Рекомбинантная плазмидная ДНК pGEM-TCRAC-sjTREC- sjKREC, содержащая нуклеотидные последовательности локуса гена Т-лимфоцитарного α-рецептора и сигнальные фрагменты эксцизионных колец Т- и В-клеточного рецепторов Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/6809 C12N15/70 

Изобретение относится к области генной инженерии, молекулярной и клеточной биологии и предназначено для оценки специфичности и чувствительности праймеров и зондов, разрабатываемых для оценки количества копий Т-лимфоцитарного α-рецептора и сигнального фрагмента эксцизионного кольца Т-клеточного рецептора в образцах ДНК человека, т.е. выступающим в качестве стандартизированного положительного контрольного образца ДНК.

Т-лимфоциты (Т-клетки) играют ключевую роль в клеточном иммунном ответе [1, 2], поскольку они распознают специфические антигенные пептиды, связанные с главными комплексами гистосовместимости (ГКГС) [3, 4]. Это распознавание регулируется гетеродимерным αβ Т-клеточным рецептором [2]. Внутри цепи TCRβ определяющая комплементарность область (CDR) 1 и петли CDR2 TCR контактируют с альфа-спиралями ГКГС, в то время как гипервариабельные области CDR3 взаимодействуют в основном с пептидом [1, 2]. Как в цепях TCRα, так и в цепях TCRβ петли CDR3 имеют наибольшее разнообразие последовательностей и являются основными детерминантами специфичности связывания с рецептором. CDR1 и CDR2 определяются геном V, используемым в TCR, тогда как CDR3 определяется как V, (D в TCRβ), так и J, а также добавлением и удалением нуклеотидов на стыках VD и DJ (VJ в альфа-цепочка), то есть подвергаются так называемой V(D)J рекомбинации [1].

В процессе реаранжировки TCR вырезанные фрагменты ДНК создают круги эксцизии Т-клеточных рецепторов (TREC), которые экспортируются в цитоплазму Т-клеток [5, 6]. В частности, сигнальный совместный TREC δRec-ψJα (sjTREC) продуцируется во время делеции TCRD и обнаруживается примерно в 70% (альфа-бета) αβ Т-клеток. Они считаются наиболее оптимальной мишенью для оценки продукции тимуса [7-9]. Кольца вырезания рекомбинации с удалением каппа (KREC) образуются во время перестройки BCR в наивных В-клетках и аналогичны TREC [10]. Сходным образом, sjKREC, образующийся во время реаранжировок intronRSS-Kde в локусе IGK, является надежной мишенью для оценки неогенеза В-клеток из костного мозга [11,12].

Как TREC, так и KREC стабильны и нерепликативны, а затем разбавляются во время пролиферации клеток [13, 14]. Следовательно, анализы TREC и KREC широко применяются в различных клинических условиях для оценки продукции тимуса и костного мозга. Измерение уровней TREC и KREC в периферической крови можно использовать для скрининга первичных иммунодефицитных заболеваний.

Появление технологии цифровой ПЦР (digital PCR, dPCR), в том числе такого варианта как капельная цифровая ПЦР (digital droplet PCR, ddPCR), позволила получить точные (абсолютные) измерения количества копий участков ДНК (copy number variation, CNV) путём проведения двух флуоресцентных анализов (один для определения региона интереса, а другой для определения контрольного эталонного локуса с известным числом копий участка ДНК), одновременно протекающих в десятках тысяч независимых реакций (капель, лунок) [15,16]. Технология построена таким образом, чтобы в одной реакции участвовала в среднем одна молекула исходной ДНК. Тем самым достигается точная оценка числа молекул ДНК, содержащих исследуемый регион ДНК, в определенном объеме образца. Эта значительно отличает её от эмульсионной ПЦР, в результате которой получаются капли различного объема.

Число копий по технологии dPCR рассчитывается путём сравнения количества флуоресцирующих молекул интересующего региона с количеством молекул эталонного локуса генома. Однако, в отличие от количественной ПЦР в режиме реального времени, измерение флуоресценции по технологии dPCR проводится не во время ПЦР, а «по конечной точке», т.е. по завершению ПЦР. Тем самым достигается высокая точность анализа, который позволяет определить целочисленное количество копий в локусах, по сравнению с другими технологиями [15-17].

В литературе описана плазмидная ДНК близкая к заявляемой по технической сущности, но предназначена для ПЦР в режиме реального времени [18]. Использование подобной плазмиды в системе цифровой ПЦР сложно контролировать количество копий участков ДНК плазмиды ввиду её размера, который составляет порядка 5 тыс. п.н., что значительно превышает объем формируемых капель. Других аналогичных или близких к заявляемой по технической сущности и функциональному назначению не описано.

Задачей изобретения является получение плазмидной ДНК, которая служит в качестве контрольной ДНК для оценки чувствительности и специфичности праймеров и зондов, направленных на оценку количества копий гена Т-лимфоцитарного α-рецептора, а также сигнальных фрагментов эксцизионных колец Т и В-клеточного рецепторов при проведения цифровой ПЦР с абсолютной квантификацией в биологических образцах ДНК человека.

Технический результат: получение плазмиды, несущей генетическую конструкцию pGEM-TCRAC-sjTREC-sjKREC, содержащую участок гена TCRAC, сигнальные фрагменты эксцизионных колец Т- и В-клеточного рецептора, обеспечивающую высокую достоверность оценки чувствительности и специфичности праймеров и зондов, разрабатываемых для оценки Т- и В-клеточного состава в биологических образцах ДНК человека.

Указанный результат достигается за счет содержания в плазмиде pGEM-TCRAC-sjTREC-sjKREC 1 копий участка гена TCRAC, 1 копии сигнального фрагмента эксцизионного кольца Т-клеточного рецептора и 1 копии сигнального фрагмента эксцизионного кольца В-клеточного рецептора.

Описание изобретения

Предложена плазмидная генетическая конструкция pGEM-TCRAC-sjTREC-sjKREC, содержащая участок гена TCRAC, сигнальные фрагменты эксцизионных колец Т- и В-клеточного рецептора. ДНК плазмиды pGEM-TCRAC-sjTREC-sjKREC, выступает в качестве стандартизированного положительного контрольного образца ДНК для оценки чувствительности и специфичности праймеров и зондов, разрабатываемых для определения Т- и В-клеточного состава в биологических образцах ДНК человека. Подход с использованием плазмиды pGEM-TCRAC-sjTREC-sjKREC позволит изучить Т- и В-клеточного состав, при котором участок гена TCRAC выступает в качестве оценки общего количество ядро-содержащих клеток в изучаемом образце ДНК, тогда как сигнальные фрагменты TREC и KREC, образующиеся при Т- и В-лимфоцитопоэзе, соответственно, выступают в качестве контрольного уровня Т- и В-клеточного состава, соответственно. Таким образом, при определении соотношения TCRAC, TREC и KREC 1:1:1 указывает на высокую чувствительность и специфичность разрабатываемых праймеров и зондов.

Исходным генетическим материалом для конструирования плазмиды pGEM-TCRAC-sjTREC-sjKREC служит плазмида pGEM-T Easy, размером 3015 п.н. (фиг. 1), имеющая нуклеотидную последовательность SEQID NO 1. Плазмида pGEM-TCRAC-sjTREC-sjKREC получена следующим образом.

Для синтеза фрагментов TCRAC, TREC и KREC использовали полимеразную цепную реакцию (ПЦР)со следующими праймерами: TCRAC (TCRAC-F 5'-GGCATGCATGAGACCGTGACTTGCCAG-3' и TCRAC-R 5'-GGCATGCGCTGTTGTTGAAGGCGTTTGC-3'), TREC (5'-AAAGAGGGCAGCCCTCTCCAAGGC и TREC-R 5'-GGCTGATCTTGTCTGACATTTGC-3') и KREC (KREC-F 5'-CCCACTAGTTCAGCGCCCATTACGTTTCT-3' и KREC-R 5'-CCCACGCGTGTGAGGGACACGCAGCC-3'). ПЦР проводили на термоциклере T100 (Bio-Rad) с использованием высокоточной полимеразы Q5® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs) согласно инструкции производителя по следующей программе: 98°С - 30 сек.; 35 циклов: 98°С - 10 сек., 65°С -30 сек., 72°С - 20 сек.; 72°С - 3 мин.

Фрагменты ДНК ожидаемого размера выделяли из агарозного геля с помощью набора реагентов Cleanup Mini (Евроген). На первом этапе фрагмент TREC клонировали в векторе pGEM-T Easy (Promega) с использованием 2× буфера и T4 ДНК-лигазы, поставляемой вместе с вектором (EcoRV, pGEM®-T Easy Vector System I) (фиг.2). После отбора рекомбинантных плазмидных клонов было проведено секвенирование по Сенгеру с использованием универсальных праймеров M13-F 5'-GTAAAACGACGGCCAGTG-3' и M13-R 5'-GGAAACAGCTATGACCATG-3'.

Выбранный после этого плазмидный клон был использован для клонирования фрагмента TCRAC по сайту эндонуклеазы рестрикции SphI. Для этого плазмидную ДНК и ПЦР-фрагмент подвергали гидролизу SphI (СибЭнзайм), очищали через гель (Cleanup Mini (Евроген)) и лигировали с помощью T4 ДНК-лигазы (Thermo Fisher Scientific). После отбора рекомбинантных клонов повторяли секвенирование. На третьем этапе KREC клонировали по сайтам SpeI и MluI. Для этого проводили гидролиз плазмидной ДНК и соответствующего ПЦР-фрагмента с помощью эндонуклеаз рестрикции SpeI (New England Biolabs) и MluI (СибЭнзайм), проводили очистку и лигирование как на предыдущих этапах. Для клонирования и наработки плазмидной ДНК использовали химически- или электрокомпетентные клетки E.coli штамма TOP10.

Полученная в результате плазмида pGEM-TCRAC-sjTREC-sjKREC, имеющая нуклеотидную последовательность SEQID NO 2, несущая локус гена Т-лимфоцитарного α-рецептора и сигнальные фрагменты эксцизионных колец Т и В-клеточного рецепторов (фиг. 3), характеризуется следующими признаками:

- имеет размер 3870 п.н.;

- состоит из следующих элементов:

а) фрагмент последовательности гена TCRAC (367 п.н.), локус сигнального фрагмента эксцизионного кольца TREC (375 п.н.) и локус сигнального фрагмента эксцизионного кольца KREC (148 п.н.).

б) фрагмента плазмиды pGEM-T Easy (3015 п.н.), содержащего ген устойчивости к ампицилину AmpR, необходимый для селекции целевых плазмид на этапе клонирования, ориджины репликации плазмиды ori и f1 ori, а также промотор и оператор lac-оперона бактерий.

в) последовательности Т3 (19 п.н.) и SP6 (19 п.н.) промоторов, а также сайты отжига универсальных праймеров M13 fwd (17 п.н.) и M13 rev (17 п.н.) по обе стороны от генетической конструкции фрагмента гена TCRAC, сигнальных фрагментов TREC и KREC.

Изобретение иллюстрируется следующими фигурами:

фиг. 1. Схематическое изображение создания плазмиды;

фиг. 2. Графическая карта исходной плазмиды pGEM-T Easy;

фиг. 3. Графическая карта оригинальной рекомбинантной плазмидной ДНК pGEM-TCRAC-sjTREC-sjKREC, содержащую фрагмент гена TCRAC, и сигнальные фрагменты TREC и KREC;

фиг. 4. Проверка работоспособности предложенной системы методом цифровой капельной ПЦР кольцевой плазмиды pGEM-TCRAC-sjTREC-sjKREC;

фиг. 5. Проверка работоспособности предложенной системы методом цифровой капельной ПЦР с градиентом разведения кольцевой плазмиды pGEM-TCRAC-sjTREC-sjKREC.

Для лучшего понимания сущности предлагаемого изобретения оно иллюстрируются следующими примерами конкретного осуществления.

Пример. Подтверждение пригодности разрабатываемых праймеров и зондов для оценки Т- и В-клеточного состава в образцах ДНК человека, а также их специфичности с помощью плазмиды pGEM-TCRAC-sjTREC-sjKREC.

Генотипирование с помощью набора проб осуществляли по модифицированному протоколу генотипирования методом dPCR и ddPCR следующим образом:

1. В качестве материала для исследования можно использовать препарат ДНК индивида, выделенный из биообразца любым способом, позволяющим использование ДНК в качестве матрицы в полимеразной цепной реакции. Основным требованием к качеству используемой ДНК является отсутствие каких-либо признаков деградации (разрушения) ДНК. Проверка на качество ДНК обязательна с помощью любого метода ДНК электрофореза, при котором должен присутствовать только высокомолекулярный бэнд тотальной ДНК, отсутствие бэндов примесей РНК и любых «шмеров» - признаков деградации ДНК. Выполнение данного требования необходимо во избежание неточности измерений количества копий мтДНК.

2. Образец исследуемой ДНК необходимо развести до рабочей концентрации, варьирующей от 5 до 100 нг/мкл, для удобства последующих манипуляций. В реакционную смесь могут входить безнуклеазная вода, буферы для фермента рестрикции и иные компоненты, рекомендованные производителем.

3. Реакционная смесь для проведения мультиплексной цифровой ПЦР состоит из двух объемов мастер-микса производителя dPCR или ddPCR, мультиплекса из праймеров и зондов для исследуемых генов TCRAC, TREC и KREC, безнуклеазной воды и фрагментированного образца ДНК. Оптимальная концентрация ДНК выбирается согласно рекомендациям производителя прибора dPCR или ddPCR.

4. Использовали следующие пары праймеров и зонды:

1. Для проверки наличия TCRAC 5'- TGGCCTAACCCTGATCCTCTT-3', 5'- GGATTTAGAGTCTCTCAGCTGGTACAC-3', и зонда 5'-HEX-TCCCACAGATATCCAGAACCCTGACCC-BHQ1-3'.

2. Для проверки наличия сигнального фрагмента эксцизионного кольца TREC 5'- CACATCCCTTTCAACCATGCT-3' и 5'- TGCAGGTGCCTATGCATCA-3', и зонда 5'-FAM-ACACCTCTGGTTTTTGTAAAGGTGCCCACT-BHQ1-3'.

3. Для проверки наличия KREC 5'- TCCCTTAGTGGCATTATTTGTATCACT-3' и 5'- AGGAGCCAGCTCTTACCCTAGAGT-3', и зонда 5'-FAM-TCTGCACGGGCAGCAGGTTGG-BHQ1-3'.

1. Протокол программы ПЦР основан по принципу стандартной 2 шаговой ПЦР, включающая: этап денатурации при +94°С - +98°С, этап отжига и элонгации при +57°С. Этап денатурации может варьировать от 20 сек до 1 мин, оптимальным является 30 сек. Этап отжига и элонгации может длиться от 20 сек до 2 мин, оптимальным является 1 мин. Этап «горячего старта» и «горячего завершения» может быть добавлен согласно протоколу производителя. Хранение готовых продуктов ПЦР может происходить от +4°С до +12°С, до суток.

2. Общая методическая постановка dPCR (ddPCR) и получение сигналов флуоресценции производится согласно протоколу производителя технологии ddPCR (капельное, микрофлюидная) или dPCR (на микрокристалле, нанопланшете, иное) [19, 20]. Основным требованием для оценки сигналов флуоресценции нанореакций является достаточное общее количество нанореакций, которое должно превышать более 10000 капель на реакцию для адекватной оценки результатов, а также разведение плазмиды от 10 фг до 1,3 пг, согласно линейной модели, рассчитанной при получении результатов серий разведения плазмиды (фиг. 5). Примеры получаемых результатов представлены на фиг. 4-5. Соотношение копий TCRAC, sjTREC и sjKREC составляет 1:1:1. Таким образом, доказано, что созданная плазмидная конструкция действительно обеспечивает возможность оценки специфичности и чувствительности разрабатываемых праймеров и зондов для оценки Т- и В-клеточного состава в образцах ДНК человека. Следовательно, их можно использовать для исследования чувствительности и специфичности разрабатываемых олигонуклеотидных праймеров и зондов для оценки Т- и В-клеточного состава в образцах ДНК человека.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания:

1. Davis MM, Bjorkman PJ. T-Cell Antigen Receptor Genes and T-cell Recognition. Nature (1988) 334:395-402. doi: 10.1038/334395a0

2. Krogsgaard M, Davis MM. How T Cells 'See' Antigen. Nat Immunol (2005) 6:239-45. doi: 10.1038/ni1173

3. Rowen L, Koop BF, Hood L, Even J, Kanellopoulos J, Kourilsky P. The Complete 685-Kilobase DNA Sequence of the Human Beta T Cell Receptor Locus. Sci (80- ) (1999) 272:1755-62. doi: 10.1126/science.272.5269.1755

4. Glanville J, Huang H, Nau A, Hatton O, Wagar LE, Rubelt F, et al. Identifying Specificity Groups in the T Cell Receptor Repertoire. Nature (2017) 547:94-8. doi: 10.1038/nature22976

5. Livak F, Schatz DG. Identification of V(D)J recombination coding end intermediates in normal thymocytes. J Mol Biol. (1997) 267:1-9. doi: 10.1006/jmbi.1996.0834

6. Takeshita S, Toda M, Yamagishi H. Excision products of the T cell receptor gene support a progressive rearrangement model of the alpha/delta locus. EMBO J. (1989) 8:3261-70. doi: 10.1002/j.1460-2075.1989.tb08486.x

7. Ye P, Kirschner DE. Reevaluation of T cell receptor excision circles as a measure of human recent thymic emigrants. J Immunol. (2002) 168:4968-79. doi: 10.4049/jimmunol.168.10.4968

8. Hazenberg MD, Verschuren MC, Hamann D, Miedema F, van Dongen JJ. T cell receptor excision circles as markers for recent thymic emigrants: basic aspects, technical approach, and guidelines for interpretation. J Mol Med. (2001) 79:631-40. doi: 10.1007/s001090100271

9. Barbaro M, Ohlsson A, Borte S, Jonsson S, Zetterstrom RH, King J, et al. Newborn screening for severe primary immunodeficiency diseases in Sweden-a 2-year pilot TREC and KREC screening study. J Clin Immunol. (2017) 37:51-60. doi: 10.1007/s10875-016-0347-5

10. Siminovitch KA, Bakhshi A, Goldman P, Korsmeyer SJ. A uniform deleting element mediates the loss of kappa genes in human B cells. Nature. (1985) 316:260-2. doi: 10.1038/316260a0

11. van Zelm MC, van der Burg M, Langerak AW, van Dongen JJ. PID comes full circle: applications of V(D)J recombination excision circles in research, diagnostics and newborn screening of primary immunodeficiency disorders. Front Immunol. (2011) 2:12. doi: 10.3389/fimmu.2011.00012

12. van Zelm MC, Szczepanski T, van der Burg M, van Dongen JJ. Replication history of B lymphocytes reveals homeostatic proliferation and extensive antigen-induced B cell expansion. J Exp Med. (2007) 204:645-55. doi: 10.1084/jem.20060964

13. Kong FK, Chen CL, Six A, Hockett RD, Cooper MD. T cell receptor gene deletion circles identify recent thymic emigrants in the peripheral T cell pool. Proc Natl Acad Sci USA. (1999) 96:1536-40. doi: 10.1073/pnas.96.4.1536

14. Livak F, Schatz DG. T-cell receptor alpha locus V(D)J recombination by-products are abundant in thymocytes and mature T cells. Mol Cell Biol. (1996) 16:609-18. doi: 10.1128/MCB.16.2.609

15. Hindson B.J. et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number // Anal. Chem. 2011. Vol. 83, № 22. P. 8604-8610.

16. Pinheiro L.B. et al. Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification // Anal. Chem. 2012. Vol. 84, № 2. P. 1003-1011.

17. Usher C.L. et al. Structural forms of the human amylase locus and their relationships to SNPs, haplotypes and obesity // Nat. Genet. Nature Publishing Group, 2015. Vol. 47, № 8. P. 921-925.

18. Sottini A. et al. Simultaneous quantification of recent thymic T-cell and bone marrow B-cell emigrants in patients with primary immunodeficiency undergone to stem cell transplantation // Clin. Imm. 2010. 136(2), 217-227.

19. Dong L. et al. Comparison of four digital PCR platforms for accurate quantification of DNA copy number of a certified plasmid DNA reference material // Sci. Rep. Nature Publishing Group, 2015. Vol. 5, № 1. P. 1-11.

20. Farr R.J. et al. Comparative analysis of diagnostic platforms for measurement of differentially methylated insulin DNA // J. Biol. Methods. Journal of Biological Methods, 2019. Vol. 6, № 2. P. 113.

Изобретение относится к области генной инженерии, молекулярной и клеточной биологии и предназначено для оценки специфичности и чувствительности праймеров и зондов, разрабатываемых для оценки количества копий Т-лимфоцитарного α-рецептора и сигнального фрагмента эксцизионного кольца Т-клеточного рецептора в образцах ДНК человека. Предложенная плазмидная ДНК pGEM-TCRAC-sjTREC-sjKREC выступает в качестве стандартизированного положительного контрольного образца ДНК при проведении оценки количества копий гена Т-лимфоцитарного α-рецептора и сигнальных фрагментов эксцизионных колец Т- и В-клеточного рецепторов при проведении цифровой ПЦР с абсолютной квантификацией в биологических образцах ДНК человека. 5 ил., 1 пр.

Рекомбинантная плазмидная ДНК pGEM-TCRAC-sjTREC-sjKREC, предназначенная для контроля оценки Т- и В-клеточного состава в биологических образцах ДНК человека, выступающая в качестве положительного образца, содержащая одну копию участка гена TCRAC и по одной копии участка сигнальных фрагментов эксцизионных колец Т- и В- клеточных рецепторов размером 3870 п.н., имеющая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2, содержащая в соответствии с графической картой:

- фрагмент последовательности гена TCRAC размером 367 п.н., локус сигнального фрагмента эксцизионного кольца TREC размером 3 п.н. и локус сигнального фрагмента эксцизионного кольца KREC размером 148 п.н.;

- ген устойчивости к ампициллину AmpR, необходимый для селекции целевых плазмид на этапе клонирования;

- ориджины репликации плазмиды ori и f1 ori, а также промотор и оператор lac-оперона бактерий;

- уникальные последовательности размером 19 п.н. и SP6 размером 19 п.н. промоторов, а также сайты отжига универсальных праймеров M13 fwd размером 17 п.н. и M13 rev размером 17 п.н. по обе стороны от генетической конструкции фрагмента гена TCRAC, сигнальных фрагментов TREC и KREC.