параллельно с иммобилизацией планшета проводят серологическую реакцию связывания антигена с испытуемыми и контрольными пробами сыворотки крови животных. Готовят следующие разведения сывороток крови животных: 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; 8,5; 9,0; 9,5; 10,0; 10,5; 11,0 log₂ SN₅₀ (1:22-1:2048) в растворе №2. Для этого во все лунки планшета за исключением лунок H1-6, которые оставляют для контроля антигена (КА) и контроля конъюгата (КК), вносят по 0,047 см³ (47 мкл) буферного раствора и 0,003 см³ (3 мкл) пробы. В лунки H1-6 вносят по 0,05 см³ (50 мкл) буферного раствора. Испытуемые и контрольные пробы располагают на планшете согласно таблице 1. Положительной сыворотка считается при уровне гуморального иммунитета>* 5,0 log₂ SN₅₀ (≥1:32).

В качестве контроля 1 используют сильноположительную сыворотку крови КРС/свиней против вируса ящура штамма A №2205/G-IV генотипа A/AFRICA/G-IV - процент ингибиции (PI) 75-100%, контроля 2 - положительную сыворотку крови КРС/свиней против вируса ящура штамма A №2205/G-IV генотипа A/AFRICA/G-IV - PI=50,0-74,9%, контроля 3 - нормальную сыворотку КРС/свиней - процент ингибиции<50%.

Во все лунки планшета добавляют по 0,05 см³ рабочего разведения антигена в растворе №2 в соответствии с разведением 1:2500. После перемешивания содержимого лунок планшета проводят в течение 1 часа при температуре (2-8)°С.

4. Улавливание антигена. В промытые лунки иммобилизованного планшета вносят по 0,05 см³ смеси контрольных и испытуемых проб и антигена, планшет закрывают крышкой и инкубируют в течение 60±2 мин при температуре (37±1)°С.

5. Промывание лунок планшета. Проводят, как представлено выше (п. 2). Процедуру повторяют 3 раза.

6. Внесение детекторных антител. Во все лунки планшета, за исключением лунок с КК (контроль конъюгата), куда добавляют по 0,05 см³ раствора №3, вносят по 0,05 см³ рабочего разведения детекторных антител (1:4000) в растворе №3. Планшет накрывают крышкой и инкубируют в течение 60±2 мин при температуре (37±1)°С.

7. Промывание лунок планшета. Проводят, как представлено выше (п. 2). Процедуру повторяют 3 раза.

8. Внесение конъюгата. Во все лунки планшета вносят по 0,05 см³ рабочего разведения конъюгата (1:2500) в растворе №3. Планшет накрывают крышкой и инкубируют в течение 60±2 мин при температуре (37±1)°С.

9. Промывание лунок планшета. Проводят, как представлено выше (п. 2). Процедуру повторяют 4 раза.

10. Проявление цветной реакции. Во все лунки планшета вносят по 0,05 см³ хромогенного субстрата ABTS, закрывают крышкой и выдерживают 15-20 минут при температуре (20±2)°С.

11. Торможение реакции. Реакцию останавливают добавлением в каждую лунку планшета 0,05 см³ 0,5% раствора кокосульфата натрия.

12. Определение значения экстинкции и уровня гуморального иммунитета по данным ИФА. Результаты анализа учитывают инструментальным способом. Сразу после остановки реакции измеряют оптическую плотность ($D) продуктов реакции в каждой лунке при длине волны 415 нм, используя спектрофотометр-ридер для микропланшетов с вертикальным лучом света. Значения $D переводят в значение процента ингибиции (ПИ, %) по формуле:

ПИ (%)=(1-($D_{сыворотки}-$D_КК)/($D_КА-$D_КК))×100, где

$D_{сыворотки} - среднее значение оптической плотности смеси сыворотки с инактивированным вирусом ящура штамма A №2205/G-IV генотипа A/AFRICA/G-IV;

$D_КА - среднее значение оптической плотности контроля антигена;

$D_КК - среднее значение оптической плотности контроля конъюгата.

Достоверность проводимого анализа с помощью предложенной тест-системы определяется при удовлетворении следующим критериям:

- разница между значениями $D_КА и $D_КК не менее 0,4 оптических единиц (о.е.);

- контроль 1 имеет значение ПИ>75%;

- контроль 2 имеет значение ПИ в пределах 50,0-74,9%;

- контроль 3 имеет значение ПИ<50%.

Сыворотки крови, для которых значение ПИ>50%, считают положительными, а животные, от которых они получены, иммунными к ящуру, вызванного вирусом штамма A №2205/G-IV генотипа A/AFRICA/G-IV. Значение ПИ<50% в сыворотке крови обследуемых животных является отрицательным, что свидетельствует об отсутствии специфических антител к ящуру, вызванного вирусом штамма A №2205/G-IV генотипа A/AFRICA/G-IV. Исходя из полученных данных берут последнее разведение сыворотки, для которого процент ингибиции составляет ≥50%. Данное разведение считают титром антител против ящура, вызванного вирусом штамма A №2205/G-IV генотипа A/AFRICA/G-IV и выражают в log₂ SN₅₀.

В результате проведенных экспериментов были оттитрованы оригинальные компоненты реакции. Активность детекторных антител в ИФА составила 1:4000, сенсибилизирующих антител - 1:9000, антивидового конъюгата - 1:2500; антигена вируса ящура штамма A №2205/G-IV генотипа A/AFRICA/G-IV - 1:2500, контроля 1 - 1:3500, контроля 2 - 1:4000. С использованием разработанной тест-системы проведено исследование образцов сывороток крови животных с количественным определением уровня гуморального иммунитета и проведен сравнительный анализ с результатами реакции микронейтрализации в чувствительной перевиваемой монослойной клеточной линии почки свиньи (IB-RS-2) [2].

Разработанная тест-система дает возможность тестировать одновременно в формате одного 96-луночного планшета 6 проб сывороток в следующих разведениях, выраженных в двоичном логарифме: 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; 8,5; 9,0: 9,5; 10,0; 10,5; 11,0 log₂ SN₅₀ (1:16-1:2048).

Для работы применяли уникальный инактивированный антиген вируса ящура штамма A №2205/G-IV генотипа A/AFRICA/G-IV. Данный штамм применяют для разработки серологических тест-систем в настоящее время исключительно в РФ.

Контроль штамма А №2205/G-IV генотипа A/AFRICA/G-IV вируса ящура на специфичность.

Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма A №2205/G-IV генотипа A/AFRICA/G-IV вируса ящура, был выделен от крупного рогатого скота на территории Арабской республики Египет 02.2018 г. Специфичность определена с помощью ОТ-ПЦР с последующим секвенированием 1D-гена, соответствующего белку VP₁, в котором наиболее часто возникают мутации. По результатам исследования нуклеотидной последовательности указанного гена была выявлена принадлежность штамма А №2205/G-IV к генотипу A/AFRICA/G-IV. Расчет проводился в соответствии с Байесовской теорией вероятности. Специфичность подтверждена также в реакции связывания комплемента со штаммоспецифической сывороткой. Концентрация общего вирусного белка в исследуемом антигене вируса ящура штамма A №2205/G-IV составила 2,87 мкг/мл, концентрация 146S компонента - 2,12 мкг/мл, 75S компонента - 0,65 мкг/мл, 12 S частиц - 0,10 мкг/мл. Экспериментально подтверждена возможность использования штамма А №2205/G-IV вируса ящура для разработки диагностических тест-систем.

Морфологические признаки.

Штамм A №2205/G-IV вируса ящура относится к семейству Picornaviridae, роду Aphthovirus, серотипу А, генотипу A/AFRICA/G-IV и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона икосаэдрическая, размер 23-25 нм. Вирион состоит из молекулы РНК, заключенной в белковую оболочку, которая состоит из 32 капсомеров с кубическим типом симметрии.

Антигенные свойства.

По своим антигенным свойствам штамм A №2205/G-IV вируса стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности. У переболевших животных в сыворотке крови образуются антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе (ИФА) и реакции микронейтрализации.

При гипериммунизации морских свинок концентрированный антиген из инактивированного вируса ящура штамма A №2205/G-IV индуцирует образование вирусоспецифических антител, выявляемых в РСК в разведении не менее 1:2500.

Антигенное родство штамма A №2205/G-IV вируса ящура с имеющимися производственными штаммами вируса ящура серотипа А исследовано серологическим методом в перекрестной реакции микронейтрализации (РМН). Штамм A №2205/G-IV антигенно отличается от производственных штаммов А №2029/Турция/2006, А №2155/Забайкальский/2013, А №2269/ВНИИЗЖ/2015, А₂₂ Ирак 24/64, А №2187/Кути/2013, А №2171/Кабардино-Балкарский/2013.

Результаты исследований в РМН представлены в таблице 2. Антигенное соответствие (r₁) составило для А/Танзания/2013 - 0,45, A/EGY/1/72 - 0,48, A21/Lumbwa/KEN/3/64 - 0,52, A/SUD/3/77 - 0,49, A/NGR/2/73 - 0,41, A/GHA/16/73 - 0,64, A/EGY/2006 - 0,55. При значении r₁≥0,3 полевой изолят и производственный штамм являются близкородственными, и вакцина из производственного штамма будет защищать от эпизоотического полевого вируса, при значении r₁<0,3 полевой изолят отличается от производственного штамма, и вакцина из данного штамма не защищает от эпизоотического полевого вируса.

Биотехнологические характеристики.

Штамм A №2205/G-IV репродуцируется в перевиваемых монослойных клеточных линиях почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), почки свиньи IB-RS-2, почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/SUSP/ARRIAH, и в течение 13-20 часов инкубирования вирус в указанных культурах клеток накапливается от 6,75 до 8,00 lg ТЦД₅₀/СМ³.

Генотаксономическая характеристика.

Штамм A №2205/G-IV вируса ящура типа А является РНК (+) - содержащим вирусом. Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой с молекулярной массой 2,8×10⁶ Да. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех структурных белков VP₁, VP₂, VP₃ и VP₄.

Основным антигенным белком является VP₁. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирионная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Из 8 неструктурных полипептидов, накапливающихся в инфицированных клетках, один (VP_66a) является РНК-зависимой РНК-полимеразой, участвующей в репликации РНК новых вирионов.

Физические свойства.

Для данного вируса при константе седиментации полных вирусных частиц 146 S, константе диффузии 1,41 см²/с молекулярная масса составляет 8,08×10⁶Д. Размер вириона 23-25 нм, масса составляет 8,4×10^-18 г.

Устойчивость к внешним факторам.

Штамм A №2205/G-IV устойчив к эфиру, хлороформу, ацетону и другим органическим растворителям и детергентам. Наиболее стабилен при рН 7,5-7,8. Сдвиги водородного показателя как в кислую, так и в щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Вирусная частица чувствительна к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам.

Дополнительные признаки и свойства.

Иммуногенная активность - иммуногенен в составе инактивированной вакцины.

Антигенная активность - введение инактивированного вируса ящура штамма A №2205/G-IV морским свинкам, кроликам, свиньям, овцам, КРС индуцирует образование вирусоспецифических антител.

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - патогенен для парнокопытных животных, новорожденных мышат, морских свинок.

Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при культивировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения).

Сущность изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Получение антигена вируса ящура штамма A №2205/G-IV.

Для получения антигена вируса ящура штамма A №2205/G-IV для диагностических целей проводили суспензионное культивирование вируса в клеточной линии BHK-21/SUSP/ARRIAH в течение 10-13 ч с получением вирусной суспензии с титром инфекционной активности не ниже 6,5 lg ТЦД₅₀/СМ³. Полученную вирусную суспензию инактивировали с помощью аминоэтилэтиленимина и осветляли полигексаметиленгуанидином.

Инактивированную культуральную суспензию, содержащую антиген вирус ящура, осветляли в течение 30 мин. при 6000 об/мин и 4°С. Надосадочную жидкость отбирали и добавляли в нее полиэтиленгликоль с молекулярным весом 6000 Д (ПЭГ-6000) до конечной концентрации 8% и хлорид натри (сухой) до конечной концентрации 0,85%, интенсивно перемешивали и выдерживали при температуре 4±2°С в течение 18-24 часов. Вирусную суспензию осаждали при 6000 об/мин в течение 60 мин., осадок растворяли в 1/15 M растворе ФСБ, концентрируя в 300 раз (1/300 от первоначального объема).

К полученному преципитату добавляли 50% хлороформа, интенсивно перемешивали и фракционировали с помощью центрифуги в течение 30 мин. при 3000 об/мин. Отбирали верхнюю водную фракцию, содержащую антиген вируса ящура штамма A №2205/G-IV. Отбирали 100 мкл образца для последующего электрофоретического анализа в 12% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях.

На следующем этапе проводили получение полных частиц вируса ящура штамма A №2205/G-IV (данный компонент является иммуногенным и наиболее важным в иммунизации животных).

Для выделения полных частиц с коэффициентом седиментации 146S готовили линейный градиент сахарозы с концентрациями 50, 40, 30, 20, и 10% (по направлению слоев в центрифужной пробирке снизу вверх). Суспензию антигена вируса ящура штамма A №2205/G-IV вносили по 15 мл в центрифужные пробирки, затем последовательно подслаивали растворы сахарозы, начиная с 10%о-го и заканчивая 50%-м раствором. Пробирки помещали в металлические центрифужные стаканы и после тщательно выполненного уравновешивания центрифугировали при скорости 30000 об/мин и температуре 4±2°С в течение 4 часов. Фракционирование градиента сахарозы производили с помощью перистальтического насоса, отбирая фракции по 1,0 мл в отдельные пробирки. Начало и конец пика 146S компонента определяли по спектральному профилю на спектрограмме, объединяя фракции, входящие в этот диапазон.

При использовании перистальтического насоса сначала оценивали визуально пробирку с градиентом сахарозы. Опалесцирующий слой, содержащий 146S компонент, располагается приблизительно в 30%-м слое сахарозы. В этом случае отбирали последнюю верхнюю фракцию 50%-го слоя (1,0 мл), все фракции 30%-го слоя (5,0 мл) и нижнюю фракцию 20%-го слоя сахарозы (1,0 мл). Общий объем составляет приблизительно 7,0 мл. Затем 146S компонент переосаждали с помощью ультрацентрифугирования в течение 4 часов при скорости 25000 об/мин. и температуре 4±2°С и ресуспендировали осадок в 1/15 M фосфатно-солевом буферном растворе.

Результаты спектрометрического исследования полученных фракций антигена вируса ящура штамма A №2205/G-IV в виде антигенного профиля представлены на фиг. 2. Анализ проводили для 18 фракций, пики наблюдали для 5-10 фракции с максимальными значениями в для 7 и 8 пиков. Проведен электрофорез полученных фракций в 12% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях для 18 фракций, в которых возможно нахождение 146S компонента вируса ящура данного штамма (фиг. 3). На фиг. 3 отражено, что слоты №№1-5 - фракции с 50% сахарозы, №№6-10 - фракции с 40% сахарозы, №№11-15 - фракции с 30% сахарозы, №№16-18 - фракции с 20% сахарозы.

Пример 2. Получение гипериммунной сыворотки крови кроликов (сенсибилизирующие антитела) против штамма A №2205/G-IV.

Для получения специфических сывороток крови против вируса ящура штамма A №2205/G-IV применяли клинически здоровых кроликов средней упитанности массой 2,5-3,0 кг.

Для гипериммунизации животных применяли концентрированный очищенный инактивированный антиген вируса ящура штамма A №2205/G-IV, полученный как описано в примере 1, из которого готовили эмульсию с использованием масляного адъюванта Montanide ISA-61 VG (в соотношении адъювант/антиген = 60/40 по массе). Полученную вакцину вводили в мышцу задних конечностей кролика на 0, 14 и 28 дни в объеме 0,5 см³. Через 7 дней после последней иммунизации у кроликов отбирали кровь, содержащую сенсибилизирующие антитела, которую лиофильно высушивали и хранили при температуре (4-8)°С.

Пример 3. Получение гипериммунной сыворотки крови морских свинок (детекторные антитела) против вируса ящура штамма A №2205/G-IV.

Для гипериммунизации морских свинок использовали эмульсию очищенного препарата концентрированного инактивированного антигена вируса ящура штамма A №2205/G-IV, полученного как описано в примере 1. Приготовление вакцины и схема иммунизации такая, как в примере 2.

Пример 4. Определение активности в ИФА антигена вируса ящура штамма A №2205/G-IV, сенсибилизирующих и детекторных антител к нему.

Образцы сывороток крови животных проверяли на активность и специфичность в жидкофазном блокирующем непрямом «сэндвич»-варианте ИФА. Был проведен подбор оптимальных рабочих разведений указанных компонентов для получения достоверных результатов в ИФА. Полученные данные анализа представлены в таблицах 3, 4, 5.

Для анализа исследовали следующие разведения сенсибилизирующих антител: 1:7000, 1:8000, 1:9000, 1:10000. Разведения остальных компонентов были постоянны: для антигена - 1:2500, для детекторных антител - 1:4000, конъюгата - 1:2500. В качестве контрольных сывороток для анализа применяли сыворотки, специфичные к определенным штаммам вируса ящура с активностью 8,0 log₂ SN₅₀. Их таблицы 3 следует, что при разведении сенсибилизирующих антител 1:9000 достигалось получение достоверного результата (1:256 или 8 log₂ SN₅₀). При меньших разведений антител наблюдали высокие фоновые значения, что не позволяло получить корректный результат. При большем разведении отмечали снижение детектируемых значений уровня гуморального иммунитета в сыворотках крови животных. При исследовании неспецифических и отрицательных сывороток получали отрицательные результаты, что свидетельствовало о высокой специфичности разработанного способа.

Для анализа исследовали следующие разведения детекторных антител: 1:3000, 1:3500, 1:4000, 1:4500. Разведения остальных компонентов были постоянны: для антигена - 1:2500, для сенсибилизирующих антител - 1:9000, конъюгата - 1:2500. В качестве контрольных сывороток для анализа применяли сыворотки, специфичные к определенным штаммам вируса ящура с активностью 8,0 log₂ SN₅₀. Их таблицы 4 следует, что при разведении детекторных антител 1:4000 достигалось получение достоверного результата (1:256 или 8 log₂ SN₅₀). При меньших разведений антител наблюдали высокие фоновые значения, что не позволяло получить корректный результат. При большем разведении наблюдали снижение детектируемого значения титра антител в сыворотках крови животных. При исследовании неспецифических и отрицательных сывороток отмечали отрицательные результаты, что свидетельствовало о высокой специфичности разработанного способа.

Для анализа исследовали следующие разведения антигена: 1:1500, 1:2000, 1:2500, 1:3000. Разведения остальных компонентов были постоянны: для детекторных антител - 1:4000, для сенсибилизирующих антител - 1:9000, конъюгата - 1:2500. В качестве контрольных сывороток для анализа применяли сыворотки, специфичные к определенным штаммам вируса ящура с активностью 8,0 log₂ SN₅₀. Их таблицы 5 следует, что при разведении антигена 1:2500 достигалось получение достоверного результата (1:256 или 8 log₂ SN₅₀). При меньших разведениях наблюдали высокие фоновые значения, что не позволяло получить корректный результат. При большем разведении наблюдали снижение детектируемого значения титра антител в сыворотках крови животных.

При исследовании неспецифических и отрицательных сывороток отмечали отрицательные результаты, что свидетельствовало о высокой специфичности разработанной тест-системы.

Таким образом, в ходе лабораторных исследований доказано, что рабочие разведения антигена вируса ящура штамма A №2205/G-IV, сенсибилизирующих и детекторных антител составили 1:2500, 1:9000, 1:4000, соответственно.

Пример 5. Применение тест-системы жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для количественного определения уровня гуморального иммунитета против антигена вируса ящура штамма A №2205/G-IV

Исследовали 12 сывороток крови животных, полученных после иммунизации инактивированными сорбированными вакцинами против ящура, содержащими антиген вируса ящура штамма A №2205/G-IV генотипа A/AFRICA/G-IV. Определены значения уровня гуморального иммунитета с применением разработанной тест-системы ИФА, а также данные сыворотки были исследованы в реакции микронейтрализации (РМН) в чувствительной перевиваемой монослойной клеточной линии IB-RS-2, рекомендованной МЭБ (OIE) [2]. Полученные результаты отражены в таблице 6, из которой следует, что степень корреляции результатов разработанной тест-системы ИФА (предлагаемое изобретение) и классического метода РМН высокая (приближено к 100%).

Пример 6. Определение диагностических показателей разработанной тест-системы для количественного определения уровня гуморального иммунитета в сыворотках крови животных против антигена вируса ящура штамма А №2205/G-IV с применением жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА (предлагаемое изобретение).

Для исследования представленной тест-системы (предлагаемое изобретение) для количественного определения уровня гуморального иммунитета против антигена вируса ящура штамма A №2205/G-IV исследовали стандартные диагностические показатели. Для определения чувствительности предложенной тест-системы анализировали 380 сывороток крови животных, которые являлись заведомо положительными по данным реакции микронейтрализации в чувствительной перевиваемой монослойной клеточной линии почки свиньи IB-RS-2. Уровень антител для данных сывороток крови находилась в диапазоне 5,5-9,5 log₂ SN₅₀. Постановку ИФА проводили, как отражено выше. Разработанной тест-системой (предлагаемое изобретение) определили, что из 380 образцов сывороток крови 379 определены в качестве положительных, а 1 - в качестве отрицательных (уровень гуморального иммунитета по данным ИФА составил 1:24). Для исследования специфичности метода тестировали 202 отрицательных сывороток крови животных. В результате исследования с помощью ИФА (предлагаемое изобретение) определили, что из 202 отрицательных проб - 202 определены в качестве отрицательных. Определили, что в 95%-ном доверительном интервале диагностическая чувствительность (DSe) составила 98,55-99,99%, диагностическая специфичность (DSp) - 98,19-100,00%, k-критерий - 1,000; прогностичность отрицательного результата (NPV) - 96,61-99,93%, общая точность (DAc) - 99,05-100,00% (таблица 7).

Таким образом предлагаемая «Тест-система для количественного определения уровня гуморального иммунитета животных против антигена вируса ящура штамма A №2205/G-IV генотипа A/AFRICA-IV с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА» является специфичной и чувствительной, позволяющей быстро в течение 4 часов провести анализ сывороток крови животных с количественным определением уровня гуморального иммунитета против антигена вируса ящура штамма А №2205/G-IV генотипа A/AFRICA-IV. Данный штамм и соответствующий ему генотип является актуальным и быстро распространяющимся на территории Африканского континента, а также в странах Ближнего Востока. Разработанная тест-система будет направлена на подтверждение высокой эффективности производимых в РФ противоящурных инактивированных вакцин, содержащих антиген данного штамма, и, тем самым, на защиту территории России и граничащих с ней на юге стран от распространения вируса ящура генотипа A/AFRICA/G-IV.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Тест-система для количественного определения уровня гуморального иммунитета животных против антигена вируса ящура штамма A №2205/G-IV генотипа A/AFRICA/G-IV с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА»:

1. Груздев, К.Н. Программа совместных действий по профилактике и борьбе с ящуром животных в странах СНГ / К.Н. Груздев, В.М. Захаров, A.M. Рахманов // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. -Владимир, 2005. - Т. 3. - С. 3-13.

2. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals. -Paris, 2018. - Chapter 2.1.8.

3. Гуленкин, В.М. Экономическая эффективность проведения профилактической вакцинации животных против ящура на территории Российской Федерации / В.М. Гуленкин // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2012. - Т. 10. - С. 31-41.

4. Brooksby, J.В. 1982. Portraits of viruses: foot-and-mouth disease virus. Intervirology 18:1-23.

5. Rueckert, R.R., and E. Wimmer. 1984. Systematic nomenclature of picornavirus proteins. J. Virol. 50:957-959,

6. Grubman, M.J. 1980. The 5' end of foot-and-mouth disease virion RNA contains a protein covalently linked to the nucleotide pUp. Arch. Virol. 63:311-315.

7. Domingo, E., C. Escarmis, E. Baranowski, С.M. Ruiz-Jarabo, E. Carrillo, J. I. Nunez, and F. Sobrino. 2003. Evolution of foot-and-mouth disease virus. Virus Res. 91:47-63.

8. Sobrino, F., M. Davila, J. Ortin, and E. Domingo. 1983. Multiple genetic variants arise in the course of replication of foot-and-mouth disease virus in cell culture. Virology 128:310-318.

9. Динамика развития противоящурного гуморального иммунитета у крупного рогатого скота, иммунизированного трехвалентной сорбированной вакциной типов А, О, Азия-1 / Д.В. Михалишин, Т.Н. Лезова // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2007. - Т. 5. - С. 75-82.

10. Wong C.L., Yong С.Y., Ong Н.К., Но K.L., Tan W.S. Advances in the Diagnosis of Foot-and-Mouth Disease // Front Vet Sci. - 2020 Aug 21. - V.7. - P. 477.

11. Curry S., Abu-Ghazaleh R., Blakemore W., Fry E., Jackson Т., King A., Lea S., Logan D., Newman J., Stuart D. Crystallization and preliminary X-ray analysis of three serotypes of foot-and-mouth disease virus // J. Mol Biol. - 1992. - V. 228(4). -P. 1263-1268.

12. King, A.M., D. McCahon, K. Saunders, J. W. Newman, and W.R. Slade. 1985. Multiple sites of recombination within the RNA genome of foot-and-mouth disease virus. Virus Res. 3:373-384.

13. Tosh, C., D. Hemadri, and A. Sanyal. 2002. Evidence of recombination in the capsid-coding region of type A foot-and-mouth disease virus. J. Gen. Virol. 83:2455-2460.

14. Fry E.E., Stuart D.I., Rowlands D.J. The structure of foot-and-mouth disease virus // Curr Top Microbiol Immunol - 2005. - V. 288. - P. 71-101/

15. Palmenberg A.C. Proteolytic processing of picornaviral polyprotein // Annu Rev Microbiol. - 1990. - V. 44. - P. 603-623.

16. Curry S., Fry E., Blakemore W., Abu-Ghazaleh R., Jackson Т., King A., Lea S., Newman J., Stuart D. Dissecting the roles of VP₀ cleavage and RNA packaging in picornavirus capsid stabilization: the structure of empty capsids of foot-and-mouth disease virus // J. Virol. - 1997. - V. 71(12). - P. 9743-9752.

17. Anon N. Global Strategy for control of foot-and-mouth disease. - In, Bangkok, Thailand, - 2012. - P. 27-29.

18. Saitou N. and Nei M. (1987). The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution 4:406-425.

19. Felsenstein J. (1985). Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap.Evolution 39:783-791.

20. Tamura K., Nei M., and Kumar S. (2004). Prospects for inferring very large phylogenies by using the neighbor-joining method. Proceedings of the National Academy of Sciences (USA) 101:11030-11035.

21. Kumar S., Stecher G., Li M., Knyaz C., and Tamura K. (2018). MEGA X: Molecular Evolutionary Genetics Analysis across computing platforms. Molecular Biology and Evolution 35:1547-1549.

22. Патент РФ №2772713, 24.05.2022 Вакцина для ранней защиты против ящура из штамма А 2205 / G IV культуральная инактивированная эмульсионная // Заявка №2021113565 / Михалишин Д.В., Доронин М.И., Елькина Ю.С., Борисов А.В., Фомина С.Н.

23. Oem J.K., Park J.H., Lee K.N., Kim Y.J., Kye S.J., Park J.Y, Song H.J. Characterization of recombinant foot-and-mouth disease virus pentamer-like structures expressed by baculovirus and their use as diagnostic antigens in a blocking ELISA // Vaccine. - 2007. - V. 25(20). - P. 4112-412.

24. Lewis S.A., Morgan D.O., Grubman M.J. Expression, processing, and assembly of foot-and-mouth disease virus capsid structures in heterologous systems: induction of a neutralizing antibody response in guinea pigs // J. Virol. - 1991. - V. 65(12). - P.6572-6580.

25. Cao Y., Lu Z., Sun J., Bai X., Sun P., Bao H., Chen Y., Guo J., Li D., Liu X., Liu Z. Synthesis of empty capsid-like particles of Asia I foot-and-mouth disease virus in insect cells and their immunogenicity in guinea pigs // Vet. Microbiol. - 2009. -V. 137(1-2).-P. 10-17.

26. Hamblin C, Barnett I.T., Hedger R.S. A new enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of antibodies against foot-and-mouth disease virus. I. Development and method of ELISA // J. Immunol. Methods. - 1986. -V. 93(1).-P. 115-121.

27. Grubman M.J., Moraes M.P., Diaz-San Segundo F., Pena L., de los Santos T. Evading the host immune response: how foot-and-mouth disease virus has become an effective pathogen // FEMS Immunol Med Microbiol. - 2008. - V. 53(1). - P. 8-17.

28. Ma L.N., Zhang J., Chen H.T., Zhou J.H, Ding Y.Z., Liu Y.S. An overview on ELISA techniques for FMD // Virol J. - 2011 Sep 4. - V. 8. - P. 419.

29. Sharma GK, Mahajan S, Matura R, Subramaniam S, Mohapatra JK, Pattnaik B. Quantitative single dilution liquid phase blocking ELISA for sero-monitoring of foot-and-mouth disease in India. Biologicals. 2015 May;43(3): 158-64.

30. Robiolo B, La Torre J, Duffy S, Leon E, Seki C, Torres A, Mattion N. Quantitative single serum-dilution liquid phase competitive blocking ELISA for the assessment of herd immunity and expected protection against foot-and-mouth disease virus in vaccinated cattle. J Virol Methods. 2010 Jun;166(1-2):21-7.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="FMDV - 2205 -

AFRICA-IV .xml" softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.1.2"

productionDate="2022-09-20">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2022122687</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2022-08-22</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>048403</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2022122687</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2022-08-22</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное

бюджетное учреждение &quot;Федеральный центр охраны здоровья

животных&quot; (ФГБУ ВНИИЗЖ)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>FGBI ARRIAH</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Доронин Максим

Игоревич</InventorName>

<InventorNameLatin>Doronin Maksim Igorevich</InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Тест-система для количественного

определения уровня гуморального иммунитета животных против антигена

вируса ящура штамма А №2205/G-IV генотипа A/AFRICA-IV с помощью

жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта

ИФА</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>2</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>639</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..639</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic RNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q1">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>accactgcaacaggggagtctgcagaccctgtcaccaccaccgtggaga

actacggcggtgagacacaacaccaacgacggtaccacacggacgttggctttataatggacagatttgt

gaaggtgagcagttccacccccacacacgtcattgatctcatgcaaacccaccaacacgggctggtaggt

gcgttgttgcgttcagccacctactatttctctgatctggagatcgtggtaagacaccaggggaacctga

cctgggtgcccaacggcgccccggagggcgccctctcgaacacgggcaaccccacagcttaccacaaagc

gccgttcacgaggctggcacttccctacaccgcgccacaccgcgtgctggcgacagtgtacaacgggacg

accaagtacacggcagatgcttcacccaggcgaggtgacctgggagcccttgcggcgagactcgccacac

agctcccctcctctttcaactatggggcgctgcgcgctgagaccatccacgaggttctcgtgcgcatgaa

gcgggccgagctttactgccccagaccgctgttgtcaacagaggtgagttcagcggacagacacaaacag

aagatcattgcgccagccaaacagctcctt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>213</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..213</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>TTTAGESADPVTTTVENYGGETQTQRRHHTDVGFIMDRFVKITPVNPTH

VIDLMQTHQHALVGALLRAATYYFSDLEIVVRHEGNLTWVPNGAPEGALANTSNPTAYHRQPFTRLALPY

TAPHRVLATVYNGVSKYSTTGGGRRGDLGSLAARVAAQLPSSFNFGAIRATTIHELLVRMKRAELYCPRP

LLAVEVSSQDRHKQKIIAPAKQLL</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Описана тест-система для количественного определения уровня гуморального иммунитета животных против антигена вируса ящура штамма A №2205/G-IV генотипа A/AFRICA/G-IV с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА. Преимуществом разработанной тест-системы является продолжительный срок хранения (не менее 3 лет) за счет получения лиофильно высушенных иммуноспецифических составляющих. Предложенная тест-система обеспечивает создание современной, специфической и чувствительной тест-системы, предназначенной для количественного определения уровня гуморального иммунитета против антигена вируса ящура штамма A №2205/G-IV нового генотипа A/AFRICA/G-IV в широком диапазоне 4,5-11,0 log₂ SN₅₀ для последующего анализа иммунного статуса животных в отношении ящура. Данный штамм и соответствующий ему генотип является актуальным и быстро распространяющимся на территории Африканского континента, а также в странах Ближнего Востока. Разработанная тест-система направлена на подтверждение высокой эффективности производимых в РФ противоящурных инактивированных вакцин, содержащих антиген данного штамма, и тем самым на защиту территории России и граничащих с ней на юге стран от распространения изолятов вируса ящура генотипа A/AFRICA-IV. 1 з.п. ф-лы, 4 ил., 7 табл., 6 пр.

1. Тест-система для количественного определения уровня гуморального иммунитета животных против антигена вируса ящура штамма A №2205/G-IV генотипа A/AFRICA/G-IV с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА, содержащая:

- иммуноспецифические лиофилизированные составляющие: культуральный инактивированный вирус ящура штамма A №2205/G-IV генотипа A/AFRICA/G-IV с активностью в ИФА 1:2500; сенсибилизирующие антитела - иммуноглобулины G кролика против вируса ящура штамма A №2205/G-IV генотипа A/AFRICA/G-IV с активностью в ИФА 1:9000; детекторные антитела - иммуноглобулины G морской свинки против вируса ящура штамма A №2205/G-IV генотипа A/AFRICA/G-IV с активностью в ИФА 1:4000; контроль 1 - сильноположительная сыворотка крови телят к антигену вируса ящура штамма A №2205/G-IV генотипа A/AFRICA/G-IV с процентом ингибиции 75-100%; контроль 2 - положительная сыворотка крови телят к антигену вируса ящура штамма A №2205/G-IV генотипа A/AFRICA/G-IV с процентом ингибиции от 50 до 74,9%; контроль 3 - отрицательная сыворотка крови телят, не содержащая антитела к вирусу ящура; блокирующая сыворотка крови крупного рогатого скота; антивидовой конъюгат - иммуноглобулины кролика против Ig G морской свинки, конъюгированные с пероксидазой хрена, с активностью в ИФА 1:2500;

- неспецифические компоненты: буферный раствор на основе карбоната и гидрокарбоната натрия с рН 9,5-9,6, 20-кратный концентрат буферного раствора, хромогенный субстрат - 2,2-азино-ди-(3-этилбензоаминосульфоновая кислота), «стоп»-раствор - 0,5%-ный раствор кокосульфата натрия;

отличающаяся тем, что в качестве антигена вируса ящура содержит культуральный инактивированный вирус ящура штамма A №2205/G-IV нового генотипа A/AFRICA/G-IV;

и для определения процента ингибиции используется модифицированная формула: ПИ, %=(1-($D_{сыворотки}-$D_КК)/($D_КА-$D_КК))×100, при этом уровень гуморального иммунитета определяется как максимальное разведение сыворотки крови, для которой значение процента ингибиции составляет ≥50%.

2. Тест-система по п. 1, которая является специфичной и чувствительной, позволяющей быстро в течение 4 часов провести анализ сывороток крови животных с количественным определением уровня гуморального иммунитета против вируса ящура штамма A №2205/G-IV нового генотипа A/AFRICA/G-IV и количественно определять уровень гуморального иммунитета в диапазоне 4,5-11,0 log₂ SN₅₀.