ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

По настоящей заявке испрашивается приоритет Предварительной патентной заявки США No.62/947200, поданной 12 декабря 2019 г., Предварительной патентной заявки США No. 62/947202, поданной 12 декабря 2019 г., и Предварительной патентной заявки США No. 62/947204, поданной 12 декабря 2019 г. Полное содержание каждой из предварительных патентных заявок приведено в настоящем описании в качестве ссылки в полном объеме.

ВКЛЮЧЕНИЕ В КАЧЕСТВЕ ССЫЛКИ списка последовательностей, ПРЕДСТАВЛЕННОГО В ВИДЕ текстового файлА

Список последовательностей представлен с настоящей заявкой в виде текстового файла, «PC040318A_SeqListing_ST25.txt», созданного 3 ноября 2020 г. и имеющего размер 152 КБ. Полное содержание текстового файла приведено в настоящем описании в качестве ссылки.

Уровень техники

Настоящее изобретение относится к онколитическим вирусам в общем и к рекомбинантному онколитическому вирусу осповакцины с улучшенными противоопухолевыми свойствами в частности.

Онколитические вирусы (OV) представляют собой вирусы, которые реплицируются избирательно или более эффективно в злокачественных клетках, чем в незлокачественных клетках. Эта группа вирусов включает вирусы, обнаруженные в природе (например, вирус дикого типа или нативный вирус), так же как вирусы, сконструированные из нативного вируса посредством разрушений генов или добавлений генов, таким образом, чтобы улучшать его противоопухолевые свойства, такие как избирательность для опухолей или предпочтительная репликация в клетках опухолей, тропизм к хозяину, прикрепление к поверхности, лизис и распространение. Живые реплицирующиеся OV тестировали в клинических исследованиях для множества злокачественных опухолей человека. OV могут индуцировать противоопухолевые иммунные ответы, так же как прямой лизис клеток опухолей (т.е., онколизис). Общераспространенные OV включают ослабленные штаммы вируса простого герпеса (HSV), аденовируса (Ad), вируса кори (MV), вируса Коксаки (CV), вируса везикулярного стоматита (VSV) и вируса осповакцины (VV).

Вирус осповакцины, прототипический член рода Orthopoxvirus, реплицируется в цитоплазме клетки-хозяина. В ходе репликации, продуцируются три морфологически и антигенно различные формы вируса: внутриклеточные зрелые вирионы (IMV), внутриклеточные оболочечные вирионы (IEV) и внеклеточные вирионы. Подгруппа IMV, первое продуцируемое инфекционное потомство, мигрируют к транс-сети Гольджи (TGN), где они оборачиваются двумя дополнительными мембранами с получением IEV. IEV транспортируются через цитоплазму к периферии клетки, где самая внешняя мембрана сливается с плазматической мембраной для высвобождения формы с двойной мембраной, названной EV. EV, которые остаются на клеточной поверхности, называют ассоциированными с клетками оболочечными вирионами (CEV), в то время как EV, которые больше не прикреплены к клеточной поверхности, называют внеклеточными оболочечными вирионами (EEV). IMV является преобладающей инфекционной формой и, как считают, является ответственным за распространение между хозяевами; CEV считают играющим роль в распространении от клетки к клетке; и EEV считают важным для широкого распространения внутри организма хозяина.

VV содержит двухцепочечный ДНК-геном приблизительно 200 т.п.о., который, как прогнозировано, кодирует более чем 200 открытых рамок считывания. Семь белков, кодируемых вирусом, а именно, A33, A34, A36, A56, B5, F12 и F13, являются уникальными для оболочечных форм (IEV/EEV/CEV) вируса. Открытые рамки считывания вируса осповакцины обозначены посредством заглавной буквы, показывающей фрагмент, образованный рестрикционной эндонуклеазой HindIII, числа, показывающего положение фрагмента HindIII, и буквы (L или R), показывающей направление транскрипции, например, A34R. Соответствующий белок обозначен посредством заглавной буквы и числа, например, A34. Специфические для мембраны внеклеточного вириона гликопротеины A33, A34 и B5 экспонированы на поверхности EV и играют роли в ходе формирования внеклеточного вириона и последующей инфекции.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к компетентному по репликации, рекомбинантному онколитическому вирусу осповакцины (далее в настоящем описании обозначенному как «онколитический вирус осповакцины» или «OVV»), содержащему нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант вирусного полипептида, где вариант вирусного полипептида обеспечивает увеличенное распространение вируса или увеличенную продукцию EEV. Термин «усиленный», в рамках изобретения, имеет одинаковое значение и использован взаимозаменяемо с «увеличенный» в настоящем описании. В некоторых аспектах, OVV содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант вирусного полипептида, выбранную из варианта полипептида A33, нуклеотидной последовательности, кодирующей вариант полипептида A34, нуклеотидной последовательности, кодирующей вариант полипептида B5, или любую комбинацию нуклеотидных последовательностей выше, где вариант полипептида A33, вариант полипептида A34 и вариант полипептида B5 содержат 1, 2, 3, 4, 5, 6 или более мутаций аминокислот (таких как замены, делеции или вставки), обеспечивающих увеличенное распространение вируса или увеличенную продукцию EEV, по сравнению с соответствующим полипептидом без соответствующих мутаций. В некоторых вариантах осуществления, OVV сконструирован на основе штамма Copenhagen. В других вариантах осуществления, OVV сконструирован на основе штамма Western Reserve.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к композициям, содержащим OVV. Настоящее изобретение также относится к способам индукции онколизиса у индивидуума, имеющего опухоль, включающим введение индивидууму эффективного количества OVV по настоящему изобретению или композиции по настоящему изобретению. Настоящее изобретение также относится к OVV или композиции по настоящему изобретению для применения в способах индукции онколизиса у индивидуума, имеющего опухоль, и к применению OVV или композиции по настоящему изобретению в изготовлении лекарственного средства для применения в таких способах.

Краткое описание чертежей

На ФИГ. 1A-1C представлены выравнивания нуклеотидных последовательностей A33R и аминокислотных последовательностей A33 для распространенных штаммов вируса осповакцины. A и B) нуклеотидные последовательности A33R для Copenhagen (SEQ ID NO:1), Ankara (SEQ ID NO:2), IHD-J (SEQ ID NO:3), Lister (SEQ ID NO:4), Tian Tan (SEQ ID NO:5), Western Reserve (SEQ ID NO:6) и Wyeth (SEQ ID NO: 7), показывающие локализации нуклеотидов между генами и на протяжении генов. C) аминокислотные последовательности A33 для Copenhagen (SEQ ID NO:8), Ankara (SEQ ID NO:9), IHD-J (SEQ ID NO:10), Lister (SEQ ID NO:11), Tian Tan (SEQ ID NO:12), Western Reserve (SEQ ID NO:13) и Wyeth (SEQ ID NO:14), показывающие локализации аминокислот между белками и на протяжении белков.

На ФИГ. 2A-2C представлены выравнивания нуклеотидных последовательностей A34R и аминокислотных последовательностей A34 для распространенных штаммов вируса осповакцины. A и B) нуклеотидные последовательности A34R для Copenhagen (SEQ ID NO:15), Ankara (SEQ ID NO:16), IHD-J (SEQ ID NO:17), Lister (SEQ ID NO:18), Tian Tan (SEQ ID NO:19), Western Reserve (SEQ ID NO:20) и Wyeth (SEQ ID NO: 21), показывающие локализации нуклеотидов между генами и на протяжении генов. C) аминокислотные последовательности A34 для Copenhagen (SEQ ID NO:22), Ankara (SEQ ID NO:23), IHD-J (SEQ ID NO:24), Lister (SEQ ID NO:25), Tian Tan (SEQ ID NO:26), Western Reserve (SEQ ID NO:27) и Wyeth (SEQ ID NO:28), показывающие локализации аминокислот между белками и на протяжении белков.

На ФИГ. 3A-3D представлены выравнивания нуклеотидных последовательностей A56R и аминокислотных последовательностей A56 для распространенных штаммов вируса осповакцины. A-C) нуклеотидные последовательности A56R для Copenhagen (SEQ ID NO:29), Ankara (SEQ ID NO:30), IHD-J (SEQ ID NO:31), Lister (SEQ ID NO:32), Tian Tan (SEQ ID NO:33), Western Reserve (SEQ ID NO:34) и Wyeth (SEQ ID NO: 35), показывающие локализации нуклеотидов между генами и на протяжении генов. D) аминокислотные последовательности A56 для Copenhagen (SEQ ID NO:36), Ankara (SEQ ID NO:37), IHD-J (SEQ ID NO:38), Lister (SEQ ID NO:39), Tian Tan (SEQ ID NO:40), Western Reserve (SEQ ID NO:41) и Wyeth (SEQ ID NO:42), показывающие локализации аминокислот между белками и на протяжении белков.

На ФИГ. 4A-4D представлены выравнивания нуклеотидных последовательностей B5R и аминокислотных последовательностей B5 для распространенных штаммов вируса осповакцины. A-C) нуклеотидные последовательности B5R для Copenhagen (SEQ ID NO:43), Ankara (SEQ ID NO:44), IHD-J (SEQ ID NO:45), Lister (SEQ ID NO:46), Tian Tan (SEQ ID NO:47), Western Reserve (SEQ ID NO:48) и Wyeth (SEQ ID NO: 49), показывающие локализации нуклеотидов между генами и на протяжении генов. D) аминокислотные последовательности B5 для Copenhagen (SEQ ID NO:50), Ankara (SEQ ID NO:51), IHD-J (SEQ ID NO:52), Lister (SEQ ID NO:53), Tian Tan (SEQ ID NO:54), Western Reserve (SEQ ID NO:55) и Wyeth (SEQ ID NO:56), показывающие локализации аминокислот между белками и на протяжении белков.

На ФИГ. 5 представлен схематический пример одной стадии способа направленной эволюции, используемого для идентификации вариантов EEV in vitro.

На ФИГ. 6 представлены данные частоты конкретных вариантов вируса осповакцины в различных циклах способа направленной эволюции для идентификации вариантов, способных к увеличенному распространению и продукции EEV после инфекции различных первичных клеток злокачественных опухолей человека и стимулированных посредством VEGF эндотелиальных клеток.

На ФИГ. 7A-7B представлены данные распространения вируса и продукции EEV для вариантов вируса осповакцины, содержащих замены A33 и A34.

На ФИГ. 8A-8D представлены данные продукции вируса осповакцины для инфекционного вируса, высвобожденного в супернатант на ранних стадиях цикла инфекции (потенциально, EEV) в репрезентативных линиях клеток злокачественных опухолей человека.

На ФИГ. 9A-9B представлены данные распространения вируса осповакцины в репрезентативных линиях клеток злокачественных опухолей человека.

На ФИГ. 10A-10B представлены данные для различных замен и комбинаций замен вариантов вируса осповакцины, в отсутствие замены K151E в A34, применительно к продукции EEV и распространению вируса.

На ФИГ. 11A-11B представлены данные для различных замен и комбинаций замен вариантов вируса осповакцины, в дополнение к замене K151E в A34, применительно к продукции EEV и распространению вируса.

На ФИГ. 12A-12B представлены данные для различных вариантов вируса осповакцины, применительно к продукции физических EEV и специфической инфекционности в линии клеток HeLa S3 (аденокарциномы шейки матки).

На ФИГ. 13A-13B представлены данные для различных замен вариантов вируса осповакцины, в комбинации с заменой K151E в A34, в штамме Western Reserve, применительно к продукции EEV и распространению вируса.

На ФИГ. 14 представлены данные частоты специфических вариантов вируса осповакцины в конечном цикле способа направленной эволюции для идентификации вариантов, способных к увеличенному распространению вируса и продукции EEV после инфекции и отбора в клетках колоректального рака человека HCT-116.

На ФИГ. 15A-15F представлены данные распространения вируса и продукции EEV для дополнительных вариантов вируса осповакцины, содержащих замены A34 и A56.

На ФИГ. 16A-16B представлены выравнивания аминокислотных последовательностей A33 и A34 для вариантов вируса осповакцины. A) аминокислотные последовательности A33 для Copenhagen (SEQ ID NO:8), замены M63R (SEQ ID NO:57), замены A88D (SEQ ID NO:58), замены E129M (SEQ ID NO:59), и замен A88D и E129M (SEQ ID NO:60), показывающие локализации аминокислот между белками и на протяжении белков. B) аминокислотные последовательности A34 для Copenhagen (SEQ ID NO:22), замены M66T (SEQ ID NO:61), замены F94H (SEQ ID NO:62), замены K151E (SEQ ID NO:63), замен F94H и K151E (SEQ ID NO:64), замены R84G (SEQ ID NO:65), замены R91A (SEQ ID NO:81), замены R91S (SEQ ID NO:66) и замены T127E (SEQ ID NO:67), показывающие локализации аминокислот между белками и на протяжении белков.

На ФИГ. 17 представлены данные частоты для специфического вируса осповакцины в финальном цикле способа направленной эволюции для идентификации вариантов, способных к увеличенному распространению вируса и продукции EEV после инфекции клеток колоректального рака человека Colo 205 с использованием библиотек вирусов осповакцины.

На ФИГ. 18A-18B представлены данные частоты для специфических вариантов вируса осповакцины в конечном цикле способа направленной эволюции для идентификации вариантов, способных к увеличенному распространению вируса и продукции EEV после инфекции клеток рака молочной железы человека MDA-MB-231, в отсутствие или в присутствии сыворотки от доноров, вакцинированных вирусом осповакцины.

На ФИГ. 19A-19B представлены данные распространения вируса и продукции EEV для вариантов вируса осповакцины, содержащих замены B5.

На ФИГ. 20A-20D представлены данные для инфекционных вирионов вируса осповакцины в супернатанте (потенциальных EEV) в репрезентативных линиях клеток злокачественных опухолей человека.

На ФИГ. 21A-21B представлены данные частоты специфических вариантов вируса осповакцины в способе направленной эволюции для идентификации вариантов, способных к увеличенному распространению in vivo.

На ФИГ. 22A-22D представлены данные распространения вируса и продукции EEV дополнительных вариантов вируса осповакцины, содержащих замены A33/A34 или B5.

На ФИГ. 23 представлено выравнивание аминокислотных последовательностей B5 для вариантов вируса осповакцины. Последовательности белка B5 для Copenhagen (SEQ ID NO:50), замены N94T (SEQ ID NO:68), замены S197F (SEQ ID NO:82), замены S197V (SEQ ID NO:83), замены S199M (SEQ ID NO:69), замены S273I (SEQ ID NO:70), замен N39G и S273I (SEQ ID NO:71), замен L90R и S273V (SEQ ID NO:72), замен K229C и S273L (SEQ ID NO:73), замен V233D, I236L, V238W, T240Y и E243R (SEQ ID NO:74), замен I236P, V238R, T240R и E243G (SEQ ID NO:75), замен N241T, E243V, V247S, G250R и A276F (SEQ ID NO:76), замен N241G, E243S, V247W, D248Y, G250A и A276F (SEQ ID NO:77), замен D263A, E270S, E272G и E275F (SEQ ID NO:78), и замен D263V, E268T, E270G, E272P и E275S (SEQ ID NO:79), показывающие локализации аминокислот между белками и на протяжении белков.

На ФИГ. 24 представлено выравнивание аминокислотных последовательностей A56 для вариантов вируса осповакцины. Аминокислотные последовательности A56 для Copenhagen (SEQ ID NO:36) и замены I269F (SEQ ID NO:80), показывающие локализации аминокислот между белками и на протяжении белков.

Подробное описание

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Перед описанием настоящего изобретения, определено несколько терминов, используемых в контексте настоящего изобретения. В дополнение к этим терминам, другие определены в другом месте в настоящем описании, по необходимости. Если в настоящем описании явно не определено иное, термины из области техники, используемой в настоящем описании, имеют свои известные в данной области значения.

Термин «онколитический» вирус осповакцины относится к вирусу осповакцины, который предпочтительно инфицирует и уничтожает злокачественные клетки, по сравнению с нормальными (незлокачественными) клетками.

Термин «гетерологичный» относится к нуклеотидной или полипептидной последовательности, не обнаруженной в нативных нуклеиновой кислоте или белке, соответственно. Например, в контексте рекомбинантного вируса осповакцины по настоящему изобретению, нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую «гетерологичный» иммуномодулирующий полипептид, представляет собой нуклеиновую кислоту, не обнаруженную в природе в вирусе осповакцины, т.е., кодированный иммуномодулирующий полипептид не кодирован встречающимся в природе вирусом осповакцины.

Термины «полинуклеотид» и «нуклеиновая кислота», использованные взаимозаменяемо в настоящем описании, относятся к полимерной форме нуклеотидов любой длины, либо рибонуклеотидов, либо дезоксирибонуклеотидов. Таким образом, этот термин включает, но без ограничения, одно-, двух- или многоцепочечную ДНК или РНК, геномную ДНК, кДНК, гибриды ДНК-РНК, или полимер, содержащий пуриновые и пиримидиновые основания или другие природные, химически или биохимически модифицированные, неприродные, или дериватизированные нуклеотидные основания.

В рамках изобретения, термины «лечение», «осуществление лечения» и т.п., относятся к получению желательного фармакологического и/или физиологического эффекта. Эффект может являться профилактическим в отношении полного или частичного предотвращения заболевания или его симптома, и/или может являться терапевтическим в отношении полного или частичного излечения заболевания и/или неблагоприятного эффекта, который можно приписать заболеванию. «Лечение», в рамках изобретения, относится к любому лечению заболевания у млекопитающего, например, у человека, и включает: (a) предотвращение возникновения заболевания у субъекта, который может являться предрасположенным к заболеванию или подверженным риску получения заболевания, но еще не был диагностирован как имеющий его; (b) ингибирование заболевания, т.е., остановку его развития; и (c) облегчение заболевания, т.е., вызов регрессии заболевания.

Термины «индивидуум», «субъект», «хозяин» и «пациент», используемые взаимозаменяемо в настоящем описании, относятся к млекопитающему, включая, но без ограничения, мышиных (например, крыс, мышей), зайцеобразных (например, кроликов), нечеловекообразных приматов, человека, собачьих, кошачьих, копытных (например, лошадиных, бычьих, овечьих, свиных, козьих) и т.д.

«Терапевтически эффективное количество» или «эффективное количество» относится к количеству средства (например, компетентного по репликации, рекомбинантного онколитического вируса осповакцины по настоящему изобретению), или объединенным количествам двух средств (например, компетентного по репликации, рекомбинантного онколитического вируса осповакцины по настоящему изобретению и второго лекарственного средства), которое, при введении млекопитающему или другому субъекту для лечения заболевания, является достаточным для осуществления такого лечения заболевания. «Терапевтически эффективное количество» может меняться в зависимости от средств(а), заболевания и его тяжести, и возраста, массы и т.д., субъекта, подлежащего лечению.

Термин «вариант» полипептида относится к полипептиду, аминокислотная последовательность которого имеет по меньшей мере 90%, но менее чем 100%, идентичность с аминокислотной последовательностью эталонного полипептида; при условии, что указанный вариант имеет биологическую активность, как определено в настоящем описании. Вариант может возникать при модификации аминокислотной последовательности эталонного полипептида посредством таких модификаций, как вставка, замена или делеция одной или более аминокислот. Соответственно, термин «вариант» полипептида включает фрагменты эталонного полипептида, содержащие достаточное количество непрерывных аминокислотных остатков для обеспечения желательного биологического свойства.

Термин «замена» относится к замене одной аминокислоты в полипептиде на другую аминокислоту. В контексте настоящего изобретения, замена в варианте указана как: исходная аминокислота-положение-замененная аминокислота. Соответственно, обозначение «K151E» означает, что вариант содержит замену лизина (K) на глутаминовую кислоту (E) в положении аминокислоты варианта, соответствующем аминокислоте в положении 151 в исходном полипептиде.

Перед дальнейшим описанием настоящего изобретения, следует понимать, что это изобретение не является ограниченным никакими описанными конкретными вариантами осуществления, поскольку они могут, разумеется, изменяться. Следует понимать также, что терминология, используемая в настоящем описании, предназначена только для цели описания конкретных вариантов осуществления, и не предназначена, чтобы являться ограничивающей, поскольку объем настоящего изобретения ограничен только прилагаемой формулой изобретения.

Когда представлен диапазон значений, понятно, что каждое промежуточное значение, до десятой единицы нижнего предела, если контекст явно не требует иного, между верхним и нижним пределами этого диапазона, и любым другим указанным или промежуточным значением в этом указанном диапазоне, включено в изобретение. Верхний и нижний пределы этих меньших диапазонов могут быть независимо включены в меньшие диапазоны, а также включены в объект изобретения, ограниченный любым конкретно исключенным пределом в указанном диапазоне. Когда указанный диапазон включает один или оба предела, диапазоны, исключающие любой или оба из этих включенных пределов, также включены в изобретение.

Если не определено иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют такое же значение, какое является общепринятым для специалиста в области, к которой относится это изобретение. Хотя любые способы и материалы, сходные или эквивалентные с описанными в настоящем описании, можно также использовать в практическом осуществлении или тестировании настоящего изобретения, предпочтительные способы и материалы описаны в настоящее время. Содержание всех публикаций, упомянутых в настоящем описании, приведено в качестве ссылки с целью раскрытия и описания способов и/или материалов, в связи с которыми процитированы публикации.

Следует отметить, что как используют в настоящем описании и прилагаемой формуле изобретения, формы единственного числа включают объекты ссылки множественного числа, если контекст явно не требует иного. Таким образом, например, ссылка на «вирус осповакцины» включает множество таких вирусов осповакцины и, ссылка на «полипептид A33» включает ссылку на один или несколько полипептидов A33 и их эквивалентов, известных специалисту в данной области, и т.д. Кроме того, следует отметить, что пункты формулы изобретения можно составлять для исключения любого необязательного элемента. Таким образом, это утверждение предназначено, чтобы служить предшествующим основанием для использования такой исключительной терминологии, как «единственно», «только» и т.п., в связи с перечислением заявленных элементов, или использования «отрицательного» ограничения.

Понятно, что конкретные признаки изобретения, которые, для ясности, описаны в контексте отдельных вариантов осуществления, могут быть также представлены в комбинации в одном варианте осуществления. И наоборот, различные признаки изобретения, которые, для краткости, описаны в контексте одного варианта осуществления, могут быть также представлены по отдельности или в любой подходящей подкомбинации. Все комбинации вариантов осуществления, относящихся к изобретению, конкретно включены в настоящее изобретение и раскрыты в настоящем описании, точно также, как если бы все без исключения комбинации были индивидуально и явно описаны. Кроме того, все подкомбинации различных вариантов осуществления и их элементов также конкретно включены в настоящее изобретение и раскрыты в настоящем описании, точно также, как если бы все без исключения подкомбинации были индивидуально и явно описаны в настоящем описании.

Публикации, обсуждаемые в настоящем описании, представлены только по их описаниям до даты подачи настоящей заявки. Ничего в этом описании не следует рассматривать как допущение, что настоящее изобретение неправомочно датировать задним числом такую публикацию на основании предшествующего изобретения. Кроме того, представленные даты публикации могут отличаться от фактических дат публикации, которые могут нуждаться в независимом подтверждении.

Онколитический вирус осповакцины

Настоящее изобретение относится к компетентному по репликации, рекомбинантному онколитическому вирусу осповакцины (также обозначенному как «онколитический вирус осповакцины», или «OVV»), имеющему желательные онколитические свойства. Он может происходить из любого штамма вируса осповакцины, предпочтительно, штаммов Elstree, Wyeth, Copenhagen и Western Reserve. Если не указано иное, номенклатура генов, используемая в настоящем описании, представляет собой номенклатуру для штамма осповакцины Copenhagen. OVV можно получать из исходного вируса осповакцины посредством изменения одного или нескольких вирусного гена(ов), которое изменяет продукцию, активность, функцию или любые другие свойства продукта гена (такого как делеция, вставка, замена одного или нескольких нуклеотидов в вирусном гене или его регуляторных элементах) и/или вставка одного или нескольких трансгенов, кодирующих экзогенные полипептиды (т.е., полипептиды, в природе не экспрессируемые вирусом).

В некоторых аспектах, настоящее изобретение относится к OVV, содержащему нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант вирусного полипептида, где вариант вирусного полипептида обеспечивает одно или несколько улучшенных онколитических свойств вируса, таких как увеличенное распространение вируса или увеличенная продукция EEV. Эффекты варианта вирусного полипептида на распространение вируса или продукцию EEV можно определять с использованием способов, описанных в примерах, представленных в описании, так же как любых других пригодных способов, известных в данной области.

В некоторых вариантах осуществления, OVV содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A33, где вариант полипептида A33 обеспечивает увеличенное распространение вируса и/или увеличенную продукцию EEV, по сравнению с контрольным вирусом осповакцины, который не содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A33 (например, по сравнению с контрольным вирусом осповакцины, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид A33 дикого типа, такой как полипептид A33, имеющий аминокислотную последовательность, изображенную на ФИГ. 1C). В некоторых других вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к OVV, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A34, где вариант полипептида A34 обеспечивает увеличенное распространение вируса и/или увеличенную продукцию EEV, по сравнению с контрольным вирусом осповакцины, который не содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A34 (например, по сравнению с контрольным вирусом осповакцины, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид A34 дикого типа, такой как полипептид A34, имеющий аминокислотную последовательность, изображенную на ФИГ. 2C). В некоторых дополнительных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к OVV, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида B5, содержащий одну или более аминокислотных замен, обеспечивающих увеличенное распространение вируса и/или продукцию EEV, по сравнению с контрольным вирусом осповакцины, который не включает нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида B5 (например, по сравнению с контрольным вирусом осповакцины, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид B5 дикого типа, такой как полипептид B5, имеющий аминокислотную последовательность, изображенную на ФИГ. 4D). В некоторых других вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к OVV, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A33, нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A34, и нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида B5, в любых комбинациях. Примеры пригодного контроля включают IGV-007 и IGV-006, как описано в примерах. Примеры вариантов полипептида A33, вариантов полипептида A34 и вариантов полипептида B5, обеспечивающих увеличенное распространение вируса и/или продукцию EEV, подробно описаны ниже.

В некоторых случаях, OVV по настоящему изобретению содержит a) нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A33, где вариант полипептида A33 обеспечивает увеличенное распространение вируса и/или увеличенную продукцию EEV, по сравнению с контрольным вирусом осповакцины, который не содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A33; b) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид A34, который не включает никаких аминокислотных замен, обеспечивающих увеличенное распространение вируса и/или увеличенную продукцию EEV; и c) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид B5, который не включает никаких аминокислотных замен, обеспечивающих увеличенное распространение вируса и/или увеличенную продукцию EEV. В некоторых случаях, OVV по настоящему изобретению содержит: a) нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A33, где вариант полипептида A33 обеспечивает увеличенное распространение вируса и/или увеличенную продукцию EEV, по сравнению с контрольным вирусом осповакцины, который не содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A33; b) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид A34 дикого типа (например, полипептид A34, имеющий природную аминокислотную последовательность); и c) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид B5 дикого типа (например, полипептид B5, имеющий природную аминокислотную последовательность).

В некоторых случаях, OVV по настоящему изобретению содержит: a) нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A34, где вариант полипептида A34 обеспечивает увеличенное распространение вируса и/или увеличенную продукцию EEV, по сравнению с контрольным вирусом осповакцины, который не содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A34; b) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид A33, который не включает никаких аминокислотных замен, обеспечивающих увеличенное распространение вируса и/или увеличенную продукцию EEV (например, полипептид A33 дикого типа); и c) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид B5, который не включает никаких аминокислотных замен, обеспечивающих увеличенное распространение вируса и/или увеличенную продукцию EEV (например, полипептид B5 дикого типа). В некоторых случаях, OVV по настоящему изобретению содержит: a) нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A34, где вариант полипептида A34 обеспечивает увеличенное распространение вируса и/или увеличенную продукцию EEV, по сравнению с контрольным вирусом осповакцины, который не содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A34; b) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид A33 дикого типа (например, полипептид A33, имеющий природную аминокислотную последовательность); и c) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид B5 дикого типа (например, полипептид B5, имеющий природную аминокислотную последовательность).

В некоторых случаях, OVV по настоящему изобретению содержит: a) нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида B5, где вариант полипептида B5 обеспечивает увеличенное распространение вируса и/или увеличенную продукцию EEV, по сравнению с контрольным вирусом осповакцины, который не содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида B5; b) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид A33, который не включает никаких аминокислотных замен, обеспечивающих увеличенное распространение вируса и/или увеличенную продукцию EEV; и c) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид A34, который не включает никаких аминокислотных замен, обеспечивающих увеличенное распространение вируса и/или увеличенную продукцию EEV. В некоторых случаях, OVV по настоящему изобретению содержит: a) нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида B5, где вариант полипептида B5 обеспечивает увеличенное распространение вируса и/или увеличенную продукцию EEV, по сравнению с контрольным вирусом осповакцины, который не содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида B5; b) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид A33 дикого типа (например, полипептид A33, имеющий природную аминокислотную последовательность); и c) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид A34 дикого типа (например, полипептид A34, имеющий природную аминокислотную последовательность).

В некоторых случаях, OVV по настоящему изобретению содержит: a) нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A33, где вариант полипептида A33 обеспечивает увеличенное распространение вируса и/или увеличенную продукцию EEV, по сравнению с контрольным вирусом осповакцины, который не содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A33 (например, по сравнению с контрольным вирусом осповакцины, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид A33 дикого типа, такой как полипептид A33, имеющий аминокислотную последовательность, изображенную на ФИГ. 1C); b) нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A34, где вариант полипептида A34 обеспечивает увеличенное распространение вируса и/или увеличенную продукцию EEV, по сравнению с контрольным вирусом осповакцины, который не содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A34 (например, по сравнению с контрольным вирусом осповакцины, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид A34 дикого типа, такой как полипептид A34, имеющий аминокислотную последовательность, изображенную на ФИГ. 2C); и c) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид B5 дикого типа (например, полипептид B5, имеющий природную аминокислотную последовательность).

В некоторых случаях, OVV по настоящему изобретению содержит: a) нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A33, где вариант полипептида A33 обеспечивает увеличенное распространение вируса и/или увеличенную продукцию EEV, по сравнению с контрольным вирусом осповакцины, который не содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A33 (например, по сравнению с контрольным вирусом осповакцины, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид A33 дикого типа, такой как полипептид A33, имеющий аминокислотную последовательность, изображенную на ФИГ. 1C); b) нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида B5, где вариант полипептида B5 обеспечивает увеличенное распространение вируса и/или увеличенную продукцию EEV, по сравнению с контрольным вирусом осповакцины, который не содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида B5 (например, по сравнению с контрольным вирусом осповакцины, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид B5 дикого типа, такой как полипептид B5, имеющий аминокислотную последовательность, изображенную на ФИГ. 4D); и c) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид A34 дикого типа (например, полипептид A34, имеющий природную аминокислотную последовательность).

В некоторых случаях, OVV по настоящему изобретению содержит: a) нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A34, где вариант полипептида A34 обеспечивает увеличенное распространение вируса и/или увеличенную продукцию EEV, по сравнению с контрольным вирусом осповакцины, который не содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A34 (например, по сравнению с контрольным вирусом осповакцины, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид A34 дикого типа, такой как полипептид A34, имеющий аминокислотную последовательность, изображенную на ФИГ. 2C); b) нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида B5, где вариант полипептида B5 обеспечивает увеличенное распространение вируса и/или увеличенную продукцию EEV, по сравнению с контрольным вирусом осповакцины, который не содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида B5 (например, по сравнению с контрольным вирусом осповакцины, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид B5 дикого типа, такой как полипептид B5, имеющий аминокислотную последовательность, изображенную на ФИГ. 4D); и c) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид A33 дикого типа (например, полипептид A33, имеющий природную аминокислотную последовательность).

В некоторых случаях, OVV по настоящему изобретению содержит: a) нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A33, где вариант полипептида A33 обеспечивает увеличенное распространение вируса и/или увеличенную продукцию EEV, по сравнению с контрольным вирусом осповакцины, который не содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A33 (например, по сравнению с контрольным вирусом осповакцины, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид A33 дикого типа, такой как полипептид A33, имеющий аминокислотную последовательность, изображенную на ФИГ. 1C); b) нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A34, где вариант полипептида A34 обеспечивает увеличенное распространение вируса и/или увеличенную продукцию EEV, по сравнению с контрольным вирусом осповакцины, который не содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A34 (например, по сравнению с контрольным вирусом осповакцины, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид A34 дикого типа, такой как полипептид A34, имеющий аминокислотную последовательность, изображенную на ФИГ. 2C); и c) нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида B5, где вариант полипептида B5 обеспечивает увеличенное распространение вируса и/или увеличенную продукцию EEV, по сравнению с контрольным вирусом осповакцины, который не содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида B5 (например, по сравнению с контрольным вирусом осповакцины, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид B5 дикого типа, такой как полипептид B5, имеющий аминокислотную последовательность, изображенную на ФИГ. 4D).

В некоторых случаях, OVV по настоящему изобретению имеет увеличенное распространение вируса и/или увеличенную продукцию EEV, по сравнению с контрольным вирусом осповакцины, который не содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A33 и/или вариант полипептида A34, и/или вариант полипептида B5, как описано в настоящем описании. Например, в некоторых случаях, OVV по настоящему изобретению, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A33, и/или нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A34, и/или нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида B5, имеет по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 100% (или в 2 раза), по меньшей мере в 2,5 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 15 раз, по меньшей мере в 20 раз, по меньшей мере в 25 раз или более чем в 25 раз, большее распространение, по сравнению с контрольным вирусом осповакцины, который не содержит нуклеотидную последовательность(и), кодирующие вариант полипептида A33 и/или вариант полипептида A34, и/или вариант полипептида B5. Обеспечивает ли данный вариант полипептида A33, данный вариант полипептида A34, данный полипептид B5 или комбинация двух или трех из данного полипептида A33, данного варианта полипептида A34 и данного варианта полипептида B5, увеличенное распространение вируса, по сравнению с контролем, можно определять с использованием любого известного способа, включая способ, как описано в примерах в настоящем описании, такой как двухстадийный анализ инфекционности с использованием клеток U-2 OS, описанный в примере 2. Двухстадийный анализ инфекционности включает стадии (1) инфекции клеток U-2 с использованием различных 3-кратных разведений множественностей инфекции (MOI) вируса осповакцины, (2) сбора супернатанта через 22 часа после инфекции, (3) инфекции нового планшета клеток U-2 OS супернатантом, и (4) измерения люциферазы, экспрессированной с вируса, через 15 часов после инфекции, где увеличенные уровни люциферазы являются показательными для увеличенного распространения вируса.

В некоторых случаях, OVV по настоящему изобретению, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A33, нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A34, нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида B5, или нуклеотидные последовательности, кодирующие любую комбинацию вариантов полипептидов A33, A34 и B5, имеет по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 100% (или в 2 раза), по меньшей мере в 2,5 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 15 раз, по меньшей мере в 20 раз, по меньшей мере в 25 раз, или более чем в 25 раз большую продукцию EEV, по сравнению с контрольным вирусом осповакцины который содержит нуклеотидную последовательность(и), кодирующие соответствующие полипептиды A33, A34 и B5 дикого типа. Обеспечивает ли данный вариант полипептида A33, данный вариант полипептида A34, данный вариант полипептида B5, или комбинация двух или трех из данного полипептида A33, данного варианта полипептида A34 и данного полипептида B5, увеличенную продукцию EEV, по сравнению с контролем, можно определять с использованием любого известного способа, включая способ, как описано в примерах в настоящем описании, такой как анализ бляшкообразования, описанный в примере 3. Анализ бляшкообразования включает стадии (1) инфекции одной или более линий клеток вирусами, (2) промывки клеток после 1 часа адсорбции вируса, (3) сбора супернатанта (потенциально EEV) через 24 часа после инфекции, и (4) определения количества инфекционных вирусов, продуцированных в супернатанте, посредством анализа бляшкообразования.

В некоторых случаях, OVV по настоящему изобретению имеет увеличенное распространение вируса и/или увеличенную продукцию EEV, по сравнению с контрольным вирусом осповакцины, который не содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A33 и/или вариант полипептида A34, как описано в настоящем описании. Например, в некоторых случаях, OVV по настоящему изобретению, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A33 и/или нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A34, имеет по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 100% (или в 2 раза), по меньшей мере в 2,5 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 15 раз, по меньшей мере в 20 раз, по меньшей мере в 25 раз или более чем в 25 раз большее распространение, по сравнению с контрольным вирусом осповакцины, который не содержит нуклеотидную последовательность(и), кодирующие вариант полипептида A33 и/или вариант полипептида A34 (например, по сравнению с контрольным вирусом осповакцины, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид A33 дикого типа, такой как полипептид A33, имеющий аминокислотную последовательность, изображенную на ФИГ. 1C); и/или, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид A34 дикого типа, такой как полипептид A34, имеющий аминокислотную последовательность, изображенную на ФИГ. 2C). Обеспечивает ли данный вариант полипептида A33, данный вариант полипептида A34, или комбинация данного полипептида A33 и данного варианта полипептида A34, увеличенное распространение вируса, по сравнению с контролем, можно определять с использованием любого известного способа, включая способ, как описано в примерах в настоящем описании.

В некоторых случаях, OVV по настоящему изобретению, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A33 и/или нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A34, имеет по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 100% (или в 2 раза), по меньшей мере в 2,5 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 15 раз, по меньшей мере в 20 раз, по меньшей мере в 25 раз или более чем в 25 раз большую продукцию EEV, по сравнению с контрольным вирусом осповакцины, который не содержит нуклеотидную последовательность(и), кодирующие вариант полипептида A33 и/или вариант полипептида A34 (например, по сравнению с контрольным вирусом осповакцины, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид A33 дикого типа, такой как полипептид A33, имеющий аминокислотную последовательность, изображенную на ФИГ. 1C); и/или который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид A34 дикого типа, такой как полипептид A34, имеющий аминокислотную последовательность, изображенную на ФИГ. 2C). Обеспечивает ли данный вариант полипептида A33, данный вариант полипептида A34, или комбинация данного полипептида A33 и данного варианта полипептида A34, увеличенную продукцию EEV, по сравнению с контролем, можно определять с использованием любого известного способа, включая способ, как описано в примерах в настоящем описании.

В некоторых случаях, OVV по настоящему изобретению имеет увеличенное распространение вируса и/или увеличенную продукцию EEV, по сравнению с контрольным вирусом осповакцины, который не содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида B5 как описано в настоящем описании (например, по сравнению с контрольным вирусом осповакцины, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид B5 дикого типа, такой как полипептид B5, имеющий аминокислотную последовательность, изображенную на ФИГ. 4D). Например, в некоторых случаях, OVV по настоящему изобретению, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида B5, имеет по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 100% (или в 2 раза), по меньшей мере в 2,5 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 15 раз, по меньшей мере в 20 раз, по меньшей мере в 25 раз, или более чем в 25 раз, большее распространение, по сравнению с контрольным вирусом осповакцины, который не включает нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида B5 (например, по сравнению с контрольным вирусом осповакцины, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид B5 дикого типа, такой как полипептид B5, имеющий аминокислотную последовательность, изображенную на ФИГ. 4D). Обеспечивает ли данный вариант полипептида B5 увеличенное распространение вируса, по сравнению с контролем, можно определять с использованием любого известного способа, включая способ, как описано в примерах в настоящем описании.

В некоторых случаях, OVV по настоящему изобретению, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида B5, имеет по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 100% (или в 2 раза), по меньшей мере в 2,5 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 15 раз, по меньшей мере в 20 раз, по меньшей мере в 25 раз или более чем в 25 раз большую продукцию EEV, по сравнению с контрольным вирусом осповакцины, который не включает нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида B5 (например, по сравнению с контрольным вирусом осповакцины, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид B5 дикого типа, такой как полипептид B5, имеющий аминокислотную последовательность, изображенную на ФИГ. 4D). Обеспечивает ли данный вариант полипептида B5 увеличенную продукцию EEV, по сравнению с контролем, можно определять с использованием любого известного способа, включая способ, как описано в примерах в настоящем описании.

В некоторых случаях, по меньшей мере 2%, по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75% или более чем 75%, инфекционных вирионов, продуцированных с использованием OVV по настоящему изобретению, представляют собой EEV. В некоторых случаях, по меньшей мере 2%, по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75% или более чем 75%, суммарных физических вирусных частиц, продуцированных с использованием OVV по настоящему изобретению, представляют собой EEV.

Варианты полипептидОВ A33

Примеры аминокислотных последовательностей полипептидов A33 дикого типа распространенных штаммов вируса осповакцины изображены на ФИГ. 1C и указаны в SEQ ID NO:8-14. Вариант полипептида A33 может содержать 1, 2, 3 или более мутаций аминокислот, таких как замены в одном или нескольких из M63, A88 и E129, где нумерация аминокислот основана на нумерации, показанной на ФИГ. 1C (например, где нумерация аминокислот основана на нумерации аминокислот из аминокислотной последовательности A33 Copenhagen; SEQ ID NO:8).

В некоторых случаях, вариант полипептида A33 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью A33, изображенной на ФИГ. 1C; и содержит аминокислоту в положении 63, отличную от Met. Например, в некоторых случаях, вариант полипептида A33 содержит Ala, Gly, Ile, Leu, Pro, Val, Phe, Trp, Tyr, Asp, Glu, Arg, His, Lys, Ser, Thr, Cys, Asn или Gln в положении 63, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 1C. В некоторых случаях, вариант полипептида A33 содержит замену M63R, M63H или замену M63K. В некоторых случаях, вариант полипептида A33 содержит замену M63R.

В некоторых случаях, вариант полипептида A33 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью A33, изображенной на ФИГ. 1C; и содержит аминокислоту в положении 88, отличную от Ala. Например, в некоторых случаях, вариант полипептида A33 содержит Gly, Ile, Leu, Pro, Val, Phe, Trp, Tyr, Asp, Glu, Arg, His, Lys, Ser, Thr, Cys, Met, Asn или Gln в положении 88, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 1C. В некоторых случаях, вариант полипептида A33 содержит замену A88D или замену A88E. В некоторых случаях, вариант полипептида A33 содержит замену A88D.

В некоторых случаях, вариант полипептида A33 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью A33, изображенной на ФИГ. 1C; и содержит аминокислоту в положении 129, отличную от Glu. Например, в некоторых случаях, вариант полипептида A33 содержит Ala, Gly, Ile, Leu, Pro, Val, Phe, Trp, Tyr, Asp, Arg, His, Lys, Ser, Thr, Cys, Met, Asn или Gln в положении 129, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 1C. В некоторых случаях, вариант полипептида A33 содержит замену E129M.

В некоторых случаях, вариант полипептида A33 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью A33, изображенной на ФИГ. 1C; содержит аминокислоту в положении 63, отличную от Met, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 1C; и содержит аминокислоту в положении 88, отличную от Ala, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 1C. В некоторых случаях, вариант полипептида A33 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью A33, изображенной на ФИГ. 1C; и содержит замену M63R и замену A88D.

В некоторых случаях, вариант полипептида A33 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью A33, изображенной на ФИГ. 1C; содержит аминокислоту в положении 63, отличную от Met, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 1C; и содержит аминокислоту в положении 129, отличную от Glu, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 1C. В некоторых случаях, вариант полипептида A33 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью A33, изображенной на ФИГ. 1C; и содержит замену M63R и замену E129M.

В некоторых случаях, вариант полипептида A33 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью A33, изображенной на ФИГ. 1C; содержит аминокислоту в положении 88, отличную от Ala, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 1C; и содержит аминокислоту в положении 129, отличную от Glu, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 1C. В некоторых случаях, вариант полипептида A33 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью A33, изображенной на ФИГ. 1C; и содержит замену A88D и замену E129M.

В некоторых случаях, вариант полипептида A33 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью A33, изображенной на ФИГ. 1C; содержит аминокислоту в положении 63, отличную от Met, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 1C; содержит аминокислоту в положении 88, отличную от Ala, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 1C; и содержит аминокислоту в положении 88, отличную от Ala, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 1C; и содержит аминокислоту в положении 129, отличную от Glu, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 1C. В некоторых случаях, вариант полипептида A33 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью A33, изображенной на ФИГ. 1C; и содержит замену M63R, замену A88D и замену E129M.

Варианты полипептидОВ A34

Примеры аминокислотных последовательностей полипептидов A34 дикого типа распространенных штаммов вируса осповакцины изображены на ФИГ. 2C и указаны в SEQ ID NO:22-28. Вариант полипептида A34 может содержать 1, 2, 3, 4, 5, 6 или более мутаций аминокислот, таких как аминокислотные замены в 1, 2, 3, 4 или 5 из M66, F94, R84, R91 и T127, где нумерация аминокислот основана на нумерации, показанной на ФИГ. 2C (например, где нумерация аминокислот основана на нумерации аминокислот из аминокислотной последовательности A34 Copenhagen; SEQ ID NO:22).

В некоторых случаях, вариант полипептида A34 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью A34, изображенной на ФИГ. 2C; и содержит аминокислоту в положении 66, отличную от Met. Например, в некоторых случаях, вариант полипептида A34 содержит Ala, Gly, Ile, Leu, Pro, Val, Phe, Trp, Tyr, Asp, Glu, Arg, His, Lys, Ser, Thr, Cys, Asn или Gln в положении 66, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 2C. В некоторых случаях, вариант полипептида A34 содержит замену M66T или замену M66S. В некоторых случаях, вариант полипептида A34 содержит замену M66T. В некоторых случаях, вариант полипептида A34 содержит Lys в положении 151. В некоторых случаях, вариант полипептида A34 содержит Glu в положении 151.

В некоторых случаях, вариант полипептида A34 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью A34, изображенной на ФИГ. 2C; и содержит аминокислоту в положении 94, отличную от Phe. Например, в некоторых случаях, вариант полипептида A34 содержит Ala, Gly, Ile, Leu, Pro, Val, Trp, Tyr, Asp, Glu, Arg, His, Lys, Ser, Thr, Cys, Met, Asn или Gln в положении 94, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 2C. В некоторых случаях, вариант полипептида A34 содержит замену F94H, замену F94R или замену F94K. В некоторых случаях, вариант полипептида A34 содержит замену F94H. В некоторых случаях, вариант полипептида A34 содержит Lys в положении 151. В некоторых случаях, вариант полипептида A34 содержит Glu в положении 151.

В некоторых случаях, вариант полипептида A34 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью A34, изображенной на ФИГ. 2C; и содержит аминокислоту в положении 84, отличную от Arg. Например, в некоторых случаях, вариант полипептида A34 содержит Ala, Gly, Ile, Leu, Pro, Val, Phe, Trp, Tyr, Asp, Glu, His, Lys, Ser, Thr, Cys, Met, Asn или Gln в положении 84, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 2C. В некоторых случаях, вариант полипептида A34 содержит замену R84G, замену R84A, замену R84I, замену R84L или замену R84V. В некоторых случаях, вариант полипептида A34 содержит замену R84G. В некоторых случаях, вариант полипептида A34 содержит Lys в положении 151. В некоторых случаях, вариант полипептида A34 содержит Glu в положении 151.

В некоторых случаях, вариант полипептида A34 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью A34, изображенной на ФИГ. 2C; и содержит аминокислоту в положении 91, отличную от Arg. Например, в некоторых случаях, вариант полипептида A34 содержит Ala, Gly, Ile, Leu, Pro, Val, Phe, Trp, Tyr, Asp, Glu, His, Lys, Ser, Thr, Cys, Met, Asn или Gln в положении 91, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 2C. В некоторых случаях, вариант полипептида A34 содержит замену R91S, замену R91A или замену R91T. В некоторых случаях, вариант полипептида A34 содержит замену R91S. В некоторых случаях, вариант полипептида A34 содержит замену R91A. В некоторых случаях, вариант полипептида A34 содержит Lys в положении 151. В некоторых случаях, вариант полипептида A34 содержит Glu в положении 151.

В некоторых случаях, вариант полипептида A34 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью A34, изображенной на ФИГ. 2C; и содержит аминокислоту в положении 127, отличную от Thr. Например, в некоторых случаях, вариант полипептида A34 содержит Ala, Gly, Ile, Leu, Pro, Val, Phe, Trp, Tyr, Asp, Glu, Arg, His, Lys, Ser, Cys, Met, Asn или Gln в положении 127, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 2C. В некоторых случаях, вариант полипептида A34 содержит замену T127E или замену T127D. В некоторых случаях, вариант полипептида A34 содержит замену T127E. В некоторых случаях, вариант полипептида A34 содержит Lys в положении 151. В некоторых случаях, вариант полипептида A34 содержит Glu в положении 151.

В некоторых случаях, вариант полипептида A34 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью A34, изображенной на ФИГ. 2C; и содержит аминокислотные замены в 2 положениях, выбранных из M66, F94, R84, R91 и T127, где нумерация аминокислот основана на нумерации, показанной на ФИГ. 2C. Таким образом, например, в некоторых случаях, вариант A34 содержит замены в M66 и F94; в M66 и R84; в M66 и R91; в M66 и T127; в F94 и R84; и F94 и F91; в F94 и T127; в R84 и R91; в R84 и T127; или в R91 и T127. В некоторых случаях, замена в M66 представляет собой замену M66T. В некоторых случаях, замена в F94 представляет собой замену F94H. В некоторых случаях, замена в R84 представляет собой замену R84G. В некоторых случаях, замена в R91 представляет собой замену R91S. В некоторых случаях, замена в R91 представляет собой замену R91A. В некоторых случаях, замена в T127 представляет собой замену T127E. В некоторых случаях, вариант полипептида A34 содержит Lys в положении 151. В некоторых случаях, вариант полипептида A34 содержит Glu в положении 151.

В некоторых случаях, вариант полипептида A34 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью A34, изображенной на ФИГ. 2C; и содержит аминокислотные замены в 3 положениях, выбранных из M66, F94, R84, R91 и T127, где нумерация аминокислот основана на нумерации, показанной на ФИГ. 2C. Таким образом, например, в некоторых случаях, вариант A34 содержит замены в M66, F94 и R84; в M66, F94 и R91; в M66, F94 и T127; в F94, R84 и R91; в F94, R84 и T127; в F94, R91 и T127; в R84, R91 и T127; в M66, R84 и R91; или в M66, R91 и T127. В некоторых случаях, замена в M66 представляет собой замену M66T. В некоторых случаях, замена в F94 представляет собой замену F94H. В некоторых случаях, замена в R84 представляет собой замену R84G. В некоторых случаях, замена в R91 представляет собой замену R91S. В некоторых случаях, замена в R91 представляет собой замену R91A. В некоторых случаях, замена в T127 представляет собой замену T127E. В некоторых случаях, вариант полипептида A34 содержит Lys в положении 151. В некоторых случаях, вариант полипептида A34 содержит Glu в положении 151.

В некоторых случаях, вариант полипептида A34 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью A34, изображенной на ФИГ. 2C; и содержит аминокислотные замены в 4 положениях, выбранных из M66, F94, R84, R91 и T127, где нумерация аминокислот основана на нумерации, показанной на ФИГ. 2C. Таким образом, например, в некоторых случаях, вариант A34 содержит замены в M66, F94, R84 и R91; в M66, F94, R84 и T127; в F94, R84, R91 и T127; в M66, R84, R91 и T127; или в M66, F94, R91 и T127. В некоторых случаях, замена в M66 представляет собой замену M66T. В некоторых случаях, замена в F94 представляет собой замену F94H. В некоторых случаях, замена в R84 представляет собой замену R84G. В некоторых случаях, замена в R91 представляет собой замену R91S. В некоторых случаях, замена в R91 представляет собой замену R91A. В некоторых случаях, замена в T127 представляет собой замену T127E. В некоторых случаях, вариант полипептида A34 содержит Lys в положении 151. В некоторых случаях, вариант полипептида A34 содержит Glu в положении 151.

В любом из вышеописанных вариантов осуществления, вариант полипептида A34 может иметь, в положении 151 на основании нумерации, показанной на ФИГ. 2C, Lys. В любом из вышеописанных вариантов осуществления, вариант полипептида A34 может иметь, в положении 151 на основании нумерации, показанной на ФИГ. 2C, аминокислоту, отличную от Lys. В любом из вышеописанных вариантов осуществления, вариант полипептида A34 может иметь, в положении 151 на основании нумерации, показанной на ФИГ. 2C, Glu. Таким образом, например, в некоторых случаях, вариант полипептида A34 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью A34, изображенной на ФИГ. 2C; и содержит аминокислотную замену в F94 и аминокислотную замену в K151. Например, в некоторых случаях, вариант полипептида A34 содержит замену F94H и замену K151E.

Комбинации ВариантА полипептида A33 и варианта полипептида A34

Как отмечено выше, в некоторых случаях, OVV по настоящему изобретению содержит: a) нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A33, где вариант полипептида A33 обеспечивает увеличенное распространение вируса и/или увеличенную продукцию EEV, по сравнению с контрольным вирусом осповакцины, который не содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A33 (например, по сравнению с контрольным вирусом осповакцины, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид A33 дикого типа, такой как полипептид A33, имеющий аминокислотную последовательность, изображенную на ФИГ. 1C); и b) нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A34, где вариант полипептида A34 обеспечивает увеличенное распространение вируса и/или увеличенную продукцию EEV, по сравнению с контрольным вирусом осповакцины, который не содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A34 (например, по сравнению с контрольным вирусом осповакцины, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид A34 дикого типа, такой как полипептид A34, имеющий аминокислотную последовательность, изображенную на ФИГ. 2C).

OVV по настоящему изобретению, который содержит нуклеотидные последовательности, кодирующие как вариант полипептида A33, так и вариант полипептида A34, может содержать нуклеотидные последовательности, кодирующие любой из вышеописанных вариантов полипептидов A33 и любой из вышеописанных полипептидов A34 в любой комбинации. Неограничивающие примеры комбинаций указаны в таблице 2.

Таким образом, например, в некоторых случаях, OVV по настоящему изобретению содержит: a) нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A33, где вариант полипептида A33 содержит 1, 2 или 3 аминокислотные замены в M63, A88 и E129, как описано выше; и b) нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A34, где вариант полипептида A34 содержит 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотных замен в M66, F94, R84, R91 и T127, как описано выше.

Приведенные ниже комбинации представляют собой иллюстративные комбинации и не предназначены для ограничения.

A33(A88x) и A34(F94x)

В качестве одного примера, OVV по настоящему изобретению содержит a) нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A33, где вариант полипептида A33 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью A33, изображенной на ФИГ. 1C; и содержит аминокислоту в положении 88, отличную от Ala, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 1C (например, вариант полипептида A33 содержит Gly, Ile, Leu, Pro, Val, Phe, Trp, Tyr, Asp, Glu, Arg, His, Lys, Ser, Thr, Cys, Met, Asn или Gln в положении 88); и b) нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A34, где вариант полипептида A34 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью A34, изображенной на ФИГ. 2C; и содержит аминокислоту в положении 94, отличную от Phe (например, вариант полипептида A34 содержит Ala, Gly, Ile, Leu, Pro, Val, Trp, Tyr, Asp, Glu, Arg, His, Lys, Ser, Thr, Cys, Met, Asn или Gln в положении 94). В качестве одного примера, OVV по настоящему изобретению содержит a) нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A33, где вариант полипептида A33 содержит замену A88D; и b) нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A34, где вариант полипептида A34 содержит замену F94H. В некоторых случаях, вариант полипептида A34 содержит Lys в положении 151. В некоторых случаях, вариант полипептида A34 содержит Glu в положении 151. Например, в некоторых случаях, OVV по настоящему изобретению содержит a) нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A33, где вариант полипептида A33 содержит замену A88D; и b) нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A34, где вариант полипептида A34 содержит: i) замену F94H; и ii) замену K151E.

A33(E129x) и A34(F94x)

В качестве одного примера, OVV по настоящему изобретению содержит a) нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A33, где вариант полипептида A33 содержит аминокислоту в положении 129, отличную от Glu (например, вариант полипептида A33 содержит Ala, Gly, Ile, Leu, Pro, Val, Phe, Trp, Tyr, Asp, Arg, His, Lys, Ser, Thr, Cys, Met, Asn или Gln в положении 129; и b) нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A34, где вариант полипептида A34 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью A34, изображенной на ФИГ. 2C; и содержит аминокислоту в положении 94, отличную от Phe (например, вариант полипептида A34 содержит Ala, Gly, Ile, Leu, Pro, Val, Trp, Tyr, Asp, Glu, Arg, His, Lys, Ser, Thr, Cys, Met, Asn или Gln в положении 94). В качестве одного примера, OVV по настоящему изобретению содержит a) нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A33, где вариант полипептида A33 содержит замену E129M; и b) нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A34, где вариант полипептида A34 содержит замену F94H. В некоторых случаях, вариант полипептида A34 содержит Lys в положении 151. В некоторых случаях, вариант полипептида A34 содержит Glu в положении 151. Таким образом, например, в некоторых случаях, OVV по настоящему изобретению содержит a) нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A33, где вариант полипептида A33 содержит замену E129M; и b) нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A34, где вариант полипептида A34 содержит: i) замену F94H; и ii) замену K151E.

A33(A88x; и E129x) и A34(F94x)

В качестве одного примера, OVV по настоящему изобретению содержит: a) нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A33, где вариант полипептида A33 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью A33, изображенной на ФИГ. 1C; и содержит: i) аминокислоту в положении 88, отличную от Ala, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 1C (например, вариант полипептида A33 содержит Gly, Ile, Leu, Pro, Val, Phe, Trp, Tyr, Asp, Glu, Arg, His, Lys, Ser, Thr, Cys, Met, Asn или Gln в положении 88); и ii) аминокислоту в положении 129, отличную от Glu (например, вариант полипептида A33 содержит Ala, Gly, Ile, Leu, Pro, Val, Phe, Trp, Tyr, Asp, Arg, His, Lys, Ser, Thr, Cys, Met, Asn или Gln в положении 129; и b) нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A34, где вариант полипептида A34 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью A34, изображенной на ФИГ. 2C; и содержит аминокислоту в положении 94, отличную от Phe (например, вариант полипептида A34 содержит Ala, Gly, Ile, Leu, Pro, Val, Trp, Tyr, Asp, Glu, Arg, His, Lys, Ser, Thr, Cys, Met, Asn или Gln в положении 94). В качестве одного примера, OVV по настоящему изобретению содержит a) нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A33, где вариант полипептида A33 содержит: i) замену A88D; и ii) замену E129M; и b) нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A34, где вариант полипептида A34 содержит замену F94H. В некоторых случаях, вариант полипептида A34 содержит Lys в положении 151. В некоторых случаях, вариант полипептида A34 содержит Glu в положении 151. Например, в некоторых случаях, OVV по настоящему изобретению содержит a) нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A33, где вариант полипептида A33 содержит: i) замену A88D; и ii) замену E129M; и b) нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A34, где вариант полипептида A34 содержит: i) замену F94H; и ii) замену K151E.

ВариантЫ ПолипептидОВ A56

В любом из вариантов осуществления, указанных выше, в некоторых случаях, OVV по настоящему изобретению содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A56, где полипептид A56 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью A56, изображенной на ФИГ. 3D; где кодированный вариант полипептида A56 содержит аминокислоту в положении 269, отличную от Ile, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 3D (например, вариант полипептида A56 содержит Ala, Gly, Leu, Pro, Val, Phe, Trp, Tyr, Asp, Glu, Arg, His, Lys, Ser, Thr, Cys, Met, Asn или Gln в положении 269. Например, вариант полипептида A56 может содержать Phe, Trp или Tyr в положении аминокислоты 269. В некоторых случаях, вариант полипептида A56 содержит Phe в положении аминокислоты 269.

В качестве одного примера, OVV по настоящему изобретению содержит: a) нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A34, где вариант полипептида A34 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью A34, изображенной на ФИГ. 2C; и содержит аминокислоту в положении 91, отличную от Arg. Например, в некоторых случаях, вариант полипептида A34 содержит Ala, Gly, Ile, Leu, Pro, Val, Phe, Trp, Tyr, Asp, Glu, His, Lys, Ser, Thr, Cys, Met, Asn или Gln в положении 91, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 2C; и b) нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A56, где полипептид A56 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью A56, изображенной на ФИГ. 3D; где кодированный вариант полипептида A56 содержит аминокислоту в положении 269, отличную от Ile, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 3D (например, вариант полипептида A56 содержит Ala, Gly, Leu, Pro, Val, Phe, Trp, Tyr, Asp, Glu, Arg, His, Lys, Ser, Thr, Cys, Met, Asn или Gln в положении 269. Например, OVV по настоящему изобретению может содержать: a) нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A34, где вариант полипептида A34 содержит замену R91S; и b) нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A56, где вариант полипептида A56 содержит замену I269F. В некоторых случаях, вариант полипептида A34 содержит Lys в положении 151. В некоторых случаях, вариант полипептида A34 содержит Glu в положении 151. Например, OVV по настоящему изобретению может содержать: a) нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A34, где вариант полипептида A34 содержит: i) замену R91S; и ii) замену K151E; и b) нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A56, где вариант полипептида A56 содержит замену I269F.

Варианты полипептидОВ B5

В некоторых вариантах осуществления, OVV, представленный в настоящем описании, содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида B5. Примеры аминокислотных последовательностей полипептидов B5 дикого типа вируса осповакцины изображены на ФИГ. 4D и указаны в SEQ ID No: 50-56. Вариант полипептида B5 может содержать 1, 2, 3, 4 или более аминокислотных замен в положениях аминокислот из N39, L90, N94, S197, S199, K229, V233, I236, V238, T240, N241, E243, V247, D248, G250, D263, E268, E270, D272, S273, D275 и A276, где нумерация аминокислот основана на нумерации, показанной на ФИГ. 4D.

В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит одиночную аминокислотную замену в любом из N39, L90, N94, S197, S199, K229, V233, I236, V238, T240, N241, E243, V247, D248, G250, D263, E268, E270, E272, S273, E275 и A276, где нумерация аминокислот основана на нумерации, показанной на ФИГ. 4D. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит 2 аминокислотные замены в положениях, выбранных из N39, L90, N94, S197, S199, K229, V233, I236, V238, T240, N241, E243, V247, D248, G250, D263, E268, E270, E272, S273, E275 и A276, где нумерация аминокислот основана на нумерации, показанной на ФИГ. 4D. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит 3 аминокислотные замены в положениях, выбранных из N39, L90, N94, S197, S199, K229, V233, I236, V238, T240, N241, E243, V247, D248, G250, D263, E268, E270, E272, S273, E275 и A276, где нумерация аминокислот основана на нумерации, показанной на ФИГ. 4D. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит 4 аминокислотные замены в положениях, выбранных из N39, L90, N94, S197, S199, K229, V233, I236, V238, T240, N241, E243, V247, D248, G250, D263, E268, E270, E272, S273, E275 и A276, где нумерация аминокислот основана на нумерации, показанной на ФИГ. 4D. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит 5 аминокислотных замен в положениях, выбранных из N39, L90, N94, S197, S199, K229, V233, I236, V238, T240, N241, E243, V247, D248, G250, D263, E268, E270, E272, S273, E275 и A276, где нумерация аминокислот основана на нумерации, показанной на ФИГ. 4D. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит 6 аминокислотных замен в положениях, выбранных из N39, L90, N94, S197, S199, K229, V233, I236, V238, T240, N241, E243, V247, D248, G250, D263, E268, E270, E272, S273, E275 и A276, где нумерация аминокислот основана на нумерации, показанной на ФИГ. 4D.

В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью B5, изображенной на ФИГ. 4D; и содержит аминокислоту в положении 39, отличную от Asn. Например, в некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит Ala, Gly, Ile, Leu, Pro, Val, Phe, Trp, Tyr, Asp, Glu, Arg, His, Lys, Ser, Thr, Cys, Met или Gln в положении 39, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 4D. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену N39G.

В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью B5, изображенной на ФИГ. 4D; и содержит аминокислоту в положении 90, отличную от Leu. Например, в некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит Ala, Gly, Ile, Pro, Val, Phe, Trp, Tyr, Asp, Glu, Arg, His, Lys, Ser, Thr, Cys, Met, Asn или Gln в положении 90, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 4D. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену L90R. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену L90H. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену L90K.

В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью B5, изображенной на ФИГ. 4D; и содержит аминокислоту в положении 94, отличную от Asn. Например, в некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит Ala, Gly, Ile, Leu, Pro, Val, Phe, Trp, Tyr, Asp, Glu, Arg, His, Lys, Ser, Thr, Cys, Met или Gln в положении 94, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 4D. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену N94T. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену N94S. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену N94Q.

В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью B5, изображенной на ФИГ. 4D; и содержит аминокислоту в положении 197, отличную от Ser. Например, в некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит Ala, Gly, Ile, Leu, Pro, Val, Phe, Trp, Tyr, Asp, Glu, Arg, His, Lys, Thr, Cys, Met, Asn или Gln в положении 197, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 4D. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену S197F. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену S197V.

В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью B5, изображенной на ФИГ. 4D; и содержит аминокислоту в положении 199, отличную от Ser. Например, в некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит Ala, Gly, Ile, Leu, Pro, Val, Phe, Trp, Tyr, Asp, Glu, Arg, His, Lys, Thr, Cys, Met, Asn или Gln в положении 199, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 4D. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену S199M. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену S199L. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену S199I.

В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью B5, изображенной на ФИГ. 4D; и содержит аминокислоту в положении 229, отличную от Lys. Например, в некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит Ala, Gly, Ile, Leu, Pro, Val, Phe, Trp, Tyr, Asp, Glu, Arg, His, Ser, Thr, Cys, Met, Asn или Gln в положении xx, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 4D. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену K229C.

В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью B5, изображенной на ФИГ. 4D; и содержит аминокислоту в положении 233, отличную от Val. Например, в некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит Ala, Gly, Ile, Leu, Pro, Phe, Trp, Tyr, Asp, Glu, Arg, His, Lys, Ser, Thr, Cys, Met, Asn или Gln в положении xx, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 4D. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену V233D. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену V233E.

В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью B5, изображенной на ФИГ. 4D; и содержит аминокислоту в положении 236, отличную от Ile. Например, в некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит Ala, Gly, Leu, Pro, Val, Phe, Trp, Tyr, Asp, Glu, Arg, His, Lys, Ser, Thr, Cys, Met, Asn или Gln в положении 236, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 4D. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену I236P. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену I236L. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену I236C. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену I236V.

В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью B5, изображенной на ФИГ. 4D; и содержит аминокислоту в положении 238, отличную от Val. Например, в некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит Ala, Gly, Ile, Leu, Pro, Phe, Trp, Tyr, Asp, Glu, Arg, His, Lys, Ser, Thr, Cys, Met, Asn или Gln в положении 238, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 4D. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену V238R. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену V238H. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену V238K. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену V238W. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену V238Y. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену V238F.

В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью B5, изображенной на ФИГ. 4D; и содержит аминокислоту в положении 240, отличную от Thr. Например, в некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит Ala, Gly, Ile, Leu, Pro, Val, Phe, Trp, Tyr, Asp, Glu, Arg, His, Lys, Ser, Cys, Met, Asn или Gln в положении 240, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 4D. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену T240R. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену T240H. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену T240K. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену T240Y. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену T240W. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену T240F.

В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью B5, изображенной на ФИГ. 4D; и содержит аминокислоту в положении 241, отличную от Asn. Например, в некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит Ala, Gly, Ile, Leu, Pro, Val, Phe, Trp, Tyr, Asp, Glu, Arg, His, Lys, Ser, Thr, Cys, Met или Gln в положении 241, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 4D. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену N241T. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену N241S. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену N241Q. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену N241G.

В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью B5, изображенной на ФИГ. 4D; и содержит аминокислоту в положении 243, отличную от Glu. Например, в некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит Ala, Gly, Ile, Leu, Pro, Val, Phe, Trp, Tyr, Asp, Arg, His, Lys, Ser, Thr, Cys, Met, Asn или Gln в положении 243, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 4D. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену E243G. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену E243V. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену E243A. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену E243I. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену E243L. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену E243S. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену E243T. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену E243R.

В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью B5, изображенной на ФИГ. 4D; и содержит аминокислоту в положении 247, отличную от Val. Например, в некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит Ala, Gly, Ile, Leu, Pro, Phe, Trp, Tyr, Asp, Glu, Arg, His, Lys, Ser, Thr, Cys, Met, Asn или Gln в положении 247, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 4D. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену V247S. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену V247T. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену V247N. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену V247Q. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену V247W. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену V247Y. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену V247F.

В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью B5, изображенной на ФИГ. 4D; и содержит аминокислоту в положении 248, отличную от Asp. Например, в некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит Ala, Gly, Ile, Leu, Pro, Val, Phe, Trp, Tyr, Glu, Arg, His, Lys, Ser, Thr, Cys, Met, Asn или Gln в положении 248, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 4D. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену D248Y. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену D248F. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену D248W.

В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью B5, изображенной на ФИГ. 4D; и содержит аминокислоту в положении 250, отличную от Gly. Например, в некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит Ala, Ile, Leu, Pro, Val, Phe, Trp, Tyr, Asp, Glu, Arg, His, Lys, Ser, Thr, Cys, Met, Asn или Gln в положении 250, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 4D. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену G250A. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену G250V. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену G250I. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену G250L. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену G250R. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену G250H. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену G250K.

В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью B5, изображенной на ФИГ. 4D; и содержит аминокислоту в положении 263, отличную от Asp. Например, в некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит Ala, Gly, Ile, Leu, Pro, Val, Phe, Trp, Tyr, Glu, Arg, His, Lys, Ser, Thr, Cys, Met, Asn или Gln в положении 263, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 4D. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену D263V. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену D263A. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену D263I. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену D263L.

В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью B5, изображенной на ФИГ. 4D; и содержит аминокислоту в положении 268, отличную от Glu. Например, в некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит Ala, Gly, Ile, Leu, Pro, Val, Phe, Trp, Tyr, Asp, Arg, His, Lys, Ser, Thr, Cys, Met, Asn или Gln в положении 268, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 4D. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену E268T. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену E268S. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену E268N. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену E268Q.

В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью B5, изображенной на ФИГ. 4D; и содержит аминокислоту в положении 270, отличную от Glu. Например, в некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит Ala, Gly, Ile, Leu, Pro, Val, Phe, Trp, Tyr, Asp, Arg, His, Lys, Ser, Thr, Cys, Met, Asn или Gln в положении 270, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 4D. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену E270S. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену E270T. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену E270N. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену E270Q. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену E270G.

В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью B5, изображенной на ФИГ. 4D; и содержит аминокислоту в положении 272, отличную от Glu. Например, в некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит Ala, Gly, Ile, Leu, Pro, Val, Phe, Trp, Tyr, Asp, Arg, His, Lys, Ser, Thr, Cys, Met, Asn или Gln в положении 272, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 4D. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену E272G. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену E272P.

В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью B5, изображенной на ФИГ. 4D; и содержит аминокислоту в положении 273, отличную от Ser. Например, в некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит Ala, Gly, Ile, Leu, Pro, Val, Phe, Trp, Tyr, Asp, Glu, Arg, His, Lys, Thr, Cys, Met, Asn или Gln в положении 273, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 4D. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену S273I. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену S273L. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену S273V. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену S273A.

В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью B5, изображенной на ФИГ. 4D; и содержит аминокислоту в положении 275, отличную от Glu. Например, в некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит Ala, Gly, Ile, Leu, Pro, Val, Phe, Trp, Tyr, Asp, Arg, His, Lys, Ser, Thr, Cys, Met, Asn или Gln в положении 275, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 4D. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену E275F. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену E275Y. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену E275W. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену E275S. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену E275T. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену E275N. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену E275Q.

В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью B5, изображенной на ФИГ. 4D; и содержит аминокислоту в положении 276, отличную от Ala. Например, в некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит Gly, Ile, Leu, Pro, Val, Phe, Trp, Tyr, Asp, Glu, Arg, His, Lys, Ser, Thr, Cys, Met, Asn или Gln в положении 276, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 4D. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену A276F. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену A276Y. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит замену A276W.

В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью B5, изображенной на ФИГ. 4D; содержит аминокислоту в положении 90, отличную от Leu, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 4D; и содержит аминокислоту в положении 273, отличную от Ser, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 4D. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью B5, изображенной на ФИГ. 4D; и содержит замену L90R и замену S273V.

В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью B5, изображенной на ФИГ. 4D; содержит аминокислоту в положении 229, отличную от Lys, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 4D; и содержит аминокислоту в положении 273, отличную от Ser, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 4D. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью B5, изображенной на ФИГ. 4D; и содержит замену K229C и замену S273L.

В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью B5, изображенной на ФИГ. 4D; содержит аминокислоту в положении 39, отличную от Asn, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 4D; и содержит аминокислоту в положении 273, отличную от Ser, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 4D. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью B5, изображенной на ФИГ. 4D; и содержит замену N39G и замену S273I.

В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью B5, изображенной на ФИГ. 4D; содержит аминокислоту в положении 236, отличную от Ile, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 4D; и содержит аминокислоту в положении 238, отличную от Val, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 4D. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью B5, изображенной на ФИГ. 4D; и содержит замену I236P и замену V238R.

В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью B5, изображенной на ФИГ. 4D; содержит аминокислоту в положении 233, отличную от Val, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 4D; и содержит аминокислоту в положении 236, отличную от Ile, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 4D. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью B5, изображенной на ФИГ. 4D; и содержит замену V233D и замену I236L.

В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью B5, изображенной на ФИГ. 4D; содержит аминокислоту в положении 263, отличную от Asp, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 4D; и содержит аминокислоту в положении 268, отличную от Glu, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 4D. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью B5, изображенной на ФИГ. 4D; и содержит замену D263V и замену E268T.

В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью B5, изображенной на ФИГ. 4D; содержит аминокислоту в положении 263, отличную от Asp, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 4D; содержит аминокислоту в положении 270, отличную от Glu, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 4D; содержит аминокислоту в положении 272, отличную от Glu, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 4D; и содержит аминокислоту в положении 275, отличную от Glu, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 4D. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью B5, изображенной на ФИГ. 4D; и содержит замену D263A, замену E270S, замену E272G и замену E275F.

В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью B5, изображенной на ФИГ. 4D; содержит аминокислоту в положении 236, отличную от Ile, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 4D; содержит аминокислоту в положении 238, отличную от Val, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 4D; содержит аминокислоту в положении 240, отличную от Thr, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 4D; и содержит аминокислоту в положении 243, отличную от Glu, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 4D. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью B5, изображенной на ФИГ. 4D; и содержит замену I236P, замену V238R, замену T240R и замену E243G.

В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью B5, изображенной на ФИГ. 4D; содержит аминокислоту в положении 233, отличную от Val, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 4D; содержит аминокислоту в положении 236, отличную от Ile, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 4D; содержит аминокислоту в положении 238, отличную от Val, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 4D; содержит аминокислоту в положении 240, отличную от Thr, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 4D; и содержит аминокислоту в положении 243, отличную от Glu, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 4D. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью B5, изображенной на ФИГ. 4D; и содержит замену V233D, замену I236L, замену V238W, замену T240Y и замену E243R.

В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью B5, изображенной на ФИГ. 4D; содержит аминокислоту в положении 241, отличную от Asn, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 4D; содержит аминокислоту в положении 243, отличную от Glu, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 4D; содержит аминокислоту в положении 247, отличную от Val, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 4D; содержит аминокислоту в положении 250, отличную от Gly, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 4D; и содержит аминокислоту в положении 276, отличную от Ala, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 4D. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью B5, изображенной на ФИГ. 4D; и содержит замену N241T, замену E243V, замену V247S, замену G250R и замену A276F.

В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью B5, изображенной на ФИГ. 4D; содержит аминокислоту в положении 263, отличную от Asp, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 4D; содержит аминокислоту в положении 268, отличную от Glu, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 4D; содержит аминокислоту в положении 270, отличную от Glu, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 4D; содержит аминокислоту в положении 272, отличную от Glu, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 4D; и содержит аминокислоту в положении 275, отличную от Glu, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 4D. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью B5, изображенной на ФИГ. 4D; и содержит замену D263V, замену E268T, замену E270G, замену E272P и замену E275S.

В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью B5, изображенной на ФИГ. 4D; содержит аминокислоту в положении 241, отличную от Asn, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 4D; содержит аминокислоту в положении 243, отличную от Glu, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 4D; содержит аминокислоту в положении 247, отличную от Val, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 4D; содержит аминокислоту в положении 248, отличную от Asp, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 4D; содержит аминокислоту в положении 250, отличную от Gly, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 4D; и содержит аминокислоту в положении 276, отличную от Ala, на основании нумерации аминокислот, изображенной на ФИГ. 4D. В некоторых случаях, вариант полипептида B5 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью B5, изображенной на ФИГ. 4D; и содержит замену N241G, замену E243S, замену V247W, замену D248Y, замену G250A и замену A276F.

В любом из вышеописанных вариантов осуществления, компетентный по репликации, рекомбинантный онколитический вирус осповакцины может дополнительно включать нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A34, где вариант полипептида A34 имеет замену K151E. Например, вариант полипептида A34 может содержать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере 99%, идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью A34, изображенной на ФИГ. 2C; и содержит замену K151E. Неограничивающие примеры комбинаций указаны в таблице 2.

Варианты ПолипептидОВ A34 и Варианты ПолипептидОВ B5

В некоторых случаях, OVV по настоящему изобретению содержит нуклеотидные последовательности, кодирующие как вариант полипептида A34, так и вариант полипептида B5; такой OVV может содержать нуклеотидные последовательности, кодирующие любой из вышеописанных вариантов полипептида A34 и любой из вышеописанных полипептидов B5 в любой комбинации. Неограничивающие примеры комбинаций указаны в таблице 2.

В качестве одного неограничивающего примера, OVV по настоящему изобретению содержит: a) нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A34, где вариант полипептида A34 содержит замену F94H; и b) нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида B5, где вариант полипептида B5 содержит замену N39G и замену S273I. В качестве другого неограничивающего примера, OVV по настоящему изобретению содержит: a) нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A34, где вариант полипептида A34 содержит замену F94H и замену K151E; и b) нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида B5, где вариант полипептида B5 содержит замену N39G и замену S273I.

КОНСТРУИРОВАНИЕ ОнколитическиХ вирусОВ осповакцины

OVV по настоящему изобретению можно конструировать из любого из множества штаммов вируса осповакцины. Примеры штамма вируса осповакцины, пригодные для использования, включают, но без ограничения, штаммы Lister, New York City Board of Health (NYBH), Wyeth, Copenhagen, Western Reserve (WR), Modified Vaccinia Ankara (MVA), EM63, Ikeda, Dalian, LIVP, Tian Tan, IHD-J, Tashkent, Bern, Paris, Dairen и производные подобных. В некоторых случаях, OVV по настоящему изобретению представляет собой штамм Copenhagen вируса осповакцины. В некоторых случаях, OVV по настоящему изобретению представляет собой штамм WR вируса осповакцины.

Нуклеотидные последовательности геномов вирусов осповакцины различных штаммов известны в данной области. См., например, Goebel et al. (1990) Virology 179:247; Goebel et al. (1990) Virology 179:517. Нуклеотидная последовательность штамма Copenhagen вируса осповакцины известна; см., например, No. доступа в GenBank M35027. Нуклеотидная последовательность штамма WR вируса осповакцины известна; см., например, No. доступа в GenBank AY243312; и No. доступа в GenBank NC_006998. Штамм WR вируса осповакцины является доступным из Американской коллекции типовых культур (ATCC); ATCC VR-1354.

Вирус осповакцины, используемый для конструирования OVV по настоящему изобретению, может включать ослабленные и/или избирательные для опухоли вирусы осповакцины. В рамках изобретения, «ослабленный» означает низкую токсичность (например, низкую репликацию вируса, низкую цитолитическую активность, низкую цитотоксическую активность) для нормальных клеток (например, не относящихся к опухоли клеток). В рамках изобретения, «избирательный для опухоли» означает токсичность для клеток опухолей (например, онколитическую) выше, чем для нормальных клеток (например, не относящихся к опухоли клеток). Вирусы осповакцины, генетически модифицированные, чтобы иметь недостаточность функции специфического белка, или для супрессии экспрессии специфического гена или белка (Guse et al. (2011) Expert Opinion on Biological Therapy 11:595) можно использовать в онколитическом вирусе по настоящему изобретению. Например, для увеличения избирательности для опухолей вируса осповакцины, можно использовать вирус осповакцины с недостаточностью функции фактора роста вируса осповакцины (VGF) (McCart et al. (2001) Cancer Research 61:8751); вирус осповакцины, имеющий модифицированный ген TK, модифицированный ген гемагглютинина (HA) и модифицированный ген F3 или прерванный локус F3 вируса осповакцины (WO 2005/047458), вирус осповакцины с недостаточностью функции VGF и O1L (WO 2015/076422); вирус осповакцины, в котором последовательность-мишень микроРНК, экспрессия которой уменьшена в клетках злокачественных опухолей, вставлена в 3'-некодирующую область гена B5R (WO 2011/125469); вирус осповакцины с недостаточностью функции HA и F14.5L (Zhang et al. (2007) Cancer Research 67:10038); вирус осповакцины с недостаточностью функции рибонуклеотидредуктазы (Gammon et al. (2010) PLoS Pathogens 6:e1000984); вирус осповакцины с недостаточностью функции ингибитора сериновых протеаз (например, SPI-1, SPI-2) (Guo et al. (2005) Cancer Research 65:9991); вирус осповакцины с недостаточностью функции SPI-1 и SPI-2 (Yang et al. (2007) Gene Therapy 14:638); вирус осповакцины с недостаточностью функции генов рибонуклеотидредуктазы F4L или I4L (Child et al. (1990) Virology 174:625; Potts et al. (2017) EMBO Mol. Med. 9:638); вирус осповакцины с недостаточностью функции B18R (B19R в штамме Copenhagen) (Symons et al. (1995) Cell 81:551; Kirn et al. (2007) PLoS Medicine 4:e353); вирус осповакцины с недостаточностью функции A48R (Hughes et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:20103); вирус осповакцины с недостаточностью функции B8R (Verardi et al. (2001) J. Virol. 75:11); вирус осповакцины с недостаточностью функции B15R (B16R в штамме Copenhagen) (Spriggs et al. (1992) Cell 71:145); вирус осповакцины с недостаточностью функции A41R (Ng et al. (2001) Journal of General Virology 82:2095); вирус осповакцины с недостаточностью функции A52R (Bowie et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:10162); вирус осповакцины с недостаточностью функции F1L (Gerlic et al. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110:7808); вирус осповакцины с недостаточностью функции E3L (Chang et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4825); вирус осповакцины с недостаточностью функции A44R-A46R (Bowie et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:10162); вирус осповакцины с недостаточностью функции K1L (Bravo Cruz et al. (2017) Journal of Virology 91:e00524); вирус осповакцины с недостаточностью функции A48R, B18R, C11R и TK (Mejías-Pérez et al. (2017) Molecular Therapy: Oncolytics 8:27); или вирус осповакцины, имеющий мутации в областях E3L и K3L (WO 2005/007824). Кроме того, можно использовать вирус осповакцины с недостаточностью функции O1L (Schweneker et al. (2012) J. Virol. 86:2323). Кроме того, можно использовать вирус осповакцины с недостаточностью внеклеточной области B5R (Bell et al. (2004) Virology 325:425) или вирус осповакцины с недостаточностью в области A34R (Thirunavukarasu et al. (2013) Molecular Therapy 21:1024). Кроме того, можно использовать вирус осповакцины с недостаточностью рецептора интерлейкина-1b (IL-1b) (WO 2005/030971). Такую вставку чужеродного гена, или делецию или мутацию гена можно осуществлять, например, посредством известной гомологичной рекомбинации или сайт-направленного мутагенеза. Кроме того, вирус осповакцины, имеющий комбинацию двух или более таких генетических модификаций, можно использовать в OVV по настоящему изобретению.

В рамках изобретения, «имеющий недостаточность» означает, что область гена или продукт гена, определенные посредством этого термина, имеют уменьшенную или отсутствующую функцию, и включает недостаточность, возникшую в результате одного или нескольких из: i) мутации (например, замены, инверсии и т.д.) и/или укорочения, и/или делеции области гена; ii) мутации и/или укорочения, и/или делеции промоторной области, контролирующей экспрессию области гена; и iii) мутации и/или укорочения, и/или делеции последовательности для полиаденилирования, таким образом, что трансляция полипептида, кодируемого областью гена, уменьшена или прекращена. OVV по настоящему изобретению, который содержит генетическое изменение, такое что компетентный по репликации, рекомбинантный онколитический вирус осповакцины имеет «недостаточность» данного гена вируса осповакцины, имеет уменьшенную продукцию и/или активность продукта гена (например, продукта мРНК гена; полипептидного продукта гена) для гена; например, количество и/или активность продукта гена составляет менее чем 75%, менее чем 60%, менее чем 50%, менее чем 40%, менее чем 30%, менее чем 25%, менее чем 20%, менее чем 15%, менее чем 10%, менее чем 5% или менее чем 1% от количества и/или активности такого же продукта гена, продуцируемого вирусом осповакцины дикого типа или контрольным вирусом осповакцины, который не содержит генетическое изменение. Например, «недостаточность» может являться результатом делеции в области, состоящей из указанной области гена, или делеции в соседней области гена, содержащего указанную область гена. В качестве одного примера, мутация и/или укорочение, и/или делеция промоторной области, которые уменьшают транскрипцию области гена, могут приводить к недостаточности. Области гена можно также придать недостаточность посредством включения элемента терминации транскрипции, таким образом, что трансляция полипептида, кодируемого областью гена, уменьшена или прекращена. Области гена можно также придать недостаточность посредством использования редактирующего гены фермента или редактирующего гены комплекса для уменьшения или прекращения транскрипции области гена. Области гена можно также придать недостаточность посредством использования конкурентной обратной занятости промотора/полимеразы для уменьшения или прекращения транскрипции области гена. Области гена можно также придать недостаточность посредством вставки нуклеиновой кислоты в область гена, таким образом, нокаута области гена.

В некоторых вариантах осуществления, OVV, представленный в настоящем описании, представляет собой вирус осповакцины с недостаточностью тимидинкиназы (TK). В некоторых случаях, OVV по настоящему изобретению содержит делецию всей или части кодирующей области TK вируса осповакцины, так что компетентный по репликации, рекомбинантный онколитический вирус осповакцины имеет недостаточность TK. Например, в некоторых случаях, OVV по настоящему изобретению содержит делецию в гене J2R (т.е., гене, который кодирует вирусную тимидинкиназу). См., например, Mejía-Perez et al. (2018) Mol. Ther. Oncolytics 8:27. В некоторых случаях, OVV по настоящему изобретению содержит вставку в область J2R, что, таким образом, приводит к уменьшенной экспрессии или активности TK вируса осповакцины.

OVV по настоящему изобретению может, в некоторых случаях, содержать ген A34R, кодирующий полипептид A34, имеющий замену K151E (т.е., содержащий модификацию, обеспечивающую замену K151E в кодированном полипептиде). См., например, Blasco et al. (1993) J. Virol. 67(6):3319-3325; и Thirunavukarasu et al. (2013) Mol. Ther. 21:1024. Ген A34R кодирует gp22-24 вируса осповакцины.

В некоторых случаях, OVV по настоящему изобретению содержит гетерологичную нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую иммуномодулирующий полипептид (гетерологичный иммуномодулирующий полипептид). Примеры иммуномодулирующего полипептида включают цитокины (такие как IL-2 и IL-12), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) и фактор некроза опухоли-альфа (TNF-α).

OVV по настоящему изобретению имеет онколитическую активность. Примеры способов оценки того, имеет ли данный вирус онколитическую активность, включают способ оценки уменьшения частоты выживания клеток злокачественных опухолей посредством добавления вируса. Примеры клеток злокачественных опухолей, подлежащих использованию для оценки, включают клетку злокачественной меланомы RPMI-7951 (например, ATCC HTB-66), аденокарциномы легкого HCC4006 (например, ATCC CRL-2871), карциномы легкого A549 (например, ATCC CCL-185), карциномы легкого HOP-62 (например, Хранилище образцов опухолей DCTD (DCTD Tumor Repository)), карциномы легкого EKVX (например, Хранилище образцов опухолей DCTD), клетку мелкоклеточного рака легкого DMS 53 (например, ATCC CRL-2062), плоскоклеточной карциномы легкого NCI-H226 (например, ATCC CRL-5826), клетку рака почки Caki-1 (например, ATCC HTB-46), клетку рака мочевого пузыря 647-V (например, DSMZ ACC 414), клетку рака головы и шеи Detroit 562 (например, ATCC CCL-138), клетку рака молочной железы JIMT-1 (например, DSMZ ACC 589), клетку рака молочной железы MDA-MB-231 (например, ATCC HTB-26), клетку рака молочной железы MCF7 (например, ATCC HTB-22), рака молочной железы HS-578T (например, ATCC HTB-126), карциномы протоков молочной железы T-47D (например, ATCC HTB-133), клетку рака пищевода OE33 (например, ECACC 96070808), глиобластомы U-87MG (например, ECACC 89081402), нейробластомы GOTO (например, JCRB JCRB0612), миеломы RPMI 8226 (например, ATCC CCL-155), клетку рака яичника SK-OV-3 (например, ATCC HTB-77), клетку рака яичника OVMANA (например, JCRB JCRB1045), рака шейки матки HeLa (например, ATCC CCL-2), клетку рака ободочной кишки RKO (например, ATCC CRL-2577), клетку рака ободочной кишки HT-29 (например, ATCC HTB-38), рака ободочной кишки Colo 205 (например, ATCC CCL-222), рака ободочной кишки SW620 (например, ATCC CCL-227), колоректальной карциномы HCT 116 (например, ATCC CCL-247), клетку рака поджелудочной железы BxPC-3 (например, ATCC CRL-1687), остеосаркомы кости U-2 OS (например, ATCC HTB-96), клетку рака предстательной железы LNCaP клона FGC (например, ATCC CRL-1740), печеночноклеточной карциномы JHH-4 (например, JCRB JCRB0435), мезотелиомы NCI-H28 (например, ATCC CRL-5820), клетку рака шейки матки SiHa (например, ATCC HTB-35) и клетку рака желудка Kato III (например, RIKEN BRC RCB2088). Также подходящими для использования являются клетки злокачественных опухолей, полученные от пациента. Например, можно использовать клетки колоректального рака, клетки рака молочной железы или клетки немелкоклеточного рака легкого, полученные от пациента.

Как отмечено выше, OVV по настоящему изобретению имеет увеличенное распространение вируса и/или увеличенную продукцию EEV, по сравнению с контрольным вирусом осповакцины, который не включает a) нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A33, как описано в настоящем описании (например, по сравнению с контрольным вирусом осповакцины, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид A33 дикого типа, такой как полипептид A33, имеющий аминокислотную последовательность, изображенную на ФИГ. 1C); и/или b) нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A34, как описано в настоящем описании (например, по сравнению с контрольным вирусом осповакцины, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид A34 дикого типа, такой как полипептид A34, имеющий аминокислотную последовательность, изображенную на ФИГ. 2C); и/или c) вариант полипептида B5, как описано в настоящем описании (например, по сравнению с контрольным вирусом осповакцины, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид B5 дикого типа, такой как полипептид B5, имеющий аминокислотную последовательность, изображенную на ФИГ. 4D).

Композиции

Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим OVV по настоящему изобретению. В некоторых случаях, композиция представляет собой фармацевтическую композицию. Фармацевтическая композиция, содержащая OVV по настоящему изобретению, может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель(и). В рамках изобретения, термины «фармакологически приемлемый носитель» и «фармакологически приемлемый наполнитель» использованы взаимозаменяемо и относятся к любому веществу, которое является пригодным для использования в составе OVV для введения человеку. Такой носитель, как правило, смешивают с OVV по настоящему изобретению, и он может представлять собой твердое, полутвердое или жидкое средство. Композиция может представлять собой раствор или суспензию в желательном носителе или разбавителе. Можно использовать любой из множества фармацевтически приемлемых носителей, включая, без ограничения, водные среды, например, такие как, дистиллированная, деионизированная вода, солевой раствор; растворители; диспергирующие среды; покрытия; антибактериальные и противогрибковые средства; изотонические и замедляющие абсорбцию средства; или любой другой неактивный ингредиент. Выбор фармакологически приемлемого носителя может зависеть от способа введения. За исключением случаев, когда любой фармакологически приемлемый носитель является несовместимым с OVV по настоящему изобретению, предусмотрено его использование в фармацевтически приемлемых композициях. Неограничивающие примеры конкретных применений таких фармацевтических носителей можно обнаружить в «Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems» (Howard C. Ansel et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins Publishers, 7^th ed. 1999); «Remington: The Science and Practice of Pharmacy» (Alfonso R. Gennaro ed., Lippincott, Williams & Wilkins, 20^th 2000); «Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics» Joel G. Hardman et al., eds., McGraw-Hill Professional, 10^th ed. 2001); и «Handbook of Pharmaceutical Excipients» (Raymond C. Rowe et al., APhA Publications, 4^th edition 2003).

Рассматриваемая фармацевтическая композиция может, необязательно, включать, без ограничения, другие фармацевтически приемлемые компоненты, включая, без ограничения, буферы, консерванты, средства для коррекции тоничности, соли, антиоксиданты, физиологические вещества, фармакологические вещества, придающие объем средства, эмульгаторы, увлажняющие средства, и т.п.. Различные буферы и средства для доведения pH можно использовать для получения фармацевтической композиции, описанной в настоящем описании, при условии, что полученный препарат является фармацевтически приемлемым. Такие буферы включают, без ограничения, ацетатные буферы, цитратные буферы, фосфатные буферы, нейтральный забуференный солевой раствор, фосфатно-солевой буфер и боратные буферы. Понятно, что кислоты или основания можно использовать для доведения pH композиции, по необходимости. Фармацевтически приемлемые антиоксиданты включают, без ограничения, метабисульфит натрия, тиосульфат натрия, ацетилцистеин, бутилированный гидроксианизол и бутилированный гидрокситолуол. Консерванты, которые можно использовать, включают, без ограничения, хлорид бензалкония, хлорбутанол, тимеросал, ацетат фенилртути, нитрат фенилртути и композицию стабилизированного оксихлора, например, PURITE™. Средства для доведения тоничности, пригодные для включения в рассматриваемую фармацевтическую композицию, включают, без ограничения, соли, например, такие как хлорид натрия, хлорид калия, маннит или глицерин и другое фармацевтически приемлемое средство для доведения тоничности. Понятно, что эти и другие вещества, известные в области фармакологии, можно включать в рассматриваемую фармацевтическую композицию.

Некоторые примеры материалов, которые могут служить в качестве фармацевтически приемлемых носителей, включают: (1) сахара, такие как лактоза, глюкоза и сахароза; (2) крахмалы, такие как кукурузный крахмал и картофельный крахмал; (3) целлюлозу и ее производные, такие как карбоксиметилцеллюлоза натрия, этилцеллюлоза и ацетат целлюлозы; (4) порошкообразный трагакант; (5) солод; (6) желатин; (7) тальк; (8) наполнители, такие как масло какао и воски для суппозиториев; (9) масла, такие как арахисовое масло, хлопковое масло, сафлоровое масло, кунжутное масло, оливковое масло, кукурузное масло и соевое масло; (10) гликоли, такие как пропиленгликоль; (11) полиолы, такие как глицерин, сорбит, маннит и полиэтиленгликоль; (12) сложные эфиры, такие как этилолеат и этиллаурат; (13) агар; (14) забуферивающие средства, такие как гидроксид магния и гидроксид алюминия; (15) альгиновую кислоту; (16) апирогенную воду; (17) изотонический солевой раствор; (18) раствор Рингера; (19) этиловый спирт; (20) растворы с забуференным pH; (21) полиэфиры, поликарбонаты и/или полиангидриды; и (22) другие нетоксичные совместимые вещества, используемые в фармацевтических составах.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может содержать OVV по настоящему изобретению в количестве от приблизительно 10² бляшкообразующих единиц (БОЕ) на мл (БОЕ/мл) до приблизительно 10⁴ БОЕ/мл, от приблизительно 10⁴ БОЕ/мл до приблизительно 10⁵ БОЕ/мл, от приблизительно 10⁵ БОЕ/мл до приблизительно 10⁶ БОЕ/мл, от приблизительно 10⁶ БОЕ/мл до приблизительно 10⁷ БОЕ/мл, от приблизительно 10⁷ БОЕ/мл до приблизительно 10⁸ БОЕ/мл, от приблизительно 10⁸ БОЕ/мл до приблизительно 10⁹ БОЕ/мл, от приблизительно 10⁹ БОЕ/мл до приблизительно 10¹⁰ БОЕ/мл, от приблизительно 10¹⁰ БОЕ/мл до приблизительно 10¹¹ БОЕ/мл или от приблизительно 10¹¹ БОЕ/мл до приблизительно 10¹² БОЕ/мл.

Способы индукции онколизиса

Настоящее изобретение относится к способам индукции онколизиса у индивидуума, имеющего опухоль, включающим введение индивидууму эффективного количества OVV по настоящему изобретению или композиция по настоящему изобретению. Введение эффективного количества OVV по настоящему изобретению, или композиции по настоящему изобретению, также обозначено в настоящем описании как «виротерапия». Настоящее изобретение, кроме того, относится к OVV или композиции по настоящему изобретению для использования в способах индукции онколизиса у индивидуума, имеющего опухоль. Настоящее изобретение, кроме того, относится к применению OVV или композиции по настоящему изобретению в изготовлении лекарственного средства для применения в таких способах.

В некоторых случаях, «эффективное количество» OVV по настоящему изобретению представляет собой количество, которое, при введении в 1, 2 или более дозах нуждающемуся в этом индивидууму, уменьшает количество клеток злокачественных опухолей у индивидуума. Например, в некоторых случаях, «эффективное количество» OVV по настоящему изобретению представляет собой количество, которое, при введении в одной или более дозах нуждающемуся в этом индивидууму, уменьшает количество клеток злокачественных опухолей у индивидуума по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 95%, по сравнению с количеством клеток злокачественных опухолей у индивидуума до введения компетентного по репликации, рекомбинантного онколитического вируса осповакцины, или в отсутствие введения компетентного по репликации, рекомбинантного онколитического вируса осповакцины. В некоторых случаях, «эффективное количество» OVV по настоящему изобретению представляет собой количество, которое, при введении в одной или более дозах нуждающемуся в этом индивидууму, уменьшает количество клеток злокачественных опухолей у индивидуума до не поддающихся детекции уровней. В некоторых случаях, «эффективное количество» OVV по настоящему изобретению представляет собой количество, которое, при введении в одной или более дозах нуждающемуся в этом индивидууму, уменьшает массу опухоли у индивидуума. Например, в некоторых случаях, «эффективное количество» OVV по настоящему изобретению представляет собой количество, которое, при введении в одной или более дозах нуждающемуся в этом индивидууму, уменьшает массу опухоли у индивидуума по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95%, по сравнению с массой опухоли у индивидуума до введения компетентного по репликации, рекомбинантного онколитического вируса осповакцины, или в отсутствие введения компетентного по репликации, рекомбинантного онколитического вируса осповакцины.

В некоторых случаях, «эффективное количество» OVV по настоящему изобретению представляет собой количество, которое, при введении в одной или более дозах нуждающемуся в этом индивидууму, увеличивает время выживаемости индивидуума. Например, в некоторых случаях, «эффективное количество» OVV по настоящему изобретению представляет собой количество, которое, при введении в одной или более дозах нуждающемуся в этом индивидууму, увеличивает время выживаемости индивидуума по меньшей мере на 1 месяц, по меньшей мере на 2 месяца, по меньшей мере на 3 месяца, от 3 месяцев до 6 месяцев, от 6 месяцев до 1 года, от 1 года до 2 лет, от 2 лет до 5 лет, от 5 лет до 10 лет, или более чем на 10 лет, по сравнению с ожидаемым временем выживаемости индивидуума в отсутствие введения компетентного по репликации, рекомбинантного онколитического вируса осповакцины.

В некоторых случаях, «эффективное количество» OVV по настоящему изобретению представляет собой количество, которое, при введении в одной или более дозах нуждающемуся в этом индивидууму, индуцирует длительный противоопухолевый иммунный ответ, например, противоопухолевый иммунный ответ, обеспечивающий уменьшение количества клеток опухоли и/или массы опухоли, и/или роста опухоли в течение по меньшей мере 1 месяца, по меньшей мере 2 месяцев, по меньшей мере 6 месяцев или по меньшей мере 1 года.

Подходящую дозу может определять лечащий терапевт или другой квалифицированный медицинский работник, на основании различных клинических факторов. Как хорошо известно в области медицины, дозы для любого одного пациента зависят от множества факторов, включая рост, площадь поверхности тела, возраст, опухолевую нагрузку пациента и другие значимые факторы.

OVV по настоящему изобретению можно вводить в количестве от приблизительно 10² бляшкообразующих единиц (БОЕ) до приблизительно 10⁴ БОЕ, от приблизительно 10⁴ БОЕ до приблизительно 10⁵ БОЕ, от приблизительно 10⁵ БОЕ до приблизительно 10⁶ БОЕ, от приблизительно 10⁶ БОЕ до приблизительно 10⁷ БОЕ, от приблизительно 10⁷ БОЕ до приблизительно 10⁸ БОЕ, от приблизительно 10⁸ БОЕ до приблизительно 10⁹ БОЕ, от приблизительно 10⁹ БОЕ до приблизительно 10¹⁰ БОЕ, от приблизительно 10¹⁰ БОЕ до приблизительно 10¹¹ БОЕ или от приблизительно 10¹¹ БОЕ до приблизительно 10¹² БОЕ на дозу.

В некоторых случаях, OVV по настоящему изобретению вводят в общем количестве от приблизительно 1×10⁹ БОЕ до 5×10¹² БОЕ. В некоторых случаях, OVV по настоящему изобретению вводят в общем количестве от приблизительно 1×10⁹ БОЕ до приблизительно 5×10⁹ БОЕ, от приблизительно 5×10⁹ БОЕ до приблизительно 10¹⁰ БОЕ, от приблизительно 10¹⁰ БОЕ до приблизительно 5×10¹⁰ БОЕ, от приблизительно 5×10¹⁰ БОЕ до приблизительно 10¹¹ БОЕ, от приблизительно 10¹¹ БОЕ до приблизительно 5×10¹¹ БОЕ, от приблизительно 5×10¹¹ БОЕ до приблизительно 10¹² БОЕ или от приблизительно 10¹² БОЕ до приблизительно 5×10¹² БОЕ. В некоторых случаях, OVV по настоящему изобретению вводят в общем количестве приблизительно 2×10¹⁰ БОЕ.

В некоторых случаях, OVV по настоящему изобретению вводят в количестве от приблизительно 1×10⁸ БОЕ/кг массы пациента до приблизительно 1×10¹⁰ БОЕ/кг массы пациента. В некоторых случаях, OVV по настоящему изобретению вводят в количестве от приблизительно 1×10⁸ БОЕ/кг массы пациента до приблизительно 5×10⁸ БОЕ/кг массы пациента, от приблизительно 5×10⁸ БОЕ/кг массы пациента до приблизительно 10⁹ БОЕ/кг массы пациента, от приблизительно 10⁹ БОЕ/кг массы пациента до приблизительно 5×10⁹ БОЕ/кг массы пациента или от приблизительно 5×10⁹ БОЕ/кг массы пациента до приблизительно 10¹⁰ БОЕ/кг массы пациента. В некоторых случаях, OVV по настоящему изобретению вводят в количестве 1×10⁸ БОЕ/кг массы пациента. В некоторых случаях, OVV по настоящему изобретению вводят в количестве 2×10⁸ БОЕ/кг массы пациента. В некоторых случаях, OVV по настоящему изобретению вводят в количестве 3×10⁸ БОЕ/кг массы пациента. В некоторых случаях, OVV по настоящему изобретению вводят в количестве 4×10⁸ БОЕ/кг массы пациента. В некоторых случаях, OVV по настоящему изобретению вводят в количестве 5×10⁸ БОЕ/кг массы пациента. В некоторых случаях, OVV по настоящему изобретению вводят в количестве 10⁹ БОЕ/кг массы пациента. В некоторых случаях, OVV по настоящему изобретению вводят в количестве 5×10⁹ БОЕ/кг массы пациента.

В некоторых случаях, вводят множественные дозы OVV по настоящему изобретению. Частоту введения OVV по настоящему изобретению можно менять, в зависимости от любого из множества факторов, например, тяжести симптомов и т.д. Например, в некоторых вариантах осуществления, OVV по настоящему изобретению вводят один раз в месяц, два раза в месяц, три раза в месяц, каждую вторую неделю (qow), один раз в неделю (qw), два раза в неделю (biw), три раза в неделю (tiw), четыре раза в неделю, пять раз в неделю, шесть раз в неделю, на каждые вторые сутки (qod), ежесуточно (qd), два раза в сутки (qid) или три раза в сутки (tid).

Длительность введения OVV по настоящему изобретению, например, период времени, на протяжении которого вводят мультимерный полипептид по настоящему изобретению, OVV по настоящему изобретению, можно менять, в зависимости от любого из множества факторов, например, ответа пациента и т.д. Например, OVV по настоящему изобретению можно вводить на протяжении периода времени, лежащего в диапазоне от приблизительно одних суток до приблизительно одной недели, от приблизительно двух недель до приблизительно четырех недель, от приблизительно одного месяца до приблизительно двух месяцев, от приблизительно двух месяцев до приблизительно четырех месяцев, от приблизительно четырех месяцев до приблизительно шести месяцев, от приблизительно шести месяцев до приблизительно восьми месяцев, от приблизительно восьми месяцев до приблизительно 1 года, от приблизительно 1 года до приблизительно 2 лет или от приблизительно 2 лет до приблизительно 4 лет, или более.

OVV по настоящему изобретению вводят индивидууму с использованием любого доступного способа и пути, пригодных для доставки лекарственного средства, включая способы in vivo и ex vivo, так же как системные и локализованные способы введения.

Общепринятые и фармацевтически приемлемые способы введения включают внутриопухолевое, перитуморальное, внутримышечное, интратрахеальное, интратекальное, интракраниальное, подкожное, внутрикожное, местное введение, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное, внутрипузырное, ректальное, назальное, пероральное и другие энтеральные и парентеральные способы введения. Способы введения можно комбинировать, если желательно, или корректировать, в зависимости от компетентного по репликации, рекомбинантного онколитического вируса осповакцины и/или желательного эффекта. OVV по настоящему изобретению можно вводить в однократной дозе или в множественных дозах.

В некоторых случаях, OVV по настоящему изобретению вводят внутривенно. В некоторых случаях, OVV по настоящему изобретению вводят внутримышечно. В некоторых случаях, OVV по настоящему изобретению вводят местно. В некоторых случаях, OVV по настоящему изобретению вводят внутрь опухоли. В некоторых случаях, OVV по настоящему изобретению вводят перитуморально. В некоторых случаях, OVV по настоящему изобретению вводят интракраниально. В некоторых случаях, OVV по настоящему изобретению вводят подкожно. В некоторых случаях, OVV по настоящему изобретению вводят внутриартериально. В некоторых случаях, OVV по настоящему изобретению вводят внутрибрюшинно. В некоторых случаях, OVV по настоящему изобретению вводят посредством внутрипузырного способа введения. В некоторых случаях, OVV по настоящему изобретению вводят интратекально.

КомбинациИ

В некоторых случаях, OVV по настоящему изобретению вводят в комбинации с другой противораковой терапией, такой как хирургия (например, хирургическое удаление злокачественной ткани), радиотерапия, трансплантация костного мозга, химиотерапевтическое лечение, лечение антителом, лечение модификатором биологического ответа, иммунотерапевтическое лечение и конкретные комбинации вышеуказанного. В некоторых случаях, способ по настоящему изобретению включает: a) введение нуждающемуся в этом индивидууму OVV по настоящему изобретению, или содержащей его композиции; и b) подвергание индивидуума второй противораковой терапии. В некоторых случаях, вторая противораковая терапия выбрана из химиотерапии, биологической терапии, радиотерапии, иммунотерапии, гормональной терапии, антиваскулярной терапии, криотерапии, терапии токсином, терапии онколитическим вирусом (например, онколитическим вирусом, отличным от OVV по настоящему изобретению), клеточной терапии и хирургии.

Радиотерапия включает, но без ограничения, рентгеновские лучи или гамма-лучи, которые доставляют либо из прилагаемого снаружи источника, такого как пучок, либо посредством имплантации малых радиоактивных источников.

Подходящие антитела для применения в лечении злокачественных опухолей включают, но без ограничения, например, трастузумаб (герцептин), бевацизумаб (авастин™), цетуксимаб (эрбитукс™), панитумумаб (вектибикс™), ипилимумаб (ервой™), ритуксимаб (ритуксан), алемтузумаб (лемтрада™), офатумумаб (арзерра™), ореговомаб (ОваРекс™), ламбролизумаб (MK-3475), пертузумаб (перьета™), ранибизумаб (луцентис™) и т.д., и конъюгированные антитела, например, гемтузумаб озогамицин (милотарг™), брентуксимаб ведотин (адцетрис™), меченный ⁹⁰Y ибритутомаб тиуксетан (зевалин™), меченный ¹³¹I тозитумомаб (бексар™) и т.д. Подходящие антитела для применения в лечении злокачественных опухолей включают, но без ограничения, например, ипилимумаб, нацеленный на CTLA-4 (как используют в лечении меланомы, рака предстательной железы, RCC); тремелимумаб, нацеленный на CTLA-4 (как используют в лечении CRC, рака желудка, меланомы, NSCLC); ниволумаб, нацеленный на PD-1 (как используют в лечении меланомы, NSCLC, RCC); MK-3475, нацеленный на PD-1 (как используют в лечении меланомы); пидилизумаб, нацеленный на PD-1 (как используют в лечении гематологических злокачественных новообразований); BMS-936559, нацеленный на PD-L1 (как используют в лечении меланомы, NSCLC, рака яичников, RCC); MEDI4736, нацеленный на PD-L1; MPDL33280A, нацеленный на PD-L1 (как используют в лечении меланомы); ритуксимаб, нацеленный на CD20 (как используют в лечении неходжскинской лимфомы); ибритутомаб тиуксетан и тозитумомаб (как используют в лечении лимфомы); брентуксимаб ведотин, нацеленный на CD30 (как используют в лечении лимфомы Ходжкина); гемтузумаб озогамицин, нацеленный на CD33 (как используют в лечении острого миелогенного лейкоза); алемтузумаб, нацеленный на CD52 (как используют в лечении хронического лимфоцитарного лейкоза); IGN101 и адекатумумаб, нацеленные на EpCAM (как используют в лечении эпителиальных опухолей (молочной железы, ободочной кишки и легкого)); лабетузумаб, нацеленный на CEA (как используют в лечении опухолей молочной железы, ободочной кишки и легкого); huA33, нацеленный на gpA33 (как используют в лечении колоректальной карциномы); пемтумомаб и ореговомаб, нацеленные на муцины (как используют в лечении опухолей молочной железы, ободочной кишки, легкого и яичника); CC49 (минретумомаб), нацеленный на TAG-72 (как используют в лечении опухолей молочной железы, ободочной кишки и легкого); cG250, нацеленный на CAIX (как используют в лечении почечноклеточного рака); J591, нацеленный на PSMA (как используют в лечении карциномы предстательной железы); MOv18 и MORAb-003 (фарлетузумаб), нацеленные на связывающий фолат белок (как используют в лечении опухолей яичников); 3F8, ch14.18 и KW-2871, нацеленные на ганглиозиды (такие как GD2, GD3 и GM2) (как используют в лечении нейроэктодермальных опухолей и некоторых эпителиальных опухолей); hu3S193 и IgN311, нацеленные на Le y (как используют в лечении опухолей молочной железы, ободочной кишки, легкого и предстательной железы); бевацизумаб, нацеленный на VEGF (как используют в лечении сосудистой сети опухоли); IM-2C6 и CDP791, нацеленные на VEGFR (как используют в лечении происходящих из эпителия солидных опухолей); этарацизумаб, нацеленный на интегрин_V_3 (как используют в лечении сосудистой сети опухоли); волоциксимаб, нацеленный на интегрин_5_1 (как используют в лечении сосудистой сети опухоли); цетуксимаб, панитумумаб, нимотузумаб и 806, нацеленные на EGFR (как используют в лечении глиомы, опухолей легкого, молочной железы, ободочной кишки и опухолей головы и шеи); трастузумаб и пертузумаб, нацеленные на ERBB2 (как используют в лечении опухолей молочной железы, ободочной кишки, легкого, яичника и предстательной железы); MM-121, нацеленный на ERBB3 (как используют в лечении опухолей молочной железы, ободочной кишки, легкого, яичника и предстательной железы); AMG 102, METMAB и SCH 900105, нацеленные на MET (как используют в лечении опухолей молочной железы, яичника и легкого); AVE1642, IMC-A12, MK-0646, R1507 и CP 751871, нацеленные на IGF1R (как используют в лечении глиомы, рака легкого, молочной железы, головы и шеи, предстательной железы и щитовидной железы); KB004 и IIIA4, нацеленные на EPHA3 (как используют в лечении опухолей легкого, почки и ободочной кишки, меланомы, глиомы и гематологических злокачественных новообразований); мапатумумаб (HGS-ETR1), нацеленный на TRAILR1 (как используют в лечении опухолей ободочной кишки, легкого и поджелудочной железы, и гематологических злокачественных новообразований); HGS-ETR2 и CS-1008, нацеленные на TRAILR2; деносумаб, нацеленный на RANKL (как используют в лечении рака предстательной железы и метастазирования в кости); сибротузумаб и F19, нацеленные на FAP (как используют в лечении опухолей ободочной кишки, молочной железы, легкого, поджелудочной железы, и головы и шеи); 81C6, нацеленный на тенасцин (как используют в лечении глиомы, опухолей молочной железы и предстательной железы); блинатумомаб (блинцито; Amgen), нацеленный на CD3 (как используют в лечении ALL); пембролизумаб, нацеленный на PD-1, как используют в иммунотерапии злокачественных опухолей; антитело 9E10, нацеленное на c-Myc; и т.п..

В некоторых случаях, способ по настоящему изобретению включает введение: a) эффективного количества OVV по настоящему изобретению; и b) антитела против PD-1. В некоторых случаях, способ по настоящему изобретению содержит введение: a) эффективного количества OVV по настоящему изобретению; и b) антитела против PD-L1. Примеры антител против PD-1 и против PD-L1, которые можно использовать в комбинированной терапии по настоящему изобретению включают, но без ограничения, пембролизумаб (кейтруда®; MK-3475), ниволумаб (опдиво®; BMS-926558; MDX1106), пидилизумаб (CT-011), AMP-224, AMP-514 (MEDI-0680), PDR001 и PF-06801591 (также известный как сасанлимаб или RN888), BMS-936559 (MDX1105), дурвалумаб (MEDI4736; ИМФИНЗИ®,), атезолизумаб (MPDL33280A; ТЕЦЕНТРИК®), MSB0010718C, BCD-100 (BIOCAD Biopharmaceutical Company), тислелизумаб (BGB-A317, BeiGene Ltd./Celgene Corporation), генолимзумаб (CBT-501, CBT Pharmaceuticals), CBT-502 (CBT Pharmaceuticals), GLS-010 (Harbin Gloria Pharmaceuticals Co., Ltd.), синтилимаб (IBI308, Innovent Biologics, Inc.), WBP3155 (CStone Pharmaceuticals Co., Ltd.), AMP-224 (GlaxoSmithKline plc), BI 754091 (Boehringer Ingelheim GmbH), BMS-936559 (Bristol-Myers Squibb Company), CA-170 (Aurigene Discovery Technologies), FAZ053 (Novartis AG), спартализумаб (PDR001, Novartis AG), LY3300054 (Eli Lilly & Company), MEDI0680 (AstraZeneca PLC), PDR001 (Novartis AG), цемиплимаб (LIBTAYO®, REGN2810, Regeneron Pharmaceuticals, Inc.), камрелизумаб (SHR-1210, Incyte Corporation), TSR-042 (Tesaro, Inc.), AGEN2034 (Agenus Inc.), CX-072 (CytomX Therapeutics, Inc.), JNJ-63723283 (Johnson & Johnson), MGD013 (MacroGenics, Inc.), AN-2005 (Adlai Nortye), ANA011 (AnaptysBio, Inc.), ANB011 (AnaptysBio, Inc.), AUNP-12 (Pierre Fabre Medicament S.A.), BBI-801 (Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd.), BION-004 (Aduro Biotech), CA-327 (Aurigene Discovery Technologies), CK-301 (Fortress Biotech, Inc.), ENUM 244C8 (Enumeral Biomedical Holdings, Inc.), FPT155 (Five Prime Therapeutics, Inc.), FS118 (F-star Alpha Ltd.), hAb21 (Stainwei Biotech, Inc.), J43 (Transgene S.A.), JTX-4014 (Jounce Therapeutics, Inc.), KD033 (Kadmon Holdings, Inc.), KY-1003 (Kymab Ltd.), MCLA-134 (Merus B.V.), MCLA-145 (Merus B.V.), PRS-332 (Pieris AG), SHR-1316 (Atridia Pty Ltd.), STI-A1010 (Sorrento Therapeutics, Inc.), STI-A1014 (Sorrento Therapeutics, Inc.), STI-A1110 (Les Laboratoires Servier) и XmAb20717 (Xencor, Inc.). Дополнительные антитела против PD-1 и против PD-L1 можно обнаружить, например, в Sunshine and Taube (2015) Curr. Opin. Pharmacol. 23:32; и Heery et al. (2017) The Lancet Oncology 18:587; Iwai et al. (2017) J. Biomed. Sci. 24:26; Hu-Lieskovan et al. (2017) Annals of Oncology 28: issue Suppl. 5, mdx376.048; WO2016/092419 и Публикации патента США No. 2016/0159905.

В некоторых случаях, подходящее антитело представляет собой биспецифическое антитело, например, биспецифическое моноклональное антитело. Катумаксомаб, блинатумомаб, солитомаб, пасотуксизумаб и флотетузумаб представляют собой неограничивающие примеры биспецифических антител, пригодных для применения в противораковой терапии. См., например, Chames and Baty (2009) MAbs 1:539; и Sedykh et al. (2018) Drug Des. Devel. Ther. 12:195.

Модификаторы биологического ответа, пригодные для применения в связи со способами по настоящему изобретению, включают, но без ограничения, (1) ингибиторы активности тирозинкиназы (RTK); (2) ингибиторы активности серин/треонин-киназы; (3) антагонисты опухолеассоциированного антигена, такие как антитела, которые специфически связываются с антигеном опухоли; (4) агонисты рецептора апоптоза; (5) интерлейкин-2; (6) интерферон-α; (7) интерферон-γ; (8) колониестимулирующие факторы; (9) ингибиторы ангиогенеза; и (10) антагонисты фактора некроза опухоли.

Химиотерапевтические средства представляют собой непептидные (т.е., небелковые) соединения, уменьшающие пролиферацию клеток злокачественных опухолей, и включают цитотоксические средства и цитостатические средства. Неограничивающие примеры химиотерапевтических средств включают алкилирующие средства, нитрозомочевину, антиметаболиты, противоопухолевые антибиотики, алкалоиды растений (барвинка) и стероидные гормоны.

Средства, которые действуют для уменьшения пролиферации, известны в данной области и широко используются. Такие средства включают алкилирующие средства, такие как азотистые иприты, нитрозомочевина, производные этиленимина, алкилсульфонаты и триазены, включая, но без ограничения, мехлорэтамин, циклофосфамид (цитоксан™), мелфалан (L-сарколизин), кармустин (BCNU), ломустин (CCNU), семустин (метил-CCNU), стрептозоцин, хлорзотоцин, урамустин, хлорметин, ифосфамид, хлорамбуцил, пипоброман, триэтиленмеламин, триэтилентиофосфорамин, бусульфан, декарбазин и темозололмид.

Антиметаболитные средства включают аналоги фолиевой кислоты, аналоги пиримидина, аналоги пурина и ингибиторы аденозиндезаминазы, включая, но без ограничения, цитарабин (ЦИТОЗАР-U), арабинозид цитозина, фторурацил (5-FU), флоксуридин (FudR), 6-тиогуанин, 6-меркаптопурин (6-MP), пентостатин, 5-фторурацил (5-FU), метотрексат, 10-пропаргил-5,8-дидеазафолат (PDDF, CB3717), 5,8-дидеазатетрагидрофолиевую кислоту (DDATHF), лейковорин, фосфат флударабина, пентостатин и гемцитабин.

Пригодные природные продукты и их производные, (например, алкалоиды барвинка, противоопухолевые антибиотики, ферменты, лимфокины и эпиподофиллотоксины), включают, но без ограничения, Ara-C, паклитаксел (таксол®), доцетаксел (таксотер®), дезоксикоформицин, митомицин-C, L-аспарагиназу, азатиоприн; бреквинар; алкалоиды, например, винкристин, винбластин, винорелбин, виндезин и т.д.; подофиллотоксины, например, этопозид, тенипозид и т.д.; антибиотики, например, антрациклин, гидрохлорид даунорубицина (дауномицин, рубидомицин, церубидин), идарубицин, доксорубицин, эпирубицин и морфолинопроизводные и т.д.; феноксизон-бисциклопептиды, например, дактиномицин; основные гликопептиды, например, блеомицин; антрахиноновые гликозиды, например, пликамицин (митрамицин); антрацендионы, например, митоксантрон; азиринопирролоиндолдионы, например, митомицин; макроциклические иммунодепрессанты, например, циклоспорин, FK-506 (такролимус, програф), рапамицин и т.д.; и т.п..

Другие антипролиферативные цитотоксические средства представляют собой навельбин, CPT-11, анастрозол, летразол, капецитабин, релоксафин, циклофосфамид, ифозамид и дролоксафин.

Действующие на микротрубочки средства, имеющие антипролиферативную активность, также являются пригодными для применения и включают, но без ограничения, аллоколхицин (NSC 406042), халихондрин B (NSC 609395), колхицин (NSC 757), производные колхицина (например, NSC 33410), долстатин 10 (NSC 376128), майтанзин (NSC 153858), ризоксин (NSC 332598), паклитаксел (таксол®), производные таксола®, доцетаксел (таксотер®), тиоколхицин (NSC 361792), тритилцистеин, сульфат винбластина, сульфат винкристина, природные и синтетические эпотилоны включая, но без ограничения, эпотилон A, эпотилон B, дискодермолид; эстрамустин, нокодазол и т.п.

Модуляторы гормонов и стероиды (включая синтетические аналоги), подходящие для применения, включают, но без ограничения, адренокортикостероиды, например, преднизон, дексаметазон и т.д.; эстрогены и прогестины, например, капроат гидроксипрогестерона, ацетат медроксипрогестерона, ацетат мегестрола, эстрадиол, кломифен, тамоксифен; и т.д.; и адренокортикальные супрессанты, например, аминоглутетимид; 17α-этинилэстрадиол; диэтилстилбестрол, тестостерон, флуоксиместерон, пропионат дромостанолона, тестолактон, метилпреднизолон, метил-тестостерон, преднизолон, триамцинолон, хлортрианизен, гидроксипрогестерон, аминоглутетимид, эстрамустин, ацетат медроксипрогестерона, леупролид, флутамид (дрогенил), торемифен (фарестон) и золадекс®. Эстрогены стимулируют пролиферацию и дифференцировку, таким образом, соединения, связывающиеся с рецептором эстрогена, используют для блокирования этой активности. Кортикостероиды могут ингибировать пролиферацию T-клеток.

Другие химиотерапевтические средства включают комплексы металлов, например, цисплатин (цис-DDP), карбоплатин и т.д.; мочевины, например, гидроксимочевину; и гидразины, например, N-метилгидразин; эпидофиллотоксин; ингибитор топоизомеразы; прокарбазин; митоксантрон; лейковорин; тегафур; и т.д. Другие представляющие интерес антипролиферативные средства включают иммунодепрессанты, например, микофеноловую кислоту, талидомид, дезоксиспергуалин, азаспорин, лефлуномид, мизорибин, азаспиран (SKF 105685); иресса® (ZD 1839, 4-(3-хлор-4-фторфениламино)-7-метокси-6-(3-(4-морфолинил)пропокси)хиназолин); и т.д.

«Таксаны» включают паклитаксел, так же как любое активное производное или пролекарство таксана. «Паклитаксел» (который следует понимать в настоящем описании как включающий аналоги, составы и производные, например, такие как доцетаксел, ТАКСОЛ™, ТАКСОТЕР™ (состав доцетаксела), 10-дезацетиловые аналоги паклитаксела и 3'N-дезбензоил-3'N-т-бутоксикарбониловые аналоги паклитаксела) можно легко получать с использованием способов, известных специалисту в данной области (см. также WO 94/07882, WO 94/07881, WO 94/07880, WO 94/07876, WO 93/23555, WO 93/10076; Патенты США No. 5294637; 5283253; 5279949; 5274137; 5202448; 5200534; 5229529; и EP 590,267), или получать из множества коммерческих источников, включая например, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo. (T7402 из Taxus brevifolia; или T-1912 из Taxus yannanensis).

Паклитаксел следует понимать как обозначающий не только общепринятую химически доступную форму паклитаксела, но и аналоги и производные (например, доцетаксел таксотер™, как отмечено выше), и конъюгаты паклитаксела (например, паклитаксел-PEG, паклитаксел-декстран или паклитаксел-ксилозу).

Клеточная терапия включает терапию T-клетками с химерным рецептором антигена (CAR) (CAR-T-терапию); терапию клетками естественными киллерами (NK); терапию дендритными клетками (DC) (например, вакцину на основе DC); терапию на основе T-клеток со сконструированным T-клеточным рецептором (TCR); и т.п.

Ингибиторы иммунных контрольных точек известны в данной области и включают антитела, специфические для полипептида иммунной контрольной точки. Например, ингибиторы иммунных контрольных точек включают, например, антитело, специфическое для полипептида иммунной контрольной точки, выбранного из CD27, CD28, CD40, CD122, CD96, CD73, CD47, OX40, GITR, CSF1R, JAK, PI3K-дельта, PI3K-гамма, TAM, аргиназы, CD137, ICOS, A2AR, B7-H3, B7-H4, BTLA, CTLA-4, LAG3, TIM3, VISTA, CD96, TIGIT, CD122, PD-1, PD-L1 и PD-L2.

Антитела, например, моноклональные антитела, которые являются специфическими для иммунных контрольных точек и которые функционируют как ингибиторы иммунных контрольных точек, известны в данной области. См., например, Wurz et al. (2016) Ther. Adv. Med. Oncol. 8:4; и Naidoo et al. (2015) Ann. Oncol. 26:2375.

Пригодные антитела против иммунных контрольных точек включают, но без ограничения, ниволумаб (Bristol-Myers Squibb), пембролизумаб (Merck), пидилизумаб (Curetech), AMP-224 (GlaxoSmithKline/Amplimmune), MPDL3280A (Roche), MDX-1105 (Medarex, Inc./Bristol Myer Squibb), MEDI-4736 (Medimmune/AstraZeneca), авелумаб (Merck Serono), ипилимумаб (ЕРВОЙ, (Bristol-Myers Squibb), тремелимумаб (Pfizer), пидилизумаб (CureTech, Ltd.), IMP321 (Immutep S.A.), MGA271 (Macrogenics), BMS-986016 (Bristol-Meyers Squibb), лирилумаб (Bristol-Myers Squibb), урелумаб (Bristol-Meyers Squibb), PF-05082566 (Pfizer), IPH2101 (Innate Pharma/Bristol-Myers Squibb), MEDI-6469 (MedImmune/AZ), CP-870,893 (Genentech), Mogamulizumab (Kyowa Hakko Kirin), варлилумаб (CelIDex Therapeutics), галиксимаб (Biogen Idec), AMP-514 (Amplimmune/AZ), AUNP 12 (Aurigene и Pierre Fabre), индоксимод (NewLink Genetics), NLG-919 (NewLink Genetics), INCB024360 (Incyte); KN035; и их комбинации.

ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫЕ ОПУХОЛИ

Клетки злокачественных опухолей, которые можно подвергать лечению посредством способов и композиций по настоящему изобретению, включают клетки из мочевого пузыря, крови, кости, костного мозга, головного мозга, молочной железы, ободочной кишки, пищевода, желудочно-кишечного тракта, десны, головы, почки, печени, легкого, носоглотки, шеи, яичника, предстательной железы, кожи, желудка, спинного мозга, яичек, языка или матки. Кроме того, злокачественная опухоль может специфически принадлежать к следующим гистологическим типам, хотя и без ограничения ими: неоплазия, злокачественная; карцинома; карцинома, недифференцированная; гигантоклеточная и веретеноклеточная карцинома; мелкоклеточная карцинома; папиллярная карцинома; плоскоклеточная карцинома; лимфоэпителиальная карцинома; базальноклеточная карцинома; пиломатриксная карцинома; переходноклеточная карцинома; папиллярная переходноклеточная карцинома; аденокарцинома; гастринома, злокачественная; холангиокарцинома; печеночноклеточная карцинома; комбинированная печеночноклеточная карцинома и холангиокарцинома; трабекулярная аденокарцинома; аденокистозная карцинома; аденокарцинома в аденоматозном полипе; аденокарцинома, семейный коли-полипоз; солидная карцинома; карциноидная опухоль, злокачественная; бронхиолоальвеолярная аденокарцинома; папиллярная аденокарцинома; хромофобная карцинома; ацидофильная карцинома; оксифильная аденокарцинома; базофильная карцинома; светлоклеточная аденокарцинома; зернистоклеточная карцинома; фолликулярная аденокарцинома; папиллярная и фолликулярная аденокарцинома; неинкапсулированная склерозирующая карцинома; карцинома коры надпочечников; эндометриоидная карцинома; карцинома из придатков кожи; апокринная аденокарцинома; аденокарцинома сальных желез; аденокарцинома серных желез; мукоэпидермоидная карцинома; цистаденокарцинома; папиллярная цистаденокарцинома; папиллярная серозная цистаденокарцинома; слизистая цистаденокарцинома; слизистая аденокарцинома; перстневидноклеточная карцинома; инфильтрирующая карцинома протоков; медуллярная карцинома; лобулярная карцинома; воспалительная карцинома; Болезнь Педжета молочной железы; ацинозноклеточная карцинома; аденосквамозная карцинома; аденокарцинома со сквамозной метаплазией; тимома, злокачественная; опухоль стромы яичников, злокачественная; текома, злокачественная; гранулезоклеточная опухоль, злокачественная; андробластома, злокачественная; карцинома из клеток Сертоли; опухоль из клеток Лейдига, злокачественная; опухоль из жировых клеток, злокачественная; параганглиома, злокачественная; экстрамамиллярная параганглиома, злокачественная; феохромоцитома; гломангиосаркома; злокачественная меланома; амеланнотическая меланома; поверхностная распространяющаяся меланома; злокачественная меланома в гигантском пигментированном невусе; меланома эпителиоидных клеток; синий невус, злокачественный; саркома; фибросаркома; фиброзная гистиоцитома, злокачественная; миксосаркома; липосаркома; лейомиосаркома; рабдомиосаркома; эмбриональная рабдомиосаркома; альвеолярная рабдомиосаркома; стромальная саркома; смешанная опухоль, злокачественная; смешанная опухоль Мюллера; нефробластома; гепатобластома; карциносаркома; мезенхимома, злокачественная; опухоль Бреннера, злокачественная; филлоидная опухоль, злокачественная; синовиальная саркома; мезотелиома, злокачественная; дисгерминома; эмбриональная карцинома; тератома, злокачественная; вздутие яичников, злокачественное; хориокарцинома; мезонефрома, злокачественная; гемангиосаркома; гемангиоэндотелиома, злокачественная; саркома Капоши; гемангиоперицитома, злокачественная; лимфангиосаркома; остеосаркома; юкстакортикальная остеосаркома; хондросаркома; хондробластома, злокачественная; мезенхимальная хондросаркома; гигантоклеточная опухоль кости; саркома Юинга; одонтогенная опухоль, злокачественная; амелобластическая одонтосаркома; амелобластома, злокачественная; амелобластическая фибросаркома; пинеалома, злокачественная; хордома; глиома, злокачественная; эпендимома; астроцитома; протоплазмическая астроцитома; фибриллярная астроцитома; астробластома; глиобластома; олигодендроглиома; олигодендробластома; примитивная нейроэктодермальная опухоль; церебеллярная саркома; ганглионейробластома; нейробластома; ретинобластома; опухоль обонятельного нерва; менингиома, злокачественная; нейрофибросаркома; неврилеммома, злокачественная; зернистоклеточная опухоль, злокачественная; злокачественная лимфома; болезнь Ходжкина; парагранулема Ходжкина; злокачественная лимфома из малых лимфоцитов; злокачественная лимфома, крупноклеточная, диффузная; злокачественная лимфома, фолликулярная; фунгоидный микоз; другие известные неходжкинские лимфомы; злокачественный гистиоцитоз; множественная миелома; тучноклеточная саркома; иммунопролиферативное заболевание тонкого кишечника; лейкоз; лимфоидный лейкоз; лейкоз плазматических клеток; эритролейкоз; лимфосаркомоклеточный лейкоз; миелоидный лейкоз; базофильный лейкоз; эозинофильный лейкоз; моноцитарный лейкоз; тучноклеточный лейкоз; мегакариобластный лейкоз; миелоидная саркома; рак поджелудочной железы; рак прямой кишки; и волосатоклеточный лейкоз.

Опухоли, которые можно лечить с использованием способа по настоящему изобретению, включают, например, злокачественную опухоль мозга, злокачественную опухоль головы и шеи, злокачественную опухоль пищевода, злокачественную опухоль кожи, злокачественную опухоль легкого, злокачественную опухоль тимуса, злокачественную опухоль желудка, злокачественную опухоль ободочной кишки, злокачественную опухоль печени, злокачественную опухоль яичника, злокачественную опухоль тела матки, злокачественную опухоль мочевого пузыря, злокачественную опухоль яичка, злокачественную опухоль прямой кишки, злокачественную опухоль молочной железы или злокачественную опухоль поджелудочной железы.

В некоторых случаях, опухоль представляет собой колоректальную аденокарциному. В некоторых случаях, опухоль представляет собой немелкоклеточную карциному легких. В некоторых случаях, опухоль представляет собой трижды отрицательный рак молочной железы. В некоторых случаях, опухоль представляет собой солидную опухоль. В некоторых случаях, опухоль представляет собой опухоль жидких тканей. В некоторых случаях, опухоль является рецидивирующей. В некоторых случаях, опухоль представляет собой первичную опухоль. В некоторых случаях, опухоль является метастазирующей.

Множество субъектов являются подходящими для лечения с использованием рассматриваемого способа лечения злокачественной опухоли. Подходящие субъекты включают любого индивидуума, например, человека или не относящегося к человеку животного, который имеет злокачественную опухоль, у которого диагностирована злокачественная опухоль, который подвержен риску развития злокачественной опухоли, который имел злокачественную опухоль и подвержен риску рецидива злокачественной опухоли, который был подвергнут лечению с использованием средства, отличного от онколитического вируса осповакцины по настоящему изобретению, из-за злокачественной опухоли и не смог отвечать на такое лечение, или который был подвергнут лечению с использованием средства, отличного от онколитического вируса осповакцины по настоящему изобретению, из-за злокачественной опухоли, но имел рецидив после первоначального ответа на такое лечение.

Иммуногенные композиции ВирусА осповакцины

Настоящее изобретение относится к композиции, содержащий OVV, содержащий одну или более из: a) нуклеотидной последовательности, кодирующей вариант полипептида A33, где вариант полипептида A33 обеспечивает увеличенное распространение вируса и/или увеличенную продукцию EEV, по сравнению с контрольным вирусом осповакцины, который не содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A33 (например, по сравнению с контрольным вирусом осповакцины, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид A33 дикого типа, такой как полипептид A33, имеющий аминокислотную последовательность, изображенную на ФИГ. 1C); b) нуклеотидной последовательности, кодирующей вариант полипептида A34, где вариант полипептида A34 обеспечивает увеличенное распространение вируса и/или увеличенную продукцию EEV, по сравнению с контрольным вирусом осповакцины, который не содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A34 (например, по сравнению с контрольным вирусом осповакцины, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид A34 дикого типа, такой как полипептид A34, имеющий аминокислотную последовательность, изображенную на ФИГ. 2C); и c) нуклеотидной последовательности, кодирующей вариант полипептида B5, где вариант полипептида B5 обеспечивает увеличенное распространение вируса и/или увеличенную продукцию EEV, по сравнению с контрольным вирусом осповакцины, который не содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида B5 (например, по сравнению с контрольным вирусом осповакцины, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид B5 дикого типа, такой как полипептид B5, имеющий аминокислотную последовательность, изображенную на ФИГ. 4D).

Для индукции или усиления иммунного ответа у индивидуума на антиген злокачественной опухоли, OVV по настоящему изобретению вводят нуждающемуся в этом индивидууму. Субъекты, подходящие для лечения, включают субъектов, описанных выше. В некоторых случаях, компетентный по репликации, рекомбинантный онколитический вирус осповакцины вводят нуждающемуся в этом индивидууму в низкой дозе, например, от приблизительно 10² бляшкообразующих единиц (БОЕ) до приблизительно 10⁴ БОЕ, от приблизительно 10⁴ БОЕ до приблизительно 10⁵ БОЕ или от приблизительно 10⁵ БОЕ до приблизительно 10⁶ БОЕ на дозу. В некоторых случаях, компетентный по репликации, рекомбинантный онколитический вирус осповакцины вводят нуждающемуся в этом индивидууму в дозе от приблизительно 10⁶ БОЕ до приблизительно 10¹² БОЕ, например, в дозе от приблизительно 10⁶ БОЕ до приблизительно 10⁷ БОЕ, от приблизительно 10⁷ БОЕ до приблизительно 10⁸ БОЕ, от приблизительно 10⁸ БОЕ до приблизительно 10⁹ БОЕ, от приблизительно 10⁹ БОЕ до приблизительно 10¹⁰ БОЕ, от приблизительно 10¹⁰ БОЕ до приблизительно 10¹¹ БОЕ или от приблизительно 10¹¹ БОЕ до приблизительно 10¹² БОЕ.

OVV по настоящему изобретению можно вводить нуждающемуся в этом индивидууму в фармацевтической композиции, например, фармацевтическая композиция может содержать: a) OVV по настоящему изобретению; и b) фармацевтически приемлемый наполнитель. Таким образом, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей: a) OVV по настоящему изобретению; и b) фармацевтически приемлемый наполнитель. Пригодные фармацевтически приемлемые наполнители являются такими, как описано выше. В некоторых случаях, фармацевтическая композиция содержит адъювант. Пригодные адъюванты включают, но без ограничения, квасцы, фосфат алюминия, гидроксид алюминия, MF59 (4,3% масс./об. сквалена, 0,5% масс./об. Tween 80™, 0,5% масс./об. Span 85), содержащую CpG нуклеиновую кислоту (где цитозин является неметилированным), монофосфориллипид A (MPL), 3-Q-дезацил-4'-монофосфориллипид A (3DMPL), и т.п.

OVV по настоящему изобретению можно вводить нуждающемуся в этом индивидууму посредством любого подходящего способа введения, например, способа введения, как описано выше. Например, рекомбинантный вирус осповакцины по настоящему изобретению можно вводить нуждающемуся в этом индивидууму посредством внутримышечного, внутривенного, подкожного способа введения.

Примеры НЕОГРАНИЧИВАЮЩИХ АСПЕКТОВ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Аспекты, включая варианты осуществления, объекта настоящего изобретения, описанного выше, могут обеспечивать преимущества, отдельно или в комбинации с одним или несколькими другими аспектами или вариантами осуществления. Без ограничения приведенного выше описания, конкретные неограничивающие аспекты настоящего изобретения, пронумерованные 1-72, представлены ниже. Как станет очевидным специалисту в данной области при прочтении настоящего описания, каждый из индивидуально пронумерованных аспектов можно использовать или комбинировать с любым из предшествующих или последующих индивидуально пронумерованных аспектов. Оно предназначено для обеспечения поддержки для всех таких комбинаций аспектов и не является ограниченным комбинациями аспектов, явно представленными ниже:

Аспект 1. OVV, содержащий одну или более из:

a) нуклеотидной последовательности, кодирующей вариант полипептида A33, где вариант полипептида A33 обеспечивает увеличенное распространение вируса и/или увеличенную продукцию внеклеточного оболочечного вириона (EEV), по сравнению с контрольным вирусом осповакцины, который не содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A33;

b) нуклеотидной последовательности, кодирующей вариант полипептида A34, где вариант полипептида A34 обеспечивает увеличенное распространение вируса и/или увеличенную продукцию EEV, по сравнению с контрольным вирусом осповакцины, который не содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A34; и

c) нуклеотидной последовательности, кодирующей вариант полипептида B5, где вариант полипептида B5 обеспечивает увеличенное распространение вируса и/или увеличенную продукцию EEV, по сравнению с контрольным вирусом осповакцины, который не содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида B5.

Аспект 2. Компетентный по репликации, рекомбинантный онколитический вирус осповакцины из аспекта 1, содержащий:

a) нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A33, где вариант полипептида A33 обеспечивает увеличенное распространение вируса и/или увеличенную продукцию EEV, по сравнению с контрольным вирусом осповакцины, который не содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A33; и

b) нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A34, где вариант полипептида A34 обеспечивает увеличенное распространение вируса и/или увеличенную продукцию EEV, по сравнению с контрольным вирусом осповакцины, который не содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A34.

Аспект 3. Компетентный по репликации, рекомбинантный онколитический вирус осповакцины из аспекта 1, содержащий:

a) нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A33, где вариант полипептида A33 обеспечивает увеличенное распространение вируса и/или увеличенную продукцию EEV, по сравнению с контрольным вирусом осповакцины, который не содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A33;

b) нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A34, где вариант полипептида A34 обеспечивает увеличенное распространение вируса и/или увеличенную продукцию EEV, по сравнению с контрольным вирусом осповакцины, который не содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A34; и

c) нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида B5, где вариант полипептида B5 обеспечивает увеличенное распространение вируса и/или увеличенную продукцию EEV, по сравнению с контрольным вирусом осповакцины, который не содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида B5.

Аспект 4. Компетентный по репликации, рекомбинантный онколитический вирус осповакцины из любого из аспектов 1-3, где вариант полипептида A33 содержит замену 1, 2 или 3 из M63, A88 и E129.

Аспект 5. Компетентный по репликации, рекомбинантный онколитический вирус осповакцины из аспекта 4, где замена представляет собой одну или более из замены M63R, замены A88D и замены E129M.

Аспект 6. Компетентный по репликации, рекомбинантный онколитический вирус осповакцины из аспекта 5, где вариант полипептида A33 содержит замену A88D и замену E129M.

Аспект 7. Компетентный по репликации, рекомбинантный онколитический вирус осповакцины из любого из аспектов 4-6, где вирус осповакцины содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A34, где вариант полипептида A34 содержит замену K151E.

Аспект 8. Компетентный по репликации, рекомбинантный онколитический вирус осповакцины из любого из аспектов 1-3, где вариант полипептида A34 содержит замену 1, 2, 3, 4 или 5 из M66, F94, R84, R91 и T127.

Аспект 9. Компетентный по репликации, рекомбинантный онколитический вирус осповакцины из аспекта 8, где замена представляет собой одну или более из замены M66T, замены F94H, замены R84G, замены R91A, замены R91S и замены T127E.

Аспект 10. Компетентный по репликации, рекомбинантный онколитический вирус осповакцины из аспекта 9, где вариант полипептида A34 содержит замену K151E.

Аспект 11. Компетентный по репликации, рекомбинантный онколитический вирус осповакцины из аспекта 9, где вариант полипептида A34 содержит замену F94H.

Аспект 12. Компетентный по репликации, рекомбинантный онколитический вирус осповакцины из аспекта 10, где вариант полипептида A34 содержит замену F94H и замену K151E.

Аспект 13. Компетентный по репликации, рекомбинантный онколитический вирус осповакцины из аспекта 2,

где вариант полипептида A33 содержит замену одной или более из M63, A88 и E129; и

где вариант полипептида A34 содержит замену одной или более из M66, F94, R84, R91 и T127.

Аспект 14. Компетентный по репликации, рекомбинантный онколитический вирус осповакцины из аспекта 13, где вариант полипептида A33 содержит одну или более из замены M63R, замены A88D и замены E129M; и где вариант полипептида A34 содержит одну или более из замены M66T, замены F94H, замены R84G, замены R91S, замены R91A и замены T127E.

Аспект 15. Компетентный по репликации, рекомбинантный онколитический вирус осповакцины из аспекта 14, где вариант полипептида A34 содержит замену K151E.

Аспект 16. Компетентный по репликации, рекомбинантный онколитический вирус осповакцины из аспекта 14, где вариант полипептида A33 содержит замену A88D; и где вариант полипептида A34 содержит замену F94H.

Аспект 17. Компетентный по репликации, рекомбинантный онколитический вирус осповакцины из аспекта 14, где вариант полипептида A33 содержит замену E129M, и где вариант полипептида A34 содержит замену F94H.

Аспект 18. Компетентный по репликации, рекомбинантный онколитический вирус осповакцины из аспекта 14, где вариант полипептида A33 содержит замену A88D и замену E129M, и где вариант полипептида A34 содержит замену F94H.

Аспект 19. Компетентный по репликации, рекомбинантный онколитический вирус осповакцины из аспекта 15, где вариант полипептида A33 содержит замену A88D и замену E129M, и где вариант полипептида A34 содержит замену K151E.

Аспект 20. Компетентный по репликации, рекомбинантный онколитический вирус осповакцины из аспекта 15, где вариант полипептида A33 содержит замену A88D, и где вариант полипептида A34 содержит замену F94H и замену K151E.

Аспект 21. Компетентный по репликации, рекомбинантный онколитический вирус осповакцины из аспекта 15, где вариант полипептида A33 содержит замену E129M, и где вариант полипептида A34 содержит замену F94H и замену K151E.

Аспект 22. Компетентный по репликации, рекомбинантный онколитический вирус осповакцины из аспекта 15, где вариант полипептида A33 содержит замену A88D и замену E129M, и где вариант полипептида A34 содержит замену F94H и замену K151E.

Аспект 23. Компетентный по репликации, рекомбинантный онколитический вирус осповакцины из аспекта 1 или аспекта 3, где вариант полипептида B5 содержит 1, 2, 3, 4 или более аминокислотных замен в положениях из N39, L90, N94, S199, K229, V233, I236, V238, T240, N241, E243, V247, D248, G250, D263, E268, E270, D272, S273, D275 и A276.

Аспект 24. Компетентный по репликации, рекомбинантный онколитический вирус осповакцины из аспекта 23, где вариант полипептида B5 содержит замену S197F или S197V.

Аспект 25. Компетентный по репликации, рекомбинантный онколитический вирус осповакцины из аспекта 23, где вариант полипептида B5 содержит замену S199M.

Аспект 26. Компетентный по репликации, рекомбинантный онколитический вирус осповакцины из аспекта 23, где вариант полипептида B5 содержит замену S273L или замену S273I.

Аспект 27. Компетентный по репликации, рекомбинантный онколитический вирус осповакцины из аспекта 23, где вариант полипептида B5 содержит замену N39G.

Аспект 28. Компетентный по репликации, рекомбинантный онколитический вирус осповакцины из аспекта 23, где вариант полипептида B5 содержит замену N94T.

Аспект 29. Компетентный по репликации, рекомбинантный онколитический вирус осповакцины из аспекта 23, где вариант полипептида B5 содержит замену L90R и замену S273V.

Аспект 30. Компетентный по репликации, рекомбинантный онколитический вирус осповакцины из аспекта 23, где вариант полипептида B5 содержит замену N39G и замену S273I.

Аспект 31. Компетентный по репликации, рекомбинантный онколитический вирус осповакцины из аспекта 23, где вариант полипептида B5 содержит замену K229C и замену S273L.

Аспект 32. Компетентный по репликации, рекомбинантный онколитический вирус осповакцины из аспекта 23, где вариант полипептида B5 содержит замену D263A, замену E270S, замену E272G и замену E275F.

Аспект 33. Компетентный по репликации, рекомбинантный онколитический вирус осповакцины из аспекта 23, где вариант полипептида B5 содержит замену I236P, замену V238R, замену T240R и замену E243G.

Аспект 34. Компетентный по репликации, рекомбинантный онколитический вирус осповакцины из аспекта 23, где вариант полипептида B5 содержит замену V233D, замену I236L, замену V238W, замену T240Y и замену E243R.

Аспект 35. Компетентный по репликации, рекомбинантный онколитический вирус осповакцины из аспекта 23, где вариант полипептида B5 содержит замену D263V, замену E268T, замену E270G, замену E272P и замену E275S.

Аспект 36. Компетентный по репликации, рекомбинантный онколитический вирус осповакцины из аспекта 23, где вариант полипептида B5 содержит замену N241T, замену E243V, замену V247S, замену G250R и замену A276F.

Аспект 37. Компетентный по репликации, рекомбинантный онколитический вирус осповакцины из аспекта 23, где вариант полипептида B5 содержит замену N241G, замену E243S, замену V247W, замену D248Y, замену G250A и замену A276F.

Аспект 38. Компетентный по репликации, рекомбинантный онколитический вирус осповакцины из любого из аспектов 1-37, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A34, где вариант полипептида A34 содержит замену K151E

Аспект 39. Компетентный по репликации, рекомбинантный онколитический вирус осповакцины из любого из аспектов 1-38, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A56.

Аспект 40. Компетентный по репликации, рекомбинантный онколитический вирус осповакцины из аспекта 39, где вариант полипептида A56 содержит замену аминокислоты 269.

Аспект 41. Компетентный по репликации, рекомбинантный онколитический вирус осповакцины из аспекта 40, где замена аминокислоты 269 представляет собой замену I269F.

Аспект 42. Компетентный по репликации, рекомбинантный онколитический вирус осповакцины из любого из аспектов 1-41, где вирус осповакцины содержит гетерологичную нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую иммуномодулирующий полипептид.

Аспект 43. Компетентный по репликации, рекомбинантный онколитический вирус осповакцины из любого из аспектов 1-41, где вирус осповакцины содержит модификацию, приводящую к потере экспрессии и/или функции J2R.

Аспект 44. Компетентный по репликации, рекомбинантный онколитический вирус осповакцины из любого из аспектов 1-41, где вирус осповакцины содержит обе: i) гетерологичную нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую иммуномодулирующий полипептид; и ii) модификацию, приводящую к потере экспрессии и/или функции J2R.

Аспект 45. Композиция, содержащая:

a) вирус осповакцины из любого из аспектов 1-44; и

b) фармацевтически приемлемый наполнитель.

Аспект 46. Способ индукции онколизиса у индивидуума, имеющего опухоль, включающий введение индивидууму эффективного количества вируса осповакцины из любого из аспектов 1-44 или композиции из аспекта 45.

Аспект 47. Способ из аспекта 46, где указанное введение включает введение однократной дозы вируса или композиции.

Аспект 48. Способ из аспекта 47, где однократная доза содержит по меньшей мере 10⁶ бляшкообразующих единиц (БОЕ) вируса осповакцины.

Аспект 49. Способ из аспекта 47, где однократная доза содержит от 10⁹ до 10¹² БОЕ вируса осповакцины.

Аспект 50. Способ из аспекта 46, где указанное введение включает введение множественных доз вируса осповакцины или композиции.

Аспект 51. Способ из аспекта 50, где вирус осповакцины или композицию вводят на каждые вторые сутки.

Аспект 52. Способ из аспекта 50, где вирус осповакцины или композицию вводят один раз в неделю.

Аспект 53. Способ из аспекта 50, где вирус осповакцины или композицию вводят каждую вторую неделю.

Аспект 54. Способ из любого из аспектов 46-53, где опухоль представляет собой злокачественную опухоль мозга, злокачественную опухоль головы и шеи, злокачественную опухоль пищевода, злокачественную опухоль кожи, злокачественную опухоль легкого, злокачественную опухоль тимуса, злокачественную опухоль желудка, злокачественную опухоль ободочной кишки, злокачественную опухоль печени, злокачественную опухоль яичника, злокачественную опухоль тела матки, злокачественную опухоль мочевого пузыря, злокачественную опухоль яичка, злокачественную опухоль прямой кишки, злокачественную опухоль молочной железы или злокачественную опухоль поджелудочной железы.

Аспект 55. Способ из любого из аспектов 46-53, где опухоль представляет собой колоректальный рак.

Аспект 56. Способ из любого из аспектов 46-53, где опухоль представляет собой немелкоклеточный рак легкого.

Аспект 57. Способ из любого из аспектов 46-53, где опухоль представляет собой рак молочной железы.

Аспект 58. Способ из аспекта 5576, где опухоль представляет собой трижды отрицательный рак молочной железы.

Аспект 59. Способ из любого из аспектов 46-58, где опухоль представляет собой солидную опухоль.

Аспект 60. Способ из любого из аспектов 46-58, где опухоль представляет собой опухоль жидких тканей.

Аспект 61. Способ из любого из аспектов 46-60, где опухоль является рецидивирующей.

Аспект 62. Способ из любого из аспектов 46-60, где опухоль представляет собой первичную опухоль.

Аспект 63. Способ из любого из аспектов 46-62, где опухоль является метастазирующей.

Аспект 64. Способ из любого из аспектов 46-63, дополнительно включающий подвергание индивидуума второй противораковой терапии.

Аспект 65. Способ из аспекта 64, где вторая противораковая терапия выбрана из химиотерапии, биологической терапии, радиотерапии, иммунотерапии, гормональной терапии, антиваскулярной терапии, криотерапии, терапии токсином, терапии онколитическим вирусом, клеточной терапии, генотерапии и хирургии.

Аспект 66. Способ из аспекта 64, где второе противораковое терапевтическое средство представляет собой ингибитор иммунной контрольной точки.

Аспект 67. Способ из аспекта 66, где ингибитор иммунной контрольной точки представляет собой антитело, специфическое для ингибитора иммунной контрольной точки, выбранного из CD27, CD28, CD40, CD122, CD96, CD73, CD47, OX40, GITR, CSF1R, JAK, PI3K-дельта, PI3K-гамма, TAM, аргиназы, CD137, ICOS, A2AR, B7-H3, B7-H4, BTLA, CTLA-4, LAG3, TIM3, VISTA, CD96, TIGIT, CD122, PD-1, PD-L1 и PD-L2.

Аспект 68. Способ из любого из аспектов 46-67, где индивидуум имеет иммунную недостаточность.

Аспект 69. Способ из любого из аспектов 46-68, где указанное введение вируса осповакцины или композиции является внутриартериальным, внутрибрюшинным, внутрипузырным или интратекальным.

Аспект 70. Способ из любого из аспектов 46-68, где указанное введение вируса осповакцины или композиции является внутриопухолевым.

Аспект 71. Способ из любого из аспектов 46-68, где указанное введение вируса осповакцины или композиции является перитуморальным.

Аспект 72. Способ из любого из аспектов 46-68, где указанное введение вируса осповакцины или композиции является внутривенным.

Аспект 73 Вирус осповакцины из любого из аспектов 1-44, или композиция из аспекта 45 для применения в способе индукции онколизиса у индивидуума, имеющего опухоль.

Аспект 74. Применение вируса осповакцины из любого из аспектов 1-44, или композиции из аспекта 45 в изготовлении лекарственного средства для применения в способе индукции онколизиса у индивидуума, имеющего опухоль.

ПРИМЕРЫ

Следующие примеры приведены так, чтобы предоставлять специалисту в данной области полное раскрытие и описание того, каким образом осуществлять и применять настоящее изобретение, и как не предназначены для ограничения объема того, что авторы настоящего изобретения рассматривают как их изобретение, так и не предназначены для представления того, что приведенные ниже эксперименты представляют собой все или единственные проведенные эксперименты. Предприняты усилия для обеспечения точности, применительно к используемым числам (например, количествам, температуре и т.д.), однако, необходимо учитывать некоторые экспериментальные ошибки и отклонения. Если не указано иное, части представляют собой части по массе, молекулярная масса представляет собой средневзвешенную молекулярную массу, температура приведена в градусах Цельсия, и давление является атмосферным или около атмосферного. Можно использовать стандартные сокращения, например, п.о., пара(ы) оснований; т.п.о., тысяча(и) пар оснований; пл, пиколитр(ы); с или сек, секунда(ы); мин, минута(ы); ч или час, час(ы); ак, аминокислота(ы); т.п.о., тысяча(и) пар оснований; п.о., пара(ы) оснований; н, нуклеотид(ы); i.m., внутримышечный(но); i.p., внутрибрюшинный(но); s.c., подкожный(но); и т.п..

ПРИМЕР 1

A. ПОЛУЧЕНИЕ БИБЛИОТЕКИ ОСТОВОВ ВИРУСОВ ОСПОВАКЦИНЫ

Остовы вирусов получали для облегчения клонирования, реактивации и конструирования множества библиотек в представляющих интерес локусах в геноме вируса осповакцины. Остовы вирусов содержали селективные маркеры тимидинкиназу вируса простого герпеса (HSV-TK) и слитый белок mCherry (подвергнутый оптимизации кодонного состава для экспрессии с вируса осповакцины) под контролем синтетического раннего-позднего промотора (pSEL). Донорную ДНК, содержащую кассету pSEL-HSV-TK/mCherry, фланкированную участками эндонуклеазы хоминга I-SceI и I-CeuI, и уникальными парами участков AarI в вышележащих и нижележащих областях гомологии с 1) локусами A33R/A34R, 2) локусом A56R или 3) локусом B5R, получали посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) с перекрывающимися праймерами, с использованием специфических праймеров для каждой области (IDT) и Phusion-HF (Thermo Fisher). Продукты ПЦР очищали с использованием набора для очистки и концентрирования ДНК Zymo DNA clean-and-concentrator-5 (ZymoResearch) и клонировали по тупым концам в челночный ДНК-вектор, поставленный в наборе для клонирования продуктов ПЦР Zero Blunt™ TOPO™ PCR Cloning (Thermo Fisher). ДНК секвенировали в Elim Biopharmaceuticals (Hayward, CA). Вирусную геномную ДНК из вируса осповакцины Copenhagen, содержащего делецию J2R и вставку люциферазы светляка-2A-eGFP под контролем промотора pSEL, выделяли и разрезали в одном из трех представляющих интерес локусов. Селективными маркерами заменяли каждый из представляющих интерес локусов: 1) локусы A33R/A34R, 2) локус A56R и 3) локус B5R генома вируса осповакцины, с использованием реактивации вируса. Кратко, клетки VERO-B4 (DSMZ) инфицировали с использованием вируса фибромы Шоупа (SFV; ATCC) в течение 2 часов при комнатной температуре, промывали и позволяли восстанавливаться при 37°C и 5% CO₂ в течение 1 час. Во время восстановления, смесь для трансфекции, содержащую геномную ДНК и донорную ДНК, смешивали с липофектамином 2000 (Thermo Fisher), в соответствии с инструкциями производителя. Инфицированные клетки трансфицировали с использованием смеси для трансфекции при 37°C и 5% CO₂ в течение 2 суток. Функциональный вирус выделяли посредством серийного разведения и выделения бляшек из клеток BSC-40 (Earl et al. (1998) Curr. Protocol. Mol. Biol. 43:16.17.1.). Из вирусных бляшек выделяли ДНК с использованием QuickExtract (Epicentre/Lucigen) и секвенировали по Сенгеру до и после 3 циклов очистки бляшек в Elim Biopharmaceuticals. Вирусы с подтвержденной последовательностью амплифицировали в клетках HeLa S3 (DSMZ), и очищали, как описано ниже. ДНК выделяли (Cotter et al, (2015) Curr. Protocol Mol. Biol. 39:14A.3.1.) и подвергали полногеномному секвенированию (WGS) (Seqmatic Hayward, CA). Анализ WGS проводили в лаборатории авторов настоящего изобретения с использованием программного обеспечения для настольных компьютеров Geneious (Biomatters Ltd.)

B. ПОЛУЧЕНИЕ БИБЛИОТЕК ДНК A33R, A34R, A56R И B5R ВИРУСОВ ОСПОВАКЦИНЫ

Библиотеки, содержащие одиночные аминокислотные замены, получали посредством ПЦР. ДНК-матрицу, содержащую последовательности вируса осповакцины Copenhagen для A33R и A34R (содержащего замену K151E), A56R или B5R, синтезировали (Genescript) для каждого локуса с уникальными участками клонирования AarI и SfiI выше промотора первого гена и ниже терминатора последнего гена. Библиотеки NNK, перекрывающие длину генов, конструировали для кодирующих последовательностей A33R, A34R, A56R и B5R. Вырожденные содержащие NNK праймеры (IDT), расположенные вплотную на протяжении кодирующих областей каждого белка, использовали для получения вариантов NNK для каждого локуса посредством ПЦР. Гомология между прямыми и обратными праймерами позволяла самосборку вариантов NNK для каждого кодона с использованием смеси для сборки NEBuilder® HiFi DNA Assembly (NEB). Реакционными смесями после сборки трансформировали химически компетентные E. coli Endura (Lucigen) и выращивали на селективных средах с агаром (среде Луриа с 100 мкг/мл карбенициллина, или LB+карб., Teknova). Колонии подсчитывали и трансформации продолжали до достижения ~20x количества колониеобразующих единиц (КОЕ) на NNK для каждого кодона в каждом локусе. Колонии выделяли с чашек посредством заливки и соскребания с использованием жидких сред LB+карб. (Teknova), аликвотировали и замораживали в 30% глицерине. Одну аликвоту для каждого кодона инокулировали в 96-луночный планшет, содержащий LB+50мкг/мл карб., встряхивали в течение ночи при 37°C и 900 об./мин; затем получали минипрепараты с использованием набора Nucleospin 96 Plasmid Transfection-grade (Macherey-Nagel). Минипрепараты разводили 1:100 в стерильной воде; затем донорную ДНК для каждого кодона амплифицировали с использованием специфических праймеров (IDT) для A33R/A34R, A56R и B5R, соответственно, с использованием Phusion-HF (Thermo Fisher). Ампликоны ПЦР для каждого рандомизированного кодона количественно оценивали с использованием набора для количественной оценки дцДНК AccuClear Ultra High Sensitivity dsDNA quantification (Biotium) на считывателе для планшетов Spectramax M5 (Molecular Devices) и секвенировали в Elim Biopharmaceuticals (Hayward, CA). Результаты секвенирования анализировали в лаборатории авторов настоящего изобретения с использованием Geneious (Biomatters Ltd.). Подтвержденные продукты ПЦР NNK нормализовали по концентрации, пулировали и использовали в качестве донорной ДНК для рекомбинации в вирус осповакцины. Библиотеки, содержащие рандомизированные представляющие интерес области в генах B5R, синтезировали в Genewiz с использованием способа вырожденного синтеза в определенных областях рандомизации. Оценки разнообразия библиотеки и аллельные частоты на стадии библиотеки ДНК определяли для всех библиотек.

C. ПОЛУЧЕНИЕ БИБЛИОТЕК ВИРУСОВ ДЛЯ A33, A34, A56 И B5 ВИРУСА ОСПОВАКЦИНЫ

Библиотеки вставляли в геном вируса осповакцины с использованием такого же способа, описанного для получения остовы вируса осповакцины или реактивации вируса. Кратко, клетки VERO-B4 (DSMZ) инфицировали вирусом фибромы Шоупа (SFV, ATCC) и трансфицировали расщепленной вирусной геномной ДНК и донорной ДНК. Вирусные частицы вируса осповакцины выделяли через 24 часа. Разнообразие немедленно после реактивации вируса оценивали посредством выделения бляшек, выделения ДНК с использованием Quick Extract (Epicentre/Lucigen) и секвенирования ампликонов ПЦР, как описано выше. Вирусы из каждой библиотеки амплифицировали в клетках HeLa S3. Препараты вируса для рассева, находящиеся на хранении, анализировали по разнообразию посредством амплификации каждого локуса и подвергания ампликонов секвенированию нового поколения (NGS, SeqMatic). Анализ разнообразия, присутствующего в специфической для каждого локуса библиотеке, осуществляли посредством бесплатной консольной программы VirVarSeq (на https://omictools(dot)com(forward slash)virvarseq-tool)) и последующей обработки с использованием Microsoft Excel. Амплифицированные библиотеки вирусов очищали посредством градиента сахарозы и ультрацентрифугирования (Cotter et al. (2015) Curr. Protocol Mol. Biol. 39:14A.3.1), как описано ниже. Очищенные библиотеки вирусов хранили при -80°C и титровали в двух повторах посредством анализа бляшкообразования, добавляя серийные разведения очищенного вируса к клеткам BSC-40 (ATCC), как описано ниже (Earl et al. (1998) Curr. Protocol. Mol. Biol. 43:16.17.1.).

D. НАПРАВЛЕННАЯ ЭВОЛЮЦИЯ

Несколько программ направленной эволюции in vitro и in vivo осуществляли для идентификации вариантов, способных к увеличенным продукции EEV и распространению вируса в комбинации с трансдукцией различных типов опухолей. Программы обобщены в таблице 1. Общий способ направленной эволюции обобщен на ФИГ. 5.

Таблица 1 Отбор Линия клеток Тип опухоли Сыворотка in vitro первичные клетки злокачественных опухолей и стимулированные посредством VEGF эндотелиальные клетки колоректальная; молочной железы; немелкоклеточная легкого; нормальный стимулированный посредством VEGF эндотелий -- in vitro HCT 116 колоректальная -- in vitro Colo 205 колоректальная -- in vitro MDA-MB-231 молочной железы -- in vitro MDA-MB-231 молочной железы вакцинированных доноров in vivo происходящий от пациента ксенотрансплантат в мыши NSG колоректальная -- in vivo происходящий от пациента ксенотрансплантат в гуманизированной мыши колоректальная --

На ФИГ. 5 представлен схематический пример одностадийного способа направленной эволюции, используемого для идентификации вариантов EEV in vitro. Содержащие вирус осповакцины библиотеки вирусных вариантов в соответствующей представляющей интерес области, в этом примере, области A33/A34, B5 и A56, сначала конструировали посредством крупномасштабных экспериментов по реактивации вируса до подвергания множеству циклов отбора в конкретных типах клеток. Способ направленной эволюции можно адаптировать либо для происходящих от пациента с злокачественной опухолью первичных клеток, либо для иммортализованных линий клеток злокачественных опухолей. Варианты вируса можно пропускать через циклы отбора в одном или множестве типов клеток. Кратко, способ начинают с вируса, способного к репликации и высвобождению в супернатант в первом выбранном типе клеток, с последующим сбором после 24-часового периода инкубации, амплификации и очистки (Цикл 1). Инфекционный вирус, полученный из цикла 1, затем используют для инфекции либо другого типа клеток, либо такого же типа клеток (Цикл 2). Исполнение циклов 1-4 рассматривают как 1 стадию способа направленной эволюции. Совместно, завершали всего 3 стадии. В зависимости от используемого типа клеток (происходящих от пациента с злокачественной опухолью первичных клеток или иммортализованных линий клеток злокачественных опухолей), следует предусматривать различные множественности инфекции (MOI).

Для множества циклов способа направленной эволюции, секвенирование репрезентативной фракции библиотеки проводили с использованием комбинации секвенирования нового поколения (NGS) ампликона, секвенирования по Сенгеру индивидуальных бляшек и полногеномного секвенирования (WGS). Частота, выраженная как процент от общей популяции, наиболее преобладающих вариантов значительно увеличивалась в ходе отборов.

E. КОНСТРУИРОВАНИЕ ПЛАЗМИД

Плазмиды, содержащие последовательности варианта A33R и/или A34R, получали с использованием способов синтеза генов. Последовательность, кодирующую каждый из вариантов замен, описанных ниже, подавали в GenScript для синтеза генов и вставляли в вектор pUC57-mini. Аминокислотные последовательности, кодируемые вариантами последовательностей A33 и A34, аннотированы в кратком описании ФИГ. 16 как SEQ ID NO:57-60, 61-67 и 81. Аминокислотные последовательности, кодируемые вариантами последовательности B5, аннотированы в кратком описании ФИГ. 23 как SEQ ID NO:68-79, 82 и 83. Аминокислотная последовательность, кодируемая вариантом последовательности A56, аннотирована в кратком описании ФИГ. 24 как SEQ ID NO:80.

F. ВИРУСЫ И КЛЕТКИ

Вирус осповакцины Copenhagen IGV-007 конструировали путем вставки посредством гомологичной рекомбинации кассеты люцифераза-2A-GFP под контролем промотора pSEL в ген вирусной тимидинкиназы J2R штамма Copenhagen вируса осповакцины. Экспрессию репортерного гена люциферазы подтверждали посредством люминесценции с использованием системы для анализа люциферазы Bright-Glo™ (Promega) и Spectramax M5 (Molecular Devices). Экспрессию GFP подтверждали посредством флуоресцентной микроскопии.

Вирусы осповакцины штамма Copenhagen, содержащие замену K151E в A34 (IGV-006), замену A88D в A33 (IGV-060), замену E129M в A33 (IGV-061), замену F94H в A34 (IGV-062), замены A88D и E129M в A33 (IGV-063), замену A88D в A33 и замену F94H в A34 (IGV-064), замену E129M в A33 и замену F94H в A34 (IGV-065), и замены A88D и E129M в A33, и замену F94H в A34 (IGV-066) конструировали посредством реактивации и гомологичной рекомбинации синтезированных генов в область гена A33R/A34R IGV-007. Вирусы осповакцины штамма Copenhagen, содержащие замену A88D в A33 и замену K151E в A34 (IGV-067), замену E129M в A33 и замену K151E в A34 (IGV-068), замены F94H и K151E в A34 (IGV-073), замены A88D и E129M в A33, и замену K151E в A34 (IGV-069), замену A88D в A33 и замены F94H и K151E в A34 (IGV-070), замену E129M в A33 и замены F94H и K151E в A34 (IGV-071), и замены A88D и E129M в A33, и замены F94H и K151E в A34 (IGV-072), конструировали посредством реактивации и гомологичной рекомбинации синтезированных генов в область гена A33R/A34R IGV-006. Успешную вставку варианта гена A33R и/или гена A34R в IGV-007 или IGV-006 подтверждали посредством секвенирования по Сенгеру индивидуальных выделенных бляшек. Вирусы амплифицировали и очищали, как описано ниже.

Вирусы осповакцины штамма Western Reserve, содержащие замену K151E в A34 (IGV-117), замены F94H и K151E в A34 (IGV-118), замену A88D в A33 и замены F94H и K151E в A34 (IGV-119), и замены A88D и E129M в A33, и замены F94H и K151E в A34 (IGV-120), конструировали посредством реактивации и гомологичной рекомбинации синтезированных генов в область гена A33R/A34R IGV-013. Вирус осповакцины Western Reserve (WR; ATCC) IGV-013 конструировали посредством гомологичной рекомбинации вставки кассеты люцифераза-2A-GFP под контролем промотора pSEL с тетрациклиновым оператором в ген вирусной тимидинкиназы J2R штамма WR вируса осповакцины. Экспрессию репортерного гена люциферазы подтверждали посредством люминесценции с использованием системы для анализа люциферазы Bright-Glo™ (Promega) и Spectramax M5 (Molecular Devices). Экспрессию GFP подтверждали посредством флуоресцентной микроскопии.

Клетки HeLa, U-2 OS и BSC-40 получали из ATCC. Клетки A549, HCT 116, Colo205 и MDA-MB-231 получали из Хранилища образцов опухолей и линий клеток опухолей NCI DCTD. Клетки HeLa S3 и VERO-B4 получали из DSMZ. Происходящие от пациента с злокачественной опухолью первичные клетки (молочной железы, колоректальные и легкого) получали из Conversant Bio. Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC) получали из Lonza. Клетки RK-13 получали из Sigma-Aldrich.

G. АМПЛИФИКАЦИЯ И ОЧИСТКА ВИРУСА

Клетки HeLa S3 (DSMZ) инфицировали посредством добавления вируса к монослою и инкубации в течение 1 часа в средах с 2,5% FBS. После инфекции, добавляли свежие среды, и монослой инфицированных клеток инкубировали в течение 48 часов, чтобы позволить репликацию и амплификацию вируса. После инкубации, клетки снимали и собирали посредством центрифугирования. Клетки лизировали посредством механического разрушения с использованием гомогенизатора Даунса (Wheaton). Очистку вируса осуществляли с использованием градиента 24% - 40% сахарозы и ультрацентрифугирования. Очищенный вирус аликвотировали, хранили при -80°C и титровали в двух повторах посредством анализа бляшкообразования, добавляя серийные разведения очищенного вируса к клеткам BSC-40 или к клеткам U-2 OS (ATCC), как описано ранее (Earl et al. (1998) Curr. Protocol. Mol. Biol. 43:16.17.1.).

H. ТИТРОВАНИЕ ВИРУСА ПОСРЕДСТВОМ АНАЛИЗА БЛЯШКООБРАЗОВАНИЯ

Титр вируса определяли посредством десятикратных серийных разведений, с конечным разведением 10^-9 из препарата для хранения концентрированного, очищенного вируса. Разведения вируса использовали для инфекции клеток BSC-40 или клеток U-2 OS для определения количества бляшкообразующих единиц на мл (БОЕ/мл). 1 мл каждого серийного разведения добавляли в двух повторах в лунки, содержащие конфлюэнтный монослой клеток, в стандартном 6-луночном микропланшете (BD Falcon). Клетки инфицировали в течение часа, промывали свежими средами, и покрывали раствором свежих сред, содержащих 1,5% карбоксиметилцеллюлозу (Teknova). После 48 или 72 часов инкубации, среды удаляли, и клетки фиксировали и окрашивали с использованием раствора 20% этанола, содержащего 0,1% кристаллического фиолетового (Sigma). Титр препарата для хранения затем определяли посредством подсчета количества бляшек в каждой лунке, нахождения среднего между двумя повторами титров и коррекции на фактор разведения.

I. ИНФЕКЦИОННЫЙ ВИРУС В СУПЕРНАТАНТАХ КЛЕТОК ОПУХОЛЕЙ ЧЕЛОВЕКА

Репликацию вируса в линиях клеток опухолей A549 (NCI), Colo205 (NCI), MDA MB 231 (NCI), HT-29 (NCI), SW-620 (NCI) и HeLa (DSMZ) определяли посредством инфекции монослоя клеток вирусом при MOI 1 или 3 в течение 1 часа в трех повторах. После инфекции, вирусный инокулят промывали 3 раза и заменяли на свежие среды. Вирус, продуцированный в супернатанте и клетках, собирали по отдельности в средах через 24 часа после инфекции. Вирус в супернатанте титровали немедленно в двух повторах с использованием способа анализа бляшкообразования, описанного выше. Вирус, содержащийся в осадке клеток, замораживали и хранили при -80°C.

J. АНАЛИЗ КОМЕТ

Монослои клеток BSC-40, рассеянных в 6-луночные планшеты, инфицировали с использованием 1 мл 10-кратных серийных разведений вируса в течение 1 часа. Инфицированные клетки промывали 3 раза, дополняли свежими средами и инкубировали в течение 48 или 72 часов с углом 40° при 37°C. Монослои клеток окрашивали с использованием раствора 20% этанола, содержащего 0,1% кристаллический фиолетовый (Sigma) в течение 2 часов для визуализации комет.

K. АНАЛИЗ РАСПРОСТРАНЕНИЯ

Для двухстадийного анализа инфекционности, клетки U-2 OS (остеосаркомы), RK-13 (почки кролика), VERO-B4 (почки африканской зеленой мартышки), A549 (аденокарциномы легкого) или MDA-MB-231 (рака молочной железы) инфицировали с использованием лежит диапазона MOI в течение 1 час. Инфицированные клетки промывали 3 раза и инкубировали в течение 20-24 часов, в этой временной точке супернатант собирали. Супернатант осветляли от клеточного дебриса посредством центрифугирования на низкой скорости и использовали для инфекции нового планшета соответствующих клеток, рассеянных в 96-луночном планшете с белыми стенками (Greiner). Через пятнадцать или двадцать четыре часа после инфекции второго планшета, активность люциферазы оценивали в спектрофотометре Spectramax M5 с использованием системы для анализа люциферазы Bright-Glo (Promega).

L. КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА EEV

Образцы вируса, имеющие обогащение частицами внутриклеточного зрелого вируса (IMV) или обогащение частицами внеклеточного оболочечного вируса (EEV), разделяли и очищали с использованием способа ультрацентрифугирования в градиенте плотности CsCl. Вирус наслаивали на градиент 25% - 30% CsCl и центрифугировали в течение 18 часов при 175000 rcf. Полосы, содержащие обогащенные фракции, экстрагировали в определенных положениях в градиенте плотности, и CsCl удаляли. Образцы инкубировали с конъюгированным антителом против B5 до количественной оценки. Частицы размером с вирус (VSP) и VSP, содержащие антиген B5 (показатель EEV), количественно оценивали с использованием проточного микроцитометра (Apogee).

ПРИМЕР 2

При первом отборе идентифицировали варианты, способные к увеличенному распространению и продукции EEV после инфекции первичных клеток различных злокачественных опухолей (ободочной кишки, молочной железы и легкого) и стимулированных посредством VEGF эндотелиальных клеток. Идентифицировали два варианта, для которых показана увеличенная частота в секвенированной популяции (ФИГ. 6). Для двух вариантов, одного, содержащего замены A88D и E129M в последовательности A33, и одного, содержащего замену F94H в последовательности A34, показано значительное обогащение (в 900 раз и 400 раз, соответственно) в цикле 11 (ФИГ. 6).

На ФИГ. 6 представлены данные частоты конкретных вариантов вируса осповакцины в различных циклах способа направленной эволюции для идентификации вариантов, способных к увеличенному распространению и продукции EEV после инфекции различных первичных клеток злокачественных опухолей человека и стимулированных посредством VEGF эндотелиальных клеток. Репрезентативную фракцию из библиотеки секвенировали после начальной амплификации в HeLa S3, цикла 3, цикла 4, цикла 9, цикла 10 и цикла 11 с использованием комбинации секвенирования нового поколения (NGS) ампликона, секвенирования по Сенгеру индивидуальных бляшек (секвенирования бляшек) и полногеномного секвенирования (WGS). Частота двух наиболее преобладающих вариантов, выраженная как процент от общей популяции, значительно увеличивалась в ходе отбора. Обогащение вариантом A33, содержащим замены A88D и E129M, и вариантом A34, содержащим замены F94H и K151E, показывает, что эти замены увеличивают способность вируса осповакцины к увеличению распространения и продукции EEV после инфекции первичных клеток злокачественных опухолей человека. n.d., не выполняли.

Влияние вариантов замен на распространение вируса и продукцию EEV оценивали in vitro с использованием линий клеток BSC-40 (почки африканской зеленой мартышки) и U-2 OS (остеосаркомы человека). Вирусы осповакцины Copenhagen, содержащие последовательности A33 и A34 дикого типа (IGV-007), замену K151E в A34 (IGV-006; известную мутацию для увеличения распространения и продукции EEV), замены A88D и E129M в A33 и замену K151E в A34 (IGV-051), или замены F94H и K151E в A34 (IGV-052), получали и изготавливали, как описано в примере 1. Анализ комет проводили, как описано в примере 1. Присутствие более длинных хвостов комет (ФИГ. 7A) для вариантов вирусов осповакцины, по сравнению с вирусом осповакцины Copenhagen, содержащим последовательности A33 и A34 дикого типа, указывает на увеличенное распространение вируса и таким образом, больше EEV, продуцированных вариантами вирусов осповакцины, конкретно, для IGV-051 и IGV-052. Распространение вариантов дополнительно оценивали с использованием анализа распространения, описанного в примере 1. При сравнении с вирусами осповакцины Copenhagen, содержащими последовательности A33 и A34 дикого типа (IGV-007) и замену K151E в A34 (IGV-006), варианты вирусов осповакцины (IGV-051 и IGV-052) образовывали более высокое количество относительных световых единиц (RLU), что указывало на увеличенное распространение вируса (ФИГ. 7B). Эти исследования иллюстрируют, что включение замен в A33 и A34, в частности, в положениях A88 и E129 в A33 и в положении F94 в A34, в комбинации с заменой K151E в A34, приводит к увеличению продукции EEV и таким образом, распространения вируса.

На ФИГ. 7A-7B представлены данные распространения вируса и продукции EEV для вариантов вируса осповакцины, содержащих замены A33 и A34. A) Репрезентативные изображения комет, образованных после инфекции клеток BSC-40, показывают, что для вариантов вируса осповакцины получали в результате более длинные хвосты комет, показатель лучшего распространения и увеличенной продукции EEV, по сравнению с вирусом осповакцины Copenhagen, содержащим последовательности A33 и A34 дикого типа (вверху слева), и вирусом осповакцины Copenhagen, содержащим замену K151E в A34 (известную мутацию для увеличения распространения вируса и продукции EEV; вверху справа). B) Двухстадийный анализ инфекционности для измерения распространения вируса, в котором клетки U-2 OS сначала инфицировали с использованием различных 3-кратных разведений множественностей инфекции (MOI) вируса осповакцины, затем супернатант собирали через 22 часа после инфекции, осветляли и использовали для инфекции нового планшета клеток U-2 OS. Люциферазу, экспрессированную с вируса, измеряют через 15 часов после инфекции, и увеличенные уровни люциферазы коррелируют с более высокими частотами инфекции и репликации вируса. Таким образом, более высокий уровень люциферазы является показателем увеличенного распространения. Данные представлены как кратность увеличения, по сравнению с экспрессией люциферазы в IGV-006 (вирусе осповакцины Copenhagen, содержащем замену K151E в A34). Для обоих вариантов вируса осповакцины показано почти семикратное увеличение распространения вируса, по сравнению с вирусом Copenhagen без замен в A34 (IGV-007), которое может приводить к улучшенной онколитической активности в злокачественной опухоли посредством лучшей способности к внутриопухолевому распространению. IGV-007 представляет собой Copenhagen (контроль), IGV-006 представляет собой Copenhagen с заменой A34 K151E, IGV-051 представляет собой Copenhagen с заменами A34 F94H и K151E, IGV-052 представляет собой замены A33 A88D и E129M, и A34 K151E. Планки погрешностей показывают SD (n=3). Звездочки обозначают статистическую значимость, по сравнению с вирусом осповакцины Copenhagen с заменой K151E в гене A34R (IGV-006) (*p < 0,05; **p < 0,001; t-критерий Стьюдента).

ПРИМЕР 3

Влияние вариантов замен на инфекционный вирус, образованный в супернатанте (продукцию EEV) в различных линиях клеток злокачественных опухолей человека, оценивали in vitro с использованием клеток A549 (аденокарциномы легкого), клеток MDA-MB-231 (аденокарциномы молочной железы), клеток Colo205 (колоректальной аденокарциномы) и клеток HeLa (рака шейки матки). Вирусы осповакцины Copenhagen, содержащие последовательности A33 и A34 дикого типа (IGV-007), замену K151E в A34 (IGV-006; известную мутацию для увеличения распространения вируса и продукции EEV), замены A88D и E129M в A33 и замену K151E в A34 (IGV-051), или замены F94H и K151E в A34 (IGV-052), получали и изготавливали, как описано в примере 1. Все линии клеток, перечисленные выше, инфицировали с использованием MOI 1 и тщательно промывали 3 раза после 1 часа адсорбции вируса. Через 24 часа после инфекции, супернатант собирали, и количество инфекционных вирусов, продуцированных в супернатанте (потенциально, EEV) определяли посредством анализа бляшкообразования, как описано в примере 1. Во всех четырех линиях клеток, варианты замен, содержащие замены A88D и E129M в A33 и замену K151E в A34 (IGV-051) или замены F94H и K151E в A34 (IGV-052), продуцировали более высокое количество инфекционных вирусов в супернатанте (потенциально, EEV) (ФИГ. 8A-8D). Это исследование показывает, что включение мутаций в A33 и A34, в частности, в положениях A88 и E129 в A33, и в положении F94 в A34, в комбинации с заменой K151E в A34, приводит к увеличенной продукции инфекционного EEV в различных линиях клеток злокачественных опухолей.

На ФИГ. 8A-8D представлены данные продукции вируса осповакцины для инфекционного вируса, высвобожденного в супернатант на ранних стадиях цикла инфекции (потенциально, EEV) в репрезентативных линиях клеток злокачественных опухолей человека. A) клетки A549 (аденокарциномы легкого), B) клетки MDA-MB-231 (аденокарциномы молочной железы), C) клетки Colo205 (колоректальной аденокарциномы) и D) клетки HeLa (рака шейки матки) инфицировали вирусом осповакцины с MOI 1. Через двадцать четыре часа после инфекции, количество инфекционных вирусов, высвобожденных в супернатант (потенциально, частиц EEV), определяли посредством анализа бляшкообразования. Кратность увеличения количества инфекционных вирусов, высвобожденных в супернатант для каждой линии клеток злокачественных опухолей, рассчитывали для каждого варианта вируса, по сравнению с вирусом Copenhagen, содержащим последовательности A33 и A34 дикого типа (IGV-007). Присутствует значимое увеличение количества инфекционных вирусов в супернатанте для обеих вариантов вируса осповакцины, по сравнению с Copenhagen, содержащим последовательности A33 и A34 дикого типа, и вирусом осповакцины Copenhagen, содержащим замену K151E в A34 (известную мутацию для увеличения распространения вируса и продукции EEV) во всех тестированных линий клеток злокачественных опухолей. IGV-007 представляет собой Copenhagen (контроль), IGV-006 представляет собой Copenhagen с заменой A34 K151E, IGV-051 представляет собой Copenhagen с заменами A34 F94H и K151E, IGV-052 представляет собой замены A33 A88D и E129M и A34 K151E. Планки погрешностей обозначают SD (n=3). Звездочки обозначают статистическую значимость против вируса осповакцины Copenhagen, содержащего последовательности A33 и A34 дикого типа (IGV-007) (*p<0,5, **** < 0,0001; однофакторный ANOVA и критерий множественных сравнений Даннетта).

ПРИМЕР 4

Влияние вариантов замен на распространение вируса осповакцины в различных линиях клеток злокачественных опухолей человека оценивали in vitro с использованием клеток A549 (аденокарциномы легкого) и клеток MDA-MB-231 (аденокарциномы молочной железы). Вирусы осповакцины Copenhagen, содержащие последовательности A33 и A34 дикого типа (IGV-007), замену K151E в A34 (IGV-006; известную мутацию для увеличения распространения вируса и продукции EEV), замены A88D и E129M в A33, и замену K151E в A34 (IGV-051), или замены F94H и K151E в A34 (IGV-052) получали и изготавливали как описано в примере 1. Клетки A549 (аденокарциномы легкого) и клетки MDA-MB-231 (аденокарциномы молочной железы) инфицировали с использованием серийных разведений MOI всех тестированных вирусов, и клетки промывали 3 раза через 1 час. Супернатант собирали через 22 часа после инфекции, осветляли и использовали для инфекции нового планшета клеток. Через 15 часов после инфекции, активность люциферазы в клетках на втором планшете оценивали посредством количественной оценки люминесценции с использованием системы для анализа люциферазы Bright-Glo (Promega). В обеих линиях клеток, варианты замен, содержащие замены A88D и E129M в A33, и замену K151E в A34 (IGV-051) или замены F94H и K151E в A34 (IGV-052), приводили к более высокой детекции люциферазы (ФИГ. 9A-9B), которая является показателем превосходящей инфекции и распространения. Это исследование, кроме того, иллюстрирует, что включение замен в A33 и A34, в частности, в положениях A88 и E129 в A33, и в положении F94 в A34 в комбинации с заменой K151E в A34, приводит к увеличенному распространению вируса в различных линиях клеток злокачественных опухолей человека.

На ФИГ. 9A-9B представлены данные распространения вируса осповакцины в репрезентативных линиях клеток злокачественных опухолей человека. A) клетки A549 (аденокарциномы легкого), и B) клетки MDA-MB-231 (рака молочной железы) инфицировали вирусом осповакцины при MOI 1,25 в течение 1 часа. Через двадцать два часа после инфекции, супернатант собирали, осветляли и использовали для инфекции нового планшета клеток. Активность люциферазы (измеренную как RLU) определяли через 15 часов после вторичной инфекции. Более высокую активность люциферазы наблюдали для вариантов вирусов осповакцины, что показывает, что они являются способными к более сильному распространению в различных клетках злокачественных опухолей человека. IGV-007 представляет собой Copenhagen (контроль), IGV-006 представляет собой Copenhagen с заменой A34 K151E, IGV-051 представляет собой Copenhagen с заменами A34 F94H и K151E, IGV-052 представляет собой замены A33 A88D и E129M, и A34 K151E. Планки погрешностей показывают SD (n=3). Звездочки обозначают статистическую значимость, по сравнению с вирусом осповакцины Copenhagen, содержащим последовательности A33 и A34 дикого типа (IGV-007) (***p < 0,001, **** < 0,0001; однофакторный ANOVA и критерий множественных сравнений Даннетта).

ПРИМЕР 5

Мутации A33 и A34, идентифицированные в вирусах IGV-051 и IGV-52 использовали для конструирования новых вирусов с использованием IGV-006 и IGV-007 в качестве вирусных остовов, во всех возможных комбинациях, как описано в примере 1. Оценка всех одиночных замен и комбинаций мутаций A88D, E129M, F94H и K151E позволяла идентификацию дополнительных комбинаций и замен, которые обеспечивали преимущества для распространения. Влияние одиночных или множественных замен на продукцию EEV и распространение вируса оценивали in vitro с использованием линий клеток BSC-40 (почки африканской зеленой мартышки) и U-2 OS (остеосаркомы человека), как описано в примере 1. Вирусы осповакцины Copenhagen, содержащие последовательности A33 и A34 дикого типа (IGV-007), замену K151E в A34 (IGV-006; известную мутацию для увеличения распространения вируса и продукции EEV), замену A88D в A33 (IGV-060), замену E129M в A33 (IGV-061), замену F94H в A34 (IGV-062), замены A88D и E129M в A33 (IGV-063), замену A88D в A33 и замену F94H в A34 (IGV-064), замену E129M в A33 и замену F94H в A34 (IGV-065), замены A88D и E129M в A33, и замену F94H в A34 (IGV-066), замену A88D в A33 и замену K151E в A34 (IGV-067), замену E129M в A33 и замену K151E в A34 (IGV-068), замену A88D и E129M в A33, и замену K151E в A34 (IGV-069), замену A88D в A33 и замены F94H и K151E в A34 (IGV-070), замену E129M в A33 и замены F94H и K151E в A34 (IGV-071), замены A88D и E129M в A33, и замены F94H и K151E в A34 (IGV-072) или замены F94H и K151E в A34 (IGV-073), получали и изготавливали, как описано в примере 1. Анализ комет проводили, как описано в примере 1. В этом анализе, комбинации замен, включающие F94H, постоянно приводили к более длинным и более широко распространенным хвостам комет (ФИГ. 10A: IGV-062, IGV-064, IGV-065, IGV-066 против IGV-007). И наоборот, присутствие A88D или E129M, по-видимому, приводило к слабому, но все еще заметному влиянию на размер исходных комет (ФИГ. 10A: IGV-066, IGV-064, IGV-061 против IGV-007). Комбинация A88D и F94H является синергической: немного уменьшающей размер бляшек, с расширением в то же время распространения хвостов комет (ФИГ. 10A: IGV-60, IGV-62 против IGV-64). В присутствии K151E, содержащие F94H вирусы постоянно имели усиленное формирование комет (ФИГ. 11A: IGV-073 против IGV-006, IGV-070 против IGV-067, IGV-071 против IGV-068, IGV-072 против IGV-069). Распространение вариантов оценивали с использованием анализа распространения, описанного в примере 1. Активность люциферазы сравнивали с активностью люциферазы вируса осповакцины Copenhagen, содержащего последовательности A33 и A34 дикого типа (IGV-007), и активностью люциферазы вируса осповакцины Copenhagen, содержащего замену K151E в A34 (IGV-006), и регистрировали как кратность увеличения (ФИГ. 10B, ФИГ. 11B). По сравнению с вирусами осповакцины Copenhagen, содержащими последовательности A33 и A34 дикого типа (IGV-007), замена F94H в A34 (IGV-062), замена A88D в A33 и замена F94H в A34 (IGV-064), замена E129M в A33 и замена F94H в A34 (IGV-065), и замены A88D и E129M в A33, и замена F94H в A34 (IGV-066), приводили к более высокой активности люциферазы, что показывает, что варианты вирусов осповакцины являются способными к более сильному распространению (ФИГ. 10B). По сравнению с вирусом осповакцины Copenhagen, содержащим замену K151E в A34 (IGV-006), замены A88D и E129M в A33, и замена K151E в A34 (IGV-069), замена A88D в A33 и замены F94H и K151E в A34 (IGV-070), замена E129M в A33 и замены F94H и K151E в A34 (IGV-071), замены A88D и E129M в A33 и замены F94H и K151E в A34 (IGV-072), и замены F94H и K151E в A34 (IGV-073), приводили к более высокой активности люциферазы, что показывает, что варианты вирусов осповакцины являются способными к более сильному распространению (ФИГ. 11B). Это исследование, кроме того, иллюстрирует, что включение мутаций в A33 и A34, в частности, в положениях A88 и E129 в A33 и в положении F94 в A34, либо отдельно, либо в комбинации, приводит к увеличенной продукции EEV и увеличенному распространению вируса в клетках злокачественных опухолей человека.

На ФИГ. 10A-10B представлены данные для различных замен и комбинаций замен вариантов вируса осповакцины в отсутствие замены K151E в A34, для продукции EEV и распространения вируса. A) Репрезентативные изображения комет, сформированных после инфекции клеток BSC-40, показывают, что некоторые варианты вирусов осповакцины в отсутствие замены A34 K151E приводят к образованию более длинных хвостов комет, показателю увеличенного распространения вируса и продукции EEV, по сравнению с вирусом осповакцины Copenhagen без замен в A34 (IGV-007, вверху слева). B) клетки U-2 OS инфицировали вирусом осповакцины при MOI 0,6 в течение 1 часа. Через двадцать два часа после инфекции, супернатант собирали, осветляли, и использовали для инфекции нового планшета клеток. Уровни люциферазы (измеренные как RLU) определяли через 15 часов после вторичной инфекции. Уровни люциферазы, по сравнению с уровнями люциферазы вируса осповакцины Copenhagen без замен в A34 (IGV-007), регистрировали как кратность увеличения. Более высокий уровень люциферазы наблюдали для большинства одиночных замен и комбинаций замен, что показывает, что варианты вирусов осповакцины являются способными к более сильному распространению. IGV-007 представляет собой Copenhagen (контроль), IGV-060 представляет собой замену A33 A88D, IGV-061 представляет собой замену A33 E129M, IGV-062 представляет собой замену A34 F94H, IGV-063 представляет собой замены A33 A88D и E129M, IGV-064 представляет собой замены A33 A88D и A34 F94H, IGV-065 представляет собой замены A33 E129M и A34 F94H, IGV-066 представляет собой замены A33 A88D и E129M, и A34 F94H. Планки погрешностей обозначают SD (n=3). Звездочки обозначают статистическую значимость, по сравнению с вирусом осповакцины Copenhagen без замен в A34 (IGV-007) (**p < 0,01, ***p < 0,001, **** < 0,0001; однофакторный ANOVA и критерий множественных сравнений Даннетта).

На ФИГ. 11A-11B представлены данные для различных замен и комбинаций замен вариантов вируса осповакцины, в дополнение к замене K151E в A34, для продукции EEV и распространения вируса. A) Репрезентативные изображения комет, сформированных после инфекции клеток BSC-40, показывают, что варианты вирусов осповакцины в присутствии замены A34 K151E приводят к образованию более длинных хвостов комет, показателю увеличенного распространения вируса и продукции EEV, по сравнению с вирусом осповакцины Copenhagen, содержащим замену K151E в A34 (IGV-006, вверху слева). B) клетки U-2 OS инфицировали вирусом осповакцины при MOI 0,33 в течение 1 час. Через двадцать два часа после инфекции, супернатант собирали, осветляли, и использовали для инфекции нового планшета клеток . Уровни люциферазы (измеренные как RLU) определяли через 15 часов после вторичной инфекции. Уровни люциферазы, по сравнению с уровнями люциферазы вируса осповакцины Copenhagen, содержащего замену K151E в A34 (IGV-006), регистрировали как кратность увеличения. Более высокий уровень люциферазы наблюдали для большинства комбинаций вариантов, что показывает, что варианты вирусов осповакцины являются способными к более сильному распространению. IGV-006 представляет собой Copenhagen с заменой A34 K151E (контроль), IGV-067 представляет собой замены A33 A88D и A34 K151E, IGV-068 представляет собой замены A33 E129M и A34 K151E, IGV-073 представляет собой замены A34 F94H и K151E, IGV-069 представляет собой замены A33 A88D и E129M, и A34 K151E, IGV-070 представляет собой замены A33 A88D и A34 F94H и K151E, IGV-071 представляет собой замены A33 E129M и A34 F94H и K151E, IGV-072 представляет собой замены A33 A88D и E129M, и A34 F94H и K151E. Планки погрешностей обозначают SD (n=3). Звездочки обозначают статистическую значимость, по сравнению с Copenhagen A34 K151E (IGV-006) (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, **** < 0,0001; однофакторный ANOVA и критерий множественных сравнений Даннетта).

ПРИМЕР 6

Для дополнительной оценки влияния вариантов замен на общую физическую продукцию частиц EEV и специфическую инфекционность в клетках злокачественных опухолей, определяли количество физических и инфекционных EEV, продуцированных в клетках HeLa S3 (аденокарциномы шейки матки) через 24 часа после инфекции. Супернатант от инфицированных клеток HeLa S3 собирали и очищали посредством градиентов хлорида цезия (CsCl) для получения очищенных EEV. Инфекционные EEV титровали посредством анализа бляшкообразования, как описано в примере 1. Физическое количество частиц размером с вирион (VSP) и процент этих частиц, окрашенных с использованием антитела B5, количественно оценивали посредством Apogee. Для вариантов вирусов, содержащих замены A88D и E129M в A33, и замену K151E в A34 (IGV-051), замены F94H и K151E в A34 (IGV-052), и замену A88D в A33 и замены F94H и K151E в A34 (IGV-070), получали более высокий процент физических частиц EEV, измеренный посредством окрашивания антителом белка мембраны EEV B5, по сравнению с вирусом осповакцины Copenhagen, содержащим последовательности A33 и A34 дикого типа (IGV-007) (ФИГ. 12A). В дополнение к увеличенному количеству образованных физических частиц EEV, варианты вирусов (IGV-051, IGV-052 и IGV-070) продуцировали EEV с увеличенной специфической инфекционностью, измеренной посредством расчета инфекционности VSP, деленной на БОЕ, по сравнению с вирусом осповакцины Copenhagen, содержащим последовательности A33 и A34 дикого типа (IGV-007), и вирусом осповакцины Copenhagen с заменой K151E в A34 (IGV-006; известной мутацией для увеличения распространения вируса и продукции EEV) (ФИГ. 12B). Это исследование дополнительно иллюстрирует, что включение мутаций в A33 и A34, в частности, в положениях A88 и E129 в A33, и в положении F94 в A34, в комбинации с заменой K151E в A34, приводит к увеличенной продукции физических EEV с увеличенной специфической инфекционностью.

На ФИГ. 12A-12B представлены данные для различных вариантов вируса осповакцины для продукции физических EEV и специфической инфекционности в линии клеток HeLa S3 (аденокарциномы шейки матки). Клетки HeLa S3 (аденокарциномы шейки матки) инфицировали с использованием различных вариантов вируса осповакцины. Через двадцать четыре часа после инфекции, вирусные частицы из супернатанта собирали и очищали посредством градиента CsCl. Полосу градиента, соответствующую плотности EEV, выделяли. Общее количество частиц размером с вирус (VSP), процент B5+ VSP и инфекционного вируса, продуцированного в супернатанте, количественно оценивали. A) Процент B5+ VSP (показатель присутствия белка оболочки EEV), количественно оценивали посредством Apogee. Данные регистрируют как кратность увеличения каждого варианта рекомбинантного вируса, по сравнению с вирусом осповакцины Copenhagen, содержащим последовательности A33 и A34 дикого типа (IGV-007). B) Специфическую инфекционность частиц EEV рассчитывают как соотношение инфекционного вируса на физическую VSP в супернатанте. Данные регистрируют как кратность увеличения, по сравнению с вирусом осповакцины Copenhagen, содержащим последовательности A33 и A34 дикого типа (IGV-007). Увеличенное количество физических и инфекционных вирусных частиц EEV, по сравнению с вирусом осповакцины Copenhagen, содержащим последовательности A33 и A34 дикого типа, и вирусом осповакцины Copenhagen, содержащим замену K151E в A34 (IGV-006), показывает, что варианты вирусов осповакцины увеличивают продукцию EEV, так же как их специфическую инфекционность. IGV-007 представляет собой Copenhagen (контроль), IGV-006 представляет собой Copenhagen с заменой A34 K151E (контроль), IGV-051 представляет собой замены A33 A88D и E129M, и A34 K151E, IGV-052 представляет собой замены A34 F94H и K151E, IGV-070 представляет собой замены A33 A88D, и A34 F94H и K151E.

ПРИМЕР 7

Влияние вариантов вируса на продукцию EEV и распространение вируса для штамма вируса осповакцины Western Reserve (WR) оценивали in vitro с использованием линий клеток RK-13 (почки кролика) и VERO-B4 (почки африканской зеленой мартышки). Вирусы осповакцины WR, содержащие последовательности A33 и A34 дикого типа (IGV-013), замену K151E в A34 (IGV-117; известную мутацию для увеличения распространения вируса и продукции EEV), замены F94H и K151E в A34 (IGV-118), замену A88D в A33 и замены F94H и K151E в A34 (IGV-119), и замены A88D и E129M в A33, и замены F94H и K151E в A34 (IGV-120), получали и изготавливали, как описано в примере 1. Распространение вариантов оценивали с использованием анализа распространения, описанного в примере 1. При сравнении с вирусом осповакцины WR, содержащим последовательности A33 и A34 дикого типа (IGV-013), варианты вирусов осповакцины образовывали более высокую степень относительных световых единиц (RLU), что указывает на увеличенное распространение вируса (ФИГ. 13). Эти исследования иллюстрируют, что включение мутаций в A33 и A34, в частности, в положениях A88 и E129 в A33, и в положении F94 в A34, в комбинации с заменой K151E в A34, приводит к увеличенной продукции EEV и таким образом, распространению вируса в других штаммах вируса осповакцины, подобных WR.

На ФИГ. 13A-13B представлены данные для различных вариантов замен вируса осповакцины, в комбинации с заменой K151E в A34, на продукцию EEV и распространение вируса штамма Western Reserve. A) Клетки RK-13 инфицировали вирусом осповакцины при MOI 50 в течение 1 час. Через двадцать четыре часа после инфекции, супернатант собирали, осветляли, и использовали для инфекции нового планшета клеток. Уровни люциферазы (измеренные как RLU) определяли через 24 часа после вторичной инфекции. Уровни люциферазы вариантов, по сравнению с уровнями люциферазы вируса осповакцины Western Reserve (IGV-013), регистрируют как кратность увеличения. B) клетки VERO-B4 инфицировали вирусом осповакцины при MOI 50 в течение 1 час. Через двадцать четыре часа после инфекции, супернатант собирали, осветляли и использовали для инфекции нового планшета клеток. Уровни люциферазы (измеренные как RLU) определяли через 24 часа после вторичной инфекции. Уровни люциферазы вариантов, по сравнению с уровнями люциферазы вируса осповакцины Western Reserve (IGV-013), регистрируют как кратность увеличения. Более высокие уровни люциферазы наблюдали для всех комбинаций вариантов, что показывает, что варианты вирусов осповакцины являются способными к более сильному распространению. IGV-013 представляет собой Western Reserve с последовательностями A33 и A34 дикого типа (контроль), IGV-117 представляет собой Western Reserve с заменой A34 K151E (контроль), IGV-118 представляет собой замены A34 F94H и K151E, IGV-119 представляет собой замены A33 A88D и A34 F94H и K151E, IGV-120 представляет собой замены A33 A88D и E129M, и A34 F94H и K151E. Планки погрешностей обозначают SD (n=3). Звездочки обозначают статистическую значимость, по сравнению с Western Reserve (IGV-013) (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, **** < 0,0001; однофакторный ANOVA и критерий множественных сравнений Даннетта).

ПРИМЕР 8

В следующем отборе идентифицировали варианты, способные к увеличенному распространению вируса и продукции EEV после инфекции клеток колоректальной злокачественной опухоли человека HCT 116. Идентифицировали четыре варианта, для которых показана увеличенная частота в секвенированной популяции (ФИГ. 14). Из четырех вариантов, для варианта, содержащего замену R91S в последовательности A34, показано наибольшее обогащение в конечном цикле отбора (ФИГ. 14).

На ФИГ. 14 представлены данные частоты специфических вариантов вируса осповакцины в конечном цикле способа направленной эволюции для идентификации вариантов, способных к увеличенному распространению вируса и продукции EEV после инфекции и отбора на клетках колоректального рака человека HCT 116. Репрезентативную фракцию библиотеки секвенировали после конечного цикла отбора с использованием полногеномного секвенирования (WGS) или секвенирования по Сенгеру индивидуальных бляшек. Частота четырех наиболее преобладающих вариантов, выраженная как процент от общей популяции, значительно увеличивалась в ходе отбора. Обогащение по вариантам A34, содержащим замены R91S, T127E, R84G или F94H, показывает, что эти замены увеличивают способность вируса осповакцины к распространению и продукции EEV после инфекции клеток злокачественных опухолей человека.

Влияние вариантов замен на продукцию EEV и распространение вируса оценивали in vitro с использованием линий клеток BSC-40 (почки африканской зеленой мартышки) и U-2 OS (остеосаркомы человека). Вирусы осповакцины Copenhagen, содержащие последовательности A33 и A34 дикого типа (IGV-007), замену K151E в A34 (IGV-006; известную мутацию для увеличения распространения вируса и продукции EEV), замены R91S и K151E в A34 и замену I269F в A56 (IGV-084), замены T127E и K151E в A34 (IGV-085), замены R84G и K151E в A34 (IGV-086), или замены R91A и K151E в A34 (IGV-087), получали и изготавливали, как описано в примере 1. Анализ комет проводили, как описано в примере 1. Присутствие более длинных хвостов комет (ФИГ. 15A) для вариантов вирусов осповакцины, по сравнению с вирусом осповакцины Copenhagen, содержащим последовательность A34 дикого типа, указывает на большее распространение вируса и увеличенную продукцию EEV посредством вариантов вируса осповакцины. Распространение вариантов оценивали с использованием анализа распространения, описанного в примере 1. По сравнению с вирусом осповакцины Copenhagen, содержащим замену K151E в A34 (IGV-006), замены R91S и K151E в A34 и замена I269F в A56 (IGV-084), замены T127E и K151E в A34 (IGV-085), или замены R84G и K151E в A34 (IGV-086), или замены R91A и K151E в A34 (IGV-087), приводили к более высоким уровням люциферазы, что показывает, что варианты вирусов осповакцины являются способными к более сильному распространению (ФИГ. 15B). Влияние вариантов замен на продукцию частиц инфекционного вируса в супернатанте (продукцию EEV) в различных линиях клеток колоректального рака человека оценивали in vitro с использованием клеток HCT 116 (колоректальной карциномы), клеток HT-29 (колоректальной аденокарциномы), клеток Colo205 (колоректальной аденокарциномы) и клеток SW-620 (колоректальной аденокарциномы). Все линии клеток, перечисленные выше, инфицировали с MOI 3 и тщательно промывали 3 раза (за исключением клеток Colo205, которые промывали один раз) после 1 часа адсорбции вируса. Через 24 часа после инфекции, супернатант собирали, и количество продуцированных частиц инфекционного вируса (потенциально, EEV) определяли посредством проведения анализа бляшкообразования, как описано в примере 1. Во всех четырех линиях клеток, варианты замен, содержащие комбинацию замены K151E в A34 и замены T127 в A34 (IGV-085) или замены R84G в A34 (IGV-086), приводили к более высокому количеству частиц инфекционного вируса в супернатанте, что позволяет предполагать увеличение образования частиц EEV (ФИГ. 15C-15F). Это исследование дополнительно иллюстрирует, что включение мутаций в A34, в частности, в положениях R84, R91 и T127 в A34, в комбинации с заменой K151E в A34 и заменой I269F в A56, приводит к увеличенной продукции EEV и увеличенному распространению вируса в клетках колоректального рака человека.

На ФИГ. 15A-15F представлены данные распространения вируса и продукции EEV дополнительных вариантов вируса осповакцины, содержащих замены A34. A) Репрезентативные изображения бляшек, сформированных после инфекции клеток BSC-40, показывают, что варианты вирусов осповакцины приводят к образованию более длинных хвостов комет, показателю лучшего распространения и увеличенной продукции EEV, по сравнению с вирусом осповакцины Copenhagen, содержащим последовательности A33 и A34 дикого типа (вверху слева), и вирусом осповакцины Copenhagen, содержащим замену K151E в A34 (известную мутацию для увеличения распространения вируса и продукции EEV; вверху справа). B) Двухстадийный анализ инфекционности для измерения распространения вируса, в котором клетки U-2 OS сначала инфицировали с использованием равных множественностей инфекции (MOI) вируса осповакцины, затем супернатант собирали через 22 часа после инфекции и использовали для инфекции нового планшета клеток U-2 OS. Люциферазу, экспрессированную с вируса, измеряют через 15 часов после инфекции, и увеличенные уровни люциферазы коррелируют с более высокими частотами инфекции. Таким образом, более высокий уровень люциферазы является показателем увеличенного распространения. Данные представлены как кратность увеличения, по сравнению с экспрессией люциферазы в IGV-006 (вирусе осповакцины Copenhagen, содержащем замену K151E в A34). Для вариантов вируса осповакцины, содержащих замены R91S и K151E в A34, и замену I269F в A56 (IGV-084), замены T127E и K151E в A34 (IGV-085), замены R84G и K151E в A34 (IGV-086) или замены R91A и K151E в A34 (IGV-087), показано более чем 2,5-кратное увеличение распространения вируса, по сравнению с вирусом Copenhagen с заменой K151E в A34 (IGV-006), которое может приводить к улучшенной онколитической активности в злокачественной опухоли. Количественная оценка инфекционного вируса в супернатанте через 24 часа после инфекции линий клеток C) HCT 116 (колоректальной карциномы), D) HT-29 (колоректальной аденокарциномы), E) Colo205 (колоректальной аденокарциномы) и F) SW-620 (колоректальной аденокарциномы). Линии клеток инфицировали вирусом осповакцины с MOI 3. Через двадцать четыре часа после инфекции, количество частиц инфекционного вируса, продуцированных в супернатанте (EEV), определяли посредством анализа бляшкообразования. IGV-007 представляет собой Copenhagen (контроль), IGV-006 представляет собой Copenhagen с заменой A34 K151E, IGV-084 представляет собой Copenhagen с заменами A34 R91S и K151E, и заменой A56 I269F, IGV-085 представляет собой Copenhagen с заменами A34 T127E и K151E, IGV-086 представляет собой Copenhagen с заменами A34 R84G и K151E, IGV-087 представляет собой Copenhagen с заменами A34 R91A и K151E. Планки погрешностей обозначают SD (n=3). Звездочки обозначают статистическую значимость, по сравнению с вирусом осповакцины Copenhagen с заменой K151E в гене A34R (IGV-006) (**p < 0,01, ***p < 0,001, **** < 0,0001; обычный однофакторный ANOVA, с последующим критерием множественных сравнений Тьюки).

ПРИМЕР 9

В следующем отборе идентифицировали варианты, способные к увеличенному распространению вируса и продукции EEV после инфекции клеток колоректального рака человека Colo 205. Идентифицировали два варианта, для которых показана увеличенная частота в секвенированной популяции (ФИГ. 17). Из двух вариантов, для варианта, содержащего замену S197F в последовательности B5, показано наибольшее обогащение в конечном цикле отбора (ФИГ. 17).

На ФИГ. 17 представлены данные частоты специфических вариантов вируса осповакцины в конечном цикле способа направленной эволюции для идентификации вариантов, способных к увеличенному распространению вируса и продукции EEV после инфекции и отбора в клетках колоректального рака человека Colo 205. Репрезентативную фракцию библиотеки секвенировали после конечного цикла отбора с использованием секвенирования нового поколения ампликонов (NGS). Частота двух наиболее преобладающих вариантов, выраженная как процент от общей популяции, значительно увеличивалась в ходе отбора. Обогащение по вариантам B5, содержащим замены S197F или S197V, показало, что эти замены увеличивают способность вируса осповакцины к распространению и продукции EEV после инфекции клеток злокачественных опухолей человека.

ПРИМЕР 10

В следующих отборах идентифицировали варианты, способные к увеличенному распространению вируса и продукции EEV после инфекции клеток рака молочной железы MDA-MB-231, в отсутствие или в присутствии сыворотки от доноров, вакцинированных вирусом осповакцины. Всего идентифицировано пять вариантов, три в отсутствие сыворотки и два в присутствии сыворотки, для которых показана увеличенная частота в секвенированной популяции (ФИГ. 18).

На ФИГ. 18A-18B представлены данные частоты для специфических вариантов вируса осповакцины в конечном цикле способа направленной эволюции для идентификации вариантов, способных к увеличенному распространению вируса и продукции EEV после инфекции клеток рака молочной железы человека MDA-MB-231, в отсутствие или в присутствии сыворотки от доноров, вакцинированных вирусом осповакцины. Репрезентативную фракцию библиотеки секвенировали после конечного цикла отбора с использованием либо полногеномного секвенирования (WGS), либо секвенирования по Сенгеру индивидуальных бляшек. Частота пяти наиболее преобладающих вариантов, выраженная как процент от общей популяции, значительно увеличивалась в ходе отбора. Обогащение вариантов B5, содержащих замены N39G и S273I, замену S199M, замены L90R и S273V, замены K229C и S273L или замену S273I, показывает, что эти замены увеличивают способность вируса осповакцины к увеличению распространения вируса и продукции EEV после инфекции клеток рака молочной железы человека.

Влияние вариантов замен на продукцию EEV и распространение вируса оценивали in vitro с использованием линий клеток BSC-40 (почки африканской зеленой мартышки) и U-2 OS (остеосаркомы человека). Вирусы осповакцины Copenhagen, содержащие последовательности A33, A34 и B5 дикого типа (IGV-007), замену K151E в A34 (IGV-006; известную мутацию для увеличения распространения вируса и продукции EEV), замены K229C и S273L в B5 (IGV-110), замены N39G и S273I в B5 (IGV-112), замену S199M в B5 (IGV-116), замены L90R и S273V в B5 (IGV-114) или замену S273I в B5 (IGV-111), получали и изготавливали как описано в примере 1. Анализ комет проводили, как описано в примере 1. Присутствие более длинных хвостов комет (ФИГ. 19A) для вариантов вирусов осповакцины, по сравнению с вирусом осповакцины Copenhagen, содержащим последовательность B5 дикого типа, показывает, что большее количество формы EEV вируса продуцируется вариантами вирусов осповакцины. Распространение вариантов оценивали с использованием анализа распространения, описанного в примере 1. По сравнению с вирусом осповакцины Copenhagen, содержащим замену K151E в A34 отдельно (IGV-006), комбинация замены K151E в A34 и большинства замен в B5, приводила к более высокой активности люциферазы, что показывает, что варианты вирусов осповакцины являются способными к более сильному распространению (ФИГ. 19B). В частности, комбинация замены K151E в A34 с заменой S273L в B5 (IGV-109), заменой S273I в B5 (IGV-111), заменами N39G и S273I в B5 (IGV-112), заменами L90R и S273V в B5 (IGV-114) или заменой S199M в B5 (IGV-116) приводила к значимо увеличенному распространению. Это исследование дополнительно иллюстрирует, что включение мутаций в B5, либо отдельно, либо в комбинации, приводит к увеличенной продукции EEV и увеличенному распространению вируса в клетках злокачественных опухолей.

На ФИГ. 19A-19B представлены данные распространения вируса и продукции EEV для вариантов вируса осповакцины, содержащих замены B5. A) Репрезентативные изображения комет, сформированных после инфекции клеток BSC-40, показывают, что варианты вируса осповакцины с комбинацией замен в B5 и замены K151E в A34 приводят к получения более длинных хвостов комет, показателю увеличенной продукции EEV, по сравнению с вирусом осповакцины Copenhagen (IGV-007, вверху слева). B) клетки U-2 OS инфицировали вирусом осповакцины с MOI 0,33 в течение 1 часа. Через двадцать два часа после инфекции, супернатант собирали и использовали для инфекции нового планшета клеток. Уровни люциферазы (измеренные как RLU) определяли 15 часов после вторичной инфекции. Уровни люциферазы вариантов вируса, по сравнению с уровнями люциферазы вируса осповакцины Copenhagen содержащего замену K151E в A34 (IGV-006), регистрировали как кратность увеличения. Более высокую активность люциферазы наблюдали для большинства комбинаций вариантов, что показывает, что варианты вирусов осповакцины являются способными к более сильному распространению. IGV-007 представляет собой Copenhagen (контроль), IGV-006 представляет собой Copenhagen с заменой A34 K151E (контроль), IGV-109 представляет собой замены B5 S273L и A34 K151E, IGV-110 представляет собой замены B5 K229C и S273L, и A34 K151E, IGV-111 представляет собой замены B5 S273I и A34 K151E, IGV-112 представляет собой замены B5 N39G и S273I, и A34 K151E, IGV-113 представляет собой замены B5 S273V и A34 K151E, IGV-114 представляет собой замены B5 L90R и S273V, и A34 K151E, IGV-115 представляет собой замены B5 N39G и S273I, и A34 F94H и K151E, IGV-116 представляет собой замены B5 S199M и A34 K151E. Планки погрешностей показывают SD (n=3). Звездочки обозначают статистическую значимость, по сравнению с Copenhagen A34R_K151E (IGV-006) (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, **** < 0,0001; однофакторный ANOVA и критерий множественных сравнений Даннетта).

ПРИМЕР 11

Влияние вариантов замен на продукцию инфекционных вирусных частиц в супернатанте (продукцию EEV) в различных линиях клеток злокачественных опухолей человека оценивали in vitro с использованием клеток MDA-MB-231 (аденокарциномы молочной железы), клеток MCF7 (аденокарциномы молочной железы), клеток T47D (карциномы молочной железы) и клеток HCT 116 (колоректальной карциномы). Вирусы осповакцины Copenhagen, содержащие последовательности A33, A34 и B5 дикого типа (IGV-007), замену K151E в A34 (IGV-006; известную мутацию для увеличения распространения вируса и продукции EEV), и варианты вируса осповакцины, содержащие комбинацию замены K151E в A34 и замен K229C и S273L в B5 (IGV-110), замены S273I в B5 (IGV-111), замен N39G и S273I в B5 (IGV-112), замен L90R и S273V в B5 (IGV-114) или замены S199M в B5 (IGV-116), получали и изготавливали, как описано в примере 1. Все линии клеток, перечисленные выше, инфицировали с MOI 3 и тщательно промывали 3 раза после 1 часа адсорбции вируса. Через 24 часа после инфекции, супернатант собирали, и количество продуцированных частиц инфекционного вируса (EEV) определяли посредством проведения анализа бляшкообразования, как описано в примере 1. Во всех четырех линии клеток, варианты замен, содержащие комбинацию замены K151E в A34 и замен K229C и S273L в B5 (IGV-110), замены S273I в B5 (IGV-111), замен N39G и S273I в B5 (IGV-112), замен L90R и S273V в B5 (IGV-114) или замены S199M в B5 (IGV-116), продуцировали более высокое количество частиц инфекционного вируса в супернатанте, что позволяет предполагать увеличение формирования частиц EEV (ФИГ. 20A-20D). Это исследование показывает, что включение мутаций в B5 приводит к увеличенной продукции инфекционного EEV в различных линиях клеток злокачественных опухолей.

На ФИГ. 20A-20D представлены данные для инфекционных вирионов вируса осповакцины в супернатанте (потенциальных EEV) в репрезентативных линиях клеток злокачественных опухолей человека. A) клетки MDA-MB-231 (аденокарциномы молочной железы), B) клетки MCF7 (аденокарциномы молочной железы), C) клетки T47D (карциномы молочной железы) и D) клетки HCT 116 (колоректальной карциномы) инфицировали вирусом осповакцины с MOI 3. Через двадцать четыре часа после инфекции, количество частиц инфекционного вируса, продуцированных в супернатанте (EEV), определяли посредством анализа бляшкообразования. Кратность увеличения количества частиц инфекционного вируса в супернатанте, продуцированных в каждой линии клеток злокачественной опухоли, рассчитывали для каждого варианта вируса, по сравнению с вирусом Copenhagen, содержащим последовательности A33, A34 и B5 дикого типа (IGV-007). Присутствует значимое увеличение количества инфекционных вирусных частиц для вариантов вируса осповакцины, по сравнению с Copenhagen, содержащим последовательности A33, A34 и B5 дикого типа, во всех тестированных линиях клеток злокачественных опухолей. IGV-007 представляет собой Copenhagen (контроль), IGV-006 представляет собой Copenhagen с заменой A34 K151E (контроль), IGV-110 представляет собой замены B5 K229C и S273L, и A34 K151E, IGV-111 представляет собой замены B5 S273I и A34 K151E, IGV-112 представляет собой замены B5 N39G и S273I, и A34 K151E, IGV-114 представляет собой замены B5 L90R и S273V, и A34 K151E, IGV-116 представляет собой замены B5 S199M и A34R K151E. Планки погрешностей показывают SD (n=3). Звездочки обозначают статистическую значимость, по сравнению с вирусом осповакцины Copenhagen, содержащим последовательности A33, A34 и B5 дикого типа (IGV-007) (*p<0,5, **** < 0,0001; однофакторный ANOVA и критерий множественных сравнений Даннетта).

ПРИМЕР 12

В отборах in vivo, проведенных в моделях злокачественных опухолей на мышах, идентифицировали варианты, способные к увеличенному распространению и продукции EEV после инфекции мышей, содержащих происходящие от пациента-человека клетки злокачественных опухолей, вирусом осповакцины. Всего идентифицировали восемь вариантов, два с использованием модели билатерального происходящего от пациента ксенотрансплантата (PDX) колоректального рака на мышах, и шесть с использованием модели билатерального происходящего от пациента ксенотрансплантата (PDX) колоректального рака на мышах, которые также содержали гуманизированную систему крови, для которых показана увеличенная частота в секвенированной популяции (ФИГ. 21).

На ФИГ. 21A-21B представлены данные частоты специфических вариантов вируса осповакцины в способе направленной эволюции для идентификации вариантов, способных к увеличенному распространению in vivo. Репрезентативную фракцию библиотеки секвенировали после конечного цикла отбора с использованием полногеномного секвенирования (WGS) или секвенирования по Сенгеру индивидуальных бляшек (секвенирования бляшек). Частота восьми наиболее преобладающих вариантов, выраженная как процент от общей популяции, значительно увеличивалась в ходе отбора. Обогащение по вариантам B5, содержащим множество замен в пределах или около области стебля, и по вариантам A33/A34, показывает, что эти замены увеличивают способность вируса осповакцины к увеличенному распространению после инфекции клеток злокачественных опухолей человека in vivo.

Влияние вариантов замен на продукцию EEV и распространение вируса оценивали in vitro с использованием линий клеток BSC-40 (почки африканской зеленой мартышки) и U-2 OS (остеосаркомы человека). Вирусы осповакцины Copenhagen, содержащие последовательности A33, A34 и B5 дикого типа (IGV-007), замену K151E в A34 (IGV-006; известную мутацию для увеличения распространения вируса и продукции EEV), и варианты, содержащие комбинацию замены K151E в A34 с заменами I236P, V238R, T240R, и E243G в B5 (IGV-101), заменами V233D, I236L, V238W, T240Y и E243R в B5 (IGV-102), заменами D263V, E268T, E270G, E272P и E275S в B5 (IGV-103), заменой N94T в B5 (IGV-104), заменой M63R в A33 и заменой M66T в A34 (IGV-105), заменами N241G, E243S, V247W, D248Y, G250A и A276F в B5 (IGV-106), заменами D263A, E270S, E272G и E275F в B5 (IGV-107) или заменами N241T, E243V, V247S, G250R и A276F в B5 (IGV-108), получали и изготавливали как описано в примере 1. Анализ комет проводили, как описано в примере 1. Присутствие более длинных хвостов комет (ФИГ. 22A-22C) для вариантов вирусов осповакцины, по сравнению с вирусом осповакцины Copenhagen, содержащим последовательности A33, A34 и B5 дикого типа, показывает, что лучшее распространение и большее количество формы EEV вируса получают посредством вариантов вирусов осповакцины. Распространение вариантов оценивали с использованием анализа распространения, описанного в примере 1. По сравнению с вирусом осповакцины Copenhagen, содержащим последовательности A33, A34 и B5 дикого типа (IGV-007), комбинация замены K151E в A34 и замен в A33/A34 или B5 приводила к более высоким уровням люциферазы, что показывает, что варианты вирусов осповакцины являются способными к более сильному распространению (ФИГ. 22D). В частности, комбинация замены K151E в A34 с заменами V233D, I236L, V238W, T240Y и E243R в B5 (IGV-102), заменой M63R в A33 и заменой M66T в A34 (IGV-105), заменами N241G, E243S, V247W, D248Y, G250A и A276F в B5 (IGV-106), заменами D263A, E270S, E272G и E275F в B5 (IGV-107) или заменами N241T, E243V, V247S, G250R и A276F в B5 (IGV-108) приводила к значимо увеличенному распространению. Это исследование, кроме того, иллюстрирует, что включение мутаций в A33, A34 или B5, либо отдельно, либо в комбинации, приводит к увеличенной продукции EEV и увеличенному распространению вируса в клетках злокачественных опухолей.

На ФИГ. 22A-22D представлены данные распространения вируса и продукции EEV дополнительных вариантов вируса осповакцины, содержащих замены A33/A34 или B5. A) Репрезентативные изображения комет, сформированных после инфекции клеток BSC-40, показывают, что варианты вирусов осповакцины с комбинацией замен в B5 и замены A34 K151E приводят к образованию более длинных хвостов комет, показателю увеличенного распространения и продукции EEV, по сравнению с вирусом осповакцины Copenhagen (IGV-007, слева). B) Репрезентативные изображения комет, сформированных после инфекции клеток BSC-40, показывают, что варианты вирусов осповакцины с комбинацией замен в A33/A34 или B5 и замены A34 K151E приводят к образованию более длинных хвостов комет, показателю увеличенного распространения и продукции EEV, по сравнению с вирусом осповакцины Copenhagen (IGV-007, вверху слева). C) Репрезентативные изображения комет, сформированных после инфекции клеток BSC-40, показывают, что варианты вирусов осповакцины с комбинацией замен в B5 и замены A34 K151E приводят к образованию более длинных хвостов комет, показателю увеличенного распространения и продукции EEV, по сравнению с вирусом осповакцины Copenhagen (IGV-007, вверху слева). D) клетки U-2 OS инфицировали вирусом осповакцины с MOI 1 в течение 1 час. Через двадцать два часа после инфекции, супернатант собирали и использовали для инфекции нового планшета клеток. Уровни экспрессии люциферазы (измеренные как RLU) определяли 15 часов после вторичной инфекции. Уровень экспрессии люциферазы вариантов, по сравнению с уровнем экспрессии люциферазы для вируса осповакцины Copenhagen, содержащего последовательности A33, A34 и B5 дикого типа (IGV-007), регистрируют как кратность увеличения. Более высокие уровни люциферазы наблюдали для всех комбинаций вариантов, что показывает, что варианты вирусов осповакцины являются способными к более сильному распространению. IGV-007 представляет собой Copenhagen (контроль), IGV-006 представляет собой Copenhagen с заменой A34 K151E (контроль), IGV-101 представляет собой замены B5 I236P, V238R, T240R и E243G, и A34 K151E, IGV-102 представляет собой замены B5 V233D, I236L, V238W, T240Y и E243R, и A34 K151E, IGV-103 представляет собой замены B5 D263V, E268T, E270G, E272P и E275S, и A34 K151E, IGV-104 представляет собой замены B5 N94T и A34 K151E, IGV-105 представляет собой замены A33 M63R и A34 M66T и K151E, IGV-106 представляет собой замены B5 N241G, E243S, V247W, D248Y, G250A и A276F, и A34 K151E, IGV-107 представляет собой замены B5 D263A, E270S, E272G и E275F, и A34 K151E, и IGV-108 представляет собой замены B5 N241T, E243V, V247S, G250R и A276F, и A34 K151E. Планки погрешностей показывают SD (n=3). Звездочки обозначают статистическую значимость, по сравнению с Copenhagen (IGV-007) (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, **** < 0,0001; однофакторный ANOVA и критерий множественных сравнений Даннетта).

Обобщение всех вариантов замен вирусов осповакцины, идентифицированных посредством направленной эволюции, представлено в таблице 2.

Таблица 2 ID номер вируса Замена(ы) A33 Замена(ы) A34 Замена(ы) B5 Замена(ы) A56 Опухоль-мишень IGV-052/IGV-073 F94H+K151E колоректальная, молочной железы, легкого IGV-051/IGV-069 A88D+E129M K151E колоректальная, молочной железы, легкого IGV-060 A88D колоректальная, молочной железы, легкого IGV-061 E129M колоректальная, молочной железы, легкого IGV-062 F94H колоректальная, молочной железы, легкого IGV-063 A88D+E129M колоректальная, молочной железы, легкого IGV-064 A88D F94H колоректальная, молочной железы, легкого IGV-065 E129M F94H колоректальная, молочной железы, легкого IGV-066 A88D+E129M F94H колоректальная, молочной железы, легкого IGV-067 A88D K151E колоректальная, молочной железы, легкого IGV-068 E129M K151E колоректальная, молочной железы, легкого IGV-070 A88D F94H+K151E колоректальная, молочной железы, легкого IGV-071 E129M F94H+K151E колоректальная, молочной железы, легкого IGV-072 A88D+E129M F94H+K151E колоректальная, молочной железы, легкого IGV-084 R91S+K151E I269F колоректальная IGV-085 T127E+K151E колоректальная IGV-086 R84G+K151E колоректальная IGV-087 R91A+K151E колоректальная IGV-101 K151E I236P+V238R
+T240R+E243G колоректальная IGV-102 K151E V233D+I236L+V238W+T240Y+E243R колоректальная IGV-103 K151E B5R D263V+E268T+E270G+E272P+E275S колоректальная IGV-104 K151E N94T колоректальная IGV-105 M63R M66T+K151E колоректальная IGV-106 K151E N241G+E243S+V247W+D248Y+G250A+A276F колоректальная IGV-107 K151E D263A+E270S+E272G+E275F колоректальная IGV-108 K151E N241T+E243V+V247S+G250R+A276F колоректальная IGV-110 K151E K229C+S273L молочной железы IGV-111 K151E S273I молочной железы IGV-112 K151E N39G+S273I молочной железы IGV-114 K151E L90R+S273V молочной железы IGV-115 F94H+K151E N39G+S273I молочной железы IGV-116 K151E S199M молочной железы -- K151E S197F колоректальная -- K151E S197V колоректальная

Для вариантов осуществления, которые относятся к способу лечения, как описано в настоящем описании, такие варианты осуществления также представляют собой дополнительные варианты осуществления для применения в таком лечении, или альтернативно, для изготовления лекарственного средства для применения в таком лечении.

В то время как настоящее изобретение описано со ссылкой на конкретные варианты его осуществления, специалист в данной области должен понимать, что можно осуществлять различные изменения, и эквиваленты можно заменять без отклонения от точного содержания и объема изобретения. Кроме того, можно осуществлять множество модификаций для адаптации конкретных ситуации, материала, смеси химически связанных веществ, способа, стадии или стадий способа, к цели, содержанию и объему настоящего изобретения. Все такие модификации предназначены для включения в объем пунктов приложенной к нему формулы изобретения.

Настоящее изобретение относится биотехнологии, вирусологии и медицине. Предложен компетентный по репликации, рекомбинантный онколитический вирус осповакцины (OVV). OVV содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A34. Вариант полипептида A34 содержит (a) замену K151E и (b) дополнительную замену, выбранную из группы, состоящей из: R84G, R91A, R91S, F94H и T127E. Предложен OVV, который содержит (а) нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида В5, содержащий одну или более замен, выбранных из группы, состоящей из: N39G, L90R, S199M, K229C, S273L, S273V и S273I, и (b) нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида А34, который содержит замену K151E. Предложен OVV, который содержит (а) нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида А33, содержащий замены A88D и E129M, и (b) нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида А34, где вариант полипептида A34 содержит замену K151E. Варианты полипептида А33, А34 и B5 обеспечивают увеличенное распространение вируса или увеличенную продукцию EEV по сравнению с соответствующими полипептидами А33 А34 и B5 дикого типа. Предложена композиция, содержащая OVV, для лечения рака и применение OVV или композиции для индукции онколизиса у индивидуума, имеющего опухоль. Изобретение позволяет получить рекомбинантный онколитический вирус осповакцины с улучшенными противоопухолевыми свойствами. 5 н. и 30 з.п. ф-лы, 2 табл., 58 ил., 11 пр.

1. Компетентный по репликации рекомбинантный онколитический вирус осповакцины (OVV) для применения в лечении рака, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида A34, где вариант полипептида A34 обеспечивает увеличенное распространение вируса или увеличенную продукцию внеклеточного оболочечного вириона (EEV) по сравнению с соответствующим полипептидом A34 дикого типа и где вариант полипептида A34 содержит (a) замену K151E и (b) дополнительную замену, выбранную из группы, состоящей из R84G, R91A, R91S, F94H и T127E.

2. OVV для применения в лечении рака, содержащий (а) нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида В5, и (b) нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида А34, где вариант полипептида В5 и вариант полипептида А34 обеспечивают увеличенное распространение вируса или увеличенную продукцию EEV по сравнению с соответствующими полипептидами B5 и A34 дикого типа, и где вариант полипептида B5 содержит одну или более замен, выбранных из группы, состоящей из N39G, L90R, S199M, K229C, S273L, S273V и S273I, и где вариант полипептида A34 содержит замену K151E.

3. OVV для применения в лечении рака, содержащий (а) нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида А33, и (b) нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида А34, где вариант полипептида А33 и вариант полипептида А34 обеспечивают увеличенное распространение вируса или увеличенную продукцию EEV по сравнению с соответствующими полипептидами А33 и А34 дикого типа, где вариант полипептида А33 содержит замены A88D и E129M и где вариант полипептида A34 содержит замену K151E.

4. OVV по п. 1, где вариант полипептида A34 содержит замены K151E и R84G.

5. OVV по п. 1, где вариант полипептида A34 содержит замены F94H и K151E.

6. OVV по п. 2, где вариант полипептида B5 содержит замену S199M.

7. OVV по п. 2, где вариант полипептида B5 содержит замену S273L или замену S273I.

8. OVV по п. 2, где вариант полипептида B5 содержит замену N39G.

9. Композиция для лечения рака, содержащая:

а) OVV по любому из пп. 1-3 и

b) эффективное количество фармацевтически приемлемого эксципиента.

10. Способ индукции онколиза у индивидуума с опухолью, включающий введение индивидууму эффективного количества OVV по любому из пп. 1-3 или композиции по п. 9.

11. Способ по п. 10, где указанное введение включает введение разовой дозы OVV или композиции.

12. Способ по п. 11, где разовая доза содержит по меньшей мере 10⁶ бляшкообразующих единиц (БОЕ) OVV.

13. Способ по п. 10, где указанное введение включает введение множественных доз OVV или композиции.

14. Способ по п. 13, где вирус OVV или композицию вводят на каждые вторые сутки.

15. Способ по п. 13, где вирус OVV или композицию вводят один раз в неделю.

16. Способ по п. 13, где вирус OVV или композицию вводят каждую вторую неделю.

17. Способ по любому из пп. 10-16, где опухоль представляет собой злокачественную опухоль мозга, злокачественную опухоль головы и шеи, злокачественную опухоль пищевода, злокачественную опухоль кожи, злокачественную опухоль легкого, злокачественную опухоль тимуса, злокачественную опухоль желудка, злокачественную опухоль ободочной кишки, злокачественную опухоль печени, злокачественную опухоль яичника, злокачественную опухоль тела матки, злокачественную опухоль мочевого пузыря, злокачественную опухоль яичка, злокачественную опухоль прямой кишки, злокачественную опухоль молочной железы или злокачественную опухоль поджелудочной железы.

18. Способ по любому из пп. 10-16, где опухоль представляет собой колоректальный рак.

19. Способ по любому из пп. 10-16, где опухоль представляет собой немелкоклеточный рак легкого.

20. Способ по любому из пп. 10-16, где опухоль представляет собой рак молочной железы.

21. Способ по п. 20, где опухоль представляет собой трижды отрицательный рак молочной железы.

22. Способ по любому из пп. 10-21, где опухоль представляет собой солидную опухоль.

23. Способ по любому из пп.10-21, где опухоль представляет собой опухоль жидких тканей.

24. Способ по любому из пп. 10-23, где опухоль является рецидивирующей.

25. Способ по любому из пп. 10-23, где опухоль представляет собой первичную опухоль.

26. Способ по любому из пп. 10-25, где опухоль является метастазирующей.

27. Способ по любому из пп. 10-26, дополнительно включающий осуществление у индивидуума второй противораковой терапии.

28. Способ по п. 27, где вторая противораковая терапия выбрана из химиотерапии, биологической терапии, радиотерапии, иммунотерапии, гормональной терапии, антиваскулярной терапии, криотерапии, терапии токсином, терапии онколитическим вирусом, клеточной терапии, генотерапии и хирургии.

29. Способ по п. 27, где второе противораковое терапевтическое средство представляет собой ингибитор иммунной контрольной точки.

30. Способ по п. 29, где ингибитор иммунной контрольной точки представляет собой антитело, специфическое для ингибитора иммунной контрольной точки, выбранного из CD27, CD28, CD40, CD122, CD96, CD73, CD47, OX40, GITR, CSF1R, JAK, PI3K-дельта, PI3K-гамма, TAM, аргиназы, CD137, ICOS, A2AR, B7-H3, B7-H4, BTLA, CTLA-4, LAG3, TIM3, VISTA, CD96, TIGIT, CD122, PD-1, PD-L1 и PD-L2.

31. Способ по любому из пп. 10-30, где индивидуум имеет иммунную недостаточность.

32. Способ по любому из пп. 10-31, где указанное введение OVV или композиции является внутриартериальным, внутрибрюшинным, внутрипузырным или интратекальным.

33. Способ по любому из пп. 10-31, где указанное введение OVV или композиции является внутриопухолевым.

34. Способ по любому из пп. 10-31, где указанное введение OVV или композиции является перитуморальным.

35. Способ по любому из пп. 10-31, где указанное введение OVV или композиции является внутривенным.

название	год	авторы	номер документа
Рекомбинантный онколитический штамм вируса осповакцины Л-ИВП_oncoM, содержащий гены, кодирующие гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор и полиэпитопный иммуноген, состоящий из эпитопов антигенов, гиперэкспрессирующихся опухолевыми клетками при меланоме	2017	Бауэр Татьяна Валерьевна Колосова Ирина Валерьевна Трегубчак Татьяна Владимировна Максютов Амир Закиевич Гаврилова Елена Васильевна Максютов Ринат Амирович	RU2678060C1
Рекомбинантный онколитический штамм вируса осповакцины Л-ИВП_oncoB, содержащий гены, кодирующие гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор и полиэпитопный иммуноген, состоящий из эпитопов антигенов, гиперэкспрессирующихся опухолевыми клетками при раке молочной железы	2017	Бауэр Татьяна Валерьевна Колосова Ирина Валерьевна Трегубчак Татьяна Владимировна Максютов Амир Закиевич Гаврилова Елена Васильевна Максютов Ринат Амирович	RU2678056C1
Рекомбинантный онколитический штамм вируса осповакцины Л-ИВП_oncoQ, содержащий гены, кодирующие гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор и полиэпитопный иммуноген, состоящий из эпитопов антигенов, гиперэкспрессирующихся опухолевыми клетками при раке яичников	2017	Бауэр Татьяна Валерьевна Колосова Ирина Валерьевна Трегубчак Татьяна Владимировна Максютов Амир Закиевич Гаврилова Елена Васильевна Максютов Ринат Амирович	RU2678003C1
ДИСПЛЕЙ ИНТЕГРАЛЬНОГО МЕМБРАННОГО БЕЛКА НА ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ОБОЛОЧЕЧНЫХ ВИРИОНАХ ПОКСВИРУСА	2017	Смит, Эрнест С. Пэрис, Марк Скривенс, Мария Г. М. Кирк, Рене А. Корнелисон, Ангелика А.	RU2759846C2
ОНКОЛИТИЧЕСКИЙ ВИРУС ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ МОДУЛЯТОРОВ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ КОНТРОЛЬНЫХ ТОЧЕК	2015	Сильвестр Натали Гейст Мишель Риттнер Карола Маршан Жан-Батист Тиуделле Кристин	RU2696312C2
ПОЛИПЕПТИДЫ Е2 ПАПИЛЛОМАВИРУСА, ПРИМЕНЯЕМЫЕ ДЛЯ ВАКЦИНАЦИИ	2008	Боди Мартина Байюль Жан-Марк Сильвестр Натали	RU2482189C2
КОНСТРУКЦИИ ГОМОДИМЕРНЫХ БЕЛКОВ	2011	Руффини Пьер Адельки Боген Бьярне Фредриксен Агнете Брунсвик	RU2624041C2
ПРОЦЕСС ПОЛУЧЕНИЯ ПОКСВИРУСОВ И КОМПОЗИЦИИ ПОКСВИРУСОВ	2013	Маларме Даньель Кордье Ив Сене Клод	RU2581910C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОКСВИРУСОВ И КОМПОЗИЦИИ ПОКСВИРУСОВ	2007	Маларме Даньель Кордье Ив Сене Клод	RU2551982C2
ТЕРАПИЯ РАКА ПУТЕМ КОМБИНИРОВАННОГО ПРИМЕНЕНИЯ ОНКОЛИТИЧЕСКОГО ВИРУСА ОСПОВАКЦИНЫ И ИНГИБИТОРА ИММУННОЙ КОНТРОЛЬНОЙ ТОЧКИ И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ И КОМБИНИРОВАННОЕ ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В ТЕРАПИИ РАКА	2019	Накао, Синсуке Кавасе, Тацуя	RU2788874C2

Станок для придания концам круглых радиаторных трубок шестигранного сечения	1924	Гаркин В.А.	SU2019A1
W0 2017/043815 A1, 16.03.2017
РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ VV-GMCSF-Lact ВИРУСА ОСПОВАКЦИНЫ, ОБЛАДАЮЩИЙ ОНКОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ И ПРОДУЦИРУЮЩИЙ ГРАНУЛОЦИТАРНО-МАКРОФАГАЛЬНЫЙ КОЛОНИЕСТИМУЛИРУЮЩИЙ ФАКТОР ЧЕЛОВЕКА И ОНКОТОКСИЧЕСКИЙ БЕЛОК ЛАКТАПТИН	2015	Кочнева Галина Вадимовна Сиволобова Галина Филипповна Лупан Татьяна Анатольевна Гражданцева Антонина Анатольевна Ткачева Анастасия Викторовна Кулигина Елена Владимировна Коваль Ольга Александровна Рихтер Владимир Александрович	RU2604187C1

ВАРИАНТ ОНКОЛИТИЧЕСКОГО ВИРУСА ОСПОВАКЦИНЫ И СПОСОБЫ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2023 года по МПК C12N7/00 A61K35/768

Описание патента на изобретение RU2805179C1

Похожие патенты RU2805179C1

Иллюстрации к изобретению RU 2 805 179 C1

Реферат патента 2023 года ВАРИАНТ ОНКОЛИТИЧЕСКОГО ВИРУСА ОСПОВАКЦИНЫ И СПОСОБЫ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ

Формула изобретения RU 2 805 179 C1

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2023 года RU2805179C1

RU 2 805 179 C1