Область изобретения

Настоящее изобретение относится к композиции для культивирования естественных клеток-киллеров и способу получения естественных клеток-киллеров с использованием вышеупомянутого.

Предшествующий уровень техники

Разные виды лечения, такие как хирургическое вмешательство, лучевая терапия и химиотерапия, разработаны для лечения рака, но поскольку сообщается о нескольких побочных эффектах, недавно разработана иммунотерапия с использованием иммунной функции пациента. В частности, исследовали иммунотерапию с использованием естественных клеток-киллеров, которые могут подвергаться крупномасштабному производству и замораживанию.

В частности, естественные клетки-киллеры представляют собой тип лимфоцитов, которые распространены в костном мозге, селезенке, периферических лимфоузлах и периферической крови организма. Они составляют примерно 10% лимфоцитов периферической крови и играют важную роль во врожденном иммунном ответе (Ann Rev Immunol., 24: 257-286, 2006)). Корме того, естественные клетки-киллеры являются позитивными в отношении CD56 и CD16, но негативными в отношении CD3. Естественные клетки-киллеры уничтожают клетки посредством высвобождения цитолазматических гранул, содержащих перфорин и гранзим. Естественные клетки-киллеры секретируют разные цитокины, такие как IFN-γ (от англ. Interferon gamma - интерферон гамма), TNF-α (от англ. tumor necrosis factor - фактор некроза опухоли), GM-CSF (от англ. Granulocyte-macrophage colony- stimulating factor - гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор) и IL-10 (от англ. Interleukin 10 - интерлейкин 10).

Кроме того, естественные клетки-киллеры экспрессируют несколько рецепторов на клеточной поверхности, и данные рецепторы задействованы в адгезии клеток, активации способности уничтожать клетки или ингибировании способности уничтожать клетки. Однако, наибольшая часть естественных клеток-киллеров в организме нормального субъекта существует в неактивном состоянии. Таким образом, существует необходимость в активированных естественных клетках-киллерах для устранения рака. Кроме того, в случае естественных клеток-киллеров, находящихся в организме пациента с раком, естественные клетки-киллеры имеют функциональные дефекты из-за механизма уклонения раковых клеток от иммунного надзора. Таким образом, очень важно активировать естественные клетки-киллеры для использования естественных клеток-киллеров в качестве терапевтического средства. Кроме того, крайне важно разработать методику масштабной пролиферации и заморозки естественных клеток-киллеров в крови от нормального субъекта или пациента, поскольку число естественных клеток-киллеров, присутствующих в организме, ограничено.

Тем не менее, IL-2, также называемые факторами роста Т-клеток (TCGF - от англ. T-cell growth factor), представляет собой глобулярный гликопротеин, который играет центральную роль в продукции, выживаемости и гомеостазе лимфоцита. IL-2 имеет размер 15,5 кДа - 16 кДа белка и состоит из 133 аминокислот.IL-2 опосредует разные иммунные ответы посредством связывания с рецептором IL-2, который имеет три отличающихся субъединицы.

Корме того, CD80 известен как В7-1 и один из членов семейства В7 среди белков, связанных с мембраной, участвующих в иммунной регуляции посредством связывания с лигандом и, таким образом, передачи костимулирующих ответов и коингибируюших ответов. CD80 представляет собой трансмембранный белок, экспрессируемый на поверхности Т-клеток, В-клеток, дендритных клеток и моноцитов. Известно, что CD80 связывается с CD28, CTLA4 (CD152) и PD-L1.

Таким образом, широко известно, что естественные клетки-киллеры важны для противоракового лечения, но конкретных способов, которые могли бы расширить эффективное использование естественных клеток-киллеров, все еще не достаточно.

Подробное описание изобретения Техническая проблема

Соответственно, авторы настоящего изобретения получили естественные клетки-киллеры посредством использования димера слитого белка, содержащего белок IL-2 и белок CD80, в результате исследования для получения активированных естественных клеток-киллеров в большом количестве. Кроме того, авторы настоящего изобретения идентифицировали, что естественные клетки-киллеры, полученные таким образом, обладают повышенной активностью и демонстрируют превосходное противораковое действие и, таким образом, завершили настоящее изобретение.

Решение проблемы

Для достижения указанной ваше цели, в соответствии с иллюстративным воплощением, предложена композиция для культивирования естественных клеток-киллеров, включающая, в качестве активного ингредиента, димер слитого белка, содержащий IL-2 или его вариант и CD80 или его фрагмент.

Согласно еще одному иллюстративному воплощению предложен способ культивирования естественных клеток-киллеров, включающий: i) выделение клеток, которые не экспрессируют CD3, из мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС); ii) выделение клеток, которые экспрессируют CD56, от клеток, которые не экспрессируют CD3, выделенных на указанной выше стадии; и iii) культивирование выделенных клеток в присутствии димера слитого белка, содержащего IL-2 или его вариант и CD80 или его фрагмент.

Согласно еще одному иллюстративному воплощению предложены естественные клетки-киллеры, полученные способом культивирования естественных клеток-киллеров.

Согласно еще одному иллюстративному воплощению предложена фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения рака, включающая естественные клетки-киллеры в качестве активного ингредиента.

Согласно еще одному иллюстративному воплощению предложен способ культивирования естественных клеток-киллеров, включающий: i) выделение клеток, которые не экспрессируют CD3, из РВМС; и ii) культивирование выделенных клеток в присутствии димера слитого белка, содержащего IL-2 или его вариант и CD80 или его фрагмент.

Согласно еще одному иллюстративному воплощению предложены естественные клетки-киллеры, полученные способом культивирования естественных клеток-киллеров.

Согласно еще одному иллюстративному воплощению предложена фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения рака, включающая естественные клетки-киллеры в качестве активного ингредиента.

Согласно еще одному иллюстративному воплощению предложен способ культивирования естественных клеток-киллеров, включающий: i) выделение клеток, которые экспрессируют CD56, из РВМС; и ii) культивирование выделенных клеток в присутствии димера слитого белка, содержащего IL-2 или его вариант и CD80 или его фрагмент.

Согласно еще одному иллюстративному воплощению предложены естественные клетки-киллеры, полученные способом культивирования естественных клеток-киллеров.

Согласно еще одному иллюстративному воплощению предложена фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения рака, включающая естественные клетки-киллеры в качестве активного ингредиента.

Согласно еще одному иллюстративному воплощению предложен способ стимуляции активности естественных клеток-киллеров в РВМС, включающий культивирование РВМС в присутствии димера слитого белка, содержащего IL-2 или его вариант и CD80 или его фрагмент.

Согласно еще одному иллюстративному воплощению предложены РВМС, полученные способом стимуляции активности естественных клеток-киллеров в РВМС.

Согласно еще одному иллюстративному воплощению предложена фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения рака, включающая РВМС в качестве активного ингредиента.

Эффект изобретения

Композиция по настоящему изобретению для культивирования естественных клеток-киллеров, включающая в качестве активного ингредиента слитый белок, содержащий IL-2 или его вариант и CD80 или его фрагмент, стимулирует пролиферацию естественных клеток - киллеров, индуцирует экспрессию CD16 и NKp46 и повышает уровень экспрессии и секреции гранзима В и перфорина, и, таким образом, может с пользой использоваться в получении естественных клеток-киллеров, обладающих превосходной противораковой иммунной функцией.

Краткое описание графических материалов

Иллюстративные воплощения могут быть более подробно поняты на основе следующего описания, вместе с прилагаемыми графическими материалами, в которых:

Фиг. 1А представляет собой схематическое изображение димера слитого белка, используемого в настоящем изобретении;

На Фиг. 1В показано изображение SDS-PAGE (от англ. sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis - электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия), подтверждающее полученный димер слитого белка (GI-101);

На Фиг. 1С показано содержание димера слитого белка (GI-101) согласно поглощению;

На Фиг. 1D показан результат анализа полученного димера слитого белка (GI-101) на основе эксклюзионной хроматографии (SEC - от англ. size exclusion chromatography);

На Фиг. 2А показаны изображения SDS-PAGE, подтверждающие полученный димер слитого белка hCD80-Fc;

На Фиг. 2В показаны результаты анализа на основе эксклюзионной хроматографии (SEC) полученного димера слитого белка hCD80-Fc;

На Фиг. 3А показано изображение SDS-PAGE, подтверждающие полученный димер слитого белка Fc-IL2v2;

На Фиг. 3В показаны результаты анализа на основе эксклюзионной хроматографии (SEC) полученного димера слитого белка Fc-IL2v2;

На Фиг. 3С показаны изображения SDS-PAGE, подтверждающие полученный димер слитого белка Fc-IL2wt;

На Фиг. 3D показаны результаты анализа на основе эксклюзионной хроматографии (SEC) полученного димера слитого белка Fc-IL2wt;

На Фиг. 4А показано изображение SDS-PAGE, подтверждающее полученный димер слитого белка hCD80-Fc-IL2wt;

На Фиг. 4В показаны результаты анализа на основе эксклюзионной хроматографии (SEC) полученного димера слитого белка hCD80-Fc-IL2wt;

На Фиг. 5А и 5В показано число NK-клеток при культивировании в условиях AIM-V (5% SR);

На Фиг. 6А и 6В показана жизнеспособность NK-клеток при культивировании в условиях AIM-V (5% SR);

На Фиг. 7А и 7В показано число NK-клеток при культивировании в условиях AIM-V (5% hABS);

На Фиг. 8А и 8В показана жизнеспособность NK-клеток при культивировании в условиях AIM-V (5% hABS);

На Фиг. 9А и 9В показано число NK-клеток при культивировании в условиях X-VIVO (5% hABS);

На Фиг. 10А и 10В показана жизнеспособность NK-клеток при культивировании в условиях X-VIVO (5% hABS);

На Фиг. 11А и 11В показано число NK-клеток при культивировании в условиях NK MACS (5% hABS);

На Фиг. 12А и 12В показана жизнеспособность NK-клеток при культивировании в условиях NK MACS (5% hABS);

На Фиг. 13 показан результат анализа FACS (от англ. fluorescence-activated cell sorting - сортировка клеток с активированной флуоресценцией), подтверждающий чистоту естественных клеток-киллеров, культивируемых в композиции, содержащей среду AIM-V (5% SR);

На Фиг. 14 показан результат FACS-анализа, подтверждающий чистоту естественных клеток-киллеров, культивируемых в композиции, содержащей среду AIM-V (5% hABS);

На Фиг. 15 показан результат FACS-анализа, подтверждающий чистоту естественных клеток-киллеров, культивируемых в композиции, содержащей среду X-VIVO15 (5% hABS);

На Фиг. 16 показан результат FACS-анализа, подтверждающий чистоту естественных клеток-киллеров, культивируемых в композиции, содержащей среду NK MACS (5% hABS);

На Фиг. 17 показан результат анализа маркеров активации естественных клеток-киллеров, культивируемых в композиции, содержащей среду AIM-V (5% SR);

На Фиг. 18 показан результат анализа маркеров ингибирования естественных клеток-киллеров, культивируемых в композиции, содержащей среду AIM-V (5% SR);

На Фиг. 19 показан результат анализа маркеров активации естественных клеток-киллеров, культивируемых в композиции, содержащей среду AIM-V (5% hABS);

На Фиг. 20 показан результат анализа маркеров ингибирования естественных клеток-киллеров, культивируемых в композиции, содержащей среду AIM-V (5% hABS);

На Фиг. 21 показан результат анализа маркеров активации естественных клеток-киллеров, культивируемых в композиции, содержащей среду Х-VIVO (5% hABS);

На Фиг. 22 показан результат анализа маркеров ингибирования естественных клеток-киллеров, культивируемых в композиции, содержащей среду X-VIVO (5% hABS);

На Фиг. 23 показан результат анализа маркеров активации естественных клеток-киллеров, культивируемых в композиции, содержащей среду NK MACS (5% hABS);

На Фиг. 24 показан результат анализа маркеров ингибирования естественных клеток-киллеров, культивируемых в композиции, содержащей среду NK MACS (5% hABS);

На Фиг. 25 показан результат анализа маркеров цитотоксичности естественных клеток-киллеров, культивируемых в композиции, содержащей среду AIM-V (5% SR);

На Фиг. 26 показан результат анализа маркеров цитотоксичности естественных клеток-киллеров, культивируемых в композиции, содержащей среду AIM-V (5% hABS);

На Фиг. 27 показан результат анализа маркеров цитотоксичности естественных клеток-киллеров, культивируемых в композиции, содержащей среду X-VIVO15 (5% hABS);

На Фиг. 28 показан результат анализа маркеров цитотоксичности естественных клеток-киллеров, культивируемых в композиции, содержащей среду NK MACS (5% hABS);

На Фиг. 29 показан результат анализа способности к дегрануляции естественных клеток-киллеров, культивируемых в течение 21 суток в композиции, содержащей GI-101 (50 нМ), GI-101_wt (50 нМ), CD80-FC (50 hM)+Fc-IL2v2 (50 нМ) или CD80-Fc (50 HM)+Fc-IL2wt (50 нМ) в среде AIM-V (5% hABS);

На Фиг. 30 показаны результаты анализа эффекта уничтожения раковых клеток естественными клетками-киллерами, культивируемыми в течение 21 суток в композиции, содержащей GI-101 (50 нМ), GI-101_wt (50 нМ), CD80-Fc (50 hM)+Fc-IL2v2 (50 нМ) или CD80-Fc (50 HM)+Fc-IL2wt (50 нМ) в среде AIM-V (5% hABS);

На Фиг. 31 показан результат анализа способности к дегрануляции естественных клеток-киллеров, культивируемых в течение 21 суток в композиции, содержащей GI-101 (50 нМ), GI-101_wt (50 нМ), CD80-Fc (50 hM)+Fc-IL2v2 (50 нМ) или CD80-Fc (50 HM)+Fc-IL2wt (50 нМ) в среде X-VIVO15 (5% hABS);

На Фиг. 32 показаны результаты анализа эффекта уничтожения раковых клеток естественными клетками-киллерами, культивируемыми в течение 21 суток в композиции, содержащей GI-101 (50 нМ), GI-101_wt (50 нМ), CD80-Fc (50 hM)+Fc-IL2v2 (50 нМ) или CD80-Fc (50 HM)+Fc-IL2wt (50 нМ) в среде X-VIVO15 (5% hABS);

На Фиг. 33 показан результат анализа способности к дегрануляции естественных клеток-киллеров, культивируемых в течение 21 суток в композиции, содержащей GI-101 (50 нМ), GI-101_wt (50 нМ), CD80-Fc (50 hM)+Fc-IL2v2 (50 нМ) или CD80-Fc (50 HM)+Fc-IL2wt (50 нМ) в среде NK MACS (5% hABS); и

На Фиг. 34 показаны результаты анализа эффекта уничтожения раковых клеток естественными клетками-киллерами, культивируемыми в течение 21 суток в композиции, содержащей GI-101 (50 нМ), GI-101_wt (50 нМ), CD80-Fc (50 hM)+Fc-IL2v2 (50 нМ) или CD80-Fc (50 HM)+Fc-IL2wt (50 нМ) в среде NK MACS (5% hABS).

Наилучший способ осуществления изобретения Композиция и среда для пролиферации NK-клеток

Согласно аспекту настоящего изобретения предложена композиция для культивирования естественной клетки-киллера (NK-клетки), включающая в качестве активного ингредиента димер слитого белка, содержащий IL-2 или его вариант и CD80 или его фрагмент.Кроме того, предложена среда для культивирования естественных клеток-киллеров, включающая димер слитого белка в качестве активного ингредиента.

Композиция для культивирования естественной клетки-киллера может дополнительно включать любое, выбранное из группы, состоящей из среды, сыворотки, добавки и их комбинации.

Среда для культивирования NK-клеток может представлять собой среду, в которой димер слитого белка, содержащий белок IL-2 и белок CD80, добавляют в среду для культивирования клеток. В данном случае, среда для культивирования клеток может включать любое, выбранное из группы, состоящей из аминокислот, Сахаров, неорганических солей и витаминов. Предпочтительно, среда для культивирования клеток может включать все из аминокислот, Сахаров, неорганических солей и витаминов. В качестве конкретного воплощения среда для культивирования NK-клеток может включать по меньшей мере один из компонентов в указанных ниже Таблице 1 - Таблице 4.

В том виде, в котором он используется в данном документе, термин «среда для культивирования клеток» означает среду, используемую для культивирования клеток, в частности, NK-клеток и более конкретно CD3-CD56+ клеток. Данный термин включает компоненты, которые требуются клеткам для роста и выживаемости клеток in vitro или включает компоненты, которые помогают клеточному росту и выживаемости. Конкретно, компоненты могут представлять собой витамины, незаменимые или заменимые аминокислоты и микроэлементы. Среда может представлять собой среду, используемую для культивирования клеток, предпочтительно эукариотических клеток и более предпочтительно NK-клеток.

Среда для культивирования клеток согласно настоящему изобретению может включать компонент-аминокислоты, компонент-витамины, компонент неорганические соли, другой компонент и чистую воду, где:

а) компонент - аминокислоты представляет собой по меньшей мере одну аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из глицина, L-аланина, L-валина, L-лейцина, L-изолейцина, L-треонина, L-серина, L-цистеина, L-метионина, L-аспарагиновой кислоты, L-аспарагина, L-глутаминовой кислоты, L-глутамина, L-лизина, L-аргинина, L-гистидина, L-фенилаланина, L-тирозина, L-триптофана, L-пролина, |3-аланина, у-аминомасляной кислоты, орнитина, цитруллина, гомосерина, трийодтиронина, тироксина и диоксифенилаланина или их комбинации, и предпочтительно по меньшей мере одну аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из глицина, L-аланина, L-аргинина, L-цистеина, L-глутамина, L-гистидина, L-лизина, L-метионина, L-пролина, L-серина, L-треонина и L-валина или их комбинации;

b) компонент - витамины представляет собой по меньшей мере один витамин, выбранный из группы, состоящей из биотина, Д-пантотената кальция, фолиевой кислоты, ниацинамида, пиридоксина гидрохлорида, рибофлавина, тиамина гидрохлорида, витамина В12, холина хлорида, и-инозитола и аскорбиновой кислоты или их комбинации, и предпочтительно по меньшей мере один витамин, выбранный из группы, состоящей из и-инозитола, тиамина гидрохлорида, ниацинамида и пиридоксина гидрохлорида или их комбинации;

c) компонент - неорганические соли представляет собой по меньшей мере одну неорганическую соль, выбранную из группы, состоящей из хлорида кальция (CaCl₂)(безводный), пентагидрата сульфата меди (CuSO₄-5H₂O), гептагидрата сульфата железа (II) (FeSO₄-7H₂O), хлорида магния (безводный), сульфата магния (MgSO₄)(безводный), хлорида калия (KCl), хлорида натрия (NaCl), гидрофосфата натрия (Na₂HPO₄), моногидрата дигидрофосфата натрия (NaH₂PO₄-H₂O), гептагидрата сульфата цинка (ZnSO₄-7H₂O), нонагидрата нитрата железа (III) (Fe(NO₃)₃⋅9H₂O) и гидрокарбоната натрия (NaHCO₃) или их комбинации и предпочтительно по меньшей мере одну неорганическую соль, выбранную из группы, состоящей из хлорида натрия (NaCl), гидрокарбоната натрия (NaHCO₃), хлорида калия (KCl), хлорида кальция (CaCl₂)(безводный) и моногидрата дигидрофосфата натрия (NaH₂PO₄-H₂O) или их комбинации;

d) другой компонент представляет собой по меньшей мере один другой компонент, выбранный из группы, состоящей из D-глюкозы (декстрозы), пирувата натрия, гипоксантина Na, тимидина, линолевой кислоты, липоевой кислоты, аденозина, цитидина, гуанозина, уридина, 2'-дезоксиаденозина, 2'-дезоксицитидина HCI и 2'-дезоксигуанозина или их комбинации, и он может предпочтительно представлять собой пируват натрия; и

е) очищенная вода используется для растворения аминокислоты, витамина, неорганической соли и другого компонента и может быть получена одним или более способами дистилляции или очищена через фильтр.

Кроме того, среда для культивирования клеток согласно настоящему изобретению может дополнительно включать фактор роста или цитокин. Фактор роста может представлять собой IGF (от англ. insulin-like growth factor - инсулиноподобный фактор роста), bFGF (от англ. basic fibroblast growth factor - основной фактор роста фибробластов), TGF (от англ. transforming growth factor - трансформирующий фактор роста), HGF (от англ. hepatocyte growth factor - фактор роста гепатоцитов), EGF (от англ. epidermal growth factor - эпидермальный фактор роста), VEGF (от англ. vascular endothelial growth factor - фактор роста эндотелия сосудов), PDGF (от англ. platelet derived growth factor - фактор роста тромбоцитов) или т.п., один или по меньшей мере два из них, но не ограничивается ими. Цитокин может представлять собой IL-1, IL-4, IL-6, IFN-γ, IL-10, IL-15, IL-17, IL-21 или т.п., один или по меньшей мере два из них, но не ограничивается ими.

Кроме того, среда для культивирования клеток согласно настоящему изобретению может дополнительно включать антитело для активации естественных клеток-киллеров. Антитело для активации естественных клеток-киллеров может представлять собой антитело против CD3, антитело против CD2, антитело против CD335 или т.п., одно или по меньшей мере два из них, но не ограничивается ими. Кроме того, может быть включен шарик, с которым связывается антитело для активации естественных клеток-киллеров. Кроме того, может быть использован слитый белок, включающий два или более типов антител или их фрагментов вариабельных областей, для активации естественных клеток-киллеров.

В частности, среда для культивирования NK может дополнительно включать одно, выбранное из группы, состоящей из IL-15, IL-21 и их комбинации.

IL-15 и IL-21 могут представлять собой тип интерлейкина (IL) и означают белковые, биоактивные вещества, продуцируемые иммунокомпетентными клетками, такими как лимфоциты или моноциты и макрофаги. IL-15 и IL-21 могут быть использованы при культивировании естественных клеток-киллеров с использованием мононуклеарных клеток в качестве клеток-источников посредством стимуляции пролиферации естественных клеток-киллеров, но существует проблема низкой степени пролиферации и чистоты, когда используются только в отдельности или в комбинации (Biossel L. et al., Biology of Blood and Marrow Transplantation, 14, 1031-1038, 2008).

Конкретно, среда может представлять собой традиционную среду для культивирования животных клеток, такую как DMEM (от англ. Dulbecco's Modified Eagle's Medium - среда Игла, модифицированная по Дульбекко), EDM (от англ. Endothelial differentiation medium - среда для эндотелиальной дифференцировки), MEM (от англ. Minimal Essential Medium - минимальная питательная среда), ВМЕ (от англ. Basal Medium Eagle - базовая питательная среда Игла), RPMI 1640, F-10, F-12, а-МЕМ (от англ. a-Minimal Essential Medium), G-MEM (от англ. Glasgow's Minimal Essential Medium - минимальная питательная среда Глазго), среда Дульбекко в модификации Пскова, среда AIM-V, среда X-VIVO™ 15, среда NK MACS. В одном воплощении настоящего изобретения в качестве среды использовали среду AIM-V, среду X-VIVO™ 15 и среду NK MACS.

Термин «сыворотка», в том виде, в котором он используется в настоящем изобретении, означает прозрачный супернатант, выделенный из крови, после того, как кровь полностью свернулась. Кроме того, требуется добавлять сыворотку к синтетической среде для культивирования животных клеток, и распространено использование бычьей, лошадиной или человеческой сыворотки. В случае сыворотки бычьего происхождения можно использовать фетальную телячью сыворотку (от англ. FBS - fetal bovine serum), сыворотку новорожденных телят, телячью сыворотку, бычью сыворотку или т.п., в зависимости от времени забора крови. В случае сыворотки, происходящей из человека, используют человеческую сыворотку от донора, чей тип крови представляет собой АВ, и можно использовать человеческую сыворотку АВ, которая не содержит антител к антигенам типа крови А и В, таким образом, что может минимизировать иммунную реактивность. Кроме того, в качестве альтернативы «сыворотке» можно использовать CTS Immune Cell SR или т.п. В одном воплощении настоящего изобретения использовали человеческую сыворотку АВ или CTS Immune Cell SR.

GLUTAMAX (GIBCO®), альтернативу L-глутамину, можно использовать в качестве добавки для улучшения стабильности и клеточной активности во время культивирования клеток. Корме того, добавка может представлять собой добавку NK MACS (Miltenyi Biotec, 130-113-102).

Димер слитого белка, содержащий белок IL-2 или его вариант и белок CD80 или его фрагмент

Термин «IL-2» или «интерлейкин-2» в том виде, как он используется в данном документе, если не утверждается иное, относится к любому IL-2 дикого типа, полученному из любого источника-позвоночного, включая млекопитающих, например, приматов (таких как человек) и грызунов (таких как мыши и крысы). IL-2 может быть получен из животных клеток и также включает IL-2, полученный из рекомбинантных клеток, способных к продукции IL-2. Кроме того, IL-2 может представлять собой IL-2 дикого типа или его вариант.

В настоящем описании изобретения IL-2 или его вариант могут быть совместно выражены термином «белок IL.-2» или «полипептид IL-2». IL-2, белок IL-2, полипептид IL-2 и вариант IL-2 специфично связываются, например, с рецептором IL-2. Это специфичное связывание может быть идентифицировано способами, известными специалистам в данной области.

В одном воплощении IL-2 может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35 или SEQ ID NO: 36. Здесь IL-2 также может находиться в зрелой форме. В частности, зрелый IL-2 может не содержать сигнальную последовательность и может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10. Здесь IL-2 может использоваться согласно конфигурации, охватывающей фрагмент IL-2 дикого типа, в котором усечена часть N-конца или С-конца IL-2 дикого типа.

Кроме того, данный фрагмент IL-2 может находиться в форме, в которой 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 смежных аминокислот усечены с N-конца белка, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35 или SEQ ID NO: 36. Кроме того, фрагмент IL-2 может находиться в форме, в которой 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 смежных аминокислот усечены с С-конца белка, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35 или SEQ ID NO: 36.

Термин «вариант IL-2» в том виде, как он используется в данном документе, относится к форме, в которой часть аминокислот в полноразмерном IL-2 или вышеописанном фрагменте IL-2 заменена. То есть, вариант IL-2 может иметь отличную аминокислотную последоватеьность от IL-2 дикого типа или его фрагмента. Однако вариант IL-2 может иметь эквивалентную или аналогичную активность относительно IL-2 дикого типа. Здесь «активность IL-2» может, например, относиться к специфичному связыванию с рецептором IL-2, причем данное специфичное связывание можно измерять способами, известными специалистам в данной области.

В частности, вариант IL-2 можно получать заменой части аминокислот в IL-2 дикого типа. Одно воплощение варианта IL-2, полученного аминокислотной заменой, может быть получено заменой по меньшей мере одной из 38-ой, 42-ой, 45-ой, 61-ой и 72-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10.

В частности, вариант IL-2 может быть получен заменой по меньшей мере одной из 38-ой, 42-ой, 45-ой, 61-ой или 72-ой аминокислоты в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10 другой аминокислотой. Кроме того, когда IL-2 находится в форме, в которой часть N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 35 усечена, аминокислота в положении, комплементарно соответствующем положению в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, может быть заменена другой аминокислотой. Например, когда IL-2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35, его вариант IL-2 может быть получен заменой по меньшей мере одной из 58-ой, 62-ой, 65-ой, 81-ой или 92-ой аминокислоты в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 35 другой аминокислотой. Данные аминокислотные остатки соответствуют 38-му, 42-му, 45-му, 61-му и 72-му аминокислотному остатку в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10 соответственно. Согласно одному воплощению могут быть заменены одна, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять аминокислот, при условии, что такой вариант IL-2 сохраняет активность IL-2. Согласно другому воплощению могут быть заменены от одной до пяти аминокислот.

В одном воплощении вариант IL-2 может находиться в форме, в которой заменены две аминокислоты. В частности, вариант IL-2 может быть получен заменой 38-ой и 42-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменой 38-ой и 45-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменой 38-ой и 61-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменой 38-ой и 72-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменой 42-ой и 45-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменой 42-ой и 61-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменой 42-ой и 72-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменой 45-ой и 61-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменой 45-ой и 72-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменой 61-ой и 72-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10.

Кроме того, вариант IL-2 может находится в форме, в которой заменяются три аминокислоты. В частности, вариант IL-2 может быть получен заменой 38-ой, 42-ой и 45-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменой 38-ой, 42-ой и 61-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменой 38-ой, 42-ой и 72-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменой 38-ой, 45-ой и 61-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменой 38-ой, 45-ой и 72-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменой 38-ой, 61-ой и 72-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменой 42-ой, 45-ой и 61-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменой 42-ой, 45-ой и 72-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменой 45-ой, 61-ой и 72-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10.

Кроме того, вариант IL-2 может находится в форме, в которой заменяются четыре аминокислоты. В частности, вариант IL-2 может быть получен заменой 38-ой, 42-ой, 45-ой и 61-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменой 38-ой, 42-ой, 45-ой и 72-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменой 38-ой, 45-ой, 61-ой и 72-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменой 38-ой, 42-ой, 61-ой и 72-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменой 42-ой, 45-ой, 61-ой и 72-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10.

Кроме того, вариант IL-2 может находится в форме, в которой заменяются пять аминокислот.В частности, вариант IL-2 может быть получен заменой каждой из 38-ой, 42-ой, 45-ой, 61-ой и 72-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10 другой аминокислотой.

Здесь «другая аминокислота», вводимая заменой, может представлять собой любую аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из аланина, аргинина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, цистеина, глутаминовой кислоты, глутамина, гистидина, изолейцина, лейцина, лизина, метионина, фенилаланина, пролина, серина, треонина, триптофана, тирозина и валина. Однако относительно аминокислотной замены для варианта IL-2 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, 38-ая аминокислота не может быть заменена аргинином, 42-ая аминокислота не может быть заменена фенилаланином, 45-ая аминокислота не может быть заменена тирозином, 61-ая аминокислота не может быть заменена глутаминовой кислотой, и 72-ая аминокислота не может быть заменена лейцином.

Относительно аминокислотной замены для варианта IL-2 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, 38-ая аминокислота - аргинин - может быть заменена аминокислотой, отличной от аргинина. Предпочтительно относительно аминокислотной замены для варианта IL-2 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, 38-ая аминокислота - аргинин - может быть заменена аланином (R38A).

Относительно аминокислотной замены для варианта IL-2 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, 42-ая аминокислота - фенилаланин - может быть заменена другой аминокислотой, чем фенилаланин. Предпочтительно относительно аминокислотной замены для варианта IL-2 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, 42-ая аминокислота - фенилаланин - может быть заменена аланином (F42A).

Относительно аминокислотной замены для варианта IL-2 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, 45-ая аминокислота - тирозин - может быть заменена другой аминокислотой, чем тирозин. Предпочтительно относительно аминокислотной замены для варианта IL-2 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, 45-ая аминокислота - тирозин - может быть заменена аланином (Y45A).

Относительно аминокислотной замены для варианта IL-2 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, 61-ая аминокислота - глутаминовая кислота -может быть заменена другой аминокислотой, чем глутаминовая кислота. Предпочтительно относительно аминокислотной замены для варианта IL-2 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, 61-ая аминокислота -глутаминовая кислота - может быть заменена аргинином (E61R).

Относительно аминокислотной замены для варианта IL-2 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, 72-ая аминокислота - лейцин - может быть заменена другой аминокислотой, чем лейцин. Предпочтительно относительно аминокислотной замены для варианта IL-2 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, 72-ая аминокислота - лейцин - может быть заменена глицином (L72G).

В частности, вариант IL-2 может быть получен по меньшей мере одной заменой, выбранной из группы, состоящей из R38A, F42A, Y45A, E61R и L72G в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10.

В частности, вариант IL-2 может быть получен аминокислотными заменами в двух, трех, четырех или пяти положениях среди положений, выбранных в группе, состоящей из R38A, F42A, Y45A, Е61 R и L72G.

Кроме того, вариант IL-2 может находиться в форме, в которой заменены две аминокислоты. В частности, вариант IL-2 может быть получен заменами R38A и F42A. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменами R38A и Y45A. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменами R38A и E61R. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменами R38A и L72G. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменами F42A и Y45A. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменами F42A и E61R. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменами F42A и L72G. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменами E61R и L72G.

Кроме того, вариант IL-2 может находиться в форме, в которой заменяются три аминокислоты. В частности, вариант IL-2 может быть получен заменами R38A, F42A и Y45A. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменами R38A, F42A и E61R. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменами R38A, F42A и L72G. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменами R38A, Y45A и E61R. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменами R38A, Y45A и E61R. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменами R38A, Y45A и L72G. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменами F42A, Y45A и E61R. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменами F42A, Y45A и L72G. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменами F42A, E61R и L72G. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменами Y45A, E61R и L72G.

Кроме того, вариант IL-2 может находиться в форме, в которой заменяются четыре аминокислоты. В частности, вариант IL-2 может быть получен заменами R38A, F42A, Y45A и E61R. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменами R38A, F42A, Y45A и L72G. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменами R38A, F42A, E61R и L72G. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменами R38A, Y45A, E61R и L72G. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменами F42A, Y45A, E61R и L72G.

Кроме того, вариант IL-2 может быть получен заменами R38A, F42A, Y45A, E61R и L72G.

Предпочтительно одно воплощение варианта IL-2 может содержать замену, которая представляет собой любую замену, выбранную из следующих комбинаций замен (a)-(d) в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10:

(a) R38A/F42A

(b) R38A/F42A/Y45A

(c) R38A/F42A/E61 R

(d) R38A/F42A/L72G

Здесь, когда IL-2 имеет аминокислотную замену SEQ ID NO: 35, аминокислотная замена может присутствовать в положении, комплементарно соответствующем положению в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, даже когда IL-2 представляет собой фрагмент аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 35, аминокислотная замена может присутствовать в положении, комплементарно соответствующем положению в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10.

В частности, вариант IL-2 может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, 22, 23 или 24.

Кроме того, вариант IL-2 может отличаться наличием низкой токсичности in vivo. Здесь низкая токсичность in vivo может представлять собой побочный эффект, вызванный связыванием IL-2 с альфа цепью рецептора IL-2 (IL-2Rα). Были разработаны разные варианты IL-2 для уменьшения интенсивности побочного эффекта, вызванного связыванием IL-2 с IL-2Rα, и такие варианты IL-2 могут представлять собой варианты, раскрытые в патенте США №5229109 и корейском патенте №1667096. В частности, варианты IL-2, описанные в настоящей заявке, имеют низкую аффинность связывания в отношении альфа цепи рецептора IL-2 (IL-2Rα) и, таким образом, имеют более низкую токсичность in vivo, чем IL-2 дикого типа.

Термин «CD80» в том виде, в котором он используется в данном документе, также именуемый «В7-1», относится к мембранному белку, присутствующему в дендритных клетках, активированных В-клетках и моноцитах. CD80 предоставляет костимулирующие сигналы, важные для активации и выживания Т-клеток. CD80 известен в качестве лиганда двух разных белков - CD28 и CTLA-4, присутствующих на поверхности Т-клеток. CD80 состоит из 288 аминокислот и может, в частности, иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11. Кроме того, термин «белок CD80» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к полноразмерному CD80 или к фрагменту CD80.

Термин «фрагмент CD80» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к усеченной форме CD80. Кроме того, фрагмент CD80 может представлять собой внеклеточный домен CD80. Одно воплощение фрагмента CD80 может быть получено устранением 1-ой-34-ой аминокислот с N-конца, которые представляют собой сигнальную последовательность CD80. В частности, одно воплощение фрагмента CD80 может представлять собой белок, состоящий из 35-ой - 288-ой аминокислот в SEQ ID NO: 11. Кроме того, одно воплощение фрагмента CD80 может представлять собой белок, состоящий из 35-ой - 242-ой аминокислот в SEQ ID NO: 11. Кроме того, одно воплощение фрагмента CD80 может представлять собой белок, состоящий из 35-ой - 232-ой аминокислот в SEQ ID NO: 11. Кроме того, одно воплощение фрагмента CD80 может представлять собой белок, состоящий из 35-ой - 139-ой аминокислот в SEQ ID NO: 11. Кроме того, одно воплощение фрагмента CD80 может представлять собой белок, состоящий из 142-ой - 242-ой аминокислот в SEQ ID NO: 11. В одном воплощении фрагмент CD80 может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.

Кроме того, белок IL-2 и белок CD80 могут присоединяться друг к другу через линкер или носитель. В частности, IL-2 или его вариант и CD80 (В7-1) или его фрагмент могут присоединяться друг к другу через линкер или носитель. В настоящем описании термины «линкер» и «носитель» могут использоваться взаимозаменяемо.

Линкер связывает два белка. Одно воплощение линкера может содержать от 1 до 50 аминокислот, альбумин или его фрагмент, домен Fc иммуноглобулина или тому подобное. Здесь домен Fc иммуноглобулина относится к белку, который содержит константную область 2 тяжелой цепи (СН2) и константную область 3 тяжелой цепи (СН3) иммуноглобулина, и не содержит вариабельные области тяжелой и легкой цепи, и константную область 1 легкой цепи (CL1) иммуноглобулина. Данный иммуноглобулин может представлять собой IgG, IgA, IgE, IgD или IgM и предпочтительно может представлять собой lgG4. Здесь домен Fc иммуноглобулина G4 дикого типа может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4.

Кроме того, домен Fc иммуноглобулина может представлять собой вариант домена Fc, а также домен Fc дикого типа. Кроме того, термин «вариант домена Fc» в том виде, как он используется в данном документе, может относиться к форме, которая отличается от домена Fc дикого типа в показателях картины гликозилирования, имеет высокое гликозилирование по сравнению с доменом Fc дикого типа или имеет низкое гликозилирование по сравнению с доменом Fc дикого типа, или представляет собой дегликозилированную форму. Кроме того, в данный документ включается негликозилированный домен Fc. Домен Fc или его вариант может быть адаптирован для наличия скорректированного числа сиаловых кислот, фукозилирований или гликозилирований посредством культуральных условий или генетических манипуляций с хозяином.

Кроме того, гликозилирование домена Fc иммуноглобулина может быть модифицировано традиционными способами, такими как химические способы, ферментативные способы и способы генной инженерии с использованием микроорганизмов. Кроме того, вариант домена Fc может находиться в смешанной форме соответствующих областей Fc иммуноглобулинов - IgG, IgA, IgE, IgD и IgM. Кроме того, вариант домена Fc может находиться в форме, в которой некоторые аминокислоты домена Fc заменяются другими аминокислотами. Одно воплощение варианта домена Fc может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.

Данный слитый белок может иметь структуру, в которой с использованием домена Fc в качестве линкера (или носителя) белок CD80 и белок IL-2 или белок IL-2 и белок CD80 связываются с N-концом и С-концом линкера или носителя соответственно (Фиг. 1А). Связь между N-концом или С-концом домена Fc и CD-80 или IL-2 возможно может достигаться посредством линкерного пептида.

В частности, слитый белок может состоять из следующей структурной формулы (I) или (II):

N'-X-[линкер (1)]_n-домен Fc-[линкер (2)]_m-Y-C' (I)

N'-Y-[линкер (1)]_n-домен Fc-[линкер (2)]_m-X-C' (II)

Здесь в структурных формулах (I) и (II)

N' представляет собой N-конец слитого белка,

С' представляет собой С-конец слитого белка,

X представляет собой белок CD80,

Y представляет собой белок IL-2,

линкеры (1) и (2) представляют собой пептидные линкеры и n и m каждый независимо равен 0 или 1.

Предпочтительно данный слитый белок может состоять из структурной формулы (I). Белок IL-2 является таким, как описано выше. Кроме того, белок CD80 является таким, как описано выше. Согласно одному воплощению белок IL-2 может представлять собой вариант IL-2 с одной-пятью аминокислотными заменами по сравнению с IL-2 дикого типа. Белок CD80 может представлять собой фрагмент, полученный усечением вплоть до примерно 34 смежных аминокислотных остатков от N-конца или С-конца CD80 дикого типа. В качестве альтернативы, белок CD может представлять собой внеклеточный иммуноглобулиноподобный домен, имеющий активность связывания с рецепторами поверхности Т-клеток CTLA-4 и CD28.

В частности, данный слитый белок может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, 26, 28 или 30. Согласно другому воплощению данный слитый белок содержит полипептид, имеющий идентичность последовательности 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 9, 26, 28 или 30. Здесь идентичность представляет собой, например, процент гомологии и может определяться посредством программы для сравнения гомологии, такой как программа BlastN Национального центра биотехнологической информации (NCBI).

Пептидный линкер (1) может содержаться между белком CD80 и доменом Fc. Пептидный линкер (1) может состоять из 5-80 смежных аминокислот, 20-60 смежных аминокислот, 25-50 смежных аминокислот или 30-40 смежных аминокислот.В одном воплощении пептидный линкер (1) может состоять из 30 аминокислот.Кроме того, пептидный линкер (1) может содержать по меньшей мере один цистеин. В частности, пептидный линкер (1) может содержать один, два или три цистеина. Кроме того, пептидный линкер (1) может происходить из шарнира иммуноглобулина. В одном воплощении пептидный линкер (1) может представлять собой пептидный линкер, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3.

Пептидный линкер (2) может состоять из 1-50 смежных аминокислот, 3-30 смежных аминокислот или 5-15 смежных аминокислот.В одном воплощении пептидный линкер (2) может представлять собой (G4S)_n (где n представляет собой целое число от 1 до 10). Здесь в (G4S)_n n может быть равен 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10. В одном воплощении пептидный линкер (2) может представлять собой пептидный линкер, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5.

В другом аспекте настоящего изобретения предложен димер, полученный связыванием двух слитых белков, каждый из которых содержит белок IL-2 и белок CD80. Слитый белок, содержащий IL-2 или его вариант и CD80 или его фрагмент, является таким, как описано выше.

Здесь связывание между слитыми белками, составляющими данный димер, может достигаться посредством дисульфидной связи, образованной цистеинами, присутствующими в линкере, но не ограничиваясь ей. Слитые белки, составляющие димер, могут быть одинаковыми или отличающимися друг от друга слитыми белками. Предпочтительно данный димер может представлять собой гомодимер. Одним воплощением слитого белка, составляющего димер, может быть белок, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9.

Способ культивирования NK-клеток 1

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложен способ культивирования естественной клетки-киллера, включающий: i) отделение клетки, которая не экспрессирует CD3, из мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС); ii) отделение клетки, которая экспрессирует CD56, от клетки, которая не экспрессирует CD3, выделенной на указанной выше стадии; и iii) культивирование выделенных клеток в присутствии димера слитого белка, содержащего IL-2 или его вариант и CD80 или его фрагмент.

Термин «РВМС», в том виде, в котором он используется в настоящем изобретении, означает мононуклеарную клетку периферической крови. РВМС состоят из лимфоцитов (Т-клетки, В-клетки и естественные клетки-киллеры) и моноцитов, и могут быть выделены из цельной крови посредством Ficoll и центрифугирования. РВМС можно выделять из цельной крови, полученной от индивида.

Димер слитого белка представляет собой такой, как подробно описано в случае композиции для культивирования естественных клеток-киллеров. Слитый белок-димер может быть обработан в концентрации 1 нМ - 500 нМ. В частности, слитый белок-димер может быть обработан в концентрации 1 нМ - 500 нМ, 5 нМ -300 нМ или 10 нМ - 150 нМ. В одном воплощении настоящего изобретения димер слитого белка обрабатывали в концентрации 1,6 нМ или 50 нМ.

Способ культивирования выделенных клеток можно осуществлять, используя способ, широко известный в данной области. В частности, температура культивирования на стадии культивирования выделенных клеток может составлять от 27°С до 40°С или от 30°С до 37°С. В одном воплощении настоящего изобретения культивирование можно проводить при температуре 37°С.Кроме того, на стадии культивирования выделенных клеток условие - концентрация CO₂ во время культивирования может составлять 1%-10%, и предпочтительно они могут культивироваться в условиях с 5% CO₂.

На стадии культивирования выделенных клеток период культивирования может составлять от 5 суток до 25 суток, от 6 суток до 23 суток, или от 7 суток до 21 суток. В одном воплощении настоящего изобретения период культивирования мог составлять 20 суток, и значимое различие в пролиферации появлялось с 5-ых суток.

Полученные NK-клетки и их применение

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложены естественные клетки-киллеры, полученные способом культивирования естественных клеток-киллеров.

Естественные клетки-киллеры могут иметь повышенный уровень экспрессии CD16 и NKp46. Естественные клетки-киллеры могут иметь повышенный уровень экспрессии гранзима В и перфорина. Естественные клетки-киллеры, культивируемые согласно способу культивирования естественных клеток-киллеров, можно замораживать, и функция клеток не нарушается, даже при повторном размораживании.

Из-за высокого уровня экспрессии активирующих рецепторов, таких как CD16 и NKp46, естественные клетки-киллеры демонстрируют повышенную способность к уничтожению линии раковых клеток и повышенный уровень секреции гранзима В и перфорина, и, таким образом, можно ожидать превосходный противораковый эффект.Таким образом, может быть получено терапевтическое средство, эффективное в отношении лечения рака, с использованием большого количества активированных естественных клеток-киллеров, которые клинически применимы. Кроме того, естественные клетки-киллеры могут иметь высокий уровень экспрессии NKp30 или DNAM1.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения рака, включающая естественные клетки-киллеры в качестве активного ингредиента.

Корме того, естественные клетки-киллеры, полученные способом культивирования естественных клеток-киллеров, могут быть включены в количестве 10-95 масс. % в расчете на общую массу фармацевтической композиции. Кроме того, фармацевтическая композиция может дополнительно включать, помимо активного ингредиента, по меньшей мере один активный ингредиент, который демонстрирует такие же или похожие функции.

Дозировку фармацевтической композиции можно регулировать в соответствии с разными факторами, включая тип заболевания, тяжесть заболевания, виды и содержание активных ингредиентов и других ингредиентов, включенных в композицию, виды препарата и возраст, массу, общее состояние здоровья, пол и рацион пациента, время введения, путь введения и скорость секреции композиции, продолжительность лечения и одновременно используемые лекарственные средства.

Однако, для желательного эффекта дозировка фармацевтической композиции может составлять 1×10² клеток/кг - 1,0×10¹³ клеток/кг, и 1×10⁷ клеток/кг - 1,5×10¹¹ клеток/кг в расчете на естественные клетки-киллеры, что является активным ингредиентом. В данном случае доза может быть введена один раз в сутки или может быть разделена на несколько раз.

Кроме того, фармацевтическая композиция может быть введена индивиду разными способами, известными в данной области. Путь введения может быть соответствующим образом выбран специалистом в данной области с учетом способа введения, объема жидкости организма, вязкости или т.п.

Рак может представлять собой любой рак, выбранный из группы, состоящей из рака желудка, рака печени, рака легкого, колоректального рака, рака молочной железы, рака предстательной железы, рака яичника, рака поджелудочной железы, рака шейки матки, рака щитовидной железы, рака гортани, острого лимфобластного лейкоза, опухоли головного мозга, нейробластомы, ретинобластомы, рака головы и шеи, рака слюнных желез и лимфомы.

Способ лечения с использованием полученных NK-клеток

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложен способ лечения рака, включающий введение NK-клеток индивиду, имеющему рак. В данном случае NK-клетки и рак представляют собой такие, как описано выше. Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложено применение NK-клеток для лечения рака.

Способ культивирования NK-клеток 2

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложен способ культивирования естественной клетки-киллера, включающий: i) выделение клеток, которые не экспрессируют CD3, из РВМС; и ii) культивирование выделенных клеток в присутствии димера слитого белка, содержащего IL-2 или его вариант и CD80 или его фрагмент.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложены естественные клетки-киллеры, полученные способом культивирования естественных клеток-киллеров. Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения рака, включающая естественные клетки-киллеры в качестве активного ингредиента. Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложен способ лечения рака, включающий введение NK-клеток индивиду, имеющему рак. В данном случае NK-клетки и рак представляют собой такие, как описано выше. Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложено применение NK-клеток для лечения рака.

Из-за высокого уровня экспрессии активирующих рецепторов, таких как CD16 и NKp46, естественные клетки-киллеры демонстрируют повышенную способность к уничтожению линии раковых клеток и повышенный уровень секреции гранзима В и перфорина, и, таким образом, можно ожидать превосходный противораковый эффект.Таким образом, может быть получено терапевтическое средство, эффективное в отношении лечения рака, с использованием большого количества активированных естественных клеток-киллеров, которые клинически применимы. Кроме того, естественные клетки-киллеры могут иметь высокий уровень экспрессии NKp30 или DNAM1.

Рак может представлять собой любой рак, выбранный из группы, состоящей из рака желудка, рака печени, рака легкого, коло ректального рака, рака молочной железы, рака предстательной железы, рака яичника, рака поджелудочной железы, рака шейки матки, рака щитовидной железы, рака гортани, острого лимфобластного лейкоза, опухоли головного мозга, нейробластомы, ретинобластомы, рака головы и шеи, рака слюнных желез и лимфомы.

Способ культивирования NK-клеток 3

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложен способ культивирования естественных клеток-киллеров, включающий: i) отделение клетки, которая экспрессирует CD56, из РВМС; и ii) культивирование выделенных клеток в присутствии димера слитого белка, содержащего IL-2 или его вариант и CD80 или его фрагмент.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложена естественная клетка-киллер, полученная способом культивирования естественных клеток-киллеров. Из-за высокого уровня экспрессии активирующих рецепторов, таких как CD16 и NKp46, естественные клетки-киллеры демонстрируют повышенную способность к уничтожению линии раковых клеток и повышенный уровень секреции гранзима В и перфорина, и, таким образом, можно ожидать превосходный противораковый эффект. Таким образом, может быть получено терапевтическое средство, эффективное в отношении лечения рака, с использованием большого количества активированных естественных клеток-киллеров, которые клинически применимы. Кроме того, естественные клетки-киллеры могут иметь высокий уровень экспрессии NKp30 или DNAM1.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения рака, включающая естественные клетки-киллеры в качестве активного ингредиента. Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложен способ лечения рака, включающий введение NK-клеток индивиду, имеющему рак. В данном случае NK-клетки и рак представляют собой такие, как описано выше. Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложено применение NK-клеток для лечения рака.

Рак может представлять собой любой рак, выбранный из группы, состоящей из рака желудка, рака печени, рака легкого, колоректального рака, рака молочной железы, рака предстательной железы, рака яичника, рака поджелудочной железы, рака шейки матки, рака щитовидной железы, рака гортани, острого лимфобластного лейкоза, опухоли головного мозга, нейробластомы, ретинобластомы, рака головы и шеи, рака слюнных желез и лимфомы.

Способ культивирования NK-клеток 4

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложен способ стимуляции активности естественных клеток-киллеров в РВМС, включающий культивирование РВМС в присутствии димера слитого белка, содержащего IL-2 или его вариант и CD80 или его фрагмент.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложены РВМС, полученные способом стимуляции активности естественных клеток-киллеров в РВМС. Естественные клетки - киллеры в РВМС имеют высокий уровень экспрессии активирующего рецептора, такого как CD16 и NKp46, таким образом, что повышают способность к уничтожению линий раковых клеток и уровень секреции гранзима В и перфорина, и, таким образом, можно ожидать превосходные противораковые эффекты. Таким образом, терапевтическое средство, эффективное в отношении лечения рака, может быть получено с использованием РВМС, включающее большое количество активированных естественных клеток-киллеров, которые клинически применимы. Кроме того, естественные клетки-киллеры в РВМС могут иметь высокий уровень экспрессии NKp30 или DNAM1.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения рака, включающая РВМС в качестве активного ингредиента. Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложен способ лечения рака, включающий введение NK-клеток индивиду, имеющему рак. В данном случае NK-клетки и рак представляют собой такие, как описано выше. Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложено применение NK-клетокдля лечения рака.

Рак может представлять собой любой рак, выбранный из группы, состоящей из рака желудка, рака печени, рака легкого, колоректального рака, рака молочной железы, рака предстательной железы, рака яичника, рака поджелудочной железы, рака шейки матки, рака щитовидной железы, рака гортани, острого лимфобластного лейкоза, опухоли головного мозга, нейробластомы, ретинобластомы, рака головы и шеи, рака слюнных желез и лимфомы.

Способ осуществления изобретения

Ниже в данном документе настоящее изобретение будет описано более подробно посредством следующих примеров. Однако, следующие примеры предназначены лишь для иллюстрации настоящего изобретения, и объем настоящего изобретения не ограничивается ими.

I. Получение GI-101, естественных клеток-киллеров и культуральной композиции естественных клеток-киллеров

Пример получения 1. Получение варианта hCD80-Fc-IL-2 (2М): GI-101

Для получения слитого белка, включающего фрагмент человеческого CD80, домен Fc и вариант IL-2, полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 8), кодирующую слитый белок, содержащий сигнальный пептид (SEQ ID NO: 1), фрагмент CD80 (SEQ ID NO: 2), шарнир Ig, конъюгированный с линкером (SEQ ID NO: 3), домен Fc (SEQ ID NO: 4), линкер (SEQ ID NO: 5) и вариант IL-2 (2M), в котором две аминокислоты заменены (R38A, F42A) (SEQ ID NO: 6), в данном порядке от N-конца синтезировали посредством службы синтеза генов Invitrogen GeneArt ThermoFisher Scientific Inc. и клонировали в вектор pcDNA3_4. Кроме того, вектор вводили в клетки СНО (от англ. Chinese Hamster Ovary - яичник китайского хомяка) (EXPI-CHO™) для экспрессии слитого белка SEQ ID NO: 9. После введения вектора клетки культивировали в окружающей среде с 37°С, 125 об./мин. и 8% CO₂ в течение 7 суток и затем собирали для очистки слитого белка. Очищенный димер слитого белка был назван «GI-101».

Очистку проводили, используя хроматографию, включая смолу с белком А MabSelect SuRe. Слитый белок связывался в условиях 25 мМ Tris, 25 мМ NaCl и рН 7,4. Затем, его элюировали 100 мМ NaCl и 100 мМ уксусной кислотой при рН 3. После помещения 20% 1М Tris-HCl при рН 9 в пробирку для сбора собирали слитый белок. Собранный слитый белок подвергали диализу в буфер PBS (от англ. phosphate buffered saline - фосфатно-солевой буферный раствор) в течение 16 часов для замены.

Затем, поглощение при длине волны 280 нм со временем измеряли посредством использования эксклюзионной хроматографии с помощью колонки TSKgel G3000SWXL (TOSOH Bioscience) с получением высокой концентрации слитого белка. При этом, выделенный и очищенный слитый белок подвергали SDS-PAGE в восстанавливающих (R) или невосстанавливающих (NR) условиях и окрашивали кумасси синим для подтверждения его чистоты (Фиг. 1В). Подтверждали, что слитый белок содержался в концентрации 2,78 мг/мл, как выявлено с использованием NanoDrop (Фиг. 1С). Также, результат, анализируемый с использованием эксклюзионной хроматографии, представлен на Фиг. 1D.

Пример получения 2. Получение димера варианта Fc-IL-2 (2М): Fc-IL-2v2 Для получения слитого белка, содержащего домен Fc и вариант IL-2, полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 45), кодирующую слитый белок, содержащий сигнальный пептид (SEQ ID NO: 1), шарнир Ig (SEQ ID NO: 38), домен Fc (SEQ ID NO: 4), линкер (SEQ ID NO: 5) и вариант IL-2 (2M), в котором две аминокислоты заменены (R38A, F42A) (SEQ ID NO: 6), в данном порядке от N-конца синтезировали посредством службы синтеза генов Invitrogen GeneArt ThermoFisher Scientific Inc. и клонировали в вектор pcDNA3_4. Кроме того, вектор вводили в клетки СНО (EXPI-CHO™) для экспрессии слитого белка SEQ ID NO: 44. После введения вектора культуральный раствор культивировали в окружающей среде с 37°С, 125 об./мин. и 8% CO₂ в течение 7 суток и затем собирали для очистки димера слитого белка. Очищенный димер слитого белка был назван «Fc-IL2v2».

Очистку и сбор слитого белка осуществляли тем же образом, как в Примере получения 1. Выделенный и очищенный слитый белок подвергали SDS-PAGE в восстанавливающих (R) или невосстанавливающих (NR) условиях и окашивали кумасси синим для подтверждения его чистоты (Фиг. 3А). В результате, подтверждали, что слитый белок образует димер. Также, результат, анализируемый с использованием эксклюзионной хроматографии, представляет собой такой, как показано на Фиг. 3В.

Пример получения 3. Получение димера Fc-IL-2: Fc-IL-2wt

Для получения слитого белка, содержащего домен Fc и IL-2 дикого типа, полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 43), кодирующую слитый белок, содержащий сигнальный пептид (SEQ ID NO: 1), шарнир Ig (SEQ ID NO: 38), домен Fc (SEQ ID NO: 4), линкер (SEQ ID NO: 5) и IL-2 дикого типа (SEQ ID NO: 10), в данном порядке от N-конца синтезировали посредством службы синтеза генов Invitrogen GeneArt Gene Synthesis ThermoFisher Scientific Inc. и клонировали в вектор pcDNA3_4. Кроме того, вектор вводили в клетки СНО (EXPI-СНО™) для экспрессии слитого белка SEQ ID NO: 42. После введения вектора клетки культивировали в окружающей среде с 37°С, 125 об./мин. и 8% CO₂ в течение 7 суток и затем собирали для очистки димера слитого белка. Очищенный димер слитого белка был назван «Fc-IL2wt».

Очистку и сбор слитого белка осуществляли тем же образом, как в Примере получения 1. Выделенный и очищенный слитый белок подвергали SDS-PAGE в восстанавливающих (R) или невосстанавливающих (NR) условиях и окашивали кумасси синим для подтверждения его чистоты (Фиг. 3С). В результате подтверждали, что слитый белок образует димер. Также, результат, анализируемый с использованием эксклюзионной хроматографии, представляет собой такой, как показано на Фиг. 3D.

Пример получения 4. Получение димера дикого типа hCD80-Fc-IL-2: hCD80-Fc-IL-2wt

Для получения слитого белка, содержащего фрагмент человеческого CD80, домен Fc и белок IL-2 дикого типа, полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 41), кодирующую слитый белок, содержащий сигнальный пептид (SEQ ID NO: 1), фрагмент CD80 (SEQ ID NO: 2), шарнир Ig, конъюгированный с линкером (SEQ ID NO: 3), домен Fc (SEQ ID NO: 4), линкер (SEQ ID NO: 5) и IL-2 дикого типа (SEQ ID NO: 10), в данном порядке от N-конца, синтезировали посредством службы синтеза генов Invitrogen GeneArt ThermoFisher Scientific Inc. и клонировали в вектор pcDNA3_4. Кроме того, вектор вводили в клетки СНО (EXPI-CHO™) для экспрессии слитого белка SEQ ID NO: 46. После введения вектора клетки культивировали в окружающей среде с 37°С, 125 об./мин. и 8%-ной концентрацией CO₂ в течение 7 суток и затем собирали для очистки димера слитого белка. Очищенный димер слитого белка называли «hCD80-Fc-IL2wt».

Очистку осуществляли с использованием хроматографии, включающей смолу с белком A MabSelect SuRe. Слитый белок связывался в условиях 25 мМ Tris, 25 мМ NaCl и рН 7,4. Затем, его элюировали 100 мМ NaCl и 100 мМ уксусной кислотой при рН 3. После помещения 20% 1М Tris-HCl при рН 9 в пробирку для сбора слитый белок собирали. Собранный слитый белок подвергали диализу в буфер PBS в течение 16 часов для замены.

Затем, поглощение при длине волны 280 нм со временем измеряли посредством использования эксклюзионной хроматографии с помощью колонки TSKgel G3000SWXL (TOSOH Bioscience) с получением высокой концентрации слитого белка. При этом, выделенный и очищенный слитый белок подвергали SDS-PAGE в восстанавливающих (R) или невосстанавливающих (NR) условиях и окашивали кумасси синим для подтверждения его чистоты (Фиг. 4А). В результате, подтверждали, что слитый белок образует димер. Также, результат, анализируемый с использованием эксклюзионной хроматографии, представляет собой такой, как показано на Фиг. 4В.

Пример получения 5. Получение димера hCD80-Fc: hCD80-Fc

Для получения слитого белка, содержащего фрагмент человеческого CD80 и домен Fc, полинуклеотид (SEQ ID NO: 39), включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую слитый белок, содержащий сигнальный пептид (SEQ ID NO: 1), фрагмент CD80 (SEQ ID NO: 2), шарнир Ig, конъюгированный с линкером (SEQ ID NO: 3), и домен Fc (SEQ ID NO: 4), в данном порядке от N-конца синтезировали посредством службы синтеза генов Invitrogen GeneArt ThermoFisher Scientific Inc. и клонировали в вектор pcDNA3_4. Кроме того, вектор вводили в клетки СНО (EXPI-CHO™) для экспрессии слитого белка SEQ ID NO: 40. После введения вектора клетки культивировали в окружающей среде с 37°С, 125 об./мин. и 8% CO₂ в течение 7 суток и затем собирали для очистки слитого белка - димера. Очищенный димер слитого белка был назван «hCD80-Fc».

Очистку осуществляли с использованием хроматографии, включающей смолу с белком A MabSelect SuRe. Слитый белок связывался в условиях 25 мМ Tris, 25 мМ NaCl и рН 7,4. Затем, его элюировали 100 мМ NaCl и 100 мМ уксусной кислотой при рН 3. После помещения 20% 1М Tris-HCl при рН 9 в пробирку для сбора слитый белок собирали. Собранный слитый белок подвергали диализу в буфер PBS в течение 16 часов для замены.

Затем, поглощение при длине волны 280 нм со временем измеряли посредством использования эксклюзионной хроматографии с помощью колонки TSKgel G3000SWXL (TOSOH Bioscience) с получением высокой концентрации слитого белка. При этом, выделенный и очищенный слитый белок подвергали SDS-PAGE в восстанавливающих (R) или невосстанавливающих (NR) условиях и окашивали кумасси синим для подтверждения его чистоты (Фиг. 2А). В результате, подтверждали, что слитый белок образует димер. Также, результат, анализируемый с использованием эксклюзионной хроматографии, представляет собой такой, как показано на Фиг. 2В.

Пример получения 1. Получение среды для культивирования естественных клеток-киллеров

Среды для культивирования естественных клеток-киллеров получали посредством, соответственно, добавления веществ, в соответствии с условиями добавления 1-4 Таблицы 5, в каждую базовую культуральную среду, имеющую состав Таблицы 1 - Таблицы 4, указанных ниже.

Пример 1. Получение CD3(-)CD56(+) естественных клеток-киллеров, происходящих из мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС)

Для получения CD3(-) клеток число РВМС (мононуклеарные клетки периферической крови, Zen-Bio. Inc, NC 27709, США, кат.№: SER-PBMC-200-F) подсчитывали с использованием автоматического счетчика клеток ADAM-MC2 (NanoEnTek, приобретенный у Cosmo Genetech Co., Ltd.). РВМС переносили в новую пробирку и затем центрифугировали при 300×g в течение 5 минут при температуре 4°С. 0,5%-ный (об./об.) бычий сывороточный альбумин (BSA - от англ. bovine serum albumin) и ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) в концентрации 2 мМ включали в PBS для получения буфера MACS (рН 7,2). После завершения центрифугирования осадок клеток обрабатывали 80 мкл буфера MACS и 20 мкл магнитных шариков с CD3 (Miltenyi biotech, 130-050-101) на 1×10⁷ клеток для суспендирования и затем инкубировали при температуре 4°С в течение 15 минут.10 мл буфера MACS добавляли для промывки и центрифугировали при 300×g в течение 10 минут при температуре 4°С, и затем осадок клеток ресуспендировали в 0,5 мл буфера MACS.

2 мл буфера MACS сначала наливали в колонку LD (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Германия, кат. №: 130-042-901), и затем наливали клеточную суспензию.

Затем получали CD3(-) клетки, проходящие через колонку LD. При этом, CD3(-) клетки получали посредством протекания 2 мл буфера MACS три раза таким образом, чтобы можно было достаточно отделить клетки, остающиеся в колонке LD. Полученные CD3(-) клетки подсчитывали с использованием клеточного счетчика и затем помещали в новую пробирку и затем центрифугировали при 300×g в течение 5 минут при температуре 4°С.Затем, супернатант удаляли, и затем 80 мкл буфера MACS и 20 мкл магнитных шариков с CD56 (Miltenyi biotech, кат.№: 130-050-401) добавляли на 1×10⁷ клеток с последующей инкубацией при температуре 4°С в течение 15 минут.10 мл буфера MACS добавляли для промывки и центрифугировали при 300×g в течение 10 минут при температуре 4°С, и затем осадок клеток ресуспендировали в 0,5 мл буфера MACS.

Сначала 3 мл буфера MACS наливали в колонку LS (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Германия, кат. №: 130-042-901), и затем наливали суспензию клеток. При этом, 2 мл буфера MACS три раза наливали таким образом, чтобы клетки, остающиеся в колонке LS, можно было достаточным образом отделить. Затем, после отделения колонки LS от магнитного держателя, добавляли 5 мл буфера MACS, и давление прикладывали посредством поршня с получением CD3(-)CD56(+) естественных клеток-киллеров. Полученные CD3(-)CD56(+) естественные клетки-киллеры помещали в новую пробирку и центрифугировали при 300×g в течение 5 минут при температуре 4°С. После удаления супернатанта клетки суспендировали в базовых культуральных средах, показанных в Таблице 1 - Таблице 4, с учетом условий культивирования. Число суспендированных клеток подсчитывали с использованием счетчика клеток.

Пример 2. Культивирование CD3(-)CD56(+) естественных клеток-киллеров, происходящих из мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС)

100 мкл CD335 (NKp46)-биотин и 100 мкл CD2-биотин, включенных в набор для активации/размножения NK-клеток (кат. №: 130-112-968) (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Германия) помещали в микропробирку, объемом 1,5 мл, и смешивали и затем добавляли 500 мкл частиц с антителами против биотина MACSiBead и перемешивали. Затем, добавляли 300 мкл буфера MACS и смешивали при 2°С-8°С в течение 2 часов с использованием ротора для микропробирок. Принимая во внимание число клеток, 5 мкл шариков для активации NK на 1×10⁶ клеток переносили в новую пробирку. 1 мл PBS добавляли и центрифугировали при 300×g в течение 5 минут. После удаления супернатанта среду MACS NK (кат. №: 130-094-483) (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Германия), подлежащую использованию, добавляли из расчета 5 мкл на 10⁶ NK-клеток и высвобождали шарики с последующей инокуляцией в CD3(-)CD56(+) естественные клетки-киллеры, выделенные в Примере 1.

Далее, полученные CD3(-)CD56(+) естественные клетки-киллеры суспендировали в композиции культуральной среды, содержащей добавку, полученную в Примере получения 1, таким образом, что общее число клеток составляло 2,5×10⁵, и высевали в 48-луночный планшет с последующим культивированием в условиях 37°С и 5% CO₂. Затем, число клеток определяли каждые 2 суток для субкультивирования в следующем порядке: 48-луночный планшет, 24-луночный планшет, 12-луночный планшет, 6-луночный планшет и колба 25Т, когда клетки сливались на 80% или более сосуда для культивирования (конфлюентность), и, в конечном итоге, все клетки собирали в сутки 21.

Пример 3. Подсчет числа клеток и сравнение жизнеспособности клеток

Общее число клеток и жизнеспособность культивируемых естественных клеток-киллеров подсчитывали, используя счетчик клеток (ADAM-MC2), в сутки 5, 9, 11, 13, 15, 17 и 21. При этом, число клеток подсчитывали в указанные выше даты, когда клетки достигают конфлюентности 80%, которая является критерием для субкультивирования, поскольку степень пролиферации клеток варьирует в зависимости от обрабатываемого материала и типа культуральной среди.

Результаты сравнения общего числа клеток и жизнеспособности CD3-CD56+клеток, культивируемых в условиях композиции культуральной среды, полученной в Примере получения 1, показаны в Таблицах 6-13, и на Фиг. 5А-12В.

В результате, подтвердили, что все композиции культуральных сред, в которые добавляли GI-101, полученный в Примере получения 1, имели общее число естественных клеток-киллеров, больше чем контрольная группа (добавление CD80-Fc+Fc-IL2v2 или CD80-Fc+Fc-IL2WT), несмотря на концентрацию обработки в условиях четырех базовых культуральных сред (Таблицы 1-4) (Фиг. 5А, 5В, 7А, 7В, 9А, 9В, 11А и 11В).

Кроме того, даже в случае жизнеспособности клеток, когда добавляли GI-101, все композиции культуральных сред демонстрировали высокую жизнеспособность, независимо от базовой культуральной среды и концентрации (Фиг. 6А, 6В, 8А, 8В, 10А, 10В, 12А и 12В).

На основе результатов подтвердили, что GI-101 играет важную роль в улучшении способности к пролиферации и жизнеспособности естественных клеток-киллеров, по сравнению с контрольной группой (добавление CD80-Fc+Fc-IL2v2 или CD80-Fc+Fc-IL2WT), независимо от базовой культуральной среды и концентрации.

II. Характеристика естественных клеток-киллеров с использованием композиции для культивирования естественных клеток-киллеров

Пример 4. Измерение чистоты естественных клеток-киллеров

CD3-CD56+ естественные клетки-киллеры, полученные из Примера 2, соответственно, центрифугировали при 300×g в течение 5 минут для удаления супернатанта, и 1 мл буфера FACS добавляли с высвобождением осадка. Затем, 3% (об./об.) FBS, 10 мМ ЭДТА, 20 мМ HEPES, 10 мкг/мл полимиксина В, 100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 1 мМ пирувата натрия добавляли к PBS с получением буфера FACS, и 1 мл полученного буфера FACS добавляли для ресуспендирования осадка клеток. Далее, его разводили буфером FACS до 2×10⁶ ^{клеток/мл с использованием счетчика клеток.}

100 мкл разведенного раствора клеток добавляли в каждую пробирку с 5 мл FACS, и 100 мкл буфера FACS дополнительно добавляли туда с последующей обработкой антителом против человеческого CD3, меченным PerCP (антитело против человеческого CD3, меченное PerCP (клон UCHT1)) и антителом против человеческого CD56, меченным РЕ/су7 (антитело против человеческого CD56, меченное РЕ/су7 (Клон В159)). Затем, после инкубации при 4°С в течение 20 минут, 200 мкл буфера FACS добавляли и центрифугировали при 1500 об./мин. в течение 3 минут.Супернатант удаляли, и 200 мкл буфера FACS добавляли для суспендирования, и затем фенотип клеток определяли с использованием проточного цитометра (CYTEK® Aurora, Cytek, Fremont, СА, США).

Информация об антителах, используемых в эксперименте, показана в Таблице 14. Кроме того, чистоты CD3-CD56+естественных клеток-киллеров, культивируемых в течение 21 суток в условиях композиций культуральных сред, полученных в Примере получения 1, были измерены и показаны на Фиг. 13-16.

Пример 5. Идентификация маркеров активации и ингибирования для естественных клеток-киллеров

CD3-CD56+ естественные клетки-киллеры, полученные в Примере 2, соответственно центрифугировали при 300×g в течение 5 минут для удаления супернатанта, и 1 мл буфера FACS добавляли для высвобождения осадка.

3% (об./об.) FBS, 10 мМ ЭДТА, 20 мМ HEPES, 10 мкг/мл полимиксина В, 100 Ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 1 мМ пирувата натрия добавляли в PBS с получением буфера FACS, и 1 мл полученного буфера FACS добавляли для ресуспендирования осадка клеток. Затем, его разводили буфером FACS до 2×10⁶ клеток/мл с использованием счетчика клеток. 100 мкл разведенного раствора клеток добавляли в каждую 5 мл пробирку для FACS и подтверждали посредством использования антитела против человеческого CD16, меченного Pe-CF594 (антитело против человеческого CD16, меченное PE-CF594 (клон 3G8)), антитела против человеческого DNAM1, меченного АРС (антитело против человеческого DNAM1, меченное АРС (клон 11А8)), антитела против человеческого NKG2C, меченного BV605 (антитело против человеческого NKG2C, меченное BV605 (клон 134591)), антитела против человеческого NKG2D, меченного BV650 (антитело против человеческого NKG2D, меченное BV650 (Клон 1D11)), антитела против человеческого NKp46, меченного ВВ515 (антитело против человеческого NKp46, меченное ВВ515 (Клон 9Е2)), антитела против человеческого NKp30, меченного BV480 (антитело против человеческого NKp30, меченное BV480 (Клон р30-15)), антитела против человеческого PD-1, меченного РЕ (антитело против человеческого PD-1, меченное РЕ (клон ЕН12.2Н7)), и антитела против человеческого NKG2A, меченного АРС (антитело против человеческого NKG2A, меченное АРС (клон 131411)), с использованием проточного цитометра. Затем, после инкубирования при 4°С в течение 20 минут, 100 мкл буфера FACS добавляли и центрифугировали при 1500 об./мин. в течение 3 минут.

Супернатант удаляли, и 200 мкл буфера FACS добавляли для суспендирования, и затем фенотип клеток определяли с использованием проточного цитометра (CYTEK® Aurora, Cytek, Fremont, СА, США). Информация антител, используемых в эксперименте, показана в Таблице 15. Маркеры активации и ингибирования для CD3-CD56+ естественных клеток-киллеров, культивируемых в течение 21 суток в условиях композиций культуральных сред, полученных в Примере получения 1, идентифицировали и показаны на Фиг. 17-24.

Пример 6. Определение способности естественных клеток-киллеров секретировать гранзим В, перфорин, интерферон гамма

Для определения способности CD3-CD56+ естественных клеток-киллеров, полученных в Примере 2, секретировать гранзим и перфорин, количество экспрессии гранзима В, перфорина и интерферона гамма в естественных клетках-киллерах измеряли посредством внутриклеточного окрашивания. Культивируемые естественные клетки-киллеры центрифугировали в условиях 300×g в течение 5 минут, и супернатант удаляли. Затем, их разводили каждой культуральной композицией до 2×10⁶ клеток/мл с использованием счетчика клеток.

200 мкл полученных клеток дозировали в каждую лунку 96-луночного планшета, и затем добавляли 1%-ную (об./об.) смесь для стимуляции (1х) (Thermo Scientific, Waltham, MA, США) и инкубировали при 37°С, в условиях CO₂ в течение 4 часов. Затем, планшеты центрифугировали при 300×g в течение 5 минут, и удаляли супернатант.Затем, 3% (об./об.) FBS, 10 мМ ЭДТА, 20 мМ HEPES, 10 мкг/мл полимиксина В, 100 Ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 1 мМ пирувата натрия добавляли в PBS с получением FACS, и 100 мкл полученного буфера FACS добавляли для ресуспендирования осадка клеток. Супернатант удаляли, и 100 мкл буфера BD CYTOFIX/CYTOPERM™ (проникающий/фиксирующий буфер, BD science) добавляли для фиксации и проникновения и затем суспендировали с последующей инкубацией при 4°С в течение 30 минут.100 мкл буфера FACS дополнительно добавляли и центрифугировали при 1500 об./мин. в течение 3 минут.

Антителом против человеческого гранзима В, меченным РЕ/су7 (антитело против человеческого гранзима В, меченное РЕ/су7 (Клон NGZB)), антителом против человеческого перфорина, меченным АРС (антитело против человеческого перфорина, меченное АРС (Клон B-D48)), и антителом против человеческого интерферона гамма, меченным BV421 (антитело против человеческого интерферона гамма, меченное BV421 (Клон В27)) осуществляли обработку. Затем, после инкубации при 4°С в течение 20 минут, 100 мкл буфера FACS добавляли и центрифугировали при 1500 об./мин. в течение 3 минут.После удаления супернатанта и добавления 200 мкл буфера FACS (фиксирующий буфер) для суспендирования, количество экспрессии клеток определяли с использованием проточной цитометрии.

Информация об антителах, используемых в эксперименте, показана в Таблице 16. Маркеры для CD3-CD56+ естественных клеток-киллеров, культивируемых в течение 21 суток в условиях композиций культуральных сред, полученных в Примере получения 1, были идентифицированы и показаны на Фиг. 25-28.

III. Анализ способности естественных клеток-киллеров уничтожать раковые клетки в соответствии с культуральной композицией

Пример 8. Подтверждение способности к дегрануляции и эффекта уничтожения е естественных клеток-киллеров в отношении раковых клеток

В частности, линию раковых клеток K562 (Американская коллекция типовых культур, АТСС (от англ. American Type Culture Collection)) разводили в PBS для определения числа клеток, показанного ниже в Таблице 17, и дозировали в каждую лунку.

В частности, линию раковых клеток K562 разводили каждой культуральной композицией до 1×10⁷ клеток/мл и затем дозировали согласно числу клеток, и затем дозировали в соответствии с числом клеток, конкретно определенном в указанной выше таблице для каждой лунки. Затем, естественные клетки-киллеры также разводили каждой культуральной композицией до 5×10⁶ клеток/мл, и затем дозировали в соответствии с числом клеток, конкретно указанным в указанной выше таблице для каждой лунки, и центрифугировали в условиях 30×g в течение 3 минут.Далее, после культивирования при 37°С, в условиях 5% CO₂ в течение 4 часов, антителом против человеческого CD3, меченным BV421 (антитело против человеческого CD3, меченное BV421 (клон UCHT1)), антителом против человеческого CD16, меченным РЕ (антитело против человеческого CD16, меченное РЕ (клон 3G8)), антителом против человеческого CD56, меченным РЕ/су7 (антитело против человеческого CD56, меченное РЕ/су7 (Клон В159)), и антителом против человеческого CD107a, меченным FITC (антитело против человеческого CD107a, меченное FITC (клон Н4А3)), осуществляли обработку и инкубацию на льду в течение 20 минут.

Затем, 100 мкл буфера FACS добавляли и центрифугировали при 1300 об./мин., в условиях 4°С в течение 5 минут.После удаления супернатанта осуществляли обработку окрашивающим раствором для определения жизнеспособности 7-AAD, и свет блокировали для осуществления реакции при комнатной температуре в течение 15 минут.Затем, 100 мкл буфера FACS добавляли и центрифугировали при 1300 об./мин., в условиях 4°С в течение 5 минут.Еще раз добавляли 200 мкл буфера FACS, и центрифугировали при 1300 об./мин., в условиях 4°С в течение 5 минут.После повторения указанного выше процесса еще раз супернатант удаляли, и добавляли 400 мкл буфера FACS с последующим анализом с использованием проточного цитометра (CYTEL® Aurora, Cytek, Fremont, СА, США).

Способность к дегрануляции и эффект уничтожения у естественных клеток-киллеров, культивируемых в течение 21 суток, в композиции, в которой 50 нМ добавки в Таблице 5 добавляли к базовой культуральной среде в Таблицах 1-14, соответственно, показаны на Фиг. 29-34.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> GI CELL, INC.

<120> КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЕСТЕСТВЕННЫХ КЛЕТОК-КИЛЛЕРОВ

И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЕСТЕСТВЕННЫХ КЛЕТОК-КИЛЛЕРОВ С ЕЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ

<130> PF-B2646

<140> PCT/KR2020/016376

<141> 2020-11-19

<150> 10-2019-0149779

<151> 2019-11-20

<150> 10-2020-0015802

<151> 2020-02-10

<160> 46

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> сигнальный пептид (TPA)

<400> 1

Met Asp Ala Met Leu Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly

1 5 10 15

Ala Val Phe Val Ser Pro Ser His Ala

20 25

<210> 2

<211> 208

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> hB7-1:35-242

<400> 2

Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys

1 5 10 15

Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp

20 25 30

Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn

35 40 45

Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn

50 55 60

Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr

65 70 75 80

Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His

85 90 95

Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser

100 105 110

Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys

115 120 125

Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu Asn

130 135 140

Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro Glu

145 150 155 160

Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr Thr

165 170 175

Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val Asn

180 185 190

Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn

195 200 205

<210> 3

<211> 30

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> шарнир с линкером

<400> 3

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

1 5 10 15

Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

20 25 30

<210> 4

<211> 216

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> fc иммуноглобулина

<400> 4

Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

100 105 110

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met

115 120 125

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

130 135 140

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

145 150 155 160

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

165 170 175

Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val

180 185 190

Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

195 200 205

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly

210 215

<210> 5

<211> 5

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> линкер

<400> 5

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 6

<211> 133

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> hIL-2M

<400> 6

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 7

<211> 617

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> слитый белок, содержащий варианты IL-2 и фрагменты CD80

<400> 7

Met Asp Ala Met Leu Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly

1 5 10 15

Ala Val Phe Val Ser Pro Ser His Ala Val Ile His Val Thr Lys Glu

20 25 30

Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys Gly His Asn Val Ser Val Glu

35 40 45

Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp Gln Lys Glu Lys Lys Met Val

50 55 60

Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn

65 70 75 80

Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala

85 90 95

Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr

100 105 110

Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser

115 120 125

Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro

130 135 140

Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro

145 150 155 160

Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu Asn Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile

165 170 175

Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro Glu Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser

180 185 190

Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr Thr Asn His Ser Phe Met Cys Leu

195 200 205

Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val Asn Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr

210 215 220

Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

225 230 235 240

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly

245 250 255

Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser

260 265 270

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg

275 280 285

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro

290 295 300

Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

305 310 315 320

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

325 330 335

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

340 345 350

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr

355 360 365

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

370 375 380

Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

385 390 395 400

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

405 410 415

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

420 425 430

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser

435 440 445

Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala

450 455 460

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly

465 470 475 480

Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu

485 490 495

Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile

500 505 510

Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Ala Lys Phe

515 520 525

Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu

530 535 540

Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys

545 550 555 560

Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile

565 570 575

Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala

580 585 590

Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe

595 600 605

Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

610 615

<210> 8

<211> 1857

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотиды, кодирующие слитый белок (GI101)

<400> 8

atggatgcta tgctgagagg cctgtgttgc gtgctgctgc tgtgtggcgc tgtgttcgtg 60

tctccttctc acgctgtgat ccacgtgacc aaagaagtga aagaggtcgc cacactgtcc 120

tgcggccaca acgtttcagt ggaagaactg gcccagacca ggatctactg gcagaaagaa 180

aagaaaatgg tgctgaccat gatgtccggc gacatgaaca tctggcctga gtacaagaac 240

cggaccatct tcgacatcac caacaacctg tccatcgtga ttctggccct gaggccttct 300

gatgagggca cctatgagtg cgtggtgctg aagtacgaga aggacgcctt caagcgcgag 360

cacctggctg aagtgacact gtccgtgaag gccgactttc ccacaccttc catctccgac 420

ttcgagatcc ctacctccaa catccggcgg atcatctgtt ctacctctgg cggctttcct 480

gagcctcacc tgtcttggct ggaaaacggc gaggaactga acgccatcaa caccaccgtg 540

tctcaggacc ccgaaaccga gctgtacgct gtgtcctcca agctggactt caacatgacc 600

accaaccaca gcttcatgtg cctgattaag tacggccacc tgagagtgaa ccagaccttc 660

aactggaaca ccaccaagca agagcacttc cctgacaatg gatctggcgg cggaggttct 720

ggcggaggtg gaagcggagg cggaggatct gctgagtcta agtatggccc tccttgtcct 780

ccatgtcctg ctccagaagc tgctggcgga ccctctgtgt tcctgtttcc tccaaagcct 840

aaggaccagc tcatgatctc tcggacaccc gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtct 900

caagaggacc ctgaggtgca gttcaattgg tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc 960

aagaccaagc ctagagagga acagttcaac tccacctaca gagtggtgtc cgtgctgacc 1020

gtgctgcacc aggattggct gaacggcaaa gagtacaagt gcaaggtgtc caacaagggc 1080

ctgccttcca gcatcgaaaa gaccatctcc aaggctaagg gccagcctag ggaaccccag 1140

gtttacaccc tgcctccaag ccaagaggaa atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgc 1200

ctggtcaagg gcttctaccc ttccgacatt gccgtggaat gggagtccaa tggccagcct 1260

gagaacaact acaagaccac acctcctgtg ctggactccg acggctcctt ctttctgtac 1320

tctcgcctga ccgtggacaa gtctagatgg caagagggca acgtgttctc ctgctctgtg 1380

ctgcacgagg ccctgcacaa tcactacacc cagaagtccc tgtctctgtc tcttggaggt 1440

ggtggcggtt ctgcccctac cagctcctct accaagaaaa cccagctcca gttggagcat 1500

ctgctgctgg acctccagat gattctgaac gggatcaaca actataagaa ccccaagctg 1560

accgccatgc tgaccgctaa gttctacatg cccaagaagg ccaccgagct gaagcacctc 1620

cagtgcctgg aagaagaact gaagcccctg gaagaggtgc tgaatctggc ccagtccaag 1680

aacttccacc tgaggccacg ggacctgatc agcaacatca acgtgatcgt gctggaactg 1740

aagggctccg agacaacctt tatgtgcgag tacgccgacg agacagccac catcgtggaa 1800

tttctgaacc ggtggatcac cttctgccag agcatcatct ccacactgac ctgatga 1857

<210> 9

<211> 592

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> слитый белок (GI101)

<400> 9

Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys

1 5 10 15

Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp

20 25 30

Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn

35 40 45

Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn

50 55 60

Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr

65 70 75 80

Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His

85 90 95

Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser

100 105 110

Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys

115 120 125

Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu Asn

130 135 140

Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro Glu

145 150 155 160

Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr Thr

165 170 175

Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val Asn

180 185 190

Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn

195 200 205

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

210 215 220

Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

225 230 235 240

Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

245 250 255

Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

260 265 270

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

275 280 285

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

290 295 300

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

305 310 315 320

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

325 330 335

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

340 345 350

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

355 360 365

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

370 375 380

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

385 390 395 400

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

405 410 415

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

420 425 430

Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

435 440 445

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser

450 455 460

Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu

465 470 475 480

Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr

485 490 495

Ala Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu

500 505 510

Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val

515 520 525

Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu

530 535 540

Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr

545 550 555 560

Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe

565 570 575

Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

580 585 590

<210> 10

<211> 133

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> hIL-2

<400> 10

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 11

<211> 288

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD80

<400> 11

Met Gly His Thr Arg Arg Gln Gly Thr Ser Pro Ser Lys Cys Pro Tyr

1 5 10 15

Leu Asn Phe Phe Gln Leu Leu Val Leu Ala Gly Leu Ser His Phe Cys

20 25 30

Ser Gly Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu

35 40 45

Ser Cys Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile

50 55 60

Tyr Trp Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp

65 70 75 80

Met Asn Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr

85 90 95

Asn Asn Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly

100 105 110

Thr Tyr Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg

115 120 125

Glu His Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr

130 135 140

Pro Ser Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile

145 150 155 160

Ile Cys Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu

165 170 175

Glu Asn Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp

180 185 190

Pro Glu Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met

195 200 205

Thr Thr Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg

210 215 220

Val Asn Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro

225 230 235 240

Asp Asn Leu Leu Pro Ser Trp Ala Ile Thr Leu Ile Ser Val Asn Gly

245 250 255

Ile Phe Val Ile Cys Cys Leu Thr Tyr Cys Phe Ala Pro Arg Cys Arg

260 265 270

Glu Arg Arg Arg Asn Glu Arg Leu Arg Arg Glu Ser Val Arg Pro Val

275 280 285

<210> 12

<211> 215

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> модифицированный Fc

<400> 12

Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

1 5 10 15

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

20 25 30

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

35 40 45

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

50 55 60

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

65 70 75 80

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

85 90 95

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

100 105 110

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

115 120 125

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

130 135 140

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

145 150 155 160

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

165 170 175

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

180 185 190

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

195 200 205

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

210 215

<210> 13

<211> 306

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> mCD80

<400> 13

Met Ala Cys Asn Cys Gln Leu Met Gln Asp Thr Pro Leu Leu Lys Phe

1 5 10 15

Pro Cys Pro Arg Leu Ile Leu Leu Phe Val Leu Leu Ile Arg Leu Ser

20 25 30

Gln Val Ser Ser Asp Val Asp Glu Gln Leu Ser Lys Ser Val Lys Asp

35 40 45

Lys Val Leu Leu Pro Cys Arg Tyr Asn Ser Pro His Glu Asp Glu Ser

50 55 60

Glu Asp Arg Ile Tyr Trp Gln Lys His Asp Lys Val Val Leu Ser Val

65 70 75 80

Ile Ala Gly Lys Leu Lys Val Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Leu

85 90 95

Tyr Asp Asn Thr Thr Tyr Ser Leu Ile Ile Leu Gly Leu Val Leu Ser

100 105 110

Asp Arg Gly Thr Tyr Ser Cys Val Val Gln Lys Lys Glu Arg Gly Thr

115 120 125

Tyr Glu Val Lys His Leu Ala Leu Val Lys Leu Ser Ile Lys Ala Asp

130 135 140

Phe Ser Thr Pro Asn Ile Thr Glu Ser Gly Asn Pro Ser Ala Asp Thr

145 150 155 160

Lys Arg Ile Thr Cys Phe Ala Ser Gly Gly Phe Pro Lys Pro Arg Phe

165 170 175

Ser Trp Leu Glu Asn Gly Arg Glu Leu Pro Gly Ile Asn Thr Thr Ile

180 185 190

Ser Gln Asp Pro Glu Ser Glu Leu Tyr Thr Ile Ser Ser Gln Leu Asp

195 200 205

Phe Asn Thr Thr Arg Asn His Thr Ile Lys Cys Leu Ile Lys Tyr Gly

210 215 220

Asp Ala His Val Ser Glu Asp Phe Thr Trp Glu Lys Pro Pro Glu Asp

225 230 235 240

Pro Pro Asp Ser Lys Asn Thr Leu Val Leu Phe Gly Ala Gly Phe Gly

245 250 255

Ala Val Ile Thr Val Val Val Ile Val Val Ile Ile Lys Cys Phe Cys

260 265 270

Lys His Arg Ser Cys Phe Arg Arg Asn Glu Ala Ser Arg Glu Thr Asn

275 280 285

Asn Ser Leu Thr Phe Gly Pro Glu Glu Ala Leu Ala Glu Gln Thr Val

290 295 300

Phe Leu

305

<210> 14

<211> 1848

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотиды, кодирующие слитый белок (mGI101)

<400> 14

atggatgcta tgctgagagg cctgtgttgc gtgctgctgc tgtgtggcgc tgtgttcgtg 60

tctccttctc acgctgtgga cgagcagctc tccaagtccg tgaaggataa ggtcctgctg 120

ccttgccggt acaactctcc tcacgaggac gagtctgagg accggatcta ctggcagaaa 180

cacgacaagg tggtgctgtc cgtgatcgcc ggaaagctga aagtgtggcc tgagtacaag 240

aacaggaccc tgtacgacaa caccacctac agcctgatca tcctgggcct cgtgctgagc 300

gatagaggca cctattcttg cgtggtgcag aagaaagagc ggggcaccta cgaagtgaag 360

cacctggctc tggtcaagct gtccatcaag gccgacttca gcacccctaa catcaccgag 420

tctggcaacc cttccgccga caccaagaga atcacctgtt tcgcctctgg cggcttccct 480

aagcctcggt tctcttggct ggaaaacggc agagagctgc ccggcatcaa taccaccatt 540

tctcaggacc cagagtccga gctgtacacc atctccagcc agctcgactt taacaccacc 600

agaaaccaca ccatcaagtg cctgattaag tacggcgacg cccacgtgtc cgaggacttt 660

acttgggaga aacctcctga ggaccctcct gactctggat ctggcggcgg aggttctggc 720

ggaggtggaa gcggaggcgg aggatctgct gagtctaagt atggccctcc ttgtcctcca 780

tgtcctgctc cagaagctgc tggcggaccc tctgtgttcc tgtttcctcc aaagcctaag 840

gaccagctca tgatctctcg gacccctgaa gtgacctgcg tggtggtgga tgtgtctcaa 900

gaggaccctg aggtgcagtt caattggtac gtggacggcg tggaagtgca caacgccaag 960

accaagccta gagaggaaca gttcaactcc acctatagag tggtgtccgt gctgaccgtg 1020

ctgcaccagg attggctgaa cggcaaagag tacaagtgca aggtgtccaa caagggcctg 1080

ccttccagca tcgaaaagac catcagcaag gctaagggcc agcctaggga accccaggtt 1140

tacaccctgc ctccaagcca agaggaaatg accaagaacc aggtgtccct gacctgcctg 1200

gtcaagggct tctacccttc cgacattgcc gtggaatggg agtccaatgg ccagcctgag 1260

aacaactaca agaccacacc tcctgtgctg gactccgacg gctccttctt tctgtactct 1320

cgcctgaccg tggacaagtc taggtggcaa gagggcaacg tgttctcctg ctctgtgctg 1380

cacgaggctc tgcacaacca ctacacccag aagtccctgt ctctgtctct tggaggtggt 1440

ggcggttctg cccctacctc cagctctacc aagaaaaccc agctccagtt ggagcatctg 1500

ctgctggacc tccagatgat cctgaatggc atcaacaatt acaagaaccc caagctgacc 1560

gccatgctga ccgctaagtt ctacatgccc aagaaggcca ccgagctgaa gcacttgcag 1620

tgcctggaag aggaactgaa gcccctggaa gaagtgctga atctggccca gtccaagaac 1680

ttccacctga ggcctaggga cctgatctcc aacatcaacg tgatcgtgct ggaactgaaa 1740

ggctccgaga caaccttcat gtgcgagtac gccgacgaga cagccaccat cgtggaattt 1800

ctgaaccggt ggatcacctt ctgccagagc atcatctcca cactgacc 1848

<210> 15

<211> 616

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> слитый белок (mGI101)

<400> 15

Met Asp Ala Met Leu Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly

1 5 10 15

Ala Val Phe Val Ser Pro Ser His Ala Val Asp Glu Gln Leu Ser Lys

20 25 30

Ser Val Lys Asp Lys Val Leu Leu Pro Cys Arg Tyr Asn Ser Pro His

35 40 45

Glu Asp Glu Ser Glu Asp Arg Ile Tyr Trp Gln Lys His Asp Lys Val

50 55 60

Val Leu Ser Val Ile Ala Gly Lys Leu Lys Val Trp Pro Glu Tyr Lys

65 70 75 80

Asn Arg Thr Leu Tyr Asp Asn Thr Thr Tyr Ser Leu Ile Ile Leu Gly

85 90 95

Leu Val Leu Ser Asp Arg Gly Thr Tyr Ser Cys Val Val Gln Lys Lys

100 105 110

Glu Arg Gly Thr Tyr Glu Val Lys His Leu Ala Leu Val Lys Leu Ser

115 120 125

Ile Lys Ala Asp Phe Ser Thr Pro Asn Ile Thr Glu Ser Gly Asn Pro

130 135 140

Ser Ala Asp Thr Lys Arg Ile Thr Cys Phe Ala Ser Gly Gly Phe Pro

145 150 155 160

Lys Pro Arg Phe Ser Trp Leu Glu Asn Gly Arg Glu Leu Pro Gly Ile

165 170 175

Asn Thr Thr Ile Ser Gln Asp Pro Glu Ser Glu Leu Tyr Thr Ile Ser

180 185 190

Ser Gln Leu Asp Phe Asn Thr Thr Arg Asn His Thr Ile Lys Cys Leu

195 200 205

Ile Lys Tyr Gly Asp Ala His Val Ser Glu Asp Phe Thr Trp Glu Lys

210 215 220

Pro Pro Glu Asp Pro Pro Asp Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

225 230 235 240

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro

245 250 255

Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val

260 265 270

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr

275 280 285

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

290 295 300

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

305 310 315 320

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

325 330 335

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

340 345 350

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

355 360 365

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

370 375 380

Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

385 390 395 400

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

405 410 415

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

420 425 430

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

435 440 445

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu

450 455 460

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly

465 470 475 480

Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln

485 490 495

Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn

500 505 510

Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr

515 520 525

Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu

530 535 540

Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn

545 550 555 560

Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val

565 570 575

Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp

580 585 590

Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys

595 600 605

Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

610 615

<210> 16

<211> 1437

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотиды, кодирующие слитый белок (GI101C1)

<400> 16