Штамм дрожжей @ @ ЦМПМ @ -449,используемый для регистрации прямых генных мутаций Советский патент 1986 года по МПК C12N15/00 

г

Штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae ЦМПМ Y-449 (Коллекция Центрального музея промьшшенных микроорганизмов института ВНИИгенетика), используемый для регистрации прямых генных мутаций.

00

сд

00 00 Изобретение относится к области генетики и представляет собой новый тестерный штамм дрожжей, используемый для регистрации прямых генных мутаций. Тестерные штаммы предназначены дл оценки генетической опасности, вызываемой химическими и физическими факторами, загрязняющими окружающую среду. Одним из средств фиксирования генетических последствий действия на клетку различных физических и химических му.тагенов является регистрация пр(ямых генных мутаций с использованием предназначенных для этого тестер1ных штаммов. Регистрация мутаций по генам аденинзависимости имеет преимущества перед другими способами определения прямых генных мутаций. Это преимущество заключается в том, что возникающие мутантные колонии отличаются по цвету от колоний исходного штамма и позтому их легко регистрировать визуально мето дом простого подсчета. Известен способ для регистрации прямых генных мутаций на S. c revisiae к аденинзависимости, в котором в качестве исходного используют штамм, способный к синтезу аденина и имеющий колонии белого цвета. Под воздействием химических и физических факторов могут возникать мутации в генах ade Т и ade 2, блокирующие синтез аденина и приводящи к накоплению красного пигмента в му тантных клетках. Это позволяет на фоне белых колоний исходного штамма легко регистрировать мутантные коло нии красного цвета. Недостатком такого штамма являет ся малая чувствительность к мутагенному действию различных агентов, обусловленная тем, что регистрация мутаций проводится по двум генам. .В связи с этим при использовании этого штамма требуется проанализировать большое количество колоний (не менее 400000) при испытании, одной дозы вещества в одной повторное ти. Для этого требуется приблизител но 200 чашек с питательной средой. Объем работы еще более возрастает при проверке веществ со слабой мута генной активностью. Наиболее близким к заявляемому п принципу регистрации прямых генных мутаций является штамм дрожжей Shirosaccharomyces pombe SP-198 ade 660. Использовался этот штамм на регистрации прямых белых аденинзависимых мутанов по 5 генам аденинзависимости (ade I, ade 3, ade 4, ade 5 и ade 9), возникающих под воздействием химических и физических агентов на фоне красного аденинзависимого штамма, Недостатком этого штамма является невысокая точность определения мутаций, так как использование этого штамма не исключает возможность появления ревертантных колоний, имеющих такой же фенотип, как и мутантные колонии. Поскольку различные физические и химические факторы могут индуцировать различное число ревертантов, точность регистрации генных.мутаций с использованием этого штамма значительно снижается. Целью изобретения является штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae 1ПГ-216 (зарегистрированный в Коллекции института ВНИИгенетика под номером ЦМПМ Y-449), обладающий более высокой точностью и чувствительностью . определения прямых генных мутаций. В основе принципа действия этого штамма лежит регистрация прямых генных мутаций по 6 генам аденинзависимости (ade 3, ade 4, ade 5, ade 6, ade 7 и ade 8). Мутации в этих генах блокируют накопление красного пигмента в клетках исходного аденинзависимого по гену ade 2 штамма, что приводит к появлению белых мутантных колоний на фоне красных колоний исходного штамма. Большая точность предлагаемого штамма, по сравнению с аналогичным штаммом Shirosaccharomyces pombe обусловлена тем, что прямые белые мутанты по аденинзависимости индуцируются на фоне делеции G-668, затрагивающей весь ген ade 2, что полностью исключает появление ревертантных, т.е. способных к синтезу аденина колоний, такуе имеющих белый цвет. Увеличение числа генов до 6 по сравнению с 2 в случае ранее использованного штамма у 9-15В-ПЧ Saccharomyces cerevisiae, и с 5 в случае использования штамма SP-198- ade 660 Shiro saccHarpmyces pombe, по которым могут быть зарегистрированы генные мутации, приводит к большей чувствительности; штамма, как тесгтерного. Повышению чувствительности штамма способствуетналичие клеточной оболочки для химических мутагенов. Введение в генотип штамма мута ции rad 2, нарушающей эксцизионную систему репарации, также способству ет увеличению его чувствительности. Полученный штамм дрожжей S.cerevisiae (ЦМПМ-Y 449) имеет следующие морфологические и физиологические характеристики. Величина клеток 3суточной культуры на жидкой полной среде составляет 3,,7 ммк. Преобладающая форма клеток - овальная. Размножение - почкованием. На жидкой полной среде после 3 сут роста образуется осадок, дающий при взбалтьшании равномерную муть, пленка не образуется. При посеве на агаризованную полную среду в чашки Петри через 18 су образуются круглые колонии красного цвета с -ровными краями диаметром 2,2 см. Отношение к углеводам. Усваивает глюкозу, галактозу, сахарозу, рафинозу, мальтозу. Не усваивает декстрин, лактозу, ксилозу, арабинозу. Отношение к спиртам. Усваивает этиловый спирт, глицерин. Не усваивает маннит, дульцит, сорбит. Отношение к органическим кислота Усваивает молочную и уксусную кисло ты. Для получения заявляемого тестер ного штамма были изучены три деле- ционных штамма Saccharomyces сегеvisiae, полученные в секторе радиационной генетики, у которых делеции затрагивали различные по величине участки гена ade 2. Бып отобран шта ШГ-215 генотипа . ade 2 G-668 hisX у которого частота спонтанного мути рования оказалась наименьшей, а индуцированного УФ-светом наибольшей. После скрещивания этого штамма со штаммом р9-15В-П4 генотипа а ига X amp 1 был отобран сегрегант генотипа ct-ade 2 G-668 ura X ump 1 и обозначен как тестерный штамм 1ПГ216. Для введения мутации радиочувствительности rad 2 штамм 1ПГ-216 был скрещен со штаммом 7-ПГ-59 генотипа Ы. ade 1 rad 2. Для проверки штамма как тестер - ного в качестве мутагенов бьти выбр ны УФ-свет, как сильный мутаген, и метилметансульфонат (ММС), как слабый мутаген. Условия проверки следую 88 На суспензию клеток испы.туемого штамма действовали указанными мутагенами в различных дозах. Затем контрольную и обработанную суспензию клеток разводили и высевали на чашки Петри с питательной средой, содержащей спирт. На такой среде не вырастают мутанты с дыхательной недостаточностью, имеющие такой же цвет колоний (белый), как и аденинзависимые мутанты. Разведения подбирали таким образом, чтобы при учете выживаемости на чашках вырастало не более 500 колоний, а при подсчете числа- мутантов - от 2000 до 5000 колоний. О чувствительности штамма к воздействию мутантов судили по частоте мутирования, которую определяли как отношение числа мутантных колоний, отнесенное к общему числу выживших колоний. В каждом опыте также учитывали число мутантных колоний, возникающих в необработанном контроле (спонтанный фон). Летальный и мутагенный эффекты УФ-света и ММС на штамм ЦМПМ Y-449 представлены в таблице. Действие УФ-света изучали на штамме 1ПГ-216 без мутации rad 2, так как наличие последней в генотипе штамма очень сильно увеличивает летальный эффект УФ-света. Как следует из данных таблицы, заявляемый штамм позволяет регистрировать прямые генные мутации и при действии слабого мутагена ММС. При этом введение мутации rad 2 увеличивает чувствительность штамма, мутагенный эффект ММС проявляется при более низких концентрациях. Это очень важно при проверке на мутагенную активность слабых мутагенов или веществ, присутствующих в очень малых концентрациях. Для сравнения чувствительности тестерных штаммов на дрожжах-сахаро- мицетах заявленного и обычно используемого штамма, позволяющего регистрировать мутации по двум генам аденинзависимости (ade I и ade 2),рассмотрим данные по индукции мутаций УФ-светом у штамма ЦМПМ Y-449 и данные штамма У9-13В-П4 Saccharomyces cerevisiae. При одинаковой выживаемости (22%) у штамма ЦМПМ Y-449 частота индуцированного мутагенеза на составляет 52,9, а штамма У9-15В-П4 - 2,7,т.е. в 19,6 раза меньше. . Сдедонательно, увеличение числа генов, по которым регистрируются индуцируемые мутации, значительно увеличивает чувствительность штамма. Штамм-прототип относится к другому роду дрожжей, чем предпа:гаемый нами штамм. Шизосахаромицеты отличаются от сахаромицетов многими свой ствами, в том числе способом размножения (делением клеток, а не пачкованием) и числом хромосом (3-у шизосахаромицетов и 17 - у сахаромицетов) . На дрожжах Saccharomyces сегеvisiae штамм, аналогичный штамму -про тотипу, неизвестен. Однако по принци пу регистрации прямых генных мутаций штамм-прототип является наиболее близким. Чувствительность штамм и мутагенному эфф П 8-6 Преимущества заявляемого штамма по сравнению с прототипом SP-198 ade G-60 Scizosaccharnmyces pombe) состоят в следующем.Исключена возможность появления ревертантов, имеющих тот же фенотип, что и индуцируемые мутанты, из-за наличия в генотипе штамма ЦМПМ Y-449 делеции G-668, полностью захватьгоающей весь ген ade 2. Учет индуцируемых мутаций ведется по 6 генам аденинзависимости (у прототипа по 5) . Наличие в генотипе штамма мутации ump, приводящей к повьш1ению проницаемости клеточной оболочки. Эти преимущества приводят к более высокой точности и чувствительности определения прямых генных мутаций. ПМ Y-449 к летальному м УФ-света и ММС