Соединение ингибитора FGFR в твердой форме и способ его получения Российский патент 2023 года по МПК C07D487/04 C07D495/00 A61K31/53 A61P35/00 

В настоящей заявке испрашивается приоритет по патентной заявке КНР No. 201910117530.7, озаглавленной «КРИСТАЛЛИЧЕСКАЯ ФОРМА ИНГИБИТОРА FGFR И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ», поданной 15 февраля 2019 в Патентное ведомство КНР, которая во всей полноте включена в данную заявку посредством ссылки.

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к твердой форме, кристаллической форме, кристаллической форме А и кристаллической форме В соединения формулы (I), а также к способу получения кристаллической формы А и кристаллической формы В, а также относится к применению твердой формы, кристаллической формы, кристаллической формы А, кристаллической формы В в изготовлении лекарственного средства для лечения заболеваний, связанных с FGFR (рецептором фактора роста фибробластов).

Уровень изобретения

Рецептор фактора роста фибробластов (FGFR) является рецептором фактора роста фибробластов (FGF) для передачи сигнала, который относится к семейству, состоящему из четырех представителей (FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4), и представляет собой гликопротеин, состоящий из внеклеточного иммуноглобулино(Ig)-подобного домена, гидрофобного трансмембранного домена и внутриклеточной части, содержащей тирозинкиназный домен. С помощью рецептора (FGFR) фактор роста фибробластов (FGF) оказывает свое важное влияние на многие физиологические регуляторные процессы, такие как пролиферация клеток, дифференциация клеток, миграция клеток и ангиогенез. Кроме того, с помощью многих доказательств было показано, что нарушение FGF сигнальных путей (например, высокая экспрессия, амплификация гена, мутация гена, хромосомная рекомбинация) напрямую связано со многими патологическими процессами, такими как пролиферация, миграция, инвазия и ангиогенез опухолевых клеток. Таким образом, FGFR стал важной терапевтической мишенью, вызывающей широкий исследовательский интерес.

В WO 2015008844 заявлена серия соединений, обладающих ингибирующей способностью в отношении FGFR, включая соединения сравнения 1 и 2. В WO 2013124316, WO 2013087647 и US 20130158000 также сообщается о серии соединений с ингибирующей способностью в отношении FGFR, включая бензотиофеновую структуру из настоящей заявки и соединение сравнения 3.

В WO 2019034076 раскрыт класс соединений с ингибирующей способностью в отношении FGFR, включая соединение WX001 (включая пару WX001A и WX001B в виде оптических изомеров) с хорошей активностью, но не удалось получить его продукт в твердой форме.

Авторы настоящего изобретения также обнаружили, что трудно получить твердую форму соединения WX001 традиционными способами, такими как применение метанола, этанола, тетрагидрофуранав качестве растворителя в обычных условиях обработки.

Таким образом, проблема, которую необходимо решить, состоит в том, чтобы получить соединение WX001A или WX001B в твердой форме, чтобы обеспечить продукты, удобные при производстве, очистке, хранении и применении.

Сущность изобретения

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили способ, позволяющий получать соединение WX001A или WX001B, описанное выше, в твердой форме, а также полученный соответствующий продукт в твердой форме, а также в кристаллической форме.

На основании указанного выше, в первом аспекте настоящего изобретения предложено соединение, представленное формулой (I), в твердой форме:

Во втором аспекте настоящего изобретения предложено соединение, представленное формулой (I), в кристаллической форме.

В предпочтительном аспекте настоящего изобретения предложена кристаллическая форма А соединения, представленного формулой (I), с дифракционными пиками при угле 2θ 6,37±0,2°, 9,90±0,2° и 19,07±0,2° на ее порошковой рентгенодифрактограмме.

В некоторых воплощениях настоящего изобретения описанная кристаллическая форма А соединения, представленного формулой (I), имеет дифракционные пики при угле 2θ 6,37±0,2°, 9,90±0,2°, 12,74±0,2°, 13,35±0,2°, 14,26±0,2°, 16,31±0,2°, 19,07±0,2° и 21,83±0,2° на ее порошковой рентгенодифрактограмме.

В некоторых воплощениях настоящего изобретения описанная кристаллическая форма А соединения, представленного формулой (I), имеет порошковую рентгенодифрактограмму, показанную на фиг. 1.

В некоторых воплощениях настоящего изобретения описанная кристаллическая форма А соединения, представленного формулой (I), имеет данные анализа порошковой рентгенодифрактограммы, показанные в таблице 1.

В некоторых воплощениях настоящего изобретения описанная кристаллическая форма А соединения, представленного формулой (I), имеет на ее кривой дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) эндотермический пик при температуре 141,05°С±5°С.

В некоторых воплощениях настоящего изобретения описанная кристаллическая форма А соединения, представленного формулой (I), имеет кривую ДСК, показанную на фиг. 2.

В некоторых воплощениях настоящего изобретения описанная кристаллическая форма А соединения, представленного формулой (I), имеет потерю массы 1,232% при температуре 124,65±3°С на ее кривой термогравиметрического анализа (ТГА).

В некоторых воплощениях настоящего изобретения описанная кристаллическая форма А соединения, представленного формулой (I), имеет кривую ТГА, показанную на фиг. 3.

В настоящем изобретении также предложен способ получения описанной кристаллической формы А соединения, представленного формулой (I), включающий:

(a) добавление соединения, представленного формулой (I), в нитрильный растворитель или сложноэфирный растворитель;

(b) перемешивание при температуре 30-50°С в течение 40-55 часов и

(c) отделение кристаллической формы А соединения, представленного формулой (I).

В указанном выше способе стадия (с) отделения может быть осуществлена путем центрифугирования, фильтрации и т.д. и предпочтительно путем центрифугирования; при этом необязательно за стадией (с) отделения может быть осуществлена сушка.

В некоторых воплощениях настоящего изобретения нитрильный растворитель, описанный выше, выбирают из ацетонитрила, пропионитрила и бутиронитрила.

В некоторых воплощениях настоящего изобретения сложноэфирный растворитель, описанный выше, выбирают из этилацетата, метилацетата, изопропилацетата и этилформиата.

В другом аспекте настоящего изобретения предложена также кристаллическая форма В соединения, представленного формулой (I), с дифракционными пиками при угле 20 3,60±0,2°, 9,14±0,2° и 15,07±0,2° на ее порошковой рентгенодифрактограмме.

Кристаллическая форма В соединения, представленного формулой (I), предложенная в настоящем изобретении, имеет дифракционные пики при угле 20 9,14±0,2° и 15,07±0,2° на ее порошковой рентгенодифрактограмме.

В некоторых воплощениях настоящего изобретения описанная кристаллическая форма В соединения, представленного формулой (I), имеет дифракционные пики при угле 2θ 3,60±0,2°, 9,14±0,2°, 11,05±0,2°, 13,25±0,2°, 15,07±0,2°, 16,47±0,2°, 18,31±0,2° и 22,29±0,2° на ее порошковой рентгенодифрактограмме.

В некоторых воплощениях настоящего изобретения описанная кристаллическая форма В соединения, представленного формулой (I), имеет дифракционные пики при угле 2θ 9,14±9,2°, 11,05±0,2°, 13,25±0,2°, 15,97±9,2°, 16,47±0,2°, 18,31±0,2° и 22,29±0,2° на ее порошковой рентгенодифрактограмме.

В некоторых воплощениях настоящего изобретения описанная кристаллическая форма В соединения, представленного формулой (I), имеет порошковую рентгенодифрактограмму, показанную на фиг. 4.

В некоторых воплощениях настоящего изобретения описанная кристаллическая форма В соединения, представленного формулой (I), имеет данные анализа порошковой рентгенодифрактограммы, показанные в таблице 2.

В некоторых воплощениях настоящего изобретения описанная кристаллическая форма В соединения, представленного формулой (I), имеет на ее кривой дифференциальной сканирующей калориметрии эндотермический пик с начальной точкой при температуре 174,09°С±5°С.

В некоторых воплощениях настоящего изобретения описанная кристаллическая форма В соединения, представленного формулой (I), имеет кривую ДСК, показанную на фиг. 5.

В некоторых воплощениях настоящего изобретения описанная кристаллическая форма В соединения, представленного формулой (I), имеет потерю массы 0,4324% при температуре 169,70±3°С на ее кривой термогравиметрического анализа (ТГА).

В некоторых воплощениях настоящего изобретения описанная кристаллическая форма В соединения, представленного формулой (I), имеет кривую ТГА, показанную на фиг. 6.

В настоящем изобретении также предложен способ получения описанной кристаллической формы В соединения, представленного формулой (I), включающий:

(a) добавление кристаллической формы А соединения, представленного формулой (I), в спиртовый растворитель или смешанный растворитель из спиртового растворителя и воды;

(b) перемешивание при температуре 30-50°С в течение 5-30 часов;

(c) выстаивание при температуре 10-20°С в течение 3-10 часов и

(d) отделение кристаллической формы В соединения, представленного формулой (I).

В указанном выше способе стадия (d) отделения может быть осуществлена путем центрифугирования, фильтрации и т.д. и предпочтительно путем центрифугирования; при этом необязательно за стадией (d) отделения может быть осуществлена сушка.

В некоторых воплощениях настоящего изобретения описанный спиртовый растворитель выбирают из метанола, этанола и изопропанола.

В некоторых воплощениях настоящего изобретения описанный смешанный растворитель из спиртового растворителя и воды выбирают из смешанного растворителя метанола и воды, смешанного растворителя этанола и воды и смешанного растворителя изопропанола и воды.

В настоящем описании также предложено применение соединения, представленного формулой (I), в твердой форме, описанной выше, соединения, представленного формулой (I), в кристаллической форме, кристаллической формы А соединения, представленного формулой (I), кристаллической формы В соединения, представленного формулой (I), в производстве лекарственного средства для лечения заболеваний, связанных с FGFR.

В некоторых воплощениях настоящего изобретения описанное заболевание, связанное с FGFR, представляет собой твердую опухоль.

Технический результат

Кристаллическая форма В соединения формулы (I) имеет увеличение массы, вызванное адсорбцией влаги, составляющее 0,1928% при температуре 25°С и 80% ОВ (относительной влажности), не проявляя или почти не проявляя гигроскопичности и показывая хорошие перспективы для изготовления лекарственных средств. Соединение формулы (I) проявляло хорошую ингибирующую способность в отношении FGFR дикого типа, а также хорошую ингибирующую способность в отношении FGFR мутантного типа и имело хорошие фармакокинетические параметры.

Определения и описание

Если не указано иное, следующие термины и выражения, используемые в данной заявке, имеют значения, указанные ниже. Конкретный термин или конкретное выражение, не определенное конкретно, следует понимать в соответствии с его обычным значением, а не считать его неопределенным или неясным. Когда в данной заявке указывается торговое наименование, оно относится к соответствующему товару или его активному ингредиенту.

Промежуточные соединения в настоящем изобретении можно получить разными способами синтеза, хорошо известными специалистам в данной области техники, включая конкретные воплощения, приведенные ниже, воплощения, образованные с помощью этих конкретных воплощений в сочетании с другими способами химического синтеза, а также эквивалентными им альтернативными способами, хорошо известными специалистам в данной области техники. Предпочтительные воплощения включают, не ограничиваясь указанными, примеры по настоящему изобретению.

Растворители, используемые в описании настоящей заявки, являются коммерчески доступными и могут использоваться без дальнейшей очистки.

В настоящем описании используют следующие сокращения: ДМФ обозначает диметилформамид; MsOH обозначает метансульфоновую килоту; EtOH обозначает этанол; NaOH обозначает гидроксид натрия; ДМСО обозначает диметилсульфоксид.

Названия соединениям даны без использования специальных программ или с помощью программного комплекса ChemDraw®, а для коммперчески доступных соединений используют название по каталогу поставщика.

Способ рентгеновской порошковой дифракции (XRPD) в описании настоящей заявки

Модель прибора: рентгеновский дифрактометр Bruker D8 advance

Способ испытания: Приблизительно 10-20 мг образца использовали для измерения методом рентгеновской порошковой дифракции (XRPD).

Подробные параметры XRPD были следующими:

Световая трубка: Cu, kα,

Напряжение световой трубки: 40 кВ, ток световой трубки: 40 мА

Щель расходимости: 0,60 мм

Щель детектора: 10,50 мм

Антирассеивающая щель: 7,10 мм

Диапазон сканирования: 3-40 град

Диаметр шага: 0,02 град

Длина шага: 0,12 секунд

Скорость вращения лотка для образцов: 15 об/мин

Способ дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) в описании настоящей заявки

Модель прибора: дифференциальный сканирующий калориметр ТА Q2000

Способ испытания: Образец (0,5-1 мг) помещали в алюминиевую чашку ДСК прибора и испытывали в интервале 25°С-300°С при скорости 10°С/мин. Скорость нагревания m-ДСК составляла 2°С/мин.

Способ термического гравиметрического анализа (ТГА) в описании настоящей заявки

Модель прибора: анализатор термического гравиметрического анализа ТА Q5000

Способ испытания: Образец (2-5 мг) помещали в платиновую чашку ТГА анализатора для испытания в условиях 25 мл/мин N2 и нагревания со скоростью нагревания 10°С/мин от комнатной температуры до 350°С или до потери массы 20%.

Динамическая сорбция паров (DVS)

Условия испытания: Приблизительно 10-15 мг образца использовали для определения DVS.

Уравновешивание dm/dt: 0,01%/мин: (время: 10 мин - 180 мин (максимум))

Сушка: 0% ОВ (относительной влажности), 120 мин

Градиент измерения ОВ (%): 10%

Диапазон градиента измерения ОВ (%): 0% - 90% - 0%

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 показана порошковая рентгенодифрактограмма кристаллической формы А соединения формулы (I).

На фиг. 2 показана ДОС кривая кристаллической формы А соединения формулы (I).

На фиг. 3 показан ТГА спектр кристаллической формы А соединения формулы (I).

На фиг. 4 показана порошковая рентгенодифрактограмма кристаллической формы В соединения формулы (I).

На фиг. 5 показана ДОС кривая кристаллической формы В соединения формулы (I).

На фиг. 6 показан ТГА спектр кристаллической формы В соединения формулы (I); и

На фиг. 7 показан ДВС спектр кристаллической формы В соединения формулы (I).

Подробное описание изобретения

Далее в заявке, чтобы лучше понять содержание настоящей заявки, приводятся конкретные примеры для дополнительной иллюстрации содержания настоящего изобретения, но они не предназначены для ограничения содержания настоящего изобретения.

Примеры

Промежуточное соединение А1:

Путь синтеза:

Стадия 1: синтез соединения А1-1

При комнатной температуре сначала 4-амино-7-бромопирроло[1,2-f][1,2,4]триазин (3,00 г, 14,1 ммоль, 1,00 экв.) растворяли в смешанном растворе 1,4-диоксана (40 мл) и воды (8 мл) и затем в тот же смешанный раствор последовательно добавляли сложный пинаколиновый эфир 1-Вос-2,5-дигидро-1Н-пиррол-3-бороновой кислоты (4,36 г, 14,8 ммоль, 1,05 экв.), фосфат калия (8,97 г, 42,2 ммоль, 3,00 экв.) и [1,1'-бис(дифенилфосфино)ферроцен]дихлорпалладий (1,03 г, 1,41 ммоль, 0,10 экв.). Под защитой газообразным азотом реакционный раствор нагревали до 80°С и перемешивали в течение 2 часов. После завершения реакции реакционный раствор охлаждали до 25°С и выливали в 20 мл воды. Черное твердое вещество получали и собирали путем фильтрации, а затем растворяли в смешанном растворе дихлорметана и метанола (100 мл, 5:1) и снова отфильтровывали. Фильтрат сушили с помощью безводного сульфата натрия и упаривали при пониженном давлении с помощью роторного испарителя для удаления органического растворителя и получения неочищенного продукта. Неочищенный продукт суспендировали в этилацетате (30 мл) и отфильтровывали с получением соединения А1-1. ЖХ-МС (ESI) m/z: 302,1 [М+Н]⁺, ¹Н ЯМР (400 МГц, дейтерированный ДМСО) δ=7,95 (s, 1H), 7,79 (шир. s, 2Н), 6,92 (s, 1H), 6,80-6,66 (m, 2Н), 4,47 (s, 2Н), 4,24 (s, 2Н), 1,44 (s, 9Н).

Стадия 2: синтез соединения А1-2

При комнатной температуре гидроксид палладия (615 мг, 438 мкмоль) добавляли в раствор А1-1 (1,20 г, 3,98 ммоль, 1,00 экв.) в метаноле (30 мл). После замены газа с помощью газообразного водорода 3 раза реакционный раствор нагревали до 50°С и перемешивали при 50 psi давления водорода в течение 2 часов. Реакционный раствор охлаждали до комнатной температуры и отфильтровывали для удаления катализатора. Фильтрат упаривали при пониженном давлении с помощью роторного испарителя для удаления растворителя с получением А1-2. ¹Н ЯМР (400 МГц, дейтерированный метанол) δ: 7,80 (s, 1Н), 6,86 (d, J=4,4 Гц, 1Н), 6,53 (d, J=4,4 Гц, 1H), 3,96-3,79 (m. 2Н), 3,60-3,51 (m, 1H), 3,49-3,38 (m, 2Н), 2,39-2,36 (m, 1H), 2,19-2,13 (m, 1H), 1,49 (d, J=3,6 Гц, 9Н).

Стадия 3: синтез соединения А1

При комнатной температуре йодосукцинимид (26,7 г, 119 ммоль, 3,00 экв.) добавляли порциями в раствор А1-2 (12,0 г, 39,6 ммоль, 1,00 экв.) в N,N-диметилформамиде (150 мл). Затем реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа, его медленно добавляли в ледяную баню (200 мл) и высаживали твердое вещество. После фильтрации растворитель удаляли и фильтровальный кек сушили с помощью роторного испарителя при пониженном давлении с получением соединения A1. ¹Н ЯМР (400 МГц, дейтерированный ДМСО) δ=7,88 (s, 1Н), 6,75 (s, 1H), 3,77-3,68 (m, 2Н), 3,42-3,38 (m, 1H), 3,28-3,23 (m, 2Н), 2,31-2,22 (m, 1H), 2,05-1,98 (m, 1Н), 1,39 (d, J=5,2 Гц, 9Н).

Промежуточное соединение В1:

Путь синтеза:

Раствор В1-1 (2,00 г, 11,22 ммоль, 1,00 экв.) в тетрагидрофуране (20,00 мл) охлаждали до -70°С. В охлажденный раствор медленно по каплям добавляли раствор бутиллития в н-гексане (2,5 моль/л, 8,98 мл, 2,00 экв.) и перемешивали в течение 1 часа после добавления. Затем добавляли триизопропилборат (2,11 г, 11,22 ммоль, 1,00 экв.) и перемешивали в течение 1 часа после добавления. Реакцию останавливали путем добавления по каплям воды (10 мл). Дезактивированную реакционную смесь концентрировали для удаления тетрагидрофурана. Остаток промывали петролейным эфиром (50 мл) и затем доводили до рН 5 разбавленной соляной кислотой для получения белого твердого вещества. После фильтрации фильтровальный кек промывали водой (50 мл) и затем сушили под вакуумом с получением промежуточного соединения В1. ¹Н ЯМР (400 МГц, дейтерированный хлороформ) δ=7,72 (s, 1H), 7,28 (s, 1H), 6,67 (s, 1H), 4,01 (s, 3Н), 2,50 (s, 3Н).

Пример 1 Синтез соединения формулы (I)

Стадия 1: Синтез соединения WX001-1

При комнатной температуре соединение В1 (777,25 мг, 3,50 ммоль, 2,50 экв.), карбонат натрия (296,77 мг, 2,80 ммоль, 2,00 экв.) и тетракис(трифенилфосфин)палладий (161,78 мг, 140,00 мкмоль, 0,10 экв.) последовательно добавляли в смешанный раствор соединения А1 (600,00 мг, 1,40 ммоль, 1,00 экв.) в диметиловом эфире этиленгликоля (9 мл), этанола (3 мл) и воды (0,5 мл). После замены газа газообразным азотом 3 раза смесь нагревали до 90°С. После этого смесь перемешивали в течение 5 часов, охлаждали ее до комнатной температуры и выливали в 30 мл воды и потом экстрагировали дихлорметаном (10 мл) 5 раз. Органические фазы объединяли и сушили безводным сульфатом натрия. После фильтрации фильтрат подвергали упариванию с помощью роторного испарителя при пониженном давлении для удаления растворителя с получением неочищенного продукта. Неочищенный продукт очищали методом колоночной хроматографии (петролейный эфир / этилацетат = от 10/1 до 1/3) с получением WX001-1. ЖХ-МС (ESI) m/z: 480,2 [М+Н]⁺, 502,2 [M+Na]⁺, ¹H ЯМР (400 МГц, дейтерированный метанол) δ=7,91 (s, 1Н), 7,27 (s, 2Н), 6,77 (s, 1H), 6,70 (s, 1H), 4,00 (s, 3Н), 3,96-3,90 (m, 2Н), 3,64-3,50 (m, 3Н), 2,49 (s, 3Н), 2,44-2,36 (m, 2Н), 1,50 (s, 9Н).

Стадия 2: Синтез соединения WX001-2

При комнатной температуре раствор соляной кислоты в этилацетате (4 моль/л, 2,00 мл, 9,51 экв.) медленно добавляли по каплям в раствор WX001-1 (350,00 мг, 729,79 мкмоль, 1,00 экв.) в этилацетате (2 мл) и перемешивали в течение 1 часа. После фильтрации твердое вещество получали и сушили при пониженном давлении с получением гидрохлоридной соли соединения WX001-2. ЖХ-МС (ESI) m/z: 380,1 [М+Н]⁺, ¹Н ЯМР (400 МГц, дейтерированный метанол) δ=8,17 (s, 1Н), 7,46 (s, 1H), 7,33 (s, 1H), 7,12-7,06 (m, 1H), 6,84 (s, 1H), 4,12-4,06 (m, 1H), 4,02 (s, 3H), 3,92-3,82 (m, 2H), 3,67-3,58 (m, 2H), 2,66-2,60 (m, 1H), 2,51 (s, 3H), 2,39-2,32 (m, 1H).

Стадия 3: Синтез соединения формулы (I)

При 0°С диизопропилэтиламин (258,56 мг, 2,00 ммоль, 349,41 мкл, 4,00 экв.) и раствор акрилоилхлорида в дихлорметане (0,25 М, 1,80 мл, 0,90 экв.) добавляли последовательно в раствор гидрохлоридной соли WX001-2 (200,00 мг, 500,16 мкмоль, 1,00 экв.) в дихлорметане (4,00 мл) и перемешивали в течение 5 минут. Затем реакционную жидкость выливали в 2 мл воды. После разделения слоев водную фазу экстрагировали дихлорметаном (1 мл) 3 раза. Органические фазы объединяли и сушили безводным сульфатом натрия. После фильтрации фильтрат подвергали упариванию с помощью роторного испарителя при пониженном давлении для удаления растворителя и с получением неочищенного продукта. Неочищенный продукт очищали методом тонкослойной препаративной хроматографии (дихлорметан/метанол=10/1) с получением соединения WX001-3. Соединение WX001-3 подвергали хиральному разделению (колонка: AS (250 мм × 30 мм, 5 мкм), подвижная фаза: [0,1% гидроксида аммония, этанол], диоксид углерода: 40%-40%) с получением соединения формулы (I) (время удерживания: 6,98 минут). Время удерживания определяли с помощью аналитической колонки Chiralpak AS-3 150×4,6 мм 3 мкм, подвижная фаза А: диоксид углерода В: метанол (0,05% диэтиламина), 40% диоксида углерода, со скоростью потока 2,5 мл/мин и температурой колонки 35°С. ЖХ-МС (ESI) m/z: 434,2 [М+Н]⁺, 456,1 [M+Na]⁺, ¹Н ЯМР (400 МГц, дейтерированный метанол) δ=7,75 (d, J=2,8 Гц, 1H), 7,08 (s, 2Н), 6,61 (s, 1H), 6,54 (d, J=6,4 Гц, 1H), 6,41-6,51 (m, 1H), 6,20-6,16 (m, 1H), 5,66-5,42 (m, 1Н), 4,09-3,96 (m, 1Н), 3,85 (s, 3Н), 3,80-3,38 (m, 4Н), 2,44-2,25 (m, 4Н), 2,21-1,99 (m, 1H).

Пример 2: Получение кристаллической формы А

500 мг соединения формулы (I), полученного в Примере 1, взвешивали добавляли в стеклянную колбу на 40 мл, затем добавляли 8 мл ацетонитрила и магнитную палочку для перемешивания. Смесь перемешивали, пока она не стала образцом-суспензией. Указанный выше образец еще перемешивали в течение 2 дней (с защитой от света) на нагревательном столике с магнитным перемешиванием (40°С). Образец быстро центрифугировали и оставшееся твердое вещество сушили под вакуумом в вакуумном сушильном шкафу при температуре 30°С в течение ночи для удаления остатков растворителя и с получением кристаллической формы А соединения формулы (I).

Пример 3: Получение кристаллической формы В

600 мг кристаллической формы А соединения формулы (I), полученного в Примере 2, взвешивали и добавляли в стеклянную колбу на 40 мл, затем добавляли 12 мл этанола в качестве растворителя и магнитную палочку для перемешивания. Смесь перемешивали, пока она не стала образцом-суспензией. Указанный выше образец еще перемешивали в течение ночи (с защитой от света) на нагревательном столике с магнитным перемешиванием (40°С) и оставляли при стоянии в течение 5 часов при комнатной температуре (примерно 15°С). Образец быстро центрифугировали и удаляли надосадочную жидкость. Твердое вещество, полученное путем центрифугирования, сушили под вакуумом в вакуумном сушильном шкафу сначала при температуре 40°С в течение 2 часов и потом при температуре 30°С в течение 60 часов с получением кристаллической формы В соединения формулы (I).

Пример 4: Исследование гигроскопичности кристаллической формы В соединения формулы (I)

Экспериментальные материалы:

Прибор для динамической адсорбции паров SMS DVS Advantage

Экспериментальный метод:

Брали 10-15 мг кристаллической формы В соединения формулы (I) и помещали на панель для DVS образца для испытания.

Результат эксперимента:

Кристаллическая форма В соединения формулы (I) имела DVS спектр, показанный на фиг. 7. При температуре 25°С и 80% влажности увеличение массы составляло ΔW=0,1928%.

Вывод:

Кристаллическая форма В соединения формулы (I) имела увеличение массы, вызванное адсорбцией влаги 0,1928% при 25°С и 80% ОВ, что является показателем того, что кристаллическая форма В соединения формулы (I) не имела или практически не имела гигроскопичности.

Экспериментальный пример 1: Оценка ингибирующей способности киназы дикого типа in vitro

IC₅₀ определяли, используя количественное определение активности киназы, меченной изотопом ³³Р (Reaction Biology Corp), для оценки ингибирующей способности испытуемого соединения против FGFR1 и FGFR4 человека.

Буфер: 20 мМ Hepes (рН 7,5), 10 мМ MgCl₂, 1 мМ ЭГТК (этиленгликоль тетрауксусной кислоты), 0,02% Brij35, 0,02 мг/мл БСА (бычьего сывороточного альбумина), 0,1 мМ Na₃VO₄, 2 мМ ДТТ (дитиотреитола) и 1% ДМСО.

Методика испытания: При комнатной температуре соединение формулы (I) растворяли в ДМСО для получения 10 мМ раствора. Субстрат растворяли в свежеприготовленном буфере и добавляли в испытуемую киназу и хорошо перемешивали. С помощью акустической технологии (Echo 550) раствор испытуемого соединения в ДМСО добавляли в указанный выше хорошо перемешиваемый реакционный раствор, чтобы концентрация соединения в реакционном растворе составляла 10 мкМ, 3,33 мкМ, 1,11 мкМ, 0,370 мкМ, 0,123 мкМ, 41,2 нМ, 13,7 нМ, 4,57 нМ, 1,52 нМ и 0,508 нМ или составляла 10 мкМ, 2,50 мкМ, 0,62 мкМ, 0,156 мкМ, 39,1 нМ, 9,8 нМ, 2,4 нМ, 0,61 нМ, 0,15 нМ и 0,038 нМ. Через 15 минут инкубации добавляли ³³Р-АТР (имеющую активность 0,01 мкСi/мкл, соответствующие концентрации приведены в таблице 3) для начала реакции. Информация о FGFR1, FGFR4 и поставщиках их субстратов, номера по каталогу и номер партии, а также их концентрации в реакционном растворе перечислены в таблице 3. После проведения реакции при комнатной температуре в течение 120 минут реакционный раствор наносили пятнами на ионообменную фильтровальную бумагу Р81 (номер Whatman 3698-915). После многократной промывки фильтровальной бумаги 0,75% раствором фосфорной кислоты определяли радиоактивность фосфорилированного субстрата, оставшегося на фильтровальной бумаге. Данные по активности киназы выражали путем сравнения активности киназы испытуемого соединения с активностью контрольной группы (содержащей только ДМСО), a IC₅₀ определяли путем аппроксимации кривой с помощью программного обеспечения Prism4 (GraphPad). Результаты эксперимента представлены в таблице 4.

Вывод: Соединение формулы (I) в настоящем изобретении проявляет более хорошую ингибирующую способность против FGFR дикого типа.

Экспериментальный пример 2: Оценка ингибирующей способности киназы мутантного типа in vitro

IC₅₀ определяли, используя количественное определение активности киназы, меченной изотопом ³³Р (Reaction Biology Corp), для оценки ингибирующей способности испытуемого соединения против FGFR мутантного типа. Релевантная информация о киназе, субстрате и АТР для in vitro испытания показана в таблице 5.

Буфер: 20 мМ Hepes (рН 7,5), 10 мМ MgCl₂, 1 мМ ЭГТК, 0,02% Brij35, 0,02 мг/мл БСА, 0,1 мМ Na₃VO₄, 2 мМ ДТТ и 1% ДМСО.

Методика испытания: При комнатной температуре соединение формулы (I) растворяли в ДМСО для получения 10 мМ раствора. Субстрат растворяли в свежеприготовленном буфере и добавляли в испытуемую киназу и хорошо перемешивали. С помощью акустической технологии (Echo 550) раствор испытуемого соединения в ДМСО добавляли в указанный выше хорошо перемешиваемый реакционный раствор, чтобы концентрация соединения в реакционном растворе составляла 10 мкМ, 3,33 мкМ, 1,11 мкМ, 0,370 мкМ, 0,123 мкМ, 41,2 нМ, 13,7 нМ, 4,57 нМ, 1,52 нМ и 0,508 нМ или составляла 10 мкМ, 2,50 мкМ, 0,62 мкМ, 0,156 мкМ, 39,1 нМ, 9,8 нМ, 2,4 нМ, 0,61 нМ, 0,15 нМ и 0,038 нМ. Через 15 минут инкубации добавляли ³³Р-АТР (имеющую активность 0,01 мкCi/мкл, соответствующие концентрации приведены в таблице 5) для начала реакции. Информация о FGFR1, FGFR4 и поставщиках их субстратов, номера по каталогу и номер партии, а также их концентрации в реакционном растворе перечислены в таблице 5. После проведения реакции при комнатной температуре в течение 120 минут реакционный раствор наносили пятнами на ионообменную фильтровальную бумагу Р81 (номер Whatman 3698-915). После многократной промывки фильтровальной бумаги 0,75% раствором фосфорной кислоты определяли радиоактивность фосфорилированного субстрата, оставшегося на фильтровальной бумаге. Данные по активности киназы выражали путем сравнения активности киназы испытуемого соединения с активностью контрольной группы (содержащей только ДМСО), a IC₅₀ определяли путем аппроксимации кривой с помощью программного обеспечения Prism4 (GraphPad). Результаты эксперимента представлены в таблице 6.

Вывод: Соединение формулы (I) в настоящем изобретении проявляет более хорошую ингибирующую способность против FGFR мутантного типа.

Экспериментальный пример 3: фармакокинетические исследования на собаках

Цель экспериментов

Целью экспериментов является испытание фармакокинетики испытуемого соединения на собаках породы бигль.

Экспериментальные материалы:

Собаки породы бигль (кобели)

Экспериментальный метод:

Две собаки породы бигль были отобраны в одну группу. Соединение вводили в состав смеси препарат с определенным назначением. В качестве носителя для внутривенного введения использовали смесь ДМСО: полиэтиленликоль 1400 (PEG400): водный раствор хлорида натрия=10:40:50 (объемное отношение) или смесь 10% ДМСО/10% солютола/80% воды. В качестве носителя для перорального введения была смесь 0,5% метилцеллюлозы (МЦ) + 0,2% Tween. Каждому животному вводили препарат внутрижелудочно в заранее заданной дозе.

Образцы цельной крови, каждый примерно по 500 мкл, собирали из головной вены или подкожной вены в 12 моментов времени, а именно: 5 минут, 15 минут, 30 минут, 1 час, 2 часа, 4 часа, 6 часов, 8 часов, 12 часов и 24 часа после введения животным.

Образцы плазмы помещали в пробирку для центрифуги, содержащую антикоагулянт, и центрифугировали при 3000 g в течение 10 мин при 4°С. Супернатант плазмы быстро замораживали на сухом льду и после этого хранили в холодильнике при -70±10°С до проведения ЖХ-МС/МС анализа.

Обработка данных:

Концентрацию соединения в плазме обрабатывали с использованием некомпартментной модели с помощью фармакокинетического программного обеспечения WinNonlin™ Version 6,3,0 (Pharsight, Mountain View, CA). Пиковую концентрацию (С_макс), время достижения пиковой концентрации (Т_макс) и время последней определяемой концентрации определяли напрямую по кривой зависимости концентрации в плазме от времени.

Следующие фармакокинетические параметры: период полувыведения (Т1/2), среднее время пребывания лекарственного средства в организме от момента времени 0 до конечного момента времени (MRTO-last), среднее время пребывания лекарственного средства в организме от момента времени 0 до бесконечного времени (MRTO-inf), площадь под кривой зависимости концентрации плазмы от времени от момента времени 0 до конечного момента времени (AUC0-last), площадь под кривой зависимости концентрации плазмы от времени от момента времени 0 до бесконечного времени (AUCO-inf), вычисляли линейно-логарифмическим методом трапеций.

Для отдельных концентраций в плазме ниже предела обнаружения, если она появлялась до Т_макс, учитывалась при расчетах как 0; если появлялась после Т_макс, ее просто исключали. Все параметры и соотношения записывались в виде трех значащих цифр.

В этих экспериментах фармакокинетические параметры рассчитывали на основе теоретического времени забора крови и теоретической вводимой концентрации в воплощениях изобретения. Отклонение между фактической вводимой концентрацией и теоретической концентрацией находилось в пределах ±20%. Отклонение между фактическим временем забора крови и теоретическим временем забора крови соответствовало релевантным стандартным рабочим методикам (SOP) (моменты времени в пределах 1 часа после введения находились в пределах ±1 минуты, а другие - в пределах 5% от теоретического времени).

Результаты эксперимента:

Результаты эксперимента с испытуемыми соединениями показаны в Таблице 7.

Вывод эксперимента:

Соединение формулы (I) имеет хорошие фармакокинетические параметры в опытах на собаках.

Изобретение относится к соединению, представленному формулой (I), в твердой форме, которое представляет собой кристаллическую форму А соединения, представленного формулой (I), с дифракционными пиками при угле 2θ 6,37±0,2°, 9,90±0,2°, 12,74±0,2°, 13,35±0,2°, 14,26±0,2°, 16,31±0,2°, 19,07±0,2° и 21,83±0,2° на порошковой рентгенодифрактограмме или представляет собой кристаллическую форму В соединения, представленного формулой (I), с дифракционными пиками при угле 2θ 9,14±0,2°, 11,05±0,2°, 13,25±0,2°, 15,07±0,2°, 16,47±0,2°, 18,31±0,2° и 22,29±0,2° на порошковой рентгенодифрактограмме. Изобретение относится к способу получения кристаллической формы А соединения, представленного формулой (I), включающему (а) добавление соединения, представленного формулой (I), в ацетонитрил; (b) перемешивание при температуре 30-50°С в течение 40-55 ч и (c) отделение кристаллической формы А соединения, представленного формулой (I). Изобретение относится к способу получения кристаллической формы В соединения, представленного формулой (I), включающему (a) добавление кристаллической формы А соединения, представленного формулой (I), в этанол; (b) перемешивание при температуре 30-50°С в течение 5-30 ч; (c) выстаивание при температуре 10-20°С в течение 3-10 ч и (d) отделение кристаллической формы В соединения, представленного формулой (I). Изобретение также относится к применению соединения, представленного формулой (I), в твердой форме, которое представляет собой кристаллическую форму А или кристаллическую форму В для производства лекарственного средства для лечения заболевания, связанного с FGFR. Технический результат - соединение формулы (I) проявляло хорошую ингибирующую способность в отношении FGFR дикого типа, а также кристаллическая форма В соединения формулы (I) не проявляет гигроскопичности и показывает хорошие перспективы для изготовления лекарственных средств. 4 н. и 11 з.п. ф-лы, 7 ил., 7 табл., 4 пр.

1. Соединение, представленное формулой (I), в твердой форме

которое представляет собой кристаллическую форму А соединения, представленного формулой (I), с дифракционными пиками при угле 2θ 6,37±0,2°, 9,90±0,2°, 12,74±0,2°, 13,35±0,2°, 14,26±0,2°, 16,31±0,2°, 19,07±0,2° и 21,83±0,2° на ее порошковой рентгенодифрактограмме или

которое представляет собой кристаллическую форму В соединения, представленного формулой (I), с дифракционными пиками при угле 2θ 9,14±0,2°, 11,05±0,2°, 13,25±0,2°, 15,07±0,2°, 16,47±0,2°, 18,31±0,2° и 22,29±0,2° на ее порошковой рентгенодифрактограмме.

2. Соединение, представленное формулой (I), в твердой форме по п. 1, которое представляет собой кристаллическую форму А соединения, представленного формулой (I), которая имеет порошковую рентгенодифрактограмму, показанную на фиг. 1.

3. Соединение, представленное формулой (I), в твердой форме по п. 1 или 2, которое представляет собой кристаллическую форму А соединения, представленного формулой (I), которая имеет эндотермический пик при температуре 141,05±5°С на кривой дифференциальной сканирующей калориметрии.

4. Соединение, представленное формулой (I), в твердой форме по п. 3, которое представляет собой кристаллическую форму А соединения, представленного формулой (I), которая имеет кривую ДСК, показанную на фиг. 2.

5. Соединение, представленное формулой (I), в твердой форме по любому из пп. 1-4, которое представляет собой кристаллическую форму А соединения, представленного формулой (I), которая имеет потерю массы 1,232% при температуре 124,65±3°С на кривой термогравиметрического анализа (ТГА).

6. Соединение, представленное формулой (I), в твердой форме по п. 5, которое представляет собой кристаллическую форму А соединения, представленного формулой (I), которая имеет кривую ТГА, показанную на фиг. 3.

7. Соединение, представленное формулой (I), в твердой форме по п. 1, которое представляет собой кристаллическую форму В соединения, представленного формулой (I), которая имеет порошковую рентгенодифрактограмму, показанную на фиг. 4.

8. Соединение, представленное формулой (I), в твердой форме по п. 1 или 7, которое представляет собой кристаллическую форму В соединения, представленного формулой (I), которая имеет эндотермический пик с начальной точкой при температуре 174,09±5°С на кривой дифференциальной сканирующей калориметрии.

9. Соединение, представленное формулой (I), в твердой форме по п. 8, которое представляет собой кристаллическую форму В соединения, представленного формулой (I), которая имеет кривую ДСК, показанную на фиг. 5.

10. Соединение, представленное формулой (I), в твердой форме по любому из пп. 1, 8 и 9, которое представляет собой кристаллическую форму В соединения, представленного формулой (I), которая имеет потерю массы 0,432% при температуре 169,70±3°С на спектре термогравиметрического анализа (ТГА).

11. Соединение, представленное формулой (I), в твердой форме по п. 10, которое представляет собой кристаллическую форму В соединения, представленного формулой (I), которая имеет спектр ТГА, показанный на фиг. 6.

12. Способ получения соединения, представленного формулой (I), в твердой форме по любому из пп. 1-6, которое представляет собой кристаллическую форму А соединения, представленного формулой (I), включающий:

(а) добавление соединения, представленного формулой (I), в ацетонитрил;

(b) перемешивание при температуре 30-50°С в течение 40-55 ч и

(c) отделение кристаллической формы А соединения, представленного формулой (I).

13. Способ получения соединения, представленного формулой (I), в твердой форме по любому из пп. 1 и 7-11, которое представляет собой кристаллическую форму В соединения, представленного формулой (I), включающий:

(a) добавление кристаллической формы А соединения, представленного формулой (I), в этанол;

(b) перемешивание при температуре 30-50°С в течение 5-30 ч;

(c) выстаивание при температуре 10-20°С в течение 3-10 ч и

(d) отделение кристаллической формы В соединения, представленного формулой (I).

14. Применение соединения, представленного формулой (I), в твердой форме по любому из пп. 1-6, которое представляет собой кристаллическую форму А соединения, представленного формулой (I), или соединения, представленного формулой (I), в твердой форме по любому из пп. 1 и 7-11, которое представляет собой кристаллическую форму В соединения, представленного формулой (I), в производстве лекарственного средства для лечения заболевания, связанного с FGFR.

15. Применение по п. 14, в котором заболевание, связанное с FGFR, представляет собой твердую опухоль.