Настоящее изобретение относится к получению олигосахаридов посредством микробной ферментации. Более конкретно, настоящее изобретение относится к применению гликозидаз для улучшения получения целевых олигосахаридов посредством микробной ферментации.

Предшествующий уровень техники

Человеческое грудное молоко содержит уникальную смесь разных олигосахаридов, называемых Олигосахаридами Грудного Молока (ОГМ). На сегодняшний день в человеческом грудном молоке идентифицировано более чем 150 структурно разных олигосахаридов. За очень редким исключением, ОГМ характеризуются лактозной группировкой на их восстанавливающем конце, и многие ОГМ содержат остаток фукозы и/или остаток N-ацетилнейраминовой кислоты на их невосстанавливающем конце. Обычно, остатки моносахаридов ОГМ происходят из D-глюкозы, D-галактозы, N-ацетилглюкозамина, L-фукозы и N-ацетилнейраминовой кислоты. Важность ОГМ для питания грудных детей прямо связано с их уникальными биологическими активностями, включая защиту новорожденного от патогенов, поддержку развития иммунной системы и познавательных способностей грудного ребенка. Таким образом, существует большой интерес к получению ОГМ в коммерческом масштабе.

Помимо химического синтеза отдельных ОГМ значительный прогресс был сделан в разработке получения ОГМ посредством микробной ферментации с использованием генетически модифицированных микроорганизмов, которые сверхэкспрессируют гетерологичную гликозилтрансферазу. При культивации таких микроорганизмов в среде и в условиях, являющихся пермиссивными в отношении экспрессии микроорганизмами указанной гетерологичной гликозилтрансферазы, ОГМ может быть продуцирован указанным микроорганизмом и выделен из культуральной среды или клеточного лизата.

Однако гликозилтрансферазы часто обладают ферментативными побочными активностями, таким образом, что их сверхэкспрессия для получения целевого олигосахарида обычно приводит к побочным продуктам, которые являются нежелательными. Обычно, данные побочные продукты также представляют собой олигосахариды, но которые должны быть удалены из препарата целевого олигосахарида для коммерческого применения продукта. Однако, удаление таких побочных продуктов из целевого олигосахарида является сложным и трудоемким. Один подход к удалению таких побочных продуктов включает применение гликозидаз, которых либо экзогенно добавляют к реакционной смеси/клеточной среде, содержащей желательные и нежелательные олигосахариды, либо продуцирует генетически сконструированный микроорганизм при индукции в конкретный момент времени в конце процесса ферментации для получения целевого олигосахарида.

Международная публикация WO 2015/032412 А1 относится к применению фукозы и в ней раскрыт способ, в котором генетически модифицированную клетку, экспрессирующую гетерологичную фукозилтрансферазу, культивируют в присутствии лактозы для продуцирования и секреции смеси 2'-фукозиллактозы (2'-FL- от англ. 2'-fucosyllactose) и дифукозиллактозы (DFL - от англ. difucosyllactose) во внеклеточное пространство культуральной среды с высоким выходом. Сахариды разделяют и подвергают гидролизу посредством кислоты или посредством фукозидазы с получением фукозы с высоким выходом.

В международной публикации №WO 2104/090261 А1 раскрыт способ образования смеси, содержащей по меньшей мере одну из 2'-FL и 3-фукозиллактозы β-FL), где DFL подвергается частичному гидролизу, например, ферментативному гидролизу или кислотному гидролизу. В ферментативном гидролизе DFL подвергают действию фукозидазы, которая может высвобождать один из остатков фукозы из DFL. DFL (10 мМ) инкубировали с 1,2-α-1_-фукозидазой из Xanthomonas manihotis при 37°С в инкубационном буфере, и гидролиз DFL отслеживали посредством ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография). Спустя 18 часов, DFL подвергали частичному гидролизу до 3-FL и фукозы. Лактозы не выявляли.

Европейская патентная заявка №ЕР 2845905 А1 относится к получению олигосахаридов и в ней раскрыто применение одного или более гликозидаз в способе получения и/или очистки олигосахарида. Способ включает а) культивирование микроорганизма-хозяина, подходящего для продукции целевого олигосахарида, в условиях и в среде, являющихся пермиссивными для продукции указанного целевого олигосахарида, в результате чего продуцируются данный олигосахарид и, где применимо, промежуточные соединения биосинтеза - сахариды и/или побочные продукты; b) применение гликозидазы в среде, в которой культивируется микроорганизм-хозяин, для деградации промежуточных соединений биосинтеза - сахаридов и/или побочных продуктов - сахаридов и/или неиспользованных субстратов сахаридов; и с) выделение целевого олигосахарида. В одном воплощении указанная гликозидаза эндогенно продуцируется в микроорганизме-хозяине, где гликозидаза представляет собой гликозидазу, которая не встречается в природе в микроорганизме-хозяине, и где экспрессия указанной гликозидазы в указанном микроорганизме-хозяине является индуцибельной, таким образом, что данная экспрессия может быть инициирована после того, как достаточное и/или по существу максимальное количество целевого олигосахарида было продуцировано во время культивации микроорганизмα-хозяина.

В итоге, в предшествующем уровне техники раскрыто применение гликозидаз для удаления нецелевых олигосахаридов из смеси целевых и нецелевых олигосахаридов посредством гидролиза нецелевых олигосахаридов в реакционной смеси/клеточной среде. Однако, данные подходы включают биосинтез нецелевых олигосахаридов микроорганизмом, включая применение субстратов и энергии, и данные подходы требуют удаления продуктов деградации нецелевых олигосахаридов из целевых олигосахаридов.

Таким образом, цель настоящего изобретения заключалась в предложении способа получения целевого олигосахарида посредством микробной ферментации без сопутствующей продукции/аккумуляции нецелевых побочных продуктов-сахаридов, а именно нецелевых олигосахаридов, в клеточной среде, содержащей микроорганизм, подлежащий ферментации.

Цель достигается посредством предложения генетически сконструированной микробной клетки-хозяина, способной продуцировать целевой олигосахарид, где указанная микробная клетка-хозяин экспрессирует гетерологичную гликозидазу, которая способна внутриклеточно деградировать побочные продукты метаболизма, которые образуются во время внутриклеточного биосинтеза целевого олигосахарида, таким образом, предотвращая образование смеси целевых и нецелевых сахаридов в культуральной среде. Указанные продукты деградации затем могут быть использованы в метаболизме микробной клетки-хозяина, например, для биосинтеза целевого олигосахарида.

В Таблице 1 предоставлен подробный обзор целевых олигосахаридов и возможных предшественников, которые добавляются, и/или нецелевых побочных продуктов - сахаридов, которые образуются во время получения целевого олигосахарида.

Краткое изложение сущности изобретения

В первом аспекте раскрыт способ получения целевого олигосахарида с использованием генетически сконструированной микробной клетки-хозяина, которая способна продуцировать целевой олигосахарид, причем указанная микробная клетка-хозяин экспрессирует гетерологичную гликозидазу, способную осуществлять внутриклеточную деградацию побочных продуктов метаболизма - сахаридов, которые образуются в процессе внутриклеточного биосинтеза целевого олигосахарида.

Во втором аспекте раскрыта генетически сконструированная микробная клетка-хозяин для получения целевого олигосахарида, где указанная микробная клетка-хозяин способна продуцировать целевой олигосахарид, и где указанная микробная клетка-хозяин была генетически сконструирована с возможностью экспрессии гетерологичной гликозидазы, которая может осуществлять внутриклеточную деградацию побочных продуктов метаболизма - сахаридов, которые образуются в процессе внутриклеточного биосинтеза целевого олигосахарида.

В третьем аспекте раскрыто применение генетически сконструированной микробной клетки-хозяина согласно второму аспекту для получения целевого олигосахарида.

В четвертом аспекте раскрыты олигосахариды, а именно желательные олигосахариды, которые получают способом согласно первому аспекту и/или посредством использования генетически сконструированной микробной клетки-хозяина согласно второму аспекту.

В пятом аспекте раскрыто применение целевых олигосахаридов согласно четвертому аспекту для получения питательной композиции.

В шестом аспекте раскрыты питательные композиции, содержащие целевой олигосахарид согласно четвертому аспекту.

Краткое описание графических материалов

На Фиг. 1 показано схематичное представление воплощения микробной клетки-хозяина, экспрессирующей гетерологичную гликозидазу (например, альфа-1,3-фукозидазу), которая может осуществлять деградацию побочных продуктов метаболизма - сахаридов (например, 3-фукозиллактозы и 2'3-дифукозиллактозы), которые образуются во время внутриклеточного биосинтеза целевого олигосахарида (2'-фукозиллактоза), и где микробная клетка-хозяин может повторно использовать продукты деградации (например, фукозу и лактозу), являющиеся результатом ферментативной активности указанной гликозидазы, для продукции целевого олигосахарида.

Подробное описание

Согласно первому аспекту предложен способ получения целевого олигосахарида с использованием генетически сконструированной микробной клетки-хозяина, который включает следующие стадии:

(i) предоставление генетически сконструированной микробной клетки-хозяина, которая способна продуцировать целевой олигосахарид, где микробная клетка-хозяин генетически сконструирована с возможностью экспрессии гетерологичной гликозидазы, которая может осуществлять внутриклеточную деградацию побочных продуктов метаболизма - сахаридов, которые образуются в процессе внутриклеточного биосинтеза целевого олигосахарида, и где микробная клетка-хозяин способна повторно использовать продукты деградации, являющиеся результатом ферментативной активности указанной гликозидазы;

(ii) культивирование генетически сконструированной микробной клетки-хозяина в условиях и в среде, являющихся пермиссивными в отношении продукции целевого олигосахарида, с получением, таким образом, целевого олигосахарида; и

(iii) возможно выделение целевого олигосахарида.

Термин «целевой», в том виде, в котором он используется в данном документе в отношении олигосахаридов, относится к олигосахариду, который предназначен для того, чтобы быть продуцированным микробной клеткой-хозяином. Термин «целевой» используется для проведения различия между олигосахаридом, подлежащим целевой продукции, и другими олигосахаридами, которые может продуцировать микробная клетка-хозяин. Указанные другие олигосахариды считаются «нежелательными», независимо от того, обладают ли или нет данные другие олигосахариды биологической функцией, участвуют ли или нет в биосинтезе других соединений клетки, таких как гликолипиды, гликопротеины или полисахариды, или являются ли или нет продуктами метаболизма - сахаридами, которые образованы во время внутриклеточного биосинтеза целевого олигосахарида, или за счет запасных (нецелевых) ферментативных активностей одного или более ферментов, участвующих в биосинтезе целевого олигосахарида, или за счет ферментативной активности одного или более ферментов, которые не прямо участвуют в биосинтезе целевого олигосахарида, а используют олигосахарид в качестве субстрата, который образуется в виде промежуточного соединения в метаболическом пути, приводя к получению целевого олигосахарида.

Термин «олигосахарид», в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к молекуле сахарида, состоящей из трех - двадцати остатков моносахаридов, где каждый из указанных остатков моносахаридов связан по меньшей мере с еще одним из указанных моносахаридных звеньев гликозидной связью. Олигосахарид может представлять собой линейную цепь моносахаридных остатков или разветвленную цепь моносахаридных остатков.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении целевой олигосахарид представляет собой олигосахарид грудного молока (НМО).

В дополнительном и/или альтернативном воплощении целевой олигосахарид представляет собой ОГМ, выбранный из группы, состоящей из 2'-фукозиллактозы (2'-FL), 3-фукозиллактозы (3-FL), 2'3-дифукозиллактозы (DFL), лакто-N-триозы II, лакто-N-тетраозы (LNT), лакто-N-неотетраозы (LNnT), лакто-N-фукопентаозы I (LNFP-I), лакто-N-неофукопентаозы I (LNnFP-I), лакто-N-фукопентаозы II (LNFP-II), лакто-N-фукопентаозы III (LNFP-III), лакто-N-фукопентаозы V (LNFP-V), лакто-N-неофукопентаозы V (LNnFP-V), лакто-N-дифукогексаозы I, лакто-N-дифукозилгексаозы II, пара-Лакто-N-фукозилгексаозы, фукозил-лакто-N-сиалилпентаозы b, фукозил-лакто-N-сиалилпентаозы с, фукозил-лакто-N-сиалилпентаозы с, дисиалил-лакто-N-фукопентаозы, 3-фукозил-3'-сиалиллактозы, 3-фукозил-6'-сиалиллактозы, лакто-N-неодифукогексаозы I, 3'-сиалиллакозы β-SL), 6'-сиалиллактозы (6-SL), сиалиллакто-N-тетраозы a (LST-a), сиалиллакто-N-тетраозы b (LST-b), сиалиллакто-N-тетраозы с (LST-c) и дисиалиллакто-N-тетраозы.

Способ включает предоставление генетически сконструированной микробной клетки-хозяина, которая способна продуцировать целевой олигосахарид.

Термин «генетически сконструированный», в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к модификации генетического состава клетки с использованием методов молекулярной биологии. Модификация генетического состава клетки может включать перенос генов в пределах и/или через видовые связи, вставку, удаление, замену и/или модификацию нуклеотидов, триплетов, генов, открытых рамок считывания, промоторов, энхансеров, терминаторов и других нуклеотидных последовательностей, опосредуя и/или контролируя экспрессию генов. Модификация генетического состава клетки нацелена на создание генетически модифицированного организма, обладающего конкретными, желательными свойствами. Генетически сконструированная микробная клетка-хозяин может содержать один или более генов, которые отсутствуют в нативной (не генетически сконструированной) форме клетки. Методики введения экзогенных молекул нуклеиновой кислоты и/или осуществления вставки экзогенных молекул нуклеиновой кислоты (рекомбинантных, гетерологичных) в наследуемую информацию клетки для вставки, удаления или изменения нуклеотидной последовательности генетической информации клетки известны квалифицированному специалисту. Генетически сконструированные клетки могут содержать один или более генов, которые находятся в нативной форме клетки, где указанные гены модифицированы и повторно вставлены в клетку искусственными средствами. Термин «генетически сконструированный» также охватывает клетки, которые содержат молекулу нуклеиновой кислоты, являющуюся эндогенной в отношении клетки, и которая модифицирована без удаления молекулы нуклеиновой кислоты из клетки. Такие модификации включают модификации, полученные в результате замены генов, сайт-специфичных мутаций, и родственные методики, включающие методики, обычно называемые «редактированием генома».

Генетически сконструированная микробная клетка-хозяин может представлять собой прокариотическую клетку или эукариотическую клетку. Подходящие микробные клетки-хозяева включают дрожжевые клетки, бактериальные клетки, клетки архебактерий и клетки грибов.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении прокариотическая клетка представляет собой бактериальную клетку, предпочтительно бактериальную клетку, выбранную из бактерий рода, выбранного из группы, состоящей из Bacillus, Bifidobacterium, Clostridium, Corynebacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Micrococcus, Micromonospora, Pseudomonas, Rhodococcus и Sporolactobacillus. Подходящие виды бактерий представляют собой Bacillus subtilis, В, licheniformis, В. coagulans, В, thermophiius, В. laterosporus, В, megaterium, В. mycoides, В. pumilus, В. lentus, В. cereus, В. circulans, Bifidobacterium longum, B. infantis, B, bifidum, Citrobacter freundii, Clostridium cellulolyticum, C. Ijungdahiii, C, autoethanogenum, C. acetobutylicum, Corynebacterium glutamicum, Enterococcus faecium, E. thermophiles, Escherichia coli, Erwinia herbicoia (Pantoea agglomerans), Lactobacillus acidophilus, L. salivarius, L, plantarum, L, helveticus, L. deibrueckii, L, rhamnosus, L. buigaricus, L. crispatus, L. gasseri, L, casei, L. reuteri, L. jensenii, L. lactis, Pantoea citrea, Pectobacterium carotovorum, Proprionibacterium freudenreichii, Pseudomonas fluorescens, P. aeruginosa, Streptococcus thermophiles и Xanthomonas campestris.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении эукариотическая клетка представляет собой дрожжевую клетку, предпочтительно, дрожжевую клетку, выбранную из группы, состоящей из Saccharomyces sp., в частности Saccharomyces cerevisiae, Saccharomycopsis sp., Pichia sp., в частности, Pichia pastoris, Hansenula sp., Kluyveromyces sp., Yarrowia sp., Rhodotorula sp, и Schizosaccharomyces sp.

Генетически сконструированная микробная клетка-хозяин может продуцировать целевой олигосахарид. Термин «может продуцировать» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к способности генетически сконструированной микробной клетки-хозяина продуцировать целевой олигосахарид, при условии, что микробную клетку-хозяина культивируют в условиях и в среде, которые являются пермиссивными в отношении продукции микробной клеткой-хозяином целевого олигосахарида. Таким образом, среда должна иметь значение рН в определенном интервале, состав ионов и питательных элементов, а также содержать соединения, требуемые для сохранения жизнеспособности и метаболической активности микробной клетки-хозяина. При необходимости для получения целевого олигосахарида, среда также должна содержать достаточные количества какого-либо предшественника, требуемого для биосинтеза целевого олигосахарида микробной клеткой-хозяином. Аналогично, условия (например, температура, рН, подача кислорода, перемешивание, снабжение питательными веществами и т.д.) для культивирования микробной клетки-хозяина для продукции целевого олигосахарида должны поддерживаться таким образом, чтобы микробная клетка-хозяин могла быть или оставаться метаболически активной для продуцирования целевого олигосахарида.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически сконструированная микробная клетка-хозяин, способная продуцировать целевой олигосахарид, представляет собой микробную клетку-хозяина, которая генетически сконструирована для того, чтобы иметь способность продуцировать целевой олигосахарид. В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически сконструированная микробная клетка-хозяин генетически сконструирована с возможностью экспрессии гетерологичной гликозилтрансферазы. Гетерологичная гликозидаза экспрессируется в генетически сконструированной микробной клетке-хозяине во время ферментации, а именно во время продукции или биосинтеза целевого олигосахарида. В дополнительном и/или альтернативном воплощении экспрессия гетерологичной гликозидазы является конститутивной в генетически сконструированном хозяине - микробе.

Термин «гетерологичный», в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к нуклеотидной последовательности, молекуле нуклеиновой кислоты или полипептиду, которые являются чужеродными в отношении клетки или организма, а именно, к нуклеотидной последовательности, молекуле нуклеиновой кислоты или полипептиду, которые в природе не встречаются в указанной клетке или организме. Термин «гетерологичная последовательность» или «гетерологичная нуклеиновая кислота» или «гетерологичный полипептид», в том виде, в котором он используется в данном документе, представляет собой последовательность или нуклеиновую кислоту или пептид, которые происходят из источника, являющегося чужеродным для конкретной клетки-хозяина (например, из другого вида), или, если из того же источника, модифицированы по сравнению со своей исходной формой. Таким образом, гетерологичная нуклеиновая кислота, функционально связанная с промотором, происходит из источника, отличного от источника, из которого происходит промотор, или, если из того же источника, является модифицированной в сравнении с ее исходной формой. Гетерологичная последовательность может быть стабильно введена, например, посредством трансфекции, трансформации, конъюгации или трансдукции, в геном микробной клетки-хозяина, таким образом, представляя генетически модифицированную клетку-хозяина. Можно применять методики, которые будут зависеть клетки-хозяина, последовательности, которая подлежит введению. Разные методики известны специалисту в данной области, и например, раскрыты в Sambrook ef al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989). Соответственно, «гетерологичный полипептид» представляет собой полипептид, который в природе не встречается в клетке дикого типа, от которой происходит генетически сконструированная клетка, и «гетерологичная гликозилтрансфераза» представляет собой гликозилтрансферазу, которая не встречается в природе в клетке дикого типа, от которой происходит генетически сконструированная клетка.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении гетерологичная гликозилтрансфераза выбрана из группы, состоящей из фукозилтрансфераз, предпочтительно α-1,2-фукозилтрансфераз и α-1,3-фукозилтрансфераз, гликозилтрансфераз, галактозилтрансфераз, предпочтительно β-1,3-галактозилтрансфераз и β-1,4-галактозилтрансфераз, сиалилтрансфераз, предпочтительно α-2,3-сиалилтрансфераз и α-2,6-сиалилтрансфераз, и N-ацетил-глкжозаминилтрансфераз.

Фукозилтрансферазы катализируют перенос остатков фукозы от донора - гуанозиндифосфат-активированной L-фукозы (ГДФ-фукоза) к нескольким акцепторным молекулам. Фукозилтрансферазы экспрессируются в животных, растениях, грибах и бактериях, и они подразделяются на категории в соответствии со связью с фукозой на акцепторном субстрате. Таким образом, α-1,2-, α-1,3/4- и α-1,6-фукозилтрансферазы отличаются друг от друга. Подходящие фукозилтрансферазы для гетерологичной экспрессии в генетически сконструированной микробной клетке-хозяине раскрыты, например, в Европейской патентной заявке №17180176.

Сиалилтрансферазы катализируют перенос остатков N-ацетилнейраминовой кислоты (Neu5Ac) от донора CMP-Neu5Ac к акцепторным молекулам. Обнаружили, что сиалилтрансферазы экспрессируются в животных, растениях, грибах и бактериях. Сиалилтрансферазы подразделяются на категории в соответствии со связью, которая образуется между NeuSAc и акцепторной молекулой. Следовательно, α-2,3-, α-2,6- и α-2,8-сиалилтрансферазы отличаются друг от друга. Подходящие сиалилтрансферазы для гетерологичной экспрессии в генетически сконструированной микробной клетке-хозяине раскрыты, например, в Европейской патентной заявке №17183391.

Галактозилтрансферазы катализируют перенос остатка галактозы от донора, УДФ (уридиндифосфат)-галактозы, к акцепторным субстратам. Галактозилтрансферазы различают на основе связи между галактозой и акцепторной молекулой, которая образуется. Следовательно, β-1,3- и β-1,4-галактозилтрансферазы отличаются друг от друга. Подходящая β-1,3-галактозилтрансфераза для гетерологичной экспрессии в генетически сконструированной микробной клетке-хозяине кодируется геном wbdO Salmonella enterica. Подходящая β-1,4-галактозилтрансфераза для гетерологичной экспрессии в генетически сконструированной микробной клетке-хозяине кодируется геном lex1 Aggregatibacter aphrophilus.

Генетически сконструированная микробная клетка-хозяин генетически сконструирована с возможностью экспрессии гетерологичной гликозидазы, которая может осуществлять внутриклеточную деградацию побочных продуктов метаболизма - сахаридов, которые образуются во время внутриклеточного биосинтеза целевого олигосахарида. Подходящие гликозидазы представляют собой гликозидазы, которые являются специфичными в отношении гликозидной связи, которая гидролизуется под действием ферментативной активности, и/или в отношении субстрата, который гидролизуется гликозидазой. За счет указанной специфичности гликозидаза гидролизует нежелательные побочные продукты, а не целевой олигосахарид, подлежащий продуцированию. В дополнительном и/или альтернативном воплощении гликозидаза не гидролизует один или более предшественников, которые поглощаются или синтезируются микробной клеткой-хозяином для продуцирования целевого олигосахарида. Предпочтительно, гликозидаза представляет собой экзогликозидазу.

Экзогликозидазы представляют собой ферменты гликозид гидролазы, которые разрушают гликозидные связи на концевом остатке структуры олигосахарида.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении гетерологичная гликозидаза выбрана из группы, состоящей из фукозидаз, включая α-1,2-фукозидазы и α-1,3-фукозидазы, сиалидаз, таких как α-2,3-сиалидазы, α-2,6-сиалидазы, α-2,8-сиалидазы, галактозидаз, таких как β-1,3-галактозидазы, β-1,4-галактозидазы и β-1,6-галактозидазы, β-N-ацетилгексозаминидаз и глюкозидаз, таких как β-1,3-глюкозидазы.

Подходящая фукозидаза представляет собой α-1,2-фукозидазу. α-1,2-фукозидаза представляет собой высокоспецифичную экзогликозидазу, которая катализирует гидролиз линейных альфа-1,2-связанных L-фукопиранозильных остатков от олигосахаридов. Предпочтительная α-1,2-фукозидаза представляет собой AfcA Bifidobacterium bifidum (SEQ ID NO: 2).

В дополнительном и/или альтернативном воплощении предложена генетически сконструированная микробная клетка-хозяин, которая может продуцировать 3-FL, где указанная генетически сконструированная микробная клетка-хозяин экспрессирует α-1,2-фукозидазу. Для того, чтобы мочь продуцировать 3-FL, генетически сконструированная микробная клетка-хозяин экспрессирует альфа-1,3-фукозилтрансферазу. Указанная альфа-1,3-фукозилтрансфераза может переносить остаток фукозы от ГДФ-фукозы на группировку глюкозы лактозы в качестве акцепторного субстрата, синтезируя, таким образом, 3-FL в качестве целевого олигосахарида. 2'-FL и 2'3-DFL представляют собой нежелательные побочные продукты - сахариды в получении 3-FL.

Посредством экспрессии гетерологичной α-1,2-фукозидазы в генетически сконструированной микробной клетке-хозяине, которая может продуцировать 3-FL, продукция побочных продуктов 2'-FL и 2'3-DFL может быть прекращена или по меньшей мере уменьшена, поскольку данные побочные продукты гидролизуются в пределах генетически-сконструированной микробной клетки-хозяина под действием гетерологичной α-1,2-фукозидазы. Полученные продукты деградации представляют собой фукозу и лактозу. Как фукоза, так и лактоза могут быть использованы генетически сконструированной микробной клеткой-хозяином для продукции целевой 3-FL.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически сконструированная микробная клетка-хозяин генетически сконструирована с возможностью экспрессии α-1,2-фукозидазы. В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически сконструированная микробная клетка-хозяин генетически сконструирована для того, чтобы содержать молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую α-1,2-фукозидазу для ее экспресии. Предпочтительно, нуклеотидная последовательность, кодирующая α-1,2-фукозидазу, представляет собой нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

- нуклеотидной последовательности, ка представлено SEQ ID NO: 1;

- нуклеотидных последовательностей, которые комплементарны нуклеотидной последовательности, которая гибридизуется с нуклеотидной последовательностью, как представлено SEQ ID NO: 1, в жестких условиях;

- нуклеотидных последовательностей, обладающих идентичностью последовательностей по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с нуклеотидной последовательностью, как представлено SEQ ID NO: 1;

- нуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, как представлено SEQ ID NO: 2; и

- нуклеотидных последовательностей, кодирующих функциональный вариант полипептидных последовательностей, как представлено SEQ ID NO: 2, где аминокислотная последовательность функционального варианта обладает идентичностью последовательностей по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с аминокислотной последовательностью, как представлено SEQ ID NO: 2.

Термин «гибридизуется» или «гибридизация», в том виде, в котором он используется в данном документе, означает гибридизацию в общепринятых условиях, как описано в Sambrook et al. (1989) «Molecular Cloning, A Laboratory Manual» (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York), предпочтительно в жестких условиях. Жесткие условия гибридизации, например, выглядят следующим образом: гибридизация в 4 × SSC при 65°С и последующая множественная промывка в 0,1 × SSC при 65°С на протяжении в общей сложности примерно 1 часа. Менее жесткие условия гибридизации выглядят, например, следующим образом: гибридизация в 4 × SSC при 37°С и последующая множественная промывка в 1 × SSC при комнатной температуре (примерно 21°С). «Условия жесткой гибридизации» могут также означать: гибридизацию при 68°С в 0,25 М фосфате натрия, рН 7,2, 7% SDS (от англ. sodium dodecyl sulphate - додецилсульфат натрия), 1 мМ ЭДТА (Этилендиаминтетрауксусная кислота) и 1% БСА (Бычий сывороточный альбумин) в течение 16 часов и с последующими двумя промывками 2 × SSC и 0,1% SDS при 68°С.

Для экспрессии нуклеотидной последовательности, кодирующей α-1,2-фукозидазу или ее функциональный вариант, указанная нуклеотидная последовательность функционально связана с последовательностями контроля экспрессии, которые опосредуют экспрессию нуклеотидной последовательности, кодирующей α-1,2-фукозидазу или ее функциональный вариант в генетически сконструированной микробной клетке-хозяине.

«Последовательности контроля экспрессии» представляют собой регуляторные нуклеотидные последовательности, которые не являются частью нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, а опосредуют экспрессию нуклеотидной последовательности, кодирующей белок. Нуклеотидные последовательности регуляторных элементов включают промоторы, цис-регуляторные элементы, энхансеры, интроны и терминаторы. В зависимости от типа регуляторного элемента, он находится на молекуле нуклеиновой кислоты перед нуклеотидной последовательностью, кодирующей белок (а именно 3'), или позади нуклеотидной последовательности, кодирующей белок (а именно 5'). Регуляторные элементы являются функциональными в микробной клетке-хозяине.

Термин «функционально связанный» означает, что регуляторный элемент соединен таким путем с нуклеотидной последовательностью, кодирующей белок, а именно расположен таким образом относительно нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, например, молекулы нуклеиновой кислоты, что экспрессия нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, под контролем данного регуляторного элемента может происходить в живой клетке.

В целях настоящего изобретения «промотор» представляет собой нуклеотидную последовательность, регулирующую экспрессию гена, которая обычно находится на 5'-конце гена и посредством взаимодействия с конкретными ДНК-связывающими белками опосредует инициацию транскрипции посредством РНК-полимеразы.

Кроме того, подходящие промоторы включают синтетические промоторы. Существуют промоторы, которые были созданы посредством методик молекулярной биологии, которые не обнаруживаются в природе в данной конфигурации. Синтетический промотор представляет собой минималистичный промотор, содержащий только один или более выбранных определенных цис-элементов помимо минимального промотора. Данные цис-элементы представляют собой сайты связывания для ДНК-связывающих белков, таких как транскрипционные факторы, и выделены из природных промоторов, происходящих из ранее выделенных цис-элементов, или технически получены посредством методик случайной рекомбинации и выбраны соответствующими способами; по сравнению с природным промотором, за счет своей менее сложной конструкции синтетический промотор активируется только несколькими экзогенными и эндогенными факторами и, таким образом, более специфично регулируется.

«Минимальный промотор» или «коровый промотор» представляет собой нуклеотидную последовательность, которая содержит сайты связывания для комплекса базальных факторов транскрипции и делает возможной точную инициацию транскрипции посредством РНК-полимеразы II. Характеристические мотивы последовательности минимального промотора представляют собой ТАТА-бокс, инициаторный элемент (Inr), «элемент распознавания TFBII» (BRE) и «расположенный ниже элемент корового промотора» (ОРЕ). В минимальном промоторе данные элементы могут встречаться отдельно или в комбинации. Минимальный промотор или его мотивы последовательности доступны, например, из гена бактерии, гриба или вируса.

«Цис-элементы» представляют собой нуклеотидные последовательности, которые расположены на той же молекуле нуклеиновой кислоты, что и нуклеотидная последовательность, кодирующая белок, подлежащая экспрессии. Цис-элементы не должны кодировать РНК или белок и в направлении транскрипции могут быть расположены перед или после нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, подлежащей экспрессии. Расположенные выше цис-элементы перед нуклеотидной последовательностью, кодирующей белок, подлежащей экспрессии, часто предоставляют необходимые мотивы связывания, в частности для транскрипционных факторов, которые участвуют как транс-действующие элементы (от лат.trans - за пределами), на молекулярном уровне, с другой стороны в регуляции транскрипции данного гена. Если, кроме того, цис-элементы приводят к ингибированию транскрипции, они называются сайленсерами. Цис-элементы, которые приводят к усилению транскрипции, называются энхансерами. Совокупность цис/транс-активностей в промоторе определяет интенсивность, с которой РНК-полимераза осуществляет транскрипцию.

Кроме того, промотор может представлять собой химерный промотор и/или промотор, который был модифицирован цис-элементами. Модификация промотора также может означать дополнительное включение цис-элемента в промотор, который, например, уже в природе имеет цис-элемент. Кроме того, модификация также включает мультимеризацию цис-элемента, в частности мультимеризацию существующего в природе цис-элемента. По сравнению с нативной версией, такой модифицированный промотор может, например, обладать измененными свойствами в отношении специфичности, уровня экспрессии или фоновой активности.

Терминаторы представляют собой нуклеотидные последовательности на ДНК, которые обычно отмечают конец гена и приводят к терминации транскрипции.

Другая подходящая фукозидаза представляет собой α-1,3-фукозидазу. α-1,3-фукозидаза представляет собой высоко специфичную гликозидазу, которая катализирует гидролиз α-1,3-связанных L-фукопиранозильных остатков от олигосахаридов. Предпочтительная α-1,3-фукозидаза представляет собой AfcB из Bifidobacterium bifidum (SEQ ID NO: 4).

В дополнительном и/или альтернативном воплощении предложена генетически сконструированная микробная клетка-хозяин, которая способна продуцировать 2'-FL, где указанный генетически сконструированный микроорганизм - хозяин экспрессирует α-1,3-фукозидазу. Для того, чтобы мочь продуцировать 2'-FL, генетически сконструированная микробная клетка-хозяин экспрессирует α-1,2-фукозилтрансферазу. Указанная альфа-1,2-фукозилтрансфераза может переносить остаток фукозы от ГДФ-фукозы к группировке галактозы лактозы в качестве акцепторного субстрата, синтезируя, таким образом, 2'-FL в качестве целевого олигосахарида. 3-FL и 2'3-DFL представляют собой нежелательные побочные продукты - сахариды в продукции 2-FL.

Посредством экспрессии гетерологичной α-1,3-фукозидазы в генетически сконструированной микробной клетке-хозяине, которая может продуцировать 2'-FL, продукция побочных продуктов 3-FL и 2'3-DFL может быть прекращена или по меньшей мере уменьшена, по той причине, что данные побочные продукты гидролизуются в генетически сконструированной микробной клетке-хозяине посредством гетерологичной α-1,3-фукозидазы. Полученные продукты деградации представляют собой фукозу и лактозу. Как фукоза, так и лактоза могут быть использованы генетически сконструированным микроорганизмом-хозяином для продукции целевой 2'-FL.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически сконструированная микробная клетка-хозяин генетически сконструирована с возможностью экспрессии α-1,3-фукозидазы. В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически сконструированная микробная клетка-хозяин генетически сконструирована для того, чтобы содержать молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую α-1,3-фукозидазу, для ее экспрессии. Предпочтительно, нуклеотидная последовательность, кодирующая α-1,3-фукозидазу, представляет собой нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

- нуклеотидной последовательности, как представлено SEQ ID NO: 3;

- нуклеотидных последовательностей, которые комплементарны нуклеотидной последовательности, которая гибридизуется с нуклеотидной последовательностью, как представлено SEQ ID NO: 3, в жестких условиях;

- нуклеотидных последовательностей, обладающих идентичностью последовательностей по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с нуклеотидной последовательностью, как представлено SEQ ID NO: 3;

- нуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, как представлено SEQ ID NO: 4; и

- нуклеотидных последовательностей, кодирующих функциональный вариант полипептидных последовательностей, как представлено SEQ ID NO: 4, где аминокислотная последовательность функционального варианта обладает идентичностью последовательностей по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с аминокислотной последовательностью, как представлено SEQ ID NO: 4.

Для экспрессии нуклеотидной последовательности, кодирующей α-1,3-фукозидазу или ее функциональный вариант, указанная нуклеотидная последовательность функционально связана с последовательностями контроля экспрессии, которые опосредуют экспрессию нуклеотидной последовательности, кодирующей α-1,3-фукозидазу или ее функциональный вариант в генетически-сконструированной микробной клетке-хозяине.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении предложена генетически сконструированная микробная клетка-хозяин, которая может продуцировать LNFP-I, где указанная генетически сконструированная микробная клетка-хозяин экспрессирует α-1,3-фукозидазу. Для того, чтобы мочь продуцировать LNFP-I, генетически сконструированная микробная клетка экспрессирует β-1,3-N-ацетилглюкозаминилтрансферазу, β-1,3-галактозилтрансферазу и α-1,2-фукозилтрансферазу. Указанная β-1,3-N-ацетилглюкозаминилтрансфераза может переносить остаток GlcNAc от УДФ-GlcNAc к галактозной группировке лактозы, синтезируя, таким образом, лакто-N-триозу-11 (LNT-II). Указанная β-1,3-галактозилтрансфераза может переносить остаток галактозы от УДФ-галактозы к группировке GlcNAc LNT-II, синтезируя, таким образом, лакто-N-тетраозу (LNT). Указанная α-1,2-фукозилтрансфераза может переносить остаток фукозы от ГДФ-фукозы к концевой группировке галактозы LNT, синтезируя, таким образом, LNFP-I. 3-FL и 2'3-DFL будут нежелательными побочными продуктами в получении LNFP-I. Посредством экспрессии α-1,3-фукозидазы в генетически сконструированной микробной клетке-хозяине, способной продуцировать LNFP-I, продукция побочных продуктов 3-FL и 2'3-DFL может быть прекращена или по меньшей мере уменьшена, по той причине, что данные побочные продукты гидролизуются под действием гетерологичной α-1,3-фукозидазы в пределах генетически-сконструированной микробной клетки-хозяина. Полученные продукты деградации представляют собой фукозу, лактозу и 2'-FL. Фукоза и лактоза могут использоваться генетически сконструированным микроорганизмом-хозяином для продукции целевой LNFP-I.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически сконструированная микробная клетка-хозяин генетически сконструирована с возможностью экспрессии α-1,3-фукозидазы. В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически сконструированная микробная клетка-хозяин генетически сконструирована для того, чтобы содержать молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую α-1,3-фукозидазу, для ее экспрессии. Предпочтительно, нуклеотидная последовательность, кодирующая α-1,3-фукозидазу, представляет собой нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

- нуклеотидной последовательности, как представлено SEQ ID NO: 3;

- нуклеотидных последовательностей, которые комплементарны нуклеотидной последовательности, которая гибридизуется с нуклеотидной последовательностью, как представлено SEQ ID NO: 3, в жестких условиях;

- нуклеотидных последовательностей, обладающих идентичностью последовательностей по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с нуклеотидной последовательностью, как представлено SEQ ID NO: 3;

- нуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, как представлено SEQ ID NO: 4; и

- нуклеотидных последовательностей, кодирующих функциональный вариант полипептидных последовательностей, как представлено SEQ ID NO: 4, где аминокислотная последовательность функционального варианта обладает идентичностью последовательностей по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с аминокислотной последовательностью, как представлено SEQ ID NO: 4.

Для экспрессии нуклеотидной последовательности, кодирующей α-1,3-фукозидазу или ее функциональный вариант указанная нуклеотидная последовательность функционально связана с последовательностями контроля экспрессии, которые опосредуют экспрессию нуклеотидной последовательности, кодирующей α-1,3-фукозидазу или ее функциональный вариант в генетически сконструированной микробной клетке-хозяине.

Подходящая сиалидаза представляет собой α-2,3-сиалидазу. α-2,3-Сиалидаза представляет собой высоко специфичную экзогликозидазу, которая катализирует гидролиз линейных α-2,3-связанных L-сиалильных остатков от олигосахаридов. Предпочтительная α-2,3-сиалидаза представляет собой NanB Streptococcus pneumoniae (SEQ ID NO: 6).

В дополнительном и/или альтернативном воплощении предложена генетически сконструированная микробная клетка-хозяин, которая способна продуцировать 6'-SL, где указанная генетически сконструированная микробная клетка-хозяин экспрессирует α-2,3 сиалидазу. Для того чтобы мочь продуцировать 6'-SL, генетически сконструированная микробная клетка-хозяин экстрессирует α-2,6-сиалилтрансферазу. Указанная 2,6-сиалилтрансфераза может переносить остаток NeuSAc от CMP-Neu5Ac к галактозной группировке лактозы в качестве субстрата, синтезируя, таким образом, 6'-SL. 3'-SL представляет собой нецелевой побочный продукт в продукции 6'-SL.

Посредством экспрессии α-2,3-сиалидазы в генетически сконструированной микробной клетке-хозяине, которая может продуцировать 6'SL, продукция побочного продукта 3'-SL может быть прекращена или по меньшей мере уменьшена по той причине, что данный побочный продукт гидролизуется под действием α-2,3-сиалидазы в генетически модифицированной микробной клетке-хозяине. Полученные продукты деградации представляют собой N-ацетилнейарминовую кислоту и лактозу. Как N-ацетилнейраминовая кислота, так и лактоза могут быть использованы генетически сконструированным микроорганизмом-хозяином для продукции целевой 6'-SL.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически сконструированная микробная клетка-хозяин генетически сконструирована с возможностью экспрессии α-2,3-сиалидазы. В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически сконструированная микробная клетка-хозяин генетически сконструирована для того, чтобы содержать молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую α-2,3-сиалидазу для ее экспрессии. Предпочтительно, нуклеотидная последовательность, кодирующая α-2,3-сиалидазу, представляет собой нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

- нуклеотидной последовательности, как представлено SEQ ID NO: 5;

- нуклеотидных последовательностей, которые комплементарны нуклеотидной последовательности, которая гибридизуется с нуклеотидной последовательностью, как представлено SEQ ID NO: 5, в жестких условиях;

- нуклеотидных последовательностей, обладающих идентичностью последовательностей по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с нуклеотидной последовательностью, как представлено SEQ ID NO: 5;

- нуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, как представлено SEQ ID NO: 6; и

- нуклеотидных последовательностей, кодирующих функциональный вариант полипептидных последовательностей, как представлено SEQ ID NO: 6, где аминокислотная последовательность функционального варианта обладает идентичностью последовательностей по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с аминокислотной последовательностью, как представлено SEQ ID NO: 6.

Для экспрессии нуклеотидной последовательности, кодирующей α-2,3-сиалидазу или ее функциональный вариант, указанная нуклеотидная последовательность функционально связана с последовательностями контроля экспрессии, которые опосредуют экспрессию нуклеотидной последовательности, кодирующей α-2,3-сиалидазу или ее функциональный вариант, в генетически сконструированной микробной клетке-хозяине.

Подходящая галактозидаза представляет собой β-1,3-галактозидазу. β-1,3-Галактозидаза представляет собой фермент, который катализирует гидролиз остатка β-1,3-связанной галактозы от олигосахаридов. Предпочтительная β-1,3-галактозидаза представляет собой Bga42A Bifidobacterium longum (SEQ ID NO: 8).

В дополнительном и/или альтернативном воплощении предложена генетически сконструированная микробная клетка-хозяин, которая может продуцировать LNnT, где указанная генетически сконструированная микробная клетка-хозяин экспрессирует β-1,3-галактозидазу. Для того, чтобы иметь способность продуцировать LNnT, генетически сконструированная микробная клетка-хозяин экспрессирует β-1,3-N-ацетилглюкозаминилтрансферазу и β-1,4-галактозилтрансферазу. Указанная β-1,3-N-ацетилглюкозаминилтрансфераза может переносить остаток GlcNAc от УДФ-GlcNAc к группировке галактозы лактозы, синтезируя, таким образом, LNT-II. Указанная β-1,4-галактозилтрансфераза может переносить остаток галактозы от УДФ-галактозы на группировку GlcNAc LNT-II, синтезируя, таким образом, LNnT в качестве целевого олигосахарида.

LNT представляет собой нецелевой побочный продукт в продукции LNnT. Посредством экспрессии β-1,3-галактозидазы в генетически сконструированной микробной клетке-хозяине, способной продуцировать LNnT, продукция побочного продукта LNT может быть прекращена или по меньшей мере уменьшена по той причине, что данный побочный продукт гидролизуется в генетически сконструированной микробной клетке-хозяине под действием гетерологичной β-1,3-галактозидазы. Полученные продукты деградации представляют собой галактозу и LNT-II. Галактоза, а также LNT-II могут быть использованы генетически сконструированным микроорганизмом-хозяином для продукции целевой LNnT.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически сконструированная микробная клетка-хозяин генетически сконструирована с возможностью экспрессии β-1,3-галактозидазы. В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически сконструированная микробная клетка-хозяин генетически сконструирована для того, чтобы содержать молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую β-1,3-галактозидазу для ее экспрессии.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически сконструированная микробная клетка-хозяин генетически сконструирована с возможностью экспрессии β-1,3-галактозидазы. В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически сконструированная микробная клетка-хозяин генетически сконструированная для того, чтобы содержать молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую β-1,3-галактозидазу для ее экспрессии. Предпочтительно, нуклеотидная последовательность, кодирующая β-1,3-галактозидазу, представляет собой нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

- нуклеотидной последовательности, как представлено SEQ ID NO: 7;

- нуклеотидных последовательностей, которые комплементарны нуклеотидной последовательности, которая гибридизуется с нуклеотидной последовательностью, как представлено SEQ ID NO: 7, в жестких условиях;

- нуклеотидных последовательностей, обладающих идентичностью последовательностей по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с нуклеотидной последовательностью, как представлено SEQ ID NO: 7;

- нуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, как представлено SEQ ID NO: 8; и

- нуклеотидных последовательностей, кодирующих функциональный вариант полипептидных последовательностей, как представлено SEQ ID NO: 8, где аминокислотная последовательность функционального варианта обладает идентичностью последовательностей по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с аминокислотной последовательностью, как представлено SEQ ID NO: 8.

Для экспрессии нуклеотидной последовательности, кодирующей β-1,3-галактозидазу или ее функциональный вариант, указанная нуклеотидная последовательность функционально связана с последовательностями контроля экспрессии, которые опосредуют экспрессию нуклеотидной последовательности, кодирующей β-1,3-глюкозидазу или ее функциональный вариант в генетически сконструированной микробной клетке-хозяине.

Другая подходящая галактозидаза представляет собой галактан β-1,3-галактозидазу. Галактан β-1,3-галактозидаза представляет собой фермент, который катализирует гидролиз остатка β-1,3-связанной галактозы от олигосахаридных цепей, несущих галактозу. Предпочтительная галактан β-1,3-галактозидаза представляет собой Ct1,3Gal43A Clostridium thermocellum (SEQ ID NO: 10).

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически сконструированная микробная клетка-хозяин генетически сконструирована с возможностью экспрессии галактан β-1,3-галактозидазы. В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически сконструированная микробная клетка-хозяин генетически сконструирована для того, чтобы содержать молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую галактан β-1,3-галактозидазу для ее экспрессии. Предпочтительно, нуклеотидная последовательность, кодирующая галактан β-1,3-галактозидазу, представляет собой нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

- нуклеотидной последовательности, как представлено SEQ ID NO: 9;

- нуклеотидных последовательностей, которые комплементарны нуклеотидной последовательности, которая гибридизуется с нуклеотидной последовательностью, как представлено SEQ ID NO: 9, в жестких условиях;

- нуклеотидных последовательностей, обладающих идентичностью последовательностей по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с нуклеотидной последовательностью, как представлено SEQ ID NO: 9;

- нуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, как представлено SEQ ID NO: 10; и

- нуклеотидных последовательностей, кодирующих функциональный вариант полипептидных последовательностей, как представлено SEQ ID NO: 10, где аминокислотная последовательность функционального варианта обладает идентичностью последовательностей по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с аминокислотной последовательностью, как представлено SEQ ID NO: 10.

Для экспрессии нуклеотидной последовательности, кодирующей галактан β-1,3-галактозидазу или ее функциональный вариант, указанная нуклеотидная последовательность функционально связана с последовательностями контроля экспрессии, которые опосредуют экспрессию нуклеотидной последовательности, кодирующей галактан β-1,3-глюкозидазу или ее функциональный вариант, в генетически сконструированной микробной клетке-хозяине.

Подходящая глюкозидаза представляет собой β-1,3-глюкозидазу. β-1,3-Глюкозидаза представляет собой высокоспецифичную экзогликозидазу, которая катализирует гидролиз остатка β-1,3-связанной глюкозы от олигосахаридов. Предпочтительная β-1,3-глюкозидаза представляет собой PgIA Paenibacillus sp.(SEQ ID NO: 12).

В дополнительном и/или альтернативном воплощении предложен генетически сконструированный микроорганизм-хозяин, который может продуцировать LNT или LNnT, где указанная генетически сконструированная микробная клетка-хозяин экспрессирует β1,3-глюкозидазу и/или β-1,3-галактозидазу. Для того, чтобы мочь продуцировать LNT, генетически сконструированная микробная клетка-хозяин экспрессирует β-1,3-N-ацетилглюкозаминилтрансферазу и β-1,3-галактозилтрансферазу. Указанная β-1,3-N-ацетилглюкозаминилтрансфераза может переносить остаток GlcNAc от УДФ-GlcNAc к группировке галактозы лактозы, синтезируя, таким образом, лакто-N-триозу-II (LNT-II). Указанная β-1,3-галактозилтрансфераза может переносить остаток галактозы от УДФ-галактозы к группировке GlcNAc LNT-II, синтезируя, таким образом, лакто-N-тетраозу (LNT). Для того, чтобы мочь продуцировать LNnT, генетически сконструированная микробная клетка-хозяин экспрессирует β-1,3-N-ацетилглюкозаминилтрансферазу и β-1,4-галактозилтрансферазу. Указанная β-1,3-N-ацетилглюкозаминилтрансфераза может синтезировать LNT-II. Указанная β-1,4-галактозилтрансфераза может переносить остаток галактозы от УДФ-галактозы к группировке GlcNAc LNT-II, синтезируя, таким образом, LNnT в качестве целевого олигосахарида.

Квалифицированному специалисту в данной области известно, что β-1,3-N-ацетилглюкозаминилтрансферазы, подобно LgtA Neisseria meningitides, акцептируют широкий спектр субстратов-доноров. Как правило, при переносе GlcNAc от УДФ-GlcNAc к соответствующему акцепторному сахариду, LgtA также может использовать УДФ-галактозу или УДФ-глюкозу в качестве субстратов-до но ров. Используя генетически сконструированный микроорганизм-хозяин, способный продуцировать LNT или LNnT, как описано, указанная β-1,3-N-ацетилглюкозаминилтрансфераза также может переносить остаток галактозы от УДФ-галактозы, а также остаток глюкозы от УДФ-глюкозы к группировке галактозы лактозы, синтезируя, таким образом, нежелательные побочные продукты Gal(β1,3)Gal(β1,4)Glc и Glc(β1,3)Gal(β1,4)Glc, соответственно.

Посредством экспрессии галактан β-1,3-галактозидазы и/или β-1,3-глюкозидазы в генетически сконструированной микробной клетке-хозяине, способной продуцировать LNT или LNnT, продукция побочных продуктов Gal(β1,3)Gal(β1,4)Glc и Glc(β1,3)Gal(β1,4)Glc может быть прекращена или по меньшей мере уменьшена по той причине, что данные побочный продукты гидролизуются в генетически сконструированной микробной клетке-хозяине под действием галактан β-1,3-галактозидазы и/или β1,3-глюкозидазы. Полученные продукты деградации представляют собой галактозу и/или глюкозу и лактозу. Оба моносахарида, а также лактоза могут быть использованы генетически сконструированной микробной клеткой-хозяином для продукции целевой LNT или LNnT.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически сконструированная микробная клетка-хозяин генетически сконструирована с возможностью экспрессии β-1,3-глюкозидазы. В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически сконструированная микробная клетка-хозяин генетически сконструирована для того, чтобы содержать молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую β-1,3-глюкозидазу для ее экспрессии. Предпочтительно, нуклеотидная последовательность, кодирующая β-1,3-глюкозидазу, представляет собой нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

- нуклеотидной последовательности, как представлено SEQ ID NO: 11;

- нуклеотидных последовательностей, которые комплементарны нуклеотидной последовательности, которая гибридизуется с нуклеотидной последовательностью, как представлено SEQ ID NO: 11, в жестких условиях;

- нуклеотидных последовательностей, обладающих идентичностью последовательностей по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с нуклеотидной последовательностью, как представлено SEQ ID NO: 11;

- нуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, как представлено SEQ ID NO: 12; и

- нуклеотидных последовательностей, кодирующих функциональный вариант полипептидных последовательностей, как представлено SEQ ID NO: 12, где аминокислотная последовательность функционального варианта обладает идентичностью последовательностей по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с аминокислотной последовательностью, как представлено SEQ ID NO: 10.

Для экспрессии нуклеотидной последовательности, кодирующей β-1,3-глюкозидазу или ее функциональный вариант, указанная нуклеотидная последовательность функционально связана с последовательностями контроля экспрессии, которые опосредуют экспрессию нуклеотидной последовательности, кодирующей β-1,3-глюкозидазу или ее функциональный вариант, в генетически сконструированной микробной клетке-хозяине.

Генетически сконструированная микробная клетка-хозяин может повторно использовать по меньшей мере один из продуктов деградации, полученных в результате ферментативной активности гетерологичной гликозидазы в генетически сконструированной микробной клетке-хозяине. Таким образом, генетически сконструированная микробная клетка-хозяин может использовать по меньшей мере один из продуктов деградации, полученных за счет ферментативной активности гетерологичной гликозидазы для продукции целевого олигосахарида. Например, остаток моносахарида, высвобождающийся из нецелевого побочного продукта -сахарида под действием гетерологичной гликозидазы, может быть повторно активирован, а именно связан с нуклеотидом, перенесен от полученного нуклеотид-активированного моносахарида к субстрату-акцептору посредством соответствующей гликозилтрансферазы с получением целевого олигосахарида или предшественника целевого олигосахарида.

Способ включает стадию культивирования генетически сконструированной микробной клетки-хозяина в среде, которая является пермиссивной для продукции целевого олигосахарида указанным генетически сконструированным микроорганизмом-хозяином, и в условиях, которые являются пермиссивными для продукции целевого олигосахарида указанным генетически сконструированным микроорганизмом-хозяином.

Среда, которая является пермиссивной в отношении продукции целевого олигосахарида генетически сконструированной микробной клеткой-хозяином, содержит питательные вещества, по меньшей мере один источник энергии, незаменимые металлы и минеральные вещества и буферный агент. Среда возможно содержит предшественник целевого олигосахарида, причем указанный предшественник может поглощаться генетически сконструированной микробной клеткой-хозяином и использоваться для продукции целевого олигосахарида, при условии, что генетически сконструированная микробная клетка-хозяин не может синтезировать указанный предшественник самостоятельно. Затем, генетически сконструированная микробная клетка-хозяин поглощает предшественник и подвергает предшественник биосинтезу целевого олигосахарида. Например, лактозу можно считать предшественником 2'-фукозиллактозы.

Во время культивации генетически сконструированных микробных клеток-хозяев для продуцирования целевого олигосахарида поддерживаются пермиссивные условия. Условия являются «пермиссивными», если генетически сконструированные микробные клетки-хозяева, которые культивируют в данных условиях, остаются живыми и продуцируют целевой олигосахарид. Предпочтительно, пермиссивные условия культивирования делают возможным размножение генетически сконструированных микробных клеток-хозяев. Условия, которые нужно поддерживать при определенной величине или в пределах определенного диапазона, включают рН, температуру, кислород и концентрации питательных веществ, источников энергии и незаменимых металлов и минеральных веществ.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении способ включает стадию выделения целевого олигосахарида. Целевой олигосахарид может быть выделен из ферментационного бульона и/или из генетически сконструированного микроорганизмα-хозяина.

Способ, как ранее описано в данном документе, является преимущественным в том отношении, что во время продукции целевого олигосахарида продуцируется меньше нецелевых побочных продуктов или они не продуцируются. Таким образом, менее трудоемко и затратно выделять и очищать целевой огилосахарид из ферментационного бульона или клеточного лизата.

Кроме того, гораздо больше субстрата специфично используется для продуцирования целевого олигосахарида вместо того, чтобы стать недоступным для продукции целевого олигосахарида, поскольку он включается в нежелательные побочные продукты, которые не могут быть метаболизированы микробной клеткой-хозяином.

Согласно второму аспекту предложены генетически сконструированные микробные клетки-хозяева для получения целевого олигосахарида, где микробная клетка-хозяин может продуцировать целевой олигосахарид, и где микробная клетка-хозяин генетически сконструирована с возможностью экспрессии гетерологичной гликозидазы, которая может осуществлять внутриклеточную деградацию побочных продуктов метаболизма, которые образуются во время внутриклеточного биосинтеза целевого олигосахарида.

Согласно третьему аспекту, генетически сконструированные микробные клетки-хозяева, как ранее описано в данном документе, используются для продуцирования целевого олигосахарида. Использование данных генетически сконструированных микробных клеток-хозяев для продуцирования целевого олигосахарида посредством ферментации является преимущественным, поскольку продуцирование нецелевых побочных продуктов-сахаридов предотвращается или даже прекращается. Таким образом, это сохраняет ресурсы и является менее трудоемким для выделения целевого олигосахарида из ферментационного бульона, поскольку можно избежать отделения целевого олигосахарида от нецелевых побочных продуктов - олигосахаридов. Кроме того, гораздо больше продукта извлечения и источников энергии, предоставленных генетически сконструированным микробным клеткам-хозяевам согласно настоящему изобретению, превращается в целевой продукт, по сравнению с нативной микробной клеткой-хозяином, которая не была генетически сконструирована с возможностью экспрессии гетерологичной гликозидазы.

Согласно четвертому аспекту, целевые олигосахариды, которые получены способом, и/или применением генетически сконструированных микробных клеток-хозяев, описанных в данном документе ранее, предпочтительно выбраны из группы ОГМ.

Целевые олигосахариды, которые получены способом, и/или применением генетически сконструированных микробных клеток-хозяев, описанных в данном документе, могут быть использованы для получения питательной композиции.

Питательная композиция представляет собой лечебную композицию, диетическую композицию, детскую питательную смесь или т.п.

Настоящее изобретение будет описано в отношении конкретных воплощений и со ссылкой на графические материалы, но данное изобретение не ограничивается ими, а только формулой изобретения. Кроме того, термины первый, второй и тому подобное в описании и в формуле изобретения используются для проведения различия между похожими элементами и не обязательно для описания последовательности, во времени, в пространстве, по рангу или любым другим образом. Следует понимать, что термины, используемые таким образом, являются взаимозаменяемыми в соответствующих обстоятельствах, и что воплощения изобретения, описанные в данном документе, способны работать в последовательностях, отличных от описанных или проиллюстрированных в данном документе.

Следует понимать, что термин «содержащий», используемый в формуле изобретения, не следует считать ограничивающимся средствами, перечисленными в дальнейшем; он не исключает других элементов или стадий. Таким образом, его следует считать определяющим наличие заявленных признаков, целых чисел, стадий или компонентов, на которые ссылаются, но он не исключает наличия или добавления одного или более других признаков, целых чисел, стадий или компонентов или их групп. Таким образом, объем выражения «устройство, содержащее средства А и В» не следует ограничивать устройствами, состоящими только из компонентов А и В. Оно означает, что в отношении настоящего изобретения, единственными релевантными компонентами устройства являются А и В.

Ссылка на всем протяжении данного описания изобретения на «одно воплощение» или «воплощение» означает, что конкретный признак, структура или характеристика, описанные в связи с данным воплощением, включены в по меньшей мере одно воплощение настоящего изобретения. Таким образом, появления фраз «в одном воплощении» или «в воплощении» в разных местах по всему объему данного описания изобретения не обязательно все относятся к одному и тому же воплощению, но могут. Кроме того, конкретные признаки, структуры или характеристики могут быть объединены любым подходящим образом, как будет очевидно обычному специалисту в данной области из данного раскрытия, в одном или более воплощениях.

Аналогично следует понимать, что в описании иллюстративных воплощений изобретения разные признаки изобретения иногда сгруппированы вместе в одном единственном воплощении, фигуре или его описании в целях упрощения раскрытия и помощи в понимании одного или более разных аспектов изобретения. Данный способ раскрытия, однако, не нужно считать отражающим мысль, что заявленное изобретение требует больше признаков, чем явным образом перечислены в каждом пункте. Скорее, как отражено в следующей формуле изобретения, аспекты изобретения заключаются меньше чем во всех признаках одного вышеизложенного раскрытого воплощения. Таким образом, формула изобретения после подробного описания явным образом включена тем самым в данное подробное описание, причем каждый пункт отдельно стоит в виде отдельного воплощения данного изобретения.

Кроме того, в то время как некоторые воплощения, описанные в данном документе, включают некоторые, но не все признаки, включенные в другие воплощения, подразумевается, что комбинации признаков разных воплощений находятся в объеме изобретения и образуют разные воплощения, как будет понятно специалистам в данной области. Например, в следующей формуле изобретения любое из заявленных воплощений можно использовать в любой комбинации.

Кроме того, некоторые из воплощений описаны в данном документе как способ или комбинация элементов способа, которые могут быть реализованы посредством процессора компьютерной системы или с помощью других средств выполнения функции. Таким образом, процессор с необходимыми инструкциями для осуществления такого способа или элемента способа образует средство осуществления способа или элемента способа. Кроме того, описанный в данном документе элемент воплощения аппарата представляет собой пример средства осуществления функции, выполняемой элементом, с целью осуществления изобретения.

В описании и графических материалах, предоставленных в данном документе, изложены многочисленные конкретные подробности. Однако, понятно, что воплощения изобретения можно осуществлять на практике без данных конкретных подробностей. В других примерах хорошо известные способы, структуры и методики не были показаны подробно для того, чтобы не затруднять понимание данного описания.

Теперь изобретение будет описано с помощью подробного описания нескольких воплощений изобретения. Ясно, что другие воплощения изобретения могут быть скомпонованы в соответствии со знаниями специалистов в данной области, не отклоняясь от истинной сущности или технической идеи изобретения, причем изобретение ограничено только условиями прилагаемой формулы изобретения.

Пример 1: Метаболическое конструирование штамма BL21(DE3) Е. coli для продукции 2'-фукозиллактозы

BL21(DE3) Е. coli (Novagen) использовали в качестве исходного штамма для конструирования штаммα-хозяина для продукции 2'-FL. Генетическое конструирование исходного штамма включало нарушение гена и события делеций и интеграцию гетерологичных генов.

Поскольку 2'-фукозиллактоза синтезируется из лактозы, ее применяют для бактериальной культуры, и из ГДФ-L-фукозы, которая продуцируется из живых клеток, сначала, копию дикого типа гена lacZ, кодирующего эндогенную β-галактозидазу, инактивировали посредством мутагенеза с использованием ошибки спаривания олигонуклеотидов (Ellis et al., «High efficiency mutagenesis, repair, and engineering of chromosomal DNA using single-stranded oligonucleotides”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6742-6746 (2001)). Используя тот же способ, нарушали ген арабинозоизомеразы araA.

Фрагмент гена lacZΩ вводили под контролем чувствительного к температуре транскрипционного репрессора cl857. Фрагмент гена lacZα экспрессируется под контролем промотора PgbA BL21 (DE3) Е, coli в данном штамме, обнаруживая LacZ⁺штамм.

Геномные делеции осуществляли посредством Red-зависимой рекомбинации фага λ в соответствии с методом Datsenko и Warner («One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products», Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6640-6645 (2000)). Гены fuel и fucK, кодирующие L-фукозоизомеразу и L-фукулозокиназу, соответственно, удаляли для предотвращения деградации L-фукозы. Также удаляли гены wzxC-wcaJ. WcaJ возможно кодирует УДФ-глюкоза: ундекапренилфосфатглюкозо-1-фосфаттрансферазу, катализирующую первую стадию в синтезе колановой кислоты (Stevenson et al., «Organization of the Escherichia coli K-12 gene cluster responsible for production of the extracellular polysaccharide colonic acid», J. Bacterid. 178:4885-4893; (1996)); продуцирование колановой кислоты будет конкурировать за ГДФ-фукозу с реакцией фукозилтрансферазы.

Интеграцию в геном гетерологичных генов проводили посредством транспозиции. Большие кластеры генов интегрировали в геном при посредничестве гиперактивного С9-мутанта транспозазы mariner Himarl (Lampe et al., «Hyperactive transposase mutants of the Himarl mariner transposon», Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:11428-11433 (1999)), который вставляли в плазмиду pEcomar под транскрипционным контролем промотора P_ara. Для усиления de novo синтеза ГДФ-фукозы, гены, кодирующие фосфоманномутазу (manB), маннозо-1-фосфатгуанозилтрансферазу (manC), ГДФ-маннозо-4,6-дегидратазу (gmd) и ГДФ-L-фукозосинтазу (wcaG), из DH5α K12 Е, coli сверхэкспрессировали в штамме BL21(DE3) Е, coli; оперон manCB ставили под контролем конститутивного промотора P_tet, оперон gmd, wcaG транскрибируется с конститутивного промотора P_T5-Транспозонную кассету <P_tet-manCB-P_T5-gmd, wcaG-FRT-dhfr-FRT> (SEQ ID NO: 13), включающую ген дигидрофолатредуктазы для устойчивости к триметоприму, фланкированную инвертированными концевыми повторами, специфично узнаваемыми транспозазой mariner-подобных элементов Himar1, вставляли в геном Е, coli из pEcomar CQ-manCB-gmd, wcaG-dhfr.

Для хромосомной интеграции одиночных генов использовали транспозазу EZ-Tn5™ (Epicentre, США). Для получения транспосом EZ-Tn5 исследуемый ген вместе с FRT-сайт-фланкированной кассетой устойчивости к антибиотику амплифицировали с помощью праймеров, которые несли на обоих участках сайты распознавания 19 - п.н. Mosaic End (5'-CTGTCTCTTATACACATCT, SEQ ID NO: 21) для транспозазы EZ-Tn5. Используя транспозазу EZ-Tn5TM, ген импортера лактозы LacY от K12 TG1 Е, coli (учет. №ABN72583), ген 2-фукозилтрансферазы wbgL от Е. coli: O126 (учет. №ADN43847), и ген yberc0001_9420, кодирующий эффлюксный транспортер сахара суперсемейства мембранных транспортеров из Yersinia bercovieri АТСС 43970 (учет. №EEQ08298), интегрировали, используя соответствующие кассеты интеграции: <P_tet-lacY-FRT-aadA-FRT> (SEQ ID NO: 14), <P_tet-wbgL.co-FRT-neo-FRT> (SEQ ID NO: 15) и <P_tet-yberc0001_9420co-FRT-cat-FRT> (SEQ ID NO: 16). Гены wbgL и yberc0001_9420 синтетически синтезировали и осуществляли оптимизацию кодонов (со) GenScript Cooperation (США). После успешной интеграции гена lacY ген устойчивости устраняли из клонов, устойчивых к стрептомицину, посредством рекомбиназы FLP, кодируемой на плазмиде рСР20 (Datsenko and Warner, «One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6640-6645 (2000)).

Поскольку BL21(DE3) E, coli не имеет функционального gal-оперона, нативно регулируемую копию оперона galETKM от Е, coli K интегрировали в штамм В посредством EZ-транспозиции с использованием интегрируемой кассеты <P_gal-galЕ-galT-galK-galM> (SEQ ID NO: 17). Интегранты выбирали из агара МакКонки, содержащего 1% галактозу, в виде красных колоний. Полученный штамм может метаболизировать моносахариды - глюкозу и галактозу, возникающие в результате гидролиза лактозы.

Дополнительного улучшения, касающегося синтеза 2'-фукозиллактозы штаммом Е, coli, достигали посредством делеции гена pfkA, кодирующего фосфофруктокиназу А. При культивировании Е, coli на глюконеогенном субстрате подобно глицерину, фосфорилирование фруктозо-6-фосфата под действием PfkA представляет собой тредмил-реакцию с высоким потреблением АТФ, и, кроме того, конкурирует с ManA за субстрат. Ген pfkA удаляли в результате гомологичной рекомбинации в соответствии с Datsenko and Wanner (2000) с использованием кассеты устойчивости к гентамицину (аасС1), которая фланкирована сайтами lox71/66 (Lambert, JM et al. (2007) Cre-lox-based system for multiple gene deletions and selectable - marker removal in Lactobacillus plantarum. Appl. Environ. Microbiol 73: 1126-1135). После удачной делеции гена pfkA ген устойчивости к антибиотику удаляли из генома Е, colic использованием рекомбиназы Cre (Abremski, K et al. (1983) Studies on the properties of P1 site-specific recombination: evidence for topologically unlinked products following recombination. Cell 32: 1301-1311), который клонировали под контролем промотора P_ara в каркас pKD46 (Datsenko and Wanner, 2000).

В случае разных фукозилтрансфераз помимо трансферазной активности была продемонстрирована ГДФ-L-фукозогидролазная активность. Кроме того, в случае wbgL, α-1,2-фукозилтрансферазы, используемой в данном документе для синтеза 2'-фукозиллактозы, была показана данная гидролитическая активность (см. ЕР 3 050 973 А1). Для сохранения свободной L-фукозы для продуцирования 2'-фукозиллактозы и для устранения загрязняющей L-фукозы из культурального бульона, ген fkp, кодирующий бифункциональную L-фукокиназо/L-фукозо-1-фосфатгуанилилтрансферазу Bacteroides fragilis, под транскрипционным контролем промотора P_tet, вместе с lox71/66-фланкированным геном аасС1 хромосомно интегрировали посредством транспозиции с использованием транспозазы EZ-Tn5™, <P_tet-fkp-lox-aacC1-lox> (SEQ ID NO: 18). После успешной интеграции ген устойчивости к гентамицину удаляли из генома, как описано выше.

Для усиления потока метаболизированного источника углерода-глицерина через глюконеогенный путь от триозофосфатов до фруктозо-6-фосфата для подпитки биосинтеза ГДФ-L-фукозы осуществляли сверхэкспрессию генов, кодирующих фруктозо-1,6-бисфосфатальдолазу (fbaB) и гетерологичную фруктозо-1,6-бисфосфатфосфотазу (fbpase), из Pisum sativum. Ген fbaB от BL21 (DE3) Е. coli сливали с промотором P_tet. Активность FBPase хлоропласта P. sativum аллостерически регулировали посредством замены дисульфид-дитиол за счет восстановления тиоредоксинами. Замена остатка цистеина 153 на серии приводит к конститутивно активному ферменту. Приобретали ген, кодирующий FBPase хлоропласта от P. sativum (учет. №AAD10213), осуществляли оптимизацию кодонов для экспрессии в Е. coli, метели N-концевой гексагистидиновой меткой и модифицировали для кодирования варианта C153S фермента из Genescript. Ген fbpase транскрибируется с промотора 17. Кассету <P_tet-fbaB-P₁₇-His₆-fbpase-lox-аасС1-lox> (SEQ ID NO: 19) использовали для транспозаза EZ-Tn5™ -опосредованной интеграции в штамме-хозяине. После удаления гена устойчивости к гентамицину из генома Е. coli штамм использовали для продукции 2'-фукозиллактозы. Впоследствии, данный штамм называется «штаммом А».

Пример 2: Конструирование штамма BL21(DE3) Е. coli для продукции 2'-фукозиллактозы с высокой чистотой

Культивирования с подпиткой с использованием штамма А для продукции 2'-фукозиллактозы обнаружили наличие побочных продуктов β-фукозиллактозы и 2'3-дифукозиллактозы) в культуральном бульоне. Для минимизации продукции данных побочных продуктов, а также для улучшения выхода углерода, α-1,3-фукозидазу субклонировали за конститутивным промотором и интегрировали в геном штамма А. Таким образом, ген afcB Bifidobacterium bifidum (учетн. № АВ474964) сливали с конститутивным промотором P_and и геном устойчивости к гентамицину. Полученную транспозонную кассету <P_and-afcS-lox-aacC7-lox> (SEQ ID NO: 20), фланкированную инвертированными концевыми повторами, специфично распознаваемыми транспозазой mariner-подобных элементов Himar1, вставляли в геном Е, coli из pEcomar afcB-aacC1, образуя «штамм В».

Пример 3: Анализ ВЭЖХ для выявления 2'-фукозиллактозы в супернатанте культуры

Анализы посредством ВЭЖХ проводили, используя рефрактометрический детектор (RID-10A) (Shimadzu, Германия) и колонку Waters XBridge Amide 3,5 мкм (250 × 4,6 мм) (Eschborn, Германия), соединенную с системой ВЭЖХ (Shimadzu, Германия). Элюирование проводили изократически с помощью 30% А: 50% (об./об.) ACN (от англ. acetonitrile - ацетонитрил) в ddH₂O, 0,1% (об./об.) NH₄OH и 70% В: 80% (об./об.) ACN в ddH₂O, 0,1% (об./об.) NH₄OH (об./об.) в качестве элюента при 35°С и при скорости потока 1,4 мл мин^-1. Образцы для ВЭЖХ подвергали стерильной фильтрации (размер пор 0,22 мкм) и очищали посредством твердофазной экстракции на ионообменной матрице (Strata ABW, Phenomenex). 10 мкл образцов наносили на колонку, и концентрацию 2'-фукозиллактозы рассчитывали в соответствии со стандартной кривой. Другие сахара, такие как L-фукоза и/или другие моносахариды, лактоза и/или другие дисахариды, 3-фукозиллактоза и/или другие трисахариды, 2'3-дифукозиллактоза и/или другие тетрасахариды, а также глицерин, также могут быть выявлены с использованием данных условий анализа. Относительные количества выявленных Сахаров можно определять посредством сравнения AUC (от англ. area under the curve - площадь под кривой) всех пиков в хроматограмме. Пики, также присутствующие в водном контроле, исключают из данного расчета.

Пример 4: Получение 2'-фукозиллактозы в процессе ферментации

Ферментации проводили в 3л-ферментерах при 33°С (New Brunswick, Edison, США), начиная с 1000 мл среды с минеральными солями, содержащей 3 г/л KH₂PO₄, 12 г/л K₂HPO₄, 5 г/л (NH₄)₂SO₄, 0,3 г/л лимонной кислоты, 2 г/л MgSO₄ × 7⋅H₂O, 0,1 г/л NaCl и 0,015 г/л CaCl₂ × 6⋅H₂O с добавлением 1 г/л раствора микроэлементов (54,4 г^⋅л^-1 цитрата железа (III)-аммония, 9,8 г/л MnCl₂ × 4⋅H₂O, 1,6 г/л CoCl₂ × 6⋅Н₂O, 1 г/л CuCl₂ × 2⋅H₂O, 1,9 г/л Н₃ВО₃, 9 г/л ZnSO₄ × 7⋅H₂O, 1,1 г/л Na₂MoO₄ × 2⋅H₂O, 1,5 г/л Na₂SeO₃, 1.,5 г/л NiSO₄ × 6⋅H₂O) и содержащей 2% (об./об.) глицерина в качестве источника углерода, 60 мМ лактозу и антибиотик канамицин (25 мкг/мл). Аэрацию поддерживали на уровне 3 л/мин. Растворенный кислород поддерживали на уровне насыщения 20-30% посредством осуществления контроля скорости перемешивания. рН поддерживали на уровне 7,0 посредством добавления 25%-ного раствора аммония. Культивацию начинали с 2,5% (об./об.) инокулята из предварительной культуры, растущей в той же среде, содержащей глицерин, но не содержащей лактозы. После прохождения порционной фазы, на что указывало повышение уровня растворенного кислорода, осуществляли подачу глицерина (60% (об./об.) с добавлением 2 г/л MgSO₄ × 7⋅H₂O, 0,015 г/л CaCl₂ × 6⋅H₂O и 1 мл/л раствора микроэлементов) при скоростях потока 7,0-8,0 мл/ч, относительно исходного объема. Подачу лактозы (0,66 М) проводили на протяжении всей культивации и регулировали интуитивно для реализации постоянной подачи лактозы в культуральной бульоне. Подачу лактозы останавливали к концу ферментации, и культивацию продолжали до тех пор, пока лактоза полностью не превратится в 2'-фукозиллактозу. Через примерно 94 часа после засева ферментера титр 2'-фукозиллактозы в клеточной среде примерно 150 г/л достигался при использовании штамма, описанного в примере 1 (штамм А). Штамм, продуцирующий 2'-фукозиллактозу, генетически модифицированный, как описано в примере 2 (штамм В), культивировали аналогично, и он также приводил к получению титра 2'-фукозиллактозы примерно 150 г/л. Однако, количество побочных продуктов было значимо ниже, чем после культивирования штамма А (Таблица 2). Тогда как содержание сахарида в супернатанте культуры штамма А составляло только 94,22% 2'-фукозиллактозы, оно увеличивалось на 5,50% в супернатанте культуры штамма В, демонстрируя чистоту 99,72%.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Jennewein Biotechnologie GmbH

<120> ПРИМЕНЕНИЕ ГЛИКОЗИДАЗ В ПОЛУЧЕНИИ ОЛИГОСАХАРИДОВ

<130> P 1804 WO

<160> 20

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 5880

<212> ДНК

<213> Bifidobacterium bifidum

<400> 1

atgaaacata gagcgatgtc atcgcgtctg atgccactgg tggcgtcctg cgcgacggtc 60

ggcatgctgc tggccggact acctgtgtcg gccgtcgcgg tcggcacgac gagagcggca 120

gcgtccgacg cctcgtcctc caccacagca accatcaccc cctccgccga taccacgttg 180

cagacatgga cgagcgagaa gaattcctca atggcgtcca agccgtacat cggcacactg 240

caagggccct cgcaaggcgt gttcggcgag aagttcgagt ccacggatgc cgcggacacc 300

accgatctga agaccggcct gctgacgttc gacctgagcg cctacgacca tgcccccgat 360

tccgcaacgt tcgagatgac gtacctcggc taccgcggca acccgacggc caccgacacc 420

gacaccatca aggtgacccc cgtcgacacc accgtgtgca ccaataacgc cacagactgc 480

ggcgcgaatg tcgcgaccgg cgcgaccaag ccgaagttca gcatcaacga ctcctcattc 540

gtcgccgagt ccaagccgtt cgagtacggt acgacggttt acacgggcga cgccatcacc 600

gtggttcccg ccaataccaa gaaggtcacc gtagatgtga ccgaaatcgt gcgccagcag 660

ttcgccgaag gcaagaaggt catcaccctg gccgtgggcg agaccaagaa gaccgaggtt 720

cgtttcgcca gttccgaagg cacgacgtcc ctgaacggcg cgaccgcaga catggctccg 780

aagctgaccg tttccgtgtc caccaaggac gatctcaagc cctccgccga caccacgttg 840

caggcatggg ccagcgagaa gaacgagaag aagaacactg cggcctatgt cggcgcgctg 900

cagccggaag gcgattacgg cgacttcggt gagaagttca agtccaccga cgtccacgat 960

gtcacagacg ccaagatggg tctgatgacg ttcgacctgt ccgattacac cgcggcgccc 1020

gagcactcca tcctcacctt gacgtatctg ggctacgccg gtgcagacaa gaccgccacg 1080

gccaccgata aggtcaaggt ggtcgctgtt gacacgtcgc ggtgcaccgg caccgctccc 1140

tgcgacacca acaatgccac gtgggcgaac cgcccggact tcgaggtgac cgataccacg 1200

aagaccgcga cgtcccatgc gttcgcttat ggatctaaga agtattccga tggcatgacc 1260

gtcgaatcgg gcaacgccaa gaaggtcctg ctcgacgtgt ccgatgtcat caaggcagag 1320

ttcgccaagt tcagcgccgg cgccaccgag aagaagatca cgctggccct gggcgagctc 1380

aacaagtccg acatgcgttt cggcagcaag gaagtcacct cgctgaccgg cgccaccgaa 1440

gccatgcagc cgaccttgtc cgtcaccaag aagccgaagg catacacgct gagcatcgaa 1500

ggcccgacca aggtcaagta ccagaagggc gaggcgttcg acaaggccgg actcgtggtc 1560

aaggccacca gcacggctga cggcacggtc aagacgctga ccgaaggcaa cggtgaggat 1620

aactacacca tcgacaccag cgctttcgat agtgccagca tcggcgtata ccctgttacc 1680

gtgaagtaca acaaggaccc cgaaatcgcc gcttcgttca acgcctatgt catcgccagt 1740

gtcgaggacg gcggagacgg cgacaccagc aaagacgact ggctgtggta caagcagccc 1800

gcgtcgcaga ccgacgccac cgccaccgcc ggcggcaatt acggcaaccc cgacaacaac 1860

cgttggcagc agaccacctt gccgttcggc aacggcaaga tcggcggcac cgtctggggc 1920

gaggtcagcc gtgaacgcgt caccttcaac gaggagacgc tgtggaccgg cggccccgga 1980

tcctcgacca gctacaacgg cggcaacaac gagaccaagg gtcagaacgg cgccacgctg 2040

cgcgcgctca acaagcagct cgcgaacggc gccgagacgg tcaatcccgg caacctgacc 2100

ggcggcgaga acgcggccga gcagggcaac tacctgaact ggggcgacat ctacctcgac 2160

tacgggttca acgatacgac cgtcaccgaa taccgccgcg acctgaacct gagcaagggc 2220

aaggccgacg tcacgttcaa gcatgacggc gtcacctaca cgcgcgaata cttcgcgtcg 2280

aaccccgaca atgtcatggt cgcccgcctc acggccagca aagccggcaa gctgaacttc 2340

aacgtcagca tgccgaccaa cacgaactac tccaagaccg gcgaaaccac gacggtcaag 2400

ggtgacacgc tcaccgtcaa gggcgctctc ggcaacaacg gcctgctgta caactcgcag 2460

atcaaggtcg tcctcgacaa cggtgagggc acgctctccg aaggctccga cggcgcttcg 2520

ctgaaggtct ccgacgcgaa ggcggtcacg ctgtacatcg ccgccgcgac ggactacaag 2580

cagaagtatc cgtcctaccg caccggcgaa accgccgccg aggtgaacac ccgcgtcgcc 2640

aaggtcgtgc aggacgccgc caacaagggc tacaccgccg tcaagaaagc gcacatcgac 2700

gatcattccg ccatctacga ccgcgtgaag atcgatttgg gccagtccgg ccacagctcc 2760

gacggcgccg tcgccaccga cgcgctgctc aaggcgtacc agagaggctc cgcaaccacc 2820

gcgcagaagc gcgagctgga gacgctggtg tacaagtacg gccgctactt gaccatcggc 2880

tcctcccgtg agaacagcca gctgcccagc aacctgcagg gcatctggtc ggtcaccgcg 2940

ggcgacaacg cccacggcaa cacgccttgg ggctccgact tccacatgaa cgtgaacctc 3000

cagatgaact actggccgac ctattcggcc aacatgggag agctcgccga gccgctcatc 3060

gagtatgtgg agggtctggt caagcccggc cgtgtgaccg ccaaggtcta cgcgggcgcg 3120

gagacgacga accccgagac cacgccgatc ggcgagggcg agggctacat ggcccacacc 3180

gagaacaccg cctacggctg gaccgcaccc ggtcaatcgt tctcgtgggg ttggagcccg 3240

gccgccgtgc cgtggatcct gcagaacgtg tacgaggcgt acgagtactc cggcgaccct 3300

gccctgcttg atcgcgtgta cgcgctgctc aaggaggaat cgcacttcta cgtcaactac 3360

atgctgcaca aggccggctc cagctccggt gaccgcctga ctaccggcgt cgcgtactcg 3420

cccgaacagg gcccgctggg caccgacggc aacacgtacg agagctcgct cgtgtggcag 3480

atgctcaacg acgccatcga ggcggccaag gccaagggag atccggacgg tctggtcggc 3540

aataccaccg actgctcggc cgacaactgg gccaagaatg acagcggcaa cttcaccgat 3600

gcgaacgcca accgttcctg gagctgcgcc aagagcctgc tcaagccgat cgaggtcggc 3660

gactccggcc agatcaagga atggtacttc gaaggtgcgc tcggcaagaa gaaggatgga 3720

tccaccatca gcggctacca ggcggacaac cagcaccgtc acatgtccca cctgctcgga 3780

ctgttccccg gtgatttgat caccatcgac aactccgagt acatggatgc ggccaagacc 3840

tcgctgaggt accgctgctt caagggcaac gtgctgcagt ccaacaccgg ctgggccatt 3900

ggccagcgca tcaattcgtg ggctcgcacc ggcgacggca acaccacgta ccagctggtc 3960

gagctgcagc tcaagaacgc gatgtatgca aacctgttcg attaccatgc gccgttccag 4020

atcgacggca acttcggcaa cacctccggt gtcgacgaaa tgctgctgca gtccaactcc 4080

accttcaccg acaccgccgg caagaagtac gtgaactaca cgaacatcct gcccgccctg 4140

cccgatgcct gggcgggcgg ctcggtgagc ggcctcgtgg cccgcggcaa cttcaccgtc 4200

ggcacgacat ggaagaacgg caaggccacc gaagtcaggc tgacctccaa caagggcaag 4260

caggcggccg tcaagatcac cgccggcggc gcccagaact acgaggtcaa gaacggtgac 4320

accgccgtga acgccaaggt cgtgaccaac gcggacggcg cctcgctgct cgtgttcgat 4380

accaccgcag gcaccacgta cacgatcacg aagaaggcga gcgccaacgt gcccgtcacc 4440

ggcgtgaccg tgaccggcgc caacaccgcc accgcaggcg acaccgtcac tcttacggct 4500

accgtcgccc cggccaatgc gaccgacaag tccgtcacct ggtcgacctc cgacgccgcc 4560

gtagctacgg tcaacgccaa cggcgtggtg accacgaaga aggccggcaa ggtgaccatc 4620

accgccacgt cgaacggcga caagacgaag ttcggttcca tcgagatcac cgtctccgcc 4680

gcgaccgtgc ccgtcaccag cgtcaccgtt gccggcgacg ccgcgatgac cgtcgatgga 4740

gagcagaccc tgacggcgac cgtcgccccg gccactgcga ccgacaagac ggtcacgtgg 4800

aagtcctccg acgccactgt ggcgacggtt gacgccaacg gcaaggtcgt cgcgaagaag 4860

gccggcgaag tgacgatcac cgccacggcc ggtggcgtgt ccggcacgct gaagatcacg 4920

gtgagcgaca aggccccgac cgtcatcccg gtccagtccg tgaccgtgac aggcaagcag 4980

gagctcgtcg aaggcgcctc cacgaccctg acggcgaccg tcgccccggc tgacgcgacc 5040

gacaagacgg ttacgtggaa gtcgagcgac gagtccgtcg ccacggtcga caaggacggc 5100

gtcgtgaccg ccaagaaggc cggcacggtg accatcaccg ccacggccgg tggcgtgtcc 5160

ggcacgctcc acatcaccgt gacggccaag cccgtcgaga ccgtccccgt caccagcgtg 5220

gaggtcaccg tcgaggccgg caccaccgtc tccgtcggca agacactcca ggccaccgcg 5280

accgtcaagc ccggcaacgc caccaacaag aaggtgacgt ggaagtcgag cgacgaatcc 5340

atcgcgacgg tcgacgccaa cggcgtcatc accgcgaaga aggccggcaa ggtcgtcatc 5400

acggccacct cgaccgacgg cacggacaag tccggcagcg tcgagatcac cgtcgtggat 5460

gagaccaagc cgacgcccga ccacaagtcc gtcaaggccg ataccggcga cgtgaccgcc 5520

ggcaagaccg gtacggtcac cgagccgaag gacgtggcgg gctggaagag ccgctccatc 5580

atcaagcaag gcaagctcgg caaggccgaa atcgccgacg gcacgctcgt gtatgcggcc 5640

ggcgacaaga ccggtgacga cagcttcgtc gtgcagtaca cgatggccga cggcacggtc 5700

atcgacgtga cctacagcgt cacggtcaag gccgccgaaa ccggcaagaa cgacggcgac 5760

ggcaagggcg acggtgtcgc gaagaccggc gccgccgtcg gcgcgctcgc cggcctcggc 5820

ttgatgctgc tcgccgtcgg agtgagcgtg gtgatgattc gccgcaagca ctccgcctga 5880

<210> 2

<211> 1959

<212> ПРТ

<213> Bifidobacterium bifidum

<400> 2

Met Lys His Arg Ala Met Ser Ser Arg Leu Met Pro Leu Val Ala Ser

1 5 10 15

Cys Ala Thr Val Gly Met Leu Leu Ala Gly Leu Pro Val Ser Ala Val

20 25 30

Ala Val Gly Thr Thr Arg Ala Ala Ala Ser Asp Ala Ser Ser Ser Thr

35 40 45

Thr Ala Thr Ile Thr Pro Ser Ala Asp Thr Thr Leu Gln Thr Trp Thr

50 55 60

Ser Glu Lys Asn Ser Ser Met Ala Ser Lys Pro Tyr Ile Gly Thr Leu

65 70 75 80

Gln Gly Pro Ser Gln Gly Val Phe Gly Glu Lys Phe Glu Ser Thr Asp

85 90 95

Ala Ala Asp Thr Thr Asp Leu Lys Thr Gly Leu Leu Thr Phe Asp Leu

100 105 110

Ser Ala Tyr Asp His Ala Pro Asp Ser Ala Thr Phe Glu Met Thr Tyr

115 120 125

Leu Gly Tyr Arg Gly Asn Pro Thr Ala Thr Asp Thr Asp Thr Ile Lys

130 135 140

Val Thr Pro Val Asp Thr Thr Val Cys Thr Asn Asn Ala Thr Asp Cys

145 150 155 160

Gly Ala Asn Val Ala Thr Gly Ala Thr Lys Pro Lys Phe Ser Ile Asn

165 170 175

Asp Ser Ser Phe Val Ala Glu Ser Lys Pro Phe Glu Tyr Gly Thr Thr

180 185 190

Val Tyr Thr Gly Asp Ala Ile Thr Val Val Pro Ala Asn Thr Lys Lys

195 200 205

Val Thr Val Asp Val Thr Glu Ile Val Arg Gln Gln Phe Ala Glu Gly

210 215 220

Lys Lys Val Ile Thr Leu Ala Val Gly Glu Thr Lys Lys Thr Glu Val

225 230 235 240

Arg Phe Ala Ser Ser Glu Gly Thr Thr Ser Leu Asn Gly Ala Thr Ala

245 250 255

Asp Met Ala Pro Lys Leu Thr Val Ser Val Ser Thr Lys Asp Asp Leu

260 265 270

Lys Pro Ser Ala Asp Thr Thr Leu Gln Ala Trp Ala Ser Glu Lys Asn

275 280 285

Glu Lys Lys Asn Thr Ala Ala Tyr Val Gly Ala Leu Gln Pro Glu Gly

290 295 300

Asp Tyr Gly Asp Phe Gly Glu Lys Phe Lys Ser Thr Asp Val His Asp

305 310 315 320

Val Thr Asp Ala Lys Met Gly Leu Met Thr Phe Asp Leu Ser Asp Tyr

325 330 335

Thr Ala Ala Pro Glu His Ser Ile Leu Thr Leu Thr Tyr Leu Gly Tyr

340 345 350

Ala Gly Ala Asp Lys Thr Ala Thr Ala Thr Asp Lys Val Lys Val Val

355 360 365

Ala Val Asp Thr Ser Arg Cys Thr Gly Thr Ala Pro Cys Asp Thr Asn

370 375 380

Asn Ala Thr Trp Ala Asn Arg Pro Asp Phe Glu Val Thr Asp Thr Thr

385 390 395 400

Lys Thr Ala Thr Ser His Ala Phe Ala Tyr Gly Ser Lys Lys Tyr Ser

405 410 415

Asp Gly Met Thr Val Glu Ser Gly Asn Ala Lys Lys Val Leu Leu Asp

420 425 430

Val Ser Asp Val Ile Lys Ala Glu Phe Ala Lys Phe Ser Ala Gly Ala

435 440 445

Thr Glu Lys Lys Ile Thr Leu Ala Leu Gly Glu Leu Asn Lys Ser Asp

450 455 460

Met Arg Phe Gly Ser Lys Glu Val Thr Ser Leu Thr Gly Ala Thr Glu

465 470 475 480

Ala Met Gln Pro Thr Leu Ser Val Thr Lys Lys Pro Lys Ala Tyr Thr

485 490 495

Leu Ser Ile Glu Gly Pro Thr Lys Val Lys Tyr Gln Lys Gly Glu Ala

500 505 510

Phe Asp Lys Ala Gly Leu Val Val Lys Ala Thr Ser Thr Ala Asp Gly

515 520 525

Thr Val Lys Thr Leu Thr Glu Gly Asn Gly Glu Asp Asn Tyr Thr Ile

530 535 540

Asp Thr Ser Ala Phe Asp Ser Ala Ser Ile Gly Val Tyr Pro Val Thr

545 550 555 560

Val Lys Tyr Asn Lys Asp Pro Glu Ile Ala Ala Ser Phe Asn Ala Tyr

565 570 575

Val Ile Ala Ser Val Glu Asp Gly Gly Asp Gly Asp Thr Ser Lys Asp

580 585 590

Asp Trp Leu Trp Tyr Lys Gln Pro Ala Ser Gln Thr Asp Ala Thr Ala

595 600 605

Thr Ala Gly Gly Asn Tyr Gly Asn Pro Asp Asn Asn Arg Trp Gln Gln

610 615 620

Thr Thr Leu Pro Phe Gly Asn Gly Lys Ile Gly Gly Thr Val Trp Gly

625 630 635 640

Glu Val Ser Arg Glu Arg Val Thr Phe Asn Glu Glu Thr Leu Trp Thr

645 650 655

Gly Gly Pro Gly Ser Ser Thr Ser Tyr Asn Gly Gly Asn Asn Glu Thr

660 665 670

Lys Gly Gln Asn Gly Ala Thr Leu Arg Ala Leu Asn Lys Gln Leu Ala

675 680 685

Asn Gly Ala Glu Thr Val Asn Pro Gly Asn Leu Thr Gly Gly Glu Asn

690 695 700

Ala Ala Glu Gln Gly Asn Tyr Leu Asn Trp Gly Asp Ile Tyr Leu Asp

705 710 715 720

Tyr Gly Phe Asn Asp Thr Thr Val Thr Glu Tyr Arg Arg Asp Leu Asn

725 730 735

Leu Ser Lys Gly Lys Ala Asp Val Thr Phe Lys His Asp Gly Val Thr

740 745 750

Tyr Thr Arg Glu Tyr Phe Ala Ser Asn Pro Asp Asn Val Met Val Ala

755 760 765

Arg Leu Thr Ala Ser Lys Ala Gly Lys Leu Asn Phe Asn Val Ser Met

770 775 780

Pro Thr Asn Thr Asn Tyr Ser Lys Thr Gly Glu Thr Thr Thr Val Lys

785 790 795 800

Gly Asp Thr Leu Thr Val Lys Gly Ala Leu Gly Asn Asn Gly Leu Leu

805 810 815

Tyr Asn Ser Gln Ile Lys Val Val Leu Asp Asn Gly Glu Gly Thr Leu

820 825 830

Ser Glu Gly Ser Asp Gly Ala Ser Leu Lys Val Ser Asp Ala Lys Ala

835 840 845

Val Thr Leu Tyr Ile Ala Ala Ala Thr Asp Tyr Lys Gln Lys Tyr Pro

850 855 860

Ser Tyr Arg Thr Gly Glu Thr Ala Ala Glu Val Asn Thr Arg Val Ala

865 870 875 880

Lys Val Val Gln Asp Ala Ala Asn Lys Gly Tyr Thr Ala Val Lys Lys

885 890 895

Ala His Ile Asp Asp His Ser Ala Ile Tyr Asp Arg Val Lys Ile Asp

900 905 910

Leu Gly Gln Ser Gly His Ser Ser Asp Gly Ala Val Ala Thr Asp Ala

915 920 925

Leu Leu Lys Ala Tyr Gln Arg Gly Ser Ala Thr Thr Ala Gln Lys Arg

930 935 940

Glu Leu Glu Thr Leu Val Tyr Lys Tyr Gly Arg Tyr Leu Thr Ile Gly

945 950 955 960

Ser Ser Arg Glu Asn Ser Gln Leu Pro Ser Asn Leu Gln Gly Ile Trp

965 970 975

Ser Val Thr Ala Gly Asp Asn Ala His Gly Asn Thr Pro Trp Gly Ser

980 985 990

Asp Phe His Met Asn Val Asn Leu Gln Met Asn Tyr Trp Pro Thr Tyr

995 1000 1005

Ser Ala Asn Met Gly Glu Leu Ala Glu Pro Leu Ile Glu Tyr Val

1010 1015 1020

Glu Gly Leu Val Lys Pro Gly Arg Val Thr Ala Lys Val Tyr Ala

1025 1030 1035

Gly Ala Glu Thr Thr Asn Pro Glu Thr Thr Pro Ile Gly Glu Gly

1040 1045 1050

Glu Gly Tyr Met Ala His Thr Glu Asn Thr Ala Tyr Gly Trp Thr

1055 1060 1065

Ala Pro Gly Gln Ser Phe Ser Trp Gly Trp Ser Pro Ala Ala Val

1070 1075 1080

Pro Trp Ile Leu Gln Asn Val Tyr Glu Ala Tyr Glu Tyr Ser Gly

1085 1090 1095

Asp Pro Ala Leu Leu Asp Arg Val Tyr Ala Leu Leu Lys Glu Glu

1100 1105 1110

Ser His Phe Tyr Val Asn Tyr Met Leu His Lys Ala Gly Ser Ser

1115 1120 1125

Ser Gly Asp Arg Leu Thr Thr Gly Val Ala Tyr Ser Pro Glu Gln

1130 1135 1140

Gly Pro Leu Gly Thr Asp Gly Asn Thr Tyr Glu Ser Ser Leu Val

1145 1150 1155

Trp Gln Met Leu Asn Asp Ala Ile Glu Ala Ala Lys Ala Lys Gly

1160 1165 1170

Asp Pro Asp Gly Leu Val Gly Asn Thr Thr Asp Cys Ser Ala Asp

1175 1180 1185

Asn Trp Ala Lys Asn Asp Ser Gly Asn Phe Thr Asp Ala Asn Ala

1190 1195 1200

Asn Arg Ser Trp Ser Cys Ala Lys Ser Leu Leu Lys Pro Ile Glu

1205 1210 1215

Val Gly Asp Ser Gly Gln Ile Lys Glu Trp Tyr Phe Glu Gly Ala

1220 1225 1230

Leu Gly Lys Lys Lys Asp Gly Ser Thr Ile Ser Gly Tyr Gln Ala

1235 1240 1245

Asp Asn Gln His Arg His Met Ser His Leu Leu Gly Leu Phe Pro

1250 1255 1260

Gly Asp Leu Ile Thr Ile Asp Asn Ser Glu Tyr Met Asp Ala Ala

1265 1270 1275

Lys Thr Ser Leu Arg Tyr Arg Cys Phe Lys Gly Asn Val Leu Gln

1280 1285 1290

Ser Asn Thr Gly Trp Ala Ile Gly Gln Arg Ile Asn Ser Trp Ala

1295 1300 1305

Arg Thr Gly Asp Gly Asn Thr Thr Tyr Gln Leu Val Glu Leu Gln

1310 1315 1320

Leu Lys Asn Ala Met Tyr Ala Asn Leu Phe Asp Tyr His Ala Pro

1325 1330 1335

Phe Gln Ile Asp Gly Asn Phe Gly Asn Thr Ser Gly Val Asp Glu

1340 1345 1350

Met Leu Leu Gln Ser Asn Ser Thr Phe Thr Asp Thr Ala Gly Lys

1355 1360 1365

Lys Tyr Val Asn Tyr Thr Asn Ile Leu Pro Ala Leu Pro Asp Ala

1370 1375 1380

Trp Ala Gly Gly Ser Val Ser Gly Leu Val Ala Arg Gly Asn Phe

1385 1390 1395

Thr Val Gly Thr Thr Trp Lys Asn Gly Lys Ala Thr Glu Val Arg

1400 1405 1410

Leu Thr Ser Asn Lys Gly Lys Gln Ala Ala Val Lys Ile Thr Ala

1415 1420 1425

Gly Gly Ala Gln Asn Tyr Glu Val Lys Asn Gly Asp Thr Ala Val

1430 1435 1440

Asn Ala Lys Val Val Thr Asn Ala Asp Gly Ala Ser Leu Leu Val

1445 1450 1455

Phe Asp Thr Thr Ala Gly Thr Thr Tyr Thr Ile Thr Lys Lys Ala

1460 1465 1470

Ser Ala Asn Val Pro Val Thr Gly Val Thr Val Thr Gly Ala Asn

1475 1480 1485

Thr Ala Thr Ala Gly Asp Thr Val Thr Leu Thr Ala Thr Val Ala

1490 1495 1500

Pro Ala Asn Ala Thr Asp Lys Ser Val Thr Trp Ser Thr Ser Asp

1505 1510 1515

Ala Ala Val Ala Thr Val Asn Ala Asn Gly Val Val Thr Thr Lys

1520 1525 1530

Lys Ala Gly Lys Val Thr Ile Thr Ala Thr Ser Asn Gly Asp Lys

1535 1540 1545

Thr Lys Phe Gly Ser Ile Glu Ile Thr Val Ser Ala Ala Thr Val

1550 1555 1560

Pro Val Thr Ser Val Thr Val Ala Gly Asp Ala Ala Met Thr Val

1565 1570 1575

Asp Gly Glu Gln Thr Leu Thr Ala Thr Val Ala Pro Ala Thr Ala

1580 1585 1590

Thr Asp Lys Thr Val Thr Trp Lys Ser Ser Asp Ala Thr Val Ala

1595 1600 1605

Thr Val Asp Ala Asn Gly Lys Val Val Ala Lys Lys Ala Gly Glu

1610 1615 1620

Val Thr Ile Thr Ala Thr Ala Gly Gly Val Ser Gly Thr Leu Lys

1625 1630 1635

Ile Thr Val Ser Asp Lys Ala Pro Thr Val Ile Pro Val Gln Ser

1640 1645 1650

Val Thr Val Thr Gly Lys Gln Glu Leu Val Glu Gly Ala Ser Thr

1655 1660 1665

Thr Leu Thr Ala Thr Val Ala Pro Ala Asp Ala Thr Asp Lys Thr

1670 1675 1680

Val Thr Trp Lys Ser Ser Asp Glu Ser Val Ala Thr Val Asp Lys

1685 1690 1695

Asp Gly Val Val Thr Ala Lys Lys Ala Gly Thr Val Thr Ile Thr

1700 1705 1710

Ala Thr Ala Gly Gly Val Ser Gly Thr Leu His Ile Thr Val Thr

1715 1720 1725

Ala Lys Pro Val Glu Thr Val Pro Val Thr Ser Val Glu Val Thr

1730 1735 1740

Val Glu Ala Gly Thr Thr Val Ser Val Gly Lys Thr Leu Gln Ala

1745 1750 1755

Thr Ala Thr Val Lys Pro Gly Asn Ala Thr Asn Lys Lys Val Thr

1760 1765 1770

Trp Lys Ser Ser Asp Glu Ser Ile Ala Thr Val Asp Ala Asn Gly

1775 1780 1785

Val Ile Thr Ala Lys Lys Ala Gly Lys Val Val Ile Thr Ala Thr

1790 1795 1800

Ser Thr Asp Gly Thr Asp Lys Ser Gly Ser Val Glu Ile Thr Val

1805 1810 1815

Val Asp Glu Thr Lys Pro Thr Pro Asp His Lys Ser Val Lys Ala

1820 1825 1830

Asp Thr Gly Asp Val Thr Ala Gly Lys Thr Gly Thr Val Thr Glu

1835 1840 1845

Pro Lys Asp Val Ala Gly Trp Lys Ser Arg Ser Ile Ile Lys Gln

1850 1855 1860

Gly Lys Leu Gly Lys Ala Glu Ile Ala Asp Gly Thr Leu Val Tyr

1865 1870 1875

Ala Ala Gly Asp Lys Thr Gly Asp Asp Ser Phe Val Val Gln Tyr

1880 1885 1890

Thr Met Ala Asp Gly Thr Val Ile Asp Val Thr Tyr Ser Val Thr

1895 1900 1905

Val Lys Ala Ala Glu Thr Gly Lys Asn Asp Gly Asp Gly Lys Gly

1910 1915 1920

Asp Gly Val Ala Lys Thr Gly Ala Ala Val Gly Ala Leu Ala Gly

1925 1930 1935

Leu Gly Leu Met Leu Leu Ala Val Gly Val Ser Val Val Met Ile

1940 1945 1950

Arg Arg Lys His Ser Ala

1955

<210> 3

<211> 4482

<212> ДНК

<213> Bifidobacterium bifidum

<400> 3

atgctacaca cagcatcaag aggatgctcg cgttcgtggc tgcgcagact caccgcattg 60

atagcggtct cggcgctcgc gttcgtggca ttgccgaacg tcgcggtggc ggcggatccg 120

atggaatacc tcgatgtgtc gttcggcggc acgttcgctg cagacaccta caccacaggt 180

ggcgacgagg tggcgaaggg ccccgtgacc aagcacggca gcataccgac caagcttgac 240

ggcggcggca tcaccctcgc tggcggcacc aacggcgtga cattcacctc gaccgcgagc 300

ttcagcgaga gtgggaaggt gaacaaggga ttccgcgccg aaatggagta ccgtacgacg 360

cagacgccca gcaacctcgc cacattgttc tccgccatgg gcaacatctt cgtgcgggcg 420

aacggcagca acctcgaata cggcttctcc acgaaccctt ccggcagtac atggaacgac 480

tacacaaagt ccgtgacgct gccttccaac aatgtgaagc acatcatcca gctgacatat 540

ctgccgggag ccgacggcgc tgcctcgacg ttgcagttgt cggtggatgg cgtggccggc 600

gagaccgcca cctccgcggc cggcgagctc gcggccgtca gcgattccgt cgggaacaag 660

ttcgggatcg gctacgaggt gaaccccgct tccggcgcgg cgagccgcgg tcttgccggt 720

gacgtgttcc gcgcgcgtgt cgccgattcg gacgccccgt gggagattct tgacgcatcc 780

cagctgctgc atgtcaattt caacggcacg ttcagcggca cctcatatac cgcggcgagc 840

ggcgagcaga tgctgggctc gctggtgtcg cgctcggcca atccgtccat ctcgaactcc 900

gccgtcacgc tgggcggcgg cacggccgga ttcgatttca cgcccacgga cttcaccctc 960

ggtgacaacg aggccatcac ccgcccgctg gtcgcggagc tgcgcttcac cccgacgcag 1020

accggcgaca accagaccct gttcggcgcg ggcggcaacc tgttcctgcg ctacgagtcg 1080

aacaagctcg tgttcggcgc ctccaccaag tccggcgata attggaccga ccacaagatc 1140

gagtccgcgg ccgccacggg tgcggagcac gtcgtgtcgg tggcgtacgt gcccaataag 1200

gccggcaccg gcgcgaagct tgtcatgcgc gtggatggcg gcgacgccca gaccaaggac 1260

atcactggtc tggcttacct gaattcgagc atcaagggca aggtcggctt cggcaacgac 1320

gtgcataccg acgcgctcag ccgcggcttc gtcggctcgc tgagcgagat ccgcctggcc 1380

gaaacctccg cgaacttcac caccaacgaa ttcaagctgg tctactctca ggtcagctgc 1440

gacacgtcgg gcatcaagga ggcgaatacc ttcgacgtgg agcccgccga gtgcgaggcc 1500

gcgcttaaga ccaagctgtc caagctgcgt ccgaccgaag ggcaggccga ctacatcgac 1560

tggggtcaga tcggattcct ccattacggc atcaacacgt actacaacca ggagtggggt 1620

cacggtaacg aggatccctc ccgcatcaac ccgaccggcc tcgacaccga ccagtgggcg 1680

aagtccttcg ccgacggtgg cttcaagatg atcatggtga cggtcaagca ccatgacggt 1740

ttcgagctgt acgactcgcg gtacaacacc gagcacgact gggcaaacac cgccgtcgcc 1800

aagcgcacgg gggagaagga cctgttccgc aagattgtcg cctcggcgaa gaaatacggc 1860

ctgaaggtcg gcatctacta ttcgccggcc gattcctaca tggagaggaa gggcgtctgg 1920

ggcaacaact ccgcacgcgt cgagcgcacg atccccacgc tggtggagaa cgacgaccgc 1980

gccggcaagg tggcttccgg caaactgccc acgttcaagt acaaggccac ggattacggc 2040

gcctacatgc tcaaccagct ctatgagctg ctgactgagt acggcgacat ctccgaggtc 2100

tggttcgacg gtgcccaagg caacaccgca ggcactgagc attacgacta tggcgtgttc 2160

tacgagatga tccgccggct tcagccccag gcaattcagg ccaacgccgc atacgatgcc 2220

cgatgggtgg gcaacgagga cggctgggcc cgtcagaccg agtggagccc gcaggcggca 2280

tacaacgacg gcgtggacaa ggtgtcgctc aagcctggcc agatggcccc cgacggtaag 2340

cttggcagca tgtcgagcgt gctgtccgag atccgcagcg gcgccgccaa ccagctgcac 2400

tggtatccgg ccgaagtcga cgccaagaac cggcccggat ggttctaccg tgccagccaa 2460

tcgccggcgt ccgtagccga agtcgtgaag tactacgagc agtccacggg acgcaactcg 2520

cagtatctgc tgaacgtccc accgtccgat accggcaagc tcgccgatgc ggatgccgcg 2580

ggacttaagg ggctgggcga ggagctcgcc cgacgctacg gcaccgatct tgccctgggc 2640

aagagcgcga ccgtcgccgc gtccgcgaac gacactgcgg tagcggcccc gaagctgacc 2700

gacggttcga agctctcctc cgacaaggcc gtgggcaata cgccgacgta caccatcgat 2760

ctgggcagca ctgtcgccgt ggatgcagtg aagatctccg aggacgtgcg caatgccggc 2820

cagcagatcg aaagcgccac tctgcaggga cgagtcaatg gaacatggac gaatctggcg 2880

actatgacga cggtcgggca gcagcgcgac cttcgcttca cgtcccagaa catcgatgcc 2940

atccgtctgg tggtcaactc ctcccgcggt ccggtgcgtc tgagccgtct tgaggtgttc 3000

cacaccgaat ccgagattca gaccggcgcc cgcgcctact acatcgatcc gacggcgcag 3060

accgcgggag atggattcac gaaggacaag cccatgacgt cgatcgagca gctgcacgat 3120

gtgaccgtcg cgccaggctc cgtgatcttc gtcaaggcgg gcaccgagct gaccggggac 3180

ttcgccgtct tcggctacgg caccaaggac gagcccatca ccgtgacgac atacggcgaa 3240

agcgacaaag ccaccaccgc gagcttcgac ggcatgaccg ccgggctgac gctgaagcag 3300

gcgctgaagg cgctcggcaa ggacgacgcc ggctgggtcg tggccgattc cgccactgca 3360

ccggcctccc gcgtgtatgt cccgcaggat gagatcagcg tgcacgccca gtcgtcgcag 3420

aactccggcg cagaggcggc gagggcgctc gacggcgact cgtcgacgag ctggcactcc 3480

cagtacagcc cgaccaccgc gtctgctccg cattgggtga ctctcgatct cggcaaatcg 3540

cgtgagaacg tcgcctactt cgactacctc gcccgtatcg acggcaacaa taacggtgcc 3600

gccaaggatt acgaggtgta tgtctccgac gatcccaacg attttggagc ccctgtggcc 3660

tcgggcacgt tgaagaacgt cgcctacacg cagcgcatca agctgacccc caagaacgga 3720

cggtacgtca agttcgtcat caagaccgat tattccggat cgaacttcgg ctccgcggcg 3780

gaaatgaatg tcgagttgct gcccacggcc gtagaggagg acaaggtcgc caccccgcag 3840

aagccgacag tggacgatga tgccgataca tacaccatcc ccgacatcga gggagtcgtg 3900

tacaaggtcg acggcaaggt gttggccgct ggttccgtag tgaacgtggg cgatgaggac 3960

gtgaccgtca cggtcaccgc cgagcccgcc gacggatacc gcttcccgga tggtgtgacg 4020

tccccagtca cgtatgagct gacgttcacc aagaagggtg gcgagaagcc tccgaccgaa 4080

gtcaacaagg acaagctgca cgccacgatc accaaggctc aggcgatcga ccgttccgcc 4140

tatacggacg agtcgctcaa ggtgcttgat gacaagctcg ccgcagcgct caaggtctat 4200

gacgatgaca aggtgagcca ggatgatgtc gatgccgccg aggcggctct gtctgcggcg 4260

atcgacgcgc tgaagaccaa gccgacgacc cccggcggtg aaggtgagaa gcctggtgaa 4320

ggtgaaaagc ccggtgacgg caacaagccc ggtgacggca agaagcccgg cgacgtgatc 4380

gcaaagaccg gcgcctccac aatgggcgtt gtcttcgctg cactcgcgat ggtagcgggt 4440

gcggtcgtga cgcttgaagc caagcgtaag tccaaccggt aa 4482

<210> 4

<211> 1493

<212> PRT

<213> Bifidobacterium bifidum

<400> 4

Met Leu His Thr Ala Ser Arg Gly Cys Ser Arg Ser Trp Leu Arg Arg

1 5 10 15

Leu Thr Ala Leu Ile Ala Val Ser Ala Leu Ala Phe Val Ala Leu Pro

20 25 30

Asn Val Ala Val Ala Ala Asp Pro Met Glu Tyr Leu Asp Val Ser Phe

35 40 45

Gly Gly Thr Phe Ala Ala Asp Thr Tyr Thr Thr Gly Gly Asp Glu Val

50 55 60

Ala Lys Gly Pro Val Thr Lys His Gly Ser Ile Pro Thr Lys Leu Asp

65 70 75 80

Gly Gly Gly Ile Thr Leu Ala Gly Gly Thr Asn Gly Val Thr Phe Thr

85 90 95

Ser Thr Ala Ser Phe Ser Glu Ser Gly Lys Val Asn Lys Gly Phe Arg

100 105 110

Ala Glu Met Glu Tyr Arg Thr Thr Gln Thr Pro Ser Asn Leu Ala Thr

115 120 125

Leu Phe Ser Ala Met Gly Asn Ile Phe Val Arg Ala Asn Gly Ser Asn

130 135 140

Leu Glu Tyr Gly Phe Ser Thr Asn Pro Ser Gly Ser Thr Trp Asn Asp

145 150 155 160

Tyr Thr Lys Ser Val Thr Leu Pro Ser Asn Asn Val Lys His Ile Ile

165 170 175

Gln Leu Thr Tyr Leu Pro Gly Ala Asp Gly Ala Ala Ser Thr Leu Gln

180 185 190

Leu Ser Val Asp Gly Val Ala Gly Glu Thr Ala Thr Ser Ala Ala Gly

195 200 205

Glu Leu Ala Ala Val Ser Asp Ser Val Gly Asn Lys Phe Gly Ile Gly

210 215 220

Tyr Glu Val Asn Pro Ala Ser Gly Ala Ala Ser Arg Gly Leu Ala Gly

225 230 235 240

Asp Val Phe Arg Ala Arg Val Ala Asp Ser Asp Ala Pro Trp Glu Ile

245 250 255

Leu Asp Ala Ser Gln Leu Leu His Val Asn Phe Asn Gly Thr Phe Ser

260 265 270

Gly Thr Ser Tyr Thr Ala Ala Ser Gly Glu Gln Met Leu Gly Ser Leu

275 280 285

Val Ser Arg Ser Ala Asn Pro Ser Ile Ser Asn Ser Ala Val Thr Leu

290 295 300

Gly Gly Gly Thr Ala Gly Phe Asp Phe Thr Pro Thr Asp Phe Thr Leu

305 310 315 320

Gly Asp Asn Glu Ala Ile Thr Arg Pro Leu Val Ala Glu Leu Arg Phe

325 330 335

Thr Pro Thr Gln Thr Gly Asp Asn Gln Thr Leu Phe Gly Ala Gly Gly

340 345 350

Asn Leu Phe Leu Arg Tyr Glu Ser Asn Lys Leu Val Phe Gly Ala Ser

355 360 365

Thr Lys Ser Gly Asp Asn Trp Thr Asp His Lys Ile Glu Ser Ala Ala

370 375 380

Ala Thr Gly Ala Glu His Val Val Ser Val Ala Tyr Val Pro Asn Lys

385 390 395 400

Ala Gly Thr Gly Ala Lys Leu Val Met Arg Val Asp Gly Gly Asp Ala

405 410 415

Gln Thr Lys Asp Ile Thr Gly Leu Ala Tyr Leu Asn Ser Ser Ile Lys

420 425 430

Gly Lys Val Gly Phe Gly Asn Asp Val His Thr Asp Ala Leu Ser Arg

435 440 445

Gly Phe Val Gly Ser Leu Ser Glu Ile Arg Leu Ala Glu Thr Ser Ala

450 455 460

Asn Phe Thr Thr Asn Glu Phe Lys Leu Val Tyr Ser Gln Val Ser Cys

465 470 475 480

Asp Thr Ser Gly Ile Lys Glu Ala Asn Thr Phe Asp Val Glu Pro Ala

485 490 495

Glu Cys Glu Ala Ala Leu Lys Thr Lys Leu Ser Lys Leu Arg Pro Thr

500 505 510

Glu Gly Gln Ala Asp Tyr Ile Asp Trp Gly Gln Ile Gly Phe Leu His

515 520 525

Tyr Gly Ile Asn Thr Tyr Tyr Asn Gln Glu Trp Gly His Gly Asn Glu

530 535 540

Asp Pro Ser Arg Ile Asn Pro Thr Gly Leu Asp Thr Asp Gln Trp Ala

545 550 555 560

Lys Ser Phe Ala Asp Gly Gly Phe Lys Met Ile Met Val Thr Val Lys

565 570 575

His His Asp Gly Phe Glu Leu Tyr Asp Ser Arg Tyr Asn Thr Glu His

580 585 590

Asp Trp Ala Asn Thr Ala Val Ala Lys Arg Thr Gly Glu Lys Asp Leu

595 600 605

Phe Arg Lys Ile Val Ala Ser Ala Lys Lys Tyr Gly Leu Lys Val Gly

610 615 620

Ile Tyr Tyr Ser Pro Ala Asp Ser Tyr Met Glu Arg Lys Gly Val Trp

625 630 635 640

Gly Asn Asn Ser Ala Arg Val Glu Arg Thr Ile Pro Thr Leu Val Glu

645 650 655

Asn Asp Asp Arg Ala Gly Lys Val Ala Ser Gly Lys Leu Pro Thr Phe

660 665 670

Lys Tyr Lys Ala Thr Asp Tyr Gly Ala Tyr Met Leu Asn Gln Leu Tyr

675 680 685

Glu Leu Leu Thr Glu Tyr Gly Asp Ile Ser Glu Val Trp Phe Asp Gly

690 695 700

Ala Gln Gly Asn Thr Ala Gly Thr Glu His Tyr Asp Tyr Gly Val Phe

705 710 715 720

Tyr Glu Met Ile Arg Arg Leu Gln Pro Gln Ala Ile Gln Ala Asn Ala

725 730 735

Ala Tyr Asp Ala Arg Trp Val Gly Asn Glu Asp Gly Trp Ala Arg Gln

740 745 750

Thr Glu Trp Ser Pro Gln Ala Ala Tyr Asn Asp Gly Val Asp Lys Val

755 760 765

Ser Leu Lys Pro Gly Gln Met Ala Pro Asp Gly Lys Leu Gly Ser Met

770 775 780

Ser Ser Val Leu Ser Glu Ile Arg Ser Gly Ala Ala Asn Gln Leu His

785 790 795 800

Trp Tyr Pro Ala Glu Val Asp Ala Lys Asn Arg Pro Gly Trp Phe Tyr

805 810 815

Arg Ala Ser Gln Ser Pro Ala Ser Val Ala Glu Val Val Lys Tyr Tyr

820 825 830

Glu Gln Ser Thr Gly Arg Asn Ser Gln Tyr Leu Leu Asn Val Pro Pro

835 840 845

Ser Asp Thr Gly Lys Leu Ala Asp Ala Asp Ala Ala Gly Leu Lys Gly

850 855 860

Leu Gly Glu Glu Leu Ala Arg Arg Tyr Gly Thr Asp Leu Ala Leu Gly

865 870 875 880

Lys Ser Ala Thr Val Ala Ala Ser Ala Asn Asp Thr Ala Val Ala Ala

885 890 895

Pro Lys Leu Thr Asp Gly Ser Lys Leu Ser Ser Asp Lys Ala Val Gly

900 905 910

Asn Thr Pro Thr Tyr Thr Ile Asp Leu Gly Ser Thr Val Ala Val Asp

915 920 925

Ala Val Lys Ile Ser Glu Asp Val Arg Asn Ala Gly Gln Gln Ile Glu

930 935 940

Ser Ala Thr Leu Gln Gly Arg Val Asn Gly Thr Trp Thr Asn Leu Ala

945 950 955 960

Thr Met Thr Thr Val Gly Gln Gln Arg Asp Leu Arg Phe Thr Ser Gln

965 970 975

Asn Ile Asp Ala Ile Arg Leu Val Val Asn Ser Ser Arg Gly Pro Val

980 985 990

Arg Leu Ser Arg Leu Glu Val Phe His Thr Glu Ser Glu Ile Gln Thr

995 1000 1005

Gly Ala Arg Ala Tyr Tyr Ile Asp Pro Thr Ala Gln Thr Ala Gly

1010 1015 1020

Asp Gly Phe Thr Lys Asp Lys Pro Met Thr Ser Ile Glu Gln Leu

1025 1030 1035

His Asp Val Thr Val Ala Pro Gly Ser Val Ile Phe Val Lys Ala

1040 1045 1050

Gly Thr Glu Leu Thr Gly Asp Phe Ala Val Phe Gly Tyr Gly Thr

1055 1060 1065

Lys Asp Glu Pro Ile Thr Val Thr Thr Tyr Gly Glu Ser Asp Lys

1070 1075 1080

Ala Thr Thr Ala Ser Phe Asp Gly Met Thr Ala Gly Leu Thr Leu

1085 1090 1095

Lys Gln Ala Leu Lys Ala Leu Gly Lys Asp Asp Ala Gly Trp Val

1100 1105 1110

Val Ala Asp Ser Ala Thr Ala Pro Ala Ser Arg Val Tyr Val Pro

1115 1120 1125

Gln Asp Glu Ile Ser Val His Ala Gln Ser Ser Gln Asn Ser Gly

1130 1135 1140

Ala Glu Ala Ala Arg Ala Leu Asp Gly Asp Ser Ser Thr Ser Trp

1145 1150 1155

His Ser Gln Tyr Ser Pro Thr Thr Ala Ser Ala Pro His Trp Val

1160 1165 1170

Thr Leu Asp Leu Gly Lys Ser Arg Glu Asn Val Ala Tyr Phe Asp

1175 1180 1185

Tyr Leu Ala Arg Ile Asp Gly Asn Asn Asn Gly Ala Ala Lys Asp

1190 1195 1200

Tyr Glu Val Tyr Val Ser Asp Asp Pro Asn Asp Phe Gly Ala Pro

1205 1210 1215

Val Ala Ser Gly Thr Leu Lys Asn Val Ala Tyr Thr Gln Arg Ile

1220 1225 1230

Lys Leu Thr Pro Lys Asn Gly Arg Tyr Val Lys Phe Val Ile Lys

1235 1240 1245

Thr Asp Tyr Ser Gly Ser Asn Phe Gly Ser Ala Ala Glu Met Asn

1250 1255 1260

Val Glu Leu Leu Pro Thr Ala Val Glu Glu Asp Lys Val Ala Thr

1265 1270 1275

Pro Gln Lys Pro Thr Val Asp Asp Asp Ala Asp Thr Tyr Thr Ile

1280 1285 1290

Pro Asp Ile Glu Gly Val Val Tyr Lys Val Asp Gly Lys Val Leu

1295 1300 1305

Ala Ala Gly Ser Val Val Asn Val Gly Asp Glu Asp Val Thr Val

1310 1315 1320

Thr Val Thr Ala Glu Pro Ala Asp Gly Tyr Arg Phe Pro Asp Gly

1325 1330 1335

Val Thr Ser Pro Val Thr Tyr Glu Leu Thr Phe Thr Lys Lys Gly

1340 1345 1350

Gly Glu Lys Pro Pro Thr Glu Val Asn Lys Asp Lys Leu His Ala

1355 1360 1365

Thr Ile Thr Lys Ala Gln Ala Ile Asp Arg Ser Ala Tyr Thr Asp

1370 1375 1380

Glu Ser Leu Lys Val Leu Asp Asp Lys Leu Ala Ala Ala Leu Lys

1385 1390 1395

Val Tyr Asp Asp Asp Lys Val Ser Gln Asp Asp Val Asp Ala Ala

1400 1405 1410

Glu Ala Ala Leu Ser Ala Ala Ile Asp Ala Leu Lys Thr Lys Pro

1415 1420 1425

Thr Thr Pro Gly Gly Glu Gly Glu Lys Pro Gly Glu Gly Glu Lys

1430 1435 1440

Pro Gly Asp Gly Asn Lys Pro Gly Asp Gly Lys Lys Pro Gly Asp

1445 1450 1455

Val Ile Ala Lys Thr Gly Ala Ser Thr Met Gly Val Val Phe Ala

1460 1465 1470

Ala Leu Ala Met Val Ala Gly Ala Val Val Thr Leu Glu Ala Lys

1475 1480 1485

Arg Lys Ser Asn Arg

1490

<210> 5

<211> 2094

<212> ДНК

<213> Streptococcus pneumoniae

<400> 5

atgaataaaa gaggtcttta ttcaaaacta ggaatttctg ttgtaggcat tagtctttta 60

atgggagtcc ccactttgat tcatgcgaat gaattaaact atggtcaact gtccatatct 120

cctatttttc aaggaggttc atatcaactg aacaataaga gtatagatat cagctctttg 180

ttattagata aattgtctgg agagagtcag acagtagtaa tgaaatttaa agcagataaa 240

ccaaactctc ttcaagcttt gtttggccta tctaatagta aagcaggctt taaaaataat 300

tacttttcaa ttttcatgag agattctggt gagataggtg tagaaataag agacgcccaa 360

gagggaataa attatttatt ttctagacca gcttcattat ggggaaagca taaaggacag 420

gcagttgaaa atacactagt atttgtatct gattctaaag ataaaacata cacaatgtat 480

gttaatggaa tagaagtgtt ctctgaaaca gttgatacat ttttgccaat ttcaaatata 540

aatggtatag ataaggcaac actaggagct gttaatcgtg aaggtaagga acattacctc 600

gcaaaaggaa gtattggtga aatcagtcta tttaacaaag caattagtga tcaggaagtt 660

tcaaatattc ccttgtcaaa tccatttcag ttaattttcc aatcaggaga ttctactcaa 720

gctaactatt ttagaatacc gacactatat acattaagta gtggaagagt tctatcaagt 780

attgatgcac gttatggtgg gactcatgat tctaaaagta agattaatat tgccacttct 840

tatagtgatg ataatgggaa aacgtggagt gagccaattt ttgctatgaa gtttaatgac 900

tatgaggagc agttagttta ctggccacga gataataaat taaagaatag tcaaattagt 960

ggaagtgctt cattcataga ttcatccatt gttgaagata aaaaatctgg gaaaacgata 1020

ttactagctg atgttatgcc tgcgggtatt ggaaataata atgcaaataa agccgactca 1080

ggttttaaag aaataaatgg tcattattat ttaaaactaa agaagaatgg agataacgat 1140

ttccgttata cagttagaga aaatggtgtc gtttatgatg aaacaactaa taaacctaca 1200

aattatacta taaatgataa gtatgaagtt ttggagggag gaaagtcttt aacagtcgaa 1260

caatattcgg ttgattttga tagtggctct ttaagagaaa ggcataatgg aaaacaggtt 1320

cctatgaatg ttttctacaa agattcgtta tttaaagtga ctcctactaa ttatatagca 1380

atgacaacta gtcagaatag aggagagagt tgggaacaat ttaagttgtt gcctccgttc 1440

ttaggagaaa aacataatgg aacttacttg tgtcctggac aaggtttagc attaaaatca 1500

agtaacagat tgatttttgc aacatatact agtggagaac taacctatct catttcggat 1560

gatagtggtc aaacatggaa gaaatcctca gcttcaattc cgtttaaaaa tgcaacagca 1620

gaagcacaaa tggttgaact gagagatggt gtgattagaa cattctttag aaccactaca 1680

ggtaagatag cttatatgac tagtagagat tctggagaaa catggtcgaa agtttcgtat 1740

attgatggaa ttcaacaaac ttcatatggc acacaagtat ctgcaattaa atactctcaa 1800

ttaattgatg gaaaagaagc agtcattttg agtacaccaa attctagaag tggccgtaag 1860

ggaggccaat tagttgtcgg tttggtcaat aaagaagatg atagtattga ttggagatac 1920

cactatgata ttgatttgcc ttcgtatggt tatgcctatt ctgcgattac agaattgcca 1980

aatcatcaca taggtgtact gtttgaaaaa tatgattcgt ggtcgagaaa tgaattgcat 2040

ttaagcaatg tagttcagta tatagatttg gaaattaatg atttaacaaa ataa 2094

<210> 6

<211> 697

<212> ПРТ

<213> Streptococcus pneumoniae

<400> 6

Met Asn Lys Arg Gly Leu Tyr Ser Lys Leu Gly Ile Ser Val Val Gly

1 5 10 15

Ile Ser Leu Leu Met Gly Val Pro Thr Leu Ile His Ala Asn Glu Leu

20 25 30

Asn Tyr Gly Gln Leu Ser Ile Ser Pro Ile Phe Gln Gly Gly Ser Tyr

35 40 45

Gln Leu Asn Asn Lys Ser Ile Asp Ile Ser Ser Leu Leu Leu Asp Lys

50 55 60

Leu Ser Gly Glu Ser Gln Thr Val Val Met Lys Phe Lys Ala Asp Lys

65 70 75 80

Pro Asn Ser Leu Gln Ala Leu Phe Gly Leu Ser Asn Ser Lys Ala Gly

85 90 95

Phe Lys Asn Asn Tyr Phe Ser Ile Phe Met Arg Asp Ser Gly Glu Ile

100 105 110

Gly Val Glu Ile Arg Asp Ala Gln Lys Gly Ile Asn Tyr Leu Phe Ser

115 120 125

Arg Pro Ala Ser Leu Trp Gly Lys His Lys Gly Gln Ala Val Glu Asn

130 135 140

Thr Leu Val Phe Val Ser Asp Ser Lys Asp Lys Thr Tyr Thr Met Tyr

145 150 155 160

Val Asn Gly Ile Glu Val Phe Ser Glu Thr Val Asp Thr Phe Leu Pro

165 170 175

Ile Ser Asn Ile Asn Gly Ile Asp Lys Ala Thr Leu Gly Ala Val Asn

180 185 190

Arg Glu Gly Lys Glu His Tyr Leu Ala Lys Gly Ser Ile Asp Glu Ile

195 200 205

Ser Leu Phe Asn Lys Ala Ile Ser Asp Gln Glu Val Ser Thr Ile Pro

210 215 220

Leu Ser Asn Pro Phe Gln Leu Ile Phe Gln Ser Gly Asp Ser Thr Gln

225 230 235 240

Ala Asn Tyr Phe Arg Ile Pro Thr Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Gly Arg

245 250 255

Val Leu Ser Ser Ile Asp Ala Arg Tyr Gly Gly Thr His Asp Ser Lys

260 265 270

Ser Lys Ile Asn Ile Ala Thr Ser Tyr Ser Asp Asp Asn Gly Lys Thr

275 280 285

Trp Ser Glu Pro Ile Phe Ala Met Lys Phe Asn Asp Tyr Glu Glu Gln

290 295 300

Leu Val Tyr Trp Pro Arg Asp Asn Lys Leu Lys Asn Ser Gln Ile Ser

305 310 315 320

Gly Ser Ala Ser Phe Ile Asp Ser Ser Ile Val Glu Asp Lys Lys Ser

325 330 335

Gly Lys Thr Ile Leu Leu Ala Asp Val Met Pro Ala Gly Ile Gly Asn

340 345 350

Asn Asn Ala Asn Lys Ala Asp Ser Gly Phe Lys Glu Ile Asn Gly His

355 360 365

Tyr Tyr Leu Lys Leu Lys Lys Asn Gly Asp Asn Asp Phe Arg Tyr Thr

370 375 380

Val Arg Glu Asn Gly Val Val Tyr Asn Glu Thr Thr Asn Lys Pro Thr

385 390 395 400

Asn Tyr Thr Ile Asn Asp Lys Tyr Glu Val Leu Glu Gly Gly Lys Ser

405 410 415

Leu Thr Val Glu Gln Tyr Ser Val Asp Phe Asp Ser Gly Ser Leu Arg

420 425 430

Glu Arg His Asn Gly Lys Gln Val Pro Met Asn Val Phe Tyr Lys Asp

435 440 445

Ser Leu Phe Lys Val Thr Pro Thr Asn Tyr Ile Ala Met Thr Thr Ser

450 455 460

Gln Asn Arg Gly Glu Ser Trp Glu Gln Phe Lys Leu Leu Pro Pro Phe

465 470 475 480

Leu Gly Glu Lys His Asn Gly Thr Tyr Leu Cys Pro Gly Gln Gly Leu

485 490 495

Ala Leu Lys Ser Ser Asn Arg Leu Ile Phe Ala Thr Tyr Thr Ser Gly

500 505 510

Glu Leu Thr Tyr Leu Ile Ser Asp Asp Ser Gly Gln Thr Trp Lys Lys

515 520 525

Ser Ser Ala Ser Ile Pro Phe Lys Asn Ala Thr Ala Glu Ala Gln Met

530 535 540

Val Glu Leu Arg Asp Gly Val Ile Arg Thr Phe Phe Arg Thr Thr Thr

545 550 555 560

Gly Lys Ile Ala Tyr Met Thr Ser Arg Asp Ser Gly Glu Thr Trp Ser

565 570 575

Lys Val Ser Tyr Ile Asp Gly Ile Gln Gln Thr Ser Tyr Gly Thr Gln

580 585 590

Val Ser Ala Ile Lys Tyr Ser Gln Leu Ile Asp Gly Lys Glu Ala Val

595 600 605

Ile Leu Ser Thr Pro Asn Ser Arg Ser Gly Arg Lys Gly Gly Gln Leu

610 615 620

Val Val Gly Leu Val Asn Lys Glu Asp Asp Ser Ile Asp Trp Lys Tyr

625 630 635 640

His Tyr Asp Ile Asp Leu Pro Ser Tyr Gly Tyr Ala Tyr Ser Ala Ile

645 650 655

Thr Glu Leu Pro Asn His His Ile Gly Val Leu Phe Glu Lys Tyr Asp

660 665 670

Ser Trp Ser Arg Asn Glu Leu His Leu Ser Asn Val Val Gln Tyr Ile

675 680 685

Asp Leu Glu Ile Asn Asp Leu Thr Lys

690 695

<210> 7

<211> 2076

<212> ДНК

<213> Bifidobacterium longum

<400> 7

atggaacata gagcgttcaa gtggccgcag ccacttgcgg gcaacaagcc ccgcatctgg 60

tacggcggcg attacaaccc cgaccaatgg cctgaggaag tgtgggacga agatgtagcc 120

ctcatgcagc aggccggcgt caacctcgtc tccgtagcca tcttctcctg ggccaagctt 180

gagcccgaag aaggcgtgta cgacttcgat tggctcgacc gcgtcatcga caagctcggc 240

aaggccggca tcgccgtcga tctcgcctcc ggcaccgcat ccccgccgat gtggatgacc 300

caggcccacc cggagatcct ctgggtcgac taccgcggcg acgtctgcca gcccggtgcc 360

cgccagcact ggcgcgccac cagcccggtc ttccttgact acgcgctcaa cctgtgccgc 420

aagatggccg agcactacaa ggacaacccc tatgtggtct cttggcatgt gagcaacgag 480

tacggctgcc acaaccgctt cgactattcc gaagacgccg agcgcgcctt ccagaagtgg 540

tgcgagaaga agtacggcac catcgacgct gtcaacgacg cctggggcac cgccttctgg 600

gcgcagcgca tgaacaattt ctccgagatc atcccgccgc gattcatcgg cgacggcaac 660

ttcatgaacc cgggcaagct gcttgattgg aagcgtttca gctccgacgc gctgctggac 720

ttctacaagg ccgagcgcga cgccctgctc gagatcgccc ccaagccgca gaccaccaac 780

ttcatggtct ccgcgggctg caccgtcctc gactacgaca agtggggtca tgacgtggac 840

ttcgtgtcca acgaccatta cttctcgccc ggcgaggccc acttcgacga gatggcctac 900

gcggcctgcc tcaccgacgg catcgcccgc aagaacccgt ggttcctcat ggaacattcc 960

acgtccgccg tcaactggcg cccgaccaac taccggctcg agcccggcga gctggtgcgc 1020

gactccctgg cccatctggc catgggcgcc gacgccatct gctacttcca gtggcgtcag 1080

tccaaggccg gcgccgagaa gtggcattcc gccatggtgc cccacgcagg ccccgactcc 1140

cagatcttcc gcgatgtgtg cgagctgggt gccgacctca acaagcttgc tgacgagggc 1200

ctgctgagca ccaagctggt caagtccaag gtcgccatcg tcttcgacta cgagtcccag 1260

tgggccaccg agcacaccgc cacccccacg caggaggtgc gccactggac cgagccgctg 1320

gactggttcc gcgcgctggc ggacaatggc ctgaccgccg acgtggtgcc ggtccgcggt 1380

ccttgggatg agtacgaggc cgtcgtgttg ccgagcctgg ccatcctgtc cgagcagacc 1440

acgcgccgcg tgcgcgagta tgtggcgaac ggcggcaagc tgttcgtgac ctactacacc 1500

ggtctggtgg acgacaggga tcacgtctgg ctgggcggct accccggctc cattcgcgac 1560

gtggtgggcg tgcgcgtcga ggaattcgcc ccgatgggca ccgacgcccc cggcaccatg 1620

gaccaccttg acttggacaa cggaaccgtg gcgcacgatt tcgccgacgt gatcacctcc 1680

gtggccgata ccgctcacgt ggtcgcctcc ttcaaggcag ataagtggac cggtttcgac 1740

ggcgctcccg ccatcaccgt caacgacttc ggcgacggca aggccgcata cgtcggtgcc 1800

cgtctcgggc gtgagggctt ggccaagagc ctgcccgcgc tgctggagga actcggcatc 1860

gagacttcgg ctgaggacga tcgtggtgaa gtgctgcgcg tcgagcgtgc ggacgaaact 1920

ggcgagaacc acttcgtgtt cctgttcaac cgcacccacg atgttgcggt cgtggacgtg 1980

gaaggcgaac cgctggtcgc ctcgctggcc caggtcaacg agtccgagca cacggccgcc 2040

atccagccca acggcgtact cgtcgtcaag ctgtaa 2076

<210> 8

<211> 691

<212> ПРТ

<213> Bifidobacterium longum

<400> 8

Met Glu His Arg Ala Phe Lys Trp Pro Gln Pro Leu Ala Gly Asn Lys

1 5 10 15

Pro Arg Ile Trp Tyr Gly Gly Asp Tyr Asn Pro Asp Gln Trp Pro Glu

20 25 30

Glu Val Trp Asp Glu Asp Val Ala Leu Met Gln Gln Ala Gly Val Asn

35 40 45

Leu Val Ser Val Ala Ile Phe Ser Trp Ala Lys Leu Glu Pro Glu Glu

50 55 60

Gly Val Tyr Asp Phe Asp Trp Leu Asp Arg Val Ile Asp Lys Leu Gly

65 70 75 80

Lys Ala Gly Ile Ala Val Asp Leu Ala Ser Gly Thr Ala Ser Pro Pro

85 90 95

Met Trp Met Thr Gln Ala His Pro Glu Ile Leu Trp Val Asp Tyr Arg

100 105 110

Gly Asp Val Cys Gln Pro Gly Ala Arg Gln His Trp Arg Ala Thr Ser

115 120 125

Pro Val Phe Leu Asp Tyr Ala Leu Asn Leu Cys Arg Lys Met Ala Glu

130 135 140

His Tyr Lys Asp Asn Pro Tyr Val Val Ser Trp His Val Ser Asn Glu

145 150 155 160

Tyr Gly Cys His Asn Arg Phe Asp Tyr Ser Glu Asp Ala Glu Arg Ala

165 170 175

Phe Gln Lys Trp Cys Glu Lys Lys Tyr Gly Thr Ile Asp Ala Val Asn

180 185 190

Asp Ala Trp Gly Thr Ala Phe Trp Ala Gln Arg Met Asn Asn Phe Ser

195 200 205

Glu Ile Ile Pro Pro Arg Phe Ile Gly Asp Gly Asn Phe Met Asn Pro

210 215 220

Gly Lys Leu Leu Asp Trp Lys Arg Phe Ser Ser Asp Ala Leu Leu Asp

225 230 235 240

Phe Tyr Lys Ala Glu Arg Asp Ala Leu Leu Glu Ile Ala Pro Lys Pro

245 250 255

Gln Thr Thr Asn Phe Met Val Ser Ala Gly Cys Thr Val Leu Asp Tyr

260 265 270

Asp Lys Trp Gly His Asp Val Asp Phe Val Ser Asn Asp His Tyr Phe

275 280 285

Ser Pro Gly Glu Ala His Phe Asp Glu Met Ala Tyr Ala Ala Cys Leu

290 295 300

Thr Asp Gly Ile Ala Arg Lys Asn Pro Trp Phe Leu Met Glu His Ser

305 310 315 320

Thr Ser Ala Val Asn Trp Arg Pro Thr Asn Tyr Arg Leu Glu Pro Gly

325 330 335

Glu Leu Val Arg Asp Ser Leu Ala His Leu Ala Met Gly Ala Asp Ala

340 345 350

Ile Cys Tyr Phe Gln Trp Arg Gln Ser Lys Ala Gly Ala Glu Lys Trp

355 360 365

His Ser Ala Met Val Pro His Ala Gly Pro Asp Ser Gln Ile Phe Arg

370 375 380

Asp Val Cys Glu Leu Gly Ala Asp Leu Asn Lys Leu Ala Asp Glu Gly

385 390 395 400

Leu Leu Ser Thr Lys Leu Val Lys Ser Lys Val Ala Ile Val Phe Asp

405 410 415

Tyr Glu Ser Gln Trp Ala Thr Glu His Thr Ala Thr Pro Thr Gln Glu

420 425 430

Val Arg His Trp Thr Glu Pro Leu Asp Trp Phe Arg Ala Leu Ala Asp

435 440 445

Asn Gly Leu Thr Ala Asp Val Val Pro Val Arg Gly Pro Trp Asp Glu

450 455 460

Tyr Glu Ala Val Val Leu Pro Ser Leu Ala Ile Leu Ser Glu Gln Thr

465 470 475 480

Thr Arg Arg Val Arg Glu Tyr Val Ala Asn Gly Gly Lys Leu Phe Val

485 490 495

Thr Tyr Tyr Thr Gly Leu Val Asp Asp Arg Asp His Val Trp Leu Gly

500 505 510

Gly Tyr Pro Gly Ser Ile Arg Asp Val Val Gly Val Arg Val Glu Glu

515 520 525

Phe Ala Pro Met Gly Thr Asp Ala Pro Gly Thr Met Asp His Leu Asp

530 535 540

Leu Asp Asn Gly Thr Val Ala His Asp Phe Ala Asp Val Ile Thr Ser

545 550 555 560

Val Ala Asp Thr Ala His Val Val Ala Ser Phe Lys Ala Asp Lys Trp

565 570 575

Thr Gly Phe Asp Gly Ala Pro Ala Ile Thr Val Asn Asp Phe Gly Asp

580 585 590

Gly Lys Ala Ala Tyr Val Gly Ala Arg Leu Gly Arg Glu Gly Leu Ala

595 600 605

Lys Ser Leu Pro Ala Leu Leu Glu Glu Leu Gly Ile Glu Thr Ser Ala

610 615 620

Glu Asp Asp Arg Gly Glu Val Leu Arg Val Glu Arg Ala Asp Glu Thr

625 630 635 640

Gly Glu Asn His Phe Val Phe Leu Phe Asn Arg Thr His Asp Val Ala

645 650 655

Val Val Asp Val Glu Gly Glu Pro Leu Val Ala Ser Leu Ala Gln Val

660 665 670

Asn Glu Ser Glu His Thr Ala Ala Ile Gln Pro Asn Gly Val Leu Val

675 680 685

Val Lys Leu

690

<210> 9

<211> 1626

<212> ДНК

<213> Clostridium thermocellum

<400> 9

atggcagaag gggttatagt caacggaact cagtttaaag acacatcggg aaatgtgata 60

catgcccatg ggggaggcat gttaaagcat ggtgactatt attactggta cggtgaatac 120

cgggacgact ccaacttgtt tttgggtgta agttgctaca ggtcaaaaga tcttgtaaac 180

tgggaataca gaggagaagt gctgagccga aattccgctc ctgaactgaa tcactgcaat 240

attgaaagac cgaaagtcat gtacaacgca tcaaccggtg aatttgtcat gtggatgcac 300

tgggagaacg gcataaacta cggtcaggca agagcagctg ttgcgtattc caaaacgccc 360

gacggcaaat tcacatacat tcgaagcttt cgtcccatgc aggataccgg cgttatggat 420

catggccttc cgggatatat gtcaagggac tgcaatgtat ttgtggacac tgacggcaag 480

ggatatttta tatccgcagc caatgagaac atggacctgc acctttatga gctgacacct 540

gactataaaa atattgcatc ccttaaggca aagctgtttg tcggacagca gagggaagca 600

ccatgcctta taaagagaaa cggctactat taccttatta cttccggttg tacaggttgg 660

aacccgaatc aggctaaata cgcatattcc aaagatttgg ccagtggctg gtcccagctt 720

tacaatcttg gtaattcaac cacctacagg tcacagccga cttttatcat tcccgttcag 780

ggaagctcgg gaaccagtta tctttatatg ggtgaccgtt gggccggtgc ctggggagga 840

aaggttaatg actcccaata tgtatggctt cccttaaact tcatatccga tacaacactt 900

gaactgccct attatgactc tgtaaagatt gatgcttctt caggaataat ttccgagtac 960

ataccggaca ctacacgcta caagctggta aacaaaaaca gcggaaaagt cctggatgtt 1020

cttgacggtt ctgtcgataa tgcagcccag atagtccaat ggaccgataa cgggtctttg 1080

agtcaacagt ggtaccttgt ggacgtgggc ggtggttata aaaagattgt aaatgtaaag 1140

agcggaagag ccttggatgt aaaagacgaa tccaaggaag acggtggagt attaatacaa 1200

tataccagca acggcggata taatcagcac tggaaattca cagacatagg tgacgggtat 1260

tacaagattt ccagccgcca ctgcggaaaa cttatagatg tgcgaaaatg gtcaacggaa 1320

gacggcggaa taattcagca gtggtccgat gccggaggaa caaatcagca ttggaagctg 1380

gtgcttgtat caagtcccga gccttcacca tcaccttctc cccaagtggt taaaggagat 1440

gtaaacggcg acttgaaagt aaattcaacg gatttttcca tgttaagaag atatttactt 1500

aaaaccattg acaattttcc gacagaaaac ggaaaacagg ctgccgattt gaacggagac 1560

ggcagaataa actcttcgga tcttacaatg ctgaaaagat acttgcttat ggaagtggat 1620

ttgtaa 1626

<210> 10

<211> 541

<212> ПРТ

<213> Clostridium thermocellum

<400> 10

Met Ala Glu Gly Val Ile Val Asn Gly Thr Gln Phe Lys Asp Thr Ser

1 5 10 15

Gly Asn Val Ile His Ala His Gly Gly Gly Met Leu Lys His Gly Asp

20 25 30

Tyr Tyr Tyr Trp Tyr Gly Glu Tyr Arg Asp Asp Ser Asn Leu Phe Leu

35 40 45

Gly Val Ser Cys Tyr Arg Ser Lys Asp Leu Val Asn Trp Glu Tyr Arg

50 55 60

Gly Glu Val Leu Ser Arg Asn Ser Ala Pro Glu Leu Asn His Cys Asn

65 70 75 80

Ile Glu Arg Pro Lys Val Met Tyr Asn Ala Ser Thr Gly Glu Phe Val

85 90 95

Met Trp Met His Trp Glu Asn Gly Ile Asn Tyr Gly Gln Ala Arg Ala

100 105 110

Ala Val Ala Tyr Ser Lys Thr Pro Asp Gly Lys Phe Thr Tyr Ile Arg

115 120 125

Ser Phe Arg Pro Met Gln Asp Thr Gly Val Met Asp His Gly Leu Pro

130 135 140

Gly Tyr Met Ser Arg Asp Cys Asn Val Phe Val Asp Thr Asp Gly Lys

145 150 155 160

Gly Tyr Phe Ile Ser Ala Ala Asn Glu Asn Met Asp Leu His Leu Tyr

165 170 175

Glu Leu Thr Pro Asp Tyr Lys Asn Ile Ala Ser Leu Lys Ala Lys Leu

180 185 190

Phe Val Gly Gln Gln Arg Glu Ala Pro Cys Leu Ile Lys Arg Asn Gly

195 200 205

Tyr Tyr Tyr Leu Ile Thr Ser Gly Cys Thr Gly Trp Asn Pro Asn Gln

210 215 220

Ala Lys Tyr Ala Tyr Ser Lys Asp Leu Ala Ser Gly Trp Ser Gln Leu

225 230 235 240

Tyr Asn Leu Gly Asn Ser Thr Thr Tyr Arg Ser Gln Pro Thr Phe Ile

245 250 255

Ile Pro Val Gln Gly Ser Ser Gly Thr Ser Tyr Leu Tyr Met Gly Asp

260 265 270

Arg Trp Ala Gly Ala Trp Gly Gly Lys Val Asn Asp Ser Gln Tyr Val

275 280 285

Trp Leu Pro Leu Asn Phe Ile Ser Asp Thr Thr Leu Glu Leu Pro Tyr

290 295 300

Tyr Asp Ser Val Lys Ile Asp Ala Ser Ser Gly Ile Ile Ser Glu Tyr

305 310 315 320

Ile Pro Asp Thr Thr Arg Tyr Lys Leu Val Asn Lys Asn Ser Gly Lys

325 330 335

Val Leu Asp Val Leu Asp Gly Ser Val Asp Asn Ala Ala Gln Ile Val

340 345 350

Gln Trp Thr Asp Asn Gly Ser Leu Ser Gln Gln Trp Tyr Leu Val Asp

355 360 365

Val Gly Gly Gly Tyr Lys Lys Ile Val Asn Val Lys Ser Gly Arg Ala

370 375 380

Leu Asp Val Lys Asp Glu Ser Lys Glu Asp Gly Gly Val Leu Ile Gln

385 390 395 400

Tyr Thr Ser Asn Gly Gly Tyr Asn Gln His Trp Lys Phe Thr Asp Ile

405 410 415

Gly Asp Gly Tyr Tyr Lys Ile Ser Ser Arg His Cys Gly Lys Leu Ile

420 425 430

Asp Val Arg Lys Trp Ser Thr Glu Asp Gly Gly Ile Ile Gln Gln Trp

435 440 445

Ser Asp Ala Gly Gly Thr Asn Gln His Trp Lys Leu Val Leu Val Ser

450 455 460

Ser Pro Glu Pro Ser Pro Ser Pro Ser Pro Gln Val Val Lys Gly Asp

465 470 475 480

Val Asn Gly Asp Leu Lys Val Asn Ser Thr Asp Phe Ser Met Leu Arg

485 490 495

Arg Tyr Leu Leu Lys Thr Ile Asp Asn Phe Pro Thr Glu Asn Gly Lys

500 505 510

Gln Ala Ala Asp Leu Asn Gly Asp Gly Arg Ile Asn Ser Ser Asp Leu

515 520 525

Thr Met Leu Lys Arg Tyr Leu Leu Met Glu Val Asp Leu

530 535 540

<210> 11

<211> 2631

<212> ДНК

<213> Paenibacillus sp.

<400> 11

atgaatcgac acgtcctgct tcatccgtat ctccaccgga aggcgttgcc tctgctcctg 60

gccttgacgc tgctgacggg catcgccctg ttcccggcct ccaccgcgca ggcggcgacg 120

accgtgacgt cgatgacgta cttctctgcc aatgacggtc ccgtcatctc caaatccggc 180

gtcgggcaag ccagctacgg tttcgtcatg ccgatcttca acggaggcgc tgcgacctgg 240

aacgatgtcg ccgatgacgt cggcgttcgc gtcaaggtcg gcggcagctg ggtcgacatt 300

gacagcgttg gcggctatgt gtacaaccag aactggggcc attggaacga cagcggcacc 360

tatggctact ggttcaccct ctccgccacg accgagctgc agctctactc caaggcgaac 420

agcagcgtca cactcaacta cacgctcgtc ttccagaatg tcaatgaaac gaccattacc 480

tcgatgacac cgacccaggg cccgcaattg accgcagggt ataccggcgg cgcaggcttc 540

acctatccgg tcttcaacaa cgatccctcc atcccgtatg cagccgtagc cggcgatctg 600

aaggtgtacg tcaagccagt cgccagcagt acctggatcg atatcgacaa caacgcggcg 660

agcggctgga tctacgacag caacttcggc cagttcaccg aaggcggcgg cggctactgg 720

ttcaccgtca ccgagtcgat caacgtcaag ctcgagtcca ggacgtcctc ggccaacgtc 780

gtctatacga tcaacttccc gcagccgacg cgcagcagct acacactctc cgcctatgac 840

ggcacgacct acagcgccga tgcgagcggc gcgatcggta tcccgctgcc gcggatcgac 900

ggcaccccgg cgatcggcag cgagctcggc aacttcgtct accagatcta ccggaacggc 960

cagtgggtcg agatgagcaa ctcggcgcag agcagcttcg tctactcggc caatggctac 1020

aacaacatgt ccgacgccaa tcaatggggc tactgggccg actacatcta cggcctctgg 1080

ttccggccga tccaggagga tatgcagatc cgcatcggct atccgctgaa tggccagtcc 1140

ggcggcagcg tcggcagcaa cttcgtcacc tatacgctga tcggcaaccc gaacgcgccg 1200

cgacccgatg tgagcgacca gggcgacgtc gagatcggca cgcccaccga tccggccatc 1260

gcaggatgga atctgtattg gcaggatgaa ttcgccggca gcgcgctcga tctgaacaag 1320

tggaactacg agaccggcta ctacatcggc aacgacccca atctgtgggg ctggggcaac 1380

gccgagatgc agcactatac gacgagcacg caaaatgtct tcgtcgctga cggcaaactc 1440

aacatccgag cgctccacga ttaccaatcg ttcccgcagg acccgaaccg ctacgcgacc 1500

tactcctccg gcaagatcaa caccaaggac aacatgtcgc tgcagtacgg ccgcgtcgat 1560

atccgcgcca agctgccgac tggcgatggc gtctggccgg cactgtggat gctgccggag 1620

gactccgtct acggcgcatg ggcggcatca ggagagatcg acatcatgga ggcgaagggc 1680

cgtctgcccg gcacgacgag cggcgcgatc cactacggcg gccaatggcc ggtcaaccgc 1740

tacctcgccg gagaatgcta cctcccgcaa ggtacgacat tcgccgacga ctttaatgtg 1800

tacacgatga tctgggaaga ggacaacatg aagtggtacg ttaacggtga gtttttcttc 1860

aaggtgacgc gcgagcagtg gtactccgtc gccgccccca acaatccgga cgcgccgttc 1920

gaccagccgt tctatctgat catgaacctg gcggtcggcg gccacttcga cggcgggcgt 1980

acgcccgacc cgtccgacat cccggcgacg atgcagatcg actacgtgcg ggtgtacaaa 2040

gagggcgcgg gcggcggtcc gggcaacccg ggcggcaacg tcgcggtgac cggcgttagc 2100

gtgaccccgg caacggcgca ggtgcaggtc ggtcagaccg tctcgctgag cgccaacgtc 2160

gcgccagcca atgcaacgaa caagcaagtg acctggtcag tcgccaatgg cagcatcgcc 2220

tcggtgagcg ccagcggcgt cgtcagtgga ctcgctgctg gcacgacgac cgtaaccgcc 2280

acgaccgcag acggcaaccg caccgcctcg gcgacgatca ccgtcgtgcc gccaccgacg 2340

acgaccgtca tcatcggcga tagcgtgcgc ggcatccgaa agaccggcga caacctgctc 2400

ttctacgtca acggcgcaac ctacgccgac ctgcactaca aggtgaacgg cggcggtcag 2460

cctaatgtcg cgatgacgca cacaggaggc ggcaactaca cctacccggt gcatggcctc 2520

caacaaggcg ataccgtcga atacttcttc acctacaacc ccggcaacgg cgcgctagac 2580

acgccttggc agacttatgt gcatggggta acacaaggtg ttgttgagta a 2631

<210> 12

<211> 876

<212> ПРТ

<213> Paenibacillus sp.

<400> 12

Met Asn Arg His Val Leu Leu His Pro Tyr Leu His Arg Lys Ala Leu

1 5 10 15

Pro Leu Leu Leu Ala Leu Thr Leu Leu Thr Gly Ile Ala Leu Phe Pro

20 25 30

Ala Ser Thr Ala Gln Ala Ala Thr Thr Val Thr Ser Met Thr Tyr Phe

35 40 45

Ser Ala Asn Asp Gly Pro Val Ile Ser Lys Ser Gly Val Gly Gln Ala

50 55 60

Ser Tyr Gly Phe Val Met Pro Ile Phe Asn Gly Gly Ala Ala Thr Trp

65 70 75 80

Asn Asp Val Ala Asp Asp Val Gly Val Arg Val Lys Val Gly Gly Ser

85 90 95

Trp Val Asp Ile Asp Ser Val Gly Gly Tyr Val Tyr Asn Gln Asn Trp

100 105 110

Gly His Trp Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Gly Tyr Trp Phe Thr Leu Ser

115 120 125

Ala Thr Thr Glu Leu Gln Leu Tyr Ser Lys Ala Asn Ser Ser Val Thr

130 135 140

Leu Asn Tyr Thr Leu Val Phe Gln Asn Val Asn Glu Thr Thr Ile Thr

145 150 155 160

Ser Met Thr Pro Thr Gln Gly Pro Gln Leu Thr Ala Gly Tyr Thr Gly

165 170 175

Gly Ala Gly Phe Thr Tyr Pro Val Phe Asn Asn Asp Pro Ser Ile Pro

180 185 190

Tyr Ala Ala Val Ala Gly Asp Leu Lys Val Tyr Val Lys Pro Val Ala

195 200 205

Ser Ser Thr Trp Ile Asp Ile Asp Asn Asn Ala Ala Ser Gly Trp Ile

210 215 220

Tyr Asp Ser Asn Phe Gly Gln Phe Thr Glu Gly Gly Gly Gly Tyr Trp

225 230 235 240

Phe Thr Val Thr Glu Ser Ile Asn Val Lys Leu Glu Ser Arg Thr Ser

245 250 255

Ser Ala Asn Val Val Tyr Thr Ile Asn Phe Pro Gln Pro Thr Arg Ser

260 265 270

Ser Tyr Thr Leu Ser Ala Tyr Asp Gly Thr Thr Tyr Ser Ala Asp Ala

275 280 285

Ser Gly Ala Ile Gly Ile Pro Leu Pro Arg Ile Asp Gly Thr Pro Ala

290 295 300

Ile Gly Ser Glu Leu Gly Asn Phe Val Tyr Gln Ile Tyr Arg Asn Gly

305 310 315 320

Gln Trp Val Glu Met Ser Asn Ser Ala Gln Ser Ser Phe Val Tyr Ser

325 330 335

Ala Asn Gly Tyr Asn Asn Met Ser Asp Ala Asn Gln Trp Gly Tyr Trp

340 345 350

Ala Asp Tyr Ile Tyr Gly Leu Trp Phe Arg Pro Ile Gln Glu Asp Met

355 360 365

Gln Ile Arg Ile Gly Tyr Pro Leu Asn Gly Gln Ser Gly Gly Ser Val

370 375 380

Gly Ser Asn Phe Val Thr Tyr Thr Leu Ile Gly Asn Pro Asn Ala Pro

385 390 395 400

Arg Pro Asp Val Ser Asp Gln Gly Asp Val Glu Ile Gly Thr Pro Thr

405 410 415

Asp Pro Ala Ile Ala Gly Trp Asn Leu Tyr Trp Gln Asp Glu Phe Ala

420 425 430

Gly Ser Ala Leu Asp Leu Asn Lys Trp Asn Tyr Glu Thr Gly Tyr Tyr

435 440 445

Ile Gly Asn Asp Pro Asn Leu Trp Gly Trp Gly Asn Ala Glu Met Gln

450 455 460

His Tyr Thr Thr Ser Thr Gln Asn Val Phe Val Ala Asp Gly Lys Leu

465 470 475 480

Asn Ile Arg Ala Leu His Asp Tyr Gln Ser Phe Pro Gln Asp Pro Asn

485 490 495

Arg Tyr Ala Thr Tyr Ser Ser Gly Lys Ile Asn Thr Lys Asp Asn Met

500 505 510

Ser Leu Gln Tyr Gly Arg Val Asp Ile Arg Ala Lys Leu Pro Thr Gly

515 520 525

Asp Gly Val Trp Pro Ala Leu Trp Met Leu Pro Glu Asp Ser Val Tyr

530 535 540

Gly Ala Trp Ala Ala Ser Gly Glu Ile Asp Ile Met Glu Ala Lys Gly

545 550 555 560

Arg Leu Pro Gly Thr Thr Ser Gly Ala Ile His Tyr Gly Gly Gln Trp

565 570 575

Pro Val Asn Arg Tyr Leu Ala Gly Glu Cys Tyr Leu Pro Gln Gly Thr

580 585 590

Thr Phe Ala Asp Asp Phe Asn Val Tyr Thr Met Ile Trp Glu Glu Asp

595 600 605

Asn Met Lys Trp Tyr Val Asn Gly Glu Phe Phe Phe Lys Val Thr Arg

610 615 620

Glu Gln Trp Tyr Ser Val Ala Ala Pro Asn Asn Pro Asp Ala Pro Phe

625 630 635 640

Asp Gln Pro Phe Tyr Leu Ile Met Asn Leu Ala Val Gly Gly His Phe

645 650 655

Asp Gly Gly Arg Thr Pro Asp Pro Ser Asp Ile Pro Ala Thr Met Gln

660 665 670

Ile Asp Tyr Val Arg Val Tyr Lys Glu Gly Ala Gly Gly Gly Pro Gly

675 680 685

Asn Pro Gly Gly Asn Val Ala Val Thr Gly Val Ser Val Thr Pro Ala

690 695 700

Thr Ala Gln Val Gln Val Gly Gln Thr Val Ser Leu Ser Ala Asn Val

705 710 715 720

Ala Pro Ala Asn Ala Thr Asn Lys Gln Val Thr Trp Ser Val Ala Asn

725 730 735

Gly Ser Ile Ala Ser Val Ser Ala Ser Gly Val Val Ser Gly Leu Ala

740 745 750

Ala Gly Thr Thr Thr Val Thr Ala Thr Thr Ala Asp Gly Asn Arg Thr

755 760 765

Ala Ser Ala Thr Ile Thr Val Val Pro Pro Pro Thr Thr Thr Val Ile

770 775 780

Ile Gly Asp Ser Val Arg Gly Ile Arg Lys Thr Gly Asp Asn Leu Leu

785 790 795 800

Phe Tyr Val Asn Gly Ala Thr Tyr Ala Asp Leu His Tyr Lys Val Asn

805 810 815

Gly Gly Gly Gln Pro Asn Val Ala Met Thr His Thr Gly Gly Gly Asn

820 825 830

Tyr Thr Tyr Pro Val His Gly Leu Gln Gln Gly Asp Thr Val Glu Tyr

835 840 845

Phe Phe Thr Tyr Asn Pro Gly Asn Gly Ala Leu Asp Thr Pro Trp Gln

850 855 860

Thr Tyr Val His Gly Val Thr Gln Gly Val Val Glu

865 870 875

<210> 13

<211> 6783

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Транспозонная кассета

<400> 13

gccagatgat taattcctaa tttttgttga cactctatca ttgatagagt tattttacca 60

ctccctatca gtgatagaga aaagtgaaat gaatagttcg acaaaaatct agaaataatt 120

ttgtttaact ttaagaagga gatatacaat ttcgtcgaca cacaggaaac atattaaaaa 180

ttaaaacctg caggagtttg aaggagatag aaccatggcg cagtcgaaac tctatccagt 240

tgtgatggca ggtggctccg gtagccgctt atggccgctt tcccgcgtac tttatcccaa 300

gcagttttta tgcctgaaag gcgatctcac catgctgcaa accaccatct gccgcctgaa 360

cggcgtggag tgcgaaagcc cggtggtgat ttgcaatgag cagcaccgct ttattgtcgc 420

ggaacagctg cgtcaactga acaaacttac cgagaacatt attctcgaac cggcagggcg 480

aaacacggca cctgccattg cgctggcggc gctggcggca aaacgtcata gcccggagag 540

cgacccgtta atgctggtat tggcggcgga tcatgtgatt gccgatgaag acgcgttccg 600

tgccgccgtg cgtaatgcca tgccatatgc cgaagcgggc aagctggtga ccttcggcat 660

tgtgccggat ctaccagaaa ccggttatgg ctatattcgt cgcggtgaag tgtctgcggg 720

tgagcaggat atggtggcct ttgaagtggc gcagtttgtc gaaaaaccga atctggaaac 780

cgctcaggcc tatgtggcaa gcggcgaata ttactggaac agcggtatgt tcctgttccg 840

cgccggacgc tatctcgaag aactgaaaaa atatcgcccg gatatcctcg atgcctgtga 900

aaaagcgatg agcgccgtcg atccggatct caattttatt cgcgtggatg aagaagcgtt 960

tctcgcctgc ccggaagagt cggtggatta cgcggtcatg gaacgtacgg cagatgctgt 1020

tgtggtgccg atggatgcgg gctggagcga tgttggctcc tggtcttcat tatgggagat 1080

cagcgcccac accgccgagg gcaacgtttg ccacggcgat gtgattaatc acaaaactga 1140

aaacagctat gtgtatgctg aatctggcct ggtcaccacc gtcggggtga aagatctggt 1200

agtggtgcag accaaagatg cggtgctgat tgccgaccgt aacgcggtac aggatgtgaa 1260

aaaagtggtc gagcagatca aagccgatgg tcgccatgag catcgggtgc atcgcgaagt 1320

gtatcgtccg tggggcaaat atgactctat cgacgcgggc gaccgctacc aggtgaaacg 1380

catcaccgtg aaaccgggcg agggcttgtc ggtacagatg caccatcacc gcgcggaaca 1440

ctgggtggtt gtcgcgggaa cggcaaaagt caccattgat ggtgatatca aactgcttgg 1500

tgaaaacgag tccatttata ttccgctggg ggcgacgcat tgcctggaaa acccggggaa 1560

aattccgctc gatttaattg aagtgcgctc cggctcttat ctcgaagagg atgatgtggt 1620

gcgtttcgcg gatcgctacg gacgggtgta aacgtcgcat caggcaatga atgcgaaacc 1680

gcggtgtaaa taacgacaaa aataaaattg gccgcttcgg tcagggccaa ctattgcctg 1740

aaaaagggta acgatatgaa aaaattaacc tgctttaaag cctatgatat tcgcgggaaa 1800

ttaggcgaag aactgaatga agatatcgcc tggcgcattg gtcgcgccta tggcgaattt 1860

ctcaaaccga aaaccattgt gttaggcggt gatgtccgcc tcaccagcga aaccttaaaa 1920

ctggcgctgg cgaaaggttt acaggatgcg ggcgttgacg tgctggatat tggtatgtcc 1980

ggcaccgaag agatctattt cgccacgttc catctcggcg tggatggcgg cattgaagtt 2040

accgccagcc ataatccgat ggattataac ggcatgaagc tggttcgcga gggggctcgc 2100

ccgatcagcg gagataccgg actgcgcgac gtccagcgtc tggctgaagc caacgacttt 2160

cctcccgtcg atgaaaccaa acgcggtcgc tatcagcaaa tcaacctgcg tgacgcttac 2220

gttgatcacc tgttcggtta tatcaatgtc aaaaacctca cgccgctcaa gctggtgatc 2280

aactccggga acggcgcagc gggtccggtg gtggacgcca ttgaagcccg ctttaaagcc 2340

ctcggcgcgc ccgtggaatt aatcaaagtg cacaacacgc cggacggcaa tttccccaac 2400

ggtattccta acccactact gccggaatgc cgcgacgaca cccgcaatgc ggtcatcaaa 2460

cacggcgcgg atatgggcat tgcttttgat ggcgattttg accgctgttt cctgtttgac 2520

gaaaaagggc agtttattga gggctactac attgtcggcc tgttggcaga agcattcctc 2580

gaaaaaaatc ccggcgcgaa gatcatccac gatccacgtc tctcctggaa caccgttgat 2640

gtggtgactg ccgcaggtgg cacgccggta atgtcgaaaa ccggacacgc ctttattaaa 2700

gaacgtatgc gcaaggaaga cgccatctat ggtggcgaaa tgagcgccca ccattacttc 2760

cgtgatttcg cttactgcga cagcggcatg atcccgtggc tgctggtcgc cgaactggtg 2820

tgcctgaaag ataaaacgct gggcgaactg gtacgcgacc ggatggcggc gtttccggca 2880

agcggtgaga tcaacagcaa actggcgcaa cccgttgagg cgattaaccg cgtggaacag 2940

cattttagcc gtgaggcgct ggcggtggat cgcaccgatg gcatcagcat gacctttgcc 3000

gactggcgct ttaacctgcg cacctccaat accgaaccgg tggtgcgcct gaatgtggaa 3060

tcgcgcggtg atgtgccgct gatggaagcg cgaacgcgaa ctctgctgac gttgctgaac 3120

gagtaaaaac gcggccgcga tatcgttgta aaacgacggc cagtgcaaga atcataaaaa 3180

atttatttgc tttcaggaaa atttttctgt ataatagatt cataaatttg agagaggagt 3240

ttttgtgagc ggataacaat tccccatctt agtatattag ttaagtataa atacaccgcg 3300

gaggacgaag gagatagaac catgtcaaaa gtcgctctca tcaccggtgt aaccggacaa 3360

gacggttctt acctggcaga gtttctgctg gaaaaaggtt acgaggtgca tggtattaag 3420

cgtcgcgcat cgtcattcaa caccgagcgc gtggatcaca tttatcagga tccgcacacc 3480

tgcaacccga aattccatct gcattatggc gacctgagtg atacctctaa cctgacgcgc 3540

attttgcgtg aagtacagcc ggatgaagtg tacaacctgg gcgcaatgag ccacgttgcg 3600

gtctcttttg agtcaccaga atataccgct gacgtcgacg cgatgggtac gctgcgcctg 3660

ctggaggcga tccgcttcct cggtctggaa aagaaaactc gtttctatca ggcttccacc 3720

tctgaactgt atggtctggt gcaggaaatt ccgcagaaag agaccacgcc gttctacccg 3780

cgatctccgt atgcggtcgc caaactgtac gcctactgga tcaccgttaa ctaccgtgaa 3840

tcctacggca tgtacgcctg taacggaatt ctcttcaacc atgaatcccc gcgccgcggc 3900

gaaaccttcg ttacccgcaa aatcacccgc gcaatcgcca acatcgccca ggggctggag 3960

tcgtgcctgt acctcggcaa tatggattcc ctgcgtgact ggggccacgc caaagactac 4020

gtaaaaatgc agtggatgat gctgcagcag gaacagccgg aagatttcgt tatcgcgacc 4080

ggcgttcagt actccgtgcg tcagttcgtg gaaatggcgg cagcacagct gggcatcaaa 4140

ctgcgctttg aaggcacggg cgttgaagag aagggcattg tggtttccgt caccgggcat 4200

gacgcgccgg gcgttaaacc gggtgatgtg attatcgctg ttgacccgcg ttacttccgt 4260

ccggctgaag ttgaaacgct gctcggcgac ccgaccaaag cgcacgaaaa actgggctgg 4320

aaaccggaaa tcaccctcag agagatggtg tctgaaatgg tggctaatga cctcgaagcg 4380

gcgaaaaaac actctctgct gaaatctcac ggctacgacg tggcgatcgc gctggagtca 4440

taagcatgag taaacaacga gtttttattg ctggtcatcg cgggatggtc ggttccgcca 4500

tcaggcggca gctcgaacag cgcggtgatg tggaactggt attacgcacc cgcgacgagc 4560

tgaacctgct ggacagccgc gccgtgcatg atttctttgc cagcgaacgt attgaccagg 4620

tctatctggc ggcggcgaaa gtgggcggca ttgttgccaa caacacctat ccggcggatt 4680

tcatctacca gaacatgatg attgagagca acatcattca cgccgcgcat cagaacgacg 4740

tgaacaaact gctgtttctc ggatcgtcct gcatctaccc gaaactggca aaacagccga 4800

tggcagaaag cgagttgttg cagggcacgc tggagccgac taacgagcct tatgctattg 4860

ccaaaatcgc cgggatcaaa ctgtgcgaat catacaaccg ccagtacgga cgcgattacc 4920

gctcagtcat gccgaccaac ctgtacgggc cacacgacaa cttccacccg agtaattcgc 4980

atgtgatccc agcattgctg cgtcgcttcc acgaggcgac ggcacagaat gcgccggacg 5040

tggtggtatg gggcagcggt acaccgatgc gcgaatttct gcacgtcgat gatatggcgg 5100

cggcgagcat tcatgtcatg gagctggcgc atgaagtctg gctggagaac acccagccga 5160

tgttgtcgca cattaacgtc ggcacgggcg ttgactgcac tatccgcgag ctggcgcaaa 5220

ccatcgccaa agtggtgggt tacaaaggcc gggtggtttt tgatgccagc aaaccggatg 5280

gcacgccgcg caaactgctg gatgtgacgc gcctgcatca gcttggctgg tatcacgaaa 5340

tctcactgga agcggggctt gccagcactt accagtggtt ccttgagaat caagaccgct 5400

ttcggggggg gagctaacgc gccatttaaa tcaacctcag cggtcatagc tgtttcctgt 5460

gactgagcaa taactagcat aaccccttgg ggcctctaaa cgggtcttga ggggtttttt 5520

gctgaaacca atttgcctgg cggcagtagc gcggtggtcc cacctgaccc catgccgaac 5580

tcagaagtga aacgccgtag cgccgatggt agtgtggggt ctccccatgc gagagtaggg 5640

aactgccagg catcaaataa aacgaaaggc tcagtcgaaa gactgggcct ttcgggatcc 5700

aggccggcct gttaacgaat taatcttccg cggcggtatc gataagcttg atatcgaatt 5760

ccgaagttcc tattctctag aaagtatagg aacttcaggt ctgaagagga gtttacgtcc 5820

agccaagcta gcttggctgc aggtcgtcga aattctaccg ggtaggggag gcgcttttcc 5880

caaggcagtc tggagcatgc gctttagcag ccccgctggg cacttggcgc tacacaagtg 5940

gcctctggcc tcgcacacat tccacatcca ccggtaggcg ccaaccggct ccgttctttg 6000

gtggcccctt cgcgccacct tctactcctc ccctagtcag gaagttcccc cccgccccgc 6060

agctcgcgtc gtgcaggacg tgacaaatgg aagtagcacg tctcactagt ctcgtgcaga 6120

tggacagcac cgctgagcaa tggaagcggg taggcctttg gggcagcggc caatagcagc 6180

tttgctcctt cgctttctgg gctcagaggc tgggaagggg tgggtccggg ggcgggctca 6240

ggggcgggct caggggcggg gcgggcgccc gaaggtcctc cggaggcccg gcattctgca 6300

cgcttcaaaa gcgcacgtct gccgcgctgt tctcctcttc ctcatctccg ggcctttcga 6360

cctgcagcct gttgacaatt aatcatcggc atagtatatc ggcatagtat aatacgacaa 6420

ggtgaggaac taaaccatgg gtcaaagtag cgatgaagcc aacgctcccg ttgcagggca 6480

gtttgcgctt cccctgagtg ccacctttgg cttaggggat cgcgtacgca agaaatctgg 6540

tgccgcttgg cagggtcaag tcgtcggttg gtattgcaca aaactcactc ctgaaggcta 6600

tgcggtcgag tccgaatccc acccaggctc agtgcaaatt tatcctgtgg ctgcacttga 6660

acgtgtggcc taatgagggg atcaattctc tagagctcgc tgatcagaag ttcctattct 6720

ctagaaagta taggaacttc gatggcgcct catccctgaa gccaataggg ataacagggt 6780

aat 6783

<210> 14

<211> 2851

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Кассета интеграции

<400> 14

tggccagatg attaattcct aatttttgtt gacactctat cattgataga gttattttac 60

cactccctat cagtgataga gaaaagtgaa atgaatagtt cgacaaaaat ctagaaataa 120

ttttgtttaa ctttaagaag gagatataca aatgtactat ttaaaaaaca caaacttttg 180

gatgttcggt ttattctttt tcttttactt ttttatcatg ggagcctact tcccgttttt 240

cccgatttgg ctacatgaca tcaaccatat cagcaaaagt gatacgggta ttatttttgc 300

cgctatttct ctgttctcgc tattattcca accgctgttt ggtctgcttt ctgacaaact 360

cgggctgcgc aaatacctgc tgtggattat taccggcatg ttagtgatgt ttgcgccgtt 420

ctttattttt atcttcgggc cactgttaca atacaacatt ttagtaggat cgattgttgg 480

tggtatttat ctaggctttt gttttaacgc cggtgcgcca gcagtagagg catttattga 540

gaaagtcagc cgtcgcagta atttcgaatt tggtcgcgcg cggatgtttg gctgtgttgg 600

ctgggcgctg tgtgcctcga ttgtcggcat catgttcacc atcaataatc agtttgtttt 660

ctggctgggc tctggctgtg cactcatcct cgccgtttta ctctttttcg ccaaaacgga 720

tgcgccctct tctgccacgg ttgccaatgc ggtaggtgcc aaccattcgg catttagcct 780

taagctggca ctggaactgt tcagacagcc aaaactgtgg tttttgtcac tgtatgttat 840

tggcgtttcc tgcacctacg atgtttttga ccaacagttt gctaatttct ttacttcgtt 900

ctttgctacc ggtgaacagg gtacgcgggt atttggctac gtaacgacaa tgggcgaatt 960

acttaacgcc tcgattatgt tctttgcgcc actgatcatt aatcgcatcg gtgggaaaaa 1020

cgccctgctg ctggctggca ctattatgtc tgtacgtatt attggctcat cgttcgccac 1080

ctcagcgctg gaagtggtta ttctgaaaac gctgcatatg tttgaagtac cgttcctgct 1140

ggtgggctgc tttaaatata ttaccagcca gtttgaagtg cgtttttcag cgacgattta 1200

tctggtctgt ttctgcttct ttaagcaact ggcgatgatt tttatgtctg tactggcggg 1260

caatatgtat gaaagcatcg gtttccaggg cgcttatctg gtgctgggtc tggtggcgct 1320

gggcttcacc ttaatttccg tgttcacgct tagcggcccc ggcccgcttt ccctgctgcg 1380

tcgtcaggtg aatgaagtcg ctgggagcta agcggccgcg tcgacacgca aaaaggccat 1440

ccgtcaggat ggccttctgc ttaatttgat gcctggcagt ttatggcggg cgtcctgccc 1500

gccaccctcc gggccgttgc ttcgcaacgt tcaaatccgc tcccggcgga tttgtcctac 1560

tcaggagagc gttcaccgac aaacaacaga taaaacgaaa ggcccagtct ttcgactgag 1620

cctttcgttt tatttgatgc ctggcagttc cctactctcg catggggaga ccccacacta 1680

ccatcatgta tgaatatcct ccttagttcc tattccgaag ttcctattct ctagaaagta 1740

taggaacttc ggcgcgtcct acctgtgaca cgcgtgccgc agtctcacgc ccggagcgta 1800

gcgaccgagt gagctagcta tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct 1860

catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgaggga 1920

agcggtgatc gccgaagtat cgactcaact atcagaggta gttggcgtca tcgagcgcca 1980

tctcgaaccg acgttgctgg ccgtacattt gtacggctcc gcagtggatg gcggcctgaa 2040

gccacacagt gatattgatt tgctggttac ggtgaccgta aggcttgatg aaacaacgcg 2100

gcgagctttg atcaacgacc ttttggaaac ttcggcttcc cctggagaga gcgagattct 2160

ccgcgctgta gaagtcacca ttgttgtgca cgacgacatc attccgtggc gttatccagc 2220

taagcgcgaa ctgcaatttg gagaatggca gcgcaatgac attcttgcag gtatcttcga 2280

gccagccacg atcgacattg atctggctat cttgctgaca aaagcaagag aacatagcgt 2340

tgccttggta ggtccagcgg cggaggaact ctttgatccg gttcctgaac aggatctatt 2400

tgaggcgcta aatgaaacct taacgctatg gaactcgccg cccgactggg ctggcgatga 2460

gcgaaatgta gtgcttacgt tgtcccgcat ttggtacagc gcagtaaccg gcaaaatcgc 2520

gccgaaggat gtcgctgccg actgggcaat ggagcgcctg ccggcccagt atcagcccgt 2580

catacttgaa gctagacagg cttatcttgg acaagaagaa gatcgcttgg cctcgcgcgc 2640

agatcagttg gaagaatttg tccactacgt gaaaggcgag atcaccaagg tagtcggcaa 2700

ataatgtcta acaattcgtt caagccgagg ggccgcaaga tccggccacg atgacccggt 2760

cgtcgggtac cggcagggcg gggcgtaagg cgcgccattt aaatgaagtt cctattccga 2820

agttcctatt ctctagaaag tataggaact t 2851

<210> 15

<211> 2858

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Кассета интеграции

<400> 15

ggccagatga ttaattccta atttttgttg acactctatc attgatagag ttattttacc 60

actccctatc agtgatagag aaaagtgaaa tgaatagttc gacaaaaatc tagaaataat 120

tttgtttaac tttaagaagg agatatacaa atgggcagca ttattcgtct gcagggtggt 180

ctgggtaatc agctgtttca gtttagcttt ggttatgccc tgagcaaaat taatggtaca 240

ccgctgtatt tcgacattag ccattatgcc gaaaacgatg atcatggtgg ttatcgtctg 300

aataatctgc agattccgga agaatatctg cagtattata ccccgaaaat taataatatt 360

tataaactgc tggtgcgtgg cagccgtctg tatccggata tttttctgtt tctgggcttt 420

tgcaacgaat ttcatgccta tggctacgat tttgaatata ttgcccagaa atggaaaagc 480

aaaaaataca ttggctactg gcagagcgaa cacttttttc ataaacatat tctggacctg 540

aaagaatttt ttattccgaa aaatgtgagc gaacaggcaa atctgctggc agcaaaaatt 600

ctggaaagcc agagcagcct gagcattcat attcgtcgtg gcgattatat taaaaacaaa 660

accgcaaccc tgacacatgg tgtttgtagc ctggaatatt ataaaaaagc cctgaacaaa 720

atccgcgatc tggcaatgat tcgtgatgtg tttatcttta gcgacgatat cttctggtgc 780

aaagaaaata ttgaaaccct gctgagcaaa aaatataata tttattatag cgaagatctg 840

agccaagaag aggatctgtg gctgatgagc ctggcaaatc atcatattat tgccaatagc 900

agctttagtt ggtggggtgc atatctgggt agcagcgcaa gccagattgt tatttatccg 960

accccgtggt atgatattac cccgaaaaac acctatatcc cgattgtgaa ccattggatc 1020

aacgttgata aacatagcag ctgctaagcg gccgcgtcga cacgcaaaaa ggccatccgt 1080

caggatggcc ttctgcttaa tttgatgcct ggcagtttat ggcgggcgtc ctgcccgcca 1140

ccctccgggc cgttgcttcg caacgttcaa atccgctccc ggcggatttg tcctactcag 1200

gagagcgttc accgacaaac aacagataaa acgaaaggcc cagtctttcg actgagcctt 1260

tcgttttatt tgatgcctgg cagttcccta ctctcgcatg gggagacccc acactaccat 1320

catgtatgaa tatcctcctt agttcctatt ccgaagttcc tattctctag aaagtatagg 1380

aacttcggcg cgtcctacct gtgacacgcg tcaagatccc ctcacgctgc cgcaagcact 1440

cagggcgcaa gggctgctaa aggaagcgga acacgtagaa agccagtccg cagaaacggt 1500

gctgaccccg gatgaatgtc agctactggg ctatctggac aagggaaaac gcaagcgcaa 1560

agagaaagca ggtagcttgc agtgggctta catggcgata gctagactgg gcggttttat 1620

ggacagcaag cgaaccggaa ttgccagctg gggcgccctc tggtaaggtt gggaagccct 1680

gcaaagtaaa ctggatggct ttcttgccgc caaggatctg atggcgcagg ggatcaagat 1740

ctgatcaaga gacaggatga ggatcgtttc gcatgattga acaagatgga ttgcacgcag 1800

gttctccggc cgcttgggtg gagaggctat tcggctatga ctgggcacaa cagacaatcg 1860

gctgctctga tgccgccgtg ttccggctgt cagcgcaggg gcgcccggtt ctttttgtca 1920

agaccgacct gtccggtgcc ctgaatgaac tgcaggacga ggcagcgcgg ctatcgtggc 1980

tggccacgac gggcgttcct tgcgcagctg tgctcgacgt tgtcactgaa gcgggaaggg 2040

actggctgct attgggcgaa gtgccggggc aggatctcct gtcatctcac cttgctcctg 2100

ccgagaaagt atccatcatg gctgatgcaa tgcggcggct gcatacgctt gatccggcta 2160

cctgcccatt cgaccaccaa gcgaaacatc gcatcgagcg agcacgtact cggatggaag 2220

ccggtcttgt cgatcaggat gatctggacg aagagcatca ggggctcgcg ccagccgaac 2280

tgttcgccag gctcaaggcg cgcatgcccg acggcgagga tctcgtcgtg acccatggcg 2340

atgcctgctt gccgaatatc atggtggaaa atggccgctt ttctggattc atcgactgtg 2400

gccggctggg tgtggcggac cgctatcagg acatagcgtt ggctacccgt gatattgctg 2460

aagagcttgg cggcgaatgg gctgaccgct tcctcgtgct ttacggtatc gccgctcccg 2520

attcgcagcg catcgccttc tatcgccttc ttgacgagtt cttctgagcg ggactctggg 2580

gttcgaaatg accgaccaag cgacgcccaa cctgccatca cgagatttcg attccaccgc 2640

cgccttctat gaaaggttgg gcttcggaat cgttttccgg gacgccggct ggatgatcct 2700

ccagcgcggg gatctcatgc tggagttctt cgcccacccc agcttcaaaa gcgctctcgg 2760

taccggcagg gcggggcgta aggcgcgcca tttaaatgaa gttcctattc cgaagttcct 2820

attctctaga aagtatagga acttcgaagc agctccag 2858

<210> 16

<211> 2631

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Кассета интеграции

<400> 16

ggccagatga ttaattccta atttttgttg acactctatc attgatagag ttattttacc 60

actccctatc agtgatagag aaaagtgaaa tgaatagttc gacaaaaatc tagaaataat 120

tttgtttaac tttaagaagg agatatacaa atgaagtcgg cactgacctt ttcccgtcgc 180

atcaatccgg tgtttctggc gttctttgtc gttgcttttc tgagcggtat cgcaggcgca 240

ctgcaggctc cgaccctgag tctgtttctg tccacggaag tgaaagttcg tccgctgtgg 300

gttggtctgt tctataccgt caacgcaatc gctggcatta cggttagctt tatcctggcg 360

aaacgttcag attcgcgcgg tgaccgtcgc aagctgatta tggtgtgcta tctgatggcg 420

gttggcaact gtctgctgtt tgccttcaat cgtgattacc tgaccctgat cacggcaggt 480

gtgctgctgg cgagcgttgc caacaccgca atgccgcaga ttttcgcgct ggcccgtgaa 540

tatgccgaca gctctgcacg cgaagtggtt atgtttagtt ccatcatgcg cgctcaactg 600

agtctggcat gggtgattgg tccgccgctg tcctttatgc tggcgctgaa ttacggtttt 660

accctgatgt tctcaatcgc ggccggcatt ttcgttctgt cggccctggt cgtgtggttt 720

atcctgccga gtgtcccgcg tgcagaaccg gttgtcgatg caccggtggt tgtccagggt 780

tcactgttcg cagacaaaaa cgttctgctg ctgtttatcg cgtcgatgct gatgtggacc 840

tgcaatacga tgtatattat cgatatgccg ctgtacatta ccgcaagcct gggtctgccg 900

gaacgtctgg ctggtctgct gatgggtacc gcagctggcc tggaaattcc gatcatgctg 960

ctggcgggtt attctgtgcg ttactttggc aaacgcaaga ttatgctgtt cgctgttctg 1020

gcgggtgtcc tgttttatac cggcctggtt ctgtttaaat tcaagacggc cctgatgctg 1080

ctgcagatct ttaacgcaat tttcatcggt attgtggctg gcattggtat gctgtacttc 1140

caagatctga tgccgggtcg tgcaggtgca gcaaccacgc tgtttaccaa tagcatctct 1200

acgggtgtca ttctggcagg cgtgctgcaa ggcggtctga ccgaaacgtg gggccatgac 1260

agcgtctatg tgatggcgat ggtcctgtct attctggccc tgattatctg tgcacgtgtg 1320

cgcgaagctt aaatcgatac tagcataacc ccttggggcc tctaaacgcg tcgacacgca 1380

aaaaggccat ccgtcaggat ggccttctgc ttaatttgat gcctggcagt ttatggcggg 1440

cgtcctgccc gccaccctcc gggccgttgc ttcgcaacgt tcaaatccgc tcccggcgga 1500

tttgtcctac tcaggagagc gttcaccgac aaacaacaga taaaacgaaa ggcccagtct 1560

ttcgactgag cctttcgttt tatttgatgc ctggcagttc cctactctcg catggggaga 1620

ccccacacta ccatcatgta tgaatatcct ccttagttcc tattccgaag ttcctattct 1680

ctagaaagta taggaacttc ggcgcgtcct acctgtgacg gaagatcact tcgcagaata 1740

aataaatcct ggtgtccctg ttgataccgg gaagccctgg gccaactttt ggcgaaaatg 1800

agacgttgat cggcacgtaa gaggttccaa ctttcaccat aatgaaataa gatcactacc 1860

gggcgtattt tttgagttgt cgagattttc aggagctaag gaagctaaaa tggagaaaaa 1920

aatcactgga tataccaccg ttgatatatc ccaatggcat cgtaaagaac attttgaggc 1980

atttcagtca gttgctcaat gtacctataa ccagaccgtt cagctggata ttacggcctt 2040

tttaaagacc gtaaagaaaa ataagcacaa gttttatccg gcctttattc acattcttgc 2100

ccgcctgatg aatgctcatc cggaattacg tatggcaatg aaagacggtg agctggtgat 2160

atgggatagt gttcaccctt gttacaccgt tttccatgag caaactgaaa cgttttcatc 2220

gctctggagt gaataccacg acgatttccg gcagtttcta cacatatatt cgcaagatgt 2280

ggcgtgttac ggtgaaaacc tggcctattt ccctaaaggg tttattgaga atatgttttt 2340

cgtctcagcc aatccctggg tgagtttcac cagttttgat ttaaacgtgg ccaatatgga 2400

caacttcttc gcccccgttt tcaccatggg caaatattat acgcaaggcg acaaggtgct 2460

gatgccgctg gcgattcagg ttcatcatgc cgtttgtgat ggcttccatg tcggcagatg 2520

cttaatgaat acaacagtac tgcgatgagt ggcagggcgg ggcgtaaggc gcgccattta 2580

aatgaagttc ctattccgaa gttcctattc tctagaaagt ataggaactt c 2631

<210> 17

<211> 4259

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Кассета интеграции

<400> 17

ttactcagca ataaactgat attccgtcag gctggaatac tcttcgccag gacgcaggaa 60

gcagtccggt tgcggccatt cagggtggtt cgggctgtcc ggtagaaact cgctttccag 120

agccagccct tgccagtcgg cgtaaggttc ggttccccgc gacggtgtgc cgccgaggaa 180

gttgccggag tagaattgca gagccggagc ggtggtgtag accttcagct gcaatttttc 240

atctgctgac cagacatgcg ccgccacttt cttgccatcg cctttggcct gtaacaagaa 300

tgcgtgatcg taacctttca ctttgcgctg atcgtcgtcg gcaagaaact cactggcgat 360

gattttggcg ctgcggaaat caaaagacgt tccggcgaca gatttcaggc cgtcgtgcgg 420

aatgccgcct tcatcaaccg gcagatattc gtccgccaga atctgcaact tgtgattgcg 480

cacgtcagac tgctcgccgt caagattgaa atagacgtga ttagtcatat tcaccgggca 540

aggtttatca actgtggcgc gataagtaat ggagatacgg ttatcgtcgg tcagacgata 600

ttgcaccgtc gcgccgagat tacccgggaa gccctgatca ccatcatctg aactcagggc 660

aaacagcacc tgacgatcgt tctggttcac aatctgccag cgacgtttgt cgaacccttc 720

cggcccgccg tgcagctggt taacgccctg acttggcgaa agcgtcacgg tttcaccgtc 780

aaaggtataa cggctattgg cgatacggtt ggcataacga ccaatagagg cccccagaaa 840

cgcggcctga tcctgatagc attccgggct ggcacagccg agcagcgcct cgcggacgct 900

gccatcggaa agcggaatac gggcggaaag taaagtcgca ccccagtcca tcagcgtgac 960

taccatccct gcgttgttac gcaaagttaa cagtcggtac ggctgaccat cgggtgccag 1020

tgcgggagtt tcgttcagca ctgtcctgct ccttgtgatg gtttacaaac gtaaaaagtc 1080

tctttaatac ctgtttttgc ttcatattgt tcagcgacag cttgctgtac ggcaggcacc 1140

agctcttccg ggatcagcgc gacgatacag ccgccaaatc cgccgccggt catgcgtacg 1200

ccacctttgt cgccaatcac agctttgacg atttctacca gagtgtcaat ttgcggcacg 1260

gtgatttcga aatcatcgcg catagaggca tgagactccg ccatcaactc gcccatacgt 1320

ttcaggtcgc cttgctccag cgcgctggca gcttcaacgg tgcgggcgtt ttcagtcagt 1380

atatgacgca cgcgttttgc cacgatcggg tccagttcat gcgcaacagc gttgaactct 1440

tcaatggtga catcacgcag ggctggctgc tggaagaaac gcgcaccggt ttcgcactgt 1500

tcacgacggg tgttgtattc gctgccaacc agggtacgtt tgaagttact gttgatgatg 1560

acgacagcca cacctttggg catggaaact gctttggtcc ccagtgagcg gcaatcgatc 1620

agcaaggcat gatctttctt gccgagcgcg gaaattagct gatccatgat cccgcagtta 1680

cagcctacaa actggttttc tgcttcctga ccgttaagcg cgatttgtgc gccgtccagc 1740

ggcagatgat aaagctgctg caatacggtt ccgaccgcga cttccagtga agcggaagaa 1800

cttaacccgg caccctgcgg cacattgccg ctgatcacca tgtccacgcc gccgaagctg 1860

ttgttacgca gttgcagatg tttcaccacg ccacgaacgt agttagccca ttgatagttt 1920

tcatgtgcga caatgggcgc atcgagggaa aactcgtcga gctgattttc ataatcggct 1980

gccatcacgc gaactttacg gtcatcgcgt ggtgcacaac tgatcacggt ttgataatca 2040

atcgcgcagg gcagaacgaa accgtcgttg tagtcggtgt gttcaccaat caaattcacg 2100

cggccaggcg cctgaatggt gtgagtggca gggtagccaa atgcgttggc aaacagagat 2160

tgtgtttttt ctttcagact catttcttac actccggatt cgcgaaaatg gatatcgctg 2220

actgcgcgca aacgctctgc tgcctgttct gcggtcaggt ctcgctgggt ctctgccagc 2280

atttcataac caaccataaa tttacgtacg gtggcggagc gcagcagagg cggataaaag 2340

tgcgcgtgca gctgccagtg ttgattctct tcgccattaa atggcgcgcc gtgccagccc 2400

atagagtagg ggaaggagca ctggaagagg ttgtcataac gactggtcag ctttttcaac 2460

gccagcgcca gatcgctgcg ctgggcgtcg gtcaaatcgg tgatccgtaa aacgtgggct 2520

ttgggcagca gtagcgtttc gaacggccag gcagcccagt aaggcacgac ggctaaccag 2580

tgttcggttt cgacaacggt acggctaccg tctgccagct cgcgctgaac ataatccacc 2640

agcattggtg atttctgttc ggcaaaatat tctttttgca ggcggtcttc gcgctcagct 2700

tcgttaggca ggaagctatt tgcccaaatc tgaccgtgcg gatgcgggtt agagcagccc 2760

atcgccgcgc ctttgttttc aaaaacctgc acccatgggt acgttttccc cagttctgcg 2820

gtttgctcct gccaggtttt gacgatttcc gtcaatgctg caacgctgag ctctggcagc 2880

gttttactgt gatccggtga aaagcagatc acccggctgg tgccgcgcgc gctctggcaa 2940

cgcatcagcg gatcgtgact ttctggcgca tctggcgtgt cagacatcaa agccgcaaag 3000

tcattagtga aaacgtaagt cccggtgtaa tcggggtttt tatcgcctgt cacccgcaca 3060

ttacctgcgc agaggaagca atctggatcg tgcgcaggta acacctgttt ggctggcgtt 3120

tcctgcgccc cctgccaggg gcgcttagcg cggtgcggtg aaaccagaat ccattgcccg 3180

gtgagcgggt tgtagcggcg atgtggatga tcaacgggat taaattgcgt catggtcgtt 3240

ccttaatcgg gatatccctg tggatggcgt gactgccagt gccaggtgtc ctgcgccatt 3300

tcatcgagtg tgcgcgttac gcgccagttc agttcacggt cggctttgct ggcgtccgcc 3360

cagtaggccg gaaggtcgcc ctcgcgacgc ggtgcaaaat gataattaac cggtttgccg 3420

caggctttgc tgaaggcatt aaccacgtcc agcacgctgt tgcctacgcc agcgccgagg 3480

ttgtagatgt gtacgcctgg cttgttcgcc agtttttcca tcgccacgac gtgaccgtcc 3540

gccagatcca ttacgtggat gtaatcgcgt acgccagtac catcttcggt cggataatcg 3600

ttaccaaaaa tcgccagcga gtcgcgacgg cctacagcaa cctgggcgat gtatggcatc 3660

aggttattcg gaatgccttg cggatcttcg cccatatcgc ccgacggatg cgcgccaacc 3720

gggttgaagt agcgcagcag ggcaatgctc cagtccggct gggctttttg cagatcggtg 3780

aggatctgtt ccaccatcag cttgcttttg ccgtaagggc tttgcggtgt gccggtcggg 3840

aagctttcaa cgtatggaat tttgggctga tcgccataaa cggtggcgga ggagctaaaa 3900

ataaagtttt tgacgttagc ggcgcgcatg gcgctaatca ggcgcagagt gccgttgaca 3960

ttgttgtcgt aatattccag cggtttttgt accgattcgc ccacggcttt cagcccggcg 4020

aagtggatca cggtgtcgat agcgtgatcg tgcaggatct cggtcatcaa cgcttcgtta 4080

cgaatatcgc cttcaacaaa cgttggatgt ttgccgccta aacgctcgat aacaggcagt 4140

acgctgcgct tactgttaca gaggttatca agaatgatga catcatgacc gttttgcagt 4200

aattgcacac aggtatgact tccaatgtaa ccgctaccac cggtaaccag aactctcat 4259

<210> 18

<211> 4223

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Кассета интеграции

<400> 18

tggccagatg attaattcct aatttttgtt gacactctat cattgataga gttattttac 60

cactccctat cagtgataga gaaaagtgaa atgaatagtt cgacaaaaat ctagaaataa 120

ttttgtttaa ctttaagaag gagatataca aatgcaaaaa ctactatctt taccgtccaa 180

tctggttcag tcttttcatg aactggagag ggtgaatcgt accgattggt tttgtacttc 240

cgacccggta ggtaagaaac ttggttccgg tggtggaaca tcctggctgc ttgaagaatg 300

ttataatgaa tattcagatg gtgctacttt tggagagtgg cttgaaaaag aaaaaagaat 360

tcttcttcat gcgggtgggc aaagccgtcg tttacccggc tatgcacctt ctggaaagat 420

tctcactccg gttcctgtgt tccggtggga gagagggcaa catctgggac aaaatctgct 480

ttctctgcaa cttcccctat atgaaaaaat catgtctttg gctccggata aactccatac 540

actgattgcg agtggtgatg tctatattcg ttcggagaaa cctttgcaga gtattcccga 600

agcggatgtg gtttgttatg gactgtgggt agatccgtct ctggctaccc atcatggcgt 660

gtttgcttcc gatcgcaaac atcccgaaca actcgacttt atgcttcaga agccttcgtt 720

ggcagaattg gaatctttat cgaagaccca tttgttcctg atggacatcg gtatatggct 780

tttgagtgac cgtgccgtag aaatcttgat gaaacgttct cataaagaaa gctctgaaga 840

actaaagtat tatgatcttt attccgattt tggattagct ttgggaactc atccccgtat 900

tgaagacgaa gaggtcaata cgctatccgt tgctattctg cctttgccgg gaggagagtt 960

ctatcattac gggaccagta aagaactgat ttcttcaact ctttccgtac agaataaggt 1020

ttacgatcag cgtcgtatca tgcaccgtaa agtaaagccc aatccggcta tgtttgtcca 1080

aaatgctgtc gtgcggatac ctctttgtgc cgagaatgct gatttatgga tcgagaacag 1140

tcatatcgga ccaaagtgga agattgcttc acgacatatt attaccgggg ttccggaaaa 1200

tgactggtca ttggctgtgc ctgccggagt gtgtgtagat gtggttccga tgggtgataa 1260

gggctttgtt gcccgtccat acggtctgga cgatgttttc aaaggagatt tgagagattc 1320

caaaacaacc ctgacgggta ttccttttgg tgaatggatg tccaaacgcg gtttgtcata 1380

tacagatttg aaaggacgta cggacgattt acaggcagtt tccgtattcc ctatggttaa 1440

ttctgtagaa gagttgggat tggtgttgag gtggatgttg tccgaacccg aactggagga 1500

aggaaagaat atctggttac gttccgaaca tttttctgcg gacgaaattt cggcaggtgc 1560

caatctgaag cgtttgtatg cacaacgtga agagttcaga aaaggaaact ggaaagcatt 1620

ggccgttaat catgaaaaaa gtgtttttta tcaacttgat ttggccgatg cagctgaaga 1680

ttttgtacgt cttggtttgg atatgcctga attattgcct gaggatgctc tgcagatgtc 1740

acgcatccat aaccggatgt tgcgtgcgcg tattttgaaa ttagacggga aagattatcg 1800

tccggaagaa caggctgctt ttgatttgct tcgtgacggc ttgctggacg ggatcagtaa 1860

tcgtaagagt accccaaaat tggatgtata ttccgatcag attgtttggg gacgtagccc 1920

cgtgcgcatc gatatggcag gtggatggac cgatactcct ccttattcac tttattcggg 1980

aggaaatgtg gtgaatctag ccattgagtt gaacggacaa cctcccttac aggtctatgt 2040

gaagccgtgt aaagacttcc atatcgtcct gcgttctatc gatatgggtg ctatggaaat 2100

agtatctacg tttgatgaat tgcaagatta taagaagatc ggttcacctt tctctattcc 2160

gaaagccgct ctgtcattgg caggctttgc acctgcgttt tctgctgtat cttatgcttc 2220

attagaggaa cagcttaaag atttcggtgc aggtattgaa gtgactttat tggctgctat 2280

tcctgccggt tccggtttgg gcaccagttc cattctggct tctaccgtac ttggtgccat 2340

taacgatttc tgtggtttag cctgggataa aaatgagatt tgtcaacgta ctcttgttct 2400

tgaacaattg ctgactaccg gaggtggatg gcaggatcag tatggaggtg tgttgcaggg 2460

tgtgaagctt cttcagaccg aggccggctt tgctcaaagt ccattggtgc gttggctacc 2520

cgatcattta tttacgcatc ctgaatacaa agactgtcac ttgctttatt ataccggtat 2580

aactcgtacg gcaaaaggga tcttggcaga aatagtcagt tccatgttcc tcaattcatc 2640

gttgcatctc aatttacttt cggaaatgaa ggcgcatgca ttggatatga atgaagctat 2700

acagcgtgga agttttgttg agtttggccg tttggtagga aaaacctggg aacaaaacaa 2760

agcattggat agcggaacaa atcctccggc tgtggaggca attatcgatc tgataaaaga 2820

ttataccttg ggatataaat tgccgggagc cggtggtggc gggtacttat atatggtagc 2880

gaaagatccg caagctgctg ttcgtattcg taagatactg acagaaaacg ctccgaatcc 2940

gcgggcacgt tttgtcgaaa tgacgttatc tgataaggga ttccaagtat cacgatcata 3000

actgaaacca atttgcctgg cggcagtagc gcggtggtcc cacctgaccc catgccgaac 3060

tcagaagtga aacgccgtag cgccgatggt agtgtggggt ctccccatgc gagagtaggg 3120

aactgccagg catcaaataa aacgaaaggc tcagtcgaaa gactgggcct ttcgggatcc 3180

aggccggcct gttaagacgg ccagtgaatt cgagctcggt acctaccgtt cgtataatgt 3240

atgctatacg aagttatcga gctctagaga atgatcccct cattaggcca cacgttcaag 3300

tgcagcgcac accgtggaaa cggatgaagg cacgaaccca gttgacataa gcctgttcgg 3360

ttcgtaaact gtaatgcaag tagcgtatgc gctcacgcaa ctggtccaga accttgaccg 3420

aacgcagcgg tggtaacggc gcagtggcgg ttttcatggc ttgttatgac tgtttttttg 3480

tacagtctat gcctcgggca tccaagcagc aagcgcgtta cgccgtgggt cgatgtttga 3540

tgttatggag cagcaacgat gttacgcagc agcaacgatg ttacgcagca gggcagtcgc 3600

cctaaaacaa agttaggtgg ctcaagtatg ggcatcattc gcacatgtag gctcggccct 3660

gaccaagtca aatccatgcg ggctgctctt gatcttttcg gtcgtgagtt cggagacgta 3720

gccacctact cccaacatca gccggactcc gattacctcg ggaacttgct ccgtagtaag 3780

acattcatcg cgcttgctgc cttcgaccaa gaagcggttg ttggcgctct cgcggcttac 3840

gttctgccca ggtttgagca gccgcgtagt gagatctata tctatgatct cgcagtctcc 3900

ggcgagcacc ggaggcaggg cattgccacc gcgctcatca atctcctcaa gcatgaggcc 3960

aacgcgcttg gtgcttatgt gatctacgtg caagcagatt acggtgacga tcccgcagtg 4020

gctctctata caaagttggg catacgggaa gaagtgatgc actttgatat cgacccaagt 4080

accgccacct aacaattcgt tcaagccgag atcgtagaat ttcgacgacc tgcagccaag 4140

cataacttcg tataatgtat gctatacgaa cggtaggatc ctctagagtc gacctgcagg 4200

catgagatgt gtataagaga cag 4223

<210> 19

<211> 3792

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Кассета интеграции

<400> 19

gggaattgat tctggtacca aatgagtcga ccggccagat gattaattcc taatttttgt 60

tgacactcta tcattgatag agttatttta ccactcccta tcagtgatag agaaaagtga 120

aatgaatagt tcgacaaaaa tctagaaata attttgttta actttaagaa ggagatatac 180

aaatgattac ccgcaaaagg cgggccagga caatccatag ccgatatcca atcggaattt 240

acgggagcat agtaatgaca gatattgcac agttgcttgg caaagacgcc gacaaccttt 300

tacagcaccg ttgtatgact attccttctg accagcttta tctccccgga catgactacg 360

tagaccgcgt gatgattgac aataatcgcc cgccagcggt gttacgtaat atgcagacgt 420

tgtacaacac tgggcgtctg gctggcacag gatatctttc tattctgccg gttgaccagg 480

gcgttgagca ctctgccgga gcttcatttg ctgctaaccc gctctacttt gacccgaaaa 540

acattgttga actggcgatc gaagcgggct gtaactgtgt ggcatcaact tacggcgtgt 600

tggcgtcggt atcgcggcgc tatgcgcatc gcattccatt cctcgtcaaa cttaatcaca 660

acgagacgct aagttacccg aacacctacg atcaaacgct gtatgccagc gtggagcagg 720

ccttcaacat gggcgcggtg gcggttggtg cgactatcta ttttggttcg gaagagtcac 780

gtcgccagat tgaagaaatt tctgcggctt ttgaacgtgc gcacgagctg ggcatggtga 840

cagtgctgtg ggcctatttg cgtaactccg cctttaagaa agatggcgtt gattaccatg 900

tttccgccga cctgaccggt caggcaaacc atctggcggc gaccataggt gcagatatcg 960

tcaaacaaaa aatggcggaa aataacggcg gctataaagc aattaattac ggttataccg 1020

acgatcgcgt gtacagcaag ttaaccagcg aaaacccgat tgatctggtg cgttatcagt 1080

tagctaactg ctatatgggc cgggccgggt tgataaactc cggcggtgct gcaggcggtg 1140

aaactgacct cagcgatgca gtgcgtactg cggttatcaa caaacgcgct ggcggaatgg 1200

ggctgattct tggacgtaag gcgttcaaga aatcgatggc tgacggcgtg aaactgatta 1260

acgccgtgca ggatgtttat ctcgatagca aaattactat cgcctaagag gatcgagatc 1320

tcgatcccgc gaaattaata cgactcacta taggggaatt gtgagcggat aacaattccc 1380

ctctagaaat aattttgttt aactttaaga aggagatata ccatgggcca tcatcatcat 1440

catcatcatc atcatcacag cagcggccat atcgaaggtc gtcatatggc ggtgaaagaa 1500

gcgaccagcg agaccaagaa gcgtagcggt tacgagatca ttaccctgac cagctggctg 1560

ctgcaacaag aacagaaggg tatcattgac gcggaactga ccatcgttct gagcagcatt 1620

agcatggcgt gcaaacagat cgcgagcctg gtgcaacgtg cgaacattag caacctgacc 1680

ggtacccaag gcgcggttaa catccagggt gaagaccaaa agaaactgga tgttattagc 1740

aacgaggtgt tcagcaactg cctgcgtagc agcggtcgta ccggcatcat tgcgagcgag 1800

gaagaggacg tggcggttgc ggtggaagag agctacagcg gtaactatat cgtggttttt 1860

gacccgctgg atggcagcag caacctggat gcggctgtga gcaccggtag catcttcggc 1920

atttacagcc cgaacgacga gagcctgccg gattttggtg acgatagcga cgataacacc 1980

ctgggcaccg aagagcaacg ttgcatcgtt aacgtgtgcc aaccgggtag caacctgctg 2040

gcggcgggct actgcatgta tagcagcagc gttgcgttcg tgctgaccat tggcaagggc 2100

gttttcgtgt ttaccctgga cccgctgtac ggtgaattcg tgctgaccca ggagaacctg 2160

caaatcccga agagcggtga aatttacagc tttaacgagg gcaactataa actgtgggat 2220

gaaaacctga agaaatatat cgacgatctg aaggaaccgg gtccgagcgg taaaccgtac 2280

agcgcgcgtt atatcggtag cctggttggc gacttccacc gtaccctgct gtacggtggc 2340

atttacggtt atccgcgtga taagaaaagc aagaacggca aactgcgtct gctgtatgaa 2400

tgcgcgccga tgagctttat tgttgagcag gcgggtggca aaggtagcga cggccaccag 2460

cgtgtgctgg atatccaacc gaccgaaatt caccagcgtg ttccgctgta cattggtagc 2520

accgaagagg ttgaaaaagt tgaaaagtat ctggcgtaat cgagtctggt aaagaaaccg 2580

ctgctgcgaa atttgaacgc cagcacatgg actcgtctac tagcgcagct taattaacct 2640

aggctgctgc caccgctgag caataactag cataacccct tggggcctct aaacgggtct 2700

tgaggggttt tttgctgaaa ggaggaacta tatccggatt ggcgaatggg acgcgccctg 2760

tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtggacg gccagtgaat tcgagctcgg tacctaccgt 2820

tcgtataatg tatgctatac gaagttatcg agctctagag aatgatcccc tcattaggcc 2880

acacgttcaa gtgcagcgca caccgtggaa acggatgaag gcacgaaccc agttgacata 2940

agcctgttcg gttcgtaaac tgtaatgcaa gtagcgtatg cgctcacgca actggtccag 3000

aaccttgacc gaacgcagcg gtggtaacgg cgcagtggcg gttttcatgg cttgttatga 3060

ctgttttttt gtacagtcta tgcctcgggc atccaagcag caagcgcgtt acgccgtggg 3120

tcgatgtttg atgttatgga gcagcaacga tgttacgcag cagcaacgat gttacgcagc 3180

agggcagtcg ccctaaaaca aagttaggtg gctcaagtat gggcatcatt cgcacatgta 3240

ggctcggccc tgaccaagtc aaatccatgc gggctgctct tgatcttttc ggtcgtgagt 3300

tcggagacgt agccacctac tcccaacatc agccggactc cgattacctc gggaacttgc 3360

tccgtagtaa gacattcatc gcgcttgctg ccttcgacca agaagcggtt gttggcgctc 3420

tcgcggctta cgttctgccc aggtttgagc agccgcgtag tgagatctat atctatgatc 3480

tcgcagtctc cggcgagcac cggaggcagg gcattgccac cgcgctcatc aatctcctca 3540

agcatgaggc caacgcgctt ggtgcttatg tgatctacgt gcaagcagat tacggtgacg 3600

atcccgcagt ggctctctat acaaagttgg gcatacggga agaagtgatg cactttgata 3660

tcgacccaag taccgccacc taacaattcg ttcaagccga gatcgtagaa tttcgacgac 3720

ctgcagccaa gcataacttc gtataatgta tgctatacga acggtaggat cctctagagt 3780

cgacctgcag gc 3792

<210> 20

<211> 5917

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Транспозонная кассета

<400> 20

acaggttggc tgataagtcc ccggtctagc ttgcatgcag attgcagcat tacacgtctt 60

gatttgacgg ctagctcagt cctaggtaca gtgctagcac tgctttgtgg aaggagatag 120

acttatggcg gatccgatgg aatacctcga tgtgtcgttc ggcggcacgt tcgctgcaga 180

cacctacacc acaggtggcg acgaggtggc gaagggcccc gtgaccaagc acggcagcat 240

accgaccaag cttgacggcg gcggcatcac cctcgctggc ggcaccaacg gcgtgacatt 300

cacctcgacc gcgagcttca gcgagagtgg gaaggtgaac aagggattcc gcgccgaaat 360

ggagtaccgt acgacgcaga cgcccagcaa cctcgccaca ttgttctccg ccatgggcaa 420

catcttcgtg cgggcgaacg gcagcaacct cgaatacggc ttctccacga acccttccgg 480

cagtacatgg aacgactaca caaagtccgt gacgctgcct tccaacaatg tgaagcacat 540

catccagctg acatatctgc cgggagccga cggcgctgcc tcgacgttgc agttgtcggt 600

ggatggcgtg gccggcgaga ccgccacctc cgcggccggc gagctcgcgg ccgtcagcga 660

ttccgtcggg aacaagttcg ggatcggcta cgaggtgaac cccgcttccg gcgcggcgag 720

ccgcggtctt gccggtgacg tgttccgcgc gcgtgtcgcc gattcggacg ccccgtggga 780

gattcttgac gcatcccagc tgctgcatgt caatttcaac ggcacgttca gcggcacctc 840

atataccgcg gcgagcggcg agcagatgct gggctcgctg gtgtcgcgct cggccaatcc 900

gtccatctcg aactccgccg tcacgctggg cggcggcacg gccggattcg atttcacgcc 960

cacggacttc accctcggtg acaacgaggc catcacccgc ccgctggtcg cggagctgcg 1020

cttcaccccg acgcagaccg gcgacaacca gaccctgttc ggcgcgggcg gcaacctgtt 1080

cctgcgctac gagtcgaaca agctcgtgtt cggcgcctcc accaagtccg gcgataattg 1140

gaccgaccac aagatcgagt ccgcggccgc cacgggtgcg gagcacgtcg tgtcggtggc 1200

gtacgtgccc aataaggccg gcaccggcgc gaagcttgtc atgcgcgtgg atggcggcga 1260

cgcccagacc aaggacatca ctggtctggc ttacctgaat tcgagcatca agggcaaggt 1320

cggcttcggc aacgacgtgc ataccgacgc gctcagccgc ggcttcgtcg gctcgctgag 1380

cgagatccgc ctggccgaaa cctccgcgaa cttcaccacc aacgaattca agctggtcta 1440

ctctcaggtc agctgcgaca cgtcgggcat caaggaggcg aataccttcg acgtggagcc 1500

cgccgagtgc gaggccgcgc ttaagaccaa gctgtccaag ctgcgtccga ccgaagggca 1560

ggccgactac atcgactggg gtcagatcgg attcctccat tacggcatca acacgtacta 1620

caaccaggag tggggtcacg gtaacgagga tccctcccgc atcaacccga ccggcctcga 1680

caccgaccag tgggcgaagt ccttcgccga cggtggcttc aagatgatca tggtgacggt 1740

caagcaccat gacggtttcg agctgtacga ctcgcggtac aacaccgagc acgactgggc 1800

aaacaccgcc gtcgccaagc gcacggggga gaaggacctg ttccgcaaga ttgtcgcctc 1860

ggcgaagaaa tacggcctga aggtcggcat ctactattcg ccggccgatt cctacatgga 1920

gaggaagggc gtctggggca acaactccgc acgcgtcgag cgcacgatcc ccacgctggt 1980

ggagaacgac gaccgcgccg gcaaggtggc ttccggcaaa ctgcccacgt tcaagtacaa 2040

ggccacggat tacggcgcct acatgctcaa ccagctctat gagctgctga ctgagtacgg 2100

cgacatctcc gaggtctggt tcgacggtgc ccaaggcaac accgcaggca ctgagcatta 2160

cgactatggc gtgttctacg agatgatccg ccggcttcag ccccaggcaa ttcaggccaa 2220

cgccgcatac gatgcccgat gggtgggcaa cgaggacggc tgggcccgtc agaccgagtg 2280

gagcccgcag gcggcataca acgacggcgt ggacaaggtg tcgctcaagc ctggccagat 2340

ggcccccgac ggtaagcttg gcagcatgtc gagcgtgctg tccgagatcc gcagcggcgc 2400

cgccaaccag ctgcactggt atccggccga agtcgacgcc aagaaccggc ccggatggtt 2460

ctaccgtgcc agccaatcgc cggcgtccgt agccgaagtc gtgaagtact acgagcagtc 2520

cacgggacgc aactcgcagt atctgctgaa cgtcccaccg tccgataccg gcaagctcgc 2580

cgatgcggat gccgcgggac ttaaggggct gggcgaggag ctcgcccgac gctacggcac 2640

cgatcttgcc ctgggcaaga gcgcgaccgt cgccgcgtcc gcgaacgaca ctgcggtagc 2700

ggccccgaag ctgaccgacg gttcgaagct ctcctccgac aaggccgtgg gcaatacgcc 2760

gacgtacacc atcgatctgg gcagcactgt cgccgtggat gcagtgaaga tctccgagga 2820

cgtgcgcaat gccggccagc agatcgaaag cgccactctg cagggacgag tcaatggaac 2880

atggacgaat ctggcgacta tgacgacggt cgggcagcag cgcgaccttc gcttcacgtc 2940

ccagaacatc gatgccatcc gtctggtggt caactcctcc cgcggtccgg tgcgtctgag 3000

ccgtcttgag gtgttccaca ccgaatccga gattcagacc ggcgcccgcg cctactacat 3060

cgatccgacg gcgcagaccg cgggagatgg attcacgaag gacaagccca tgacgtcgat 3120

cgagcagctg cacgatgtga ccgtcgcgcc aggctccgtg atcttcgtca aggcgggcac 3180

cgagctgacc ggggacttcg ccgtcttcgg ctacggcacc aaggacgagc ccatcaccgt 3240

gacgacatac ggcgaaagcg acaaagccac caccgcgagc ttcgacggca tgaccgccgg 3300

gctgacgctg aagcaggcgc tgaaggcgct cggcaaggac gacgccggct gggtcgtggc 3360

cgattccgcc actgcaccgg cctcccgcgt gtatgtcccg caggatgaga tcagcgtgca 3420

cgcccagtcg tcgcagaact ccggcgcaga ggcggcgagg gcgctcgacg gcgactcgtc 3480

gacgagctgg cactcccagt acagcccgac caccgcgtct gctccgcatt gggtgactct 3540

cgatctcggc aaatcgcgtg agaacgtcgc ctacttcgac tacctcgccc gtatcgacgg 3600

caacaataac ggtgccgcca aggattacga ggtgtatgtc tccgacgatc ccaacgattt 3660

tggagcccct gtggcctcgg gcacgttgaa gaacgtcgcc tacacgcagc gcatcaagct 3720

gacccccaag aacggacggt acgtcaagtt cgtcatcaag accgattatt ccggatcgaa 3780

cttcggctcc gcggcggaaa tgaatgtcga gttgctgccc acggccgtag aggaggacaa 3840

ggtcgccacc ccgcagaagc cgacagtgga cgatgatgcc gatacataca ccatccccga 3900

catcgaggga gtcgtgtaca aggtcgacgg caaggtgttg gccgctggtt ccgtagtgaa 3960

cgtgggcgat gaggacgtga ccgtcacggt caccgccgag cccgccgacg gataccgctt 4020

cccggatggt gtgacgtccc cagtcacgta tgagctgacg ttcaccaaga agggtggcga 4080

gaagcctccg accgaagtca acaaggacaa gctgcacgcc acgatcacca aggctcaggc 4140

gatcgaccgt tccgcctata cggacgagtc gctcaaggtg cttgatgaca agctcgccgc 4200

agcgctcaag gtctatgacg atgacaaggt gagccaggat gatgtcgatg ccgccgaggc 4260

ggctctgtct gcggcgatcg acgcgctgaa gaccaagccg acgacccccg gcggtgaagg 4320

tgagaagcct ggtgaaggtg aaaagcccgg tgacggcaac aagcccggtg acggcaagaa 4380

gcccggcgac gtgatcgcaa agaccggcgc ctccacaatg taactagcat aaccccttgg 4440

ggcctctaaa cgggtcttga ggggtttttt gctgaaacca atttgcctgg cggcagtagc 4500

gcggtggtcc cacctgaccc catgccgaac tcagaagtga aacgccgtag cgccgatggt 4560

agtgtggggt ctccccatgc gagagtaggg aactgccagg catcaaataa aacgaaaggc 4620

tcagtcgaaa gactgggcct ttcgggatcc aggccggcct gttaacgaat taatcttccg 4680

cggcggtatc gataagcttg atatcgaatt ccgaagttcc tattctctag acgccattca 4740

ggctgcgcaa ctgttgggaa gggcgatcgg tgcgggcctc ttcgctatta cgccagctgg 4800

cgaaaggggg atgtgctgca aggcgattaa gttgggtaac gccagggttt tcccagtcac 4860

gacgttgtaa aacgacggcc agtgaattcg agctcggtac ctaccgttcg tataatgtat 4920

gctatacgaa gttatcgagc tctagagaat gatcccctca ttaggccaca cgttcaagtg 4980

cagcgcacac cgtggaaacg gatgaaggca cgaacccagt tgacataagc ctgttcggtt 5040

cgtaaactgt aatgcaagta gcgtatgcgc tcacgcaact ggtccagaac cttgaccgaa 5100

cgcagcggtg gtaacggcgc agtggcggtt ttcatggctt gttatgactg tttttttgta 5160

cagtctatgc ctcgggcatc caagcagcaa gcgcgttacg ccgtgggtcg atgtttgatg 5220

ttatggagca gcaacgatgt tacgcagcag caacgatgtt acgcagcagg gcagtcgccc 5280

taaaacaaag ttaggtggct caagtatggg catcattcgc acatgtaggc tcggccctga 5340

ccaagtcaaa tccatgcggg ctgctcttga tcttttcggt cgtgagttcg gagacgtagc 5400

cacctactcc caacatcagc cggactccga ttacctcggg aacttgctcc gtagtaagac 5460

attcatcgcg cttgctgcct tcgaccaaga agcggttgtt ggcgctctcg cggcttacgt 5520

tctgcccaga tttgagcagc cgcgtagtga gatctatatc tatgatctcg cagtctccgg 5580

cgagcaccgg aggcagggca ttgccaccgc gctcatcaat ctcctcaagc atgaggccaa 5640

cgcgcttggt gcttatgtga tctacgtgca agcagattac ggtgacgatc ccgcagtggc 5700

tctctataca aagttgggca tacgggaaga agtgatgcac tttgatatcg acccaagtac 5760

cgccacctaa caattcgttc aagccgagat cgtagaattt cgacgacctg cagccaagca 5820

taacttcgta taatgtatgc tatacgaacg gtaggatcct ctagagtcga ccaggtggca 5880

cttttcgggc agaccgggga cttatcagcc aacctgt 5917

<---

Изобретение относится к получению олигосахаридов. Предложенный способ получения 2'-фукозиллактозы с использованием генетически сконструированной клетки Escherichia coli включает предоставление генетически сконструированной клетки Escherichia coli, которая продуцирует 2'-фукозиллактозу. Причем клетка Escherichia coli генетически сконструирована для экспрессии по меньшей мере одной гетерологичной α-1,3-фукозидазы, осуществляющей внутриклеточную деградацию 3-фукозиллактозы и 2'3-дифукозиллактозы, которые образуются в процессе внутриклеточного биосинтеза 2'-фукозиллактозы. При этом клетка Escherichia coli повторно использует продукты деградации – лактозу и фукозу, полученные в результате ферментативной активности указанной α-1,3-фукозидазы, для продуцирования 2'-фукозиллактозы, причем генетически сконструированная клетка Escherichia coli содержит бифункциональную L-фукокиназо/L-фукозо-1-фосфатгуанилил-трансферазу для сохранения фукозы для продуцирования 2'-фукозиллактозы. Осуществляют культивирование генетически сконструированной клетки Escherichia coli в условиях и в среде, являющихся пермиссивными в отношении продуцирования 2'-фукозиллактозы, с получением, таким образом, 2'-фукозиллактозы и возможно выделение 2'-фукозиллактозы. Также предложена генетически сконструированная клетка Escherichia coli для получения 2'-фукозиллактозы и ее применение для получения 2'-фукозиллактозы. Изобретение направлено на получение 2'-фукозиллактозы с меньшим количеством нецелевых побочных продуктов. 3 н. и 5 з.п. ф-лы, 1 ил., 2 табл., 4 пр.

1. Способ получения 2'-фукозиллактозы с использованием генетически сконструированной клетки Escherichia coli, который включает следующие стадии:

(i) предоставление генетически сконструированной клетки Escherichia coli, которая продуцирует 2'-фукозиллактозу, причем клетка Escherichia coli генетически сконструирована для экспрессии по меньшей мере одной гетерологичной α-1,3-фукозидазы, осуществляющей внутриклеточную деградацию 3-фукозиллактозы и 2'3-дифукозиллактозы, которые образуются в процессе внутриклеточного биосинтеза 2'-фукозиллактозы, и при этом клетка Escherichia coli повторно использует продукты деградации – лактозу и фукозу, полученные в результате ферментативной активности указанной α-1,3-фукозидазы, для продуцирования 2'-фукозиллактозы, причем генетически сконструированная клетка Escherichia coli содержит бифункциональную L-фукокиназо/L-фукозо-1-фосфатгуанилил-трансферазу для сохранения фукозы для продуцирования 2'-фукозиллактозы;

(ii) культивирование генетически сконструированной клетки Escherichia coli в условиях и в среде, являющихся пермиссивными в отношении продуцирования 2'-фукозиллактозы, с получением, таким образом, 2'-фукозиллактозы; и

(iii) возможно выделение 2'-фукозиллактозы.

2. Генетически сконструированная клетка Escherichia coli для получения 2'-фукозиллактозы, где клетка Escherichia coli:

a) внутриклеточно продуцирует 2'-фукозиллактозу;

b) генетически сконструирована для экспрессии по меньшей мере одной гетерологичной α-1,3-фукозидазы, которая осуществляет внутриклеточную деградацию 3-фукозиллактозы и 2'3-дифукозиллактозы, которые образуются в процессе внутриклеточного биосинтеза 2'-фукозиллактозы;

c) генетически сконструирована с содержанием бифункциональной L-фукокиназо/L-фукозо-1-фосфатгуанилил-трансферазы для сохранения свободной фукозы для продуцирования 2'-фукозиллактозы; и

d) повторно использует продукты деградации – лактозу и фукозу, полученные в результате ферментативной активности указанной α-1,3-фукозидазы, для продуцирования 2'-фукозиллактозы.

3. Способ по п. 1 или генетически сконструированная клетка Escherichia coli по п. 2, где генетически сконструированная клетка Escherichia coli генетически сконструирована для экспрессии гетерологичной гликозилтрансферазы, предпочтительно гликозилтрансферазы, выбранной из группы, состоящей из фукозилтрансфераз, сиалилтрансфераз, галактозилтрансфераз, N-ацетил-глюкозаминилтрансфераз и глюкозилтрансфераз.

4. Способ по любому из пп. 1 и 3 или генетически сконструированная клетка Escherichia coli по любому из пп. 2, 3, где генетически сконструированная клетка Escherichia coli генетически сконструирована для экспрессии гетерологичной α-1,2-фукозилтрансферазы и гетерологичной α-1,3-фукозидазы.

5. Способ по любому из пп. 1 и 3 или генетически сконструированная клетка Escherichia coli по любому из пп. 2, 3, где генетически сконструированная клетка Escherichia coli генетически сконструирована для экспрессии α-1,2-фукозилтрансферазы гена 2-фукозилтрансферазы wbgL от E. coli:O126.

6. Способ или генетически сконструированная клетка Escherichia coli по любому из пп. 4 или 5, где генетически сконструированная клетка Escherichia coli генетически сконструирована для экспрессии α-1,3-фукозидазы AfcB из Bifidobacterium bifidum.

7. Способ по любому из пп. 1, 3-6 или генетически сконструированная клетка Escherichia coli по любому из пп. 2-6, где генетически сконструированная клетка Escherichia coli генетически сконструирована с содержанием гена fkp, кодирующего бифункциональную L-фукокиназо/L-фукозо-1-фосфатгуанилилтрансферазу, предпочтительно кодирующего бифункциональную L-фукокиназо/L-фукозо-1-фосфатгуанилилтрансферазу Bacteroides fragilis.

8. Применение генетически сконструированной клетки Escherichia coli по любому из пп. 2-7 для получения 2'-фукозиллактозы.

название	год	авторы	номер документа
ФЕРМЕНТАТИВНОЕ ПОЛУЧЕНИЕ СИАЛИЛИРОВАННЫХ САХАРИДОВ	2019	Йенневайн, Штефан Вартенберг, Дирк	RU2819876C2
СИАЛИЛТРАНСФЕРАЗЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В ПОЛУЧЕНИИ СИАЛИРОВАННЫХ ОЛИГОСАХАРИДОВ	2018	Йенневайн, Штефан Вартенберг, Дирк	RU2822039C2
АBC-ТРАНСПОРТЕРЫ ДЛЯ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОГО ПРОИЗВОДСТВА РЕБАУДИОЗИДОВ	2020	Вичманн, Гейл A. Лунд, Шон Лерман, Джошуа Цзян, Ханьсяо Сюн, И	RU2795855C2
КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ КУРОНЫ, И ПУТИ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ	2018	Кахведжан, Авак Вайнштейн, Эрика Габриэль Плуджис, Николас Маккартни Лебо, Кевин Джеймс Диас, Фернандо Мартин Навандар, Дхананджай Маниклал	RU2822800C2
СПОСОБ СНИЖЕНИЯ ОШИБОЧНОГО ВКЛЮЧЕНИЯ НЕКАНОНИЧЕСКИХ АМИНОКИСЛОТ С РАЗВЕТВЛЕННОЙ ЦЕПЬЮ	2019	Хауптманн, Петер Корколес Гарсия, Анхель Латтеманн, Клаус Тобиас Матцен, Арне Нойбауэр, Петер	RU2816654C2
РЕКОМБИНАНТНОЕ ПОЛУЧЕНИЕ СТЕВИОЛ-ГЛИКОЗИДОВ	2014	Мао, Гохун Юй, Сяодань	RU2741103C2
Рекомбинантный микроорганизм для получения L-глутаминовой кислоты и способ получения L-глутаминовой кислоты с его использованием	2021	Квон Нара Сон Гухён Ли Джин Нам Бон Хён-Чжу Со Чан Иль Ли А Рым	RU2817194C1
ГЕНЕТИЧЕСКИ СКОНСТРУИРОВАННЫЕ КЛЕТКИ, ЧУВСТВИТЕЛЬНЫЕ К КЛОСТРИДИАЛЬНЫМ НЕЙРОТОКСИНАМ	2020	Ойлер, Джордж Э. Гертц, Барри	RU2824389C2
Новый вариант белка и способ получения L-лизина с его применением	2021	Чан Джин Сук Ли Хан Хён Ким Хе Ми Пак Сочжун Ким Бён Су	RU2793405C1
Выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует слитый белок на основе FVIII-BDD и гетерологичного сигнального пептида, и ее применение	2022	Перепелкина Мария Павловна Власова Елена Вениаминовна Фомина Анастасия Владимировна Гершович Павел Михайлович Маркова Виталия Александровна Морозов Дмитрий Валентинович	RU2818229C2

EP 2845905 A1, 11.03.2015
EP 3131912 A1, 22.02.2017
JP 8140691 A, 04.06.1996
ПРОДУКТЫ ПИТАНИЯ, СОДЕРЖАЩИЕ ОЛИГОСАХАРИДЫ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО МОЛОКА, И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ	2012	Брассар Доминик Декань Дьюла Эрдманн Питер Шварц Андреа Шпренгер Норберт	RU2591123C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЛИКОЗИДОВ АКРИЛАТНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПОЛИСАХАРИДОВ И ГЛИКОЗИДАЗ ИЛИ ГЛИКОЗИЛТРАНСФЕРАЗ	2011	Келлер Харальд Лоос Катя Клоостерман Воутер	RU2570556C2

ПРИМЕНЕНИЕ ГЛИКОЗИДАЗ В ПОЛУЧЕНИИ ОЛИГОСАХАРИДОВ Российский патент 2023 года по МПК C12P19/00 C12N1/21

Описание патента на изобретение RU2810730C2

Похожие патенты RU2810730C2

Иллюстрации к изобретению RU 2 810 730 C2

Реферат патента 2023 года ПРИМЕНЕНИЕ ГЛИКОЗИДАЗ В ПОЛУЧЕНИИ ОЛИГОСАХАРИДОВ

Формула изобретения RU 2 810 730 C2

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2023 года RU2810730C2

RU 2 810 730 C2