НОВЫЕ ИНГИБИТОРЫ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ГЛУТАМИНИЛОВЫХ ЦИКЛАЗ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В ЛЕЧЕНИИ ПЕРИОДОНТАЛЬНЫХ И СВЯЗАННЫХ С НИМИ ЗАБОЛЕВАНИЙ Российский патент 2023 года по МПК C07D471/04 C07D487/22 C07F15/02 A61K31/437 A61K31/5377 A61P31/04 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к новым соединениям, которые особенно полезны в качестве ингибиторов бактериальных глутаминилциклаз (bacQC); фармацевтические композиции, содержащие такие соединения; соединения и/или фармацевтические композиции для использования в способах лечения, в частности для применения при лечении периодонтита и родственных состояний. Настоящее изобретение также относится к кристаллам, содержащим бактериальные глутамилциклазы, и способам идентификации соединений-кандидатов, которые могут ассоциироваться со связывающим карманом bacQC и/или являются ингибиторами bacQC.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Заболевания пародонта широко распространены, около 30% населения мира поражены этим заболеванием, оказывают значительное влияние на людей и общество и требуют дорогостоящего лечения. Стоимость стоматологической помощи занимает четвертое место среди всех заболеваний и требует от 5 до 10% всех ресурсов здравоохранения (Batchelor, P. British Dental Journal 2014, 217, 405–409). Репрезентативные популяционные исследования показывают, что заболевания пародонта широко распространены, и их распространенность растет с 1997 г. (Micheelis, W. et al. Vierte Deutsche Mundgesundheitsstudie (DMS IV), Deutscher Ärzte-Verlag, Köln, 2006). Среди взрослого населения Германии 52,7% страдают пародонтитом средней степени тяжести и 20,5% - тяжелыми формами пародонтита. Расходы на медицинское страхование в Германии на прямое лечение пародонтита составили около 1,1 миллиарда евро (Statistisches Bundesamt, 2008), не включая затраты на вторичные заболевания.

Пародонтит — это общий термин, описывающий воспалительное состояние пародонтального аппарата, которое вызвано мультибактериальной индукцией и имеет тесную связь с различными системными заболеваниями, такими как сердечно-сосудистые заболевания, ревматоидный артрит, хроническая обструктивная болезнь легких и болезнь Альцгеймера.

В соответствии с рекомендациями Немецкого общества стоматологических, оральных и краниомандибулярных наук, применяемая в настоящее время терапия пародонтита обычно проводится путем ручной наддесневой и поддесневой обработки (удаление бактериальных бляшек) с применением антисептических средств (ежедневная дезинфекция жидкостью для полоскания рта), которые разрушают всю биопленку полости рта и делают возможным реколонизацию (обсеменение) потенциального патогена. Кроме того, при запущенных формах заболевания применяется адъювантная системная антибактериальная терапия широкого спектра действия. Последнее также приводит к неселективному разрушению биопленки и должно вводиться в высоких дозах и в течение длительного периода времени для достижения достаточных терапевтических уровней в конкретном месте действия, то есть в зубодесневом кармане. Стандартная адъювантная терапия пародонтита включает, например, системное введение доксициклина (орально) 1 × 200 мг/день в течение 1 дня и 2×100 мг/день в течение следующих 18 дней (Wissenschaftliche Stellungnahme: Adjuvante Antibiotika in der Parodontitistherapie, Deutsche Gesellschaft für Zahn- Mund- und Kieferheilkunde, DZZ 2003). В результате наблюдается развитие устойчивости у возбудителей болезней полости рта. Кроме того, микробиом в кишечнике пациента разрушается, что приводит к потере метаболической поддержки, иммунной модуляции и делает возможным реколонизацию (обсеменение) потенциального патогена. Специализированная и целенаправленная терапия наряду с сохранением оставшейся биопленки будет представлять собой значительное улучшение лечения пародонтита и связанных с ним состояний.

Наличие пародонтопатогенных бактерий варьируется среди пациентов с пародонтитом. Тем не менее, обнаружено, что присутствие определенных видов бактерий в поддесневых бляшках тесно связано с причиной заболеваний пародонта (Socransky et al., Journal of Clinical Periodontology, 1998, 25, 134–144).

Таким образом, существует большая потребность в разработке новых методов лечения пародонтита и связанных с ним состояний, способных избирательно воздействовать на патогены, вызывающие заболевание пародонтоза, при этом будучи, по существу, неактивными по отношению к гомологичным белкам-мишеням человека и предпочтительно, по существу, сохраняющими остальную часть естественной биопленки. Такое лечение могло бы значительно улучшить состояние пациентов и систем здравоохранения.

ТЕХНИЧЕСКАЯ ЗАДАЧА, РЕШАЕМАЯ ИЗОБРЕТЕНИЕМ

Ввиду вышеизложенного, настоящее изобретение направлено на идентификацию и создание соединений и/или фармацевтических композиций, используемых для лечения заболеваний пародонта и родственных заболеваний. Указанные соединения и/или фармацевтические композиции предпочтительно должны быть способны избирательно воздействовать на патогены, которые вызывают заболевание пародонта. Более предпочтительно, чтобы остальная часть естественной биопленки была в значительной степени сохранена; гомологичные белки-мишени человека не должны существенно подавляться. Еще более предпочтительно, чтобы соединения и/или фармацевтические композиции проявляли высокую активность in vivo против целевых патогенов.

Другой целью является получение кристалла и/или сокристалла терапевтического целевого белка (белков), который может быть использован для идентификации ингибиторов, способных воздействовать на патогены, вызывающие пародонтоз, например, с помощью лекарственного средства на основе структурно-подкрепленного драг-дизайна.

Еще одна цель состоит в том, чтобы предоставить способ идентификации соединения-кандидата, которое может ассоциироваться со связывающим карманом указанного терапевтического средства.

Еще одной целью настоящего изобретения является предоставление ингибитора указанного терапевтического целевого белка (белков) и фармацевтической композиции, содержащей такой ингибитор. Указанный ингибитор должен быть предпочтительно селективным ингибитором, т.е. селективно уничтожающим или селективно подавляющим рост (а) бактериального патогена(ов), в то же время являясь по существу неактивным в отношении других бактериальных и/или белковых человеческих мишеней.

Еще одна цель настоящего изобретения - предоставить способ лечения организма человека или животного и/или соединение или фармацевтическую композицию для использования в таком способе.

Еще одним объектом настоящего изобретения является способ терапии или профилактики бактериальной инфекции и/или соединение или фармацевтическая композиция для использования в таком способе, предпочтительно путем селективного уничтожения или селективного ингибирования роста патогенных видов бактерий.

Еще одна цель настоящего изобретения - предоставить способ терапии или профилактики острого, хронического или рецидивирующего заболевания пародонта и/или соединение или соединение фармацевтической композиции для использования в таком способе.

В способах лечения в соответствии с вышеуказанными целями способ введения должен быть предпочтительно местным или системным введением, и способы предпочтительно являются безоперационными методами.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В качестве решения сформулированных выше задач в настоящем описании предлагается соединение согласно одной из следующих формул I или II,

его индивидуальные энантиомеры, его индивидуальные диастереоизомеры, его гидраты, его сольваты, его кристаллические формы, его индивидуальные таутомеры или его фармацевтически приемлемая соль, где L, A и R¹ определены в соответствии с прилагаемой формулой.

В настоящем описании дополнительно предлагается фармацевтическая композиция, содержащая соединение, как определено выше, и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

Настоящее описание дополнительно предлагает описанное выше соединение и/или описанную выше фармацевтическую композицию для применения в способе лечения организма человека или животного; для использования в способе терапии и/или профилактики бактериальной инфекции; и для использования в способе терапии и/или профилактики острого, хронического или рецидивирующего заболевания пародонта.

В настоящем описании дополнительно предложен кристалл, содержащий бактериальную глутамилциклазу (bacQC), выбранную из PgQC и TfQC, и сокристалл, дополнительно содержащий представляющее интерес соединение, предпочтительно ингибитор bacQC; а также способы получения указанного кристалла и/или сокристалла.

Настоящее раскрытие дополнительно предоставляет способы идентификации представляющего интерес соединения, которое может связываться со связывающим карманом bacQC, предпочтительно ингибитора bacQC.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ

На фиг.1 показано выравнивание аминокислотной последовательности QC человека (hQC, SEQ ID NO: 4) и предполагаемых бактериальных глутамилциклаз (QCs, т.е. глутаминциклотрансферазы) из Porphyromonas gingivalis (PgQC, SEQ ID NO: 1) (A); выравнивание аминокислотных последовательностей дополнительных предполагаемых QCs из Prevotella intermedia (PiQC, SEQ ID NO: 3), P. gingivalis (PgQC, SEQ ID NO: 1) и Tannerella forsythia (TfQC, SEQ ID NO: 2)) (B) ; нумерация аминокислот полноразмерной последовательности (SEQ ID NO: 1) глутамилциклазы (т.е. глутаминциклотрансферазы) из P. gingivalis (PgQC), аминокислоты 1-333 (C); и нумерацию аминокислот полноразмерной последовательности (SEQ ID NO: 2) глутамилциклазы (т.е. глутаминциклотрансферазы) T. forsythia (TfQC), аминокислоты 1-333 (D).

На Фиг. 2 показаны SDS-PAGE очищенных рекомбинантных предполагаемых бактериальных QCs, экспрессированных в E. coli Rosetta(DE3)pLysS.

На Фиг. 3 показаны графики Лайнуивера-Берка для циклизации H-Gln-AMC, катализируемой PgQC (A), PiQC (B) и TfQC (C).

На Фиг.4 показаны типичные v/S характеристики, графики Лайнуивера-Берка и Иди-Хофсти для PgQC-катализируемой циклизации H-Gln-AMC в присутствии эталонного соединения MWT-S-00431.

На Фиг.5 показана активность PhoA в пермеабилизированных клетках E.coli CC118 pGP1-2, экспрессирующих белки слияния seqPgQC-`PhoA.

На Фиг. 6 показано изображение ленты для трех глутамилциклаз: PgQC (A); TfQC (B); hQC (C); и накладка (D).

На Фиг. 7 показаны поверхности молекул трех глутамилциклаз в кристалле: PgQC (A); TfQC (B); и hQC (код PDB 3SI0) (C). Поверхность окрашена липофильностью (зеленый: более липофильный, фиолетовый: более гидрофильный); центрированное отверстие показывает активный центр.

На Фиг.8 показаны молекулярные поверхности для PgQC (A); TfQC (B); и hQC (C) в кристалле, где гидрофильные области выделены более темным серым цветом (верхние рисунки).

На Фиг.9 показаны молекулярные поверхности для PgQC (A); TfQC (B); и hQC (C) в кристалле, где липофильные области выделены более темным серым цветом (нижние рисунки).

На Фиг. 10 показано сравнение активных центров и молекулярных поверхностей PgQC и hQC.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Терапевтические целевые белки (bacQC)

Socransky et al. (Journal of Clinical Periodontology, 1998, 25 134–144) описали, что появление в поддесневых бляшках так называемого «красного комплекса», состоящего из тесно связанной группы Tannerella forsythia, Porphyromonas gingivalis и Treponema denticola, в значительной степени связано с клиническими показателями болезни пародонтита, и, в частности, глубины кармана и кровотечения при зондировании.

Еще один родственный комплекс (так называемый «оранжевый комплекс») включает представителей подвидов Fusobacterium nucleatum/periodonticum, Prevotella intermedia, Prevotella nigrescens и Peptostreptococcus micros. Было обнаружено, что колонизация здоровых участков пародонта членами «оранжевого комплекса» коррелирует с возникновением гингивита. Бактерии «оранжевого комплекса», кроме того, способствуют колонизации бактериями «красного комплекса», которые, в свою очередь, вызывают глубокие карманы и хронический пародонтит.

Бактерии «красного комплекса» и «оранжевого комплекса» секретируют множество факторов вирулентности. Например, было обнаружено, что P. gingivalis секретирует цистеиновые протеазы, такие как гингипаин, P. intermedia секретирует протеазы IgA слюны, и T. forsythia секретирует гликозидазы.

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что около 80% секретируемых белков, несущих сигнальный пептид в секрете патогенов полости рта P. gingivalis, T. forsythia и P. intermedia, расщепляются по пептидной связи Xaa-Gln сигнальной пептидазой. На N-концах высвобожденных белков содержится остаток pGlu. Это подразумевает существование глутаминилциклаз, которые, по-видимому, необходимы для транслокации ростовых белков через внешнюю мембрану и роста указанных патогенов пародонта.

Глутаминилциклазы (QC) (EC 2.3.2.5), также называемые глутаминциклотрансферазами, представляют собой ацилтрансферазы, которые катализируют циклизацию N-концевых глутаминильных остатков белков в пироглутамат (pGlu) при высвобождении NH₃, тем самым модифицируя N-конец пептидов:

К настоящему времени определены два типа (Тип I и Тип II). QCs типа I были обнаружены у растений, а также у нескольких патогенных бактерий и паразитов человека (Huang et al., J. Mol. Biol. 2010, 401, 374–388). Папайя QC (pQC) является наиболее известным QC типа I. Этот фермент был впервые обнаружен в латексе тропического растения Carica papaya (Messer, M. Nature 1963, 197, 1299). Фермент проявляет каталитическую активность в широком диапазоне pH (pH 3,5–11). Рентгеноструктурный анализ показал, что pQC представляет собой молекулу в форме шляпной коробки, состоящую из пятилопастного β-пропеллера, пересекаемого центральным каналом (Wintjens, R., Belrhali, H., Clantin, B., Azarkan, M., Bompard, C., Baeyens-Volant, D., Looze, Y., and Villeret, V. J. Mol. Biol. 2006, 357, 457–470). pQC содержит ион цинка, но совершенно не ингибируется гетероциклическими хелаторами (Zerhouni et al. Biochim. Biophys. Acta 1998, 1387, 275–290), и поэтому предполагается, что цинк выполняет только структурную и стабилизирующую функцию. pQC обладает высокой устойчивостью к протеолитической, химической и термической денатурации (Wintjens et al., Zerhouni et al.).

QCs типа II были в основном идентифицированы в нейроэндокринных тканях млекопитающих. Среди QCs типа II наиболее изученным является человеческий QC (hQC), который, как известно, играет важную роль в созревании многочисленных нейропептидов и цитокинов в их секреторных путях. В отличие от QCs типа I, hQC весьма чувствителен к химической и термической денатурации. Schilling et al., 2003 (J. Biol. Chem. 2003, 278, 49773–49779) показали, что hQC был значительно нестабилен при pH выше 8,5 и ниже 6,0. hQC принимает α/β топологию (Huang et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 2005, 102, 13117–13122) и был идентифицирован как металлофермент, что подтверждается зависимым от времени ингибированием гетероциклическими хелаторами. Инактивированный фермент может быть полностью восстановлен добавлением Zn²⁺ в присутствии эквимолярных концентраций EDTA (Schilling et al., 2003). Таким образом, QCs типа II представляют собой металл-зависимые трансферазы, что позволяет предположить, что металл, связанный с активным центром (Zn²⁺), необходим для каталитической активности, в отличие от QCs типа I, в которых цинк выполняет только структурную и стабилизирующую функцию.

Таким образом, QCs типа I обычно обнаруживаются в растениях, некоторых бактериях и простейших; они имеют структуру β-пропеллер; высокую устойчивость к протеолизу, теплу и кислоте; оптимальную каталитическую активность - при pH 3,5-11; и имеют структурный ион Ca²⁺/Zn²⁺.

Напротив, QCs типа II в основном обнаруживаются у позвоночных; они демонстрируют α/β-топологии; низкая устойчивость к протеолизу, теплу и кислоте; оптимальная каталитическая активность - при pH 6,0-8,0; и есть каталитически необходимый ион Zn²⁺. Таким образом, глутамилциклазы II типа являются цинк-зависимыми ацилтрансферазами.

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что QCs типа II экспрессируются в патогенах ротовой полости P. gingivalis, T. forsythia и P. intermedia.

Первичная структура белка QC из P. gingivalis (PgQC, SEQ ID NO: 1) на 25% идентична QC человека (hQC, SEQ ID NO: 4). Кроме того, были идентифицированы QC из P. intermedia (PiQC, SEQ ID NO: 3) и T. forsythia (TfQC, SEQ ID NO: 2), которые имеют идентичность с PgQC 42% и 49% соответственно. Дальнейшие экспериментальные данные показывают, что эти ферменты действительно принадлежат к семейству QC типа II, что подтверждается, среди прочего, зависимостью активности bacQC от pH и ионной силы, ингибированием активности QC хелаторами металлов, схемами укладки всех трех белков, предполагающих наличие α/β топологии, как показывает спектроскопический анализ CD, и их термическая стабильность.

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что бактериальные QCs типа II экспрессируются и необходимы для роста 2 из 3 вызывающих периодонтит видов бактерий «красного комплекса», а также по меньшей мере одного вида бактерий «оранжевого комплекса», и поэтому имеют решающее значение в качестве цели для разработки терапевтического ингибитора с антибиотическими свойствами для лечения заболеваний и состояний пародонтита.

Таким образом, в контексте настоящего изобретения терапевтические целевые белки представляют собой бактериальные глутаминилциклазы (bacQCs), где bacQC определяется как полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1 (также называемой PgQC), SEQ ID NO: 2 (также обозначаемая как TfQC), SEQ ID NO: 3 (также обозначаемая как PiQC) и аминокислотная последовательность, имеющая 90% или более идентичность последовательности с любой из SEQ ID NO: : 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3.

bacQCs могут быть идентифицированы, выделены и очищены и использованы для идентификации ингибиторов, способных избирательно воздействовать на патогены, вызывающие пародонтит, как дополнительно описано в примерах в данном раскрытии. В целях сравнения двух или более аминокислотных последовательностей степень идентичности между двумя аминокислотными последовательностями (процент «идентичности последовательностей») может быть определена обычными методами, например, с помощью стандартных алгоритмов выравнивания последовательностей, известных в штате в данной области, такие как, например, BLAST (Altschul SF и др. J Mol Biol. 1990, 215 (3), 403-10).

Соединения

Используя описанные здесь способы идентификации соединений-кандидатов и/или ингибиторов, авторы настоящего изобретения определили новую группу в качестве ведущего структурного мотива для создания и получения сильнодействующих и терапевтически эффективных ингибиторов бактериальных глутамилциклаз. Указанный структурный мотив представляет собой имидазо[4,5-b]пиридиновую группу, как показано ниже (включая нумерацию атомов кольца):

Этот структурный мотив представляет собой подходящую группу связывания металла, способную обратимо связываться с ионом Zn²⁺, расположенным в кармане связывания bacQCs. Предпочтительно, когда имидазо[4,5-b]пиридиновая группа замещена в положении 6 пиридинового кольца могут быть достигнуты особенно высокая ингибирующая активность и селективность bacQC.

Более предпочтительно группа, связанная с имидазо[4,5-b]пиридиновой группой, представляет собой либо бензиламин, либо ароматический сульфонамид, каждый из которых связан через атом N с пиридиновым кольцом. Напротив, было обнаружено, что использование ароматических амидов вместо этого обеспечивает слабую активность, и поэтому они менее предпочтительны. Другими словами, R^a и R^b предпочтительно не представляют вместе с = O.

В следующем предпочтительном варианте осуществления соединения содержат фрагмент, представленный следующей структурой E:

Присутствие этого фрагмента увеличивает поглощение соединений-ингибиторов согласно настоящему изобретению клетками бактерий, экспрессирующих глутаминилциклазы типа II (такие как P. gingivalis, T. forsythia и P. intermedia), которые распознают, активно поглощают и захватывают над порфиринованный фрагмент с помощью металл-независимой системы (например, домена HA2, который является рецептором как для гема, так и для гемоглобина) и/или металл-зависимой системы (например, HusA, который представляет собой гемофор-подобный порфирин-связывающий белок, способный распознавать вышеуказанную группу). Таким образом, соединение ингибитора общей формулы I или II с фрагментом, представленным структурой E, обеспечивает усиленную целенаправленную доставку к патогенным клеткам, улучшенной селективности в отношении целевых патогенов полости рта и/или улучшенную антибиотическую активность in vivo против этих патогенов. Эти эффекты особенно выражены, когда фрагмент, представленный структурой E, присоединен к группе A ингибитора через линкер, представленный структурой E, как определено в прилагаемой формуле изобретения.

В частности, настоящее описание предоставляет соединения для любого из следующих аспектов <1> - <19>.

<1> Соединение согласно одной из следующих формул I или II,

его индивидуальные энантиомеры, его индивидуальные диастереоизомеры, его гидраты, его сольваты, его кристаллические формы, его индивидуальные таутомеры или его фармацевтически приемлемая соль, где:

A выбран из группы, состоящей из необязательно замещенного арила, необязательно замещенного гетероциклила, необязательно замещенного циклоалкила и необязательно замещенного алкенила;

R¹ независимо выбран из группы, состоящей из H и необязательно замещенного алкила;

L выбирается из и .

R^a и R^b одинаковы или отличаются друг от друга и независимо выбраны из группы, состоящей из H, галогена, необязательно замещенного алкила, необязательно замещенного арила, необязательно замещенного гетероалкила и необязательно замещенного гетероарила, и где R^a и R^b необязательно могут быть соединены вместе с образованием карбоциклического или гетероциклического кольца.

<2> Соединение согласно аспекту <1>, где:

указанный арил независимо представляет собой C_6-10, предпочтительно C₆ арильную группу;

указанный гетероциклил независимо представляет собой моноциклическую или бициклическую C_1-11, предпочтительно C_2-8, более предпочтительно C_4-5 гетероциклическую группу, содержащую от 1 до 4 кольцевых гетероатомов, выбранных из N, S и O;

указанный алкил независимо представляет собой линейную или разветвленную, открытую или циклическую C_1-6, предпочтительно C_1-4, более предпочтительно C_1-3, еще более предпочтительно C_1-2 алкильную группу;

указанный циклоалкил независимо представляет собой циклическую C_3-6, предпочтительно C_4-6, более предпочтительно C_5-6 алкильную группу;

указанный алкенил независимо представляет собой линейную или разветвленную, открытую или циклическую группу C_2-6, предпочтительно C_2-4, более предпочтительно группу C₂, содержащую по меньшей мере одну связь C=C;

указанный гетероарил независимо представляет собой ароматическую, моноциклическую или бициклическую C_1-11, предпочтительно C_2-8, более предпочтительно C_4-5 гетероциклическую группу, содержащую от 1 до 4 кольцевых гетероатомов, выбранных из N, S и O; и

указанный гетероалкил независимо представляет собой линейную или разветвленную, открытую или циклическую C_1-5, предпочтительно C_1-3, более предпочтительно C_1-2 гетероалкильную группу, содержащую от 1 до 4 гетероатомов, выбранных из N, S и О.

<3> Соединение согласно любому из аспектов с <1> по <2>, которое представлено одной из следующих формул Ia, IIa, Ib и IIb, предпочтительно Ia:

где A выбран из необязательно замещенного арила и необязательно замещенного гетероарила; и

R¹, R^a и R^b — это H.

<4> Соединение согласно любому из аспектов с <1> по <3>, где R^a и R^b независимо выбраны из ¹H и D.

<5> Соединение согласно любому из аспектов с <1> по <4>, где либо один из R^a и R^b представляет собой ¹H, а другой - D; или каждый из них представляет собой ¹H; или каждый из них D.

<6> Соединение согласно любому из аспектов с <1> по <5>, где:

A представлен одной из следующих структур от A-1 до A-7;

где Y выбран из О и S; и

от R² до R⁶ каждый независимо выбран из группы, состоящей из H, фтора, хлора, брома, йода, алкила, арила, гетероарила, алкокси, арилокси, (аминоалкил)окси, (гетероарил)окси, амино, (диалкил)амино, (моноалкил)амино, (алкил)(гетероалкил)амино, (дигетероалкил)амино, [(алкил)окси]карбонил и галогеналкил, каждый из которых может быть необязательно дополнительно замещен.

<7> Соединение согласно аспекту <6>, где либо:

(а) R⁴, или

(б) R³, или

(c) R³ и R⁴

каждый независимо выбран из группы, состоящей из фтора, хлора, брома, йода, алкила, арила, гетероарила, алкокси, арилокси, (аминоалкил)окси, (гетероарил)окси, амино, (диалкил)амино, (моноалкил)амино , (алкил)(гетероалкил)амино, (дигетероалкил)амино, [(алкил)окси]карбонил и галогеналкил, каждый из которых необязательно может быть дополнительно замещен;

а остальные от R² до R⁶ — это H.

<8> Соединение согласно любому из аспектов с <6> по <7>, где

по крайней мере, один из R², R³, R⁴, R⁵ и R⁶ независимо представлен следующей структурой B:

B

где n = 1, 2, 3, 4, 5 или 6;

R⁷ и R⁸ независимо выбраны из алкила, арила, гетероалкила, гетероарила, карбамимидоила, формила, алкилацила и арилацила, каждый из которых может быть дополнительно замещен, и где R⁷ и R⁸ могут быть необязательно соединены вместе с образованием карбоциклического или гетероциклического кольца.

<9> Соединение согласно любому из аспектов с <6> по <8>, где:

R¹, R^a и R^b представляют собой H; и

A представлен структурой A-1.

<10> Соединение согласно любому из аспектов с <1> по <7>, где A замещен по меньшей мере одним заместителем, представленным следующей структурой B:

B

где n = 1, 2, 3, 4, 5 или 6; и

R⁷ и R⁸ независимо выбраны из алкила, арила, гетероалкила, гетероарила, карбамимидоила, формила, алкилацила и арилацила, каждый из которых необязательно может быть дополнительно замещен и где R⁷ и R⁸ могут быть необязательно соединены вместе с образованием карбоциклического или гетероциклического кольца.

<11> Соединение согласно любому из аспектов с <8> по <10>, где R⁷ представлен следующей структурой E:

где М выбран из Fe²⁺ и Fe³⁺ или отсутствует;

R^c и R^d независимо выбраны из –H, –CH₃, –CH=CH₂, –SO₃H и –CH(OH)CH₂OH; и

X выбран из ковалентной связи, группы алкилена, аралкилена, гетероалкилена, карбоциклена, гетероциклена, гетероарилена, гетероаралкилена, аминоалкилена, алкиламино и карбонилалкиламино; где каждый из них может иметь до 12 атомов углерода и до 11 гетероатомов в основной цепи и может быть замещен одной или несколькими C_1-6алкильной группой(ами), C_1-6 гетероалкильной группой(ами), C_1-6карбоциклильная группа(ы), C_1-5гетероциклильная группа(ы), C_1-5гетероарильная группа(ы), атом(ы) галогена, гидроксильная группа(ы), цианогруппа(ы), первичная, вторичная или третичная аминогруппа(ы), карбоксильные группы и боковые цепи, полученные из протеиногенных или непротеиногенных аминокислот.

<12> Соединение согласно аспекту <11>, где X представлен следующей структурой:

где m = 0, 1, 2 или 3, и

R^e представляет собой боковую цепь, полученную из протеиногенной аминокислоты.

<13> Соединение согласно любому из аспектов с <1> по <12>, в котором A замещен заместителем, представленным следующей структурой F:

где М выбран из Fe²⁺ и Fe³⁺ или отсутствует; и

R^c и R^d независимо выбраны из –H, –CH₃, –CH=CH₂, –SO₃H и –CH(OH)CH₂OH.

<14> Соединение согласно аспекту <13>, где A имеет значение, определенное согласно аспекту <6>, и где по меньшей мере один из R², R³, R⁴, R⁵ и R⁶ представлен структурой F.

<15> Соединение согласно любому из аспектов с <1> по <14>, где A замещен по меньшей мере одним заместителем, представленным следующей структурой E1:

где М выбран из Fe²⁺ и Fe³⁺ или отсутствует;

R^c и R^d независимо выбраны из –H, –CH₃, –CH=CH₂, –SO₃H и –CH(OH)CH₂OH; и

X выбран из ковалентной связи, O, NH, группы алкилена, аралкилена, гетероалкилена, карбоциклена, гетероциклена, гетероарилена, гетероаралкилена, аминоалкилена, алкиламино и карбонилаалкиламино; где каждый из них может иметь до 12 атомов углерода и до 11 гетероатомов в основной цепи и может быть замещен одной или несколькими C_1-6 алкильной группой(ами), C_1-6 гетероалкильной группой(ами), C_1-6 карбоциклильная группа(ы), C_1-5 гетероциклильная группа(ы), C_1-5 гетероарильная группа(ы), атом(ы) галогена, гидроксильная группа(ы), цианогруппа(ы), первичная, вторичная или третичная аминогруппа(ы), карбоксильные группы и боковые цепи, полученные из протеиногенных или непротеиногенных аминокислот.

<16> Соединение согласно любому из аспектов с <1> по <15>, где

A выбран из группы, состоящей из алкоксиарила, (алкокси)(галоген)арила, (алкокси)гетероарила, алкиларила, алкилгетероарила, аминоарила, аминогетероарила, ариларила, арилгетероарила, (арилокси)арила, (арилокси)гетероарила, галогенарила, галогетероарила, (гетероалкил)арила, (галогеналкил)арила, (гетероарил)арила, [(гетероарил)окси]арила, [(аминоалкил)окси]арила, арила, гетероарила, циклоалкила и гетероциклоалкила, каждый из которых необязательно может быть заменены.

<17> Соединение согласно любому из аспектов <1> - <16>, в котором:

A выбран из группы, состоящей из 2-алкоксифенила, 3-алкоксифенила, 4-алкоксифенила, 2,3-диалкоксифенила, 2,4-диалкоксифенила, 2,5-диалкоксифенила, 2,6-диалкоксифенила, 3,4-диалкоксифенила, 3,5-диалкоксифенил, 3,4,5-триалкоксифенил, 2,6-дигало-4-алкоксифенил, 2-галоген-4-алкоксифенил, 3-галоген-5-алкоксифенил, 4-галоген-3-алкоксифенил, 2- алкилфенил, 3-алкилфенил, 4-алкилфенил, 3-[(алкил)(гетероалкил)амино]фенил, 3-[(диалкил)амино]фенил, 3- [(дигетероалкил)амино]фенил, 3-[(моноалкил)амино]фенил, 4-[(алкил)(гетероалкил)амино]фенил, 4-[(диалкил)амино]фенил, 4-[(дигетероалкил)амино]фенил, 4-[(гетероарил)окси]фенил, 4-[(моноалкил)амино]фенил, арилфенил, 2-(арилокси)фенил, 3-(арилокси)фенил, 4-(арилокси)фенил, 2-галогенфенил, 3-галогенофенил, 4-галогенфенил, 2,3-дигалогенфенил, 2,4 -дигалогенфенил, 2,5-дигалогенфенил, 2,6-дигалогенфенил, 3,4-дигалогенфенил, 3,5-дигалогенфенил, 2,3,4-тригалогенфенил, 2,3,5-тригалогенфенил, 3,4,5-тригалогенфенил , 2,4,5-тригалогенфенил, 2,4,6-тригалогенфенил, 3-(галогеналкил)фенил, 4-(галогеналкил)фенил, 3-(C₅моногетероарил)фенил, 4-(C₅моногетероарил)фенил, 3-(C₄моногетероарил)фенил, 4-(C₄моногетероарил)фенил, 3-[(гетероарил)окси]фенил, 4-{[амино(алкил)]окси}фенил, 3-{[амино (алкил)]окси}фенил, нафтил, фенил, C₅-моногетероарил, C₄-моногетероарил, морфолинил и пиперидинил, каждый из которых необязательно может быть дополнительно замещен.

<18> Соединение согласно любому из аспектов с <1> по <17>, где:

A выбран из группы, состоящей из 2-метоксифенила, 3-метоксифенила, 4-пропоксифенила, 4-метоксифенила, 4-изопропоксифенила, 4-бензилоксифенила, 3,4-диметоксифенила, 2,3-дигидро-1,4-бензодиоксина-6-ил, 2,2-дифтор-1,3-бензодиоксол-5-ил, 7-метокси-1,3-бензодиоксол-5-ил, 2,6-дифтор-4-метоксифенил, 3-(1-пиперидил)фенил, 4-морфолинофенил, [1,1'-бифенил]-3-ил, [1,1'-бифенил]-4-ил, 3-феноксифенил, 4-феноксифенил, 2-хлорфенил, 3-хлорфенил , 4-хлорфенил, 3,4-дихлорфенил, 3,4,5-трифторфенил, 4-(2-пиридил)фенил, 4-(2-карбамимидамидоэтилокси) фенил, 4-(2-аминоэтокси)фенил, 4-(2-морфолиноэтокси)фенил, фенил, 2-пиридил, 3-пиридил, 4-пиридил, 2-тиенил и 3-тиенил.

<19> Соединение, выбранное из группы, состоящей из:

Выражение «алкил», используемое в данном документе, если специально не ограничено, означает C_1-12 алкильную группу, подходяще C_1-8 алкильную группу, например C_1-6алкильная группа, например С_1-4алкильная группа. Алкильные группы могут быть с прямой или разветвленной цепью. Подходящие алкильные группы включают, например, метил, этил, пропил (например, н-пропил и изопропил), бутил (например, н-бутил, изобутил, втор-бутил и трет-бутил), пентил (например, н-пентил), гексил (например, н-гексил), гептил (например, н-гептил) и октил (например, н-октил). Термин «алкил» также включает циклоалкильные группы. Выражение «циклоалкил», если специально не ограничено, обозначает C_3-10циклоалкильную группу (т.е. от 3 до 10 атомов углерода в кольце), более предпочтительно C_3-8циклоалкильную группу, например C_3-6циклоалкильную группу. Примеры циклоалкильных групп включают циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогептил и циклооктил. Наиболее подходящее количество атомов углерода в кольце составляет от трех до шести.

Выражение «гетероалкил», если специально не ограничено, относится к алкильной группе, в которой один или несколько атомов углерода, предпочтительно 1, 2 или 3, заменены гетероатомами, выбранными из N, S и О.

Выражения «карбоциклил» и «карбоциклический», если специально не ограничены, обозначают любую кольцевую систему, в которой все кольцевые атомы являются углеродом, и которая содержит от трех до двенадцати кольцевых атомов углерода, более приемлемо от трех до десяти атомов углерода и более приемлемо от трех до восемь атомов углерода. Карбоциклильные группы могут быть насыщенными или частично ненасыщенными, но не включают ароматические кольца. Примеры карбоциклических групп включают моноциклические, бициклические и трициклические кольцевые системы, в частности моноциклические и бициклические кольцевые системы. Другие карбоцилцильные группы включают кольцевые системы с внутренним мостиком (например, бицикло[2.2.1]гептенил). Конкретным примером карбоциклильной группы является циклоалкильная группа. Еще одним примером карбоциклильной группы является циклоалкенильная группа.

Выражение «арил», если специально не ограничено, обозначает C_6-12арильную группу, подходящую C_6-10арильную группу, более подходящую C_6-8арильную группу. Арильные группы будут содержать по крайней мере одно ароматическое кольцо (например, одно, два или три кольца). Примером типичной арильной группы с одним ароматическим кольцом является фенил. Примером типичной арильной группы с двумя ароматическими кольцами является нафтил.

Выражения «гетероциклил» и «гетероциклический», если специально не ограничиваются, относятся к карбоциклильной группе, в которой один или несколько (например, 1, 2 или 3) кольцевых атома заменены гетероатомами, выбранными из N, S и O. Конкретный пример гетероциклической группы представляет собой циклоалкильная группа (например, циклопентил или, более конкретно, циклогексил), в которой один или несколько (например, 1, 2 или 3, особенно 1 или 2, особенно 1) кольцевых атомов заменены гетероатомами, выбранными из N, S или О. Примерные гетероциклические группы, содержащие один гетероатом, включают пирролидин, тетрагидрофуран и пиперидин, а примерные гетероциклические группы, содержащие два гетероатома, включают морфолин и пиперазин. Еще одним конкретным примером гетероциклической группы является циклоалкенильная группа (например, циклогексенильная группа), в которой одна или несколько (например, 1 , 2 или 3, особенно 1 или 2, особенно 1) кольцевых атома заменены гетероатомами, выбранными из N, S и O. Примером такой группы является дигидропиранил (например, 3,4-дигидро-2H-пиран-2-ил-).

Выражение «гетероарил», если специально не ограничено, означает арильный остаток, где один или несколько (например, 1, 2, 3 или 4, приемлемо 1, 2 или 3) кольцевых атома заменены гетероатомами, выбранными из N, S и O или 5-членное ароматическое кольцо, содержащее один или несколько (например, 1, 2, 3 или 4, подходяще 1, 2 или 3) кольцевых атома, выбранных из N, S и О. Гетероарильные группы представляют собой конкретный подтип в общем классе «гетероциклических» или «гетероциклических» групп. Примеры моноциклических гетероарильных групп, содержащих один гетероатом, включают: пятичленные кольца (например, пиррол, фуран, тиофен) и шестичленные кольца (например, пиридин, такой как пиридин-2-ил, пиридин-3-ил и пиридин-4-ил). Примеры моноциклических гетероарильных групп, содержащих два гетероатома, включают: пятичленные кольца (например, пиразол, оксазол, изоксазол, тиазол, изотиазол, имидазол, такие как имидазол-1-ил, имидазол-2-ил имидазол-4-ил); шестичленные кольца (например, пиридазин, пиримидин, пиразин). Примеры моноциклических гетероарильных групп, содержащих три гетероатома, включают 1,2,3-триазол и 1,2,4-триазол. Примеры моноциклических гетероарильных групп, содержащих четыре гетероатома, включают тетразол. Примеры бициклических гетероарильных групп включают: индол (например, индол-6-ил), бензофуран, бензтиофен, хинолин, изохинолин, индазол, бензимидазол, бензотиазол, хиназолин и пурин.

Выражения «алкоксиарил», «карбоксиарил», «цианоарил», «галоарил», «гидроксиарил» и «гетероариларил», если специально не ограничены, обозначают арильный остаток, который замещен по меньшей мере одним алкокси, карбокси, циано, галоген, гидрокси и гетероарильной группой соответственно.

Выражения «алкоксигетероарил», «карбоксигетероарил», «цианогетероарил», «галогетероарил» и «гидроксигетероарил», если специально не ограничены, обозначают гетероарильный остаток, который замещен по меньшей мере одной алкоксильной, карбоксильной, циано, галогеновой и гидроксильной группой соответственно.

Выражение «алк», например, в выражениях «алкокси», «галогеналкил» следует интерпретировать в соответствии с определением «алкил». Примеры алкоксигрупп включают метокси, этокси, пропокси (например, н-пропокси), бутокси (например, н-бутокси), пентокси (например, н-пентокси), гексокси (например, н-гексокси), гептокси (например, н-гептокси) и октокси (например н-октокси). Примеры галогеналкильных групп включают фторалкил, например CF₃; примерные галогеналкоксигруппы включают фторалкил, например OCF₃.

Термин «галоген» или «галогено» включает фтор (F), хлор (CI), бром (Br) и йод (I).

Термины «водород» или «H» в контексте настоящего описания охватывают все изотопы водорода, в частности протий (¹H) и дейтерий (²H, также обозначаемый как D).

Термин «необязательно замещенный» относится к необязательному замещению одной или несколькими группами, независимо выбранными из: С_1-6алкила, С_1-6гетероалкила, С_1-6карбоциклила, С_1-5гетероциклила и С_1-5гетероарильной группы, каждая из которых может быть замещенной одним или несколькими атомами галогена и/или гидроксильными группами; атомом галогена; цианогруппой; первичной, вторичной или третичной аминогруппой; гидроксильной группой; и карбоксильной группой.

Стереоизомеры

Все возможные стереоизомеры заявленных соединений включены в настоящее изобретение.

Если соединения, согласно настоящему изобретению, имеют по крайней мере один хиральный центр, они могут соответственно существовать в виде энантиомеров. Если соединения имеют два или более хиральных центра, они могут дополнительно существовать в виде диастереомеров. Следует понимать, что все такие изомеры и их смеси входят в объем настоящего изобретения.

Если способы получения соединений, согласно изобретению, приводят к смеси стереоизомеров, эти изомеры могут быть разделены обычными методами, такими как препаративная хроматография. Соединения могут быть получены в рацемической форме, или отдельные энантиомеры могут быть получены либо путем энантиоспецифического синтеза, либо путем разделения. Соединения могут, например, быть разделены на их компоненты-энантиомеры стандартными методами, такими как образование диастереомерных пар путем образования соли с оптически активной кислотой, такой как (-)-ди-п-толуоил-d-винная кислота и/или (+)- ди-п-толуоил-1-винная кислота с последующей фракционной кристаллизацией и регенерацией свободного основания или образованием соли с оптически активным основанием, таким как хинин, хинидин, хинотоксин, цинкотоксин, (S) -фенилэтиламин, (1R, 2S)-эфедрин, (R) -фенилглицин, (S)-2-аминобутанол, с последующей фракционной кристаллизацией и регенерацией свободной кислоты. Соединения также могут быть разделены путем образования диастереомерных сложных эфиров или амидов с последующим хроматографическим разделением и удалением хирального вспомогательного вещества. Альтернативно, соединения можно разделить с использованием колонки для хиральной высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC).

Полиморфные кристаллические формы, сольваты, гидраты

Кроме того, некоторые из индивидуальных кристаллических форм соединений могут существовать в виде полиморфов и, как таковые, предназначены для включения в настоящее изобретение. Кроме того, некоторые из соединений могут образовывать сольваты с водой (то есть гидраты) или обычными органическими растворителями, и предполагается, что такие сольваты также входят в объем настоящего изобретения. Соединения, включая их соли, также могут быть получены в форме их гидратов или могут включать другие растворители, используемые для их кристаллизации. Принимая во внимание тесную взаимосвязь между свободными соединениями и соединениями в форме их солей, гидратов или сольватов, всякий раз, когда соединение упоминается в этом контексте, также подразумевается соответствующая соль, сольват или полиморф, при условии, что это возможно, или уместно в данных обстоятельствах.

Таутомеры

Используемый здесь термин «таутомер» относится к миграции протонов между соседними одинарными и двойными связями. Процесс таутомеризации обратим. Описанные здесь соединения могут подвергаться любой возможной таутомеризации, которая находится в пределах физических характеристик соединения.

Фармацевтически приемлемые соли

Используемый здесь термин «фармацевтически приемлемый» охватывает как человеческое, так и ветеринарное использование. Например, термин «фармацевтически приемлемый» охватывает ветеринарно приемлемое соединение или соединение, приемлемое для медицины и здравоохранения.

Соли, гидраты и сольваты соединений формулы I и их физиологически функциональных производных, которые подходят для использования в медицине, представляют собой соли, в которых противоион или связанный с ним растворитель являются фармацевтически приемлемыми. Однако соли, гидраты и сольваты, содержащие фармацевтически неприемлемые противоионы или ассоциированные растворители, входят в объем настоящего изобретения, например, для использования в качестве промежуточных продуктов при получении других соединений и их фармацевтически приемлемых солей, гидратов и сольватов.

Подходящие соли, согласно изобретению, включают соли, образованные как с органическими, так и с неорганическими кислотами или основаниями. Фармацевтически приемлемые соли, полученные посредствам добавления кислоты, включают соли, образованные из соляной, бромистоводородной, серной, азотной, лимонной, винной, фосфорной, молочной, пировиноградной, уксусной, трифторуксусной, трифенилуксусной, сульфаминовой, сульфаниловой, янтарной, щавелевой, фумаровой, малеиновой, яблочной, миндальной, глутаминовой, аспарагиновой, щавелевоуксусной, метансульфоновой, этансульфоновой, арилсульфоновой (например, п-толуолсульфоновая, бензолсульфоновая, нафталинсульфоновая или нафталиндисульфоновая), салициловой, глутаровой, глюконовой, трикарбаллиловой, коричной, замещенной коричной (например, фенил, метил, метокси или галоген замещенная коричная кислота, включая 4-метил и 4-метоксикоричная кислота), аскорбиновой, олеиновой, нафтойной, гидроксинафтоиновой (например, 1-или3-гидрокси-2-нафтойная), нафталинакриловой (например, нафталины-акрил), бензойной, 4-метоксибензойной, 2- или 4-гидроксибензойной, 4-хлорбензойной, 4-фенилбензойной, бензолакриловой (например, 1,4-бензолдиакриловая), изетионовой кислоты, хлорной, пропионовой, гликолевой, гидроксиэтансульфоновой, памовой, циклогексансульфаминовой, салициловой, сахариновой и трифторуксусной кислоты. Фармацевтически приемлемые основные соли включают аммонийные соли, соли щелочных металлов, такие как соли натрия и калия, соли щелочноземельных металлов, такие как соли кальция и магния, и соли с органическими основаниями, такими как дициклогексиламин и N-метил-D-глюкамин.

Предполагается, что все фармацевтически приемлемые формы соединений солей, полученных посредством добавления кислоты, по настоящему изобретению входят в объем настоящего изобретения.

Фармацевтические композиции

Фармацевтическая композиция, согласно настоящему изобретению, включает соединение, как описано выше, и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

Используемый здесь термин «фармацевтическая композиция» предназначен для охвата продукта, содержащего заявленные соединения в терапевтически эффективных количествах, а также любого продукта, который является прямым или косвенным результатом комбинаций заявленных соединений. Используемый здесь термин «вспомогательное вещество» относится к носителю, связующему веществу, дезинтегратору и/или другой подходящей добавке для галеновых составов, например, для жидких препаратов для орального введения, таких как суспензии, эликсиры и растворы; и/или для твердых препаратов для орального введения, таких как, например, порошки, капсулы, желатиновые капсулы и таблетки. Носители, которые могут быть добавлены к смеси, включают необходимые и инертные фармацевтические вспомогательные вещества, включая, но не ограничиваясь ими, подходящие суспендирующие агенты, лубриканты, ароматизаторы, подсластители, консерванты, покрытия, гранулирующие агенты, красители и пигменты.

Терапевтическое применение

В настоящем описании раскрыто соединение, например, соединение по любому из вышеуказанных аспектов <1> - <19>, и/или фармацевтическая композиция, как описано выше, для применения в способе лечения организма человека или животного. В настоящем описании также предлагается способ лечения тела человека или животного, в котором способ включает введение терапевтически эффективного количества указанного соединения или композиции субъекту, нуждающемуся в этом.

Настоящее раскрытие дополнительно обеспечивает соединение и/или фармацевтическую композицию, как описано выше, для использования в способе терапии или профилактики бактериальной инфекции. В настоящем раскрытии также предлагается способ терапии или профилактики бактериальной инфекции, где способ включает введение терапевтически эффективного количества указанного соединения или композиции субъекту, нуждающемуся в этом. Бактериальная инфекция предпочтительно вызывается бактерией, экспрессирующей бактериальную глутамилциклазу II типа (bacQC). Более предпочтительно, бактериальная инфекция вызывается бактерией, выбранной из группы, состоящей из видов Porphyromonas, Prevotella и Tannerella, предпочтительно выбранной из группы, состоящей из видов Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia и Tannerella forsythia.

Соединение-ингибитор bacQC или фармацевтическая композиция, используемые в способах согласно настоящему раскрытию, предпочтительно избирательно убивают или селективно ингибируют рост бактерии, выбранной из группы, состоящей из видов Porphyromonas, Prevotella и Tannerella, предпочтительно выбранных из группы, состоящей из видов Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia и Tannerella forsythia внутри биопленки, тогда как оставшиеся бактерии в биопленке предпочтительно остаются практически незатронутыми (т.е. погибают или их рост подавляется в значительно меньшей степени). Указанная биопленка предпочтительно представляет собой сложную биопленку, более предпочтительно природную биопленку и еще более предпочтительно природную биопленку полости рта.

В настоящем описании дополнительно предложено соединение-ингибитор bacQC или фармацевтическая композиция для использования в способе терапии или профилактики острого, хронического или рецидивирующего заболевания или состояния пародонта. Основные категории заболеваний и состояний пародонта подразделяются на группы заболеваний десен, вызванных зубным налетом, хронический пародонтит, агрессивный пародонтит, пародонтит как проявление системных заболеваний, некротические заболевания пародонта, абсцессы пародонта, пародонтит, связанный с эндодонтическими поражениями, периимплантный мукозит, периимплантит и эндодонтические инфекции. В настоящем описании острое, хроническое или рецидивирующее заболевание пародонта предпочтительно выбирается из группы, состоящей из заболеваний десен, вызванных зубным налетом, хронического пародонтита, агрессивного пародонтита, пародонтита как проявления системных заболеваний, некротических заболеваний пародонта, абсцессов пародонта, пародонтит, связанный с эндодонтическими поражениями, периимплантный мукозит, периимплантит и эндодонтические инфекции. В настоящем описании также предложен способ терапии или профилактики острого, хронического или рецидивирующего заболевания пародонта, который предпочтительно выбран из группы, состоящей из заболеваний десен, вызванных зубным налетом, хронического периодонтита, агрессивного пародонтита, пародонтита как проявления системных заболеваний, некротические заболевания пародонта, абсцессы пародонта, периодонтит, связанный с эндодонтическими поражениями, периимплантный мукозит, периимплантит и эндодонтические инфекции, при этом способ включает введение терапевтически эффективного количества соединения-ингибитора bacQC или фармацевтической композиции в соответствии с настоящим раскрытием нуждающегося в этом субъекта. Другие острые, хронические или рецидивирующие заболевания пародонта описаны, например, в Armitage, A. Ann Periodontol 1999, 4, 1-6.

В одном варианте осуществления настоящего раскрытия соединение или фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим раскрытием предпочтительно используется в любом из способов, описанных выше, где способ введения представляет собой местное введение и/или где способ представляет собой нехирургический метод. В другом варианте осуществления соединение-ингибитор или фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим раскрытием предпочтительно используется в любом из способов, описанных выше, где способ введения представляет собой системное введение и/или где способ представляет собой нехирургический метод.

Используемый здесь термин «субъект» относится к животному, предпочтительно млекопитающему, наиболее предпочтительно человеку, который является или являлось объектом лечения, терапии, профилактики, наблюдения или эксперимента.

Термин «терапевтически эффективное количество» в контексте настоящего описания означает такое количество активного соединения или фармацевтического агента, которое вызывает биологический или лекарственный ответ в тканевой системе, животном или человеке, который ищет исследователь, ветеринар, врач или другой лечащий персонал, которое включает облегчение симптомов заболевания или расстройства, которое лечат.

Белковые кристаллы

В настоящем описании представлены кристаллы бактериальных глутамилциклаз (bacQC).

Координаты атомов в кристаллической структуре PgQC показаны в таблице 1 на страницах 21–42 европейской заявки на патент EP18158343, поданной в Европейское патентное ведомство 23 февраля 2018 г., приоритет которой испрашивается настоящей заявкой и к которой сделана отсылка; или, альтернативно, в базе данных белков RCSB (www.rcsb.org) под идентификационным кодом PDB 6QQL, зарегистрированный 19 февраля 2019 г. В одном варианте осуществления кристалл, содержащий бактериальную глутамилциклазу (bacQC), представляет собой кристалл, содержащий PgQC, где PgQC представляет собой полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO. 1, или аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичности последовательности SEQ ID NO. 1, и предпочтительно имеющий:

- координаты атомов согласно таблице 1 заявки EP18158343 или 6QQL, как указано выше, или где среднеквадратичное отклонение от атомов основной цепи полипептидной цепи согласно таблице 1 заявки EP18158343 или 6QQL, как упомянуто выше, составляет 2 Å или меньше, и / или

- связывающий карман, определяемый остатками Gln133; Asp149; Glu182; Asp183; Tyr187; Gly188; Asp189; Asp190; Trp193; Cys194; Asp218; Met219; Phe232; Gly263; Ala264; Leu265; Thr266; Asp267; Val270; Ile284; Tyr286; Asn290; Glu291; His292; Gly293; Phe294; Trp298; His299 из SEQ ID NO: 1 и / или

- пространственная группа P 3₁ 2 1 и размеры элементарной ячейки a = 89,9 Å, b = 89,9 Å, c = 164,7 Å, α = 90°, β = 90° и γ = 120°.

Кроме того, предпочтительно кристалл PgQC дифрагирует рентгеновские лучи для определения координат атомов кристалла с разрешением от 2,81 до 44,95 Å.

Координаты атомов в кристаллической структуре TfQC показаны в Таблице 2 на страницах 43–91 европейской заявки на патент EP18158343, поданной в Европейское патентное ведомство 23 февраля 2018 г., приоритет которой испрашивается настоящей заявкой и к которой сделана ссылка; или, альтернативно, в базе данных протеинов RCSB (www.rcsb.org) под идентификационным кодом PDB 6QRO, зарегистрированной 19 февраля 2019 г.

В другом варианте осуществления кристалл, содержащий бактериальную глутамилциклазу (bacQC), может быть кристаллом, содержащим TfQC, где TfQC представляет собой полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO. 2, или аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичность последовательности SEQ ID NO. 2 и предпочтительно имеющий:

- координаты атомов согласно таблице 2 заявки EP18158343 или 6QQL, как указано выше, или где среднеквадратичное отклонение от атомов основной цепи полипептидной цепи согласно таблице 2 заявки EP18158343 или 6QQL, как упомянуто выше, составляет 3 Å или меньше, и/или

- связывающий карман, определяемый остатками His126; Arg130; His135; Glu183; Asp184; Gly186; Thr187; Glu189; Lys195; Pro196; Asp197; Trp199; Asp224; Met225; Gly269; Ala270; Ile271; Val272; Gln276; Tyr277; Ile290; Tyr292; Gln297; Ser298; Gly299; Phe300; Trp304; His305 из SEQ ID NO: 2 и/или

- пространственная группа P 1 и размеры элементарной ячейки a = 56,1 Å, b = 79,2 Å, c = 83,1 Å, α = 89,9 °, β = 90,0 ° и γ = 71,9 °.

Кроме того, предпочтительно кристалл TfQC дифрагирует рентгеновские лучи для определения координат атомов кристалла с разрешением от 2,10 до 38,28 Å.

Среднеквадратичное отклонение от атомов основной цепи полипептидной цепи может быть определено как позиционное среднеквадратичное отклонение от структурных координат эквивалентных атомов основной цепи C_α после структурного выравнивания структуры, которая будет сравниваться со структурой белка в соответствии с настоящего изобретения и с использованием программы DALI (L. Holm and C. Sander, Science, 1996, vol. 273, 595-602). Термин «связывающий карман», используемый здесь, включает ссылки на конкретную область (или атом) в молекулярный объект, способный вступать в стабилизирующее взаимодействие с другим молекулярным объектом. В некоторых вариантах осуществления термин также относится к реакционным частям макромолекулы, которые непосредственно участвуют в ее конкретной комбинации с другой молекулой. В альтернативном варианте осуществления связывающий участок содержит или определяется трехмерным расположением одного или нескольких аминокислотных остатков в свернутом полипептиде. Наиболее предпочтительно, чтобы связывающий карман bacQC, описанный в данном документе, определялся, соответственно, атомами остатков, перечисленных для каждого из bacQC выше.

В конкретном варианте осуществления изобретения кристалл, содержащий бактериальную глутаминилциклазу (bacQC), представляет собой кристалл, содержащий фрагмент полипептида, содержащий усеченную аминокислотную последовательность SEQ ID NO. 1 или аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичность последовательности с усеченной аминокислотной последовательностью SEQ ID NO. 1. Указанная усеченная аминокислотная последовательность SEQ ID NO. 1 получается делецией от 1 до 132, предпочтительно от 1 до 20, более предпочтительно от 2 до 10 последовательных аминокислот, начиная с N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO. 1, и/или путем делеции от 1 до 34, предпочтительно от 1 до 10, более предпочтительно от 2 до 5 последовательных аминокислот, начиная с С-конца SEQ ID NO. 1.

В другом конкретном варианте осуществления изобретения кристалл, содержащий бактериальную глутамилциклазу (bacQC), представляет собой кристалл, содержащий полипептидный фрагмент, содержащий усеченную аминокислотную последовательность SEQ ID NO. 2, или аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичность с усеченной аминокислотной последовательностью SEQ ID NO. 2. Указанная усеченная аминокислотная последовательность SEQ ID NO. 2 получается делецией от 1 до 125, предпочтительно от 1 до 21, более предпочтительно от 2 до 10 последовательных аминокислот, начиная с N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO. 2, и/или путем делеции от 1 до 29, предпочтительно от 1 до 10, более предпочтительно от 2 до 5 последовательных аминокислот, начиная с С-конца SEQ ID NO. 2.

В еще одном варианте осуществления обеспечивается сокристалл, содержащий bacQC, как описано выше, вместе с соединением-кандидатом. Соединение-кандидат предпочтительно связано со связывающим карманом bacQC. Соединение-кандидат дополнительно предпочтительно представляет собой ингибитор bacQC. Наиболее предпочтительно соединение-кандидат представляет собой соединение согласно одной из формул I или II, как указано в любом из аспектов от <1> до <19>.

Кристаллы и сокристаллы, согласно настоящему изобретению, предпочтительно имеют достаточное качество и размер, чтобы обеспечить определение трехмерной структуры дифракции рентгеновских лучей бактериальной глутамилциклазы с разрешением примерно 1,9 Å и примерно 2,8 Å.

Обе кристаллические структуры имеют складку α-β гидролазы, которая определяется 8-нитевым β-листом, окруженным 7 α-спиралями. В обоих случаях ион Zn тетраэдрически координирован с 2 аспартатами и 1 гистидином соответственно. Четвертый координационный узел занят молекулой воды, субстратом или металлсвязывающей группой как субструктурной частью ингибитора. Эти взаимодействия металлов небольшой группы и иона Zn важны для разработки активного соединения, используемого в качестве антибактериального агента против патогенов, упомянутых здесь. Более того, места связи образованы гидрофобными и гидрофильными участками, которые отличаются от человеческих ферментов и отвечают за создание селективности для бактериальных ферментов (см. Рис. 7–10).

Кристаллы и сокристаллы в соответствии с настоящим изобретением могут быть получены с помощью периодических способов, способов жидкого мостика, диализа, диффузии пара, таких как диффузия пара через «висящую» или «сидящую» каплю, как дополнительно описано ниже.

Один предпочтительный способ получения кристалла bacQC, как определено выше, включает стадии:

(а) обеспечение раствора, содержащего bacQC, как определено выше, предпочтительно в присутствии 150 мМ NaCl, в подходящем буфере, таком как 50 мМ Трис-HCl pH 8,0;

(b) смешивание указанного раствора с равным количеством кристаллизационного раствора, содержащего (i) 1 M HEPES pH 8,0, 2M сульфат аммония, 3% (об./об.) PEG400 в случае PgQC; или (ii) 0,1 М ацетата натрия, pH 4,6, 2М сульфата аммония в случае TfQC; и

(c) инкубирование полученной смеси в условиях, способствующих диффузии пара «висячей» или «сидящей» капли, в течение времени, достаточного для получения кристалла bacQC.

Один способ получения сокристалла bacQC вместе с соединением-кандидатом включает стадии:

(а) обеспечение раствора, содержащего bacQC, как определено выше, предпочтительно PgQC, и соединение-кандидат, растворенное в 100 мМ HCl, в молярном соотношении bacQC: соединение = 1: 2,3;

(b) смешивание указанного раствора с равным количеством кристаллизационного раствора, содержащего 1 M HEPES pH 8,0, 2M сульфат аммония, 3% (об./об.) PEG400; и

(c) инкубирование полученной смеси в условиях, способствующих диффузии пара «висячей» или «сидящей» капли, в течение времени, достаточного для получения сокристалла bacQC и соединения-кандидата.

Другой способ получения сокристалла bacQC вместе с соединением-кандидатом включает стадии:

(d) обеспечение раствора в качестве посевного материала собранного и измельченного bacQC, предпочтительно кристаллов TfQC без соединения-кандидата, полученного, как определено выше;

(e) обеспечение раствора, содержащего bacQC, как определено выше, и соединение-кандидат, растворенное в 100 мМ HCl, в молярном соотношении bacQC: соединение = 1: 1,2;

(f) смешивание указанного раствора с равным количеством кристаллизационного раствора, содержащего 1M гранул калия pH 6,6 или pH 6,8, 32,5% (об./об.) PEG 600, 0,1 M NaCl и 15% исходный раствор семян;

(g) инкубирование полученной смеси в условиях, способствующих диффузии пара «висячей» или «сидящей» капли, в течение времени, достаточного для получения сокристалла bacQC и соединения-кандидата.

Способы идентификации соединений-кандидатов и/или ингибиторов

Настоящее изобретение обеспечивает способ идентификации соединения-кандидата, которое может связываться со связывающим карманом bacQC, включающий следующие этапы:

(а) создание 3-мерной модели соответствующего bacQC с использованием структурных координат, описанных в таблице 1 заявки EP18158343 или 6QQL, как указано выше, или 2,

(б) анализ связывающего кармана, обеспечиваемого остатками Gln133; Asp149; Glu182; Asp183; Tyr187; Gly188; Asp189; Asp190; Trp193; Cys194; Asp218; Met219; Phe232; Gly263; Ala264; Leu265; Thr266; Asp267; Val270; Ile284; Tyr286; Asn290; Glu291; His292; Gly293; Phe294; Trp298; His299 из SEQ ID NO: 1 в соответствии с координатами таблицы 1 из заявки EP18158343 или 6QQL, как указано выше, или анализ связывающего кармана, обеспечиваемого остатками His126; Arg130; His135; Glu183; Asp184; Gly186; Thr187; Glu189; Lys195; Pro196; Asp197; Trp199; Asp224; Met225; Gly269; Ala270; Ile271; Val272; Gln276; Tyr277; Ile290; Tyr292; Gln297; Ser298; Gly299; Phe300; Trp304; His305 из SEQ ID NO: 2 согласно координатам таблицы 2 заявки EP18158343 или 6QQL, как указано выше;

(c) выполнение анализа компьютерного моделирования для идентификации соединения-кандидата, которое может ассоциироваться со связывающим карманом соответствующего bacQC.

Предпочтительно способ дополнительно включает:

(d) проверки in vitro того, снижает ли соединение-кандидат каталитическую активность bacQC, тем самым классифицируя соединение-кандидат, которое снижает каталитическую активность bacQC, как ингибитора bacQC.

Проверка того, снижает ли соединение-кандидат каталитическую активность bacQC, может быть выполнена, например, с помощью метода идентификации ингибитора bacQC, включающего следующие стадии (d1) - (d5):

(d1) обеспечение композиции, содержащей субстрат bacQC и bacQC;

(d2) предоставление соединения-кандидата, указанного в (c);

(d3) контактирование соединения-кандидата с композицией;

(d4) мониторинг каталитической активности bacQC;

(d5) классификация соединения-кандидата в качестве ингибитора bacQC на основе влияния соединения-кандидата на каталитическую активность bacQC, где соединение-кандидат, которое снижает каталитическую активность bacQC, классифицируется как ингибитор bacQC.

Указанная композиция (на стадии d1) может представлять собой водный раствор, предпочтительно содержащий подходящий буферный и/или солевой компоненты. Указанный субстрат предпочтительно представляет собой пептид или производное пептида, содержащее остаток глутамина на своем N-конце. Указанный субстрат предпочтительно меченный, более предпочтительно меченный изотопом, наиболее предпочтительно флюорогенный субстрат. Флуорогенный субстрат предпочтительно претерпевает изменение интенсивности флуоресценции после превращения в ходе реакции, катализируемой bacQC.

Подходящим флуорогенным субстратом для мониторинга активности bacQC является H-Gln-AMC, как описано в Schilling, S., Hoffmann, T., Wermann, M., Heiser, U., Wasternack, C., и Demuth, H.-U. Anal. Biochem. 2002, 303, 49-56 (Schilling et al., 2002), как показано на следующей схеме:

Соединение-кандидат может контактировать до, одновременно с или после добавления остальных компонентов композиции на стадии (d1). Соединение-кандидат предпочтительно находится в растворе, более предпочтительно в виде раствора диметилсульфоксида (ДМСО).

Превращение субстрата отслеживают с течением времени, например, отслеживая эмиссию флуорофора, образующегося при расщеплении флуорогенного субстрата. Активность bacQC можно определить по стандартной кривой AMC в условиях анализа.

Каталитическая активность bacQC может быть определена с использованием различных концентраций субстрата, bacQC и/или соединения-кандидата. Подходящими показателями каталитической активности bacQC являются, например, константы ингибирования (K_i), 50% остаточная активность (RA) в присутствии заданной концентрации соединения-кандидата и/или значения IC₅₀.

В настоящем изобретении также предлагается способ идентификации соединения-кандидата, которое связывается со связывающим карманом bacQC, причем способ включает следующие этапы:

(а) создание 3-мерной модели сокристалла, содержащего bacQC, как описано выше, вместе с соединением-кандидатом;

(b) анализ расстояний между атомами соединения-кандидата и атомами связывающего кармана, обеспечиваемого остатками Gln133; Asp149; Glu182; Asp183; Tyr187; Gly188; Asp189; Asp190; Trp193; Cys194; Asp218; Met219; Phe232; Gly263; Ala264; Leu265; Thr266; Asp267; Val270; Ile284; Tyr286; Asn290; Glu291; His292; Gly293; Phe294; Trp298; His299 из SEQ ID NO: 1, или атомы атомов кармана связывания по остаткам XXXX His126; Arg130; His135; Glu183; Asp184; Gly186; Thr187; Glu189; Lys195; Pro196; Asp197; Trp199; Asp224; Met225; Gly269; Ala270; Ile271; Val272; Gln276; Tyr277; Ile290; Tyr292; Gln297; Ser 298; Gly299; Phe300; Trp304; His305 из SEQ ID NO: 2 для идентификации соединения-кандидата, которое связывается со связывающим карманом bacQC.

Предпочтительно способ дополнительно включает:

(c) проверку in vitro того, снижает ли соединение-кандидат каталитическую активность bacQC, тем самым классифицируя соединение-кандидат, которое снижает каталитическую активность bacQC, как ингибитор bacQC.

Проверка того, снижает ли соединение-кандидат каталитическую активность bacQC, может быть выполнена, например, с помощью метода идентификации ингибитора bacQC, включающего следующие стадии (c1) - (c5):

(c1) обеспечение композиции, содержащей субстрат bacQC и bacQC;

(c2) предоставление соединения-кандидата, указанного в (b);

(c3) контактирование соединения-кандидата с композицией;

(c4) мониторинг каталитической активности bacQC;

(c5) классификация соединения-кандидата в качестве ингибитора bacQC на основе действия соединения-кандидата на каталитическую активность bacQC, где соединение-кандидат, которое снижает каталитическую активность bacQC, классифицируется как ингибитор bacQC.

ПРИМЕРЫ

I. Идентификация и получение предполагаемых бактериальных глутамилциклаз (bacQC)

а) Идентификация

Биоинформатический анализ секретома патогенов ротовой полости P. gingivalis, T. forsythia и P. intermedia (http://www.oralgen.lanl.gov/) показал, что около 80% секретируемых белков, несущих сигнальный пептид, расщепляются по пептидной связи Xaa-Gln сигнальной пептидазой. На N-концах высвобожденных белков содержится остаток pGlu. Это подразумевает существование глутамилциклаз, которые, по-видимому, необходимы для транслокации ростовых белков через внешнюю мембрану и роста пародонтальных патогенов.

На фиг.1 показано выравнивание аминокислотной последовательности QC человека (hQC, SEQ ID NO: 4) и предполагаемого бактериального QC из P. gingivalis (PgQC, SEQ ID NO: 1) (A), а также выравнивание аминокислотной последовательности дополнительного предполагаемые QC P. intermedia (PiQC, SEQ ID NO: 3) и T. forsythia (TfQC, SEQ ID NO: 2) и P. gingivalis (PgQC, SEQ ID NO: 1) (B). Предполагаемый PgQC на 25% идентичен человеческому QC. Кроме того, предполагаемый TfQC на 49% идентичен PgQC, а QC из P. intermedia обладают 42% идентичностью с PgQC. Подчеркнутые серым цветом остатки цистеина отражают дисульфидные мостики в hQC, которые отсутствуют в PgQC. Последовательности, выделенные жирным шрифтом в QC человека, отражают высоко консервативные остатки QC типа II. Последовательности Грея описывают предполагаемые сигнальные последовательности PgQC и hQC. Кроме того, типичный металл-связывающий мотив Asp-Glu-His представлен жирным шрифтом с подчеркиванием. Предполагаемый мотив связывания металла также был идентифицирован в TfQC и PiQC (B, жирные буквы). Выравнивания были подготовлены с использованием программы Clustal Omega в EMBL-EBInet; (*) указывает положения, которые имеют один полностью консервативный остаток, (:) указывает на сохранение между группами сильно схожих свойств, (.) указывает на сохранение между группами слабо схожих свойств (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/).

Анализ BLAST выявил открытую рамку считывания (ORF), кодирующую предполагаемый белок QC в P. gingivalis (WP_005874301). Первичная структура этого предполагаемого белка QC на 25% идентична QC человека. Кроме того, предполагаемые белки QC были также идентифицированы в геноме патогенов полости рта P. intermedia (WP_014709208) и T. forsythia (WP_014225037), которые на 42% или 49% идентичны предполагаемым QC из P. gingivalis (рис. 1). Как показано выравниванием аминокислот, консервативные остатки QC человека, по-видимому, отличаются в бактериальных QCs от тех консервативных остатков цистеина, которые образуют дисульфид, связанный в человеческом, и другие QCs типа II, по-видимому, не присутствуют во всех трех предполагаемых бактериальных QC. Однако высококонсервативный металл-связывающий мотив Asp144, Glu184 (Asp) и His322 QC типа II (Wintjens et al., 2006), по-видимому, присутствует в предполагаемом QC бактерий, который может представлять собой каталитический центр. Первичные структуры этих белков могут указывать на то, что эти белки действительно являются QCs.

б) Подготовка

На фиг. 2 показан электрофорез белков в полиакриламидном геле (SDS-PAGE) очищенных рекомбинантных предполагаемых бактериальных QCs, экспрессированных в pLysS E. coli Rosetta (DE3) и очищенных, как подробно описано ниже. Поэтому 30 мкг очищенного белка загружали в 12% SDS-PAGE и делали наглядным путем окрашивания Кумасси, дорожка 1, неокрашенный PageRuler Broad Range (Thermofisher Scientific), дорожка 2, HisPgQC, дорожка 3, HisPiQC и дорожка 5, HisTfQC. Все три предполагаемых бактериальных QC обладают теоретической молекулярной массой ≈ 37 кДа.

аа) Штаммы-акцепторы и среда

Для процедур клонирования использовали штамм E. coli DH5α или XL-1 blue (Stratagene). E. coli Rosetta(DE3)pLysS (Novagene) использовали для экспрессии белка. Анализ активности щелочной фосфатазы проводили в штамме CC118 pGP1-2 (Tabor, S. and Richardson, CC Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1985, 82, 1074-1078; Manoil, C., JJ Mekalanos and Beckwith, JJ Bacteriol.1990, 172 (2), 515-518). Все штаммы E. coli выращивали в среде Лурия-Бертани, как указано, при 20 °C, 30 °C или 37 °C. При необходимости добавляли антибиотики (ампициллин [от 50 до 125 мг/литр], хлорамфеникол [от 15 до 30 мг/литр] и канамицин [25 мг/литр]). Для приготовления твердой среды к соответствующему бульону добавляли 1,5% агар (Roth).

bb) Молекулярное клонирование плазмидных векторов, кодирующих бактериальные QC.

Все процедуры клонирования выполнялись с использованием стандартных методов молекулярной биологии. Для экспрессии белка используются открытые рамки считывания (ORF) PgQC (SEQ ID NO: 1, предполагаемый QC из P. gingivalis), PiQC (SEQ ID NO: 3 предполагаемый QC из P. intermedia) и TfQC (SEQ ID NO: 2, предполагаемый QC из T. forsythia) усиливались с использованием синтезированных последовательностей ДНК, приобретенных у Eurofins Genomics, в качестве матриц в пилимеразной цепной реакции (ПЦР) для введения сайта рестрикции NheI/NdeI, необходимого для прямого клонирования, в вектор pET28a(+) (Novagen). Для создания белка слияния PgQC-´PhoA предполагаемый pgQC с предсказанной сигнальной последовательностью был субклонирован в pET26b(+) через сайт рестрикции NheI/XhoI с использованием пары праймеров seqpgQC NdeI (прямой) и seqpgQC XhoI (обратный). Кроме того, pgQC с нативной сигнальной последовательностью, включающей места связывания рибосомы вектора pET26b(+), амплифицировали с использованием пары праймеров seqpgQC RBS NotI (прямой) и seqpgQC XbaI (обратный) для клонирования в вектор экспрессии phoA pECD637. Все праймеры для клонирования были приобретены у Metabion и описаны в таблице 3.

Таблица 1. Олигонуклеотиды, используемые для клонирования конструкций bacQC

SEQ ID NO: Праймер Секвенция (5’→ 3’) 5 pgQC NdeI (прямой) AAA CAT ATG AAC GGC AAT AAC ACA AGT GAA 6 pgQC NheI (обратный) TTT GCT AGC TCA GTG TGA AGC GGC TTT 7 piQC NdeI (прямой) TTT CAT ATG AAA GGA AAA TCG TCT AAC 8 piQC NheI (обратный) ATG CTA GCT TAC ATG CTG TAA AGC AC 9 tfQC NdeI (прямой) TCA CAT ATG GGT CAG AAA AAT ACG ACA 10 tfQC NheI (обратный) ATG CTA GCT TAT TTC TCA TTA TAA ATC AC 11 seqpgQC NdeI (прямой) AAA CAT ATG AAA AGA CTG ATA ACA ACA GGA GCA GCC TTT CTA CTG GCT GCT ACA CTC TCT GCC TGC AAC GGC AAT AAC ACA AGT GAA ACG 12 seqpgQC XhoI (обратный) TTT CTC GAG GTG TGA AGC GGC TTT CAC 13 seqpgQC RBS NotI (прямой) TGG CGG CCG CTA AGA AGG AGA 14 seqpgQC XbaI (обратный) TTT TCT AGA GTG TGA AGC GGC TTT CAC

cc) Экспрессия бактериального QC в виде слитого белка His Tag или слитого белка ´PhoA

Вектор экспрессии pET28a (+):: pgQC трансформировали в E. coli Rosetta(DE3)pLysS. Бактерии выращивали в среде Лурия-Бертани, содержащей канамицин (25 мкг/мл) и хлорамфеникол (15 мкг/мл), при 37 °C до тех пор, пока плотность клеток не достигала OD 600~0,6. Культуры индуцировали с 0,4 мМ изопропил β-D-1-тиогалактопиранозидом и добавляли 2% (об./об.) объем этанола с последующим инкубированием в течение 16 часов при 20 °C. Культуры собирали центрифугированием при 4 °C и 3900 g в течение 30 мин, а осадок клеток хранили при –20 °.

Для экспрессии слитого белка seqPgQC-´PhoA рекомбинантный вектор pECD637:: seqpgQC трансформировали в CC118 (без, например, гена phoA) вместе с вспомогательной плазмидой pGP1-2. Культуры инокулировали при 30 °C в течение ночи. Кроме того, ночные культуры разводили в свежей среде Лурия-Бертани до конечной оптической плотности (OD600) ~ 0,4 с последующей инкубацией при 42 °C в течение 20 минут для индукции экспрессии слитых белков seqPgQC-´PhoA. Затем культуры инокулировали еще 2 ч при 30 °C. Наконец, оптическую плотность OD600 определяли с помощью спектрофотометра (BioRad) и 200 мкл культур собирали центрифугированием при 4 °C и 16000 g в течение 15 мин для определения активности PhoA.

dd) Очистка бактериальных QCs

Осадок клеток из 500 мл культуры ресуспендировали в 20 мл буфера, состоящего из 50 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl pH 8,0, 10 мкг/мл ДНКазы и коктейльной смеси ингибиторов протеазы (полные мини-таблетки, без ЭДТА, Roche). Клетки разрушали путем прохождения через пресс Френча (Thermo Scientific, Waltman, MA, USA) 3-4 раза. Клеточный дебрис удаляли центрифугированием при 4 °C и 30000 g в течение 30 мин. Супернатант разбавляли 1:2 уравновешивающим буфером и наносили на 5 мл колонку HisTrap (GE Healthcare). Колонку уравновешивали 50 мМ Трис-HCl, содержащей 150 мМ NaCl, pH 8,0. После промывки несколькими объемами колонки уравновешивающего буфера и по крайней мере 20 мМ белка имидазола элюировали с использованием многоступенчатых градиентов, достигая конечной концентрации 250 мМ имидазола, тогда как большая часть чистого белка уже была элюирована c приблизительно 100 мМ имидазолом. Все фракции, содержащие bacQC, объединяли, концентрировали с помощью Vivaspin 20 (Sartorius AG) и наносили на обессоливающую колонку HiPrep 26/10 (GE, Healthcare), которую уравновешивали 50 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl, pH 8,0. Очищенные белки анализировали с помощью SDS-PAGE, и содержание белка определяли путем абсорбции при 280 нм с использованием спектрофотометра NanoDrop 2000 (Thermo Scientifc) или по методам Брэдфорда или Гилла и фон Хиппеля (Bradford, MM 1976 Anal Biochem 72, 248- 254; Gill, SC и von Hippel, PH 1989 Anal Biochem 182, 319-326). Наконец, очищенные рекомбинантные слитые белки bacQC замораживали в жидком азоте и хранили при –80 °C или добавляли глицерин до конечной концентрации 50% и хранили при –20 °C. Его метку N-концевых слитых белков удаляли с использованием 1 единицы тромбина на 1 мг слитого белка (набор для захвата расщепления тромбина, Novagen) в присутствии 20 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl, 2,5 мМ CaCl₂ при pH 8,0 с последующей инкубацией в течение 16 часов при 4 °C. Тромбин удаляли путем связывания со стептавидиновой агарозой (набор для захвата расщепления тромбина, Novagen), а белки bacQC без His Tag белков выделяли центрифугированием. После дополнительной стадии обессоливания с использованием HiPrep (26/10) фракции bacQC объединяли и концентрировали с помощью Vivaspin 20 (Sartorius AG). Наконец, рекомбинантный bacQC в 50 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl, pH 8,0 подвергали шоковой заморозке в жидком азоте и хранили при –80 °C или добавляли глицерин до конечной концентрации 50% и хранили при –20 °C. PiQC экспрессировали и очищали так же, как PgQC. TfQC экспрессировали так же, как PgQC, и очищали с использованием колонки HiTrap Talon (GE, Healthcare).

Выводы: все предполагаемые бактериальные QC были экспрессированы в E. coli Rosetta(DE3)pLysS без сигнальной последовательности в виде N-концевых слитых белков His Tag и очищены до гомогенности с помощью аффинной хроматографии. 16-40 мг рекомбинантных чистых слитых белков His-Tag выделяли из приблизительно 500 мл индуцированных культур E. coli. Впоследствии His-Tag слитых белков была расщеплена тромбином с последующей ферментативной характеристикой этих предполагаемых бактериальных QCs.

II. Кристаллизация белка

а) Кристаллизация PgQC.

Кристаллы кристаллографического качества получали из PgQC, экспрессированного и очищенного, как описано выше. PgQC кристаллизовали при концентрации 90 мкМ (2,3 мг/мл) в течение 40 дней при 15 °C, используя метод диффузии паров «висячей» капли. В капле 1 мкл раствора белка смешивали с равным объемом буфера для кристаллизации, состоящего из 0,1 М HEPES pH 8,0, 3% (об./об.) PEG 400 и 2М (NH₄)₂SO₄. Для процесса кристаллизации каплю, содержащую белок, уравновешивали паром с 500 мкл кристаллизационного буфера, находящегося в резервуаре.

Перед рентген измерением кристаллы подвергали криозащите путем быстрого вымачивания в кристаллизационном буфере, содержащем 18% (об./об.) глицерина, а затем мгновенно замораживали при –180 °C. Собственные данные с дифрагирующего монокристалла были собраны с использованием детектора CCD (SATURN 944+, Rigaku Europe), установленного на медном источнике с вращающимся анодом (RA Micro 007, Rigaku Europe). Впоследствии собранные дифракционные данные были обработаны, масштабированы и объединены с помощью XDSGUI. Измеренные кристаллы PgQC относятся к тригональной пространственной группе P 3₁21 с постоянными ячейки a = 89.9 Å, b = 89.9 Å, c = 164.7 Å, α= 90°, β = 90°, γ = 120°. Они содержат две молекулы PgQC в асимметричной единице и дифрагируют до 2,8 Å.

Начальные фазы для структуры PgQC были получены путем молекулярного замещения с использованием программы PHASER MR из кристаллографического набора CCP4 и поисковой модели PgQC с PQ 50, в которой были выполнены некоторые циклы ручного восстановления с помощью программы COOT и уточнения с максимальным правдоподобием с помощью REFMAC5. Модель была уточнена до значения R_work 0,2428 и значения R_free 0,30404. Для получения окончательной модели PgQC достаточно повторения циклов ручной перестройки и уточнения.

б) Кристаллизация TfQC.

Кристаллы кристаллографического качества получали из TfQC, экспрессированного и очищенного, как описано выше. Белок мог быть кристаллизован при концентрации 9,91 мг/мл (279 мкМ) в течение 91 дня при 15 °C с использованием метода диффузии паров «сидячей» капли. Поэтому 200 нл белка смешивали с равным объемом кристаллизационного буфера, состоящего из 2M (NH₄)₂SO₄ и 0,1M ацетата натрия, pH 4,6, в капле, оставшейся в контакте посредством диффузии паров с резервуаром, содержащим 55 мкл кристаллизационного буфера.

Перед рентген измерением кристаллы подвергали криозащите путем быстрого вымачивания в кристаллизационном буфере, содержащем 25% (об./об.) этиленгликоля, и затем мгновенно замораживали при -180°C. Следующие данные с дифрагирующего монокристалла были собраны собственными силами с использованием детектора CCD (SATURN 944+, Rigaku Europe), установленного на медном источнике с вращающимся анодом (RA Micro 007, Rigaku Europe).

Полученные дифракционные данные обрабатывали, масштабировали и объединяли с помощью программы XDSGUI. Кристаллы TfQC относятся к триклинной пространственной группе P1 с постоянными ячеек a = 56,1 Å, b = 79,2 Å, c = 83,1 Å, α = 89,9°, β = 90°, γ = 71,9°. Они содержат четыре молекулы TfQC в асимметричной единице и дифрагируют до 2,1 Å.

Начальные фазы предполагаемой структуры TfQC были получены путем молекулярного замещения с использованием PHASER MR из кристаллографического пакета CCP4. Для этой стратегии решения должна быть сгенерирована подходящая модель поиска, поскольку в этот момент времени модели TfQC не существовало. Эта модель была приготовлена ​​из исходной модели PgQC с PQ 50 путем обрезания боковой цепи с использованием программы SCULPTOR из набора PHENIX. Окончательная модель TfQC была получена после повторения циклов ручной перестройки с использованием программы COOT и уточнения максимального правдоподобия с помощью PHENIX.REFINE. Он был уточнен до значения R_work 0,1938 и значения R_free 0,2404.

III. Флуорометрический анализ активности глутаминилциклазы

Активность QC оценивали с использованием H-Gln-AMC в качестве субстрата (как ранее описано в Schilling et al., 2002).

Анализ состоит из различных концентраций флуорогенного субстрата и 0,5 ед. Пироглутаминиламинопептидазы в 50 мМ Tris-HCl, 50 мМ NaCl при pH 8,0. Через 10 минут инкубации при 30°C реакцию инициировали добавлением bacQC к конечному объему 125 мкл реакционной смеси. Длина волны возбуждения/излучения составляла 380/460 нм. Активность bacQC определяли по стандартной кривой флуорофора AMC в условиях анализа. Все определения проводили в 96-луночных микротитрационных планшетах (Fisher Scientific) при 30°C с использованием FluoStar Optima (BMG Labtech). Кинетические данные оценивали с использованием программного обеспечения GraFit (версия 7, Erithacus software Ltd., Хорли, Великобритания).

На Фиг. 3 показаны графики Лайнуивера-Берка для циклизации H-Gln-AMC, катализируемой PgQC (A), PiQC (B) и TfQC (C). На вставке показан вторичный график полученных наклонов оценки Лайнуивера-Берка. Измерение активности bacQC проводили в 50 мМ Трис-HCl, pH 8,0 и 50 мМ Трис-HCl при 30°C. Кинетические данные оценивали с использованием программного обеспечения GraFit (версия 7, Erithacus software Ltd., Хорли, Великобритания). Были определены ферментативные параметры бактериального QC (таблица 4), которые отличаются от параметров hQC (Schilling, S., Manhart, S., Hoffmann, T., Ludwig, H.-H., Wasternack, C., and Demuth, H.-U. Biol. Chem. 2003, 384, 1583-1592).

Таблица 2. Кинетические параметры превращения H-Gln-AMC с помощью бактериального контроля качества. Определение кинетических параметров проводили в 50 мМ Трис-HCl pH 8 и 50 мМ NaCl при 30°C.

Фермент Km [мкМ] kcat [с^-1] kcat/Km [мМ^-1 с^-1] PgQC 510,94 ± 13,3 4,71 ± 0,22 9,24 ± 0,28 PiQC 645,33 ± 7,4 8,51 ± 0,37 13,18 ± 0,05 TfQC 1091,67 ± 34,36 4,49 ± 0,22 4,1 ± 0,14

Выводы. Очищенные рекомбинантные белки тестировали на ферментативную активность с помощью флуорометрического анализа с H-Gln-AMC в качестве субстрата. H-Gln-AMC в качестве субстрата был передан этими бактериальными белками, что привело к увеличению RFU и, следовательно, к увеличению скорости реакции (фиг. 3). Сродство к H-Gln AMC в качестве субстрата в случае PgQC и PiQC примерно в десять раз ниже, чем у hQC для этого субстрата. Значение K_m для TfQC на самом деле в 20 раз выше, чем значение K_m для hQC. Кроме того, эффективность бактериальных белков, по-видимому, аналогична эффективности hQC, при этом PiQC обладает в два раза большим числом оборота по сравнению с PgQC или TfQC.

IV. Анализ ингибитора активности бактериальной глутаминилциклазы

Для тестирования ингибитора состав образца был таким же, как описано выше, за исключением добавления предполагаемого ингибирующего соединения. Это привело к присутствию в реакционной смеси 1% или 2% (об./об.) диметисульфоксида (ДМСО). Константы ингибирования определяли с использованием различных концентраций H-Gln-AMC, варьирующихся от 1/4 K_m до 2 K_m. Конечная концентрация бактериального QC находилась в диапазоне от 25 нМ до 50 нМ. Константу ингибирования оценивали путем подгонки набора кривых процесса к общему уравнению конкурентного ингибирования с использованием программного обеспечения GraFit (версия 7, Erithacus software Ltd., Хорли, Великобритания).

На Фиг. 4 показаны типичные v/S характеристики, графики Лайнуивера-Берка и Иди-Хофсти для катализируемой PgQC циклизации H-Gln-AMC (A) в присутствии (●) 1 мкМ, () 0,5 мкМ, () 0,25 мкМ, (△) 0,125 мкМ и () 0,063 мкМ эталонного соединения MWT-S-00431 ((3,5-дихлорфенил-1,4,6,7-тетрагидро-5H-имидазо[4,5-c]пиридин-5-ил)метанон). (○) представляет реакцию без ингибитора. Определения проводили в 50 мМ Трис-HCl, 50 мМ NaCl pH 8,0 и 1% (об./oб.) ДМСО при 30°C. Были получены кинетические параметры, показанные в таблице 5.

Таблица 3. Кинетические параметры ингибирования превращения H-Gln-AMC под действием PgQC в присутствии эталонного соединения MWT-S-00431.

Параметр Значение Стандартная ошибка Vmax [мкМ мин-1] 4,41161 1,0569·10-1 Km [M] 6,45485·10-4 3,14087·10-5 Ki [M] 1,03698·10-7 3,31239·10-9

V. Ингибирование глутаминилциклазы соединениями

Следующие соединения были синтезированы, как описано в описании методов синтеза ниже. Средние значения K_i для ингибирования PgQC (выделенного и очищенного, как описано выше), TfQC, PiQC и hQC были измерены с использованием указанного выше анализа ингибитора и показаны. K_i обозначает средние значения K_i, измеренные, как описано выше, и Std(K_i) относится к стандартному отклонению K_i.

Таблица 4. Ингибирование PgQC, TfQC, PiQC и hQC ингибиторами bacQC.

Структура вещества Пример PgQC TfQC PiQC hQC № Ki [нM] Ki [нM] Ki [нM] Ki [нM] 1 1945 ± 318 8255 ± 361 9400 ± 325 8800 ± 127 2 149 ± 4 1400 ± 156 1945 ± 148 1280 ± 71 3 157 ± 6 нет данных нет данных нет данных 4 53 ± 1 нет данных нет данных 655 ± 27 5 106 ± 13 нет данных нет данных 769 ± 153 6 77 ± 2 нет данных нет данных 599 ± 40 7 83 ± 3 нет данных нет данных нет данных 8 185 ± 11 нет данных нет данных 1870 ± 78 9 442 ± 71 нет данных нет данных нет данных 10 395 ± 5 нет данных нет данных нет данных 11 139 ± 4 нет данных нет данных нет данных 12 44 ± 1 680 ± 45 728 ± 35 543 ± 20 13 133 ± 6 n.d. n.d. 556 ± 28 14 53 ± 2 358 ± 64 542 ± 44 431 ± 19 15 34 ± 2 нет данных нет данных нет данных 16 30 ± 2 317 ± 52 815 ± 4 1067 ± 203 17 14 ± 0.1 123 ± 16 349 ± 17 455 ± 14 18 86 ± 5 нет данных нет данных нет данных 19 15 ± 0.1 нет данных нет данных нет данных 20 42 ± 4 нет данных нет данных нет данных 21 19 ± 1 нет данных нет данных нет данных 22 30 ± 1 нет данных нет данных нет данных 23 65 ± 13 нет данных нет данных нет данных 24 67 ± 1 нет данных нет данных нет данных 25 38 ± 3 нет данных нет данных нет данных 26 33 ± 1 нет данных нет данных нет данных 27 60 ± 2 нет данных нет данных нет данных

Вывод: все соединения, согласно настоящему изобретению, проявляют ингибирующую активность против бактериальных глутамилциклаз. Приведенные выше результаты показывают, что соединения и/или фармацевтические композиции полезны для лечения пародонта и родственных заболеваний. В частности, соединения и/или фармацевтические композиции способны избирательно воздействовать на патогены, которые вызывают заболевания пародонта (P. gingivalis, T. forsythia и P. intermedia), и в то же время являются по существу инертными по отношению к гомологическому ферменту человека.

Кроме того, было обнаружено, что при этом остальная естественная биопленка должна быть в значительной степени сохранена. Еще более предпочтительно, чтобы соединения и/или фармацевтические композиции проявляли высокую активность in vivo против целевых патогенов.

Кроме того, было обнаружено, что, когда указанные патогены встроены в биопленку (например, сложную биопленку, природную биопленку или природную биопленку полости рта), оставшиеся бактерии в биопленке предпочтительно остаются практически незатронутыми соединениями в соответствии с настоящим изобретением (т.е. погибают или их рост подавляется в значительно меньшей степени).

Как видно из экспериментальных данных, приведенных выше, особенно высокая ингибирующая активность может быть достигнута, когда имидазо[4,5-b]пиридиновое ядро замещено в положении 6 (т.е. в соответствии с формулой I, как в примере 2), в отличие от замены в 5-положении (т.е. согласно Fromula II, как в Примере 1). Тем не менее, в обоих случаях наблюдается значительная ингибирующая активность bacQC и селективность в отношении PgQC по сравнению с человеческим ферментом hQC (таблица 7).

Таблица 5. Сравнение параметров ингибирования соединений из примеров 1 и 2

Целевой
белок Ki [мкМ] Относительная ингибирующая активность
[Ki(Пример 1)]/[Ki(Пример 2)] Пример 1 Пример 2 PgQC 1,95 0,15 13 PiQC 9,4 1,95 4,8 TfQC 8,3 1,4 5,9 hQC 8,8 1,28 6,9

Наконец, ввиду относительно высокой степени гомологии между PiQC и двумя другими bacQC (как показано на фиг. 1), соединения, идентифицированные как ингибиторы PgQC и/или TfQC с использованием способов по настоящему изобретению, также могут ожидаться, что они будут проявлять значительную активность PiQC (о чем свидетельствуют экспериментальные данные в таблице 6 выше).

VI. Определение активности seqQC-´PhoA

На фиг.5 показана активность PhoA в пермеабилизированных клетках E.coli CC118 pGP1-2, экспрессирующих слитые белки seqPgQC-`PhoA. PgQC с нативной предполагаемой сигнальной последовательностью был клонирован в pECD637 для создания слитого белка seqPgQC-`PhoA. Полученный переносчик трансформировали в штамм E. coli CC118 pGP1-2. Экспрессию гибридного белка инициировали инкубацией культуры при 42°C в течение 20 мин. Активность PhoA индуцированной культуры определяли, как описано ранее (Pribyl, T., Topologie des CzcCBA-Efflux-Komplexes aus Ralstonia Metallidurans CH34. Диссертация, 2001, Университет Мартина Лютера в Галле-Виттенберге). Черная заливка представляет активность PhoA клеток E. coli, экспрессирующих seqPgQC-`PhoA, полосатая заливка отображает активность PhoA клеток, экспрессирующих `BlaM-`PhoA, и служила в качестве положительного контроля, а клетки, экспрессирующие вектор без вставки, использовали в качестве отрицательного контроля (без заливки).

Активность PhoA определяли в культурах, выращенных, как описано выше, с использованием хромогенного субстрата п-нитрофенилфосфата (PNPP) (Pribyl, 2001). Поэтому 200 мкл клеточной суспензии с известным OD600 собирали при 13000 об/мин при 4°C в течение 10 минут. Осадок клеток промывали 0,5 мл 10 мМ Трис-HCl pH 8,0, 10 мМ MgSO₄ и 1 мМ йодацетамида. Полученный осадок клеток ресуспендировали в 1 мл 1М Трис-HCl pH 8,0, 0,1 мМ ZnCl₂ и 1 мМ йодацетамида. Затем к смеси добавляли 50 мкл 0,1% (мас./об.) додецилсульфат натрия (SDS) и 50 мкл хлороформа, после чего инкубировали в течение 5 минут при 37°C. Затем реакцию инициировали добавлением 100 мкл раствора субстрата (1М Трис-HCl pH 8,0, 0,4% (мас./об.) PNPP). Реакционную смесь дополнительно инкубировали при 37°C до тех пор, пока раствор не стал желтым. Затем реакцию останавливали добавлением 120 мкл 1М KH₂PO₄, 0,5 М ЭДТА, pH 8,0. Время, необходимое для развития желтой окраски, определяло специфическую ферментативную активность PhoA. Клеточный дебрис удаляли центрифугированием (13000 об/мин, 20 мин) и определяли оптическую плотность супернатанта при 420 нм. Активность PhoA определяли согласно закону Ламберта-Бера. Культуры E. coli CC118 pGP1-2, несущие пустой вектор pECD637, служили отрицательным контролем, тогда как E. coli CC118 pGP1-2 с pECD619 (Pribyl, 2001) служили положительным контролем. Эта плазмида кодирует короткую форму β-лактамазы (´blaM), включающую сигнальную последовательность ниже домена 'phoA.

Заключение: анализ in silico открытой рамки считывания PgQC выявил предполагаемую сигнальную последовательность. Это указывает на локализацию PgQC вне цитоплазмы P. gingivalis. С-концевые слияния PgQC, включающие «нативные» сигнальные последовательности, с щелочной фосфатазой (PhoA) были сконструированы для исследования «природы» локализации PgQC. Слияния со щелочными фосфатазами активны исключительно при локализации в периплазме. Экспрессия seqPgQC-`PhoA приводила к высокой активности фосфатазы 638,5 Ед/л ± 50,9 (фиг. 5). Это указывает на то, что PgQC локализован в периплазме.

VII. Описание синтетических методов

а) Синтез 5-замещенных имидазо[4,5-b]пиридинаминов

5-замещенные имидазо[4,5-b]пиридинамины получали общим способом, включающим: обработку 6-хлорпиридин-2,3-диамина триэтилортоформиатом при повышенной температуре с получением 5-хлоримидазо[4,5-b]пиридина (Стадия A1); с последующей реакцией перекрестного сочетания продукта со стадии A1 с соответствующим амином в присутствии подходящего Pd-катализатора и основания с получением соответствующего 5-замещенного имидазо[4,5-b]пиридинамина (Стадия A2).

Соединение Примера 1 получали описанным выше способом, как показано на следующей схеме 1.

Схема 1: Синтетическая схема получения Примера 1.

Пример 1: N-Бензилимидазо[4,5-b]пиридин-5-амин.

Стадия A1: 5-Хлоримидазо[4,5-b]пиридин

Раствор 6-хлорпиридин-2,3-диамина (718 мг, 5 ммоль) в метаноле (10 мл) и триэтилортоформиате (10 мл) нагревали с обратным холодильником в течение 3 часов. Летучие компоненты выпаривали и остаток очищали флэш-хроматографией на диоксиде кремния, используя градиент CHCl₃-MeOH. Выход: 540 мг (58%); ESI-MS масса/заряд 151,1 [M+H]⁺.

Стадия A2: N-бензилимидазо[4,5-b]пиридин-5-амин

5-Хлор[4,5-b]пиридин (207 мг, 1,1 ммоль, 1 экв.), DavePhos (10 мг, 0,0264 ммоль, 0,25 экв.) и Pd₂(dba)₃ (9 мг, 0,011 ммоль, 0,1 экв.) были растворены в сухом ТГФ (15 мл) в атмосфере аргона. Добавляли LiN(TMS)₂ (1M в ТГФ, 2,4 мл, 2,4 ммоль, 2,2 экв.) и бензиламин (144 мкл, 1,3 ммоль, 1,2 экв.) и смесь перемешивали при 65°C в течение 18 часов. После охлаждения до комнатной температуры смесь подкисляли с помощью водной HCl (5 н.) и перемешивание продолжали еще 10 мин. Реакционную смесь выливали в насыщенный водный NaHCO₃ и экстрагировали EtOAc (3×25 мл). Объединенные органические слои сушили над MgCO₃ и упаривали досуха. Остаток очищали полупрепаративной жидкостной колоночной хроматографией (ВЭЖХ). Выход: 90 мг (24%). МС масса/заряд: 225,2 [M+H]⁺; ВЭЖХ (градиент A): комнатная температура 8,93 мин, 100%; ¹H-ЯМР (ДМСО-d6) δ: 4,55 (s, 2H); 6,80 (d, 1H, ³J = 8,8 Гц); 7,22-7,27 (m, 1H); 7,30-7,37 (m, 4H); 7,83-7,91 (m, 2H); 9,08 (s, 1H).

б) Синтез 6-замещенных имидазо[4,5-b]пиридинаминов.

6-Замещенные имидазо[4,5-b]пиридинамины получали общим способом, включающим стадии: обработка 2-хлор-3,5-динитропиридина аммиаком в подходящем растворителе или смеси растворителей с получением 3,5-динитропиридина-2-амин (Стадия B1); обработку продукта, полученного на стадии B1, (NH₄)₂S с получением 5-нитропиридин-2,3-диамина (Стадия B2); обработку продукта, полученного на стадии B2, триэтилортоформиатом с получением 6-нитроимидазо[4,5-b]пиридина (Стадия B3); обработку продукта, полученного на стадии B3, подходящим восстанавливающим агентом для получения имидазо[4,5-b]пиридин-6-амина (стадия B4); с последующей обработкой продукта, полученного на стадии B4, соответствующим альдегидом в присутствии подходящего восстанавливающего агента, такого как NaBH₄, для получения соответствующего N-аликлимидазо[4,5-b]пиридин-6-амина (стадия B5).

Синтетический путь согласно вышеуказанному общему способу проиллюстрирован на схеме 2 ниже.

Схема 2: Синтетическая схема получения 6-замещенных имидазо[4,5-b]пиридинаминов

аа) Синтез имидазо[4,5-b]пиридин-6-амина

Стадия B1: 3,5-динитропиридин-2-амин

Раствор 2-хлор-3,5-динитропиридина (5 г, 24,6 ммоль, 1 экв.) в этаноле (150 мл) обрабатывали по каплям водным NH₃ (7 мл, 123 ммоль, 5 экв.) при 0°C. После завершения добавления смесь перемешивали при температуре окружающей среды в течение 1 часа. Твердый продукт собирали фильтрованием и сушили. Соединение использовали без дополнительной очистки. Выход: 4,17 г (92%).

Стадия B2: 5-нитропиридин-2,3-диамин

Раствор 3,5-динитропиридин-2-амина (3,9 г, 21,2 ммоль, 1 экв.) в метаноле (80 мл) обрабатывали 20% водным (NH₄)₂S (36,1 мл, 106 ммоль, 5 экв.) и нагревали до кипения с обратным холодильником 1 час. После охлаждения твердое вещество собирали фильтрацией и сушили. Продукт использовали без дополнительной очистки. Выход: 3,2 г (98%); ESI-MS масса/заряд: 155,0 [M+H]⁺; ВЭЖХ (градиент A): комнатная температура 4,08 мин, 100%; ¹H-ЯМР (ДМСО-d6) δ: 5,31 (br s, 2H), 6,98 (br s, 2H), 7,36 (d, 1H, ⁴J = 2,2 Гц), 8,28 (d, 1H, ⁴J = 2,6 Гц).

Стадия 3: 6-нитроимидазо[4,5-b]пиридин

Раствор 5-нитропиридин-2,3-диамина (2,7 г, 17,5 ммоль) в метаноле (14 мл) и триэтилортоформиате (14 мл) перемешивали при 150°C в микроволновой печи в течение 10 минут. Растворители выпаривали, а остаток использовали без дополнительной очистки. Выход: 2,64 г (92%); ESI-MS масса/заряд: 165,1 [M+H]⁺; ВЭЖХ (градиент A): комнатная температура 6,21 мин, 100%.

Стадия 4: Имидазо[4,5-b]пиридин-6-амин

Раствор 6-нитроимидазо[4,5-b]пиридина (1240 мг, 7,5 ммоль, 1 экв.) в водной соляной кислоте (10%) обрабатывали SnCl₂ (5076 мг, 22,5 ммоль, 3 экв.) и нагревали в микроволновой печи до 100°C в течение 30 минут. После охлаждения до комнатной температуры смесь подщелачивали с помощью водного NaOH (1М) и упаривали. Остаток суспендировали в МеОН и фильтровали. Фильтрат упаривали и остаток очищали флэш-хроматографией (диоксид кремния, градиент CHCl₃/MeOH с 0,5% NH₃). Выход: 993 мг (98%). ESI-MS масса/заряд: 135,2 [M+H]⁺; ВЭЖХ (градиент A): комнатная температура 1,47 мин, 100%.

bb) Общая процедура синтеза N-Аликлимидазо[4,5-b]пиридин-6-аминов

Стадия 5: N-Аликлимидазо[4,5-b]пиридин-6-амины

Имидазо[4,5-b]пиридин-6-амин (1 экв.) и соответствующий альдегид (1 экв.) растворяли в EtOH (5 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 4 часов. Добавляли NaBH₄ (1,5 экв.) и перемешивание продолжали в течение ночи. Реакцию гасили водой и экстрагировали EtOAc (3×20 мл). Объединенные органические слои промывали рассолом, сушили над Na₂SO₄ и упаривали. Остаток очищали флэш-хроматографией (диоксид кремния, градиент CHCl₃/MeOH).

Следующие ниже примеры 6-замещенных имидазо[4,5-b]пиридинаминов были получены с использованием описанных выше способов.

Пример 2: N-Бензилимидазо[4,5-b]пиридин-6-амин.

Соединение синтезировали, исходя из имидазо[4,5-b]пиридин-6-амина (50 мг, 0,4 ммоль) и бензальдегида (38 мкл, 0,4 ммоль), как описано выше. Выход: 30 мг (36%); МС масса/заряд: 225,2 [M+H]⁺; ВЭЖХ (градиент A): комнатная температура 8,45 мин, 100%; ¹H-ЯМР (ДМСО-d6) δ: 4,33 (s, 2H); 6,35 (br s, 1H); 6,93 (s, 1H); 7,21-7,26 (m, 1H); 7,31-7,36 (m, 2H); 7,39-7,43 (m, 2H); 7,94 (d, 1H, ⁴J = 2,6 Гц); 8,07 (s, 1H); 12,20 (br s, 1H).

Пример 3: N-(3,4,5-Трифторбензил)имидазо[4,5-b]пиридин-6-амин.

Соединение синтезировали, исходя из имидазо[4,5-b]пиридин-6-амина (67 мг, 0,5 ммоль) и 3,4,5-трифторбензальдегида (80 мг, 0,5 ммоль), как описано выше. Выход: 74 мг (53%). МС масса/заряд: 279,1 [M+H]⁺; ВЭЖХ (градиент A): комнатная температура 10,13 мин, 100%; ¹H-ЯМР (ДМСО-d6) δ: 4,34 (d, 2H, ³J = 5,7 Гц); 6,44 (br s, 1H); 6,94 (s, 1H); 7,31-7,39 (m, 2H); 7,92 (d, 1H, ⁴J = 2,6 Гц); 8,10 (s, 1H); 12,16 (br s, 1H).

Пример 4: N-(4-Хлорбензил)имидазо[4,5-b]пиридин-6-амин.

Соединение синтезировали, исходя из имидазо[4,5-b]пиридин-6-амина (50 мг, 0,4 ммоль) и 4-хлорбензальдегида (52 мг, 0,4 ммоль), как описано выше. Выход: 48 мг (50%); МС масса/заряд: 259,1 [M+H]⁺; ВЭЖХ (градиент A): комнатная температура 9,97 мин, 100%; ¹H-ЯМР (ДМСО-d6) δ: 4,33 (s, 2H); 6,39 (br s, 1H); 6,91 (s, 1H); 7,36-7,45 (m, 4H); 7,93 (d, 1H, ⁴J = 2,5 Гц); 8,08 (s, 1H); 12,22 (br s, 1H).

Пример 5: N-(3-Хлорбензил)имидазо[4,5-b]пиридин-6-амин.

Соединение синтезировали, исходя из имидазо[4,5-b]пиридин-6-амина (50 мг, 0,4 ммоль) и 3-хлорбензальдегида (42 мкл, 0,4 ммоль), как описано выше. Выход: 70 мг (73%); МС масса/заряд: 259,1 [M+H]⁺; ВЭЖХ (градиент A): комнатная температура 9,84 мин, 100%; ¹H-ЯМР (ДМСО-d6) δ: 4,36 (d, 2H, ³J = 5,9 Гц); 6,42 (s, 1H); 6,93 (s, 1H); 7,27-7,31 (m, 1H); 7,35-7,39 (m, 2H); 7,45-7,47 (m, 1H); 7,93 (d, 1H, ⁴J = 2,3 Гц); 8,08 (s, 1H); 12,09 (br s, 1H).

Пример 6: N-(3-Метоксибензил)имидазо[4,5-b]пиридин-6-амин.

Соединение синтезировали, исходя из имидазо[4,5-b]пиридин-6-амина (50 мг, 0,4 ммоль) и 3-метоксибензальдегида (46 мкл, 0,4 ммоль), как описано выше. Выход: 40 мг (42%). МС масса/заряд: 255,1 [M+H]⁺; ВЭЖХ (градиент A): комнатная температура 8,51 мин, 97%; ¹H-ЯМР (ДМСО-d6) δ: 3,73 (s, 3H); 4,28-4,32 (м, 2H); 6,34 (br s, 1H); 6,80 (dd, 1H, ³J = 8,1 Гц, ⁴J = 1,9 Гц); 6,92 (s, 1H); 6,96-7,00 (м, 2H); 7,22-7,27 (м, 1H); 7,93 (d, 1H, ⁴J = 2,5 Гц); 8,07 (s, 1H); 12,18 (br s, 1H).

Пример 7: N-(4-Метоксибензил)имидазо[4,5-b]пиридин-6-амин.

Соединение синтезировали, исходя из имидазо[4,5-b]пиридин-6-амина (50 мг, 0,4 ммоль) и 3-метоксибензальдегида (46 мкл, 0,4 ммоль), как описано выше. Выход: 25 мг (26%). МС масса/заряд: 255,1 [M+H]⁺; ВЭЖХ (градиент A): комнатная температура 8,43 мин, 97%; ¹H-ЯМР (ДМСО-d6) δ: 3,72 (s, 3H); 4,24 (s, 2H); 6,25 (br s, 1H); 6,85-6,97 (m, 3H); 7,29-7,35 (m, 2H); 7,92 (d, 1H, ⁴J = 2,4 Гц); 8,06 (s, 1H); 12,13 (br s, 1H).

Пример 8: N- (3-тиенилметил)имидазо[4,5-b]пиридин-6-амин.

Соединение синтезировали, исходя из имидазо[4,5-b]пиридин-6-амина (50 мг, 0,4 ммоль) и тиофен-3-карбальдегида (33 мкл, 0,4 ммоль), как описано выше. Выход: 60 мг (70%). МС масса/заряд: 231,2 [M+H]⁺; ВЭЖХ (градиент A): комнатная температура 7,63 мин, 100%; ¹H-ЯМР (ДМСО-d6) δ: 4,31 (s, 2H); 7,03 (d, 1H, ⁴J = 2,5 Гц); 7,13 (dd, 1H, ³J = 4,9 Гц, ⁴J = 1,1 Гц); 7,37-7,40 (m, 1H); 7,49 (dd, 1H, ³J = 4,9 Гц, ⁴J = 3,0 Гц); 7,96 (d, 1H, ⁴J = 2,5 Гц).

Пример 9: N-(3-(1-пиперидил)бензил)имидазо[4,5-b]пиридин-6-амин.

Соединение синтезировали, исходя из имидазо[4,5-b]пиридин-6-амина (50 мг, 0,4 ммоль) и 3-(1-пиперидил)бензальдегида (71 мг, 0,4 ммоль), как описано выше. Выход: 56 мг (49%). МС масса/заряд: 308,3 [M+H]⁺; ВЭЖХ (градиент A): rt (двойной пик) 5,17/5,49 мин, 100%; ¹H-ЯМР (ДМСО-d6) δ: 1,48-1,63 (m, 6H); 3,07-3,14 (m, 4H); 4,25 (s, 2H); 6,76-6,81 (m, 2H); 6,95 (d, ⁴J = 2,5 Гц); 6,99 (s, 1H); 7,14 (t, 1H, ³J = 7,8 Гц); 7,96 (d, 1H, ⁴J = 2,5 Гц); 8,15 (s, 1H).

Пример 10: N-(2-Пиридилметил)имидазо[4,5-b]пиридин-6-амин.

Соединение синтезировали, исходя из имидазо[4,5-b]пиридин-6-амина (50 мг, 0,4 ммоль) и пиридин-2-карбальдегида (35 мкл, 0,4 ммоль), как описано выше. Выход: 6 мг (7%). МС масса/заряд: 226,2 [M+H]⁺; ВЭЖХ (градиент B): комнатная температура 4,96 мин, 100%; ¹H-ЯМР (ДМСО-d6) δ: 4,43 (s, 2H); 6,97 (d, 1H, ⁴J = 2,5 Гц); 7,25-7,30 (m, 1H); 7,42 (d, 1H, ³J = 7,8 Гц); 7,72-7,78 (m, 1H); 8,01 (d, 1H, ⁴J = 2,5 Гц); 8,27 (s, 1H); 8,55 (d, 1H, ³J = 4,5 Гц).

Пример 11: N-(3-Пиридилметил)имидазо[4,5-b]пиридин-6-амин.

Соединение синтезировали, исходя из имидазо[4,5-b]пиридин-6-амина (50 мг, 0,4 ммоль) и пиридин-3-карбальдегида (35 мкл, 0,4 ммоль), как описано выше. Выход: 15 мг (18%). МС масса/заряд: 226,2 [M+H]⁺; ВЭЖХ (градиент B): комнатная температура 4,64 мин, 94%; ¹H-ЯМР (ДМСО-d6) δ: 4,38 (s, 2H); 7,01 (d, 1H, ⁴J = 2,5 Гц); 7,34-7,39 (m, 1H); 7,78-7,83 (m, 1H); 7,97 (d, 1H, ⁴J = 2,5 Гц); 8,21 (s, 1H); 8,46 (dd, 1H, ³J = 4,7 Гц, ⁴J = 1,4 Гц); 8,64 (d, 1H, ⁴J = 1,6 Гц).

Пример 12: N-(2,3-Дигидро-1,4-бензодиоксин-6-ил-метил)имидазо[4,5-b]пиридин-6-амин.

Соединение синтезировали, исходя из имидазо[4,5-b]пиридин-6-амина (50 мг, 0,4 ммоль) и 1,4-бензодиоксан-6-карбальдегида (61 мг, 0,4 ммоль), как описано выше. Выход: 21 мг (20%). МС масса/заряд: 283,2 [M+H]⁺; ВЭЖХ (градиент A): комнатная температура 8,59 мин, 96%; ¹H-ЯМР (ДМСО-d6) δ: 4,16-4,23 (m, 6H); 6,27 (br s, 1H); 6,77-6,94 (m, 4H); 7,91 (d, 1H, ⁴J = 2,5 Гц); 8,08 (s, 1H); 12,25 (br s, 1H).

Пример 13: N-(3,4-Диметоксибензил)имидазо[4,5-b]пиридин-6-амин.

Соединение синтезировали, исходя из имидазо[4,5-b]пиридин-6-амина (134 мг, 1 ммоль) и 3,4-диметоксибензальдегида (166 мг, 1 ммоль), как описано выше. Выход: 90 мг (32%); МС масса/заряд: 285,2 [M+H]⁺; ВЭЖХ (градиент A): комнатная температура 7,79 мин, 100%; ¹H-ЯМР (ДМСО-d6) δ: 3,70-3,76 (m, 6H); 4,24 (s, 2H); 6,24 (br s, 1H); 6,87-6,97 (m, 3H); 7.01-7.04 (m, 1H); 7,93 (d, 1H, ⁴J = 2,3 Гц); 8,07 (s, 1H); 12,16 (br s, 1H).

Пример 14: N-(3,4-Дихлорбензил)имидазо[4,5-b]пиридин-6-амин.

Соединение синтезировали, исходя из имидазо[4,5-b]пиридин-6-амина (50 мг, 0,4 ммоль) и 3,4-дихлорбензальдегида (65 мг, 0,4 ммоль), как описано выше. Выход: 75 мг (69%); МС масса/заряд: 293,1 [M+H]⁺; ВЭЖХ (градиент A): комнатная температура 11,09 мин, 100%; ¹H-ЯМР (ДМСО-d6) δ: 4,36 (s, 2H); 6,45 (br s, 1H); 6,94 (d, 1H, ⁴J = 1,6 Гц); 7,39 (dd, 1H, ³J = 8,3 Гц, ⁴J = 1,7 Гц); 7,59 (d, 1H, ³J = 8,3 Гц); 7,66 (d, 1H, ⁴J = 1,6 Гц); 7,93 (d, 1H, ⁴J = 2,5 Гц); 8,09 (s, 1H); 12,25 (br s, 1H).

Пример 15: N-(4-пропоксибензил)имидазо[4,5-b]пиридин-6-амин.

Соединение синтезировали, исходя из имидазо[4,5-b]пиридин-6-амина (134 мг, 1 ммоль) и 4-пропоксибензальдегида (158 мкл, 1 ммоль), как описано выше. Выход: 110 мг (39%); МС масса/заряд: 283,3 [M+H]⁺; ВЭЖХ (градиент A): комнатная температура 11,07 мин, 100%; ¹H-ЯМР (ДМСО-d6) δ: 0,96 (t, 3H, ³J = 7,4 Гц); 1,70 (sext, 2H, ³J = 7,0 Гц); 3,88 (t, 2H, ³J = 6,5 Гц); 4,24 (s, 2H); 6,84-6,97 (m, 3H); 7,27-7,34 (m, 2H); 7,93 (d, 1H, ⁴J = 1,4 Гц); 8,07 (s, 1H); 12,18 (br s, 1H).

Пример 16: N-(4- (2-аминоэтокси)бензил)имидазо[4,5-b]пиридин-6-амин.

Соединение синтезировали, исходя из имидазо[4,5-b]пиридин-6-амина (268 мг, 2 ммоль) и N-Boc-(4-(2-аминоэтокси)бензальдегида (531 мг, 2 ммоль), как описано выше с последующим удалением Boc-защиты с использованием тетрауксосная кислота/дихлорметан (TFA/DCM) (1:1,2 мл) и TIS (100 мкл), и очисткой полупрепаративной ВЭЖХ. Выход: 53 мг (9%); МС масса/заряд: 284,1 [M+H]⁺; ВЭЖХ (градиент A): комнатная температура 5,12 мин, 100%; ¹H-ЯМР (ДМСО-d6) δ: 3,18-3,25 (м, 2H); 4,13 (t, 2H, ³J = 5,0 Гц); 4,31 (s, 2H); 6,94-6,99 (m, 2H); 7,07 (d, 1H, ⁴J = 2,4 Гц); 7,33-7,38 (m, 2H); 7,91-8,01 (m, 3H); 8,09 (d, 1H, ⁴J = 2,4 Гц); 8,85 (s, 1H).

Пример 17: 1-(2-(4 -((Имидазо[4,5-b]пиридин-6-иламино)метил)фенокси)этил)гуанидин.

Раствор N-(4-(2-аминоэтокси)бензил)имидазо[4,5-b]пиридин-6-амина*TFA (41 мг, 0,08 ммоль, 1 экв.) В ДМФ обрабатывали N, N'- Бис(трет-бутоксикарбонил)-S-метилизотиомочевина (23 мг, 0,08 ммоль, 1 экв.), 4-диметиламинопиридин (DMAP) (1 мг, 0,008 ммоль, 0,1 экв.) и триэтиламин (TEA) (33 мкл, 0,24 ммоль, 3 экв.). Смесь перемешивали в течение 16 часов при комнатной температуре, гасили водой и экстрагировали EtOAc (3×20 мл). Объединенные органические слои сушили над MgCO₃ и упаривали. Снятие защиты с Boc осуществляли с помощью TFA/DCM (1: 1,2 мл) и TIS (100 мкл). Летучие компоненты упаривали, а остаток очищали полупрепаративной ВЭЖХ. Выход: 18 мг (41%); МС масса/заряд: 326,1 [M+H]⁺; ВЭЖХ (градиент A): комнатная температура 5,95 мин, 100%; ¹H-ЯМР (ДМСО-d6) δ: 4,04 (t, 2H, ³J = 5,3 Гц); 4,30 (s, 2H); 6,91-6,95 (m, 2H); 7,07 (d, 1H, ⁴J = 2,5 Гц); 7,32-7,36 (m, 2H); 7,64 (t, 1H, ³J = 5,8 Гц); 8,09 (d, 1H, ⁴J = 2,4 Гц); 8,86 (s, 1H).

Пример 18: N-[(4-Изопропоксифенил)метил]-3H-имидазо[4,5-b]пиридин-6-амин.

Соединение синтезировали, исходя из имидазо[4,5-b]пиридин-6-амина (67 мг, 0,5 ммоль) и 4-изопропоксибензальдегида (78 мкл, 0,5 ммоль), как описано выше. Выход: 6 мг (4%); МС масса/заряд: 283,2 [M+H]⁺; ВЭЖХ (градиент A): комнатная температура 10,69 мин, 89,7%; ¹H-ЯМР (ДМСО-d6) δ: 1,23 (d, 6H, ³J = 5,9 Гц), 4,20-4,24 (m, 2H), 4,50-4,60 (m, 1H), 6,83-6,89 (m, 3H), 7,26. -7,32 (m, 2H), 7,92 (br s, 1H), 8,05 (br s, 1H), 12,02 (br s, 1H)

Пример 19: N-[(3-Феноксифенил)метил]-3H-имидазо[4,5-b]пиридин-6-амин.

Соединение синтезировали, исходя из имидазо[4,5-b]пиридин-6-амина (50 мг, 0,4 ммоль) и 3-феноксибензальдегида (64 мкл, 0,4 ммоль), как описано выше. Выход: 19 мг (16%); МС масса/заряд: 317,3 [M+H]⁺; ВЭЖХ (градиент A): комнатная температура 12,13 мин, 100%; ¹H-ЯМР (ДМСО-d6) δ: 4,30-4,36 (m, 2H), 6,41 (br s, 1H), 6,80-6,97 (m, 4H), 7,02-7,20 (m, 3H), 7,28-7,36 (m, 3H), 7,82-8,16 (m, 2H), 12,03 (br s, 1H)

Пример 20: N-[(4-Бензилоксифенил)метил]-3H-имидазо[4,5-b]пиридин-6-амин.

Соединение синтезировали, исходя из имидазо[4,5-b]пиридин-6-амина (50 мг, 0,4 ммоль) и 3-бензилоксибензальдегида (79 мг, 0,4 ммоль), как описано выше. Выход: 47 мг (38%); МС масса/заряд: 331,2 [[M+H]⁺; ВЭЖХ (градиент A): комнатная температура 12,59 мин, 97,8%; ¹H-ЯМР (ДМСО-d6) δ: 4,22-4,26 (m, 2H), 5,06 (s, 2H), 6,24 (br s, 1H), 6,86-7,00 (m, 3H), 7,28-7,45 (m, 7H), 7,90-7,93 (m, 1H), 8,05 (s, 1H), 12,05 (br s, 1H)

Пример 21: N-[(4-Бифенил)метил]-3H-имидазо[4,5-b]пиридин-6-амин.

Соединение синтезировали, исходя из имидазо[4,5-b]пиридин-6-амина (50 мг, 0,4 ммоль) и 4-бифенилкарбоксальдегида (68 мг, 0,4 ммоль), как описано выше. Выход: 30 мг (27%); МС масса/заряд: 301,2 [M+H]⁺; ВЭЖХ (градиент A): комнатная температура 12,37 мин, 100%; ¹H-ЯМР (ДМСО-d6) δ: 4,37 (d, 2H, ³J = 5,4 Гц), 6,40 (br s, 1H), 6,94 (br s, 1H), 7,31-7,37 (m, 1H), 7,41-7,51 (m, 4H), 7,60-7,67 (m, 4H), 7,95 (s, 1H), 8,06 (s, 1H), 12,04 (br s, 1H)

Пример 22: N-[(2,6-Дифтор-4-метоксифенил)метил]-3H-имидазо[4,5-b]пиридин-6-амин.

Соединение синтезировали, исходя из имидазо[4,5-b]пиридин-6-амина (67 мг, 0,5 ммоль) и 2,6-дифтор-4-метоксибензальдегида (86 мг, 0,4 ммоль), как описано выше. Выход: 77 мг (53%). МС масса/заряд: 291,2 [M+H]⁺; ВЭЖХ (градиент A): комнатная температура 9,60 мин, 100%; ¹H-ЯМР (ДМСО-d6) δ: 3,76 (s, 3H), 4,22 (d, 2H, ³J = 5,9 Гц), 5,97 (br s, 1H), 6,71-6,79 (m, 2H), 7,10 (br s, 1H), 7,92 (s, 1H), 8,09 (s, 1H), 12,16 (br s, 1H)

Пример 23: N-[(7-Метокси-1,3-бензодиоксол-5-ил)метил]-3H-имидазо[4,5-b]пиридин-6-амин

Соединение синтезировали, исходя из имидазо[4,5-b]пиридин-6-амина (60 мг, 0,45 ммоль) и 5-метоксипиперонала (81 мг, 0,45 ммоль), как описано выше. Выход: 44 мг (33%); МС масса/заряд: 299,2 [M+H]⁺; ВЭЖХ (градиент A): комнатная температура 8,91 мин, 100%; ¹H-ЯМР (ДМСО-d6) δ: 3,80 (s, 3H), 4,21 (s, 2H), 5,93 (s, 2H), 6,27 (br s, 1H), 6,63 (s, 1H), 6,72 (s, 1H), 6,94 (s, 1H), 7,91 (s, 1H), 8,07 (s, 1H), 12,23 (s, 1H)

Пример 24: N-[(2,2-Дифтор-1,3-бензодиоксол-5-ил)метил]-3H-имидазо[4,5-b]пиридин-6-амин

Соединение синтезировали, исходя из имидазо[4,5-b]пиридин-6-амина (67 мг, 0,5 ммоль) и 2,2-дифтор-1,3-бензодиоксол-5-карбоксальдегида (93 мг, 0,5 ммоль) как описано выше. Выход: 60 мг (40%); МС масса/заряд: 305,3 [M+H]⁺; ВЭЖХ (градиент A): комнатная температура 11,07 мин, 100%; ¹H-ЯМР (ДМСО-d6) δ: 4,34 (d, 2H, 3J = 6,4 Гц), 6,45/6,26 (br s, 1H, ротамер), 6,85/7,08 (br s, 1H, ротамер), 7,22-7,31 (m, 1H), 7,33-7,38 (m, 1H), 7,43 (s, 1H), 7,85-8,15 (m, 2H), 12,02/12,59 (br s, 1H)

Пример 25: N-[[4-(2-Пиридил)фенил]метил]-3H-имидазо[4,5-b]пиридин-6-амин.

Соединение синтезировали, исходя из имидазо[4,5-b]пиридин-6-амина (67 мг, 0,5 ммоль) и 4-(2-пиридил)бензальдегида (92 мг, 0,5 ммоль) как описано выше. Выход: 25 мг (17%); МС масса/заряд: 302,4 [M+H]⁺; ВЭЖХ (градиент A): комнатная температура 6,00 мин, 100%; ¹H-ЯМР (ДМСО-d6) δ: 4,39 (d, 2H, ³J = 5,9 Гц), 6,45 (br s, 1H), 7,29-7,35 (m, 1H), 7,51 (d, 2H, ³J = 8,3 Гц), 7,82-7,88 (m, 1H), 7,91-7,98 (m, 2H), 8,02-8,09 (m, 3H), 8,64 (d, 2H, ³J = 4,9 Гц), 12,02 (br s, 1H)

Пример 26: N-[[4-(2-морфолиноэтокси)фенил]метил]-3H-имидазо[4,5-b]пиридин-6-амин.

Соединение синтезировали, исходя из имидазо[4,5-b]пиридин-6-амина (67 мг, 0,5 ммоль) и 4-(2-морфолиноэтокси)бензальдегида (118 мг, 0,5 ммоль), как описано выше. Выход: 21 мг (12%); МС масса/заряд: 177,6 [M+2H]²⁺, 354,4 [M+H]⁺; ВЭЖХ (градиент A): комнатная температура 5,76 мин, 100%; ¹H-ЯМР (MeOH-d4) δ: 2,55-2,61 (m, 4H), 2,78 (t, 2H, ³J = 5,4 Гц), 3,67-3,72 (m, 4H), 4,11 (t, 2H, ³J = 5,4 Гц), 4,30 (s, 2H), 6,87-6,93 (m, 2H), 7,02 (s, 1H), 7,29-7,35 (m, 2H), 7,94 (s, 1H), 8,05 (s, 1H)

Пример 27: N-[(4-морфолинофенил)метил]-3H-имидазо[4,5-b]пиридин-6-амин.

Соединение синтезировали, исходя из имидазо[4,5-b]пиридин-6-амина (67 мг, 0,5 ммоль) и 4-(4-морфолинил)бензальдегида (96 мг, 0,5 ммоль), как описано выше. Выход: 42 мг (26%); МС масса/заряд: 310,4 [M+H]⁺; ВЭЖХ (градиент A): комнатная температура 6,91 мин, 93,9%; ¹H-ЯМР (MeOH-d4) δ: 3,07-3,11 (m, 4H), 3,79-3,82 (m, 4H), 4,29 (s, 2H), 6,91-6,96 (м, 2H), 7,01 (br s, 1H), 7,27-7,32 (m, 2H), 7,95 (br s, 1H), 8,04 (br s, 1H)

в) Общая процедура синтеза конъюгатов N-бензилимидазо[4,5-b]пиридин-6-амин-порфирин.

Стадия C1:

Имидазо[4,5-b]пиридин-6-амин (1 экв.) растворяли в MeOH или EtOH (c=0,05–0,08M). Добавляли соответствующий альдегид и смесь перемешивали при комнатной температуре до тех пор, пока тонкослойная хроматография (ТСХ) не показывала полный оборот исходных материалов. Осторожно добавляли NaBH₄ (1,5 экв.) (В случае R^a/b = 1H) или NaBD₄ (1,7 экв.) (В случае R^a/b = D), и перемешивание продолжали в течение ночи. Летучие компоненты упаривали и остаток очищали флэш-хроматографией (Al₂O₃, градиент CHCl₃/MeOH).

Очищенный продукт растворяли в MeOH (c=0,06–0,12M) и обрабатывали свежеприготовленной 1M HCl в MeOH (16 экв.). После перемешивания при комнатной температуре в течение 3 ч летучие вещества выпаривали, а остаток использовали без дополнительной очистки.

Схема 3: Примерная синтетическая схема синтеза конъюгатов N-бензилимидазо[4,5-b]пиридин-6-амин-порфирин

Стадия C2:

N-[[4-(2-аминоэтокси)фенил]-метил]-1H-имидазо[4,5-b]пиридин-6-амин или N-[[4-(2-аминоэтокси)фенил]дидейтериометил]-1H-имидазо[4,5-b]пиридин-6-амин (1 экв.), полученный на стадии C1, растворяли в диметилформамиде (c = 0,1–0,13 M). Добавляли Fmoc-Lys (Boc)-OH (1,2 экв.), TBTU (1,2 экв.) И DIPEA (4 экв.), и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4-5 часов. Добавляли воду и экстрагировали EtOAc (3×100 мл). Объединенные органические слои сушили над Na₂SO₄ и упаривали. Остаток очищали флэш-хроматографией (градиент Al₂O₃, CHCl₃/MeOH).

Стадия C3:

Соответствующий продукт, полученный на стадии C2 (1 экв.), растворяли в диметилформамиде (c=0,03 M), обрабатывали DBU (1 экв.) И перемешивали при комнатной температуре в течение 30-40 минут. Подходящий порфирин (1,2 экв.), HOBt (1,2 экв.), TBTU (1 экв.) И DIPEA (4 экв.) Растворяли в диметилформамиде, предварительно перемешивали в течение 50 минут при комнатной температуре и добавляли к раствору. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Реакцию осторожно гасили добавлением TFA/DCM (1: 1 об./об., 10 мл) и перемешивание продолжали в течение 45 минут. Летучие компоненты упаривали, и сырую смесь непосредственно подвергали полупрепаративной ВЭЖХ.

Пример 28: 3-[(1Z, 4Z, 9Z, 15Z)-18-[3-[[(1S)-5-амино-1-[2-[4-[(3H-имидазо[4,5-b]]пиридин-6-иламино)метил]фенокси]этилкарбамоил]пентил]амино]-3-оксопропил]-3,8,13,17-тетраметил- 21,23-дигидропорфирин-2-ил]пропановая кислота

Выход (последняя стадия): 15 мг (6%); МС масса/заряд: 453,1 [M+2H]²⁺; 904,8 [М+Н]⁺ ВЭЖХ (градиент A): комнатная температура 12,43 мин, 94%; ¹H-ЯМР (ДМСО-d6) δ: 0,96-1,53 (м, 8H), 2,40-2,48 (м, 3H), 3,02- 3,26 (м, 5H), 3,59-3,80 (м, 12H), 4,20-4,26 (м, 2H), 4,26-4,33 (м, 2H), 4,33-4,45 (м, 2H), 6,70 (d, 2H, J = 8,7 Гц), 7,04-7,08 (м, 1H), 7,17-7,24 (м, 2H), 7,42-7,51 (м, 3H), 7,87 (t, 1H, ³J = 5,4 Гц), 8,05-8,12 (м, 2H), 8,97 (br s, 1H), 9,34 (d, 1H, J = 24,0 Гц), 9,35 (s, 1H), 10,19 (d, 1H, J = 8,6 Гц), 10,32 (с, 1H), 10,33 (d, 2H, J = 9,8 Гц) 12,34 (br s, 1H).

Пример 29: 3 - [(4Z, 10Z, 15Z, 19Z) -18- [3 - [[(1S) -5-амино-1- [2- [4- [дидейтерио- (1H-имидазо [4,5 -b]пиридин-6-иламино)метил]фенокси]этилкарбамоил]пентил]амино]-3-оксопропил] -3,8,13, 17 -тетраметил-22,24-дигидропорфирин-2-ил]пропановая кислота

Выход (последняя стадия): 37 мг (26%); МС масса/заряд: 453,9 [M+2H]²⁺; 906,4 [М+Н]⁺ ВЭЖХ (градиент A): комнатная температура 12,45 мин,> 99%; ¹H-ЯМР (ДМСО-d6) δ: 0,96-1,53 (м, 6H), 2,40-2,48 (м, 2H), 3,02 -3,26 (м, 6H), 3,59-3,80 (м, 14H), 4,26-4,45 (м, 5H), 6,70 (d, 2H, J=8,4 Гц), 7,04-7,08 (м, 1H), 7,17-7,24 (м, 2H), 7,42-7,51 (м, 3H), 7,87 (м, 1H), 8,05-8,12 (м, 2H), 8,98 (br s, 1H), 9,34 (d, 1H, J = 23,7 Гц) , 9,35 (s, 1H), 10,28 (d, 1H, J = 8,4 Гц), 10,31 (s, 1H), 10,33 (d, 2H, J = 10,0 Гц).

с) Аналитические методы

ВЭЖХ: аналитическая система ВЭЖХ состояла из устройства Merck-Hitachi (модель LaChrom) с использованием LUNA RP 18 (5 мкм), аналитической колонки (длина: 125 мм, диаметр: 4 мм) и диодно-матричного детектора (DAD) с λ = 214 нм в качестве длины волны отчета. Соединения анализировали с использованием градиента при скорости потока 1 мл/мин; при этом элюент (A) представлял собой ацетонитрил, элюент (B) был водой, оба содержали 0,04% (об./об.) трифторуксусной кислоты с применением одного из следующих градиентов:

Градиент A: 0 мин - 5% (A), 15 мин - 60% (A), 20 мин - 95% (A), 30 мин - 95% (A), 31 мин - 5% (A), 35 мин - 5% (А)

Градиент B: 0 мин - 1% (A), 5 мин - 1% (A), 20 мин - 20% (A), 30 мин - 95% (A), 34 мин - 95% (A), 35 мин - 1% (A), 37 мин - 1% (A)

Чистота всех указанных соединений определялась процентом площади пика при 214 нм.

Масс-спектрометрия: ESI- и APCI-масс-спектры были получены с помощью спектрометра SCIEX API 1200 (Perkin Elmer) или экспресс-CMS (Advion).

ЯМР-спектроскопия. Спектры ЯМР 1H записывали на спектрометре Agilent DD2 400 МГц. Химические сдвиги выражаются в миллионных долях (ppm) в меньшем поле по сравнению с тетраметилсиланом. Паттерны расщепления были обозначены следующим образом: s (синглет), d (дублет), dd (дублет дублета), t (триплет), m (мультиплет) и br (широкий сигнал).

ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ

Кристаллы и сокристаллы в соответствии с настоящим изобретением представляют собой кристаллы терапевтических белков-мишеней (бактериальные глутамилциклазы, bacQC) и могут быть специально и существенно использованы для идентификации ингибиторов, способных избирательно воздействовать на патогены, вызывающие пародонтит, с использованием методов идентификации соединений-кандидатов, которые могут связываться со связывающим карманом bacQC, и/или являются ингибиторами bacQC, описанными в данном документе. Таким образом, кристаллы подходят для лечения определенного заболевания, например пародонтит, и, соответственно, подвержен промышленному применению.

Способы идентификации соединений-кандидатов, которые могут связываться со связывающим карманом bacQC и/или являются ингибиторами bacQC в соответствии с настоящим изобретением, промышленно применимы с учетом фармацевтического значения ферментов bacQC для возникновения пародонтита и их важности для роста пародонтальных патогенов продемонстрирован здесь.

Соединения согласно настоящему изобретению, включая соединения, идентифицированные методами идентификации соединений-кандидатов, которые могут связываться со связывающим карманом bacQC и/или являются ингибиторами bacQC, и фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению также могут быть использованы в промышленности, поскольку они могут быть использованы в способах лечения организма человека или животного, в частности, в способе терапии или профилактики бактериальной инфекции, например бактериальная инфекция, вызванная бактерией, выбранной из группы, состоящей из Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia и Tannerella forsythia, и/или в способе терапии или профилактики острого, хронического или рецидивирующего заболевания пародонта, например пародонтит.

Исследования, приведшие к этим результатам, были поддержаны Европейским Союзом.

Группа изобретений относится к органической химии и включает соединение формулы I, фармацевтическую композицию, его содержащую, и применение указанного соединения или фармацевтической композиции в терапии и/или профилактике бактериальной инфекции. В формуле I A выбран из группы, состоящей из необязательно замещенного арила, необязательно замещенного гетероциклила, необязательно замещенного циклоалкила и необязательно замещенного алкенила; R¹ независимо выбран из группы, состоящей из H и необязательно замещенного алкила; L это ; R^a и R^b одинаковы или отличаются друг от друга и независимо выбраны из группы, состоящей из H, галогена, необязательно замещенного алкила, необязательно замещенного арила, необязательно замещенного гетероалкила и необязательно замещенного гетероарила, и R^a и R^b необязательно могут быть соединены вместе с образованием карбоциклического или гетероциклического кольца; остальные значения заместителей являются такими, как определено в формуле изобретения. Технический результат - соединение формулы I, обладающее ингибирующей активностью в отношении бактериальных глутамилциклаз (bacQC). 4 н. и 8 з.п. ф-лы, 10 ил., 5 табл., 29 пр.

I

1. Соединение согласно следующей Формуле I,

где:

A выбран из группы, состоящей из необязательно замещенного арила, необязательно замещенного гетероциклила, необязательно замещенного циклоалкила и необязательно замещенного алкенила;

R¹ независимо выбран из группы, состоящей из H и необязательно замещенного алкила;

L это ;

R^a и R^b одинаковы или отличаются друг от друга и независимо выбраны из группы, состоящей из H, галогена, необязательно замещенного алкила, необязательно замещенного арила, необязательно замещенного гетероалкила и необязательно замещенного гетероарила, и где R^a и R^b необязательно могут быть соединены вместе с образованием карбоциклического или гетероциклического кольца;

где «необязательно замещенный» относится к необязательному замещению одной-тремя группами, независимо выбранными из: C_1-6алкила, C_1-6гетероалкила, C_1-6карбоциклила, C_1-5гетероциклила и C_1-5гетероарильной группы, каждая из которых может быть замещена одним-двумя атомами галогена и/или гидроксильными группами; атома галогена; цианогруппы; первичной, вторичной или третичной аминогруппы; гидроксильной группы и карбоксильной группы; или где A необязательно замещен по меньшей мере одним заместителем, представленным следующей структурой B:

где n = 1, 2, 3, 4, 5 или 6; и R⁷ и R⁸ независимо выбраны из алкила, арила, гетероалкила, гетероарила, карбамимидоила, формила, алкилацила и арилацила, каждый из которых необязательно может быть дополнительно замещен, и где R⁷ и R⁸ могут быть необязательно соединены вместе с образованием карбоциклического или гетероциклического кольца и/или R⁷ представлен следующей структурой E:

где М выбран из Fe²⁺ и Fe³⁺ или отсутствует;

R^c и R^d независимо выбраны из –H, –CH₃, –CH=CH₂, –SO₃H и –CH(OH)CH₂OH; и

X выбран из ковалентной связи, группы алкилена, аралкилена, гетероалкилена, карбоциклена, гетероциклена, гетероарилена, гетероаралкилена, аминоалкилена, алкиламино и карбонилалкиламино; где каждый из них может иметь до 12 атомов углерода и до 11 гетероатомов в основной цепи и может быть замещен одной или несколькими C_1-6алкильной группой(ами), C_1-6гетероалкильной группой(ами), C_1-6карбоциклильной группой(ами), C_1-5гетероциклильной группой(ами), C_1-5гетероарильной группой(ами), атомом(ами) галогена, гидроксильной группой(ами), цианогруппой(ами), первичной, вторичной или третичной аминогруппой(ами), карбоксильной группой(ами) и боковой цепью(ями), полученными из протеиногенных или непротеиногенных аминокислот;

указанный арил независимо представляет собой C_6-10арильную группу;

указанный гетероциклил независимо представляет собой моноциклическую или бициклическую C_1-11гетероциклическую группу, содержащую от 1 до 4 кольцевых гетероатомов, выбранных из N, S и O;

указанный алкил независимо представляет собой линейную или разветвленную, открытую C_1-6алкильную группу;

указанный циклоалкил независимо представляет собой циклическую C_3-6алкильную группу;

указанный алкенил независимо представляет собой линейную или разветвленную, открытую C_2-6 группу, каждая из которых содержит по меньшей мере одну связь C=C;

указанный гетероарил независимо представляет собой ароматическую моноциклическую или бициклическую С_1-11гетероциклическую группу, содержащую от 1 до 4 кольцевых гетероатомов, выбранных из N, S и О; и

указанный гетероалкил независимо представляет собой линейную или разветвленную, открытую C_1-5гетероалкильную группу, содержащую от 1 до 4 гетероатомов, выбранных из N, S и О, или в качестве альтернативы

A выбран из группы, состоящей из 2-метоксифенила, 3-метоксифенила, 4-пропоксифенила, 4-метоксифенила, 4-изопропоксифенила, 4-бензилоксифенила, 3,4-диметоксифенила, 2,3-дигидро-1,4-бензодиоксина-6-ила, 2,2-дифтор-1,3-бензодиоксол-5-ила, 7-метокси-1,3-бензодиоксол-5-ила, 2,6-дифтор-4-метоксифенила, 3-(1-пиперидил)фенила, 4-морфолинофенила, [1,1'-бифенил]-3-ила, [1,1'-бифенил]-4-ила, 3-феноксифенила, 4-феноксифенила, 2-хлорфенила, 3-хлорфенила, 4-хлорфенила, 3,4-дихлорфенила, 3,4,5-трифторфенила, 4-(2-пиридил)фенила, 4-(2-карбамимидамидоэтилокси)фенила, 4-(2-аминоэтокси)фенила, 4-(2-морфолиноэтокси)фенила, фенила, 2-пиридила, 3-пиридила, 4-пиридила, 2-тиенила и 3-тиенила.

2. Соединение по п. 1, которое представлено следующей Формулой Ia:

где A выбран из необязательно замещенного арила и необязательно замещенного гетероарила; и

R¹, R^a и R^b - это H.

3. Соединение по любому из пп. 1, 2, где R^a и R^b независимо выбраны из ¹H и D.

4. Соединение по любому из пп. 1-3, отличающееся тем, что A замещен по меньшей мере одним заместителем, представленным следующей структурой B:

где n = 1, 2, 3, 4, 5 или 6; и

R⁷ и R⁸ независимо выбраны из алкила, арила, гетероалкила, гетероарила, карбамимидоила, формила, алкилацила и арилацила, каждый из которых необязательно может быть дополнительно замещен, и где R⁷ и R⁸ могут быть необязательно соединены вместе с образованием карбоциклического или гетероциклического кольца.

5. Соединение по п. 4, отличающееся тем, что R⁷ представлен следующей структурой E:

где М выбран из Fe²⁺ и Fe³⁺ или отсутствует;

R^c и R^d независимо выбраны из –H, –CH₃, –CH=CH₂, –SO₃H и –CH(OH)CH₂OH; и

X выбран из ковалентной связи, группы алкилена, аралкилена, гетероалкилена, карбоциклена, гетероциклена, гетероарилена, гетероаралкилена, аминоалкилена, алкиламино и карбонилалкиламино; где каждый из них может иметь до 12 атомов углерода и до 11 гетероатомов в основной цепи и может быть замещен одной или несколькими C_1-6алкильной группой(ами), C_1-6гетероалкильной группой(ами), C_1-6карбоциклильной группой(ами), C_1-5гетероциклильной группой(ами), C_1-5гетероарильной группой(ами), атомом(ами) галогена, гидроксильной группой(ами), цианогруппой(ами), первичной, вторичной или третичной аминогруппой(ами), карбоксильной группой(ами) и боковой цепью(ями), полученными из протеиногенных или непротеиногенных аминокислот.

6. Соединение по п. 5, где X представлен следующей структурой:

где m = 0, 1, 2 или 3, и

R^e представляет собой боковую цепь, полученную из протеиногенной аминокислоты.

7. Соединение по любому из пп. 1-6, отличающееся тем, что A замещен заместителем, представленным следующей структурой F:

где М выбран из Fe²⁺ и Fe³⁺ или отсутствует; и

R^c и R^d независимо выбраны из –H, –CH₃, –CH=CH₂, –SO₃H и –CH(OH)CH₂OH.

8. Соединение по п. 1, выбранное из группы, состоящей из:

9. Фармацевтическая композиция, обладающая ингибирующей активностью в отношении бактериальных глутаминилциклаз (bacQC), содержащая эффективное количество соединения по одному из пп. 1-8 и фармацевтически приемлемый носитель.

10. Применение соединения по любому из пп. 1-8 или фармацевтической композиции по п. 9 в терапии и/или профилактике бактериальной инфекции, где:

(i) бактериальная инфекция вызвана бактерией, которая экспрессирует бактериальную глутамилциклазу (bacQC), причем bacQC представляет собой полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, или аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичность последовательности с любой из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3; и/или

(ii) бактериальная инфекция вызвана бактерией, выбранной из группы, состоящей из Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia и Tannerella forsythia; и/или

(iii) соединение избирательно подавляет рост бактерии в биопленке.

11. Применение соединения по любому из пп. 1-8 или фармацевтической композиции по п. 9 в терапии или профилактике острого, хронического или рецидивирующего заболевания пародонта.

12. Применение по п. 11, отличающееся тем, что заболевание выбрано из группы, состоящей из заболеваний десен, вызванных зубным налетом, хронического периодонтита, агрессивного пародонтита, пародонтита как проявления системного заболевания, некротических заболеваний пародонта, абсцессы пародонта, пародонтит, связанный с эндодонтическими поражениями, периимплантный мукозит, периимплантит и эндодонтические инфекции.