ПРОДУКЦИЯ ФУКОЗИЛИРОВАННЫХ ОЛИГОСАХАРИДОВ В BACILLUS Российский патент 2023 года по МПК C12N1/21 C12N15/52 C12N15/75 C12N9/10 C12N9/12 C12N9/18 C12P19/18 

Настоящее изобретение относится к областям техники генной инженерии, в частности к генной инженерии клеток Bacillus для продукции фукозилированных олигосахаридов и к микробной продукции фукозилированных олигосахаридов с использованием указанных генетически сконструированных клеток Bacillus.

Предшествующий уровень техники

Человеческое грудное молоко обладает оптимальными питательными свойствами для грудных детей. Сахариды, которые присутствуют в человеческом грудном молоке, представляют собой основной компонент человеческого молока, превосходя жиры и белки. Помимо лактозы, которая служит источником энергии, человеческое грудное молоко содержит от примерно 5 до 25 граммов на литр молекул сложных сахаров, а именно, олигосахаридов. Данные олигосахариды обнаружены в значимых концентрациях только в человеческом молоке, и они суммарно известны как олигосахариды грудного молока (ОГМ).

На сегодняшний день идентифицировано приблизительно 200 структурно отличающихся ОГМ. Указанные ОГМ основаны на дисахариде - лактозе (состоящей из группировки глюкозы (Glc) и группировки галактозы (Gal)) и несут дополнительные остатки моносахаридов, которые основаны на N-ацетил-глюкозамине (GlcNAc), фукозе (Fuc), салициловой кислоте (NeuNAc) и галактозе (Gal). Концентрация и состав ОГМ в человеческом грудном молоке варьирует среди индивидуумов и на протяжении периода лактации от вплоть до 20 г/л в молозиве до 5-10 г/л в зрелом молоке.

Молоко женщин, принадлежащее к так называемому «фенотипу секретора», содержит высокое содержание α-1,2-фукозилированных ОГМ. У данных женщин экспрессируется ген FUT2, кодирующий так называемую «фукозилтрансферазу 2». Наиболее распространенными ОГМ в их молоке являются 2'-фукозиллактоза (2'-FL - от англ. 2'-fucosyllactose; Fuc(α1-2)Gal(β1-4)Glc) и лакто-N-фукопентаоза-I (LNPF-I - от англ.lacto-N-fucopentaose-I; Fuc(α1-2)Gal(β1-3)GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)Glc).

Олигосахариды грудного молока не перевариваются во время их прохождения через кишечник грудных детей. За счет их устойчивости в кишечнике грудного ребенка они демонстрируют полезные действия. Более конкретно, ОГМ, как было показано, являются пребиотическими, поскольку они служат источником углерода для комменсальных микроорганизмов родов Bifidobacterium, Bacteroides и Lactobacillus. Таким образом, ОГМ поддерживают пролиферацию данных микроорганизмов в кишечниках грудных детей.

Олигосахариды грудного молока также непосредственно уменьшают колонизацию кишечника грудного ребенка патогенами за счет того, что они предотвращают прилипание указанных патогенов к структурам гликана на поверхности слизистой кишечника. ОГМ функционируют как ловушка, благодаря их структурному сходству с гликанами поверхности эпителия, и ингибируют инвазию патогенов, снижая, вследствие этого, риск инфекций.

Показано, что альфа-1,2-фукозилированные ОГМ защищают от инфицирований Campylobacter jejuni, возбудителем наиболее распространенных бактериальных диарей. α-1,2-Фукозилированные ОГМ также ассоциированы с защитой от диареи, обусловленной термостойким токсином Escherichia coli. Кроме того, риск инфицирований калицивирусами, опосредующими диарею, снижается за счет высокого содержания α-1,2-фукозилированных ОГМ в грудном молоке. ОГМ, главным образом фукозилированный ОГМ лакто-N-фукопентаоза V (LNFP-V; Gal(β1-3)GlcNAc (β1-3)Gal(β1-4)[Fucα1-3]Glc), связывается(ются) с участком связывания токсина А из Clostridium difficile с углеводом, наиболее распространенной причины внутрибольничной диареи. Таким образом, ОГМ, по-видимому, препятствуют взаимодействию токсина toxin А из С. difficile с клеточными рецепторами.

Кроме того, прилипание Pseudomonas aeruginosa к эпителиальным клеткам значимо ингибировалось 2-FL и 3-фукозиллактозой (3-FL - от англ. 3-fucosyllactose; Gal(β1-4)[Fucα1-3]Glc). Связывание норовирусов (вирусов Норуолк, NLV - от англ. Norwalk-like virus), основной причины острого гастроэнтерита, с антигенами группы гисто-крови, предотвращается α-1,2-фукозилированными ОГМ, а также α-1,3-фукозилированными ОГМ. Это указывает на потенциал данных ОГМ в отношении ингибирования связывания капсида норовируса с гликанами рецептора хозяина.

Благодаря известной пользе от ОГМ и главным образом фукозилированных ОГМ экономически целесообразный способ их синтеза является желательным таким образом, чтобы данные олигосахариды или по меньшей мере некоторые из данных олигосахаридов стали доступными в качестве добавки к детской питательной смеси.

Из-за ограниченной поставки и сложностей получения чистых фракций отдельных олигосахаридов грудного молока, были разработаны химические пути синтеза некоторых данных сложных молекул. Однако и химический синтез, и биокаталитические подходы оказались коммерчески нерациональными. Кроме того, в частности химический синтез олигосахаридов грудного молока включает применение нескольких вредных химических веществ, которые накрадывают риск загрязнения конечного продукта.

Из-за проблем, возникающих при химическом синтезе олигосахаридов грудного молока, были разработаны ферментативные подходы к получению ОГМ. На сегодняшний день, раскрыта микробная продукция нескольких ОГМ, таких как 2'-фукозиллактоза, 3-фукозиллактоза, лакто-N-тетраоза, лакто-N-неотетраоза, лакто-N-фукопентаоза I, лакто-N-дифукогексаоза II, 3'-сиалиллактоза и 6'-сиалиллактоза, с использованием главным образом генетически сконструированных штаммов Escherichia coli.

На сегодняшний день рекомбинантные клетки Е. coli используют для микробной продукции ОГМ в промышленном масштабе. Однако род Escherichia coli содержит патогенные члены, а также непатогенные члены. Несмотря на то, что непатогенные штаммы Е. coli используют для микробной продукции ОГМ, такие непатогенные Е. coli не считают безопасными для изготовления продуктов, которые предназначены для потребления человеком во множестве областей. Таким образом, микробные клетки родов, которые расценивались бы как безопасные в таких областях, необходимы для изготовления соединений, которые предназначены для потребления человеком, для получения официального одобрения указанных продуктов для их коммерциализации в указанных областях.

Проблема решается посредством использования бактериальных клеток рода Bacillus, которые расцениваются как безопасные для потребления человеком, и которые способны продуцировать фукозилированный олигосахарид.

Бактерии рода Bacillus являются грамположительными, палочковидными микробными клетками, образующими эндоспоры, или аэробных, или факультативно анаэробных видов. Род Bacillus принадлежит к типу Фирмикуты. Геном членов рода Bacillus имеет тенденцию к парам оснований А-Т в своей частоте использования кодонов. Виды Bacillus почти повсеместно распространены в природе. Например, они могут быть найдены в почве (В. subtilis), а также встречаются в экстремальных условиях окружающей среды, таких как высокий рН (В. alcalophilus), высокая температура (В. thermophilus) или высокое содержание солей (В. halodurans).

Род Bacillus включает 266 видов, имеющих название, которые включают свободноживущие виды, а также паразитарные патогенные виды. Два вида Bacillus считаются с медицинской точки зрения значимыми: В. anthracis, который вызывает сибирскую язву, и В. cereus, который вызывает пищевое отравление. Третий вид, В. thuringiensis, является важным патогеном насекомых, продуцирующим токсин, который может уничтожать насекомых. Таким образом, он используется в качестве инсектицида для контроля над насекомыми-вредителями.

Из-за их статуса GRAS (от англ. generally recognized as safe - общепризнан безопасным), несколько видов Bacillus, например, В. amyloliquefaciens, В. licheniformis и В. subtilis, используются в биотехнологической продукции разных белков и соединений, используемых в пищевой и фармацевтической промышленности.

В. amyloliquefaciens является источником рестриктазы BamHI, и также синтезирует природный белок - антибиотик барназу. Кроме того, В. amyloliquefaciens продуцирует плантазолицин, антибиотик с селективной активностью в отношении B. anthracis. Альфа-амилаза из В. amyloliquefaciens часто используется в гидролизе крахмала. В. amyloliquefaciens также является источником субтилизина, который катализирует распад белков.

В. amyloliquefaciens представляет собой бактерию-колонизатора корней, которая используется для того, чтобы бороться с некоторыми патогенами корней растений в сельском хозяйстве, водной культуре и гидропонике, поскольку она оказывает действие против бактериальных и грибковых патогенов, и может предотвращать инфицирование в результате конкурентного исключения или вытеснения в конкурентной борьбе нежелательного патогена.

Ее высокая способность секретировать щелочную сериновую протеазу сделала В. licheniformis одной из наиболее важных бактерий в промышленном производстве фермента. Субтилизин Carlsberg, секретируемый В. licheniformis, используют в качестве протеазы для моющих средств, и он продается под торговым названием Alcalase®.

В. subtilis представляет собой бактерию, позитивную в отношении каталазы, которая обнаружена в почве и желудочно-кишечном тракте жвачных животных и человека. В. subtilis и вещества, происходящие из данной бактерии, не содержащей эндотоксин, оценивались разными авторитетными органами в отношении их безопасности и пользы в применении в пищевой продукции. В Соединенных Штатах ферменты карбогидраза и протеаза из В. subtilis общепризнаны безопасными (GRAS) Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA - от англ. Food and Drug Administration). Bacillus subtilis также присвоен статус «квалифицированной презумпции безопасности» Европейским агентством по безопасности продуктов питания.

Кроме того, нетоксигенные и непатогенные штаммы В. subtilis обычно используются в пищевой промышленности. Например, ферментированные соевые бобы в виде натто, которые обычно потребляют в Японии, содержат вплоть до 10 жизнеспособных клеток В. subtilis на грамм. Ферментированные бобы признают за их вклад в здоровую флору кишечника и поглощение витамина K₂. Продукт натто и В. subtilis var. natto в качестве его основного компонента представляют собой FOSHU (от англ. Foods for Specified Health Use - пищевые продукты, специально используемые для поддержания здоровья), одобренные министерством здравоохранения, труда и социальной защиты Японии в качестве эффективных для сохранения здоровья.

С В. subtilis легко работать, она быстро растет, и условия культивирования являются простыми. Рекомбинантные штаммы В. subtilis используют в продукции полигидроксиалканолатов, гиалуроновой кислоты и разных ферментов, таких как амилаза и протеазы.

С природными изолятами В. subtilis дикого типа сложно работать, по сравнению с лабораторными штаммами, которые подвергались процессам одомашнивания на основе мутагенеза и селекции. Данные одомашненные штаммы часто обладают улучшенными способностями к развитию природной компетентности (поглощению и интеграции ДНК окружающей среды), росту и потере способностей, необходимых «в дикой природе». В В. subtilis линейная ДНК, а также мультимерные формы плазмидной ДНК активно поглощаются природными компетентными клетками.

В определенных физиологических условиях маленькая субпопуляция клеток В. subtilis становится компетентной. В В. subtilis природная компетентность регулируется сложной регуляторной сетью. Ключевые регуляторы в данной сети представляют собой, среди прочих, мастер регулятор компетентности ComK и транскрипционный мастер регулятор споруляции Spo0A. Эффективность трансформации клеток В. subtilis и возможно эффективность интеграции ДНК в их геном можно улучшать посредством генной инженерии. Это может быть достигнуто посредством эктопической интеграции экспрессионной кассеты, содержащей регулируемый промотор (например, промотор, индуцируемый маннитом P_mtlA) и гены сотK и comS, в геном В. subtilis. Дополнительно, данная стратегия обеспечивает трансформацию В. subtilis за счет природной компетентности с использованием сложной среды (например, LB).

Для продукции фукозилированных сахаридов В. subtilis можно генетически модифицировать разными способами.

Интеграцию генов и/или (одновременную) инактивацию генов посредством нарушения или удаления можно достигать посредством гомологичной рекомбинации. Для эффективной гомологичной рекомбинации по меньшей мере 400-500 п.н. гомологичных плечей необходимы в В. subtilis.

Еще один способ для направленного конструирования генома представляет собой современную систему CRISPR-Cas9. Данный быстрый и безмаркерный инструмент редактирования генома можно использовать для крупномасштабных геномных делеций, маленьких и больших вставок ДНК, сайленсинга генов посредством введения стоп-кодона, а также введения точечных мутаций. Никаких предварительных геномных модификаций не требуется в случае лишенного изъянов редактирования генома посредством CRISPR-Cas9.

Случайная хромосомная интеграция генов и инсерционный мутагенез могут быть выполнены, используя модифицированный транспозон mariner. Данная система не связана с горячими точками в В. subtilis, одновременно демонстрируя высокую эффективность в случайной эктопической интеграции.

Несмотря на то, что виды Bacillus используют для промышленной продукции ферментов, на сегодняшний день не представлены клетки Bacillus для промышленной продукции олигосахаридов, в частности, фукозилированных олигосахаридов.

В китайской патентной заявке CN 108 410 787 А раскрыты рекомбинантные клетки Bacillus subtilis, которые синтезируют лактил-N-неотетраозу. Указанные рекомбинантные клетки В. subtilis имеют ген лактопермеазы, который интегрируют в геном клетки. Кроме того, указанная клетка Bacillus, которая несет плазмиду, содержащую ген бета-1,3-N-глюкозаминтрансферазы и ген β-1,4-галактозилотансферазы. Клетки В. subtilis можно культивировать в присутствии экзогенной лактозы и они синтезируют лактил-N-неотетраозу при титрах вплоть до примерно 1 г/л, что слишком мало для экономически целесообразного промышленного производства.

Несмотря на то, что во множестве патентных заявок упоминается Bacillus в качестве рода, который подходит для продукции олигосахаридов, таких как лакто-N-неотетраоза, никакого коммерческого применения Bacillus для продукций фукозилированных олигосахаридов, в частности фукозилированных олигосахаридов грудного молока, еще не было реализовано, предположительно из-за значительных усилий в модификации метаболизма, которые требуются для реализации необходимых путей биосинтеза для продукции ОГМ в Bacillus. Тогда как указанная выше В. subtilis для продукции LNnT зависит от субстратов-доноров, которые встречаются в природе в клетках В. subtilis, продукция фукозилированного олигосахарида в Bacillus требует реализации гетерологичного метаболического пути в клетке для обеспечения требуемого субстрата-донора - ГДФ (гуанозиндифосфат)-фукозы.

В китайской патентной заявке CN 109 735 479 А раскрыты рекомбинантные клетки Bacillus subtilis для осуществления синтеза 2'-фукозиллактозы, где уровень экспрессии фермента-транспортера лактозы повышен, и где клетка экспрессирует фукозокиназу, фосфатгуанинтрансферазу и фукозилтрансферазу. Сообщалось, что выход 2'-фукозиллактозы в ферментационной среде составлял от 0,424 г/л до 1,042 г/л.

Тем не менее цель настоящего изобретения заключалась в предложении бактериальной клетки рода Bacillus для продукции фукозилированных олигосахаридов.

Цель достигнута посредством предложения клетки Bacillus, в которой имеется лактозопермеаза для импортирования экзогенной лактозы в клетку, путь биосинтеза ГДФ-фукозы de novo для предоставления ГДФ-фукозы и фукозилтрансфераза для переноса группировки фукозы от ГДФ-фукозы на лактозу. Указанную клетку Bacillus можно культивировать в присутствии экзогенной лактозы с получением фукозилированного олигосахарида.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Согласно первому аспекту предложена неспорообразующая бактериальная клетка рода Bacillus для получения фукозилированного олигосахарида, где в клетке Bacillus имеется лактозопермеаза, путь биосинтеза ГДФ-фукозы и фукозилтрансфераза.

Согласно второму аспекту предложено применение неспорообразующей бактериальной клетки рода Bacillus согласно первому аспекту для получения фукозилированного олигосахарида.

Согласно третьему аспекту предложен способ получения фукозилированного олигосахарида, включающий:

- предоставление неспорообразующей бактериальной клетки рода Bacillus, где в указанной клетке Bacillus имеется лактозопермеаза, путь биосинтеза ГДФ-фукозы и фукозилтрансфераза, акцептирующая лактозу;

- культивирование клетки Bacillus в культуральной среде, содержащей лактозу, и в условиях, которые являются пермиссивными в отношении клетки Bacillus, с продукцией фукозилированного олигосахарида, и

- возможно, извлечение фукозилированного олигосахарида из культуральной среды и/или клетки Bacillus.

Согласно четвертому аспекту предложены фукозилированные олигосахариды, которые были продуцированы клеткой Bacillus, в которой имеется лактозопермеаза, путь биосинтеза ГДФ-фукозы и фукозилтрансфераза.

Согласно пятому аспекту предложено применение фукозилированного олигосахарида, который был продуцирован клеткой Bacillus, в которой имеется лактозопермеаза, путь биосинтеза ГДФ-фукозы и фукозилтрансфераза, для изготовления питательной композиции.

Согласно шестому аспекту предложены питательные композиции, содержащие по меньшей мере один фукозилированный олигосахарид, который продуцирован клеткой Bacillus, в которой имеется лактозопермеаза, путь биосинтеза ГДФ-фукозы и фукозилтрансфераза.

Подробное описание

Настоящее изобретение относится к клеткам Bacillus для продукции фукозилированных олигосахаридов, их применению и способам получения фукозилированных олигосахаридов посредством культивирования указанных клеток Bacillus в культуральной среде, содержащей лактозу, и в условиях, которые являются пермиссивными в отношении продукции указанного фукозилированного олигосахарида указанной клеткой Bacillus.

Для того, чтобы иметь способность продуцировать фукозилированный олигосахарид, клетка Bacillus должна предоставлять фукозилтрансферазе субстрат-донор, содержащий группировку фукозы, и субстрат-акцептор, представляющий собой дисахарид или олигосахарид, таким образом, чтобы фукозилтрансфераза могла переносить группировку фукозы от субстрата-донора на указанный субстрат-акцептор, с образованием, вследствие этого, фукозилированного олигосахарида.

Следует понимать, что фукозилированный олигосахарид, который предназначена продуцировать указанная клетка Bacillus, представляет собой желательный фукозилированный олигосахарид, тогда как другие фукозилированные олигосахариды, которые могут быть образованы за счет разнородности фукозилтрансферазы во время продукции желательного фукозилированного олигосахарида, считаются нежелательными фукозилированными олигосахаридами или побочными продуктами. Подходящий субстрат-донор представляет собой ГДФ-L-фукозу, и подходящий субстрат-акцептор для образования фукозиллактозы представляет собой дисахарид - лактозу. Полученный желательный фукозилированный олигосахарид представляет собой 2'-фукозиллактозу, 3-фукозиллактозу или 2',3-дифукозиллактозу.

Клетки Bacillus дикого типа как не синтезируют лактозу внутриклеточно, так и не поглощают и не метаболизируют экзогенную лактозу. Однако лактоза представляет собой субстрат-акцептор для группировки фукозы под действием фукозилтрансферазы, акцептирующей лактозу, в образовании некоторых фукозилированных олигосахаридов. Следовательно, с возможностью продуцировать фукозилированный олигосахарид, такой как 2'-фукозиллактоза, 3-фукозиллактоза или 2',3-дифукозиллактоза, клетка Bacillus должна обладать способностью предоставления лактозы фукозилтрансферазе, акцептирующей лактозу, или посредством образования лактозы внутриклеточно и/или посредством поглощения лактозы извне.

В одном воплощении клетка Bacillus для продуцирования фукозилированного олигосахарида может поглощать экзогенную лактозу, имея лактозопермеазу. Термин «экзогенный» в отношении лактозы, в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к лактозе, которая не происходит из клетки Bacillus, а именно, являясь внутриклеточно синтезированной клеткой Bacillus, а которая происходит снаружи по отношению к клетке Bacillus, и которую добавляют к культуральной среде, в которой выращивают клетку Bacillus для получения фукозилированного олигосахарида.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении клетка Bacillus генетически сконструирована с возможностью поглощать экзогенную лактозу, а именно для того, чтобы иметь лактозопермеазу. Таким образом, в клетке Bacillus для продукции фукозилированного олигосахарида имеется гетерологичная лактозопермеаза. Подходящая лактозопермеаза представляет собой LacY Е. coli или ее функциональный вариант.

Термин «гетерологичный», в том виде, в котором он используется в данном документе, в отношении белков, полипептидов, ферментов и транспортеров, а также в отношении молекул нуклеиновой кислоты и/или нуклеотидных последовательностей, относится к молекуле, которая не является нативной в отношении вида клетки, которая содержит указанную молекулу. Термин «ненативный» указывает на то, что указанная молекула отсутствует в клетке-предшественнике, встречающейся в природе или дикого типа, а именно, клетке того же вида, который наиболее часто встречается в природе, клетки Bacillus.

Термин «функциональный вариант», в том виде, в котором он используется в данном документе, в отношении ферментов и/или транспортных молекул, относится к белкам или полипептидам, обладающим такой же активностью (ферментативной, каталитической или транслоцирующей), как и фермент или транспортер, на который ссылаются, но который имеет аминокислотную последовательность, отличную от аминокислотной последовательности молекулы фермента или транспортера, на которую ссылаются. Таким образом, типичный вариант белка/полипептида отличается по аминокислотной последовательности от белка/полипептида, на который ссылаются. Вариант и белок/полипептид, на который ссылаются, может отличаться по аминокислотной последовательности одной или более заменами, присоединениями и/или делециями в любой комбинации. Следовательно, термин «функциональный вариант» включает усеченные версии белка/полипептида, на который ссылаются, которые обладают такой же активностью, как и белок/полипептид, на который ссылаются. Замещенный или вставленный аминокислотный остаток может представлять собой или может не представлять собой аминокислотный остаток, кодируемый генетическим кодом. Вариант белка/полипептида может представлять собой встречающийся в природе, как например, аллельный вариант, или он может представлять собой вариант, который не известно, чтобы встречался в природе. Варианты белков/полипептидов, не встречающиеся в природе, могут быть созданы посредством методик мутагенеза, посредством прямого синтеза или посредством других методов генной инженерии, известных специалистам в данной области. В пределах объема настоящего раскрытия в термин «вариант» также включены белки и межвидовые гомологи, которые имеют аминокислотную последовательность/последовательность нуклеиновой кислоты, которая обладает более чем примерно 60%-ной идентичностью аминокислотных последовательностей, 65%-ной, 70%-ной, 75%-ной, 80%-ной, 85%-ной, 90%-ной, предпочтительно 91%-ной, 92%-ной, 93%-ной, 94%-ной, 95%-ной, 96%-ной, 97%-ной, 98%-ной или 99%-ной или большей идентичностью аминокислотных последовательностей, предпочтительно, на протяжении области из по меньшей мере примерно 25, 50, 100, 200, 500, 1000 или более аминокислот, с референсным полипептидом.

Термин «такая же активность», в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к ферментативной, каталитической активности или активности транспортировки белка/полипептида лишь с точки зрения качества. Следовательно, «функциональный вариант» также включает варианты, которые обладают повышенной или пониженной активностью, по сравнению с активностью белка/полипептида, на который ссылаются.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении клетка Bacillus генетически сконструирована для того, чтобы содержать или экспрессировать нуклеотидную последовательность, которая кодирует лактозопермеазу, предпочтительно нуклеотидную последовательность, которая кодирует лактозопермеазу LacY Е. coli или ее функциональный вариант.

Лактозопермеаза LacY Е. coli кодируется областью, кодирующей белок (а именно, открытая рамка считывания) гена lacY Е. coli (номер доступа Gen Bank: NP_414877.1). Следовательно, в одном воплощении клетка Bacillus генетически сконструирована для того, чтобы содержать и экспрессировать нуклеотидную последовательность, которая кодирует лактозопермеазу LacY Е. coli или ее функциональный вариант.

В одном дополнительном и/или альтернативном воплощении частота использования кодона нуклеотидной последовательности, кодирующей гетерологичную лактозопермеазу, приспособлена к частоте использования кодона Bacillus. Частота использования кодона В. subtilis, например, необычна тем, что суммарное содержание GC ниже примерно 45%, содержание GC первой буквы данных кодонов выше примерно 51%, содержание CG второй буквы данных кодонов ниже примерно 36,1% и содержание CG третьей буквы данных кодонов ниже примерно 46%.

Для экспрессии лактозопермеазы клетка Bacillus содержит рекомбинантный ген лактозопермеазы, где нуклеотидная последовательность, которая кодирует лактозопермеазу, функционально связана с последовательностями контроля экспрессии, которые опосредуют экспрессию открытой рамки считывания лактозопермеазы.

Термин «функционально связанный», в том виде, в котором он используется в данном документе, будет означать функциональную связь между последовательностью контроля экспрессии нуклеотидной кислоты/гена (такой как промотор, сигнальная последовательность или ряд сайтов связывания транскрипционных факторов) и второй последовательностью нуклеиновой кислоты (обычно называемой «областью, кодирующей белок», «открытой рамкой считывания» и иногда даже «геном»), где последовательность контроля экспрессии влияет на транскрипцию и/или трансляцию нуклеотидной последовательности, соответствующей второй последовательности. Соответственно, термин «промотор» обозначает последовательности ДНК, которые обычно «предшествуют» открытой рамке считывания в ДНК-полимере и обеспечивают сайт инициации транскрипции в мРНК. «Регуляторные» последовательности ДНК, также обычно расположенные «выше» (то есть, предшествуя) открытой рамки считывания в данном ДНК-полимере, связывают белки, которые определяют частоту (или скорость) инициации транскрипции. В совокупности называемые «промоторной/регуляторной» или «контрольной» ДНК-последовательностью, данные последовательности, которые предшествуют выбранной открытой рамке считывания (или серии открытых рамок считывания) в функциональном ДНК-полимере способствуют определению того, будет ли происходить транскрипция (и в конечном итоге экспрессия) открытой рамки считывания. Последовательности ДНК, которые «следуют за» геном в ДНК-полимере и обеспечивают сигнал для терминации транскрипции в мРНК, называются последовательностями, «терминирующими» транскрипцию.

Рекомбинантный ген лактозопермеазы может быть интегрирован в хромосому Bacillus или присутствовать в виде эписомальной версии на плазмиде в клетке Bacillus.

Экспрессия гетерологичного гена лактозопермеазы в клетке Bacillus позволяет полученной клетке Bacillus поглощать извне поставляемую лактозу из культуральной среды. Поглощенная лактоза может затем служить субстратом-акцептором для фукозилтрансферазы (см. ниже в данном документе).

Клетка Bacillus для продукции фукозилированного олигосахарида должна иметь способность предоставлять субстрат-донор для переноса группировки фукозы на субстрат-акцептор. Субстрат-донор для группировки фукозы представляет собой ГДФ-фукозу. Следовательно, клетка Bacillus должна иметь способность внутриклеточно продуцировать ГДФ-фукозу. Для внутриклеточного биосинтеза ГДФ-фукозы, в клетке Bacillus имеется путь биосинтеза ГДФ-фукозы. Bacillus генетически сконструирована для того, чтобы иметь путь биосинтеза ГДФ-фукозы. Путь биосинтеза ГДФ-фукозы может представлять собой или путь биосинтеза ГДФ-фукозы de novo и/или реутилизационный путь ГДФ-фукозы.

В одном воплощении в клетке Bacillus имеется путь биосинтеза ГДФ-фукозы de novo для внутриклеточного биосинтеза ГДФ-фукозы. Клетка Bacillus генетически сконструирована для того, чтобы иметь путь биосинтеза ГДФ-фукозы de novo.

Путь биосинтеза ГДФ-фукозы de novo включает активности следующих ферментов:

1. фруктозо-6-фосфатизомераза;

2. фосфоманномутаза;

3. ГДФ:маннозо-1-фосфатгуанилилтрансфераза;

4. ГДФ-маннозо-4,6-дегидратаза; и

5. ГДФ-фукозосинтаза.

Следовательно, в клетке Bacillus для получения фукозилированного олигосахарида имеется фруктозо-6-фосфатизомераза (обычно также обозначаемая маннозо-6-фосфатизомеразой), фосфоманномутаза, ГДФ:маннозо-1-фосфатгуанилилтрансфераза, ГДФ-маннозо-4,6-дегидратаза и ГДФ-фукозосинтаза.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении клетка Bacillus генетически сконструирована для того, чтобы иметь фруктозо-6-фосфатизомеразу, фосфоманномутазу, ГДФ:маннозо-1-фосфатгуанилилтрансферазу, ГДФ-маннозо-4,6-дегидратазу и ГДФ-фукозосинтазу.

Путь биосинтеза ГДФ-фукозы de novo начинается с изомеризации фруктозо-6-фосфата до маннозо-6-фосфата, реакции, которая катализируется фруктозо-6-фосфатизомеразой. В дополнительном и/или альтернативном воплощении клетка Bacillus генетически сконструирована для того, чтобы содержать и экспрессировать нуклеотидную последовательность, которая кодирует фруктозо-6-фосфатизомеразу. Подходящий фруктозо-6-фосфат представляет собой ManA Е. coli или его функциональный вариант. Типичная нуклеотидная последовательность представляет собой нуклеотидную последовательность, которая кодирует ManA Е. coli.

Фруктозо-6-фосфатизомераза ManA Е. coli кодируется областью, кодирующей белок, гена тапА Е. coli (номер доступа GenBank: NP_416130.3). Таким образом, в дополнительном воплощении клетка Bacillus генетически сконструирована для того, чтобы содержать и экспрессировать нуклеотидную последовательность, которая кодирует ManA Е. coli или его функциональный вариант.

Фруктозо-6-фосфатизомераза ManA Е. coli кодируется открытой рамкой считывания гена тапА Е. coli (номер доступа GenBank: NP_416130.3). Таким образом, в дополнительном и/или альтернативном воплощении клетка Bacillus содержит ген тапА Е. coli или его функциональный вариант.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении частота использования кодона нуклеотидной последовательности, кодирующей фруктозо-6-фосфатизомеразу, приспособлена к частоте использования кодона Bacillus.

Другие подходящие фруктозо-6-фосфатизомеразы представляют собой ManA В. subtilis и белки-паралоги GmuF В. subtilis (YdhS) и Pmi В. subtilis (Yvyl) или их функциональные варианты. Иллюстративные нуклеотидные последовательности представляют собой нуклеотидные последовательности, которые кодируют ManA В. subtilis, GmuF В. subtilis или Pmi В. subtilis. Фруктозо-6-фосфатизомеразу ManA В. subtilis кодирует открытая рамка считывания гена тапА В. subtilis (номер доступа Gen Bank: NP_389084.1).

Фруктозо-6-фосфатизомераза ManA В. subtilis кодируется областью, кодирующей белок, гена тапА В. subtilis (номе доступа GenBank: (NP_389084.1)). Таким образом, в дополнительном воплощении клетка Bacillus генетически сконструирована для того, чтобы содержать и экспрессировать нуклеотидную последовательность, которая кодирует ManA В. subtilis или его функциональный вариант. Таким образом, в дополнительном и/или альтернативном воплощении клетка Bacillus содержит ген тапА В. subtilis или его функциональный вариант.В еще одном дополнительном и/или альтернативном воплощении клетка Bacillus генетически сконструирована для того, чтобы содержать и экспрессировать нуклеотидную последовательность, которая кодировала ген gmuF В. subtilis или его функциональный вариант, и/или нуклеотидную последовательность, которая кодирует ген pmi В. subtilis или его функциональный вариант.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении экспрессия нативного гена тапА, нативного гена gmuF и/или нативного гена pmi может быть повышена. Экспрессия нативного гена тапА, нативного гена gmuF и/или нативного гена pmi может быть повышена по той причине, что эндогенный промотор по меньшей мере одного из нативного гена тапА, нативного гена gmuF и нативного гена pmi заменен более сильным промотором, а именно промотором, опосредующим повышенный уровень экспрессии, по сравнению с нативным промотором гена тапА, гена gmuF и гена pmi, соответственно. В еще одном дополнительном или альтернативном воплощении экспрессия нативного гена тапА, нативного гена gmuF и/или нативного гена pmi может быть усилена по той причине, что дополнительные копии нативного гена тапА, нативного гена gmuF и/или нативного гена pmi размножаются в клетке Bacillus.

В еще одном дополнительном и/или альтернативном воплощении экспрессия нативного гена тапА может усиливаться в результате делеции или функциональной инактивации гена тапР, кодирующего транспортер маннозы, приводящей к конститутивной экспрессии нативного гена тапА.

В еще одном дополнительном или альтернативном воплощении экспрессия нативного гена gmuF может быть усилена в результате делеции или функциональной инактивации гена gmuR, кодирующего соответствующий репрессор транскрипции.

Для экспрессии фруктозо-6-фосфатизомеразы клетка Bacillus содержит рекомбинантный ген фруктозо-6-фосфатизомеразы, в котором нуклеотидная последовательность, которая кодирует фруктозо-6-фосфатизомеразу, функционально связана с последовательностями контроля экспрессии.

Рекомбинантный ген фруктозо-6-фосфатизомеразы может быть интегрирован в хромосому Bacillus или присутствовать в виде эписомальной версии на плазмиде в клетке Bacillus.

На второй стадии биосинтеза de novo ГДФ-фукозы маннозо-6-фосфат превращается в маннозо-1-фосфат под действием ферментативной активности фосфоманномутазы. В дополнительном и/или альтернативном воплощении клетка Bacillus генетически сконструирована для того, чтобы содержать и экспрессировать нуклеотидную последовательность, которая кодирует фосфоманномутазу.

Подходящая фосфоманномутаза представляет собой фосфоманномутазу ManB Е. coii. Таким образом, в дополнительном воплощении клетка Bacillus генетически сконструирована для того, чтобы содержать и экспрессировать нуклеотидную последовательность, которая кодирует ManB Е. coli или ее функциональный вариант.

Фосфоманномутаза ManB Е. coli кодируется нуклеотидной последовательностью области, кодирующей белок, ген тапВ Е. coli (номер доступа Gen Bank: NP_416552.1). Таким образом, в дополнительном и/или альтернативном воплощении клетка Bacillus содержит ген тапВ Е. coli или его функциональный вариант.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении частота использования кодона нуклеотидной последовательности, кодирующей фосфоманномутазу, приспособлена к частоте использования кодона Bacillus.

Для экспрессии фосфоманномутазы клетка Bacillus содержит рекомбинантный ген фосфоманномутазы, в котором нуклеотидная последовательность, которая кодирует фосфоманномутазу, функционально связана с последовательностями контроля экспрессии.

Рекомбинантный ген фосфоманномутазы может быть интегрирован в хромосому Bacillus или присутствовать в клетке Bacillus в виде эписомальной версии на плазмиде.

Следующая стадия в пути биосинтеза ГДФ-фукозы cfe novo представляет собой образование ГДФ-маннозы посредством следующей реакции:

α-D-маннозо-1-фосфат+ГТФ+Н⁺=>дифосфат+ГДФ-α-D-манноза

Превращение маннозо-1-фосфата в ГДФ-маннозу опосредовано ГДФ:маннозо-1-фосфатгуанилилтрансферазой. Таким образом, в клетке Bacillus для продукции фукозилированного олигосахарида имеется гетерологичная ГДФ:маннозо-1-фосфатгуанилилтрансфераза. Подходящая ГДФ:маннозо-1-фосфатгуанилилтрансфераза представляет собой ManC Е. coli или ее функциональный вариант.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении клетка Bacillus генетически сконструирована, чтобы содержать и экспрессировать нуклеотидную последовательность, которая кодирует ГДФ:маннозо-1-фосфатгуанилилтрансферазу. Иллюстративная нуклеотидная последовательность представляет собой нуклеотидную последовательность, которая кодирует ManC Е. coli. Таким образом, в дополнительном воплощении клетка Bacillus генетически сконструирована для того, чтобы содержать и экспрессировать нуклеотидную последовательность, которая кодирует ManC Е. coli или ее функциональный вариант.

ГДФ:маннозо-1-фосфатгуанилилтрансфераза ManC Е. coli кодируется открытой рамкой считывания гена тапС Е. coli (номер доступа Gen Bank: NP_416553.1). Таким образом, в дополнительном и/или альтернативном воплощении клетка Bacillus содержит ген тапС Е. coli или его функциональный вариант.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении частота использования кодона нуклеотидной последовательности, кодирующей ГДФ:маннозо-1-фосфатгуанилилтрансферазу, приспособлена к частоте использования кодона Bacillus.

В случае экспрессии ГДФ:маннозо-1-фосфатгуанилилтрансферазы в клетке Bacillus содержится рекомбинантный ген ГДФ:маннозо-1-фосфатгуанилилтрансеразы, в котором нуклеотидная последовательность, которая кодирует ГДФ:маннозо-1-фосфатгуанилилтрансферазу, функционально связана с последовательностями контроля экспрессии.

Рекомбинантный ген ГДФ:маннозо-1-фосфатгуанилилтрансферазы может быть интегрирован в хромосому Bacillus или находиться в виде эписомальной версии на плазмиде.

На последующей стадии пути ГДФ-фукозы de novo, катализируемой ГДФ-маннозо-4,6-дегидратазой, ГДФ-D-манноза превращается в ГДФ-4-дегидро-6-дезокси-D-маннозу.

Таким образом, в клетке Bacillus для получения фукозилированного олигосахарида имеется ГДФ-маннозо-4,6-дегидратаза. Подходящей ГДФ-маннозо-4,6-дегидратазой является Gmd Е. coll.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении клетка Bacillus генетически сконструирована для того, чтобы содержать и экспрессировать нуклеотидную последовательность, которая кодирует ГДФ-маннозо-4,6-дегидратазу. Иллюстративная нуклеотидная последовательность представляет собой нуклеотидную последовательность, которая кодирует Gmd Е. coll. Таким образом, в дополнительном воплощении клетка Bacillus генетически сконструирована для того, чтобы содержать и экспрессировать нуклеотидную последовательность, которая кодирует Gmd Е. coli или ее функциональный вариант.

ГДФ-маннозо-4,6-дегидратаза Gmd Е. coli кодируется открытой рамкой считывания гена gmd Е. coli (номер доступа Gen Bank: NP_416557.1). Таким образом, в дополнительном и/или альтернативном воплощении в клетке Bacillus содержится ген gmd Е. coli или его функциональный вариант.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении частота использования кодона нуклеотидной последовательности, кодирующей ГДФ-маннозо-4,6-дегидратазу, приспособлена к частоте использования кодона Bacillus.

В случае экспрессии ГДФ-маннозо-4,6-дегидратазы, в клетке Bacillus содержится рекомбинантный ген ГДФ-маннозо-4,6-дегидратазы, в котором нуклеотидная последовательность, которая кодирует ГДФ-маннозо-4,6-дегидратазу, функционально связана с последовательностями контроля экспрессии.

Рекомбинантный ген ГДФ-маннозо-4,6-дегидратазы может быть интегрирован в хромосому Bacillus или находиться в виде эписомальной версии на плазмиде.

В конечной реакции пути биосинтеза de novo ГДФ-фукозы ГДФ-4-дегидро-6-дезокси-D-манноза превращается в ГДФ-фукозу в результате двухстадийной NADPH (от англ. reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate восстановленный никотинамидадениндинуклеотидфосфат)-зависимой реакции. Данное превращение опосредовано ГДФ-фукозосинтазой и включает эпимеразную реакцию и редуктазную реакцию. Указанная эпимеразная реакция превращает ГДФ-4-кето-6-дезоксиманнозу в ГДФ-4-кето-6-дезоксигалактозу, которая затем восстанавливается до ГДФ-фукозы.

Таким образом, в клетке Bacillus для продукции фукозилированного олигосахарида имеется ГДФ-фукозосинтаза. Подходящей ГДФ-фукозосинтазой является WcaG Е. coli или ее функциональный вариант.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении клетка Bacillus генетически сконструирована для того, чтобы содержать и экспрессировать нуклеотидную последовательность, которая кодирует ГДФ-фукозосинтазу. Иллюстративная нуклеотидная последовательность представляет собой нуклеотидную последовательность, которая кодирует WcaG Е. coli. Таким образом, в дополнительном воплощении клетка Bacillus генетически сконструирована для того, чтобы содержать и экспрессировать нуклеотидную последовательность, которая кодирует WcaG Е. coli или ее функциональный вариант.

ГДФ-фукозосинтаза WcaG Е. coli кодируется открытой рамкой считывания гена wcaG Е. coli (номер доступа Gen Bank: NP_416556.1). Таким образом, в дополнительном и/или альтернативном воплощении в клетке Bacillus содержится ген wcaG Е. coli или его функциональный вариант.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении частота использования кодона нуклеотидной последовательности, кодирующей ГДФ-фукозосинтазу, приспособлена к частоте использования кодона Bacillus.

В случае экспрессии ГДФ-фукозосинтазы, в клетке Bacillus содержится рекомбинантный ген ГДФ-фукозосинтазы, в котором нуклеотидная последовательность, которая кодирует ГДФ-фукозосинтазу, функционально связана с последовательностями контроля экспрессии.

Рекомбинантный ген ГДФ-фукозосинтазы может быть интегрирован в хромосому Bacillus или находиться в виде эписомальной версии на плазмиде.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении в клетке Bacillus имеется реутилизационный путь ГДФ-фукозы для внутриклеточного биосинтеза ГДФ-фукозы. В пути реутилизации ГДФ-L-фукозы свободная цитоплазматическая фукоза фосфорилирована под действием L-фукокиназы с образованием L-фукозо-L-фосфата, который затем дополнительно превращается в ГДФ-L-фукозу.

Реутилизационный путь для биосинтеза ГДФ-фукозы включает следующие ферменты:

I. фукозокиназа; и

II. L-фукозо-1-фосфатгуанилилтрансфераза.

Следовательно, в клетке Bacillus для продукции фукозилированного олигосахарида, в которой имеется реутилизационный путь ГДФ-фукозы, имеется фукозокиназа и L-фукозо-1-фосфатгуанилилтрансфераза.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении клетка Bacillus генетически сконструирована для того, чтобы иметь фукозокиназу и L-фукозо-1-фосфатгуанилилтрансферазу.

Фукозокиназа, также называемая фукокиназой, АТФ:6-дезокси-L-галактозо-1-фосфотрансфераза, АТФ:β-L-фукозо-1-фосфотрансфераза или L-фукокиназная активность, L-фукозокиназная активность катализирует реакцию L-фукоза+АТФ → β-L-фукозо-1-фосфат+АДФ+2 Н⁺.

Затем L-фукозо-1-фосфатгуанилилтрансфераза или ГДФ-L-фукозопирофосфорилаза превращает указанный β-L-фукозс-1-фосфат в ГДФ-L-фукозу.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении клетка Bacillus генетически сконструирована для того, чтобы содержать и экспрессировать нуклеотидную последовательность, которая кодирует фукозокиназу или ее функциональный вариант, и L-фукозо-1-фосфатгуанилилтрансферазу или ее функциональный вариант.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении фукозокиназа и L-фукозо-1-фосфатгуанилилтрансфераза объединены в одном единственном полипептиде. Подходящие гены для трансформации, кодирующие фукозокиназу, фукозо-1-фосфатгуанилилтрансферазу и/или бифункциональную L-фукозо-1-фосфатгуанилилтрансферазу, могут быть получены из родов Bacteroides, Lentisphaera, Ruminococcus, Solibacter, Arabidopsis, Oryza, Physcomitrella, Vitis, Danio, Bos, Equus, Macaca, Pan, Homo, Rattus, Mus и Xenopus. Пример бифункциональной фукозокиназы/L-фукозо-1-фосфатгуанилилтрансферазы найден в Bactericides fragilis.

В В. fragilis бифункциональная фукозокиназа/L-фукозо-1-фосфатгуанилилтрансфераза Fkp кодируется геном fkp В. fragilis (номер доступа GenBank AY849806).

В дополнительном и/или альтернативном воплощении клетка Bacillus генетически сконструирована для того, чтобы содержать и экспрессировать нуклеотидную последовательность, которая кодирует Fkp В. fragilis или ее функциональный вариант.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении частота использования кодона нуклеотидных последовательностей, кодирующих фукозокиназу, фукозо-1-фосфатгуанилилтрансферазу и/или бифункциональную фукозокиназу/L-фукозо-1-фосфатгуанилилтрансферазу, приспособлена к частоте использования кодона Bacillus.

В случае экспрессии фукозокиназы и фукозо-1-фосфатгуанилилтрансферазы, в клетке Bacillus содержится по меньшей мере один рекомбинантный ген, в котором область, кодирующая белок, кодирующая фукозокиназу и L-фукозо-1-фосфатгуанилилтрансферазу и/или бифункциональную фукозокиназу/L-фукозо-1-фосфатгуанилилтрансферазу фукозокиназу, функционально связана с последовательностями контроля экспрессии.

Рекомбинантный ген фукозокиназы, ген фукозо-1-фосфатгуанилилтрансферазы и/или ген бифункциональной фукозокиназы/L-фукозо-1-фосфатгуанилилтрансферазы, может быть интегрирован в хромосому Bacillus или находиться в виде эписомальной версии на плазмиде.

В случае внутриклеточного образования фукозиллактозы в клетке Bacillus имеется фукозилтрансфераза. Ферментативная активность фукозилтрансферазы переносит группировку фукозы с субстрата-донора на субстрат-акцептор. Для биосинтеза фукозиллактозы указанный субстрат-акцептор представляет собой лактозу. Следовательно, фукозилтрансфераза представляет собой фукозилтрансферазу, акцептирующую лактозу.

Фукозилтрансфераза выбрана из группы, состоящей из α-1,2-фукозилтрансфераз для биосинтеза 2'-фукозиллактозы и α-1,3-фукозилтрансфераз для биосинтеза 3-фукозиллактозы.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении клетка Bacillus генетически сконструирована для того, чтобы содержать и экспрессировать по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, которая кодирует фукозилтрансферазу.

Для получения 2'-фукозиллактозы (2'-FL) α-1,2-фукозилтрансферазы WbgL из O126 Е. coli и FucT2 из Helicobacter pylori (ЕР 2 479 263 В1), α-1,2-фукозилтрансферазы WblA из Vibrio cholera O22, FutD из Н. bilis АТСС 437879, FutE из Н cinaede CCUG 18818, FutN из Bacteroides vulgatus АТСС 8482, FutO из Bacteroides ovatus АТСС 8483, WbgN из E. coli O55:H7, Bft1 и Bft3 из Bacteroides fragilis NCTC 9343 (WO 2014/018596 A2), и α-1,2-фукозилтрансферазы FucT2 из H. pylori для синтеза сахаридов Lewis Y и Lewis В (US 6670160 B2) были описаны и являются подходящими α-1,2-фукозилтрансферазами для биосинтеза 2'-FL в клетках Bacillus.

Для получения 3-фукозиллактозы описаны α-1,3-фукозилтрансфераза Amuc из Akkermansia muciniphila и FucT6 и FucT7 из Bacteroides fragilis (ЕР 2 439 264 А1), α-1,3-фукозилтрансфераза FutA из Н. pylori (US 2014/ 0120611 А1), и они являются подходящими α-1,3-фукозилтрансферазами для биосинтеза 3-FL в клетках Bacillus. Кроме того, в WO 2016/040531 А1 раскрыта α-1,3-фукозилтрансфераза CafC из В. nordii CL02T12C05 для синтеза 3-фукозиллактозы и лактодифукотетраозы, и CafD из Н. hepaticus АТСС51449 для продукции LNnFP-III.

Дополнительные фукозилтрансферазы, которые могут быть экспрессированы в клетках Bacillus, для продукции фукозилированных сахаридов раскрыты в WO 2019/0088133 А1, который включен в данный документ посредством ссылки.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении частота использования кодона нуклеотидной последовательности, кодирующей фукозилтрансферазу, приспособлена к частоте использования кодона Bacillus.

В случае экспрессии фукозилтрансферазы клетка Bacillus содержит по меньшей мере один рекомбинантный ген, в котором область, кодирующая белок, кодирующая фукозилтрансферазу, функционально связана с последовательностями контроля экспрессии.

Рекомбинантный ген фукозилтрансферазы может быть интегрирован в хромосому Bacillus или находиться в виде эписомальной версии на плазмиде.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении клетка Bacillus для продукции фукозилированного олигосахарида может поглощать L-фукозу. Способность поглощать L-фукозу является преимуществом клеток Bacillus, в которых имеется реутилизационный путь ГДФ-фукозы.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении клетка Bacillus генетически сконструирована для того, чтобы сделать возможным или улучшить поглощение L-фукозы. Таким образом, в клетке Bacillus имеется гетерологичная L-фукозопермеаза. Подходящая L-фукозопермеаза представляет собой FucP Е. coli или ее функциональный вариант.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении клетка Bacillus генетически сконструирована для того, чтобы содержать и экспрессировать нуклеотидную последовательность, которая кодирует L-фукозопермеазу, предпочтительно нуклеотидную последовательность, которая кодирует FucP Е. coli или ее функциональный вариант.

L-фукозопермеаза Е. coli кодируется областью, кодирующей белок, гена fucP Е. coli (номер доступа Gen Bank: NP_417281.1). Следовательно, клетка Bacillus генетически сконструирована для того, чтобы содержать и экспрессировать нуклеотидную последовательность, которая кодирует FucP Е. coli или ее функциональный вариант.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении частота использования кодона нуклеотидной последовательности, кодирующей L-фукозопермеазу, приспособлена к частоте использования кодона Bacillus.

Для экспрессии L-фукозопермеазы в клетке Bacillus содержится рекомбинантный ген L-фукозопермеазы, в котором нуклеотидная последовательность, которая кодирует L-фукозопермеазу, функционально связана с последовательностями контроля экспрессии.

Рекомбинантный ген L-фукозопермеазы может быть интегрирован в хромосому Bacillus или находиться в виде эписомальной версии на плазмиде.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении клетка Bacillus для продукции фукозилированного олигосахарида не обладает никакой β-галактозидазной активностью или обладает сниженной β-галактозидазной активностью, по сравнению с клеткой дикого типа того же вида.

Внутриклеточный биосинтез фукозилированных олигосахаридов требует импортирования лактозы в качестве субстрата-акцептора для фукозилтрансферазы, акцептирующей лактозу. Любая внутриклеточная ферментативная активность, которая гидролизует поглощенную лактозу, будет воздействовать на эффективность образования фукозиллактозы, поскольку пул внутриклеточной лактозы будет уменьшен. Таким образом, будет преимущественным, если клетка Bacillus для продукции фукозилированного олигосахарида не будет обладать или будет обладать по меньшей мере, по сравнению с клеткой Bacillus дикого типа, сниженной активностью бета-галактозидазы.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении клетка Bacillus генетически сконструирована для устранения или по меньшей мере уменьшения активности β-галактозидазы клетки.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении клетка Bacillus генетически сконструирована посредством делеции или функциональной инактивации гена дапА. В еще одном воплощении клетка Bacillus генетически сконструирована для снижения уровня экспрессии гена дапА, по сравнению с клеткой Bacillus дикого типа.

Ген ganA Bacillus также называется yvfH или 1асА. Он представляет собой ген регулона GanR, который содержит гены, кодирующие ферменты, участвующие в утилизации галактана. Ген ganA кодирует бета-галактозидазу, которая участвует в утилизации галактана Bacillus.

Делеция или функциональная инактивация гена ganA устраняет GanA-опосредуемую β-галактозидазную активность в клетке Bacillus, в то время как уменьшение уровня экспрессии ganA снижает количество GanA в клетке Bacillus и, следовательно, β-галактозидазную активность, которая могла бы препятствовать биосинтезу фукозилированного олигосахарида.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении клетка Bacillus генетически сконструирована посредством делеции или функциональной инактивации гена yesZ. Ген yesZ Bacillus кодирует бета-галактозидазу YesZ, которая играет роль в деградации рамногалактуронана, происходящего из клеточных стенок растений. Экспрессия гена yesZ Bacillus индуцируется рамногалактуронаном I. В еще одном воплощении клетка Bacillus генетически сконструирована для того, чтобы уменьшать уровень экспрессии гена yesZ, по сравнению с клеткой Bacillus дикого типа.

Делеция или функциональная инактивация гена yesZ устраняет YesZ-опосредуемую β-галактозидазную активность в клетке Bacillus, тогда как уменьшение уровня экспрессии yesZ снижает количество YesZ в клетке Bacillus и, следовательно, β-галактозидазную активность, которая могла бы препятствовать биосинтезу фукозилированного олигосахарида.

Когда В. subtilis поступает в постэкспоненциальную фазу роста, они (начинают) продуцируют большие количества внеклеточных протеаз. Чужеродные белки часто являются чувствительными к протеазам. Таким образом, штамм, не содержащий экзопротеазу, является желательным для повышения стабильности гетерологичных белков и для обеспечения аккумуляции высоких уровней чужеродных белков. Геном Bacillus кодирует по меньшей мере восемь внеклеточных протеаз, а именно, nprE, aprE, epr, bpr, mpr, nprB, vpr и wprA. Таким образом, в дополнительном и/или альтернативном воплощении клетка генетически сконструирована в том смысле, что по меньшей мере один ген, кодирующий внеклеточную протеазу, был удален или функционально инактивирован, предпочтительно, по меньшей мере один из генов, выбранных из группы, состоящей из nprE, aprE, epr, bpr, mpr, nprB, vpr и wprA. Предпочтительно, два, три, четыре, пять, шест, семь или восемь генов, выбранных из группы, состоящей из nprE, aprE, epr, bpr, mpr, nprB, vpr и wprA, удалены или функционально инактивированы.

В. subtilis синтезирует пульхерриминовую кислоту при росте в средах, содержащих углевод, такой как глюкоза или лактоза. Выделяемая пульхерриминовая кислота образует красный пигмент пульхерримин, соль пульхерриминовой кислоты (хелат железа (III)), где железо находится в среде для выращивания. Образование данного нежелательного побочного продукта во время процессов ферментации можно предотвратить/аннулировать посредством делеции или нарушения генов yvmC и/или сурХ. Ген yvmC кодирует цикподипептидсинтазу, и ген сурХ кодирует цитохром Р450 цикло-l-лейцил-l-лейцилдипептидоксидазу.

Таким образом, в дополнительном и/или альтернативном воплощении клетка Bacillus генетически сконструирована так, чтобы по меньшей мере один из генов yvmC и сурХ удален или функционально инактивирован.

В ризобактерии В. subtilis имеются гены для синтеза более чем 20 антибиотиков. Среди них имеются пептидные антибиотики, подобно лантибиотикам Bacillus subtilis и лантибиотик-подобным пептидам (субтилин, эрицин S, мерсацидин, субланцин 168, субтилозин А), и нерибосомно синтезируемые (пептидные) антибиотики (сурфактин, итурин, бацилломицин, микосубтилин, коринебактин/ бациллибактин, фенгицин, плипастатин, микобациллин, TL-119, бацилизин, бацилизоцин, амикумацин, 3,3'-неотрегалосадиамин, диффицидин, ризоктицин).

Для продукции фукозилированного олигосахарида предпочтительно использовать клетку Bacillus, которая не продуцирует антибиотик. Таким образом, в дополнительном и/или альтернативном воплощении клетка Bacillus не синтезирует один или более антибиотиков, выбранных из группы, состоящей из лантибиотиков и лантибиотик-подобных пептидов, таких как субтилин, эрицин S, мерсацидин, субланцин 168, субтилозин А; нерибосомно синтезируемых (пептидных) антибиотиков, таких как сурфактин, итурин, бацилломицин, микосубтилин, коринебактин/бациллибактин, фенгицин, плипастатин, микобациллин, TL-119, бацилизин, бацилизоцин, амикумацин, 3,3'-неотрегалозадиамин, диффицидин и ризоктицин. Клетка Bacillus может быть генетически сконструирована с получением клетки Bacillus, которая не синтезирует один или более из указанных антибиотиков.

Клетки Bacillus дикого типа могут образовывать споры. Споруляцию, а именно процесс образования спор, у бактерий рассматривают как реакцию бактериальной клетки, которая инициирует программу развития, приводящую к образованию дочерних клеток отличной морфологии и направления развития. Споруляцию Bacillus исследовали как основную модель дифференцировки клеток. Во время споруляции палочковидная клетка Bacillus делится асимметрично, что приводит вследствие этого к получению двух генетически идентичных клеток с разной морфологией и направлениями развития.

Однако при промышленном получении нежелательно, если бактериальный штамм - продуцент образует споры во время ферментации. Таким образом, предпочтительно использовать клетки Bacillus для продукции фукозилированных олигосахаридов, которые не способны образовывать споры. Такие клетки Bacillus называются «неспорообразующими».

Предпочтительно, неспорообразующая клетка Bacillus, способная продуцировать фукозилированный олигосахарид, происходила из одного из штаммов В. Subtilis, перечисленных в Таблице 1.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении клетка Bacillus генетически сконструирована посредством делеции или функциональной инактивации Spo0A. Подходящая функциональная инактивация Spo0A включает делецию участка фосфорилирования, где фосфотрансферазы Spo0F и Spo0B фосфорилируют Spo0A.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении клетка Bacillus генетически сконструирована посредством делеции или функциональной инактивации генов, кодирующих фактор сигма SigE (sigE) и/или фактор сигма SigF (sigF).

Клетка Bacillus по изобретению способна продуцировать фукозилированный олигосахарид, при культивации в присутствии лактозы в среде и в условиях, которые являются пермиссивными в отношении клетки Bacillus для продукции фукозилированного олигосахарида.

Согласно второму аспекту предложено применение клетки Bacillus, как ранее описано в данном документе, для продукции фукозилированного олигосахарида, предпочтительно, фукозилированного олигосахарида грудного молока, такого как 2'-FL, 3-FL или 2',3-DiFL.

Поскольку Bacillus обычно расценивают как безопасную, продукция фукозилированных олигосахаридов для потребления человеком с использованием организма-продуцента, который в общем считается безопасным, также будет считаться безопасной, при условии, что изменения в клетках Bacillus для продукции фукозилированного олигосахарида не влияют на безопасность штамма-продуцента в отношении здоровья человека и окружающей среды. Следовательно, ожидают, что будет меньше проблем, влияющих на официальное одобрение фукозилированного олигосахарида для потребления человеком, в частности, фукозилированных олигосахаридов грудного молока для потребления человеком, более конкретно, для детской питательной смеси, которая состоит из или содержит фукозилированный олигосахарид, который был продуцирован посредством использования клетки Bacillus, как описано в данном документе. Таким образом, одобрение продуцируемых микробами фукозилированных олигосахаридов в детской питательной смеси и питательных композициях органами регулирования, а также среди потребителей, должно быть лучше.

Согласно третьему аспекту предложен способ получения фукозилированного олигосахарида, который включает:

- предоставление неспорообразующей клетки Bacillus, которая генетически сконструирована для того, чтобы иметь лактозопермеазу, путь биосинтеза ГДФ-фукозы и фукозилтрансферазу;

- культивирование клетки Bacillus в культуральной среде, содержащей лактозу, и в условиях, которые являются пермиссивными в отношении продукции фукозилированного олигосахарида, и

возможно извлечение фукозилированного олигосахарида из культуральной среды и/или из клетки Bacillus.

Неспорообразующая клетка Bacillus, которая предложена, представляет собой клетку Bacillus, как описано в данном документе.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении фукозилированный олигосахарид выбран из группы, состоящей из 2'-фукозиллактозы (2'-FL), 3-фукозиллактозы (3-FL), 2',3-фукозиллактозы (DiFL - от англ. 2',3-difucosyllactose), лакто-N-фукопентаозы I (LNFP I - от англ. lacto-N-fucopentaose I), лакто-N-неофукопентаозы I (LNnFP I - от англ. lacto-N-neofucopentaose I), лакто-N-фукопентаозы II (LNFP II - от англ. lacto-N-fucopentaose II), лакто-N-фукопентаозы III (LNFP III - от англ. lacto-N-fucopentaose III), лакто-N-фукопентаозы V (LNFP V - от англ. lacto-N-fucopentaose V), лакто-N-неофукопентаозы V (LNnFP V - от англ. lacto-N-neofucopentaose V), лакто-N-дифукогексаозы I (LNDH I - от англ. lacto-N-difucohexaose I) и лакто-N-дифукогексаозы II (LND - от англ. lacto-N-difucohexaose II).

В дополнительном и/или альтернативном воплощении культуральная среда содержит L-фукозу, в частности, для культивирования клетки Bacillus для продукции фукозилированного олигосахарида, в которой имеется реутилизационный путь ГДФ-фукозы для обеспечения ГДФ-фукозы в качестве субстрата-донора для фукозилтрансферазы.

Изобретение также относится к фукозилированным олигосахаридам, которые были продуцированы клеткой Bacillus, и/или способу, как описано в данном документе, к применению указанных фукозилированных олигосахаридов для изготовления питательной композиции, предпочтительно, детской питательной смеси, добавки к рациону или продукта лечебного питания. Кроме того, настоящее изобретение также относится к питательным композициям, содержащим фукозилированный олигосахарид, который был продуцирован клеткой Bacillus, и/или способу, как описано в данном документе.

Настоящее изобретение будет описано относительно конкретных воплощений и со ссылкой на графические материалы, но данное изобретение не ограничивается ими, а только формулой изобретения. Кроме того, термины первый, второй и тому подобное в описании и в формуле изобретения используются для проведения различия между похожими элементами и не обязательно для описания последовательности, во времени, в пространстве, по рангу или любым другим образом. Следует понимать, что термины, используемые таким образом, являются взаимозаменяемыми в соответствующих обстоятельствах, и что воплощения изобретения, описанные в данном документе, способны работать в последовательностях, отличных от описанных или проиллюстрированных в данном документе.

Следует отметить, что термин «содержащий», используемый в формуле изобретения, не следует считать ограничивающимся средствами, перечисленными в дальнейшем; он не исключает других элементов или стадий. Таким образом, его следует считать определяющим наличие заявленных признаков, целых чисел, стадий или компонентов, на которые ссылаются, но он не исключает наличие или добавление одного или более других признаков, целых чисел, стадий или компонентов или их групп. Таким образом, объем выражения «устройство, содержащее средства А и В» не следует ограничивать устройствами, состоящими только из компонентов А и В. Оно означает, что в отношении настоящего изобретения, единственными релевантными компонентами устройства являются А и В.

Ссылка на всем протяжении данного описания изобретения на «одно воплощение» или «воплощение» означает, что конкретный признак, структура или характеристика, описанные в связи с данным воплощением, включены в по меньшей мере одно воплощение настоящего изобретения. Таким образом, появления фраз «в одном воплощении» или «в воплощении» в разных местах по всему объему данного описания изобретения не обязательно все относятся к одному и тому же воплощению, но могут. Кроме того, конкретные признаки, структуры или характеристики могут быть объединены любым подходящим образом, как будет очевидно среднему специалисту в данной области из данного раскрытия, в одном или более воплощениях.

Аналогично, следует понимать, что в описании иллюстративных воплощений изобретения разные признаки изобретения иногда сгруппированы вместе в одном единственном воплощении, фигуре или его описании в целях упрощения раскрытия и помощи в понимании одного или более из разных аспектов изобретения. Данный способ раскрытия, однако, не нужно считать отражающим мысль, что заявленное изобретение требует больше признаков, чем явным образом перечислены в каждом пункте. Скорее, как отражено в приведенной ниже формуле изобретения, аспекты изобретения заключаются меньше чем во всех признаках одного вышеизложенного раскрытого воплощения. Таким образом, формула изобретения после подробного описания явным образом включена тем самым в данное подробное описание, причем каждый пункт отдельно стоит в виде отдельного воплощения данного изобретения.

Кроме того, в то время как некоторые воплощения, описанные в данном документе, включают некоторые, но не все признаки, включенные в другие воплощения, подразумевается, что комбинации признаков разных воплощений находятся в объеме изобретения и образуют разные воплощения, как будет понятно специалистам в данной области. Например, в приведенной ниже формуле изобретения любое из заявленных воплощений можно использовать в любой комбинации.

Кроме того, некоторые из воплощений описаны в данном документе как способ или комбинация элементов способа, которые могут быть реализованы посредством процессора компьютерной системы или с помощью других средств выполнения функции. Таким образом, процессор с необходимыми инструкциями для осуществления такого способа или элемента способа образует средство осуществления способа или элемента способа. Кроме того, описанный в данном документе элемент воплощения аппарата представляет собой пример средства осуществления функции, выполняемой элементом, с целью осуществления изобретения.

В описании и графических материалах, предоставленных в данном документе, изложены многочисленные конкретные подробности. Однако понятно, что воплощения изобретения можно осуществлять на практике без данных конкретных подробностей. В других примерах хорошо известные способы, структуры и методики не были показаны подробно для того, чтобы не затруднять понимание данного описания. Теперь изобретение будет описано с помощью подробного описания нескольких воплощений изобретения. Ясно, что другие воплощения изобретения могут быть скомпонованы в соответствии со знаниями специалистов в данной области, не отклоняясь от истинной сущности или технической идеи изобретения, причем изобретение ограничено только условиями прилагаемой формулы изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Трансформация Bacillus subtilis

Bacillus subtilis можно подвергать генетическим манипуляциям посредством разных методик. Для трансформации В, subtilis компетентные клетки готовили посредством модифицированного протокола двухстадийного способа (Anagnostopoulos, С.and Spizizen, J. (1961) J Bacteriol 81 (5): 741-746). Ночную культуру инокулировали в среде MG1 и встряхивали при 37°С. Среда MG1 представляет собой минимальную среду Спицайзена, которая дополнена 0,5% глюкозой, 5 мМ MgSO₄ и 0,02% казаминовыми кислотами (возможно, дополнительно дополнена биотином и/или L-триптофаном). На следующее утро данную культуру разводили 1:20 в свежей среде MG1 и инкубировали при 37°С в течение приблизительно 6 ч. 1 мл культуры разводили в 8 мл среды MG2, которая отличается от среды MG1 по концентрации казаминовых кислот (0,01% вместо 0,02%). В укороченном протоколе ночную культуру непосредственно разводят в среде MG2. После инкубации в течение еще 90 мин порцию культуры, 1 мл, смешивали с 1-3 мкг мультимерной плазмидной ДНК или линейной ДНК и инкубировали при 37°С в течение 30-60 мин при встряхивании. Мультимерную плазмидную ДНК получали или посредством использования штамма Е. coli NM538 для размножения плазмидной ДНК или посредством линеаризации плазмиды в результате расщепления рестриктазой с одним разрезом, которая осуществляет расщепление в пределах каркаса с последующим повторным лигированием Т4 ДНК лигазой.

Затем, клетки распределяли по чашкам с 2xYT и агаром, содержащим соответствующий антибиотик. Антибиотики добавляли в соответствующих концентрациях: 5 мкг⋅мл^-1 эритромицина, 5 мкг⋅мл^-1 хлорамфеникола, 10 мкг⋅мл^-1 канамицина,100 мкг⋅мл^-1 пектиномицина.

В качестве альтернативы, для трансформации протопластов (Romero, D. et al. (2006) Journal of Microbiological Methods 66:556-559) клетки выращивали в 20 мл бульона Penassay (РАВ - от англ. Penassay broth) при 37°С до начала стационарной фазы роста (OD₆₀₀ (от англ. optical density - оптическая фаза) равна 1,7-2). Затем клетки осаждали центрифугированием и ресуспендировали в 10 мл среды SMPP (0,3%-ный бычий сывороточный альбумин, 5%-ная 2 М сахароза, 25% 4×РАВ, 50% 2×SMM), состоящей из 2×SMM, представляющего собой 1 М сахарозу, 0,04 М гидрат двунатриевой соли малеиновой кислоты и 0,04 М MgCl₂ (рН 6,5). После добавления лизоцима (10 мг мл^-1) и мутанолизина (75 Ед мл^-1) смесь инкубировали при 37°С при встряхивании с образованием протопластов. Образование протопластов проверяли посредством микроскопа. Затем протопласты аккуратно собирали посредством центрифугирования при 5200×g и 4°С в течение 5 мин, два раза промывали охлажденным льдом промывочным буфером для электротрансформации (1×SMM) и, в конечном итоге, суспендировали в данном растворе. Плазмидную ДНК (1-3 мкг) добавляли к 120 мкл суспензии протопластов, и смесь держали на льду в течение по меньшей мере 5 мин. Смесь для трансформации переносили в кювету, объемом 0,2 см, и один импульс для электропорации прикладывали на уровне 25 мкФ, 400 Ω и 0,7 кВ. Сразу после разряда электропорации 1 мл восстанавливающей среды (равные объемы 4×РАВ и 2×SMM, свежеприготовленные перед применением) добавляли в кювету. Затем реакционную смесь для трансформации переносили в 2 мл пробирку и инкубировали при 37°С при встряхивании в течение 12 ч. Для регенерации клеточную суспензию распределяли по чашкам с DM3 и агаром (Chang, S. and Cohen, S. (1979) MGG 168(1):111-115) и инкубировали при 37°C в течение 48 ч. Регенерирующая смесь DM3 содержала следующие стерильные растворы на литр: 200 мл 4%-ного агара, 100 мл 5%-ных казаминовых кислот, 50 мл 10%-ого дрожжевого экстракта, 100 мл 3,5%-ного K₂HPO₄ и 1,5%-ного KH₂PO₄, 25 мл 20%-ной глюкозы, 20 мл 1 М MgCl₂, 500 мл 0,5 М сорбита и 5 мл простерилизованного посредством фильтрации 2%-ного бычьего сывороточного альбумина (добавляемые к смеси, когда температура ниже 55°С), и ее дополняли соответствующим антибиотиком.

Электропорацию В. subtilis проводили в соответствии с модифицированным протоколом от Zhang et al. (2011), предоставленным MoBiTec GmbH (Zhang, G., Bao, P., Zhang. Y., Deng, A. Chen. N. и Wen, T. (2011) Anal. Biochem., 409:130-137). Ночную культуру 2×YT разводили в 100 раз свежей средой 2×YT, и культуру выращивали до OD₆₀₀ 0,2 при 37°С на ротационной качалке. Затем культуру дополняли 1%-ным DL-треонином, 2%-ным глицином, 0,1%-ным триптофаном и 0,03% Tween 80. После культивирования в течение еще 60 мин, клеточную суспензию охлаждали на льду в течение 20 мин, центрифугировали при 5000×g в течение 10 мин при 4°С и два раза промывали буфером для электропорации (0,5 М трегалоза, 0,5 М сорбит, 0,5 М маннит, 0,5 мМ MgCl₂, 0,5 мМ K₂HPO₄, 0,5 мМ KH₂PO₄, рН 7,4, стерилизовали посредством фильтрации и хранили в замороженном виде). Наконец, клетки ресуспендировали в буфере для электропорации в соотношении 1/100 исходного объема культуры, и 100 мкл клеточной суспензии смешивали с ДНК. Смесь для трансформации переносили в 0,1-см кювету, и электропорацию проводили при 1,8 кВ с помощью одного импульса, доставляемого посредством прибора MicroPulser™ (Bio-Rad). Сразу после переноса импульса, 1 мл бульона 2×YT, содержащего 0,5 М сорбит и 0,38 М маннит, добавляли в кювету. Суспензию для трансформации переносили в пробирку, объемом 2 мл, и инкубировали при 37°С в течение 3 ч на ротационной качалке. Клетки распределяли по чашке с 2×YT и агаром и инкубировали при 37°С в течение ночи.

Используя альтернативный протокол электропорации (Xue, G. P., J. S. Johnson, и В. P. Dalrymple: 1999; Journal of Microbiological Methods 34:183-191), 5 мл LB, содержащей 0,5 M глюцит, инокулировали В. subtilis и инкубировали в течение ночи при 37°С. Далее, ночную культуру разводили (1:16) 75 мл LB, содержащей 0,5 М глюцит, и инкубировали до получения OD₆₀₀ 0,85 - 0,95. Затем клетки осаждали посредством центрифугирования в течение 10 мин при 4°С при 5,000×g и четыре раза промывали буфером для электропорации, охлажденным посредством льда (10% глицерин, 0,5 М глюцит, 0,5 М маннит). Наконец, клетки ресуспендировали в 1-2 мл буфера для электропорации. Электропорацию проводили, используя 60 мкл компетентных клеток с ДНК в охлажденной кювете для электропорации (расстояние между электродами 1 мм). Смесь клетки-ДНК подвергали воздействию одного электрического импульса на уровне 25 мкФ, 200 Ω и 21 кВ/см. Наконец, 1 мл бульона для восстановления (LB, содержащая 0,5 М глюцит и 0,38 М маннит) добавляли к электропермеабилизированным клеткам, и бактериальную культуру инкубировали в течение 3 ч при 37°С с последующим посевом на LB с агаром с добавлением антибиотика.

Использовали две разные обогащенные среды, а именно бульон Luria (LB) и 2×YT. Среда бульон Luria (LB) состояла из 1%-ного триптона, 0,5%-ого дрожжевого экстракта и 0,5% NaCl (рН 7,2).

Среда 2×YT состояла из 1,6%-ного триптона, 1%-ого дрожжевого экстракта и 0,5% NaCl (рН 7,5).

Для получения чашек с обогащенной средой с агаром добавляли 15 г л^-1 агара.

Для экспериментов с встряхиваемыми колбами использовали минимальную среду Спицайзена (Spizizen, J. 1958 Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 44(10):1072-1078).

Минимальная среда Спицайзена содержит следующие соли: 2 г/л (NH₄)₂SO₄, 14 г/л K₂HPO₄, 6 г/л KH₂PO₄, 1 г/л цитрата Na₃ × 2⋅H₂O и 0,2 г/л MgSO₄ × 7⋅H₂O.

Предкультуральная среда, состоящая из минимальных солей Спицайзена, дополненная 2% D-глюкозой, 0,05% казаминовыми кислотами и MgSO₄, до конечной концентрации 2 мМ (возможно дополнительно дополненная биотином и/или L-триптофаном).

Основная культуральная среда состояла из минимальных солей Спицайзена, дополненная 2%-ной D-глюкозой, 0,05%-ыми казаминовыми кислотами, MgSO₄ до конечной концентрации 2 мМ и 0,5 мл⋅л^-1 1000×раствора микроэлементов (возможно дополнительно дополненная биотином и/или L-триптофаном).

Раствор микроэлементов (1000х) состоял из 100,6 г⋅л^-1 C₆H₉NO₆, 56,4 г⋅л^-1 цитрата железа (III)-аммония, 9,8 гл^-1 MnCl₂ × 4⋅H₂O, 1,6 г⋅л^-1 CoCl₂ × 6 H₂O, 1 г⋅л^-1 CuCl₂ × 2⋅H₂O, 1,9 г⋅л^-1 Н_{3 В}О₃, 9 г⋅л^-1 ZnSO₄ × 7⋅H₂O, 1,1 г⋅л^-1 Na₂MoO₄ × 2⋅H₂O, 1,5 г⋅л^-1 Na₂SeO₃, 1,5 г⋅л^-1 NiSO₄ × 6⋅H₂O.

При необходимости, соответствующий(ие) антибиотик(и) добавляли к среде для того, чтобы сделать ее селективной.

Штаммы В. subtilis исходно выращивали на чашках с обогащенными средами с агаром с получением одиночных колоний. Данные чашки выращивали в течение 1 суток при 30-37°С. В экспериментах со встряхиваемыми колбами 20 мл предварительной культуры инокулировали одиночной колонией и выращивали в течение ночи при 30-37°С на ротационной качалке. Следующие 20 мл основных культур инокулировали данной предварительной культурой до начальной OD₆₀₀ примерно 0,1 и инкубировали при 30-37°С на ротационной качалке. Если требовалась индукция, 40-60 мл основной культуры разбивали на порции по 20 мл в момент времени индукции. Объем культуры не превышал 20% емкости встряхиваемой колбы.

Пример 2: Конструирование штамма-продуцента Bacillus subtilis для 2'-фукозиллактозы

Модификации метаболизма штамма Bacillus subtilis с дефектом спорообразования (таблица 1) достигали посредством интеграции гетерологичных генов тапС Е. coli, тапВ Е. coli и тапА Е. coli и одновременного удаления эндогенного гена lacA посредством гомологичной рекомбинации. Ген дапА (yvfN, lacA) В. subtilis, который расположен в пределах галактозного оперона, кодирует бета-галактозидазу.

Для синтеза ГДФ-маннозы открытые рамки считывания тапС, тапВ и тапА функционально связаны с конститутивным промотором Р43 В, subtilis (часть репозитория iGem: ID последовательности: ВВа_K143013) в виде оперона. Ген тапС (номер доступа Gen Bank: NP_416553.1) кодирует ГДФ:маннозо-1-фосфатгуанилилтрансферазу из Е. coli. Ген тапВ (номер доступа Gen Bank: NP_416552.1) кодирует фосфоманномутазу Е. coli и ген тапА (номер доступа Gen Bank: NP_389084.1) кодирует фруктозо-6-фосфатизомеразу В. subtilis. Каждый из генов, упомянутых выше, сливали in silico с последовательностью RBS В. subtilis. Описанную в данном документе экспрессионную кассету <Р43-тапСВА> подвергали оптимизации кодонов для экспрессии в В. subtilis и получали синтетически посредством GenScript Corp. Далее, кассету полной интеграции собирали и клонировали в pBR322 (New England Biolabs GmbH, Франкфурт, Германия) с созданием суицидной плазмиды <pBR322 flank дапА up-lox71-erm-lox66-P43-manCBA-flank ganA down> (SEQ ID NO: 1). Затем, В. subtilis трансформировали данной плазмидой за счет ее природной компетентности. Клетки распределяли по чашкам с 2х YT и агаром, содержащим соответствующий антибиотик (5 мкг мл^-1 эритромицина). Интеграцию экспрессионной кассеты <Р43-тапСВА> в локус ganA генома В. subtilis, с получением штамма А, проверяли посредством ПЦР (полимеразная цепная реакция) на колониях. Экспрессию гена подтверждали посредством направленной протеомики и/или посредством ПЦР в реальном времени.

Для продукции 2'-фукозиллактозы из лактозы и ГДФ-маннозы в полученном штамме для интеграции <Р43-тапСВА> конструировали экспрессионную плазмиду (SEQ ID NO: 2), которая содержит все необходимые гены под контролем индуцибельного промотора P_grac100. Таким образом, экспрессионный вектор рНТ253 В. subtilis (MoBiTec GmbH, Геттинген, Германия) использовали в качестве каркаса. Открытую рамку считывания гена lacY Е. coli (номер доступа Gen Bank: NP_414877.1) амплифицировали посредством ПЦР из хромосомной ДНК. Открытую рамку считывания гена wbgL, кодирующего α-1,2-фукозилтрансферазы O126 Е. coli, подвергали оптимизации кодонов для экспрессии в В. subtilis и получали синтетически посредством GenScript Corp. Кроме того, открытые рамки считывания генов gmd Е. coli (номер доступа Gen Bank: NP_416557.1; кодирующий ГДФ-маннозо-4,6-дегидратазу) и wcaG (номер доступа Gen Bank: NP_416556.1; кодирующий ГДФ-фукозосинтазу) подвергали оптимизации кодонов для экспрессии в В. subtilis и получали синтетически посредством GenScript Corp. Каждый ген, заключенный в индуцибельной экспрессионной кассете, был связан с последовательностью RBS В, subtilis. Кроме того, подходящую терминирующую последовательность В. subtilis из части репозитория iGem (ID последовательности: ВВа_В0015) вводили в конечную экспрессионную плазмиду <рНТ253 P_grac100-wbgL-gmd-wcaG-lacY-terminator> (SEQ ID NO: 2). Штамм интеграции <P43-manCBA> трансформировали данной экспрессионной плазмидой (SEQ ID NO: 2) за счет его природной компетентности. Экспрессию генов подтверждали посредством направленной протеомики и/или посредством ПЦР в реальном времени. Трансформанты культивировали в условиях, которые являются пермиссивными в отношении В. Subtilis, для продукции 2'-фукозиллактозы в присутствии экзогенной лактозы.

Пример 3: Конструирование штамма-продуцента Bacillus subtilis для 2'-фукозиллактозы

Штамм А, который описан в примере 2, использовали в качестве родительского штамма. Для продукции 2'-фукозиллактозы из лактозы и ГДФ-маннозы, дополнительно, гены lacY, gmd, wcaG и wbgL Е. coli интегрировали в эндогенный локус атуЕ (атуА) штамма А (кодирующий альфа-амилазу).

Открытую рамку считывания гена wbgL (кодирующего α-1,2-фукозилтрансферазу) подвергали оптимизации кодонов для экспрессии в В. subtilis и получали синтетически посредством GenScript Corp. Кроме того, открытые рамки считывания генов gmd (номер доступа Gen Bank: NP_416557.1; кодирующего ГДФ-маннозо-4,6-дегидратазу) и wcaG (номер доступа Gen Bank: NP_416556.1; кодирующего ГДФ-фукозосинтазу) подвергали оптимизации кодонов для экспрессии в В. subtilis (проводилось GenScript Corp), помещали под контроль сильного конститутивного промотора P_lepA В. subtilis в виде оперона из двух генов и получали синтетически с помощью GenScript Corp. Открытую рамку считывания гена lacY Е. coli (номер доступа Gen Bank: NP_414877.1), кодирующего лактозопермеазу, амплифицировали посредством ПЦР из хромосомной ДНК.

Все необходимые гены для продукции 2'-фукозиллактозы из лактозы и ГДФ-маннозы собирали в конститутивную экспрессионную кассету <P43-wbgL-lacY-P_lepA-gmd-wcaG>, в которой каждый ген был связан с последовательностью RBS В. subtilis. Дополнительно, подходящую терминирующую последовательность В. subtilis из части репозитория iGem (ID последовательности: ВВа_В0015) помещали ниже данной экспрессионной кассеты. Описанную выше конструкцию клонировали в pBR322 (New England Biolabs GmbH, Франкфурт, Германия) с получением <pBR322 flank amyE up-lox71-aacd9-lox66-P43-wbgL-lacY-P_lepA-gmd wcaG-ferminator-flank amyE down> (SEQ ID NO: 3).

Полученный вектор для интеграции amyE (SEQ ID NO: 3) использовали для трансформации В. subtilis за счет ее природной компетентности. Проводили селекцию трансформантов посредством спектиномицина (100 мкг мл^-1). Интеграцию экспрессионной кассеты <P43-wbgL-lacY-P_lepA-gmd wcaG-terminator> в локус атуЕ генома В. subtilis проверяли посредством ПЦР на колониях. Экспрессию генов подтверждали посредством направленной протеомики и/или посредством ПЦР в реальном времени.

Пример 4: Конструирование штамма-продуцента Bacillus subtilis для 2'-фукозиллактозы

Для получения 2'-фукозиллактозы из ГДФ-фукозы и экзогенной лактозы, исходно, ген lacY Е. coli интегрировали в эндогенный локус атуЕ (атуА) (кодирующий альфа-амилазу). Открытую рамку считывания гена lacY Е. coli (номер доступа Gen Bank: NP_414877.1), кодирующего лактозопермеазу, амплифицировали посредством ПЦР из хромосомной ДНК. Кассету для интеграции <flank атуЕ up-lox71-aad9-lox66-P43-lacY-flank атуЕ down> (SEQ ID NO: 4) конструировали и клонировали в pBR322 (New England Biolabs GmbH, Франкфурт, Германия). В. subtilis трансформировали полученной плазмидой за счет ее природной компетентности. Интеграцию экспрессионной кассеты <Р43-lacY> в локус атуЕ генома В. Subtilis, приводящую к получению штамма В, проверяли посредством ПЦР на колониях. Экспрессию генов подтверждали посредством направленной протеомики и/или посредством ПЦР в реальном времени.

Для синтеза ГДФ-фукозы из экзогенной L-фукозы конструировали экспрессионную плазмиду В. subtilis, содержащую все необходимые гены. Плазмиду pDW1 использовали в качестве каркаса. Данную плазмиду получали синтетически посредством GenScript Corp, и она содержит гены bla и erm для селекции в Е. coli и В. subtilis, соответственно. Дополнительно, она содержит репликон рМВ1 для размножения в Е. coli и репликон pUB110 для размножения в В. subtilis.

Ген fkp В. fragilis (номер доступа GenBank AY849806) кодирует бифункциональную фукозокиназу/L-фукозо-1-фосфатгуанилилтрансферазу, ген wbgL Е. coli кодирует α-1,2-фукозилтрансферазы и ген fucP Е. coli (номер доступа Gen Bank: NP_417281.1) кодирует L-фукозопермеазу. Каждую из открытых рамок считывания данных генов подвергали оптимизации кодонов для экспрессии в В. subtilis и получали синтетически посредством GenScript Corp. Конструировали экспрессионную кассету, которая содержит гены fkp, wbgL и fucP под контролем сильного конститутивного промотора Р436. subtilis.

Каждый ген, заключенный в экспрессионную кассету, был связан с последовательностью RBS В. subtilis. Кроме того, подходящую терминирующую последовательность В. subtilis из части репозитория iGem (ID последовательности: ВВа_В0015) вводили в конечную экспрессионную плазмиду <pDW1-P43-fkp-wbgL-fucP-terminator> (SEQ ID NO: 5). Штамм В трансформировали данной экспрессионной плазмидой (SEQ ID NO: 5) за счет его природной компетентности. Экспрессию генов подтверждали посредством направленной протеомики и/или посредством ПЦР в реальном времени. Трансформанты культивировали в условиях, которые являются пермиссивными в отношении В. Subtilis, с получением 2'-фукозиллактозы в присутствии экзогенной лактозы и L-фукозы.

Пример 5: Получение 2'-фукозиллактозы с использованием штаммов Bacillus subtilis с модифицированным метаболизмом

Предварительную культуру инокулировали штаммом Bacillus subtilis с модифицированным метаболизмом, подходящим для биосинтеза 2'-фукозиллактозы (как описано в примере 2, 3 и 4, соответственно).

Предварительную культуру инкубировали при 30-37°С в течение ночи и затем разводили до исходной OD₆₀₀ примерно 0,1 в свежей основной культуральной среде. Когда основная культура достигала OD₆₀₀ приблизительно 0,5, 2 мМ лактозу добавляли к среде для выращивания. Когда для экспрессии гена использовали индуцибельный промотор P_grac100, индукцию осуществляли посредством лактозы (2 мМ) или как лактозы (2 мМ), так и IPTG (от англ. isopropylthiogalactoside - изопропилтиогалактозид) (1 мМ). Для утилизирующего биосинтеза ГДФ-фукозы, дополнительно, добавляли 2 мМ L-фукозу. Культивирование прекращали после 24 ч/48 ч, и внутриклеточную и внеклеточную 2'-фукозиллактозу анализировали посредством тонкослойной хроматографии и/или ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографии) и/или масс-спектрометрии (как описано в WO 2017/042382 А или WO 2019/008133 А). Выявляли биосинтез существенных количеств 2'-фукозиллактозы.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Jennewein Biotechnologie GmbH

<120> ПРОДУКЦИЯ ФУКОЗИЛИРОВАННЫХ ОЛИГОСАХАРИДОВ В BACILLUS

<130> P 1903 WO

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 11270

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Суицидная плазмида

<400> 1

ttctcatgtt tgacagctta tcatcgataa gctttaatgc ggtagtttat cacagttaaa

60

ttgctaacgc agtcaggcac cgtgtatgaa atctaacaat gcgctcatcg tcatcctcgg

120

caccgtcacc ctggatgctg taggcatagg cttggttatg ccggtactgc cgggcctctt

180

gcgggatatc gtccattccg acagcatcgc cagtcactat ggcgtgctgc tagcgctata

240

tgcgttgatg caatttctat gcgcacccgt tctcggagca ctgtccgacc gctttggccg

300

ccgcccagtc ctgctcgctt cgctacttgg agccactatc gactacgcga tcatggcgac

360

cacacccgtc ctgtggatcc tctacgccgg acgcatcgtg gccggcatca ccggcgccac

420

aggtgcggtt gctggcgcct atatcgccga catcaccgat ggggaagatc gggctcgcca

480

cttcgggctc atgagcgctt gtttcggcgt gggtatggtg gcaggccccg tggccggggg

540

actgttgggc gccatctcct tgcatgcacc attccttgcg gcggcggtgc tcaacggcct

600

caacctacta ctgggctgct tcctaatgca ggagtcgcat aagggagagc gtcgaccgat

660

gcccttgaga gccttcaacc cagtcagctc cttccggtgg gcgcggggca tgactatcgt

720

cgccgcactt atgactgtct tctttatcat gcaactcgta ggacaggtgc cggcagcgct

780

ctgggtcatt ttcggcgagg accgctttcg ctggagcgcg acgatgatcg gcctgtcgct

840

tgcggtattc ggaatcttgc acgccctcgc tcaagccttc gtcactggtc ccgccaccaa

900

acgtttcggc gagaagcagg ccattatcgc cggcatggcg gccgacgcgc tgggctacgt

960

cttgctggcg ttcgcgacgc gaggctggat ggccttcccc attatgattc ttctcgcttc

1020

cggcggcatc gggatgcccg cgttgcaggc catgctgtcc aggcaggtag atgacgacca

1080

tcagggacag cttcaaggat cgctcgcggc tcttaccagc ctaacttcga tcactggacc

1140

gctgatcgtc acggcgattt atgccgcctc ggcgagcaca tggaacgggt tggcatggat

1200

tgtaggcgcc gccctatacc ttgtctgcct ccccgcgttg cgtcgcggtg catggagccg

1260

ggccacctcg acctgaatgg aagccggcgg cacctcgcta acggattcac cactccaaga

1320

attggagcca atcaattctt gcggagaact gtgaatgcgc aaaccaaccc ttggcagaac

1380

atatccatcg cgtccgccat ctccagcagc cgcacgcggc gcatctcggg cagcgttggg

1440

tcctggccac gggtgcgcat gatcgtgctc ctgtcgttga ggacccggct aggctggcgg

1500

ggttgcctta ctggttagca gaatgaatca ccgatacgcg agcgaacgtg aagcgactgc

1560

tgctgcaaaa cgtctgcgac ctgagcaaca acatgaatgg tcttcggttt ccgtgtttcg

1620

taaagtctgg aaacgcggaa gtcagcgccc tgcaccatta tgttccggat ctgcatcgca

1680

ggatgctgct ggctaccctg tggaacacct acatctgtat taacgaagcg ctggcattga

1740

ccctgagtga tttttctctg gtcccgccgc atccataccg ccagttgttt accctcacaa

1800

cgttccagta accgggcatg ttcatcatca gtaacccgta tcgtgagcat cctctctcgt

1860

ttcatcggta tcattacccc catgaacaga aatccccctt acacggaggc atcagtgacc

1920

aaacaggaaa aaaccgccct taacatggcc cgctttatca gaagccagac attaacgctt

1980

ctggagaaac tcaacgagct ggacgcggat gaacaggcag acatctgtga atcgcttcac

2040

gaccacgctg atgagcttta ccgcagctgc ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac

2100

ctctgacaca tgcagctccc ggagacggtc acagcttgtc tgtaagcgga tgccgggagc

2160

agacaagccc gtcagggcgc gtcagcgggt gttggcgggt gtcggggcgc agccatgacc

2220

cagtcacgta gcgatagcgg agtgtatact ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg

2280

tactgagagt gcaccagcgg gcaaggaaag ccttcaatat gtgcagtggt atgtcaactc

2340

tatgaagatc agcctgttta caatggcagg gtctttgctc tgtgtgacgt ttacggccta

2400

tgcgttttcg cgctttcggt ttaaagggag gaaatacgct ttaacgctct ttttattgct

2460

gcagatgatt cctcagtttt cagctttaat tgccttgttt gtgctggcgc aaatcttggg

2520

aatgatcaat agccactggc tgctaatctt gctttatatc ggcggcctga tcccgatgaa

2580

tacgtatttg atgaaagggt acatggattc cattccgatg gatttagacg aaagcgccaa

2640

gattgacgga gccagcagca ccagaatctt cttccagatc attctgccat tatcaaaacc

2700

gatggcggca gtcgtggcca tgaacggctt taccggtccg ctcggagatt ttgtgctgtc

2760

ctcaaccata ttgagaacgc ctgaatcata tacattgccc gtcggtctat tcaatttagt

2820

gaatgatgtc atgggggcca gctatacgac atttgcggcc ggagccctgc ttatcagcat

2880

accggttgcc gtcatcttta ttatgctgca aaagaatttt gtgtccggat taaccgcagg

2940

cggaacgaag ggctaagaga acaaggagga gaatgtgatg tcaaagcttg aaaaaacgca

3000

cgtaacaaaa gcaaaattta tgctccatgg gggagactac aaccccgatc agtggctgga

3060

tcggcccgat attttagctg acgatatcaa actgatgaag ctttctcata cgaatacgtt

3120

ttctgtcggc accagtgaat tcgagctcgg tacctaccgt tcgtataatg tatgctatac

3180

gaagttatta cgcgttaacc cgggcccgcg gatgcatatg atcagatcct ttaactctgg

3240

caaccctcaa aattgaatga gacatgctac acctccggat aataaatata tataaacgta

3300

tatagatttc ataaagtcta acacactaga cttatttact tcgtaattaa gtcgttaaac

3360

cgtgtgctct acgaccaaaa ctataaaacc tttaagaact ttcttttttt acaagaaaaa

3420

agaaattaga taaatctctc atatctttta ttcaataatc gcatccgatt gcagtataaa

3480

tttaacgatc actcatcatg ttcatattta tcagagctcg tgctataatt atactaattt

3540

tataaggagg aaaaaatatg ggcattttta gtatttttgt aatcagcaca gttcattatc

3600

aaccaaacaa aaaataagtg gttataatga atcgttaata agcaaaattc atataaccaa

3660

attaaagagg gttataatga acgagaaaaa tataaaacac agtcaaaact ttattacttc

3720

aaaacataat atagataaaa taatgacaaa tataagatta aatgaacatg ataatatctt

3780

tgaaatcggc tcaggaaaag gccattttac ccttgaatta gtaaagaggt gtaatttcgt

3840

aactgccatt gaaatagacc ataaattatg caaaactaca gaaaataaac ttgttgatca

3900

cgataatttc caagttttaa acaaggatat attgcagttt aaatttccta aaaaccaatc

3960

ctataaaata tatggtaata taccttataa cataagtacg gatataatac gcaaaattgt

4020

ttttgatagt atagctaatg agatttattt aatcgtggaa tacgggtttg ctaaaagatt

4080

attaaataca aaacgctcat tggcattact tttaatggca gaagttgata tttctatatt

4140

aagtatggtt ccaagagaat attttcatcc taaacctaaa gtgaatagct cacttatcag

4200

attaagtaga aaaaaatcaa gaatatcaca caaagataaa caaaagtata attatttcgt

4260

tatgaaatgg gttaacaaag aatacaagaa aatatttaca aaaaatcaat ttaacaattc

4320

cttaaaacat gcaggaattg acgatttaaa caatattagc tttgaacaat tcttatctct

4380

tttcaatagc tataaattat ttaataagta agttaaggga tgcataaact gcatccctta

4440

acttgttttt cgtgtgccta ttttttgtga atcgattata acttcgtata atgtatgcta

4500

tacgaacggt aggatcctct agagtcgacc tgcaggcatt ttacattttt agaaatgggc

4560

gtgaaaaaaa gcgcgcgatt atgtaaaata taaagattaa ctaataagga ggacaaacat

4620

ggcacaatct aaactgtatc cggttgtgat ggcgggcgga tctggatcaa gactgtggcc

4680

gctttcacgc gttctttacc cgaaacaatt tctgtgtctg aaaggagatt taacaatgct

4740

gcagacaaca atttgcagat taaatggcgt ggaatgtgaa tctccggtcg ttatttgcaa

4800

cgaacagcat agatttatcg tcgctgaaca acttcgccag ctgaacaaac tgacagaaaa

4860

catcatcctg gaaccggccg gcagaaatac agcaccggcg attgctcttg cagcgttagc

4920

tgccaaacgc cattcaccgg aaagcgatcc gcttatgtta gtgctggcag cggatcatgt

4980

cattgcggat gaagatgctt ttagagctgc cgttcgcaac gctatgccgt atgccgaagc

5040

aggcaaactt gtgacatttg gaattgtccc ggatttaccg gaaacaggct atggatatat

5100

cagacgcggc gaagtgtcag cgggagaaca agatatggtt gcctttgaag tggcacagtt

5160

tgtcgaaaaa ccgaatctgg aaacagcgca agcgtatgtt gcttcaggcg aatattattg

5220

gaacagcgga atgtttcttt ttagagccgg ccgctatctg gaagaactta aaaaatacag

5280

accggatatt ttagatgcat gtgaaaaagc gatgtcagct gtcgatccgg atttaaactt

5340

tatcagagtt gatgaagaag cctttctggc atgcccggaa gaaagcgttg attatgcagt

5400

gatggaacgc acagccgatg cagtggtcgt tccgatggat gcgggctggt ctgatgttgg

5460

atcatggtca agcctttggg aaattagcgc gcatacagct gaaggcaatg tttgtcatgg

5520

agatgtgatc aaccataaaa cagaaaacag ctatgtttac gcggaatctg gcctggtgac

5580

aacagtcgga gttaaagatt tagtggtcgt tcagacaaaa gatgcggtgt taattgctga

5640

tagaaacgcc gtgcaagatg ttaagaaagt tgtcgaacag atcaaagcag atggaagaca

5700

tgaacataga gtccatcgcg aagtttatcg cccgtgggga aaatatgata gcattgatgc

5760

gggcgatcgc tatcaagtca aacgcatcac agttaaaccg ggcgaaggac tgtctgttca

5820

gatgcatcat catcgcgcag aacattgggt tgtggtcgcc ggcacagcaa aagtgacaat

5880

tgatggcgat attaaactgc ttggagaaaa cgaatctatt tatatcccgt taggagctac

5940

acattgcctg gaaaacccgg gcaaaattcc gcttgattta atcgaagtca gaagcggatc

6000

ttatcttgaa gaagatgatg ttgtgcgctt tgccgataga tatggccgcg tttaagctct

6060

taaggaggat tttagaatga aaaaacttac atgctttaaa gcgtatgata ttcgcggcaa

6120

acttggagaa gaattaaacg aagatattgc ttggagaatc ggccgcgcct atggagaatt

6180

tctgaaaccg aaaacaatcg tgctgggcgg agatgtcaga cttacatcag aaacacttaa

6240

actggctctg gccaaaggcc tgcaagatgc tggagttgat gtgcttgata ttggcatgag

6300

cggaacagaa gaaatctatt ttgccacatt tcatttagga gtcgatggcg gaatcgaagt

6360

tacagcaagc cataatccga tggattataa cggaatgaaa ctggttagag aaggcgcaag

6420

accgatttct ggcgatacag gattaagaga tgtgcagcgc ctggcagaag cgaacgattt

6480

tccgccggtc gatgaaacaa aaagaggacg ctatcaacag attaatttac gcgatgcgta

6540

tgttgatcat ctttttggct acatcaacgt taaaaacctg acaccgctta aactggtgat

6600

caattctggc aacggagcag cgggaccggt tgtggatgct attgaagcca gatttaaagc

6660

acttggcgca ccggttgaat taatcaaagt gcataataca ccggatggca attttccgaa

6720

cggcattccg aacccgctgc ttccggaatg cagagatgat acacgcaatg cggttattaa

6780

acatggcgct gatatgggaa tcgcctttga tggagatttt gatcgctgtt ttctttttga

6840

tgaaaaaggc caatttatcg aaggatacta catcgtgggc ttactggctg aagcatttct

6900

ggagaaaaat ccgggagcga aaattatcca tgatccgaga ctttcttgga atacagtcga

6960

tgtcgttaca gctgccggcg gaacaccggt tatgtcaaaa acaggccatg cttttatcaa

7020

agaaagaatg cgcaaagaag atgcaatcta tggcggagaa atgagcgcgc atcattactt

7080

tagagatttt gcttactgcg attctggcat gatcccgtgg cttttagtcg cggaactggt

7140

ttgtcttaaa gataaaacac tgggagaact ggtcagagat cgcatggcag cgtttccggc

7200

ttcaggcgaa attaatagca aactggcaca accggtggaa gcgatcaaca gagtcgaaca

7260

gcatttttca cgcgaagcac tggcggttga tagaacagat ggaattagca tgacatttgc

7320

cgattggaga tttaatcttc gcacatctaa cacagaaccg gtggtcagac ttaacgttga

7380

atcacgcggc gatgtgccgt taatggaagc aagaacacgc acactgctta cattactgaa

7440

tgaataaaaa ggaggaacta ctatgacaac agaaccgctg tttttcaaac cggtctttaa

7500

agaaagaatt tggggcggaa cagctctggc cgattttggc tatacaatcc cgtctcaacg

7560

cacaggagaa tgctgggctt ttgcagcgca tcaaaatggc cagagcgttg tgcagaacgg

7620

catgtacaaa ggatttacac tgtctgaact gtgggaacat catagacatc tttttggcca

7680

attagaagga gatcgctttc cgctgcttac aaaaatttta gatgctgatc aggatctgtc

7740

agttcaggtt catccgaatg atgaatatgc caatatccat gaaaacggcg aacttggaaa

7800

aacagaatgc tggtatatta tcgattgtca gaaagatgct gaaattatct atggccataa

7860

cgccacaaca aaagaagaat taacaacaat gatcgaaaga ggagaatggg atgaattact

7920

gagacgcgtg aaagtcaaac cgggcgattt cttttatgtc ccgtcaggaa cagttcatgc

7980

aattggcaaa ggaatccttg cgttagaaac acaacagaat agcgatacaa catacagact

8040

gtacgattac gatcgcaaag atgcagaagg caaacttaga gaactgcatc ttaaaaaatc

8100

aatcgaagtt atcgaagtgc cgagcattcc ggaacgccat acagttcatc atgaacaaat

8160

cgaagattta ctgacaacaa cactgatcga atgcgcatat tttagcgtgg gcaaatggaa

8220

cctttcagga agcgcgtctt taaaacaaca gaaaccgttt ctgcttattt ctgtgatcga

8280

aggcgaagga cgcatgattt caggcgaata tgtctatccg tttaagaaag gcgatcacat

8340

gttactgccg tatggcctgg gagaatttaa acttgaagga tatgcggaat gtatcgtttc

8400

tcatctttaa gcgaggcagg atcaggacaa tgattatatt tttgtcatga atttcacgga

8460

agaaaaacag ctggtcacgt ttgatcagag tgtgaaggac ataatgacag gagacatatt

8520

gtcaggcgac ctgacgatgg aaaagtatga agtgagaatt gtcgtaaaca cacattaggc

8580

tgatgctccg ctcgatatgg gcggattctt ttttctatag aatgaaaacg cttgctaagt

8640

cttgggggga tgaaatcatg aaaagcaaag tgaaaatgtt ctttgcggct gccatcgtgt

8700

ggagtgcatg tagttcaaca ggatatgccg ctgccattga gaaggagaag cacgtgtcag

8760

agcttcgggc agaggatctt tttgttaaaa aagtagaggg gatgaacaag gattttatca

8820

aaggggcaga tgtatccagc gttattgctt tggaaaacag cggtgtcacc ttttacaata

8880

caaacggaaa acgccaggat atctttacaa ctttaaaaca ggctggggtc aactatgttc

8940

gcgtccgcat ctggaatcac ccgtatgatt caaatggcaa cgggtatggc gggggaaaca

9000

atgatgttca aaaagccatc gaaatcggaa aaagagcgac agcgaacgga atgaaggtgc

9060

tggccgactt tcactactct gatttctggg ccgatccagc gaaacaaaag gtgcccaaag

9120

cctgggcgaa tctcagcttt gaagcaaaaa aagcaaagct ctatgagtat acgaaacaaa

9180

gcctgcaaaa gatgatcaag gaaggcgtgc ggtgtgaaat accgcacaga tgcgtaagga

9240

gaaaataccg catcaggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg

9300

ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat

9360

caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta

9420

aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa

9480

atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc

9540

cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt

9600

ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca

9660

gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg

9720

accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat

9780

cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta

9840

cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct

9900

gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac

9960

aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa

10020

aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa

10080

actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt

10140

taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca

10200

gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca

10260

tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc

10320

ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa

10380

accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc

10440

agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca

10500

acgttgttgc cattgctgca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat

10560

tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag

10620

cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac

10680

tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt

10740

ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt

10800

gctcttgccc ggcgtcaaca cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc

10860

tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat

10920

ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca

10980

gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga

11040

cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg

11100

gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg

11160

ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga

11220

cattaaccta taaaaatagg cgtatcacga ggccctttcg tcttcaagaa

11270

<210> 2

<211> 12427

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> экспрессионная плазмида

<400> 2

ttaagttatt ggtatgactg gttttaagcg caaaaaaagt tgctttttcg tacctattaa

60

tgtatcgttt tagaaaaccg actgtaaaaa gtacagtcgg cattatctca tattataaaa

120

gccagtcatt aggcctatct gacaattcct gaatagagtt cataaacaat cctgcatgat

180

aaccatcaca aacagaatga tgtacctgta aagatagcgg taaatatatt gaattacctt

240

tattaatgaa ttttcctgct gtaataatgg gtagaaggta attactatta ttattgatat

300

ttaagttaaa cccagtaaat gaagtccatg gaataataga aagagaaaaa gcattttcag

360

gtataggtgt tttgggaaac aatttccccg aaccattata tttctctaca tcagaaaggt

420

ataaatcata aaactctttg aagtcattct ttacaggagt ccaaatacca gagaatgttt

480

tagatacacc atcaaaaatt gtataaagtg gctctaactt atcccaataa cctaactctc

540

cgtcgctatt gtaaccagtt ctaaaagctg tatttgagtt tatcaccctt gtcactaaga

600

aaataaatgc agggtaaaat ttatatcctt cttgttttat gtttcggtat aaaacactaa

660

tatcaatttc tgtggttata ctaaaagtcg tttgttggtt caaataatga ttaaatatct

720

cttttctctt ccaattgtct aaatcaattt tattaaagtt catttgatat gcctcctaaa

780

tttttatcta aagtgaattt aggaggctta cttgtctgct ttcttcatta gaatcaatcc

840

ttttttaaaa gtcaatatta ctgtaacata aatatatatt ttaaaaatat cccactttat

900

ccaattttcg tttgttgaac taatgggtgc tttagttgaa gaataaagac cacattaaaa

960

aatgtggtct tttgtgtttt tttaaaggat ttgagcgtag cgaaaaatcc ttttctttct

1020

tatcttgata ataagggtaa ctattgccga tcgtccattc cgacagcatc gccagtcact

1080

atggcgtgct gctagcgcca ttcgccattc aggctgcgca actgttggga agggcgatcg

1140

gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg gcgaaagggg gatgtgctgc aaggcgatta

1200

agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca cgacgttgta aaacgacggc cagtgaattc

1260

gagctcaggc cttaactcac attaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga

1320

aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt

1380

attgggcgcc agggtggttt ttcttttcac cagtgagacg ggcaacagct gattgccctt

1440

caccgcctgg ccctgagaga gttgcagcaa gcggtccacg ctggtttgcc ccagcaggcg

1500

aaaatcctgt ttgatggtgg ttgacggcgg gatataacat gagctgtctt cggtatcgtc

1560

gtatcccact accgagatat ccgcaccaac gcgcagcccg gactcggtaa tggcgcgcat

1620

tgcgcccagc gccatctgat cgttggcaac cagcatcgca gtgggaacga tgccctcatt

1680

cagcatttgc atggtttgtt gaaaaccgga catggcactc cagtcgcctt cccgttccgc

1740

tatcggctga atttgattgc gagtgagata tttatgccag ccagccagac gcagacgcgc

1800

cgagacagaa cttaatgggc ccgctaacag cgcgatttgc tggtgaccca atgcgaccag

1860

atgctccacg cccagtcgcg taccgtcttc atgggagaaa ataatactgt tgatgggtgt

1920

ctggtcagag acatcaagaa ataacgccgg aacattagtg caggcagctt ccacagcaat

1980

ggcatcctgg tcatccagcg gatagttaat gatcagccca ctgacgcgtt gcgcgagaag

2040

attgtgcacc gccgctttac aggcttcgac gccgcttcgt tctaccatcg acaccaccac

2100

gctggcaccc agttgatcgg cgcgagattt aatcgccgcg acaatttgcg acggcgcgtg

2160

cagggccaga ctggaggtgg caacgccaat cagcaacgac tgtttgcccg ccagttgttg

2220

tgccacgcgg ttgggaatgt aattcagctc cgccatcgcc gcttccactt tttcccgcgt

2280

tttcgcagaa acgtggctgg cctggttcac cacgcgggaa acggtctgat aagagacacc

2340

ggcatactct gcgacatcgt ataacgttac tggtttcatc aaaatcgtct ccctccgttt

2400

gaatatttga ttgatcgtaa ccagatgaag cactctttcc actatcccta cagtgttatg

2460

gcttgaacaa tcacgaaaca ataattggta cgtacgatct ttcagccgac tcaaacatca

2520

aatcttacaa atgtagtctt tgaaagtatt acatatgtaa gatttaaatg caaccgtttt

2580

ttcggaagga aatgatgacc tcgtttccac cggaattagc ttggtaccaa aggaggtaag

2640

gatcactaga aaatttttta aaaaatctct tgacattgga agggagatat gttattataa

2700

gaattgcgga attgtgagcg gataacaatt cccatataga ttaactaata aggaggacaa

2760

acatgggttc tatcatcaga cttcagggtg gtttaggcaa tcaactgttt caatttagct

2820

ttggttatgc tctttcaaaa atcaatggca caccgctgta ctttgatatt tcacattacg

2880

cagaaaacga tgatcatggc ggatatagac tgaataacct tcaaatcccg gaagaatatc

2940

ttcagtacta cacaccgaaa atcaacaaca tctacaaact gcttgtcaga ggcagccgct

3000

tatatccgga tatttttctg tttcttggct tttgcaacga atttcatgcg tatggctatg

3060

attttgaata catcgcgcaa aaatggaaaa gcaaaaaata catcggatac tggcagtctg

3120

aacatttctt tcataaacat attctggatc tgaaagaatt tttcatcccg aaaaacgtta

3180

gcgaacaagc taacttactg gcagcgaaaa tcttagaatc tcagtcaagc ctgtcaattc

3240

atatcagacg cggcgattac atcaaaaaca aaacagccac actgacacat ggagtttgct

3300

ctcttgaata ctacaagaaa gcactgaaca aaatcagaga tttagccatg attcgcgatg

3360

tgtttatctt ttctgatgat attttctggt gtaaagaaaa catcgaaaca cttctgagca

3420

aaaaatacaa catctactac tcagaagatt taagccaaga agaagattta tggctgatgt

3480

ctctggctaa tcatcatatt atcgccaact cttcattttc atggtggggc gcatatcttg

3540

gaagctctgc gagccagatt gttatctatc cgacaccgtg gtatgatatt acaccgaaaa

3600

acacatacat tcctatcgtg aaccattgga tcaacgtgga caaacattcc tcctgctaag

3660

gagaaaagct agcgattaac taataaggag gaactgaaat gtcaaaagtg gcgcttatta

3720

caggcgtcac aggacaagat ggcagctatt tagctgaatt tctgcttgaa aaaggatatg

3780

aagtgcatgg cattaaaaga cgcgcatcat catttaacac agaaagagtc gatcatatct

3840

atcaagatcc gcatacatgc aacccgaaat ttcatctgca ttatggcgat ctgagcgata

3900

catctaacct gacaagaatt ttacgcgaag tccagccgga tgaagtttat aacctgggcg

3960

cgatgtctca tgtcgctgtt tcatttgaaa gcccggaata tacagccgat gtcgatgcaa

4020

tgggaacact tagattactg gaagccattc gctttttagg cctggaaaag aaaacacgct

4080

tttatcaggc atctacatca gaactgtatg gacttgttca agaaatcccg cagaaagaaa

4140

caacaccgtt ttatccgaga agcccgtatg cggtcgctaa actttacgcg tactggatca

4200

cagttaatta tcgcgaatct tatggaatgt atgcttgcaa tggcatctta tttaaccatg

4260

aatcaccgag acgcggagaa acatttgtta caagaaaaat cacacgcgcc attgcaaata

4320

tcgcccaagg actggaaagc tgtctttatt taggcaacat ggattctctt agagattggg

4380

gccatgcaaa agattacgtt aaaatgcaat ggatgatgtt acaacaggaa cagccggaag

4440

attttgtgat cgccacagga gtgcaatatt cagtcagaca gtttgttgaa atggcagcgg

4500

ctcagcttgg cattaaactg cgctttgaag gcacaggagt ggaagaaaaa ggaatcgttg

4560

tgagcgttac aggccatgat gcgccgggag tgaaaccggg cgatgtgatt atcgccgtcg

4620

atccgagata ttttcgcccg gcagaagtcg aaacactttt aggagatccg acaaaagcgc

4680

atgaaaaact gggctggaaa ccggaaatta cactgagaga aatggttagc gaaatggtgg

4740

ctaacgattt agaagccgcg aaaaaacatt ctctgcttaa atcacatggc tatgatgtgg

4800

cgatcgctct ggaatcttaa aaaggaggaa ctactatgag caaacaaaga gtttttatcg

4860

ctggccatcg cggaatggtg ggctctgcca ttagacgcca attagaacag agaggagatg

4920

tggaacttgt cttaagaaca cgcgatgaac tgaatctgct tgattcaaga gctgtccatg

4980

atttctttgc cagcgaacgc atcgatcagg tttatcttgc agcggctaaa gttggcggaa

5040

ttgtggcaaa taacacatat ccggcggatt ttatctacca aaacatgatg atcgaatcta

5100

acattatcca tgccgcacat cagaatgatg ttaacaaact gctgtttctg ggatcaagct

5160

gcatctatcc gaaacttgca aaacaaccga tggcggaatc agaactttta cagggcacac

5220

tggaaccgac aaatgaaccg tatgcaattg cgaaaatcgc gggaatcaaa ctttgtgaat

5280

cttacaacag acaatacggc agagattatc gctcagtgat gccgacaaac ttatatggac

5340

cgcatgataa ttttcatccg tctaactcac atgtcattcc ggcactgctt agacgctttc

5400

atgaagctac agcccagaac gcgccggatg ttgtggtctg gggctcagga acaccgatgc

5460

gcgaatttct gcatgttgat gatatggcgg ctgccagcat ccatgtgatg gaacttgctc

5520

atgaagtctg gttagaaaat acacaaccga tgcttagcca tattaacgtc ggcacaggag

5580

ttgattgcac aatcagagaa ttagctcaga caattgccaa agttgtggga tataaaggcc

5640

gcgtcgtttt tgatgcctct aaaccggatg gcacaccgag aaaattactg gatgtgacac

5700

gcctgcatca acttggatgg tatcatgaaa ttagcttaga agcaggcctg gcgtctacat

5760

accaatggtt tttagaaaac caggatagat ttcgcggcgg atcataaagt gatagcggta

5820

ccattatagg taagagagga atgtacacat gtactattta aaaaacacaa acttttggat

5880

gttcggttta ttctttttct tttacttttt tatcatggga gcctacttcc cgtttttccc

5940

gatttggcta catgacatca accatatcag caaaagtgat acgggtatta tttttgccgc

6000

tatttctctg ttctcgctat tattccaacc gctgtttggt ctgctttctg acaaactcgg

6060

gctgcgcaaa tacctgctgt ggattattac cggcatgtta gtgatgtttg cgccgttctt

6120

tatttttatc ttcgggccac tgttacaata caacatttta gtaggatcga ttgttggtgg

6180

tatttatcta ggcttttgtt ttaacgccgg tgcgccagca gtagaggcat ttattgagaa

6240

agtcagccgt cgcagtaatt tcgaatttgg tcgcgcgcgg atgtttggct gtgttggctg

6300

ggcgctgtgt gcctcgattg tcggcatcat gttcaccatc aataatcagt ttgttttctg

6360

gctgggctct ggctgtgcac tcatcctcgc cgttttactc tttttcgcca aaacggatgc

6420

gccctcttct gccacggttg ccaatgcggt aggtgccaac cattcggcat ttagccttaa

6480

gctggcactg gaactgttca gacagccaaa actgtggttt ttgtcactgt atgttattgg

6540

cgtttcctgc acctacgatg tttttgacca acagtttgct aatttcttta cttcgttctt

6600

tgctaccggt gaacagggta cgcgggtatt tggctacgta acgacaatgg gcgaattact

6660

taacgcctcg attatgttct ttgcgccact gatcattaat cgcatcggtg ggaaaaacgc

6720

cctgctgctg gctggcacta ttatgtctgt acgtattatt ggctcatcgt tcgccacctc

6780

agcgctggaa gtggttattc tgaaaacgct gcatatgttt gaagtaccgt tcctgctggt

6840

gggctgcttt aaatatatta ccagccagtt tgaagtgcgt ttttcagcga cgatttatct

6900

ggtctgtttc tgcttcttta agcaactggc gatgattttt atgtctgtac tggcgggcaa

6960

tatgtatgaa agcatcggtt tccagggcgc ttatctggtg ctgggtctgg tggcgctggg

7020

cttcacctta atttccgtgt tcacgcttag cggccccggc ccgctttccc tgctgcgtcg

7080

tcaggtgaat gaagtcgctt aaggatccat gtctagagtc gacgtccccg gggcagcccg

7140

cctaatgagc gggctttttt cacgtcccag gcatcaaata aaacgaaagg ctcagtcgaa

7200

agactgggcc tttcgtttta tctgttgttt gtcggtgaac gctctctact agagtcacac

7260

tggctcacct tcgggtgggc ctttctgcgt ttatacccgg ggcagcccgc ctaatgagcg

7320

ggcttttttc acgtcacgcg tccatggaga tctttgtctg caactgaaaa gtttatacct

7380

tacctggaac aaatggttga aacatacgag gctaatatcg gcttattagg aatagtccct

7440

gtactaataa aatcaggtgg atcagttgat cagtatattt tggacgaagc tcggaaagaa

7500

tttggagatg acttgcttaa ttccacaatt aaattaaggg aaagaataaa gcgatttgat

7560

gttcaaggaa tcacggaaga agatactcat gataaagaag ctctaaaact attcaataac

7620

cttacaatgg aattgatcga aagggtggaa ggttaatggt acgaaaatta ggggatctac

7680

ctagaaagcc acaaggcgat aggtcaagct taaagaaccc ttacatggat cttacagatt

7740

ctgaaagtaa agaaacaaca gaggttaaac aaacagaacc aaaaagaaaa aaagcattgt

7800

tgaaaacaat gaaagttgat gtttcaatcc ataataagat taaatcgctg cacgaaattc

7860

tggcagcatc cgaagggaat tcatattact tagaggatac tattgagaga gctattgata

7920

agatggttga gacattacct gagagccaaa aaacttttta tgaatatgaa ttaaaaaaaa

7980

gaaccaacaa aggctgagac agactccaaa cgagtctgtt tttttaaaaa aaatattagg

8040

agcattgaat atatattaga gaattaagaa agacatggga ataaaaatat tttaaatcca

8100

gtaaaaatat gataagatta tttcagaata tgaagaactc tgtttgtttt tgatgaaaaa

8160

acaaacaaaa aaaatccacc taacggaatc tcaatttaac taacagcggc caaactgaga

8220

agttaaattt gagaagggga aaaggcggat ttatacttgt atttaactat ctccatttta

8280

acattttatt aaaccccata caagtgaaaa tcctctttta cactgttcct ttaggtgatc

8340

gcggagggac attatgagtg aagtaaacct aaaaggaaat acagatgaat tagtgtatta

8400

tcgacagcaa accactggaa ataaaatcgc caggaagaga atcaaaaaag ggaaagaaga

8460

agtttattat gttgctgaaa cggaagagaa gatatggaca gaagagcaaa taaaaaactt

8520

ttctttagac aaatttggta cgcatatacc ttacatagaa ggtcattata caatcttaaa

8580

taattacttc tttgattttt ggggctattt tttaggtgct gaaggaattg cgctctatgc

8640

tcacctaact cgttatgcat acggcagcaa agacttttgc tttcctagtc tacaaacaat

8700

cgctaaaaaa atggacaaga ctcctgttac agttagaggc tacttgaaac tgcttgaaag

8760

gtacggtttt atttggaagg taaacgtccg taataaaacc aaggataaca cagaggaatc

8820

cccgattttt aagattagac gtaaggttcc tttgctttca gaagaacttt taaatggaaa

8880

ccctaatatt gaaattccag atgacgagga agcacatgta aagaaggctt taaaaaagga

8940

aaaagagggt cttccaaagg ttttgaaaaa agagcacgat gaatttgtta aaaaaatgat

9000

ggatgagtca gaaacaatta atattccaga ggccttacaa tatgacacaa tgtatgaaga

9060

tatactcagt aaaggagaaa ttcgaaaaga aatcaaaaaa caaataccta atcctacaac

9120

atcttttgag agtatatcaa tgacaactga agaggaaaaa gtcgacagta ctttaaaaag

9180

cgaaatgcaa aatcgtgtct ctaagccttc ttttgatacc tggtttaaaa acactaagat

9240

caaaattgaa aataaaaatt gtttattact tgtaccgagt gaatttgcat ttgaatggat

9300

taagaaaaga tatttagaaa caattaaaac agtccttgaa gaagctggat atgttttcga

9360

aaaaatcgaa ctaagaaaag tgcaataaac tgctgaagta tttcagcagt tttttttatt

9420

tagaaatagt gaaaaaaata taatcaggga ggtatcaata tttaatgagt actgatttaa

9480

atttatttag actggaatta ataattaaca cgtagactaa ttaaaattta atgagggata

9540

aagaggatac aaaaatatta atttcaatcc ctattaaatt ttaacaaggg ggggattaaa

9600

atttaattag aggtttatcc acaagaaaag accctaataa aatttttact agggttataa

9660

cactgattaa tttcttaatg ggggagggat taaaatttaa tgacaaagaa aacaatcttt

9720

taagaaaagc ttttaaaaga taataataaa aagagctttg cgattaagca aaactcttta

9780

ctttttcatt gacattatca aattcatcga tttcaaattg ttgttgtatc ataaagttaa

9840

ttctgttttg cacaaccttt tcaggaatat aaaacacatc tgaggcttgt tttataaact

9900

cagggtcgct aaagtcaatg taacgtagca tatgatatgg tatagcttcc acccaagtta

9960

gcctttctgc ttcttctgaa tgtttttcat atacttccat gggtatctct aaatgatttt

10020

cctcatgtag caaggtatga gcaaaaagtt tatggaattg atagttcctc tctttttctt

10080

caactttttt atctaaaaca aacactttaa catctgagtc aatgtaagca taagatgttt

10140

ttccagtcat aatttcaatc ccaaatcttt tagacagaaa ttctggacgt aaatcttttg

10200

gtgaaagaat ttttttatgt agcaatatat ccgatacagc accttctaaa agcgttggtg

10260

aatagggcat tttacctatc tcctctcatt ttgtggaata aaaatagtca tattcgtcca

10320

tctacctatc ctattatcga acagttgaac tttttaatca aggatcagtc ctttttttca

10380

ttattcttaa actgtgctct taactttaac aactcgattt gtttttccag atctcgaggg

10440

taactagcct cgccgatccc gcaagaggcc cggcagtcag gtggcacttt tcggggaaat

10500

gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg

10560

agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa

10620

catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac

10680

ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac

10740

atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt

10800

ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc

10860

gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca

10920

ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc

10980

ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag

11040

gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa

11100

ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg

11160

gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa

11220

ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg

11280

gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt

11340

gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt

11400

caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag

11460

cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat

11520

ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct

11580

taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct

11640

tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca

11700

gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc

11760

agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc

11820

aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct

11880

gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag

11940

gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc

12000

tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg

12060

agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag

12120

cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt

12180

gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac

12240

gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg

12300

ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc

12360

cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcccaata

12420

cgcatgc

12427

<210> 3

<211> 12330

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> интеграционный вектор

<400> 3

ttctcatgtt tgacagctta tcatcgataa gctttaatgc ggtagtttat cacagttaaa

60

ttgctaacgc agtcaggcac cgtgtatgaa atctaacaat gcgctcatcg tcatcctcgg

120

caccgtcacc ctggatgctg taggcatagg cttggttatg ccggtactgc cgggcctctt

180

gcgggatatc gtccattccg acagcatcgc cagtcactat ggcgtgctgc tagcgctata

240

tgcgttgatg caatttctat gcgcacccgt tctcggagca ctgtccgacc gctttggccg

300

ccgcccagtc ctgctcgctt cgctacttgg agccactatc gactacgcga tcatggcgac

360

cacacccgtc ctgtggatcc tctacgccgg acgcatcgtg gccggcatca ccggcgccac

420

aggtgcggtt gctggcgcct atatcgccga catcaccgat ggggaagatc gggctcgcca

480

cttcgggctc atgagcgctt gtttcggcgt gggtatggtg gcaggccccg tggccggggg

540

actgttgggc gccatctcct tgcatgcacc attccttgcg gcggcggtgc tcaacggcct

600

caacctacta ctgggctgct tcctaatgca ggagtcgcat aagggagagc gtcgaccgat

660

gcccttgaga gccttcaacc cagtcagctc cttccggtgg gcgcggggca tgactatcgt

720

cgccgcactt atgactgtct tctttatcat gcaactcgta ggacaggtgc cggcagcgct

780

ctgggtcatt ttcggcgagg accgctttcg ctggagcgcg acgatgatcg gcctgtcgct

840

tgcggtattc ggaatcttgc acgccctcgc tcaagccttc gtcactggtc ccgccaccaa

900

acgtttcggc gagaagcagg ccattatcgc cggcatggcg gccgacgcgc tgggctacgt

960

cttgctggcg ttcgcgacgc gaggctggat ggccttcccc attatgattc ttctcgcttc

1020

cggcggcatc gggatgcccg cgttgcaggc catgctgtcc aggcaggtag atgacgacca

1080

tcagggacag cttcaaggat cgctcgcggc tcttaccagc ctaacttcga tcactggacc

1140

gctgatcgtc acggcgattt atgccgcctc ggcgagcaca tggaacgggt tggcatggat

1200

tgtaggcgcc gccctatacc ttgtctgcct ccccgcgttg cgtcgcggtg catggagccg

1260

ggccacctcg acctgaatgg aagccggcgg cacctcgcta acggattcac cactccaaga

1320

attggagcca atcaattctt gcggagaact gtgaatgcgc aaaccaaccc ttggcagaac

1380

atatccatcg cgtccgccat ctccagcagc cgcacgcggc gcatctcggg cagcgttggg

1440

tcctggccac gggtgcgcat gatcgtgctc ctgtcgttga ggacccggct aggctggcgg

1500

ggttgcctta ctggttagca gaatgaatca ccgatacgcg agcgaacgtg aagcgactgc

1560

tgctgcaaaa cgtctgcgac ctgagcaaca acatgaatgg tcttcggttt ccgtgtttcg

1620

taaagtctgg aaacgcggaa gtcagcgccc tgcaccatta tgttccggat ctgcatcgca

1680

ggatgctgct ggctaccctg tggaacacct acatctgtat taacgaagcg ctggcattga

1740

ccctgagtga tttttctctg gtcccgccgc atccataccg ccagttgttt accctcacaa

1800

cgttccagta accgggcatg ttcatcatca gtaacccgta tcgtgagcat cctctctcgt

1860

ttcatcggta tcattacccc catgaacaga aatccccctt acacggaggc atcagtgacc

1920

aaacaggaaa aaaccgccct taacatggcc cgctttatca gaagccagac attaacgctt

1980

ctggagaaac tcaacgagct ggacgcggat gaacaggcag acatctgtga atcgcttcac

2040

gaccacgctg atgagcttta ccgcagctgc ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac

2100

ctctgacaca tgcagctccc ggagacggtc acagcttgtc tgtaagcgga tgccgggagc

2160

agacaagccc gtcagggcgc gtcagcgggt gttggcgggt gtcggggcgc agccatgacc

2220

cagtcacgta gcgatagcgg agtgtatact ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg

2280

tactgagagt gcaccatatg acccgacatc cggcgttctc atggcggtgc ttgccgccag

2340

cggtattccg tatgtcaagt ggctgcggtt tatggtgccg cttgctctga tttggttctt

2400

gatcgggctt gtctttatcg tgatcggagt catgatcaat tgggggccgt tttaacgatt

2460

gctgcccgcc ggcttgtacg gcgggctttt gagttattca ttgcagaagc gcaggctgtt

2520

attgtaacat gtaagccata agccattcgt aaaagtgcgg gaggaaggtc atgaataatc

2580

tgcgtaatag actttcaggc gtgaatggga aaaataagag agtaaaagaa aaagaacaaa

2640

aaatctggtc ggagattggg atgatagcgg gagcatttgc gctgcttgat gtgatcatcc

2700

gcggcattat gtttgaattt ccgtttaaag aatgggctgc aagccttgtg tttttgttca

2760

tcattatctt atattactgc atcagggctg cggcatccgg aatgctcatg ccgagaatag

2820

acaccaaaga agaactgcaa aaacgggtga agcagcagcg aatagaatca attgcggtcg

2880

cctttgcggt agtggtgctt acgatgtacg acagggggat tccccataca ttcttcgctt

2940

ggctgaaaat gattcttctt tttatcgtct gcggcggcgt tctgtttctg cttcggtatg

3000

tgattgtgaa gctggcttac agaagagcgg taaaagaaga aataaaaaag aaatcatctt

3060

ttttgtttgg aaagcgaggg aagcgttcac agtttcgggc agcttttttt ataggaacat

3120

tgatttgtat tcactctgcc aagttgtttt gatagagtga ttgtgataat tttaaatgta

3180

agcgttaaca aaattctcca gtcttcacat cggtttgaaa ggaggaagcg gaagaatgaa

3240

gtaagaggga tttttgactc cgaagtaagt cttcaaaaaa tcaaataagg agtgtcaaga

3300

ccagtgaatt cgagctcggt acctaccgtt cgtataatgt atgctatacg aagttatgat

3360

aaaaaattta gaagccaatg aaatctataa ataaactaaa ttaagtttat ttaattaaca

3420

actatggata taaaataggt actaatcaaa atagtgagga ggatatattt gaatacatac

3480

gaacaaatta ataaagtgaa aaaaatactt cggaaacatt taaaaaataa ccttattggt

3540

acttacatgt ttggatcagg agttgagagt ggactaaaac caaatagtga tcttgacttt

3600

ttagtcgtcg tatctgaacc attgacagat caaagtaaag aaatacttat acaaaaaatt

3660

agacctattt caaaaaaaat aggagataaa agcaacttac gatatattga attaacaatt

3720

attattcagc aagaaatggt accgtggaat catcctccca aacaagaatt tatttatgga

3780

gaatggttac aagagcttta tgaacaagga tacattcctc agaaggaatt aaattcagat

3840

ttaaccataa tgctttacca agcaaaacga aaaaataaaa gaatatacgg aaattatgac

3900

ttagaggaat tactacctga tattccattt tctgatgtga gaagagccat tatggattcg

3960

tcagaggaat taatagataa ttatcaggat gatgaaacca actctatatt aactttatgc

4020

cgtatgattt taactatgga cacgggtaaa atcataccaa aagatattgc gggaaatgca

4080

gtggctgaat cttctccatt agaacatagg gagagaattt tgttagcagt tcgtagttat

4140

cttggagaga atattgaatg gactaatgaa aatgtaaatt taactataaa ctatttaaat

4200

aacagattaa aaaaattata aaaaaattga aaaaatggtg gaaacacttt tttcaatttt

4260

tttgttttat tatttaatat ttgggaaata ttcattctaa tataacttcg tataatgtat

4320

gctatacgaa cggtaggatc ctctagagtc gacctgcagg cattttacat ttttagaaat

4380

gggcgtgaaa aaaagcgcgc gattatgtaa aatataaaga ttaactaata aggaggacaa

4440

acatgggttc tatcatcaga cttcagggtg gtttaggcaa tcaactgttt caatttagct

4500

ttggttatgc tctttcaaaa atcaatggca caccgctgta ctttgatatt tcacattacg

4560

cagaaaacga tgatcatggc ggatatagac tgaataacct tcaaatcccg gaagaatatc

4620

ttcagtacta cacaccgaaa atcaacaaca tctacaaact gcttgtcaga ggcagccgct

4680

tatatccgga tatttttctg tttcttggct tttgcaacga atttcatgcg tatggctatg

4740

attttgaata catcgcgcaa aaatggaaaa gcaaaaaata catcggatac tggcagtctg

4800

aacatttctt tcataaacat attctggatc tgaaagaatt tttcatcccg aaaaacgtta

4860

gcgaacaagc taacttactg gcagcgaaaa tcttagaatc tcagtcaagc ctgtcaattc

4920

atatcagacg cggcgattac atcaaaaaca aaacagccac actgacacat ggagtttgct

4980

ctcttgaata ctacaagaaa gcactgaaca aaatcagaga tttagccatg attcgcgatg

5040

tgtttatctt ttctgatgat attttctggt gtaaagaaaa catcgaaaca cttctgagca

5100

aaaaatacaa catctactac tcagaagatt taagccaaga agaagattta tggctgatgt

5160

ctctggctaa tcatcatatt atcgccaact cttcattttc atggtggggc gcatatcttg

5220

gaagctctgc gagccagatt gttatctatc cgacaccgtg gtatgatatt acaccgaaaa

5280

acacatacat tcctatcgtg aaccattgga tcaacgtgga caaacattcc tcctgctaaa

5340

gtgatagcgg taccattata ggtaagagag gaatgtacac atgtactatt taaaaaacac

5400

aaacttttgg atgttcggtt tattcttttt cttttacttt tttatcatgg gagcctactt

5460

cccgtttttc ccgatttggc tacatgacat caaccatatc agcaaaagtg atacgggtat

5520

tatttttgcc gctatttctc tgttctcgct attattccaa ccgctgtttg gtctgctttc

5580

tgacaaactc gggctgcgca aatacctgct gtggattatt accggcatgt tagtgatgtt

5640

tgcgccgttc tttattttta tcttcgggcc actgttacaa tacaacattt tagtaggatc

5700

gattgttggt ggtatttatc taggcttttg ttttaacgcc ggtgcgccag cagtagaggc

5760

atttattgag aaagtcagcc gtcgcagtaa tttcgaattt ggtcgcgcgc ggatgtttgg

5820

ctgtgttggc tgggcgctgt gtgcctcgat tgtcggcatc atgttcacca tcaataatca

5880

gtttgttttc tggctgggct ctggctgtgc actcatcctc gccgttttac tctttttcgc

5940

caaaacggat gcgccctctt ctgccacggt tgccaatgcg gtaggtgcca accattcggc

6000

atttagcctt aagctggcac tggaactgtt cagacagcca aaactgtggt ttttgtcact

6060

gtatgttatt ggcgtttcct gcacctacga tgtttttgac caacagtttg ctaatttctt

6120

tacttcgttc tttgctaccg gtgaacaggg tacgcgggta tttggctacg taacgacaat

6180

gggcgaatta cttaacgcct cgattatgtt ctttgcgcca ctgatcatta atcgcatcgg

6240

tgggaaaaac gccctgctgc tggctggcac tattatgtct gtacgtatta ttggctcatc

6300

gttcgccacc tcagcgctgg aagtggttat tctgaaaacg ctgcatatgt ttgaagtacc

6360

gttcctgctg gtgggctgct ttaaatatat taccagccag tttgaagtgc gtttttcagc

6420

gacgatttat ctggtctgtt tctgcttctt taagcaactg gcgatgattt ttatgtctgt

6480

actggcgggc aatatgtatg aaagcatcgg tttccagggc gcttatctgg tgctgggtct

6540

ggtggcgctg ggcttcacct taatttccgt gttcacgctt agcggccccg gcccgctttc

6600

cctgctgcgt cgtcaggtga atgaagtcgc ttaaagtcaa tgtatgaatg gatacgggat

6660

atgaatcaat aagtacgtga aagagaaaag caacccagat atgataggga acttttctct

6720

ttcttgtttt acattgaatc tttacaatcc tattgatata atctaagcta gtgtattttg

6780

cgtttaatag tggagaaaag ctagcgatta actaataagg aggaactgaa atgtcaaaag

6840

tggcgcttat tacaggcgtc acaggacaag atggcagcta tttagctgaa tttctgcttg

6900

aaaaaggata tgaagtgcat ggcattaaaa gacgcgcatc atcatttaac acagaaagag

6960

tcgatcatat ctatcaagat ccgcatacat gcaacccgaa atttcatctg cattatggcg

7020

atctgagcga tacatctaac ctgacaagaa ttttacgcga agtccagccg gatgaagttt

7080

ataacctggg cgcgatgtct catgtcgctg tttcatttga aagcccggaa tatacagccg

7140

atgtcgatgc aatgggaaca cttagattac tggaagccat tcgcttttta ggcctggaaa

7200

agaaaacacg cttttatcag gcatctacat cagaactgta tggacttgtt caagaaatcc

7260

cgcagaaaga aacaacaccg ttttatccga gaagcccgta tgcggtcgct aaactttacg

7320

cgtactggat cacagttaat tatcgcgaat cttatggaat gtatgcttgc aatggcatct

7380

tatttaacca tgaatcaccg agacgcggag aaacatttgt tacaagaaaa atcacacgcg

7440

ccattgcaaa tatcgcccaa ggactggaaa gctgtcttta tttaggcaac atggattctc

7500

ttagagattg gggccatgca aaagattacg ttaaaatgca atggatgatg ttacaacagg

7560

aacagccgga agattttgtg atcgccacag gagtgcaata ttcagtcaga cagtttgttg

7620

aaatggcagc ggctcagctt ggcattaaac tgcgctttga aggcacagga gtggaagaaa

7680

aaggaatcgt tgtgagcgtt acaggccatg atgcgccggg agtgaaaccg ggcgatgtga

7740

ttatcgccgt cgatccgaga tattttcgcc cggcagaagt cgaaacactt ttaggagatc

7800

cgacaaaagc gcatgaaaaa ctgggctgga aaccggaaat tacactgaga gaaatggtta

7860

gcgaaatggt ggctaacgat ttagaagccg cgaaaaaaca ttctctgctt aaatcacatg

7920

gctatgatgt ggcgatcgct ctggaatctt aaaaaggagg aactactatg agcaaacaaa

7980

gagtttttat cgctggccat cgcggaatgg tgggctctgc cattagacgc caattagaac

8040

agagaggaga tgtggaactt gtcttaagaa cacgcgatga actgaatctg cttgattcaa

8100

gagctgtcca tgatttcttt gccagcgaac gcatcgatca ggtttatctt gcagcggcta

8160

aagttggcgg aattgtggca aataacacat atccggcgga ttttatctac caaaacatga

8220

tgatcgaatc taacattatc catgccgcac atcagaatga tgttaacaaa ctgctgtttc

8280

tgggatcaag ctgcatctat ccgaaacttg caaaacaacc gatggcggaa tcagaacttt

8340

tacagggcac actggaaccg acaaatgaac cgtatgcaat tgcgaaaatc gcgggaatca

8400

aactttgtga atcttacaac agacaatacg gcagagatta tcgctcagtg atgccgacaa

8460

acttatatgg accgcatgat aattttcatc cgtctaactc acatgtcatt ccggcactgc

8520

ttagacgctt tcatgaagct acagcccaga acgcgccgga tgttgtggtc tggggctcag

8580

gaacaccgat gcgcgaattt ctgcatgttg atgatatggc ggctgccagc atccatgtga

8640

tggaacttgc tcatgaagtc tggttagaaa atacacaacc gatgcttagc catattaacg

8700

tcggcacagg agttgattgc acaatcagag aattagctca gacaattgcc aaagttgtgg

8760

gatataaagg ccgcgtcgtt tttgatgcct ctaaaccgga tggcacaccg agaaaattac

8820

tggatgtgac acgcctgcat caacttggat ggtatcatga aattagctta gaagcaggcc

8880

tggcgtctac ataccaatgg tttttagaaa accaggatag atttcgcggc ggatcataag

8940

gatccatgtc tagagtcgac gtccccgggg cagcccgcct aatgagcggg cttttttcac

9000

gtcccaggca tcaaataaaa cgaaaggctc agtcgaaaga ctgggccttt cgttttatct

9060

gttgtttgtc ggtgaacgct ctctactaga gtcacactgg ctcaccttcg ggtgggcctt

9120

tctgcgttta tagaattcat attacttaga ggatactatt gagagagcta ttgataagat

9180

ggttgagaca ttacctgaga gccaaaaaac tttttatgaa tatgaattaa aaaaaagaac

9240

caacaaaggc tgagacagac tccgggcaag gctagacggg acttaccgaa agaaaccatc

9300

aatgatggtt tcttttttgt tcataaatca gacaaaactt ttctcttgca aaagtttgtg

9360

aagtgttgca caatataaat gtgaaatact tcacaaacaa aaagacatca aagagaaaca

9420

taccctggaa ggatgattaa tgatgaacaa acatgtaaat aaagtagctt taatcggagc

9480

gggttttgtt ggaagcagtt atgcatttgc gttaattaac caaggaatca cagatgagct

9540

tgtggtcatt gatgtaaata aagaaaaagc aatgggcgat gtgatggatt taaaccacgg

9600

aaaggcgttt gcgccacaac cggtcaaaac atcttacgga acatatgaag actgcaagga

9660

tgctgatatt gtctgcattt gcgccggagc aaaccaaaaa cctggtgaga cacgccttga

9720

attagtagaa aagaacttga agattttcaa aggcatcgtt agtgaagtca tggcgagcgg

9780

atttgacggc attttcttag tcgcgacaaa tccggttgat atcctgactt acgcaacatg

9840

gaaattcagc ggcctgccaa aagagcgggt gattggaagc ggcacaacac ttgattctgc

9900

gagattccgt ttcatgctga gcgaatactt tggcgcagcg cctcaaaacg tacacgcgca

9960

tattatcgga gagcacggcg acacagagct tcctgtttgg agccacgcga atgtcggcgg

10020

tgtgccggtc agtgaactcg ttgagaaaaa cgatgcgtac aaacaagagg agctggacca

10080

aattgtagat gatgtgaaaa acgcagctta ccatatcatt gagaaaaaag gcgcgactta

10140

ttatggggtt gcgatgagtc ttgctcgcat tacaaaagcc attcttcata atgaaaacag

10200

catattaact gtcagcacat atttggacgg gcaatacggt gcagatgacg tgtacatcgg

10260

tgtcatatgc ggtgtgaaat accgcacaga tgcgtaagga gaaaataccg catcaggcgc

10320

tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta

10380

tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag

10440

aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg

10500

tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg

10560

tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg

10620

cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga

10680

agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc

10740

tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt

10800

aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact

10860

ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg

10920

cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt

10980

accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt

11040

ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct

11100

ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg

11160

gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt

11220

aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt

11280

gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc

11340

gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg

11400

cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc

11460

gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg

11520

gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctgca

11580

ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga

11640

tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct

11700

ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg

11760

cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca

11820

accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaaca

11880

cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct

11940

tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact

12000

cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa

12060

acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc

12120

atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga

12180

tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga

12240

aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg

12300

cgtatcacga ggccctttcg tcttcaagaa

12330

<210> 4

<211> 4254

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> интеграционная кассета

<400> 4

gcaggctgtt attgtaacat gtaagccata agccattcgt aaaagtgcgg gaggaaggtc

60

atgaataatc tgcgtaatag actttcaggc gtgaatggga aaaataagag agtaaaagaa

120

aaagaacaaa aaatctggtc ggagattggg atgatagcgg gagcatttgc gctgcttgat

180

gtgatcatcc gcggcattat gtttgaattt ccgtttaaag aatgggctgc aagccttgtg

240

tttttgttca tcattatctt atattactgc atcagggctg cggcatccgg aatgctcatg

300

ccgagaatag acaccaaaga agaactgcaa aaacgggtga agcagcagcg aatagaatca

360

attgcggtcg cctttgcggt agtggtgctt acgatgtacg acagggggat tccccataca

420

ttcttcgctt ggctgaaaat gattcttctt tttatcgtct gcggcggcgt tctgtttctg

480

cttcggtatg tgattgtgaa gctggcttac agaagagcgg taaaagaaga aataaaaaag

540

aaatcatctt ttttgtttgg aaagcgaggg aagcgttcac agtttcgggc agcttttttt

600

ataggaacat tgatttgtat tcactctgcc aagttgtttt gatagagtga ttgtgataat

660

tttaaatgta agcgttaaca aaattctcca gtcttcacat cggtttgaaa ggaggaagcg

720

gaagaatgaa gtaagaggga tttttgactc cgaagtaagt cttcaaaaaa tcaaataagg

780

agtgtcaaga atgtttgcaa aacgattcaa aacctcttta ctgccgttat tcgctggatt

840

tttattgctg tttcatttgg ttctggcagg accggcggct gcgagtgctg aaacggcgaa

900

caaatcgaat gagcttacag caccgtcgat caaaagcgga accattcttc atgcatggcc

960

agtgaattcg agctcggtac ctaccgttcg tataatgtat gctatacgaa gttatgataa

1020

aaaatttaga agccaatgaa atctataaat aaactaaatt aagtttattt aattaacaac

1080

tatggatata aaataggtac taatcaaaat agtgaggagg atatatttga atacatacga

1140

acaaattaat aaagtgaaaa aaatacttcg gaaacattta aaaaataacc ttattggtac

1200

ttacatgttt ggatcaggag ttgagagtgg actaaaacca aatagtgatc ttgacttttt

1260

agtcgtcgta tctgaaccat tgacagatca aagtaaagaa atacttatac aaaaaattag

1320

acctatttca aaaaaaatag gagataaaag caacttacga tatattgaat taacaattat

1380

tattcagcaa gaaatggtac cgtggaatca tcctcccaaa caagaattta tttatggaga

1440

atggttacaa gagctttatg aacaaggata cattcctcag aaggaattaa attcagattt

1500

aaccataatg ctttaccaag caaaacgaaa aaataaaaga atatacggaa attatgactt

1560

agaggaatta ctacctgata ttccattttc tgatgtgaga agagccatta tggattcgtc

1620

agaggaatta atagataatt atcaggatga tgaaaccaac tctatattaa ctttatgccg

1680

tatgatttta actatggaca cgggtaaaat cataccaaaa gatattgcgg gaaatgcagt

1740

ggctgaatct tctccattag aacataggga gagaattttg ttagcagttc gtagttatct

1800

tggagagaat attgaatgga ctaatgaaaa tgtaaattta actataaact atttaaataa

1860

cagattaaaa aaattataaa aaaattgaaa aaatggtgga aacacttttt tcaatttttt

1920

tgttttatta tttaatattt gggaaatatt cattctaata taacttcgta taatgtatgc

1980

tatacgaacg gtaggatcct ctagagtcga cctgcaggca ttttacattt ttagaaatgg

2040

gcgtgaaaaa aagcgcgcga ttatgtaaaa tataaagtga tagcggtacc attataggta

2100

agagaggaat gtacacatgt actatttaaa aaacacaaac ttttggatgt tcggtttatt

2160

ctttttcttt tactttttta tcatgggagc ctacttcccg tttttcccga tttggctaca

2220

tgacatcaac catatcagca aaagtgatac gggtattatt tttgccgcta tttctctgtt

2280

ctcgctatta ttccaaccgc tgtttggtct gctttctgac aaactcgggc tgcgcaaata

2340

cctgctgtgg attattaccg gcatgttagt gatgtttgcg ccgttcttta tttttatctt

2400

cgggccactg ttacaataca acattttagt aggatcgatt gttggtggta tttatctagg

2460

cttttgtttt aacgccggtg cgccagcagt agaggcattt attgagaaag tcagccgtcg

2520

cagtaatttc gaatttggtc gcgcgcggat gtttggctgt gttggctggg cgctgtgtgc

2580

ctcgattgtc ggcatcatgt tcaccatcaa taatcagttt gttttctggc tgggctctgg

2640

ctgtgcactc atcctcgccg ttttactctt tttcgccaaa acggatgcgc cctcttctgc

2700

cacggttgcc aatgcggtag gtgccaacca ttcggcattt agccttaagc tggcactgga

2760

actgttcaga cagccaaaac tgtggttttt gtcactgtat gttattggcg tttcctgcac

2820

ctacgatgtt tttgaccaac agtttgctaa tttctttact tcgttctttg ctaccggtga

2880

acagggtacg cgggtatttg gctacgtaac gacaatgggc gaattactta acgcctcgat

2940

tatgttcttt gcgccactga tcattaatcg catcggtggg aaaaacgccc tgctgctggc

3000

tggcactatt atgtctgtac gtattattgg ctcatcgttc gccacctcag cgctggaagt

3060

ggttattctg aaaacgctgc atatgtttga agtaccgttc ctgctggtgg gctgctttaa

3120

atatattacc agccagtttg aagtgcgttt ttcagcgacg atttatctgg tctgtttctg

3180

cttctttaag caactggcga tgatttttat gtctgtactg gcgggcaata tgtatgaaag

3240

catcggtttc cagggcgctt atctggtgct gggtctggtg gcgctgggct tcaccttaat

3300

ttccgtgttc acgcttagcg gccccggccc gctttccctg ctgcgtcgtc aggtgaatga

3360

agtcgcttaa gcaatcaatg tcggatgcca gcctggcttt gattacgtgc taaatggttt

3420

atataatgac tcgggcttaa gcggttctct tccccattga gggcaaggct agacgggact

3480

taccgaaaga aaccatcaat gatggtttct tttttgttca taaatcagac aaaacttttc

3540

tcttgcaaaa gtttgtgaag tgttgcacaa tataaatgtg aaatacttca caaacaaaaa

3600

gacatcaaag agaaacatac cctggaagga tgattaatga tgaacaaaca tgtaaataaa

3660

gtagctttaa tcggagcggg ttttgttgga agcagttatg catttgcgtt aattaaccaa

3720

ggaatcacag atgagcttgt ggtcattgat gtaaataaag aaaaagcaat gggcgatgtg

3780

atggatttaa accacggaaa ggcgtttgcg ccacaaccgg tcaaaacatc ttacggaaca

3840

tatgaagact gcaaggatgc tgatattgtc tgcatttgcg ccggagcaaa ccaaaaacct

3900

ggtgagacac gccttgaatt agtagaaaag aacttgaaga ttttcaaagg catcgttagt

3960

gaagtcatgg cgagcggatt tgacggcatt ttcttagtcg cgacaaatcc ggttgatatc

4020

ctgacttacg caacatggaa attcagcggc ctgccaaaag agcgggtgat tggaagcggc

4080

acaacacttg attctgcgag attccgtttc atgctgagcg aatactttgg cgcagcgcct

4140

caaaacgtac acgcgcatat tatcggagag cacggcgaca cagagcttcc tgtttggagc

4200

cacgcgaatg tcggcggtgt gccggtcagt gaactcgttg agaaaaacga tgcg

4254

<210> 5

<211> 10340

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> экспрессионная плазмида

<400> 5

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca

60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg

120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc

180

accatatgcc ttcaatcctt ttaataacaa ttatagcatc taatcttcaa caaactggcc

240

cgtttgttga actactcttt aataaaataa tttttccgtt cccaattcca cattgcaata

300

atagaaaatc catcttcatc ggctttttcg tcatcatctg tatgaatcaa atcgccttct

360

tctgtgtcat caaggtttaa ttttttatgt atttctttta acaaaccacc ataggagatt

420

aaccttttac ggtgtaaacc ttcctccaaa tcagacaaac gtttcaaatt cttttcttca

480

tcatcggtca taaaatccgt atcctttaca ggatattttg cagtttcgtc aattgccgat

540

tgtatatccg atttatattt atttttcggt cgaatcattt gaacttttac atttggatca

600

tagtctaatt tcattgcctt tttccaaaat tgaatccatt gtttttgatt cacgtagttt

660

tctgtattct taaaataagt tggttccaca cataccaata catgcatgtg ctgattataa

720

gaattatctt tattatttat tgtcacttcc gttgcacgca taaaaccaac aagattttta

780

ttaatttttt tatattgcat cattcggcga aatccttgag ccatatctga caaactctta

840

tttaattctt cgccatcata aacattttta actgttaatg tgagaaacaa ccaacgaact

900

gttggctttt gtttaataac ttcagcaaca accttttgtg actgaatgcc atgtttcatt

960

gctctcctcc agttgcacat tggacaaagc ctggatttac aaaaccacac tcgatacaac

1020

tttctttcgc ctgtttcacg attttgttta tactctaata tttcagcaca atcttttact

1080

ctttcagcct ttttaaattc aagaatatgc agaagttcaa agtaatcaac attagcgatt

1140

ttcttttctc tccatggtct cacttttcca ctttttgtct tgtccactaa aacccttgat

1200

ttttcatctg aataaatgct actattagga cacataatat taaaagaaac ccccatctat

1260

ttagttattt gtttagtcac ttataacttt aacagatggg gtttttctgt gcaaccaatt

1320

ttaagggttt tcaatacttt aaaacacata cataccaaca cttcaacgca cctttcagca

1380

actaaaataa aaatgacgtt atttctatat gtatcaagat aagaaagaac aagttcaaaa

1440

ccatcaaaaa aagacacctt ttcaggtgct ttttttattt tataaactca ttccctgatc

1500

tcgacttcgt tcttttttta cctctcggtt atgagttagt tcaaattcgt tctttttagg

1560

ttctaaatcg tgtttttctt ggaattgtgc tgttttatcc tttaccttgt ctacaaaccc

1620

cttaaaaacg tttttaaagg cttttaagcc gtctgtacgt tccttaagat tttacatttt

1680

tagaaatggg cgtgaaaaaa agcgcgcgat tatgtaaaat ataaagatta actaataagg

1740

aggacaaaca tgcaaaaact gctttctctg ccgtcaaatc ttgtccagtc ttttcatgaa

1800

cttgaaagag ttaaccgcac agattggttt tgcacatcag atccggttgg caaaaaactg

1860

ggctcaggcg gaggcacaag ctggttactg gaagaatgtt acaacgaata cagcgatgga

1920

gcgacatttg gcgaatggct ggaaaaagaa aaacgcattc tgttacatgc tggaggccaa

1980

agcagacgcc ttccgggata tgccccgtct ggcaaaatct taacaccggt cccggttttt

2040

agatgggaaa gaggacaaca tttaggccag aacctgctta gcttacaact gccgctttat

2100

gaaaaaatta tgtctctggc tccggataaa ctgcatacac tgattgcctc tggcgatgtg

2160

tatatccgca gcgaaaaacc gcttcagtct atcccggaag ctgatgttgt gtgctatgga

2220

ttatgggtcg atccgtctct ggcaacacat catggcgttt ttgcgtcaga tagaaaacat

2280

ccggaacaac tggattttat gctgcagaaa ccgtcacttg cagaattaga aagcctgtct

2340

aaaacacatt tatttctgat ggatattggc atctggttac tgtcagatag agcggtcgaa

2400

attctgatga aacgcagcca taaagaatca agcgaagaac ttaaatacta cgatctgtac

2460

tcagattttg gacttgcttt aggcacacat ccgcgcattg aagatgaaga agtgaataca

2520

cttagcgtcg caatcctgcc tcttccggga ggcgaatttt accattacgg aacatcaaaa

2580

gaactgattt cttcaacact tagcgttcaa aacaaagtgt atgatcagag acgcatcatg

2640

catagaaaag tgaaaccgaa tccggcaatg tttgtccaaa acgcggtcgt tcgcattccg

2700

ctttgcgctg aaaatgccga tttatggatt gaaaacagcc atatcggacc gaaatggaaa

2760

atcgcatcaa gacatattat cacaggcgtg ccggaaaatg attggtcact tgcagtcccg

2820

gcgggagtgt gtgtcgatgt ggtcccgatg ggagataaag gctttgttgc gagaccgtat

2880

ggattagatg atgtgtttaa aggcgatctg cgcgatagca aaacaacact tacaggcatt

2940

ccgtttggcg aatggatgtc taaaagagga ttatcataca cagatttaaa aggccgcaca

3000

gatgatctgc aggctgtttc agtgtttccg atggtgaaca gcgtcgaaga attaggcctg

3060

gtccttagat ggatgctttc tgaaccggaa ttagaagaag gaaaaaatat ttggctgcgc

3120

tctgaacatt tttcagcaga tgaaatctca gctggcgcca accttaaaag actgtacgcg

3180

caaagagaag aatttcgcaa aggaaattgg aaagcacttg cggttaacca tgaaaaatca

3240

gtgttttatc agctggatct ggcagatgca gcggaagatt ttgttcgcct tggcttagat

3300

atgccggaac ttttaccgga agatgctctg caaatgtcac gcattcataa tcgcatgctt

3360

agagcccgca tcctgaaact tgatggaaaa gattatagac cggaagaaca ggctgccttt

3420

gatctgctta gagatggatt actggatggc attagcaacc gcaaatctac accgaaactg

3480

gatgtctatt ctgatcaaat tgtttggggc agatcaccgg tgcgcatcga tatggcaggc

3540

ggctggacag atacaccgcc gtatagcctt tattctggag gcaatgttgt gaaccttgcg

3600

attgaattaa atggccaacc gccgcttcag gtctacgtta aaccgtgcaa agattttcat

3660

atcgttctga gatcaatcga tatgggagct atggaaatcg tgagcacatt tgatgaactg

3720

caagattaca agaaaattgg ctcaccgttt agcatcccga aagcagcgtt aagcctggcc

3780

ggatttgctc cggccttttc tgctgtcagc tatgcatcac tggaagaaca gcttaaagat

3840

tttggcgcag gaattgaagt tacactttta gctgccatcc cggcgggctc tggattaggc

3900

acaagctcta ttctggcttc aacagtgctt ggagccatca atgatttttg cggcctggca

3960

tgggataaaa acgaaatttg tcaaagaaca cttgtcttag aacagctgct tacaacaggc

4020

ggcggctggc aagatcagta tggcggagtc ctgcaaggag ttaaactgct gcagacagaa

4080

gctggctttg cccagtcacc gttagttcgc tggctgccgg atcatctttt tacacatccg

4140

gaatacaaag attgtcatct tttatactac acaggaatta caagaacagc aaaaggcatt

4200

ttagcggaaa tcgtgtcaag catgtttctg aatagctcac tgcatcttaa cctgcttagc

4260

gaaatgaaag cacatgcgct tgatatgaat gaagctattc aaagaggctc ttttgtcgaa

4320

tttggacgct tagttggcaa aacatgggaa cagaataaag ccctggatag cggaacaaac

4380

ccgccggcag tggaagcgat catcgatctg atcaaagatt acacactggg atacaaactg

4440

cctggagcag gcggcggcgg ctatctgtat atggttgcga aagatccgca agcagctgtg

4500

agaattagaa aaatcctgac agaaaatgct ccgaacccga gagcccgctt tgtggaaatg

4560

acactttcag ataaaggatt tcaggtctca agaagctaag ctcttaagga ggattttaga

4620

atgggttcta tcatcagact tcagggtggt ttaggcaatc aactgtttca atttagcttt

4680

ggttatgctc tttcaaaaat caatggcaca ccgctgtact ttgatatttc acattacgca

4740

gaaaacgatg atcatggcgg atatagactg aataaccttc aaatcccgga agaatatctt

4800

cagtactaca caccgaaaat caacaacatc tacaaactgc ttgtcagagg cagccgctta

4860

tatccggata tttttctgtt tcttggcttt tgcaacgaat ttcatgcgta tggctatgat

4920

tttgaataca tcgcgcaaaa atggaaaagc aaaaaataca tcggatactg gcagtctgaa

4980

catttctttc ataaacatat tctggatctg aaagaatttt tcatcccgaa aaacgttagc

5040

gaacaagcta acttactggc agcgaaaatc ttagaatctc agtcaagcct gtcaattcat

5100

atcagacgcg gcgattacat caaaaacaaa acagccacac tgacacatgg agtttgctct

5160

cttgaatact acaagaaagc actgaacaaa atcagagatt tagccatgat tcgcgatgtg

5220

tttatctttt ctgatgatat tttctggtgt aaagaaaaca tcgaaacact tctgagcaaa

5280

aaatacaaca tctactactc agaagattta agccaagaag aagatttatg gctgatgtct

5340

ctggctaatc atcatattat cgccaactct tcattttcat ggtggggcgc atatcttgga

5400

agctctgcga gccagattgt tatctatccg acaccgtggt atgatattac accgaaaaac

5460

acatacattc ctatcgtgaa ccattggatc aacgtggaca aacattcctc ctgctaaaaa

5520

ggaggaacta ctatgggcaa tacatcaatt caaacacaga gctatagagc agttgataaa

5580

gatgcgggac aaagccgctc ttatattatc ccgtttgcac tgctttgctc tctgtttttc

5640

ctgtgggctg tggccaataa cctgaatgat attttactgc cgcagtttca acaggcgttt

5700

acacttacaa actttcaagc tggattaatt cagagcgcct tttactttgg ctactttatc

5760

atcccgatcc cggctggaat ccttatgaaa aaactgtctt acaaagctgg aattatcaca

5820

ggcttatttc tgtatgcact gggagcagct ctgttttggc ctgctgccga aatcatgaat

5880

tatacactgt ttctggtcgg actgtttatt atcgcagcgg gactgggctg tcttgaaaca

5940

gctgccaacc cgtttgtcac agttcttgga ccggaatcaa gcggccattt tagactgaac

6000

cttgcacaaa catttaactc atttggagca atcatcgcgg ttgtgtttgg ccagagctta

6060

attctgtcta atgtcccgca tcaaagccag gatgttctgg ataaaatgtc tccggaacaa

6120

ctttcagcgt ataaacattc acttgtgtta agcgtccaga caccgtatat gattatcgtt

6180

gcaatcgtgc ttttagtcgc gctgcttatt atgttaacaa aatttccggc actgcaatct

6240

gataaccatt cagatgcgaa acagggctca tttagcgctt ctttatcaag actggccaga

6300

attagacatt ggcgctgggc tgtgttagcc caattttgct atgtcggagc acagacagcg

6360

tgttggtcat atctgatccg ctatgctgtc gaagaaattc cgggaatgac agccggcttt

6420

gcagcgaatt atcttacagg cacaatggtt tgctttttca tcggaagatt tacaggcaca

6480

tggttaattt ctcgctttgc accgcataaa gtgcttgctg cctatgcgtt aatcgcaatg

6540

gcgctgtgcc ttatttcagc ttttgccggc ggacatgtcg gccttattgc attaacactg

6600

tgtagcgcgt ttatgtctat ccaatacccg acaatcttta gcctgggaat taaaaacctt

6660

ggccaggata caaaatacgg atcttcattt atcgttatga caattatcgg cggaggcatt

6720

gttacaccgg tgatgggatt tgtgagcgat gcagcgggca atatcccgac agctgaatta

6780

attccggctc tgtgttttgc cgttatcttt atctttgcta gatttcgctc tcaaacagcc

6840

acaaactaat ctagagtcga cgtccaggca tcaaataaaa cgaaaggctc agtcgaaaga

6900

ctgggccttt cgttttatct gttgtttgtc ggtgaacgct ctctactaga gtcacactgg

6960

ctcaccttcg ggtgggcctt tctgcgttta tatacgcgtt aacccgggcc cgcggatgga

7020

tatgatcaga tcctttaact ctggcaaccc tcaaaattga atgagacatg ctacacctcc

7080

ggataataaa tatatataaa cgtatataga tttcataaag tctaacacac tagacttatt

7140

tacttcgtaa ttaagtcgtt aaaccgtgtg ctctacgacc aaaactataa aacctttaag

7200

aactttcttt ttttacaaga aaaaagaaat tagataaatc tctcatatct tttattcaat

7260

aatcgcatcc gattgcagta taaatttaac gatcactcat catgttcata tttatcagag

7320

ctcgtgctat aattatacta attttataag gaggaaaaaa tatgggcatt tttagtattt

7380

ttgtaatcag cacagttcat tatcaaccaa acaaaaaata agtggttata atgaatcgtt

7440

aataagcaaa attcatataa ccaaattaaa gagggttata atgaacgaga aaaatataaa

7500

acacagtcaa aactttatta cttcaaaaca taatatagat aaaataatga caaatataag

7560

attaaatgaa catgataata tctttgaaat cggctcagga aaaggccatt ttacccttga

7620

attagtaaag aggtgtaatt tcgtaactgc cattgaaata gaccataaat tatgcaaaac

7680

tacagaaaat aaacttgttg atcacgataa tttccaagtt ttaaacaagg atatattgca

7740

gtttaaattt cctaaaaacc aatcctataa aatatatggt aatatacctt ataacataag

7800

tacggatata atacgcaaaa ttgtttttga tagtatagct aatgagattt atttaatcgt

7860

ggaatacggg tttgctaaaa gattattaaa tacaaaacgc tcattggcat tacttttaat

7920

ggcagaagtt gatatttcta tattaagtat ggttccaaga gaatattttc atcctaaacc

7980

taaagtgaat agctcactta tcagattaag tagaaaaaaa tcaagaatat cacacaaaga

8040

taaacaaaag tataattatt tcgttatgaa atgggttaac aaagaataca agaaaatatt

8100

tacaaaaaat caatttaaca attccttaaa acatgcagga attgacgatt taaacaatat

8160

tagctttgaa caattcttat ctcttttcaa tagctataaa ttatttaata agtaagttaa

8220

gggatgcata aactgcatcc cttaacttgt ttttcgtgtg cctatttttt gtgaatcgat

8280

tcagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc

8340

ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc

8400

agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa

8460

catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt

8520

tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg

8580

gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg

8640

ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag

8700

cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc

8760

caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa

8820

ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg

8880

taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc

8940

taactacggc tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac

9000

cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg

9060

tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt

9120

gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt

9180

catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa

9240

atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga

9300

ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt

9360

gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg

9420

agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga

9480

gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga

9540

agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg

9600

catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc

9660

aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc

9720

gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca

9780

taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac

9840

caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg

9900

ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc

9960

ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg

10020

tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac

10080

aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat

10140

actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata

10200

catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa

10260

agtgccacct gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg

10320

tatcacgagg ccctttcgtc

10340

<---

Изобретение относится к биотехнологии. Предложена неспорообразующая клетка Bacillus subtilis для получения 2'-фукозиллактозы. При этом в указанной клетке нарушена споруляция в результате делеции или функциональной инактивации одного или более генов, 5 кодирующих Spo0A, сигма E и сигма F. Также указанная клетка содержит лактозопермеазу LacY E. coli и α-1,2-фукозилтрансферазу WbgL E. coli. Также клетка генетически сконструирована для экспрессии генов пути биосинтеза ГДФ-фукозы de novo, представляющих собой гены E. coli manA, E. coli manB, E. coli manC, E. coli gmd и E. coli wcaG; и причем указанная клетка Bacillus не обладает какой-либо β-галактозидазной активностью или обладает пониженной β-галактозидазной активностью по сравнению с клеткой-предшественником Bacillus дикого типа того же вида в результате делеции или функциональной инактивации ganA. Также предложены применение указанной клетки Bacillus для получения 2'-фукозиллактозы и способ получения 2'-фукозиллактозы с использованием указанной клетки Bacillus. Изобретение может быть использовано для эффективной продукции 2'-фукозиллактозы. 3 н. и 1 з.п. ф-лы, 1 табл., 5 пр.

1. Неспорообразующая клетка Bacillus subtilis для получения 2'-фукозиллактозы, где нарушена споруляция в результате делеции или функциональной инактивации одного или более генов, кодирующих Spo0A, сигма E и сигма F, причем указанная клетка генетически сконструирована, чтобы иметь лактозопермеазу, где лактозопермеаза представляет собой LacY E. coli, генетически сконструирована для экспрессии генов пути биосинтеза ГДФ-фукозы de novo, представляющих собой гены E. coli manA, E. coli manB, E. coli manC, E. coli gmd и E. coli wcaG; генетически сконструирована, чтобы иметь α-1,2-фукозилтрансферазу WbgL E. coli, и причем указанная клетка Bacillus не обладает какой-либо β-галактозидазной активностью или обладает пониженной β-галактозидазной активностью по сравнению с клеткой-предшественником Bacillus дикого типа того же вида в результате делеции или функциональной инактивации ganA.

2. Неспорообразующая клетка Bacillus subtilis по п. 1, где клетка Bacillus subtilis дополнительно генетически сконструирована в результате делеции или функциональной инактивации yesZ.

3. Применение клетки Bacillus по п. 1 или 2 для получения 2'-фукозиллактозы.

4. Способ получения 2'-фукозиллактозы, включающий:

- предоставление неспорообразующей клетки Bacillus, охарактеризованной в п. 1 или 2;

- культивирование указанной клетки Bacillus в среде, которая содержит лактозу, и в условиях, которые являются пермиссивными в отношении получения фукозилированного олигосахарида; и возможно

- извлечение 2'-фукозиллактозы из среды и/или клетки Bacillus.