СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЖЕНСКОЙ ФЕРТИЛЬНОСТИ Российский патент 2023 года по МПК G01N33/84 G01N33/52 

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к лабораторным методам исследования в области биохимии, патологической физиологии, репродуктивной медицине.

Одной из важнейших проблем здравоохранения остается бесплодие. В мире от бесплодия страдает 12-15% супружеских пар, т.е. проблема является глобальной и затрагивает, по некоторым оценкам, до 90 миллионов человек. В большинстве случаев механизмом развития женского бесплодия является нарушение овуляции, что составляет 25% известных причин женского бесплодия. В современном мире вспомогательные репродуктивные технологии (ВРТ) решают глобальную проблему - рождение желанных детей у пациенток с нарушенной фертильностью. К сожалению, яичники уже при рождении девочки имеют фиксированное количество ооцитов, которые постепенно истощаются в течение всей репродуктивной жизни, в отличие от мужчин, где репродуктивное здоровье может сохраниться до глубокой старости. Практически репродуктивный возраст женщин начинает угасать в возрасте 35 лет и заканчивается истощением фолликулов в пределах 53-55 лет, что приводит к прогрессирующему уменьшению яичников, фолликулярного резерва, сопровождающихся снижением количества и качества ооцитов. Несмотря на достижения в области репродуктивной медицины, остается сложной задачей для диагностики и лечения женского бесплодия. В России число женщин с первичным бесплодием за последние 20 лет увеличилось в 1,9 раза. Одним из важных признаков первичного женского бесплодия является неспособность женщины забеременеть в течение одного года активной половой жизни, без применения контрацепции.

В этой связи актуальна разработка и внедрение передовых технологий, направленных на совершенствование методов лабораторной диагностики бесплодия. Никотинамидным коферментам (никотинамидадениндинуклеотиду окисленному и восстановленному - НАД⁺ и НАДН) принадлежит уникальная роль в формировании, созревании, старении ооцитов, что определяет репродуктивное здоровье женщин. Качество яичников важно для формирования общей фертильности женщины.

Одним из критериев диагностики женского бесплодия является функциональные тесты: измерение базальной температуры, гистологические исследования влагалищных мазков и эндометрия, измерение вязкости цервикальной слизи. Они позволяют косвенно судить о характере гормональной секреции яичников и процессов овуляции [К.Н. Жмакин и др. Гинекологическая эндокринология, М., стр. 186., 1980].

Функциональные тесты имею свои недостатки:

1. Тесты носят лишь ориентировочный характер, и не дают возможности выявить функциональные и патофизиологические изменения в самих яйцеклетках.

2. Субъективный характер, низкая точность.

3. Данные тесты используются при формировании групп женщин для дальнейшего углубленного исследования.

Известен способ оценки состояния овариального резерва яичников, характеризующийся тем, что осуществляют трансвагинальную 2D-эхографию яичников с цветовым допплеровским картированием кровотока артерий стромы яичников. Определяется пульсаторный индекс и индекс резистентности для правого и левого яичников. Дополнительно рассчитывают отношение пульсаторного индекса к индексу резистентности для каждого яичника. Если отношение пульсаторного индекса к индексу резистентности для каждого яичника < 1.8, то диагностируют нормальный овариальный резерв яичников. Если отношение пульсаторного индекса к индексу резистентности для одного яичника или для каждого из них составляет ≥ 1.8, то диагностируют сниженный овариальный резерв яичников [патент RU 2646572, 2018].

Недостаток данного способа - даже в случае сниженного овариального резерва, значения пульсаторного индекса и индекс резистентности могут находиться в пределах нормы, в связи с чем, не всегда по этим допплерометрическим критериям возможно оценить состояние овариального резерва.

Известен способ диагностики преждевременной недостаточности яичников. Проводится измерение фолликулостимулирующего гормона в сыворотке крови на 2-3 день менструального цикла, считают количество антральных фолликулов при проведении ультразвукового исследования яичников на 1-7 дни менструального цикла. Проводят вычисление нового индекса P=F/G, где Р - индекс морфофункционального состояния овариального резерва, F - суммарное количество антральных фолликулов во всем объеме яичников, G - концентрация ФСГ в сыворотке крови в мМЕд/мл, при значениях которого менее 2,2 диагностируют снижение овариального резерва и преждевременную недостаточность яичников [патент RU 2750159, 2021]. Способ позволяет на доклинической стадии выявить молодых женщин, угрожаемых по преждевременному истощению яичников, устранить необоснованное медикаментозное воздействие на организм пациенток с отсутствием перспективы естественного зачатия при снижении затрат на лечение бесплодия.

Недостатками данного технического решения являются:

1. Данный способ ориентирован на пациенток в возрасте до 40 лет.

2. Основывается на пороговых значениях ключевых характеристик состояния репродуктивных значений обследуемых пациенток.

Наиболее близким аналогом изобретения является способ прогнозирования исходов программы ЭКО и ПЭ, сущность которого заключается в следующем: в фолликулярной жидкости определяют содержание ФНО-α и β-ФРФ. В дальнейшем рассчитывают прогностический индекс (ПИ) по формуле: ПИ=0,0027⋅Х+Y⋅(+8,9626⋅10-7⋅Y-3,0827⋅10-6⋅X)-0,1448, где X - количество ФНО-α, Y - количество β-ФРФ. Получение результата меньше, чем 0,3038 свидетельствует о благоприятном прогнозе для оплодотворения in vivo. При значении равном или большем, чем 0,3038 прогнозируют неблагоприятный исход оплодотворения in vivo [патент RU 2273031, 2006].

Недостатками прототипа являются:

1. ФНО-α и β-ФРФ могут содержаться не только в фолликулярной жидкости, но и образуются лейкоцитами, в частности нейтрофилами, моноцитами, лимфоцитами.

2. Воспалительный процесс при заболеваниях малого таза приводит к естественному увеличению этих показателей. Возникает сложность интерпретации полученных результатов.

3. При ожирении жировая ткань выполняет функцию эндокринного органа. Жировая ткань непосредственно принимает участие в формировании метаболического синдрома, за счет адипокинов, цитокинов, в том числе ФНО-α и факторов роста, в том числе и β-ФРФ, что в свою очередь, ограничивает эффективность применения данного метода для прогноза исхода ЭКО.

Хронологический возраст является наиболее важным предиктором скорости репродуктивного старения женщин. У женщин с бесплодием неясного генеза, которым применяются ВРТ, может наблюдаться слабый или преувеличенный ответ, низкое качество яйцеклеток, синдром гиперстимуляции яичников, а также изменения в структуре метаболитов фолликулярной жидкости.

Задачей изобретения является разработка способа диагностики фертильности ооцитов при женском бесплодии на основе определения уровня НАД⁺, позволяющего выявить нарушения окислительно-восстановительных процессов в яйцеклетках, в том числе сопряженных с патологией ооцитов, репарацией ДНК, регуляцией апоптоза и ранним старением яйцеклеток.

Технический результат при использовании способа - повышение точности и специфичности диагностики за счет оценки редокс-потенциала в ооцитах и раннего старения яйцеклеток, упрощение способа.

Предлагаемый способ диагностики женской фертильности осуществляется следующим образом: образцы яйцеклеток получают путем трансвагинальной пункции. На гинекологическом кресле проводят забор фолликулярной жидкости с использованием влагалищного датчика и установленной на нем специальной насадки для пункционной иглы. Весь период забора проводят строго под контролем ультразвукового аппарата «Voluson Е8», с применением трансвагинального 4D-датчика. Фолликулярную жидкость аспирируют с помощью вакуум отсоса под давлением 80 мм рт. ст. Сбор аспирированной фолликулярной жидкости проводят в стерильные разовые пробирки. Полученную фолликулярную жидкость передают эмбриологу для идентификации и выделения из нее ооцитов.

Для измерения концентрации НАД⁺ в фолликулярной жидкости используют колориметрический метод (NAD/NADH Cell-Based Assay Kit, Cayman Chemical, США) на 96-луночном планшетном анализаторе, способном измерять оптическую плотность при 450 нм в соответствии с инструкцией производителя. Фолликулярную жидкость инкубируют при температуре 37°С, центрифугируют в объеме не менее 300 мкл в течение 10-15 минут, надосадочную жидкость в объеме 100 мкл переносят в 96-луночный планшет. Каждую реакцию проводят в двух репликах. После промывки и лизиса 100 мкл супернатанта переносят в соответствующие лунки планшета. После инкубации в течение 30 мин с реагентом - солями тетразолия измеряют оптическую плотность каждого образца при длине волны 450 нм, затем определяют концентрацию восстановленного формазана, по которой рассчитывают концентрацию никотинамидадениндинуклеотида окисленного НАД⁺ в клеточном лизате [Kit Booklet NAD/NADH Cell-Based Assay Kit, Cayman Chemical, 2017]. При значении концентрации НАД⁺ в интервале, равном 56-76 нмоль/мг белка фолликулярной жидкости, диагностируют фертильность ооцитов.

Разработанный способ диагностики рекомендуется применять для оценки женской фертильности в клинической гинекологии, репродуктологии как эффективный дополнительный метод диагностики женского бесплодия неясной этиологии. Данный метод позволяет определить энергетический потенциал ооцитов и прогнозировать раннее старение ооцитов со снижением процесса фертилизации, а также о возможном прогнозе при оплодотворении и особенности проведении ЭКО у пациенток.

Предлагаемым способом была проведена оценка фертильности у 20 фертильных и 45 бесплодных женщин. Анализ результатов показал достоверные изменения в показателях фолликулярной жидкости и концентрации НАД⁺ у обследованных пациентов по возрастным категориям (таблица). Если показатели не входят в диапазон референсных значений, то отмечается высокая вероятность снижения оплодотворяющей способности ооцитов.

Сущность изобретения поясняется следующими клиническими примерами.

Пример 1.

Супружеская пара Н. обратилась в клинику ВРТ «Семья» г. Уфы по поводу первичного бесплодия в течение 2 лет. Возраст супруги 28 лет, супруга 29 лет. При проведении обследования при стандартном лабораторном исследовании эякулята не было выявлено отклонений от нормы, эякулят оценивался как фертильный. У супруги при обследовании патология: Спаечная болезнь органов малого таза. Вторичное бесплодие. При проведении обследования ооциотов у супруги концентрация НАД⁺ составила 76 нмоль/мг белка.

Заключение: Спаечная болезнь органов малого таза. Вторичное бесплодие. У супруга: нормозооспермия. Фолликулярный резерв яичников не нарушен. В результате культивирования ооцитов были получены эмбрионы и осуществлен их перенос.

Пример 2.

Супружеская пара Г. обратилась в клинику ВРТ «Семья» г. Уфы по поводу первичного бесплодия в течение 2-х лет. Возраст супруги 26 лет, супруга 32 года. При проведении обследования эякулята супруга, эякулят оценивают как инфертильный. Женский фактор трубное бесплодие. Результат проведенного анализа уровня НАД⁺ фолликулярной жидкости составил 56 нмоль/мг белка. У супруга при стандартном лабораторном исследовании эякулята не было выявлено отклонений от нормы: показатель подвижности составил 48% (категория А - 31%, категория В - 17%), показатель сперматозоидов с нормальной морфологией 27%, концентрация 46 млн/мл.

Заключение: Женский фактор трубное бесплодие. Фолликулярный резерв яичников у пациентки не нарушен. В результате культивирования ооцитов были получены эмбрионы и осуществлен их перенос.

Пример 3.

Супружеская пара Б. обратилась в клинику ВРТ «Семья» г. Уфы по поводу бесплодия в течение 2 лет. Возраст супруги 40 лет, супруга 38 лет. Менструальный цикл регулярный. У супруга при стандартном лабораторном исследовании эякулята не было выявлено отклонений от нормы: показатель подвижности составил 46% (категория А - 30%, категория В - 16%), показатель сперматозоидов с нормальной морфологией 25%, концентрация 44 млн/мл. У женщины патологии со стороны репродуктивной системы не было выявлены.

Результат проведенного анализа уровень НАД⁺ в фолликулярной жидкости составил 46 нмоль/мг белка. На основании полученных данных диагностируется снижение фолликулярного резерва яичников, фертильность ооцитов снижена. В результате культивирования ооцитов эмбрионы не были получены.

Пример 4.

Супружеская пара Н. обратилась в клинику ВРТ г. Уфы по поводу первичного бесплодия в течение 5 лет. Возраст супруги 33 лет, супруга 28 года. При проведении обследования эякулята супруга, эякулят оценивают как фертильный. У супруги при обследовании выявлена патология женского бесплодия воспалительного происхождения (хронического сальпингоофоритат).

При проведении обследования фолликулярной жидкости у супруги концентрация НАД⁺ составила 81,2 нмоль/мг белка. Диагностируется у пациентки снижение фолликулярного резерва.

Заключение: Диагностирован женский фактор бесплодия - хронический сальпингоофорит, фолликулярный резерв яичников снижен. У супруга нормоспермия. В результате культивирования ооцитов не произошло, эмбрионы получены не были.

Таким образом, приведенные примеры демонстрируют, что предлагаемый метод определения НАД⁺ позволяет выявить фолликулярный резерв яйцеклеток, репродуктивный потенциал обследуемых женщин, связанных с женским фактором бесплодия неясной этиологии и неудачными исходами ВРТ.

Преимущества заявляемого метода:

1. Данный метод является эффективным биомаркером диагностики идиопатического женского бесплодия, а также перспективным предиктором позитивного/негативного исхода ЭКО.

2. На основе данного метода возможен первичный скрининг образцов фолликулярной жидкости, определение потенциала фертильности во время репродуктивного старения женщин.

Изобретение относится к медицине, а именно к биохимии, патологической физиологии, репродуктивной медицине, и может быть использовано для диагностики женской фертильности. Проводят забор фолликулярной жидкости. Образцы фолликулярной жидкости инкубируют с солями тетразолия. Затем колориметрическим методом при длине волны 450 нм определяют концентрацию восстановленного формазана, по которой рассчитывают концентрацию никотинамидадениндинуклеотида окисленного (НАД⁺). При значении концентрации НАД⁺ 56-76 нмоль/мг белка фолликулярной жидкости диагностируют фертильность ооцитов. Способ обеспечивает возможность повышения точности, специфичности и упрощения диагностики за счет оценки редокс-потенциала в ооцитах и раннего старения яйцеклеток посредством определения уровня НАД⁺, позволяющего выявить нарушения окислительно-восстановительных процессов в яйцеклетках, в том числе сопряженных с патологией ооцитов, репарацией ДНК, регуляцией апоптоза и ранним старением яйцеклеток. 1 табл., 4 пр.

Способ диагностики женской фертильности, включающий забор фолликулярной жидкости, отличающийся тем, что образцы фолликулярной жидкости инкубируют с солями тетразолия, затем колориметрическим методом при длине волны 450 нм определяют концентрацию восстановленного формазана, по которой рассчитывают концентрацию никотинамидадениндинуклеотида окисленного (НАД⁺), и при значении концентрации НАД⁺ 56-76 нмоль/мг белка фолликулярной жидкости диагностируют фертильность ооцитов.