Включение перечня последовательностей посредством ссылки

Настоящая заявка подается с перечнем последовательностей в электронной форме. Полное содержание перечня последовательностей настоящим включено в данный документ посредством ссылки.

Уровень техники

У пациентов с коагулопатией, таких как люди с гемофилией A и B, функция различных этапов коагуляционного каскада становится нарушенной, например, из-за отсутствия или недостаточного наличия функционального фактора свертывания крови. Такое нарушение функции одной части коагуляционного каскада приводит к недостаточному свертыванию крови и потенциально опасному для жизни кровотечению или повреждению внутренних органов, таких как суставы.

Дефицит фактора свертывания крови VIII (FVIII), обычно называемый гемофилией А, представляет собой врожденное нарушение свертываемости крови, поражающее примерно 420000 человек во всем мире, из которых около 105000 в настоящее время имеют поставленный диагноз.

Пациенты с гемофилией А могут получать заместительную терапию фактором свертывания крови, таким как экзогенный FVIII. Традиционное лечение состоит из заместительной терапии, предоставляемой в качестве профилактики или при необходимости для лечения эпизодов кровотечения. До недавнего времени профилактическим лечением пациента с тяжелой гемофилией А было введение не более трех внутривенных инъекций в неделю или полученного из плазмы крови FVIII, или рекомбинантного FVIII, или его вариантов длительного действия.

Однако у таких пациентов существует риск развития нейтрализующих антител, так называемых ингибиторов, к таким экзогенным факторам, что делает ранее эффективную терапию неэффективной. Гемофилия А у пациентов с наличием ингибиторов представляет собой неограничивающий пример коагулопатии, которая является частично врожденной и частично приобретенной. Пациентов, у которых развились ингибиторы FVIII, нельзя лечить с помощью традиционной заместительной терапии. Экзогенные факторы свертывания крови можно вводить только внутривенно, что создает значительные неудобства и дискомфорт для пациентов. Например, младенцам и детям младшего возраста может потребоваться введение внутривенных катетеров в грудную вену хирургическим путем, чтобы гарантировать доступ в вену. Это приводит к большому риску развития у них бактериальных инфекций.

У индивидуума с кровотечением коагуляция инициируется образованием комплекса тканевой фактор/фактор VIIa (TF/FVIIa), когда внесосудистый TF подвергается воздействию активированного FVII (FVIIa) в крови. Образование комплекса TF/FVIIa приводит к активации фактора свертывания крови X (FX) до активированного фактора свертывания крови Xa (FXa), который вместе с активированным фактором свертывания крови V (FVa) приводит к образованию ограниченного количества тромбина, который, в свою очередь, активирует тромбоциты в крови. Активированные тромбоциты поддерживают сборку теназного комплекса, состоящего из активированного фактора VIII (FVIIIa) и активированного фактора свертывания крови IX (FIXa). Теназный комплекс является очень эффективным катализатором активации FX, и FXa, образуемый на этой второй стадии, служит в качестве активной протеазы в протромбиназном комплексе FVa/FXa, который отвечает за окончательный тромбиновый «взрыв». Тромбин расщепляет фибриноген с образованием фибриновых мономеров, которые полимеризуются с образованием фибриновой сети, герметизирующей протекающий сосуд и останавливающей кровотечение. Быстрый и обширный тромбиновый «взрыв» является необходимым условием для образования твердого и стабильного фибринового сгустка.

Недостаточное образование FXa и снижение выработки тромбина, вызванное снижением или отсутствием активности FVIII, является причиной, лежащей в основе геморрагического диатеза у пациентов с гемофилией А.

Как уже упоминалось, протеолитическое превращение FX в его ферментативно активную форму FXa может быть достигнуто с помощью собственного FX-активирующего комплекса, содержащего FIXa и его кофактор FVIIIa. Связывание кофактора увеличивает ферментативную активность FIXa на приблизительно пять порядков, и, как полагают, это происходит благодаря нескольким механизмам, описанным в Scheiflinger et al. (2008) J Thromb Haemost, 6:315–322. Следует отметить, было обнаружено, что FVIIIa стабилизирует конформацию FIXa, которая обладает повышенной протеолитической активностью в отношении FX (Kolkman JA, Mertens K (2000) Biochemistry, 39:7398–7405, Zögg T, Brandstetter H (2009) Biol Chem, 390:391–400). Основываясь на этом наблюдении и осознавая, что антитела являются универсальными связывающими белками, способными имитировать различные белок-белковые взаимодействия, Scheiflinger et al. выполнили скрининг на агонистические антитела к FIXa, характеризующиеся способностью усиливать активацию FX с помощью FIXa в присутствии фосфолипидной поверхности и кальция, но в отсутствие природного кофактора FVIIIa. В результате скрининга супернатантов от 5280 гибридом обнаружили 88, которые вырабатывают антитела, проявляющие различные степени агонистической активности в отношении FIXa, см. EP1220923 B1 и EP1660536 B1. С точки зрения кинетики активации FX и способности стимулировать образование тромбина в плазме крови человека с дефицитом FVIII в EP1660536 B1 постоянно указывается на антитело 224F3 к FIXa как наиболее эффективное антитело.

В последнее время новое лекарственное средство эмицизумаб (HEMLIBRA^®), также известное как ACE910, было одобрено для подкожного профилактического лечения гемофилии А с наличием ингибиторов против факторов традиционной заместительной терапии или без них. Эмицизумабпредставляет собой гуманизированное биспецифическое моноклональное антитело к FIX(a)/FX(a), разработанное Chugai Pharmaceuticals/Roche Pharmaceuticals для лечения гемофилии A. Эмицизумаб имитирует функцию кофактора FVIII (см. Sampei et al.: (2013) PLoS One, 8, e57479 и WO2012067176), однако у некоторых пациентов развились ингибиторы против эмицизумаба, делающие лечение с помощью этого соединения неэффективным.

Все еще остается множество неудовлетворенных медицинских потребностей у группы лиц с гемофилией, в частности, и у субъектов с типами коагулопатии, в целом, и настоящее изобретение относится к усовершенствованным соединениям, способным заменить FVIII и, таким образом, пригодным для лечения коагулопатии, такой как гемофилия A.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение относится к соединениям, которые служат заменой фактора свертывания крови VIII (FVIII) у пациентов, страдающих коагулопатией, и, в частности, у пациентов, у которых отсутствует функциональный FVIII, таких как пациенты с гемофилией A, включая пациентов с гемофилией A с наличием ингибиторов.

Следовательно, один аспект настоящего изобретения относится к соединениям, способным усиливать выработку FXa и, таким образом, частично или полностью восстанавливать коагуляцию у пациентов, у которых отсутствует функциональный FVIII.

В одном аспекте соединение представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. В одном таком аспекте соединение представляет собой полиспецифическое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, такое как биспецифическое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

В одном конкретном аспекте настоящее изобретение относится к прокоагулянтным антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, которые служат заменой FVIII у пациентов,у которых отсутствует функциональный FVIII, таких как пациенты с гемофилией A.

В одном таком аспекте антитело или его антигенсвязывающий фрагмент способны связывать FIX(a) и увеличивать ферментативную активность FIXa в отношении FX, необязательно также будучи способными связывать FX.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к прокоагулянтному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые способны связывать FIX(a) и FX(a), включая биспецифические прокоагулянтные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые повышают ферментативную активность FIXa в отношении FX.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к прокоагулянтному биспецифическому антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые способны связываться с FIX(a) и FX(a).

Дополнительный аспект настоящего изобретения относится к отдельным компонентным антителам (промежуточным соединениям) или их антигенсвязывающим фрагментам, которые являются частью прокоагулянтного антитела, таким как конкретное антитело к FIX(a) или его антигенсвязывающий фрагмент или конкретное антитело к FX(a) или его антигенсвязывающий фрагмент.

Дополнительный аспект настоящего изобретения относится к изготовлению антител или их антигенсвязывающих фрагментов и их компонентов (промежуточных соединений), раскрытых в данном документе.

Дополнительный аспект настоящего изобретения относится к антителу, которое конкурирует с прокоагулянтным антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, раскрытыми в данном документе, за связывание с FIX(a) и/или FX(a).

Дополнительный аспект настоящего изобретения относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые имеют общие остатки эпитопа или остатки-«горячие точки» эпитопа на FIX(a) и/или FX(a) с прокоагулянтным антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, раскрытыми в данном документе.

Дополнительный аспект настоящего изобретения направлен на прокоагулянтные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, раскрытые в данном документе, для предупреждения и/или лечения коагулопатии, заболевания, сопровождающего коагулопатию, или заболевания, вызванного коагулопатией. В одном аспекте коагулопатия представляет собой гемофилию А с наличием ингибиторов или без них.

Еще один дополнительный аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей прокоагулянтное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, раскрытые в данном документе, составленной для доставки указанного антитела для предупреждения и/или лечения коагулопатии, такой как гемофилия A с наличием ингибиторов или без них, а также к инъекционному устройству с его содержимым.

Дополнительный аспект настоящего изобретения направлен на набор, содержащий (i) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, раскрытые в данном документе, такое как биспецифическое антитело, и (ii) инструкции по применению.

Настоящее изобретение также может обеспечить решение дополнительных задач, которые будут очевидны из раскрытия иллюстративных вариантов осуществления.

Краткое описание графических материалов

На фигуре 1A-D показано выравнивание последовательностей, представляющих вариабельные домены тяжелой и легкой цепей антител IgG к FIX(a) (фиг. 1A и 1B) и к FX(a) (фиг. 1C и 1D), раскрытых в данном документе. Последовательности CDR1, 2 и 3 выделены жирным шрифтом и подчеркнуты в самой верхней последовательности и характерны для остальных последовательностей.

На фигуре 2 показаны результаты теста тромбинообразования (TGT) для биспецифических антител bimAb05-0745, bimAb05-3761, bimAb05-3769, bimAb05-0746, bimAb05-2112, bimAb05-2113, bimAb05-2114 и ACE910 в активированной тканевым фактором обедненной тромбоцитами плазме крови человека при гемофилии А (PPP). Эксперимент выполняли, как описано в примере 16. Точечные и штриховые линии показывают пиковый уровень (нМ) тромбина, наблюдаемый в отсутствие антитела в HA-PPP и нормальной PPP соответственно, и их стандартное отклонение, обозначенное точечными линиями. Профили bimAb05-0745, bimAb05-3761, bimAb05-3769, bimAb05-0746, bimAb05-2112, bimAb05-2113 и bimAb05-2114 обозначены направленными вниз треугольниками, тогда как профиль ACE910 обозначен направленными вверх треугольниками. Результаты представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение на основе по меньшей мере трех независимых экспериментов.

На фигуре 3 показаны результаты теста тромбинообразования (TGT) для биспецифических антител bimAb05-0745, bimAb05-3761, bimAb05-3769, bimAb05-0746, bimAb05-2112, bimAb05-2113, bimAb05-2114 и ACE910 в активированной тканевым фактором обогащенной тромбоцитами плазме крови человека при гемофилии А (PRP). Эксперимент выполняли, как описано в примере 16. Точечные и штриховые линии показывают пиковый уровень (нМ) тромбина, наблюдаемый в отсутствие антитела в HA-PRP и нормальной PRP соответственно, и их стандартное отклонение, обозначенное точечными линиями. Профили bimAb05-0745, bimAb05-3761, bimAb05-3769, bimAb05-0746, bimAb05-2112, bimAb05-2113 и bimAb05-2114 обозначены направленными вниз треугольниками, тогда как профиль ACE910 обозначен направленными вверх треугольниками. Результаты представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение на основе по меньшей мере трех независимых экспериментов.

На фигуре 4A и 4B показаны результаты экспериментов по сортировке антител по группам в системе Octet Fortebio с использованием модифицированного тандемного режима. Вкратце, биотинилированный человеческий FIXa захватывали на наконечниках со стрептавидином. Затем захваченный FIXa насыщали за счет первоначального воздействия первого (1-го) бивалентного антитела к FIXa, за которым следовало второе воздействие эквимолярной смесью первого (1-го) антитела и второго (2-го) бивалентного антитела к FIXa. Показаны ответы связывания для каждой из трех фаз, а также обозначение используемых антител.

На фигуре 5 показаны результаты экспериментов по сортировке антител по группам в системе Octet Fortebio с использованием модифицированного тандемного режима. Вкратце, биотинилированный человеческий FXa захватывали на наконечниках со стрептавидином. Затем захваченный FXa насыщали за счет первоначального воздействия первого (1-го) бивалентного антитела к FXa, за которым следовало второе воздействие эквимолярной смесью первого (1-го) антитела и второго (2-го) бивалентного антитела к FXa. Показаны ответы связывания для каждой из трех фаз, а также обозначение используемых антител.

Краткое описание последовательностей

SEQ ID NO:1 представляет аминокислотную последовательность фактора свертывания крови IX человека.

SEQ ID NO:2 представляет аминокислотную последовательность фактора свертывания крови X человека.

SEQ ID NO:3–1194 и 1202–1249 представляют последовательности вариабельных доменов тяжелой цепи (VH), вариабельных доменов легкой цепи (VL) и определяющих комплементарность областей (CDR) моноклональных антител (mAb) к FIX(a) и к FX(a), описанных в данном документе.

SEQ ID NO:1195 представляет константную область тяжелой цепи IgG4 человека с S228P и усечением C-концевого лизина.

SEQ ID NO:1196 представляет константную область тяжелой цепи IgG4 человека с S228P, F405L, R409K и усечением C-концевого лизина.

SEQ ID NO:1197 представляет константную область легкой каппа-цепи человека.

SEQ ID NO:1198 представляет константную область тяжелой цепи IgG1 человека с F405L и усечением C-концевого лизина.

SEQ ID NO:1199 представляет константную область тяжелой цепи IgG1 человека с K405R и усечением C-концевого лизина.

SEQ ID NO:1200 представляет N-концевую His-метку.

SEQ ID NO:1201 представляет GS-линкер.

Таблицы в примере 6 связывают SEQ ID NO с отдельными (компонентными) антителами к FIX(а) и к FX(а) и биспецифическими антителами по настоящему изобретению.

ОПИСАНИЕ

У субъектов с коагулопатией, таких как люди с гемофилией A, функция коагуляционого каскада становится нарушенной из-за отсутствия или недостаточного наличия функционального FVIII. Такое нарушение функции одной части коагуляционного каскада приводит к недостаточному свертыванию крови и потенциально опасному для жизни кровотечению или повреждению внутренних органов, таких как суставы. Настоящее изобретение относится к соединениям, которые служат заменой фактора свертывания крови VIII (FVIII) у пациентов, страдающих коагулопатией, и, в частности, у пациентов, у которых отсутствует функциональный FVIII, таких как пациенты с гемофилией A, включая пациентов с гемофилией A с наличием ингибиторов. В одном аспекте такое соединение представляет собой антитело.

В частности, авторы настоящего изобретения неожиданно идентифицировали антитела, которые имитируют активность кофактора FVIII с высокой активностью и эффективностью. В одном конкретном аспекте настоящее изобретение относится к прокоагулянтным антителам, которые служат заменой FVIII у пациентов, у которых отсутствует функциональный FVIII, таких как пациенты с гемофилией A. В одном таком аспекте прокоагулянтные антитела связываются с фактором свертывания крови IXa (FIXa) и увеличивают его ферментативную активность в отношении фактора свертывания крови X (FX), необязательно также связывая FX. В одном таком аспекте антитела по настоящему изобретению представляют собой биспецифические антитела, способные связываться с FIX/FIXa и FX.

Дополнительный аспект настоящего изобретения относится к отдельным компонентным антителам (промежуточным соединениям) или их антигенсвязывающим фрагментам, которые являются частью полиспецифического прокоагулянтного антитела, таким как конкретное антитело к FIX(a) или его антигенсвязывающий фрагмент или конкретное антитело к FX(a) или его антигенсвязывающий фрагмент.

Дополнительный аспект настоящего изобретения относится к изготовлению антител или их антигенсвязывающих фрагментов и их компонентов (промежуточных соединений), раскрытых в данном документе.

Дополнительный аспект настоящего изобретения относится к антителу, которое конкурирует с прокоагулянтным антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, раскрытыми в данном документе, за связывание с FIX(a) и/или FX(a).

Дополнительный аспект настоящего изобретения относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые имеют общие остатки эпитопа или остатки-«горячие точки» эпитопа на FIX(a) и/или FX(a) с прокоагулянтным антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, раскрытыми в данном документе.

В одном аспекте антитело представляет собой человеческое или гуманизированное антитело, такое как человеческое или гуманизированное биспецифическое антитело.

Дополнительный аспект настоящего изобретения направлен на прокоагулянтные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, раскрытые в данном документе, для предупреждения и/или лечения коагулопатии, заболевания, сопровождающего коагулопатию, или заболевания, вызванного коагулопатией. В одном аспекте коагулопатия представляет собой гемофилию А с наличием ингибиторов или без них.

Еще один дополнительный аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей прокоагулянтное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, раскрытые в данном документе, составленной для доставки указанного антитела для предупреждения и/или лечения коагулопатии, такой как гемофилия A с наличием ингибиторов или без них, а также к инъекционному устройству с его содержимым.

Дополнительный аспект настоящего изобретения направлен на набор, содержащий (i) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, раскрытые в данном документе, такое как биспецифическое антитело, и (ii) инструкции по применению.

Фактор свертывания крови IX

Фактор свертывания крови IX (FIX) представляет собой витамин К-зависимый фактор свертывания крови со структурным сходством с фактором VII, протромбином, фактором X и С-белком. FIX циркулирует в плазме крови в виде одноцепочечного зимогена (SEQ ID NO:1). Циркулирующая зимогенная форма состоит из 415 аминокислот, разделенных на четыре отдельных домена, включая N-концевой домен, обогащенный γ-карбоксиглутаминовой кислотой (Gla), два EGF-домена и C-концевой домен, представляющий собой трипсиноподобную сериновую протеазу. Активация FIX происходит путем ограниченного протеолиза по Arg145 и Arg180 с высвобождением активационного пептида (остатки 146–180 из SEQ ID NO:1). Таким образом, активированный FIX (FIXa) состоит из остатков 1–145 из SEQ ID NO:1 (легкая цепь) и остатков 181–415 из SEQ ID NO:1 (тяжелая цепь).

Таким образом, циркулирующие молекулы FIX включают зимоген FIX и активированную форму FIX, которые в данном документе в целом обозначаются как FIX и FIXa со ссылкой на SEQ ID NO:1.

Активированный фактор IX обозначается как фактор IXa или FIXa. Термин «FIX (SEQ ID NO:1) и/или его активированная форма (FIXa)» также может обозначаться как «FIX/FIXa» или просто «FIX(a)».

FIXa представляет собой трипсиноподобную сериновую протеазу, которая играет ключевую роль в гемостазе, находясь в составе теназного комплекса, он образует большую часть фактора Xa, необходимого для поддержания надлежащего образования тромбина во время коагуляции.

FIX представлен в данном документе под SEQ ID NO:1, что соответствует аллельной форме Ala148 FIX человека (Anson et al. EMBO J. 1984 3:1053–1060; McGraw et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1985 82:2847–2851; Graham et al. Am. J. Hum. Genet. 1988 42:573–580). В настоящем изобретении подразумевается, что FIX охватывает все природные варианты FIX, такие как вариант T148 (ID P00740 в Uniprot).

Фактор свертывания крови X

FX представляет собой витамин К-зависимый фактор свертывания крови со структурным сходством с фактором VII, протромбином, FIX и С-белком. FX циркулирует в плазме крови в виде двухцепочечного зимогена, включающего остатки 1–139 из SEQ ID NO:2 (легкая цепь) и остатки 143–448 из SEQ ID NO:2 (тяжелая цепь). Зимоген FX человека содержит четыре отдельных домена, содержащие N-концевой домен, обогащенный гамма-карбоксиглутаминовой кислотой (Gla) (остатки 1–45), два домена EGF, EGF1 (остатки 46–82) и EGF2 (остатки 85–125) соответственно, и C-концевой домен, представляющий собой трипсиноподобную сериновую протеазу (остатки 195–448). Активация FX происходит путем ограниченного протеолиза по Arg194, что приводит к высвобождению активационного пептида (остатки 143–194). Таким образом, активированный FX (FXa) состоит из остатков 1–139 из SEQ ID NO:2 (легкая цепь) и остатков 195–448 из SEQ ID NO:2 (активированная тяжелая цепь). Таким образом, циркулирующие молекулы фактора X включают зимоген FX и активированную форму FX, которые в данном документе обозначаются как FX и FXa соответственно, со ссылкой на SEQ ID NO:2. В настоящем изобретении подразумевается, что FX охватывает все природные варианты FX. Термин «FX (SEQ ID NO:2) и/или его активированная форма (FXa)» также может обозначаться как «FX/FXa» или «FX(a)».

Антитела

Термин «антитело» в данном документе относится к белку, полученному из последовательности иммуноглобулина, который способен связываться с антигеном или его частью. Термин антитело включает без ограничения полноразмерные антитела любого класса (или изотипа), то есть IgA, IgD, IgE, IgG, IgM и/или IgY. Термин антитело включает без ограничения антитела, которые являются бивалентными, такие как биспецифические антитела.

Природные полноразмерные антитела содержат по меньшей мере четыре полипептидные цепи: две тяжелые цепи (HC) и две легкие цепи (LC), которые соединены дисульфидными связями. В некоторых случаях природные антитела содержат менее четырех цепей, как в случае IgNAR, обнаруженных у Chondrichthyes. Особый интерес для получения фармацевтических препаратов представляет один класс иммуноглобулинов, IgG. У людей класс IgG можно разделить на четыре подкласса IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 на основании последовательности их константных областей тяжелой цепи. Легкие цепи можно разделить на два типа: каппа- и лямбда-цепи, на основании различий в составе их последовательностей. Молекулы IgG состоят из двух тяжелых цепей, связанных между собой двумя или более дисульфидными связями, и двух легких цепей, каждая из которых прикреплена к тяжелой цепи за счет дисульфидной связи. Тяжелая цепь IgG может содержать вариабельный домен тяжелой цепи (V_H) и не более трех константных доменов тяжелой цепи (C_H): C_H1, C_H2 и C_H3. Легкая цепь может содержать вариабельный домен легкой цепи (V_L) и константный домен легкой цепи (C_L). Области V_H и V_L можно дополнительно подразделить на области гипервариабельности, называемые определяющими комплементарность областями (CDR) или гипервариабельными областями (HvR), чередующиеся с более консервативными областями, называемыми каркасными областями (FR). Домены V_H и V_L обычно состоят из трех CDR и четырех FR, расположенных от амино-конца к карбокси-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные домены тяжелой и легкой цепей, содержащие гипервариабельные области (CDR), образуют структуру, которая способна взаимодействовать с антигеном, в то время как константная область антитела может опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, в том числе, без ограничения, с различными клетками иммунной системы (эффекторными клетками), Fc-рецепторами и первым компонентом, C1q, из комплекса C1 классической системы комплемента.

Антитела по настоящему изобретению могут быть моноклональными антителами (mAb) в том смысле, что они представляют собой набор уникальных последовательностей вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей, экспрессируемый одной B-клеткой или клональной популяцией B-клеток. Антитела по настоящему изобретению можно получать и очищать с использованием различных способов, которые известны специалисту в данной области. Например, антитела можно получать из клеток гибридомы. Антитела можно получать путем размножения B-клеток. Антитела или их фрагменты можно рекомбинантным образом экспрессировать в системах экспрессии на основе клеток млекопитающих или микроорганизмов или за счет трансляции in vitro. Антитела или их фрагменты также можно рекомбинантным образом экспрессировать в виде молекул, связанных с поверхностью клетки, например, с помощью фагового дисплея, бактериального дисплея, дрожжевого дисплея, дисплея на клетках млекопитающих или рибосомального или mRNA-дисплея.

Антитела по настоящему изобретению могут быть выделенными. Термин «выделенное антитело» относится к антителу, которое было отделено от и/или извлечено из другого(-их) компонента(-ов) в среде, в которой оно было произведено, и/или которое было очищено от смеси компонентов, присутствующих в среде, в которой оно было произведено.

В контексте настоящего изобретения могут быть подходящими определенные антигенсвязывающие фрагменты антител, поскольку было показано, что антигенсвязывающую функцию антитела могут выполнять фрагменты полноразмерного антитела. Термин «антигенсвязывающий фрагмент» антитела относится к одному или нескольким фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном, таким как FIX/FIXa, FX/FXa или другая целевая молекула, описанные в данном документе, или распознавать его. Примеры антигенсвязывающих фрагментов включают (без ограничения) Fab, Fab', Fab₂, Fab'₂, Fv (как правило, комбинация доменов V_L и V_H из одного плеча антитела), одноцепочечный Fv (scFv); см., например, Bird et al. Science 1988; 242:423–426 и Huston et al. PNAS 1988; 85:5879–5883), dsFv, Fd (как правило, домен V_H и C_H1), одновалентные молекулы, содержащие как один домен V_H, так и один домен V_L; минитела, диатела, триотела, тетратела и каппа-тела (см., например, Ill et al (1997) Protein Eng 10: 949–57); а также один или более выделенных CDR или функциональный паратоп, где выделенные CDR или антигенсвязывающие остатки или полипептиды могут быть ассоциированы или связаны вместе с образованием функционального фрагмента антитела. Эти фрагменты антител можно получать с использованием традиционных методик, известных специалистам в данной области, и фрагменты можно подвергать скринингу в отношении их применимости таким же образом, как и интактные антитела.

«Fab-фрагменты» антитела, включая «Fab»- и «Fab’₂»-фрагменты, можно получать из антитела путем расщепления тяжелой цепи в шарнирной области на N-концевой или C-концевой стороне соответственно шарнирных остатков цистеина, соединяющих тяжелые цепи антитела. «Fab»-фрагмент включает вариабельный и константный домены легкой цепи и вариабельный домен и домен C_H1 тяжелой цепи. «Fab'₂»-фрагменты содержат пару «Fab'»-фрагментов, которые обычно ковалентно связаны своими шарнирными остатками цистеинов. Fab' обычно получают из Fab'₂-фрагмента путем расщепления шарнирных дисульфидных связей, соединяющих тяжелые цепи в Fab'₂. Из уровня техники также известны другие химические связи, фрагментов антител, отличные от дисульфидных связей. Fab-фрагмент сохраняет способность родительского антитела связываться со своим антигеном, потенциально с более низкой аффинностью. Fab'₂-фрагменты способны к бивалентному связыванию, тогда как фрагменты Fab и Fab’ могут связываться только моновалентно. Обычно у Fab-фрагментов отсутствуют константные домены C_H2 и C_H3, т. e. Fc-часть, где могло бы происходить взаимодействие с Fc-рецепторами и C1q. Таким образом, Fab-фрагменты в целом лишены эффекторных функций. Fab-фрагменты можно получить с помощью способов, известных из уровня техники, или за счет ферментативного расщепления антитела, например, с использованием папаина для получения Fab или пепсина для получения Fab'₂, или Fab-фрагменты, в том числе Fab, Fab', Fab'₂ можно получить рекомбинантным образом с использованием методик, которые хорошо известны специалисту в данной области.

«Fv»-фрагмент (вариабельный фрагмент) представляет собой фрагмент антитела, который содержит полный участок распознавания и связывания антигена и обычно содержит один вариабельный домен тяжелой и один вариабельный домен легкой цепи в ассоциации, которая может быть ковалентной по природе, например, в виде одноцепочечного фрагмента из вариабельных доменов (scFv). Именно в этой конфигурации три гипервариабельных области каждого вариабельного домена взаимодействуют с образованием антигенсвязывающего участка на поверхности димера V_H-V_L. В совокупности шесть гипервариабельных областей или их подмножество придают антителу специфичность связывания антигена.

«Одноцепочечный Fv» или «scFv»-антитело содержат домены V_H и V_L антитела, где эти домены присутствуют в одной полипептидной цепи. Обычно полипептид Fv дополнительно содержит полипептидный линкер между доменами V_H и V_L, который позволяет scFv формировать структуру, необходимую для связывания антигена. Обзор scFv см. в Pluckthun, 1994, в: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269–315.

«Одноцепочечный Fab» или «scFab»-антитело содержит домены V_H, C_H1, V_L и C_L антитела, где эти домены присутствуют в одной полипептидной цепи. Обычно полипептид Fab дополнительно содержит полипептидный линкер между доменами V_H и C_L или V_L и C_H1, который позволяет scFab формировать структуру, необходимую для связывания антигена (Koerber et al. (2015) J Mol Biol. 427:576–86).

Термин «диатела» относится к небольшим фрагментам антител с двумя антигенсвязывающими участками, причем фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи (V_H), соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (V_L) в одной и той же полипептидной цепи (V_H и V_L). При использовании линкера, который является слишком коротким, чтобы обеспечить спаривание между двумя вариабельными доменами на одной и той же цепи, вариабельные домены вынуждены образовывать пару с комплементарными доменами другой цепи, создавая два антигенсвязывающих участка.

Выражение «линейные антитела» относится к антителам, описываемым в Zapata et al. (1995) Protein Eng. 8: 1057–1062. Вкратце, эти антитела содержат пару тандемных сегментов Fd (V_H-C_H1-V_H-C_H1), которые вместе с комплементарными полипептидами легкой цепи образуют пару антигенсвязывающих областей. Линейные антитела могут быть биспецифическими или моноспецифичными.

Фрагменты антител можно получать с использованием традиционных методик рекомбинантной или белковой инженерии, и фрагменты можно подвергать скринингу в отношении связывания с FIX и его активированной формой, FX или другим функциональным элементом таким же образом, как и интактные антитела.

Фрагменты антител по настоящему изобретению можно получать путем усечения, например, за счет удаления одной или нескольких аминокислот с N- и/или С-концов полипептида. Фрагменты также можно получать за счет одной или нескольких внутренних делеций.

Антитело по настоящему изобретению может представлять собой или может содержать фрагмент антитела или вариант любого из антител, раскрытых в данном документе. Антитело по настоящему изобретению может представлять собой или может содержать антигенсвязывающую часть одного из этих антител или их вариантов. Например, антитело по настоящему изобретению может представлять собой Fab-фрагмент одного из этих антител или его вариантов или это может быть одноцепочечное антитело, полученное из одного из этих антител или его варианта. Также антитело по настоящему изобретению может представлять собой комбинацию полноразмерного антитела и его фрагмента.

Используемый в данном документе термин «одноплечее» относится к моновалентному антителу конкретного типа, состоящему из тяжелой цепи антитела, усеченной тяжелой цепи, у которой отсутствует область Fab, и одной легкой цепи.

Используемый в данном документе термин «моноспецифическое» антитело относится к антителу, которое способно связываться с одним конкретным эпитопом (включая без ограничения бивалентные антитела).

Используемый в данном документе термин «биспецифическое» антитело относится к антителу, которое способно связываться с двумя разными антигенами или двумя разными эпитопами на одном и том же антигене.

Используемый в данном документе термин «триспецифическое» антитело относится к антителу, которое способно связываться с тремя разными антигенами, или тремя разными эпитопами на одном и том же антигене, или тремя разными эпитопами, присутствующими на двух разных антигенах.

Используемый в данном документе термин «полиспецифическое» антитело относится к антителу, которое способно связываться с двумя или более разными антигенами или двумя или более разными эпитопами на одном и том же антигене. Таким образом, полиспецифические антитела включают би- и триспецифические антитела.

Биспецифические антитела в формате полноразмерного IgG можно получать за счет слияния двух отдельных гибридом с образованием гибридной квадромы, которая продуцирует смесь антител, включающую фракцию биспецифических гетеродимеризующихся антител (Chelius D. et al.; MAbs. 2010 May-Jun; 2(3): 309–319). Биспецифические гетеродимеризующиеся антитела можно альтернативно получать с использованием рекомбинантных методик. Гетеродимеризацию также можно обеспечивать за счет конструирования поверхности контакта для димеризации в Fc-области, чтобы содействовать гетеродимеризации. Одним из примеров этого являются так называемые мутации «выступ-во-впадину», когда стерически объемные боковые цепи (выступы) вводят в один Fc, совпадающий со стерически небольшими боковыми цепями (впадины) на противоположном Fc, за счет чего создается стерическая комплементарность, способствующая гетеродимеризации. Другими способами конструирования поверхностей контакта на Fc для гетеродимеризации являются электростатическая комплементарность, слияние с доменами гетеродимеризации, отличными от IgG, или использование природного явления обмена Fab-плечами в IgG4 человека для управления гетеродимеризацией. Примеры гетеродимеризованных биспецифических антител хорошо описаны в литературе, например (Klein C, et al.; MAbs. 2012 Nov-Dec; 4(6): 653–663). Особое внимание следует уделить легким цепям в гетеродимерных антителах. Правильного спаривания LC и HC можно достичь за счет применения общей легкой цепи. Опять же, конструирование поверхности контакта LC/HC можно использовать для содействия гетеродимеризации или конструирования перекреста легких цепей, как в CrossMabs. Повторную сборку антител in vitro в слегка восстанавливающих условиях из двух отдельных IgG, содержащих соответствующие мутации, также можно использовать для получения биспецифических антител (например, Labrijn et al., PNAS, 110, 5145–5150 (2013)). Также сообщается, что природный способ обмена Fab-плечами обеспечивает правильное спаривание легких цепей.

Молекулы на основе полиспецифических антител также можно экспрессировать рекомбинантным образом в виде слитых белков, объединяющих природные модули IgG с образованием полиспецифических и поливалентных производных антител, описанных в литературе. Примерами слитых антител являются DVD-Ig, IgG-scFV, диатела, DART и т. д. В слитые белки можно вводить специфические метки для обнаружения или очистки, фрагменты для удлинения времени полужизни или другие компоненты. Дополнительные, отличные от IgG элементы также можно вводить в слитые белки. Биспецифические полноразмерные антитела, основанные на гетеродимеризации Fc, обычно называют асимметричными IgG, независимо от методологии спаривания LC.

Обычно биспецифические антитела можно получать в различных молекулярных форматах, как описано Brinkmann et al. (Brinkmann et al. The making of bispecific antibodies. Mabs 9, 182–212 (2017)).

Молекулы на основе полиспецифических антител также можно получать путем химической конъюгации или сопряжения отдельных полноразмерных IgG или сопряжения фрагментов IgG с образованием полиспецифических и поливалентных производных антител, описанных в литературе. Примерами являются химически сопряженные Fab-фрагменты, димер IgG и т. д. В конъюгированные белки можно вводить специфические метки для обнаружения или очистки, молекулы для удлинения времени полужизни или другие компоненты. Дополнительные, отличные от IgG полипептиды также можно вводить в слитые белки. Полиспецифические молекулы также можно получать за счет объединения рекомбинантных и химических способов, в том числе описанных выше.

В одном аспекте антитело по настоящему изобретению представляет собой химерное антитело, человеческое антитело или гуманизированное антитело. Такое антитело можно получать с использованием, например, подходящих платформ для дисплея антител или иммунизации или других подходящих платформ или способов, известных из уровня техники. Подразумевается, что используемый в данном документе термин «человеческое антитело» обозначает антитела, имеющие вариабельные домены, в которых по меньшей мере часть каркасной области и/или по меньшей мере часть области CDR получены из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. Например, человеческое антитело может иметь вариабельные домены, в которых как каркасные, так и области CDR получены из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. Кроме того, если антитело содержит константную область, то константная область или ее часть также получены из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. Человеческие антитела по настоящему изобретению могут включать аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями иммуноглобулинов зародышевой линии человека (например, мутации, введенные за счет случайного или сайт-специфического мутагенеза in vitro или за счет соматической мутации in vivo).

Такое человеческое антитело может представлять собой человеческое моноклональное антитело. Такое человеческое моноклональное антитело может продуцироваться гибридомой, которая включает В-клетку, полученную от трансгенного животного, отличного от человека, например, трансгенной мыши, имеющей геном, включающий репертуары генных сегментов тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина человека, слитую с иммортализованной клеткой.

Человеческие антитела можно выделять из библиотек последовательностей, построенных на наборах последовательностей зародышевой линии человека, дополнительно диверсифицированных с помощью введения природного и синтетического разнообразия последовательностей.

Человеческие антитела можно получать за счет иммунизации человеческих лимфоцитов in vitro с последующей трансформацией лимфоцитов с помощью вируса Эпштейна-Барр.

Человеческие антитела можно получать за счет рекомбинантных способов, известных из уровня техники.

Термин «производное человеческого антитела» относится к любой модифицированной форме человеческого антитела, такой как конъюгат антитела и другого средства или антитела.

Используемый в данном документе термин «гуманизированное антитело» относится к человеческому/отличному от человеческого антителу, которое содержит последовательность (области CDR или их части), полученную из иммуноглобулина, отличного от человеческого. Таким образом, гуманизированное антитело представляет собой человеческий иммуноглобулин (реципиентное антитело), в котором остатки из по меньшей мере гипервариабельной области реципиентного антитела заменены остатками из гипервариабельной области антитела вида, отличного от человека (донорское антитело), такого как мышь, крыса, кролик или отличный от человека примат, которое обладает необходимой специфичностью, аффинностью, составом и функциональностью последовательности. В некоторых случаях каркасные (FR) остатки человеческого иммуноглобулина заменяют соответствующими остатками, отличными от человеческих. Примером такой модификации является введение одной или нескольких так называемых обратных мутаций, которые, как правило, представляют собой аминокислотные остатки, полученные из донорского антитела. Гуманизацию антитела можно осуществлять с использованием рекомбинантных методик, известных специалисту в данной области (см., например, Antibody Engineering, Methods in Molecular Biology, vol. 248, edited by Benny K. Lo). Подходящий человеческий реципиентный каркас для вариабельного домена как легкой, так и тяжелой цепи, можно идентифицировать, например, по гомологии последовательности или структуры. В качестве альтернативы можно использовать фиксированные реципиентные каркасы, например, на основании знания структуры, биофизических и биохимических свойств. Реципиентные каркасы можно получать из зародышевой линии или получать из последовательности зрелого антитела. Области CDR от донорского антитела можно переносить за счет прививания CDR. CDR-привитое гуманизированное антитело можно дополнительно оптимизировать, например, в отношении аффинности, функциональности и биофизических свойств, за счет идентификации критически важных положений в каркасе, где повторное введение (обратная мутация) аминокислотного остатка из донорского антитела оказывает благотворное влияние на свойства гуманизированного антитела. В дополнение к обратным мутациям на основе донорских антител гуманизированное антитело можно конструировать за счет введения остатков зародышевой линии в CDR или каркасные области, удаления иммуногенных эпитопов, сайт-направленного мутагенеза, созревания аффинности и т.д.

Более того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, которые не обнаружены ни в реципиентном антителе, ни в донорском антителе. Эти модификации производят для дополнительного улучшения эксплуатационных характеристик антитела. В целом, гуманизированное антитело будет содержать по меньшей мере один, как правило, два вариабельных домена, в которых все или практически все области CDR соответствуют областям иммуноглобулина, отличного от человеческого, и в которых все или практически все остатки FR представляют собой остатки из последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело необязательно также может содержать по меньшей мере часть константной области (Fc) иммуноглобулина, как правило, иммуноглобулина человека.

Термин «производное гуманизированного антитела» относится к любой модифицированной форме гуманизированного антитела, такой как конъюгат антитела и химического средства или конъюгат антитела с другим антителом.

Используемый в данном документе термин «химерное антитело» относится к антителу, содержащему части антител, полученные от двух или более видов. Например, гены, кодирующие такое антитело, содержат гены, кодирующие вариабельные домены, и гены, кодирующие константные домены, происходящие от двух разных видов. Например, гены, кодирующие вариабельные домены мышиного моноклонального антитела, можно присоединять к генам, кодирующим константные домены антитела человеческого происхождения.

Область кристаллизующегося фрагмента («Fc-область»/«домен Fc») антитела представляет собой C-концевую область антитела, которая содержит шарнир и константные домены C_H2 и C_H3. Домен Fc может взаимодействовать с рецепторами клеточной поверхности, называемыми Fc-рецепторами, а также с некоторыми белками системы комплемента. Fc-область позволяет антителам взаимодействовать с иммунной системой. В одном аспекте настоящего изобретения можно конструировать антитела с включением модификаций в пределах Fc-области, как правило, для изменения одного или нескольких его функциональных свойств, таких как время полужизни в сыворотке крови, связывание комплемента, связывание с Fc-рецептором, стабильность белка и/или антиген-зависимая клеточная цитотоксичность или ее отсутствие, среди прочего. Кроме того, антитело по настоящему изобретению можно химически модифицировать (например, к антителу можно присоединять одну или более химических групп) или модифицировать для изменения его гликозилирования, опять же, для изменения одного или нескольких функциональных свойств антитела. Антитело IgG1 может нести модифицированный домен Fc, содержащий одну или более и, возможно, все из следующих мутаций, которые будут приводить к снижению аффинности к определенным Fc-гамма-рецепторам (L234A, L235E и G237A) и к уменьшению опосредованного C1q связывания комплемента (A330S и P331S) соответственно (нумерация остатков в соответствии с индексом EU). В качестве альтернативы можно использовать другие аминокислотные замены и их комбинации и комбинации с вышеупомянутым, известные из уровня техники, чтобы получить измененное (уменьшенное или увеличенное) связывание с Fc-гамма-рецептором.

Изотип антитела по настоящему изобретению может представлять собой IgG, такой как IgG1, такой как IgG2, такой как IgG4. При необходимости класс антитела можно «переключать» с помощью известных методик. Например, у антитела, которое первоначально было получено в виде молекулы IgM, можно переключить класс на антитело IgG. Методики переключения классов также можно использовать для преобразования одного подкласса IgG в другой, например, из IgG1 в IgG2 или IgG4; из IgG2 в IgG1 или IgG4; или из IgG4 в IgG1 или IgG2. Можно также выполнять конструирование антител с получением химерных по константной области молекул путем объединения областей из разных подклассов IgG.

В одном варианте осуществления шарнирную область антитела модифицируют таким образом, что количество остатков цистеина в шарнирной области изменяется, например увеличивается или уменьшается. Этот подход дополнительно описан, например, в патенте США № 5677425 от Bodmer et al.

Константную область можно модифицировать для стабилизации антитела, например для снижения риска разделения бивалентного антитела на полуантитела. Например, в константной области lgG4 остаток S228 (согласно индексу нумерации EU и S241 в соответствии с Kabat) можно мутировать в остаток пролина (P) для стабилизации образования дисульфидного мостика между тяжелыми цепями в шарнире (см., например, Angal et al. Mol Immunol. 1993; 30:105–8).

Антитела или их фрагменты можно определить с точки зрения их определяющих комплементарность областей (CDR). Используемый в данном документе термин «определяющая комплементарность область» или «гипервариабельная область» относится к областям антитела, в которых расположены аминокислотные остатки, участвующие в связывании антигена. Область гипервариабельности или CDR можно идентифицировать как области с самой высокой вариабельностью при аминокислотном выравнивании вариабельных доменов антител. Для идентификации CDR можно использовать базы данных, такие как база данных Kabat, при этом CDR, например, определяются как содержащие аминокислотные остатки 24–34 (L1), 50–56 (L2) и 89–97 (L3) вариабельного домена легкой цепи и 31–35 (H1), 50–65 (H2) и 95–102 (H3) в вариабельном домене тяжелой цепи (Kabat et al. 1991; Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91–3242). В качестве альтернативы CDR можно определять как остатки из «гипервариабельной петли» (остатки 26–33 (L1), 50–52 (L2) и 91–96 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 26–32 (H1), 53–55 (H2) и 96–101 (H3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 1987; 196:901–917). Как правило, нумерацию аминокислотных остатков в этой области выполняют с помощью способа, описанного в Kabat et al. выше. В данном документе такие фразы, как «положение по Kabat», «остаток по Kabat» и «в соответствии с Kabat», относятся к этой системе нумерации для вариабельных доменов тяжелой цепи или вариабельных доменов легкой цепи. При применении системы нумерации по Kabat, фактическая линейная аминокислотная последовательность пептида может содержать меньшее количество или дополнительные аминокислоты, соответствующие укорочению или вставке в каркас (FR) или CDR вариабельного домена. Например, вариабельный домен тяжелой цепи может включать аминокислотные вставки (остатки 52a, 52b и 52c в соответствии с Kabat) после остатка 52 из CDR H2 и вставленные остатки (например, остатки 82a, 82b и 82c и т. д. в соответствии с Kabat) после остатка 82 в FR тяжелой цепи. Нумерацию остатков по Kabat можно определить для данного антитела путем выравнивания по областям гомологии последовательности антитела со «стандартной» последовательностью, пронумерованной по Kabat.

Термин остатки «каркасной области» или «FR» относятся к тем аминокислотным остаткам в V_H или V_L, которые не находятся в пределах CDR, определенных в данном документе.

Антитело по настоящему изобретению может содержать область CDR из одного или более специфических антител, раскрытых в данном документе.

Термин «прокоагулянтное антитело» относится к антителу, которое усиливает свертывание крови, например, за счет ускорения процесса свертывания крови и/или увеличения ферментативной активности одного или нескольких факторов свертывания крови.

Термин «прокоагулянтная активность» относится к способности соединения, такого как антитело, усиливать свертывание крови, например, за счет ускорения процесса свертывания крови и/или увеличения ферментативной активности одного или нескольких факторов свертывания крови.

Термин «антиген» (Ag) относится к молекулярному объекту, используемому для иммунизации иммунокомпетентного позвоночного животного, чтобы образовалось антитело (Ab), которое распознает Ag. В данном документе Ag определяется более широко и обычно подразумевается, что он включает целевые молекулы, которые специфически распознаются Ab, таким образом, включая фрагменты или имитаторы молекулы, используемой в процессе иммунизации или в другом процессе, например фаговом дисплее, используемом для выработки Ab.

Настоящее изобретение охватывает варианты антител или их антигенсвязывающих фрагментов по настоящему изобретению, которые могут содержать 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотных замен, и/или делеций, и/или вставок в отдельных последовательностях, раскрытых в данном документе.

Варианты с «заменой» предпочтительно включают замену одной или нескольких аминокислот тем же количеством аминокислот. Замены без ограничения могут представлять собой консервативные замены. Например, аминокислота может быть заменена аминокислотой с аналогичными биохимическими свойствами, например, основная аминокислота может быть заменена другой основной аминокислотой (например, лизин аргинином), кислая аминокислота может быть заменена другой кислой аминокислотой (например, глутамат аспартатом), нейтральная аминокислота может быть заменена другой нейтральной аминокислотой (например, треонин серином), заряженная аминокислота может быть заменена другой заряженной аминокислотой (например, глутамат аспартатом), гидрофильная аминокислота кислота может быть заменена другой гидрофильной аминокислотой (например, аспарагин глутамином), гидрофобная аминокислота может быть заменена другой гидрофобной аминокислотой (например, аланин валином), полярная аминокислота может быть заменена другой полярной аминокислотой (например, серин треонином), ароматическая аминокислота может быть заменена другой ароматической аминокислотой (например, фенилаланин триптофаном), а алифатическая аминокислота может быть заменена другой алифатической аминокислотой (например, лейцин изолейцином).

Предпочтительные варианты включают те, в которых вместо аминокислоты, которая появляется в последовательности, содержится структурный аналог аминокислоты.

Эпитоп и паратоп

Используемый в данном документе термин «эпитоп» определяется в контексте молекулярного взаимодействия между «антигенсвязывающим полипептидом», таким как антитело (Ab), и его соответствующим антигеном (Ag). Обычно «эпитоп» относится к области или участку на Ag, с которыми связывается Ab, т. е. к зоне или области физического контакта с Ab. Физический контакт можно определить с использованием различных критериев (например, предела расстояния 2–6 Å, такого как 3 Å, такого как 3,5 Å, такого как 4 Å, такого как 4,5 Å, такого как 5 Å, или доступности для растворителя) для атомов в молекулах Ab и Ag.

FIX/FIXa и FX/FXa могут содержать целый ряд различных эпитопов, которые могут включать без ограничения: (1) линейные пептидные эпитопы, (2) конформационные эпитопы, которые состоят из одной или нескольких несмежных аминокислот, расположенных рядом друг с другом в зрелой конформации FIX/FIXa или FX/FXa; и (3) эпитопы, которые полностью или частично состоят из молекулярных структур, ковалентно присоединенных к FIX/FIXa или FX/FXa, таких как углеводные группы.

Эпитоп для данной пары антитело (Ab)/антиген (Ag) можно описать и охарактеризовать на разных уровнях детализации с использованием различных экспериментальных и вычислительных способов картирования эпитопов. Экспериментальные способы включают мутагенез, рентгеновскую кристаллографию, ядерную магнитно-резонансную (ЯМР) спектроскопию, масс-спектрометрию водородно-дейтериевого обмена (HDX-MS) и различные способы конкурентного связывания; способы, которые известны из уровня техники. Поскольку каждый способ основан на уникальном принципе, описание эпитопа тесно связано со способом, с помощью которого он был определен. Таким образом, в зависимости от используемого способа картирования эпитопа, эпитоп для данной пары Ab/Ag может описываться по-разному.

В контексте полученной с помощью рентгеновских лучей кристаллической структуры, определяемой пространственными координатами комплекса между Ab, например Fab-фрагментом, и его Ag, термин «эпитоп» в данном документе, если иное не указано или не противоречит контексту, конкретно определен как остатки FIX/FIXa или FX/FXa, характеризующиеся наличием тяжелого атома (т. е. отличного от водорода атома) на расстоянии 3,5 Å от тяжелого атома в Ab.

Считается, что эпитопы, описанные на уровне аминокислот, например определенные на основании рентгеновской структуры, являются идентичными, если они содержат одинаковый набор аминокислотных остатков. Считается, что эпитопы перекрываются, если по меньшей мере один аминокислотный остаток является общим для эпитопов. Считается, что эпитопы являются отдельными (уникальными), если отсутствуют аминокислотные остатки, которые являются общими для эпитопов.

Определение термина «паратоп» получено из приведенного выше определения «эпитоп» путем обращения угла зрения. Таким образом, термин «паратоп» относится к зоне или области на антителе или его фрагменте, с которым связывается антиген, т. е. с помощью которых оно вступает в физический контакт с антигеном.

В контексте полученной с помощью рентгеновских лучей кристаллической структуры, определяемой пространственными координатами комплекса между Ab, таким как Fab-фрагмент, и его Ag, термин «паратоп» в данном документе, если иное не указано или не противоречит контексту, конкретно определен как остатки Ab, характеризующиеся наличием тяжелого атома (т. е. отличного от водорода атома) на расстоянии 3,5 Å от тяжелого атома в FIX/FIXa или FX/FXa.

Эпитоп и паратоп для данной пары антитело (Ab)/антиген (Ag) можно идентифицировать обычными способами. Например, общее местоположение эпитопа можно определить путем оценки способности антитела связываться с различными фрагментами или вариантами FIX/FIXa или FX/FXa. Специфические аминокислоты в пределах FIX/FIXa или FX/FXa, которые вступают в контакт с антителом (эпитоп), и специфические аминокислоты в антителе, которые вступают в контакт с FIX/FIXa или FX/FXa (паратоп), также можно определять обычными способами. Например, антитело и целевую молекулу можно объединять и комплекс Ab:Ag можно кристаллизовать. Кристаллическую структуру комплекса можно определять и использовать для идентификации специфических участков взаимодействия между антителом и его мишенью.

Эпитопы на антигене могут содержать один или более остатков-«горячих точек», т. е. остатков, которые особенно важны для взаимодействия с когнатным антителом, и где взаимодействия, опосредованные боковой цепью указанного остатка-«горячей точки», вносят значительный вклад в энергию связывания для взаимодействия антитело/антиген (Peng et al. (2014) PNAS 111, E2656–E2665). Остатки-«горячие точки» можно идентифицировать путем тестирования вариантов антигена (в данном документе FIX/FIXa и FX), в которых отдельные остатки эпитопа были заменены, например аланином, в отношении связывания с когнатным антителом. Если замена эпитопного остатка аланином оказывает сильное влияние на связывание с антителом, то указанный остаток эпитопа считается остатком-«горячей точкой» и, следовательно, имеет особое значение для связывания антитела с антигеном.

Антитела, которые связываются с одним и тем же антигеном, можно характеризовать с точки зрения их способности связываться с их общим антигеном одновременно и можно подвергать «конкурентному связыванию»/«сортировке по группам». В контексте настоящего изобретения термин «сортировка по группам» относится к способу группировки антител, которые связываются с одним и тем же антигеном. «Сортировка по группам» антител может быть основана на конкурентном связывании двух антител с их общим антигеном в анализах на основании стандартных методик.

«Группу» антитела определяют с использованием эталонного антитела. Если второе антитело не способно связываться с антигеном одновременно с эталонным антителом, считается, что второе антитело относится к той же «группе», что и эталонное антитело. В этом случае эталонное и второе антитело конкурентно связывают одну и ту же часть антигена и представляют собой «конкурирующие антитела». Если второе антитело способно связываться с антигеном одновременно с эталонным антителом, считается, что второе антитело относится к отдельной «группе». В этом случае эталонное и второе антитело не связывают конкурентно одну и ту же часть антигена и обозначаются как «неконкурирующие антитела».

«Сортировка по группам» антител не дает прямой информации об эпитопе.

Конкурирующие антитела, т. е. антитела, принадлежащие к одной и той же «группе», могут быть характерны идентичные эпитопы, перекрывающиеся эпитопы или даже отдельные эпитопы. Последнее имеет место, если эталонное антитело, связанное со своим эпитопом на антигене, занимает пространство, необходимое для того, чтобы второе антитело вошло в контакт со своим эпитопом на антигене («стерическое затруднение»). Неконкурирующие антитела обычно характеризуются отдельными эпитопами. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления антитела по настоящему изобретению будут связываться с тем же эпитопом, что и по меньшей мере одно из антител, конкретно раскрытых в данном документе.

Конкурентные анализы для определения того, конкурирует ли антитело за связывание с антителом к FIX/FIXa или антителом к FX/FXa, раскрытыми в данном документе, известны из уровня техники. Иллюстративные конкурентные анализы включают иммунологические анализы (например, анализы ELISA, анализы RIA), анализ с использованием поверхностного плазмонного резонанса (например, с использованием прибора BIAcore™), интерферометрию биослоев (ForteBio®) и проточную цитометрию.

Как правило, конкурентный анализ предусматривает применение антигена, связанного с твердой поверхностью или экспрессированного на клеточной поверхности, тестируемого антитела, связывающего FIX- или FIXa, и эталонного антитела. Эталонное антитело является меченым, а тестируемое антитело немеченым. Конкурентное ингибирование измеряют путем определения количества меченого эталонного антитела, связанного с твердой поверхностью или клетками в присутствии тестируемого антитела. Обычно тестируемое антитело присутствует в избытке (например, при 1-, 5-, 10-, 20-, 100-, 1000-, 10000- или 100000-кратном). Антитела, идентифицированные как конкурировавшие в конкурентном анализе (т.е. конкурирующие антитела), включают антитела, связывающиеся с тем же эпитопом или с перекрывающимися эпитопами, что и эталонное антитело, и антитела, связывающиеся с прилежащим эпитопом, достаточно близким к эпитопу, связанному эталонным антителом, для возникновения стерического затруднения.

В иллюстративном конкурентном анализе эталонное антитело к FIX или к FIXa биотинилируют с использованием коммерчески доступных реагентов. Биотинилированное эталонное антитело смешивают с серийными разведениями тестируемого антитела или немеченого эталонного антитела (контроль самоконкуренции), что приводит к смеси при различных молярных соотношениях (например, 1-, 5-, 10-, 20-, 100-, 1000-, 10000- или 100000-кратном) тестируемого антитела (или немеченого эталонного антитела) и меченого эталонного антитела. Смесь антител добавляют в планшет для ELISA, покрытый полипептидом FIX или FIXa. Затем планшет промывают и в качестве реагента для обнаружения в планшет добавляют пероксидазу хрена (HRP)-стрептавидин. Количество меченого эталонного антитела, связанного с целевым антигеном, обнаруживают после добавления хромогенного субстрата (например, TMB (3,3',5,5'-тетраметилбензидин) или ABTS (2,2"-азино-ди-(3-этилбензтиазолин-6-сульфонат)), которые известны из уровня техники. Данные оптической плотности (единицы OD) получают с использованием спектрометра (например, спектрометра SpectraMax® M2 (Molecular Devices)). Ответ (единицы OD), соответствующий нулевому проценту ингибирования, определяют на основании лунок без какого-либо конкурирующего антитела. Ответ (единицы OD), соответствующий 100% ингибированию, т. е. фоновое значение анализа, определяют на основании лунок без какого-либо меченого эталонного антитела или тестируемого антитела. Процент ингибирования меченого эталонного антитела к FIX или FIXa тестируемым антителом (или немеченым эталонным антителом) при каждой концентрации рассчитывают следующим образом: % ингибирования = (1- (единицы OD - 100% ингибирования)/(0% ингибирования - 100% ингибирования))* 100.

Специалисту в данной области будет понятно, что аналогичные анализы можно выполнить для определения того, характеризуются ли два или более антител к FX/FXa общей областью связывания, группой и/или конкурентным связыванием антигена. Специалисты в данной области также будут понимать, что конкурентный анализ можно выполнять с использованием различных систем обнаружения, известных из уровня техники.

Тестируемое антитело конкурирует с эталонным антителом за связывание с антигеном, если избыток одного антитела (например, 1-, 5-, 10-, 20-, 100-, 1000-, 10000- или 100000-кратный) ингибирует связывание другого антитела, например на по меньшей мере 50%, 75%, 90%, 95% или 99%, как измерено в анализе конкурентного связывания.

Если не указано иное, конкуренцию определяют с использованием конкурентного анализа ELISA, описанного выше.

Термин «аффинность связывания» используется в данном документе как показатель силы нековалентного взаимодействия между двумя молекулами, например, антителом или его фрагментом и антигеном. Термин «аффинность связывания» используется для описания моновалентных взаимодействий.

Аффинность связывания между двумя молекулами, например антителом или его фрагментом и антигеном, посредством моновалентного взаимодействия можно оценить количественно путем определения равновесной константы диссоциации (K_D). K_D можно определить путем измерения кинетики образования и диссоциации комплекса, например, с помощью способа поверхностного плазмонного резонанса (SPR) или способа изотермической титрационной калориметрии (ITC). Константы скорости, соответствующие ассоциации и диссоциации моновалентного комплекса, обозначаются как константа скорости ассоциации, k_a (или k_on), и константа скорости диссоциации, k_d (или k_off), соответственно. K_D соотносится с k_a и k_d через уравнение K_D = k_d / k_a.

Следуя приведенному выше определению, аффинности связывания, ассоциированные с различными молекулярными взаимодействиями, такие как сравнение аффинности связывания различных антител для данного антигена, можно сравнивать путем сравнения значений K_D для отдельных комплексов антитело/антиген.

Значение константы диссоциации можно определить напрямую хорошо известными способами. Стандартные анализы для оценки способности связывания лигандов, таких как антитела, с мишенями известны из уровня техники и включают, например, анализы ELISA, вестерн-блоттинг, RIA и проточную цитометрию. Кинетику связывания и аффинность связывания антитела также можно оценить с помощью стандартных анализов, известных из уровня техники, таких как SPR. Однако предпочтительно для измерения аффинностей взаимодействия антитело/мишень, а также для получения термодинамических параметров взаимодействия можно использовать изотермическую титрационную калориметрию (ITC).

Можно проводить анализ конкурентного связывания, в котором связывание антитела с мишенью сравнивают со связыванием мишени другим лигандом этой мишени, таким как другое антитело.

K_D антитела по настоящему изобретению для его мишени может составлять меньше 100 мкМ, как, например, меньше 10 мкМ, как, например, меньше 9 мкМ, как, например, меньше 8 мкМ, как, например, меньше 7 мкМ, как, например, меньше 6 мкМ, как, например, меньше 5 мкМ, как, например, меньше 4 мкМ, как, например, меньше 3 мкМ, как, например, меньше 2 мкМ, как, например, меньше 1 мкМ, как, например, меньше 0,9 мкМ, как, например, меньше 0,8 мкМ, как, например, меньше 0,7 мкМ, как, например меньше 0,6 мкМ, как, например, меньше 0,5 мкМ, как, например, меньше 0,4 мкМ, как, например, меньше 0,3 мкМ, как, например, меньше 0,2 мкМ, как, например, меньше 0,1 мкМ.

В одном таком варианте осуществления антитело представляет собой биспецифическое антитело, содержащее плечо к FX с K_D в отношении FX, составляющей меньше 100 мкM, как, например, меньше 10 мкM как, например, меньше 9 мкM, как, например, меньше 8 мкM, как, например, меньше 7 мкM, как, например, меньше 6 мкM, как, например, меньше 5 мкM, как, например, меньше 4 мкM, как, например, меньше 3 мкМ, как, например, меньше 2 мкМ, как, например, меньше 1 мкМ, как, например, меньше 0,9 мкМ, как, например, меньше 0,8 мкМ, как, например, меньше 0,7 мкМ, как, например, меньше 0,6 мкМ, как, например, меньше 0,5 мкМ, как, например, меньше 0,4 мкМ, как, например, меньше 0,3 мкМ, как, например, меньше 0,2 мкМ, как, например, меньше 0,1 мкМ, как, например, меньше 0,09 мкМ, как, например, меньше 0,08 мкМ, как, например, меньше 0,07 мкМ, как, например, меньше 0,06 мкМ, как, например, меньше 0,05 мкМ, как, например, меньше 0,04 мкМ, как, например, меньше 0,03 мкМ, как, например, меньше 0,02 мкМ, как, например, меньше 0,01 мкМ, как, например, меньше 9 нM, как, например, меньше 8 нM, как, например, меньше 7 нM, как, например, меньше 6 нM, как, например, меньше 5 нM, как, например, меньше 4 нM, как, например, меньше 3 нM, как, например, меньше 2 нM, как, например, меньше 1 нM, как, например, меньше 0,5 нM.

Антитела и фрагменты таких антител, описанные в данном документе, можно объединять с другими антителами и фрагментами антител, известными из уровня техники, с образованием молекул биспецифических, триспецифических или полиспецифических антител. Соединения, имитирующие функцию кофактора FVIII, ранее были созданы с использованием других связывающих FIX(a) и FX(a) доменов, каждый из которых потенциально может заменять описанные в данном документе связывающие FIX(a) и/или FX(a) домены. Таким образом, ясно, что связывающие FIX(a) и FX(a) домены по настоящему изобретению представляют самостоятельный интерес как отдельные компонентные молекулы (промежуточные соединения) в качестве частей би-, три- или полиспецифического антитела, содержащего по меньшей мере один связывающий FIX(a) и/или FX(a) домен.

Активность прокоагулянтных антител, включая би-, три- и полиспецифические антитела, можно определять с помощью способов, известных из уровня техники. Стандартные анализы включают тест тромбинообразования (TGT) в цельной крови, измерение времени свертывания с помощью тромбоэластографии (TEG) и анализы образования FXa.

Идентичность

Как известно в данной области термин «идентичность» относится к взаимосвязи между последовательностями двух или более полипептидов, определяемой путем сравнения последовательностей. В данной области «идентичность» также означает степень родства последовательностей у разных полипептидов, определяемую по количеству совпадений между отрезками из двух или более аминокислотных остатков. «Идентичность» измеряет процент идентичных совпадений у меньшей из двух или более последовательностей при выравниваниях с гэпами (если они есть), рассматриваемых с помощью конкретной математической модели или компьютерной программы (т. е. «алгоритмов»). Идентичность родственных полипептидов можно легко рассчитать известными способами.

В настоящем изобретении сходство и идентичность определяли с использованием алгоритма Needleman (Needleman et al. J. Mol. Biol. 1970; 48:443–453) в EMBOSS-6.6.0 с использованием параметров 10 и 0,5 для внесения и продления гэпов соответственно (gapopen=10, gapextend=0,5).

Фармацевтические составы

В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрены композиции и составы, содержащие соединения по настоящему изобретению, такие как антитела, описанные в данном документе. Например, в настоящем изобретении предусмотрена фармацевтическая композиция, которая содержит одно или более антител по настоящему изобретению, составленных вместе с фармацевтически приемлемым носителем.

Соответственно, одна цель настоящего изобретения заключается в том, чтобы обеспечить фармацевтический состав, содержащий такое антитело, которое присутствует в концентрации от 0,25 мг/мл до 250 мг/мл, и где указанный состав характеризуется рН от 2,0 до 10,0. Состав может дополнительно содержать одно или более из буферной системы, консерванта, средства регуляции тоничности, хелатообразующего средства, стабилизатора или поверхностно-активного вещества, а также их различных комбинаций. Применение консервантов, изотонических средств, хелатообразующих средств, стабилизаторов и поверхностно-активных веществ в фармацевтических композициях хорошо известно специалисту. Можно сделать ссылку на Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19^th edition, 1995.

В одном варианте осуществления фармацевтический состав представляет собой водный состав. Такой состав, как правило, представляет собой раствор или суспензию, но также может включать коллоиды, дисперсии, эмульсии и многофазные материалы. Термин «водный состав» определяется как состав, содержащий по меньшей мере 50% вес/вес воды. Аналогично, термин «водный раствор» определяется как раствор, содержащий по меньшей мере 50% вес/вес воды, а термин «водная суспензия» определяется как суспензия, содержащая по меньшей мере 50% вес/вес воды.

В другом варианте осуществления фармацевтический состав представляет собой лиофилизированный состав, в который растворитель и/или разбавитель добавляют перед применением.

В дополнительном аспекте фармацевтический состав содержит водный раствор такого антитела и буфер, где антитело присутствует в концентрации от 1 мг/мл или более, и где указанный состав характеризуется рН от приблизительно 2,0 до приблизительно 10,0.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к инъекционному устройству, содержащему указанную композицию. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция по настоящему изобретению предназначена для применения и/или содержится в инъекционном устройстве. В некоторых вариантах осуществления инъекционное устройство представляет собой одноразовую предварительно заполненную многодозовую шприц-ручку типа FlexTouch^® (поставщик Novo Nordisk A/S, Дания). В некоторых вариантах осуществления инъекционное устройство представляет собой устройство однократного действия.

В некоторых вариантах осуществления инъекционное устройство представляет собой устройство с фиксированной дозой, такое как устройство, выполненное с возможностью доставки нескольких заранее определенных доз лекарственного средства, иногда называемое устройством с несколькими фиксированными дозами или устройством с фиксированной дозой многократного действия.

В одном варианте осуществления фармацевтическую композицию по настоящему изобретению вводят с использованием инъекционного устройства, содержащего трубку с диаметром иглы 20 или более.

В одном варианте осуществления биспецифическое антитело в соответствии с таблицей 1 в данном документе вводят с использованием инъекционного устройства, содержащего трубку с диаметром иглы 20 или более.

В одном варианте осуществления биспецифическое антитело в соответствии с таблицей 1 в данном документе вводят с использованием инъекционного устройства, содержащего трубку с диаметром иглы от 20 до 36. В одном таком варианте осуществления биспецифическое антитело выбрано из перечня, состоящего из bimAb05-0745, bimAb05-3761, bimAb05-3761, bimAb05-2112, bimAb05-2113, bimAb05-2114, bimAb05-3769, bimAb05-4271, bimAb05-4756, bimAb05-0396, bimAb05-0417 и bimAb05-0438.

Введение и дозировки

Соединение по настоящему изобретению, такое как антитело, можно вводить парентерально, например внутривенно, например внутримышечно, например подкожно. В качестве альтернативы антитело по настоящему изобретению можно вводить непарентеральным путем, например перорально или местно. Антитело по настоящему изобретению можно вводить профилактически. Антитело по настоящему изобретению можно вводить терапевтически (при необходимости).

Доза соединений, которые требуется доставить, может составлять от приблизительно 0,01 мг до 500 мг соединения в сутки, предпочтительно от приблизительно 0,1 мг до 250 мг в сутки и более предпочтительно от приблизительно 0,5 мг до приблизительно 250 мг в сутки, в неделю, в две недели или в месяц в качестве нагрузочных и поддерживающих доз в зависимости от тяжести состояния. Подходящую дозу также можно отрегулировать для конкретного соединения на основе свойств этого соединения, включая его время полужизни in vivo или среднее время удержания и его биологическую активность. Например, соединения, которые требуется доставить, в одном варианте осуществления можно вводить один раз в неделю, или в другом варианте осуществления один раз в две недели, или в другом варианте осуществления один раз в месяц, и в каждом из указанных вариантов осуществления в дозе, например, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,125, 0,15, 0,175, 0,2, 0,25, 0,3, 0,35, 0,4, 0,45, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5 или 10 мг на кг массы тела.

Композиции, содержащие соединения, раскрытые в данном документе, можно вводить для профилактического и/или, в некоторых вариантах осуществления, для терапевтического лечения. При терапевтических путях применениях композиции вводят субъекту, уже страдающему заболеванием, таким как любое нарушение свертываемости крови, описанное выше, в количестве, достаточном для излечения, облегчения или частичной задержки развития заболевания и его осложнений. Количество, достаточное для достижения этого, определяется как «терапевтически эффективное количество». Как будет понятно специалисту в данной области, количества, эффективные для этой цели, будут зависеть от тяжести заболевания или поражения, а также от массы и общего состояния субъекта.

Варианты осуществления

Настоящее изобретение дополнительно описывается следующими вариантами осуществления.

1. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способные связываться с фактором IX (FIX) под SEQ ID NO:1 и/или его активированной формой (FIXa).

2. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 1, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент являются частью «группы B», описанной в данном документе.

3. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 1, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент конкурируют с эталонным антителом, где эталонное антитело содержит:

a. вариабельный домен тяжелой цепи, идентифицированный под SEQ ID NO:35, и вариабельный домен легкой цепи, идентифицированный под SEQ ID NO:39,

b. вариабельный домен тяжелой цепи, идентифицированный под SEQ ID NO:43, и вариабельный домен легкой цепи, идентифицированный под SEQ ID NO:47, или

c. вариабельный домен тяжелой цепи, идентифицированный под SEQ ID NO:51, и вариабельный домен легкой цепи, идентифицированный под SEQ ID NO:55, или

d. вариабельный домен тяжелой цепи, идентифицированный под SEQ ID NO:67, и вариабельный домен легкой цепи, идентифицированный под SEQ ID NO:71, или

e. вариабельный домен тяжелой цепи, идентифицированный под SEQ ID NO:1202, и вариабельный домен легкой цепи, идентифицированный под SEQ ID NO:1206, или

f. вариабельный домен тяжелой цепи, идентифицированный под SEQ ID NO:1210, и вариабельный домен легкой цепи, идентифицированный под SEQ ID NO:1214, или

g. вариабельный домен тяжелой цепи, идентифицированный под SEQ ID NO:1218, и вариабельный домен легкой цепи, идентифицированный под SEQ ID NO:1222, или

h. вариабельный домен тяжелой цепи, идентифицированный под SEQ ID NO:1226, и вариабельный домен легкой цепи, идентифицированный под SEQ ID NO:1230, или

i. вариабельный домен тяжелой цепи, идентифицированный под SEQ ID NO:1234, и вариабельный домен легкой цепи, идентифицированный под SEQ ID NO:1238, или

j. вариабельный домен тяжелой цепи, идентифицированный под SEQ ID NO:1242, и вариабельный домен легкой цепи, идентифицированный под SEQ ID NO:1246.

4. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по предыдущему варианту осуществления, где эталонное антитело представляет собой Fab.

5. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из предыдущих вариантов осуществления, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат:

a. вариабельный домен тяжелой цепи, который на по меньшей мере 90% идентичен последовательности, идентифицированной под SEQ ID NO:35, и вариабельный домен легкой цепи, который на по меньшей мере 90% идентичен последовательности, идентифицированной под SEQ ID NO:39; или

b. вариабельный домен тяжелой цепи, который на по меньшей мере 90% идентичен последовательности, идентифицированной под SEQ ID NO:43, и вариабельный домен легкой цепи, который на по меньшей мере 90% идентичен последовательности, идентифицированной под SEQ ID NO:47; или

c. вариабельный домен тяжелой цепи, который на по меньшей мере 90% идентичен последовательности, идентифицированной под SEQ ID NO:51, и вариабельный домен легкой цепи, который на по меньшей мере 90% идентичен последовательности, идентифицированной под SEQ ID NO:55; или

d. вариабельный домен тяжелой цепи, который на по меньшей мере 90% идентичен последовательности, идентифицированной под SEQ ID NO:67, и вариабельный домен легкой цепи, который на по меньшей мере 90% идентичен последовательности, идентифицированной под SEQ ID NO:71, или

e. вариабельный домен тяжелой цепи, который на по меньшей мере 90% идентичен последовательности, идентифицированной под SEQ ID NO:1202, и вариабельный домен легкой цепи, который на по меньшей мере 90% идентичен последовательности, идентифицированной под SEQ ID NO:1206, или

f. вариабельный домен тяжелой цепи, который на по меньшей мере 90% идентичен последовательности, идентифицированной под SEQ ID NO:1210, и вариабельный домен легкой цепи, который на по меньшей мере 90% идентичен последовательности, идентифицированной под SEQ ID NO:1214, или

g. вариабельный домен тяжелой цепи, который на по меньшей мере 90% идентичен последовательности, идентифицированной под SEQ ID NO:1218, и вариабельный домен легкой цепи, который на по меньшей мере 90% идентичен последовательности, идентифицированной под SEQ ID NO:1222, или

h. вариабельный домен тяжелой цепи, который на по меньшей мере 90% идентичен последовательности, идентифицированной под SEQ ID NO:1226, и вариабельный домен легкой цепи, который на по меньшей мере 90% идентичен последовательности, идентифицированной под SEQ ID NO:1230, или

i. вариабельный домен тяжелой цепи, который на по меньшей мере 90% идентичен последовательности, идентифицированной под SEQ ID NO:1234, и вариабельный домен легкой цепи, который на по меньшей мере 90% идентичен последовательности, идентифицированной под SEQ ID NO:1238, или

j. вариабельный домен тяжелой цепи, который на по меньшей мере 90% идентичен последовательности, идентифицированной под SEQ ID NO:1242, и вариабельный домен легкой цепи, который на по меньшей мере 90% идентичен последовательности, идентифицированной под SEQ ID NO:1246.

6. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 5, где вариабельный домен тяжелой цепи на по меньшей мере 92, 94, 96, 97, 98, 99, 99,1 или 99,2% идентичен последовательности, идентифицированной под SEQ ID NO:35, 43, 51, 67, 1202, 1210, 1218, 1226, 1234 или 1242 соответственно.

7. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 5, где вариабельный домен легкой цепи на по меньшей мере 92, 94, 96, 97, 98, 99, 99,1 или 99,2% идентичен последовательности, идентифицированной под SEQ ID NO: 39, 47, 55, 71, 1206, 1214, 1222, 1230, 1238 или 1246 соответственно.

8. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 6 и 7, где как вариабельный домен тяжелой цепи, так и вариабельный домен легкой цепи на по меньшей мере 92, 94, 96, 97, 98, 99, 99,1 или 99,2% идентичны идентифицированным SEQ ID.

9. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из предыдущих вариантов осуществления, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент способны связывать эпитоп, содержащий один или более аминокислотных остатков L337, R338, S339, T340, K341 и T343 из SEQ ID NO:1.

10. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из предыдущих вариантов осуществления, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент способны связывать эпитоп, содержащий аминокислотный остаток R338 из SEQ ID NO:1.

11. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из предыдущих вариантов осуществления, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент способны связывать эпитоп, содержащий аминокислотные остатки R338 и K341 из SEQ ID NO:1.

12. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из предыдущих вариантов осуществления, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент способны связывать эпитоп, содержащий два или три аминокислотных остатка L337, R338, S339, T340, K341 и T343 из SEQ ID NO:1.

13. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из предыдущих вариантов осуществления, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент способны связывать эпитоп, содержащий четыре или пять аминокислотных остатков L337, R338, S339, T340, K341 и T343 из SEQ ID NO:1.

14. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из предыдущих вариантов осуществления, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент способны связывать эпитоп, содержащий:

a. R338, S339, T340, K341 и T343,

b. L337, S339, T340, K341 и T343,

c. L337, R338, T340, K341 и T343,

d. L337, R338, S339, K341 и T343,

e. L337, R338, S339, T340 и T343,

f. L337, R338, S339, T340 и K341,

g. L337, R338, S339 и T340 или

h. R338, T340 и K341

из SEQ ID NO:1.

15. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1–11, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент способны связывать эпитоп, содержащий аминокислотные остатки:

a. R338, T340 и K341 из SEQ ID NO:1 или

b. L337, R338, S339, T340 и K341 из SEQ ID NO:1.

16. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из предыдущих вариантов осуществления, содержащие паратоп, содержащий следующие аминокислотные остатки:

a. H30, D31, W53, D56, S102, S104, Y106 и N107 в вариабельном домене тяжелой цепи (SEQ ID NO:67) и Y91 и S92 в вариабельном домене легкой цепи (SEQ ID NO:71), необязательно содержащие одну, две или три аминокислотные замены в десяти перечисленных аминокислотных остатках паратопа, или

b. H30, D31, W53, S102, S104, Y106 и N107 в вариабельном домене тяжелой цепи (SEQ ID NO:51) и остатки Y91 и S92 в вариабельном домене легкой цепи (SEQ ID NO: 55), необязательно содержащие одну, две или три аминокислотные замены в девяти перечисленных аминокислотных остатках паратопа.

17. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1–16, содержащие паратоп, содержащий следующие аминокислотные остатки D30, D31, W53, S102, S104 и N107 в вариабельном домене тяжелой цепи (SEQ ID NO: 35) и Y91 и S92 в вариабельном домене легкой цепи (SEQ ID NO: 39), необязательно содержащие одну, две или три аминокислотные замены в восьми перечисленных аминокислотных остатках паратопа.

18. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 16 или 17, где указанная(-ые) замена(-ы) представляет(-ют) собой консервативную(-ые) замену(-ы).

19. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из предыдущих вариантов осуществления, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат:

a.

i. три последовательности CDR тяжелой цепи, содержащие максимум 10 аминокислотных замен по сравнению с последовательностями CDR вариабельного домена тяжелой цепи, идентифицированного под SEQ ID NO:35, и

ii. три последовательности CDR легкой цепи, содержащие максимум 10 аминокислотных замен по сравнению с последовательностями CDR вариабельного домена легкой цепи, идентифицированного под SEQ ID NO:39, или

b.

i. три последовательности CDR тяжелой цепи, содержащие максимум 10 аминокислотных замен по сравнению с последовательностями CDR вариабельного домена тяжелой цепи, идентифицированного под SEQ ID NO:43, и

ii. три последовательности CDR легкой цепи, содержащие максимум 10 аминокислотных замен по сравнению с последовательностями CDR вариабельного домена легкой цепи, идентифицированного под SEQ ID NO:47, или

c.

i. три последовательности CDR тяжелой цепи, содержащие максимум 10 аминокислотных замен по сравнению с последовательностями CDR вариабельного домена тяжелой цепи, идентифицированного под SEQ ID NO:51, и

ii. три последовательности CDR легкой цепи, содержащие максимум 10 аминокислотных замен по сравнению с последовательностями CDR вариабельного домена легкой цепи, идентифицированного под SEQ ID NO:55, или

d.

i. три последовательности CDR тяжелой цепи, содержащие максимум 10 аминокислотных замен по сравнению с последовательностями CDR вариабельного домена тяжелой цепи, идентифицированного под SEQ ID NO:67, и

ii. три последовательности CDR легкой цепи, содержащие максимум 10 аминокислотных замен по сравнению с последовательностями CDR вариабельного домена легкой цепи, идентифицированного под SEQ ID NO:71, или

e.

i. три последовательности CDR тяжелой цепи, содержащие максимум 10 аминокислотных замен по сравнению с последовательностями CDR вариабельного домена тяжелой цепи, идентифицированного под SEQ ID NO:1202, и

ii. три последовательности CDR легкой цепи, содержащие максимум 10 аминокислотных замен по сравнению с последовательностями CDR вариабельного домена легкой цепи, идентифицированного под SEQ ID NO:1206, или

f.

i. три последовательности CDR тяжелой цепи, содержащие максимум 10 аминокислотных замен по сравнению с последовательностями CDR вариабельного домена тяжелой цепи, идентифицированного под SEQ ID NO:1210, и

ii. три последовательности CDR легкой цепи, содержащие максимум 10 аминокислотных замен по сравнению с последовательностями CDR вариабельного домена легкой цепи, идентифицированного под SEQ ID NO:1214, или

g.

i. три последовательности CDR тяжелой цепи, содержащие максимум 10 аминокислотных замен по сравнению с последовательностями CDR вариабельного домена тяжелой цепи, идентифицированного под SEQ ID NO:1218, и

ii. три последовательности CDR легкой цепи, содержащие максимум 10 аминокислотных замен по сравнению с последовательностями CDR вариабельного домена легкой цепи, идентифицированного под SEQ ID NO:1222, или

h.

i. три последовательности CDR тяжелой цепи, содержащие максимум 10 аминокислотных замен по сравнению с последовательностями CDR вариабельного домена тяжелой цепи, идентифицированного под SEQ ID NO:1226, и

ii. три последовательности CDR легкой цепи, содержащие максимум 10 аминокислотных замен по сравнению с последовательностями CDR вариабельного домена легкой цепи, идентифицированного под SEQ ID NO:1230, или

i.

i. три последовательности CDR тяжелой цепи, содержащие максимум 10 аминокислотных замен по сравнению с последовательностями CDR вариабельного домена тяжелой цепи, идентифицированного под SEQ ID NO:1234, и

ii. три последовательности CDR легкой цепи, содержащие максимум 10 аминокислотных замен по сравнению с последовательностями CDR вариабельного домена легкой цепи, идентифицированного под SEQ ID NO:1238, или

j.

i. три последовательности CDR тяжелой цепи, содержащие максимум 10 аминокислотных замен по сравнению с последовательностями CDR вариабельного домена тяжелой цепи, идентифицированного под SEQ ID NO:1242, и

ii. три последовательности CDR легкой цепи, содержащие максимум 10 аминокислотных замени по сравнению с последовательностями CDR вариабельного домена легкой цепи, идентифицированного под SEQ ID NO:1246.

20. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 19, где три последовательности CDR тяжелой цепи содержат максимум 9, как, например, 8, как, например, 7 или, как, например, 6 аминокислотных замен по сравнению с CDR из идентифицированных SEQ ID.

21. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 19, где три последовательности CDR тяжелой цепи содержат максимум 5, как, например, 4, как, например, 3, как, например, 2 или максимум 1 аминокислотную замену по сравнению с CDR из идентифицированных SEQ ID.

22. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 19, где три последовательности CDR легкой цепи содержат максимум 9, как, например, 8, как, например, 7 или, как, например, 6 аминокислотных замен по сравнению с CDR из идентифицированных SEQ ID.

23. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 19, где три последовательности CDR легкой цепи содержат максимум 5, как, например, 4, как, например, 3, как, например, 2 или максимум 1 аминокислотную замену по сравнению с CDR из идентифицированных SEQ ID.

24. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из предыдущих вариантов осуществления, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат:

a. последовательности CDR из вариабельного домена тяжелой цепи, идентифицированного под SEQ ID NO:35, и последовательности CDR из вариабельного домена легкой цепи, идентифицированного под SEQ ID NO:39, или

b. последовательности CDR из вариабельного домена тяжелой цепи, идентифицированного под SEQ ID NO:43, и последовательности CDR из вариабельного домена легкой цепи, идентифицированного под SEQ ID NO:47, или

c. последовательности CDR из вариабельного домена тяжелой цепи, идентифицированного под SEQ ID NO:51, и последовательности CDR из вариабельного домена легкой цепи, идентифицированного под SEQ ID NO:55, или

d. последовательности CDR из вариабельного домена тяжелой цепи, идентифицированного под SEQ ID NO:67, и последовательности CDR из вариабельного домена легкой цепи, идентифицированного под SEQ ID NO:71, или

e. последовательности CDR из вариабельного домена тяжелой цепи, идентифицированного под SEQ ID NO:1202, и последовательности CDR из вариабельного домена легкой цепи, идентифицированного под SEQ ID NO:1206, или

f. последовательности CDR из вариабельного домена тяжелой цепи, идентифицированного под SEQ ID NO:1210, и последовательности CDR из вариабельного домена легкой цепи, идентифицированного под SEQ ID NO:1214, или

g. последовательности CDR из вариабельного домена тяжелой цепи, идентифицированного под SEQ ID NO:1218, и последовательности CDR из вариабельного домена легкой цепи, идентифицированного под SEQ ID NO:1222, или

h. последовательности CDR из вариабельного домена тяжелой цепи, идентифицированного под SEQ ID NO:1226, и последовательности CDR из вариабельного домена легкой цепи, идентифицированного под SEQ ID NO:1230, или

i. последовательности CDR из вариабельного домена тяжелой цепи, идентифицированного под SEQ ID NO:1234, и последовательности CDR из вариабельного домена легкой цепи, идентифицированного под SEQ ID NO:1238, или

j. последовательности CDR из вариабельного домена тяжелой цепи, идентифицированного под SEQ ID NO:1242, и последовательности CDR из вариабельного домена легкой цепи, идентифицированного под SEQ ID NO:1246.

25. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из предыдущих вариантов осуществления, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат:

a. вариабельный домен тяжелой цепи, идентифицированный под SEQ ID NO:35, и вариабельный домен легкой цепи, идентифицированный под SEQ ID NO:39, или