СИНТЕТИЧЕСКИЙ ОНКОЛИТИЧЕСКИЙ LNP-РЕПЛИКОН РНК И ПРИМЕНЕНИЯ ДЛЯ ИММУНОТЕРАПИИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЕЙ Российский патент 2023 года по МПК C12N15/09 C07K14/54 C12N15/86 C12N15/88 A61K35/768 A61K31/7105 

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

По настоящей патентной заявке по 35 U.S.C. § 119(e) испрашивается приоритет Предварительной патентной заявки США серийный номер 62/815611, поданной 8 марта 2019 г., полное содержание которой приведено в настоящем описании в качестве ссылки.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ДЛЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к синтетическим онколитическим вирусам, содержащим липидную наночастицу, содержащую один или несколько типов липидов и самоамплифицирующийся репликон РНК, содержащий последовательность, кодирующую иммуномодулирующую молекулу.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение основано, по меньшей мере частично, на неожиданном обнаружении, что при инъекции в участок опухоли, синтетический онколитический вирус успешно запускает противораковый иммунный ответ локальных опухолей и обеспечивает системный иммунитет против отдаленных опухолей.

Соответственно, в одном аспекте, настоящее изобретение относится к синтетическому онколитическому вирусу, содержащему липидную наночастицу, содержащую один или несколько типов липидов и самоамплифицирующийся репликон РНК, содержащий последовательность, кодирующую молекулу интерлейкина (IL)-12. Липидная наночастица является способной запускать иммуногенную клеточную смерть. Молекула IL-12 экспрессируется посредством самоамплифицирующегося репликона РНК.

Синтетический онколитический вирус содержит липидную наночастицу. Липидная наночастица содержит один или несколько типов липидов. В некоторых вариантах осуществления, один или несколько типов липидов содержит катионный липид. В некоторых вариантах осуществления, катионный липид представляет собой N1,N3,N5-трис(3-(дидодециламино)пропил)бензол-1,3,5-трикарбоксамид (TT3). В некоторых вариантах осуществления, липидная наночастица содержит TT3, 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE), холестерин и C14-PEG2000.

Кроме того, синтетический онколитический вирус содержит самоамплифицирующийся репликон РНК. В некоторых вариантах осуществления, самоампликон РНК происходит из альфавируса или других вирусов группы IV (вирусов с одиночной положительной цепью РНК, таких как вирус гепатита C (HCV)). В некоторых вариантах осуществления, альфавирус может представлять собой вирус венесуэльского энцефалита лошадей, вирус леса Семлики или вирус Синдбис.

В некоторых вариантах осуществления, самоамплифицирующийся репликон РНК содержит последовательность, кодирующую молекулу IL-12. В некоторых вариантах осуществления, последовательность, кодирующая молекулу IL-12, локализована в субгеномной области самоамплифицирующегося репликона РНК.

В некоторых вариантах осуществления, самоамплифицирующийся репликон РНК содержит нуклеотидную последовательность, которая является по меньшей мере на 90% идентичной репликону РНК дикого типа (WT), имеющему последовательность из SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления, самоамплифицирующийся репликон РНК не является идентичным SEQ ID NO: 1 и является способным экспрессировать молекулу IL-12 на более высоком уровне, по сравнению с самоамплифицирующимся репликоном РНК, содержащим SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления, репликон РНК, который является способным экспрессировать молекулу IL-12 на более высоком уровне, содержит точечные мутации G3936C и/или A4758G из SEQ ID NO: 1.

В некоторых вариантах осуществления, самоамплифицирующийся репликон РНК дополнительно содержит последовательность, кодирующую сывороточный альбумин. В некоторых вариантах осуществления, самоамплифицирующийся репликон РНК дополнительно содержит последовательность, кодирующую люмикан.

В некоторых аспектах, самоамплифицирующийся репликон РНК содержит последовательность, кодирующую молекулу IL-12. В некоторых вариантах осуществления, молекула IL-12 выбрана из группы, состоящей из IL-12, субъединицы IL-12 или мутантной молекулы IL-12, сохраняющей иммуномодулирующую функцию. В некоторых дополнительных вариантах осуществления, молекула IL-12 содержит субъединицы IL12α и/или IL12β.

В некоторых вариантах осуществления, липидная наночастица имеет диаметр приблизительно 100-120 нм. В некоторых вариантах осуществления, липидная наночастица имеет дзета-потенциал приблизительно 3-6 мВ.

В некоторых вариантах осуществления, липид и самоамплифицирующийся репликон РНК имеют массовое соотношение приблизительно от 1:2 до 2:1.

Настоящее изобретение, по меньшей мере частично, относится к фармацевтической композиции, содержащей синтетический онколитический вирус и фармацевтически приемлемый носитель.

В некоторых вариантах осуществления, фармацевтическая композиция составлена для внутриопухолевой инъекции.

Настоящее изобретение, по меньшей мере частично, относится к способу лечения злокачественной опухоли у нуждающегося в этом субъекта, включающему введение субъекту эффективного количества любого из синтетических онколитических вирусов или содержащей синтетический онколитический вирус фармацевтической композиции.

В некоторых вариантах осуществления, субъект представляет собой пациента-человека, имеющего или, как подозревают, имеющего злокачественную опухоль. Иллюстративные целевые злокачественные опухоли включают, но без ограничения, меланому, рак молочной железы и рак ободочной кишки.

В некоторых вариантах осуществления, фармацевтическую композицию вводят субъекту в однократной дозе. В некоторых вариантах осуществления, фармацевтическую композицию вводят субъекту посредством внутриопухолевой инъекции.

Настоящее изобретение относится также к любой из содержащих синтетический онколитический вирус фармацевтических композиций, описанных в настоящем описании, для использования в лечении любого из целевых заболеваний, описанных в настоящем описании (например, злокачественной опухоли), так же как к фармацевтическим композициям, содержащим синтетический онколитический олигонуклеотид, для использования в изготовлении лекарственного средства для лечения злокачественной опухоли.

Детали одного или нескольких вариантов осуществления изобретения приведены в описании ниже. Другие признаки или преимущества настоящего изобретения станут очевидными из следующих чертежей и подробного описания нескольких вариантов осуществления, а также из прилагаемой формулы изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

ФИГ. 1A-1H представляют собой графики, показывающие эффекты на клетки B16F10, трансфицированные с использованием DOTAP, липофектамина (Липо), TT3-наночастицы (TT3), мутантного репликона РНК (РНК), DOTAP-, Липо- и TT3-наночастицы, инкапсулирующей мутантный репликон РНК (DOTAP-mtRep, Липо-mtRep, и TT3-mtRep), электропорации (Электро), и электропорации с использованием мутантного репликона РНК (Электро-mtRep). ФИГ. 1A представляет собой график, показывающий жизнеспособность клеток B16F10 через 3 суток после трансфекции. ФИГ. 1B представляет собой график, показывающий экспрессию GFP в клетках B16F10, трансфицированных липидной наночастицей, инкапсулирующей мутантный или мертвый репликон РНК (deRep). ФИГ. 1C представляет собой график, показывающий проценты PI+ аннексин V+ мертвых клеток B16F10, трансфицированных с использованием липидных наночастиц или с использованием липидных наночастиц, инкапсулирующих репликон РНК. Иммуногенная клеточная смерть, индуцированная посредством липидных наночастиц или с использованием липидных наночастиц, инкапсулирующих репликон РНК, показана посредством процента кальретикулин+ (CRT+) клеток (ФИГ. 1D), внеклеточного ATP (ФИГ. 1E) и высвобождения HMGB1 (ФИГ. 1F). На ФИГ. 1G показан диаметр липидных наночастиц и липидных наночастиц, нагруженных мутантными репликонами РНК. На ФИГ. 1H показан дзета-потенциал липидных наночастиц и липидных наночастиц, нагруженных мутантными репликонами РНК.

ФИГ. 2A-2J представляют собой графики, показывающие, что mtRep и deRep запускают передачу сигналов TLR3 и индуцируют комплекс ISGF3 для некротической клеточной смерти. LNP-репликон РНК запускает передачу сигналов TLR3 (ФИГ. 2B и ФИГ. 2E) и активирует экспрессию стимулируемых интерфероном генов Stat 1, Stat2, IRF9, IRF3 и cGAS (ФИГ. 2F-2J), но не активирует TLR2 (ФИГ. 2A), TLR7 (ФИГ. 2C) или TLR9 (ФИГ. 2D).

ФИГ. 3A-3K представляют собой графики, показывающие, что TT3-mtRep привлекает иммуноциты и вызывает регрессию роста опухоли. На ФИГ. 3A показано, что mtRep привлекает больше Ly6clo Ly6G+ гранулоцитов через 3 суток после инъекции. На ФИГ. 3B показаны проценты mCherry+ клеток в CD45+ и CD45- клетках в опухолях, подвергнутых инъекции TT3-mtRep, через 3 суток после инъекции. На ФИГ. 3C показана экспрессия комплекса ISGF3 (Stat1/Stat2/IRF9), так же как IRF3 и cGAS, через 1 сутки после инъекции TT3-mtRep. На ФИГ. 3D-3F показана инфильтрация иммуноцитов (гранулоцитов, M-MDSC, моноцитов, макрофагов, CD4 T, CD8 T, NK, NKT, обычных DC1 (cDC1) и обычных DC2 (cDC2)) в опухоль на сутки 1 (ФИГ. 3D) и на сутки 3 (ФИГ. 3E) после одной инъекции TT3-mtRep, и на сутки 1 после 3 последовательных инъекций (ФИГ. 3F) TT3-mtRep. На ФИГ. 3G-3H показано, что TT3-mtRep индуцирует больше клеточной смерти (ФИГ. 3G), больше инфильтрации иммуноцитов (ФИГ. 3H), уменьшение массы опухоли (ФИГ. 3I), площади опухоли (ФИГ. 3J) и увеличение экспрессии CCL5 (ФИГ. 3K) через одни сутки после 3 последовательных инъекций TT3-mtRep.

ФИГ. 4A-4G представляют собой графики, показывающие, что TT3-mtRep, кодирующий IL12-MSA или IL12-MSA-люмикан, эффективно модулирует микроокружение опухолей и инфильтрацию иммуноцитов. На ФИГ. 4A и 4B показана количественная оценка IFNα2 посредством ELISA в опухоли (ФИГ. 4A) и в сыворотке (ФИГ. 4B), через одни сутки и трое суток после инъекции TT3-mtRep. На ФИГ. 4C показано, что клетки B16F10, трансфицированные с использованием mtRep-IL12-MSA и mtRep-IL12-MSA-люмикана, могут продуцировать IL-12. На ФИГ. 4D показан уровень IL-12 в опухоли через одни сутки и через трое суток после однократной инъекции TT3-mtRep, TT3-mtRep-IL12-MSA или TT3-mtRep-IL12-MSA-люмикана. На ФИГ. 4E-4F показана инфильтрация иммуноцитов в опухоли через одни сутки (ФИГ. 4E) и трое суток (ФИГ. 4F) после однократной инъекции TT3-mtRep, TT3-mtRep-IL12-MSA или TT3-mtRep-IL12-MSA-люмикана. На ФИГ. 4G показаны количества обычных DC1 (cDC1) в дренирующем опухоль лимфатическом узле через одни сутки и трое суток после однократной инъекции TT3-mtRep, TT3-mtRep-IL12-MSA или TT3-mtRep-IL12-MSA-люмикана.

ФИГ. 5A-5E представляют собой графики, показывающие синергические противораковые эффекты in vivo иммуномодулирующего IL12 и иммуногенной клеточной смерти, индуцированной посредством TT3-mtRep. Синергические противораковые эффекты оценивали посредством изменений массы тела (ФИГ. 5A), IFNr в сыворотке (ФИГ. 5B), площади опухоли (ФИГ. 5C) и кривой выживаемости (ФИГ. 5D). На ФИГ. 5E показано, что обработка TT3-mtRep-IL12 может предотвращать рецидив опухоли у излеченных мышей.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Настоящее изобретение основано, по меньшей мере частично, на неожиданном открытии, что при инъекции в участок опухоли, синтетический онколитический вирус, содержащий липидную наночастицу, содержащую один или несколько типов липидов и самоамплифицирующийся репликон РНК, содержащий последовательность, кодирующую молекулу IL-12, успешно запускает противораковый иммунный ответ локальных опухолей и обеспечивает системный иммунитет против отдаленных опухолей.

I. Синтетический онколитический вирус

Настоящее изобретение, по меньшей мере частично, относится к синтетическому онколитическому вирусу. В рамках изобретения, термин «синтетический» относится к неприродному или сконструированному онколитическому вирусу, как описано в настоящем описании, который включает липидную наночастицу и самоамплифицирующийся репликон РНК, содержащий последовательность, кодирующую молекулу IL-12.

В некоторых аспектах, настоящее изобретение относится к использованию липидных наночастиц (LNP), которые сами по себе являются способными индуцировать иммуногенную клеточную смерть, для облегчения доставки биологически активного средства (например, самоамплифицирующегося репликона РНК, кодирующего молекулу IL-12) в клетки опухолей.

(i) Липидная наночастица

Настоящее изобретение, по меньшей мере частично, относится к доставке биологически активных молекул в клетки с использованием липидных наночастиц. Конкретно, изобретение относится к синтетическому онколитическому вирусу, содержащему экспрессирующий IL-12 самоамплифицирующийся репликон РНК, инкапсулированный посредством липидных наночастиц, к его композиции, и к способам использования синтетического онколитического вируса и его композиции для лечения субъекта, имеющего злокачественную опухоль или как подозревают, имеющего злокачественную опухоль.

Липидная наночастица (LNP), в рамках изобретения, относится к везикуле, такой как сферическая везикула, имеющей непрерывный липидный бислой. Липидные наночастицы можно использовать в способах, посредством которых фармацевтические терапевтические средства доставляют в целевые локализации. Неограничивающие примеры LNP включают липосомы, болаамфифилы, твердые липидные наночастицы (SLN), наноструктурированные липидные носители (NLC), и монослойные мембранные структуры (например, археосомы и мицеллы).

Липидная наночастица, в рамках изобретения, содержит один или несколько типов липидов. Липид, в рамках изобретения, относится к группе органических соединений, которые включают, но без ограничения, сложные эфиры жирных кислот, и в некоторых вариантах осуществления, характеризуются тем, что являются нерастворимыми в воде, но растворимыми в многих органических растворителях. Их обычно разделяют по меньшей мере на три класса: (1) «простые липиды», которые включают жиры и масла, так же как воски; (2) «сложные липиды», которые включают фосфолипиды и гликолипиды; (3) «производные липиды», такие как стероиды. Неограничивающие примеры липидов включают триглицериды (например, тристеарин), диглицериды (например, глицеринбегенат), моноглицериды (например, глицеринмоностеарат), жирные кислоты (например, стеариновую кислоту), стероиды (например, холестерин) и воски (например, цетиловый пальмитат). В некоторых вариантах осуществления, один или несколько типов липидов в LNP содержит катионный липид.

Катионный липид, в рамках изобретения, относится к любому из ряда видов липидов, которые могут нести суммарный положительный заряд при выбранном pH, таком как физиологический pH. Такие липиды включают, но без ограничения, N1,N3,N5-трис(3-(дидодециламино)пропил)бензол-1,3,5-трикарбоксамид (TT3), хлорид N-(2,3-диолеоилокси)пропил)-N,N,N-триметиламмония (DOTAP); липофектамин; 1,2-дилинолеилокси-N,N-диметиламинопропан (DLinDMA), 1,2-дилиноленилокси-N,N-диметиламинопропан (DLenDMA), диоктадецилдиметиламмоний (DODMA), дистеарилдиметиламмоний (DSDMA), хлорид N,N-диолеил-N,N-диметиламмония (DODAC); хлорид N-(2,3-диолеилокси)пропил)-N,N,N-триметиламмония (DOTMA); бромид N,N-дистеарил-N,N-диметиламмония (DDAB); 3-(N-(N',N'-диметиламиноэтан)-карбамоил)холестерин (DC-Chol) и бромид N-(1,2-димиристилоксипроп-3-ил)-N,N-диметил-N-гидроксиэтиламмония (DMRIE).

В некоторых вариантах осуществления, катионный липид представляет собой TT3. TT3, в рамках изобретения, является способным формировать липидные наночастицы для доставки различных биологических действующих веществ в клетки. Кроме того, по настоящему изобретению показано также, что не нагруженный TT3-LNP может индуцировать иммуногенную клеточную смерть (ICD) в клетках злокачественных опухолей in vivo и in vitro. Иммуногенная клеточную смерть, как описано в настоящем описании, относится к форме клеточной смерти, которая может индуцировать эффективный иммунный ответ посредством активации дендритных клеток (DC) и являющейся следствием активации специфического ответа T-клеток. В некоторых вариантах осуществления, клетки, которые подвергаются иммуногенной клеточной смерти (ICD), представляют собой клетки опухолей. Иммуногенная смерть клетки опухоли может запускать эффективный противоопухолевый иммунный ответ. В некоторых вариантах осуществления, синтетический онколитический вирус содержит TT3-LNP, инкапсулирующую самоамплифицирующийся репликон РНК, кодирующий только репортерный ген (TT3-LNP-репликон РНК). Самоамплифицирующийся репликон РНК может действовать синергически с TT3-LNP для индукции повышения уровня ICD в клетках опухолей, по сравнению с TT3-LNP отдельно. В других вариантах осуществления, синтетический онколитический вирус содержит TT3-LNP, инкапсулирующую самоамплифицирующийся репликон РНК, кодирующий молекулу IL-12. IL-12, который представляет собой иммунорегуляторный цитокин, вызывает сильный иммунный ответ против локальной опухоли. Кроме того, комбинация TT3-LNP, самоамплифицирующегося репликона РНК и экспрессии IL-12, не только является эффективной для синергического ингибирования клеток опухолей на месте, но также вызывает системный противоопухолевый иммунный ответ для уничтожения клеток отдаленных опухолей и предотвращения рецидива опухолей.

В некоторых вариантах осуществления, катионный липид представляет собой DOTAP. DOTAP, в рамках изобретения, также является способным формировать липидные наночастицы. DOTAP может быть использован для высокоэффективной трансфекции ДНК, включая искусственные хромосомы дрожжей (YAC), в эукариотические клетки для временной или стабильной экспрессии гена, и также является пригодным для эффективного переноса других отрицательно заряженных молекул, таких как РНК, олигонуклеотиды, нуклеотиды, рибонуклеопротеиновые (RNP) комплексы и белки, в образцы клеток млекопитающих для исследований.

В других вариантах осуществления, катионный липид представляет собой липофектамин. Липофектамин, в рамках изобретения, представляет собой общераспространенный реагент для трансфекции, производимый и продаваемый в Invitrogen, используемый в молекулярной и клеточной биологии. Его используют для увеличения эффективности трансфекции РНК (включая мРНК и миРНК) или плазмидной ДНК в культурах клеток in vitro посредством липофекции. Липофектамин содержит липидные субъединицы, которые могут формировать липосомы или липидные наночастицы в водном окружении, которые захватывают трансфекционную нагрузку, например, самоамплифицирующийся репликон РНК. Содержащие РНК липосомы (положительно заряженные на своей поверхности) могут сливаться с отрицательно заряженной плазматической мембраной живых клеток, благодаря опосредованному нейтральным совместным липидом слиянию липосомы с клеточной мембраной, позволяющему грузу молекул нуклеиновой кислоты пересекать ее до цитоплазмы для репликации или экспрессии.

В некоторых вариантах осуществления, LNP состоят в первую очередь из катионных липидов, вместе с другими липидными ингредиентами. Они, как правило, включают другие липидные молекулы, принадлежащие, но без ограничения, к классу фосфатидилхолина (PC) (например, 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DSPC), и 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE)), стеролы (например, холестерин) и конъюгаты полиэтиленгликоль (PEG)-липид (например, 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[фолат(полиэтиленгликоль)-2000 (DSPE-PEG2000) и 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[метокси(полиэтиленгликоль)-2000 (C14-PEG2000). В таблице 1 показан состав двух LNP, TT3-LNP и DOTAP-LNP.

Таблица 1:

DOTAP-LNP DOTAP DSPC Холестерин DSPE-PEG2000 Молярное соотношение 40 10 48 2 TT3-LNP TT3 DOPE Холестерин C14-PEG2000 Молярное соотношение 20 30 40 0,75

Размер частиц липидных наночастиц может влиять на скорость высвобождения лекарственного средства, биораспределение, мукоадгезию, клеточное поглощение воды и обмен буфера с внутренней частью наночастиц, и диффузию белка. В некоторых вариантах осуществления, диаметр LNP лежит в диапазоне от 30 до 150 нм. В некоторых вариантах осуществления, диаметр LNP лежит в диапазоне от 100 до 120 нм. В некоторых вариантах осуществления, диаметр LNP может составлять 30 нм, 40 нм, 50 нм, 60 нм, 70 нм, 80 нм, 90 нм, 100 нм, 101 нм, 102 нм, 103 нм, 104 нм, 105 нм, 106 нм, 107 нм, 108 нм, 109 нм, 110 нм, 111 нм, 112 нм, 113 нм, 114 нм, 115 нм, 116 нм, 117 нм, 118 нм, 119 нм или 120 нм.

Дзета-потенциал представляет собой показатель эффективного электрического заряда на поверхности липидной наночастицы. Амплитуда дзета-потенциала предоставляет информацию о стабильности частицы. В некоторых вариантах осуществления, дзета-потенциал LNP лежит в диапазоне от -10 милливольт (мВ) до 25 мВ. В некоторых вариантах осуществления, дзета-потенциал LNP лежит в диапазоне от 3 до 6 мВ. В некоторых вариантах осуществления, дзета-потенциал LNP может составлять 3 мВ, 3,1 мВ, 3,2 мВ, 3,3 мВ, 3,4 мВ, 3,5 мВ, 3,6 мВ, 3,7 мВ, 3,8 мВ, 3,9 мВ, 4 мВ, 4,1 мВ, 4,2 мВ, 4,3 мВ, 4,4 мВ, 4,5 мВ, 4,6 мВ, 4,7 мВ, 4,8 мВ, 4,9 мВ, 5 мВ, 5,1 мВ, 5,2 мВ, 5,3 мВ, 5,4 мВ, 5,5 мВ, 5,6 мВ, 5,7 мВ, 5,8 мВ, 5,9 мВ и 6 мВ.

Настоящее изобретение, по меньшей мере частично, относится к инкапсуляции репликона РНК с использованием липидных наночастиц. В некоторых вариантах осуществления, массовое соотношение между LNP и репликоном РНК лежит в диапазоне от 1:2 до 2:1. В некоторых вариантах осуществления, массовое соотношение между LNP и репликоном РНК может составлять 1:2, 1:1,5, 1:1,2, 1:1, 1,1:1, 1,2:1, 1,3:1, 1,4:1, 1,5:1, 1,6:1, 1,7:1, 1,8:1, 1,9:1 и 2:1. В некоторых вариантах осуществления, массовое соотношение между LNP и репликоном РНК может составлять 1:1.

(ii) Самоамплифицирующийся репликон РНК

По настоящему изобретению, самоамплифицирующийся репликон РНК, кодирующий молекулу IL-12 под контролем субгеномного промотора, вместо структурных белков, необходимых для репликации вируса, представляют значительный интерес для иммунотерапии злокачественных опухолей. В рамках изобретения, термин «самоамплифицирующийся репликон РНК» относится к самореплицирующемуся генетическому элементу, содержащему РНК, которая реплицируется от одной точки начала репликации. Термины «репликон РНК» и «самоамплифицирующийся репликон РНК» использованы взаимозаменяемо в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления, самоамплифицирующийся репликон РНК представляет собой вирусный репликон.

Вирус представляет собой небольшой патоген, способный к репликации только внутри живой клетки-хозяина (например, прокариотических и эукариотических клеток). Вне живых клеток, вирусы существуют в форме независимых частиц (например, вирусных частиц или вирионов), которые содержат генетический материал в форме ДНК или РНК, последняя из которых может являться одноцепочечной или двухцепочечной. Вирусы с ДНК обозначены как ДНК-вирусы, и вирусы с РНК обозначены как РНК-вирусы. В некоторых случаях, вирус содержит ассоциированные с нуклеиновой кислотой белки, и комбинация вируса и ассоциированных с нуклеиновой кислотой белков обозначена как нуклеопротеин. В дополнение к генетическому материалу, вирусы имеют одинарную или двойную белковую оболочку, также известную как капсид, которая облегчает прикрепление вируса к рецепторам живой клетки-хозяина в ходе инфекции и защищает генетический материал вируса от ферментной деградации. Комбинация нуклеопротеина и капсида обозначена как нуклеокапсид. В некоторых случаях, вирусы имеют липидную бислойную оболочку, с шипами из кодированных вирусом, гликозилированных (трансмембранных) ассоциированных с мембраной белков. После инфекции вирусом живой клетки-хозяина, вирус является зависимым от живой клетки-хозяина для предоставления аппарата для его репликации и последующего размножения. Вирусный геном кодирует некоторые структурные белки и неструктурные регуляторные белки.

В рамках изобретения, термин «субгеном» или «субгеномный» относится к меньшей секции полного генома репликона. Соответственно, субгеномная транскрипция, в рамках изобретения, относится к транскрипции одного или нескольких генов в геноме репликона, но не всех генов, составляющих геном репликона. В одном варианте осуществления, субгеномная транскрипция относится к транскрипции генов, представляющих экспериментальный или терапевтический интерес, которые описаны в другом месте в настоящем описании.

Термин «структурный белок», как используют в контексте вирусов в настоящем описании, относится к белкам, составляющим структурные компоненты зрелых собранных вирусных частиц или вирионов. Неограничивающие примеры таких структурных белков включают коровые нуклеокапсидные белки (например, белки gag), ферменты, упакованные в вирусную частицу (например, белки pol), и компоненты мембраны (например, белки env). В отличие от этого, термин «неструктурные белок», как используют в контексте вирусов в настоящем описании, относятся к белкам, которые экспрессируются внутри клетки-хозяина, но не составляют структурные компоненты вирусной частицы или вириона. Некоторые из ролей неструктурных белков включают, но без ограничения, формирование репликона, иммуномодуляцию и трансактивацию генов структурных белков.

В некоторых вариантах осуществления, самоамплифицирующийся репликон РНК происходит из альфавируса. В отличие от мРНК хозяина, РНК альфавирусного репликона кодируют набор из четырех неструктурных белков (nsP 1-4), которые как являются ответственными за репликацию генома, так и, когда сконструированы для включения генов, кодирующих невирусные продукты, таких как молекулы IL-12, обеспечивают транскрипцию таких невирусных продуктов под контролем субгеномного промотора. Альфавирусы являются частью группы IV семейства вирусов Togaviridae, имеют положительный смысловой, одноцепочечный РНК-геном, и характеризуются икосаэдрическим нуклеокапсидом. Другие неограничивающие примеры вирусов группы IV могут представлять собой Astroviridae, Caliciviridae, Coronaviridae, Flaviviridae, Picornaviridae, Arteriviridae и Togaviridae. Род альфавирус включает 26 оболочечных вирусов, которые инфицируют эукариот. Альфавирусы имеют широкий диапазон хозяев и передаются посредством комаров и питающихся кровью членистоногих. Неограничивающие примеры альфавирусов включают вирус венесуэльского энцефалита лошадей (VEE), вирус леса Семлики(SF), вирус Синдбис (SIN), вирус восточного энцефалита лошадей (EEE), вирус западного энцефалита лошадей (WEE), вирус Эверглейдс (EVE), вирус Мукамбо (MUC), вирус Пиксуна (PIX), вирус леса Семлики (SF), вирус Миддельбург (MID), вирус Чикунгунья (CHIK), вирус О'Ньонг-ньонг (ONN), вирус реки Росс (RR), вирус леса Барма (BF), вирус Гета (GET), вирус Сагияма (SAG), вирус Бебару (BEB), вирус Майаро (MAY), вирус Уна (UNA), вирус Аура (AURA), вирус Бабанки (BAB), вирус Хайлендс-Джи (HJ) и вирус Форт-Морган (FM).

По настоящему изобретению, по меньшей мере частично, альфавирусный репликон представляет собой репликон альфавируса VEE. Вирус VEE представляет собой вирусный патоген, как правило, переносимый комарами, который вызывает VEE или энцефаломиелит, преимущественно у видов лошадей. Люди, однако, могут также заражаться VEE, и люди с ослабленной иммунной системой подвержены особенному риску наличия тяжелых осложнений, если инфицированы VEE. Вирион VEE является сферическим и имеет липидную мембрану с гликопротеиновыми поверхностными белками, распределенными по внешней поверхности. Как правило, VEE имеет геном приблизительно 11,45 т.п.о., исключая 5'-концевой кэп и 3'-концевой поли(A)-участок, и содержит 4 неструктурных белка (nsP) и 5 структурных белков. Неструктурные белки включают nsP1, nsP2, nsP3 и nsP4, в то время как структурная область кодирует белки C, E3, E2, 6K и E1. В некоторых случаях, самоамплифицирующийся репликон РНК представляет собой репликон РНК WT, происходящий из VEE. Последовательность репликона РНК WT вируса VEE указана в SEQ ID NO: 1:

ATGGGCGGCGCATGAGAGAAGCCCAGACCAATTACCTACCCAAAATGGAGAAAGTTCACGTTGACATCGAGGAAGACAGCCCATTCCTCAGAGCTTTGCAGCGGAGCTTCCCGCAGTTTGAGGTAGAAGCCAAGCAGGTCACTGATAATGACCATGCTAATGCCAGAGCGTTTTCGCATCTGGCTTCAAAACTGATCGAAACGGAGGTGGACCCATCCGACACGATCCTTGACATTGGAAGTGCGCCCGCCCGCAGAATGTATTCTAAGCACAAGTATCATTGTATCTGTCCGATGAGATGTGCGGAAGATCCGGACAGATTGTATAAGTATGCAACTAAGCTGAAGAAAAACTGTAAGGAAATAACTGATAAGGAATTGGACAAGAAAATGAAGGAGCTGGCCGCCGTCATGAGCGACCCTGACCTGGAAACTGAGACTATGTGCCTCCACGACGACGAGTCGTGTCGCTACGAAGGGCAAGTCGCTGTTTACCAGGATGTATACGCGGTTGACGGACCGACAAGTCTCTATCACCAAGCCAATAAGGGAGTTAGAGTCGCCTACTGGATAGGCTTTGACACCACCCCTTTTATGTTTAAGAACTTGGCTGGAGCATATCCATCATACTCTACCAACTGGGCCGACGAAACCGTGTTAACGGCTCGTAACATAGGCCTATGCAGCTCTGACGTTATGGAGCGGTCACGTAGAGGGATGTCCATTCTTAGAAAGAAGTATTTGAAACCATCCAACAATGTTCTATTCTCTGTTGGCTCGACCATCTACCACGAGAAGAGGGACTTACTGAGGAGCTGGCACCTGCCGTCTGTATTTCACTTACGTGGCAAGCAAAATTACACATGTCGGTGTGAGACTATAGTTAGTTGCGACGGGTACGTCGTTAAAAGAATAGCTATCAGTCCAGGCCTGTATGGGAAGCCTTCAGGCTATGCTGCTACGATGCACCGCGAGGGATTCTTGTGCTGCAAAGTGACAGACACATTGAACGGGGAGAGGGTCTCTTTTCCCGTGTGCACGTATGTGCCAGCTACATTGTGTGACCAAATGACTGGCATACTGGCAACAGATGTCAGTGCGGACGACGCGCAAAAACTGCTGGTTGGGCTCAACCAGCGTATAGTCGTCAACGGTCGCACCCAGAGAAACACCAATACCATGAAAAATTACCTTTTGCCCGTAGTGGCCCAGGCATTTGCTAGGTGGGCAAAGGAATATAAGGAAGATCAAGAAGATGAAAGGCCACTAGGACTACGAGATAGACAGTTAGTCATGGGGTGTTGTTGGGCTTTTAGAAGGCACAAGATAACATCTATTTATAAGCGCCCGGATACCCAAACCATCATCAAAGTGAACAGCGATTTCCACTCATTCGTGCTGCCCAGGATAGGCAGTAACACATTGGAGATCGGGCTGAGAACAAGAATCAGGAAAATGTTAGAGGAGCACAAGGAGCCGTCACCTCTCATTACCGCCGAGGACGTACAAGAAGCTAAGTGCGCAGCCGATGAGGCTAAGGAGGTGCGTGAAGCCGAGGAGTTGCGCGCAGCTCTACCACCTTTGGCAGCTGATGTTGAGGAGCCCACTCTGGAGGCAGACGTCGACTTGATGTTACAAGAGGCTGGGGCCGGCTCAGTGGAGACACCTCGTGGCTTGATAAAGGTTACCAGCTACGATGGCGAGGACAAGATCGGCTCTTACGCTGTGCTTTCTCCGCAGGCTGTACTCAAGAGTGAAAAATTATCTTGCATCCACCCTCTCGCTGAACAAGTCATAGTGATAACACACTCTGGCCGAAAAGGGCGTTATGCCGTGGAACCATACCATGGTAAAGTAGTGGTGCCAGAGGGACATGCAATACCCGTCCAGGACTTTCAAGCTCTGAGTGAAAGTGCCACCATTGTGTACAACGAACGTGAGTTCGTAAACAGGTACCTGCACCATATTGCCACACATGGAGGAGCGCTGAACACTGATGAAGAATATTACAAAACTGTCAAGCCCAGCGAGCACGACGGCGAATACCTGTACGACATCGACAGGAAACAGTGCGTCAAGAAAGAACTAGTCACTGGGCTAGGGCTCACAGGCGAGCTGGTGGATCCTCCCTTCCATGAATTCGCCTACGAGAGTCTGAGAACACGACCAGCCGCTCCTTACCAAGTACCAACCATAGGGGTGTATGGCGTGCCAGGATCAGGCAAGTCTGGCATCATTAAAAGCGCAGTCACCAAAAAAGATCTAGTGGTGAGCGCCAAGAAAGAAAACTGTGCAGAAATTATAAGGGACGTCAAGAAAATGAAAGGGCTGGACGTCAATGCCAGAACTGTGGACTCAGTGCTCTTGAATGGATGCAAACACCCCGTAGAGACCCTGTATATTGACGAAGCTTTTGCTTGTCATGCAGGTACTCTCAGAGCGCTCATAGCCATTATAAGACCTAAAAAGGCAGTGCTCTGCGGGGATCCCAAACAGTGCGGTTTTTTTAACATGATGTGCCTGAAAGTGCATTTTAACCACGAGATTTGCACACAAGTCTTCCACAAAAGCATCTCTCGCCGTTGCACTAAATCTGTGACTTCGGTCGTCTCAACCTTGTTTTACGACAAAAAAATGAGAACGACGAATCCGAAAGAGACTAAGATTGTGATTGACACTACCGGCAGTACCAAACCTAAGCAGGACGATCTCATTCTCACTTGTTTCAGAGGGTGGGTGAAGCAGTTGCAAATAGATTACAAAGGCAACGAAATAATGACGGCAGCTGCCTCTCAAGGGCTGACCCGTAAAGGTGTGTATGCCGTTCGGTACAAGGTGAATGAAAATCCTCTGTACGCACCCACCTCAGAACATGTGAACGTCCTACTGACCCGCACGGAGGACCGCATCGTGTGGAAAACACTAGCCGGCGACCCATGGATAAAAACACTGACTGCCAAGTACCCTGGGAATTTCACTGCCACGATAGAGGAGTGGCAAGCAGAGCATGATGCCATCATGAGGCACATCTTGGAGAGACCGGACCCTACCGACGTCTTCCAGAATAAGGCAAACGTGTGTTGGGCCAAGGCTTTAGTGCCGGTGCTGAAGACCGCTGGCATAGACATGACCACTGAACAATGGAACACTGTGGATTATTTTGAAACGGACAAAGCTCACTCAGCAGAGATAGTATTGAACCAACTATGCGTGAGGTTCTTTGGACTCGATCTGGACTCCGGTCTATTTTCTGCACCCACTGTTCCGTTATCCATTAGGAATAATCACTGGGATAACTCCCCGTCGCCTAACATGTACGGGCTGAATAAAGAAGTGGTCCGTCAGCTCTCTCGCAGGTACCCACAACTGCCTCGGGCAGTTGCCACTGGAAGAGTCTATGACATGAACACTGGTACACTGCGCAATTATGATCCGCGCATAAACCTAGTACCTGTAAACAGAAGACTGCCTCATGCTTTAGTCCTCCACCATAATGAACACCCACAGAGTGACTTTTCTTCATTCGTCAGCAAATTGAAGGGCAGAACTGTCCTGGTGGTCGGGGAAAAGTTGTCCGTCCCAGGCAAAATGGTTGACTGGTTGTCAGACCGGCCTGAGGCTACCTTCAGAGCTCGGCTGGATTTAGGCATCCCAGGTGATGTGCCCAAATATGACATAATATTTGTTAATGTGAGGACCCCATATAAATACCATCACTATCAGCAGTGTGAAGACCATGCCATTAAGCTTAGCATGTTGACCAAGAAAGCTTGTCTGCATCTGAATCCCGGCGGAACCTGTGTCAGCATAGGTTATGGTTACGCTGACAGGGCCAGCGAAAGCATCATTGGTGCTATAGCGCGGCAGTTCAAGTTTTCCCGGGTATGCAAACCGAAATCCTCACTTGAAGAGACGGAAGTTCTGTTTGTATTCATTGGGTACGATCGCAAGGCCCGTACGCACAATTCTTACAAGCTTTCATCAACCTTGACCAACATTTATACAGGTTCCAGACTCCACGAAGCCGGATGTGCACCCTCATATCATGTGGTGCGAGGGGATATTGCCACGGCCACCGAAGGAGTGATTATAAATGCTGCTAACAGCAAAGGACAACCTGGCGGAGGGGTGTGCGGAGCGCTGTATAAGAAATTCCCGGAAAGCTTCGATTTACAGCCGATCGAAGTAGGAAAAGCGCGACTGGTCAAAGGTGCAGCTAAACATATCATTCATGCCGTAGGACCAAACTTCAACAAAGTTTCGGAGGTTGAAGGTGACAAACAGTTGGCAGAGGCTTATGAGTCCATCGCTAAGATTGTCAACGATAACAATTACAAGTCAGTAGCGATTCCACTGTTGTCCACCGGCATCTTTTCCGGGAACAAAGATCGACTAACCCAATCATTGAACCATTTGCTGACAGCTTTAGACACCACTGATGCAGATGTAGCCATATACTGCAGGGACAAGAAATGGGAAATGACTCTCAAGGAAGCAGTGGCTAGGAGAGAAGCAGTGGAGGAGATATGCATATCCGACGACTCTTCAGTGACAGAACCTGATGCAGAGCTGGTGAGGGTGCATCCGAAGAGTTCTTTGGCTGGAAGGAAGGGCTACAGCACAAGCGATGGCAAAACTTTCTCATATTTGGAAGGGACCAAGTTTCACCAGGCGGCCAAGGATATAGCAGAAATTAATGCCATGTGGCCCGTTGCAACGGAGGCCAATGAGCAGGTATGCATGTATATCCTCGGAGAAAGCATGAGCAGTATTAGGTCGAAATGCCCCGTCGAAGAGTCGGAAGCCTCCACACCACCTAGCACGCTGCCTTGCTTGTGCATCCATGCCATGACTCCAGAAAGAGTACAGCGCCTAAAAGCCTCACGTCCAGAACAAATTACTGTGTGCTCATCCTTTCCATTGCCGAAGTATAGAATCACTGGTGTGCAGAAGATCCAATGCTCCCAGCCTATATTGTTCTCACCGAAAGTGCCTGCGTATATTCATCCAAGGAAGTATCTCGTGGAAACACCACCGGTAGACGAGACTCCGGAGCCATCGGCAGAGAACCAATCCACAGAGGGGACACCTGAACAACCACCACTTATAACCGAGGATGAGACCAGGACTAGAACGCCTGAGCCGATCATCATCGAAGAGGAAGAAGAGGATAGCATAAGTTTGCTGTCAGATGGCCCGACCCACCAGGTGCTGCAAGTCGAGGCAGACATTCACGGGCCGCCCTCTGTATCTAGCTCATCCTGGTCCATTCCTCATGCATCCGACTTTGATGTGGACAGTTTATCCATACTTGACACCCTGGAGGGAGCTAGCGTGACCAGCGGGGCAACGTCAGCCGAGACTAACTCTTACTTCGCAAAGAGTATGGAGTTTCTGGCGCGACCGGTGCCTGCGCCTCGAACAGTATTCAGGAACCCTCCACATCCCGCTCCGCGCACAAGAACACCGTCACTTGCACCCAGCAGGGCCTGCTCGAGAACCAGCCTAGTTTCCACCCCGCCAGGCGTGAATAGGGTGATCACTAGAGAGGAGCTCGAGGCGCTTACCCCGTCACGCACTCCTAGCAGGTCGGTCTCGAGAACCAGCCTGGTCTCCAACCCGCCAGGCGTAAATAGGGTGATTACAAGAGAGGAGTTTGAGGCGTTCGTAGCACAACAACAATGACGGTTTGATGCGGGTGCATACATCTTTTCCTCCGACACCGGTCAAGGGCATTTACAACAAAAATCAGTAAGGCAAACGGTGCTATCCGAAGTGGTGTTGGAGAGGACCGAATTGGAGATTTCGTATGCCCCGCGCCTCGACCAAGAAAAAGAAGAATTACTACGCAAGAAATTACAGTTAAATCCCACACCTGCTAACAGAAGCAGATACCAGTCCAGGAAGGTGGAGAACATGAAAGCCATAACAGCTAGACGTATTCTGCAAGGCCTAGGGCATTATTTGAAGGCAGAAGGAAAAGTGGAGTGCTACCGAACCCTGCATCCTGTTCCTTTGTATTCATCTAGTGTGAACCGTGCCTTTTCAAGCCCCAAGGTCGCAGTGGAAGCCTGTAACGCCATGTTGAAAGAGAACTTTCCGACTGTGGCTTCTTACTGTATTATTCCAGAGTACGATGCCTATTTGGACATGGTTGACGGAGCTTCATGCTGCTTAGACACTGCCAGTTTTTGCCCTGCAAAGCTGCGCAGCTTTCCAAAGAAACACTCCTATTTGGAACCCACAATACGATCGGCAGTGCCTTCAGCGATCCAGAACACGCTCCAGAACGTCCTGGCAGCTGCCACAAAAAGAAATTGCAATGTCACGCAAATGAGAGAATTGCCCGTATTGGATTCGGCGGCCTTTAATGTGGAATGCTTCAAGAAATATGCGTGTAATAATGAATATTGGGAAACGTTTAAAGAAAACCCCATCAGGCTTACTGAAGAAAACGTGGTAAATTACATTACCAAATTAAAAGGACCAAAAGCTGCTGCTCTTTTTGCGAAGACACATAATTTGAATATGTTGCAGGACATACCAATGGACAGGTTTGTAATGGACTTAAAGAGAGACGTGAAAGTGACTCCAGGAACAAAACATACTGAAGAACGGCCCAAGGTACAGGTGATCCAGGCTGCCGATCCGCTAGCAACAGCGTATCTGTGCGGAATCCACCGAGAGCTGGTTAGGAGATTAAATGCGGTCCTGCTTCCGAACATTCATACACTGTTTGATATGTCGGCTGAAGACTTTGACGCTATTATAGCCGAGCACTTCCAGCCTGGGGATTGTGTTCTGGAAACTGACATCGCGTCGTTTGATAAAAGTGAGGACGACGCCATGGCTCTGACCGCGTTAATGATTCTGGAAGACTTAGGTGTGGACGCAGAGCTGTTGACGCTGATTGAGGCGGCTTTCGGCGAAATTTCATCAATACATTTGCCCACTAAAACTAAATTTAAATTCGGAGCCATGATGAAATCTGGAATGTTCCTCACACTGTTTGTGAACACAGTCATTAACATTGTAATCGCAAGCAGAGTGTTGAGAGAACGGCTAACCGGATCACCATGTGCAGCATTCATTGGAGATGACAATATCGTGAAAGGAGTCAAATCGGACAAATTAATGGCAGACAGGTGCGCCACCTGGTTGAATATGGAAGTCAAGATTATAGATGCTGTGGTGGGCGAGAAAGCGCCTTATTTCTGTGGAGGGTTTATTTTGTGTGACTCCGTGACCGGCACAGCGTGCCGTGTGGCAGACCCCCTAAAAAGGCTGTTTAAGCTTGGCAAACCTCTGGCAGCAGACGATGAACATGATGATGACAGGAGAAGGGCATTGCATGAAGAGTCAACACGCTGGAACCGAGTGGGTATTCTTTCAGAGCTGTGCAAGGCAGTAGAATCAAGGTATGAAACCGTAGGAACTTCCATCATAGTTATGGCCATGACTACTCTAGCTAGCAGTGTTAAATCATTCAGCTACCTGAGAGGGGCCCCTATAACTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAGTCTAGCATATGGGCGCGCCCTCAGCATCGATTGAATTGGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAACATGGCCATCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCACATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCTCCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGCGCCCTGAAGGGCGAGATCAAGCAGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACGACGCTGAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACAACGTCAACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAGGAATTGGCAAGCTGCTTACATAGAACTCGCGGCGATTGGCATGCCGCCTTAAAATTTTTATTTTATTTTTCTTTTCTTTTCCGAATCGGATTTTGTTTTTAATATTTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACGCGTCGAGGGGAATTAATTCTTGAAGACGAAAGGGCCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCATTGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGAGCTCTAATACGACTCACTATAG (SEQ ID NO: 1)

Самоамплифицирующийся репликон РНК, как описано в настоящем описании, содержит нуклеотидную последовательность, по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичную SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления, самоамплифицирующийся репликон РНК является по меньшей мере на 90% идентичным SEQ ID NO: 1.

Самоамплифицирующаяся РНК (репликон) представляет собой многообещающую новую платформу для генотерапии, но применения все еще ограничены короткой персистенцией экспрессии в некоторых типах клеток и низкими уровнями экспрессии трансгена in vivo. Эволюция in vitro синтетического репликона РНК предоставляет потенциально мощный способ модификации и улучшения экспрессии репликона как in vitro, так и in vivo. С использованием способа эволюции in vitro, в nsP2 и nsP3 из репликона венесуэльского энцефалита лошадей (VEE) идентифицировали мутации, стимулирующие субгеномную экспрессию в клетках человека.

В некоторых вариантах осуществления, самоамплифицирующийся репликон РНК содержит мутации, придающие репликону РНК способность экспрессировать молекулу IL-12 на более высоком уровне, по сравнению с репликоном РНК, содержащим SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления, самоамплифицирующийся репликон РНК содержит по меньшей мере одну точечную мутацию в положении нуклеиновой кислоты 3936 и/или 4758 репликона WT из SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления, самоамплифицирующийся репликон РНК содержит по меньшей мере одну из следующих точечных мутаций: гуанина до цитозина в положении 3936 (G3936C) и аденина до гуанина в положении 4758 (A4758G) последовательности репликона WT из SEQ ID NO: 1. Мутация G3936C может приводить к замене глицина на аргинин в аминокислотном остатке 1309 (G1309R). Мутация A4758G может приводить к замене серина на глицин в аминокислотном остатке 1583 (S1583G). В некоторых вариантах осуществления, последовательность мутантного самоамплифицирующегося репликона РНК (mtРепликона РНК) указана в SEQ ID NO: 2 с выделенными мутациями (жирный, подчеркнутый текст):

ATGGGCGGCGCATGAGAGAAGCCCAGACCAATTACCTACCCAAAATGGAGAAAGTTCACGTTGACATCGAGGAAGACAGCCCATTCCTCAGAGCTTTGCAGCGGAGCTTCCCGCAGTTTGAGGTAGAAGCCAAGCAGGTCACTGATAATGACCATGCTAATGCCAGAGCGTTTTCGCATCTGGCTTCAAAACTGATCGAAACGGAGGTGGACCCATCCGACACGATCCTTGACATTGGAAGTGCGCCCGCCCGCAGAATGTATTCTAAGCACAAGTATCATTGTATCTGTCCGATGAGATGTGCGGAAGATCCGGACAGATTGTATAAGTATGCAACTAAGCTGAAGAAAAACTGTAAGGAAATAACTGATAAGGAATTGGACAAGAAAATGAAGGAGCTGGCCGCCGTCATGAGCGACCCTGACCTGGAAACTGAGACTATGTGCCTCCACGACGACGAGTCGTGTCGCTACGAAGGGCAAGTCGCTGTTTACCAGGATGTATACGCGGTTGACGGACCGACAAGTCTCTATCACCAAGCCAATAAGGGAGTTAGAGTCGCCTACTGGATAGGCTTTGACACCACCCCTTTTATGTTTAAGAACTTGGCTGGAGCATATCCATCATACTCTACCAACTGGGCCGACGAAACCGTGTTAACGGCTCGTAACATAGGCCTATGCAGCTCTGACGTTATGGAGCGGTCACGTAGAGGGATGTCCATTCTTAGAAAGAAGTATTTGAAACCATCCAACAATGTTCTATTCTCTGTTGGCTCGACCATCTACCACGAGAAGAGGGACTTACTGAGGAGCTGGCACCTGCCGTCTGTATTTCACTTACGTGGCAAGCAAAATTACACATGTCGGTGTGAGACTATAGTTAGTTGCGACGGGTACGTCGTTAAAAGAATAGCTATCAGTCCAGGCCTGTATGGGAAGCCTTCAGGCTATGCTGCTACGATGCACCGCGAGGGATTCTTGTGCTGCAAAGTGACAGACACATTGAACGGGGAGAGGGTCTCTTTTCCCGTGTGCACGTATGTGCCAGCTACATTGTGTGACCAAATGACTGGCATACTGGCAACAGATGTCAGTGCGGACGACGCGCAAAAACTGCTGGTTGGGCTCAACCAGCGTATAGTCGTCAACGGTCGCACCCAGAGAAACACCAATACCATGAAAAATTACCTTTTGCCCGTAGTGGCCCAGGCATTTGCTAGGTGGGCAAAGGAATATAAGGAAGATCAAGAAGATGAAAGGCCACTAGGACTACGAGATAGACAGTTAGTCATGGGGTGTTGTTGGGCTTTTAGAAGGCACAAGATAACATCTATTTATAAGCGCCCGGATACCCAAACCATCATCAAAGTGAACAGCGATTTCCACTCATTCGTGCTGCCCAGGATAGGCAGTAACACATTGGAGATCGGGCTGAGAACAAGAATCAGGAAAATGTTAGAGGAGCACAAGGAGCCGTCACCTCTCATTACCGCCGAGGACGTACAAGAAGCTAAGTGCGCAGCCGATGAGGCTAAGGAGGTGCGTGAAGCCGAGGAGTTGCGCGCAGCTCTACCACCTTTGGCAGCTGATGTTGAGGAGCCCACTCTGGAGGCAGACGTCGACTTGATGTTACAAGAGGCTGGGGCCGGCTCAGTGGAGACACCTCGTGGCTTGATAAAGGTTACCAGCTACGATGGCGAGGACAAGATCGGCTCTTACGCTGTGCTTTCTCCGCAGGCTGTACTCAAGAGTGAAAAATTATCTTGCATCCACCCTCTCGCTGAACAAGTCATAGTGATAACACACTCTGGCCGAAAAGGGCGTTATGCCGTGGAACCATACCATGGTAAAGTAGTGGTGCCAGAGGGACATGCAATACCCGTCCAGGACTTTCAAGCTCTGAGTGAAAGTGCCACCATTGTGTACAACGAACGTGAGTTCGTAAACAGGTACCTGCACCATATTGCCACACATGGAGGAGCGCTGAACACTGATGAAGAATATTACAAAACTGTCAAGCCCAGCGAGCACGACGGCGAATACCTGTACGACATCGACAGGAAACAGTGCGTCAAGAAAGAACTAGTCACTGGGCTAGGGCTCACAGGCGAGCTGGTGGATCCTCCCTTCCATGAATTCGCCTACGAGAGTCTGAGAACACGACCAGCCGCTCCTTACCAAGTACCAACCATAGGGGTGTATGGCGTGCCAGGATCAGGCAAGTCTGGCATCATTAAAAGCGCAGTCACCAAAAAAGATCTAGTGGTGAGCGCCAAGAAAGAAAACTGTGCAGAAATTATAAGGGACGTCAAGAAAATGAAAGGGCTGGACGTCAATGCCAGAACTGTGGACTCAGTGCTCTTGAATGGATGCAAACACCCCGTAGAGACCCTGTATATTGACGAAGCTTTTGCTTGTCATGCAGGTACTCTCAGAGCGCTCATAGCCATTATAAGACCTAAAAAGGCAGTGCTCTGCGGGGATCCCAAACAGTGCGGTTTTTTTAACATGATGTGCCTGAAAGTGCATTTTAACCACGAGATTTGCACACAAGTCTTCCACAAAAGCATCTCTCGCCGTTGCACTAAATCTGTGACTTCGGTCGTCTCAACCTTGTTTTACGACAAAAAAATGAGAACGACGAATCCGAAAGAGACTAAGATTGTGATTGACACTACCGGCAGTACCAAACCTAAGCAGGACGATCTCATTCTCACTTGTTTCAGAGGGTGGGTGAAGCAGTTGCAAATAGATTACAAAGGCAACGAAATAATGACGGCAGCTGCCTCTCAAGGGCTGACCCGTAAAGGTGTGTATGCCGTTCGGTACAAGGTGAATGAAAATCCTCTGTACGCACCCACCTCAGAACATGTGAACGTCCTACTGACCCGCACGGAGGACCGCATCGTGTGGAAAACACTAGCCGGCGACCCATGGATAAAAACACTGACTGCCAAGTACCCTGGGAATTTCACTGCCACGATAGAGGAGTGGCAAGCAGAGCATGATGCCATCATGAGGCACATCTTGGAGAGACCGGACCCTACCGACGTCTTCCAGAATAAGGCAAACGTGTGTTGGGCCAAGGCTTTAGTGCCGGTGCTGAAGACCGCTGGCATAGACATGACCACTGAACAATGGAACACTGTGGATTATTTTGAAACGGACAAAGCTCACTCAGCAGAGATAGTATTGAACCAACTATGCGTGAGGTTCTTTGGACTCGATCTGGACTCCGGTCTATTTTCTGCACCCACTGTTCCGTTATCCATTAGGAATAATCACTGGGATAACTCCCCGTCGCCTAACATGTACGGGCTGAATAAAGAAGTGGTCCGTCAGCTCTCTCGCAGGTACCCACAACTGCCTCGGGCAGTTGCCACTGGAAGAGTCTATGACATGAACACTGGTACACTGCGCAATTATGATCCGCGCATAAACCTAGTACCTGTAAACAGAAGACTGCCTCATGCTTTAGTCCTCCACCATAATGAACACCCACAGAGTGACTTTTCTTCATTCGTCAGCAAATTGAAGGGCAGAACTGTCCTGGTGGTCGGGGAAAAGTTGTCCGTCCCAGGCAAAATGGTTGACTGGTTGTCAGACCGGCCTGAGGCTACCTTCAGAGCTCGGCTGGATTTAGGCATCCCAGGTGATGTGCCCAAATATGACATAATATTTGTTAATGTGAGGACCCCATATAAATACCATCACTATCAGCAGTGTGAAGACCATGCCATTAAGCTTAGCATGTTGACCAAGAAAGCTTGTCTGCATCTGAATCCCGGCGGAACCTGTGTCAGCATAGGTTATGGTTACGCTGACAGGGCCAGCGAAAGCATCATTGGTGCTATAGCGCGGCAGTTCAAGTTTTCCCGGGTATGCAAACCGAAATCCTCACTTGAAGAGACGGAAGTTCTGTTTGTATTCATTCGGTACGATCGCAAGGCCCGTACGCACAATTCTTACAAGCTTTCATCAACCTTGACCAACATTTATACAGGTTCCAGACTCCACGAAGCCGGATGTGCACCCTCATATCATGTGGTGCGAGGGGATATTGCCACGGCCACCGAAGGAGTGATTATAAATGCTGCTAACAGCAAAGGACAACCTGGCGGAGGGGTGTGCGGAGCGCTGTATAAGAAATTCCCGGAAAGCTTCGATTTACAGCCGATCGAAGTAGGAAAAGCGCGACTGGTCAAAGGTGCAGCTAAACATATCATTCATGCCGTAGGACCAAACTTCAACAAAGTTTCGGAGGTTGAAGGTGACAAACAGTTGGCAGAGGCTTATGAGTCCATCGCTAAGATTGTCAACGATAACAATTACAAGTCAGTAGCGATTCCACTGTTGTCCACCGGCATCTTTTCCGGGAACAAAGATCGACTAACCCAATCATTGAACCATTTGCTGACAGCTTTAGACACCACTGATGCAGATGTAGCCATATACTGCAGGGACAAGAAATGGGAAATGACTCTCAAGGAAGCAGTGGCTAGGAGAGAAGCAGTGGAGGAGATATGCATATCCGACGACTCTTCAGTGACAGAACCTGATGCAGAGCTGGTGAGGGTGCATCCGAAGAGTTCTTTGGCTGGAAGGAAGGGCTACAGCACAAGCGATGGCAAAACTTTCTCATATTTGGAAGGGACCAAGTTTCACCAGGCGGCCAAGGATATAGCAGAAATTAATGCCATGTGGCCCGTTGCAACGGAGGCCAATGAGCAGGTATGCATGTATATCCTCGGAGAAGGCATGAGCAGTATTAGGTCGAAATGCCCCGTCGAAGAGTCGGAAGCCTCCACACCACCTAGCACGCTGCCTTGCTTGTGCATCCATGCCATGACTCCAGAAAGAGTACAGCGCCTAAAAGCCTCACGTCCAGAACAAATTACTGTGTGCTCATCCTTTCCATTGCCGAAGTATAGAATCACTGGTGTGCAGAAGATCCAATGCTCCCAGCCTATATTGTTCTCACCGAAAGTGCCTGCGTATATTCATCCAAGGAAGTATCTCGTGGAAACACCACCGGTAGACGAGACTCCGGAGCCATCGGCAGAGAACCAATCCACAGAGGGGACACCTGAACAACCACCACTTATAACCGAGGATGAGACCAGGACTAGAACGCCTGAGCCGATCATCATCGAAGAGGAAGAAGAGGATAGCATAAGTTTGCTGTCAGATGGCCCGACCCACCAGGTGCTGCAAGTCGAGGCAGACATTCACGGGCCGCCCTCTGTATCTAGCTCATCCTGGTCCATTCCTCATGCATCCGACTTTGATGTGGACAGTTTATCCATACTTGACACCCTGGAGGGAGCTAGCGTGACCAGCGGGGCAACGTCAGCCGAGACTAACTCTTACTTCGCAAAGAGTATGGAGTTTCTGGCGCGACCGGTGCCTGCGCCTCGAACAGTATTCAGGAACCCTCCACATCCCGCTCCGCGCACAAGAACACCGTCACTTGCACCCAGCAGGGCCTGCTCGAGAACCAGCCTAGTTTCCACCCCGCCAGGCGTGAATAGGGTGATCACTAGAGAGGAGCTCGAGGCGCTTACCCCGTCACGCACTCCTAGCAGGTCGGTCTCGAGAACCAGCCTGGTCTCCAACCCGCCAGGCGTAAATAGGGTGATTACAAGAGAGGAGTTTGAGGCGTTCGTAGCACAACAACAATGACGGTTTGATGCGGGTGCATACATCTTTTCCTCCGACACCGGTCAAGGGCATTTACAACAAAAATCAGTAAGGCAAACGGTGCTATCCGAAGTGGTGTTGGAGAGGACCGAATTGGAGATTTCGTATGCCCCGCGCCTCGACCAAGAAAAAGAAGAATTACTACGCAAGAAATTACAGTTAAATCCCACACCTGCTAACAGAAGCAGATACCAGTCCAGGAAGGTGGAGAACATGAAAGCCATAACAGCTAGACGTATTCTGCAAGGCCTAGGGCATTATTTGAAGGCAGAAGGAAAAGTGGAGTGCTACCGAACCCTGCATCCTGTTCCTTTGTATTCATCTAGTGTGAACCGTGCCTTTTCAAGCCCCAAGGTCGCAGTGGAAGCCTGTAACGCCATGTTGAAAGAGAACTTTCCGACTGTGGCTTCTTACTGTATTATTCCAGAGTACGATGCCTATTTGGACATGGTTGACGGAGCTTCATGCTGCTTAGACACTGCCAGTTTTTGCCCTGCAAAGCTGCGCAGCTTTCCAAAGAAACACTCCTATTTGGAACCCACAATACGATCGGCAGTGCCTTCAGCGATCCAGAACACGCTCCAGAACGTCCTGGCAGCTGCCACAAAAAGAAATTGCAATGTCACGCAAATGAGAGAATTGCCCGTATTGGATTCGGCGGCCTTTAATGTGGAATGCTTCAAGAAATATGCGTGTAATAATGAATATTGGGAAACGTTTAAAGAAAACCCCATCAGGCTTACTGAAGAAAACGTGGTAAATTACATTACCAAATTAAAAGGACCAAAAGCTGCTGCTCTTTTTGCGAAGACACATAATTTGAATATGTTGCAGGACATACCAATGGACAGGTTTGTAATGGACTTAAAGAGAGACGTGAAAGTGACTCCAGGAACAAAACATACTGAAGAACGGCCCAAGGTACAGGTGATCCAGGCTGCCGATCCGCTAGCAACAGCGTATCTGTGCGGAATCCACCGAGAGCTGGTTAGGAGATTAAATGCGGTCCTGCTTCCGAACATTCATACACTGTTTGATATGTCGGCTGAAGACTTTGACGCTATTATAGCCGAGCACTTCCAGCCTGGGGATTGTGTTCTGGAAACTGACATCGCGTCGTTTGATAAAAGTGAGGACGACGCCATGGCTCTGACCGCGTTAATGATTCTGGAAGACTTAGGTGTGGACGCAGAGCTGTTGACGCTGATTGAGGCGGCTTTCGGCGAAATTTCATCAATACATTTGCCCACTAAAACTAAATTTAAATTCGGAGCCATGATGAAATCTGGAATGTTCCTCACACTGTTTGTGAACACAGTCATTAACATTGTAATCGCAAGCAGAGTGTTGAGAGAACGGCTAACCGGATCACCATGTGCAGCATTCATTGGAGATGACAATATCGTGAAAGGAGTCAAATCGGACAAATTAATGGCAGACAGGTGCGCCACCTGGTTGAATATGGAAGTCAAGATTATAGATGCTGTGGTGGGCGAGAAAGCGCCTTATTTCTGTGGAGGGTTTATTTTGTGTGACTCCGTGACCGGCACAGCGTGCCGTGTGGCAGACCCCCTAAAAAGGCTGTTTAAGCTTGGCAAACCTCTGGCAGCAGACGATGAACATGATGATGACAGGAGAAGGGCATTGCATGAAGAGTCAACACGCTGGAACCGAGTGGGTATTCTTTCAGAGCTGTGCAAGGCAGTAGAATCAAGGTATGAAACCGTAGGAACTTCCATCATAGTTATGGCCATGACTACTCTAGCTAGCAGTGTTAAATCATTCAGCTACCTGAGAGGGGCCCCTATAACTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAGTCTAGCATATGGGCGCGCCCTCAGCATCGATTGAATTGGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAACATGGCCATCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCACATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCTCCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGCGCCCTGAAGGGCGAGATCAAGCAGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACGACGCTGAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACAACGTCAACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAGGAATTGGCAAGCTGCTTACATAGAACTCGCGGCGATTGGCATGCCGCCTTAAAATTTTTATTTTATTTTTCTTTTCTTTTCCGAATCGGATTTTGTTTTTAATATTTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACGCGTCGAGGGGAATTAATTCTTGAAGACGAAAGGGCCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCATTGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGAGCTCTAATACGACTCACTATAG (SEQ ID NO: 2)

В других вариантах осуществления, самоамплифицирующийся репликон РНК происходит из вируса гепатита C (HCV). HCV являются частью группы IV семейства вирусов Flaviviridae, имеющих однокомпонентные, линейные, одноцепочечные РНК-геномы положительной полярности, длиной 9,6-12,3 тысяч пар оснований. 5'-концы флавивирусов несут метилированный нуклеотидный кэп, в то время как другие члены этого семейства являются не кэпированными и кодируют внутренний участок связывания рибосомы.

В других вариантах осуществления, альфавирус представляет собой вирус SF. Вирус SF представляет собой вирусный патоген, как правило, переносимый комарами, который вызывает энцефалит. Вирус леса Семлики представляет собой РНК-вирус с положительной цепью, с геномом приблизительно 13000 пар оснований, который кодирует девять белков. 5'-концевые две трети генома кодируют четыре неструктурных белка, участвующих в синтезе РНК, и структурные белки кодированы в 3'-концевой трети. Из структурных белков, белки C составляют икосаэдрический капсид, обернутый посредством липидного бислоя, происходящего из клетки-хозяина. Самая наружная поверхность вируса почти полностью покрыта гетеродимерами гликопротеинов E1 и E2, аранжированных в соединенные между собой тримеры, формирующие внешнюю оболочку. Тримеры заякорены в мембране посредством цитоплазматического домена E2, ассоциированного с нуклеокапсидом.

В других вариантах осуществления, альфавирус представляет собой вирус SIN. Вирус является переносимым комарами. Вирус SIN вызывает лихорадку Синдбис у человека, и симптомы включают артралгию, сыпь и дискомфорт. Вирусы Синдбис представляют собой оболочечные частицы с икосаэдрическим капсидом. Их геном представляет собой одноцепочечную РНК длиной приблизительно 11,7 т.п.о. Он имеет 5'-кэп и 3'-полиаденилированный хвост, таким образом, служит непосредственно в качестве матричной РНК (мРНК) в клетке-хозяине. Геном кодирует четыре неструктурных белка на 5'-конце, и капсид и два белка оболочки на 3'-конце. Это является характеристикой всех тогавирусов. Репликаця является цитоплазматической и быстрой. Геномная РНК частично транслируется на 5'-конце для получения неструктурных белков, которые затем вовлекаются в репликацию генома и получение новой геномной РНК и более короткой цепи субгеномной РНК. Эта субгеномная цепь транслируется в структурные белки. Вирусы осуществляют сборку на поверхностях клеток-хозяев и получают свою оболочку посредством почкования. Обнаружено, что некодирующий элемет РНК является необходимым для репликации генома вируса Синдбис.

Вирусный репликон РНК является способным стимулировать иммунный ответ посредством toll-подобных рецепторов (TLR). Подгруппа TLR, TLR3, TLR7/8 и TLR9, вовлечена в противовирусные ответы посредством запуска продукции противовирусных цитокинов, таких как интерфероны (IFN) типа I. TLR3 отвечает на двухцепочечную РНК, промежуточный продукт репликации для многих вирусов. TLR7/8 узнают вирусные одноцепочечные РНК, в то время как TLR9 узнает неметилированные мотивы CpG в вирусной ДНК. TLR, вовлеченные в узнавание вируса, экспрессируются на эндосомальных мембранах и могут быть разделены в соответствии с их необходимостью в адаптерном белке MyD88: активность TLR3 является независимой от MyD88, в то время как TLR7/8/9 зависят от MyD88. Активация TLR3 приводит к продукции интерферона (IFN) типа I. Передача сигналов интерферона типа I через комплекс ISGF3 (STAT1/STAT2/IRF9) является необходимой для длительной активации Rip3 и некроптоза.

В некоторых вариантах осуществления, LNP-репликоны РНК являются способными стимулировать передачу сигналов TLR3 в клетках опухолей, что приводит к некротической клеточной смерти клеток опухолей. В некоторых вариантах осуществления, LNP-репликон РНК может усиливать иммуногенную клеточную смерть (ICD), индуцированную LNP. В некоторых вариантах осуществления, TT3-LNP-репликон РНК может вызывать ингибирование опухоли посредством синергической индукции ICD в клетках опухолей и запуска противоопухолевого иммунного ответа (например, привлечения иммуноцитов, таких как гранулоциты, моноциты, макрофаги, супрессорные клетки миелоидного происхождения, дендритные клетки, T клетки, и клетки NK). В некоторых вариантах осуществления, синтетический онколитический вирус содержит TT3-LNP-mtРепликон РНК.

В некоторых вариантах осуществления, репликон РНК содержит кодирующую последовательность для поддающейся детекции молекулы в субгеномной области. В некоторых вариантах осуществления, поддающаяся детекции молекула представляет собой нуклеиновую кислоту или полипептид. В некоторых вариантах осуществления, полипептид представляет собой флуоресцентный белок. Флуоресцентные белки известны в данной области, и представляют собой подкласс флуорофоров, представляющих собой флуоресцентные химические соединения со способностью переизлучать свет после возбуждения. Флуорофор может поглощать энергию возбуждающего света первой специфической длины волны, и затем может переизлучать энергию света при второй, более длинной специфической длине волны. Каждый тип флуорофора отвечает на и излучает свет различных длин волн, в зависимости от характера его химической структуры и окружения. В некоторых вариантах осуществления, флуоресцентный белок включает, но без ограничения, wt-GFP, зеленый флуоресцентный белок (например, EGFP, Emerald, Superfolder GFP, Azami Green, mWasabi, TagGFP, TurboGFP, AcGFP, ZsGreen, T-Sapphire и т.д.), синий флуоресцентный белок, (например, EBFP, EBFP2, Azurite, mTagBFP и т.д.), голубой флуоресцентный белок (например, ECFP, mECFP, Cerulean, mTurquoise, CyPet, AmCyan1, Midori-Ishi Cyan, TagCFP, mTFP1 (Teal) и т.д.), желтый флуоресцентный белок (например, EYFP, Topaz, Venus, mCitrine, YPet, TagYFP, PhiYFP, ZsYellow1, mBanana и т.д.), оранжевый флуоресцентный белок (например, Kusabira Orange, Kusabira Orange2, mOrange, mOrange2, dTomato, dTomato-Tandem, TagRFP, TagRFP-T, DsRed, DsRed2, DsRed-Express (T1), DsRed-Monomer, mTangerine и т.д.), или красный флуоресцентный белок (например, mRuby, mApple, mStrawberry, AsRed2, mRFP1, JRed, mCherry, HcRed1, mRaspberry, dKeima-Tandem, HcRed-Tandem, mPlum, AQ143 и т.д.).

В некоторых аспектах, как описано в настоящем описании, самоамплифицирующийся репликон РНК содержит кодирующую последовательность для экспрессии IL-12 в субгеномной области. Иллюстративная кодирующая последовательность для IL-12 указана в SEQ ID NO: 3:

ATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCACGATGTGCCATGTGGGAGCTGGAGAAAGACGTTTATGTTGTAGAGGTGGACTGGACTCCCGATGCCCCTGGAGAAACAGTGAACCTCACCTGTGACACGCCTGAAGAAGATGACATCACCTGGACCTCAGACCAGAGACATGGAGTCATAGGCTCTGGAAAGACCCTGACCATCACTGTCAAAGAGTTTCTAGATGCTGGCCAGTACACCTGCCACAAAGGAGGCGAGACTCTGAGCCACTCACATCTGCTGCTCCACAAGAAGGAAAATGGAATTTGGTCCACTGAAATTTTAAAAAATTTCAAAAACAAGACTTTCCTGAAGTGTGAAGCACCAAATTACTCCGGACGGTTCACGTGCTCATGGCTGGTGCAAAGAAACATGGACTTGAAGTTCAACATCAAGAGCAGTAGCAGTTCCCCTGACTCTCGGGCAGTGACATGTGGAATGGCGTCTCTGTCTGCAGAGAAGGTCACACTGGACCAAAGGGACTATGAGAAGTATTCAGTGTCCTGCCAGGAGGATGTCACCTGCCCAACTGCCGAGGAGACCCTGCCCATTGAACTGGCGTTGGAAGCACGGCAGCAGAATAAATATGAGAACTACAGCACCAGCTTCTTCATCAGGGACATCATCAAACCAGACCCGCCCAAGAACTTGCAGATGAAGCCTTTGAAGAACTCACAGGTGGAGGTCAGCTGGGAGTACCCTGACTCCTGGAGCACTCCCCATTCCTACTTCTCCCTCAAGTTCTTTGTTCGAATCCAGCGCAAGAAAGAAAAGATGAAGGAGACAGAGGAGGGGTGTAACCAGAAAGGTGCGTTCCTCGTAGAGAAGACATCTACCGAAGTCCAATGCAAAGGCGGGAATGTCTGCGTGCAAGCTCAGGATCGCTATTACAATTCCTCATGCAGCAAGTGGGCATGTGTTCCCTGCAGGGTCCGATCCGGAGGTTCCGGTGGTGGATCCGGAGGTGGCTCCGGCGGCGGATCCAGGGTCATTCCAGTCTCTGGACCTGCCAGGTGTCTTAGCCAGTCCCGAAACCTGCTGAAGACCACAGATGACATGGTGAAGACGGCCAGAGAAAAACTGAAACATTATTCCTGCACTGCTGAAGACATCGATCATGAAGACATCACACGGGACCAAACCAGCACATTGAAGACCTGTTTACCACTGGAACTACACAAGAACGAGAGTTGCCTGGCTACTAGAGAGACTTCTTCCACAACAAGAGGGAGCTGCCTGCCCCCACAGAAGACGTCTTTGATGATGACCCTGTGCCTTGGTAGCATCTATGAGGACTTGAAGATGTACCAGACAGAGTTCCAGGCCATCAACGCAGCACTTCAGAATCACAACCATCAGCAGATCATTCTAGACAAGGGCATGCTGGTGGCCATCGATGAGCTGATGCAGTCTCTGAATCATAATGGCGAGACTCTGCGCCAGAAACCTCCTGTGGGAGAAGCAGACCCTTACAGAGTGAAAATGAAGCTCTGCATCCTGCTTCACGCCTTCAGCACCCGCGTCGTGACCATCAACAGGGTGATGGGCTATCTGAGCTCCGCCTGA (SEQ ID NO: 3)

Структурно, IL-12 принадлежит к цитокинам типа I и имеет структуру узла из четырех α-спиралей. IL-12 действует в форме гетеродимерного белка (IL-12-p70; IL-12-p30/p40), состоящего из двух ковалентно связанных субъединиц p30 и p40. В отличие от гетеродимерной формы, гомодимер IL-12-p40/p40 действует по большей части в качестве конкурентного супрессора действий IL-12-p70. IL-12 представляет собой плейотропный цитокин, действие которого создает взаимосвязь между врожденным и адаптивным иммунитетом. IL-12 впервые описан как фактор, секретированный из индуцированных PMA трансформированных EBV линий B-клеток. На основании его действий, IL-12 был первоначально обозначен как «фактор созревания цитотоксических лимфоцитов» и «фактор стимуляции клетки естественного киллера». Благодаря сведению врожденного и адаптивного иммунитета и сильной стимуляции продукции IFN-γ, цитокина, координирующего природные механизмы противораковой защиты, IL-12 кажется идеальным кандидатом для иммунотерапии опухолей у человека. Однако, тяжелые побочные эффекты, ассоциированные с системным введением IL-12 в клинических исследованиях, и очень узкий терапевтический индекс этого цитокина заметно снизили энтузиазм для использования этого цитокина у пациентов с злокачественными опухолями.

После открытия IL-12, три других члена (IL-23, IL-27 и IL-35) добавлены в семейство IL-12 и, как показано, играют критические роли в функциях Th1-клетки. IL-12 представляет собой лиганд рецептора, состоящего из двух аминокислотных цепей, IL-12R-β1 и IL-12R-β2. Рецептор IL-12 экспрессируется конститутивным (например, IL-12R-β1 в B клетках) или индуцируемым (IL-12R-β2) образом во множестве иммуноцитов, включая клетки NK, T- и B-лимфоциты. Связанный с лигандом IL-12R-β2 становится фосфорилированным по остаткам тирозина, предоставляющим участки связывания для двух киназ, JAK2 и TYK2. Среди семейства STAT факторов транскрипции, STAT4 считают наиболее специфическим медиатором клеточных ответов, вызываемых посредством IL-12. Основными элементами действий IL-12 являются следующие: увеличение продукции IFN-γ, который является наиболее сильным медиатором действий IL-12, из NK и T клеток; стимуляция роста и цитотоксичности активированных клеток NK, CD8+ и CD4+ T клеток, сдвиг дифференцировки CD4+ Th0 клеток в сторону Th1 фенотипа; услиление антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) против клеток опухолей; и индукция продукции IgG и супрессия продукции IgE из B-клеток. Главным источником IL-12 у человека являются активированные антигенпредставляющие клетки, такие как дендритные клетки, особенно CD1c+ фенотипа, так же как гематопоэтические фагоциты (моноциты, макрофаги, а также нейтрофилы), но IL-12 может быть также продуцирован другими типами клеток. В то время как IL-12 действует на множество иммуноцитов, общей физиологической ролью для IL-12 кажется организация иммунного ответа Th1-типа против конкретных патогенов.

Настоящее изобретение, в некотором аспекте, относится к локальной доставке IL-12 посредством LNP, инкапсулирующей вирусный репликон РНК, который кодирует молекулу IL-12 в своей субгеномной области. В дополнение к синергической иммуногенной клеточной смерти (ICD) клеток опухоли, индуцированной LNP-репликоном РНК, в некоторых вариантах осуществления, экспрессия IL12 в микроокружении опухоли может приводить к дальнейшей иммуностимуляции и приводит к усилению противоопухолевого иммунного ответа. В некоторых вариантах осуществления, комбинация LNP-репликона РНК-IL-12 в микроокружении опухоли является способной индуцировать системный противоопухолевый иммунный ответ. В других вариантах осуществления, комбинация LNP-репликона РНК-IL-12 в микроокружении опухоли является способной уничтожать клетки опухолей и предотвращать рецидив опухоли. В некоторых вариантах осуществления, синтетический онколитический вирус содержит TT3-LNP-mtРепликон РНК-IL12.

В некоторых вариантах осуществления, репликон РНК-IL12 дополнительно содержит кодирующую последовательность для сывороточного альбумина. На время полужизни пептидов и белков (например, цитокинов) в биологическом окружении (например, сыворотке, микроокружении опухоли) влияет несколько факторов, включая размер, заряд, протеолитическую чувствительность, характер их биологии, скорость оборота белков, с которыми они связываются, и другие факторы. В некоторых случаях, время полужизни белков в биологическом окружении может грубо коррелировать с их размером. Пептиды и белки, менее чем приблизительно 70 кДа (например, цитокины) могут удаляться посредством почечной фильтрации, так что они, как правило, имеют очень короткие периоды времени полужизни. Более крупные белки, однако, могут персистировать в течение нескольких суток. Три типа белков, IgG, сывороточный альбумин и трансферрин, персистируют намного дольше, чем можно было бы прогнозировать только по их размеру. В некоторых вариантах осуществления, сывороточный альбумин представляет собой человеческий сывороточный альбумин. В некоторых вариантах осуществления, сывороточный альбумин представляет собой мышиный сывороточный альбумин (MSA). Иллюстративная кодирующая последовательность для репликона РНК-IL12-MSA указана в SEQ ID NO: 4:

ATGGGCGGCGCATGAGAGAAGCCCAGACCAATTACCTACCCAAAATGGAGAAAGTTCACGTTGACATCGAGGAAGACAGCCCATTCCTCAGAGCTTTGCAGCGGAGCTTCCCGCAGTTTGAGGTAGAAGCCAAGCAGGTCACTGATAATGACCATGCTAATGCCAGAGCGTTTTCGCATCTGGCTTCAAAACTGATCGAAACGGAGGTGGACCCATCCGACACGATCCTTGACATTGGAAGTGCGCCCGCCCGCAGAATGTATTCTAAGCACAAGTATCATTGTATCTGTCCGATGAGATGTGCGGAAGATCCGGACAGATTGTATAAGTATGCAACTAAGCTGAAGAAAAACTGTAAGGAAATAACTGATAAGGAATTGGACAAGAAAATGAAGGAGCTGGCCGCCGTCATGAGCGACCCTGACCTGGAAACTGAGACTATGTGCCTCCACGACGACGAGTCGTGTCGCTACGAAGGGCAAGTCGCTGTTTACCAGGATGTATACGCGGTTGACGGACCGACAAGTCTCTATCACCAAGCCAATAAGGGAGTTAGAGTCGCCTACTGGATAGGCTTTGACACCACCCCTTTTATGTTTAAGAACTTGGCTGGAGCATATCCATCATACTCTACCAACTGGGCCGACGAAACCGTGTTAACGGCTCGTAACATAGGCCTATGCAGCTCTGACGTTATGGAGCGGTCACGTAGAGGGATGTCCATTCTTAGAAAGAAGTATTTGAAACCATCCAACAATGTTCTATTCTCTGTTGGCTCGACCATCTACCACGAGAAGAGGGACTTACTGAGGAGCTGGCACCTGCCGTCTGTATTTCACTTACGTGGCAAGCAAAATTACACATGTCGGTGTGAGACTATAGTTAGTTGCGACGGGTACGTCGTTAAAAGAATAGCTATCAGTCCAGGCCTGTATGGGAAGCCTTCAGGCTATGCTGCTACGATGCACCGCGAGGGATTCTTGTGCTGCAAAGTGACAGACACATTGAACGGGGAGAGGGTCTCTTTTCCCGTGTGCACGTATGTGCCAGCTACATTGTGTGACCAAATGACTGGCATACTGGCAACAGATGTCAGTGCGGACGACGCGCAAAAACTGCTGGTTGGGCTCAACCAGCGTATAGTCGTCAACGGTCGCACCCAGAGAAACACCAATACCATGAAAAATTACCTTTTGCCCGTAGTGGCCCAGGCATTTGCTAGGTGGGCAAAGGAATATAAGGAAGATCAAGAAGATGAAAGGCCACTAGGACTACGAGATAGACAGTTAGTCATGGGGTGTTGTTGGGCTTTTAGAAGGCACAAGATAACATCTATTTATAAGCGCCCGGATACCCAAACCATCATCAAAGTGAACAGCGATTTCCACTCATTCGTGCTGCCCAGGATAGGCAGTAACACATTGGAGATCGGGCTGAGAACAAGAATCAGGAAAATGTTAGAGGAGCACAAGGAGCCGTCACCTCTCATTACCGCCGAGGACGTACAAGAAGCTAAGTGCGCAGCCGATGAGGCTAAGGAGGTGCGTGAAGCCGAGGAGTTGCGCGCAGCTCTACCACCTTTGGCAGCTGATGTTGAGGAGCCCACTCTGGAAGCCGATGTCGACTTGATGTTACAAGAGGCTGGGGCCGGCTCAGTGGAGACACCTCGTGGCTTGATAAAGGTTACCAGCTACGATGGCGAGGACAAGATCGGCTCTTACGCTGTGCTTTCTCCGCAGGCTGTACTCAAGAGTGAAAAATTATCTTGCATCCACCCTCTCGCTGAACAAGTCATAGTGATAACACACTCTGGCCGAAAAGGGCGTTATGCCGTGGAACCATACCATGGTAAAGTAGTGGTGCCAGAGGGACATGCAATACCCGTCCAGGACTTTCAAGCTCTGAGTGAAAGTGCCACCATTGTGTACAACGAACGTGAGTTCGTAAACAGGTACCTGCACCATATTGCCACACATGGAGGAGCGCTGAACACTGATGAAGAATATTACAAAACTGTCAAGCCCAGCGAGCACGACGGCGAATACCTGTACGACATCGACAGGAAACAGTGCGTCAAGAAAGAACTAGTCACTGGGCTAGGGCTCACAGGCGAGCTGGTGGATCCTCCCTTCCATGAATTCGCCTACGAGAGTCTGAGAACACGACCAGCCGCTCCTTACCAAGTACCAACCATAGGGGTGTATGGCGTGCCAGGATCAGGCAAGTCTGGCATCATTAAAAGCGCAGTCACCAAAAAAGATCTAGTGGTGAGCGCCAAGAAAGAAAACTGTGCAGAAATTATAAGGGACGTCAAGAAAATGAAAGGGCTGGACGTCAATGCCAGAACTGTGGACTCAGTGCTCTTGAATGGATGCAAACACCCCGTAGAGACCCTGTATATTGACGAAGCTTTTGCTTGTCATGCAGGTACTCTCAGAGCGCTCATAGCCATTATAAGACCTAAAAAGGCAGTGCTCTGCGGGGATCCCAAACAGTGCGGTTTTTTTAACATGATGTGCCTGAAAGTGCATTTTAACCACGAGATTTGCACACAAGTCTTCCACAAAAGCATCTCTCGCCGTTGCACTAAATCTGTGACTTCGGTCGTCTCAACCTTGTTTTACGACAAAAAAATGAGAACGACGAATCCGAAAGAGACTAAGATTGTGATTGACACTACCGGCAGTACCAAACCTAAGCAGGACGATCTCATTCTCACTTGTTTCAGAGGGTGGGTGAAGCAGTTGCAAATAGATTACAAAGGCAACGAAATAATGACGGCAGCTGCCTCTCAAGGGCTGACCCGTAAAGGTGTGTATGCCGTTCGGTACAAGGTGAATGAAAATCCTCTGTACGCACCCACCTCAGAACATGTGAACGTCCTACTGACCCGCACGGAGGACCGCATCGTGTGGAAAACACTAGCCGGCGACCCATGGATAAAAACACTGACTGCCAAGTACCCTGGGAATTTCACTGCCACGATAGAGGAGTGGCAAGCAGAGCATGATGCCATCATGAGGCACATCTTGGAGAGACCGGACCCTACCGACGTCTTCCAGAATAAGGCAAACGTGTGTTGGGCCAAGGCTTTAGTGCCGGTGCTGAAGACCGCTGGCATAGACATGACCACTGAACAATGGAACACTGTGGATTATTTTGAAACGGACAAAGCTCACTCAGCAGAGATAGTATTGAACCAACTATGCGTGAGGTTCTTTGGACTCGATCTGGACTCCGGTCTATTTTCTGCACCCACTGTTCCGTTATCCATTAGGAATAATCACTGGGATAACTCCCCGTCGCCTAACATGTACGGGCTGAATAAAGAAGTGGTCCGTCAGCTCTCTCGCAGGTACCCACAACTGCCTCGGGCAGTTGCCACTGGAAGAGTCTATGACATGAACACTGGTACACTGCGCAATTATGATCCGCGCATAAACCTAGTACCTGTAAACAGAAGACTGCCTCATGCTTTAGTCCTCCACCATAATGAACACCCACAGAGTGACTTTTCTTCATTCGTCAGCAAATTGAAGGGCAGAACTGTCCTGGTGGTCGGGGAAAAGTTGTCCGTCCCAGGCAAAATGGTTGACTGGTTGTCAGACCGGCCTGAGGCTACCTTCAGAGCTCGGCTGGATTTAGGCATCCCAGGTGATGTGCCCAAATATGACATAATATTTGTTAATGTGAGGACCCCATATAAATACCATCACTATCAGCAGTGTGAAGACCATGCCATTAAGCTTAGCATGTTGACCAAGAAAGCTTGTCTGCATCTGAATCCCGGCGGAACCTGTGTCAGCATAGGTTATGGTTACGCTGACAGGGCCAGCGAAAGCATCATTGGTGCTATAGCGCGGCAGTTCAAGTTTTCCCGGGTATGCAAACCGAAATCCTCACTTGAAGAGACGGAAGTTCTGTTTGTATTCATTCGGTACGATCGCAAGGCCCGTACGCACAATTCTTACAAGCTTTCATCAACCTTGACCAACATTTATACAGGTTCCAGACTCCACGAAGCCGGATGTGCACCCTCATATCATGTGGTGCGAGGGGATATTGCCACGGCCACCGAAGGAGTGATTATAAATGCTGCTAACAGCAAAGGACAACCTGGCGGAGGGGTGTGCGGAGCGCTGTATAAGAAATTCCCGGAAAGCTTCGATTTACAGCCGATCGAAGTAGGAAAAGCGCGACTGGTCAAAGGTGCAGCTAAACATATCATTCATGCCGTAGGACCAAACTTCAACAAAGTTTCGGAGGTTGAAGGTGACAAACAGTTGGCAGAGGCTTATGAGTCCATCGCTAAGATTGTCAACGATAACAATTACAAGTCAGTAGCGATTCCACTGTTGTCCACCGGCATCTTTTCCGGGAACAAAGATCGACTAACCCAATCATTGAACCATTTGCTGACAGCTTTAGACACCACTGATGCAGATGTAGCCATATACTGCAGGGACAAGAAATGGGAAATGACTCTCAAGGAAGCAGTGGCTAGGAGAGAAGCAGTGGAGGAGATATGCATATCCGACGACTCTTCAGTGACAGAACCTGATGCAGAGCTGGTGAGGGTGCATCCGAAGAGTTCTTTGGCTGGAAGGAAGGGCTACAGCACAAGCGATGGCAAAACTTTCTCATATTTGGAAGGGACCAAGTTTCACCAGGCGGCCAAGGATATAGCAGAAATTAATGCCATGTGGCCCGTTGCAACGGAGGCCAATGAGCAGGTATGCATGTATATCCTCGGAGAAGGCATGAGCAGTATTAGGTCGAAATGCCCCGTCGAAGAGTCGGAAGCCTCCACACCACCTAGCACGCTGCCTTGCTTGTGCATCCATGCCATGACTCCAGAAAGAGTACAGCGCCTAAAAGCCTCACGTCCAGAACAAATTACTGTGTGCTCATCCTTTCCATTGCCGAAGTATAGAATCACTGGTGTGCAGAAGATCCAATGCTCCCAGCCTATATTGTTCTCACCGAAAGTGCCTGCGTATATTCATCCAAGGAAGTATCTCGTGGAAACACCACCGGTAGACGAGACTCCGGAGCCATCGGCAGAGAACCAATCCACAGAGGGGACACCTGAACAACCACCACTTATAACCGAGGATGAGACCAGGACTAGAACGCCTGAGCCGATCATCATCGAAGAGGAAGAAGAGGATAGCATAAGTTTGCTGTCAGATGGCCCGACCCACCAGGTGCTGCAAGTCGAGGCAGACATTCACGGGCCGCCCTCTGTATCTAGCTCATCCTGGTCCATTCCTCATGCATCCGACTTTGATGTGGACAGTTTATCCATACTTGACACCCTGGAGGGAGCTAGCGTGACCAGCGGGGCAACGTCAGCCGAGACTAACTCTTACTTCGCAAAGAGTATGGAGTTTCTGGCGCGACCGGTGCCTGCGCCTCGAACAGTATTCAGGAACCCTCCACATCCCGCTCCGCGCACAAGAACACCGTCACTTGCACCCAGCAGGGCCTGCTCGAGAACCAGCCTAGTTTCCACCCCGCCAGGCGTGAATAGGGTGATCACTAGAGAGGAGCTCGAGGCGCTTACCCCGTCACGCACTCCTAGCAGGTCGGTCTCGAGAACCAGCCTGGTCTCCAACCCGCCAGGCGTAAATAGGGTGATTACAAGAGAGGAGTTTGAGGCGTTCGTAGCACAACAACAATGACGGTTTGATGCGGGTGCATACATCTTTTCCTCCGACACCGGTCAAGGGCATTTACAACAAAAATCAGTAAGGCAAACGGTGCTATCCGAAGTGGTGTTGGAGAGGACCGAATTGGAGATTTCGTATGCCCCGCGCCTCGACCAAGAAAAAGAAGAATTACTACGCAAGAAATTACAGTTAAATCCCACACCTGCTAACAGAAGCAGATACCAGTCCAGGAAGGTGGAGAACATGAAAGCCATAACAGCTAGACGTATTCTGCAAGGCCTAGGGCATTATTTGAAGGCAGAAGGAAAAGTGGAGTGCTACCGAACCCTGCATCCTGTTCCTTTGTATTCATCTAGTGTGAACCGTGCCTTTTCAAGCCCCAAGGTCGCAGTGGAAGCCTGTAACGCCATGTTGAAAGAGAACTTTCCGACTGTGGCTTCTTACTGTATTATTCCAGAGTACGATGCCTATTTGGACATGGTTGACGGAGCTTCATGCTGCTTAGACACTGCCAGTTTTTGCCCTGCAAAGCTGCGCAGCTTTCCAAAGAAACACTCCTATTTGGAACCCACAATACGATCGGCAGTGCCTTCAGCGATCCAGAACACGCTCCAGAACGTCCTGGCAGCTGCCACAAAAAGAAATTGCAATGTCACGCAAATGAGAGAATTGCCCGTATTGGATTCGGCGGCCTTTAATGTGGAATGCTTCAAGAAATATGCGTGTAATAATGAATATTGGGAAACGTTTAAAGAAAACCCCATCAGGCTTACTGAAGAAAACGTGGTAAATTACATTACCAAATTAAAAGGACCAAAAGCTGCTGCTCTTTTTGCGAAGACACATAATTTGAATATGTTGCAGGACATACCAATGGACAGGTTTGTAATGGACTTAAAGAGAGACGTGAAAGTGACTCCAGGAACAAAACATACTGAAGAACGGCCCAAGGTACAGGTGATCCAGGCTGCCGATCCGCTAGCAACAGCGTATCTGTGCGGAATCCACCGAGAGCTGGTTAGGAGATTAAATGCGGTCCTGCTTCCGAACATTCATACACTGTTTGATATGTCGGCTGAAGACTTTGACGCTATTATAGCCGAGCACTTCCAGCCTGGGGATTGTGTTCTGGAAACTGACATCGCGTCGTTTGATAAAAGTGAGGACGACGCCATGGCTCTGACCGCGTTAATGATTCTGGAAGACTTAGGTGTGGACGCAGAGCTGTTGACGCTGATTGAGGCGGCTTTCGGCGAAATTTCATCAATACATTTGCCCACTAAAACTAAATTTAAATTCGGAGCCATGATGAAATCTGGAATGTTCCTCACACTGTTTGTGAACACAGTCATTAACATTGTAATCGCAAGCAGAGTGTTGAGAGAACGGCTAACCGGATCACCATGTGCAGCATTCATTGGAGATGACAATATCGTGAAAGGAGTCAAATCGGACAAATTAATGGCAGACAGGTGCGCCACCTGGTTGAATATGGAAGTCAAGATTATAGATGCTGTGGTGGGCGAGAAAGCGCCTTATTTCTGTGGAGGGTTTATTTTGTGTGACTCCGTGACCGGCACAGCGTGCCGTGTGGCAGACCCCCTAAAAAGGCTGTTTAAGCTTGGCAAACCTCTGGCAGCAGACGATGAACATGATGATGACAGGAGAAGGGCATTGCATGAAGAGTCAACACGCTGGAACCGAGTGGGTATTCTTTCAGAGCTGTGCAAGGCAGTAGAATCAAGGTATGAAACCGTAGGAACTTCCATCATAGTTATGGCCATGACTACTCTAGCTAGCAGTGTTAAATCATTCAGCTACCTGAGAGGGGCCCCTATAACTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAGTCTAGCATATGGGCGCGCCCTCAGCATCGATTTGAATTGGCCACCATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCACGATGTGCCATGTGGGAGCTGGAGAAAGACGTTTATGTTGTAGAGGTGGACTGGACTCCCGATGCCCCTGGAGAAACAGTGAACCTCACCTGTGACACGCCTGAAGAAGATGACATCACCTGGACCTCAGACCAGAGACATGGAGTCATAGGCTCTGGAAAGACCCTGACCATCACTGTCAAAGAGTTTCTAGATGCTGGCCAGTACACCTGCCACAAAGGAGGCGAGACTCTGAGCCACTCACATCTGCTGCTCCACAAGAAGGAAAATGGAATTTGGTCCACTGAAATTTTAAAAAATTTCAAAAACAAGACTTTCCTGAAGTGTGAAGCACCAAATTACTCCGGACGGTTCACGTGCTCATGGCTGGTGCAAAGAAACATGGACTTGAAGTTCAACATCAAGAGCAGTAGCAGTTCCCCTGACTCTCGGGCAGTGACATGTGGAATGGCGTCTCTGTCTGCAGAGAAGGTCACACTGGACCAAAGGGACTATGAGAAGTATTCAGTGTCCTGCCAGGAGGATGTCACCTGCCCAACTGCCGAGGAGACCCTGCCCATTGAACTGGCGTTGGAAGCACGGCAGCAGAATAAATATGAGAACTACAGCACCAGCTTCTTCATCAGGGACATCATCAAACCAGACCCGCCCAAGAACTTGCAGATGAAGCCTTTGAAGAACTCACAGGTGGAGGTCAGCTGGGAGTACCCTGACTCCTGGAGCACTCCCCATTCCTACTTCTCCCTCAAGTTCTTTGTTCGAATCCAGCGCAAGAAAGAAAAGATGAAGGAGACAGAGGAGGGGTGTAACCAGAAAGGTGCGTTCCTCGTAGAGAAGACATCTACCGAAGTCCAATGCAAAGGCGGGAATGTCTGCGTGCAAGCTCAGGATCGCTATTACAATTCCTCATGCAGCAAGTGGGCATGTGTTCCCTGCAGGGTCCGATCCGGAGGTTCCGGTGGTGGATCCGGAGGTGGCTCCGGCGGCGGATCCAGGGTCATTCCAGTCTCTGGACCTGCCAGGTGTCTTAGCCAGTCCCGAAACCTGCTGAAGACCACAGATGACATGGTGAAGACGGCCAGAGAAAAACTGAAACATTATTCCTGCACTGCTGAAGACATCGATCATGAAGACATCACACGGGACCAAACCAGCACATTGAAGACCTGTTTACCACTGGAACTACACAAGAACGAGAGTTGCCTGGCTACTAGAGAGACTTCTTCCACAACAAGAGGGAGCTGCCTGCCCCCACAGAAGACGTCTTTGATGATGACCCTGTGCCTTGGTAGCATCTATGAGGACTTGAAGATGTACCAGACAGAGTTCCAGGCCATCAACGCAGCACTTCAGAATCACAACCATCAGCAGATCATTCTAGACAAGGGCATGCTGGTGGCCATCGATGAGCTGATGCAGTCTCTGAATCATAATGGCGAGACTCTGCGCCAGAAACCTCCTGTGGGAGAAGCAGACCCTTACAGAGTGAAAATGAAGCTCTGCATCCTGCTTCACGCCTTCAGCACCCGCGTCGTGACCATCAACAGGGTGATGGGCTATCTGAGCTCCGCCGGTTCCGGTGGCGGATCCGAAGCACACAAGAGTGAGATCGCCCATCGGTATAATGATTTGGGAGAACAACATTTCAAAGGCCTAGTCCTGATTGCCTTTTCCCAGTATCTCCAGAAATGCTCATACGATGAGCATGCCAAATTAGTGCAGGAAGTAACAGACTTTGCAAAGACGTGTGTTGCCGATGAGTCTGCCGCCAACTGTGACAAATCCCTTCACACTCTTTTTGGAGATAAGTTGTGTGCCATTCCAAACCTCCGTGAAAACTATGGTGAACTGGCTGACTGCTGTACAAAACAAGAGCCCGAAAGAAACGAATGTTTCCTGCAACACAAAGATGACAACCCCAGCCTGCCACCATTTGAAAGGCCAGAGGCTGAGGCCATGTGCACCTCCTTTAAGGAAAACCCAACCACCTTTATGGGACACTATTTGCATGAAGTTGCCAGAAGACATCCTTATTTCTATGCCCCAGAACTTCTTTACTATGCTGAGCAGTACAATGAGATTCTGACCCAGTGTTGTGCAGAGGCTGACAAGGAAAGCTGCCTGACCCCGAAGCTTGATGGTGTGAAGGAGAAAGCATTGGTCTCATCTGTCCGTCAGAGAATGAAGTGCTCCAGTATGCAGAAGTTTGGAGAGAGAGCTTTTAAAGCATGGGCAGTAGCTCGTCTGAGCCAGACATTCCCCAATGCTGACTTTGCAGAAATCACCAAATTGGCAACAGACCTGACCAAAGTCAACAAGGAGTGCTGCCATGGTGACCTGCTGGAATGCGCAGATGACAGGGCGGAACTTGCCAAGTACATGTGTGAAAACCAGGCGACTATCTCCAGCAAACTGCAGACTTGCTGCGATAAACCACTGTTGAAGAAAGCCCACTGTCTTAGTGAGGTGGAGCATGACACCATGCCTGCTGATCTGCCTGCCATTGCTGCTGATTTTGTTGAGGACCAGGAAGTGTGCAAGAACTATGCTGAGGCCAAGGATGTCTTCCTGGGCACGTTCTTGTATGAATATTCAAGAAGACACCCTGATTACTCTGTATCCCTGTTGCTGAGACTTGCTAAGAAATATGAAGCCACTCTGGAAAAGTGCTGCGCTGAAGCCAATCCTCCCGCATGCTACGGCACAGTGCTTGCTGAATTTCAGCCTCTTGTAGAAGAGCCTAAGAACTTGGTCAAAACCAACTGTGATCTTTACGAGAAGCTTGGAGAATATGGATTCCAAAATGCCATTCTAGTTCGCTACACCCAGAAAGCACCTCAGGTGTCAACCCCAACTCTCGTGGAGGCTGCAAGAAACCTAGGAAGAGTGGGCACCAAGTGTTGTACACTTCCTGAAGATCAGAGACTGCCTTGTGTGGAAGACTATCTGTCTGCAATCCTGAACCGTGTGTGTCTGCTGCATGAGAAGACCCCAGTGAGTGAGCATGTTACCAAGTGCTGTAGTGGATCCCTGGTGGAAAGGCGGCCATGCTTCTCTGCTCTGACAGTTGATGAAACATATGTCCCCAAAGAGTTTAAAGCTGAGACCTTCACCTTCCACTCTGATATCTGCACACTTCCAGAGAAGGAGAAGCAGATTAAGAAACAAACGGCTCTTGCTGAGCTGGTGAAGCACAAGCCCAAGGCTACAGCGGAGCAACTGAAGACTGTCATGGATGACTTTGCACAGTTCCTGGATACATGTTGCAAGGCTGCTGACAAGGACACCTGCTTCTCGACTGAGGGTCCAAACCTTGTCACTAGATGCAAAGACGCCTTAGCCTGAGCGATCGCTAAATACAGCAGCAATTGGCAAGCTGCTTACATAGAACTCGCGGCGATTGGCATGCCGCCTTAAAATTTTTATTTTATTTTTCTTTTCTTTTCCGAATCGGATTTTGTTTTTAATATTTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACGCGTCGAGGGGAATTAATTCTTGAAGACGAAAGGGCCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCATTGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGAGCTCTAATACGACTCACTATAG (SEQ ID NO: 4)

В некоторых вариантах осуществления, репликон РНК-IL-12 слит с последовательностью, кодирующей сывороточный альбумин. В некоторых вариантах осуществления, слитая молекула IL-12-альбумин имеет более долгое время полужизни в микроокружении опухоли. В некоторых вариантах осуществления, слитый белок IL-12-альбумин может персистировать в микроокружении опухоли в течение по меньшей мере 1 суток, 2 суток, 3 суток, 4 суток, 5 суток, 6 суток, 7 суток, 8 суток или дольше.

В некоторых вариантах осуществления, синтетический онколитический вирус содержит LNP-репликон РНК-IL-12-сывороточный альбумин. В других вариантах осуществления, синтетический онколитический вирус содержит TT3-LNP-репликон РНК-IL-12-сывороточный альбумин. В других вариантах осуществления, синтетический онколитический вирус содержит TT3-LNP-mtРепликон РНК-IL-12-сывороточный альбумин. Присутствие персистирующего IL-12 в микроокружении опухоли может продлевать противоопухолевый иммунный ответ, вызванный синтетическим онколитическим вирусом.

В некоторых вариантах осуществления, репликон РНК-IL12-сывороточный альбумин дополнительно содержит кодирующую последовательность для люмикана. Люмикан представляет собой один из главных внеклеточных белков в интерстициальном внеклеточном матриксе (ECM) кожи, стромы роговицы, склеры, аорты, мышцы, легкого, почки, кости, хряща и межпозвоночных дисков. Он является членом семейства малых, богатых лейцином протеогликанов (SLRP), с коровым белком 30-50 кДа, содержащим сигнальный пептид, отрицательно заряженный N-концевой домен, высоко консервативный богатый лейцином внутренний домен и карбокси-концевой домен. Белковый кор и гликановые цепи люмикана могут взаимодействовать с различными клеточными эффекторами, включая цитокины, факторы роста и рецепторы клеточной поверхности, для модуляции адгезии, пролиферации и миграции клеток. В качестве эндогенного связывающего коллаген белка, присутствие люмикана в микроокружении опухоли может способствовать локальному удержанию IL-12 для улучшения эффективности и безопасности иммунотерапии опухолей, как описано в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления, репликон РНК-IL-12-MSA содержит кодирующую последовательность для люмикана. В других вариантах осуществления, mtРепликон РНК-IL-12-MSA (mtRep-IL12-MSA) содержит кодирующую последовательность для люмикана. Иллюстративная кодирующая последовательность для mtРепликон РНК-IL-12-MSA-люмикана (mtRep-IL12-MSA-люмикан) указана в SEQ ID NO: 5:

ATGGGCGGCGCATGAGAGAAGCCCAGACCAATTACCTACCCAAAATGGAGAAAGTTCACGTTGACATCGAGGAAGACAGCCCATTCCTCAGAGCTTTGCAGCGGAGCTTCCCGCAGTTTGAGGTAGAAGCCAAGCAGGTCACTGATAATGACCATGCTAATGCCAGAGCGTTTTCGCATCTGGCTTCAAAACTGATCGAAACGGAGGTGGACCCATCCGACACGATCCTTGACATTGGAAGTGCGCCCGCCCGCAGAATGTATTCTAAGCACAAGTATCATTGTATCTGTCCGATGAGATGTGCGGAAGATCCGGACAGATTGTATAAGTATGCAACTAAGCTGAAGAAAAACTGTAAGGAAATAACTGATAAGGAATTGGACAAGAAAATGAAGGAGCTGGCCGCCGTCATGAGCGACCCTGACCTGGAAACTGAGACTATGTGCCTCCACGACGACGAGTCGTGTCGCTACGAAGGGCAAGTCGCTGTTTACCAGGATGTATACGCGGTTGACGGACCGACAAGTCTCTATCACCAAGCCAATAAGGGAGTTAGAGTCGCCTACTGGATAGGCTTTGACACCACCCCTTTTATGTTTAAGAACTTGGCTGGAGCATATCCATCATACTCTACCAACTGGGCCGACGAAACCGTGTTAACGGCTCGTAACATAGGCCTATGCAGCTCTGACGTTATGGAGCGGTCACGTAGAGGGATGTCCATTCTTAGAAAGAAGTATTTGAAACCATCCAACAATGTTCTATTCTCTGTTGGCTCGACCATCTACCACGAGAAGAGGGACTTACTGAGGAGCTGGCACCTGCCGTCTGTATTTCACTTACGTGGCAAGCAAAATTACACATGTCGGTGTGAGACTATAGTTAGTTGCGACGGGTACGTCGTTAAAAGAATAGCTATCAGTCCAGGCCTGTATGGGAAGCCTTCAGGCTATGCTGCTACGATGCACCGCGAGGGATTCTTGTGCTGCAAAGTGACAGACACATTGAACGGGGAGAGGGTCTCTTTTCCCGTGTGCACGTATGTGCCAGCTACATTGTGTGACCAAATGACTGGCATACTGGCAACAGATGTCAGTGCGGACGACGCGCAAAAACTGCTGGTTGGGCTCAACCAGCGTATAGTCGTCAACGGTCGCACCCAGAGAAACACCAATACCATGAAAAATTACCTTTTGCCCGTAGTGGCCCAGGCATTTGCTAGGTGGGCAAAGGAATATAAGGAAGATCAAGAAGATGAAAGGCCACTAGGACTACGAGATAGACAGTTAGTCATGGGGTGTTGTTGGGCTTTTAGAAGGCACAAGATAACATCTATTTATAAGCGCCCGGATACCCAAACCATCATCAAAGTGAACAGCGATTTCCACTCATTCGTGCTGCCCAGGATAGGCAGTAACACATTGGAGATCGGGCTGAGAACAAGAATCAGGAAAATGTTAGAGGAGCACAAGGAGCCGTCACCTCTCATTACCGCCGAGGACGTACAAGAAGCTAAGTGCGCAGCCGATGAGGCTAAGGAGGTGCGTGAAGCCGAGGAGTTGCGCGCAGCTCTACCACCTTTGGCAGCTGATGTTGAGGAGCCCACTCTGGAAGCCGATGTCGACTTGATGTTACAAGAGGCTGGGGCCGGCTCAGTGGAGACACCTCGTGGCTTGATAAAGGTTACCAGCTACGATGGCGAGGACAAGATCGGCTCTTACGCTGTGCTTTCTCCGCAGGCTGTACTCAAGAGTGAAAAATTATCTTGCATCCACCCTCTCGCTGAACAAGTCATAGTGATAACACACTCTGGCCGAAAAGGGCGTTATGCCGTGGAACCATACCATGGTAAAGTAGTGGTGCCAGAGGGACATGCAATACCCGTCCAGGACTTTCAAGCTCTGAGTGAAAGTGCCACCATTGTGTACAACGAACGTGAGTTCGTAAACAGGTACCTGCACCATATTGCCACACATGGAGGAGCGCTGAACACTGATGAAGAATATTACAAAACTGTCAAGCCCAGCGAGCACGACGGCGAATACCTGTACGACATCGACAGGAAACAGTGCGTCAAGAAAGAACTAGTCACTGGGCTAGGGCTCACAGGCGAGCTGGTGGATCCTCCCTTCCATGAATTCGCCTACGAGAGTCTGAGAACACGACCAGCCGCTCCTTACCAAGTACCAACCATAGGGGTGTATGGCGTGCCAGGATCAGGCAAGTCTGGCATCATTAAAAGCGCAGTCACCAAAAAAGATCTAGTGGTGAGCGCCAAGAAAGAAAACTGTGCAGAAATTATAAGGGACGTCAAGAAAATGAAAGGGCTGGACGTCAATGCCAGAACTGTGGACTCAGTGCTCTTGAATGGATGCAAACACCCCGTAGAGACCCTGTATATTGACGAAGCTTTTGCTTGTCATGCAGGTACTCTCAGAGCGCTCATAGCCATTATAAGACCTAAAAAGGCAGTGCTCTGCGGGGATCCCAAACAGTGCGGTTTTTTTAACATGATGTGCCTGAAAGTGCATTTTAACCACGAGATTTGCACACAAGTCTTCCACAAAAGCATCTCTCGCCGTTGCACTAAATCTGTGACTTCGGTCGTCTCAACCTTGTTTTACGACAAAAAAATGAGAACGACGAATCCGAAAGAGACTAAGATTGTGATTGACACTACCGGCAGTACCAAACCTAAGCAGGACGATCTCATTCTCACTTGTTTCAGAGGGTGGGTGAAGCAGTTGCAAATAGATTACAAAGGCAACGAAATAATGACGGCAGCTGCCTCTCAAGGGCTGACCCGTAAAGGTGTGTATGCCGTTCGGTACAAGGTGAATGAAAATCCTCTGTACGCACCCACCTCAGAACATGTGAACGTCCTACTGACCCGCACGGAGGACCGCATCGTGTGGAAAACACTAGCCGGCGACCCATGGATAAAAACACTGACTGCCAAGTACCCTGGGAATTTCACTGCCACGATAGAGGAGTGGCAAGCAGAGCATGATGCCATCATGAGGCACATCTTGGAGAGACCGGACCCTACCGACGTCTTCCAGAATAAGGCAAACGTGTGTTGGGCCAAGGCTTTAGTGCCGGTGCTGAAGACCGCTGGCATAGACATGACCACTGAACAATGGAACACTGTGGATTATTTTGAAACGGACAAAGCTCACTCAGCAGAGATAGTATTGAACCAACTATGCGTGAGGTTCTTTGGACTCGATCTGGACTCCGGTCTATTTTCTGCACCCACTGTTCCGTTATCCATTAGGAATAATCACTGGGATAACTCCCCGTCGCCTAACATGTACGGGCTGAATAAAGAAGTGGTCCGTCAGCTCTCTCGCAGGTACCCACAACTGCCTCGGGCAGTTGCCACTGGAAGAGTCTATGACATGAACACTGGTACACTGCGCAATTATGATCCGCGCATAAACCTAGTACCTGTAAACAGAAGACTGCCTCATGCTTTAGTCCTCCACCATAATGAACACCCACAGAGTGACTTTTCTTCATTCGTCAGCAAATTGAAGGGCAGAACTGTCCTGGTGGTCGGGGAAAAGTTGTCCGTCCCAGGCAAAATGGTTGACTGGTTGTCAGACCGGCCTGAGGCTACCTTCAGAGCTCGGCTGGATTTAGGCATCCCAGGTGATGTGCCCAAATATGACATAATATTTGTTAATGTGAGGACCCCATATAAATACCATCACTATCAGCAGTGTGAAGACCATGCCATTAAGCTTAGCATGTTGACCAAGAAAGCTTGTCTGCATCTGAATCCCGGCGGAACCTGTGTCAGCATAGGTTATGGTTACGCTGACAGGGCCAGCGAAAGCATCATTGGTGCTATAGCGCGGCAGTTCAAGTTTTCCCGGGTATGCAAACCGAAATCCTCACTTGAAGAGACGGAAGTTCTGTTTGTATTCATTCGGTACGATCGCAAGGCCCGTACGCACAATTCTTACAAGCTTTCATCAACCTTGACCAACATTTATACAGGTTCCAGACTCCACGAAGCCGGATGTGCACCCTCATATCATGTGGTGCGAGGGGATATTGCCACGGCCACCGAAGGAGTGATTATAAATGCTGCTAACAGCAAAGGACAACCTGGCGGAGGGGTGTGCGGAGCGCTGTATAAGAAATTCCCGGAAAGCTTCGATTTACAGCCGATCGAAGTAGGAAAAGCGCGACTGGTCAAAGGTGCAGCTAAACATATCATTCATGCCGTAGGACCAAACTTCAACAAAGTTTCGGAGGTTGAAGGTGACAAACAGTTGGCAGAGGCTTATGAGTCCATCGCTAAGATTGTCAACGATAACAATTACAAGTCAGTAGCGATTCCACTGTTGTCCACCGGCATCTTTTCCGGGAACAAAGATCGACTAACCCAATCATTGAACCATTTGCTGACAGCTTTAGACACCACTGATGCAGATGTAGCCATATACTGCAGGGACAAGAAATGGGAAATGACTCTCAAGGAAGCAGTGGCTAGGAGAGAAGCAGTGGAGGAGATATGCATATCCGACGACTCTTCAGTGACAGAACCTGATGCAGAGCTGGTGAGGGTGCATCCGAAGAGTTCTTTGGCTGGAAGGAAGGGCTACAGCACAAGCGATGGCAAAACTTTCTCATATTTGGAAGGGACCAAGTTTCACCAGGCGGCCAAGGATATAGCAGAAATTAATGCCATGTGGCCCGTTGCAACGGAGGCCAATGAGCAGGTATGCATGTATATCCTCGGAGAAGGCATGAGCAGTATTAGGTCGAAATGCCCCGTCGAAGAGTCGGAAGCCTCCACACCACCTAGCACGCTGCCTTGCTTGTGCATCCATGCCATGACTCCAGAAAGAGTACAGCGCCTAAAAGCCTCACGTCCAGAACAAATTACTGTGTGCTCATCCTTTCCATTGCCGAAGTATAGAATCACTGGTGTGCAGAAGATCCAATGCTCCCAGCCTATATTGTTCTCACCGAAAGTGCCTGCGTATATTCATCCAAGGAAGTATCTCGTGGAAACACCACCGGTAGACGAGACTCCGGAGCCATCGGCAGAGAACCAATCCACAGAGGGGACACCTGAACAACCACCACTTATAACCGAGGATGAGACCAGGACTAGAACGCCTGAGCCGATCATCATCGAAGAGGAAGAAGAGGATAGCATAAGTTTGCTGTCAGATGGCCCGACCCACCAGGTGCTGCAAGTCGAGGCAGACATTCACGGGCCGCCCTCTGTATCTAGCTCATCCTGGTCCATTCCTCATGCATCCGACTTTGATGTGGACAGTTTATCCATACTTGACACCCTGGAGGGAGCTAGCGTGACCAGCGGGGCAACGTCAGCCGAGACTAACTCTTACTTCGCAAAGAGTATGGAGTTTCTGGCGCGACCGGTGCCTGCGCCTCGAACAGTATTCAGGAACCCTCCACATCCCGCTCCGCGCACAAGAACACCGTCACTTGCACCCAGCAGGGCCTGCTCGAGAACCAGCCTAGTTTCCACCCCGCCAGGCGTGAATAGGGTGATCACTAGAGAGGAGCTCGAGGCGCTTACCCCGTCACGCACTCCTAGCAGGTCGGTCTCGAGAACCAGCCTGGTCTCCAACCCGCCAGGCGTAAATAGGGTGATTACAAGAGAGGAGTTTGAGGCGTTCGTAGCACAACAACAATGACGGTTTGATGCGGGTGCATACATCTTTTCCTCCGACACCGGTCAAGGGCATTTACAACAAAAATCAGTAAGGCAAACGGTGCTATCCGAAGTGGTGTTGGAGAGGACCGAATTGGAGATTTCGTATGCCCCGCGCCTCGACCAAGAAAAAGAAGAATTACTACGCAAGAAATTACAGTTAAATCCCACACCTGCTAACAGAAGCAGATACCAGTCCAGGAAGGTGGAGAACATGAAAGCCATAACAGCTAGACGTATTCTGCAAGGCCTAGGGCATTATTTGAAGGCAGAAGGAAAAGTGGAGTGCTACCGAACCCTGCATCCTGTTCCTTTGTATTCATCTAGTGTGAACCGTGCCTTTTCAAGCCCCAAGGTCGCAGTGGAAGCCTGTAACGCCATGTTGAAAGAGAACTTTCCGACTGTGGCTTCTTACTGTATTATTCCAGAGTACGATGCCTATTTGGACATGGTTGACGGAGCTTCATGCTGCTTAGACACTGCCAGTTTTTGCCCTGCAAAGCTGCGCAGCTTTCCAAAGAAACACTCCTATTTGGAACCCACAATACGATCGGCAGTGCCTTCAGCGATCCAGAACACGCTCCAGAACGTCCTGGCAGCTGCCACAAAAAGAAATTGCAATGTCACGCAAATGAGAGAATTGCCCGTATTGGATTCGGCGGCCTTTAATGTGGAATGCTTCAAGAAATATGCGTGTAATAATGAATATTGGGAAACGTTTAAAGAAAACCCCATCAGGCTTACTGAAGAAAACGTGGTAAATTACATTACCAAATTAAAAGGACCAAAAGCTGCTGCTCTTTTTGCGAAGACACATAATTTGAATATGTTGCAGGACATACCAATGGACAGGTTTGTAATGGACTTAAAGAGAGACGTGAAAGTGACTCCAGGAACAAAACATACTGAAGAACGGCCCAAGGTACAGGTGATCCAGGCTGCCGATCCGCTAGCAACAGCGTATCTGTGCGGAATCCACCGAGAGCTGGTTAGGAGATTAAATGCGGTCCTGCTTCCGAACATTCATACACTGTTTGATATGTCGGCTGAAGACTTTGACGCTATTATAGCCGAGCACTTCCAGCCTGGGGATTGTGTTCTGGAAACTGACATCGCGTCGTTTGATAAAAGTGAGGACGACGCCATGGCTCTGACCGCGTTAATGATTCTGGAAGACTTAGGTGTGGACGCAGAGCTGTTGACGCTGATTGAGGCGGCTTTCGGCGAAATTTCATCAATACATTTGCCCACTAAAACTAAATTTAAATTCGGAGCCATGATGAAATCTGGAATGTTCCTCACACTGTTTGTGAACACAGTCATTAACATTGTAATCGCAAGCAGAGTGTTGAGAGAACGGCTAACCGGATCACCATGTGCAGCATTCATTGGAGATGACAATATCGTGAAAGGAGTCAAATCGGACAAATTAATGGCAGACAGGTGCGCCACCTGGTTGAATATGGAAGTCAAGATTATAGATGCTGTGGTGGGCGAGAAAGCGCCTTATTTCTGTGGAGGGTTTATTTTGTGTGACTCCGTGACCGGCACAGCGTGCCGTGTGGCAGACCCCCTAAAAAGGCTGTTTAAGCTTGGCAAACCTCTGGCAGCAGACGATGAACATGATGATGACAGGAGAAGGGCATTGCATGAAGAGTCAACACGCTGGAACCGAGTGGGTATTCTTTCAGAGCTGTGCAAGGCAGTAGAATCAAGGTATGAAACCGTAGGAACTTCCATCATAGTTATGGCCATGACTACTCTAGCTAGCAGTGTTAAATCATTCAGCTACCTGAGAGGGGCCCCTATAACTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAGTCTAGCATATGGGCGCGCCCTCAGCATCGATTTGAATTGGCCACCATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCACGATGTGCCATGTGGGAGCTGGAGAAAGACGTTTATGTTGTAGAGGTGGACTGGACTCCCGATGCCCCTGGAGAAACAGTGAACCTCACCTGTGACACGCCTGAAGAAGATGACATCACCTGGACCTCAGACCAGAGACATGGAGTCATAGGCTCTGGAAAGACCCTGACCATCACTGTCAAAGAGTTTCTAGATGCTGGCCAGTACACCTGCCACAAAGGAGGCGAGACTCTGAGCCACTCACATCTGCTGCTCCACAAGAAGGAAAATGGAATTTGGTCCACTGAAATTTTAAAAAATTTCAAAAACAAGACTTTCCTGAAGTGTGAAGCACCAAATTACTCCGGACGGTTCACGTGCTCATGGCTGGTGCAAAGAAACATGGACTTGAAGTTCAACATCAAGAGCAGTAGCAGTTCCCCTGACTCTCGGGCAGTGACATGTGGAATGGCGTCTCTGTCTGCAGAGAAGGTCACACTGGACCAAAGGGACTATGAGAAGTATTCAGTGTCCTGCCAGGAGGATGTCACCTGCCCAACTGCCGAGGAGACCCTGCCCATTGAACTGGCGTTGGAAGCACGGCAGCAGAATAAATATGAGAACTACAGCACCAGCTTCTTCATCAGGGACATCATCAAACCAGACCCGCCCAAGAACTTGCAGATGAAGCCTTTGAAGAACTCACAGGTGGAGGTCAGCTGGGAGTACCCTGACTCCTGGAGCACTCCCCATTCCTACTTCTCCCTCAAGTTCTTTGTTCGAATCCAGCGCAAGAAAGAAAAGATGAAGGAGACAGAGGAGGGGTGTAACCAGAAAGGTGCGTTCCTCGTAGAGAAGACATCTACCGAAGTCCAATGCAAAGGCGGGAATGTCTGCGTGCAAGCTCAGGATCGCTATTACAATTCCTCATGCAGCAAGTGGGCATGTGTTCCCTGCAGGGTCCGATCCGGAGGTTCCGGTGGTGGATCCGGAGGTGGCTCCGGCGGCGGATCCAGGGTCATTCCAGTCTCTGGACCTGCCAGGTGTCTTAGCCAGTCCCGAAACCTGCTGAAGACCACAGATGACATGGTGAAGACGGCCAGAGAAAAACTGAAACATTATTCCTGCACTGCTGAAGACATCGATCATGAAGACATCACACGGGACCAAACCAGCACATTGAAGACCTGTTTACCACTGGAACTACACAAGAACGAGAGTTGCCTGGCTACTAGAGAGACTTCTTCCACAACAAGAGGGAGCTGCCTGCCCCCACAGAAGACGTCTTTGATGATGACCCTGTGCCTTGGTAGCATCTATGAGGACTTGAAGATGTACCAGACAGAGTTCCAGGCCATCAACGCAGCACTTCAGAATCACAACCATCAGCAGATCATTCTAGACAAGGGCATGCTGGTGGCCATCGATGAGCTGATGCAGTCTCTGAATCATAATGGCGAGACTCTGCGCCAGAAACCTCCTGTGGGAGAAGCAGACCCTTACAGAGTGAAAATGAAGCTCTGCATCCTGCTTCACGCCTTCAGCACCCGCGTCGTGACCATCAACAGGGTGATGGGCTATCTGAGCTCCGCCGGTTCCGGTGGCGGATCCGAAGCACACAAGAGTGAGATCGCCCATCGGTATAATGATTTGGGAGAACAACATTTCAAAGGCCTAGTCCTGATTGCCTTTTCCCAGTATCTCCAGAAATGCTCATACGATGAGCATGCCAAATTAGTGCAGGAAGTAACAGACTTTGCAAAGACGTGTGTTGCCGATGAGTCTGCCGCCAACTGTGACAAATCCCTTCACACTCTTTTTGGAGATAAGTTGTGTGCCATTCCAAACCTCCGTGAAAACTATGGTGAACTGGCTGACTGCTGTACAAAACAAGAGCCCGAAAGAAACGAATGTTTCCTGCAACACAAAGATGACAACCCCAGCCTGCCACCATTTGAAAGGCCAGAGGCTGAGGCCATGTGCACCTCCTTTAAGGAAAACCCAACCACCTTTATGGGACACTATTTGCATGAAGTTGCCAGAAGACATCCTTATTTCTATGCCCCAGAACTTCTTTACTATGCTGAGCAGTACAATGAGATTCTGACCCAGTGTTGTGCAGAGGCTGACAAGGAAAGCTGCCTGACCCCGAAGCTTGATGGTGTGAAGGAGAAAGCATTGGTCTCATCTGTCCGTCAGAGAATGAAGTGCTCCAGTATGCAGAAGTTTGGAGAGAGAGCTTTTAAAGCATGGGCAGTAGCTCGTCTGAGCCAGACATTCCCCAATGCTGACTTTGCAGAAATCACCAAATTGGCAACAGACCTGACCAAAGTCAACAAGGAGTGCTGCCATGGTGACCTGCTGGAATGCGCAGATGACAGGGCGGAACTTGCCAAGTACATGTGTGAAAACCAGGCGACTATCTCCAGCAAACTGCAGACTTGCTGCGATAAACCACTGTTGAAGAAAGCCCACTGTCTTAGTGAGGTGGAGCATGACACCATGCCTGCTGATCTGCCTGCCATTGCTGCTGATTTTGTTGAGGACCAGGAAGTGTGCAAGAACTATGCTGAGGCCAAGGATGTCTTCCTGGGCACGTTCTTGTATGAATATTCAAGAAGACACCCTGATTACTCTGTATCCCTGTTGCTGAGACTTGCTAAGAAATATGAAGCCACTCTGGAAAAGTGCTGCGCTGAAGCCAATCCTCCCGCATGCTACGGCACAGTGCTTGCTGAATTTCAGCCTCTTGTAGAAGAGCCTAAGAACTTGGTCAAAACCAACTGTGATCTTTACGAGAAGCTTGGAGAATATGGATTCCAAAATGCCATTCTAGTTCGCTACACCCAGAAAGCACCTCAGGTGTCAACCCCAACTCTCGTGGAGGCTGCAAGAAACCTAGGAAGAGTGGGCACCAAGTGTTGTACACTTCCTGAAGATCAGAGACTGCCTTGTGTGGAAGACTATCTGTCTGCAATCCTGAACCGTGTGTGTCTGCTGCATGAGAAGACCCCAGTGAGTGAGCATGTTACCAAGTGCTGTAGTGGATCCCTGGTGGAAAGGCGGCCATGCTTCTCTGCTCTGACAGTTGATGAAACATATGTCCCCAAAGAGTTTAAAGCTGAGACCTTCACCTTCCACTCTGATATCTGCACACTTCCAGAGAAGGAGAAGCAGATTAAGAAACAAACGGCTCTTGCTGAGCTGGTGAAGCACAAGCCCAAGGCTACAGCGGAGCAACTGAAGACTGTCATGGATGACTTTGCACAGTTCCTGGATACATGTTGCAAGGCTGCTGACAAGGACACCTGCTTCTCGACTGAGGGTCCAAACCTTGTCACTAGATGCAAAGACGCCTTAGCCGGCGGAGGTTCCGGTGGCGGATCCCAATACTATGACTACGATATACCCCTGTTCATGTACGGGCAAATATCTCCAAACTGTGCACCAGAATGTAACTGCCCTCACTCATACCCCACTGCAATGTACTGTGACGACCTGAAGTTGAAATCCGTGCCAATGGTGCCTCCTGGGATTAAGTACCTGTACCTCCGCAACAATCAGATCGACCATATTGACGAGAAGGCTTTTGAAAACGTCACAGACCTCCAGTGGCTTATCCTGGACCATAACCTGCTTGAAAATAGTAAGATAAAGGGCAAAGTATTTTCCAAACTTAAACAGCTTAAAAAACTCCACATCAACTACAATAACCTTACTGAATCCGTGGGACCATTGCCAAAATCTCTCCAAGATTTGCAGTTGACTAACAACAAGATATCCAAACTCGGCTCCTTCGATGGGCTGGTTAATCTGACTTTCATCTACTTGCAACACAACCAATTGAAGGAGGATGCAGTTTCAGCTAGTCTTAAAGGTCTGAAAAGCCTTGAGTATCTTGATCTGTCATTTAATCAAATGTCCAAGCTCCCTGCTGGGCTCCCAACAAGTCTGCTGACACTCTATCTCGACAATAACAAGATAAGTAACATTCCCGATGAGTACTTTAAAAGATTTACCGGCCTCCAATACTTGCGGCTTTCTCACAACGAGTTGGCAGACTCTGGTGTACCCGGCAACTCCTTTAATATAAGTTCTCTTCTCGAGCTTGATTTGTCCTATAACAAACTGAAGAGTATCCCTACTGTCAATGAAAATTTGGAGAATTACTACCTCGAAGTCAATGAGCTTGAGAAGTTCGATGTTAAGTCTTTCTGTAAGATACTGGGTCCATTGTCATACAGCAAGATTAAACATCTTCGCTTGGATGGGAATCCCTTGACTCAAAGCTCACTTCCCCCCGACATGTACGAATGCCTGAGGGTAGCCAACGAAATCACAGTAAACGGAGGTGGCTCCTGAGCGATCGCTAAATACAGCAGCAATTGGCAAGCTGCTTACATAGAACTCGCGGCGATTGGCATGCCGCCTTAAAATTTTTATTTTATTTTTCTTTTCTTTTCCGAATCGGATTTTGTTTTTAATATTTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACGCGTCGAGGGGAATTAATTCTTGAAGACGAAAGGGCCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCATTGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGAGCTCTAATACGACTCACTATAG (SEQ ID NO: 5)

В некоторых вариантах осуществления, синтетический онколитический вирус содержит LNP-репликон РНК-IL-12-сывороточный альбумин-люмикан. В других вариантах осуществления, синтетический онколитический вирус содержит TT3-LNP-репликон РНК-IL-12-сывороточный альбумин-люмикан. В других вариантах осуществления, синтетический онколитический вирус содержит TT3-LNP-mtРепликон РНК-IL-12-сывороточный альбумин-люмикан. Удержание IL-12 в микроокружении опухоли может улучшать эффективность и безопасность синтетического онколитического вируса.

В некоторых случаях, репликон РНК может содержать один или несколько ген(ов), представляющих экспериментальный или терапевтический интерес. В некоторых вариантах осуществления, ген(ы), представляющие экспериментальный или терапевтический интерес, кодируют цитокины, хемокины или факторы роста, отличные от IL-12. Цитокины известны в данной области, и сам термин относится к генерализованной группе малых белков, которые секретируются конкретными клетками в иммунной системе и оказывают эффект на другие клетки. Цитокины, как известно, усиливают клеточный иммунный ответ и, в рамках изобретения, могут включать, но без ограничения, TNFα, IFN-γ, IFN-α, TGF-β, IL-1, IL-2, IL-4, IL-10, IL-13, IL-17, IL-18 и хемокины. Хемокины являются полезными для исследований, изучающих ответ на инфекцию, иммунные ответы, воспаление, травму, сепсис, злокачественную опухоль и репродукцию, среди прочих применений. Хемокины известны в данной области, и представляют собой тип цитокинов, которые индуцируют хемотаксис соседних способных отвечать клеток, как правило, лейкоцитов, к участкам инфекции. Неограничивающие примеры хемокинов включают CCL14, CCL19, CCL20, CCL21, CCL25, CCL27, CXCL12, CXCL13, CXCL-8, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL11 и CXCL10. Факторы роста известны в данной области, и сам термин иногда является взаимозаменяемым с термином цитокины. В рамках изобретения, термин «факторы роста» относится к природному веществу, способному передавать сигналы между клетками и стимулировать клеточный рост. В то время как цитокины могут представлять собой факторы роста, конкретные типы цитокинов могут также оказывать ингибирующий эффект на рост клеток, таким образом отличая эти два термина. Неограничивающие примеры факторов роста включают адреномедуллин (AM), ангиопоэтин (Ang), аутокринный фактор миграции, морфогенетические белки кости (BMP), цилиарный нейротрофический фактор (CNTF), ингибирующий лейкоз фактор (LIF), интерлейкин-6 (IL-6), макрофагальный колониестимулирующий фактор (m-CSF), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), эпидермальный фактор роста (EGF), эфрин A1, эфрин A2, эфрин A3, эфрин A4, эфрин A5, эфрин B1, эфрин B2, эфрин B3, эритропоэтин (EPO), фактор роста фибробластов 1 (FGF1), фактор роста фибробластов 2 (FGF2), фактор роста фибробластов 3 (FGF3), фактор роста фибробластов 4 (FGF4), фактор роста фибробластов 5 (FGF5), фактор роста фибробластов 6 (FGF6), фактор роста фибробластов 7 (FGF7), фактор роста фибробластов 8 (FGF8), фактор роста фибробластов 9 (FGF9), фактор роста фибробластов 10 (FGF10), фактор роста фибробластов 11 (FGF11), фактор роста фибробластов 12 (FGF12), фактор роста фибробластов 13 (FGF13), фактор роста фибробластов 14 (FGF14), фактор роста фибробластов 15 (FGF15), фактор роста фибробластов 16 (FGF16), фактор роста фибробластов 17 (FGF17), фактор роста фибробластов 18 (FGF18), фактор роста фибробластов 19 (FGF19), фактор роста фибробластов 20 (FGF20), фактор роста фибробластов 21 (FGF21), фактор роста фибробластов 22 (FGF22), фактор роста фибробластов 23 (FGF23), эмбриональный бычий соматотропин (FBS), происходящий из глиальной линии клеток нейротрофический фактор (GDNF), нейртурин, персефин, артемин, фактор роста и дифференцировки-9 (GDF9), фактор роста гепатоцитов (HGF), происходящий из гепатомы фактор роста (HDGF), инсулин, инсулиноподобный фактор роста-1 (IGF-1), инсулиноподобный фактор роста-2 (IGF-2), интерлейкин-1 (IL-1), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, фактор роста кератиноцитов (KGF), стимулирующий миграцию фактор (MSF), стимулирующий макрофаги белок (MSP), миостатин (GDF-8), нейрорегулин 1 (NRG1), нейрорегулин 2 (NRG2), нейрорегулин 3 (NRG3), нейрорегулин 4 (NRG4), нейротрофический фактор головного мозга (BDNF), фактор роста нервов (NGF), нейтрофин-3 (NT-3), нейтрофин-4 (NT-4), фактор роста плаценты (PGF), фактор роста тромбоцитов (PDGF), реналазу (RNLS), T-клеточный фактор роста (TCGF), тромбопоэтин (TPO), трансформирующий фактор роста альфа (TGF-α), трансформирующий фактор роста бета (TGF-β), фактор некроза опухоли-альфа (TNF-α) и фактор роста эндотелия сосудов (VEGF).

II. Фармацевтические композиции

В некоторых аспектах, настоящее изобретение, по меньшей мере частично, относится к фармацевтической композиции, содержащей синтетический онколитический вирус, как описано в настоящем описании. Фармацевтическая композиция, описанная в настоящем описании, может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель (наполнитель) для формирования фармацевтической композиции для использования в лечении целевого заболевания. «Приемлемый» означает, что носитель должен являться совместимым с активным ингредиентом композиции (и предпочтительно, способным стабилизировать активный ингредиент) и не должен является вредным для субъекта, подлежащего лечению. Фармацевтически приемлемые наполнители (носители) включают буферы, хорошо известные в данной области. См., например, Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K.E. Hoover.

фармацевтические композиции, предназначенные для использования для введения in vivo, должны являться стерильными. Этого легко достигают, например, посредством фильтрации через мембраны для стерильной фильтрации. Содержащие синтетический онколитический вирус композиции можно помещать в контейнер, имеющий стерильное отверстие для доступа, например, пакет с раствором для внутривенного введения или флакон, имеющий пробку, прокалываемую иглой для подкожных инъекций.

В некоторых вариантах осуществления, фармацевтическую композицию, предназначенную для использования по настоящему изобретению, можно составлять для внутриопухолевой инъекции. Внутриопухолевая инъекция, в рамках изобретения, относится к прямым инъекциям в опухоль противоопухолевой композиции (например, иммуностимулирующего синтетического онколитического вируса). Высокую концентрацию композиции можно достигать in situ, с использованием в то же время небольших количеств лекарственных средств. Локальная доставка иммунотерапевтических средств позволяет множественную комбинацию видов терапии, с предотвращением в то же время значительного системного воздействия и неспецифической токсичности.

В других вариантах осуществления, фармацевтическую композицию можно составлять для внутримышечной инъекции, внутривенной инъекции или подкожной инъекции.

Фармацевтические композиции, предназначенные для использования в способах по настоящему изобретению, могут содержать фармацевтически приемлемые носители, буферные средства, наполнители, соли или стабилизаторы в форме лиофилизированных составов или водных растворов. См., например, Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K.E. Hoover). Приемлемые носители, наполнители или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозах и концентрациях, и могут содержать буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметэтония; хлорид бензалкония, хлорид бензэтония; фенол, бутил или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцинол; циклогексанол; 3-пентанол; и m-крезол); полипептиды с низкой молекулярной массой (менее чем приблизительно 10 остатков); белки, такие как сывороточный альбумин, желатин, или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстраны; хелатирующие агенты, такие как ЭДТА; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, комплексы Zn-белок); и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN™, PLURONICS™ или полиэтиленгликоль (PEG).

В некоторых примерах, фармацевтическая композиция, описанная в настоящем описании, содержит липидные наночастицы, которые можно получать способами, известными в данной области, такими, как описанные в Epstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030 (1980); и Патентах США No. 4485045 и 4544545. Липосомы с увеличенным временем циркуляции описаны в Патенте США No. 5013556. Особенно полезные липосомы можно получать посредством способа обращеннофазового выпаривания с использованием липидной композиции, содержащей фосфатидилхолин, холестерин и PEG-дериватизированный фосфатидилэтаноламин (PEG-PE). Липосомы подвергают экструзии через фильтры с определенным размером пор для получения липосом с желательным диаметром.

В других примерах, фармацевтическую композицию, описанную в настоящем описании, можно составлять в формате замедленного высвобождения. Пригодные примеры препаратов замедленного высвобождения включают полупроницаемые матриксы из твердых гидрофобных полимеров, содержащие синтетический онколитический вирус, где матриксы находятся в форме сформованных изделий, например, пленок или микрокапсул. Примеры матриксов для замедленного высвобождения включают полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтил-метакрилат), или поли(виниловый спирт)), полилактиды (Патент США No. 3773919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и 7-этил-L-глутамата, недеградируемый этилен-винилацетат, деградируемые сополимеры молочной кислоты-гликолевой кислоты, такие как LUPRON DEPOT™ (инъецируемые микросферы, состоящие из сополимера молочной кислоты-гликолевой кислоты и ацетата леупролида), ацетат-изобутират сахарозы и поли-D-(-)-3-гидроксимасляную кислоту.

Пригодные поверхностно-активные вещества включают, в частности, неионные средства, такие как полиоксиэтиленсорбитаны (например, TWEEN™ 20, 40, 60, 80 или 85) и другие сорбитаны (например, SPAN™ 20, 40, 60, 80 или 85). Композиции с поверхностно-активным веществом могут удобным образом содержать между 0,05 и 5% поверхностно-активного вещества, и оно может составлять между 0,1 и 2,5%. Понятно, что можно добавлять другие ингредиенты, например, маннит или другие фармацевтически приемлемые носители, при необходимости.

Фармацевтические композиции, описанные в настоящем описании, можно составлять в единичных дозированных формах, таких как таблетки, пилюли, капсулы, порошки, гранулы, растворы или суспензии, или суппозитории, для перорального, парентерального или ректального введения, или введения посредством ингаляции или инсуффляции.

Для получения твердых композиций, таких как таблетки, главный активный ингредиент можно смешивать с фармацевтическим носителем, например с обычными таблетирующими ингредиентами, такими как кукурузный крахмал, лактоза, сахароза, сорбит, тальк, стеариновая кислота, стеарат магния, фосфат дикальция или камеди, и с другими фармацевтическими разбавителями, например с водой, с образованием предварительной твердой композиции, содержащей гомогенную смесь соединения по настоящему изобретению или его нетоксичной фармацевтически приемлемой соли. При указании на эти предварительные композиции как на гомогенные, подразумевают, что активный ингредиент равномерно распределен в композиции, так что композицию можно легко разделять на одинаково эффективные единичные дозированные формы, такие как таблетки, пилюли и капсулы. Эту твердую предварительную композицию затем разделяют на единичные дозированные формы описанного выше типа, содержащие от 0,1 до приблизительно 500 мг активного ингредиента по настоящему изобретению. Таблетки или пилюли из новой композиции могут быть покрыты оболочкой или смешаны иным образом для обеспечения лекарственной формы, обеспечивающей преимущества продленного действия. Например, таблетка или пилюля может содержать внутренний дозированный компонент и внешний дозированный компонент, где последний находится в форме оболочки поверх первого. Эти два компонента могут быть разделены кишечнорастворимым слоем, который служит для противодействия распадению в желудке и позволяет внутреннему компоненту проходить без изменений в двенадцатиперстную кишку или задерживать его высвобождение. Множество материалов можно использовать для таких кишечнорастворимых слоев или покрытий, где такие материалы включают ряд полимерных кислот и смеси полимерных кислот с такими материалами, как шеллак, цетиловый спирт и ацетат целлюлозы.

Пригодные эмульсии можно получать с использованием коммерчески доступных жировых эмульсий, таких как INTRALIPID™, LIPOSYN™, INFONUTROL™, LIPOFUNDIN™ и LIPIPHYSAN™. Активный ингредиент может быть либо растворен в предварительно смешанной эмульсионной композиции, либо альтернативно, он может быть растворен в масле (например в соевом масле, сафлоровом масле, хлопковом масле, кунжутном масле, кукурузном масле или миндальном масле), и эмульсия может быть сформирована при смешивании с фосфолипидом (например с яичными фосфолипидами, соевыми фосфолипидами или соевым лецитином) и водой. Следует понимать, что можно добавлять другие ингредиенты, например, глицерин или глюкозу, для регулирования тоничности эмульсии. Пригодные эмульсии могут, как правило, содержать вплоть до 20% масла, например, между 5 и 20%. Жировая эмульсия может содержать капли жира, имеющие подходящий размер, и может иметь pH в диапазоне 5,5-8,0.

Фармацевтический композиции для ингаляции или инсуффляции включают растворы и суспензии в фармацевтически приемлемых, водных или органических растворителях или их смесях, и порошки. Жидкие или твердые композиции могут содержать подходящие фармацевтически приемлемые наполнители, как указано выше. В некоторых вариантах осуществления, композиции вводят посредством перорального или назального дыхательного пути для местного или системного эффекта.

Композиции в предпочтительно стерильных фармацевтически приемлемых растворителях можно распылять с использованием газов. Распыленные растворы можно вдыхать непосредственно из распыляющего устройства или распыляющее устройство может быть прикреплено к маске для лица, палатке или дыхательному аппарату с перемежающимся положительным давлением. Раствор, суспензию или порошкообразные композиции можно вводить, предпочтительно, перорально или назально, из устройств, которые доставляют состав соответствующим образом.

III. Терапевтические применения

Фармацевтические композиции, описанные в настоящем описании, содержащие синтетический онколитический вирус, можно использовать для лечения злокачественной опухоли, например, для иммунотерапии злокачественных опухолей.

Для практического осуществления способа, описанного в настоящем описании, эффективное количество любой из фармацевтических композиций, описанных в настоящем описании, можно вводить нуждающемуся в лечении субъекту (например, человеку), подходящим способом, например, посредством внутриопухолевого введения, посредством внутривенного введения, например, в форме болюса или посредством непрерывной инфузии в течение некоторого периода времени, посредством внутримышечного, внутрибрюшинного, интрацереброспинального, подкожного, внутрисуставного, интрасиновиального, интратекального, перорального, ингаляционного или местного способов. Коммерчески доступные распылители для жидких составов, включая струйные распылители и ультразвуковые распылители, можно использовать для введения. Жидкие составы можно распылять напрямую, и лиофилизированный порошок можно распылять после разведения. Альтернативно, содержащую синтетический онколитический вирус фармацевтическую композицию можно переводить в аэрозоль с использованием фторуглеродного состава и дозирующего ингалятора, или вводить посредством ингаляции в форме лиофилизированного и размолотого порошка. В некоторых примерах, фармацевтическая композиция, описанная в настоящем описании, составлена для внутриопухолевой инъекции. В конкретных примерах, фармацевтическую композицию можно вводить субъекту (например, пациенту-человеку) посредством местного способа, например, инъекции в местный участок, такой как участок опухоли или участок инфекции.

В рамках изобретения, «эффективное количество» относится к количеству каждого действующего вещества, необходимому для оказания терапевтического эффекта на субъекта, либо отдельно, либо в комбинации с одним или несколькими другими действующими веществами. В некоторых вариантах осуществления, терапевтический эффект представляет собой уменьшение опухолевой нагрузки, уменьшение количества клеток злокачественных опухолей или увеличенную иммунную активность. Определение того, достигает ли некоторое количество синтетического онколитического вируса терапевтического эффекта, очевидно специалисту в данной области. Эффективные количества меняются, как известно специалисту в данной области, в зависимости от конкретного состояния, подвергаемого лечению, тяжести состояния, индивидуальных параметров пациента, включая возраст, физическое состояние, рост, пол и массу, длительности лечения, характера сопутствующей терапии (если она присутствует), конкретного способа введения и подобных факторов, находящихся в пределах знаний и компетенции специалиста в области здравоохранения. Эти факторы хорошо известны специалисту в данной области и могут быть учтены с использованием не более, чем общепринятых экспериментов. Как правило, является предпочтительным, чтобы была использована максимальная доза индивидуальных компонентов или их комбинаций, то есть, наивысшая безопасная доза, в соответствии с обоснованным врачебным решением.

Эмпирические соображения, такие как время полужизни, в общем, могут вносить вклад в определение дозы. Частота введения может быть определена и корректирована в ходе терапии, и как правило, но необязательно, основана на лечении и/или супрессии, и/или облегчении, и/или задержке целевого заболевания/нарушения. Альтернативно, составы для замедленного непрерывного высвобождения синтетического онколитического вируса могут являться пригодными. Различные составы и устройства для достижения замедленного высвобождения известны в данной области.

В некоторых вариантах осуществления, лечение представляет собой однократную инъекцию содержащей синтетический онколитический вирус фармацевтической композиции. В некоторых вариантах осуществления, однократную инъекцию вводят внутрь опухоли нуждающемуся в этом субъекту.

В некоторых примерах, дозы для синтетического онколитического вируса, как описано в настоящем описании, можно определять эмпирически у индивидуумов, которых подвергали одному или нескольким введению(введениям) синтетического онколитического вируса. Индивидуумам вводят пошагово увеличивающиеся дозы содержащей синтетический онколитический вирус фармацевтической композиции. Для оценки эффективности синтетического онколитического вируса, можно отслеживать показатель заболевания/нарушения. Для повторяющихся введений в течение нескольких суток или дольше, в зависимости от состояния, лечение продолжают, пока не возникнет желательная супрессия симптомов или пока не будут достигнуты достаточные терапевтические уровни для облегчения целевого заболевания или нарушения, или его симптома.

В некоторых вариантах осуществления, частота дозирования составляет один раз каждую неделю, каждые 2 недели, каждые 4 недели, каждые 5 недель, каждые 6 недель, каждые 7 недель, каждые 8 недель, каждые 9 недель или каждые 10 недель; или один раз каждый месяц, каждые 2 месяца или каждые 3 месяца, или дольше. Прогресс этой терапии легко мониторируют посредством общепринятых способов и анализов. Используемый режим дозирования синтетического онколитического вируса можно менять с течением времени.

В некоторых вариантах осуществления, способ, описанный в настоящем описании, включает введение нуждающемуся в лечении субъекту (например, пациенту-человеку) однократной или множественных доз содержащей синтетический онколитический вирус фармацевтической композиции.

Для целей по настоящему изобретению, подходящая доза синтетического онколитического вируса, как описано в настоящем описании, может зависеть от конкретного синтетического онколитического вируса, типа и тяжести заболевания/нарушения, того, вводят ли синтетический онколитический вирус для профилактических или терапевтических целей, предшествующей терапии, клинического анамнеза пациента и ответа на синтетический онколитический вирус, и решения лечащего терапевта. Медицинский работник может вводить синтетический онколитический вирус до достижения дозы, при которой достигают желательного результата. В некоторых вариантах осуществления, желательный результат представляет собой уменьшение опухолевой нагрузки, уменьшение количества клеток злокачественных опухолей, или увеличение иммунной активности. Способы определения того, привела ли доза к желательному результату, очевидны специалисту в данной области. Введение одного или нескольких синтетических онколитических вирусов может являться непрерывным или прерывистым, в зависимости, например, от физиологического состояния реципиента, того, является ли цель введения терапевтической или профилактической, и других факторов, известных практикующему специалисту в данной области. Введение синтетического онколитического вируса может являться по существу непрерывным в течение предварительно выбранного периода времени, или может быть осуществлено в сериях разделенных промежутками доз, например, до, во время или после развития целевого заболевания или нарушения.

В рамках изобретения, термин «лечение» относится к нанесению или введению композиции, включающей одно или несколько действующих веществ, субъекту, имеющему целевое заболевание или нарушение, симптом заболевания/нарушения, или предрасположенность к заболеванию/нарушению, с целью излечения, заживления, облегчения, смягчения, изменения, устранения, уменьшения, улучшения или подвергания влиянию нарушения, симптома заболевания или предрасположенности к заболеванию или нарушению.

Облегчение целевого заболевания/нарушения включает задержку развития или прогрессирования заболевания, или уменьшение тяжести заболевания. Облегчение заболевания не обязательно требует излечивающих результатов. В рамках изобретения, «задержка» развития целевого заболевания или нарушения обозначает сдвиг, торможение, замедление, сдерживание, стабилизацию и/или отсрочку прогрессирования заболевания. Эта задержка может составлять различные промежутки времени, в зависимости от анамнеза заболевания и/или индивидуумов, подвергаемых лечению. Способ, который «задерживает» или облегчает развитие заболевания, или задерживает начало заболевания, представляет собой способ, который уменьшает вероятность развития одного или нескольких симптомов заболевания в данные временные рамки и/или уменьшает степень симптомов в данные временные рамки, по сравнению с не использованием способа. Такие сравнения, как правило, основаны на клинических исследованиях, с использованием количества субъектов, достаточного для получения статистически значимого результата.

«Развитие» или «прогрессирование» заболевания обозначает первоначальные проявления и/или последующее прогрессирование заболевания. Развитие заболевания может поддаваться детекции и оценке с использованием стандартных клинических способов, как хорошо известно в данной области. Однако, развитие также относится к прогрессированию, которое может не поддаваться детекции. Для целей по настоящему изобретению, развитие или прогрессирование относится к биологическому течению симптомов. «Развитие» включает возникновение, рецидив и начало. В рамках изобретения «начало» или «возникновение» целевого заболевания или нарушения включает исходное начало и/или рецидив.

В некоторых вариантах осуществления, содержащую синтетический онколитический вирус фармацевтическую композицию, как описано в настоящем описании, вводят нуждающемуся в лечении субъекту в количестве, достаточном для уменьшения опухолевой нагрузки или роста клеток злокачественных опухолей, по меньшей мере на 5% (например, на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или более) in vivo. В других вариантах осуществления, содержащие синтетический онколитический вирус фармацевтические композиции, как описано в настоящем описании, можно вводить в количестве, эффективном для увеличения иммунной активности по меньшей мере на 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или более.

Субъект, подлежащий лечению способами, описанными в настоящем описании, может представляет собой млекопитающее, такое как человек, сельскохозяйственные животные, спортивные животные, домашние животные, приматы, лошади, собаки, кошки, мыши и крысы. В одном варианте осуществления, субъект представляет собой человека. Содержащую синтетический онколитический вирус композицию, как описано в настоящем описании, можно использовать для усиления иммунной активности, например, T-клеточной активности, у субъекта, нуждающегося в таком лечении.

В некоторых вариантах осуществления, субъект может представлять собой пациента-человека, имеющего, как подозревают, имеющего, или подверженного риску злокачественной опухоли. Неограничивающие примеры злокачественных опухолей включают меланому, плоскоклеточный рак, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аденокарциному легкого, плоскоклеточную карциному легкого, злокачественную опухоль брюшины, печеночноклеточный рак, рак желудочно-кишечного тракта, рак поджелудочной железы, глиобластому, рак шейки матки, рак яичника, рак печени, рак мочевого пузыря, гепатому, рак молочной железы, рак ободочной кишки, колоректальный рак, карциному эндометрия или матки, карциному слюнной железы, рак почки, рак предстательной железы, рак женских наружных половых органов, рак щитовидной железы, карциному печени, рак желудка и различные типы рака головы и шеи, включая плоскоклеточный рак головы и шеи. В некоторых вариантах осуществления, злокачественная опухоль может представляет собой меланому, рак легкого, колоректальный рак, почечноклеточный рак, уротелиальную карциному или лимфому Ходжкина.

Субъекта, имеющего целевое заболевание или нарушение (например, злокачественную опухоль), можно идентифицировать посредством общепринятого медицинского обследования, например, лабораторных тестов, функциональных тестов органов, сканирований КТ или ультразвуковых исследований. Субъект, как подозревают, имеющий любое из таких целевых заболеваний/нарушений, может демонстрировать один или несколько симптомов заболевания/нарушения. Субъект, подверженный риску заболевания/нарушения, может представляет собой субъекта, имеющего один или несколько из факторов риска, ассоциированных с этим заболеванием/нарушением. Такого субъекта также можно идентифицировать посредством общепринятой медицинской практики.

В некоторых вариантах осуществления, содержащую синтетический онколитический вирус фармацевтическую композицию можно использовать совместно с другим пригодным лекарственным средством (например, противораковым средством, противовирусным средством или антибактериальным средством) и/или другими средствами, которые служат для усиления и/или комплементации иммуностимулирующего эффекта синтетического онколитического вируса. В такой комбинированной терапии, содержащую синтетический онколитический вирус композицию и дополнительное лекарственное средство (например, противораковое лекарственное средство или другие, описанные в настоящем описании), можно вводить нуждающемуся в лечении субъекту последовательным способом, т.е., каждое лекарственное средство вводят в различное время. Альтернативно, эти лекарственные средства, или по меньшей мере два из средств, вводят субъекту по существу одновременным способом.

Комбинированная терапия может также охватывать введение средств, описанных в настоящем описании (например, содержащей синтетический онколитический вирус фармацевтической композиции и противоракового средства) в дополнительной комбинации с другими биологически активными ингредиентами (например, отличным противораковым средством) и видами немедикаментозной терапии (например, хирургией).

Следует понимать, что любую комбинацию содержащей синтетический онколитический вирус композиции и другого противоракового средства (например, химиотерапевтического средства) можно использовать в любой последовательности для лечения злокачественной опухоли. Комбинации, описанные в настоящем описании, можно выбирать на основании ряда факторов, которые включают, но без ограничения, эффективность уменьшения формирования опухоли или роста опухоли, уменьшение количества клеток злокачественных опухолей, увеличение иммунной активности, и/или облегчение по меньшей мере одного симптома, ассоциированного с злокачественной опухолью, или эффективность для ослабления побочных эффектов другого средства из комбинации. Например, комбинированная терапия, описанная в настоящем описании, может уменьшать любой из побочных эффектов, ассоциированный с каждым из индивидуальных членов комбинации, например, побочный эффект, ассоциированный с противораковым средством.

В некоторых вариантах осуществления, другое противораковое лекарственное средство представляет собой химиотерапию, радиотерапию, хирургическую терапию и/или иммунотерапию. Примеры химиотерапевтических средств включают, но без ограничения, карбоплатин или цисплатин, доцетаксел, гемцитабин, Nab-паклитаксел, паклитаксел, пеметрексед и винорелбин. Примеры радиотерапии включают, но без ограничения, ионизирующее излучение, гамма-облучение, радиотерапию пучком нейтронов, радиотерапию электронным пучком, протонную терапию, брахитерапию, системные радиоактивные изотопы и радиосенсибилизирующие средства. Примеры хирургической терапии включают, но без ограничения, излечивающую хирургию (например, хирургию для удаления опухоли), профилактическую хирургию, лапароскопическую хирургию и лазерную хирургию. Примеры иммунотерапии включают, но без ограничения, адоптивный клеточный перенос и терапевтические противораковые вакцины.

Дополнительные примеры химиотерапии включают, но без ограничения, содержащие платину средства, такие как карбоплатин, оксалиплатин, цисплатин, недаплатин, сатраплатин, лобаплатин, триплатин, тетранитрат, пикоплатин, пролиндак, ароплатин и другие производные; ингибиторы топоизомеразы I, такие как камптотецин, топотекан, иринотекан/SN38, рубитекан, белотекан и другие производные; ингибиторы топоизомеразы II, такие как этопозид (VP-16), даунорубицин, доксорубициновое средство (например, доксорубицин, доксорубицин HCl, аналоги доксорубицина, или доксорубицин и его соли или аналоги в липосомах), митоксантрон, акларубицин, эпирубицин, идарубицин, амрубицин, амсакрин, пирарубицин, валрубицин, зорубицин, тенипозид и другие производные; антиметаболиты, такие как семейство фолиевой кислоты (метотрексат, пеметрексед, ралтитрексид, аминоптерин и родственные соединения); антагонисты пурина (тиогуанин, флударабин, кладрибин, 6-меркаптопурин, пентостатин, клофарабин и родственные соединения) и антагонисты пиримидина (цитарабин, флоксуридин, азацитидин, тегафур, кармофур, капацитабин, гемцитабин, гидроксимочевина, 5-фторурацил (5FU) и родственные соединения); алкилирующие средства, такие как азотистые иприты (например, циклофосфамид, мелфалан, хлорамбуцил, мехлорэтамин, ифосфамид, трофосфамид, преднемустин, бендамустин, урамустин, эстрамустин и родственные соединения); нитрозомочевину (например, кармустин, ломустин, семустин, фотемустин, нимустин, ранимустин, стрептозоцин и родственные соединения); триазены (например, декарбазин, алтретамин, темозололмид, и родственные соединения); алкилсульфонаты (например, бусульфан, манносульфан, треосульфан и родственные соединения); прокарбазин; митобронитол и азиридины (например, карбоквон, триазиквон, тиотепа, триэтиленмеламин и родственные соединения); антибиотики, такие как гидроксимочевина, антрациклины (например, доксорубициновое средство, даунорубицин, эпирубицин и другие производные); антрацендионы (например, митоксантрон и родственные соединения); семейство Streptomyces (например, блеомицин, митомицин C, актиномицин, пликамицин); и ультрафиолетовый свет.

III. Наборы для использования в терапии

Настоящее изобретение также относится к наборам для использования в иммунотерапии против злокачественной опухоли (например, меланомы, рака легкого, колоректального рака или почечноклеточного рака), и/или в лечении или уменьшении риска злокачественной опухоли. Такие наборы могут включать один или несколько контейнеров, содержащих фармацевтическую композицию, содержащую синтетический онколитический вирус, например, любую из композиций, описанных в настоящем описании.

В некоторых вариантах осуществления, набор может содержать инструкции для использования в соответствии с любым из способов по изобретению, описанных в настоящем описании. Например, включенные инструкции могут содержат описание введения содержащей синтетический онколитический вирус композиции для лечения, задержки начала или облегчения целевого заболевания, такого как описанные в настоящем описании. Набор может дополнительно содержать описание выбора индивидуума, подходящего для лечения, на основании идентификации того, имеет ли индивидуум целевое заболевание. В других вариантах осуществления, инструкции содержат описание введения содержащей синтетический онколитический вирус композиции индивидууму, подверженному риску целевого заболевания.

Инструкции, относящиеся к использованию содержащей синтетический онколитический вирус композиции, как правило, включают информацию о дозировании, расписании дозирования и способе проведения намеченного лечения. Контейнеры могут представлять собой единичные дозы, нефасованные упаковки (например, упаковки множественных доз) или субъединичные дозы. Инструкции, представленные в наборах по изобретению, как правило, представляют собой письменные инструкции на этикетке или вкладыше в упаковку (например, лист бумаги, включенный в набор), однако, машиночитаемые инструкции (например инструкции, нанесенные на магнитный или оптический диск запоминающего устройства) также являются приемлемыми.

На этикетке или вкладыше в упаковку указано, что композиция предназначена для лечения, задержки начала и/или облегчения заболевания или нарушения, ассоциированного с злокачественной опухолью, такого как описанные в настоящем описании. Инструкции могут быть предоставлены для практического осуществления любого из способов, описанных в настоящем описании.

Наборы по настоящему изобретению находятся в подходящей упаковке. Подходящая упаковка включает, но без ограничения, флаконы, бутыли, банки, гибкую упаковку (например герметичные майларовые или пластиковые пакеты) и т.п. Предусмотрены также упаковки для использования в комбинации с конкретным устройством, таким как ингалятор, устройство для назального введения (например, распылитель) или инфузионное устройство, такое как мини-насос. Набор может иметь стерильное отверстие для доступа (например, контейнер может представлять собой пакет с раствором для внутривенного введения или флакон, имеющий пробку, прокалываемую иглой для подкожной инъекции). Контейнер может также иметь стерильное отверстие для доступа (например, контейнер может представлять собой пакет с раствором для внутривенного введения или флакон, имеющий пробку, прокалываемую иглой для подкожной инъекции). По меньшей мере одно действующее вещество в композиции представляет собой содержащую синтетический онколитический вирус композицию, такую как описанные в настоящем описании.

Наборы могут, необязательно, предоставлять дополнительные компоненты, такие как буферы, и пояснительную информацию. Обычно набор содержит контейнер и этикетку или вкладыш(и) в упаковку на контейнере или связанные с контейнером. В некоторых вариантах осуществления, изобретение относится к изделиям, вмещающим содержимое наборов, описанных выше.

IV. Общие способы

В практическом осуществлении настоящего изобретения используют, если не указано иное, общепринятые способы молекулярной биологии (включая рекомбинантные способы), микробиологии, клеточной биологии, биохимии и иммунологии, находящиеся в компетенции специалиста в данной области. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook, et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995). Считают, что, без дальнейшего уточнения, специалист в данной области может, на основании приведенного выше описания, использовать настоящее изобретение в его наиболее полной степени. Следующие конкретные варианты осуществления, таким образом, следует рассматривать только как иллюстративные, и совершенно не ограничивающие остальное описание никаким образом.

Содержание всех процитированных в настоящем описании публикаций приведено в качестве ссылки для целей или объектов, на которые ссылаются в настоящем описании.

Считают, что, без дальнейшего уточнения, специалист в данной области может, на основании приведенного выше описания, использовать настоящее изобретение в его наиболее полной степени. Следующие конкретные варианты осуществления, таким образом, следует рассматривать только как иллюстративные, и совершенно не ограничивающие остальное описание никаким образом. Содержание всех процитированных в настоящем описании публикаций приведено в качестве ссылки для целей или объектов, на которые ссылаются в настоящем описании.

ПРИМЕРЫ

Материалы и способы

Линии клеток и животные

Линии клеток представляли собой B16F10 (ATCC® CRL-6475™), HEK-blue-TLR2 (Invivogen), HEK-blue-TLR3 (Invivogen), HEK-blue-TLR7 (Invivogen), HEK-blue-TLR9 (Invivogen), Raw-Lucia ISG (Invivogen), и их культивировали, следуя инструкциям поставщика (37°C, 5% CO₂). Самок мышей C57BL/6J (JAX Stock No. 000664) в возрасте 6-8 недель закупали и содержали в виварии в Massachusetts Institute of Technology (MIT). Все исследования и процедуры с животными проводили, следуя федеральным, государственным и местным руководствам по одобренному IACUC протоколу работы с животными Комитета по содержанию и использованию животных MIT.

Антитела, окрашивание и анализ FACS

Антитела против мышиных Ly6c (HK1.4), CD11b (M1/70), CD11c (N418), F4/80 (BM8), MHC-II (M5/114.15.2), CD45 (30-F11), CD3 (17A2), CD4 (GK1.5), CD8 (53-6.7), NK1.1 (PK136), CD45.2 (104), CD24 (30-F1), XCR1 (ZET), CD64 (X54-5/7.1) были из Biolegend. Антитела против мышиных Ly6G (1A8), CD16/32 (2.4G2) и CD103 (M290) были из BD Biosciences. Антитела против мышиного кальретикулина (ab2907) были из Abcam. Краситель для живых/мертвых клеток (L34966) был из ThermoFisher.

Несущих опухоль меланому B16F10 мышей умерщвляли и подвергали некропсии, следуя федеральным, государственным и местным руководствам по одобренному IACUC протоколу работы с животными Комитета по содержанию и использованию животных MIT. Затем дренирующие опухоль лимфатические узлы измельчали, и опухоли нарезали и расщепляли с использованием коллагеназы IV (1 мг/мл) в течение одного часа для получения суспензии отдельных клеток. Суспензии отдельных клеток фильтровали посредством 70 мкм нейлонового ограничителя и окрашивали, как описано¹⁰.

Окрашенные образцы анализировали посредством анализатора FACS (LSR-II или LSR-II-Fortessa) от BD Biosciences. Анализировали посредством анализатора BD-LSRII Fortessa. Все данные проточной цитометрии анализировали посредством FlowJo (Flowjo LLC), и графики получали с использованием GraphPad Prism.

Конструкции, транскрипция in vitro, кэпирование/метилирование для репликона РНК и трансфекция Neon

Остовы конструкций мутантных репликонов происходили из эволюции in vitro в предшествующем исследовании (на редактировании). IL12-MSA и IL12-MSA-люмикан амплифицировали с плазмид из лаборатории Prof. Dane Wittrup, и конструировали в субгеномной области мутантного репликона.

Репликоны RNA транскрибировали in vitro (IVT) с матриц линеаризованных VEE-конструкций выше с использованием набора для транскрипции MEGAscript™ T7 (ThermoFisher), следуя инструкциям производителя. Полученные репликоны РНК кэпировали и метилировали с использованием системы кэпирования ScriptCap™ m7G и набора с 2'-O-метилтрансферазой ScriptCap™ (Cellscript), в соответствии с инструкциями производителя. Чистоту РНК оценивали посредством электрофореза в геле.

Трансфекции in vitro проводили с использованием 5 мкг РНК на 500000 клеток в 100 мкл буфера R из набора для электропорации NEON (ThermoFisher) в условиях 1200 вольт, 20 миллисекунд и 1 импульса.

Составы липидных наночастиц и инкапсуляция репликона РНК

Для инкапсуляции 10 мкг репликона РНК в DOTAP-наночастицу, липидную смесь, состоящую из 16,9375 мкл DOTAP (Avanti, кат. #890890, 10 мг/мл), 15,965 мкл DSPC (Avanti, кат. #850365, 3 мг/мл), 18,7675 мкл холестерина (Sigma-Aldrich, кат. #C8667, 6 мг/мл), 13,6 мкл DSPE-PEG2000 (Avanti, кат. #880128, 2,5 мг/мл) в молярном соотношении 40:10:48:2, получали в этаноле и выпаривали под N₂, пока не оставалась одна треть от общего начального объема. Затем 10 мкг репликона РНК (1 мг/мл) в 11,8 мкл 0,1 M цитратного буфера (PH 6,0) добавляли с использованием пипетирования, с последующим вторым добавлением дополнительных 22 мкл 0,1 M цитратного буфера (PH 6,0) с использованием пипетирования. Смесь встряхивали в течение часа и затем диализовали против PBS в течение следующего часа при 25°C в кассете для диализа с MWCO 3500.

Инкапсуляцию репликона РНК в липофектаминовую наночастицу проводили, следуя инструкциям к реагенту для трансфекции Липофектамин™ MessengerMAX™ (thermofisher.com/order/catalog/product/LMRNA008).

Для инкапсуляции 10 мкг репликона РНК в TT3-наночастицу, липидную смесь, состоящую из 10 мкл TT3 (10 мг/мл)¹¹, 8,04 мкл DOPE (Avanti, кат. # 850725, 10 мг/мл), 5,572 мкл холестерина (Sigma-Aldrich, кат. #C8667, 10 мг/мл), 3,452 мкл C14-PEG2000 (Avanti, кат. # 880150, 2 мг/мл) в молярном соотношении 20:30:40:0,75, получали в 10,437 мкл этанола. В смесь добавляли 4,167 мкл цитратного буфера (PH 3,0, 10 мМ). Затем 10 мкг репликона РНК (1 мг/мл) в 31,667 мкл цитратного буфера (PH 3,0, 10 мМ) добавляли с использованием пипетирования. Смесь диализовали против PBS в течение 80 минут при 25°C в кассете для диализа с MWCO 3500.

Полученные нагруженные репликоном липидные наночастицы аликвотировали в соответствующих дозах для внутриопухолевой инъекции (10 мкг/мышь) и для трансфекции in vitro (5 мкг/0,5 миллионов клеток в 500 мкл сред).

Окрашивание аннексина V/PI, анализ ATP и Elisa

При окрашивании аннексина V/PI следовали инструкции из набора от Biolegend (кат. #640932). Внеклеточный ATP анализировали посредством системы анализа ATP ENLITEN^® (Promega). HMGB1, CCL5, IFNα2, IL12, IFNγ измеряли посредством наборов для ELISA от Chondrex (кат. #6010, HMGB1), R & D System (кат. #DY478, CCL5), Abcam (кат. #ab215409, IFNα2) и Biolegend (кат. #88-7121-88, IL12, кат. #88-7314-88, IFNγ) и следуя их руководствам.

Выделение РНК и количественный анализ ПЦР

Для количественной оценки уровней транскриптов РНК, тотальную РНК выделяли из клеток или опухолей, трансфицированных с использованием LNP-репликона РНК, как указано, и подвергали обратной транскрипции посредством набора реагентов для обратной транскрипции TaqMan™ (ABI, каталожный No. N8080234), с последующей амплификацией с использованием готовой смеси Sybr Green (Roche) и специфических праймеров для Stat1 (кат. #MP215434), Stat2 (кат. #MP215434), IRF9 (кат. #MP206708), IRF3 (кат. #MP206702), cGAS (кат. #MP214711), и детектировали посредством устройства Roche LightCycler 480. Значения Ct нормализовали с использованием гена домашнего хозяйства актина B мыши для сравнения.

Пример 1: Синтетический «все в одном» LNP-репликон РНК для иммунотерапии злокачественной опухоли

Терапевтические способы можно упрощать, и терапевтическую эффективность можно умножать посредством синтетических многофункциональных липидных наночастиц (LNP) инкапсулирующих репликон РНК, с липидным компонентом и компонентом РНК, каждый из которых играет множество ролей: липидный состав, который как стимулирует клеточное поглощение/цитозольную доставку РНК, так и также в то же время напрямую запускает иммуногенную клеточную смерть. В тандеме, эта LNP доставляет самоамплифицирующийся репликон РНК, который как кодирует иммуномодулирующие терапевтические белки, так и напрямую обеспечивает иммуностимуляцию, усиливая последующий иммунный ответ. Функционально, этот синтетический LNP-репликон РНК должен индуцировать локальную иммуногенную клеточную смерть в опухоли и также неплохо экспрессирует иммуномодулирующее средство в трансфицированных клетках. Иммуногенная клеточная смерть может усиливать инфильтрацию опухоли иммуноцитами и обеспечивает резервуар опухолеспецифических антигенов, которые могут подвергаться перекрестному представлению для примирования новых T-клеточных ответов. Составы LNP, содержащие катионный липид TT3, идентифицированы как особенно подходящие для этих целей: 3 катионные липидные наночастицы, каждая из которых содержит ключевой катионный липид- DOTAP, липофектамин (Липо) или TT3. В качестве носителя РНК, использовали альфавирусный репликон, происходящий из вируса венесуэльского энцефалита лошадей, где структурные белки заменены грузом представляющего интерес гена, вставленным под субгеномным промотором,. При составлении с этим самоамплифицирующимся репликоном РНК (LNP-mtRep), липидные составы DOTAP, лирл и TT3 формировали частицы со средними диаметрами наночастиц 97, 46 и 105 нм, с дзета-потенциалами +22,9, -6,7 и +4,3 мВ, соответственно (фиг. 1G-1H). Токсичность «пустых» против нагруженных РНК (mtRep) LNP оценивали посредством инкубации каждого состава с клетками опухоли меланомы B16F10 in vitro. Этот анализ выявил, что жизнеспособность значимо уменьшалась для клеток, обработанных с использованием TT3-LNP, и mtRep проявлял синергизм с TT3 для стимуляции дополнительного уничтожения клеток опухоли на 3 сутки после трансфекции (фиг. 1A). TT3-LNP являлись более эффективными, чем DOTAP или Липо в стимуляции смерти клеток опухоли. Примечательно, что электропорация репликона напрямую в клетки опухолей являлась относительно нетоксичной, показывая, что уничтожение клеток стимулировано посредством доставки LNP. Для определения того, могут ли доставляемые посредством TT3 LNP-репликоны управлять экспрессией груза гена до клеточной смерти, авторы настоящего изобретения оценивали экспрессию репортерного гена GFP после обработки LNP(mtRep). Обработка TT3-mtRep приводила к экспрессии GFP в ~35,4% клеток B16F10 через 12 часов после трансфекции, ниже чем для электропорации (~90%), но значимо лучше, чем для обработок DOTAP-mtRep (~0,05%) или Липо-mtRep (~7,6%) (фиг. 1B). В соответствии с фигурой 1A, для клеток, трансфицированных TT3-наночастицами, показана большая популяция аннексина V+/PI+ мертвых клеток, и mtRep снова проявлял синергизм со смертью этих клеток (фиг. 1C).

Для определения того, является ли клеточная смерть, запускаемая посредством TT3(mtRep), типом иммуногенной клеточной смерти (ICD), измеряли кальретикулин (CRT), который обычно остается на эндоплазматическом ретикулуме (ER) и мигрирует к клеточной поверхности в качестве сигнала «съешь меня» в ходе ICD1. TT3 и mtRep проявляли синергизм для стимуляции транспорта CRT к клеточным поверхностям (фиг. 1D). Внеклеточный ATP активирует NLRP3 инфламмасому 2 и внеклеточный HMGB1 опосредует воспаление 3 в ходе ICD. TT3, TT3-mtRep и TT3-deRep эффективно индуцировали высвобождение ATP и HMGB1. (фиг. 1E и 1F). Учитывая это совместно, TT3-mtRep РНК представляет собой многообещающий онколитический состав, который может индуцировать иммуногенную клеточную смерть, в то же время также приводя к временной экспрессии груза генов, кодируемых репликоном.

Пример 2: Репликон РНК запускает передачу сигналов TLR3 и индуцирует комплекс ISGF3, связанный с некротической клеточной смертью

Для определения механизмов, лежащих в основе синергизма клеточной смерти посредством репликона и TT3-LNP, DOTAP-, Липо- или TT3-наночастицы в присутствии или в отсутствие инкапсулированного mtRep, кодирующего репортерный ген (или инкапсулированного мутантного «мертвого» репликона (deRep), лишенного функциональной экспрессии генов), трансфицировали в репортерные клетки HEK-TLR2, HEK-TLR3, HEK-TLR7 или HEK-TLR9 (invivogen.com). Как Липо-, так и TT3-LNP, несущие mtRep или deRep, активировали передачу сигналов TLR3, но ни один из других тестированных TLR не был стимулирован (фиг. 2A-D). При тестировании в репортерных клетках Raw-Lucia-ISG (invivogen.com), стимулируемые интерфероном гены подвергались значимой индукции посредством тех же самых составов LNP (фиг. 2E). Эти данные позволяют предполагать, что TLR3 узнает репликон РНК и индуцирует ответы интерферона в ответ на опосредованную LNP доставку.

Поскольку репликон РНК активирует передачу сигналов TLR3 посредством TRIF для продукции интерферона типа I⁴, что приводит к активации комплекса ISGF3 (Stat 1/Stat 2/IRF9) для некротической клеточной смерти⁵, авторы настоящего изобретения анализировали уровни транскриптов мРНК для компонентов комплекса ISGF3, Stat1, Stat2 и IRF9, так же как генов пути STING, IRF3 и cGAS, посредством qПЦР. TT3-наночастицы, инкапсулирующие mtRep или deRep, увеличивали в ~6, ~16 и ~3 раза уровни Stat1, Stat2, IRF9, по сравнению с контролем без обработки (фиг. 2F-H), соответственно. В отличие от этого, они не оказывали эффекта на транскрипцию IRF3 или cGAS (фиг. 2I-J). Составы DOTAP и Липо не могли индуцировать комплекс ISGF3, вероятно, из-за низкой эффективности трансфекции репликона РНК этими наночастицами (фиг. 1B). Эти данные позволяли предполагать, что mtRep и deRep, вероятно, активируют передачу сигналов TLR3 и индуцируют комплекс ISGF3 для стимуляции некротической клеточной смерти, типа иммуногенной клеточной смерти.

Пример 3: TT3-mtRep привлекает иммуноциты и вызывает регрессию развившихся опухолей

Представляло интерес, оказывает ли TT3-mtRep эффекты на иммуногенную клеточную смерть и экспрессию груза генов in vivo. Абсолютную численность Ly6c^lo Ly6G⁺ популяций гранулоцитов, которые являются ассоциированными с ответами на некротическую клеточную смерть⁶, измеряли в опухолях на 3 сутки после внутриопухолевой инъекции TT3-наночастиц, инкапсулирующих репликон РНК дикого типа (wtRep), с другим мутантным репликоном РНК (mt2Rep) и мутантным репликоном (mtRep), используемым выше. Неожиданно, для mtRep показано значимо более высокое (в ~2 раза выше) привлечение этой популяции гранулоцитов к опухолям (фигура 3A), и лучшая экспрессия репортерного гена mCherry, кодируемого посредством субгеномного промотора (фиг. 3B). Таким образом, TT3-mtRep индуцирует иммуногенную клеточную смерть с достаточной экспрессией груза гена. Затем проводили исследование in vivo с использованием TT3-mtRep.

Измеряли уровень экспрессии Stat1/Stat2/IRF9, так же как генов передачи сигналов STING IRF3 и cGAS in vivo после внутриопухолевой доставки репликонов посредством LNP. В соответствии с фиг. 2F-J in vitro, опухоли, подвергнутые инъекции TT3-mtRep, экспрессировали значимо более высокий уровень Stat1/Stat2/IRF9 (комплекса ISGF3), но со сравнимыми уровнями IRF3 и cGAS (фиг. 3C), что позволяет предполагать, что введение TT3-mtRep также инициирует некротическую клеточную смерть in vivo.

Для лучшего понимания эффектов TT3-mtRep на иммунный состав в опухоли, иммуноциты, такие как гранулоциты (CD45⁺ CD11b⁺ Ly6c^lo Ly6G⁺), M-MDSC (CD45⁺ CD11b⁺ Ly6c^hi Ly6G⁺), моноциты (D45⁺ CD11b⁺ Ly6c^lo Ly6G^-), макрофаги (CD45⁺ CD11b⁺ Ly6c^- Ly6G^- F4/80⁺), CD4 T (CD45⁺ CD3ε⁺ CD4⁺), CD8 T (CD45⁺ CD3ε⁺ CD8⁺), NK (CD45⁺ CD3ε^- NK1.1⁺), NKT (CD45⁺ CD3ε⁺ NK1.1⁺), обычные DC1 (cDC1, CD45⁺ CD11c⁺ MHC-II⁺ CD24⁺ CD64^- CD103⁺ CD11b^- XCR1^hi), и обычные DC2 (cDC2, CD45⁺ CD11c⁺ MHC-II⁺ CD24⁺ CD64^- CD103⁺ CD11b⁺ XCR1^lo), картировали и количественно оценивали в опухолях на сутки 1 (фиг. 3D) и сутки 3 (фиг. 3E) после одной инъекции, и на сутки 1 (фиг. 3F) после трех последовательных инъекций LNP-репликона РНК. В этом динамическом анализе иммунного состава опухоли, гранулоциты и cDC1 подвергались быстрому привлечению и уменьшению уровня на сутки 1 после инъекции репликона РНК, соответственно (фигура 3C), позволяя предполагать, что гранулоциты могут представлять собой раннее событие, и cDC1, вероятно, начинает мигрировать к дренирующему опухоль лимфатическому узлу (TDLN) в ответ на LNP-репликон РНК. На 3 сутки после инъекции репликона РНК, клетки CD4 T, CD8 T, NK и NKT также привлекались (фигура 3D). При введении 3 последовательных инъекций LNP-репликона РНК, уровень моноцитов увеличивался, а макрофагов уменьшался, но менее значимые изменения наблюдали в лимфоидных клетках, таких как клетки CD4 T, NK, и NKT (фигура 3E). В качестве эффектов этих ~3 последовательных инъекций, присутствовали на ~10% больше клеточной смерти (фигура 3F), в ~4 раза более высокий уровень инфильтрующих опухоль иммуноцитов (фигура 3G), и 2-кратное уменьшение массы опухоли (фигура 3H) в образцах из группы TT3-mtRep, что приводило к значимой регрессии роста опухоли (фигура 3I). В соответствии с тем, что клетки NK, и NKT возникали вместе с обработками TT3-mtRep, значимо индуцированной являлась экспрессия CCL5 (фигура 3I), который в основном секретируется посредством NK⁷ и активирует CD8 T-клетки (rstats.immgen.org/Skyline/skyline.html). Эти данные показывают, что TT3-mtRep индуцировал иммуногенную клеточную смерть в опухолях с экспрессией груза генов, как наблюдали на фиг. 1 и фиг. 2 in vitro. Наиболее важно, TT3-mtRep значительно модулировал микроокружение опухоли, и приводил к привлечению к опухоли CD8 T-клеток и клеток NK.

Пример 4: TT3-mtRep, кодирующий IL12-MSA или IL12-MSA-люмикан, эффективно модулирует микроокружение опухолей и иммунный состав

В то время как внутриопухолевая инъекция TT3(mtRep), кодирующего только репортерные гены, приводила к задержке роста опухоли, кодирование иммуномодулирующих белков в репликоне могло приводить к дополнительной иммуностимуляции и усилению противоопухолевого иммунитета. Привлекательным кандидатом является IL-12, который может поляризовать CD4 T-клетки-помощники до Th1 и усиливать эффекты цитотоксичности клеток NK и CD8 T⁸. Одна из субъединиц IL12, также названная как IL12b или IL12p40, в основном секретируется из антигенпредставляющих клеток (CD8⁺ DC) (rstats.immgen.org/Skyline/skyline.html), которые могут быть функционально аактивированы посредством интерферона типа I⁹. Однако, уровень интерферона α2 (IFNα2), главной формы интерферона типа I, является низким либо в сыворотке (фиг. 4A), либо в опухолях (фиг. 4B) на сутки 1 и сутки 3 после инъекций TT3-mtRep, что позволяет предполагать, что уровень IL-12, секретированного посредством DC, все еще может являться низким в микроокружении опухоли (TME). Таким образом, конструировали IL12-MSA или IL12-MSA-люмикан, в котором слиты IL12α (P30), IL12β (P40) с мышиным сывороточным альбумином (MSA), или с MSA и люмиканом. Люмикан представляет собой эндогенный связывающий коллаген белок, который, как заключили авторы настоящего изобретения, может стимулировать удержание экспрессированного IL-12 в TME для усиления эффективности и безопасности терапии репликоном. Конструкциями репликонов трансфицировали клетки B16F10 in vitro посредством трансфекции с использованием NEON, и авторы настоящего изобретения подтвердили секрецию IL12 в этих трансфицированных клетках посредством ELISA (фиг. 4C).

Согласованно, опухоли, подвергнутые инъекции TT3-mtRep, кодирующего IL12-MSA (TT3-mtRep-IL12-MSA) или IL12-MSA-люмикан (TT3-mtRep-IL12-MSA-люмикан), экспрессировали высокие уровни IL12 in vivo, достигающие 40 нг/мг в опухолях (фиг. 4D). По сравнению с иммунным составом в опухоли на сутки 1 после инъекций, уровень гранулоцитов был в 1,5-3 раза увеличен в опухолях, обработанных TT3-mtRep, экспрессирующим IL12-MSA и IL12-MSA-люмикан, в отличие от группы, обработанной TT3-mtRep, кодирующим репортерный ген mCherry (фиг. 4E). На сутки 3, в группах IL12-MSA и IL12-MSA-люмикана к опухолям были привлечены в ~2-3 раза более высокие уровни гранулоцитов, CD8 T-клеток и клеток cDC2, по сравнению с репликонами, кодирующими не относящийся к делу репортерный ген (фиг. 4F). Интересно, что для всех опухолей, подвергнутых обработке с использованием TT3-mtRep, кодирующего репортерные гены, IL12-MSA, или IL12-MSA-люмикан, показано уменьшение уровней клеток cDC1, по сравнению с не подвергнутой реакции группой (фиг. 4E-4F). Для определения того, мигрировали ли cDC1 в TDLN, авторы настоящего изобретения подсчитали клетки cDC1 в нем и показали, что количество клеток cDC1 в лимфатических узлах значимо увеличивалось после обработки TT3-mtRep, независимо от того, какой груз гена был кодирован (фиг. 4G). Увеличение количества клеток cDC1 продолжалось в группе IL12-MSA (фиг. 4G).

Пример 5: Иммуномодулирующий IL12 и ICD, индуцированные посредством TT3-mtRep, эффективно уничтожают опухоль B16F10

Поскольку введение белка IL12 имеет тяжелые побочные эффекты в клинических исследованиях, авторы настоящего изобретения измеряли изменения массы тела несущих опухоль мышей, обработанных кодируемым репликоном IL-12. Группа mtRep-IL12-MSA имела потерю массы тела ~5%, которая продолжалась неделю. В отличие от этого, группы mtRep и mtRep-IL12-MSA-люмикана имели только ~2% потерю массы тела и восстанавливались за несколько суток (фиг. 5A). Соответственно, авторам настоящего изобретения не удалось измерить IL-6 или TNFα в сыворотке на сутки 1 или сутки 3 после инъекции of mtRep-IL12-MSA или mtRep-IL12-MSA-люмикана (данные не представлены). Однако, авторы настоящего изобретения наблюдали значимое увеличение уровней IFN-γ в сыворотке в группе mtRep-IL12-MSA (фиг. 5B), в соответствии с потерей массы тела на фиг. 5A. Интересно, что для репликонов, экспрессирующих IL12-MSA или IL12-MSA-люмикан, показана очень сильная регрессия опухоли, даже для больших развившихся опухолей, с размерами при обработке 50 мм² (фиг. 5C). Несущие опухоль мыши, обработанные TT3-mtRep, кодирующими IL12-MSA и IL12-MSA-люмикан, были на 60% и 80% свободными от опухоли через 75 суток после инъекции B16F10, соответственно. Для определения того, вызван ли у этих излеченных мышей системный иммунный ответ, который мог предотвращать рецидив опухоли B16F10, этих мышей заражали с использованием 0,1 миллионов клеток B16F10 в противоположный бок. Как ожидали, все из излеченных мышей отторгали опухоль B16F10, в отличие от наивных мышей, у которых быстро развивалась опухоль B16F10. Эти данные показывают, что синергизм иммуномодулирующего IL12 и ICD (иммуногенной клеточной смерти) мог эффективно уничтожать опухоль B16F10 и индуцировать системные иммунные ответы для предотвращения рецидива опухоли B16F10.

Список литературы:

1 Yun, Y.R. et al. Fibroblast growth factors: biology, function, and application for tissue regeneration. J Tissue Eng 2010, 218142, doi:10.4061/2010/218142 (2010).

2 Zha, Q.B. et al. ATP-Induced Inflammasome Activation and Pyroptosis Is Regulated by AMP-Activated Protein Kinase in Macrophages. Front Immunol 7, 597, doi:10.3389/fimmu.2016.00597 (2016).

3 Magna, M. & Pisetsky, D.S. The role of HMGB1 in the pathogenesis of inflammatory and autoimmune diseases. Mol Med 20, 138-146, doi:10.2119/molmed.2013.00164 (2014).

4 Kawai, T. & Akira, S. TLR signaling. Cell Death Differ 13, 816-825, doi:10.1038/sj.cdd.4401850 (2006).

5 McComb, S. et al. Type-I interferon signaling through ISGF3 complex is required for sustained Rip3 activation and necroptosis in macrophages. Proc Natl Acad Sci USA 111, E3206-3213, doi:10.1073/pnas.1407068111 (2014).

6 Haverkamp, J.M. et al. Myeloid-derived suppressor activity is mediated by monocytic lineages maintained by continuous inhibition of extrinsic and intrinsic death pathways. Immunity 41, 947-959, doi:10.1016/j.immuni.2014.10.020 (2014).

7 Bottcher, J.P. et al. NK Cells Stimulate Recruitment of cDC1 into the Tumor Microenvironment Promoting Cancer Immune Control. Cell 172, 1022-1037 e1014, doi:10.1016/j.cell.2018.01.004 (2018).

8 Lasek, W., Zagozdzon, R. & Jakobisiak, M. Interleukin 12: still a promising candidate for tumor immunotherapy? Cancer Immunol Immunother 63, 419-435, doi:10.1007/s00262-014-1523-1 (2014).

9 Montoya, M. et al. Type I interferons produced by dendritic cells promote their phenotypic and functional activation. Blood 99, 3263-3271, doi:DOI 10.1182/blood.V99.9.3263 (2002).

10 Li, Y. et al. Persistent Antigen and Prolonged AKT-mTORC1 Activation Underlie Memory CD8 T Cell Impairment in the Absence of CD4 T Cells. J Immunol 195, 1591-1598, doi:10.4049/jimmunol.1500451 (2015).

11 Li, B. et al. An Orthogonal Array Optimization of Lipid-like Nanoparticles for mRNA Delivery in vivo. Nano Lett 15, 8099-8107, doi:10.1021/acs.nanolett.5b03528 (2015).

ДРУГИЕ ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Все из признаков, описанных в настоящем описании, можно комбинировать в любой комбинации. Каждый признак, описанный в настоящем описании, может быть заменен альтернативным признаком, служащим такой же, эквивалентной или сходной цели. Таким образом, если явно не указано иное, каждый описанный признак является только примером общих серий эквивалентных или сходных признаков.

Из приведенного выше описания, специалист в данной области может легко узнать существенные характеристики настоящего изобретения, и без отклонения от его сущности и объема, может осуществлять различные изменения и модификации по изобретению для его адаптации к различным применениям и условиям. Таким образом, другие варианты осуществления также включены в формулу изобретения.

ЭКВИВАЛЕНТЫ

В то время как несколько изобретательских вариантов осуществления описаны и проиллюстрированы в настоящем описании, специалист в данной области может легко предусматривать множество других средств и/или структур для осуществления функции и/или получения результатов, и/или одного или нескольких из преимуществ, описанных в настоящем описании, и каждый из таких вариантов и/или модификаций рассматривают как включенный в объем изобретательских вариантов осуществления, описанных в настоящем описании. В более общем смысле, специалисту в данной области ясно понятно, что все параметры, измерения, материалы и конфигурации, описанные в настоящем описании, понимают как являющиеся иллюстративными, и что фактические параметры, измерения, материалы, и/или конфигурации могут зависеть от специфического применения или применений, для которых изобретательские объяснения использовано/использованы. Специалисту в данной области известно, или он является способным определять с использованием не более, чем общепринятых экспериментов, множество эквивалентов конкретных изобретательских вариантов осуществления, описанных в настоящем описании. Таким образом, следует понимать, что предшествующие варианты осуществления представлены только в качестве примера, и что, в объеме прилагаемых пунктов формулы изобретения и их эквивалентов, изобретательские варианты осуществления можно осуществлять на практике иным образом, чем как конкретно описано и заявлено. Изобретательские варианты осуществления по настоящему описанию относятся к каждому индивидуальному признаку, системе, изделию, материалу, набору и/или способу, описанному в настоящем описании. Кроме того, любая комбинация двух или более таких признаков, систем, изделий, материалов, наборов и/или способов, если такие признаки, системы, изделия, материалы, наборы и/или способы не являются взаимно несовместимыми, включена в объем изобретения по настоящему описанию.

Все определения, как определено и использовано в настоящем описании, следует понимать как имеющие преимущество над словарными определениями, определениями в документах, включенных в качестве ссылки, и/или обычными значениями определенных терминов.

Содержание всех ссылок, патентов и патентных заявок, описанных в настоящем описании, приведено в качестве ссылки применительно к субъекту, для которого они процитированы, что, в некоторых случаях, может включать весь документ.

Неопределенные артикли «a» и «an», в рамках изобретения, в описании и в формуле изобретения, если явно не указано противоположное, следует понимать как обозначающие «по меньшей мере один». Фразу «и/или», в рамках изобретения, в описании и в формуле изобретения, следует понимать как обозначающую «любой или оба» из элементов, соединенных таким образом, т.е., элементов, присутствующих совместно, в некоторых случаях, и отдельно присутствующих в других случаях. Множество элементов, перечисленных с «и/или», следует рассматривать таким же образом, т.е., «один или несколько» элементов, соединенных таким образом. Другие элементы могут, необязательно, присутствовать, отличные от элементов, конкретно идентифицированных посредством условия «и/или», независимо от того, родственные они или неродственные элементам, конкретно идентифицированным. Таким образом, в качестве неограничивающего примера, ссылка на «A и/или B», при использовании в сочетании с неограничивающим выражением, таким как «содержащий», может относиться, в одном варианте осуществления, только к A (необязательно, включая элементы, отличные от B); в другом варианте осуществления, только к B (необязательно, включая элементы, отличные от A); в другом варианте осуществления, к обоим A и B (необязательно, включая другие элементы); и т.д.

В рамках изобретения, в описании и в формуле изобретения, «или» следует понимать, как имеющее такое же значение, как «и/или», как определено выше. Например, при разделении пунктов в списке, «или» или «и/или» следует интерпретировать как являющийся включительным, т.е., включение по меньшей мере одного, но также включение более одного, из ряда или списка элементов, и, необязательно, дополнительных неперечисленных пунктов. Только термины, явно указывающие на противоположное, такие как «только один из» или «точно один из», или, при использовании в формуле изобретения, «состоящий из», относятся к включению точно одного элемента из ряда или списка элементов. Как правило, термин «или», в рамках изобретения, следует интерпретировать как указывающий на исключительные альтернативы (т.е. «один или другой, но не оба»), только когда ему предшествуют термины исключительности, такие как «любой», «один из», «только один из» или «точно один из». «Состоящий в основном из», при использовании в формуле изобретения, должен иметь его обычное значение, как используют в области патентного законодательства.

В рамках изобретения, в описании и в формуле изобретения, фразу «по меньшей мере один», применительно к списку из одного или нескольких элементов, следует понимать как обозначающую по меньшей мере один элемент, выбранный из любого одного или нескольких элементов в списке элементов, но необязательно включающий по меньшей мере один из всех без исключения элементов, конкретно перечисленных в списке элементов, и не исключающую никакие комбинации элементов в списке элементов. Это определение также позволяет то, чтобы могли, необязательно, присутствовать элементы, отличные от элементов, конкретно идентифицированных в списке элементов, к которому относится фраза «по меньшей мере один», независимо от того, родственные они или неродственные элементам, конкретно идентифицированным. Таким образом, в качестве неограничивающего примера, «по меньшей мере один из A и B» (или, эквивалентно, «по меньшей мере один из A или B», или, эквивалентно, «по меньшей мере один из A и/или B»), может обозначать, в одном варианте осуществления, по меньшей мере один, необязательно, включая более чем один, A, без присутствия B (и необязательно, включая элементы, отличные от B); в другом варианте осуществления, по меньшей мере один, необязательно, включая более чем один, B, без присутствия A (и необязательно, включая элементы, отличные от A); в другом варианте осуществления, по меньшей мере один, необязательно, включая более чем один, A, и по меньшей мере один, необязательно, включая более чем один, B (и необязательно, включая другие элементы); и т.д.

Следует также понимать, что, если явно не указано противоположное, в любых способах, заявленных в настоящем описании, которые включают более одной стадии или действия, порядок стадий или действий способа необязательно является ограниченным порядком, в которых стадии или действия способа перечислены.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Massachusetts Institute of Technology

<120> СИНТЕТИЧЕСКИЙ ОНКОЛИТИЧЕСКИЙ LNP-РЕПЛИКОН РНК И ПРИМЕНЕНИЯ ДЛЯ

ИММУНОТЕРАПИИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЕЙ

<130> M0656.70464WO00

<140> Еще не присвоен

<141> Одновременно с

<150> US 62/815611

<151> 2019-03-08

<160> 5

<170> PatentIn версии 3.5

<210> 1

<211> 10276

<212> ДНК

<213> Неизвестно

<220>

<223> Вирус VEE

<400> 1

atgggcggcg catgagagaa gcccagacca attacctacc caaaatggag aaagttcacg

60

ttgacatcga ggaagacagc ccattcctca gagctttgca gcggagcttc ccgcagtttg

120

aggtagaagc caagcaggtc actgataatg accatgctaa tgccagagcg ttttcgcatc

180

tggcttcaaa actgatcgaa acggaggtgg acccatccga cacgatcctt gacattggaa

240

gtgcgcccgc ccgcagaatg tattctaagc acaagtatca ttgtatctgt ccgatgagat

300

gtgcggaaga tccggacaga ttgtataagt atgcaactaa gctgaagaaa aactgtaagg

360

aaataactga taaggaattg gacaagaaaa tgaaggagct ggccgccgtc atgagcgacc

420

ctgacctgga aactgagact atgtgcctcc acgacgacga gtcgtgtcgc tacgaagggc

480

aagtcgctgt ttaccaggat gtatacgcgg ttgacggacc gacaagtctc tatcaccaag

540

ccaataaggg agttagagtc gcctactgga taggctttga caccacccct tttatgttta

600

agaacttggc tggagcatat ccatcatact ctaccaactg ggccgacgaa accgtgttaa

660

cggctcgtaa cataggccta tgcagctctg acgttatgga gcggtcacgt agagggatgt

720

ccattcttag aaagaagtat ttgaaaccat ccaacaatgt tctattctct gttggctcga

780

ccatctacca cgagaagagg gacttactga ggagctggca cctgccgtct gtatttcact

840

tacgtggcaa gcaaaattac acatgtcggt gtgagactat agttagttgc gacgggtacg

900

tcgttaaaag aatagctatc agtccaggcc tgtatgggaa gccttcaggc tatgctgcta

960

cgatgcaccg cgagggattc ttgtgctgca aagtgacaga cacattgaac ggggagaggg

1020

tctcttttcc cgtgtgcacg tatgtgccag ctacattgtg tgaccaaatg actggcatac

1080

tggcaacaga tgtcagtgcg gacgacgcgc aaaaactgct ggttgggctc aaccagcgta

1140

tagtcgtcaa cggtcgcacc cagagaaaca ccaataccat gaaaaattac cttttgcccg

1200

tagtggccca ggcatttgct aggtgggcaa aggaatataa ggaagatcaa gaagatgaaa

1260

ggccactagg actacgagat agacagttag tcatggggtg ttgttgggct tttagaaggc

1320

acaagataac atctatttat aagcgcccgg atacccaaac catcatcaaa gtgaacagcg

1380

atttccactc attcgtgctg cccaggatag gcagtaacac attggagatc gggctgagaa

1440

caagaatcag gaaaatgtta gaggagcaca aggagccgtc acctctcatt accgccgagg

1500

acgtacaaga agctaagtgc gcagccgatg aggctaagga ggtgcgtgaa gccgaggagt

1560

tgcgcgcagc tctaccacct ttggcagctg atgttgagga gcccactctg gaggcagacg

1620

tcgacttgat gttacaagag gctggggccg gctcagtgga gacacctcgt ggcttgataa

1680

aggttaccag ctacgatggc gaggacaaga tcggctctta cgctgtgctt tctccgcagg

1740

ctgtactcaa gagtgaaaaa ttatcttgca tccaccctct cgctgaacaa gtcatagtga

1800

taacacactc tggccgaaaa gggcgttatg ccgtggaacc ataccatggt aaagtagtgg

1860

tgccagaggg acatgcaata cccgtccagg actttcaagc tctgagtgaa agtgccacca

1920

ttgtgtacaa cgaacgtgag ttcgtaaaca ggtacctgca ccatattgcc acacatggag

1980

gagcgctgaa cactgatgaa gaatattaca aaactgtcaa gcccagcgag cacgacggcg

2040

aatacctgta cgacatcgac aggaaacagt gcgtcaagaa agaactagtc actgggctag

2100

ggctcacagg cgagctggtg gatcctccct tccatgaatt cgcctacgag agtctgagaa

2160

cacgaccagc cgctccttac caagtaccaa ccataggggt gtatggcgtg ccaggatcag

2220

gcaagtctgg catcattaaa agcgcagtca ccaaaaaaga tctagtggtg agcgccaaga

2280

aagaaaactg tgcagaaatt ataagggacg tcaagaaaat gaaagggctg gacgtcaatg

2340

ccagaactgt ggactcagtg ctcttgaatg gatgcaaaca ccccgtagag accctgtata

2400

ttgacgaagc ttttgcttgt catgcaggta ctctcagagc gctcatagcc attataagac

2460

ctaaaaaggc agtgctctgc ggggatccca aacagtgcgg tttttttaac atgatgtgcc

2520

tgaaagtgca ttttaaccac gagatttgca cacaagtctt ccacaaaagc atctctcgcc

2580

gttgcactaa atctgtgact tcggtcgtct caaccttgtt ttacgacaaa aaaatgagaa

2640

cgacgaatcc gaaagagact aagattgtga ttgacactac cggcagtacc aaacctaagc

2700

aggacgatct cattctcact tgtttcagag ggtgggtgaa gcagttgcaa atagattaca

2760

aaggcaacga aataatgacg gcagctgcct ctcaagggct gacccgtaaa ggtgtgtatg

2820

ccgttcggta caaggtgaat gaaaatcctc tgtacgcacc cacctcagaa catgtgaacg

2880

tcctactgac ccgcacggag gaccgcatcg tgtggaaaac actagccggc gacccatgga

2940

taaaaacact gactgccaag taccctggga atttcactgc cacgatagag gagtggcaag

3000

cagagcatga tgccatcatg aggcacatct tggagagacc ggaccctacc gacgtcttcc

3060

agaataaggc aaacgtgtgt tgggccaagg ctttagtgcc ggtgctgaag accgctggca

3120

tagacatgac cactgaacaa tggaacactg tggattattt tgaaacggac aaagctcact

3180

cagcagagat agtattgaac caactatgcg tgaggttctt tggactcgat ctggactccg

3240

gtctattttc tgcacccact gttccgttat ccattaggaa taatcactgg gataactccc

3300

cgtcgcctaa catgtacggg ctgaataaag aagtggtccg tcagctctct cgcaggtacc

3360

cacaactgcc tcgggcagtt gccactggaa gagtctatga catgaacact ggtacactgc

3420

gcaattatga tccgcgcata aacctagtac ctgtaaacag aagactgcct catgctttag

3480

tcctccacca taatgaacac ccacagagtg acttttcttc attcgtcagc aaattgaagg

3540

gcagaactgt cctggtggtc ggggaaaagt tgtccgtccc aggcaaaatg gttgactggt

3600

tgtcagaccg gcctgaggct accttcagag ctcggctgga tttaggcatc ccaggtgatg

3660

tgcccaaata tgacataata tttgttaatg tgaggacccc atataaatac catcactatc

3720

agcagtgtga agaccatgcc attaagctta gcatgttgac caagaaagct tgtctgcatc

3780

tgaatcccgg cggaacctgt gtcagcatag gttatggtta cgctgacagg gccagcgaaa

3840

gcatcattgg tgctatagcg cggcagttca agttttcccg ggtatgcaaa ccgaaatcct

3900

cacttgaaga gacggaagtt ctgtttgtat tcattgggta cgatcgcaag gcccgtacgc

3960

acaattctta caagctttca tcaaccttga ccaacattta tacaggttcc agactccacg

4020

aagccggatg tgcaccctca tatcatgtgg tgcgagggga tattgccacg gccaccgaag

4080

gagtgattat aaatgctgct aacagcaaag gacaacctgg cggaggggtg tgcggagcgc

4140

tgtataagaa attcccggaa agcttcgatt tacagccgat cgaagtagga aaagcgcgac

4200

tggtcaaagg tgcagctaaa catatcattc atgccgtagg accaaacttc aacaaagttt

4260

cggaggttga aggtgacaaa cagttggcag aggcttatga gtccatcgct aagattgtca

4320

acgataacaa ttacaagtca gtagcgattc cactgttgtc caccggcatc ttttccggga

4380

acaaagatcg actaacccaa tcattgaacc atttgctgac agctttagac accactgatg

4440

cagatgtagc catatactgc agggacaaga aatgggaaat gactctcaag gaagcagtgg

4500

ctaggagaga agcagtggag gagatatgca tatccgacga ctcttcagtg acagaacctg

4560

atgcagagct ggtgagggtg catccgaaga gttctttggc tggaaggaag ggctacagca

4620

caagcgatgg caaaactttc tcatatttgg aagggaccaa gtttcaccag gcggccaagg

4680

atatagcaga aattaatgcc atgtggcccg ttgcaacgga ggccaatgag caggtatgca

4740

tgtatatcct cggagaaagc atgagcagta ttaggtcgaa atgccccgtc gaagagtcgg

4800

aagcctccac accacctagc acgctgcctt gcttgtgcat ccatgccatg actccagaaa

4860

gagtacagcg cctaaaagcc tcacgtccag aacaaattac tgtgtgctca tcctttccat

4920

tgccgaagta tagaatcact ggtgtgcaga agatccaatg ctcccagcct atattgttct

4980

caccgaaagt gcctgcgtat attcatccaa ggaagtatct cgtggaaaca ccaccggtag

5040

acgagactcc ggagccatcg gcagagaacc aatccacaga ggggacacct gaacaaccac

5100

cacttataac cgaggatgag accaggacta gaacgcctga gccgatcatc atcgaagagg

5160

aagaagagga tagcataagt ttgctgtcag atggcccgac ccaccaggtg ctgcaagtcg

5220

aggcagacat tcacgggccg ccctctgtat ctagctcatc ctggtccatt cctcatgcat

5280

ccgactttga tgtggacagt ttatccatac ttgacaccct ggagggagct agcgtgacca

5340

gcggggcaac gtcagccgag actaactctt acttcgcaaa gagtatggag tttctggcgc

5400

gaccggtgcc tgcgcctcga acagtattca ggaaccctcc acatcccgct ccgcgcacaa

5460

gaacaccgtc acttgcaccc agcagggcct gctcgagaac cagcctagtt tccaccccgc

5520

caggcgtgaa tagggtgatc actagagagg agctcgaggc gcttaccccg tcacgcactc

5580

ctagcaggtc ggtctcgaga accagcctgg tctccaaccc gccaggcgta aatagggtga

5640

ttacaagaga ggagtttgag gcgttcgtag cacaacaaca atgacggttt gatgcgggtg

5700

catacatctt ttcctccgac accggtcaag ggcatttaca acaaaaatca gtaaggcaaa

5760

cggtgctatc cgaagtggtg ttggagagga ccgaattgga gatttcgtat gccccgcgcc

5820

tcgaccaaga aaaagaagaa ttactacgca agaaattaca gttaaatccc acacctgcta

5880

acagaagcag ataccagtcc aggaaggtgg agaacatgaa agccataaca gctagacgta

5940

ttctgcaagg cctagggcat tatttgaagg cagaaggaaa agtggagtgc taccgaaccc

6000

tgcatcctgt tcctttgtat tcatctagtg tgaaccgtgc cttttcaagc cccaaggtcg

6060

cagtggaagc ctgtaacgcc atgttgaaag agaactttcc gactgtggct tcttactgta

6120

ttattccaga gtacgatgcc tatttggaca tggttgacgg agcttcatgc tgcttagaca

6180

ctgccagttt ttgccctgca aagctgcgca gctttccaaa gaaacactcc tatttggaac

6240

ccacaatacg atcggcagtg ccttcagcga tccagaacac gctccagaac gtcctggcag

6300

ctgccacaaa aagaaattgc aatgtcacgc aaatgagaga attgcccgta ttggattcgg

6360

cggcctttaa tgtggaatgc ttcaagaaat atgcgtgtaa taatgaatat tgggaaacgt

6420

ttaaagaaaa ccccatcagg cttactgaag aaaacgtggt aaattacatt accaaattaa

6480

aaggaccaaa agctgctgct ctttttgcga agacacataa tttgaatatg ttgcaggaca

6540

taccaatgga caggtttgta atggacttaa agagagacgt gaaagtgact ccaggaacaa

6600

aacatactga agaacggccc aaggtacagg tgatccaggc tgccgatccg ctagcaacag

6660

cgtatctgtg cggaatccac cgagagctgg ttaggagatt aaatgcggtc ctgcttccga

6720

acattcatac actgtttgat atgtcggctg aagactttga cgctattata gccgagcact

6780

tccagcctgg ggattgtgtt ctggaaactg acatcgcgtc gtttgataaa agtgaggacg

6840

acgccatggc tctgaccgcg ttaatgattc tggaagactt aggtgtggac gcagagctgt

6900

tgacgctgat tgaggcggct ttcggcgaaa tttcatcaat acatttgccc actaaaacta

6960

aatttaaatt cggagccatg atgaaatctg gaatgttcct cacactgttt gtgaacacag

7020

tcattaacat tgtaatcgca agcagagtgt tgagagaacg gctaaccgga tcaccatgtg

7080

cagcattcat tggagatgac aatatcgtga aaggagtcaa atcggacaaa ttaatggcag

7140

acaggtgcgc cacctggttg aatatggaag tcaagattat agatgctgtg gtgggcgaga

7200

aagcgcctta tttctgtgga gggtttattt tgtgtgactc cgtgaccggc acagcgtgcc

7260

gtgtggcaga ccccctaaaa aggctgttta agcttggcaa acctctggca gcagacgatg

7320

aacatgatga tgacaggaga agggcattgc atgaagagtc aacacgctgg aaccgagtgg

7380

gtattctttc agagctgtgc aaggcagtag aatcaaggta tgaaaccgta ggaacttcca

7440

tcatagttat ggccatgact actctagcta gcagtgttaa atcattcagc tacctgagag

7500

gggcccctat aactctctac ggctaacctg aatggactac gacatagtct agtccgccaa

7560

gtctagcata tgggcgcgcc ctcagcatcg attgaattgg ccaccatggt gagcaagggc

7620

gaggaggata acatggccat catcaaggag ttcatgcgct tcaaggtgca catggagggc

7680

tccgtgaacg gccacgagtt cgagatcgag ggcgagggcg agggccgccc ctacgagggc

7740

acccagaccg ccaagctgaa ggtgaccaag ggtggccccc tgcccttcgc ctgggacatc

7800

ctgtcccctc agttcatgta cggctccaag gcctacgtga agcaccccgc cgacatcccc

7860

gactacttga agctgtcctt ccccgagggc ttcaagtggg agcgcgtgat gaacttcgag

7920

gacggcggcg tggtgaccgt gacccaggac tcctccctgc aggacggcga gttcatctac

7980

aaggtgaagc tgcgcggcac caacttcccc tccgacggcc ccgtaatgca gaagaagacc

8040

atgggctggg aggcctcctc cgagcggatg taccccgagg acggcgccct gaagggcgag

8100

atcaagcaga ggctgaagct gaaggacggc ggccactacg acgctgaggt caagaccacc

8160

tacaaggcca agaagcccgt gcagctgccc ggcgcctaca acgtcaacat caagttggac

8220

atcacctccc acaacgagga ctacaccatc gtggaacagt acgaacgcgc cgagggccgc

8280

cactccaccg gcggcatgga cgagctgtac aagtaggaat tggcaagctg cttacataga

8340

actcgcggcg attggcatgc cgccttaaaa tttttatttt atttttcttt tcttttccga

8400

atcggatttt gtttttaata tttcaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa cgcgtcgagg

8460

ggaattaatt cttgaagacg aaagggccag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa

8520

cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac

8580

cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg

8640

tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc

8700

tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg

8760

atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga

8820

gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tgttgacgcc gggcaagagc

8880

aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag

8940

aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga

9000

gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg

9060

cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga

9120

atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt

9180

tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact

9240

ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt

9300

ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg

9360

ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta

9420

tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac

9480

tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta

9540

aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt

9600

tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt

9660

tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt

9720

gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc

9780

agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg

9840

tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg

9900

ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt

9960

cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac

10020

tgagatacct acagcgtgag cattgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg

10080

acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg

10140

gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat

10200

ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcgagctcta

10260

atacgactca ctatag

10276

<210> 2

<211> 10276

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полинуклеотид

<400> 2

atgggcggcg catgagagaa gcccagacca attacctacc caaaatggag aaagttcacg

60

ttgacatcga ggaagacagc ccattcctca gagctttgca gcggagcttc ccgcagtttg

120

aggtagaagc caagcaggtc actgataatg accatgctaa tgccagagcg ttttcgcatc

180

tggcttcaaa actgatcgaa acggaggtgg acccatccga cacgatcctt gacattggaa

240

gtgcgcccgc ccgcagaatg tattctaagc acaagtatca ttgtatctgt ccgatgagat

300

gtgcggaaga tccggacaga ttgtataagt atgcaactaa gctgaagaaa aactgtaagg

360

aaataactga taaggaattg gacaagaaaa tgaaggagct ggccgccgtc atgagcgacc

420

ctgacctgga aactgagact atgtgcctcc acgacgacga gtcgtgtcgc tacgaagggc

480

aagtcgctgt ttaccaggat gtatacgcgg ttgacggacc gacaagtctc tatcaccaag

540

ccaataaggg agttagagtc gcctactgga taggctttga caccacccct tttatgttta

600

agaacttggc tggagcatat ccatcatact ctaccaactg ggccgacgaa accgtgttaa

660

cggctcgtaa cataggccta tgcagctctg acgttatgga gcggtcacgt agagggatgt

720

ccattcttag aaagaagtat ttgaaaccat ccaacaatgt tctattctct gttggctcga

780

ccatctacca cgagaagagg gacttactga ggagctggca cctgccgtct gtatttcact

840

tacgtggcaa gcaaaattac acatgtcggt gtgagactat agttagttgc gacgggtacg

900

tcgttaaaag aatagctatc agtccaggcc tgtatgggaa gccttcaggc tatgctgcta

960

cgatgcaccg cgagggattc ttgtgctgca aagtgacaga cacattgaac ggggagaggg

1020

tctcttttcc cgtgtgcacg tatgtgccag ctacattgtg tgaccaaatg actggcatac

1080

tggcaacaga tgtcagtgcg gacgacgcgc aaaaactgct ggttgggctc aaccagcgta

1140

tagtcgtcaa cggtcgcacc cagagaaaca ccaataccat gaaaaattac cttttgcccg

1200

tagtggccca ggcatttgct aggtgggcaa aggaatataa ggaagatcaa gaagatgaaa

1260

ggccactagg actacgagat agacagttag tcatggggtg ttgttgggct tttagaaggc

1320

acaagataac atctatttat aagcgcccgg atacccaaac catcatcaaa gtgaacagcg

1380

atttccactc attcgtgctg cccaggatag gcagtaacac attggagatc gggctgagaa

1440

caagaatcag gaaaatgtta gaggagcaca aggagccgtc acctctcatt accgccgagg

1500

acgtacaaga agctaagtgc gcagccgatg aggctaagga ggtgcgtgaa gccgaggagt

1560

tgcgcgcagc tctaccacct ttggcagctg atgttgagga gcccactctg gaggcagacg

1620

tcgacttgat gttacaagag gctggggccg gctcagtgga gacacctcgt ggcttgataa

1680

aggttaccag ctacgatggc gaggacaaga tcggctctta cgctgtgctt tctccgcagg

1740

ctgtactcaa gagtgaaaaa ttatcttgca tccaccctct cgctgaacaa gtcatagtga

1800

taacacactc tggccgaaaa gggcgttatg ccgtggaacc ataccatggt aaagtagtgg

1860

tgccagaggg acatgcaata cccgtccagg actttcaagc tctgagtgaa agtgccacca

1920

ttgtgtacaa cgaacgtgag ttcgtaaaca ggtacctgca ccatattgcc acacatggag

1980

gagcgctgaa cactgatgaa gaatattaca aaactgtcaa gcccagcgag cacgacggcg

2040

aatacctgta cgacatcgac aggaaacagt gcgtcaagaa agaactagtc actgggctag

2100

ggctcacagg cgagctggtg gatcctccct tccatgaatt cgcctacgag agtctgagaa

2160

cacgaccagc cgctccttac caagtaccaa ccataggggt gtatggcgtg ccaggatcag

2220

gcaagtctgg catcattaaa agcgcagtca ccaaaaaaga tctagtggtg agcgccaaga

2280

aagaaaactg tgcagaaatt ataagggacg tcaagaaaat gaaagggctg gacgtcaatg

2340

ccagaactgt ggactcagtg ctcttgaatg gatgcaaaca ccccgtagag accctgtata

2400

ttgacgaagc ttttgcttgt catgcaggta ctctcagagc gctcatagcc attataagac

2460

ctaaaaaggc agtgctctgc ggggatccca aacagtgcgg tttttttaac atgatgtgcc

2520

tgaaagtgca ttttaaccac gagatttgca cacaagtctt ccacaaaagc atctctcgcc

2580

gttgcactaa atctgtgact tcggtcgtct caaccttgtt ttacgacaaa aaaatgagaa

2640

cgacgaatcc gaaagagact aagattgtga ttgacactac cggcagtacc aaacctaagc

2700

aggacgatct cattctcact tgtttcagag ggtgggtgaa gcagttgcaa atagattaca

2760

aaggcaacga aataatgacg gcagctgcct ctcaagggct gacccgtaaa ggtgtgtatg

2820

ccgttcggta caaggtgaat gaaaatcctc tgtacgcacc cacctcagaa catgtgaacg

2880

tcctactgac ccgcacggag gaccgcatcg tgtggaaaac actagccggc gacccatgga

2940

taaaaacact gactgccaag taccctggga atttcactgc cacgatagag gagtggcaag

3000

cagagcatga tgccatcatg aggcacatct tggagagacc ggaccctacc gacgtcttcc

3060

agaataaggc aaacgtgtgt tgggccaagg ctttagtgcc ggtgctgaag accgctggca

3120

tagacatgac cactgaacaa tggaacactg tggattattt tgaaacggac aaagctcact

3180

cagcagagat agtattgaac caactatgcg tgaggttctt tggactcgat ctggactccg

3240

gtctattttc tgcacccact gttccgttat ccattaggaa taatcactgg gataactccc

3300

cgtcgcctaa catgtacggg ctgaataaag aagtggtccg tcagctctct cgcaggtacc

3360

cacaactgcc tcgggcagtt gccactggaa gagtctatga catgaacact ggtacactgc

3420

gcaattatga tccgcgcata aacctagtac ctgtaaacag aagactgcct catgctttag

3480

tcctccacca taatgaacac ccacagagtg acttttcttc attcgtcagc aaattgaagg

3540

gcagaactgt cctggtggtc ggggaaaagt tgtccgtccc aggcaaaatg gttgactggt

3600

tgtcagaccg gcctgaggct accttcagag ctcggctgga tttaggcatc ccaggtgatg

3660

tgcccaaata tgacataata tttgttaatg tgaggacccc atataaatac catcactatc

3720

agcagtgtga agaccatgcc attaagctta gcatgttgac caagaaagct tgtctgcatc

3780

tgaatcccgg cggaacctgt gtcagcatag gttatggtta cgctgacagg gccagcgaaa

3840

gcatcattgg tgctatagcg cggcagttca agttttcccg ggtatgcaaa ccgaaatcct

3900

cacttgaaga gacggaagtt ctgtttgtat tcattcggta cgatcgcaag gcccgtacgc

3960

acaattctta caagctttca tcaaccttga ccaacattta tacaggttcc agactccacg

4020

aagccggatg tgcaccctca tatcatgtgg tgcgagggga tattgccacg gccaccgaag

4080

gagtgattat aaatgctgct aacagcaaag gacaacctgg cggaggggtg tgcggagcgc

4140

tgtataagaa attcccggaa agcttcgatt tacagccgat cgaagtagga aaagcgcgac

4200

tggtcaaagg tgcagctaaa catatcattc atgccgtagg accaaacttc aacaaagttt

4260

cggaggttga aggtgacaaa cagttggcag aggcttatga gtccatcgct aagattgtca

4320

acgataacaa ttacaagtca gtagcgattc cactgttgtc caccggcatc ttttccggga

4380

acaaagatcg actaacccaa tcattgaacc atttgctgac agctttagac accactgatg

4440

cagatgtagc catatactgc agggacaaga aatgggaaat gactctcaag gaagcagtgg

4500

ctaggagaga agcagtggag gagatatgca tatccgacga ctcttcagtg acagaacctg

4560

atgcagagct ggtgagggtg catccgaaga gttctttggc tggaaggaag ggctacagca

4620

caagcgatgg caaaactttc tcatatttgg aagggaccaa gtttcaccag gcggccaagg

4680

atatagcaga aattaatgcc atgtggcccg ttgcaacgga ggccaatgag caggtatgca

4740

tgtatatcct cggagaaggc atgagcagta ttaggtcgaa atgccccgtc gaagagtcgg

4800

aagcctccac accacctagc acgctgcctt gcttgtgcat ccatgccatg actccagaaa

4860

gagtacagcg cctaaaagcc tcacgtccag aacaaattac tgtgtgctca tcctttccat

4920

tgccgaagta tagaatcact ggtgtgcaga agatccaatg ctcccagcct atattgttct

4980

caccgaaagt gcctgcgtat attcatccaa ggaagtatct cgtggaaaca ccaccggtag

5040

acgagactcc ggagccatcg gcagagaacc aatccacaga ggggacacct gaacaaccac

5100

cacttataac cgaggatgag accaggacta gaacgcctga gccgatcatc atcgaagagg

5160

aagaagagga tagcataagt ttgctgtcag atggcccgac ccaccaggtg ctgcaagtcg

5220

aggcagacat tcacgggccg ccctctgtat ctagctcatc ctggtccatt cctcatgcat

5280

ccgactttga tgtggacagt ttatccatac ttgacaccct ggagggagct agcgtgacca

5340

gcggggcaac gtcagccgag actaactctt acttcgcaaa gagtatggag tttctggcgc

5400

gaccggtgcc tgcgcctcga acagtattca ggaaccctcc acatcccgct ccgcgcacaa

5460

gaacaccgtc acttgcaccc agcagggcct gctcgagaac cagcctagtt tccaccccgc

5520

caggcgtgaa tagggtgatc actagagagg agctcgaggc gcttaccccg tcacgcactc

5580

ctagcaggtc ggtctcgaga accagcctgg tctccaaccc gccaggcgta aatagggtga

5640

ttacaagaga ggagtttgag gcgttcgtag cacaacaaca atgacggttt gatgcgggtg

5700

catacatctt ttcctccgac accggtcaag ggcatttaca acaaaaatca gtaaggcaaa

5760

cggtgctatc cgaagtggtg ttggagagga ccgaattgga gatttcgtat gccccgcgcc

5820

tcgaccaaga aaaagaagaa ttactacgca agaaattaca gttaaatccc acacctgcta

5880

acagaagcag ataccagtcc aggaaggtgg agaacatgaa agccataaca gctagacgta

5940

ttctgcaagg cctagggcat tatttgaagg cagaaggaaa agtggagtgc taccgaaccc

6000

tgcatcctgt tcctttgtat tcatctagtg tgaaccgtgc cttttcaagc cccaaggtcg

6060

cagtggaagc ctgtaacgcc atgttgaaag agaactttcc gactgtggct tcttactgta

6120

ttattccaga gtacgatgcc tatttggaca tggttgacgg agcttcatgc tgcttagaca

6180

ctgccagttt ttgccctgca aagctgcgca gctttccaaa gaaacactcc tatttggaac

6240

ccacaatacg atcggcagtg ccttcagcga tccagaacac gctccagaac gtcctggcag

6300

ctgccacaaa aagaaattgc aatgtcacgc aaatgagaga attgcccgta ttggattcgg

6360

cggcctttaa tgtggaatgc ttcaagaaat atgcgtgtaa taatgaatat tgggaaacgt

6420

ttaaagaaaa ccccatcagg cttactgaag aaaacgtggt aaattacatt accaaattaa

6480

aaggaccaaa agctgctgct ctttttgcga agacacataa tttgaatatg ttgcaggaca

6540

taccaatgga caggtttgta atggacttaa agagagacgt gaaagtgact ccaggaacaa

6600

aacatactga agaacggccc aaggtacagg tgatccaggc tgccgatccg ctagcaacag

6660

cgtatctgtg cggaatccac cgagagctgg ttaggagatt aaatgcggtc ctgcttccga

6720

acattcatac actgtttgat atgtcggctg aagactttga cgctattata gccgagcact

6780

tccagcctgg ggattgtgtt ctggaaactg acatcgcgtc gtttgataaa agtgaggacg

6840

acgccatggc tctgaccgcg ttaatgattc tggaagactt aggtgtggac gcagagctgt

6900

tgacgctgat tgaggcggct ttcggcgaaa tttcatcaat acatttgccc actaaaacta

6960

aatttaaatt cggagccatg atgaaatctg gaatgttcct cacactgttt gtgaacacag

7020

tcattaacat tgtaatcgca agcagagtgt tgagagaacg gctaaccgga tcaccatgtg

7080

cagcattcat tggagatgac aatatcgtga aaggagtcaa atcggacaaa ttaatggcag

7140

acaggtgcgc cacctggttg aatatggaag tcaagattat agatgctgtg gtgggcgaga

7200

aagcgcctta tttctgtgga gggtttattt tgtgtgactc cgtgaccggc acagcgtgcc

7260

gtgtggcaga ccccctaaaa aggctgttta agcttggcaa acctctggca gcagacgatg

7320

aacatgatga tgacaggaga agggcattgc atgaagagtc aacacgctgg aaccgagtgg

7380

gtattctttc agagctgtgc aaggcagtag aatcaaggta tgaaaccgta ggaacttcca

7440

tcatagttat ggccatgact actctagcta gcagtgttaa atcattcagc tacctgagag

7500

gggcccctat aactctctac ggctaacctg aatggactac gacatagtct agtccgccaa

7560

gtctagcata tgggcgcgcc ctcagcatcg attgaattgg ccaccatggt gagcaagggc

7620

gaggaggata acatggccat catcaaggag ttcatgcgct tcaaggtgca catggagggc

7680

tccgtgaacg gccacgagtt cgagatcgag ggcgagggcg agggccgccc ctacgagggc

7740

acccagaccg ccaagctgaa ggtgaccaag ggtggccccc tgcccttcgc ctgggacatc

7800

ctgtcccctc agttcatgta cggctccaag gcctacgtga agcaccccgc cgacatcccc

7860

gactacttga agctgtcctt ccccgagggc ttcaagtggg agcgcgtgat gaacttcgag

7920

gacggcggcg tggtgaccgt gacccaggac tcctccctgc aggacggcga gttcatctac

7980

aaggtgaagc tgcgcggcac caacttcccc tccgacggcc ccgtaatgca gaagaagacc

8040

atgggctggg aggcctcctc cgagcggatg taccccgagg acggcgccct gaagggcgag

8100

atcaagcaga ggctgaagct gaaggacggc ggccactacg acgctgaggt caagaccacc

8160

tacaaggcca agaagcccgt gcagctgccc ggcgcctaca acgtcaacat caagttggac

8220

atcacctccc acaacgagga ctacaccatc gtggaacagt acgaacgcgc cgagggccgc

8280

cactccaccg gcggcatgga cgagctgtac aagtaggaat tggcaagctg cttacataga

8340

actcgcggcg attggcatgc cgccttaaaa tttttatttt atttttcttt tcttttccga

8400

atcggatttt gtttttaata tttcaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa cgcgtcgagg

8460

ggaattaatt cttgaagacg aaagggccag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa

8520

cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac

8580

cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg

8640

tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc

8700

tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg

8760

atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga

8820

gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tgttgacgcc gggcaagagc

8880

aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag

8940

aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga

9000

gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg

9060

cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga

9120

atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt

9180

tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact

9240

ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt

9300

ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg

9360

ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta

9420

tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac

9480

tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta

9540

aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt

9600

tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt

9660

tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt

9720

gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc

9780

agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg

9840

tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg

9900

ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt

9960

cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac

10020

tgagatacct acagcgtgag cattgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg

10080

acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg

10140

gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat

10200

ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcgagctcta

10260

atacgactca ctatag

10276

<210> 3

<211> 1629

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полинуклеотид

<400> 3

atgagggtcc ccgctcagct cctggggctc ctgctgctct ggctcccagg tgcacgatgt

60

gccatgtggg agctggagaa agacgtttat gttgtagagg tggactggac tcccgatgcc

120

cctggagaaa cagtgaacct cacctgtgac acgcctgaag aagatgacat cacctggacc

180

tcagaccaga gacatggagt cataggctct ggaaagaccc tgaccatcac tgtcaaagag

240

tttctagatg ctggccagta cacctgccac aaaggaggcg agactctgag ccactcacat

300

ctgctgctcc acaagaagga aaatggaatt tggtccactg aaattttaaa aaatttcaaa

360

aacaagactt tcctgaagtg tgaagcacca aattactccg gacggttcac gtgctcatgg

420

ctggtgcaaa gaaacatgga cttgaagttc aacatcaaga gcagtagcag ttcccctgac

480

tctcgggcag tgacatgtgg aatggcgtct ctgtctgcag agaaggtcac actggaccaa

540

agggactatg agaagtattc agtgtcctgc caggaggatg tcacctgccc aactgccgag

600

gagaccctgc ccattgaact ggcgttggaa gcacggcagc agaataaata tgagaactac

660

agcaccagct tcttcatcag ggacatcatc aaaccagacc cgcccaagaa cttgcagatg

720

aagcctttga agaactcaca ggtggaggtc agctgggagt accctgactc ctggagcact

780

ccccattcct acttctccct caagttcttt gttcgaatcc agcgcaagaa agaaaagatg

840

aaggagacag aggaggggtg taaccagaaa ggtgcgttcc tcgtagagaa gacatctacc

900

gaagtccaat gcaaaggcgg gaatgtctgc gtgcaagctc aggatcgcta ttacaattcc

960

tcatgcagca agtgggcatg tgttccctgc agggtccgat ccggaggttc cggtggtgga

1020

tccggaggtg gctccggcgg cggatccagg gtcattccag tctctggacc tgccaggtgt

1080

cttagccagt cccgaaacct gctgaagacc acagatgaca tggtgaagac ggccagagaa

1140

aaactgaaac attattcctg cactgctgaa gacatcgatc atgaagacat cacacgggac

1200

caaaccagca cattgaagac ctgtttacca ctggaactac acaagaacga gagttgcctg

1260

gctactagag agacttcttc cacaacaaga gggagctgcc tgcccccaca gaagacgtct

1320

ttgatgatga ccctgtgcct tggtagcatc tatgaggact tgaagatgta ccagacagag

1380

ttccaggcca tcaacgcagc acttcagaat cacaaccatc agcagatcat tctagacaag

1440

ggcatgctgg tggccatcga tgagctgatg cagtctctga atcataatgg cgagactctg

1500

cgccagaaac ctcctgtggg agaagcagac ccttacagag tgaaaatgaa gctctgcatc

1560

ctgcttcacg ccttcagcac ccgcgtcgtg accatcaaca gggtgatggg ctatctgagc

1620

tccgcctga

1629

<210> 4

<211> 12985

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полинуклеотид

<400> 4

atgggcggcg catgagagaa gcccagacca attacctacc caaaatggag aaagttcacg

60

ttgacatcga ggaagacagc ccattcctca gagctttgca gcggagcttc ccgcagtttg

120

aggtagaagc caagcaggtc actgataatg accatgctaa tgccagagcg ttttcgcatc

180

tggcttcaaa actgatcgaa acggaggtgg acccatccga cacgatcctt gacattggaa

240

gtgcgcccgc ccgcagaatg tattctaagc acaagtatca ttgtatctgt ccgatgagat

300

gtgcggaaga tccggacaga ttgtataagt atgcaactaa gctgaagaaa aactgtaagg

360

aaataactga taaggaattg gacaagaaaa tgaaggagct ggccgccgtc atgagcgacc

420

ctgacctgga aactgagact atgtgcctcc acgacgacga gtcgtgtcgc tacgaagggc

480

aagtcgctgt ttaccaggat gtatacgcgg ttgacggacc gacaagtctc tatcaccaag

540

ccaataaggg agttagagtc gcctactgga taggctttga caccacccct tttatgttta

600

agaacttggc tggagcatat ccatcatact ctaccaactg ggccgacgaa accgtgttaa

660

cggctcgtaa cataggccta tgcagctctg acgttatgga gcggtcacgt agagggatgt

720

ccattcttag aaagaagtat ttgaaaccat ccaacaatgt tctattctct gttggctcga

780

ccatctacca cgagaagagg gacttactga ggagctggca cctgccgtct gtatttcact

840

tacgtggcaa gcaaaattac acatgtcggt gtgagactat agttagttgc gacgggtacg

900

tcgttaaaag aatagctatc agtccaggcc tgtatgggaa gccttcaggc tatgctgcta

960

cgatgcaccg cgagggattc ttgtgctgca aagtgacaga cacattgaac ggggagaggg

1020

tctcttttcc cgtgtgcacg tatgtgccag ctacattgtg tgaccaaatg actggcatac

1080

tggcaacaga tgtcagtgcg gacgacgcgc aaaaactgct ggttgggctc aaccagcgta

1140

tagtcgtcaa cggtcgcacc cagagaaaca ccaataccat gaaaaattac cttttgcccg

1200

tagtggccca ggcatttgct aggtgggcaa aggaatataa ggaagatcaa gaagatgaaa

1260

ggccactagg actacgagat agacagttag tcatggggtg ttgttgggct tttagaaggc

1320

acaagataac atctatttat aagcgcccgg atacccaaac catcatcaaa gtgaacagcg

1380

atttccactc attcgtgctg cccaggatag gcagtaacac attggagatc gggctgagaa

1440

caagaatcag gaaaatgtta gaggagcaca aggagccgtc acctctcatt accgccgagg

1500

acgtacaaga agctaagtgc gcagccgatg aggctaagga ggtgcgtgaa gccgaggagt

1560

tgcgcgcagc tctaccacct ttggcagctg atgttgagga gcccactctg gaagccgatg

1620

tcgacttgat gttacaagag gctggggccg gctcagtgga gacacctcgt ggcttgataa

1680

aggttaccag ctacgatggc gaggacaaga tcggctctta cgctgtgctt tctccgcagg

1740

ctgtactcaa gagtgaaaaa ttatcttgca tccaccctct cgctgaacaa gtcatagtga

1800

taacacactc tggccgaaaa gggcgttatg ccgtggaacc ataccatggt aaagtagtgg

1860

tgccagaggg acatgcaata cccgtccagg actttcaagc tctgagtgaa agtgccacca

1920

ttgtgtacaa cgaacgtgag ttcgtaaaca ggtacctgca ccatattgcc acacatggag

1980

gagcgctgaa cactgatgaa gaatattaca aaactgtcaa gcccagcgag cacgacggcg

2040

aatacctgta cgacatcgac aggaaacagt gcgtcaagaa agaactagtc actgggctag

2100

ggctcacagg cgagctggtg gatcctccct tccatgaatt cgcctacgag agtctgagaa

2160

cacgaccagc cgctccttac caagtaccaa ccataggggt gtatggcgtg ccaggatcag

2220

gcaagtctgg catcattaaa agcgcagtca ccaaaaaaga tctagtggtg agcgccaaga

2280

aagaaaactg tgcagaaatt ataagggacg tcaagaaaat gaaagggctg gacgtcaatg

2340

ccagaactgt ggactcagtg ctcttgaatg gatgcaaaca ccccgtagag accctgtata

2400

ttgacgaagc ttttgcttgt catgcaggta ctctcagagc gctcatagcc attataagac

2460

ctaaaaaggc agtgctctgc ggggatccca aacagtgcgg tttttttaac atgatgtgcc

2520

tgaaagtgca ttttaaccac gagatttgca cacaagtctt ccacaaaagc atctctcgcc

2580

gttgcactaa atctgtgact tcggtcgtct caaccttgtt ttacgacaaa aaaatgagaa

2640

cgacgaatcc gaaagagact aagattgtga ttgacactac cggcagtacc aaacctaagc

2700

aggacgatct cattctcact tgtttcagag ggtgggtgaa gcagttgcaa atagattaca

2760

aaggcaacga aataatgacg gcagctgcct ctcaagggct gacccgtaaa ggtgtgtatg

2820

ccgttcggta caaggtgaat gaaaatcctc tgtacgcacc cacctcagaa catgtgaacg

2880

tcctactgac ccgcacggag gaccgcatcg tgtggaaaac actagccggc gacccatgga

2940

taaaaacact gactgccaag taccctggga atttcactgc cacgatagag gagtggcaag

3000

cagagcatga tgccatcatg aggcacatct tggagagacc ggaccctacc gacgtcttcc

3060

agaataaggc aaacgtgtgt tgggccaagg ctttagtgcc ggtgctgaag accgctggca

3120

tagacatgac cactgaacaa tggaacactg tggattattt tgaaacggac aaagctcact

3180

cagcagagat agtattgaac caactatgcg tgaggttctt tggactcgat ctggactccg

3240

gtctattttc tgcacccact gttccgttat ccattaggaa taatcactgg gataactccc

3300

cgtcgcctaa catgtacggg ctgaataaag aagtggtccg tcagctctct cgcaggtacc

3360

cacaactgcc tcgggcagtt gccactggaa gagtctatga catgaacact ggtacactgc

3420

gcaattatga tccgcgcata aacctagtac ctgtaaacag aagactgcct catgctttag

3480

tcctccacca taatgaacac ccacagagtg acttttcttc attcgtcagc aaattgaagg

3540

gcagaactgt cctggtggtc ggggaaaagt tgtccgtccc aggcaaaatg gttgactggt

3600

tgtcagaccg gcctgaggct accttcagag ctcggctgga tttaggcatc ccaggtgatg

3660

tgcccaaata tgacataata tttgttaatg tgaggacccc atataaatac catcactatc

3720

agcagtgtga agaccatgcc attaagctta gcatgttgac caagaaagct tgtctgcatc

3780

tgaatcccgg cggaacctgt gtcagcatag gttatggtta cgctgacagg gccagcgaaa

3840

gcatcattgg tgctatagcg cggcagttca agttttcccg ggtatgcaaa ccgaaatcct

3900

cacttgaaga gacggaagtt ctgtttgtat tcattcggta cgatcgcaag gcccgtacgc

3960

acaattctta caagctttca tcaaccttga ccaacattta tacaggttcc agactccacg

4020

aagccggatg tgcaccctca tatcatgtgg tgcgagggga tattgccacg gccaccgaag

4080

gagtgattat aaatgctgct aacagcaaag gacaacctgg cggaggggtg tgcggagcgc

4140

tgtataagaa attcccggaa agcttcgatt tacagccgat cgaagtagga aaagcgcgac

4200

tggtcaaagg tgcagctaaa catatcattc atgccgtagg accaaacttc aacaaagttt

4260

cggaggttga aggtgacaaa cagttggcag aggcttatga gtccatcgct aagattgtca

4320

acgataacaa ttacaagtca gtagcgattc cactgttgtc caccggcatc ttttccggga

4380

acaaagatcg actaacccaa tcattgaacc atttgctgac agctttagac accactgatg

4440

cagatgtagc catatactgc agggacaaga aatgggaaat gactctcaag gaagcagtgg

4500

ctaggagaga agcagtggag gagatatgca tatccgacga ctcttcagtg acagaacctg

4560

atgcagagct ggtgagggtg catccgaaga gttctttggc tggaaggaag ggctacagca

4620

caagcgatgg caaaactttc tcatatttgg aagggaccaa gtttcaccag gcggccaagg

4680

atatagcaga aattaatgcc atgtggcccg ttgcaacgga ggccaatgag caggtatgca

4740

tgtatatcct cggagaaggc atgagcagta ttaggtcgaa atgccccgtc gaagagtcgg

4800

aagcctccac accacctagc acgctgcctt gcttgtgcat ccatgccatg actccagaaa

4860

gagtacagcg cctaaaagcc tcacgtccag aacaaattac tgtgtgctca tcctttccat

4920

tgccgaagta tagaatcact ggtgtgcaga agatccaatg ctcccagcct atattgttct

4980

caccgaaagt gcctgcgtat attcatccaa ggaagtatct cgtggaaaca ccaccggtag

5040

acgagactcc ggagccatcg gcagagaacc aatccacaga ggggacacct gaacaaccac

5100

cacttataac cgaggatgag accaggacta gaacgcctga gccgatcatc atcgaagagg

5160

aagaagagga tagcataagt ttgctgtcag atggcccgac ccaccaggtg ctgcaagtcg

5220

aggcagacat tcacgggccg ccctctgtat ctagctcatc ctggtccatt cctcatgcat

5280

ccgactttga tgtggacagt ttatccatac ttgacaccct ggagggagct agcgtgacca

5340

gcggggcaac gtcagccgag actaactctt acttcgcaaa gagtatggag tttctggcgc

5400

gaccggtgcc tgcgcctcga acagtattca ggaaccctcc acatcccgct ccgcgcacaa

5460

gaacaccgtc acttgcaccc agcagggcct gctcgagaac cagcctagtt tccaccccgc

5520

caggcgtgaa tagggtgatc actagagagg agctcgaggc gcttaccccg tcacgcactc

5580

ctagcaggtc ggtctcgaga accagcctgg tctccaaccc gccaggcgta aatagggtga

5640

ttacaagaga ggagtttgag gcgttcgtag cacaacaaca atgacggttt gatgcgggtg

5700

catacatctt ttcctccgac accggtcaag ggcatttaca acaaaaatca gtaaggcaaa

5760

cggtgctatc cgaagtggtg ttggagagga ccgaattgga gatttcgtat gccccgcgcc

5820

tcgaccaaga aaaagaagaa ttactacgca agaaattaca gttaaatccc acacctgcta

5880

acagaagcag ataccagtcc aggaaggtgg agaacatgaa agccataaca gctagacgta

5940

ttctgcaagg cctagggcat tatttgaagg cagaaggaaa agtggagtgc taccgaaccc

6000

tgcatcctgt tcctttgtat tcatctagtg tgaaccgtgc cttttcaagc cccaaggtcg

6060

cagtggaagc ctgtaacgcc atgttgaaag agaactttcc gactgtggct tcttactgta

6120

ttattccaga gtacgatgcc tatttggaca tggttgacgg agcttcatgc tgcttagaca

6180

ctgccagttt ttgccctgca aagctgcgca gctttccaaa gaaacactcc tatttggaac

6240

ccacaatacg atcggcagtg ccttcagcga tccagaacac gctccagaac gtcctggcag

6300

ctgccacaaa aagaaattgc aatgtcacgc aaatgagaga attgcccgta ttggattcgg

6360

cggcctttaa tgtggaatgc ttcaagaaat atgcgtgtaa taatgaatat tgggaaacgt

6420

ttaaagaaaa ccccatcagg cttactgaag aaaacgtggt aaattacatt accaaattaa

6480

aaggaccaaa agctgctgct ctttttgcga agacacataa tttgaatatg ttgcaggaca

6540

taccaatgga caggtttgta atggacttaa agagagacgt gaaagtgact ccaggaacaa

6600

aacatactga agaacggccc aaggtacagg tgatccaggc tgccgatccg ctagcaacag

6660

cgtatctgtg cggaatccac cgagagctgg ttaggagatt aaatgcggtc ctgcttccga

6720

acattcatac actgtttgat atgtcggctg aagactttga cgctattata gccgagcact

6780

tccagcctgg ggattgtgtt ctggaaactg acatcgcgtc gtttgataaa agtgaggacg

6840

acgccatggc tctgaccgcg ttaatgattc tggaagactt aggtgtggac gcagagctgt

6900

tgacgctgat tgaggcggct ttcggcgaaa tttcatcaat acatttgccc actaaaacta

6960

aatttaaatt cggagccatg atgaaatctg gaatgttcct cacactgttt gtgaacacag

7020

tcattaacat tgtaatcgca agcagagtgt tgagagaacg gctaaccgga tcaccatgtg

7080

cagcattcat tggagatgac aatatcgtga aaggagtcaa atcggacaaa ttaatggcag

7140

acaggtgcgc cacctggttg aatatggaag tcaagattat agatgctgtg gtgggcgaga

7200

aagcgcctta tttctgtgga gggtttattt tgtgtgactc cgtgaccggc acagcgtgcc

7260

gtgtggcaga ccccctaaaa aggctgttta agcttggcaa acctctggca gcagacgatg

7320

aacatgatga tgacaggaga agggcattgc atgaagagtc aacacgctgg aaccgagtgg

7380

gtattctttc agagctgtgc aaggcagtag aatcaaggta tgaaaccgta ggaacttcca

7440

tcatagttat ggccatgact actctagcta gcagtgttaa atcattcagc tacctgagag

7500

gggcccctat aactctctac ggctaacctg aatggactac gacatagtct agtccgccaa

7560

gtctagcata tgggcgcgcc ctcagcatcg atttgaattg gccaccatga gggtccccgc

7620

tcagctcctg gggctcctgc tgctctggct cccaggtgca cgatgtgcca tgtgggagct

7680

ggagaaagac gtttatgttg tagaggtgga ctggactccc gatgcccctg gagaaacagt

7740

gaacctcacc tgtgacacgc ctgaagaaga tgacatcacc tggacctcag accagagaca

7800

tggagtcata ggctctggaa agaccctgac catcactgtc aaagagtttc tagatgctgg

7860

ccagtacacc tgccacaaag gaggcgagac tctgagccac tcacatctgc tgctccacaa

7920

gaaggaaaat ggaatttggt ccactgaaat tttaaaaaat ttcaaaaaca agactttcct

7980

gaagtgtgaa gcaccaaatt actccggacg gttcacgtgc tcatggctgg tgcaaagaaa

8040

catggacttg aagttcaaca tcaagagcag tagcagttcc cctgactctc gggcagtgac

8100

atgtggaatg gcgtctctgt ctgcagagaa ggtcacactg gaccaaaggg actatgagaa

8160

gtattcagtg tcctgccagg aggatgtcac ctgcccaact gccgaggaga ccctgcccat

8220

tgaactggcg ttggaagcac ggcagcagaa taaatatgag aactacagca ccagcttctt

8280

catcagggac atcatcaaac cagacccgcc caagaacttg cagatgaagc ctttgaagaa

8340

ctcacaggtg gaggtcagct gggagtaccc tgactcctgg agcactcccc attcctactt

8400

ctccctcaag ttctttgttc gaatccagcg caagaaagaa aagatgaagg agacagagga

8460

ggggtgtaac cagaaaggtg cgttcctcgt agagaagaca tctaccgaag tccaatgcaa

8520

aggcgggaat gtctgcgtgc aagctcagga tcgctattac aattcctcat gcagcaagtg

8580

ggcatgtgtt ccctgcaggg tccgatccgg aggttccggt ggtggatccg gaggtggctc

8640

cggcggcgga tccagggtca ttccagtctc tggacctgcc aggtgtctta gccagtcccg

8700

aaacctgctg aagaccacag atgacatggt gaagacggcc agagaaaaac tgaaacatta

8760

ttcctgcact gctgaagaca tcgatcatga agacatcaca cgggaccaaa ccagcacatt

8820

gaagacctgt ttaccactgg aactacacaa gaacgagagt tgcctggcta ctagagagac

8880

ttcttccaca acaagaggga gctgcctgcc cccacagaag acgtctttga tgatgaccct

8940

gtgccttggt agcatctatg aggacttgaa gatgtaccag acagagttcc aggccatcaa

9000

cgcagcactt cagaatcaca accatcagca gatcattcta gacaagggca tgctggtggc

9060

catcgatgag ctgatgcagt ctctgaatca taatggcgag actctgcgcc agaaacctcc

9120

tgtgggagaa gcagaccctt acagagtgaa aatgaagctc tgcatcctgc ttcacgcctt

9180

cagcacccgc gtcgtgacca tcaacagggt gatgggctat ctgagctccg ccggttccgg

9240

tggcggatcc gaagcacaca agagtgagat cgcccatcgg tataatgatt tgggagaaca

9300

acatttcaaa ggcctagtcc tgattgcctt ttcccagtat ctccagaaat gctcatacga

9360

tgagcatgcc aaattagtgc aggaagtaac agactttgca aagacgtgtg ttgccgatga

9420

gtctgccgcc aactgtgaca aatcccttca cactcttttt ggagataagt tgtgtgccat

9480

tccaaacctc cgtgaaaact atggtgaact ggctgactgc tgtacaaaac aagagcccga

9540

aagaaacgaa tgtttcctgc aacacaaaga tgacaacccc agcctgccac catttgaaag

9600

gccagaggct gaggccatgt gcacctcctt taaggaaaac ccaaccacct ttatgggaca

9660

ctatttgcat gaagttgcca gaagacatcc ttatttctat gccccagaac ttctttacta

9720

tgctgagcag tacaatgaga ttctgaccca gtgttgtgca gaggctgaca aggaaagctg

9780

cctgaccccg aagcttgatg gtgtgaagga gaaagcattg gtctcatctg tccgtcagag

9840

aatgaagtgc tccagtatgc agaagtttgg agagagagct tttaaagcat gggcagtagc

9900

tcgtctgagc cagacattcc ccaatgctga ctttgcagaa atcaccaaat tggcaacaga

9960

cctgaccaaa gtcaacaagg agtgctgcca tggtgacctg ctggaatgcg cagatgacag

10020

ggcggaactt gccaagtaca tgtgtgaaaa ccaggcgact atctccagca aactgcagac

10080

ttgctgcgat aaaccactgt tgaagaaagc ccactgtctt agtgaggtgg agcatgacac

10140

catgcctgct gatctgcctg ccattgctgc tgattttgtt gaggaccagg aagtgtgcaa

10200

gaactatgct gaggccaagg atgtcttcct gggcacgttc ttgtatgaat attcaagaag

10260

acaccctgat tactctgtat ccctgttgct gagacttgct aagaaatatg aagccactct

10320

ggaaaagtgc tgcgctgaag ccaatcctcc cgcatgctac ggcacagtgc ttgctgaatt

10380

tcagcctctt gtagaagagc ctaagaactt ggtcaaaacc aactgtgatc tttacgagaa

10440

gcttggagaa tatggattcc aaaatgccat tctagttcgc tacacccaga aagcacctca

10500

ggtgtcaacc ccaactctcg tggaggctgc aagaaaccta ggaagagtgg gcaccaagtg

10560

ttgtacactt cctgaagatc agagactgcc ttgtgtggaa gactatctgt ctgcaatcct

10620

gaaccgtgtg tgtctgctgc atgagaagac cccagtgagt gagcatgtta ccaagtgctg

10680

tagtggatcc ctggtggaaa ggcggccatg cttctctgct ctgacagttg atgaaacata

10740

tgtccccaaa gagtttaaag ctgagacctt caccttccac tctgatatct gcacacttcc

10800

agagaaggag aagcagatta agaaacaaac ggctcttgct gagctggtga agcacaagcc

10860

caaggctaca gcggagcaac tgaagactgt catggatgac tttgcacagt tcctggatac

10920

atgttgcaag gctgctgaca aggacacctg cttctcgact gagggtccaa accttgtcac

10980

tagatgcaaa gacgccttag cctgagcgat cgctaaatac agcagcaatt ggcaagctgc

11040

ttacatagaa ctcgcggcga ttggcatgcc gccttaaaat ttttatttta tttttctttt

11100

cttttccgaa tcggattttg tttttaatat ttcaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaac

11160

gcgtcgaggg gaattaattc ttgaagacga aagggccagg tggcactttt cggggaaatg

11220

tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga

11280

gacaataacc ctgataaatg cttcaataat attgaaaaag gaagagtatg agtattcaac

11340

atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg cggcattttg ccttcctgtt tttgctcacc

11400

cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg aagatcagtt gggtgcacga gtgggttaca

11460

tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc ttgagagttt tcgccccgaa gaacgttttc

11520

caatgatgag cacttttaaa gttctgctat gtggcgcggt attatcccgt gttgacgccg

11580

ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact attctcagaa tgacttggtt gagtactcac

11640

cagtcacaga aaagcatctt acggatggca tgacagtaag agaattatgc agtgctgcca

11700

taaccatgag tgataacact gcggccaact tacttctgac aacgatcgga ggaccgaagg

11760

agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac tcgccttgat cgttgggaac

11820

cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac cacgatgcct gtagcaatgg

11880

caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac tctagcttcc cggcaacaat

11940

taatagactg gatggaggcg gataaagttg caggaccact tctgcgctcg gcccttccgg

12000

ctggctggtt tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg tgggtctcgc ggtatcattg

12060

cagcactggg gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt tatctacacg acggggagtc

12120

aggcaactat ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat aggtgcctca ctgattaagc

12180

attggtaact gtcagaccaa gtttactcat atatacttta gattgattta aaacttcatt

12240

tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt

12300

aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt

12360

gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag

12420

cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta actggcttca

12480

gcagagcgca gataccaaat actgtccttc tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca

12540

agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg

12600

ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta ccggataagg

12660

cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct

12720

acaccgaact gagataccta cagcgtgagc attgagaaag cgccacgctt cccgaaggga

12780

gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc

12840

ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg

12900

agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg

12960

cgagctctaa tacgactcac tatag

12985

<210> 5

<211> 13981

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полинуклеотид

<400> 5

atgggcggcg catgagagaa gcccagacca attacctacc caaaatggag aaagttcacg

60

ttgacatcga ggaagacagc ccattcctca gagctttgca gcggagcttc ccgcagtttg

120

aggtagaagc caagcaggtc actgataatg accatgctaa tgccagagcg ttttcgcatc

180

tggcttcaaa actgatcgaa acggaggtgg acccatccga cacgatcctt gacattggaa

240

gtgcgcccgc ccgcagaatg tattctaagc acaagtatca ttgtatctgt ccgatgagat

300

gtgcggaaga tccggacaga ttgtataagt atgcaactaa gctgaagaaa aactgtaagg

360

aaataactga taaggaattg gacaagaaaa tgaaggagct ggccgccgtc atgagcgacc

420

ctgacctgga aactgagact atgtgcctcc acgacgacga gtcgtgtcgc tacgaagggc

480

aagtcgctgt ttaccaggat gtatacgcgg ttgacggacc gacaagtctc tatcaccaag

540

ccaataaggg agttagagtc gcctactgga taggctttga caccacccct tttatgttta

600

agaacttggc tggagcatat ccatcatact ctaccaactg ggccgacgaa accgtgttaa

660

cggctcgtaa cataggccta tgcagctctg acgttatgga gcggtcacgt agagggatgt

720

ccattcttag aaagaagtat ttgaaaccat ccaacaatgt tctattctct gttggctcga

780

ccatctacca cgagaagagg gacttactga ggagctggca cctgccgtct gtatttcact

840

tacgtggcaa gcaaaattac acatgtcggt gtgagactat agttagttgc gacgggtacg

900

tcgttaaaag aatagctatc agtccaggcc tgtatgggaa gccttcaggc tatgctgcta

960

cgatgcaccg cgagggattc ttgtgctgca aagtgacaga cacattgaac ggggagaggg

1020

tctcttttcc cgtgtgcacg tatgtgccag ctacattgtg tgaccaaatg actggcatac

1080

tggcaacaga tgtcagtgcg gacgacgcgc aaaaactgct ggttgggctc aaccagcgta

1140

tagtcgtcaa cggtcgcacc cagagaaaca ccaataccat gaaaaattac cttttgcccg

1200

tagtggccca ggcatttgct aggtgggcaa aggaatataa ggaagatcaa gaagatgaaa

1260

ggccactagg actacgagat agacagttag tcatggggtg ttgttgggct tttagaaggc

1320

acaagataac atctatttat aagcgcccgg atacccaaac catcatcaaa gtgaacagcg

1380

atttccactc attcgtgctg cccaggatag gcagtaacac attggagatc gggctgagaa

1440

caagaatcag gaaaatgtta gaggagcaca aggagccgtc acctctcatt accgccgagg

1500

acgtacaaga agctaagtgc gcagccgatg aggctaagga ggtgcgtgaa gccgaggagt

1560

tgcgcgcagc tctaccacct ttggcagctg atgttgagga gcccactctg gaagccgatg

1620

tcgacttgat gttacaagag gctggggccg gctcagtgga gacacctcgt ggcttgataa

1680

aggttaccag ctacgatggc gaggacaaga tcggctctta cgctgtgctt tctccgcagg

1740

ctgtactcaa gagtgaaaaa ttatcttgca tccaccctct cgctgaacaa gtcatagtga

1800

taacacactc tggccgaaaa gggcgttatg ccgtggaacc ataccatggt aaagtagtgg

1860

tgccagaggg acatgcaata cccgtccagg actttcaagc tctgagtgaa agtgccacca

1920

ttgtgtacaa cgaacgtgag ttcgtaaaca ggtacctgca ccatattgcc acacatggag

1980

gagcgctgaa cactgatgaa gaatattaca aaactgtcaa gcccagcgag cacgacggcg

2040

aatacctgta cgacatcgac aggaaacagt gcgtcaagaa agaactagtc actgggctag

2100

ggctcacagg cgagctggtg gatcctccct tccatgaatt cgcctacgag agtctgagaa

2160

cacgaccagc cgctccttac caagtaccaa ccataggggt gtatggcgtg ccaggatcag

2220

gcaagtctgg catcattaaa agcgcagtca ccaaaaaaga tctagtggtg agcgccaaga

2280

aagaaaactg tgcagaaatt ataagggacg tcaagaaaat gaaagggctg gacgtcaatg

2340

ccagaactgt ggactcagtg ctcttgaatg gatgcaaaca ccccgtagag accctgtata

2400

ttgacgaagc ttttgcttgt catgcaggta ctctcagagc gctcatagcc attataagac

2460

ctaaaaaggc agtgctctgc ggggatccca aacagtgcgg tttttttaac atgatgtgcc

2520

tgaaagtgca ttttaaccac gagatttgca cacaagtctt ccacaaaagc atctctcgcc

2580

gttgcactaa atctgtgact tcggtcgtct caaccttgtt ttacgacaaa aaaatgagaa

2640

cgacgaatcc gaaagagact aagattgtga ttgacactac cggcagtacc aaacctaagc

2700

aggacgatct cattctcact tgtttcagag ggtgggtgaa gcagttgcaa atagattaca

2760

aaggcaacga aataatgacg gcagctgcct ctcaagggct gacccgtaaa ggtgtgtatg

2820

ccgttcggta caaggtgaat gaaaatcctc tgtacgcacc cacctcagaa catgtgaacg

2880

tcctactgac ccgcacggag gaccgcatcg tgtggaaaac actagccggc gacccatgga

2940

taaaaacact gactgccaag taccctggga atttcactgc cacgatagag gagtggcaag

3000

cagagcatga tgccatcatg aggcacatct tggagagacc ggaccctacc gacgtcttcc

3060

agaataaggc aaacgtgtgt tgggccaagg ctttagtgcc ggtgctgaag accgctggca

3120

tagacatgac cactgaacaa tggaacactg tggattattt tgaaacggac aaagctcact

3180

cagcagagat agtattgaac caactatgcg tgaggttctt tggactcgat ctggactccg

3240

gtctattttc tgcacccact gttccgttat ccattaggaa taatcactgg gataactccc

3300

cgtcgcctaa catgtacggg ctgaataaag aagtggtccg tcagctctct cgcaggtacc

3360

cacaactgcc tcgggcagtt gccactggaa gagtctatga catgaacact ggtacactgc

3420

gcaattatga tccgcgcata aacctagtac ctgtaaacag aagactgcct catgctttag

3480

tcctccacca taatgaacac ccacagagtg acttttcttc attcgtcagc aaattgaagg

3540

gcagaactgt cctggtggtc ggggaaaagt tgtccgtccc aggcaaaatg gttgactggt

3600

tgtcagaccg gcctgaggct accttcagag ctcggctgga tttaggcatc ccaggtgatg

3660

tgcccaaata tgacataata tttgttaatg tgaggacccc atataaatac catcactatc

3720

agcagtgtga agaccatgcc attaagctta gcatgttgac caagaaagct tgtctgcatc

3780

tgaatcccgg cggaacctgt gtcagcatag gttatggtta cgctgacagg gccagcgaaa

3840

gcatcattgg tgctatagcg cggcagttca agttttcccg ggtatgcaaa ccgaaatcct

3900

cacttgaaga gacggaagtt ctgtttgtat tcattcggta cgatcgcaag gcccgtacgc

3960

acaattctta caagctttca tcaaccttga ccaacattta tacaggttcc agactccacg

4020

aagccggatg tgcaccctca tatcatgtgg tgcgagggga tattgccacg gccaccgaag

4080

gagtgattat aaatgctgct aacagcaaag gacaacctgg cggaggggtg tgcggagcgc

4140

tgtataagaa attcccggaa agcttcgatt tacagccgat cgaagtagga aaagcgcgac

4200

tggtcaaagg tgcagctaaa catatcattc atgccgtagg accaaacttc aacaaagttt

4260

cggaggttga aggtgacaaa cagttggcag aggcttatga gtccatcgct aagattgtca

4320

acgataacaa ttacaagtca gtagcgattc cactgttgtc caccggcatc ttttccggga

4380

acaaagatcg actaacccaa tcattgaacc atttgctgac agctttagac accactgatg

4440

cagatgtagc catatactgc agggacaaga aatgggaaat gactctcaag gaagcagtgg

4500

ctaggagaga agcagtggag gagatatgca tatccgacga ctcttcagtg acagaacctg

4560

atgcagagct ggtgagggtg catccgaaga gttctttggc tggaaggaag ggctacagca

4620

caagcgatgg caaaactttc tcatatttgg aagggaccaa gtttcaccag gcggccaagg

4680

atatagcaga aattaatgcc atgtggcccg ttgcaacgga ggccaatgag caggtatgca

4740

tgtatatcct cggagaaggc atgagcagta ttaggtcgaa atgccccgtc gaagagtcgg

4800

aagcctccac accacctagc acgctgcctt gcttgtgcat ccatgccatg actccagaaa

4860

gagtacagcg cctaaaagcc tcacgtccag aacaaattac tgtgtgctca tcctttccat

4920

tgccgaagta tagaatcact ggtgtgcaga agatccaatg ctcccagcct atattgttct

4980

caccgaaagt gcctgcgtat attcatccaa ggaagtatct cgtggaaaca ccaccggtag

5040

acgagactcc ggagccatcg gcagagaacc aatccacaga ggggacacct gaacaaccac

5100

cacttataac cgaggatgag accaggacta gaacgcctga gccgatcatc atcgaagagg

5160

aagaagagga tagcataagt ttgctgtcag atggcccgac ccaccaggtg ctgcaagtcg

5220

aggcagacat tcacgggccg ccctctgtat ctagctcatc ctggtccatt cctcatgcat

5280

ccgactttga tgtggacagt ttatccatac ttgacaccct ggagggagct agcgtgacca

5340

gcggggcaac gtcagccgag actaactctt acttcgcaaa gagtatggag tttctggcgc

5400

gaccggtgcc tgcgcctcga acagtattca ggaaccctcc acatcccgct ccgcgcacaa

5460

gaacaccgtc acttgcaccc agcagggcct gctcgagaac cagcctagtt tccaccccgc

5520

caggcgtgaa tagggtgatc actagagagg agctcgaggc gcttaccccg tcacgcactc

5580

ctagcaggtc ggtctcgaga accagcctgg tctccaaccc gccaggcgta aatagggtga

5640

ttacaagaga ggagtttgag gcgttcgtag cacaacaaca atgacggttt gatgcgggtg

5700

catacatctt ttcctccgac accggtcaag ggcatttaca acaaaaatca gtaaggcaaa

5760

cggtgctatc cgaagtggtg ttggagagga ccgaattgga gatttcgtat gccccgcgcc

5820

tcgaccaaga aaaagaagaa ttactacgca agaaattaca gttaaatccc acacctgcta

5880

acagaagcag ataccagtcc aggaaggtgg agaacatgaa agccataaca gctagacgta

5940

ttctgcaagg cctagggcat tatttgaagg cagaaggaaa agtggagtgc taccgaaccc

6000

tgcatcctgt tcctttgtat tcatctagtg tgaaccgtgc cttttcaagc cccaaggtcg

6060

cagtggaagc ctgtaacgcc atgttgaaag agaactttcc gactgtggct tcttactgta

6120

ttattccaga gtacgatgcc tatttggaca tggttgacgg agcttcatgc tgcttagaca

6180

ctgccagttt ttgccctgca aagctgcgca gctttccaaa gaaacactcc tatttggaac

6240

ccacaatacg atcggcagtg ccttcagcga tccagaacac gctccagaac gtcctggcag

6300

ctgccacaaa aagaaattgc aatgtcacgc aaatgagaga attgcccgta ttggattcgg

6360

cggcctttaa tgtggaatgc ttcaagaaat atgcgtgtaa taatgaatat tgggaaacgt

6420

ttaaagaaaa ccccatcagg cttactgaag aaaacgtggt aaattacatt accaaattaa

6480

aaggaccaaa agctgctgct ctttttgcga agacacataa tttgaatatg ttgcaggaca

6540

taccaatgga caggtttgta atggacttaa agagagacgt gaaagtgact ccaggaacaa

6600

aacatactga agaacggccc aaggtacagg tgatccaggc tgccgatccg ctagcaacag

6660

cgtatctgtg cggaatccac cgagagctgg ttaggagatt aaatgcggtc ctgcttccga

6720

acattcatac actgtttgat atgtcggctg aagactttga cgctattata gccgagcact

6780

tccagcctgg ggattgtgtt ctggaaactg acatcgcgtc gtttgataaa agtgaggacg

6840

acgccatggc tctgaccgcg ttaatgattc tggaagactt aggtgtggac gcagagctgt

6900

tgacgctgat tgaggcggct ttcggcgaaa tttcatcaat acatttgccc actaaaacta

6960

aatttaaatt cggagccatg atgaaatctg gaatgttcct cacactgttt gtgaacacag

7020

tcattaacat tgtaatcgca agcagagtgt tgagagaacg gctaaccgga tcaccatgtg

7080

cagcattcat tggagatgac aatatcgtga aaggagtcaa atcggacaaa ttaatggcag

7140

acaggtgcgc cacctggttg aatatggaag tcaagattat agatgctgtg gtgggcgaga

7200

aagcgcctta tttctgtgga gggtttattt tgtgtgactc cgtgaccggc acagcgtgcc

7260

gtgtggcaga ccccctaaaa aggctgttta agcttggcaa acctctggca gcagacgatg

7320

aacatgatga tgacaggaga agggcattgc atgaagagtc aacacgctgg aaccgagtgg

7380

gtattctttc agagctgtgc aaggcagtag aatcaaggta tgaaaccgta ggaacttcca

7440

tcatagttat ggccatgact actctagcta gcagtgttaa atcattcagc tacctgagag

7500

gggcccctat aactctctac ggctaacctg aatggactac gacatagtct agtccgccaa

7560

gtctagcata tgggcgcgcc ctcagcatcg atttgaattg gccaccatga gggtccccgc

7620

tcagctcctg gggctcctgc tgctctggct cccaggtgca cgatgtgcca tgtgggagct

7680

ggagaaagac gtttatgttg tagaggtgga ctggactccc gatgcccctg gagaaacagt

7740

gaacctcacc tgtgacacgc ctgaagaaga tgacatcacc tggacctcag accagagaca

7800

tggagtcata ggctctggaa agaccctgac catcactgtc aaagagtttc tagatgctgg

7860

ccagtacacc tgccacaaag gaggcgagac tctgagccac tcacatctgc tgctccacaa

7920

gaaggaaaat ggaatttggt ccactgaaat tttaaaaaat ttcaaaaaca agactttcct

7980

gaagtgtgaa gcaccaaatt actccggacg gttcacgtgc tcatggctgg tgcaaagaaa

8040

catggacttg aagttcaaca tcaagagcag tagcagttcc cctgactctc gggcagtgac

8100

atgtggaatg gcgtctctgt ctgcagagaa ggtcacactg gaccaaaggg actatgagaa

8160

gtattcagtg tcctgccagg aggatgtcac ctgcccaact gccgaggaga ccctgcccat

8220

tgaactggcg ttggaagcac ggcagcagaa taaatatgag aactacagca ccagcttctt

8280

catcagggac atcatcaaac cagacccgcc caagaacttg cagatgaagc ctttgaagaa

8340

ctcacaggtg gaggtcagct gggagtaccc tgactcctgg agcactcccc attcctactt

8400

ctccctcaag ttctttgttc gaatccagcg caagaaagaa aagatgaagg agacagagga

8460

ggggtgtaac cagaaaggtg cgttcctcgt agagaagaca tctaccgaag tccaatgcaa

8520

aggcgggaat gtctgcgtgc aagctcagga tcgctattac aattcctcat gcagcaagtg

8580

ggcatgtgtt ccctgcaggg tccgatccgg aggttccggt ggtggatccg gaggtggctc

8640

cggcggcgga tccagggtca ttccagtctc tggacctgcc aggtgtctta gccagtcccg

8700

aaacctgctg aagaccacag atgacatggt gaagacggcc agagaaaaac tgaaacatta

8760

ttcctgcact gctgaagaca tcgatcatga agacatcaca cgggaccaaa ccagcacatt

8820

gaagacctgt ttaccactgg aactacacaa gaacgagagt tgcctggcta ctagagagac

8880

ttcttccaca acaagaggga gctgcctgcc cccacagaag acgtctttga tgatgaccct

8940

gtgccttggt agcatctatg aggacttgaa gatgtaccag acagagttcc aggccatcaa

9000

cgcagcactt cagaatcaca accatcagca gatcattcta gacaagggca tgctggtggc

9060

catcgatgag ctgatgcagt ctctgaatca taatggcgag actctgcgcc agaaacctcc

9120

tgtgggagaa gcagaccctt acagagtgaa aatgaagctc tgcatcctgc ttcacgcctt

9180

cagcacccgc gtcgtgacca tcaacagggt gatgggctat ctgagctccg ccggttccgg

9240

tggcggatcc gaagcacaca agagtgagat cgcccatcgg tataatgatt tgggagaaca

9300

acatttcaaa ggcctagtcc tgattgcctt ttcccagtat ctccagaaat gctcatacga

9360

tgagcatgcc aaattagtgc aggaagtaac agactttgca aagacgtgtg ttgccgatga

9420

gtctgccgcc aactgtgaca aatcccttca cactcttttt ggagataagt tgtgtgccat

9480

tccaaacctc cgtgaaaact atggtgaact ggctgactgc tgtacaaaac aagagcccga

9540

aagaaacgaa tgtttcctgc aacacaaaga tgacaacccc agcctgccac catttgaaag

9600

gccagaggct gaggccatgt gcacctcctt taaggaaaac ccaaccacct ttatgggaca

9660

ctatttgcat gaagttgcca gaagacatcc ttatttctat gccccagaac ttctttacta

9720

tgctgagcag tacaatgaga ttctgaccca gtgttgtgca gaggctgaca aggaaagctg

9780

cctgaccccg aagcttgatg gtgtgaagga gaaagcattg gtctcatctg tccgtcagag

9840

aatgaagtgc tccagtatgc agaagtttgg agagagagct tttaaagcat gggcagtagc

9900

tcgtctgagc cagacattcc ccaatgctga ctttgcagaa atcaccaaat tggcaacaga

9960

cctgaccaaa gtcaacaagg agtgctgcca tggtgacctg ctggaatgcg cagatgacag

10020

ggcggaactt gccaagtaca tgtgtgaaaa ccaggcgact atctccagca aactgcagac

10080

ttgctgcgat aaaccactgt tgaagaaagc ccactgtctt agtgaggtgg agcatgacac

10140

catgcctgct gatctgcctg ccattgctgc tgattttgtt gaggaccagg aagtgtgcaa

10200

gaactatgct gaggccaagg atgtcttcct gggcacgttc ttgtatgaat attcaagaag

10260

acaccctgat tactctgtat ccctgttgct gagacttgct aagaaatatg aagccactct

10320

ggaaaagtgc tgcgctgaag ccaatcctcc cgcatgctac ggcacagtgc ttgctgaatt

10380

tcagcctctt gtagaagagc ctaagaactt ggtcaaaacc aactgtgatc tttacgagaa

10440

gcttggagaa tatggattcc aaaatgccat tctagttcgc tacacccaga aagcacctca

10500

ggtgtcaacc ccaactctcg tggaggctgc aagaaaccta ggaagagtgg gcaccaagtg

10560

ttgtacactt cctgaagatc agagactgcc ttgtgtggaa gactatctgt ctgcaatcct

10620

gaaccgtgtg tgtctgctgc atgagaagac cccagtgagt gagcatgtta ccaagtgctg

10680

tagtggatcc ctggtggaaa ggcggccatg cttctctgct ctgacagttg atgaaacata

10740

tgtccccaaa gagtttaaag ctgagacctt caccttccac tctgatatct gcacacttcc

10800

agagaaggag aagcagatta agaaacaaac ggctcttgct gagctggtga agcacaagcc

10860

caaggctaca gcggagcaac tgaagactgt catggatgac tttgcacagt tcctggatac

10920

atgttgcaag gctgctgaca aggacacctg cttctcgact gagggtccaa accttgtcac

10980

tagatgcaaa gacgccttag ccggcggagg ttccggtggc ggatcccaat actatgacta

11040

cgatataccc ctgttcatgt acgggcaaat atctccaaac tgtgcaccag aatgtaactg

11100

ccctcactca taccccactg caatgtactg tgacgacctg aagttgaaat ccgtgccaat

11160

ggtgcctcct gggattaagt acctgtacct ccgcaacaat cagatcgacc atattgacga

11220

gaaggctttt gaaaacgtca cagacctcca gtggcttatc ctggaccata acctgcttga

11280

aaatagtaag ataaagggca aagtattttc caaacttaaa cagcttaaaa aactccacat

11340

caactacaat aaccttactg aatccgtggg accattgcca aaatctctcc aagatttgca

11400

gttgactaac aacaagatat ccaaactcgg ctccttcgat gggctggtta atctgacttt

11460

catctacttg caacacaacc aattgaagga ggatgcagtt tcagctagtc ttaaaggtct

11520

gaaaagcctt gagtatcttg atctgtcatt taatcaaatg tccaagctcc ctgctgggct

11580

cccaacaagt ctgctgacac tctatctcga caataacaag ataagtaaca ttcccgatga

11640

gtactttaaa agatttaccg gcctccaata cttgcggctt tctcacaacg agttggcaga

11700

ctctggtgta cccggcaact cctttaatat aagttctctt ctcgagcttg atttgtccta

11760

taacaaactg aagagtatcc ctactgtcaa tgaaaatttg gagaattact acctcgaagt

11820

caatgagctt gagaagttcg atgttaagtc tttctgtaag atactgggtc cattgtcata

11880

cagcaagatt aaacatcttc gcttggatgg gaatcccttg actcaaagct cacttccccc

11940

cgacatgtac gaatgcctga gggtagccaa cgaaatcaca gtaaacggag gtggctcctg

12000

agcgatcgct aaatacagca gcaattggca agctgcttac atagaactcg cggcgattgg

12060

catgccgcct taaaattttt attttatttt tcttttcttt tccgaatcgg attttgtttt

12120

taatatttca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaacgcgt cgaggggaat taattcttga

12180

agacgaaagg gccaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat

12240

ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc

12300

aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct

12360

tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag

12420

atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc aacagcggta

12480

agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact tttaaagttc

12540

tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtgttg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca

12600

tacactattc tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg

12660

atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg

12720

ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca

12780

tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa

12840

acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa

12900

ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata

12960

aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat

13020

ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc

13080

cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata

13140

gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt

13200

actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga

13260

agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag

13320

cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa

13380

tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag

13440

agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg

13500

tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat

13560

acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta

13620

ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg

13680

gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc

13740

gtgagcattg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa

13800

gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc

13860

tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt

13920

caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcgag ctctaatacg actcactata

13980

g

13981

<---

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая синтетический онколитический вирус, фармацевтическую композицию для лечения злокачественной опухоли (варианты), способ лечения злокачественной опухоли у нуждающегося в этом субъекта. Синтетический онколитический вирус содержит липидную наночастицу, содержащую N1,N3,N5-трис(3-(дидодециламино)пропил)бензол-1,3,5-трикарбоксамид (TT3) и самоамплифицирующийся репликон РНК, содержащий последовательность, кодирующую молекулу интерлейкина (IL)-12. Изобретение расширяет арсенал средств, направленных на лечение злокачественной опухоли у нуждающегося в этом субъекта. 4 н. и 13 з.п. ф-лы, 5 ил., 1 табл., 5 пр.

1. Синтетический онколитический вирус, содержащий:

(i) липидную наночастицу, содержащую N1,N3,N5-трис(3-(дидодециламино)пропил)бензол-1,3,5-трикарбоксамид (TT3); и

(ii) самоамплифицирующийся репликон РНК, содержащий последовательность, кодирующую молекулу интерлейкина (IL)-12; и

где молекула IL-12 экспрессируется посредством самоамплифицирующегося репликона РНК.

2. Синтетический онколитический вирус по п. 1, где липидная наночастица является способной запускать иммуногенную клеточную смерть.

3. Синтетический онколитический вирус по п. 1 или 2, где липидная наночастица дополнительно содержит 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE).

4. Синтетический онколитический вирус по любому из пп. 1-3, где липидная наночастица дополнительно содержит холестерин.

5. Синтетический онколитический вирус по любому из пп. 1-4, где самоамплифицирующийся репликон РНК происходит из альфавируса или вируса гепатита C.

6. Синтетический онколитический вирус по п. 5, где альфавирус представляет собой вирус венесуэльского энцефалита лошадей, вирус леса Семлики или вирус Синдбис.

7. Синтетический онколитический вирус по любому из пп. 1-6, где последовательность, кодирующая молекулу IL-12, локализована в субгеномной области самоамплифицирующегося репликона РНК.

8. Синтетический онколитический вирус по любому из пп. 1-7, где самоамплифицирующийся репликон РНК содержит нуклеотидную последовательность, которая имеет по меньшей мере 90% идентичность последовательности, представленной SEQ ID NO: 1.

9. Синтетический онколитический вирус по п. 8, где самоамплифицирующийся репликон РНК содержит точечные мутации G3936C и/или A4758G из SEQ ID NO: 1.

10. Синтетический онколитический вирус по любому из пп. 1-9, где молекула IL-12 представляет собой IL-12, субъединицу IL-12 или мутантную молекулу IL-12, сохраняющую иммуномодулирующую функцию.

11. Синтетический онколитический вирус по п. 10, где молекула IL-12 содержит субъединицы IL-12α и/или IL-12β.

12. Синтетический онколитический вирус по любому из пп. 1-11, где липидная наночастица имеет диаметр приблизительно 100-120 нм и/или дзета-потенциал приблизительно 3-6 мВ.

13. Фармацевтическая композиция для лечения злокачественной опухоли, содержащая:

синтетический онколитический вирус по любому из пп. 1-12 и фармацевтически приемлемый носитель.

14. Фармацевтическая композиция по п. 13, дополнительно содержащая C14-PEG2000.

15. Фармацевтическая композиция для лечения злокачественной опухоли, содержащая синтетический онколитический вирус и фармацевтически приемлемый носитель;

где синтетический онколитический вирус содержит:

(i) липидную наночастицу, содержащую N1,N3,N5-трис(3-(дидодециламино)пропил)бензол-1,3,5-трикарбоксамид (TT3), 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE) и холестерин; и

(ii) самоамплифицирующийся репликон РНК, содержащий последовательность, кодирующую молекулу интерлейкина (IL)-12;

где самоамплифицирующийся репликон РНК содержит нуклеотидную последовательность, которая имеет по меньшей мере 90% идентичность последовательности, представленной SEQ ID NO: 1;

где липидная наночастица является способной запускать иммуногенную клеточную смерть;

где молекула IL-12 экспрессируется посредством самоамплифицирующегося репликона РНК; и

где фармацевтическая композиция дополнительно содержит C14-PEG2000.

16. Способ лечения злокачественной опухоли у нуждающегося в этом субъекта, включающий:

введение субъекту эффективного количества синтетического онколитического вируса по любому из пп. 1-12.

17. Способ по п. 16, где субъект представляет собой пациента-человека, имеющего или как подозревают имеющего злокачественную опухоль, где злокачественная опухоль представляет собой меланому, рак молочной железы, рак кишечника, плоскоклеточный рак, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аденокарциному легкого, плоскоклеточную карциному легкого, злокачественную опухоль брюшины, печеночноклеточный рак, рак желудочно-кишечного тракта, рак поджелудочной железы, глиобластому, рак шейки матки, рак яичника, рак печени, рак мочевого пузыря, гепатому, колоректальный рак, карциному эндометрия или матки, карциному слюнной железы, рак почки, рак предстательной железы, рак женских наружных половых органов, рак щитовидной железы, карциному печени, рак желудка, плоскоклеточный рак головы и шеи, почечноклеточный рак, уротелиальную карциному или лимфому Ходжкина.