ПРОДУКЦИЯ СИАЛИРОВАННЫХ ОЛИГОСАХАРИДОВ В КЛЕТКАХ BACILLUS Российский патент 2024 года по МПК A23L33/21 C07H1/08 C07H3/06 C12P19/18 C12P19/26 

Настоящее изобретение относится к области техники генной инженерии, в частности, к генной инженерии клеток Bacillus для получения сиалированных олигосахаридов в указанных клетках Bacillus, к ферментативной продукции сиалированных олигосахаридов с использованием указанных клеток Bacillus и к применению полученных таким образом сиалированных олигосахаридов.

Предшествующий уровень техники

Человеческое грудное молоко обеспечивает детей грудного возраста всеми питательными веществами, в которых они нуждаются для здорового роста и развития. Сахариды, которые присутствуют в человеческом грудном молоке, представляют собой его основной компонент, превосходя жиры и белки. Помимо лактозы, которая служит источником энергии, человеческое грудное молоко содержит молекулы более сложных сахаридов, а именно, олигосахаридов. На сегодняшний день в человеческом грудном молоке идентифицировано приблизительно 200 структурно отличающихся олигосахаридов. Данные олигосахариды обнаружены в значимых концентрациях только в человеческом молоке, и они суммарно известны как олигосахариды грудного молока (ОГМ). Указанные ОГМ основаны на дисахариде - лактозе (состоящей из группировки глюкозы (Glc) и группировки галактозы (Gal)) и несут дополнительные остатки моносахаридов, которые основаны на N-ацетил-глюкозамине (GlcNAc), фукозе (Fuc), сиаловой кислоте/N-ацетилнейраминовой кислоте (NeuNAc) и/или галактозе (Gal). Концентрация и состав ОГМ в человеческом грудном молоке варьирует среди индивидуумов и на протяжении периода лактации от вплоть до 20 г/л в молозиве до 5-10 г/л в зрелом молоке.

Значимое число ОГМ несет одну группировку NeuNAc. Среди данных сиалированных олигосахаридов грудного молока (СОГМ), 3'-сиалиллактоза, 6'-сиалиллактоза, сиалиллакто-N-тетраоза а, сиалиллакто-N-тетраоза b, сиалиллакто-N-тетраоза с и дисиалиллакто-N-тетраоза представляют собой наиболее распространенные члены в человеческом грудном молоке.

Сиаловые кислоты (Sia) представляют собой семейство отрицательно заряженных моносахаридов с каркасом из девяти атомов углерода. Более чем 50 форм данных α-кетокислот обнаружено в природе. Наиболее распространенной сиаловой кислотой, по-видимому, является N-ацетилнейраминовая кислота (NANA -от англ. N-acetylneuraminic acid, NeuNAc, Neu5Ac).

Сиаловые кислоты находятся в качестве концевых моносахаридных группировок гликанов, которые находятся в гликоконъюгатах (гликопротеины и гликолипиды) на поверхности клеток позвоночных и высших беспозвоночных. Сиаловые кислоты являются компонентами липополисахаридов и капсульных полисахаридов патогенных бактерий, включая Escherichia coli K1, Haemophilus influenzae, Haemophilus ducreyi, Pateurella multocida, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Campylobacter jejuni и Streptococcus agalactiae.

Наблюдали, что сиалированные ОГМ поддерживают устойчивость грудного ребенка к энтеропатогенным бактериям и вирусам. Что интересно, недавние исследования, кроме того, продемонстрировали защитное действие длинноцепочечных СОГМ в отношении некротического энтероколита, который является одним из наиболее распространенных и смертельных заболеваний у недоношенных новорожденных. Кроме того, показано, что сиалированные олигосахариды нейтрализуют энтеротоксины разных патогенных микробов, включая Escherichia coli, Vibrio cholerae и Salmonella. Кроме того, обнаружено, что сиалированные олигосахариды препятствуют колонизации кишечника Helicobacter pylori и, вследствие этого, предотвращают или ингибируют язвы желудка и двенадцатиперстной кишки. Кроме того, полагают, что сиалированные олигосахаирды поддерживают развитие головного мозга младенца и его когнитивные способности.

Благодаря известной пользе от ОГМ, главным образом сиалированных ОГМ, экономически целесообразный способ их получения является желательным, таким образом, чтобы данные сиалированные олигосахариды или по меньшей мере некоторые из данных сиалированных олигосахаридов стали доступными в качестве добавки к детским питательным смесям.

Ограниченная доступность грудного молока для целей, отличных от грудного вскармливания грудного ребенка, и сложности получения чистых фракций отдельных олигосахаридов грудного молока из природных источников привели к разработке химических путей их синтеза. Однако, и химический синтез, и биокаталитические подходы in-vitro оказались коммерчески нерациональными. Кроме того, в частности химический синтез олигосахаридов грудного молока включает применение нескольких вредных химических веществ, которые накладывают риск загрязнения конечного продукта.

В качестве альтернативы химическому и биокаталитическому синтезу in-vitro разработано ферментативное получение ОГМ. На сегодняшний день, рекомбинантные клетки Escherichia coli используют для микробной продукции некоторых ОГМ в промышленном масштабе.

Однако, род Escherichia coli включает патогенные члены, а также непатогенные члены. Несмотря на то, что для микробной продукции ОГМ используют непатогенные штаммы Е. coli, такие непатогенные Е. coli не считают безопасными для изготовления продуктов, которые предназначены для потребления человеком во множестве областей. Это мешает одобрению контролирующими органами ОГМ, изготавливаемых современными биотехнологическими способами, для потребления человеком в указанных областях. Таким образом, микробные клетки родов, которые расценивались бы как безопасные для потребления человеком или расценивались бы как безопасные при использовании в получении соединений для потребления человеком в таких областях, необходимы для изготовления сахаридов, которые предназначены для потребления человеком, например, олигосахаридов грудного молока, в частности, для потребления грудными детьми. Применение продуктивных штаммов, считающихся безопасными, уменьшает, по меньшей мере предположительно, проблемы в отношении вероятности рисков для здоровья человека, обусловленных сахаридом, и будет облегчать их одобрение контролирующими органами в большинстве областей.

Проблема решается посредством использования бактериальных клеток рода Bacillus для получения сиалированных олигосахаридов, в частности сиалированных ОГМ. Бактериальные клетки некоторых видов рода Bacillus уже расцениваются как безопасные для потребления человеком или для получения соединений/пищи для потребления человеком. Следовательно, предложены клетки Bacillus вида и/или штаммов, которые обычно расцениваются как безопасные для получения сиалированных олигосахаридов, в частности, для получения сиалированных олигосахаридов грудного молока.

Бактерии рода Bacillus являются грамположительными, палочковидными, образующими эндоспоры микробными клетками или аэробных, или факультативно анаэробных видов. Род Bacillus принадлежит к типу Фирмикуты. Геном членов рода Bacillus имеет тенденцию к парам оснований А-Т в своей частоте использования кодона. Виды Bacillus почти повсеместно распространены в природе. Например, они могут быть найдены в почве (В. subtilis), а также встречаются в экстремальных условиях окружающей среды, таких как высокий рН (В. alcalophilus), высокая температура (В. thermophilus) или высокое содержание солей (В, halodurans).

Род Bacillus включает 266 видов, имеющих название, которые включают свободноживущие виды, а также паразитарные патогенные виды. Два вида Bacillus считаются значимыми с медицинской точки зрения: В. anthracis, который вызывает сибирскую язву, и В. cereus, который вызывает пищевое отравление. Третий вид, В. thuringiensis, является важным патогеном насекомых, продуцирующим токсин, который может уничтожать насекомых. Таким образом, он используется в качестве инсектицида для борьбы с насекомыми-вредителями.

Из-за их статуса GRAS (от англ. generally recognized as safe - общепризнан безопасным), несколько видов Bacillus, например, В. amyloliquefaciens, В. licheniformis и B. subtilis, используются в биотехнологическом получении разных белков и соединений, используемых в пищевой и фармацевтической промышленности.

Bacillus amyloliquefaciens является источником рестриктазы BamHI и также синтезирует природный белок - антибиотик барназу. Кроме того, В. amyloliquefaciens продуцирует плантазолицин, антибиотик с селективной активностью в отношении В.anthracis. Альфа-амилаза из В. amyloliquefaciens часто используется в гидролизе крахмала. В. amyloliquefaciens также является источником субтилизина, который катализирует распад белков.

Bacillus amyloliquefaciens представляет собой бактерию-колонизатора корней, которая используется для того, чтобы бороться с некоторыми патогенами корней растений в сельском хозяйстве, водной культуре и гидропонике, поскольку она оказывает действие против бактериальных и грибковых патогенов и может предотвращать инфицирование в результате конкурентного исключения или вытеснения нежелательного патогена в конкурентной борьбе.

Ее высокая способность секретировать щелочную сериновую протеазу сделала B. licheniformis одной из наиболее важных бактерий в промышленном производстве фермента. Субтилизин Carlsberg, секретируемый В. licheniformis, используют в качестве протеазы для моющих средств, и он продается под торговым названием Alcalase®.

Bacillus subtilis представляет собой бактерию, позитивную в отношении каталазы, которая обнаружена в почве и желудочно-кишечном тракте жвачных животных и человека. В. subtilis и вещества, происходящие из данной бактерии, не содержащей эндотоксин, оценивались разными авторитетными органами в отношении их безопасности и пользы в применении в пищевой продукции. В Соединенных Штатах ферменты карбогидраза и протеаза из В. subtilis общепризнаны безопасными (GRAS) Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA - от англ. Food and Drug Administration). Bacillus subtilis также присвоен статус «квалифицированной презумпции безопасности» Европейским агентством по безопасности продуктов питания.

Кроме того, нетоксигенные и непатогенные штаммы В. subtilis обычно используются в пищевой промышленности. Например, ферментированные соевые бобы в виде натто часто потребляют в Японии, и они содержат вплоть до 10⁸ жизнеспособных клеток В. subtilis на грамм. Натто признают за их вклад в здоровую флору кишечника и поглощение витамина K₂. Продукт натто и В. subtilis var. natto в качестве его основного компонента представляют собой FOSHU (от англ. Foods for Specified Health Use - пищевые продукты, специально используемые для поддержания здоровья), одобренные министерством здравоохранения, труда и социальной защиты Японии как эффективные для сохранения здоровья.

С В. subtilis легко работать, она быстро растет, и условия культивирования являются простыми. Рекомбинантные штаммы В. subtilis используют в продукции полигидроксиалканолатов, гиалуроновой кислоты и разных ферментов, таких как амилаза и протеазы.

С природными изолятами В. subtilis дикого типа сложно работать, по сравнению с лабораторными штаммами, которые подвергались процессам одомашнивания на основе мутагенеза и селекции. Данные одомашненные штаммы часто обладают улучшенными способностями к развитию природной компетентности (поглощению и интеграции ДНК окружающей среды), улучшенными способностями к росту и потере способностей, необходимых «в дикой природе». В В. subtilis линейная ДНК, а также мультимерные формы плазмидной ДНК активно поглощаются природными компетентными клетками.

В определенных физиологических условиях маленькая субпопуляция клеток В. subtilis становится компетентной. В В. subtilis природная компетентность регулируется сложной регуляторной сетью. Ключевые регуляторы в данной сети представляют собой, среди прочих, мастер регулятор компетентности СоmK и транскрипционный мастер регулятор споруляции SpoOA. Эффективность трансформации клеток В. subtilis и возможно эффективность интеграции ДНК в их геном можно улучшать посредством генной инженерии. Это может быть достигнуто посредством эктопической интеграции экспрессионной кассеты, содержащей регулируемый промотор (например, промотор, индуцируемый маннитом ) и гены comK и comS, в геном В. subtilis. Дополнительно, данная стратегия обеспечивает трансформацию В. subtilis за счет природной компетентности с использованием сложной среды (например, LB).

Для продукции сиалированных олигосахаридов клетки Bacillus можно генетически конструировать разными способами.

Термин «генетически сконструированный», в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к модификации генетического состава клетки Bacillus с использованием методов молекулярной биологии. Модификация генетического состава клетки Bacillus может включать перенос генов в пределах и/или через видовые связи, вставку, удаление, замену и/или модификацию нуклеотидов, триплетов, генов, открытых рамок считывания, промоторов, энхансеров, терминаторов и других нуклеотидных последовательностей, опосредуя и/или контролируя экспрессию генов. Модификация генетического состава клетки Bacillus нацелена на создание генетически сконструированной клетки, обладающей конкретными, желательными свойствами. Генетически сконструированные клетки Bacillus могут содержать один или более генов, которые отсутствуют в нативной (не генетически сконструированной) форме клетки. Методики введения экзогенных молекул нуклеиновой кислоты и/или осуществления вставки экзогенных молекул нуклеиновой кислоты (рекомбинантных, гетерологичных) в наследуемую информацию клетки Bacillus для вставки, удаления или изменения нуклеотидной последовательности генетической информации клетки известны квалифицированному специалисту. Генетически сконструированные клетки Bacillus могут содержать один или более генов, которые находятся в нативной форме клетки, где указанные гены модифицированы и повторно введены в клетку Bacillus искусственными средствами. Термин «генетически сконструированный» также охватывает клетки Bacillus, которые содержат молекулу нуклеиновой кислоты, являющуюся эндогенной в отношении клетки, и которая модифицирована без удаления молекулы нуклеиновой кислоты из клетки. Такие модификации включают модификации, полученные в результате замены генов, сайт-специфичных мутаций, и родственные методики.

Интеграция гена и/или (одновременная) инактивация гена посредством нарушения или удаления может быть достигнута посредством гомологичной рекомбинации. Для эффективной гомологичной рекомбинации по меньшей мере 400-500 п. н. гомологичных плечей необходимы в В. subtilis.

Еще одним способом направленного конструирования генома является система CRISPR-Cas9. Данный быстрый и безмаркерный инструмент редактирования генома может быть использован для крупномасштабных геномных делеций, маленьких и больших вставок ДНК, сайленсинга генов посредством введения стоп-кодона, а также введения точечных мутаций. Никаких предварительных модификаций генома не требуется для «бесшовного» редактирования генома посредством CRISPR-Cas9.

Случайную хромосомную интеграцию генов и инсерционный мутагенез можно проводить, используя модифицированный транспозон mariner. Данная система не проявляет тенденцию к горячим точкам в В. subtilis, одновременно демонстрируя высокую эффективность в случайной эктопической интеграции.

Несмотря на то, что виды Bacillus используют для промышленного производства ферментов, на сегодняшний день клетки Bacillus не внедрялись для промышленного производства олигосахаридов, в частности промышленного производства сиалированных олигосахаридов.

В китайской патентной заявке CN 108410787 А раскрыты рекомбинантные клетки Bacillus subtilis, которые синтезируют лактил-N-неотетраозу. Указанные рекомбинантные клетки В. subtilis имеют ген лактозопермеазы, который интегрируют в геном клетки. Кроме того, указанная клетка Bacillus, которая несет плазмиду, содержащую ген β-1,3-N-глюкозаминтрансферазы и ген β-1,4-галактозилтрансферазы. Клетки В. subtilis можно культивировать в присутствии экзогенной лактозы и они синтезируют лактил-N-неотетраозу при титрах вплоть до примерно 1 г/л, что слишком мало для экономически целесообразного промышленного производства.

В китайской патентной заявке CN 109735479 А раскрыты рекомбинантные клетки Bacillus subtilis для осуществления синтеза 2'-фукозиллактозы, где уровень экспрессии фермента-транспортера лактозы повышен, и где клетка экспрессирует фукозокиназу, фосфатгуанинтрансферазу и фукозилтрансферазу. Сообщалось, что выход 2'-фукозиллактозы в ферментационной среде составлял от 0,424 г/л до 1,042 г/л.

Несмотря на то, что во множестве патентных заявок упоминается Bacillus в качестве рода, который, как считается, подходит для продукции нейтральных олигосахаридов, таких как лакто-N-неотетраоза или 2'-фукозиллактоза, никакого применения Bacillus для продукций сиалированных олигосахаридов, в частности сиалированных олигосахаридов грудного молока, еще не было реализовано, предположительно из-за значительных усилий в модификации метаболизма, которые требуются для реализации необходимых путей биосинтеза для продукции ОГМ в Bacillus. Тогда как указанная выше В. subtilis для продукции LNnT зависит от субстратов-доноров, которые встречаются в природе в клетках В. subtilis, продукция сиалированного олигосахарида в Bacillus требует реализации гетерологичного метаболического пути в клетке для обеспечения субстрата-донора, а именно СМР (от англ. Cytidine Monophosphatase - цитидинмонофосфат)-NeuNAc, который является крайне важным для синтеза сиалированных олигосахаридов.

Цель была достигнута посредством предоставления клетки Bacillus, в которой имеется лактозопермеаза для импортирования экзогенной лактозы в клетку, путь биосинтеза CMP-NeuNAc для внутриклеточного образования нуклеотид-активируемой сиаловой кислоты, а именно, цитидинмонофосфат-N-ацетилнейраминовой кислоты (CMP-NeuNAc), в качестве субстрата-донора для группировки сиаловой кислоты, и сиалилтрансфераза для переноса группировки сиаловой кислоты с CMP-NeuNAc на субстрат-акцептор. Культивация таких клеток Bacillus в присутствии экзогенной лактозы делает возможной продукцию желательного сиалированного олигосахарида.

Краткое изложение сущности изобретения

Согласно первому аспекту предложена неспорообразующая бактериальная клетка рода Bacillus для получения сиалированного олигосахарида, где в клетке Bacillus имеется лактозопермеаза, путь биосинтеза CMP-NeuNAc и сиалилтрансфераза.

Согласно второму аспекту предложено применение неспорообразующей бактериальной клетки рода Bacillus согласно первому аспекту для получения сиалированного олигосахарида.

Согласно третьему аспекту предложен способ получения сиалированного олигосахарида, включающий:

- предоставление неспорообразующей бактериальной клетки рода Bacillus, где в указанной клетке Bacillus имеется лактозопермеаза, путь биосинтеза CMP-NeuNAc и сиалилтрансфераза;

- культивирование клетки Bacillus в культуральной среде, содержащей лактозу, и в условиях, которые являются пермиссивными в отношении клетки Bacillus, с продукцией сиалированного олигосахарида, и

- возможно, извлечение сиалированного олигосахарида из культуральной среды и/или клетки Bacillus.

Согласно четвертому аспекту предложены сиалированные олигосахариды, которые были продуцированы клеткой Bacillus, в которой имеется лактозопермеаза, путь биосинтеза CMP-NeuNAc и сиалилтрансфераза.

Согласно пятому аспекту предложено применение сиалированного олигосахарида, который был продуцирован клеткой Bacillus, в которой имеется лактозопермеаза, путь биосинтеза CMP-NeuNAc и сиалилтрансфераза, для изготовления питательной композиции.

Согласно шестому аспекту предложены питательные композиции, содержащие по меньшей мере один сиалированный олигосахарид, который продуцирован клеткой Bacillus, в которой имеется лактозопермеаза, путь биосинтеза CMP-NeuNAc и сиалилтрансфераза.

Описание графических материалов

На фиг. 1 проиллюстрированы разные воплощения пути биосинтеза CMP-NeuNAc, который осуществляется в клетке Bacillus для получения сиалированного олигосахарида.

Подробное описание

Согласно первому аспекту предложена неспорообразующая бактериальная клетка рода Bacillus для получения сиалированного олигосахарида. Для того, чтобы иметь способность продуцировать сиалированный олигосахарид, клетка Bacillus должна предоставлять сиалилтрансферазе субстрат-донор, содержащий группировку сиаловой кислоты, и субстрат-акцептор, представляющий собой дисахарид или олигосахарид, таким образом, чтобы сиалилтрансфераза могла переносить группировку сиаловой кислоты от субстрата-донора на указанный субстрат-акцептор, с образованием, вследствие этого, сиалированного олигосахарида.

Следует понимать, что сиалированный олигосахарид, который предназначена продуцировать указанная клетка Bacillus, представляет собой целевой сиалированный олигосахарид, тогда как другие сиалированные олигосахариды, которые могут быть образованы за счет разнородности сиалилтрансферазы во время продукции желательного сиалированного олигосахарида в клетке Bacillus, считаются нежелательными сиалированными олигосахаридами или побочными продуктами.

Клетка Bacillus для получения сиалированного олигосахарида представляет собой неспорообразующую клетку Bacillus. Клетки Bacillus дикого типа могут образовывать споры. Считают, что споруляция, а именно, процесс образования спор, у бактерий представляет собой реакцию бактериальной клетки, которая инициирует программу развития, приводящую к образованию дочерних клеток отличной морфологии и направления развития. Споруляцию Bacillus исследовали как основную модель дифференцировки клеток. Во время споруляции палочковидная клетка Bacillus делится ассиметрично, что приводит, вследствие этого, к получению двух генетически идентичных клеток с разной морфологией и направлениями развития.

Однако, при промышленном получении не желательно, если бактериальный штамм - продуцент образует споры во время ферментативной продукции целевого продукта. Таким образом, предпочтительно использовать клетки Bacillus для получения сиалированных олигосахаридов, которые не способны образовывать споры. Такие клетки Bacillus называются «неспорообразующими».

В одном воплощении неспорообразующая клетка Bacillus для получения сиалированного олигосахарида происходила из одного из штаммов В. subtilis, перечисленных в Таблице 1.

В некоторых воплощениях клетка Bacillus генетически сконструирована так, чтобы стать неспорообразующей, например, посредством делеции или функциональной инактивации SpoOA. SpoOA представляет собой ДНК-связывающий белок, который влияет, напрямую или опосредовано, на экспрессию более чем 500 генов на протяжении ранней стадии споруляции. Подходящая функциональная инактивация SpoOA включает делецию участка фосфорилирования, где фосфотрансферазы SpoOF и SpoOB фосфорилируют SpoOA. Делеция или функциональная инактивация участка фосфорилирования фосфотрансферазы SpoOF и SpoOB приводит к функциональной инактивации SpoOA и, вследствие этого, нарушает способность клетки Bacillus образовывать споры. В качестве альтернативы, ген или нуклеотидная последовательность, кодирующая SpoOA, или часть гена или нуклеотидной последовательности, кодирующей SpoOA, могут быть удалены из генома клетки Bacillus.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении клетка Bacillus генетически сконструирована посредством делеции или функциональной инактивации гена(ов), кодирующего(их) фактор сигма SigE (sigE) и/или фактор сигма SigF (sigF). Факторы сигма SigE и SigF представляют собой транскрипционные факторы, которые участвуют в экспрессии генов, которые кодируют белки, которые участвуют в ранней фазе споруляции.

Делеция или функциональная инактивация SpoOA, SigE и/или SigF нарушает способность клетки Bacillus образовывать споры. Такая неспорообразующая клетка Bacillus может быть использована в качестве предшественника для образования клетки Bacillus, которая способна продуцировать сиалированный олигосахарид.

Клетки Bacillus дикого типа как не синтезируют лактозу внутриклеточно, так и не поглощают экзогенную лактозу. Однако, лактоза представляет собой субстрат-акцептор для группировки сиаловой кислоты посредством сиалилтрансферазы, акцептирующей лактозу, в образовании некоторых сиалированных олигосахаридов, таких как 3'-сиалилактоза (3-SL) или 6'-сиалилактоза (3-SL). Следовательно, для того, чтобы иметь способность продуцировать такие сиалированные олигосахариды, клетка Bacillus должна обладать способностью предоставления лактозы сиалилтрансферазе, акцептирующей лактозу, или посредством образования лактозы внутриклеточно и/или посредством поглощения лактозы извне. Корме того, лактоза обычно представляет собой дисахаридную группировку, которую несет большая часть, если не все, сиалированных ОГМ. Следовательно, поглощение лактозы также требуется для биосинтеза сиалированных ОГМ, отличных от трисахаридов, а именно, когда субстрат-акцептор для группировки NeuNAc представляет собой олигосахарид, а не дисахарид лактозу.

В одном воплощении в клетке Bacillus для продуцирования сиалированного олигосахарида имеется лактозопермеаза для поглощения экзогенной лактозы. Следовательно, клетка Bacillus может поглощать экзогенную лактозу. В качестве альтернативы, клетка Bacillus может быть генетически сконструирована для внутриклеточного синтеза лактозы из глюкозы и галактозы, таким образом, что не будет необходимым экзогенное поступление лактозы для получения сиалированного олигосахарида.

Термин «экзогенный» в отношении лактозы, в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к лактозе, которая не происходит из клетки Bacillus для получения сиалированного олигосахарида, а именно, являясь внутриклеточно синтезированной указанной клеткой Bacillus, а которая происходит вне указанной клетки Bacillus, и которую добавляют к культуральной среде, в которой выращивают клетку Bacillus для получения сиалированного олигосахарида.

В некоторых воплощениях клетка Bacillus генетически сконструирована для того, чтобы иметь способность поглощать экзогенную лактозу, а именно генетически сконструирована так, чтобы содержать лактозопермеазу. Таким образом, в клетке Bacillus для получения сиалированного олигосахарида имеется гетерологичная лактозопермеаза. Подходящая гетерологичная лактозопермеаза представляет собой LacY Е. coli или ее функциональный вариант.

Термин «гетерологичный», в том виде, в котором он используется в данном документе, в отношении белков, полипептидов, ферментов и транспортеров, а также в отношении молекул нуклеиновой кислоты, нуклеотидных последовательностей и/или генов, относится к молекуле, которая не является нативной в отношении вида клетки Bacillus, которая содержит указанную молекулу. Термин «ненативный» указывает на то, что указанная молекула отсутствует в клетке-предшественнике Bacillus, встречающейся в природе или дикого типа, а именно, в клетке Bacillus того же вида, который наиболее часто встречается в природе. Таким образом, «гетерологичная последовательность» или «гетерологичная нуклеиновая кислота» или «гетерологичный полипептид», в том виде, в котором он используется в данном документе, представляет собой последовательность или нуклеиновую кислоту или пептид, которые происходят из источника, являющегося чужеродным в отношении клетки Bacillus (например, из другого вида), или, если из того же источника, модифицированы по сравнению со своей исходной формой. Гетерологичная последовательность может быть стабильно введена, например, посредством трансфекции, трансформации, конъюгации или трансдукции, в геном микробной клетки-хозяина, таким образом, представляя генетически сконструированную клетку-хозяина. Можно применять методики, которые будут зависеть от клетки-хозяина, в которую должна быть введена последовательность. Разные методики известны специалисту в данной области, и например, раскрыты в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989). Соответственно, «гетерологичный полипептид» представляет собой полипептид, который в природе не встречается в клетке, и «гетерологичная сиалилтрансфераза» представляет собой сиалилтрансферазу, которая не встречается в природе в микробной клетке.

Термин «функциональный вариант», в том виде, в котором он используется в данном документе, в отношении ферментов и/или транспортных молекул, относится к белкам или полипептидам, обладающим такой же активностью (ферментативной, каталитической или транслоцирующей), что и референный фермент или молекула-транспортер, но который имеет аминокислотную последовательность, отличную от аминокислотной последовательности референсной молекулы фермента или транспортера. Таким образом, типичный вариант белка/полипептида отличается по аминокислотной последовательности от референсного белка/полипептида. Вариант и референсный белок/полипептид может отличаться по аминокислотной последовательности одной или более заменами, присоединениями и/или делециями в любой комбинации. Следовательно, термин «функциональный вариант» включает усеченные версии референсного белка/полипептида, которые обладают такой же активностью, как и референсный белок/полипептид. Замещенный или вставленный аминокислотный остаток может представлять собой или может не представлять собой аминокислотный остаток, кодируемый генетическим кодом. Вариант белка/полипептида может представлять собой встречающийся в природе, как например, аллельный вариант, или он может представлять собой вариант, который не известно, чтобы встречался в природе. Варианты белков/полипептидов, не встречающиеся в природе, могут быть созданы посредством методик мутагенеза, посредством прямого синтеза и посредством других методов генной инженерии, известных специалистам в данной области. В пределах объема настоящего раскрытия в термин «вариант» также включены белки и межвидовые гомологи, которые имеют аминокислотную последовательность, которая обладает более чем примерно 60%-ной идентичностью аминокислотных последовательностей, предпочтительно 65%-ной, 70%-ной, 75%-ной, 80%-ной, 85%-ной, 90%-ной, более предпочтительно 91%-ной, 92%-ной, 93%-ной, 94%-ной, 95%-ной, 96%-ной, 97%-ной, 98%-ной или 99%-ной или большей идентичностью аминокислотных последовательностей, предпочтительно, на протяжении области из по меньшей мере примерно 25, 50, 100, 200, 500, 1000 или более аминокислот, с референсным полипептидом.

Термин «такая же активность», в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к ферментативной, каталитической активности или активности транспортировки белка/полипептида лишь с точки зрения качества. Следовательно, «функциональный вариант» также включает варианты, которые обладают повышенной или пониженной активностью, по сравнению с активностью референсного белка/полипептида.

В разных воплощениях клетка Bacillus генетически сконструирована так, что содержит и экспрессирует нуклеотидную последовательность, которая кодирует лактозопермеазу, предпочтительно нуклеотидную последовательность, которая кодирует лактозопермеазу LacY E.coli (UniProtKB- Р02920) или ее функциональный вариант.

Лактозопермеаза LacY Е. coli кодируется областью, кодирующей белок (а именно, открытая рамка считывания) гена lacY Е. coli (номер доступа Gen Bank: NP_414877.1).

Следовательно, в некоторых воплощениях клетка Bacillus генетически сконструирована для того, чтобы содержать и экспрессировать нуклеотидную последовательность, кодирующую область, кодирующую белок LacY Е. coli.

В некоторых воплощениях частота использования кодона нуклеотидной последовательности, кодирующей гетерологичную лактозопермеазу, приспособлена к частоте использования кодона Bacillus. Частота использования кодона В. subtilis, например, необычна тем, что суммарное содержание GC ниже примерно 45%, содержание GC первой буквы данных кодонов выше примерно 51%, содержание CG второй буквы данных кодонов ниже примерно 36,1% и содержание CG третьей буквы данных кодонов ниже примерно 46%.

Для экспрессии лактозопермеазы клетка Bacillus содержит рекомбинантный ген лактозопермеазы, где нуклеотидная последовательность, которая кодирует лактозопермеазу, функционально связана с последовательностями контроля экспрессии, которые опосредуют экспрессию нуклеотидной последовательности, кодирующей лактозопермеазу.

Термин «функционально связанный», в том виде, в котором он используется в данном документе, будет означать функциональную связь между нуклеотидной последовательностью, которая кодирует полипептид или белок (обычно называемой «областью, кодирующей белок», «открытой рамкой считывания» и иногда даже «геном») и второй нуклеотидной последовательностью (последовательностью контроля экспрессии, такой как промотор, сигнальная последовательность или ряд сайтов связывания транскрипционных факторов), которая влияет на транскрипцию и/или трансляцию нуклеотидной последовательности, которая кодирует полипептид или белок. Соответственно, термин «промотор» обозначает последовательности дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), которые обычно «предшествуют» открытой рамке считывания в ДНК-полимере и обеспечивают сайт инициации транскрипции в мРНК. «Регуляторные» последовательности ДНК, также обычно расположенные «выше» (то есть, предшествуя) открытой рамки считывания в данном ДНК-полимере, связывают белки, которые определяют частоту (или скорость) инициации транскрипции. В совокупности называемые «промоторной/регуляторной» или «контрольной» ДНК-последовательностью, данные последовательности, которые предшествуют выбранной открытой рамке считывания (или серии открытых рамок считывания) в функциональном ДНК-полимере способствуют определению того, будет ли происходить транскрипция (и в конечном итоге экспрессия) открытой рамки считывания. Последовательности ДНК, которые «следуют за» геном в ДНК-полимере и обеспечивают сигнал для терминации транскрипции в мРНК, называются последовательностями, «терминирующими» транскрипцию.

Рекомбинантный ген лактозопермеазы может находиться, будучи интегрированным в хромосому Bacillus, или присутствовать в виде эписомальной версии на дополнительной плазмиде в клетке Bacillus.

Экспрессия гетерологичного гена лактозопермеазы в клетке Bacillus позволяет полученной клетке Bacillus поглощать извне поставляемую лактозу из культуральной среды. Поглощенная лактоза может затем служить субстратом-акцептором для группировки сиаловой кислоты, подлежащей переносу сиалилтрансферазой, акцептирующей лактозу (см. ниже в данном документе), например, в образовании 3'-SL или 6'-SL.

Для получения сиалированного олигосахарида Bacillus должна иметь способность предоставлять субстрат-донор для переноса группировки NeuNAc на субстрат-акцептор. Типичным субстратом-донором для группировки NeuNAc является CMP-NeuNAc. Следовательно, клетка Bacillus должна уметь внутриклеточно продуцировать CMP-NeuNAc для продукции сиалированных олигосахаридов. В случае внутриклеточного биосинтеза CMP-NeuNAc в клетке Bacillus имеется путь биосинтеза CMP-NeuNAc (Фиг. 1). Таким образом, клетка Bacillus генетически сконструирована так, чтобы иметь путь биосинтеза CMP-NeuNAc.

Путь биосинтеза CMP-NeuNAc включает путь утилизации NeuNAc или путь биосинтеза сиаловой кислоты для внутриклеточного биосинтеза de novo NeuNAc. Следовательно, в клетке Bacillus имеется путь биосинтеза CMP-NeuNAc, включающий путь утилизации NeuNAc и/или путь биосинтеза сиаловой кислоты.

Путь утилизации NeuNAc включает поглощение экзогенной сиаловой кислоты клеткой Bacillus и превращение поглощенной сиаловой кислоты в CMP-NeuNAc. Для поглощения экзогенной NeuNAc в клетке Bacillus имеется транспортер сиаловой кислоты. В некоторых воплощениях генетически сконструированная клетка Bacillus генетически сконструирована таким образом, чтобы имелся транспорт сиаловой кислоты для поглощения экзогенной NeuNAc. Подходящий транспортер сиаловой кислоты представляет собой NanT Е. coli (UniProtKB Р41036). NanT Е. coli катализирует протон-зависимый симпорт сиаловой кислоты. NanT может транспортировать NeuNAc, а также родственные сиаловые кислоты N-гликолилнейраминовую кислоту (NeuNGc) и 3-кето-3-дезокси-D-глицеро-D-галактононовую кислоту (KDN). В одном воплощении в генетически сконструированной клетке Bacillus имеется NanT Е. coli или его функциональный вариант.

В некоторых воплощениях клетка Bacillus генетически сконструирована таким образом, чтобы содержать и экспрессировать нуклеотидную последовательность, которая кодирует транспортер сиаловой кислоты для поглощения экзогенной NeuNAc, предпочтительно, нуклеотидную последовательность, которая кодирует NanT Е. coli или его функциональный вариант.

NanT Е. coli кодируется белок-кодирующей областью гена папТ Е. coli. Следовательно, в некоторых воплощениях клетка Bacillus генетически сконструирована таким образом, чтобы содержать и экспрессировать нуклеотидную последовательность, которая кодирует транспортер сиаловой кислоты NanT Е. coli или его функциональный вариант.

Для экспрессии транспортера сиаловой кислоты клетка Bacillus содержит рекомбинантный ген транспортера сиаловой кислоты, где нуклеотидная последовательность, которая кодирует транспортер сиаловой кислоты, функционально связана с последовательностями контроля экспрессии, которые опосредуют экспрессию нуклеотидной последовательности, кодирующей транспортер сиаловой кислоты.

Рекомбинантный ген транспортера сиаловой кислоты может присутствовать, будучи интегрированным в хромосому Bacillus, или присутствовать в виде эписомальной версии на дополнительной плазмиде в клетке Bacillus.

В одном из воплощений частота использования кодона нуклеотидной последовательности, кодирующей транспортер сиаловой кислоты, адаптирована к частоте использования кодона Bacillus.

В разных воплощениях путь биосинтеза CMP-NeuNAc включает путь биосинтеза сиаловой кислоты. Таким образом, в клетке Bacillus может иметься путь биосинтеза сиаловой кислоты для внутриклеточного биосинтеза N-ацетилнейраминовой кислоты. Путь биосинтеза сиаловой кислоты включает ферментативные активности глутамин:фруктозо-6-фосфатаминотрансферазы (Фиг. 1: ) и синтазы N-ацетилнейраминовой кислоты (тоже самое, что синтаза сиаловой кислоты) (Фиг. 1: ). Следовательно, в клетке Bacillus для получения сиалированного олигосахарида есть глутамин:фруктозо-6-фосфатаминотрансфераза и синтаза N-ацетилнейраминовой кислоты.

Фермент глутамин:фруктозо-6-фосфатаминотрансфераза (ЕС 2.6.1.16) катализирует превращение фруктозо-6-фосфата (Frc-6P) в глюкозамин-6-фосфат (GlcN-6P) с использованием глутамина (Фиг. 1: ). Обычно считается, что данная ферментативная реакция является первой стадией пути биосинтеза гексозамина. Альтернативными названиями глутамин:фруктозо-6-фосфатаминотрансферазы являются D-фруктозо-6-фосфатаминотрансфераза, GFAT, глюкозамин-6-фосфатсинтаза, гексозофосфатаминотрансфераза и L-глутамин-D-фруктозо-6-фосфатаминотрансфераза.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении в генетически сконструированной клетке Bacillus имеется глутамин:фруктозо-6-фосфатаминотрансфераза, предпочтительно, гетерологичная глутамин:фруктозо-6-фосфатаминотрансфераза. Пример подходящей гетерологичной глутамин:фруктозо-6-фосфатаминотрансферазы происходит из Е. coli. Глутамин:фруктозо-6-фосфатаминотрансфераза Е. coli (UniProtKB - Р17169) обозначается GlmS. Следовательно, в клетке Bacillus имеется GlmS Е. coli или функциональный вариант GlmS Е. coli. Предпочтительно, функциональный вариант GlmS Е. coli представляет собой версию, которая демонстрирует значимо уменьшенную чувствительность к ингибированию глюкозамин-6-фосфата, по сравнению с ферментом дикого типа. Пример функционального варианта GlmS Е. coli, который демонстрирует значимо уменьшенную чувствительность к ингибированию глюкозамин-6-фосфата. Примеры функциональных вариантов GlmS Е. coli, которые демонстрируют значимо уменьшенную чувствительность к ингибированию глюкозамин-6-фосфата, представляют собой GlmS*54 и GlmS*, как описано в международной заявке №РСТ/ЕР2019/063669 (включена в данный документ посредством ссылки).

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически сконструированная клетка Bacillus содержит молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, которая кодирует глутамин:фуктозо-6-фосфатаминотрансферазу, предпочтительно глутамин:фруктозо-6-фосфатаминотрансферазу GlmS Е. coli, или нуклеотидную последовательность, кодирующую функциональный вариант GlmS Е. coli, который демонстрировал значимо пониженную чувствительность в отношении ингибирования глюкозамин-6-фосфата, по сравнению с ферментом дикого типа.

Для экспрессии глутамин:фруктозо-6-фосфатаминотрансферазы клетка Bacillus содержит рекомбинантный ген глутамин:фруктозо-6-фосфатаминотрансферазы, где нуклеотидная последовательность, которая кодирует глутамин:фруктозо-6-фосфатаминотрансферазу, функционально связана с последовательностями контроля экспрессии, которые опосредуют экспрессию открытой рамки считывания глутамин:фруктозо-6-фосфатаминотрансферазы.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении частота использования кодона нуклеотидной последовательности, кодирующей гетерологичную глутамин:фруктозо-6-фосфатаминотрансферазу, адаптирована до частоты использования кодона Bacillus.

Рекомбинантный ген глутамин:фуктозо-6-фосфатаминотрансферазы может быть интегрирован в хромосому Bacillus или находиться в виде эписомальной версии на плазмиде в клетке Bacillus.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически сконструированная клетка Bacillus содержит синтазу сиаловой кислоты. Синтаза сиаловой кислоты катализирует конденсацию N-ацетилманнозамина (ManNAc) и фосфоенолпирувата (ФЕП) с N-ацетилнейраминовой кислотой (NeuNAc) (Фиг. 1: ). Ферментативное образование NeuNAc представляет собой последнюю стадию пути биосинтеза сиаловой кислоты.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически сконструированная клетка Bacillus содержит синтазу сиаловой кислоты или ее функциональный вариант, предпочтительно гетерологичную синтазу сиаловой кислоты. Примеры синтаз сиаловой кислоты известны из множества видов бактерий, таких как Campylobacter jejuni, Streptococcus agalactiae, Butyrivibrio proteoclasticus, Methanobrevibacter ruminatium, Acetobacterium woodii, Desulfobacula toluolica, Escherichia coli, Prevotella nigescens, Halorhabdus tiamatea, Desulfotignum phosphitoxidans или Candidatus Scalindua sp., Idomarina loihiensis, Fusobacterium nucleatum или Neisseria meningitidis. Примером подходящей синтазы сиаловой кислоты является синтаза N-ацетилнейраминовой кислоты NeuB С.jejuni, как кодируется геном пеиВ С.jejuni.

Таким образом, в дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически сконструированная клетка Bacillus содержит молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую и экспрессирующую нуклеотидную последовательность, которая кодирует синтазу N-ацетилнейраминовой кислоты. Следовательно, нуклеотидная последовательность, которая кодирует синтазу N-ацетилнейраминовой кислоты, функционально связана с по меньшей мере одной последовательностью контроля экспрессии нуклеиновой кислоты, влияющей на транскрипцию и/или трансляцию указанной нуклеотидной последовательности, которая кодирует синтазу N-ацетилнейраминовой кислоты в генетически сконструированной клетке Bacillus с обеспечением внутриклеточной активности синтазы N-ацетилнейраминовой кислоты.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении частота использования кодона нуклеотидной последовательности, кодирующей гетерологичную синтазу N-ацетилнейраминовой кислоты, адаптирована к частоте использования кодона Bacillus.

Рекомбинантный ген синтазы N-ацетилнейраминовой кислоты может быть интегрирован в хромосому Bacillus или находиться в виде эписомальной версии на плазмиде в клетке Bacillus.

В одном воплощении путь биосинтеза сиаловой кислоты включает уридиндифосфат-N-ацетилглюкозамин (УДФ-GlcNAc) в качестве промежуточного соединения. В клетке Bacillus, имеющей путь биосинтеза сиаловой кислоты, который включает УДФ-GlcNAc в качестве промежуточного соединения, дополнительно имеется фосфоглюкозаминмутаза (Фиг. 1: ), глюкозамин-1-фосфат N-ацетилтрансфераза (Фиг. 1: ), N-ацетилглюкозамин-1-фосфатуридилтрансфераза (Фиг. 1 ) и УДФ-N-ацетилглюкозамин 2-эпимераза (Фиг. 1: ).

Фосфоглюкозаминмутаза превращает глюкозамин-6-фосфат (GlcN-6P) в глюкозамин-1-фосфат (GlcN-1 Р).

В дополнительном и/или альтернативном воплощении клетка Bacillus генетически сконструирована таким образом, чтобы содержать фосфоглюкозаминмутазу. Подходящая фосфоглюкозаминмутаза представляет собой фосфоглюкозаминмутазу GlmM Е. coli или ее функциональный вариант.Указанная GlmM Е. coli кодируется геном glmM Е. coli.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении клетка Bacillus генетически сконструирована для того, чтобы в ней содержалась и экспрессировалась нуклеотидная последовательность, которая кодирует фосфоглюкозаминмутазу, предпочтительно, нуклеотидная последовательность, которая кодирует GlmM Е. coli или ее функциональный вариант.

Фосфоглюкозаминмутаза GlmM Е. coli кодируется белок-кодирующей областью гена glmM Е. coli. Следовательно, клетка Bacillus генетически сконструирована для содержания и экспрессии нуклеотидной последовательности, которая кодирует GlmM Е. coli.

Таким образом, в дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически сконструированная клетка Bacillus содержит молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую и экспрессирующую нуклеотидную последовательность, которая кодирует фосфоглюкозаминмутазу. Следовательно, нуклеотидная последовательность, которая кодирует фосфоглюкозаминмутазу, функционально связана с по меньшей мере одной последовательностью контроля экспрессии нуклеиновой кислоты, влияющей на транскрипцию и/или трансляцию указанной нуклеотидной последовательности, которая кодирует фосфоглюкозаминмутазу в генетически сконструированной клетке Bacillus с обеспечением внутриклеточной активности фосфоглюкозаминмутазы.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении частота использования кодона нуклеотидной последовательности, кодирующей гетерологичную фосфоглюкозаминмутазу, адаптирована к частоте использования кодона Bacillus.

Рекомбинантный ген фосфоглюкозаминмутазы может быть интегрирован в хромосому Bacillus или присутствовать в виде эписомальной версии на плазмиде в клетке Bacillus.

Глюкозамин-1-фосфат-N-ацетилтрансфераза катализирует перенос ацетильной группы с ацетил-коэнзима А на глюкозамин-1-фосфат (GlcN-1-P) с получением N-ацетилглюкозамин-1-фосфата (GlcNAc-1-P).

В дополнительном и/или альтернативном воплощении клетка Bacillus генетически сконструирована для того, чтобы содержать глюкозамин-1-фосфат-N-ацетилтрансферазу.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении клетка Bacillus генетически сконструирована для того, чтобы содержать и экспрессировать нуклеотидную последовательность, которая кодирует глюкозамин-1-фосфат-N-ацетилтрансферазу.

Таким образом, в дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически сконструированная клетка Bacillus содержит молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую и экспрессирующую нуклеотидную последовательность, которая кодирует глюкозамин-1-фосфат-N-ацетилтрансферазу. Следовательно, нуклеотидная последовательность, которая кодирует глюкозамин-1-фосфат-N-ацетилтрансферазу, функционально связана с по меньшей мере одной последовательностью контроля экспрессии нуклеиновой кислоты, влияющей на транскрипцию и/или трансляцию указанной нуклеотидной последовательности, которая кодирует глюкозамин-1-фосфат-N-ацетилтрансферазу в генетически сконструированной клетке Bacillus с обеспечением внутриклеточной активности глюкозамин-1-фосфат-N-ацетилтрансферазы.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении частота использования кодона нуклеотидной последовательности, кодирующей гетерологичную глюкозамин-1-фосфат-N-ацетилтрансферазу, адаптирована к частоте использования кодона Bacillus.

Рекомбинантный ген глюкозамин-1-фосфат-N-ацетилтрансферазы может быть интегрирован в хромосому Bacillus или присутствовать в виде эписомальной версии на плазмиде в клетке Bacillus.

N-ацетилглюкозамин-1-фосфатуридилтрансфераза превращает N-ацетилглюкозамин-1-фосфат (GlcNAc-1-P) в УДФ-GlcNAc посредством переноса уридин-5-монофосфата (с уридин 5-трифосфата).

В дополнительном и/или альтернативном воплощении клетка генетически сконструирована для того, чтобы иметь N-ацетилглюкозамин-1-фосфатуридилтрансферазу.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении клетка генетически сконструирована для того, чтобы содержать или экспрессировать нуклеотидную последовательность, которая кодирует N-ацетилглюкозамин-1-фосфатуридилтрансферазу.

Таким образом, в дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически сконструированная клетка Bacillus содержит молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую и экспрессирующую нуклеотидную последовательность, которая кодирует N-ацетилглюкозамин-1-фосфатуридилтрансферазу.

Следовательно, нуклеотидная последовательность, которая кодирует N-ацетилглюкозамин-1-фосфатуридилтрансферазу, функционально связана с по меньшей мере одной последовательностью контроля экспрессии нуклеиновой кислоты, влияющей на транскрипцию и/или трансляцию указанной нуклеотидной последовательности, которая кодирует N-ацетилглюкозамин-1-фосфатуридилтрансферазу в генетически сконструированной клетке Bacillus с обеспечением внутриклеточной активности N-ацетилглюкозамин-1-фосфатуридилтрансферазы.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении частота использования кодона нуклеотидной последовательности, кодирующей гетерологичную N-ацетилглюкозамин-1-фосфатуридилтрансферазу, адаптирована к частоте использования кодона Bacillus.

Рекомбинантный ген N-ацетилглюкозамин-1-фосфатуридилтрансферазы может быть интегрирован в хромосому Bacillus или присутствовать в виде эписомальной версии на плазмиде в клетке Bacillus.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении глюкозамин-1-фосфат-N-ацетилтрансферазная активность и N-ацетилглюкозамин-1-фосфатуридилтрансферазная активность обеспечиваются бифункциональным ферментом. Примером таких бифункциональных ферментов является GlmU Е. coli. GlmU Е. coli катализирует по меньшей мере две последовательные реакции, которые превращают глюкозамин-1-фосфат в УДФ-GlcNAc (Фиг. 1: ). С-концевой домен катализирует перенос ацетильной группы с ацетил-коэнзима А на глюкозамин-1-фосфат (GlcN-1-P) с получением N-ацетилглюкозамин-1-фосфата (GlcNAc-1-P), который превращается в УДФ-GlcNAc посредством переноса уридин-5-монофосфата (с уридин 5-трифосфата), реакция, катализируемая N-концевым доменом.

Такой бифункциональный фермент также известен из Bacillus subtilis и Haemophilus influenzae.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении клетка Bacillus генетически сконструирована для того, чтобы иметь гетерологичную бифункциональную глюкозамин-1-фосфат-N-ацетилтрансферазу/N-ацетилглюкозамин-1-фосфатуридилтрансферазу. Подходящим примером является GlmU Е. coli или ее функциональный вариант (включая GlmU Н. influenzae). Указанная GlmU Е. coli кодируется геном glmU Е. coli.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении клетка Bacillus генетически сконструирована для того, чтобы содержать и экспрессировать или сверхэкспрессировать нуклеотидную последовательность, которая кодирует указанный бифункциональный фермент, предпочтительно нуклеотидную последовательность, которая кодирует GlmU Е. coli или ее функциональный вариант.

Таким образом, в дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически сконструированная клетка Bacillus содержит молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую и экспрессирующую нуклеотидную последовательность, которая кодирует бифункциональную глюкозамин-1-фосфат-N-ацетилтрансферазу/N-ацетилглюкозамин-1-осфатуридилтрансферазу. Следовательно, нуклеотидная последовательность, которая кодирует бифункциональную глюкозамин-1-фосфат-N-ацетилтрансферазу/N-ацетилглюкозамин-1-фосфатуридилтрансферазу, функционально связана с по меньшей мере одной последовательностью контроля экспрессии нуклеиновой кислоты, влияющей на транскрипцию и/или трансляцию указанной нуклеотидной последовательности, которая кодирует бифункциональную глюкозамин-1-фосфат-N-ацетилтрансферазу/N-ацетилглюкозамин-1-фосфатуридилтрансферазу в генетически сконструированной клетке Bacillus с обеспечением внутриклеточной глюкозамин-1-фосфат-N-ацетилтрансферазной активности и N-ацетилглюкозамин-1-фосфатуридилтрансферазной активности.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении частота использования кодона нуклеотидной последовательности, кодирующей гетерологичную бифункциональную глюкозамин-1-фосфат-N-ацетилтрансферазу/N-ацетилглюкозамин-1-фосфатуридилтрансферазу, адаптирована к частоте использования кодона Bacillus.

Рекомбинантный ген бифункциональной глюкозамин-1-фосфат-N-ацетилтрансферазы/N-ацетилглюкозамин-1-фосфатуридилтрансферазы может быть интегрирован в хромосому Bacillus или присутствовать в виде эписомальной версии на плазмиде в клетке Bacillus.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении путь биосинтеза сиаловой кислоты включает превращение УДФ-GlcNAc в N-ацетилманнозамин (ManNAc). Данное превращение может быть катализировано УДФ-N-ацетилглюкозамин-2-эимеазой, которая не только превращает УДФ-N-ацетилглюкозамин в УДФ-N-ацетилманнозамин, но одновременно высвобождает УДФ (Фиг. 1: ).

Следовательно, клетка Bacillus содержит УДФ-N-ацетилглюкозамин-2-эпимеразу, которая одновременно высвобождает УДФ.

Подходящая УДФ-N-ацетилглюкозамин-2-эпимераза с сопутствующим высвобождением УДФ представляет собой УДФ-N-ацетилглюкозамин-2-эпимеразу NeuC Campylobacter jejuni, кодируемую геном пеиС С.jejuni.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении клетка Bacillus генетически сконструирована для того, чтобы иметь УДФ-N-ацетилглюкозамин-2-эпимеразу с сопутствующим высвобождением УДФ.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении клетка Bacillus генетически сконструирована для того, чтобы содержать и экспрессировать нуклеотидную последовательность, которая кодирует УДФ-N-ацетилглюкозамин-2-эпимеразу, которая одновременно высвобождает УДФ, предпочтительно чтобы содержать и экспрессировать нуклеотидную последовательность, которая кодирует NeuC С, jejuni или ее функциональный вариант.

УДФ-N-ацетилглюкозамин-2-эпимераза NeuC С.jejuni кодируется белок-кодирующей областью гена пеиС С.jejuni. Следовательно, клетка Bacillus генетически сконструирована для того, чтобы содержать и экспрессировать нуклеотидную последовательность, которая кодирует NeuC С.jejuni.

Таким образом, в дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически сконструированная клетка Bacillus содержит молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую и экспрессирующую нуклеотидную последовательность, которая кодирует УДФ-N-ацетилглюкозамин-2-эпимеразу с сопутствующим высвобождением УДФ во время ее ферментативной реакции с высвобождением ManNAc. Следовательно, нуклеотидная последовательность, которая кодирует УДФ-N-ацетилглюкозамин-2-эпимеразу, которая одновременно высвобождает УДФ, функционально связана с по меньшей мере одной последовательностью контроля экспрессии нуклеиновой кислоты, влияющей на транскрипцию и/или трансляцию указанной нуклеотидной последовательности, которая кодирует указанную УДФ-N-ацетилглюкозамин-2-эпимеразу в генетически сконструированной клетке Bacillus с обеспечением внутриклеточной активности УДФ-N-ацетилглюкозамин-2-эпимеразы.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении частота использования кодона нуклеотидной последовательности, кодирующей гетерологичную УДФ-N-ацетилглюкозамин-2-эпимеразу, адаптирована к частоте использования кодона Bacillus.

Рекомбинантный ген УДФ-N-ацетилглюкозамин-2-эпимеразы может быть интегрирован в хромосому Bacillus или присутствовать в виде эписомальной версии на плазмиде в клетке Bacillus.

В альтернативном воплощении в пути биосинтеза сиаловой кислоты используется N-ацетилглюкозамин-6-фосфат (GlcNAc-6-P) в качестве промежуточного соединения, но не используется УДФ-GlcNAc. В генетически сконструированной клетке Bacillus имеется путь биосинтеза сиаловой кислоты для внутриклеточного биосинтеза N-ацетилнейраминовой кислоты, в котором используется GlcNAc-6-P в качестве промежуточного соединения, имеется глюкозамин-6-фосфат-N-ацетилтрансфераза (Фиг. 1: ). В пути биосинтеза сиаловой кислоты, использующем глюкозамин-6-фосфат-N-ацетилтрансферазу для внутриклеточного биосинтеза N-ацетилнейраминовой кислоты, не используется УДФ-GlcNAc для биосинтеза сиаловой кислоты.

Путь биосинтеза сиаловой кислоты, использующий GlcNAc-6P, включает активности ферментов глутамин:фруктозо-6-фосфатаминотрансферазы (Фиг. 1: ) и синтазы N-ацетилнейраминовой кислоты (Фиг. 1: ). Указанный путь биосинтеза сиаловой кислоты дополнительно включает а) активности ферментов глюкозамин-6-фосфат-N-ацетилтрансферазы (Фиг. 1: ), N-ацетилглюкозамин-6-фосфатфосфатазы (Фиг. 1: ) и N-ацетилглюкозамин-2-эпимеразы (Фиг. 1: ) или b) активности ферментов глюкозамин-6-фосфат-N-ацетилтрансферазы (Фиг. 1: ), N-ацетилглюкозамин-6-фосфатэпимеразы (Фиг. 1: ) и N-ацетилманнозамин-6-фосфатфосфатазы (Фиг. 1: ). Таким образом, необязательно, чтобы генетически сконструированная клетка Bacillus обладала ферментативными активностями фосфоглюкозаминмутазы, N-ацетилглюкозамин-1-фосфатуридилтрансферазы и УДФ-N-ацетилглюкозамин 2-эпимеразы с сопутствующим высвобождением УДФ для внутриклеточного биосинтеза сиаловой кислоты. Таким образом, в дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически сконструированная клетка Bacillus, способная синтезировать сиаловую кислоту, не содержит одной или более активностей ферментов, выбранных из группы, состоящей из активностей ферментов фосфоглюкозаминмутазы, N-ацетилглюкозамин-1-фосфатуридилтрансферазы и УДФ N-ацетилглюкозамин-2-эпимеразы с сопутствующим высвобождением УДФ.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении в генетически сконструированной клетке Bacillus имеется глюкозамин-6-фосфат-N-ацетилтрансферазная активность. Указанная глюкозамин-6-фосфат-N-ацетилтрансферазная активность превращает GlcN-6P в N-ацетилглюкозамин-6-фосфат (GlcNAc-6P). Примером глюкозамин-6-фосфат-N-ацетилтрансферазы является Gna1 Saccharomyces cerevisiae (UniProtKB - P43577).

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически сконструированная клетка Bacillus содержит глюкозамин-6-фосфат N-ацетилтрансферазу, предпочтительно, гетерологичную глюкозамин-6-фосфат-N-ацетилтрансферазу, более предпочтительно Gna1 из S. cerevisiae или ее функциональный вариант.

Таким образом, в дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически сконструированная клетка Bacillus содержит молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую и экспрессирующую нуклеотидную последовательность, кодирующую глюкозамин-6-фосфат-N-ацетилтрансферазу, предпочтительно, Gna1 S. cerevisiae, где указанная нуклеотидная последовательность функционально связана с по меньшей мере одной последовательностью контроля экспрессии нуклеиновой кислоты, влияющей на транскрипцию и/или трансляцию указанной нуклеотидной последовательности в генетически сконструированной клетке Bacillus с обеспечением внутриклеточной активности глюкозамин-1-фосфат-N-ацетилтрансферазы.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении частота использования кодона нуклеотидной последовательности, кодирующей гетерологичную глюкозамин-6-фосфат-N-ацетилтрансферазу, адаптирована к частоте использования кодона Bacillus.

Рекомбинантный ген глюкозамин-6-фосфат-N-ацетилтрансферазы может быть интегрирован в хромосому Bacillus или находиться в виде эписомальной версии на плазмиде в клетке Bacillus.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении в генетически сконструированной клетке Bacillus имеется N-ацетилглюкозамин-6-фосфатфосфатазная активность. Указанная N-ацетилглюкозамин-6-фосфатфосфатазная активность превращает GlcNAc-6P в N-ацетилглюкозамин (GlcNAc). Примерами N-ацетилглюкозамин-6-фосфатфосфатазы являются сахарофосфатазы HAD-подобного суперсемейства, которые катализируют превращение GlcNAc6P в GlcNAc. HAD-подобное суперсемейство ферментов названо в честь бактериального фермента -дегидрогеназы галогенокислоты и включает фосфатазы. Подходящая фосфатаза HAD-подобного суперсемейства, катализирующего превращение GlcNAc6P в GlcNAc, может быть выбрана из группы, состоящей из фруктозо-1-фосфатфосфатазы (YqaB, UniProtKB - Р77475) и альфа-D-глюкозо-1-фосфатфосфатазы (YihX, UniProtKB - P0A8Y3). Считают, что ферменты YqaB Е. coli и YihX E.coli также действуют на GlcNAc6P (Lee, S.-W. and Oh, M.-K. (2015) Metabolic Engineering 28: 143-150).

В дополнительном и/или альтернативном воплощении сахарофосфатаза HAD-подобного суперсемейства, катализирующего превращение GlcNAc-6P в GlcNAc, представляет собой гетерологичный фермент в генетически сконструированной клетке Bacillus. В дополнительном и/или альтернативном воплощении сахарофосфатаза HAD-подобного суперсемейства, катализирующего превращение GlcNAc6P в GlcNAc, выбрана из группы, состоящей из YqaB Е. coli, YihX Е. coli и их функциональных вариантов.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически сконструированная клетка Bacillus содержит молекулу нуклеиновой кислоты, которая содержит и экспрессирует нуклеотидную последовательность, кодирующую сахарофосфатазу HAD-подобного суперсемейства, катализирующего превращение GlcNAc-6P в GlcNAc. В дополнительном и/или альтернативном воплощении нуклеотидная последовательность, кодирующая сахарофосфатазу HAD-подобного суперсемейства, катализирующего превращение GlcNAc-6P в GlcNAc, представляет собой гетерологичную нуклеотидную последовательность. В дополнительном и/или альтернативном воплощении нуклеотидная последовательность, кодирующая сахарофосфатазу HAD-подобного суперсемейства, катализирующего превращение GlcNAc-6P в GlcNAc, кодирует YqaB Е. coli или YihX Е. coli или функциональный вариант одного или двух данных ферментов.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении частота использования кодона нуклеотидной последовательности, кодирующей гетерологичную N-ацетилглюкозамин-6-фосфатфосфатазу, адаптирована к частоте использования кодона Bacillus.

Рекомбинантный ген N-ацетилглюкозамин-6-фосфатфосфатазы может быть интегрирован в хромосому Bacillus или находиться в виде эписомальной версии на плазмиде в клетке Bacillus.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически сконструированная клетка Bacillus обладает N-ацетилглюкозамин-2-эпимеразной активностью. N-ацетилглюкозамин-2-эпимераза (ЕС 5.1.3.8) представляет собой фермент, который катализирует превращение N-ацетилглюкозамина (GlcNAc) в N-ацетилманнозамин (ManNAc). Фермент представляет собой рацемазу, оказывающую действие на углеводы и их производные. Систематическое название данного класса ферментов представляет собой N-ацил-D-глюкозамин 2-эпимеразу. Данный фермент участвует в метаболизме аминосахаров и метаболизме нуклеотидных Сахаров, предпочтительно гетерологичная N-ацетилглюкозамин 2-эпимераза.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически сконструированная клетка Bacillus содержит N-ацетилглюкозамин-2-эпимеразу, предпочтительно гетерологичную N-ацетилглюкозамин-2-эпимеразу. Примеры N-ацетилглюкозамин-2-эпимераз описаны у Anabena variabilis, Acaryochloris sp., Nostoc sp., Nostoc punctiforme, Bacteroides ovatus или Synechocystis sp.Пример подходящей N-ацетилглюкозамин 2-эпимеразы представляет собой N-цетилглюкозамин 2-эпимеразу В. ovatus АТСС 8483 (UniProtKB - A7LVG6), как кодируется геном BACOVA_01816. Еще одним примером является N-ацетилглюкозамин 2-эпимераза Synechocystis sp.(штамм РСС 6803) (UniProtKB - Р74124), которая также известна, как ренин-связывающий белок и кодируется геном slr1975.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически сконструированная клетка Bacillus содержит молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, которая кодирует N-ацетилглюкозамин 2-эимеразу, предпочтительно, N-ацетилглюкозамин-2-эпимеразу В. ovatus АТСС 8483 или Synechocystis sp.(штамм РСС 6803) или ее функциональный вариант.

Следовательно, нуклеотидная последовательность, которая кодирует N-ацетилглюкозамин-2-эпимеразу, функционально связана с по меньшей мере одной последовательностью контроля экспрессии нуклеиновой кислоты, влияющей на транскрипцию и/или трансляцию указанной нуклеотидной последовательности, которая кодирует N-ацетилглюкозамин-2-эпимеразу в генетически сконструированной клетке Bacillus с обеспечением внутриклеточной активности N-ацетилглюкозамин-2-эпимеразы.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении частота использования кодона нуклеотидной последовательности, кодирующей гетерологичную N-ацетилглюкозамин-2-эпимеразу, адаптирована к частоте использования кодона Bacillus.

Рекомбинантный ген N-ацетилглюкозамин-2-эпимеразы может быть интегрирован в хромосому Bacillus или находиться в виде эписомальной версии на плазмиде в клетке Bacillus.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении в генетически сконструированной клетке Bacillus имеется N-ацетилглюкозамин-6-фосфатэпимеразная активность и N-ацетилманнозамин-6-фосфатфосфатазная активность. N-ацетилглюкозамин-6-фосфатэпимераза превращает N-ацетилглюкозамин-6-фосфат (GlcNAc-6P) в N-ацетилмоннозамин-6-фосфат (ManNAc-6P), тогда как N-ацетилманнозамин-6-фосфатфосфатаза дефосфорилирует ManNAc-6P с получением N-ацетилмоннозамина (ManNAc). Обладание N-ацетилглюкозамин-6-фосфатэпимеразная активность и N-ацетилглюкозамин-6-фосфатфосфатазная активность обеспечивает дополнительный или альтернативный путь для обеспечения ManNAc для продукции Neu5Ac.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически сконструированная клетка Bacillus содержит N-ацетилглюкозамин-6-фосфатэпимеразу. Примером подходящей N-ацетилглюкозамин-6-фосфатэпимеразы является NanE Е. coli (UniprotKB Р0А761), как кодируется геном папЕ Е. coli.

Таким образом, в дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически сконструированная клетка Bacillus содержит молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую и экспрессирующую нуклеотидную последовательность, кодирующую N-ацетилглюкозамин-6-фосфатэпимеразу, предпочтительно нуклеотидную последовательность, кодирующую NanE E.coli или ее функциональный вариант.

Таким образом, в дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически сконструированная клетка Bacillus содержит молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую и экспрессирующую нуклеотидную последовательность, кодирующую N-ацетилглюкозамин-6-фосфатэпимеразу, где указанная нуклеотидная последовательность функционально связана с по меньшей мере одной последовательностью контроля экспрессии нуклеиновой кислоты, влияющей на транскрипцию и/или трансляцию указанной нуклеотидной последовательности в генетически сконструированной микробной клетке с обеспечением внутриклеточной активности N-ацетилглюкозамин-2-фосфатэпимеразы.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении частота использования кодона нуклеотидной последовательности, кодирующей гетерологичную N-ацетилглюкозамин-6-фосфатэпимеразу, адаптирована к частоте использования кодона Bacillus.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически сконструированная клетка Bacillus содержит N-ацетилглюкозамин-6-фосфатфосфатазу, которая превращает ManNAc-6P в ManNAc.

Таким образом, в дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически сконструированная клетка Bacillus содержит молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую и экспрессирующую нуклеотидную последовательность, кодирующую N-ацетилманнозамин-6-фосфатфосфатазу. Следовательно, нуклеотидная последовательность, которая кодирует N-ацетилгманнозамин-6-фосфатфосфатазу, функционально связана с по меньшей мере одной последовательностью контроля экспрессии нуклеиновой кислоты, влияющей на транскрипцию и/или трансляцию указанной нуклеотидной последовательности, которая кодирует N-ацетилглюкозамин-6-фосфатфосфатазу, в генетически сконструированной клетке Bacillus с обеспечением внутриклеточной активности N-ацетилглюкозамин-6-фосфатфосфатазы.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении частота использования кодона нуклеотидной последовательности, кодирующей гетерологичную N-ацетилглюкозамин-6-фосфатфосфатазу, адаптирована к частоте использования кодона Bacillus.

Рекомбинантный ген N-ацетилманнозамин-6-фосфатфосфатазы может быть интегрирован в хромосому Bacillus или находиться в виде эписомальной версии на плазмиде в клетке Bacillus.

В генетически сконструированной клетке Bacillus имеется активность синтетазы цитидин-5'-монофосфо-(СМР)-N-ацетилнейраминовой кислоты (Фиг. 1: ) для переноса цитидин-5'-монофосфата на N-ацетилнейраминовую кислоту с образованием СМР-активированной N-ацетилнейраминовой кислоты (CMP-NeuNAc). Несколько синтетаз 5'-монофосфо-(СМР)-сиаловой кислоты известны в данной области и описаны, например, синтетазы 5'-монофосфо-(СМР)-сиаловой кислоты из Е. coli, Neisseria meningitidis, Campylobacter jejuni, Streptococcus sp.и т.д.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически сконструированная клетка Bacillus содержит синтетазу цитидин-5'-монофосфо-(СМР)-N-ацетилнейраминовой кислоты, предпочтительно, гетерологичную синтетазу цитидин-5'-монофосфо-(СМР)-N-ацетилнейраминовой кислоты, более предпочтительно N-ацетилнейраминатцитидилтрансферазу NeuA из С.jejuni. NeuA С.jejuni кодируется геном neuA С. jejuni.

Таким образом, в дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически сконструированная клетка Bacillus содержит молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую и экспрессирующую нуклеотидную последовательность, кодирующую синтетазу цитидин-5'-монофосфо-(СМР)-N-ацетилнейраминовой кислоты, где указанная нуклеотидная последовательность функционально связана с по меньшей мере одной последовательностью контроля экспрессии нуклеиновой кислоты, влияющей на транскрипцию и/или трансляцию указанной нуклеотидной последовательности в генетически сконструированной микробной клетке с обеспечением активности N-ацетилнейраминатцитидилтрансферазы.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении частота использования кодона нуклеотидной последовательности, кодирующей гетерологичную синтетазу цитидин-5'-монофосфо-(СМР)-N-ацетилнейраминовой кислоты, адаптирована к частоте использования кодона Bacillus.

Рекомбинантный ген синтетазы цитидин-5'-монофосфо-(СМР)-N-ацетилнейраминовой кислоты может быть интегрирован в хромосому Bacillus или находиться в виде эписомальной версии на плазмиде в клетке Bacillus.

В генетически сконструированной клетке Bacillus имеется сиалилтрансфераза, предпочтительно гетерологичная сиалилтрансфераза и более предпочтительно сиалилтрансферазная активность, выбранная из группы, состоящей из α-2,3-сиалилтрансферазной активности, α-2,6-сиалилтрансферазной активности и/или α-2,8-сиалилтрансферазной активности. Сиалилтрансферазная активность может переносить группировку N-ацетилнейраминовой кислоты с CMP-NeuNAc на акцепторную молекулу, где указанная акцепторная молекула представляет собой молекулу сахарида, с получением сиалированного сахарида.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически сконструированная микробная клетка содержит по меньшей мере одну сиалилтрансферазу, предпочтительно по меньшей мере одну гетерологичную сиалилтрансферазу, где указанная сиалилтрансфераза может обладать α-2,3-сиалилтрансферазной активностью и/или α-2,6-сиалилтрансферазной активностью и/или α-2,8-сиалилтрансферазной активностью для переноса группировки NeuNAc с CMP-NeuNAc в качестве субстрата-донора на акцепторный сахарид. Иллюстративные сиалилтрансферазы и их гены идентифицированы в Таблице 2.

Термин «сиалилтрансфераза», в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к полипептидам, способным обладать сиалилтрансферазной активностью. «Сиалилтрансферазная активность» относится к переносу остатка сиаловой кислоты, предпочтительно остатка N-ацетилнейраминовой кислоты (Neu5Ac), с субстрата-донора на акцепторную молекулу. Термин «сиалилтрансфераза» включает функциональные фрагменты сиалилтрансфераз, описанных в данном документе, функциональные варианты сиалилтрансфераз, описанных в данном документе, и функциональные фрагменты функциональных вариантов. «Функциональный» в данном отношении означает, что фрагменты и/или варианты могут обладать сиалилтрансферазной активностью. Функциональные фрагменты сиалилтрансферазы охватывают усеченные версии сиалилтрансферазы, как кодируется их геном, встречающимся в природе, усеченная версия которого может обладать сиалилтрансферазной активностью. Примерами усеченных версий являются сиалилтрансферазы, которые не содержат так называемой лидерной последовательности, которая обычно направляет полипептид к конкретной внутриклеточной локализации. Обычно такие лидерные последовательности удаляют из полипептида во время его внутриклеточного транспорта, и они также отсутствуют в зрелой сиалилтрансферазе, встречающейся в природе.

Гетерологичная сиалилтрансфераза может переносить остаток сиаловой кислоты с субстрата-донора на молекулу-акцептор. Термин «может» в отношении гетерологичной сиалилтрансферазы относится к сиалилтрансферазной активности гетерологичной сиалилтрансферазы и условию, что подходящие условия реакции требуются для гетерологичной сиалилтрансферазы для обладания ее ферментативной активностью. В отсутствии подходящих условий реакции гетерологичная сиалилтрансфераза не обладает своей ферментативной активностью, но сохраняет свою ферментативную активность и обладает своей ферментативной активностью, когда восстанавливают подходящие условия реакции. Подходящие условия реакции включают наличие подходящего субстрата-донора, наличие подходящих молекул-акцепторов, наличие существенных кофакторов, таких как, например, одновалентные или двухвалентные ионы, значение рН в соответствующем диапазоне, подходящую температуру и тому подобное. Не обязательно, чтобы оптимальные значения для каждого фактора, влияющего на ферментативную реакцию гетерологичной сиалилтрансферазы, были удовлетворены, но условия реакции должны быть такими, чтобы гетерологичная сиалилтрансфераза осуществляла свою ферментативную активность. Соответственно, термин «может» исключает любые условия, при которых ферментативная активность гетерологичной сиалилтрансферазы необратимо нарушена, и также исключено воздействие на гетерологичную сиалилтрансферазу любого такого условия. Напротив, термин «может» означает, что сиалилтрансфераза является ферментативно активной, а именно, обладает своей сиалилтрансферазной активностью, если пермиссивные условия реакции (где все требования, являющиеся необходимыми для того, чтобы сиалилтрансфераза реализовывала свою ферментативную активность) предоставлены сиалилтрансферазе.

Сиалилтрансферазы можно различить по типу связи с сахаром, которую они образуют. В том виде, в котором они используются в данном документе, термины «α-2,3-сиалилтрансфераза» и «α-2,3-сиалилтрансферазная активность» относятся к полипептидам и их ферментативной активности, которые добавляют остаток сиаловой кислоты с α-2,3-связью к галактозе, N-ацетилгалактозамину или галактозе или остатку N-ацетилгалактозамина акцепторной молекулы. Аналогично, термины «α-2,6-сиалилтрансфераза» и «α-2,6-сиалилтрансферазная активность» относятся к полипептидам и их ферментативной активности, которые добавляют остаток сиаловой кислоты с α-2,6-связью к галактозе, N-ацетилгалактозамину или галактозе или остатку N-ацетилгалактозамина акцепторной молекулы. Аналогично, термины «α-2,8-сиалилтрансфераза» и «α-2,8-сиалилтрансферазная активность» относятся к полипептидам и их ферментативной активности, которые добавляют остаток сиаловой кислоты с α-2,8-связью к галактозе, N-ацетилгалактозамину или галактозе или остатку N-ацетилгалактозамина акцепторной молекулы.

Кроме того, генетически сконструированная клетка Bacillus генетически сконструирована для того, чтобы содержать и экспрессировать нуклеотидную последовательность, кодирующую гетерологичную сиалилтрансферазу. С этой целью нуклеотидная последовательность, кодирующая гетерологичную сиалилтрансферазу, функционально связана с по меньшей мере одной последовательностью контроля экспрессии, влияющей на транскрипцию и/или трансляцию указанной нуклеотидной последовательности, кодирующей гетерологичную сиалилтрансферазу, в генетически сконструированной клетке Bacillus с получением внутриклеточной сиалилтрансферазной активности.

В еще одном воплощении гетерологичная сиалилтрансфераза может обладать α-2,6-сиалилтрансферазной активностью.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении в генетически сконструированной клетке Bacillus содержится и экспрессируется молекула нуклеиновой кислоты, которая содержит по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, кодирующую указанную гетерологичную сиалилтрансферазу, способную обладать α-2,6-сиалилтрансферазной активностью.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении гетерологичная сиалилтрансфераза может обладать α-2,8-сиалилтрансферазной активностью. Примером гетерологичной сиалилтрансферазы, которая способна обладать α-2,8-сиалилтрансферазной активностью, является сиалилтрансфераза Cstll OH4384Campylobacter jejuni.

Сиалилтрансфераза может переносить остаток сиаловой кислоты, например, остаток N-ацетилнейраминовой кислоты (Neu5Ac), от субстрата-донора, например, CMP-Neu5Ac, на акцепторную молекулу. Акцепторная молекула представляет собой молекулу сахарида, предпочтительно молекулу сахарида, изложенную в Таблице 3.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении в генетически сконструированной микробной клетке Bacillus содержится молекула нуклеиновой кислоты, которая содержит и экспрессирует по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, кодирующую указанную гетерологичную сиалилтрансферазу, способную обладать α-2,3-сиалилтрансферазной активностью.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении акцепторная молекула представляет собой моносахарид, предпочтительно моносахарид, выбранный из группы, состоящей из N-ацетилглюкозамина, галактозы и N-ацетилгалактозамина.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении акцепторная молекула представляет собой дисахарид, предпочтительно дисахарид, выбранный из группы, состоящей из лактозы, лактулозы, N-ацетиллактозамина, лакто-N-биозы, лактулозы и мелибиозы.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении акцепторная молекула представляет собой трисахарид, предпочтительно трисахарид, выбранный из группы, состоящей из рафинозы, лакто-N-триозы II, 2'-фукозиллактозы, 3-фукозиллактозы, 3'-сиалиллактозы, 6'-сиалиллактозы, 3'-сиалил-N-

ацетиллактозамина, 6'-сиалил-N-ацетиллактозамина, 3'-галактозиллактозы и 6'-галактозиллактозы.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении акцепторная молекула представляет собой тетрасахарид, предпочтительно тетрасахарид, выбранный из группы, состоящей из лакто-N-тетраозы, лакто-N-неотетраозы, 2'3-дифукозиллактозы, 3-фукозил-3'-сиалиллактозы и 3-фукозил-6'-сиалиллактозы.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении акцепторная молекула представляет собой пентасахарид, предпочтительно пентасахарид, выбранный из группы, состоящей из сиалиллакто-N-тетраозы а, сиалиллакто-N-тетраозы b, сиалиллакто-N-тетраозы с, лакто-N-фукопентаозы I, лакто-N-фукопентаозы II, лакто-N-фукопентаозы III, лакто-N-фукопентаозы V, лакто-N-неофукопентаозы I и лакто-N-неофукопентаозы V.

Следует понимать, что клетка Bacillus, уже несущая один или более генов, кодирующих указанные ферменты образом, достаточным для продукции NeuNAc, CMP-NeuNAc и/или сиалированного сахарида, не нуждается в генетической модификации для совершения биосинтеза сиаловой кислоты и для переноса группировки сиаловой кислоты на акцептор-сахарид, но, тем не менее, может быть генетически сконструирована для изменения уровня экспрессии одного или более из указанных генов для повышения внутриклеточного уровня продуктов указанного одного или более генов, таких как, например, количество глутамин:фруктозо-6-фосфатаминотрансфеаза, глюкозамин-6-фосфат N-ацетилтрансфераза, N-ацетилглюкозамин-6-фосфатфосфатаза, N-ацетилглюкозамин 2-эпимераза и/или синтетаза N-ацетилнейраминовой кислоты, с повышением, таким образом, скорости биосинтеза Neu5Ac, и, как следствие, сиалированного сахарида, в генетически сконструированной клетке.

В некоторых воплощениях клетка Bacillus предназначена для применения в получении 3'-SL и генетически сконструирована для того, чтобы иметь лактозопермеазу, путь биосинтеза CMP-NeuNAc, в котором используется GlcN-1P в качестве промежуточного соединения, и α-2,3-сиалилтрансферазу.

В разных воплощениях клетка Bacillus предназначена для применения в получении 6'-SL и генетически сконструирована для того, чтобы иметь лактозопермеазу, путь биосинтеза CMP-NeuNAc, в котором используется GlcN-1P в качестве промежуточного соединения, и α-2,6-сиалилтрансферазу.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически сконструированная микробная клетка Bacillus синтезирует больше ФЕП, чем клетка дикого типа. В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически сконструированная микробная клетка генетически сконструирована для того, чтобы имелся усиленный путь биосинтеза ФЕП. Предпочтительно, генетически сконструированная микробная клетка генетически сконструирована для обладания повышенной активностью синтазы фосфоенолпирувата, например, в том, что ген ppsA, кодирующий фосфоенолпируватсинтазу, сверхэкспрессируется, и/или в том, что микроорганизмы, не встречающиеся в природе, содержат по меньшей мере одну дополнительную копию нуклеотидной последовательности, делающую возможной экспрессию фосфоенолпируватсинтазы или ее функционального варианта. Сверхэкспрессия ppsA усиливает внутриклеточный синтез ФЕП таким образом, что больше ФЕП доступно для продукции сиаловой кислоты. Например, подходящая фосфоенолпируватсинтаза представляет собой PpsA Е. coli.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически сконструированная клетка Bacillus содержит молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую PpsA Е. coli или ее функциональный вариант.Указанная нуклеотидная последовательность, кодирующая PpsA Е. coli или ее функциональный вариант, обладает идентичностью последовательностей по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% с геном ppsA Е. coli.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически сконструированная клетка Bacillus дополнительно модифицирована для того, чтобы иметь способность переносить указанный один единственный источник углерода в клетку посредством механизма, при котором не потребляется ФЕП.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении клетка Bacillus для получения сиалированного олигосахарида не обладает β-галактозидазной активностью или обладает пониженной β-галактозидазной активностью, по сравнению с клеткой Bacillus дикого типа того же вида.

Внутриклеточный биосинтез сиалированных олигосахаридов требует импортирования лактозы в качестве субстрата-акцептора для сиалилтрансферазы, акцептирующей лактозу. Любая внутриклеточная активность фермента, который гидролизует поглощенную лактозу, будет воздействовать на эффективность образования сиалиллактозы, поскольку пул внутриклеточной лактозы будет уменьшен. Таким образом, будет преимущественным, если клетка Bacillus для получения сиалированного олигосахарида не будет обладать или будет обладать по меньшей мере, по сравнению с клеткой Bacillus дикого типа, сниженной активностью бета-галактозидазы.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении клетка Bacillus генетически сконструирована для исключения или по меньшей мере уменьшения р-галактозидазной активности клетки.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении клетка Bacillus генетически сконструирована посредством делеции или функциональной инактивации гена ganA. В еще одном воплощении клетка Bacillus генетически сконструирована для уменьшения уровня экспрессии гена ganA, по сравнению с клеткой Bacillus дикого типа.

Ген ganA Bacillus также называется yvfN или lacA. Это ген регулона GanR, который содержит гены, кодирующие ферменты, участвующие в утилизации галактана. Ген ganA кодирует бета-галактозидазу, которая участвует в утилизации галактана Bacillus.

Делеция или функциональная инактивация гена ganA аннулирует GanA-опосредованную β-галактозидазную активность в клетке Bacillus, тогда как уменьшение уровня экспрессии ganA уменьшает количество GanA в клетке Bacillus и, следовательно, активность β-галактозидазы, которая могла бы мешать биосинтезу сиалированного олигосахарида.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении клетка Bacillus генетически сконструирована посредством удаления или функциональной инактивации гена yesZ. Ген yesZ Bacillus кодирует бета-галактозидазу YesZ, которая играет роль в деградации рамногалактуронана, происходящего из клеточных стенок растений. Экспрессия гена yesZ Bacillus индуцируется рамногалактуронаном I. В еще одном воплощении клетка Bacillus генетически сконструирована для уменьшения уровня экспрессии гена yesZ, по сравнению с клеткой Bacillus дикого типа.

Удаление или функциональная инактивация гена yesZ аннулирует YesZ-опосредованную р-галактозидазную активность в клетке Bacillus, тогда как уменьшение уровня экспрессии yesZ уменьшает количество YesZ в клетке Bacillus и, следовательно, активность β-галактозидазы, которая могла бы мешать биосинтезу сиалированного олигосахарида.

Когда В. subtilis вступает в постэкспоненциальную фазу роста, они (начинают) продуцировать большие количества внеклеточных протеаз. Чужеродные белки часто являются чувствительными к протеазе. Таким образом, штамм, не содержащий экзопротеазу, является желательным для повышения стабильности гетерологичных белков и для обеспечения аккумуляции высоких уровней чужеродных белков. Геном Bacillus кодирует по меньшей мере восемь внеклеточных протеаз, а именно nprE, aprE, epr, bpr, mpr, nprB, vpr и wprA. Таким образом, в дополнительном и/или альтернативном воплощении клетка Bacillus генетически сконструирована в том, что по меньшей мере один ген, кодирующий внеклеточную протеазу, был удален или функционально инактивирован, предпочтительно по меньшей мере один из генов, выбранных из группы, состоящей из nprE, aprE, epr, bpr, mpr, nprB, vpr и wprA. Предпочтительно, два, три, четыре, пять, шесть, семь, или восемь из генов, выбранных из группы, состоящей из nprE, aprE, epr, bpr, mpr, nprB, vpr и wprA, удалены или функционально инактивированы.

В, subtiiis синтезирует пульхерриминовую кислоту, когда растет в средах, содержащих углевод, такой как глюкоза или лактоза. Выделяемая пульхерриминовая кислота образует красный пигмент пульхерримин, соль пульхерриминовой кислоты (хелат железа (III)), когда железо находится в среде для выращивания. Образования данного нежелательного побочного продукта во время процессов ферментации можно избежать/аннулировать посредством удаления/нарушения генов yvmC и/или сурХ. Ген yvmC кодирует циклодипептидсинтазу, и ген сурХ кодирует цитохром Р450 цикло-I-лейцил-I-лейцилдипептидоксидазу.

Таким образом, в дополнительном и/или альтернативном воплощении клетка Bacillus генетически сконструирована таким образом, что по меньшей мере один из генов yvmC и сурХ удален или функционально инактивирован.

Ризобактерия В. subtilis имеет гены для синтеза более чем 20 антибиотиков. Среди них находятся антибиотики-пептиды, такие как лантибиотики и пептиды, подобные лактибиотикам Bacillus subtilis (субтилин, эрицин S, мерсацидин, субланцин 168, субтилозин А) и антибиотики, синтезируемые нерибосомально (пептид) (сурфактин, итуирн, бацилломицин, микосубтилин, коринебактин/бациллибактин, фенгицин, плипастатин, микобациллин, TL-119, бацилизин, бацилизоцин, амикоумацин, 3,3'-неотрегалозадиамин, диффицидин, ризоктицин).

Для получения сиалированного олигосахарида предпочтительно использовать клетку Bacillus, которая не продуцирует антибиотик. Таким образом, в дополнительном и/или альтернативном воплощении клетка Bacillus не синтезирует один или более антибиотиков, выбранных из группы, состоящей из лантибиотиков и пептидов, подобных лантибиотикам, таких как субтилин, эрицин S, мерзацидин, субланцин 168, субтилозин А; антибиотиков, синтезированных нерибосомально (пептид), таких как сурфактин, итурин, бацилломицин, микосубтилин, коринебактин/ бациллибактин, фенгицин, плипастатин, микобациллин, TL-119, бацилизин, бацилизоцин, амикоумацин, 3,3'-неотрегалозадиамин, диффицидин и ризоктицин. Клетка Bacillus могла быть генетически сконструирована для нарушения или аннулирования их своей способности синтезировать один или более из указанных антибиотиков.

Генетически сконструированная клетка Bacillus, которая может продуцировать сиалированный олигосахарид, может, возможно, включать дополнительные признаки и может быть генетически сконструирована для того, чтобы иметь данные дополнительные признаки. Считается, что данные дополнительные признаки улучают продуктивность микроорганизма, который не встречается в природе, приводя к более высоким выходам сиалированного олигосахарида.

Клетка Bacillus по изобретению может продуцировать сиалированный олигосахарид при культивации в присутствии лактозы в среде и в условиях, которые являются пермиссивными в отношении клетки Bacillus, для получения сиалированного олигосахарида. Таким образом, также предложено применение генетически сконструированной клетки Bacillus, как ранее описано в данном документе, для получения сиалированного олигосахарида.

В одном аспекте предложен способ получения сиалированного олигосахарида. Способ включает (i) предоставление клетки Bacillus, как описано ранее в данном документе, (ii) культивацию указанной клетки Bacillus в культуральной среде или ферментационном бульоне и в условиях, которые являются пермиссивными в отношении получения сиалированного олигосахарида. Способ может дополнительно включать извлечение сиалированного олигосахарида из культуральной среды/ферментационного бульона и/или из клетки Bacillus.

Ферментационный бульон содержит по меньшей мере один источник углерода для метаболизма клетки Bacillus. В некоторых воплощениях по меньшей мере один источник углерода выбран из группы, состоящей из глюкозы, фруктозы, сахарозы, глицерина и их комбинаций. Источник углерода может быть поглощен клеткой Bacillus и может быть привлечен метаболизмом клетки Bacillus с образованием биомассы и/или энергии в форме высокоэнергетических трифосфатов.

В некоторых воплощениях ферментационный бульон содержит лактозу, в частности, если клетка Bacillus не может синтезировать лактозу сама по себе. Лактоза может подаваться в ферментационный бульон извне. Лактоза может служить субстратом-акцептором для группировки NeuNAc в получении некоторых сиалированных олигосахаридов, в частности, в получении сиалиллактоз.

В разных воплощениях ферментационный бульон содержит сиаловую кислоту, в частности, если клетка Bacillus используется для получения сиалированного олигосахарида, в которой отсутствует путь биосинтеза сиаловой кислоты, но есть путь утилизации сиаловой кислоты.

В некоторых воплощениях получение сиалированного олигосахарида не требует добавления N-ацетилглюкозамина, N-ацетилманнозамина и/или N-ацетилнейраминовой кислоты в ферментационный бульон и/или культивации генетически сконструированной микробной клетки в присутствии N-ацетилглюкозамина, N-ацетилманнозамина и/или N-ацетилнейрамановой кислоты для внутриклеточного биосинтеза сиалированного олигосахарида, поскольку клетка Bacillus используется для получения сиалированного олигосахарида, в которой имеется путь биосинтеза сиаловой кислоты de novo для внутриклеточного биосинтеза NeuNAC.

В данном способе по меньшей мере одна генетически сконструированная клетка Bacillus культивируется в ферментационном бульоне и в условиях, которые являются пермиссивными в отношении получения сахарида, содержащего по меньшей мере одну группировку N-ацетилнейраминовой кислоты.

В то время как в процессе используется источник углерода в ферментационном бульоне для генетически сконструированной клетки Bacillus, нет необходимости в том, чтобы добавлять глюкозамин и/или N-ацетилнейраминовую кислоту и/или N-ацетилглюкозамин и/или N-ацетилманнозамин в ферментационный бульон, когда клетка Bacillus может внутриклеточно продуцировать N-ацетилнейраминовую кислоту. Таким образом, в разных воплощениях для получения сиалированного олигосахарида, генетически сконструированную клетку Bacillus культивируют в отсутствие и/или без добавления одного или более, выбранных из группы, состоящей из глюкозамина, N-ацетилглюкозамина, N-ацетилманнозамина и N-ацетилнейраминовой кислоты. Генетически сконструированную клетку Bacillus можно культивировать в отсутствии и/или без добавления галактозы, поскольку галактоза не доставляется в качестве субстрата-акцептора для реакции сиалилтрансферазы.

В дополнительных и/или альтернативных воплощениях генетически сконструированную клетку Bacillus культивируют в присутствии одного или более моносахаридов (например, галактозы), дисахаридов (например, лактозы), трисахаридов (например, лакто-N-триозы II), тетрасахаридов (например, лакто-N-тетраозы) и/или пентасахаридов (например, сиалиллакто-N-тетраозы а).

Согласно дополнительному и/или альтернативному воплощению генетически сконструированную клетку Bacillus культивируют в присутствии по меньшей мере одного субстрата-акцептора, выбранного из группы, состоящей из галактозы, N-ацетилгалактозамина, N-ацетилглюкозамина, лактозы, лактулозы, N-ацетиллактозамина, лакто-N-биозы, лакто-N-триозы, 2'-фукозиллактозы, 3-фукозиллактозы, 3'-сиалиллактозы, 6'-сиалиллактозы, 3'-сиалил-N-ацетиллактозамина, 6'-сиалил-N-ацетиллактозамина, 3'-галактозиллактозы, 6'-галактозиллактозы, лакто-N-триозы II, лакто-N-тетраозы, лакто-N-неотетраозы, 2'3-дифукозиллактозы, 3-фукозил-3'-сиалиллактозы и 3-фукозил-6'-сиалиллактозы. Данные субстраты импортируются в клетку и используются в качестве молекул-акцепторов в клетке.

Способ включает возможную стадию выделения сиалированного олигосахарида, который продуцирован генетически сконструированной клеткой Bacillus во время ее культивирования и пролиферации в ферментационном бульоне. Сиалированный олигосахарид может быть выделен из ферментационного бульона после удаления генетически сконструированных клеток Bacillus, например, посредством центрифугирования или фильтрации и/или может быть выделен из клеток, например, в том отношении, что клетки собирают из ферментационного бульона посредством центрифугирования и подвергают стадии лизиса клеток. Затем, сиалированные олигосахариды могут быть дополнительно очищены из ферментационного бульона и/или клеточных лизатов подходящими методиками, известными специалисту в данной области. Подходящие методики включают микрофильтрацию, ультрафильтрацию, диафильтрацию, хроматографию с псевдодвижущимся слоем, электродиализ, обратный осмос, гель-фильтрацию, анионообменную хроматографию, катионообменную хроматографию и т.п.

Способ и генетически сконструированную микробную клетку, которую используют в способе, используют для получения сиалированного олигосахарида. Термин «сиалированный олигосахарид» относится к молекуле олигосахарида, содержащей по меньшей мере одну группировку N-ацетилнейраминовой кислоты.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении сиалированный сахарид представляет собой олигосахарид. Термин «олигосахарид», в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к полимерам моносахаридных остатков, где указанные полимеры содержат по меньшей мере два моносахаридных остатка, но не больше чем 10 моносахаридных остатков, предпочтительно не больше чем 7 моносахаридных остатков. Олигосахариды представляют собой или линейную цепь моносахаридов или являются разветвленными. Кроме того, моносахаридные остатки олигосахаридов могут характеризоваться целым рядом химических модификаций. Соответственно, олигосахариды могу содержать одну или более несахаридных группировок. Термин «сиалированный олигосахарид», в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к олигосахаридам, содержащим один или более группировок N-ацетилнейраминовой кислоты.

Согласно дополнительному и/или альтернативному воплощению сиалированный олигосахарид выбран из группы, состоящей из 3'-сиалиллактозы, 6'-сиалиллактозы, сиалиллакто-N-тетраозы а, сиалиллакто-N-тетраозы b, сиалиллакто-N-тетраозы с, фукозил-сиалиллакто-N-тетраозы а, фукозил-сиалиллакто-N-тетраозы b, фукозил-сиалиллакто-N-тетраозы с, дисиалиллакто-N-тетраозы, фукозиллакто-N-тетраозы I, фукозиллакто-N-тетраозы II, 3'-сиалилгалактозы, 6'-сиалилгалактозы, 3'-сиалил-N-ацетиллактозамина и 6'-сиалил-N-ацетиллактозамина.

В еще одном аспекте изобретения предложено применение генетически сконструированной клетки Bacillus, как описано ранее в данном документе, для получения сиалированного олигосахарида в цельноклеточном ферментационном процессе, а именно, сиалированный олигосахарид синтезируется генетически сконструированной клеткой Bacillus и в генетически сконструированной клетке Bacillus.

В еще одном аспекте изобретения предложен сиалированный олигосахарид, который получен способом и/или посредством применения генетически сконструированной клетки Bacillus, как описано ранее в данном документе.

В еще одном аспекте изобретения предложено применение сиалированного олигосахарида, который получен способом, как описано ранее в данном документе, и/или посредством применения генетически сконструированной клетки Bacillus, как описано ранее в данном документе, для изготовления питательной композиции.

Таким образом, предложена питательная композиция, содержащая по меньшей мере один сиалированный олигосахарид, который получен способом и/или посредством генетически сконструированной клетки Bacillus, как ранее описано в данном документе.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении сиалированный олигосахарид выбран из группы, состоящей из 3'-сиалиллактозы, 6'-сиалиллактозы, сиалиллакто-N-тетраозы а, сиалиллакто-N-тетраозы b, сиалиллакто-N-тетраозы с, фукозил-сиалиллакто-N-тетраозы а, фукозил-сиалиллакто-N-тетраозы b, фукозил-сиалиллакто-N-тетраозы с, дисиалиллакто-N-тетраозы, фукозилдисиалиллакто-N-тетраозы I, фукозилдисиаллакто-N-тетраозы II, 3'-сиалилгалактозы, 6'-сиалилгалактозы, 3'-сиалил-N-ацетиллактозамина и 6'-сиалил-N-ацетиллактозамина.

В некоторых воплощениях питательная композиция дополнительно содержит по меньшей мере один нейтральный ОГМ, предпочтительно по меньшей мере один нейтральный ОГМ, который продуцирован посредством использования генетически сконструированной клетки Bacillus. По меньшей мере один нейтральный ОГМ выделен из группы, состоящей из 2'-фукозиллактозы, 3-фукозиллактозы, 2',3-дифукозиллактозы, лакто-N-триозы II, лакто-N-тетраозы, лакто-N-неотетраозы, лакто-N-фукопентаозы I, лакто-N-неофукопентаозы I, лакто-N-фукопентаозы II, лакто-N-фукопентаозы III, лакто-N-фукопентаозы V, лакто-N-неофукопентаозы V, лакто-N-дифукогексаозы I, лакто-N-дифукогексаозы II, лакто-N-неодифукогексаозы I, лакто-N-гексаозы, лакто-N-неогексаозы, пара-лакто-N-гексаозы и пара-лакто-N-неогексаозы.

В дополнительном воплощении питательная композиция выбрана из группы, состоящей из медицинских композиций, фармацевтических композиций, нутрицевтических композиций, детских питательных смесей и биологически активных добавок.

Питательная композиция может быть представлена в жидкой форме или в твердой форме, включая порошки, гранулы, хлопья и пеллеты, но, не ограничиваясь ими.

Настоящее изобретение будет описано относительно конкретных воплощений, но данное изобретение не ограничивается ими, а только формулой изобретения. Кроме того, термины первый, второй и тому подобное в описании и в формуле изобретения используются для проведения различия между похожими элементами и не обязательно для описания последовательности, во времени, в пространстве, по рангу или любым другим образом. Следует понимать, что термины, используемые таким образом, являются взаимозаменяемыми в соответствующих обстоятельствах, и что воплощения изобретения, описанные в данном документе, способны работать в последовательностях, отличных от описанных или проиллюстрированных в данном документе.

Следует отметить, что термин «содержащий», используемый в формуле изобретения, не следует считать ограничивающимся средствами, перечисленными в дальнейшем; он не исключает других элементов или стадий. Таким образом, его следует считать определяющим наличие заявленных признаков, целых чисел, стадий или компонентов, на которые ссылаются, но он не исключает наличие или добавление одного или более других признаков, целых чисел, стадий или компонентов или их групп. Таким образом, объем выражения «устройство, содержащее средства А и В» не следует ограничивать устройствами, состоящими только из компонентов А и В. Оно означает, что в отношении настоящего изобретения, единственными релевантными компонентами устройства являются А и В.

Ссылка на всем протяжении данного описания изобретения на «одно воплощение» или «воплощение» означает, что конкретный признак, структура или характеристика, описанные в связи с данным воплощением, включены в по меньшей мере одно воплощение настоящего изобретения. Таким образом, появления фраз «в одном воплощении» или «в воплощении» в разных местах по всему объему данного описания изобретения не обязательно все относятся к одному и тому же воплощению, но могут. Кроме того, конкретные признаки, структуры или характеристики могут быть объединены любым подходящим образом, как будет очевидно среднему специалисту в данной области из данного раскрытия, в одном или более воплощениях.

Аналогично, следует понимать, что в описании иллюстративных воплощений изобретения разные признаки изобретения иногда сгруппированы вместе в одном единственном воплощении, фигуре или его описании в целях упрощения раскрытия и помощи в понимании одного или более из разных аспектов изобретения. Данный способ раскрытия, однако, не нужно считать отражающим мысль, что заявленное изобретение требует больше признаков, чем явным образом перечислены в каждом пункте. Скорее, как отражено в приведенной ниже формуле изобретения, аспекты изобретения заключаются меньше чем во всех признаках одного вышеизложенного раскрытого воплощения. Таким образом, формула изобретения после подробного описания явным образом включена тем самым в данное подробное описание, причем каждый пункт отдельно стоит в виде отдельного воплощения данного изобретения.

Кроме того, в то время как некоторые воплощения, описанные в данном документе, включают некоторые, но не все признаки, включенные в другие воплощения, подразумевается, что комбинации признаков разных воплощений находятся в объеме изобретения и образуют разные воплощения, как будет понятно специалистам в данной области. Например, в приведенной ниже формуле изобретения любое из заявленных воплощений можно использовать в любой комбинации.

Кроме того, некоторые из воплощений описаны в данном документе как способ или комбинация элементов способа, которые могут быть реализованы посредством процессора компьютерной системы или с помощью других средств выполнения функции. Таким образом, процессор с необходимыми инструкциями для осуществления такого способа или элемента способа образует средство осуществления способа или элемента способа. Кроме того, описанный в данном документе элемент воплощения аппарата представляет собой пример средства осуществления функции, выполняемой элементом, с целью осуществления изобретения.

В описании и графических материалах, предоставленных в данном документе, изложены многочисленные конкретные подробности. Однако, понятно, что воплощения изобретения можно осуществлять на практике без данных конкретных подробностей. В других примерах хорошо известные способы, структуры и методики не были показаны подробно для того, чтобы не затруднять понимание. Теперь изобретение будет описано с помощью подробного описания нескольких воплощений изобретения. Ясно, что другие воплощения изобретения могут быть скомпонованы в соответствии со знаниями специалистов в данной области, не отклоняясь от истинной сущности или технической идеи изобретения, причем изобретение ограничено только условиями прилагаемой формулы изобретения.

Примеры

Пример 1: Трансформация Bacillus subtilis

Bacillus subtilis можно подвергать генетическим манипуляциям посредством разных методик. Для трансформации В. subtilis компетентные клетки готовили посредством модифицированного протокола двухстадийного способа (Anagnostopoulos, С.and Spizizen, J. (1961) J Bacteriol 81 (5): 741-746). Ночную культуру инокулировали в среде MG1 и встряхивали при 37°С. Среда MG1 представляет собой минимальную среду Спицайзена, которая дополнена 0,5% глюкозой, 5 мМ MgSO₄ и 0,02% казаминовыми кислотами (возможно, дополнительно дополнена биотином и/или L-триптофаном). На следующее утро данную культуру разводили 1:20 в свежей среде MG1 и инкубировали при 37°С в течение приблизительно 6 ч. 1 мл культуры разводили в 8 мл среды MG2, которая отличается от среды MG1 по концентрации казаминовых кислот (0,01% вместо 0,02%). В укороченном протоколе ночную культуру непосредственно разводят в среде MG2. После инкубации в течение еще 90 мин порцию культуры, 1 мл, смешивали с 1-3 мкг мультимерной плазмидной ДНК или линейной ДНК и инкубировали при 37°С в течение 30-60 мин при встряхивании. Мультимерную плазмидную ДНК получали или посредством использования штамма Е. coli NM538 для размножения плазмидной ДНК или посредством линеаризации плазмиды в результате расщепления рестриктазой с одним разрезом, которая осуществляет расщепление в пределах каркаса с последующим повторным лигированием Т4 ДНК лигазой.

Затем, клетки распределяли по чашкам с 2xYT и агаром, содержащим соответствующий антибиотик. Антибиотики добавляли в следующих концентрациях: 5 мкг⋅мл^-1 эритромицина, 5 мкг⋅мл^-1 хлорамфеникола, 10 мкг⋅мл^-1 канамицина. 100 мкг⋅мл^-1 спектиномицина.

В качестве альтернативы, для трансформации протопластов (Romero, D. et al. (2006) Journal of Microbiological Methods 66:556-559) клетки выращивали в 20 мл бульона Penassay (РАВ) при 37°С до начала стационарной фазы роста (OD₆₀₀ (от англ. optical density - оптическая фаза) равна 1,7-2). Затем клетки осаждали и ресуспендировали в 10 мл среды SMPP (0,3%-ный бычий сывороточный альбумин, 5%-ная 2 М сахароза, 25% 4× РАВ, 50% 2× SMM), состоящей из 2×SMM, представляющего собой 1 М сахарозу, 0,04 М гидрат двунатриевой соли малеиновой кислоты и 0,04 М MgCl₂ (рН 6,5). После добавления лизоцима (10 мг мл^-1) и мутанолизина (75 Ед мл^-1) смесь инкубировали при 37°С при встряхивании с образованием протопластов. Образование протопластов проверяли посредством микроскопа. Затем протопласты аккуратно собирали посредством центрифугирования при 5200 ×g и 4°С в течение 5 мин, два раза промывали охлажденным льдом промывочным буфером для электротрансформации (1× SMM) и, в конечном итоге, суспендировали в данном растворе. Плазмидную ДНК (1-3 мкг) добавляли к 120 мкл суспензии протопластов, и смесь держали на льду в течение по меньшей мере 5 мин. Смесь для трансформации переносили в кювету, объемом 0,2 см, и один импульс для электропорации прикладывали на уровне 25 мкФ, 400 Ω⋅ и 0,7 кВ. Сразу после разряда электропорации 1 мл восстанавливающей среды (равные объемы 4х РАВ и 2х SMM, свежеприготовленные перед применением) добавляли в кювету. Затем реакционную смесь для трансформации переносили в 2 мл пробирку и инкубировали при 37°С при встряхивании в течение 12 ч. Для регенерации клеточную суспензию распределяли по чашкам с DM3 и агаром (Chang, S. and Cohen, S. (1979) MGG 168(1):111-115) и инкубировали при 37°C в течение 48 ч. Регенерирующая среда DM3 содержала следующие стерильные растворы на литр: 200 мл 4%-ого агара, 100 мл 5%-ных казаминовых кислот, 50 мл 10%-ого дрожжевого экстракта, 100 мл 3,5%-ого K₂HPO₄ и 1,5%-ого KH₂PO₄, 25 мл 20%-ной глюкозы, 20 мл 1 М MgCl₂, 500 мл 0,5 М сорбита и 5 мл стерилизованного посредством фильтрации 2%-ого бычьего сывороточного альбумина (добавляемые к смеси, когда температура ниже 55°С), и ее дополняли соответствующим антибиотиком.

Электропорацию В. subtilis проводили в соответствии с модифицированным протоколом от Zhang et al. (2011), предоставленным MoBiTec GmbH (Zhang.G., Bao,P., Zhang,Y., Deng,A., Chen,N. и Wen,T. (2011) Anal. Biochem., 409:130-137). Ночную культуру 2x YT разводили в 100 раз свежей средой 2х YT, и культуру выращивали до OD₆₀₀ 0,2 при 37°С на ротационной качалке. Затем культуру дополняли 1%-ным DL-треонином, 2%-ным глицином, 0,1%-ным триптофаном и 0,03% Tween 80. После культивирования в течение еще 60 мин клеточную суспензию охлаждали на льду в течение 20 мин, центрифугировали при 5000 × g в течение 10 мин при 4°С и два раза промывали буфером для электропорации (0,5 М трегалоза, 0,5 М сорбит, 0,5 М маннит, 0,5 мМ MgCl₂, 0,5 мМ K₂HPO₄, 0,5 мМ KH₂PO₄, рН 7,4, стерилизовали посредством фильтрации и хранили в замороженном виде). Наконец, клетки ресуспендировали в буфере для электропорации в соотношении 1/100 исходного объема культуры, и 100 мкл клеточной суспензии смешивали с ДНК. Смесь для трансформации переносили в 0,1-см кювету, и электропорацию проводили при 1,8 кВ с помощью одного импульса, доставляемого посредством прибора MicroPulser™ (Bio-Rad). Сразу после доставки импульса 1 мл бульона 2х YT, содержащего 0,5 М сорбит и 0,38 М маннит, добавляли в кювету. Суспензию для трансформации переносили в пробирку, объемом 2 мл, и инкубировали при 37°С в течение 3 ч на ротационной качалке. Клетки распределяли по чашке с 2х YT и агаром и инкубировали при 37°С в течение ночи.

Используя альтернативный протокол электропорации (Xue, G.P., J.S. Johnson and В.P. Dalrymple: 1999; Journal of Microbiological Methods 34:183-191), 5 мл седы LB, содержащей 0,5 M глюцит, инокулировали В. subtilis и инкубировали в течение ночи при 37°С.Далее, ночную культуру разводили (1:16) 75 мл LB, содержащей 0,5 М глюцит, и инкубировали до получения OD₆₀₀ 0,85-0,95. Затем клетки осаждали посредством центрифугирования в течение 10 мин при 4°С при 5,000хg и четыре раза промывали буфером для электропорации, охлажденным посредством льда (10% глицерин, 0,5 М глюцит, 0,5 М маннит). Наконец, клетки ресуспендировали в 1-2 мл буфера для электропорации. Электропорацию проводили, используя 60 мкл компетентных клеток с ДНК в охлажденной кювете для электропорации (расстояние между электродами 1 мм). Смесь клетки-ДНК подвергали воздействию одного электрического импульса на уровне 25 мкФ, 200 Ω и 21 кВ/см. Наконец, 1 мл бульона для восстановления (LB, содержащая 0,5 М глюцит и 0,38 М маннит) добавляли к электропермеабилизированным клеткам, и бактериальную культуру инкубировали в течение 3 ч при 37°С с последующим посевом на LB с агаром с добавлением антибиотика.

Использовали две разные обогащенные среды, а именно бульон Luria (LB) и 2х YT.

Среда бульон Luria (LB) состояла из 1%-ого триптона, 0,5%-ого дрожжевого экстракта и 0,5% NaCl (рН 7,2).

Среда 2х YT состояла из 1,6%-ого триптона, 1%-ого дрожжевого экстракта и 0,5% NaCl (рН 7,5).

Для получения чашек с обогащенной средой с агаром добавляли 15 г л^-1 агара.

Для экспериментов со встряхиваемыми колбами использовали минимальную среду Спицайзена (Spizizen, J. 1958 Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 44(10):1072-1078).

Минимальная среда Спицайзена содержит следующие соли: 2 г/л (NH₄)₂SO₄, 14 г/л K₂HPO₄, 6 г/л KH₂PO₄, 1 г/л цитрата Na₃ × 2⋅H₂O и 0,2 г/л MgSO₄ × 7⋅H₂O.

Предкультуральная среда, состоящая из минимальных солей Спицайзена, дополненная 2% D-глюкозой, 0,05% казаминовыми кислотами и MgSO₄, до конечной концентрации 2 мМ (возможно дополнительно дополненная биотином и/или L-триптофаном).

Основная культуральная среда состояла из минимальных солей Спицайзена, дополненная 2%-ной D-глюкозой, 0,05%-ными казаминовыми кислотами, MgSO₄ до конечной концентрации 2 мМ и 0,5 мл⋅л^-1 1000х раствора микроэлементов (возможно дополнительно дополненная биотином и/или L-триптофаном).

Раствор микроэлементов (1000х) состоял из 100,6 г л^-1 C₆H₉NO₆, 56,4 г⋅л^-1 цитрата железа (III)-аммония, 9,8 г⋅л^-1 MnCl₂ × 4⋅H₂O, 1,6 г⋅л^-1 CoCl₂ × 6⋅H₂O, 1 г⋅л^-1 CuCl₂ × 2⋅H₂O, 1,9 г⋅л^-1 Н_{3 B}O₃, 9 г⋅л^-1 ZnSO4 × 7⋅H₂O, 1,1 г⋅л^-1 Na₂MoO₄ × 2⋅H₂O, 1,5 г⋅л^-1 Na₂SeO₃, 1,5 г⋅л^-1 NiSO₄ × 6⋅H₂O.

При необходимости, соответствующий(ие) антибиотик(и) добавляли к среде для того, чтобы сделать ее селективной.

Штаммы В. subtilis исходно выращивали на чашках с обогащенными средами с агаром с получением одиночных колоний. Данные чашки выращивали в течение 1 суток при 30-37°С. В экспериментах со встряхиваемыми колбами 20 мл предварительной культуры инокулировали одиночной колонией и выращивали в течение ночи при 30-37°С на ротационной качалке. Следующие 20 мл основных культур инокулировали данной предварительной культурой до начальной OD₆₀₀ примерно 0,1 и инкубировали при 30-37°С на ротационной качалке. Если требовалась индукция, 40-60 мл основной культуры разбивали на порции по 20 мл в момент времени индукции. Объем культуры не превышал 20% емкости встряхиваемой колбы.

Пример 2: Конструирование штамма-продуцента Bacillus subtilis для 3'-сиалиллактозы

Для синтеза 3'-сиалиллактозы из метаболического промежуточного соединения - УДФ-N-ацетилглюкозамина с использованием пути neuCBA, конструировали экспрессионную плазмиду В. subtilis (SEQ ID NO: 1). Сначала гены neuA, neuB, neuC, а также α-2,3-сиалилтрансферазу, подвергали оптимизации кодонов для экспрессии в В. subtilis и получали синтетически посредством GenScript Corp.Ген neuA Campylobacter jejuni (номер доступа UniProtKB: Q93MP7) кодирует синтетазу CMP-Neu5Ac. Ген neuB Campylobacter jejuni (номер доступа UniProtKB: Q93MP9) кодирует синтазу сиаловой кислоты. Ген neuC Campylobacter jejuni (номер доступа UniProtKB: Q93MP8) кодирует N-ацетилглюкозамин-6-фосфат 2-эпимеразу. Ген siaT Pasteurella multocida (номер доступа UniProtKB: Q9CLP3) кодирует α-2,3-сиалилтрансферазу. Открытую рамку считывания гена lacY Е. coli (номе доступа Gen Bank: NP_414877.1), кодирующую лактозопермеазу, амплифицировали посредством ПЦР (полимеразная цепная реакция) из хромосомной ДНК. Затем, конструировали экспрессионную кассету <P_grac100-neuBCA-siaT-lacY-terminator>, которая содержит все необходимые гены под контролем индуцибельного промотора P_grac100. С этой целью, экспрессионный вектор рНТ253 В. subtilis (MoBiTec GmbH, Göttingen, Германия) использовали в качестве каркаса. Каждый ген в пределах экспрессионной кассеты связывали с последовательностью RBS В. subtilis. Дополнительно, подходящую терминирующую последовательность В. subtilis из части репозитория iGem (ID последовательности: ВВа_В0015) помещали ниже экспрессионной кассеты. Полученную плазмиду <pHT253-P_grac100-neuBCA-2,3siaT-lacY-terminator> (SEQ ID NO: 1) использовали для трансформации спорообразующего штамма В. subtilis (таблица 1) посредством использования его природной компетентности.

Экспрессию гена подтверждали посредством направленной протеомики и/или посредством ПЦР в реальном времени.

Трансформанты культивировали в условиях, которые являются пермиссивными в отношении В. subtilis, с получением 3'-сиалиллактозы в присутствии экзогенной лактозы.

Пример 3: Конструирование штамма-продуцента Bacillus subtilis для 3'-сиалиллактозы

Для синтеза 3'-сиалиллактозы из метаболического промежуточного соединения - УДФ-N-ацетилглюкозамина с использованием пути neuCBA, конструировали конститутивную экспрессионную плазмиду В. subtilis (SEQ ID NO: 2). Сначала, гены neuA, neuB, neuC и siaT подвергали оптимизации кодонов для экспрессии в В. subtilis и получали синтетически посредством GenScript Corp.Ген neuA Campylobacter jejuni (номер доступа UniProtKB: Q93MP7) кодирует синтетазу CMP-Neu5Ac. Ген neuB Campylobacter jejuni (номер доступа UniProtKB: Q93MP9) кодирует синтазу сиаловой кислоты.

Ген neuC Campylobacter jejuni (номер доступа UniProtKB: Q93MP8) кодирует N-ацетилглюкозамин-6-фосфат 2-эпимеразу. Ген siaT Pasteurella multocida (номер доступа UniProtKB: Q9CLP3) кодирует α-2,3-сиалилтрансферазу. Открытую рамку считывания гена lacY Е. coli (номе доступа Gen Bank: NP_414877.1), кодирующую лактозопермеазу, амплифицировали посредством ПЦР из хромосомной ДНК. Затем, конструировали экспрессионную кассету <P43-neuBCA-P_lepA-siaT-lacY-terminator>, которая содержит все необходимые гены, функционально связанные с двумя сильными конститутивными промоторами В. subtilis и/или Р43. Экспрессионный вектор рНТ253 В. subtilis (MoBiTec GmbH, Göttingen, Германия) использовали в качестве каркаса плазмиды. Каждый ген в пределах экспрессионной кассеты был связан с последовательностью RBS В. subtilis. Дополнительно, подходящую терминирующую последовательность В. subtilis из части репозитория iGem (ID последовательности: ВВа_В0015) помещали ниже экспрессионной кассеты.

Полученную плазмиду <phT253-P43-neuBCA--siaT-lacY-terminator> (SEQ ID NO: 2) использовали для трансформации спорообразующего и неспорообразующего штаммов В. subtilis (таблица 1) посредством использования их природной компетентности.

Экспрессию гена подтверждали посредством направленной протеомики и/или посредством ПЦР в реальном времени.

Трансформанты культивировали в условиях, которые являются пермиссивными в отношении В. subtilis, с получением 3'-сиалиллактозы в присутствии экзогенной лактозы.

Пример 4: Конструирование штамма-продуцента Bacillus subtilis для 6'-сиалиллактозы

Для продукции 6'-сиалиллактозы в В. subtilis использовали α-2,6-сиалилтрансферазу из Photobacterium leiognathi. Открытую рамку считывания гена siaT (номер доступа UniProtKB: D0VYB7) подвергали оптимизации кодонов для экспрессии в В. subtilis и получали синтетически посредством GenScript Corp.

Экспрессионную плазмиду <pHT253-P_grac100-neuBCA-2,6siaT-lacY-terminator> (SEQ ID NO: 3) конструировали, как описано в примере 2. Полученную плазмиду (SEQ ID NO: 3) использовали для трансформации спорообразующего и неспорообразующего штаммов В. subtilis (Таблица 1) посредством использования их природной компетентности. Экспрессию гена подтверждали посредством направленной протеомики и/или посредством ПЦР в реальном времени. Трансформанты культивировали в условиях, которые являются пермиссивными в отношении В. subtilis, с получением 6'-сиалиллактозы в присутствии экзогенной лактозы.

Пример 5: Конструирование штамма Bacillus subtilis для получения 3'-сиалиллактозы

Конструирование метаболизма В. subtilis (Таблица 1) достигалось посредством интеграции гетерологичных генов neuA Campylobacter jejuni, nanT Е. coli и siaT Haemophilus parahaemolyticus и одновременного удаления эндогенного гена ganA посредством гомологичной рекомбинации. Ген ganA В. subtilis (yvfN, lacA), который расположен в пределах галактозного оперона, кодирует бета-галактозидазу.

Для продукции 3'-сиалиллактозы из экзогенной сиаловой кислоты/N-ацетилнейраминовой кислоты и лактозы, открытые рамки считывания neuA, nanT и siaT были функционально связаны с конститутивным промотором Р43 В. subtilis (часть репозитория iGem: ID последовательности: ВВа_K143013) в виде оперона. С этой целью, во-первых, гены neuA, nanT и siaT подвергали оптимизации кодонов для экспрессиии в В. subtilis и получали синтетически посредством GenScript Corp.Ген neuA Campylobacter jejuni (номер доступа UniProtKB: Q93MP7) кодирует синтетазу CMP-Neu5Ac, ген nanT Е. coli (номер доступа GenBank: NP_417691.4) кодирует транспортер сиаловой кислоты и ген siaT Н. parahaemolyticus (номер доступа UniProtKB: I3DHL4) кодирует альфа-N-ацетилнейраминил-2,3-бета-галактозил-1,3-N-ацетилгалактозаминид 6-альфа-сиалилтрансферазу (альфа-2,3-сиалилтрансферазу).

Каждый ген в пределах экспрессионной кассеты был связан с последовательностью RBS В. subtilis. Кроме того, подходящая терминирующая последовательность В. subtilis из части репозитория iGem (ID последовательности: ВВа_В0015) была расположена ниже экспрессионной кассеты.

Клонирующий вектор pBR322 (New England Biolabs GmbH, Франкфурт, Германия) использовали в качестве каркаса плазмиды. Кассету полной интеграции собирали для создания суицидной плазмиды<pBR322 flank ganA up-Р43-siaT-neuA-nanT-terminator-erm-flank ganA down>(SEQ ID NO: 4). Затем, В. subtilis трансформировали данной плазмидой за счет ее природной компетентности. Клетки распределяли по чашкам с 2х YT и агаром, содержащей соответствующий антибиотик (5 мкг мл^-1 эритромицина). Интеграцию экспрессионной кассеты <Р43-siaT-neuA-nanT-terminator> в локус ganA генома В. subtilis, с получением штамма А, проверяли посредством ПЦР на колониях. Экспрессию гена подтверждали посредством направленной протеомики и/или посредством ПЦР в реальном времени.

Для импортирования экзогенной лактозы в клетку Bacillus ген lacY Е. coli интегрировали в эндогенный локус amyE (amyA) генома В. subtilis (кодирующий альфа-амилазу). С этой целью, открытую рамку считывания гена lacY Е. coli (номер доступа Gen Bank: NP_414877.1), кодирующую лактозопермеазу, амплифицировали посредством ПЦР из хромосомной ДНК. Кассету интеграции <flank amyE up-1ох71-aad9-lox66-P43-lacY-flank amyE down> (SEQ ID NO: 5) конструировали и клонировали в pBR322 (New England Biolabs GmbH, Фанкфурт, Германия). Штамм A трансформировали полученной суицидной плазмидой за счет природной компетентности. Интеграцию экспрессионной кассеты <Р43-lacY> в локус amyE штамма А, с получением конечного штамма В проверяли посредством ПЦР на колониях.

Экспрессию гена подтверждали посредством направленной протеомики и/или посредством ПЦР в реальном времени. Штамм В культивировали в условиях, которые являются пермиссивными в отношении В. subtilis с получением 3'-сиалиллактозы в присутствии экзогенной лактозы и сиаловой кислоты/N-ацетилнейраминовой кислоты.

Пример 6: Получение сиалиллактозы с использованием штаммов Bacillus subtilis с модифицированным метаболизмом

Предварительную культуру инокулировали штаммом Bacillus subtilis с модифицированным метаболизмом, подходящим для биосинтеза сиалиллактозы (как описано в примерах 2-5).

Предварительную культуру инкубировали при 30-37°С в течение ночи и затем разводили до исходной OD₆₀₀ примерно 0,1 в свежей основной культуральной среде. Когда основная культура достигала OD₆₀₀ приблизительно 0,5, 2 мМ лактозу добавляли к среде для выращивания. Когда для экспрессии гена использовали индуцибельный промотор P_grac100, индукцию осуществляли посредством лактозы (2 мМ) или как лактозы (2 мМ), так и IPTG (от англ. isopropylthiogalactoside -изопропилтиогалактозид) (1 мМ). Для утилизирующего биосинтеза CMP-N-ацетилнейраминовой кислоты, дополнительно, добавляли 2 мМ сиаловой кислоты/N-ацетилнейраминовой кислоты. Культивирование прекращали после примерно 24 ч/48 ч после индукции, и внутриклеточную и внеклеточную сиалиллактозу анализировали посредством тонкослойной хроматографии и/или ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографии) и/или масс-спектрометрии (как описано в WO 2017/042382 А или WO 2019/008133 А). Выявляли биосинтез существенных количеств сиалиллактозы (3'-сиалиллактозы/6'-сиалиллактозы).

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Jennewein Biotechnologie GmbH

<120> ПРОДУКЦИЯ СИАЛИРОВАННЫХ ОЛИГОСАХАРИДОВ В КЛЕТКАХ BACILLUS

<130> P 1906 WO

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 13121

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Экспрессионная плазмида

<400> 1

ttaagttatt ggtatgactg gttttaagcg caaaaaaagt tgctttttcg tacctattaa

60

tgtatcgttt tagaaaaccg actgtaaaaa gtacagtcgg cattatctca tattataaaa

120

gccagtcatt aggcctatct gacaattcct gaatagagtt cataaacaat cctgcatgat

180

aaccatcaca aacagaatga tgtacctgta aagatagcgg taaatatatt gaattacctt

240

tattaatgaa ttttcctgct gtaataatgg gtagaaggta attactatta ttattgatat

300

ttaagttaaa cccagtaaat gaagtccatg gaataataga aagagaaaaa gcattttcag

360

gtataggtgt tttgggaaac aatttccccg aaccattata tttctctaca tcagaaaggt

420

ataaatcata aaactctttg aagtcattct ttacaggagt ccaaatacca gagaatgttt

480

tagatacacc atcaaaaatt gtataaagtg gctctaactt atcccaataa cctaactctc

540

cgtcgctatt gtaaccagtt ctaaaagctg tatttgagtt tatcaccctt gtcactaaga

600

aaataaatgc agggtaaaat ttatatcctt cttgttttat gtttcggtat aaaacactaa

660

tatcaatttc tgtggttata ctaaaagtcg tttgttggtt caaataatga ttaaatatct

720

cttttctctt ccaattgtct aaatcaattt tattaaagtt catttgatat gcctcctaaa

780

tttttatcta aagtgaattt aggaggctta cttgtctgct ttcttcatta gaatcaatcc

840

ttttttaaaa gtcaatatta ctgtaacata aatatatatt ttaaaaatat cccactttat

900

ccaattttcg tttgttgaac taatgggtgc tttagttgaa gaataaagac cacattaaaa

960

aatgtggtct tttgtgtttt tttaaaggat ttgagcgtag cgaaaaatcc ttttctttct

1020

tatcttgata ataagggtaa ctattgccga tcgtccattc cgacagcatc gccagtcact

1080

atggcgtgct gctagcgcca ttcgccattc aggctgcgca actgttggga agggcgatcg

1140

gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg gcgaaagggg gatgtgctgc aaggcgatta

1200

agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca cgacgttgta aaacgacggc cagtgaattc

1260

gagctcaggc cttaactcac attaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga

1320

aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt

1380

attgggcgcc agggtggttt ttcttttcac cagtgagacg ggcaacagct gattgccctt

1440

caccgcctgg ccctgagaga gttgcagcaa gcggtccacg ctggtttgcc ccagcaggcg

1500

aaaatcctgt ttgatggtgg ttgacggcgg gatataacat gagctgtctt cggtatcgtc

1560

gtatcccact accgagatat ccgcaccaac gcgcagcccg gactcggtaa tggcgcgcat

1620

tgcgcccagc gccatctgat cgttggcaac cagcatcgca gtgggaacga tgccctcatt

1680

cagcatttgc atggtttgtt gaaaaccgga catggcactc cagtcgcctt cccgttccgc

1740

tatcggctga atttgattgc gagtgagata tttatgccag ccagccagac gcagacgcgc

1800

cgagacagaa cttaatgggc ccgctaacag cgcgatttgc tggtgaccca atgcgaccag

1860

atgctccacg cccagtcgcg taccgtcttc atgggagaaa ataatactgt tgatgggtgt

1920

ctggtcagag acatcaagaa ataacgccgg aacattagtg caggcagctt ccacagcaat

1980

ggcatcctgg tcatccagcg gatagttaat gatcagccca ctgacgcgtt gcgcgagaag

2040

attgtgcacc gccgctttac aggcttcgac gccgcttcgt tctaccatcg acaccaccac

2100

gctggcaccc agttgatcgg cgcgagattt aatcgccgcg acaatttgcg acggcgcgtg

2160

cagggccaga ctggaggtgg caacgccaat cagcaacgac tgtttgcccg ccagttgttg

2220

tgccacgcgg ttgggaatgt aattcagctc cgccatcgcc gcttccactt tttcccgcgt

2280

tttcgcagaa acgtggctgg cctggttcac cacgcgggaa acggtctgat aagagacacc

2340

ggcatactct gcgacatcgt ataacgttac tggtttcatc aaaatcgtct ccctccgttt

2400

gaatatttga ttgatcgtaa ccagatgaag cactctttcc actatcccta cagtgttatg

2460

gcttgaacaa tcacgaaaca ataattggta cgtacgatct ttcagccgac tcaaacatca

2520

aatcttacaa atgtagtctt tgaaagtatt acatatgtaa gatttaaatg caaccgtttt

2580

ttcggaagga aatgatgacc tcgtttccac cggaattagc ttggtaccaa aggaggtaag

2640

gatcactaga aaatttttta aaaaatctct tgacattgga agggagatat gttattataa

2700

gaattgcgga attgtgagcg gataacaatt cccatataga ttaactaata aggaggacaa

2760

acatgaaaga aatcaaaatc caaaacatca tcatcagcga agaaaaagcg ccgctggttg

2820

tgccggaaat cggcattaat cataacggat ctttagaact ggctaaaatc atggttgatg

2880

cagcgttttc agctggagcc aaaatcatca aacatcaaac acatatcgtc gaagatgaaa

2940

tgagcaaagc tgcaaagaaa gttatcccgg gcaacgctaa aatctctatc tacgaaatca

3000

tgcagaaatg cgctttagat tacaaagatg aacttgccct gaaagaatac acagaaaaac

3060

tgggacttgt gtatcttagc acaccgtttt caagagcagg cgcgaatcgc ttagaagata

3120

tgggagtctc tgcatttaaa atcggctcag gagaatgtaa taactatccg ctgatcaaac

3180

atattgcagc gtttaaaaaa ccgatgattg tgtctacagg catgaactca atcgaaagca

3240

ttaaaccgac agtgaaaatc ctgcttgata acgaaatccc gtttgtcctg atgcatacaa

3300

caaacctgta tccgacaccg cataatcttg ttagattaaa cgccatgctg gaactgaaga

3360

aagaatttag ctgcatggtg ggactttctg atcatacaac agataatctg gcatgccttg

3420

gcgcggtcgt tcttggagcg tgtgtcttag aaagacattt tacagattca atgcatcgca

3480

gcggaccgga tattgtttgt tctatggata caaaagcctt aaaagaactg atcattcaat

3540

cagaacagat ggcaatcatt cgcggcaata acgaatcaaa gaaagcagcc aaacaagaac

3600

aggttacaat cgattttgct tttgcctctg tggtctcaat caaagatatt aagaaaggcg

3660

aagttctgtc aatggataat atttgggtga aaagaccggg acttggcgga atcagcgcag

3720

cggaatttga aaatattctg ggcaagaaag cactgcgcga tattgaaaac gatgcgcagt

3780

taagctatga agattttgct taagctctta aggaggattt tagaatgaag aaaattctgt

3840

ttatcacagg ctcaagagcg gattactcta aaatcaaatc acttatgtac cgcgtccaaa

3900

attcaagcga atttgaactt tacatctttg ctacaggcat gcatctgagc aaaaactttg

3960

gatacacagt taaagaatta tataaaaatg gctttaaaaa catctacgaa tttatcaact

4020

acgataaata ttatcagaca gataaagccc tggcaacaac aattgatgga ttttcaagat

4080

atgcgaacga attaaaaccg gatctgattg ttgtgcatgg cgatcgcatc gaaccgcttg

4140

cagcggctat tgtcggagcc cttaacaaca tcctggttgc acatatcgaa ggcggagaaa

4200

ttagcggaac aatcgatgat tctttaagac atgcgatttc aaaacttgct catatccatc

4260

tggtgaacga tgaatttgca aaaagacgcc ttatgcaatt aggcgaagat gaaaaatcaa

4320

tctttatcat cggatctccg gatctggaac tgcttaacga taacaaaatc tcacttagcg

4380

aagccaaaaa atactacgat attaactacg aaaactatgc attactgatg tttcatccgg

4440

tcacaacaga aatcacatct atcaaaaacc aagccgataa cctggtgaaa gcacttatcc

4500

agtcaaacaa aaactacatc gtcatctatc cgaataacga tctgggcttt gaactgatcc

4560

ttcagagcta tgaagaattt aaaaacaacc cgagatttaa actgtttccg tctctgcgct

4620

ttgaatactt tatcacactt ctgaaaaacg ccgattttat tatcggaaac tcttcatgca

4680

tcctgaaaga agcgttatac ctgaaaacag ctggcattct ggttggatca agacaaaatg

4740

gccgcttagg aaatgaaaac acactgaaag tgaatgcgaa cagcgatgaa atccttaaag

4800

ctatcaacac aatccataaa aaacaggatt tattttctgc taaactggaa attcttgata

4860

gctctaaact gtttttcgaa tatcttcaat caggcgattt ctttaaactt agcacacaga

4920

aagtttttaa agatattaaa taaaaaggag gaactactat gtcacttgca attatcccgg

4980

cgagaggcgg aagcaaaggc atcaaaaaca aaaacctggt tctgcttaac aacaaaccgc

5040

ttatctacta cacaatcaaa gcagcgctga atgctaaatc tatttcaaaa gttgtggtct

5100

caagcgatag cgatgaaatc cttaactacg ccaaatctca aaacgtggat attctgaaaa

5160

gaccgatctc tcttgcacag gatgatacaa catcagataa agtcttactg catgcgctga

5220

aattttacaa agattacgaa gatgttgtgt ttttacaacc gacatctccg ctgcgcacaa

5280

acattcatat caacgaagca tttaacctgt acaaaaattc aaacgctaat gccctgatta

5340

gcgtctctga atgcgataac aaaatcctta aagcatttgt ttgcaacgat tgtggcgatt

5400

tagccggaat ttgtaatgat gaatatccgt ttatgccgcg ccagaaactg ccgaaaacat

5460

atatgagcaa cggagcgatc tacatcctta aaatcaaaga atttctgaac aacccgtcat

5520

ttctgcaaag caaaacaaaa cattttctta tggatgaatc atcatcactg gatattgatt

5580

gcctggaaga tttaaagaaa gttgaacaaa tttggaaaaa ataaagatta actaataagg

5640

aggacaaaca tggataaatt tgctgaacat gaaattccga aagctgttat cgtggccggc

5700

aacggagaat ctctttcaca aatcgattac agactgcttc cgaaaaacta tgatgtcttt

5760

agatgcaacc agttttactt tgaagaacgc tattttcttg gcaacaaaat caaagcagtt

5820

ttctttacac cgggagtgtt tttagaacaa tactacacac tgtaccatct taaacgcaac

5880

aacgaatact ttgtcgataa cgttatcctg tcatcattta accatccgac agttgatctg

5940

gaaaaatcac aaaaaatcca ggctctgttt attgatgtga tcaacggcta cgaaaaatac

6000

ctgtctaaac tgacagcctt tgatgtttat ctgagataca aagaacttta cgaaaaccaa

6060

cgcattacat caggagtgta tatgtgcgcc gtcgcaatcg cgatgggcta tacagatatt

6120

taccttacag gaatcgattt ttatcaggca agcgaagaaa actacgcgtt tgataacaaa

6180

aaaccgaaca tcatcagatt actgccggat tttcgcaaag aaaaaacatt attttcatat

6240

catagcaaag atattgatct tgaagcatta tcttttctgc aacagcatta ccatgttaac

6300

ttttacagca tttctccgat gtctccgctg tcaaaacatt ttccgatccc gacagtggaa

6360

gatgattgtg aaacaacatt tgtcgcgccg ctgaaagaaa actacatcaa cgatattctt

6420

ttaccgccgc attttgtcta tgaaaaactt ggcgttgata aacttgcagc ggctttagaa

6480

catcatcatc atcatcatta aagtgatagc ggtaccatta taggtaagag aggaatgtac

6540

acatgtacta tttaaaaaac acaaactttt ggatgttcgg tttattcttt ttcttttact

6600

tttttatcat gggagcctac ttcccgtttt tcccgatttg gctacatgac atcaaccata

6660

tcagcaaaag tgatacgggt attatttttg ccgctatttc tctgttctcg ctattattcc

6720

aaccgctgtt tggtctgctt tctgacaaac tcgggctgcg caaatacctg ctgtggatta

6780

ttaccggcat gttagtgatg tttgcgccgt tctttatttt tatcttcggg ccactgttac

6840

aatacaacat tttagtagga tcgattgttg gtggtattta tctaggcttt tgttttaacg

6900

ccggtgcgcc agcagtagag gcatttattg agaaagtcag ccgtcgcagt aatttcgaat

6960

ttggtcgcgc gcggatgttt ggctgtgttg gctgggcgct gtgtgcctcg attgtcggca

7020

tcatgttcac catcaataat cagtttgttt tctggctggg ctctggctgt gcactcatcc

7080

tcgccgtttt actctttttc gccaaaacgg atgcgccctc ttctgccacg gttgccaatg

7140

cggtaggtgc caaccattcg gcatttagcc ttaagctggc actggaactg ttcagacagc

7200

caaaactgtg gtttttgtca ctgtatgtta ttggcgtttc ctgcacctac gatgtttttg

7260

accaacagtt tgctaatttc tttacttcgt tctttgctac cggtgaacag ggtacgcggg

7320

tatttggcta cgtaacgaca atgggcgaat tacttaacgc ctcgattatg ttctttgcgc

7380

cactgatcat taatcgcatc ggtgggaaaa acgccctgct gctggctggc actattatgt

7440

ctgtacgtat tattggctca tcgttcgcca cctcagcgct ggaagtggtt attctgaaaa

7500

cgctgcatat gtttgaagta ccgttcctgc tggtgggctg ctttaaatat attaccagcc

7560

agtttgaagt gcgtttttca gcgacgattt atctggtctg tttctgcttc tttaagcaac

7620

tggcgatgat ttttatgtct gtactggcgg gcaatatgta tgaaagcatc ggtttccagg

7680

gcgcttatct ggtgctgggt ctggtggcgc tgggcttcac cttaatttcc gtgttcacgc

7740

ttagcggccc cggcccgctt tccctgctgc gtcgtcaggt gaatgaagtc gcttaaggat

7800

ccatgtctag agtcgacgtc cccggggcag cccgcctaat gagcgggctt ttttcacgtc

7860

ccaggcatca aataaaacga aaggctcagt cgaaagactg ggcctttcgt tttatctgtt

7920

gtttgtcggt gaacgctctc tactagagtc acactggctc accttcgggt gggcctttct

7980

gcgtttatac ccggggcagc ccgcctaatg agcgggcttt tttcacgtca cgcgtccatg

8040

gagatctttg tctgcaactg aaaagtttat accttacctg gaacaaatgg ttgaaacata

8100

cgaggctaat atcggcttat taggaatagt ccctgtacta ataaaatcag gtggatcagt

8160

tgatcagtat attttggacg aagctcggaa agaatttgga gatgacttgc ttaattccac

8220

aattaaatta agggaaagaa taaagcgatt tgatgttcaa ggaatcacgg aagaagatac

8280

tcatgataaa gaagctctaa aactattcaa taaccttaca atggaattga tcgaaagggt

8340

ggaaggttaa tggtacgaaa attaggggat ctacctagaa agccacaagg cgataggtca

8400

agcttaaaga acccttacat ggatcttaca gattctgaaa gtaaagaaac aacagaggtt

8460

aaacaaacag aaccaaaaag aaaaaaagca ttgttgaaaa caatgaaagt tgatgtttca

8520

atccataata agattaaatc gctgcacgaa attctggcag catccgaagg gaattcatat

8580

tacttagagg atactattga gagagctatt gataagatgg ttgagacatt acctgagagc

8640

caaaaaactt tttatgaata tgaattaaaa aaaagaacca acaaaggctg agacagactc

8700

caaacgagtc tgttttttta aaaaaaatat taggagcatt gaatatatat tagagaatta

8760

agaaagacat gggaataaaa atattttaaa tccagtaaaa atatgataag attatttcag

8820

aatatgaaga actctgtttg tttttgatga aaaaacaaac aaaaaaaatc cacctaacgg

8880

aatctcaatt taactaacag cggccaaact gagaagttaa atttgagaag gggaaaaggc

8940

ggatttatac ttgtatttaa ctatctccat tttaacattt tattaaaccc catacaagtg

9000

aaaatcctct tttacactgt tcctttaggt gatcgcggag ggacattatg agtgaagtaa

9060

acctaaaagg aaatacagat gaattagtgt attatcgaca gcaaaccact ggaaataaaa

9120

tcgccaggaa gagaatcaaa aaagggaaag aagaagttta ttatgttgct gaaacggaag

9180

agaagatatg gacagaagag caaataaaaa acttttcttt agacaaattt ggtacgcata

9240

taccttacat agaaggtcat tatacaatct taaataatta cttctttgat ttttggggct

9300

attttttagg tgctgaagga attgcgctct atgctcacct aactcgttat gcatacggca

9360

gcaaagactt ttgctttcct agtctacaaa caatcgctaa aaaaatggac aagactcctg

9420

ttacagttag aggctacttg aaactgcttg aaaggtacgg ttttatttgg aaggtaaacg

9480

tccgtaataa aaccaaggat aacacagagg aatccccgat ttttaagatt agacgtaagg

9540

ttcctttgct ttcagaagaa cttttaaatg gaaaccctaa tattgaaatt ccagatgacg

9600

aggaagcaca tgtaaagaag gctttaaaaa aggaaaaaga gggtcttcca aaggttttga

9660

aaaaagagca cgatgaattt gttaaaaaaa tgatggatga gtcagaaaca attaatattc

9720

cagaggcctt acaatatgac acaatgtatg aagatatact cagtaaagga gaaattcgaa

9780

aagaaatcaa aaaacaaata cctaatccta caacatcttt tgagagtata tcaatgacaa

9840

ctgaagagga aaaagtcgac agtactttaa aaagcgaaat gcaaaatcgt gtctctaagc

9900

cttcttttga tacctggttt aaaaacacta agatcaaaat tgaaaataaa aattgtttat

9960

tacttgtacc gagtgaattt gcatttgaat ggattaagaa aagatattta gaaacaatta

10020

aaacagtcct tgaagaagct ggatatgttt tcgaaaaaat cgaactaaga aaagtgcaat

10080

aaactgctga agtatttcag cagttttttt tatttagaaa tagtgaaaaa aatataatca

10140

gggaggtatc aatatttaat gagtactgat ttaaatttat ttagactgga attaataatt

10200

aacacgtaga ctaattaaaa tttaatgagg gataaagagg atacaaaaat attaatttca

10260

atccctatta aattttaaca agggggggat taaaatttaa ttagaggttt atccacaaga

10320

aaagacccta ataaaatttt tactagggtt ataacactga ttaatttctt aatgggggag

10380

ggattaaaat ttaatgacaa agaaaacaat cttttaagaa aagcttttaa aagataataa

10440

taaaaagagc tttgcgatta agcaaaactc tttacttttt cattgacatt atcaaattca

10500

tcgatttcaa attgttgttg tatcataaag ttaattctgt tttgcacaac cttttcagga

10560

atataaaaca catctgaggc ttgttttata aactcagggt cgctaaagtc aatgtaacgt

10620

agcatatgat atggtatagc ttccacccaa gttagccttt ctgcttcttc tgaatgtttt

10680

tcatatactt ccatgggtat ctctaaatga ttttcctcat gtagcaaggt atgagcaaaa

10740

agtttatgga attgatagtt cctctctttt tcttcaactt ttttatctaa aacaaacact

10800

ttaacatctg agtcaatgta agcataagat gtttttccag tcataatttc aatcccaaat

10860

cttttagaca gaaattctgg acgtaaatct tttggtgaaa gaattttttt atgtagcaat

10920

atatccgata cagcaccttc taaaagcgtt ggtgaatagg gcattttacc tatctcctct

10980

cattttgtgg aataaaaata gtcatattcg tccatctacc tatcctatta tcgaacagtt

11040

gaacttttta atcaaggatc agtccttttt ttcattattc ttaaactgtg ctcttaactt

11100

taacaactcg atttgttttt ccagatctcg agggtaacta gcctcgccga tcccgcaaga

11160

ggcccggcag tcaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt

11220

tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat aaatgcttca

11280

ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt

11340

ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga

11400

tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa

11460

gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt ttaaagttct

11520

gctatgtggc gcggtattat cccgtattga cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat

11580

acactattct cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc atcttacgga

11640

tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata acactgcggc

11700

caacttactt ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt tgcacaacat

11760

gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag ccataccaaa

11820

cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca acgttgcgca aactattaac

11880

tggcgaacta cttactctag cttcccggca acaattaata gactggatgg aggcggataa

11940

agttgcagga ccacttctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg ctgataaatc

12000

tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag atggtaagcc

12060

ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg aacgaaatag

12120

acagatcgct gagataggtg cctcactgat taagcattgg taactgtcag accaagttta

12180

ctcatatata ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa

12240

gatccttttt gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc

12300

gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat

12360

ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga

12420

gctaccaact ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt

12480

ccttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata

12540

cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac

12600

cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg

12660

ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg

12720

tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag

12780

cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct

12840

ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc

12900

aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt

12960

ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg

13020

tattaccgcc tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga

13080

gtcagtgagc gaggaagcgg aagagcgccc aatacgcatg c

13121

<210> 2

<211> 11125

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Плазмида

<400> 2

ttaagttatt ggtatgactg gttttaagcg caaaaaaagt tgctttttcg tacctattaa

60

tgtatcgttt tagaaaaccg actgtaaaaa gtacagtcgg cattatctca tattataaaa

120

gccagtcatt aggcctatct gacaattcct gaatagagtt cataaacaat cctgcatgat

180

aaccatcaca aacagaatga tgtacctgta aagatagcgg taaatatatt gaattacctt

240

tattaatgaa ttttcctgct gtaataatgg gtagaaggta attactatta ttattgatat

300

ttaagttaaa cccagtaaat gaagtccatg gaataataga aagagaaaaa gcattttcag

360

gtataggtgt tttgggaaac aatttccccg aaccattata tttctctaca tcagaaaggt

420

ataaatcata aaactctttg aagtcattct ttacaggagt ccaaatacca gagaatgttt

480

tagatacacc atcaaaaatt gtataaagtg gctctaactt atcccaataa cctaactctc

540

cgtcgctatt gtaaccagtt ctaaaagctg tatttgagtt tatcaccctt gtcactaaga

600

aaataaatgc agggtaaaat ttatatcctt cttgttttat gtttcggtat aaaacactaa

660

tatcaatttc tgtggttata ctaaaagtcg tttgttggtt caaataatga ttaaatatct

720

cttttctctt ccaattgtct aaatcaattt tattaaagtt catttgatat gcctcctaaa

780

tttttatcta aagtgaattt aggaggctta cttgtctgct ttcttcatta gaatcaatcc

840

ttttttaaaa gtcaatatta ctgtaacata aatatatatt ttaaaaatat cccactttat

900

ccaattttcg tttgttgaac taatgggtgc tttagttgaa gaataaagac cacattaaaa

960

aatgtggtct tttgtgtttt tttaaaggat ttgagcgtag cgaaaaatcc ttttctttct

1020

tatcttgata ataagggtaa ctattgccga tcgtccattc cgacagcatc gccagtcact

1080

atggcgtgct gctagcattt tacattttta gaaatgggcg tgaaaaaaag cgcgcgatta

1140

tgtaaaatat aaagattaac taataaggag gacaaacatg aaagaaatca aaatccaaaa

1200

catcatcatc agcgaagaaa aagcgccgct ggttgtgccg gaaatcggca ttaatcataa

1260

cggatcttta gaactggcta aaatcatggt tgatgcagcg ttttcagctg gagccaaaat

1320

catcaaacat caaacacata tcgtcgaaga tgaaatgagc aaagctgcaa agaaagttat

1380

cccgggcaac gctaaaatct ctatctacga aatcatgcag aaatgcgctt tagattacaa

1440

agatgaactt gccctgaaag aatacacaga aaaactggga cttgtgtatc ttagcacacc

1500

gttttcaaga gcaggcgcga atcgcttaga agatatggga gtctctgcat ttaaaatcgg

1560

ctcaggagaa tgtaataact atccgctgat caaacatatt gcagcgttta aaaaaccgat

1620

gattgtgtct acaggcatga actcaatcga aagcattaaa ccgacagtga aaatcctgct

1680

tgataacgaa atcccgtttg tcctgatgca tacaacaaac ctgtatccga caccgcataa

1740

tcttgttaga ttaaacgcca tgctggaact gaagaaagaa tttagctgca tggtgggact

1800

ttctgatcat acaacagata atctggcatg ccttggcgcg gtcgttcttg gagcgtgtgt

1860

cttagaaaga cattttacag attcaatgca tcgcagcgga ccggatattg tttgttctat

1920

ggatacaaaa gccttaaaag aactgatcat tcaatcagaa cagatggcaa tcattcgcgg

1980

caataacgaa tcaaagaaag cagccaaaca agaacaggtt acaatcgatt ttgcttttgc

2040

ctctgtggtc tcaatcaaag atattaagaa aggcgaagtt ctgtcaatgg ataatatttg

2100

ggtgaaaaga ccgggacttg gcggaatcag cgcagcggaa tttgaaaata ttctgggcaa

2160

gaaagcactg cgcgatattg aaaacgatgc gcagttaagc tatgaagatt ttgcttaagc

2220

tcttaaggag gattttagaa tgaagaaaat tctgtttatc acaggctcaa gagcggatta

2280

ctctaaaatc aaatcactta tgtaccgcgt ccaaaattca agcgaatttg aactttacat

2340

ctttgctaca ggcatgcatc tgagcaaaaa ctttggatac acagttaaag aattatataa

2400

aaatggcttt aaaaacatct acgaatttat caactacgat aaatattatc agacagataa

2460

agccctggca acaacaattg atggattttc aagatatgcg aacgaattaa aaccggatct

2520

gattgttgtg catggcgatc gcatcgaacc gcttgcagcg gctattgtcg gagcccttaa

2580

caacatcctg gttgcacata tcgaaggcgg agaaattagc ggaacaatcg atgattcttt

2640

aagacatgcg atttcaaaac ttgctcatat ccatctggtg aacgatgaat ttgcaaaaag

2700

acgccttatg caattaggcg aagatgaaaa atcaatcttt atcatcggat ctccggatct

2760

ggaactgctt aacgataaca aaatctcact tagcgaagcc aaaaaatact acgatattaa

2820

ctacgaaaac tatgcattac tgatgtttca tccggtcaca acagaaatca catctatcaa

2880

aaaccaagcc gataacctgg tgaaagcact tatccagtca aacaaaaact acatcgtcat

2940

ctatccgaat aacgatctgg gctttgaact gatccttcag agctatgaag aatttaaaaa

3000

caacccgaga tttaaactgt ttccgtctct gcgctttgaa tactttatca cacttctgaa

3060

aaacgccgat tttattatcg gaaactcttc atgcatcctg aaagaagcgt tatacctgaa

3120

aacagctggc attctggttg gatcaagaca aaatggccgc ttaggaaatg aaaacacact

3180

gaaagtgaat gcgaacagcg atgaaatcct taaagctatc aacacaatcc ataaaaaaca

3240

ggatttattt tctgctaaac tggaaattct tgatagctct aaactgtttt tcgaatatct

3300

tcaatcaggc gatttcttta aacttagcac acagaaagtt tttaaagata ttaaataaaa

3360

aggaggaact actatgtcac ttgcaattat cccggcgaga ggcggaagca aaggcatcaa

3420

aaacaaaaac ctggttctgc ttaacaacaa accgcttatc tactacacaa tcaaagcagc

3480

gctgaatgct aaatctattt caaaagttgt ggtctcaagc gatagcgatg aaatccttaa

3540

ctacgccaaa tctcaaaacg tggatattct gaaaagaccg atctctcttg cacaggatga

3600

tacaacatca gataaagtct tactgcatgc gctgaaattt tacaaagatt acgaagatgt

3660

tgtgttttta caaccgacat ctccgctgcg cacaaacatt catatcaacg aagcatttaa

3720

cctgtacaaa aattcaaacg ctaatgccct gattagcgtc tctgaatgcg ataacaaaat

3780

ccttaaagca tttgtttgca acgattgtgg cgatttagcc ggaatttgta atgatgaata

3840

tccgtttatg ccgcgccaga aactgccgaa aacatatatg agcaacggag cgatctacat

3900

ccttaaaatc aaagaatttc tgaacaaccc gtcatttctg caaagcaaaa caaaacattt

3960

tcttatggat gaatcatcat cactggatat tgattgcctg gaagatttaa agaaagttga

4020

acaaatttgg aaaaaataaa gtcaatgtat gaatggatac gggatatgaa tcaataagta

4080

cgtgaaagag aaaagcaacc cagatatgat agggaacttt tctctttctt gttttacatt

4140

gaatctttac aatcctattg atataatcta agctagtgta ttttgcgttt aatagtggag

4200

aaaagctagc gattaactaa taaggaggac aaacatggat aaatttgctg aacatgaaat

4260

tccgaaagct gttatcgtgg ccggcaacgg agaatctctt tcacaaatcg attacagact

4320

gcttccgaaa aactatgatg tctttagatg caaccagttt tactttgaag aacgctattt

4380

tcttggcaac aaaatcaaag cagttttctt tacaccggga gtgtttttag aacaatacta

4440

cacactgtac catcttaaac gcaacaacga atactttgtc gataacgtta tcctgtcatc

4500

atttaaccat ccgacagttg atctggaaaa atcacaaaaa atccaggctc tgtttattga

4560

tgtgatcaac ggctacgaaa aatacctgtc taaactgaca gcctttgatg tttatctgag

4620

atacaaagaa ctttacgaaa accaacgcat tacatcagga gtgtatatgt gcgccgtcgc

4680

aatcgcgatg ggctatacag atatttacct tacaggaatc gatttttatc aggcaagcga

4740

agaaaactac gcgtttgata acaaaaaacc gaacatcatc agattactgc cggattttcg

4800

caaagaaaaa acattatttt catatcatag caaagatatt gatcttgaag cattatcttt

4860

tctgcaacag cattaccatg ttaactttta cagcatttct ccgatgtctc cgctgtcaaa

4920

acattttccg atcccgacag tggaagatga ttgtgaaaca acatttgtcg cgccgctgaa

4980

agaaaactac atcaacgata ttcttttacc gccgcatttt gtctatgaaa aacttggcgt

5040

tgataaactt gcagcggctt tagaacatca tcatcatcat cattaaagtg atagcggtac

5100

cattataggt aagagaggaa tgtacacatg tactatttaa aaaacacaaa cttttggatg

5160

ttcggtttat tctttttctt ttactttttt atcatgggag cctacttccc gtttttcccg

5220

atttggctac atgacatcaa ccatatcagc aaaagtgata cgggtattat ttttgccgct

5280

atttctctgt tctcgctatt attccaaccg ctgtttggtc tgctttctga caaactcggg

5340

ctgcgcaaat acctgctgtg gattattacc ggcatgttag tgatgtttgc gccgttcttt

5400

atttttatct tcgggccact gttacaatac aacattttag taggatcgat tgttggtggt

5460

atttatctag gcttttgttt taacgccggt gcgccagcag tagaggcatt tattgagaaa

5520

gtcagccgtc gcagtaattt cgaatttggt cgcgcgcgga tgtttggctg tgttggctgg

5580

gcgctgtgtg cctcgattgt cggcatcatg ttcaccatca ataatcagtt tgttttctgg

5640

ctgggctctg gctgtgcact catcctcgcc gttttactct ttttcgccaa aacggatgcg

5700

ccctcttctg ccacggttgc caatgcggta ggtgccaacc attcggcatt tagccttaag

5760

ctggcactgg aactgttcag acagccaaaa ctgtggtttt tgtcactgta tgttattggc

5820

gtttcctgca cctacgatgt ttttgaccaa cagtttgcta atttctttac ttcgttcttt

5880

gctaccggtg aacagggtac gcgggtattt ggctacgtaa cgacaatggg cgaattactt

5940

aacgcctcga ttatgttctt tgcgccactg atcattaatc gcatcggtgg gaaaaacgcc

6000

ctgctgctgg ctggcactat tatgtctgta cgtattattg gctcatcgtt cgccacctca

6060

gcgctggaag tggttattct gaaaacgctg catatgtttg aagtaccgtt cctgctggtg

6120

ggctgcttta aatatattac cagccagttt gaagtgcgtt tttcagcgac gatttatctg

6180

gtctgtttct gcttctttaa gcaactggcg atgattttta tgtctgtact ggcgggcaat

6240

atgtatgaaa gcatcggttt ccagggcgct tatctggtgc tgggtctggt ggcgctgggc

6300

ttcaccttaa tttccgtgtt cacgcttagc ggccccggcc cgctttccct gctgcgtcgt

6360

caggtgaatg aagtcgctta aggatccatg tctagagtcg acgtccccgg ggcagcccgc

6420

ctaatgagcg ggcttttttc acgtcccagg catcaaataa aacgaaaggc tcagtcgaaa

6480

gactgggcct ttcgttttat ctgttgtttg tcggtgaacg ctctctacta gagtcacact

6540

ggctcacctt cgggtgggcc tttctgcgtt tatagaattc atattactta gaggatacta

6600

ttgagagagc tattgataag atggttgaga cattacctga gagccaaaaa actttttatg

6660

aatatgaatt aaaaaaaaga accaacaaag gctgagacag actccaaacg agtctgtttt

6720

tttaaaaaaa atattaggag cattgaatat atattagaga attaagaaag acatgggaat

6780

aaaaatattt taaatccagt aaaaatatga taagattatt tcagaatatg aagaactctg

6840

tttgtttttg atgaaaaaac aaacaaaaaa aatccaccta acggaatctc aatttaacta

6900

acagcggcca aactgagaag ttaaatttga gaaggggaaa aggcggattt atacttgtat

6960

ttaactatct ccattttaac attttattaa accccataca agtgaaaatc ctcttttaca

7020

ctgttccttt aggtgatcgc ggagggacat tatgagtgaa gtaaacctaa aaggaaatac

7080

agatgaatta gtgtattatc gacagcaaac cactggaaat aaaatcgcca ggaagagaat

7140

caaaaaaggg aaagaagaag tttattatgt tgctgaaacg gaagagaaga tatggacaga

7200

agagcaaata aaaaactttt ctttagacaa atttggtacg catatacctt acatagaagg

7260

tcattataca atcttaaata attacttctt tgatttttgg ggctattttt taggtgctga

7320

aggaattgcg ctctatgctc acctaactcg ttatgcatac ggcagcaaag acttttgctt

7380

tcctagtcta caaacaatcg ctaaaaaaat ggacaagact cctgttacag ttagaggcta

7440

cttgaaactg cttgaaaggt acggttttat ttggaaggta aacgtccgta ataaaaccaa

7500

ggataacaca gaggaatccc cgatttttaa gattagacgt aaggttcctt tgctttcaga

7560

agaactttta aatggaaacc ctaatattga aattccagat gacgaggaag cacatgtaaa

7620

gaaggcttta aaaaaggaaa aagagggtct tccaaaggtt ttgaaaaaag agcacgatga

7680

atttgttaaa aaaatgatgg atgagtcaga aacaattaat attccagagg ccttacaata

7740

tgacacaatg tatgaagata tactcagtaa aggagaaatt cgaaaagaaa tcaaaaaaca

7800

aatacctaat cctacaacat cttttgagag tatatcaatg acaactgaag aggaaaaagt

7860

cgacagtact ttaaaaagcg aaatgcaaaa tcgtgtctct aagccttctt ttgatacctg

7920

gtttaaaaac actaagatca aaattgaaaa taaaaattgt ttattacttg taccgagtga

7980

atttgcattt gaatggatta agaaaagata tttagaaaca attaaaacag tccttgaaga

8040

agctggatat gttttcgaaa aaatcgaact aagaaaagtg caataaactg ctgaagtatt

8100

tcagcagttt tttttattta gaaatagtga aaaaaatata atcagggagg tatcaatatt

8160

taatgagtac tgatttaaat ttatttagac tggaattaat aattaacacg tagactaatt

8220

aaaatttaat gagggataaa gaggatacaa aaatattaat ttcaatccct attaaatttt

8280

aacaaggggg ggattaaaat ttaattagag gtttatccac aagaaaagac cctaataaaa

8340

tttttactag ggttataaca ctgattaatt tcttaatggg ggagggatta aaatttaatg

8400

acaaagaaaa caatctttta agaaaagctt ttaaaagata ataataaaaa gagctttgcg

8460

attaagcaaa actctttact ttttcattga cattatcaaa ttcatcgatt tcaaattgtt

8520

gttgtatcat aaagttaatt ctgttttgca caaccttttc aggaatataa aacacatctg

8580

aggcttgttt tataaactca gggtcgctaa agtcaatgta acgtagcata tgatatggta

8640

tagcttccac ccaagttagc ctttctgctt cttctgaatg tttttcatat acttccatgg

8700

gtatctctaa atgattttcc tcatgtagca aggtatgagc aaaaagttta tggaattgat

8760

agttcctctc tttttcttca acttttttat ctaaaacaaa cactttaaca tctgagtcaa

8820

tgtaagcata agatgttttt ccagtcataa tttcaatccc aaatctttta gacagaaatt

8880

ctggacgtaa atcttttggt gaaagaattt ttttatgtag caatatatcc gatacagcac

8940

cttctaaaag cgttggtgaa tagggcattt tacctatctc ctctcatttt gtggaataaa

9000

aatagtcata ttcgtccatc tacctatcct attatcgaac agttgaactt tttaatcaag

9060

gatcagtcct ttttttcatt attcttaaac tgtgctctta actttaacaa ctcgatttgt

9120

ttttccagat ctcgagggta actagcctcg ccgatcccgc aagaggcccg gcagtcaggt

9180

ggcacttttc ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta aatacattca

9240

aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg

9300

aagagtatga gtattcaaca tttccgtgtc gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc

9360

cttcctgttt ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg

9420

ggtgcacgag tgggttacat cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt

9480

cgccccgaag aacgttttcc aatgatgagc acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta

9540

ttatcccgta ttgacgccgg gcaagagcaa ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat

9600

gacttggttg agtactcacc agtcacagaa aagcatctta cggatggcat gacagtaaga

9660

gaattatgca gtgctgccat aaccatgagt gataacactg cggccaactt acttctgaca

9720

acgatcggag gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca acatggggga tcatgtaact

9780

cgccttgatc gttgggaacc ggagctgaat gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc

9840

acgatgcctg tagcaatggc aacaacgttg cgcaaactat taactggcga actacttact

9900

ctagcttccc ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt

9960

ctgcgctcgg cccttccggc tggctggttt attgctgata aatctggagc cggtgagcgt

10020

gggtctcgcg gtatcattgc agcactgggg ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt

10080

atctacacga cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat cgctgagata

10140

ggtgcctcac tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag

10200

attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat

10260

ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa

10320

aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca

10380

aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt

10440

ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgtccttct agtgtagccg

10500

tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc

10560

ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga

10620

cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc

10680

agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc

10740

gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca

10800

ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg

10860

tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta

10920

tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct

10980

cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata accgtattac cgcctttgag

11040

tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa

11100

gcggaagagc gcccaatacg catgc

11125

<210> 3

<211> 13805

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Экспрессионная плазмида

<400> 3

ttaagttatt ggtatgactg gttttaagcg caaaaaaagt tgctttttcg tacctattaa

60

tgtatcgttt tagaaaaccg actgtaaaaa gtacagtcgg cattatctca tattataaaa

120

gccagtcatt aggcctatct gacaattcct gaatagagtt cataaacaat cctgcatgat

180

aaccatcaca aacagaatga tgtacctgta aagatagcgg taaatatatt gaattacctt

240

tattaatgaa ttttcctgct gtaataatgg gtagaaggta attactatta ttattgatat

300

ttaagttaaa cccagtaaat gaagtccatg gaataataga aagagaaaaa gcattttcag

360

gtataggtgt tttgggaaac aatttccccg aaccattata tttctctaca tcagaaaggt

420

ataaatcata aaactctttg aagtcattct ttacaggagt ccaaatacca gagaatgttt

480

tagatacacc atcaaaaatt gtataaagtg gctctaactt atcccaataa cctaactctc

540

cgtcgctatt gtaaccagtt ctaaaagctg tatttgagtt tatcaccctt gtcactaaga

600

aaataaatgc agggtaaaat ttatatcctt cttgttttat gtttcggtat aaaacactaa

660

tatcaatttc tgtggttata ctaaaagtcg tttgttggtt caaataatga ttaaatatct

720

cttttctctt ccaattgtct aaatcaattt tattaaagtt catttgatat gcctcctaaa

780

tttttatcta aagtgaattt aggaggctta cttgtctgct ttcttcatta gaatcaatcc

840

ttttttaaaa gtcaatatta ctgtaacata aatatatatt ttaaaaatat cccactttat

900

ccaattttcg tttgttgaac taatgggtgc tttagttgaa gaataaagac cacattaaaa

960

aatgtggtct tttgtgtttt tttaaaggat ttgagcgtag cgaaaaatcc ttttctttct

1020

tatcttgata ataagggtaa ctattgccga tcgtccattc cgacagcatc gccagtcact

1080

atggcgtgct gctagcgcca ttcgccattc aggctgcgca actgttggga agggcgatcg

1140

gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg gcgaaagggg gatgtgctgc aaggcgatta

1200

agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca cgacgttgta aaacgacggc cagtgaattc

1260

gagctcaggc cttaactcac attaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga

1320

aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt

1380

attgggcgcc agggtggttt ttcttttcac cagtgagacg ggcaacagct gattgccctt

1440

caccgcctgg ccctgagaga gttgcagcaa gcggtccacg ctggtttgcc ccagcaggcg

1500

aaaatcctgt ttgatggtgg ttgacggcgg gatataacat gagctgtctt cggtatcgtc

1560

gtatcccact accgagatat ccgcaccaac gcgcagcccg gactcggtaa tggcgcgcat

1620

tgcgcccagc gccatctgat cgttggcaac cagcatcgca gtgggaacga tgccctcatt

1680

cagcatttgc atggtttgtt gaaaaccgga catggcactc cagtcgcctt cccgttccgc

1740

tatcggctga atttgattgc gagtgagata tttatgccag ccagccagac gcagacgcgc

1800

cgagacagaa cttaatgggc ccgctaacag cgcgatttgc tggtgaccca atgcgaccag

1860

atgctccacg cccagtcgcg taccgtcttc atgggagaaa ataatactgt tgatgggtgt

1920

ctggtcagag acatcaagaa ataacgccgg aacattagtg caggcagctt ccacagcaat

1980

ggcatcctgg tcatccagcg gatagttaat gatcagccca ctgacgcgtt gcgcgagaag

2040

attgtgcacc gccgctttac aggcttcgac gccgcttcgt tctaccatcg acaccaccac

2100

gctggcaccc agttgatcgg cgcgagattt aatcgccgcg acaatttgcg acggcgcgtg

2160

cagggccaga ctggaggtgg caacgccaat cagcaacgac tgtttgcccg ccagttgttg

2220

tgccacgcgg ttgggaatgt aattcagctc cgccatcgcc gcttccactt tttcccgcgt

2280

tttcgcagaa acgtggctgg cctggttcac cacgcgggaa acggtctgat aagagacacc

2340

ggcatactct gcgacatcgt ataacgttac tggtttcatc aaaatcgtct ccctccgttt

2400

gaatatttga ttgatcgtaa ccagatgaag cactctttcc actatcccta cagtgttatg

2460

gcttgaacaa tcacgaaaca ataattggta cgtacgatct ttcagccgac tcaaacatca

2520

aatcttacaa atgtagtctt tgaaagtatt acatatgtaa gatttaaatg caaccgtttt

2580

ttcggaagga aatgatgacc tcgtttccac cggaattagc ttggtaccaa aggaggtaag

2640

gatcactaga aaatttttta aaaaatctct tgacattgga agggagatat gttattataa

2700

gaattgcgga attgtgagcg gataacaatt cccatataga ttaactaata aggaggacaa

2760

acatgaaaga aatcaaaatc caaaacatca tcatcagcga agaaaaagcg ccgctggttg

2820

tgccggaaat cggcattaat cataacggat ctttagaact ggctaaaatc atggttgatg

2880

cagcgttttc agctggagcc aaaatcatca aacatcaaac acatatcgtc gaagatgaaa

2940

tgagcaaagc tgcaaagaaa gttatcccgg gcaacgctaa aatctctatc tacgaaatca

3000

tgcagaaatg cgctttagat tacaaagatg aacttgccct gaaagaatac acagaaaaac

3060

tgggacttgt gtatcttagc acaccgtttt caagagcagg cgcgaatcgc ttagaagata

3120

tgggagtctc tgcatttaaa atcggctcag gagaatgtaa taactatccg ctgatcaaac

3180

atattgcagc gtttaaaaaa ccgatgattg tgtctacagg catgaactca atcgaaagca

3240

ttaaaccgac agtgaaaatc ctgcttgata acgaaatccc gtttgtcctg atgcatacaa

3300

caaacctgta tccgacaccg cataatcttg ttagattaaa cgccatgctg gaactgaaga

3360

aagaatttag ctgcatggtg ggactttctg atcatacaac agataatctg gcatgccttg

3420

gcgcggtcgt tcttggagcg tgtgtcttag aaagacattt tacagattca atgcatcgca

3480

gcggaccgga tattgtttgt tctatggata caaaagcctt aaaagaactg atcattcaat

3540

cagaacagat ggcaatcatt cgcggcaata acgaatcaaa gaaagcagcc aaacaagaac

3600

aggttacaat cgattttgct tttgcctctg tggtctcaat caaagatatt aagaaaggcg

3660

aagttctgtc aatggataat atttgggtga aaagaccggg acttggcgga atcagcgcag

3720

cggaatttga aaatattctg ggcaagaaag cactgcgcga tattgaaaac gatgcgcagt

3780

taagctatga agattttgct taagctctta aggaggattt tagaatgaag aaaattctgt

3840

ttatcacagg ctcaagagcg gattactcta aaatcaaatc acttatgtac cgcgtccaaa

3900

attcaagcga atttgaactt tacatctttg ctacaggcat gcatctgagc aaaaactttg

3960

gatacacagt taaagaatta tataaaaatg gctttaaaaa catctacgaa tttatcaact

4020

acgataaata ttatcagaca gataaagccc tggcaacaac aattgatgga ttttcaagat

4080

atgcgaacga attaaaaccg gatctgattg ttgtgcatgg cgatcgcatc gaaccgcttg

4140

cagcggctat tgtcggagcc cttaacaaca tcctggttgc acatatcgaa ggcggagaaa

4200

ttagcggaac aatcgatgat tctttaagac atgcgatttc aaaacttgct catatccatc

4260

tggtgaacga tgaatttgca aaaagacgcc ttatgcaatt aggcgaagat gaaaaatcaa

4320

tctttatcat cggatctccg gatctggaac tgcttaacga taacaaaatc tcacttagcg

4380

aagccaaaaa atactacgat attaactacg aaaactatgc attactgatg tttcatccgg

4440

tcacaacaga aatcacatct atcaaaaacc aagccgataa cctggtgaaa gcacttatcc

4500

agtcaaacaa aaactacatc gtcatctatc cgaataacga tctgggcttt gaactgatcc

4560

ttcagagcta tgaagaattt aaaaacaacc cgagatttaa actgtttccg tctctgcgct

4620

ttgaatactt tatcacactt ctgaaaaacg ccgattttat tatcggaaac tcttcatgca

4680

tcctgaaaga agcgttatac ctgaaaacag ctggcattct ggttggatca agacaaaatg

4740

gccgcttagg aaatgaaaac acactgaaag tgaatgcgaa cagcgatgaa atccttaaag

4800

ctatcaacac aatccataaa aaacaggatt tattttctgc taaactggaa attcttgata

4860

gctctaaact gtttttcgaa tatcttcaat caggcgattt ctttaaactt agcacacaga

4920

aagtttttaa agatattaaa taaaaaggag gaactactat gtcacttgca attatcccgg

4980

cgagaggcgg aagcaaaggc atcaaaaaca aaaacctggt tctgcttaac aacaaaccgc

5040

ttatctacta cacaatcaaa gcagcgctga atgctaaatc tatttcaaaa gttgtggtct

5100

caagcgatag cgatgaaatc cttaactacg ccaaatctca aaacgtggat attctgaaaa

5160

gaccgatctc tcttgcacag gatgatacaa catcagataa agtcttactg catgcgctga

5220

aattttacaa agattacgaa gatgttgtgt ttttacaacc gacatctccg ctgcgcacaa

5280

acattcatat caacgaagca tttaacctgt acaaaaattc aaacgctaat gccctgatta

5340

gcgtctctga atgcgataac aaaatcctta aagcatttgt ttgcaacgat tgtggcgatt

5400

tagccggaat ttgtaatgat gaatatccgt ttatgccgcg ccagaaactg ccgaaaacat

5460

atatgagcaa cggagcgatc tacatcctta aaatcaaaga atttctgaac aacccgtcat

5520

ttctgcaaag caaaacaaaa cattttctta tggatgaatc atcatcactg gatattgatt

5580

gcctggaaga tttaaagaaa gttgaacaaa tttggaaaaa ataaagatta actaataagg

5640

aggacaaaca tgaaaagaat cttttgcctt gtgtctgcaa tcctgctttc agcgtgtaat

5700

gataaccaga atacagtcga tgttgtggtc tcaacagtga acgataacgt catcgaaaac

5760

aacacatacc aggtcaaacc gatcgataca ccgacaacat ttgatagcta ttcttggatt

5820

caaacatgcg gcacaccgat ccttaaagat gatgaaaaat actcactgtc atttgatttt

5880

gttgctccgg aattagatca ggatgaaaaa ttttgttttg aatttacagg cgatgttgat

5940

ggaaaacgct atgtgacaca aacaaatctg acagttgtgg caccgacact tgaagtgtat

6000

gtcgatcatg cgagcctgcc gtctcttcaa cagctgatga aaatcatcca acagaaaaac

6060

gaatactctc agaacgaaag atttatctca tggggccgca tcggacttac agaagataac

6120

gctgaaaaac tgaatgccca tatttatccg ctggctggaa ataacacatc tcaagaatta

6180

gtcgatgcag ttatcgatta cgcggattca aaaaacagac tgaatctgga acttaacaca

6240

aacacagctc atagctttcc gaacttagcc ccgattctgc gcattatctc aagcaaaagc

6300

aacatcctga tctctaacat caacctttac gatgatggct cagccgaata cgtgaacctg

6360

tacaactgga aagatacaga agataaaagc gtcaaactgt ctgattcatt tttagttctg

6420

aaagattact ttaatggaat ttcttcagaa aaaccgagcg gcatctatgg aagatataac

6480

tggcatcagc tgtacaacac atcttactat tttctgagaa aagattatct gacagtcgaa

6540

ccgcaactgc atgatcttcg cgaatatctt ggcggatcat taaaacagat gagctgggat

6600

ggcttttcac aactgagcaa aggagataaa gaactgtttc tgaacattgt tggctttgat

6660

caagaaaaac tgcaacagga atatcaacag agcgaacttc cgaattttgt gtttacagga

6720

acaacaacat gggcaggcgg agaaacaaaa gaatattatg cgcaacagca agttaacgtc

6780

gttaacaacg caatcaacga aacatctccg tactacctgg gcagagaaca tgatcttttc

6840

tttaaaggac atccgcgcgg cggaattatc aatgatatta tcctgggctc atttaataac

6900

atgattgata ttccggcgaa agttagcttt gaagtgctta tgatgacagg aatgttaccg

6960

gatacagtgg gcggaattgc atcatcactg tattttagca tcccggccga aaaagtctct

7020

tttatcgttt ttacatcaag cgatacaatc acagatcgcg aagatgctct gaaatctccg

7080

cttgttcagg tgatgatgac actgggcatt gtgaaagaaa aagatgtcct gttttggtca

7140

gatttaccgg attgctcttc aggagtttgt attgcccaat attaaagtga tagcggtacc

7200

attataggta agagaggaat gtacacatgt actatttaaa aaacacaaac ttttggatgt

7260

tcggtttatt ctttttcttt tactttttta tcatgggagc ctacttcccg tttttcccga

7320

tttggctaca tgacatcaac catatcagca aaagtgatac gggtattatt tttgccgcta

7380

tttctctgtt ctcgctatta ttccaaccgc tgtttggtct gctttctgac aaactcgggc

7440

tgcgcaaata cctgctgtgg attattaccg gcatgttagt gatgtttgcg ccgttcttta

7500

tttttatctt cgggccactg ttacaataca acattttagt aggatcgatt gttggtggta

7560

tttatctagg cttttgtttt aacgccggtg cgccagcagt agaggcattt attgagaaag

7620

tcagccgtcg cagtaatttc gaatttggtc gcgcgcggat gtttggctgt gttggctggg

7680

cgctgtgtgc ctcgattgtc ggcatcatgt tcaccatcaa taatcagttt gttttctggc

7740

tgggctctgg ctgtgcactc atcctcgccg ttttactctt tttcgccaaa acggatgcgc

7800

cctcttctgc cacggttgcc aatgcggtag gtgccaacca ttcggcattt agccttaagc

7860

tggcactgga actgttcaga cagccaaaac tgtggttttt gtcactgtat gttattggcg

7920

tttcctgcac ctacgatgtt tttgaccaac agtttgctaa tttctttact tcgttctttg

7980

ctaccggtga acagggtacg cgggtatttg gctacgtaac gacaatgggc gaattactta

8040

acgcctcgat tatgttcttt gcgccactga tcattaatcg catcggtggg aaaaacgccc

8100

tgctgctggc tggcactatt atgtctgtac gtattattgg ctcatcgttc gccacctcag

8160

cgctggaagt ggttattctg aaaacgctgc atatgtttga agtaccgttc ctgctggtgg

8220

gctgctttaa atatattacc agccagtttg aagtgcgttt ttcagcgacg atttatctgg

8280

tctgtttctg cttctttaag caactggcga tgatttttat gtctgtactg gcgggcaata

8340

tgtatgaaag catcggtttc cagggcgctt atctggtgct gggtctggtg gcgctgggct

8400

tcaccttaat ttccgtgttc acgcttagcg gccccggccc gctttccctg ctgcgtcgtc

8460

aggtgaatga agtcgcttaa ggatccatgt ctagagtcga cgtccccggg gcagcccgcc

8520

taatgagcgg gcttttttca cgtcccaggc atcaaataaa acgaaaggct cagtcgaaag

8580

actgggcctt tcgttttatc tgttgtttgt cggtgaacgc tctctactag agtcacactg

8640

gctcaccttc gggtgggcct ttctgcgttt atacccgggg cagcccgcct aatgagcggg

8700

cttttttcac gtcacgcgtc catggagatc tttgtctgca actgaaaagt ttatacctta

8760

cctggaacaa atggttgaaa catacgaggc taatatcggc ttattaggaa tagtccctgt

8820

actaataaaa tcaggtggat cagttgatca gtatattttg gacgaagctc ggaaagaatt

8880

tggagatgac ttgcttaatt ccacaattaa attaagggaa agaataaagc gatttgatgt

8940

tcaaggaatc acggaagaag atactcatga taaagaagct ctaaaactat tcaataacct

9000

tacaatggaa ttgatcgaaa gggtggaagg ttaatggtac gaaaattagg ggatctacct

9060

agaaagccac aaggcgatag gtcaagctta aagaaccctt acatggatct tacagattct

9120

gaaagtaaag aaacaacaga ggttaaacaa acagaaccaa aaagaaaaaa agcattgttg

9180

aaaacaatga aagttgatgt ttcaatccat aataagatta aatcgctgca cgaaattctg

9240

gcagcatccg aagggaattc atattactta gaggatacta ttgagagagc tattgataag

9300

atggttgaga cattacctga gagccaaaaa actttttatg aatatgaatt aaaaaaaaga

9360

accaacaaag gctgagacag actccaaacg agtctgtttt tttaaaaaaa atattaggag

9420

cattgaatat atattagaga attaagaaag acatgggaat aaaaatattt taaatccagt

9480

aaaaatatga taagattatt tcagaatatg aagaactctg tttgtttttg atgaaaaaac

9540

aaacaaaaaa aatccaccta acggaatctc aatttaacta acagcggcca aactgagaag

9600

ttaaatttga gaaggggaaa aggcggattt atacttgtat ttaactatct ccattttaac

9660

attttattaa accccataca agtgaaaatc ctcttttaca ctgttccttt aggtgatcgc

9720

ggagggacat tatgagtgaa gtaaacctaa aaggaaatac agatgaatta gtgtattatc

9780

gacagcaaac cactggaaat aaaatcgcca ggaagagaat caaaaaaggg aaagaagaag

9840

tttattatgt tgctgaaacg gaagagaaga tatggacaga agagcaaata aaaaactttt

9900

ctttagacaa atttggtacg catatacctt acatagaagg tcattataca atcttaaata

9960

attacttctt tgatttttgg ggctattttt taggtgctga aggaattgcg ctctatgctc

10020

acctaactcg ttatgcatac ggcagcaaag acttttgctt tcctagtcta caaacaatcg

10080

ctaaaaaaat ggacaagact cctgttacag ttagaggcta cttgaaactg cttgaaaggt

10140

acggttttat ttggaaggta aacgtccgta ataaaaccaa ggataacaca gaggaatccc

10200

cgatttttaa gattagacgt aaggttcctt tgctttcaga agaactttta aatggaaacc

10260

ctaatattga aattccagat gacgaggaag cacatgtaaa gaaggcttta aaaaaggaaa

10320

aagagggtct tccaaaggtt ttgaaaaaag agcacgatga atttgttaaa aaaatgatgg

10380

atgagtcaga aacaattaat attccagagg ccttacaata tgacacaatg tatgaagata

10440

tactcagtaa aggagaaatt cgaaaagaaa tcaaaaaaca aatacctaat cctacaacat

10500

cttttgagag tatatcaatg acaactgaag aggaaaaagt cgacagtact ttaaaaagcg

10560

aaatgcaaaa tcgtgtctct aagccttctt ttgatacctg gtttaaaaac actaagatca

10620

aaattgaaaa taaaaattgt ttattacttg taccgagtga atttgcattt gaatggatta

10680

agaaaagata tttagaaaca attaaaacag tccttgaaga agctggatat gttttcgaaa

10740

aaatcgaact aagaaaagtg caataaactg ctgaagtatt tcagcagttt tttttattta

10800

gaaatagtga aaaaaatata atcagggagg tatcaatatt taatgagtac tgatttaaat

10860

ttatttagac tggaattaat aattaacacg tagactaatt aaaatttaat gagggataaa

10920

gaggatacaa aaatattaat ttcaatccct attaaatttt aacaaggggg ggattaaaat

10980

ttaattagag gtttatccac aagaaaagac cctaataaaa tttttactag ggttataaca

11040

ctgattaatt tcttaatggg ggagggatta aaatttaatg acaaagaaaa caatctttta

11100

agaaaagctt ttaaaagata ataataaaaa gagctttgcg attaagcaaa actctttact

11160

ttttcattga cattatcaaa ttcatcgatt tcaaattgtt gttgtatcat aaagttaatt

11220

ctgttttgca caaccttttc aggaatataa aacacatctg aggcttgttt tataaactca

11280

gggtcgctaa agtcaatgta acgtagcata tgatatggta tagcttccac ccaagttagc

11340

ctttctgctt cttctgaatg tttttcatat acttccatgg gtatctctaa atgattttcc

11400

tcatgtagca aggtatgagc aaaaagttta tggaattgat agttcctctc tttttcttca

11460

acttttttat ctaaaacaaa cactttaaca tctgagtcaa tgtaagcata agatgttttt

11520

ccagtcataa tttcaatccc aaatctttta gacagaaatt ctggacgtaa atcttttggt

11580

gaaagaattt ttttatgtag caatatatcc gatacagcac cttctaaaag cgttggtgaa

11640

tagggcattt tacctatctc ctctcatttt gtggaataaa aatagtcata ttcgtccatc

11700

tacctatcct attatcgaac agttgaactt tttaatcaag gatcagtcct ttttttcatt

11760

attcttaaac tgtgctctta actttaacaa ctcgatttgt ttttccagat ctcgagggta

11820

actagcctcg ccgatcccgc aagaggcccg gcagtcaggt ggcacttttc ggggaaatgt

11880

gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc cgctcatgag

11940

acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga gtattcaaca

12000

tttccgtgtc gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt ttgctcaccc

12060

agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag tgggttacat

12120

cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag aacgttttcc

12180

aatgatgagc acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgta ttgacgccgg

12240

gcaagagcaa ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat gacttggttg agtactcacc

12300

agtcacagaa aagcatctta cggatggcat gacagtaaga gaattatgca gtgctgccat

12360

aaccatgagt gataacactg cggccaactt acttctgaca acgatcggag gaccgaagga

12420

gctaaccgct tttttgcaca acatggggga tcatgtaact cgccttgatc gttgggaacc

12480

ggagctgaat gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg tagcaatggc

12540

aacaacgttg cgcaaactat taactggcga actacttact ctagcttccc ggcaacaatt

12600

aatagactgg atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg cccttccggc

12660

tggctggttt attgctgata aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg gtatcattgc

12720

agcactgggg ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt atctacacga cggggagtca

12780

ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat cgctgagata ggtgcctcac tgattaagca

12840

ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag attgatttaa aacttcattt

12900

ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca aaatccctta

12960

acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg

13020

agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc

13080

ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag

13140

cagagcgcag ataccaaata ctgtccttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa

13200

gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc

13260

cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc

13320

gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta

13380

caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag

13440

aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct

13500

tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga

13560

gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc

13620

ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt

13680

atcccctgat tctgtggata accgtattac cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg

13740

cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc gcccaatacg

13800

catgc

13805

<210> 4

<211> 10838

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Суицидная плазмида

<400> 4

ttctcatgtt tgacagctta tcatcgataa gctttaatgc ggtagtttat cacagttaaa

60

ttgctaacgc agtcaggcac cgtgtatgaa atctaacaat gcgctcatcg tcatcctcgg

120

caccgtcacc ctggatgctg taggcatagg cttggttatg ccggtactgc cgggcctctt

180

gcgggatatc gtccattccg acagcatcgc cagtcactat ggcgtgctgc tagcgctata

240

tgcgttgatg caatttctat gcgcacccgt tctcggagca ctgtccgacc gctttggccg

300

ccgcccagtc ctgctcgctt cgctacttgg agccactatc gactacgcga tcatggcgac

360

cacacccgtc ctgtggatcc tctacgccgg acgcatcgtg gccggcatca ccggcgccac

420

aggtgcggtt gctggcgcct atatcgccga catcaccgat ggggaagatc gggctcgcca

480

cttcgggctc atgagcgctt gtttcggcgt gggtatggtg gcaggccccg tggccggggg

540

actgttgggc gccatctcct tgcatgcacc attccttgcg gcggcggtgc tcaacggcct

600

caacctacta ctgggctgct tcctaatgca ggagtcgcat aagggagagc gtcgaccgat

660

gcccttgaga gccttcaacc cagtcagctc cttccggtgg gcgcggggca tgactatcgt

720

cgccgcactt atgactgtct tctttatcat gcaactcgta ggacaggtgc cggcagcgct

780

ctgggtcatt ttcggcgagg accgctttcg ctggagcgcg acgatgatcg gcctgtcgct

840

tgcggtattc ggaatcttgc acgccctcgc tcaagccttc gtcactggtc ccgccaccaa

900

acgtttcggc gagaagcagg ccattatcgc cggcatggcg gccgacgcgc tgggctacgt

960

cttgctggcg ttcgcgacgc gaggctggat ggccttcccc attatgattc ttctcgcttc

1020

cggcggcatc gggatgcccg cgttgcaggc catgctgtcc aggcaggtag atgacgacca

1080

tcagggacag cttcaaggat cgctcgcggc tcttaccagc ctaacttcga tcactggacc

1140

gctgatcgtc acggcgattt atgccgcctc ggcgagcaca tggaacgggt tggcatggat

1200

tgtaggcgcc gccctatacc ttgtctgcct ccccgcgttg cgtcgcggtg catggagccg

1260

ggccacctcg acctgaatgg aagccggcgg cacctcgcta acggattcac cactccaaga

1320

attggagcca atcaattctt gcggagaact gtgaatgcgc aaaccaaccc ttggcagaac

1380

atatccatcg cgtccgccat ctccagcagc cgcacgcggc gcatctcggg cagcgttggg

1440

tcctggccac gggtgcgcat gatcgtgctc ctgtcgttga ggacccggct aggctggcgg

1500

ggttgcctta ctggttagca gaatgaatca ccgatacgcg agcgaacgtg aagcgactgc

1560

tgctgcaaaa cgtctgcgac ctgagcaaca acatgaatgg tcttcggttt ccgtgtttcg

1620

taaagtctgg aaacgcggaa gtcagcgccc tgcaccatta tgttccggat ctgcatcgca

1680

ggatgctgct ggctaccctg tggaacacct acatctgtat taacgaagcg ctggcattga

1740

ccctgagtga tttttctctg gtcccgccgc atccataccg ccagttgttt accctcacaa

1800

cgttccagta accgggcatg ttcatcatca gtaacccgta tcgtgagcat cctctctcgt

1860

ttcatcggta tcattacccc catgaacaga aatccccctt acacggaggc atcagtgacc

1920

aaacaggaaa aaaccgccct taacatggcc cgctttatca gaagccagac attaacgctt

1980

ctggagaaac tcaacgagct ggacgcggat gaacaggcag acatctgtga atcgcttcac

2040

gaccacgctg atgagcttta ccgcagctgc ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac

2100

ctctgacaca tgcagctccc ggagacggtc acagcttgtc tgtaagcgga tgccgggagc

2160

agacaagccc gtcagggcgc gtcagcgggt gttggcgggt gtcggggcgc agccatgacc

2220

cagtcacgta gcgatagcgg agtgtatact ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg

2280

tactgagagt gcaccagcgg gcaaggaaag ccttcaatat gtgcagtggt atgtcaactc

2340

tatgaagatc agcctgttta caatggcagg gtctttgctc tgtgtgacgt ttacggccta

2400

tgcgttttcg cgctttcggt ttaaagggag gaaatacgct ttaacgctct ttttattgct

2460

gcagatgatt cctcagtttt cagctttaat tgccttgttt gtgctggcgc aaatcttggg

2520

aatgatcaat agccactggc tgctaatctt gctttatatc ggcggcctga tcccgatgaa

2580

tacgtatttg atgaaagggt acatggattc cattccgatg gatttagacg aaagcgccaa

2640

gattgacgga gccagcagca ccagaatctt cttccagatc attctgccat tatcaaaacc

2700

gatggcggca gtcgtggcca tgaacggctt taccggtccg ctcggagatt ttgtgctgtc

2760

ctcaaccata ttgagaacgc ctgaatcata tacattgccc gtcggtctat tcaatttagt

2820

gaatgatgtc atgggggcca gctatacgac atttgcggcc ggagccctgc ttatcagcat

2880

accggttgcc gtcatcttta ttatgctgca aaagaatttt gtgtccggat taaccgcagg

2940

cggaacgaag ggctaagaga acaaggagga gaatgtgatg tcaaagcttg aaaaaacgca

3000

cgtaacaaaa gcaaaattta tgctccatgg gggagactac aaccccgatc agtggctgga

3060

tcggcccgat attttagctg acgatatcaa actgatgaag ctttctcata cgaatacgtt

3120

ttctgtcggc aattttacat ttttagaaat gggcgtgaaa aaaagcgcgc gattatgtaa

3180

aatataaaga ttaactaata aggaggacaa acatgacaga acagtacatc aaaaacgttg

3240

aagtgtatct tgattatgca acaatcccga cactgaacta cttttaccat tttacagaaa

3300

acaaagatga tattgcgaca attagactgt ttggccttgg acgctttaac atctctaaat

3360

caatcatcga atcatatccg gaaggcatta tcagatattg cccgattatc tttgaagatc

3420

agacagcttt tcaacagctg tttatcacac tgcttacaga agattctttt tgtcaatacc

3480

gctttaactt tcatattaac ctgtttcatt catggaaaat gcttatcccg ctgctgcata

3540

ttatctggca atttaaacat aaagtcctgg atattaaact taacttttat gatgatggct

3600

ctgaaggact ggttacactg tcaaaaatcg aacaaaacta ttcaagcgaa attcttcaga

3660

aaatcatcga tattgatagc caatcttttt acgctgataa acttagcttt ttagatgaag

3720

atattgccag atatttatgg aatagcctgt ttgaatcaca ttactatctt ttaaacgatt

3780

ttctgcttaa aaacgaaaaa ctgagcttac tgaaaaactc tatcaaatac tgccatatca

3840

tggatcttga acgctattta caatttacac aggaagaaaa agatttcttt aacgaacttc

3900

tgggcattaa catccagagc cttgaagata aaatcaaaat ctttcaacaa aagaaaacat

3960

ttatttttac aggaacaaca atcttttctc tgccgaaaga agaagaagaa acactttaca

4020

gactgcatct gaacgctatc cttaactaca tccatccgaa cggcaaatac tttatcggcg

4080

atggatttac actggtgatc aaaggacatc cgcatcaaaa agaaatgaat agcagactgg

4140

aaaaatcatt tgaaaaagcc gtcatgctgc cggataacat cccgtttgaa attctttacc

4200

tgatcggctg caaaccggat aaaattggcg gatttgtttc aacaagctac ttttcatgtg

4260

ataagaaaaa tattgcggat ctgctgttta tcagcgcgag acaggaagaa gtgcgcaaaa

4320

acgattatct ttttaacatc caataccagc tgagagatat gatgatcaaa acaggattta

4380

tccaagaaga aaaaacacat ttttacagcg atattccgat ctttatttct taaaaaggag

4440

gaactactat gtcacttgca attatcccgg cgagaggcgg aagcaaaggc atcaaaaaca

4500

aaaacctggt tctgcttaac aacaaaccgc ttatctacta cacaatcaaa gcagcgctga

4560

atgctaaatc tatttcaaaa gttgtggtct caagcgatag cgatgaaatc cttaactacg

4620

ccaaatctca aaacgtggat attctgaaaa gaccgatctc tcttgcacag gatgatacaa

4680

catcagataa agtcttactg catgcgctga aattttacaa agattacgaa gatgttgtgt

4740

ttttacaacc gacatctccg ctgcgcacaa acattcatat caacgaagca tttaacctgt

4800

acaaaaattc aaacgctaat gccctgatta gcgtctctga atgcgataac aaaatcctta

4860

aagcatttgt ttgcaacgat tgtggcgatt tagccggaat ttgtaatgat gaatatccgt

4920

ttatgccgcg ccagaaactg ccgaaaacat atatgagcaa cggagcgatc tacatcctta

4980

aaatcaaaga atttctgaac aacccgtcat ttctgcaaag caaaacaaaa cattttctta

5040

tggatgaatc atcatcactg gatattgatt gcctggaaga tttaaagaaa gttgaacaaa

5100

tttggaaaaa ataagctctt aaggaggatt ttagaatgag cacaacaaca caaaatatcc

5160

cgtggtatcg ccatcttaac agagcccagt ggcgcgcatt ttctgcagcg tggttaggct

5220

atctgcttga tggatttgat tttgttctga ttgcactggt tcttacagaa gtgcaaggcg

5280

aatttggact tacaacagtg caggctgcct ctttaatttc agcagcgttt atcagcagat

5340

ggtttggcgg attaatgctg ggcgcaatgg gagatcgcta tggaagacgc ctggcgatgg

5400

tcacatctat tgttctgttt tcagcgggca cattagcttg cggctttgcc ccgggatata

5460

ttacaatgtt tatcgcgaga cttgtgattg gcatgggaat ggcaggcgaa tatggatcaa

5520

gcgcgacgta tgttatcgaa tcttggccga aacatctgcg caataaagca tcaggatttc

5580

ttattagcgg cttttctgtg ggagcggttg tggctgccca agtctattct cttgtcgttc

5640

cggtttgggg atggagagca ctgtttttca ttggcatcct tccgattatc tttgctcttt

5700

ggttacgcaa aaatatcccg gaagccgaag attggaaaga aaaacatgcc ggaaaagcac

5760

ctgtgagaac aatggtcgat attctgtata gaggcgaaca tcgcattgct aacatcgtta

5820

tgacattagc agcggctaca gctctgtggt tttgctttgc cggaaattta caaaacgccg

5880

caatcgttgc tgtgctgggc ttactgtgtg cggctatttt tatcagcttt atggttcagt

5940

ctgccggaaa acgctggccg acaggcgtga tgttaatggt ggtcgttctg tttgcttttc

6000

tttattcatg gccgattcaa gcccttttac cgacatacct gaaaacagat ttagcttaca

6060

atccgcatac agtggccaac gtcctgtttt tctcaggctt tggagccgca gttggctgct

6120

gtgtgggcgg atttcttggc gattggttag gaacaagaaa agcgtatgtt tgttcactgc

6180

ttgcgagcca gttactgatt atcccggttt ttgcaatcgg cggagcgaat gtctgggttc

6240

ttggactttt actgtttttc caacagatgt taggccaagg aattgctggc atcttaccga

6300

aactgattgg cggatatttt gatacagatc agagagcggc tggccttgga tttacatata

6360

atgttggagc actgggcgga gcccttgcac cgattatcgg agcgttaatt gctcaacgcc

6420

tggatcttgg cacagcgctt gcttctttat catttagcct gacatttgtg gtcattcttt

6480

taatcggcct tgatatgccg tcaagagttc agcgctggtt aagaccggaa gcactgagaa

6540

cacatgatgc gattgatggc aaaccgtttt caggagctgt gccgtttggc agcgccaaaa

6600

acgatctggt caaaacaaaa tcataaccag gcatcaaata aaacgaaagg ctcagtcgaa

6660

agactgggcc tttcgtttta tctgttgttt gtcggtgaac gctctctact agagtcacac

6720

tggctcacct tcgggtgggc ctttctgcgt ttatatacgc gttaacccgg gcccgcggat

6780

ggatatgatc agatccttta actctggcaa ccctcaaaat tgaatgagac atgctacacc

6840

tccggataat aaatatatat aaacgtatat agatttcata aagtctaaca cactagactt

6900

atttacttcg taattaagtc gttaaaccgt gtgctctacg accaaaacta taaaaccttt

6960

aagaactttc tttttttaca agaaaaaaga aattagataa atctctcata tcttttattc

7020

aataatcgca tccgattgca gtataaattt aacgatcact catcatgttc atatttatca

7080

gagctcgtgc tataattata ctaattttat aaggaggaaa aaatatgggc atttttagta

7140

tttttgtaat cagcacagtt cattatcaac caaacaaaaa ataagtggtt ataatgaatc

7200

gttaataagc aaaattcata taaccaaatt aaagagggtt ataatgaacg agaaaaatat

7260

aaaacacagt caaaacttta ttacttcaaa acataatata gataaaataa tgacaaatat

7320

aagattaaat gaacatgata atatctttga aatcggctca ggaaaaggcc attttaccct

7380

tgaattagta aagaggtgta atttcgtaac tgccattgaa atagaccata aattatgcaa

7440

aactacagaa aataaacttg ttgatcacga taatttccaa gttttaaaca aggatatatt

7500

gcagtttaaa tttcctaaaa accaatccta taaaatatat ggtaatatac cttataacat

7560

aagtacggat ataatacgca aaattgtttt tgatagtata gctaatgaga tttatttaat

7620

cgtggaatac gggtttgcta aaagattatt aaatacaaaa cgctcattgg cattactttt

7680

aatggcagaa gttgatattt ctatattaag tatggttcca agagaatatt ttcatcctaa

7740

acctaaagtg aatagctcac ttatcagatt aagtagaaaa aaatcaagaa tatcacacaa

7800

agataaacaa aagtataatt atttcgttat gaaatgggtt aacaaagaat acaagaaaat

7860

atttacaaaa aatcaattta acaattcctt aaaacatgca ggaattgacg atttaaacaa

7920

tattagcttt gaacaattct tatctctttt caatagctat aaattattta ataagtaagc

7980

gaggcaggat caggacaatg attatatttt tgtcatgaat ttcacggaag aaaaacagct

8040

ggtcacgttt gatcagagtg tgaaggacat aatgacagga gacatattgt caggcgacct

8100

gacgatggaa aagtatgaag tgagaattgt cgtaaacaca cattaggctg atgctccgct

8160

cgatatgggc ggattctttt ttctatagaa tgaaaacgct tgctaagtct tggggggatg

8220

aaatcatgaa aagcaaagtg aaaatgttct ttgcggctgc catcgtgtgg agtgcatgta

8280

gttcaacagg atatgccgct gccattgaga aggagaagca cgtgtcagag cttcgggcag

8340

aggatctttt tgttaaaaaa gtagagggga tgaacaagga ttttatcaaa ggggcagatg

8400

tatccagcgt tattgctttg gaaaacagcg gtgtcacctt ttacaataca aacggaaaac

8460

gccaggatat ctttacaact ttaaaacagg ctggggtcaa ctatgttcgc gtccgcatct

8520

ggaatcaccc gtatgattca aatggcaacg ggtatggcgg gggaaacaat gatgttcaaa

8580

aagccatcga aatcggaaaa agagcgacag cgaacggaat gaaggtgctg gccgactttc

8640

actactctga tttctgggcc gatccagcga aacaaaaggt gcccaaagcc tgggcgaatc

8700

tcagctttga agcaaaaaaa gcaaagctct atgagtatac gaaacaaagc ctgcaaaaga

8760

tgatcaagga aggcgtgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca

8820

tcaggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc

8880

gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg

8940

caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt

9000

tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa

9060

gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct

9120

ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc

9180

cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg

9240

tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct

9300

tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag

9360

cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga

9420

agtggtggcc taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga

9480

agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg

9540

gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag

9600

aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag

9660

ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat

9720

gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct

9780

taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac

9840

tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa

9900

tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg

9960

gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt

10020

gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca

10080

ttgctgcagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt

10140

cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct

10200

tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg

10260

cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg

10320

agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg

10380

cgtcaacacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa

10440

aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt

10500

aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt

10560

gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt

10620

gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca

10680

tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat

10740

ttccccgaaa agtgccacct gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca ttaacctata

10800

aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc ttcaagaa

10838

<210> 5

<211> 4254

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Интерграционная кассета

<400> 5

gcaggctgtt attgtaacat gtaagccata agccattcgt aaaagtgcgg gaggaaggtc

60

atgaataatc tgcgtaatag actttcaggc gtgaatggga aaaataagag agtaaaagaa

120

aaagaacaaa aaatctggtc ggagattggg atgatagcgg gagcatttgc gctgcttgat

180

gtgatcatcc gcggcattat gtttgaattt ccgtttaaag aatgggctgc aagccttgtg

240

tttttgttca tcattatctt atattactgc atcagggctg cggcatccgg aatgctcatg

300

ccgagaatag acaccaaaga agaactgcaa aaacgggtga agcagcagcg aatagaatca

360

attgcggtcg cctttgcggt agtggtgctt acgatgtacg acagggggat tccccataca

420

ttcttcgctt ggctgaaaat gattcttctt tttatcgtct gcggcggcgt tctgtttctg

480

cttcggtatg tgattgtgaa gctggcttac agaagagcgg taaaagaaga aataaaaaag

540

aaatcatctt ttttgtttgg aaagcgaggg aagcgttcac agtttcgggc agcttttttt

600

ataggaacat tgatttgtat tcactctgcc aagttgtttt gatagagtga ttgtgataat

660

tttaaatgta agcgttaaca aaattctcca gtcttcacat cggtttgaaa ggaggaagcg

720

gaagaatgaa gtaagaggga tttttgactc cgaagtaagt cttcaaaaaa tcaaataagg

780

agtgtcaaga atgtttgcaa aacgattcaa aacctcttta ctgccgttat tcgctggatt

840

tttattgctg tttcatttgg ttctggcagg accggcggct gcgagtgctg aaacggcgaa

900

caaatcgaat gagcttacag caccgtcgat caaaagcgga accattcttc atgcatggcc

960

agtgaattcg agctcggtac ctaccgttcg tataatgtat gctatacgaa gttatgataa

1020

aaaatttaga agccaatgaa atctataaat aaactaaatt aagtttattt aattaacaac

1080

tatggatata aaataggtac taatcaaaat agtgaggagg atatatttga atacatacga

1140

acaaattaat aaagtgaaaa aaatacttcg gaaacattta aaaaataacc ttattggtac

1200

ttacatgttt ggatcaggag ttgagagtgg actaaaacca aatagtgatc ttgacttttt

1260

agtcgtcgta tctgaaccat tgacagatca aagtaaagaa atacttatac aaaaaattag

1320

acctatttca aaaaaaatag gagataaaag caacttacga tatattgaat taacaattat

1380

tattcagcaa gaaatggtac cgtggaatca tcctcccaaa caagaattta tttatggaga

1440

atggttacaa gagctttatg aacaaggata cattcctcag aaggaattaa attcagattt

1500

aaccataatg ctttaccaag caaaacgaaa aaataaaaga atatacggaa attatgactt

1560

agaggaatta ctacctgata ttccattttc tgatgtgaga agagccatta tggattcgtc

1620

agaggaatta atagataatt atcaggatga tgaaaccaac tctatattaa ctttatgccg

1680

tatgatttta actatggaca cgggtaaaat cataccaaaa gatattgcgg gaaatgcagt

1740

ggctgaatct tctccattag aacataggga gagaattttg ttagcagttc gtagttatct

1800

tggagagaat attgaatgga ctaatgaaaa tgtaaattta actataaact atttaaataa

1860

cagattaaaa aaattataaa aaaattgaaa aaatggtgga aacacttttt tcaatttttt

1920

tgttttatta tttaatattt gggaaatatt cattctaata taacttcgta taatgtatgc

1980

tatacgaacg gtaggatcct ctagagtcga cctgcaggca ttttacattt ttagaaatgg

2040

gcgtgaaaaa aagcgcgcga ttatgtaaaa tataaagtga tagcggtacc attataggta

2100

agagaggaat gtacacatgt actatttaaa aaacacaaac ttttggatgt tcggtttatt

2160

ctttttcttt tactttttta tcatgggagc ctacttcccg tttttcccga tttggctaca

2220

tgacatcaac catatcagca aaagtgatac gggtattatt tttgccgcta tttctctgtt

2280

ctcgctatta ttccaaccgc tgtttggtct gctttctgac aaactcgggc tgcgcaaata

2340

cctgctgtgg attattaccg gcatgttagt gatgtttgcg ccgttcttta tttttatctt

2400

cgggccactg ttacaataca acattttagt aggatcgatt gttggtggta tttatctagg

2460

cttttgtttt aacgccggtg cgccagcagt agaggcattt attgagaaag tcagccgtcg

2520

cagtaatttc gaatttggtc gcgcgcggat gtttggctgt gttggctggg cgctgtgtgc

2580

ctcgattgtc ggcatcatgt tcaccatcaa taatcagttt gttttctggc tgggctctgg

2640

ctgtgcactc atcctcgccg ttttactctt tttcgccaaa acggatgcgc cctcttctgc

2700

cacggttgcc aatgcggtag gtgccaacca ttcggcattt agccttaagc tggcactgga

2760

actgttcaga cagccaaaac tgtggttttt gtcactgtat gttattggcg tttcctgcac

2820

ctacgatgtt tttgaccaac agtttgctaa tttctttact tcgttctttg ctaccggtga

2880

acagggtacg cgggtatttg gctacgtaac gacaatgggc gaattactta acgcctcgat

2940

tatgttcttt gcgccactga tcattaatcg catcggtggg aaaaacgccc tgctgctggc

3000

tggcactatt atgtctgtac gtattattgg ctcatcgttc gccacctcag cgctggaagt

3060

ggttattctg aaaacgctgc atatgtttga agtaccgttc ctgctggtgg gctgctttaa

3120

atatattacc agccagtttg aagtgcgttt ttcagcgacg atttatctgg tctgtttctg

3180

cttctttaag caactggcga tgatttttat gtctgtactg gcgggcaata tgtatgaaag

3240

catcggtttc cagggcgctt atctggtgct gggtctggtg gcgctgggct tcaccttaat

3300

ttccgtgttc acgcttagcg gccccggccc gctttccctg ctgcgtcgtc aggtgaatga

3360

agtcgcttaa gcaatcaatg tcggatgcca gcctggcttt gattacgtgc taaatggttt

3420

atataatgac tcgggcttaa gcggttctct tccccattga gggcaaggct agacgggact

3480

taccgaaaga aaccatcaat gatggtttct tttttgttca taaatcagac aaaacttttc

3540

tcttgcaaaa gtttgtgaag tgttgcacaa tataaatgtg aaatacttca caaacaaaaa

3600

gacatcaaag agaaacatac cctggaagga tgattaatga tgaacaaaca tgtaaataaa

3660

gtagctttaa tcggagcggg ttttgttgga agcagttatg catttgcgtt aattaaccaa

3720

ggaatcacag atgagcttgt ggtcattgat gtaaataaag aaaaagcaat gggcgatgtg

3780

atggatttaa accacggaaa ggcgtttgcg ccacaaccgg tcaaaacatc ttacggaaca

3840

tatgaagact gcaaggatgc tgatattgtc tgcatttgcg ccggagcaaa ccaaaaacct

3900

ggtgagacac gccttgaatt agtagaaaag aacttgaaga ttttcaaagg catcgttagt

3960

gaagtcatgg cgagcggatt tgacggcatt ttcttagtcg cgacaaatcc ggttgatatc

4020

ctgacttacg caacatggaa attcagcggc ctgccaaaag agcgggtgat tggaagcggc

4080

acaacacttg attctgcgag attccgtttc atgctgagcg aatactttgg cgcagcgcct

4140

caaaacgtac acgcgcatat tatcggagag cacggcgaca cagagcttcc tgtttggagc

4200

cacgcgaatg tcggcggtgt gccggtcagt gaactcgttg agaaaaacga tgcg

4254

<---

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой неспорообразующую клетку Bacillus для получения сиалированного олигосахарида, где указанная клетка Bacillus генетически сконструирована так, чтобы содержать лактозопермеазу, путь биосинтеза CMP-NeuNAc и сиалилтрансферазу, причем способность к споруляции клетки Bacillus нарушена в результате делеции или функциональной инактивации одного или более генов, кодирующих Spo0A, сигма E и сигма F. Изобретение относится также к способу получения сиалированного олигосахарида с использованием указанной клетки Bacillus. 3 н. и 10 з.п. ф-лы, 1 ил., 3 табл., 6 пр.

1. Неспорообразующая клетка Bacillus для получения сиалированного олигосахарида, где указанная клетка Bacillus генетически сконструирована так, чтобы содержать лактозопермеазу, путь биосинтеза CMP-NeuNAc и сиалилтрансферазу, причем способность к споруляции клетки Bacillus нарушена в результате делеции или функциональной инактивации одного или более генов, кодирующих Spo0A, сигма E и сигма F.

2. Клетка Bacillus по п. 1, в которой лактозопермеаза представляет собой LacY E. coli или ее функциональный вариант.

3. Клетка Bacillus по любому из пп. 1, 2, где в пути биосинтеза CMP-NeuNAc используется GlcN-1P или GlcNAc-6P в качестве промежуточного соединения.

4. Клетка Bacillus по любому из пп. 1-3, где в пути биосинтеза CMP-NeuNAc используется путь утилизации сиаловой кислоты.

5. Клетка Bacillus по любому из пп. 1-4, в которой сиалилтрансфераза представляет собой сиалилтрансферазу, акцептирующую лактозу, предпочтительно сиалилтрансферазу, выбранную из группы, состоящей из α-2,3-сиалилтрансфераз, α-2,6-сиалилтрансфераз и α-2,8-сиалилтрансфераз.

6. Клетка Bacillus по любому из пп. 1-5, где указанная клетка Bacillus не обладает какой-либо β-галактозидазной активностью или обладает пониженной β-галактозидазной активностью по сравнению с клеткой-предшественником Bacillus дикого типа того же вида.

7. Клетка Bacillus по п. 6, где указанная клетка Bacillus генетически сконструирована посредством делеции или функциональной инактивации по меньшей мере одного из генов, выбранных из группы, состоящей из yesZ и ganA.

8. Клетка Bacillus по любому из пп. 1-7, где указанная клетка Bacillus представляет собой клетку Bacillus subtilis.

9. Клетка Bacillus по любому из пп. 1-8, для применения в получении 3’-сиалиллактозы, где в пути биосинтеза CMP-NeuNAc используется GlcN-1P в качестве промежуточного соединения и где сиалилтрансфераза представляет собой α-2,3-сиалилтрансферазу.

10. Клетка Bacillus по любому из пп. 1-8, для применения в получении 6’-сиалиллактозы, где в пути биосинтеза CMP-NeuNAc используется GlcN-1P в качестве промежуточного соединения и где сиалилтрансфераза представляет собой α-2,6-сиалилтрансферазу.

11. Применение клетки Bacillus по любому из пп. 1-10 для получения сиалированного олигосахарида.

12. Способ получения сиалированного олигосахарида, включающий:

- предоставление неспорообразующей клетки Bacillus, как определено в любом из пп. 1-10;

- культивирование указанной клетки Bacillus в ферментационном бульоне и в условиях, которые являются пермиссивными в отношении получения сиалированного олигосахарида; и, возможно,

- извлечение сиалированного олигосахарида из среды и/или клетки Bacillus.

13. Способ по п. 12, в котором ферментационный бульон содержит лактозу.