НОВЫЕ ВАРИАНТЫ ГИАЛУРОНИДАЗЫ С УЛУЧШЕННОЙ СТАБИЛЬНОСТЬЮ И СОДЕРЖАЩАЯ ИХ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ Российский патент 2024 года по МПК C12N9/26 C12N15/56 C12N15/63 A61K38/47 A61P35/00 

Предшествующий уровень техники

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к новым вариантам PH20 человека или их фрагментам, обладающим повышенной ферментативной активностью и термостабильностью по сравнению с гиалуронидазой человека, которая представляет собой фермент, гидролизующий гиалуроновую кислоту, а более конкретно к вариантам PH20 или их фрагментам, которые включают одну или несколько замен, делеций и/или вставок аминокислотных остатков в вариантах гиалуронидазы, имеющих аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 и, необязательно, в которых один или несколько аминокислотных остатков удалены с N-конца и/или C-конца, к способу их получения, и к содержащей их фармацевтической композиции.

Описание предшествующего уровня техники

Кожа человека состоит из эпидермиса, дермы и подкожно-жирового слоя, и в коже есть шесть типов гликозаминогликанов. Эти гликозаминогликаны включают гиалуроновую кислоту, хондроитинсульфат, дерматансульфат, гепарансульфат, гепарин и кератинсульфат.

Эти гликозаминогликаны состоят из повторяющихся дисахаридных сахарных единиц. Число повторяющихся дисахаридных сахарных единиц различается среди гликозаминогликанов, но колеблется от нескольких сотен до нескольких тысяч. Среди гликозаминогликанов гиалуроновая кислота присутствует в коже более чем наполовину от количества в организме. Гиалуроновая кислота, синтезируемая гиалуронансинтазой, присутствующей в клеточной мембране, присутствует сама по себе, не связываясь с протеогликанами, и является единственным гликозаминогликаном, не имеющим сульфатной группы. Другие гликозаминогликаны связываются с протеогликанами и имеют сульфатную группу. Гиалуроновая кислота состоит из глюкуроновой кислоты и N-ацетилглюкозамина, попеременно связанных через связи β-1,4 и β-1,3, и состоит из примерно 5000 повторяющихся единиц этих дисахаридов. Известно, что около одной трети (5 г) гиалуроновой кислоты в организме человека подвергается деградации каждый день.

Гиалуронидазы - это ферменты, разрушающие гиалуроновую кислоту, присутствующую во внеклеточном матриксе. У человека известны шесть генов гиалуронидазы: Hyal1, Hyal2, Hyal3, Hyal4, HyalPS1 и PH20/SPAM1. Человеческие Hyal1 и Hyal2 экспрессируются в большинстве тканей. PH20/SPAM1 (далее обозначаемый как PH20) экспрессируется в плазматической мембране сперматозоидов и акросомной мембране. Однако HyalPS1 не экспрессируется, поскольку является псевдогеном. В зависимости от способа расщепления гиалуроновой кислоты гиалуронидазы подразделяются на три типа: ферменты (EC 3.2.1.35), которые расщепляют связи β-1,4 между N-ацетилглюкозамином и глюкуроновой кислотой с помощью H2O; ферменты (EC 3.2.1.36), которые расщепляют β-1,3-связи между N-ацетилглюкозамином и глюкуроновой кислотой с помощью H₂O; и бактериальные гиалуронидазы (EC 4.2.99.1), которые расщепляют связи β-1,4 без использования H₂O.

Каталитическими аминокислотами Hyal1 являются D129 и E131, которые гидролизуют гиалуроновую кислоту за счет катализа с использованием субстрата. Hyal1 проявляет оптимальную активность при кислотном pH от 3 до 4 и не имеет ферментативной активности при pH 4,5 или выше. В отличие от Hyal1, PH20 проявляет активность в широком диапазоне pH от 3 до 8.

Arming et al. установили, что каталитическими аминокислотами PH20 являются D111 и E113 (Arming et al., 1997). Arming et al. обозначили Leu в качестве первой аминокислоты PH20, из которой удален сигнальный пептид или т.п., и, таким образом, каталитические аминокислоты PH20, содержащие сигнальный пептид, соответствуют D146 и E148, соответственно.

Гиалуронидаза гидролизует гиалуроновую кислоту, тем самым уменьшая вязкость гиалуроновой кислоты во внеклеточном матриксе и увеличивая ее проницаемость в ткани (кожу). Подкожный участок кожи имеет нейтральный pH примерно от 7,0 до 7,5. Таким образом, среди различных типов гиалуронидаз в клинической практике широко используется PH20 (Bookbinder et al., 2006). В примерах, в которых PH20 используется в клинической практике, PH20 используется как глазной релаксант и анестезирующая добавка в офтальмологической хирургии, а также вводится совместно с терапевтическим агентом на основе антител, который вводится подкожно (Bookbinder et al., 2006). Кроме того, на основе свойства гиалуроновой кислоты, которая сверхэкспрессируется в опухолевых клетках, PH20 используется для гидролиза гиалуроновой кислоты во внеклеточном матриксе опухолевых клеток, тем самым увеличивая доступ противоопухолевого терапевтического агента к опухолевым клеткам. Кроме того, PH20 также используется для ускорения всасывания жидкостей организма и крови, которые чрезмерно присутствуют в тканях.

Lathrop et al. впервые идентифицировали PH20 в сперме морских свинок, и также известно, что она экспрессируется в сперматозоидах разных видов. Ген человека PH20 был клонирован Lin et al. и Gmachl et al. PH20 человека имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, которая состоит из 509 аминокислотных остатков и демонстрирует 60% аминокислотную идентичность с геном PH20 морской свинки. Фермент PH20 человека кодируется геном SPAM1 (молекула адгезии сперматозоидов 1), а Ser490 PH20 присутствует в форме, связанной с гликозилфосфатидилинозитолом (GPI) на поверхности плазматической мембраны сперматозоидов и в акросомальной мембране. Сперматозоид гидролизует гиалуроновую кислоту с помощью PH20, когда она проникает в ооциты через богатый гиалуронаном кумулюсный слой ооцитов. PH20 присутствует в количестве, соответствующем 1% или меньшему количеству белков в сперматозоидах, и имеет шесть сайтов N-гликозилирования (N82, N166, N235, N254, N368 и N393).

В настоящее время коммерчески доступный PH20 получают экстракцией из семенников крупного рогатого скота или овец. Их примеры включают Amphadase® (бычья гиалуронидаза) и Vitrase® (овечья гиалуронидаза).

Гиалуронидазу яичек крупного рогатого скота (англ. Bovine testicular hyaluronidase, BTH) получают путем удаления сигнального пептида и 56 аминокислот на С-конце из PH20 бычьего дикого типа во время посттрансляционной модификации. BTH также является гликопротеином и имеет содержание маннозы 5% и содержание глюкозамина 2,2% от общего количества компонентов, включая аминокислоты. Когда гиалуронидазу животного происхождения повторно вводят в организм человека в высокой дозе, может образоваться нейтрализующее антитело. Поскольку гиалуронидаза животного происхождения содержит другие биоматериалы в дополнение к PH20, она может вызывать аллергическую реакцию при введении в организм человека (Bookbinder et al., 2006). В частности, производство и применение PH20, экстрагированного из крупного рогатого скота, может быть ограничено из-за опасений, связанных с коровьим бешенством. Чтобы преодолеть эту проблему, были проведены исследования рекомбинантного белка PH20 человека.

Сообщалось, что рекомбинантный белок PH20 человека экспрессируется в дрожжах (P. pastoris), клетках насекомых DS-2 и клетках животных. Рекомбинантные белки PH20, продуцируемые в клетках насекомых и дрожжах, отличаются от PH20 человека с точки зрения характера N-гликозилирования во время посттрансляционной модификации.

Гиалуронидазы, белковые структуры которых были идентифицированы, представляют собой Hyal1 (PDB ID: 2PE4) (Chao et al., 2007) и гиалуронидазу пчелиного яда (PDB ID: 1FCQ, 1FCU, 1FCV). Hyal1 состоит из двух доменов: каталитического домена и EGF-подобного домена. Каталитический домен имеет форму (β/α)₈, в которой альфа-спираль и бета-цепь, которые характеризуют вторичную структуру белка, повторяются по восемь раз каждая (Chao et al., 2007). EGF-подобный домен полностью консервативен в вариантах, в которых C-конец Hyal1 сплайсирован другим путём. Аминокислотные последовательности Hyal1 и PH20 идентичны на 35,1%, а структура белка PH20 еще не выявлена.

Рекомбинантный белок PH20 человека был разработан Halozyme Therapeutic, Inc. и продается под торговым названием Hylenex® (Bookbinder et al., 2006; Frost, 2007).

Когда D146 и E148, которые являются каталитическими аминокислотами PH20, были мутированы в аспарагин (D146N) и глутамин (E148Q), соответственно, ферментативная активность отсутствовала (Arming et al., 1997). Кроме того, когда R246 в PH20 был заменен глицином, ферментативная активность снижалась на 90%, а когда E319 был заменен глутамином, а R322 был заменен треонином, ферментативная активность исчезла. Вариант, в котором были удалены 36 аминокислот на С-конце PH20 (удаление аминокислот 474-509), показал снижение ферментативной активности на 75% по сравнению с PH20 дикого типа. Этот мутант не секретировался внеклеточно, но оставался в клетках HeLa. Мутант, у которого 134 C-концевых аминокислоты были удалены из PH20, не имел ферментативной активности и не секретировался внеклеточно. Согласно Frost et al., C-концевой участок 477-483 PH20 важен для растворимой экспрессии (Frost, 2007). Активность полноразмерного PH20 (1-509) или варианта PH20, имеющего укороченный C-конец в положении 467, составляла всего 10% от варианта PH20, имеющего укороченный C-конец в одном из положений 477-483 (Frost, 2007).

Рекомбинантный PH20 используется в медицине в качестве носителя для подкожной доставки фармацевтических средств, для снижения внутриглазного давления у пациентов с офтальмологическими заболеваниями, для задержки стеноза после операции, в качестве диспергатора для повышения активности химиотерапевтических агентов при таких заболеваниях, как рак, в качестве вспомогательного терапевтического агента для хирургии и т.п.

В частности, в случае белковых лекарственных средств в последнее время были разработаны продукты с высокими дозами с высокими концентрациями от десятков мг до сотен мг на 1 мл, и, таким образом, применение рекомбинантного PH20 в качестве носителя для содействия подкожной доставке таких белковых лекарственных средств становится все больше. Такие белковые лекарственные средства могут иметь проблемы с низкой физической стабильностью в результате увеличения вязкости и агрегации белков из-за их высокой концентрации. Кроме того, агрегация белков необратима, и небольшие количества белков начинают агрегироваться, и агрегаты образуют более крупные сгустки (Schön et al., 2015). То есть рекомбинантная PH20, вводимая в комбинации, подвергается агрегации, что снижает стабильность белковых лекарственных средств.

Между тем, обычной рекомбинантной PH20 все еще недостаточно с точки зрения термостабильности и уровня экспрессии. Следовательно, в промышленности существует значительная потребность в рекомбинантной гиалуронидазе, обладающей еще более улучшенными биологическими и физико-химическими свойствами.

Список литературы

Arming, S., Strobl, B., Wechselberger, C., and Kreil, G. (1997). In-vitro mutagenesis of PH-20 hyaluronidase from human sperm. Eur. J. Biochem. 247, 810-814.

Bookbinder, L.H., Hofer, A., Haller, M.F., Zepeda, M.L., Keller, G.A., Lim, J.E., Edgington, T.S., Shepard, H.M., Patton, J.S., and Frost, G.I. (2006). A recombinant human enzyme for enhanced interstitial transport of therapeutics. J. Control. Release 114, 230-241.

Chao, K.L., Muthukumar, L., and Herzberg, O. (2007). Structure of human hyaluronidase-1, a hyaluronan hydrolyzing enzyme involved in tumor growth and angiogenesis. Biochemistry 46, 6911-6920.

Frost, G.I. (2007). Recombinant human hyaluronidase (rHuPH20): an enabling platform for subcutaneous drug and fluid administration. Expert Opin. Drug Deliv. 4, 427-440.

Schön, A., Clarkson, B.R., Siles, R., Ross, P., Brown, R.K., Freire, E. (2015) Denatured state aggregation parameters derived from concentration dependence of protein stability. Anal. Chem. 488, 45-50

WO 2020/022791 A (2020. 1. 30.)

Сущность изобретения

Таким образом, настоящее изобретение было создано с учетом вышеупомянутых проблем, и одной из целей настоящего изобретения является предоставление варианта PH20 или ее фрагмента с улучшенными термостабильностью, ферментативной активностью и уровнем экспрессии по сравнению с PH20 дикого типа, предпочтительно зрелой PH20 дикого типа.

Другой целью настоящего изобретения является предоставление композиции для лечения рака, включающей вариантную PH20 или ее фрагмент, и способ лечения с помощью нее рака.

В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения вышеуказанные и другие цели могут быть достигнуты путем предоставления варианта PH20 или ее фрагмента, содержащего одну или несколько замен, делеций и/или вставок аминокислотных остатков в варианте гиалуронидазы, имеющем аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, и в которой один или несколько аминокислотных остатков на N-конце или C-конце выборочно удалены.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предлагается композиция для лечения рака, содержащая вариантную PH20 или ее фрагмент, и способ лечения с помощью нее рака.

Эффекты изобретения

Варианты PH20 или их фрагменты в соответствии с настоящим изобретением характеризуются повышенным уровнем белковой экспрессии а также для них температура агрегации белка выше на 4-11,5°C или около того при экспрессии в клетках CHO (ExpiCHO), так что они эффективно продуцируются и характеризуются более высокой термостойкостью по сравнению со зрелой PH20 дикого типа.

Кроме того, согласно результатам анализа субстрат-гель, который является одним из тестов для измерения активности гиалуронидазы, у вариантов PH20 или их фрагментов в соответствии с настоящим изобретением улучшен рефолдинг белка, поэтому они регенерируются быстрее, чем зрелая PH20 дикого типа, и исходная ферментативная активность сохраняется независимо от положения C-концевого разрыва.

Кроме того, варианты PH20 или их фрагменты согласно настоящему изобретению обладают низкой иммуногенностью, так что их можно повторно вводить в организм человека.

Краткое описание чертежей

Вышеупомянутые и другие цели, особенности и другие преимущества настоящего изобретения будут более понятны из следующего подробного описания, взятого вместе с прилагаемыми чертежами, на которых:

на фиг. 1 показаны результаты анализа SDS-PAGE различных вариантов на основе варианта PH20, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3. Результат представленного ниже анализа SDS-PAGE в отношении каждого варианта получают путем очистки раствора культуры клеток животных, экспрессирующих каждый вариант, с помощью колоночной хроматографии и выполнения анализа 10% SDS-PAGE на конечном очищенном варианте;

более конкретно, фиг. 1A показаны результаты SDS-PAGE для вариантов HM98, HM99, HM130, HM143, HM71, HM100, HM131, HM72, HM101 и HM114;

на фиг. 1B показаны результаты SDS-PAGE для вариантов HM63, HM102, HM115, HM64, HM103, HM116, HM125, HM132, HM65, HM133, HM144, HM104 и HM117;

на фиг. 1C показаны результаты SDS-PAGE для вариантов HM66, HM105, HM134, HM76, HM106, HM135, HM136 и HM67;

на фиг. 1D показаны результаты SDS-PAGE для вариантов HM82, HM83, HM84, HM85, HM86, HM88, HM89, HM107, HM118, HM90, HM91, HM92, HM93, HM94 и HM95;

на фиг. 1E показаны результаты SDS-PAGE для вариантов HM73, HM111, HM121, HM139, HM74, HM112 и HM140;

на фиг. 1F показаны результаты SDS-PAGE для вариантов HM75, HM141, HM145, HM70, HM77, HM142, HM78, HM79, HM96, HM146, HM147, HM149 и HM150;

на фиг. 2 показаны уровни экспрессии зрелой PH20 дикого типа и варианта Hyal2, варианта Hyal3 и варианта Hyal4, в которых область от M345 до I361 зрелой PH20 дикого типа была заменена соответствующими последовательностями Hyal2, Hyal3 и Hyal4, соответственно, где дорожка CS в SDS-PAGE представляет собой образец культуральной среды, дорожка FT представляет собой несвязанную примесь в колонке HisTag, а дорожка E представляет собой элюат колонки HisTag;

на фиг. 3 показаны результаты анализа SDS-PAGE различных вариантов на основе варианта PH20, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3. Результат представленного ниже анализа SDS-PAGE в отношении каждого варианта получают путем очистки раствора культуры клеток животных, экспрессирующих каждый вариант, с помощью колоночной хроматографии и выполнения анализа 10% SDS-PAGE на конечном очищенном варианте;

на фиг. 3A показаны результаты SDS-PAGE для вариантов HM152, HM153, HM154, HM155, HM156, HM157, HM158, HM159, HM160, HM161, HM162, HM163, HM164, HM165, HM166, HM167 и HM167;

на фиг. 3B показаны результаты SDS-PAGE для вариантов HM170, HM171, HM172, HM173, HM174, HM175, HM176, HM177, HM178, HM179, HM180, HM181, HM182, HM183, HM184, HM185 и HM186;

на фиг. 3C показаны результаты SDS-PAGE для вариантов HM190, HM191, HM192, HM193, HM194, HM195, HM196, HM197, HM198, HM199, HM203, HM204 и HM205;

на фиг. 3D показывает результаты SDS-PAGE для вариантов HM208, HM210, HM211, HM212, HM213, HM214, HM216, HM217, HM218, HM219 и HM220;

на фиг. 3E показывает результаты SDS-PAGE для вариантов HM231, HM232, HM233, HM234, HM235, HM243, HM245 и HM246;

на фиг. 3F показаны результаты SDS-PAGE для вариантов HM254, HM261, HM262, HM263, HM266, HM268, HM271, HM275, HM276, HM279, HM280, HM287 и HM288; и

на фиг. 4 показаны результаты SDS-PAGE, подтверждающие термостабильность PH20 дикого типа (L36-Y482) и варианта PH20 (F38-F468), имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, где дорожки A, B, C и D показывают результаты анализа SDS-PAGE в отношении исходного PH20 дикого типа (дорожки A и C) и варианта PH20 SEQ ID NO: 3 (дорожки B и D) в восстановленной форме (дорожки A и B) и невосстановленной форме (дорожки C и D), а дорожки E, F, G и H показывают результаты анализа SDS-PAGE относительно исходной PH20 дикого типа (дорожки E и G) и варианта PH20 SEQ ID NO: 3 (дорожки F и H) в восстановленной форме (дорожки E и F) и в невосстановленной форме (дорожки G и H) после хранения в течение 7 дней при 42°C.

Подробное описание изобретения

Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют те же значения, которые понятны специалистам в области, к которой относится настоящее изобретение. В общем, используемая в данном документе номенклатура хорошо известна в данной области и обычно используется.

В настоящем изобретении положение аминокислотного остатка каждого варианта определяется из аминокислотной последовательности по SEQ ID NO: 1, при описании на основе PH20 дикого типа, и положения аминокислотного остатка каждого варианта. относится к аминокислотной последовательности согласно SEQ ID NO: 3, при описании на основе варианта PH20, имеющего SEQ ID NO: 3.

В ходе предыдущих исследований авторы настоящего изобретения обнаружили, что вариант гиалуронидазы PH20, который включает одну или несколько замен аминокислотных остатков в области, соответствующей области альфа-спирали и/или ее линкерной области, предпочтительно области альфа-спирали 8 (S347-C381) и/или линкерной области (A333-R346) между альфа-спиралью 7 и альфа-спиралью 8, в PH20 дикого типа, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, предпочтительно зрелой PH20 дикого типа, и необязательно в которой один или несколько N-концевых и/или C-концевых аминокислотных остатков селективно отщеплены и удалены, демонстрирует превосходную эффективность по сравнению с обычным PH20 дикого типа или его фрагментами, и подали заявку на патент в отношении этого открытия (см. WO 2020/022791A).

Используемый в данном документе термин «зрелая PH20 дикого типа» означает белок, состоящий из аминокислотных остатков с L36 по Y482 или с L36 по S490 SEQ ID NO: 1, в котором отсутствуют M1-T35, которые образуют сигнальный пептид, и N483-L509 или A491-L509, которые не связаны с существенной ферментативной функцией PH20, в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 PH20 дикого типа.

В частности, в ходе предыдущих исследований авторы настоящего изобретения обнаружили, что, когда аминокислотные участки, соответствующие T341-I361, которые являются частью области альфа-спирали 8 (S347 - C381) и/или линкерной области (A333 - R346) между альфа-спиралью 7 и альфа-спиралью 8, в PH20 дикого типа, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, заменены аминокислотными остатками, соответствующими Hyal1 дикого типа, имеющей последовательность SEQ ID NO: 2, эффективность экспрессии и ферментативная активность улучшается, и фрагменты, в которых удалена часть аминокислотной последовательности на N-конце и C-конце, также демонстрируют превосходную эффективность экспрессии и высокую ферментативную активность.

Таблица 1. Аминокислотная последовательность PH20 дикого типа и Hyal1 дикого типа

Аминокислотная последовательность PH20 дикого типа (SEQ ID NO: 1)
MGVLKFKHIFFRSFVKSSGVSQIVFTFLLIPCCLTLNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGTLSIMRSMKSCLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFYNASPSTLSATMFIVSILFLIISSVASL Аминокислотная последовательность Hyal1 дикого типа (SEQ ID NO: 2)
MAAHLLPICALFLTLLDMAQGFRGPLLPNRPFTTVWNANTQWCLERHGVDVDVSVFDVVANPGQTFRGPDMTIFYSSQLGTYPYYTPTGEPVFGGLPQNASLIAHLARTFQDILAAIPAPDFSGLAVIDWEAWRPRWAFNWDTKDIYRQRSRALVQAQHPDWPAPQVEAVAQDQFQGAARAWMAGTLQLGRALRPRGLWGFYGFPDCYNYDFLSPNYTGQCPSGIRAQNDQLGWLWGQSRALYPSIYMPAVLEGTGKSQMYVQHRVAEAFRVAVAAGDPNLPVLPYVQIFYDTTNHFLPLDELEHSLGESAAQGAAGVVLWVSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLGPFILNVTSGALLCSQALCSGHGRCVRRTSHPKALLLLNPASFSIQLTPGGGPLSLRGALSLEDQAQMAVEFKCRCYPGWQAPWCERKSMW

В результате непрерывных исследований авторы настоящего изобретения обнаружили, что вариант, имеющий последовательность SEQ ID NO: 3, сконструированный путем замены аминокислотной области, соответствующей T341, на I361 PH20 дикого типа, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 с соответствующей аминокислотной последовательностью Hyal1 дикого типа, имеющей последовательность SEQ ID NO: 2, по-прежнему демонстрирует превосходную эффективность экспрессии и высокую ферментативную активность, а также заметно улучшенную температуру агрегации белка (Tagg) по сравнению с PH20 дикого типа, хотя он включает дополнительные замены, делеции и/или вставки аминокислотных остатков, и дополнительно необязательно включает делеции одного или нескольких аминокислотных остатков на N-конце и/или C-конце. На основании этого открытия было завершено настоящее изобретение.

Вариант, имеющий последовательность SEQ ID NO: 3, сконструирован путем замены 15 аминокислотных остатков, а именно T341S, L342W, S343E, I344N, M345T, S347T, M348K, K349E, L352Q, L353A, L354I, D355K, N356E, E359D и I361T в PH20 дикого типа, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.

В этом отношении вариант PH20 или его фрагмент согласно настоящему изобретению включает замену, делецию и/или вставку одного или нескольких аминокислотных остатков в варианте PH20, имеющем аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, и необязательно включает делецию одного или нескольких аминокислотных остатков на N-конце и/или C-конце.

Как описано выше, вариант, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, представляет собой вариант, в котором аминокислотные остатки с T341 по I361 PH20 дикого типа заменены соответствующими аминокислотными остатками Hyal1 дикого типа (см. таблицу 2). Вариант, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 или ее фрагмент, включающий делецию аминокислотных остатков на N-конце и C-конце, был идентифицирован как вариант, обладающий активностью и стабильностью, превосходящей таковые PH20 дикого типа в предыдущем исследовании.

Таблица 2. Аминокислотная последовательность варианта PH20, в которой аминокислотные остатки в положениях с T341 по I361 из PH20 дикого типа заменены соответствующими аминокислотными остатками Hyla1 (SEQ ID NO: 3)

В частности, вариант PH20 или его фрагмент согласно настоящему изобретению может включать одну или несколько мутаций, предпочтительно одну или несколько замен аминокислотных остатков, делеций и/или вставок в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3, и имеет более высокую температуру агрегации белка (Tagg), которая является показателем стабильности белка, чем у PH20 дикого типа. Кроме того, вариант PH20 согласно настоящему изобретению не включает PH20 дикого типа с SEQ ID NO: 1.

Используемый в данном документе термин «вариант PH20» предназначен для включения варианта, имеющего не только мутацию одного или нескольких аминокислотных остатков, предпочтительно замену, делецию и/или вставку одного или нескольких аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3, но также делецию одного или нескольких аминокислотных остатков на его N-конце или C-конце вместе с заменой, делецией и/или вставкой аминокислотных остатков, и используется по существу в том же значении что и выражение «вариант PH20 или его фрагмент».

Предпочтительно вариант PH20 в соответствии с настоящим изобретением включает замену, вставку и/или делецию аминокислотных остатков в одном или нескольких положениях, выбранных из группы, состоящей из R39, D65-L68, N82, T84, I102-I105, T132-Y134, N166, L179-T182, T185-K187, V241-K244, N266-Q269, P271, V272, K290-P292, Q311-K314, G340-N363, L441, S442, D451-D453, D461, V463 и D461-V463 в варианте, имеющем аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, и имеет более высокую температуру агрегации белка (Tagg), чем у PH20 дикого типа.

Вариант PH20 согласно настоящему изобретению может включать мутацию в 20 или менее, предпочтительно 17 или менее, более предпочтительно 15 или менее аминокислотных положений в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3, без ограничения указанным.

Более предпочтительно вариант PH20 или его фрагмент согласно настоящему изобретению включает по меньшей мере одну замену аминокислотного остатка, выбранную из группы, состоящей из R39K, D65A, E66A, P67A, L68A, N82A, T84N, I102A, D103A, S104A, S104N, I105A, I105Q, T132A, T132S, F133A, Y134A, N166A, N166K, L179A, L179S, L179I, L179F, S180T, S180A, L181A, L181M, T182A, T185A, E186A, E186D, K187A, V241A, E242A, I243A, K244A, N266A, T267A, Q268A, Q268D, Q268I, Q268N, Q269A, P271A, V272A, K290A, I291A, I291G, I291L, P292A, P292D, Q311A, V312A, L313A, L313P, L313M, K314A, G340Q, S341H, S341D, S341T, W342I, W342D, W342H, W342L, E343V, E343S, E343Y, E343Q, N344F, N344I, T345E, T345K, T345S, R346M, R346F, R346L, R346T, R346S, R346A, T347Q, T347E, T347V, T347W, T347H, T347S, K348Q, K348F, K348D, K348T, K348E, K348M, E349L, E349W, E349A, S350Q, S350I, S350D, S350T, S350E, S350N, Q352E, Q352G, Q352Y, Q352W, Q352T, A353E, A353Y, A353H, A353K, I354E, I354Q, I354S, I354V, I354A, I354N, I354T, I354R, I354W, I354L, K355Q, K355H, K355D, E356M, E356F, E356I, E356L, E356Q, E356V, E356D, Y357W, Y357F, M358V, M358R, M358Y, M358L, D359K, D359V, D359Y, D359Q, D359T, D359S, D359E, T360Y, T360R, T360L, T360D, T360S, T361M, T361E, T361H, T361L, T361D, T361I, L362A, N363M, N363E, L441A, S442A, D451A, D451S, T452A, T452D, T452H, T452K, T452G, T452P, T452M, T452F, D453A, D461R, D461A, G462A, V463Y и V463A в варианте, имеющем аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, без ограничения указанным.

В настоящем изобретении выражение, описываемое однобуквенным кодом аминокислотного остатка вместе с числами, такое как «S341», означает аминокислотный остаток в определенном положении в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3.

Например, «S341» означает, что аминокислотный остаток в положении 341 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3 представляет собой серин, а «S341H» означает, что серин в положении 341 из SEQ ID NO: 3 замещен гистидином.

Вариант PH20 или его фрагмент согласно настоящему изобретению интерпретируется как включающий его варианты или фрагменты, в которых аминокислотный остаток в определенном положении аминокислотного остатка консервативно замещен.

Используемый в данном документе термин «консервативная замена» относится к модификациям варианта PH20, которые включают замену одной или нескольких аминокислот другими аминокислотами, имеющими аналогичные биохимические свойства, которые не приводят к потере биологической или биохимической функции варианта PH20.

Термин «консервативная аминокислотная замена» относится к замене аминокислотного остатка на аминокислотный остаток, имеющий аналогичную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих аналогичные боковые цепи, были определены и хорошо известны в области, к которой относится настоящее изобретение. Эти семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин и гистидин), аминокислоты с кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота), аминокислоты с незаряженными полярными боковыми цепями (например, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин и цистеин), аминокислоты с неполярными боковыми цепями (например, глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин и триптофан), аминокислоты с бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин и изолейцин) и аминокислоты с ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан и гистидин).

Обнаружено, что вариант PH20 или его фрагменты по настоящему изобретению сохраняет свою активность, несмотря на наличие консервативных аминокислотных замен.

Кроме того, вариант PH20 или его фрагмент согласно настоящему изобретению интерпретируется как включающий варианты PH20 или ее фрагменты, имеющие по существу такую же функцию и/или эффект, что и варианты PH20 или ее фрагмент согласно настоящему изобретению, и имеющий гомологию аминокислотной последовательности по меньшей мере 80% или 85%, предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99% с вариантом PH20 или ее фрагментом согласно настоящему изобретению.

Варианты PH20 или их фрагменты согласно настоящему изобретению обладают повышенными уровнями экспрессии и скоростью рефолдинга белка и, таким образом, имеют более высокую термическую стабильность, чем зрелая PH20 дикого типа. Кроме того, ферментативная активность вариантов PH20 была выше или аналогична ферментативной активности зрелой PH20 дикого типа, несмотря на повышение термостабильности.

Между тем, хотя известно, что зрелый вариант PH20 дикого типа, имеющий разрыв на С-конце, имеет пониженную ферментативную активность, варианты PH20 согласно настоящему изобретению демонстрируют аналогичную или повышенную ферментативную активность и эффективность экспрессии, а также высокие температуры агрегации белка (Tagg) из-за более быстрого рефолдинга белка и его термостабильности, несмотря на то, что один или несколько аминокислотных остатков на С-конце отщеплены или удалены, и/или от 1 до 7, предпочтительно от 1 до 5 аминокислотных остатков на N-конце отщеплены или удалены.

Соответственно, вариант PH20 или его фрагмент согласно настоящему изобретению отличается тем, что включает одну или несколько аминокислотных мутаций, предпочтительно одну или несколько замен, делеций и/или вставок аминокислотных остатков в варианте, имеющем аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 или т.п., и один или несколько аминокислотных остатков на N-конце и/или C-конце дополнительно удалены, без ограничения указанным.

В одном воплощении вариант PH20 или его фрагмент согласно настоящему изобретению может представлять собой вариант, в котором разрыв происходит перед аминокислотным остатком, выбранным из группы, состоящей из M1-P42 на N-конце, предпочтительно перед аминокислотным остатком L36, N37, F38, R39, A40, P41 или P42 на N-конце в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3, так что один или несколько аминокислотных остатков на N-конце удаляются, и/или разрыв происходит после аминокислотного остатка, выбранного из группы, состоящей из V455-L509, предпочтительно после аминокислотного остатка, выбранного из группы, состоящей из V455-S490, наиболее предпочтительно после аминокислотного остатка V455, D456, C458, D461, C464, I465 , D466, A467, F468, K470, P471, P472, M473, E474, T475, E476, P478, I480, Y482, A484, P486, T488 или S490 на С-конце, так что один или несколько аминокислотных остатков на C-конце удаляются.

Выражение «разрыв происходит перед аминокислотным остатком, выбранным из группы, состоящей из M1-P42 на N-конце» означает, что часть аминокислотных остатков непосредственно перед выбранным аминокислотным остатком из M1-P42 на N-конце отщепляется и удаляется. Выражение «разрыв происходит перед M1» означает, что на N-конце разрыв не происходит.

Например, выражение «разрыв происходит до аминокислотного остатка L36, N37, F38, R39, A40, P41 или P42» означает, что все аминокислотные остатки от M1 до T35 непосредственно перед L36, все аминокислотные остатки от M1 до L36 непосредственно перед N37, все аминокислотные остатки от M1 до N37 непосредственно перед F38, все аминокислотные остатки от M1 до F38 непосредственно перед R39, все аминокислотные остатки от M1 до R39 непосредственно перед A40, все аминокислотные остатки от M1 до A40 непосредственно перед P41 или все аминокислотные остатки от M1 до P41 непосредственно перед P42 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3 согласно настоящему изобретению отщепляются и удаляются.

Кроме того, выражение «разрыв происходит после аминокислотного остатка, выбранного из группы, состоящей из V455-L509 на С-конце» означает, что часть аминокислотных остатков непосредственно перед выбранным аминокислотным остатком из числа M1-P42 на N-конец отщепляется и удаляется.

Например, выражение «разрыв происходит после аминокислотного остатка V455, D456, C458, D461, C464, I465, D466, A467, F468, K470, P471, P472, M473, E474, T475, E476, P478, I480, Y482, A484, P486, T488 или S490 на С-конце» означает, что аминокислотный остаток после аминокислотного остатка V455, D456, C458, D461, C464, I465, D466, A467, F468, K470, P471, P472, M473 , E474, T475, E476, P478, I480, Y482, A484, P486, T488 или S490 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3 в соответствии с настоящим изобретением отщепляется и/или все аминокислотные остатки из аминокислотного остатка сразу после выбранного аминокислотного остатка L509 удаляются.

Предпочтительно новый вариант PH20 или его фрагмент согласно настоящему изобретению отличается тем, что включает замену, делецию или вставку аминокислотного остатка в одном или нескольких положениях в варианте, имеющем аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, и укорочение перед F38 на N-конце и укорочение после F468 на C-конце.

Более предпочтительно, новый вариант PH20 или его фрагмент согласно настоящему изобретению может включать аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 163-316, без ограничения указанным.

Последовательности замещенных или отщепленных аминокислот в варианте PH20, сконструированном в конкретном воплощении согласно настоящему изобретению, показаны в таблице 6.

Кроме того, в настоящем изобретении была предпринята попытка увеличить экспрессию рекомбинантного белка PH20 с использованием другого сигнального пептида из белков, высоко экспрессируемых в клетках животных, вместо применения исходного сигнального пептида PH20.

Следовательно, в другом воплощении новый вариант PH20 согласно настоящему изобретению может представлять собой вариант, в котором N-конец дополнительно включает сигнальный пептид гормона роста человека, имеющий аминокислотную последовательность MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA SEQ ID NO: 4, сигнальный пептид сывороточного альбумина человека, имеющий аминокислотную последовательность MKWVTFISLLFLFSSAYS SEQ ID NO: 5, или сигнальный пептид Hyal1 человека, имеющий аминокислотную последовательность MAAHLLPICALFLTLLDMAQG SEQ ID NO: 6, как показано в таблице 3 ниже, вместо сигнального пептида PH20 дикого типа, который состоит из M1-T35, без ограничения указанным.

Выражение «вместо сигнального пептида PH20 дикого типа, который состоит из M1-T35» означает случай, в котором сигнальный пептид в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3 частично или полностью удален и, таким образом, не выполняет свою функцию. Кроме того, предполагается, что выражение включает случай, в котором часть N-конца дополнительно удаляется, например, случай, когда разрыв осуществляется перед остатком N37, F38, R39, A40, P41 или P42, так что происходит дополнительная делеция N-конца вместе с делецией сигнального пептида PH20 дикого типа.

Таблица 3. Последовательность сигнального пептида согласно настоящему изобретению

Аминокислотная последовательность SEQ ID NO. Гормон роста человека MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA 4 Альбумин сыворотки человека MKWVTFISLLFLFSSAYS 5 Hyal1 человека MAAHLLPICALFLTLLDMAQG 6

В другом аспекте настоящее изобретение направлено на композицию для лечения рака, содержащую новый вариант PH20 или его фрагмент согласно настоящему изобретению, и способ лечения рака с ее помощью.

Раковые заболевания или карциномы, которые можно лечить с помощью нового варианта PH20 или ее фрагмента согласно настоящему изобретению, ничем особо не ограничены, но включают как солидные злокачественные опухоли, так и гемобластозы. Рак может быть выбран из группы, состоящей из рака кожи, такого как меланома, рака печени, гепатоцеллюлярной карциномы, рака желудка, рака молочной железы, рака легких, рака яичников, рака бронхов, рака носоглотки, рака гортани, рака поджелудочной железы, рака мочевого пузыря, колоректального рака, рака ободочной кишки, рака шейки матки, рака мозга, рака предстательной железы, рака костей, рака щитовидной железы, рака паращитовидной железы, рака почек, рака пищевода, рака желчных путей, рака яичка, рака прямой кишки, рака головы и шеи, рака мочеточника, остеосаркомы, нейроцитомы, фибросаркомы, рабдомиосаркомы, астроцитомы, нейробластомы и нейроглиомы, без ограничения указанным. Предпочтительно, рак, который можно лечить композицией согласно настоящему изобретению, может быть выбран из группы, состоящей из колоректального рака, рака молочной железы, рака легких и рака почек, без ограничения указанным.

Композиция по настоящему изобретению может быть фармацевтической композицией. Фармацевтическая композиция может дополнительно включать фармацевтически приемлемую композицию. Композиция может содержать один или несколько компонентов, выбранных из группы, состоящей из лактозы, декстрозы, сахарозы, сорбита, маннита, крахмала, гуммиарабика, фосфата кальция, альгината, желатина, силиката кальция, микрокристаллической целлюлозы, поливинилпирролидона, целлюлозы, воды, сиропов, метил целлюлозы, метилгидроксибензоата, пропилгидроксибензоата, талька, стеарата магния и минерального масла, которые обычно используются при приготовлении лекарственных средств, без ограничения указанным. Кроме того, фармацевтическая композиция может дополнительно содержать одно или несколько веществ, выбранных из группы, состоящей из разбавителей, наполнителей, смазывающих веществ, смачивающих агентов, подсластителей, ароматических углеводородов, эмульгаторов, суспензий и консервантов, которые обычно используются при приготовлении лекарственных средств.

Фармацевтическая композиция может вводиться перорально или парентерально. Парентеральное введение осуществляется путем внутривенной инъекции, подкожной инъекции, внутримышечной инъекции, внутрибрюшинной инъекции, эндотелиального введения, местного введения, интраназального введения, внутрилегочного введения, ректального введения и т.п. Для перорального введения активный ингредиент в пероральной композиции должен быть включен в лекарственную форму с покрытием или в лекарственную форму, которая может защитить активный ингредиент от распада в желудке, учитывая, что пептиды и белки перевариваются в желудке. Альтернативно, настоящая композиция может вводиться через любое устройство, с помощью которого активный ингредиент может перемещаться к интересующей клетке-мишени.

Фармацевтическая композиция может быть приготовлена в форме растворов, суспензий, сиропов или эмульсий в маслах или водных средах, или в форме экстрактов, зерен, порошков, гранул, таблеток или капсул, и может дополнительно включать диспергирующие или стабилизирующие агенты для цели приготовления лекарственного средства.

В частности, композиция для лечения рака согласно настоящему изобретению может использоваться в комбинированной терапии с другими противораковыми лекарственными средствами.

Противораковое лекарственное средство, которое можно использовать в комбинированной терапии с новым вариантом PH20 или ее фрагментом согласно настоящему изобретению, предпочтительно представляет собой химическое противораковое лекарственное средство, противораковое лекарственное средство на основе антител, биологическое противораковоее лекарственное средство, RNAi или клеточный терапевтический агент, без ограничения указанным.

Предпочтительно противораковое лекарственное средство, которое можно использовать в комбинированной терапии с новым вариантом PH20 или ее фрагментом согласно настоящему изобретению, предпочтительно является иммуноонкологическим агентом и более предпочтительно ингибитором иммунных контрольных точек, без ограничения указанным.

Кроме того, настоящее изобретение направлено на способ лечения рака с использованием нового варианта или фрагмента PH20 в сочетании с другими противораковыми средствами, в частности, с противораковыми средствами, описанными выше.

В другом аспекте настоящее изобретение направлено на нуклеиновую кислоту, кодирующую вариант PH20 или его фрагмент.

Используемые в данном документе нуклеиновые кислоты могут присутствовать в клетках, в клеточном лизате или в частично очищенной или практически чистой форме. «Выделенные» или «по существу чистые» применительно к нуклеиновым кислотам относятся к тем нуклеиновым кислотам, которые были очищены и, таким образом, отделены от других клеточных компонентов или других загрязнителей, например, других клеточных нуклеиновых кислот или белков, с помощью стандартных методов, включая обработку щелочью/обработку SDS, связывание CsCl, колоночную хроматографию, электрофорез в агарозном геле и другие, хорошо известные в данной области техники. Нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению могут быть ДНК или РНК.

В еще одном аспекте настоящее изобретение направлено на рекомбинантный экспрессирующий вектор, включающий нуклеиновую кислоту. Для экспрессии варианта PH20 или ее фрагмента согласно настоящему изобретению ДНК, кодирующая вариант PH20 или его фрагмент, может быть получена стандартными методами молекулярной биологии (например, ПЦР амплификацией или клонированием кДНК с использованием гибридомы, которая экспрессирует вариант PH20), и ДНК может быть вставлена в экспрессирующий вектор, так что она будет «функционально связана» с последовательностями, контролирующими транскрипцию и трансляцию.

Используемый в данном документе термин «функционально связанный» предназначен для обозначения того, что ген, кодирующий вариант PH20 или его фрагмент, лигируется в вектор, так что последовательности контроля транскрипции и трансляции служат его предполагаемым функциям регулирования транскрипции и трансляции гена, кодирующего вариант PH20 или его фрагмент. Экспрессирующий вектор и последовательности контроля экспрессии выбираются так, чтобы они были совместимы с используемой экспрессирующей клеткой-хозяином. Гены, кодирующие PH20, вставляют в экспрессирующий вектор стандартными способами (например, лигированием комплементарных сайтов рестрикционных ферментов на фрагменте гена, кодирующего вариант PH20 или его фрагмент, и векторе, или лигированием по тупым концам, если сайты рестрикционных ферментов отсутствуют).

Кроме того, рекомбинантные экспрессирующие векторы несут регуляторные последовательности, которые контролируют экспрессию гена, кодирующего вариант PH20 или его фрагмент, в клетке-хозяине. Термин «регуляторная последовательность» включает промоторы, энхансеры и другие элементы контроля экспрессии (например, сигналы полиаденилирования), которые контролируют транскрипцию или трансляцию генов, кодирующих вариант PH20 или его фрагмент. Специалистам в данной области будет понятно, что дизайн экспрессирующего вектора, включая выбор регуляторных последовательностей, может зависеть от таких факторов, как выбор клетки-хозяина для трансформации, искомый уровень экспрессии белка, и т.п.

В еще одном аспекте настоящее изобретение направлено на клетку-хозяина, включающую нуклеиновую кислоту или вектор. Клетка-хозяин согласно настоящему изобретению предпочтительно выбирается из группы, состоящей из клеток животных, клеток растений, дрожжей, E. coli и клеток насекомых, без ограничения указанным.

В частности, клетка-хозяин согласно настоящему изобретению включает прокариотические клетки, такие как E. coli, Bacillus subtilis, Streptomyces sp., Pseudomonas sp., Proteus mirabilis или Staphylococcus sp., грибы, такие как Aspergillus sp., Дрожжи, такие как Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces sp. и Neurospora crassa, и эукариотические клетки, такие как низшие эукариотические клетки, и высшие другие эукариотические клетки, такие как клетки насекомых.

Кроме того, клетки-хозяева, которые можно использовать в настоящем изобретении, могут быть получены из растений или млекопитающих. Предпочтительно, примеры клеток-хозяев включают, без ограничения указанным, клетки почек обезьяны (COS7), клетки NSO, SP2/0, клетки яичника китайского хомяка (CHO), W138, клетки почки детеныша хомяка (BHK), MDCK, клетки миеломы, клетки HuT 78 и клетки HEK293. Более предпочтительным является использование клеток СНО.

Нуклеиновую кислоту или вектор трансфицируют в клетку-хозяин. Трансфекцию можно проводить с использованием различных методов, которые обычно используются для введения чужеродной нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) в прокариотические или эукариотические клетки, например, электрофорез, осаждение фосфатом кальция, трансфекция DEAE-декстраном или липофекция. Для экспрессии варианта PH20 или ее фрагмента по настоящему изобретению можно использовать различные комбинации рекомбинантных экспрессирующих векторов и клеток-хозяев. Предпочтительный экспрессирующий вектор для эукариотических клеток включает регуляторные последовательности экспрессии генов, происходящие от SV40, вируса папилломы крупного рогатого скота, аденовируса, аденоассоциированного вируса, цитомегаловируса и ретровируса, без ограничения указанным. Экспрессирующие векторы, которые можно использовать для бактериальных хозяев, включают бактериальные плазмиды, такие как pET, pRSET, pBluescript, pGEX2T, векторы pUC, col E1, pCR1, pBR322, pMB9 и их производные, полученные из E. coli; плазмида с широким кругом хозяев, такая как RP4; фаговые ДНК, представленные различными производными фагов лямбда, такими как λgt10, λgt11 и NM989; и другие ДНК-фаги, такие как M13 и нитчатый одноцепочечный ДНК-фаг. Экспрессирующий вектор, доступный для дрожжевых клеток, может представлять собой плазмиду размером 2 мкм и ее производные. Экспрессирующие векторы для клеток насекомых включают pVL941.

В другом аспекте настоящее изобретение направлено на способ получения варианта PH20 или ее фрагмента, способ включает культивирование клетки-хозяина и экспрессию варианта PH20 или ее фрагмента согласно настоящему изобретению.

Когда рекомбинантный экспрессирующий вектор, способный экспрессировать вариант PH20 или его фрагмент, вводят в клетки-хозяева млекопитающих, вариант PH20 или его фрагмент можно получить путем культивирования клеток-хозяев в течение периода времени, при котором вариант PH20 или его фрагмент экспрессируется. в клетках-хозяевах предпочтительно такой период времени, чтобы вариант PH20 секретировался в среду во время культивирования клеток-хозяев.

В альтернативном воплощении экспрессированный вариант PH20 или его фрагмент можно выделить и очистить из клеток-хозяев. Выделение или очистка варианта PH20 или ее фрагмента может выполняться обычными методами выделения/очистки (например, хроматографией), которые используются для белков. Хроматография может включать комбинацию одного или нескольких, выбранных из аффинной хроматографии, ионообменной хроматографии и гидрофобной хроматографии, без ограничения указанным. В дополнение к хроматографии может использоваться комбинация фильтрации, ультрафильтрации, высаливания, диализа и т.п.

Чтобы подтвердить промышленную применимость фермента, необходимо проанализировать скорость каталитической реакции фермента. Типы ферментативных реакций включают ферментативную реакцию с активным центром с фиксированной реакционной способностью и ферментативную реакцию с несколькими активными центрами с различной реакционной способностью. Известно, что скорость каталитической реакции ферментов, имеющих активный центр с фиксированной реакционной способностью, таких как гиалуронидаза, соответствует формуле скорости Михаэлиса-Ментен.

Ферментативная кинетика Михаэлиса-Ментен основана на предположении, что ферментативная реакция представляет собой двухступенчатую реакционную систему, включающую стадию обратимой реакции, на которой образуется Комплекс [ES] фермент (E)-субстрат (S), и стадию необратимой реакции, в котором комплекс ES диссоциирует с образованием Продукта (P). В этом случае k_f, k_r и k_cat-константы скорости реакции в каждом направлении (Alan Fersht (1977) Enzyme structure and mechanism).

Ферментативная реакция предполагает, что процесс взаимодействия фермента с субстратом с образованием комплекса ES быстро достигает равновесия, или его можно рассматривать как псевдостационарное состояние, предполагая, что d[ES]/dt 0 удовлетворяется за счет значительного снижения концентрации фермента путем проведения реакции, которая поддерживает достаточно высокую концентрацию субстрата. Поскольку уравнения скорости, предполагающие быстрое равновесие или псевдостационарное состояние, выводятся таким же образом, в большинстве экспериментов предполагается псевдостационарное состояние, в котором концентрация субстрата изначально выше, чем концентрация фермента.

При таких условиях, как «количество фермента постоянно до и после реакции» и «когда химическая реакция достигает химического равновесия, скорость реакции, при которой получается продукт, равна скорости, с которой продукт снова разлагается», при использовании такого предположения, скорость реакции конечного продукта может быть выражена следующей формулой скорости Михаэлиса-Ментен. В этом случае K_M = (k_r + k_cat ) / k_f, and V_max = k_cat [E]₀.

Уравнение Лайнуивера-Берка используется для экспериментального анализа скорости ферментативной реакции с использованием формулы скорости Михаэлиса-Ментен. Это уравнение показывает взаимосвязь между обратной величиной 1/V экспериментально измеренной скорости реакции и обратной величиной 1/[S] данной концентрации субстрата в эксперименте. Статистическая проверка того, что это уравнение является линейным уравнением, демонстрирует, что ферментативная реакция является реакцией, соответствующей формуле скорости Михаэлиса-Ментен, и K_M и V_max могут быть рассчитаны с использованием этого уравнения.

Ферменты, которые катализируют химическую реакцию, имеют переходное состояние после связывания с субстратом в активном центре, а энергия активации для достижения переходного состояния с высокой энергией снижается за счет множественных связей с субстратом. Константа равновесия для достижения этого переходного состояния пропорциональна k_cat/K_M. Здесь 1/K_M-это индекс, который объединяет степень, в которой комплекс фермент-субстрат образуется путем связывания фермента с субстратом, со степенью, в которой комплекс фермент-субстрат сохраняется без разложения, а k_cat-константа равновесия, при которой продукт получается из комплекса фермент-субстрат. Следовательно, k_cat/K_M можно назвать индикатором того, сколько продукта можно получить из субстрата и фермента, то есть каталитической эффективности фермента.

Доступность гиалуронидазы пропорциональна ее каталитической эффективности. В частности, когда фермент вводится подкожно вместе с полимерным фармакологически активным веществом, таким как моноклональное антитело, каталитическая эффективность гиалуронидазы играет важную роль. В случае, когда вариант согласно настоящему изобретению имеет более высокое значение k_cat/K_M, чем PH20 дикого типа, когда гиалуронидаза в сочетании с полимерным фармакологически активным веществом вводится подкожно, гиалуроновая кислота, присутствующая в ней, быстро разлагается и, таким образом, можно получить превосходящий эффект быстро диспергируемого фармакологически активного вещества. Кроме того, когда вариант согласно настоящему изобретению имеет большее значение k_cat, чем PH20 дикого типа, максимальная скорость реакции V_max увеличивается при той же концентрации фермента, обеспечивая тем самым превосходные эффекты разложения большего количества гиалуроновой кислоты в течение того же периода времени и распространение фармакологически активного вещества в более широкой области.

Следовательно, чтобы подтвердить ферментативные свойства варианта PH20 согласно настоящему изобретению, проанализировали скорость ферментативной реакции каждого варианта и в Примере 4 сравнили V_max (максимальная скорость ферментативной реакции), K_M (концентрация субстрата при условии 50% V_max), k_cat (скорость превращения субстрата) и k_cat/K_M (эффективность ферментного катализатора). Описанные выше результаты демонстрируют, что вариант PH20 согласно настоящему изобретению превосходит PH20 дикого типа.

Примеры

Далее настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на примеры. Однако для специалистов в данной области техники будет очевидно, что эти примеры представлены только для иллюстрации настоящего изобретения и не должны рассматриваться как ограничивающие объем настоящего изобретения.

Пример 1. Создание вариантов PH20

Для конструирования вариантов PH20 кДНК (ID клона: hMU002604) для PH20 дикого типа была приобретена в Корейском банке генов человека. PH20 дикого типа кодирует аминокислоты с L36 по S490. Ген PH20 амплифицировали с помощью полимеразной цепной реакции (далее называемой ПЦР) и вставляли в сайты рестрикционных ферментов XhoI и NotI вектора pcDNA3.4-TOPO. Для экспрессии в клетках ExpiCHO в качестве сигнального пептида вместо исходного сигнального пептида PH20 использовали сигнальный пептид гормона роста человека, гормона сыворотки человека или Hyal1 человека. Для очистки белка с использованием колонки HisTrap ДНК-последовательность His-метки была расположена на 3’-конце кДНК PH20. Аминокислотную замену вариантов PH20 выполняли с помощью ПЦР, и подтверждали аминокислотную замену секвенированием ДНК.

Перечень праймеров, используемых при клонировании вариантов PH20, указан в виде сводных данных в таблице 4 ниже, а конкретные последовательности праймеров указаны в виде сводных данных в таблице 5 ниже.

Таблица 4 Перечень праймеров, используемых при клонировании вариантов PH20 согласно настоящему изобретению

Клон Праймер 1 2 3 cB4205 ALB-SP-Xho B4-hy2 SPAM1-6H-not cB4206 ALB-SP-Xho B4-hy3 SPAM1-6H-not cB4207 ALB-SP-Xho B4-hy4 SPAM1-6H-not cB4213-m63 opB4-Xho-hSA op-F468-6H-not - cB4213-m64 opB4-Xho-hSA op-Q347-m64 op-F468-6H-not cB4213-m65 op-Xho-hSA-L op-Q348-m65 op-F468-R cB4213-m66 op-Xho-hSA-L op-Q350-m66 op-F468-R cB4213-m67 opB4-Xho-hSA op-Q355-m67 op-F468-6H-not cB4213-m69 op-Xho-hSA-L op-V358-m69 op-F468-6H-not cB4213-m70 op-Xho-hSA-L op-A362-m70 op-F468-6H-not cB4213-m71 opB4-Xho-hSA op-V343-m71 op-F468-6H-not cB4213-m72 opB4-Xho-hSA op-F344-m72 op-F468-6H-not cB4213-m73 op-Xho-hSA-L op-K359-mega-NL73 op-F468-6H-not cB4213-m74 op-Xho-hSA-L op-Y360-m74 op-F468-6H-not cB4213-m75 opB4-Xho-hSA op-M361-m75 op-F468-6H-not cB4213-m76 opB4-Xho-hSA op-E352-m76 op-F468-6H-not cB4213-m77 opB4-Xho-hSA op-M363-m77 op-F468-6H-not cB4213-m78 opB4-Xho-hSA op-N84-m78 op-F468-6H-not cB4213-m79 opB4-Xho-hSA op-K166-m79 op-F468-6H-not cB4213-m82 op-Xho-hSA-L op-354E-m82 op-F468-6H-not cB4213-m83 op-Xho-hSA-L op-354Q-m83 op-F468-6H-not cB4213-m84 op-Xho-hSA-L op-354S-m84 op-F468-6H-not cB4213-m85 op-Xho-hSA-L op-354V-m85 op-F468-6H-not cB4213-m86 op-Xho-hSA-L op-354A-m86 op-F468-6H-not cB4213-m88 op-Xho-hSA-L op-354N-m88 op-F468-6H-not cB4213-m89 op-Xho-hSA-L op-354T-m89 op-F468-6H-not cB4213-m90 op-Xho-hSA-L op-356M-m90 op-F468-6H-not cB4213-m91 op-Xho-hSA-L op-356F-m91 op-F468-6H-not cB4213-m92 op-Xho-hSA-L op-356I-m92 op-F468-6H-not cB4213-m93 op-Xho-hSA-L op-356L-m93 op-F468-6H-not cB4213-m94 op-Xho-hSA-L op-356Q-m94 op-F468-6H-not cB4213-m95 op-Xho-hSA-L op-356V-m95 op-F468-6H-not cB4213-m96 op-Xho-hSA-L op-343V_364M-m96 op-F468-6H-not cB4213-m97 op-Xho-hSA-L op-340Q-m97 op-F468-6H-not cB4213-m98 op-Xho-hSA-L op-341H-m98 op-F468-6H-not cB4213-m99 op-Xho-hSA-L op-342I-m99 op-F468-6H-not cB4213-m100 op-Xho-hSA-L op-343Y-m100 op-F468-6H-not cB4213-m101 op-Xho-hSA-L op-345E-m101 op-F468-6H-not cB4213-m102 op-Xho-hSA-L op-346F-m102 op-F468-6H-not cB4213-m103 op-Xho-hSA-L op-347E-m103 op-F468-6H-not cB4213-m104 op-Xho-hSA-L op-349L-m104 op-F468-6H-not cB4213-m105 op-Xho-hSA-L op-350I-m105 op-F468-6H-not cB4213-m106 op-Xho-hSA-L op-352G-m106 op-F468-6H-not cB4213-m107 op-Xho-hSA-L op-354R-m107 op-F468-6H-not cB4213-m110 op-Xho-hSA-L op-358R-m110 op-F468-6H-not cB4213-m111 op-Xho-hSA-L op-359V-m111 op-F468-6H-not cB4213-m112 op-Xho-hSA-L op-360R-m112 op-F468-6H-not cB4213-m114 op-Xho-hSA-L op-345K-m114 op-F468-6H-not cB4213-m115 op-Xho-hSA-L op-346L-m115 op-F468-6H-not cB4213-m116 op-Xho-hSA-L op-347V-m116 op-F468-6H-not cB4213-m117 op-Xho-hSA-L op-349W-m117 op-F468-6H-not cB4213-m118 op-Xho-hSA-L op-354W-m118 op-F468-6H-not cB4213-m121 op-Xho-hSA-L op-359Y-m121 op-F468-6H-not cB4213-m125 op-Xho-hSA-L op-347W-m125 op-F468-6H-not cB4213-m126 op-Xho-hSA-L op-357W-m126 op-F468-6H-not cB4213-m130 op-Xho-hSA-L op-342D-m130 op-F468-6H-not cB4213-m131 op-Xho-hSA-L op-343Q-m131 op-F468-6H-not cB4213-m132 op-Xho-hSA-L op-347H-m132 op-F468-6H-not cB4213-m133 op-Xho-hSA-L op-348F-m133 op-F468-6H-not cB4213-m134 op-Xho-hSA-L op-350D-m134 op-F468-6H-not cB4213-m135 op-Xho-hSA-L op-352Y-m135 op-F468-6H-not cB4213-m136 op-Xho-hSA-L op-353E-m136 op-F468-6H-not cB4213-m138 op-Xho-hSA-L op-358Y-m138 op-F468-6H-not cB4213-m139 op-Xho-hSA-L op-359Q-m139 op-F468-6H-not cB4213-m140 op-Xho-hSA-L op-360L-m140 op-F468-6H-not cB4213-m141 op-Xho-hSA-L op-361E-m141 op-F468-6H-not cB4213-m142 op-Xho-hSA-L op-363E-m142 op-F468-6H-not cB4213-m143 op-Xho-hSA-L op-342H-m143 op-F468-6H-not cB4213-m144 op-Xho-hSA-L op-348D-m144 op-F468-6H-not cB4213-m145 op-Xho-hSA-L op-361H-m145 op-F468-6H-not cB4213-m146 opB4-Xho-hSA Op-R39-m146-R op-F468-6H-not cB4213-m147 opB4-Xho-hSA Op-A40-m147-R op-F468-6H-not cB4213-m149 opB4-Xho-hSA op-D456-6H-not - cB4213-m150 op-Xho-hSA-L op-350Q360R-m150 op-F468-6H-not cB4213-m152 opB4-Xho-hSA Op-m152-D65A-R op-F468-6H-not cB4213-m153 opB4-Xho-hSA Op-m153-E66A-R op-F468-6H-not cB4213-m154 opB4-Xho-hSA Op-m154-P67A-R op-F468-6H-not cB4213-m155 opB4-Xho-hSA Op-m155-L68A-R op-F468-6H-not cB4213-m156 op-Xho-hSA-L op-311A-m156 op-F468-6H-not cB4213-m157 op-Xho-hSA-L op-312A-m157 op-F468-6H-not cB4213-m158 op-Xho-hSA-L op-313A-m158 op-F468-6H-not cB4213-m159 op-Xho-hSA-L op-314A-m159 op-F468-6H-not cB4213-m160 op-Xho-hSA-L N266A-m160 op-F468-6H-not cB4213-m161 op-Xho-hSA-L T267A-m161 op-F468-6H-not cB4213-m162 op-Xho-hSA-L Q268A-m162 op-F468-6H-not cB4213-m163 op-Xho-hSA-L Q269A-m163 op-F468-6H-not cB4213-m164 op-Xho-hSA-L P271A-m164 op-F468-6H-not cB4213-m165 op-Xho-hSA-L V272A-m165 op-F468-6H-not cB4213-m166 opB4-Xho-hSA Op-m166-I102A-R op-F468-6H-not cB4213-m167 opB4-Xho-hSA Op-m167-D103A-R op-F468-6H-not cB4213-m168 opB4-Xho-hSA Op-m168-S104A-R op-F468-6H-not cB4213-m169 opB4-Xho-hSA Op-m169-I105A-R op-F468-6H-not cB4213-m170 op-Xho-hSA-L op-m170-T132A-R op-F468-6H-not cB4213-m171 op-Xho-hSA-L op-m171-F133A-R op-F468-6H-not cB4213-m172 op-Xho-hSA-L op-m172-Y134A-R op-F468-6H-not cB4213-m173 op-Xho-hSA-L V241A-m173 op-F468-6H-not cB4213-m174 op-Xho-hSA-L E242A-m174 op-F468-6H-not cB4213-m175 op-Xho-hSA-L I243A-m175 op-F468-6H-not cB4213-m176 op-Xho-hSA-L K244A-m176 op-F468-6H-not cB4213-m177 opB4-Xho-hSA Op-m177-L179A-R op-F468-6H-not cB4213-m178 opB4-Xho-hSA Op-m178-S180A-R op-F468-6H-not cB4213-m179 opB4-Xho-hSA Op-m179-L181A-R op-F468-6H-not cB4213-m180 opB4-Xho-hSA Op-m180-T182A-R op-F468-6H-not cB4213-m181 opB4-Xho-hSA Op-m181-T185A-R op-F468-6H-not cB4213-m182 opB4-Xho-hSA Op-m182-E186A-R op-F468-6H-not cB4213-m183 opB4-Xho-hSA Op-m183-K187A-R op-F468-6H-not cB4213-m184 op-Xho-hSA-L op-K290A-m184 op-F468-6H-not cB4213-m185 op-Xho-hSA-L op-I291A-m185 op-F468-6H-not cB4213-m186 op-Xho-hSA-L op-P292A-m186 op-F468-6H-not cB4213-m190 op-Xho-hSA-L L441A-m190 op-F468-6H-not cB4213-m191 op-Xho-hSA-L S442A-m191 op-F468-6H-not cB4213-m192 opB4-Xho-hSA op-D451A-m192 op-F468-6H-not cB4213-m193 opB4-Xho-hSA op-T452A-m193 op-F468-6H-not cB4213-m194 op-Xho-hSA-L op-D453A-m194 op-F468-6H-not cB4213-m195 op-Xho-hSA-L op-D461A-6H-not op-F468-6H-not cB4213-m196 op-Xho-hSA-L op-G462A-6H-not op-F468-6H-not cB4213-m197 op-Xho-hSA-L op-V463A-6H-not op-F468-6H-not cB4213-m198 op-Xho-hSA-L op-N82A-m198-R op-F468-6H-not cB4213-m199 op-Xho-hSA-L op-N166A-m199-R op-F468-6H-not cB4213-m203 op-Xho-hSA-L Op-S104N-m203-R op-F468-6H-not cB4213-m204 op-Xho-hSA-L Op-I105Q-m204-R op-F468-6H-not cB4213-m205 op-Xho-hSA-L op-Q268D-m205-F op-F468-6H-not cB4213-m208 op-Xho-hSA-L op-Q268I-m208-F op-F468-6H-not cB4213-m210 op-Xho-hSA-L op-291G-m210-F op-F468-6H-not cB4213-m211 op-Xho-hSA-L op-292D-m211-F op-F468-6H-not cB4213-m212 op-Xho-hSA-L op-T452D-m212 op-F468-6H-not cB4213-m213 op-Xho-hSA-L op-T452H-m213 op-F468-6H-not cB4213-m214 op-Xho-hSA-L op-T452K-m214 op-F468-6H-not cB4213-m216 op-Xho-hSA-L Op-T452G-m216 op-F468-6H-not cB4213-m217 op-Xho-hSA-L Op-T452P-m217 op-F468-6H-not cB4213-m218 op-Xho-hSA-L op-T452M-m218 op-F468-6H-not cB4213-m219 op-Xho-hSA-L op-T452F-m219 op-F468-6H-not cB4213-m220 op-Xho-hSA-L op-D461R-6H-not-m220 op-F468-6H-not cB4213-m231 op-Xho-hSA-L op-V463Y-6H-not-m231 - cB4213-m232 op-Xho-hSA-L op-S180T-R-m232 op-F468-6H-not cB4213-m233 op-Xho-hSA-L op-D451S-F-m233 op-F468-6H-not cB4213-m234 op-Xho-hSA-L op-L313P-m234-F op-F468-6H-not cB4213-m235 op-Xho-hSA-L op-L313M-m235-F op-F468-6H-not cB4213-m243 op-Xho-hSA-L op-L179S-m243-R op-F468-6H-not cB4213-m245 op-Xho-hSA-L op-L179I-m245-R op-F468-6H-not cB4213-m246 op-Xho-hSA-L op-L179F-m246-R op-F468-6H-not cB4213-m254 op-Xho-hSA-L FQQ-Mega-m254 op-F468-6H-not cB4213-m261 op-Xho-hSA-L op-Q268N-m259-m op-F468-6H-not cB4213-m262 op-Xho-hSA-L B4-124-R op-F468-6H-not cB4213-m263 op-Xho-hSA-L B4-124-R op-F468-6H-not cB4213-m266 op-Xho-hSA-L op-L181M,E186D-m266 op-F468-6H-not cB4213-m268 opB4-Xho-hSA op-Q268A-m268-m op-F468-6H-not cB4213-m271 opB4-Xho-hSA op-344I,348M-m271 op-F468-6H-not cB4213-m275 op-Xho-hSA-L op-DLSS-m275 op-F468-6H-not cB4213-m276 op-Xho-hSA-L op-DLS-m276 op-F468-6H-not cB4213-m279 opB4-Xho-hSA Op-K348M-m279 op-F468-6H-not cB4213-m280 opB4-Xho-hSA Op-N344I K348M-m280 op-F468-6H-not cB4213-m287 op-Xho-hSA-L Q268A-m162 op-F468-6H-not cB4213-m288 opB4-Xho-hSA Q268A-m162 op-F468-6H-not

Таблица 5. Последовательности праймеров, используемые для клонирования вариантов PH20

Праймер SEQ ID NO. Нуклеотидная последовательность (5'->3') B4-hy2 7 ATA TGG GGA ACC CTC AGT ATA ACT ACA AGC ACT GAG ACC TGC CAA TAT CTG AAG GAT TAC CTG ACC AGA CTG CTG AAT CCT TAC ATA ATC AAC B4-hy3 8 ATA TGG GGA ACC CTC AGT ATA TCC AGC AGT GAG GAA GAA TGC TGG CAT TTG CAC GAT TAC CTG GTA GAC ACA CTG AAT CCT TAC ATA ATC AAC B4-hy4 9 ATA TGG GGA ACC CTC AGT ATA ACC GCA TCT AAG GCA AAC TGC ACA AAA GTA AAA CAA TTC GTC TCC AGT GAT CTG AAT CCT TAC ATA ATC AAC ALB-SP-Xho 10 GAA TAT CTC GAG GCC ACC ATG AAG TGG GTT ACA SPAM1-6H-not 11 CTA ATT GCG GCC GCT CAT TAG TGG TGA TGG TGA TGA TGG AAG AAA CCA ATT CTG C op-F468-R 12 AAT TAG GCG GCC GCC TAT TAA AAG GCG TCG ATG CAC ACG CCA TC op-F468-6H-not 13 CTC TAA TTG CGG CCG CTC ATT AGT GGT GAT GGT GAT GAT GAA AGG CGT CGA TGC ACA CGC CAT C op-Xho-hSA-L 14 AAT TAG AGC TCG AGG CCA CCA TGA AAT GGG TGA CCT TTA TCT CC opB4-Xho-hSA 15 CAG ATT CTC GAG GCC ACC ATG AAA TGG G op-Q347-m64 16 ATC TGG GGC TCC TGG GAG AAC ACC AGG CAG AAG GAG AGC TGC CAG GCC ATC op-Q348-m65 17 ATC TGG GGC TCC TGG GAG AAC ACC AGG ACC CAG GAG AGC TGC CAG GCC ATC AAG op-Q350-m66 18 AGA ACA CCA GGA CCA AGG AGC AAT GCC AGG CCA TCA AGG AGT AC op-Q355-m67 19 AGG AGA GCT GCC AGG CCA TCC AGG AGT ACA TGG ACA CAA CCC TG op-V358-m69 20 AGC TGC CAG GCC ATC AAG GAG TAC GTG GAC ACA ACC CTG AAC CCT TAT ATC op-A362-m70 21 AGG AGT ACA TGG ACA CAA CCG CGA ACC CTT ATA TCA TCA ATG op-V343-m71 22 ATC GTG ATC TGG GGC TCC TGG GTG AAC ACC AGG ACC AAG GAG AG op-F344-m72 23 ATC TGG GGC TCC TGG GAG TTC ACC AGG ACC AAG GAG AGC TG op-K359-mega-NL73 24 AGC TGC CAG GCC ATC AAG GAG TAC ATG AAA ACA ACC CTG AAC CCT TAT ATC op-Y360-m74 25 ATC AAG GAG TAC ATG GAC TAC ACC CTG AAC CCT TAT ATC ATC op-M361-m75 26 ATC AAG GAG TAC ATG GAC ACA ATG CTG AAC CCT TAT ATC ATC op-E352-m76 27 ACC AGG ACC AAG GAG AGC TGC GAG GCC ATC AAG GAG TAC ATG G op-M363-m77 28 AGT ACA TGG ACA CAA CCC TGA TGC CTT ATA TCA TCA ATG TGA C op-N84-m78 29 TAG AAG ATT GTC ACG CCC TGG CCG TTG GCA TTG ATC CGA GGA GAG C op-K166-m79 30 TGC ACC AGC TCG ATG GAC CGT TTC TTA TAC ACG TCC TTA GGC TTC op-354E-m82 31 год ACC AAG GAG AGC TGC CAG GCC GAA AAG GAG TAC ATG GAC ACA ACC op-354Q-m83 32 ACC AAG GAG AGC TGC CAG GCC CAA AAG GAG TAC ATG GAC ACA ACC op-354S-m84 33 ACC AAG GAG AGC TGC CAG GCC TCT AAG GAG TAC ATG GAC ACA ACC op-354V-m85 34 ACC AAG GAG AGC TGC CAG GCC GTC AAG GAG TAC ATG GAC ACA ACC op-354A-m86 35 год ACC AAG GAG AGC TGC CAG GCC GCG AAG GAG TAC ATG GAC ACA ACC op-354N-m88 36 ACC AAG GAG AGC TGC CAG GCC AAC AAG GAG TAC ATG GAC ACA ACC op-354T-m89 37 ACC AAG GAG AGC TGC CAG GCC ACC AAG GAG TAC ATG GAC ACA ACC op-356M-m90 38 AAG GAG AGC TGC CAG GCC ATC AAG ATG TAC ATG GAC ACA ACC CTG AAC op-356F-m91 39 AAG GAG AGC TGC CAG GCC ATC AAG TTC TAC ATG GAC ACA ACC CTG AAC op-356I-m92 40 AAG GAG AGC TGC CAG GCC ATC AAG ATA TAC ATG GAC ACA ACC CTG AAC op-356L-m93 41 AAG GAG AGC TGC CAG GCC ATC AAG TTG TAC ATG GAC ACA ACC CTG AAC op-356Q-m94 42 AAG GAG AGC TGC CAG GCC ATC AAG CAG TAC ATG GAC ACA ACC CTG AAC op-356V-m95 43 AAG GAG AGC TGC CAG GCC ATC AAG GTA TAC ATG GAC ACA ACC CTG AAC op-343V_364M-m96 44 ATC GTG ATC TGG GGC TCC TGG GTG AAC ACC AGG ACC AAG GAG AGC TGC CAG GCC ATC AAG GAG TAC ATG GAC ACA ATG CTG AAC CCT TAT ATC ATC op-340Q-m97 45 AGC TAG CGG CAT CGT GAT CTG GCA ATC CTG GGA GAA CAC CAG GAC C op-341H-m98 46 AGC GGC ATC GTG ATC TGG GGC CAC TGG GAG AAC ACC AGG ACC AAG op-342I-m99 47 AGC GGC ATC GTG ATC TGG GGC TCC ATT GAG AAC ACC AGG ACC AAG GAG op-343Y-m100 48 ATC GTG ATC TGG GGC TCC TGG TAT AAC ACC AGG ACC AAG GAG AG op-345E-m101 49 ATC GTG ATC TGG GGC TCC TGG GAG AAC GAA AGG ACC AAG GAG AGC TGC C op-346F-m102 50 ATC TGG GGC TCC TGG GAG AAC ACC TTC ACC AAG GAG AGC TGC CAG GC op-347E-m103 51 ATC TGG GGC TCC TGG GAG AAC ACC AGG GAA AAG GAG AGC TGC CAG GCC ATC op-349L-m104 52 ATC TGG GGC TCC TGG GAG AAC ACC AGG ACC AAG TTG AGC TGC CAG GCC ATC AAG G op-350I-m105 53 AGA ACA CCA GGA CCA AGG AGA TCT GCC AGG CCA TCA AGG AG op-352G-m106 54 ACC AGG ACC AAG GAG AGC TGC GGG GCC ATC AAG GAG TAC ATG GAC op-354R-m107 55 ACC AAG GAG AGC TGC CAG GCC AGA AAG GAG TAC ATG GAC ACA AC op-358R-m110 56 AGC TGC CAG GCC ATC AAG GAG TAC CGG GAC ACA ACC CTG AAC CCT TAT ATC op-359V-m111 57 AGG CCA TCA AGG AGT ACA TGG TCA CAA CCC TGA ACC CTT ATA TC op-360R-m112 58 AGG CCA TCA AGG AGT ACA TGG ACA GAA CCC TGA ACC CTT ATA TCA TC op-345K-m114 59 ATC TGG GGC TCC TGG GAG AAC AAG AGG ACC AAG GAG AGC TGC CAG op-346L-m115 60 ATC TGG GGC TCC TGG GAG AAC ACC CTG ACC AAG GAG AGC TGC CAG GC op-347V-m116 61 ATC TGG GGC TCC TGG GAG AAC ACC AGG GTC AAG GAG AGC TGC CAG GCC ATC op-349W-m117 62 ATC TGG GGC TCC TGG GAG AAC ACC AGG ACC AAG TGG AGC TGC CAG GCC ATC AAG GAG op-354W-m118 63 ACC AAG GAG AGC TGC CAG GCC TGG AAG GAG TAC ATG GAC ACA AC op-359Y-m121 64 AGG CCA TCA AGG AGT ACA TGT ACA CAA CCC TGA ACC CTT ATA TC op-347W-m125 65 ATC TGG GGC TCC TGG GAG AAC ACC AGG TGG AAG GAG AGC TGC CAG GCC ATC op-357W-m126 66 AGC TGC CAG GCC ATC AAG GAG TGG ATG GAC ACA ACC CTG AAC CC op-342D-m130 67 AGC GGC ATC GTG ATC TGG GGC TCC GAC GAG AAC ACC AGG ACC AAG GAG op-343Q-m131 68 ATC GTG ATC TGG GGC TCC TGG CAG AAC ACC AGG ACC AAG GAG AGC op-347H-m132 69 ATC TGG GGC TCC TGG GAG AAC ACC AGG CAC AAG GAG AGC TGC CAG GCC ATC op-348F-m133 70 ATC TGG GGC TCC TGG GAG AAC ACC AGG ACC TTC GAG AGC TGC CAG GCC ATC AAG op-350D-m134 7 AGA ACA CCA GGA CCA AGG AGG ACT GCC AGG CCA TCA AGG AGT AC op-352Y-m135 72 ACC AGG ACC AAG GAG AGC TGC TAC GCC ATC AAG GAG TAC ATG GAC AC op-353E-m136 73 AGG ACC AAG GAG AGC TGC CAG GAA ATC AAG GAG TAC ATG GAC AC op-358Y-m138 74 AGC TGC CAG GCC ATC AAG GAG TAC TAC GAC ACA ACC CTG AAC CCT TAT ATC op-359Q-m139 75 AGG CCA TCA AGG AGT ACA TGC AGA CAA CCC TGA ACC CTT ATA TC op-360L-m140 76 AGG CCA TCA AGG AGT ACA TGG ACC TAA CCC TGA ACC CTT ATA TCA TC op-361E-m141 77 ATC AAG GAG TAC ATG GAC ACA GAG CTG AAC CCT TAT ATC ATC AAT G op-363E-m142 78 AGT ACA TGG ACA CAA CCC TGG AGC CTT ATA TCA TCA ATG TGA C op-342H-m143 79 AGC GGC ATC GTG ATC TGG GGC TCC CAT GAG AAC ACC AGG ACC AAG GAG op-348D-m144 80 ATC TGG GGC TCC TGG GAG AAC ACC AGG ACC GAC GAG AGC TGC CAG GCC ATC AAG op-361H-m145 81 ATC AAG GAG TAC ATG GAC ACA CAC CTG AAC CCT TAT ATC ATC AAT G Op-R39-m146-R 82 TTT GGA ATC ACA GGA GGA GCC CGA GAG TAT GCG GAG CTA AAC AG Op-A40-m147-R 83 TTT GGA ATC ACA GGA GGA GCA GAG TAT GCG GAG CTA AAC AG op-D456-6H-not 84 CTC TAA TTG CGG CCG CCT ATT AGT GGT GAT GGT GAT GAT GGT CCA CGG CAT CTG TGT CCT TC op-350Q360R-m150 85 AGA ACA CCA GGA CCA AGG AGC AGT GCC AGG CCA TCA AGG AGT ACA TGG ACC GAA CCC TGA ACC CTT ATA TCA TC Op-m152-D65A-R 86 TAA AAG AGA ACA GGC TCA TAT CCA GGG GCT CGG CAA ACT TGC CCA GGC AGA ACT C Op-m153-E66A-R 87 TAA AAG AGA ACA GGC TCA TAT CCA GGG GCG CGT CAA ACT TGC CCA GGC AGA AC Op-m154-P67A-R 88 TAA AAG AGA ACA GGC TCA TAT CCA GGG CCT CGT CAA ACT TGC CCA GGC Op-m155-L68A-R 89 TAA AAG AGA ACA GGC TCA TAT CCG CGG GCT CGT CAA ACT TGC CCA G op-311A-m156 90 ACC AGG ATC GTG TTT ACA GAC GCG GTG CTG AAG TTC CTG TCC op-312A-m157 91 AGG ATC GTG TTT ACA GAC CAG GCG CTG AAG TTC CTG TCC CAG op-313A-m158 92 ATC GTG TTT ACA GAC CAG GTG GCG AAG TTC CTG TCC CAG GAT op-314A-m159 93 ATC GTG TTT ACA GAC CAG GTG CTG GCG TTC CTG TCC CAG GAT GAG N266A-m160 94 GCC CTG TAC CCT AGC ATC TAT CTG GCC ACC CAG CAG AGC CCA GTG GC T267A-m161 95 CTG TAC CCT AGC ATC TAT CTG AAC GCC CAG CAG AGC CCA GTG GCC GCT AC Q268A-m162 96 TAC CCT AGC ATC TAT CTG AAC ACC GCG CAG AGC CCA GTG GCC GCT ACA CTG Q269A-m163 97 TAC CCT AGC ATC TAT CTG AAC ACC CAG GCG AGC CCA GTG GCC GCT ACA CTG TAT G P271A-m164 98 AGC ATC TAT CTG AAC ACC CAG CAG AGC GCA GTG GCC GCT ACA CTG TAT GTG AGG V272A-m165 99 TAT CTG AAC ACC CAG CAG AGC CCA GCG GCC GCT ACA CTG TAT GTG AGG Op-m166-I102A-R 100 TGT CAC TCC GGT GAT AGA ATC GGC ATA TGG ATA GTA GCC CAG TCT G Op-m167-D103A-R 101 TCA CTG TCA CTC CGG TGA TAG AAG CGA TAT ATG GAT AGT AGC CCA G Op-m168-S104A-R 102 TCC GTT CAC TGT CAC TCC GGT GAT AGC ATC GAT ATA TGG ATA GTA GCC CAG Op-m169-I105A-R 103 TCC GTT CAC TGT CAC TCC GGT GGC AGA ATC GAT ATA TGG ATA GTA GC op-m170-T132A-R 104 TTG TCC ACT GGC ATG TAG AAG GCG ATG TCC TTC TTA GCC TTA TC op-m171-F133A-R 105 TGC CCA GAT TGT CCA CTG GCA TGT AGG CGG TGA TGT CCT TCT TAG CCT TAT C op-m172-Y134A-R 106 TGC CCA GAT TGT CCA CTG GCA TGG CGA AGG TGA TGT CCT TCT TAG V241A-m173 107 AGA TCG TCG TTC CTC TTG ATC TCC GCA TTG AAA CAG GAG CCG TTG TAG CC E242A-m174 108 GAC AGA TCG TCG TTC CTC TTG ATC GCC ACA TTG AAA CAG GAG CCG TTG TAG CC I243A-m175 109 AGC CAA GAC AGA TCG TCG TTC CTC TTG GCC TCC ACA TTG AAA CAG GAG CCG TTG K244A-m176 110 AGC CAA GAC AGA TCG TCG TTC CTC GCG ATC TCC ACA TTG AAA CAG GAG CCG Op-m177-L179A-R 111 TCT GTG GCC TCG GTC AGG CTC GCC TGC ACG TTC TGC TGC TGC AC Op-m178-S180A-R 112 TTC TCT GTG GCC TCG GTC AGG GCC AGC TGC ACG TTC TGC TGC TG Op-m179-L181A-R 113 TAG CCT TCT CTG TGG CCT CGG TCG CGC TCA GCT GCA CGT TCT GCT G Op-m180-T182A-R 114 TTA GCC TTC TCT GTG GCC TCG GCC AGG CTC AGC TGC ACG TTC TG Op-m181-T185A-R 115 TCG AAC TCC TGC TTA GCC TTC TCT GCG GCC TCG GTC AGG CTC AGC TG Op-m182-E186A-R 116 TCG AAC TCC TGC TTA GCC TTC GCT GTG GCC TCG GTC AGG CTC AG Op-m183-K187A-R 117 TTC TCG AAC TCC TGC TTA GCC GCC TCT GTG GCC TCG GTC AGG C op-K290A-m184 118 AGA GAG GCT ATC CGC GTG TCT GCG ATC CCC GAC GCC AAG TCC CCA C op-I291A-m185 119 AGG CTA TCC GCG TGT CTA AGG CCC CCG ACG CCA AGT CCC CAC TG op-P292A-m186 120 AGG CTA TCC GCG TGT CTA AGA TCG CCG ACG CCA AGT CCC CAC TGC CC L441A-m190 121 AGT TTT ACT GCT CTT GTT ATT CCA CCG CGA GCT GTA AGG AGA AGG CTG ATG S442A-m191 122 ACT GCT CTT GTT ATT CCA CCC TGG CCT GTA AGG AGA AGG CTG ATG TG op-D451A-m192 123 AAG GAG AAG GCT GAT GTG AAG GCC ACA GAT GCC GTG GAC GTG TGC op-T452A-m193 124 AAG GAG AAG GCT GAT GTG AAG GAC GCA GAT GCC GTG GAC GTG TGC ATC op-D453A-m194 125 AAG GCT GAT GTG AAG GAC ACA GCT GCC GTG GAC GTG TGC ATC G op-D461A-6H-not 126 ATA TTC GCG GCC GCC TAT TAG TGG TGA TGG TGA TGA TGA AAG GCG TCG ATG CAC ACG CCA GCA GCG ATG CAC ACG TCC ACG op-G462A-6H-not 127 ATA TTC GCG GCC GCC TAT TAG TGG TGA TGG TGA TGA TGA AAG GCG TCG ATG CAC ACG GCA TCA GCG ATG CAC ACG TCC AC op-V463A-6H-not 128 ATA TTC GCG GCC GCC TAT TAG TGG TGA TGG TGA TGA TGA AAG GCG TCG ATG CAC GCG CCA TCA GCG ATG CAC ACG op-N82A-m198-R 129 TGT CAC GCC CTG GCC GGT GGC AGC GAT CCG AGG AGA GCC GAT AAA AG op-N166A-m199-R 130 TGC ACC AGC TCG ATG GAC CGA GCC TTA TAC ACG TCC TTA GGC TTC Op-S104N-m203-R 131 TTC ACT GTC ACT CCG GTG ATA TTA TCG ATA TAT GGA TAG TAG CC Op-I105Q-m204-R 132 TCC GTT CAC TGT CAC TCC GGT CTG AGA ATC GAT ATA TGG ATA GTA GC op-Q268D-m205-F 133 ACC CTA GCA TCT ATC TGA ACA CCG ATC AGA GCC CAG TGG CCG CTA C op-Q268I-m208-F 134 ACC CTA GCA TCT ATC TGA ACA CCA TCC AGA GCC CAG TGG CCG CTA C op-291G-m210-F 135 AGG CTA TCC GCG TGT CTA AGG GCC CCG ACG CCA AGT CCC CAC op-292D-m211-F 136 ATC CGC GTG TCT AAG ATC GAC GAC GCC AAG TCC CCA CTG C op-T452D-m212 137 AGA AGG CTG ATG TGA AGG ACG ACG ATG CCG TGG ACG TGT G op-T452H-m213 138 AGA AGG CTG ATG TGA AGG ACC ACG ATG CCG TGG ACG TGT G op-T452K-m214 139 AGA AGG CTG ATG TGA AGG ACA AAG ATG CCG TGG ACG TGT G Op-T452G-m216 140 AGA AGG CTG ATG TGA AGG ACG GAG ATG CCG TGG ACG TGT G Op-T452P-m217 141 AGA AGG CTG ATG TGA AGG ACC CAG ATG CCG TGG ACG TGT G op-T452M-m218 142 AGA AGG CTG ATG TGA AGG ACA TGG ATG CCG TGG ACG TGT G op-T452F-m219 143 AGA AGG CTG ATG TGA AGG ACT TCG ATG CCG TGG ACG TGT G op-D461R-6H-not-m220 144 CTC TAA TTG CGG CCG CCT ATT AGT GGT GAT GGT GAT GAT GAA AGG CGT CGA TGC ACA CGC CCC TAG CGA TGC ACA CGT CCA C op-V463Y-6H-not-m231 145 CTC TAA TTG CGG CCG CTC ATT AGT GGT GAT GGT GAT GAT GAA AGG CGT CGA TGC AGT AGC CAT CAG CGA TGC ACA C op-S180T-R-m232 146 TTC TCT GTG GCC TCG GTC AGG GTC AGC TGC ACG TTC TGC TGC TG op-D451S-F-m233 147 AGG AGA AGG CTG ATG TGA AGA GCA CAG ATG CCG TGG ACG TG op-L313P-m234-F 148 ATC GTG TTT ACA GAC CAG GTG CCG AAG TTC CTG TCC CAG GAT GAG op-L313M-m235-F 149 ATC GTG TTT ACA GAC CAG GTG ATG AAG TTC CTG TCC CAG GAT GAG op-L179S-m243-R 150 TCT GTG GCC TCG GTC AGG CTC GAC TGC ACG TTC TGC TGC TGC AC op-L179I-m245-R 151 TCT GTG GCC TCG GTC AGG CTA ATC TGC ACG TTC TGC TGC TGC AC op-L179F-m246-R 152 TCT GTG GCC TCG GTC AGG CTA AAC TGC ACG TTC TGC TGC TGC AC FQQ-Mega-m254 153 ATC GTG ATC TGG GGC TCC TGG GAG TTC ACC AGG ACC CAG GAG AGC TGC CAG GCC ATC CAG GAG TAC ATG GAC ACA ACC CTG AAC op-Q268N-m259-m 154 ACC CTA GCA TCT ATC TGA ACA CCA ACC AGA GCC CAG TGG CCG CTA C B4-124-R 155 GCC CAG GCA GAA CTC GC op-L181M,E186D-m266 156 TCT CGA ACT CCT GCT TAG CCT TAT CTG TGG CCT CGG TCA TGC TCA GCT GCA CGT TCT GCT GC op-Q268A-m268-m 157 ACC CTA GCA TCT ATC TGA ACA CCG CGC AGA GCC CAG TGG CCG CTA C op-344I,348M-m271 158 ATC GTG ATC TGG GGC TCC TGG GAG ATC ACC AGG ACC ATG GAG AGC TGC CAG GCC ATC AAG op-DLSS-m275 159 AGC GGC ATC GTG ATC TGG GGC GAC CTG TCG ATC TCC TCG ACC ATG GAG AGC TGC CAG GCC op-DLS-m276 160 AGC GGC ATC GTG ATC TGG GGC GAC CTG TCG ATC TCC AGG ACC ATG GAG AGC TGC CAG Op-K348M-m279 161 ATC TGG GGC TCC TGG GAG AAC ACC AGG ACC ATG GAG AGC TGC CAG GCC ATC AAG Op-N344I K348M-m280 162 ATC GTG ATC TGG GGC TCC TGG GAG ATC ACC AGG ACC ATG GAG AGC TGC CAG GCC ATC AAG

После обнаружения варианта PH20 с повышенной ферментативной активностью и термостабильностью также была сконструирована кДНК варианта PH20 без His-метки.

Вариант PH20 был сконструирован следующим образом с использованием кДНК варианта PH20.

Экспрессию варианта проводили с использованием системы экспрессии ExpiCHO. Когда плотность клеток ExpiCHO достигала 6 ⋅ 10⁶/мл, плазмиду, включающую кДНК PH20 дикого типа или вариант PH20, вставленную в вектор pcDNA3.4-TOPO, трансфицировали в клетки ExpiCHO с использованием реагента ExpiFectamine CHO. В качестве среды для культивирования клеток использовали экспрессионную среду ExpiCHO (от 100 до 500 мл). После трансфекции клетки ExpiCHO культивировали при встряхивании при 130 об/мин в течение всего 6 дней, в течение которых клетки культивировали при 37°C в течение 1 дня и далее культивировали при более низкой температуре 32°C в течение 5 дней. После завершения культивирования клеточную надосадочную жидкость собирали центрифугированием при 10000 об/мин в течение 30 минут.

Рекомбинантные белки PH20 дикого типа с присоединенной к С-концу His-меткой и варианта PH20 с присоединенной к С-концу His-меткой, продуцируемые в клетках ExpiCHO, очищали с помощью трехступенчатой колоночной хроматографии с использованием первичной системы AKTA (GE Healthcare Systems) и трехступенчатую колоночную хроматографию проводили с использованием колонки HisTrap HP-колонки Q-сефарозы-колонки фенил-HP и колонки Q-сефарозы-колонки HisTrap HP-колонки бутил-HP, соответственно, в зависимости от варианта.

Очистку с использованием колонки HisTrap HP, колонки Q-сефарозы и колонки фенил-HP выполняли следующим образом. Для очистки белка с использованием колонки HisTrap готовили буфер A (20 мМ фосфат натрия, pH 7,5, 0,5 M NaCl) и буфер B (20 мМ фосфат натрия, pH 7,5, 0,5 M NaCl, 0,5 M имидазол). Белок связывался с колонкой HisTrap, и колонка промывали 5 объемами колонки (англ. column volumes, CV) буфера A для удаления неспецифически связанных белков. После подтверждения, что проводимость поддерживается на постоянном уровне, колонку промывали 5 CV 20% буфера B для элюирования белка. Элюированный белок диализовали диализным буфером (20 мМ фосфат натрия, pH 7,5, 50 мМ NaCl). Для очистки белка с использованием колонки Q-сефарозы готовили буфер A (20 мМ фосфат натрия, pH 7,5) и буфер B (20 мМ фосфат натрия, pH 7,5, 0,5 M NaCl). Белок связывался с колонкой Q-сефарозы, и колонку промывали 5 CV буфера A для удаления неспецифически связанных белков, а затем промывали 5 CV буфера B с градиентом концентрации от 0 до 100% для элюирования белка. Для очистки белка с использованием колонки фенил-HP готовили буфер A (20 мМ фосфат натрия, pH 7,0, 1,5 M (NH4) 2SO4) и буфер B (20 мМ фосфат натрия, pH 7,0). Белок связывался с фенильной колонкой, и колонку промывали 5 CV буфера A для удаления неспецифически связанных белков, а затем промывали 5 CV буфера B с градиентом концентрации от 0 до 100% для элюирования белка.

Очистку с использованием колонки Q-сефарозы, колонки HisTrap HP и колонки бутил-HP колонки выполняли следующим образом. Для очистки белка с использованием колонки Q-сефарозы готовили буфер A (20 мМ NaPi, 15 мМ NaCl, pH 8,0) и буфер B (20 мМ NaPi, 500 мМ NaCl, pH 8,0). Чтобы довести pH и проводимость культурального раствора до тех же значений, что и в буфере A, pH титровали до 8 с использованием 1 M трис-буфера, а проводимость доводили до 5 мСм/см или менее, добавляя к нему воду (PW). Затем культуральный раствор фильтровали через мембрану с размером пор 0,22 мкм. Белок связывался с колонкой Q-сефарозы, и колонку промывали 5 CV буфера A для удаления неспецифически связанных белков, а затем промывали 5 CV буфера B для элюирования целевого белка. Для очистки белка с использованием колонки HisTrap HP готовили буфер A (20 мМ NaPi, 500 мМ NaCl, pH 7,5) и буфер B (20 мМ NaPi, 500 мМ NaCl, 500 мМ имидазол, pH 7,5). Образец белка связывался с колонкой HisTrap HP, колонку промывали 10 объемами 7% буфера В для удаления неспецифически связанных белков, а затем колонку промывали 3 объемами 40% буфера В для элюирования белка. Для очистки белка с использованием колонки бутил-HP готовили буфер А (20 мМ NaPi, 1,5 М сульфат аммония, pH 7,0) и буфер B (20 мМ NaPi, pH 7,0). 3 М раствор сульфата аммония и образец белка, который должен быть загружен в колонку, смешивали в соотношении 1:1, а затем полученную смесь фильтровали через мембрану, имеющую поры 0,22 мкм. Образец белка связывали с колонкой бутил-HP, и колонку промывали 5 объемами буфера A для удаления примесей. Затем целевой белок элюировали линейным градиентом концентрации 0-100% буфера В и диализовали с использованием буфера для диализа (20 мМ NaPi, 100 мМ NaCl, pH 7,0). Вариант согласно настоящему изобретению был очищен способом, предложенным в настоящем изобретении, 10% SDS-PAGE анализ был проведен для каждого очищенного продукта, и результаты показаны на фиг. 1 и 3.

Ферментативную активность PH20 дикого типа и варианта PH20 измеряли турбидиметрическим анализом.

Турбидиметрический анализ-это способ измерения поглощения в осадке, который образуется при смешивании гиалуроновой кислоты с альбумином (BSA). Когда гиалуроновая кислота гидролизуется с помощью PH20, поглощение осадка, образующегося при смешивании с альбумином, уменьшается. Турбидиметрический анализ обычно проводили следующим образом. Гиалуронидазу PH20 (Sigma) разводили до 1, 2, 5, 7,5, 10, 15, 20, 30, 50 и 60 единиц/мл и готовили в каждой пробирке. Очищенный образец белка растворяли в буфере для разбавления ферментов (20 мМ TrisHCl, pH 7,0, 77 мМ NaCl, 0,01% (масс./об.) Бычий сывороточный альбумин), разбавляли до 100X, 300X, 600X, 1200X и 2400X и готовили в соответствующих пробирках. В свежих пробирках раствор гиалуроновой кислоты с концентрацией 3 мг/мл разбавляли в 10 раз до концентрации 0,3 мг/мл, так что объем в каждой пробирке составлял 180 мкл. 60 мкл фермента добавляли и смешивали с разбавленным раствором гиалуроновой кислоты и оставляли реагировать при 37°C в течение 45 минут. После завершения реакции 50 мкл прореагировавшего фермента и 250 мкл кислого раствора альбумина добавляли в каждую лунку 96-луночного планшета и встряхивали в течение 10 минут, а затем измеряли оптическую плотность при 600 нм с помощью спектрофотометра.

Способы измерения термостабильности белка включают способ измерения температуры агрегации с помощью динамического светорассеяния (DLS), способ измерения температуры плавления (Tm) в ПЦР в реальном времени с использованием красителя Sypro-Orange и способ измерение ферментативной активности после выдерживания белка при заданной температуре в течение заданного времени и т.д. В способе измерения температуры агрегации с помощью DLS агрегация молекул измеряется с использованием светорассеяния, и, таким образом, чувствительность высока, а температура агрегации обычно ниже, чем температура плавления белка. Поскольку каждый вариант готовится как раствор с одинаковой концентрацией 0,2 мг/мл и затем измеряется, физические свойства каждого варианта можно сравнивать, используя полученное значение в качестве температуры агрегации (Philo, J.S. (2009) Cur. Pharm. Biotech. 10, 359-372).

Аминокислотные последовательности вариантов PH20, сконструированные путем замены или отщепления аминокислот из варианта PH20, имеющего последовательность SEQ ID NO: 3 в настоящем изобретении, показаны в таблице 6 ниже.

В настоящем изобретении эксперимент проводился с вариантом, в котором на С-конце в последовательности, показанной в таблице 6, для очистки белка были добавлены шесть гистидинов. Было обнаружено, что это добавление к С-концу не влияет на активность фермента или стабильность белка. Вариант согласно настоящему изобретению был назван как комбинация HM и серийного номера, а варианты согласно Примеру 3 были названы «Hyal2-вариант», «Hyal3-вариант» и «Hyal4-вариант».

Таблица 6. Аминокислотные последовательности вариантов PH20 согласно настоящему изобретению и характерные особенности замещений/разрывов в них

Название SEQ ID NO. Замена Последовательность Hyal2-вариант 163 15 аминокислотных остатков S341T, W342L, E343S, N344I, R346T, T347S, K348T, S350T, A353Y, I354L, E356D, M358L, D359T и T360R, T361L заменены в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком L36 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка S490 на C-конце PH20. LNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFYNASPSTLS Hyal3- вариант 164 17 аминокислотных остатков S341T, W342L, E343S, N344I, T345S, R346S, T347S, K348E, S350E, Q352W, A353H, I354L, K355H, E356D, M358L, D359V и T360D заменены в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком L36 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка S490 на C-конце PH20. LNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFYNASPSTLS Hyal4- вариант 165 17 аминокислотных остатков S341T, W342L, E343S, N344I, R346A, T347S, E349A, S350N, Q352T, A353K, I354V, E356Q, Y357F, M358V, D359S, T360S и T361D заменены в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком L36 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка S490 на C-конце PH20. LNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFYNASPSTLS HM63 166 Один аминокислотный остаток R346M заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F38 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTMTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM64 167 Один аминокислотный остаток T347Q заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F38 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTROKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM65 168 Один аминокислотный остаток K348Q заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTOESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM66 169 Один аминокислотный остаток S350Q заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKEOCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM67 170 Один аминокислотный остаток K355Q заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIOEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM69 171 Один аминокислотный остаток M358V заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYVDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM70 172 Один аминокислотный остаток L362A заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTANPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM71 173 Один аминокислотный остаток E343V заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWVNTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM72 174 Один аминокислотный остаток N344F заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWEFTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM73 175 Один аминокислотный остаток D359K заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMKTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM74 176 Один аминокислотный остаток T360Y заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDYTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM75 177 Один аминокислотный остаток T361M заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTMLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM76 178 Один аминокислотный остаток Q352E заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCEAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM77 179 Один аминокислотный остаток N363M заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLMPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM78 180 Один аминокислотный остаток T84N заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINANGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM79 181 Один аминокислотный остаток N166K заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKKRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM82 182 Один аминокислотный остаток I354E заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAEKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM83 183 Один аминокислотный остаток I354Q заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAOKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM84 184 Один аминокислотный остаток I354S заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQASKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM85 185 Один аминокислотный остаток I354V заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAVKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM86 186 Один аминокислотный остаток I354A заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAAKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM88 187 Один аминокислотный остаток I354N заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQANKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM89 188 Один аминокислотный остаток I354T заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQATKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM90 189 Один аминокислотный остаток E356M заменен из SEQ ID NO: 3, расщепление происходит перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, а расщепление происходит после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKMYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM91 190 Один аминокислотный остаток E356F заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKFYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM92 191 Один аминокислотный остаток E356I заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKIYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM93 192 Один аминокислотный остаток E356L заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKLYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM94 193 Один аминокислотный остаток E356Q заменен из SEQ ID NO: 3, расщепление происходит перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, а расщепление происходит после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKOYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM95 194 Один аминокислотный остаток E356V заменен из SEQ ID NO: 3, расщепление происходит перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, а расщепление происходит после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKVYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM96 195 3 аминокислотных остатка N166K, E343V и T361M заменены в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKKRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWVNTRTKESCQAIKEYMDTMLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM97 196 Один аминокислотный остаток G340Q заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWOSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM98 197 Один аминокислотный остаток S341H заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGHWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM99 198 Один аминокислотный остаток W342I заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSIENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM100 199 Один аминокислотный остаток E343Y заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWYNTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM101 200 Один аминокислотный остаток T345E заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENERTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM102 201 Один аминокислотный остаток R346F заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTFTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM103 202 Один аминокислотный остаток T347E заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTREKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM104 203 Один аминокислотный остаток E349L заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKLSCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM105 204 Один аминокислотный остаток S350I заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKEICQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM106 205 Один аминокислотный остаток Q352G заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCGAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM107 206 Один аминокислотный остаток I354R заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQARKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM110 207 Один аминокислотный остаток M358R заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYRDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM111 208 Один аминокислотный остаток D359V заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMVTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM112 209 Один аминокислотный остаток T360R заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDRTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM114 210 Один аминокислотный остаток T345K заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENKRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM115 211 Один аминокислотный остаток R346L заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTLTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM116 212 Один аминокислотный остаток T347V заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRVKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM117 213 Один аминокислотный остаток E349W заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKWSCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM118 214 Один аминокислотный остаток I354W заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAWKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM121 215 Один аминокислотный остаток D359Y заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMYTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM125 216 Один аминокислотный остаток T347W заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRWKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM126 217 Один аминокислотный остаток Y357W заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEWMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM130 218 Один аминокислотный остаток W342D заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSDENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM131 219 Один аминокислотный остаток E343Q заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWONTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM132 220 Один аминокислотный остаток T347H заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRHKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM133 221 Один аминокислотный остаток K348F заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTFESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM134 222 Один аминокислотный остаток S350D заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKEDCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM135 223 Один аминокислотный остаток Q352Y заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCYAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM136 224 Один аминокислотный остаток A353E заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQEIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM138 225 Один аминокислотный остаток M358Y заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYYDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM139 226 Один аминокислотный остаток D359Q заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMOTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM140 227 Один аминокислотный остаток T360L заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDLTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM141 228 Один аминокислотный остаток T361E заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTELNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM142 229 Один аминокислотный остаток N363E заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLEPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM143 230 Один аминокислотный остаток W342H заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSHENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM144 231 Один аминокислотный остаток K348D заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTDESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM145 232 Один аминокислотный остаток T361H заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTHLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM146 233 Дополнительной замены не проведены, разрыв проведен перед аминокислотным остатком R39 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. RAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM147 234 Дополнительной замены не проведены, разрыв проведен перед аминокислотным остатком A40 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. APPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM149 235 Дополнительной замены не проведены, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка D456 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVD HM150 236 2 аминокислотных остатка S350Q и T360R заменены в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком R39 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. RAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKEOCQAIKEYMDRTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM152 237 Один аминокислотный остаток D65A заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFAEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM153 238 Один аминокислотный остаток E66A заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDAPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM154 239 Один аминокислотный остаток P67A заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEALDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM155 240 Один аминокислотный остаток N344F заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPADMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM156 241 Один аминокислотный остаток Q311A заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDAVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM157 242 Один аминокислотный остаток V312A заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQALKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM158 243 Один аминокислотный остаток L313A заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVAKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM159 244 Один аминокислотный остаток K314A заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLAFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM160 245 Один аминокислотный остаток N266A заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLATQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM161 246 Один аминокислотный остаток T267A заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNAQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM162 247 Один аминокислотный остаток Q268A заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTAQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM163 248 Один аминокислотный остаток Q269A заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQASPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM164 249 Один аминокислотный остаток P271A заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSAVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM165 250 Один аминокислотный остаток V272A заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPAAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM166 251 Один аминокислотный остаток I102A заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYADSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM167 252 Один аминокислотный остаток D103A заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIASITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM168 253 Один аминокислотный остаток S104A заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDAITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM169 254 Один аминокислотный остаток I105A заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSATGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM170 255 Один аминокислотный остаток T132A заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDIAFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM171 256 Один аминокислотный остаток F133A заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITAYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM172 257 Один аминокислотный остаток Y134A заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFAMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM173 258 Один аминокислотный остаток V241A заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNAEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM174 259 Один аминокислотный остаток E242A заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVAIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM175 260 Один аминокислотный остаток I243A заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEAKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM176 261 Один аминокислотный остаток K244A заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIARNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM177 262 Один аминокислотный остаток L179A заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQASLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM178 263 Один аминокислотный остаток S180A заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLALTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM179 264 Один аминокислотный остаток L181A заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSATEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM180 265 Один аминокислотный остаток T182A заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLAEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM181 266 Один аминокислотный остаток T185A заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEAAEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM182 267 Один аминокислотный остаток E186A заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATAKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM183 268 Один аминокислотный остаток K187A заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEAAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM184 269 Один аминокислотный остаток K290A заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSAIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM185 270 Один аминокислотный остаток I291A заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKAPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM186 271 Один аминокислотный остаток P292A заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIADAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM190 272 Один аминокислотный остаток L441A заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTASCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM191 273 Один аминокислотный остаток S442A заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLACKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM192 274 Один аминокислотный остаток D451A заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKATDAVDVCIADGVCIDAF HM193 275 Один аминокислотный остаток T452A заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDADAVDVCIADGVCIDAF HM194 276 Один аминокислотный остаток D453A заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTAAVDVCIADGVCIDAF HM195 277 Один аминокислотный остаток D461A заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIAAGVCIDAF HM196 278 Один аминокислотный остаток G462A заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADAVCIDAF HM197 279 Один аминокислотный остаток V463A заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGACIDAF HM198 280 Один аминокислотный остаток N82A заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRIAATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM199 281 Один аминокислотный остаток N166A заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKARSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM203 282 Один аминокислотный остаток S104N заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDNITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM204 283 Один аминокислотный остаток I105Q заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSOTGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM205 284 Один аминокислотный остаток Q268D заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTDQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM208 285 Один аминокислотный остаток Q268I заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTIQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM210 286 Один аминокислотный остаток I291G заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKGPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM211 287 Один аминокислотный остаток P292D заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIDDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM212 288 Один аминокислотный остаток T452D заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDDDAVDVCIADGVCIDAF HM213 289 Один аминокислотный остаток T452D заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDHDAVDVCIADGVCIDAF HM214 290 Один аминокислотный остаток T452K заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDKDAVDVCIADGVCIDAF HM216 291 Один аминокислотный остаток T452G заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDGDAVDVCIADGVCIDAF HM217 292 Один аминокислотный остаток T452P заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDPDAVDVCIADGVCIDAF HM218 293 Один аминокислотный остаток T452M заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDMDAVDVCIADGVCIDAF HM219 294 Один аминокислотный остаток T452F заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDFDAVDVCIADGVCIDAF HM220 295 Один аминокислотный остаток D461R заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIARGVCIDAF HM231 296 Один аминокислотный остаток V463Y заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGYCIDAF HM232 297 Один аминокислотный остаток S180T заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLTLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM233 298 Один аминокислотный остаток D451S заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKSTDAVDVCIADGVCIDAF HM234 299 Один аминокислотный остаток L313P заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVPKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM235 300 Один аминокислотный остаток L313M заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVMKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM243 301 Один аминокислотный остаток L179S заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQSSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM245 302 Один аминокислотный остаток L179I заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQISLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM246 303 Один аминокислотный остаток L179F заменен в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQFSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM254 304 3 аминокислотных остатка N344F, K348Q и K355Q заменены в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWEFTRTOESCQAIOEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM261 305 7 аминокислотных остатков T132S, L181A, E186D, Q268N, I291L, V312A и T452D заменены в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDISFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSATEATDKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTNQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKLPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQALKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDDDAVDVCIADGVCIDAF HM262 306 Дополнительных замен не проведено, разрыв проведен перед аминокислотным остатком N37 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. NFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM263 307 Дополнительных замен не проведено, разрыв проведен перед аминокислотным остатком L36 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. LNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM266 308 9 аминокислотных остатков R39K, I105A, T132S, L181M, E186D, I291L, Q268A, V312A и T452D заменены в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FKAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSATGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDISFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSMTEATDKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTAQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKLPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQALKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDDDAVDVCIADGVCIDAF HM268 309 7 аминокислотных остатков T132A, L181A, E186A, Q268A, I291L, V312A и T452D заменены из SEQ ID NO: 3, расщепление происходит до аминокислотного остатка F38 на N-конце PH20, а расщепление происходит после аминокислотного остатка F468 на С-конец PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDIAFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSATEATAKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTAQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKLPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQALKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDDDAVDVCIADGVCIDAF HM271 310 2 аминокислотных остатка N344I и K348M заменены из SEQ ID NO: 3, расщепление происходит перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, а расщепление происходит после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWEITRTMESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM275 311 10 аминокислотных остатков S341D, W342L, E343S, N344I, T345S, R346S, K348M, K355D, D359E и T361I заменены в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDEGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM276 312 9 аминокислотных остатков S341D, W342L, E343S, N344I, T345S, K348M, K355D, D359E и T361I заменены в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDEGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAF HM279 313 8 аминокислотных остатков T132S, L181A, E186D, Q268N, I291L, V312A, T452D и K348M заменены в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDISFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSATEATDKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTNQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKLPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQALKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWENTRTMESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDDDAVDVCIADGVCIDAF HM280 314 9 аминокислотных остатков T132S, L181A, E186D, Q268N, I291L, V312A, T452D, N344I и K348M заменены в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDISFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSATEATDKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTNQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKLPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQALKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSWEITRTMESCQAIKEYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDDDAVDVCIADGVCIDAF HM287 315 17 аминокислотных остатков T132A, L181A, E186A, Q268A, I291L, V312A, S341D, W342L, E343S, N344I, T345S, R346S, K348M, K355D, D359E, T361I и T452D заменены в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDIAFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSATEATAKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTAQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKLPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQALKFLSQDQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDDDAVDVCIADGVCIDAF HM288 316 17 аминокислотных остатков T132A, L181A, E186A, Q268A, I291L, V312A, S341D, W342L, E343S, N344I, T345S, K348M, K355D, D359E, T361I и T452D заменены в SEQ ID NO: 3, разрыв проведен перед аминокислотным остатком F38 на N-конце PH20, и разрыв проведен после аминокислотного остатка F468 на C-конце PH20. FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDIAFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSATEATAKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTAQSPVAATLYVRNRVREAIRQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDDDAVDVCIADGVCIDAF

Пример 2. Определение характерных особенностей вариантов PH20 согласно настоящему изобретению

Дальнейшее изучение структуры и функции белка было проведено путем исследования вариантов, включая разрывы на N-конце и C-конце, на основе аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3. Количественная оценка экспрессии и анализ активности полученного варианта дают температуру агрегации, показанную в таблице 7.

Уровень экспрессии и удельную активность анализировали турбидиметрическим анализом, описанным в примере 1. Показаны результаты анализа. При этом активность в культуральном растворе, превышающая 300 единиц/мл, была обозначена как «>LOQ», а активность после очистки, превышающая 15 единиц/мкг, была обозначена как «>LOQ» на основании предела количественного определения (LOQ), установленного для каждой активности в культуральном растворе и активности после очистки. В противном случае знак неравенства менялся. Уровень экспрессии и пределы количественного определения (LOQ) анализа активности и результаты испытаний, основанные на них, показаны в таблице 7. Температура агрегации PH20 дикого типа (L36-Y482) SEQ ID NO: 1 составляет 46,5°C, а температура агрегации варианта PH20 (F38-F468) SEQ ID NO: 3 составляет 51°C.

Таблица 7. Уровень экспрессии, удельная активность и температура агрегации вариантов PH20 согласно настоящему изобретению

Варианты Изменение Seq ID NO. 3 Уровень экспрессии
(LOQ:
300 единиц/мл) Удельная активность
(LOQ:
15
единиц/мкг) Точка агрегации
(℃) Аминокислотная замена Начало Конец HM63 R346M F38 F468 > LOQ > LOQ 52℃ HM64 T347Q F38 F468 > LOQ > LOQ 50℃ HM65 K348Q F38 F468 > LOQ > LOQ 51℃ HM66 S350Q F38 F468 > LOQ > LOQ 56℃ HM67 K355Q F38 F468 > LOQ > LOQ 50℃ HM69 M358V F38 F468 > LOQ > LOQ 50℃ HM70 L362A F38 F468 > LOQ > LOQ 48℃ HM71 E343V F38 F468 > LOQ > LOQ 50℃ HM72 N344F F38 F468 > LOQ > LOQ 52℃ HM73 D359K F38 F468 > LOQ > LOQ 50℃ HM74 T360Y F38 F468 > LOQ > LOQ 50℃ HM75 T361M F38 F468 > LOQ > LOQ 49℃ HM76 Q352E F38 F468 > LOQ > LOQ 52℃ HM77 N363M F38 F468 > LOQ > LOQ 58℃ HM78 T84N F38 F468 > LOQ > LOQ 48℃ HM79 N166K F38 F468 > LOQ > LOQ 49℃ HM82 I354E F38 F468 > LOQ > LOQ 49℃ HM83 I354Q F38 F468 > LOQ > LOQ 49℃ HM84 I354S F38 F468 > LOQ > LOQ 48℃ HM85 I354V F38 F468 > LOQ > LOQ 51℃ HM86 I354A F38 F468 > LOQ > LOQ 49℃ HM88 I354N F38 F468 > LOQ > LOQ 49℃ HM89 I354T F38 F468 > LOQ > LOQ 49℃ HM90 E356M F38 F468 > LOQ > LOQ 50℃ HM91 E356F F38 F468 > LOQ > LOQ 49℃ HM92 E356I F38 F468 > LOQ > LOQ 49℃ HM93 E356L F38 F468 > LOQ > LOQ 49℃ HM94 E356Q F38 F468 > LOQ > LOQ 50℃ HM95 E356V F38 F468 > LOQ > LOQ 48℃ HM96 N166K, E343V, T361M F38 F468 > LOQ > LOQ 48℃ HM97 G340Q F38 F468 > LOQ > LOQ 50℃ HM98 S341H F38 F468 > LOQ > LOQ 51℃ HM99 W342I F38 F468 > LOQ > LOQ 51℃ HM100 E343Y F38 F468 > LOQ > LOQ 50℃ HM101 T345E F38 F468 > LOQ > LOQ 51℃ HM102 R346F F38 F468 > LOQ > LOQ 51℃ HM103 T347E F38 F468 > LOQ > LOQ 50℃ HM104 E349L F38 F468 > LOQ > LOQ 50℃ HM105 S350I F38 F468 > LOQ > LOQ 50℃ HM106 Q352G F38 F468 > LOQ > LOQ 49℃ HM107 I354R F38 F468 > LOQ > LOQ 48℃ HM110 M358R F38 F468 > LOQ > LOQ 48℃ HM111 D359V F38 F468 > LOQ > LOQ 50℃ HM112 T360R F38 F468 > LOQ > LOQ 52℃ HM114 T345K F38 F468 > LOQ > LOQ 50℃ HM115 R346L F38 F468 > LOQ > LOQ 52℃ HM116 T347V F38 F468 > LOQ > LOQ 49℃ HM117 E349W F38 F468 > LOQ > LOQ 49℃ HM118 I354W F38 F468 > LOQ > LOQ 51℃ HM121 D359Y F38 F468 > LOQ > LOQ 49℃ HM125 T347W F38 F468 > LOQ > LOQ 51℃ HM126 Y357W F38 F468 > LOQ > LOQ 55℃ HM130 W342D F38 F468 > LOQ > LOQ 51℃ HM131 E343Q F38 F468 > LOQ > LOQ 50℃ HM132 T347H F38 F468 > LOQ > LOQ 51℃ HM133 K348F F38 F468 > LOQ > LOQ 49℃ HM134 S350D F38 F468 > LOQ > LOQ 54℃ HM135 Q352Y F38 F468 > LOQ > LOQ 51℃ HM136 A353E F38 F468 > LOQ > LOQ 49℃ HM138 M358Y F38 F468 > LOQ > LOQ 48℃ HM139 D359Q F38 F468 > LOQ > LOQ 50℃ HM140 T360L F38 F468 > LOQ > LOQ 49℃ HM141 T361E F38 F468 > LOQ > LOQ 48℃ HM142 N363E F38 F468 > LOQ > LOQ 50℃ HM143 W342H F38 F468 > LOQ > LOQ 50℃ HM144 K348D F38 F468 > LOQ > LOQ 50℃ HM145 T361H F38 F468 > LOQ > LOQ 49℃ HM146 - R39 F468 > LOQ > LOQ 52℃ HM147 - A40 F468 > LOQ > LOQ 53℃ HM149 - F38 D456 > LOQ > LOQ 54℃ HM150 S350Q, T360R R39 F468 > LOQ > LOQ 50℃ HM152 D65A F38 F468 > LOQ > LOQ 51℃ HM153 E66A F38 F468 > LOQ > LOQ 51℃ HM154 P67A F38 F468 > LOQ > LOQ 50℃ HM155 L68A F38 F468 > LOQ > LOQ 51℃ HM156 Q311A F38 F468 > LOQ > LOQ 50℃ HM157 V312A F38 F468 > LOQ > LOQ 56℃ HM158 L313A F38 F468 > LOQ > LOQ 55℃ HM159 K314A F38 F468 > LOQ > LOQ 49℃ HM160 N266A F38 F468 > LOQ > LOQ 49℃ HM161 T267A F38 F468 > LOQ > LOQ 50℃ HM162 Q268A F38 F468 > LOQ > LOQ 51℃ HM163 Q269A F38 F468 > LOQ > LOQ 51℃ HM164 P271A F38 F468 > LOQ > LOQ 51℃ HM165 V272A F38 F468 > LOQ > LOQ 52℃ HM166 I102A F38 F468 > LOQ > LOQ 49℃ HM167 D103A F38 F468 > LOQ > LOQ 53℃ HM168 S104A F38 F468 > LOQ > LOQ 51℃ HM169 I105A F38 F468 > LOQ > LOQ 51℃ HM170 T132A F38 F468 > LOQ > LOQ 51℃ HM171 F133A F38 F468 > LOQ > LOQ 50℃ HM172 Y134A F38 F468 > LOQ > LOQ 52℃ HM173 V241A F38 F468 > LOQ > LOQ 50℃ HM174 E242A F38 F468 < LOQ > LOQ 55℃ HM175 I243A F38 F468 > LOQ > LOQ 49℃ HM176 K244A F38 F468 > LOQ > LOQ 50℃ HM177 L179A F38 F468 > LOQ > LOQ 54℃ HM178 S180A F38 F468 > LOQ > LOQ 50℃ HM179 L181A F38 F468 > LOQ > LOQ 50℃ HM180 T182A F38 F468 > LOQ > LOQ 50℃ HM181 T185A F38 F468 > LOQ > LOQ 50℃ HM182 E186A F38 F468 > LOQ > LOQ 51℃ HM183 K187A F38 F468 > LOQ > LOQ 50℃ HM184 K290A F38 F468 > LOQ > LOQ 50℃ HM185 I291A F38 F468 > LOQ > LOQ 54℃ HM186 P292A F38 F468 > LOQ > LOQ 52℃ HM190 L441A F38 F468 > LOQ > LOQ 50℃ HM191 S442A F38 F468 > LOQ > LOQ 54℃ HM192 D451A F38 F468 > LOQ > LOQ 54℃ HM193 T452A F38 F468 > LOQ > LOQ 53℃ HM194 D453A F38 F468 > LOQ > LOQ 49℃ HM195 D461A F38 F468 > LOQ > LOQ 49℃ HM196 G462A F38 F468 > LOQ > LOQ 50℃ HM197 V463A F38 F468 > LOQ > LOQ 49℃ HM198 N82A F38 F468 > LOQ > LOQ 49℃ HM199 N166A F38 F468 > LOQ > LOQ 50℃ HM203 S104N F38 F468 > LOQ > LOQ 48℃ HM204 I105Q F38 F468 > LOQ > LOQ 51℃ HM205 Q268D F38 F468 > LOQ > LOQ 55℃ HM208 Q268I F38 F468 < LOQ > LOQ 52℃ HM210 I291G F38 F468 < LOQ > LOQ 55℃ HM211 P292D F38 F468 < LOQ > LOQ 53℃ HM212 T452D F38 F468 > LOQ > LOQ 50℃ HM213 T452H F38 F468 > LOQ > LOQ 50℃ HM214 T452K F38 F468 > LOQ > LOQ 52℃ HM216 T452G F38 F468 > LOQ > LOQ 54℃ HM217 T452P F38 F468 > LOQ > LOQ 52℃ HM218 T452M F38 F468 > LOQ > LOQ 52℃ HM219 T452F F38 F468 > LOQ > LOQ 53℃ HM220 D461R F38 F468 > LOQ > LOQ 48℃ HM231 V463Y F38 F468 > LOQ > LOQ 51℃ HM232 S180T F38 F468 > LOQ > LOQ 51℃ HM233 D451S F38 F468 > LOQ > LOQ 51℃ HM234 L313P F38 F468 > LOQ > LOQ 49℃ HM235 L313M F38 F468 > LOQ > LOQ 52℃ HM243 L179S F38 F468 > LOQ > LOQ 52℃ HM245 L179I F38 F468 > LOQ > LOQ 48℃ HM246 L179F F38 F468 > LOQ > LOQ 55℃ HM254 N344F, K348Q, K355Q F38 F468 > LOQ > LOQ 53℃ HM261 T132S, L181A, E186D, Q268N, I291L, V312A, T452D F38 F468 > LOQ > LOQ 56℃ HM262 - N37 F468 > LOQ > LOQ 50℃ HM263 - L36 F468 > LOQ > LOQ 49℃ HM266 R39K, I105A, T132S, L181M, E186D, Q268A, I291L, V312A, T452D F38 F468 > LOQ > LOQ 57℃ HM268 T132A, L181A, E186A, Q268A, I291L, V312A, T452D F38 F468 > LOQ > LOQ 53℃ HM271 N344I, K348M F38 F468 > LOQ > LOQ 51℃ HM275 S341D, W342L, E343S, N344I, T345S, R346S, K348M, K355D, D359E, T361I F38 F468 > LOQ > LOQ 48℃ HM276 S341D, W342L, E343S, N344I, T345S, K348M, K355D, D359E, T361I F38 F468 > LOQ > LOQ 48℃ HM279 T132S, L181A, E186D, Q268N, I291L, V312A, K348M, T452D F38 F468 > LOQ > LOQ 56℃ HM280 T132S, L181A, E186D, Q268N, I291L, V312A, N344I, K348M, T452D F38 F468 < LOQ > LOQ 59℃ HM287 T132A, L181A, E186A, Q268A, I291L, V312A, S341D, W342L, E343S, N344I, T345S, R346S, K348M, K355D, D359E, T361I, T452D F38 F468 < LOQ > LOQ 48℃ HM288 T132A, L181A, E186A, Q268A, I291L, V312A, S341D, W342L, E343S, N344I, T345S, K348M, K355D, D359E, T361I, T452D F38 F468 < LOQ > LOQ 48℃

Как видно из таблицы 7 выше, среди вариантов, имеющих аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, всего 133 типа вариантов, имеющих замену одного аминокислотного остатка, а именно HM63, HM64, HM65, HM66, HM67, HM69, HM70, HM71, HM72, HM73, HM74, HM75, HM76, HM77, HM78, HM79, HM82, HM83, HM84, HM85, HM86, HM88, HM89, HM90, HM91, HM92, HM93, HM94, HM95, HM97, HM98, HM99, HM100, HM101, HM102, HM103, HM104, HM105, HM106, HM107, HM110, HM111, HM112, HM114, HM115, HM116, HM117, HM118, HM121, HM125, HM126, HM130, HM131, HM132, HM133, HM134, HM135, HM136, HM138, HM139, HM140, HM141, HM142, HM143, HM144, HM145, HM152, HM153, HM154, HM155, HM156, HM157, HM158, HM159, HM160, HM161, HM162, HM163, HM164, HM165, HM166, HM167, HM168, HM169, HM170, HM171, HM172, HM173, HM174, HM175, HM176, HM177, HM178, HM179, HM180, HM181, HM182, HM183, HM184, HM185, HM186, HM190, HM191, HM192, HM193, HM194, HM195, HM196, HM197, HM198, HM199, HM203, HM204, HM205, HM208, HM210, HM211, HM212, HM213, HM214, HM216, HM217, HM218, HM219, HM220, HM231, HM232, HM233, HM234, HM235, HM243, HM245 и HM246 представляли собой варианты, которые все еще сохраняют активность в очищенной фракции, полученной после очистки, и имеют температуру агрегации от 48 до 58°C и, таким образом, демонстрируют превосходную термическую стабильность. Среди них всего 65 типов вариантов, а именно HM63, HM64, HM65, HM66, HM67, HM69, HM70, HM71, HM72, HM73, HM74, HM75, HM76, HM77, HM78, HM79, HM82, HM83, HM84, HM85, HM86, HM88, HM89, HM90, HM91, HM92, HM93, HM94, HM95, HM98, HM99, HM100, HM101, HM102, HM103, HM104, HM105, HM106, HM107, HM110, HM111, HM112, HM114, HM115, HM116, HM117, HM118, HM121, HM125, HM126, HM130, HM131, HM132, HM133, HM134, HM135, HM136, HM138, HM139, HM140, HM141, HM142, HM143, HM144 и HM145 являются вариантами, которые мутированы в одном из участков замены в последовательности SEQ ID NO: 3 из PH20 и имеют температуру агрегации от 48°C до 58°C. Всего существует 68 типов вариантов, а именно HM97, HM152, HM153, HM154, HM155, HM156, HM157, HM158, HM159, HM160, HM161, HM162, HM163, HM164, HM165, HM166, HM167, HM168, HM169, HM170, HM171, HM172, HM173, HM174, HM175, HM176, HM177, HM178, HM179, HM180, HM181, HM182, HM183, HM184, HM185, HM186, HM190, HM191, HM192, HM193, HM194, HM195, HM196, HM197, HM198, HM199, HM203, HM204, HM205, HM208, HM210, HM211, HM212, HM213, HM214, HM216, HM217, HM218, HM219, HM220, HM231, HM232, HM233, HM234, HM235, HM243, HM245 и HM246 являются вариантами, которые мутированы в одном из положений отличных от участков замены в SEQ ID NO: 3 из PH20, и имеют температуру агрегации от 48°C до 56°C.

В результате можно видеть, что вариант, имеющий замену в одном положении из SEQ ID NO: 3, имеет более высокую температуру агрегации, чем у PH20 дикого типа (L36-Y482) из SEQ ID NO: 1, независимо от положения замены. Однако среди них было обнаружено, что HM174, HM208, HM210 и HM211 имеют более низкую, чем 300 единиц/мл, которая является LOQ, активность в культуральном растворе, но имеют более высокую, чем 15 единиц/мкг, которая является LOQ, активность после очистки. В этом случае считается, что характеристики самого варианта не могут быть точно проанализированы, когда активность варианта измеряется только в культуральном растворе.

Кроме того, как показано в Таблице 7 выше, среди вариантов, имеющих аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, HM146, HM147, HM149, HM262 и HM263, сохраняются те же мутации, что и у варианта, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, то есть замены аминокислотных остатков, но дополнительно включает разрыв на N-конце и C-конце, что означает, что на экспрессию и активность белков у вариантов, имеющих аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 дополнительный разрыв на N-конце и C-конце влияние не оказывает. Эти варианты имеют температуру агрегации от 49°C до 53°C, что не сильно отличается от температуры варианта SEQ ID NO: 3, что означает, что дополнительный разрыв на N-конце и С-конце также не повлиял на физические свойства вариантов.

Кроме того, в вариантах, имеющих аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, всего 13 типов вариантов, а именно HM96, HM150, HM254, HM261, HM266, HM268, HM271, HM275, HM276, HM279, HM280, HM287 и HM288, которые представляют собой варианты, включающие одну или несколько аминокислотных замен и разрывов из числа тех, которые перечислены в таблице 7 выше, относились к хорошо экспрессируемым белкам, дополнительно сохраняли ферментативную активность и имели температуру агрегации от 48°C до 59°C. Это означает, что даже в случае таких множественных замен сохранялись активность и физические свойства белков. Однако множественные замены проявляют непредсказуемую ферментативную активность и температуру агрегации, которые непредсказуемы при сочетании характеристик, которые получают в случае каждой отдельной замены, составляющей множественные замены.

Пример 3. Анализ активности вариантов, замещенных последовательностями Hyal2, Hyal3 и Hyal4

Для того, чтобы исследовать, как изменяется стабильность белков в аминокислотную последовательность PH20 дикого типа с SEQ ID NO: 1 вместо участков M345-I361 в участки M345-I361 вводили аминокислотные последовательности Hyal2 (TTSTETCQYLKDYLTRL), Hyal3 (SSSEEECWHLHDYLVDT) и Hyal4 (TASKANCTKVKQFVSSD), которые являются соответствующими частями присутствующих у человека гиалуронидаз, отличных от Hyal1.

Варианты, сконструированные путем замены участков M345-I361 зрелой PH20 дикого типа (L36-S490) соответствующими последовательностями Hyal2, Hyal3 и Hyal4, называются «Hyal2-вариант», «Hyal3-вариант» и «Hyal4-вариант», соответственно.

Были сконструированы Hyal2-вариант, Hyal3-вариант и Hyal4-вариант, а затем была проанализирована термостабильность этих вариантов (см. фиг. 2). В результате температура агрегации Hyal3-варианта, измеренная с помощью DLS, составила 48°C, что на 1,5°C выше, чем 46,5°C, которая является температурой агрегации PH20 дикого типа, что означает, что термостабильность повысилась.

Кроме того, чтобы подтвердить, экспрессируются ли эти варианты в культуре клеток ExpiCHO, варианты очищали тем же способом с использованием колонки HisTrap, и уровни экспрессии белков сравнивали с помощью анализа SDS-PAGE. Результат показал, что уровень экспрессии Hyal3-варианта был самым высоким, за ним следуют Hyal2-вариант и Hyal4-вариант в порядке убывания.

Пример 4. Анализ термической стабильности вариантов согласно настоящему изобретению

Анализ SDS-PAGE проводили для подтверждения термостабильности вариантов согласно настоящему изобретению. Очищенную PH20 дикого типа с SEQ ID NO: 1 (L36-Y482) и очищенный белок вариантов PH20 согласно настоящему изобретению с SEQ ID NO: 3 (F38-F468) хранили при 42°C в течение 7 дней с последующим анализом 10% SDS-PAGE в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях (фиг. 4).

В результате наблюдалась агрегация PH20 дикого типа (L36-Y482) (полоса G на фиг. 4), тогда как вариант PH20 (F38-F468) SEQ ID NO: 3 не агрегировал (полоса H на фиг. 4). Было обнаружено, что это различие в агрегации связано с разницей в температуре агрегации между двумя белками. Соответственно, вариант согласно настоящему изобретению, как считается, демонстрирует более высокую термическую стабильность и, таким образом, ожидается, что этот вариант имеет более широкую область применения в промышленности из-за его высокой температуры агрегации по сравнению с PH20 дикого типа.

Пример 5. Анализ ферментативной кинетики вариантов согласно настоящему изобретению

Чтобы проанализировать ферментативную кинетику вариантов согласно настоящему изобретению, ферментативную активность измеряли способом Моргана-Элсона (Takahashi, T. et al (2003) Anal. Biochem. 322: 257-263). Способ Моргана-Элсона-это колориметрический метод, который определяет красные вещества (при 545 нм), образующиеся в результате реакции восстанавливающего конца N-ацетил-D-глюкозамина (GlcNAc), образующегося при гидролизе гиалуроновой кислоты гиалуронидазой с помощью пара-диметиламинобензальдегида (DMAB), который является реагентом Эрлиха. N-ацетил-D-глюкозамин (GlcNAc, Sigma), разведенный до 0,25, 0,50, 0,75, 1,00 или 1,25 мМ в буферном растворе для разведения (0,1 M NaPi, 0,1 M NaCl, 1,5 мМ 1,4-лактона сахарной кислоты, pH 5,35) восстанавливали обработкой тетраборатом в каждой пробирке, а затем добавляли DMAB, чтобы вызвать колориметрическую реакцию. После реакции измеряли оптическую плотность при 545 нм, чтобы создать стандартную кривую реакции для GlcNAc. Гиалуроновую кислоту в качестве субстрата разводили до 0,54, 0,65, 0,87, 1,23 или 2,17 мкМ в растворе буфера для разведения в каждой пробирке и добавляли гиалуронидазу с последующей реакцией при 37°C в течение 5 минут и последующим нагреванием при 100°C в течение 5 минут для прекращения ферментативной реакции. Образец, полученный после ферментативной реакции, восстанавливали обработкой тетраборатом и добавляли DMAB для индукции колориметрической реакции. После реакции измеряли оптическую плотность при 545 нм и измеряли активность фермента, используя приведенную выше стандартную кривую реакции GlcNAc. Кинетику фермента PH20 дикого типа из SEQ ID NO: 1 и варианта PH20 согласно настоящему изобретению анализировали с использованием этого способа. В результате была обнаружена линейность кривой Лайнуивера-Берка, что означает, что вариант PH20 согласно настоящему изобретению соответствует уравнению ферментативной кинетики Михаэлиса-Ментен.

В таблице 8 показаны V_max (максимальная скорость ферментативной реакции), K_M (концентрация субстрата 50%), k_cat (скорость превращения субстрата) и k_cat/K_M (эффективность ферментного катализатора), полученные в результате анализа ферментативной кинетики относительно PH20 дикого типа (L36-Y482) с SEQ ID NO: 1, варианта PH20 (F38-F468) с SEQ ID NO: 3, HM261 и HM268. Можно видеть, что по мере уменьшения значения K_M способность фермента связывать субстрат увеличивается, и по мере увеличения значения k_cat скорость превращения субстрата ферментом увеличивается, поэтому k_cat/K_M (эффективность ферментного катализатора) каждого варианта PH20 выше, чем PH20 дикого типа. Кроме того, kcat каждой из SEQ ID NO: 3, HM261 и HM268 больше, чем у PH20 дикого типа из SEQ ID NO: 1, и, таким образом, скорость превращения субстрата ферментом больше, чем у PH20 дикого типа из SEQ ID NO: 1, поэтому промышленная доступность каждого варианта PH20 выше, чем доступность PH20 дикого типа.

Таблица 8. Результаты анализа ферментативной кинетики вариантов PH20 согласно настоящему изобретению

V_max
(мкМ/сек) K_M
(мкМ) k_cat
(1/сек) k_cat/ K_M PH20
SEQ ID NO: 1
(L36-Y482) 4,5±0,5 2,0±0,3 30,6±3,0 15,1±1,1 SEQ ID NO: 3
(F38-F468) 3,7±0,3 1,3±0,0 47,6±3,7 36,8±2,0 HM261 5,2±0,5 1,4±0,2 33,9±3,0 23,7±2,2 HM268 2,9±0,5 0,9±0,2 37,1±6,4 40,0±3,4

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> АЛТЕОГЕН, ИНК

<120> НОВЫЕ ВАРИАНТЫ ГИАЛУРОНИДАЗЫ С УЛУЧШЕННОЙ СТАБИЛЬНОСТЬЮ И

СОДЕРЖАЩАЯ ИХ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ

<130> PP-B2512

<150> KR 10-2020-0009046

<151> 2020-01-23

<160> 316

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 509

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 1

Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His Ile Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys

1 5 10 15

Ser Ser Gly Val Ser Gln Ile Val Phe Thr Phe Leu Leu Ile Pro Cys

20 25 30

Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro

35 40 45

Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe

50 55 60

Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg

65 70 75 80

Ile Asn Ala Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu

85 90 95

Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly

100 105 110

Gly Ile Pro Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys

115 120 125

Lys Asp Ile Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val

130 135 140

Ile Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro

145 150 155 160

Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn

165 170 175

Val Gln Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe

180 185 190

Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys

195 200 205

Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys

210 215 220

Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn

225 230 235 240

Val Glu Ile Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser

245 250 255

Thr Ala Leu Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val

260 265 270

Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val

275 280 285

Ser Lys Ile Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr

290 295 300

Arg Ile Val Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu

305 310 315 320

Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile

325 330 335

Val Ile Trp Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu

340 345 350

Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn

355 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln

370 375 380

Gly Val Cys Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu

385 390 395 400

Asn Pro Asp Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr

405 410 415

Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys

420 425 430

Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp

435 440 445

Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys

450 455 460

Ile Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile

465 470 475 480

Phe Tyr Asn Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe Ile Val

485 490 495

Ser Ile Leu Phe Leu Ile Ile Ser Ser Val Ala Ser Leu

500 505

<210> 2

<211> 435

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 2

Met Ala Ala His Leu Leu Pro Ile Cys Ala Leu Phe Leu Thr Leu Leu

1 5 10 15

Asp Met Ala Gln Gly Phe Arg Gly Pro Leu Leu Pro Asn Arg Pro Phe

20 25 30

Thr Thr Val Trp Asn Ala Asn Thr Gln Trp Cys Leu Glu Arg His Gly

35 40 45

Val Asp Val Asp Val Ser Val Phe Asp Val Val Ala Asn Pro Gly Gln

50 55 60

Thr Phe Arg Gly Pro Asp Met Thr Ile Phe Tyr Ser Ser Gln Leu Gly

65 70 75 80

Thr Tyr Pro Tyr Tyr Thr Pro Thr Gly Glu Pro Val Phe Gly Gly Leu

85 90 95

Pro Gln Asn Ala Ser Leu Ile Ala His Leu Ala Arg Thr Phe Gln Asp

100 105 110

Ile Leu Ala Ala Ile Pro Ala Pro Asp Phe Ser Gly Leu Ala Val Ile

115 120 125

Asp Trp Glu Ala Trp Arg Pro Arg Trp Ala Phe Asn Trp Asp Thr Lys

130 135 140

Asp Ile Tyr Arg Gln Arg Ser Arg Ala Leu Val Gln Ala Gln His Pro

145 150 155 160

Asp Trp Pro Ala Pro Gln Val Glu Ala Val Ala Gln Asp Gln Phe Gln

165 170 175

Gly Ala Ala Arg Ala Trp Met Ala Gly Thr Leu Gln Leu Gly Arg Ala

180 185 190

Leu Arg Pro Arg Gly Leu Trp Gly Phe Tyr Gly Phe Pro Asp Cys Tyr

195 200 205

Asn Tyr Asp Phe Leu Ser Pro Asn Tyr Thr Gly Gln Cys Pro Ser Gly

210 215 220

Ile Arg Ala Gln Asn Asp Gln Leu Gly Trp Leu Trp Gly Gln Ser Arg

225 230 235 240

Ala Leu Tyr Pro Ser Ile Tyr Met Pro Ala Val Leu Glu Gly Thr Gly

245 250 255

Lys Ser Gln Met Tyr Val Gln His Arg Val Ala Glu Ala Phe Arg Val

260 265 270

Ala Val Ala Ala Gly Asp Pro Asn Leu Pro Val Leu Pro Tyr Val Gln

275 280 285

Ile Phe Tyr Asp Thr Thr Asn His Phe Leu Pro Leu Asp Glu Leu Glu

290 295 300

His Ser Leu Gly Glu Ser Ala Ala Gln Gly Ala Ala Gly Val Val Leu

305 310 315 320

Trp Val Ser Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile

325 330 335

Lys Glu Tyr Met Asp Thr Thr Leu Gly Pro Phe Ile Leu Asn Val Thr

340 345 350

Ser Gly Ala Leu Leu Cys Ser Gln Ala Leu Cys Ser Gly His Gly Arg

355 360 365

Cys Val Arg Arg Thr Ser His Pro Lys Ala Leu Leu Leu Leu Asn Pro

370 375 380

Ala Ser Phe Ser Ile Gln Leu Thr Pro Gly Gly Gly Pro Leu Ser Leu

385 390 395 400

Arg Gly Ala Leu Ser Leu Glu Asp Gln Ala Gln Met Ala Val Glu Phe

405 410 415

Lys Cys Arg Cys Tyr Pro Gly Trp Gln Ala Pro Trp Cys Glu Arg Lys

420 425 430

Ser Met Trp

435

<210> 3

<211> 509

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 3

Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His Ile Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys

1 5 10 15

Ser Ser Gly Val Ser Gln Ile Val Phe Thr Phe Leu Leu Ile Pro Cys

20 25 30

Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro

35 40 45

Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe

50 55 60

Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg

65 70 75 80

Ile Asn Ala Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu

85 90 95

Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly

100 105 110

Gly Ile Pro Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys

115 120 125

Lys Asp Ile Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val

130 135 140

Ile Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro

145 150 155 160

Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn

165 170 175

Val Gln Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe

180 185 190

Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys

195 200 205

Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys

210 215 220

Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn

225 230 235 240

Val Glu Ile Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser

245 250 255

Thr Ala Leu Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val

260 265 270

Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val

275 280 285

Ser Lys Ile Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr

290 295 300

Arg Ile Val Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu

305 310 315 320

Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile

325 330 335

Val Ile Trp Gly Ser Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln

340 345 350

Ala Ile Lys Glu Tyr Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn

355 360 365

Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln

370 375 380

Gly Val Cys Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu

385 390 395 400

Asn Pro Asp Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr

405 410 415

Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys

420 425 430

Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp

435 440 445

Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys

450 455 460

Ile Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile

465 470 475 480

Phe Tyr Asn Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe Ile Val

485 490 495

Ser Ile Leu Phe Leu Ile Ile Ser Ser Val Ala Ser Leu

500 505

<210> 4

<211> 26

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 4

Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu

1 5 10 15

Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala

20 25

<210> 5

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 5

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser

<210> 6

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 6

Met Ala Ala His Leu Leu Pro Ile Cys Ala Leu Phe Leu Thr Leu Leu

1 5 10 15

Asp Met Ala Gln Gly

20

<210> 7

<211> 93

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 7

atatggggaa ccctcagtat aactacaagc actgagacct gccaatatct gaaggattac

60

ctgaccagac tgctgaatcc ttacataatc aac

93

<210> 8

<211> 93

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 8

atatggggaa ccctcagtat atccagcagt gaggaagaat gctggcattt gcacgattac

60

ctggtagaca cactgaatcc ttacataatc aac

93

<210> 9

<211> 93

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 9

atatggggaa ccctcagtat aaccgcatct aaggcaaact gcacaaaagt aaaacaattc

60

gtctccagtg atctgaatcc ttacataatc aac

93

<210> 10

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 10

gaatatctcg aggccaccat gaagtgggtt aca

33

<210> 11

<211> 55

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 11

ctaattgcgg ccgctcatta gtggtgatgg tgatgatgga agaaaccaat tctgc

55

<210> 12

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 12

aattaggcgg ccgcctatta aaaggcgtcg atgcacacgc catc

44

<210> 13

<211> 64

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 13

ctctaattgc ggccgctcat tagtggtgat ggtgatgatg aaaggcgtcg atgcacacgc

60

catc

64

<210> 14

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 14

aattagagct cgaggccacc atgaaatggg tgacctttat ctcc

44

<210> 15

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 15

cagattctcg aggccaccat gaaatggg

28

<210> 16

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 16

atctggggct cctgggagaa caccaggcag aaggagagct gccaggccat c

51

<210> 17

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 17

atctggggct cctgggagaa caccaggacc caggagagct gccaggccat caag

54

<210> 18

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 18

agaacaccag gaccaaggag caatgccagg ccatcaagga gtac

44

<210> 19

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 19

aggagagctg ccaggccatc caggagtaca tggacacaac cctg

44

<210> 20

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 20

agctgccagg ccatcaagga gtacgtggac acaaccctga acccttatat c

51

<210> 21

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 21

aggagtacat ggacacaacc gcgaaccctt atatcatcaa tg

42

<210> 22

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 22

atcgtgatct ggggctcctg ggtgaacacc aggaccaagg agag

44

<210> 23

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 23

atctggggct cctgggagtt caccaggacc aaggagagct g

41

<210> 24

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 24

agctgccagg ccatcaagga gtacatgaaa acaaccctga acccttatat c

51

<210> 25

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 25

atcaaggagt acatggacta caccctgaac ccttatatca tc

42

<210> 26

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 26

atcaaggagt acatggacac aatgctgaac ccttatatca tc

42

<210> 27

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 27

accaggacca aggagagctg cgaggccatc aaggagtaca tgg

43

<210> 28

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 28

agtacatgga cacaaccctg atgccttata tcatcaatgt gac

43

<210> 29

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 29

tagaagattg tcacgccctg gccgttggca ttgatccgag gagagc

46

<210> 30

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 30

tgcaccagct cgatggaccg tttcttatac acgtccttag gcttc

45

<210> 31

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 31

accaaggaga gctgccaggc cgaaaaggag tacatggaca caacc

45

<210> 32

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 32

accaaggaga gctgccaggc ccaaaaggag tacatggaca caacc

45

<210> 33

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 33

accaaggaga gctgccaggc ctctaaggag tacatggaca caacc

45

<210> 34

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 34

accaaggaga gctgccaggc cgtcaaggag tacatggaca caacc

45

<210> 35

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 35

accaaggaga gctgccaggc cgcgaaggag tacatggaca caacc

45

<210> 36

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 36

accaaggaga gctgccaggc caacaaggag tacatggaca caacc

45

<210> 37

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 37

accaaggaga gctgccaggc caccaaggag tacatggaca caacc

45

<210> 38

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 38

aaggagagct gccaggccat caagatgtac atggacacaa ccctgaac

48

<210> 39

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 39

aaggagagct gccaggccat caagttctac atggacacaa ccctgaac

48

<210> 40

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 40

aaggagagct gccaggccat caagatatac atggacacaa ccctgaac

48

<210> 41

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 41

aaggagagct gccaggccat caagttgtac atggacacaa ccctgaac

48

<210> 42

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 42

aaggagagct gccaggccat caagcagtac atggacacaa ccctgaac

48

<210> 43

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 43

aaggagagct gccaggccat caaggtatac atggacacaa ccctgaac

48

<210> 44

<211> 96

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 44

atcgtgatct ggggctcctg ggtgaacacc aggaccaagg agagctgcca ggccatcaag

60

gagtacatgg acacaatgct gaacccttat atcatc

96

<210> 45

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 45

agctagcggc atcgtgatct ggcaatcctg ggagaacacc aggacc

46

<210> 46

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 46

agcggcatcg tgatctgggg ccactgggag aacaccagga ccaag

45

<210> 47

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 47

agcggcatcg tgatctgggg ctccattgag aacaccagga ccaaggag

48

<210> 48

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 48

atcgtgatct ggggctcctg gtataacacc aggaccaagg agag

44

<210> 49

<211> 49

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 49

atcgtgatct ggggctcctg ggagaacgaa aggaccaagg agagctgcc

49

<210> 50

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 50

atctggggct cctgggagaa caccttcacc aaggagagct gccaggc

47

<210> 51

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 51

atctggggct cctgggagaa caccagggaa aaggagagct gccaggccat c

51

<210> 52

<211> 55

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 52

atctggggct cctgggagaa caccaggacc aagttgagct gccaggccat caagg

55

<210> 53

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 53

agaacaccag gaccaaggag atctgccagg ccatcaagga g

41

<210> 54

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 54

accaggacca aggagagctg cggggccatc aaggagtaca tggac

45

<210> 55

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 55

accaaggaga gctgccaggc cagaaaggag tacatggaca caac

44

<210> 56

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 56

agctgccagg ccatcaagga gtaccgggac acaaccctga acccttatat c

51

<210> 57

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 57

aggccatcaa ggagtacatg gtcacaaccc tgaaccctta tatc

44

<210> 58

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 58

aggccatcaa ggagtacatg gacagaaccc tgaaccctta tatcatc

47

<210> 59

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 59

atctggggct cctgggagaa caagaggacc aaggagagct gccag

45

<210> 60

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 60

atctggggct cctgggagaa caccctgacc aaggagagct gccaggc

47

<210> 61

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 61

atctggggct cctgggagaa caccagggtc aaggagagct gccaggccat c

51

<210> 62

<211> 57

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 62

atctggggct cctgggagaa caccaggacc aagtggagct gccaggccat caaggag

57

<210> 63

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 63

accaaggaga gctgccaggc ctggaaggag tacatggaca caac

44

<210> 64

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 64

aggccatcaa ggagtacatg tacacaaccc tgaaccctta tatc

44

<210> 65

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 65

atctggggct cctgggagaa caccaggtgg aaggagagct gccaggccat c

51

<210> 66

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 66

agctgccagg ccatcaagga gtggatggac acaaccctga accc

44

<210> 67

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 67

agcggcatcg tgatctgggg ctccgacgag aacaccagga ccaaggag

48

<210> 68

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 68

atcgtgatct ggggctcctg gcagaacacc aggaccaagg agagc

45

<210> 69

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 69

atctggggct cctgggagaa caccaggcac aaggagagct gccaggccat c

51

<210> 70

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 70

atctggggct cctgggagaa caccaggacc ttcgagagct gccaggccat caag

54

<210> 71

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 71

agaacaccag gaccaaggag gactgccagg ccatcaagga gtac

44

<210> 72

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 72

accaggacca aggagagctg ctacgccatc aaggagtaca tggacac

47

<210> 73

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 73

aggaccaagg agagctgcca ggaaatcaag gagtacatgg acac

44

<210> 74

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 74

agctgccagg ccatcaagga gtactacgac acaaccctga acccttatat c

51

<210> 75

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 75

aggccatcaa ggagtacatg cagacaaccc tgaaccctta tatc

44

<210> 76

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 76

aggccatcaa ggagtacatg gacctaaccc tgaaccctta tatcatc

47

<210> 77

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 77

atcaaggagt acatggacac agagctgaac ccttatatca tcaatg

46

<210> 78

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 78

agtacatgga cacaaccctg gagccttata tcatcaatgt gac

43

<210> 79

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 79

agcggcatcg tgatctgggg ctcccatgag aacaccagga ccaaggag

48

<210> 80

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 80

atctggggct cctgggagaa caccaggacc gacgagagct gccaggccat caag

54

<210> 81

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 81

atcaaggagt acatggacac acacctgaac ccttatatca tcaatg

46

<210> 82

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 82

tttggaatca caggaggagc ccgagagtat gcggagctaa acag

44

<210> 83

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 83

tttggaatca caggaggagc agagtatgcg gagctaaaca g

41

<210> 84

<211> 62

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 84

ctctaattgc ggccgcctat tagtggtgat ggtgatgatg gtccacggca tctgtgtcct

60

tc

62

<210> 85

<211> 74

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 85

agaacaccag gaccaaggag cagtgccagg ccatcaagga gtacatggac cgaaccctga

60

acccttatat catc

74

<210> 86

<211> 55

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 86

taaaagagaa caggctcata tccaggggct cggcaaactt gcccaggcag aactc

55

<210> 87

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 87

taaaagagaa caggctcata tccaggggcg cgtcaaactt gcccaggcag aac

53

<210> 88

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 88

taaaagagaa caggctcata tccagggcct cgtcaaactt gcccaggc

48

<210> 89

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 89

taaaagagaa caggctcata tccgcgggct cgtcaaactt gcccag

46

<210> 90

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 90

accaggatcg tgtttacaga cgcggtgctg aagttcctgt cc

42

<210> 91

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 91

aggatcgtgt ttacagacca ggcgctgaag ttcctgtccc ag

42

<210> 92

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 92

atcgtgttta cagaccaggt ggcgaagttc ctgtcccagg at

42

<210> 93

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 93

atcgtgttta cagaccaggt gctggcgttc ctgtcccagg atgag

45

<210> 94

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 94

gccctgtacc ctagcatcta tctggccacc cagcagagcc cagtggc

47

<210> 95

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 95

ctgtacccta gcatctatct gaacgcccag cagagcccag tggccgctac

50

<210> 96

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 96

taccctagca tctatctgaa caccgcgcag agcccagtgg ccgctacact g

51

<210> 97

<211> 55

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 97

taccctagca tctatctgaa cacccaggcg agcccagtgg ccgctacact gtatg

55

<210> 98

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 98

agcatctatc tgaacaccca gcagagcgca gtggccgcta cactgtatgt gagg

54

<210> 99

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 99

tatctgaaca cccagcagag cccagcggcc gctacactgt atgtgagg

48

<210> 100

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 100

tgtcactccg gtgatagaat cggcatatgg atagtagccc agtctg

46

<210> 101

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 101

tcactgtcac tccggtgata gaagcgatat atggatagta gcccag

46

<210> 102

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 102

tccgttcact gtcactccgg tgatagcatc gatatatgga tagtagccca g

51

<210> 103

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 103

tccgttcact gtcactccgg tggcagaatc gatatatgga tagtagc

47

<210> 104

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 104

ttgtccactg gcatgtagaa ggcgatgtcc ttcttagcct tatc

44

<210> 105

<211> 52

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 105

tgcccagatt gtccactggc atgtaggcgg tgatgtcctt cttagcctta tc

52

<210> 106

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 106

tgcccagatt gtccactggc atggcgaagg tgatgtcctt cttag

45

<210> 107

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 107

agatcgtcgt tcctcttgat ctccgcattg aaacaggagc cgttgtagcc

50

<210> 108

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 108

gacagatcgt cgttcctctt gatcgccaca ttgaaacagg agccgttgta gcc

53

<210> 109

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 109

agccaagaca gatcgtcgtt cctcttggcc tccacattga aacaggagcc gttg

54

<210> 110

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 110

agccaagaca gatcgtcgtt cctcgcgatc tccacattga aacaggagcc g

51

<210> 111

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 111

tctgtggcct cggtcaggct cgcctgcacg ttctgctgct gcac

44

<210> 112

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 112

ttctctgtgg cctcggtcag ggccagctgc acgttctgct gctg

44

<210> 113

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 113

tagccttctc tgtggcctcg gtcgcgctca gctgcacgtt ctgctg

46

<210> 114

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 114

ttagccttct ctgtggcctc ggccaggctc agctgcacgt tctg

44

<210> 115

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 115

tcgaactcct gcttagcctt ctctgcggcc tcggtcaggc tcagctg

47

<210> 116

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 116

tcgaactcct gcttagcctt cgctgtggcc tcggtcaggc tcag

44

<210> 117

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 117

ttctcgaact cctgcttagc cgcctctgtg gcctcggtca ggc

43

<210> 118

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 118

agagaggcta tccgcgtgtc tgcgatcccc gacgccaagt ccccac

46

<210> 119

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 119

aggctatccg cgtgtctaag gcccccgacg ccaagtcccc actg

44

<210> 120

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 120

aggctatccg cgtgtctaag atcgccgacg ccaagtcccc actgccc

47

<210> 121

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 121

agttttactg ctcttgttat tccaccgcga gctgtaagga gaaggctgat g

51

<210> 122

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 122

actgctcttg ttattccacc ctggcctgta aggagaaggc tgatgtg

47

<210> 123

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 123

aaggagaagg ctgatgtgaa ggccacagat gccgtggacg tgtgc

45

<210> 124

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 124

aaggagaagg ctgatgtgaa ggacgcagat gccgtggacg tgtgcatc

48

<210> 125

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 125

aaggctgatg tgaaggacac agctgccgtg gacgtgtgca tcg

43

<210> 126

<211> 81

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 126

atattcgcgg ccgcctatta gtggtgatgg tgatgatgaa aggcgtcgat gcacacgcca

60

gcagcgatgc acacgtccac g

81

<210> 127

<211> 80

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 127

atattcgcgg ccgcctatta gtggtgatgg tgatgatgaa aggcgtcgat gcacacggca

60

tcagcgatgc acacgtccac

80

<210> 128

<211> 75

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 128

atattcgcgg ccgcctatta gtggtgatgg tgatgatgaa aggcgtcgat gcacgcgcca

60

tcagcgatgc acacg

75

<210> 129

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 129

tgtcacgccc tggccggtgg cagcgatccg aggagagccg ataaaag

47

<210> 130

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 130

tgcaccagct cgatggaccg agccttatac acgtccttag gcttc

45

<210> 131

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 131

ttcactgtca ctccggtgat attatcgata tatggatagt agcc

44

<210> 132

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 132

tccgttcact gtcactccgg tctgagaatc gatatatgga tagtagc

47

<210> 133

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 133

accctagcat ctatctgaac accgatcaga gcccagtggc cgctac

46

<210> 134

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 134

accctagcat ctatctgaac accatccaga gcccagtggc cgctac

46

<210> 135

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 135

aggctatccg cgtgtctaag ggccccgacg ccaagtcccc ac

42

<210> 136

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 136

atccgcgtgt ctaagatcga cgacgccaag tccccactgc

40

<210> 137

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 137

agaaggctga tgtgaaggac gacgatgccg tggacgtgtg

40

<210> 138

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 138

agaaggctga tgtgaaggac cacgatgccg tggacgtgtg

40

<210> 139

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 139

agaaggctga tgtgaaggac aaagatgccg tggacgtgtg

40

<210> 140

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 140

agaaggctga tgtgaaggac ggagatgccg tggacgtgtg

40

<210> 141

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 141

agaaggctga tgtgaaggac ccagatgccg tggacgtgtg

40

<210> 142

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 142

agaaggctga tgtgaaggac atggatgccg tggacgtgtg

40

<210> 143

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 143

agaaggctga tgtgaaggac ttcgatgccg tggacgtgtg

40

<210> 144

<211> 82

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 144

ctctaattgc ggccgcctat tagtggtgat ggtgatgatg aaaggcgtcg atgcacacgc

60

ccctagcgat gcacacgtcc ac

82

<210> 145

<211> 76

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 145

ctctaattgc ggccgctcat tagtggtgat ggtgatgatg aaaggcgtcg atgcagtagc

60

catcagcgat gcacac

76

<210> 146

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 146

ttctctgtgg cctcggtcag ggtcagctgc acgttctgct gctg

44

<210> 147

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 147

aggagaaggc tgatgtgaag agcacagatg ccgtggacgt g

41

<210> 148

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 148

atcgtgttta cagaccaggt gccgaagttc ctgtcccagg atgag

45

<210> 149

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 149

atcgtgttta cagaccaggt gatgaagttc ctgtcccagg atgag

45

<210> 150

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 150

tctgtggcct cggtcaggct cgactgcacg ttctgctgct gcac

44

<210> 151

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 151

tctgtggcct cggtcaggct aatctgcacg ttctgctgct gcac

44

<210> 152

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 152

tctgtggcct cggtcaggct aaactgcacg ttctgctgct gcac

44

<210> 153

<211> 84

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 153

atcgtgatct ggggctcctg ggagttcacc aggacccagg agagctgcca ggccatccag

60

gagtacatgg acacaaccct gaac

84

<210> 154

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 154

accctagcat ctatctgaac accaaccaga gcccagtggc cgctac

46

<210> 155

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 155

gcccaggcag aactcgc

17

<210> 156

<211> 62

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 156

tctcgaactc ctgcttagcc ttatctgtgg cctcggtcat gctcagctgc acgttctgct

60

gc

62

<210> 157

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 157

accctagcat ctatctgaac accgcgcaga gcccagtggc cgctac

46

<210> 158

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 158

atcgtgatct ggggctcctg ggagatcacc aggaccatgg agagctgcca ggccatcaag

60

<210> 159

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 159

agcggcatcg tgatctgggg cgacctgtcg atctcctcga ccatggagag ctgccaggcc

60

<210> 160

<211> 57

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 160

agcggcatcg tgatctgggg cgacctgtcg atctccagga ccatggagag ctgccag

57

<210> 161

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 161

atctggggct cctgggagaa caccaggacc atggagagct gccaggccat caag

54

<210> 162

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 162

atcgtgatct ggggctcctg ggagatcacc aggaccatgg agagctgcca ggccatcaag

60

<210> 163

<211> 455

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 163

Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp

1 5 10 15

Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro

20 25 30

Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala

35 40 45

Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr

50 55 60

Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro

65 70 75 80

Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile

85 90 95

Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp

100 105 110

Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val

115 120 125

Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu

130 135 140

Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala

145 150 155 160

Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg

165 170 175

Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His

180 185 190

His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile

195 200 205

Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu

210 215 220

Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr

225 230 235 240

Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile

245 250 255

Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val

260 265 270

Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr

275 280 285

Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp

290 295 300

Gly Thr Leu Ser Ile Thr Thr Ser Thr Glu Thr Cys Gln Tyr Leu Lys

305 310 315 320

Asp Tyr Leu Thr Arg Leu Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu

325 330 335

Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys

340 345 350

Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp

355 360 365

Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly

370 375 380

Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys

385 390 395 400

Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp

405 410 415

Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala

420 425 430

Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe Tyr Asn

435 440 445

Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser

450 455

<210> 164

<211> 455

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 164

Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp

1 5 10 15

Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro

20 25 30

Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala

35 40 45

Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr

50 55 60

Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro

65 70 75 80

Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile

85 90 95

Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp

100 105 110

Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val

115 120 125

Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu

130 135 140

Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala

145 150 155 160

Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg

165 170 175

Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His

180 185 190

His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile

195 200 205

Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu

210 215 220

Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr

225 230 235 240

Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile

245 250 255

Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val

260 265 270

Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr

275 280 285

Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp

290 295 300

Gly Thr Leu Ser Ile Ser Ser Ser Glu Glu Glu Cys Trp His Leu His

305 310 315 320

Asp Tyr Leu Val Asp Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu

325 330 335

Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys

340 345 350

Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp

355 360 365

Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly

370 375 380

Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys

385 390 395 400

Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp

405 410 415

Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala

420 425 430

Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe Tyr Asn

435 440 445

Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser

450 455

<210> 165

<211> 455

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 165

Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp

1 5 10 15

Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro

20 25 30

Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala

35 40 45

Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr

50 55 60

Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro

65 70 75 80

Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile

85 90 95

Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp

100 105 110

Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val

115 120 125

Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu

130 135 140

Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala

145 150 155 160

Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg

165 170 175

Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His

180 185 190

His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile

195 200 205

Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu

210 215 220

Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr

225 230 235 240

Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile

245 250 255

Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val

260 265 270

Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr

275 280 285

Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp

290 295 300

Gly Thr Leu Ser Ile Thr Ala Ser Lys Ala Asn Cys Thr Lys Val Lys

305 310 315 320

Gln Phe Val Ser Ser Asp Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu

325 330 335

Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys

340 345 350

Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp

355 360 365

Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly

370 375 380

Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys

385 390 395 400

Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp

405 410 415

Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala

420 425 430

Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe Tyr Asn

435 440 445

Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser

450 455

<210> 166

<211> 431

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 166

Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp

1 5 10 15

Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp

20 25 30

Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly

35 40 45

Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr

50 55 60

Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys

65 70 75 80

Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe

85 90 95

Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu

100 105 110

Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys

115 120 125

Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu Ser Leu

130 135 140

Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys

145 150 155 160

Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn

165 170 175

His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr

180 185 190

Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg

195 200 205

Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro

210 215 220

Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr

225 230 235 240

Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp

245 250 255

Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr

260 265 270

Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe

275 280 285

Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Ser

290 295 300

Trp Glu Asn Thr Met Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala

325 330 335

Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg

340 345 350

Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe

355 360 365

Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro

370 375 380

Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys

385 390 395 400

Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp

405 410 415

Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe

420 425 430

<210> 167

<211> 431

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 167

Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp

1 5 10 15

Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp

20 25 30

Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly

35 40 45

Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr

50 55 60

Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys

65 70 75 80

Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe

85 90 95

Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu

100 105 110

Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys

115 120 125

Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu Ser Leu

130 135 140

Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys

145 150 155 160

Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn

165 170 175

His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr

180 185 190

Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg

195 200 205

Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro

210 215 220

Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr

225 230 235 240

Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp

245 250 255

Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr

260 265 270

Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe

275 280 285

Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Ser

290 295 300

Trp Glu Asn Thr Arg Gln Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala

325 330 335

Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg

340 345 350

Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe

355 360 365

Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro

370 375 380

Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys

385 390 395 400

Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp

405 410 415

Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe

420 425 430

<210> 168

<211> 431

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 168

Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp

1 5 10 15

Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp

20 25 30

Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly

35 40 45

Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr

50 55 60

Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys

65 70 75 80

Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe

85 90 95

Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu

100 105 110

Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys

115 120 125

Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu Ser Leu

130 135 140

Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys

145 150 155 160

Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn

165 170 175

His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr

180 185 190

Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg

195 200 205

Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro

210 215 220

Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr

225 230 235 240

Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp

245 250 255

Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr

260 265 270

Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe

275 280 285

Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Ser

290 295 300

Trp Glu Asn Thr Arg Thr Gln Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala

325 330 335

Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg

340 345 350

Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe

355 360 365

Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro

370 375 380

Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys

385 390 395 400

Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp

405 410 415

Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe

420 425 430

<210> 169

<211> 431

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 169

Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp

1 5 10 15

Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp

20 25 30

Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly

35 40 45

Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr

50 55 60

Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys

65 70 75 80

Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe

85 90 95

Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu

100 105 110

Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys

115 120 125

Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu Ser Leu

130 135 140

Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys

145 150 155 160

Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn

165 170 175

His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr

180 185 190

Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg

195 200 205

Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro

210 215 220

Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr

225 230 235 240

Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp

245 250 255

Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr

260 265 270

Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe

275 280 285

Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Ser

290 295 300

Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Gln Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala

325 330 335

Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg

340 345 350

Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe

355 360 365

Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro

370 375 380

Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys

385 390 395 400

Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp

405 410 415

Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe

420 425 430

<210> 170

<211> 431

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 170

Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp

1 5 10 15

Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp

20 25 30

Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly

35 40 45

Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr

50 55 60

Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys

65 70 75 80

Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe

85 90 95

Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu

100 105 110

Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys

115 120 125

Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu Ser Leu

130 135 140

Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys

145 150 155 160

Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn

165 170 175

His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr

180 185 190

Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg

195 200 205

Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro

210 215 220

Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr

225 230 235 240

Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp

245 250 255

Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr

260 265 270

Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe

275 280 285

Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Ser

290 295 300

Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Gln Glu Tyr

305 310 315 320

Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala

325 330 335

Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg

340 345 350

Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe

355 360 365

Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro

370 375 380

Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys

385 390 395 400

Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp

405 410 415

Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe

420 425 430

<210> 171

<211> 431

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 171

Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp

1 5 10 15

Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp

20 25 30

Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly

35 40 45

Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr

50 55 60

Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys

65 70 75 80

Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe

85 90 95

Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu

100 105 110

Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys

115 120 125

Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu Ser Leu

130 135 140

Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys

145 150 155 160

Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn

165 170 175

His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr

180 185 190

Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg

195 200 205

Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro

210 215 220

Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr

225 230 235 240

Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp

245 250 255

Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr

260 265 270

Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe

275 280 285

Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Ser

290 295 300

Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Val Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala

325 330 335

Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg

340 345 350

Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe

355 360 365

Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro

370 375 380

Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys

385 390 395 400

Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp

405 410 415

Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe

420 425 430

<210> 172

<211> 431

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 172

Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp

1 5 10 15

Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp

20 25 30

Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly

35 40 45

Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr

50 55 60

Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys

65 70 75 80

Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe

85 90 95

Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu

100 105 110

Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys

115 120 125

Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu Ser Leu

130 135 140

Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys

145 150 155 160

Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn

165 170 175

His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr

180 185 190

Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg

195 200 205

Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro

210 215 220

Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr

225 230 235 240

Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp

245 250 255

Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr

260 265 270

Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe

275 280 285

Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Ser

290 295 300

Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Met Asp Thr Thr Ala Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala

325 330 335

Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg

340 345 350

Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe

355 360 365

Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro

370 375 380

Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys

385 390 395 400

Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp

405 410 415

Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe

420 425 430

<210> 173

<211> 431

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 173

Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp

1 5 10 15

Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp

20 25 30

Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly

35 40 45

Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr

50 55 60

Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys

65 70 75 80

Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe

85 90 95

Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu

100 105 110

Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys

115 120 125

Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu Ser Leu

130 135 140

Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys

145 150 155 160

Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn

165 170 175

His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr

180 185 190

Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg

195 200 205

Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro

210 215 220

Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr

225 230 235 240

Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp

245 250 255

Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr

260 265 270

Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe

275 280 285

Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Ser

290 295 300

Trp Val Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala

325 330 335

Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg

340 345 350

Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe

355 360 365

Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro

370 375 380

Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys

385 390 395 400

Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp

405 410 415

Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe

420 425 430

<210> 174

<211> 431

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 174

Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp

1 5 10 15

Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp

20 25 30

Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly

35 40 45

Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr

50 55 60

Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys

65 70 75 80

Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe

85 90 95

Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu

100 105 110

Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys

115 120 125

Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu Ser Leu

130 135 140

Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys

145 150 155 160

Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn

165 170 175

His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr

180 185 190

Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg

195 200 205

Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro

210 215 220

Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr

225 230 235 240

Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp

245 250 255

Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr

260 265 270

Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe

275 280 285

Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Ser

290 295 300

Trp Glu Phe Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala

325 330 335

Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg

340 345 350

Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe

355 360 365

Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro

370 375 380

Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys

385 390 395 400

Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp

405 410 415

Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe

420 425 430

<210> 175

<211> 431

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 175

Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp

1 5 10 15

Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp

20 25 30

Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly

35 40 45

Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr

50 55 60

Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys

65 70 75 80

Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe

85 90 95

Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu

100 105 110

Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys

115 120 125

Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu Ser Leu

130 135 140

Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys

145 150 155 160

Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn

165 170 175

His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr

180 185 190

Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg

195 200 205

Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro

210 215 220

Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr

225 230 235 240

Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp

245 250 255

Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr

260 265 270

Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe

275 280 285

Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Ser

290 295 300

Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Met Lys Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala

325 330 335

Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg

340 345 350

Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe

355 360 365

Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro

370 375 380

Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys

385 390 395 400

Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp

405 410 415

Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe

420 425 430

<210> 176

<211> 431

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 176

Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp

1 5 10 15

Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp

20 25 30

Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly

35 40 45

Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr

50 55 60

Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys

65 70 75 80

Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe

85 90 95

Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu

100 105 110

Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys

115 120 125

Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu Ser Leu

130 135 140

Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys

145 150 155 160

Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn

165 170 175

His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr

180 185 190

Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg

195 200 205

Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro

210 215 220

Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr

225 230 235 240

Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp

245 250 255

Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr

260 265 270

Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe

275 280 285

Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Ser

290 295 300

Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Met Asp Tyr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala

325 330 335

Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg

340 345 350

Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe

355 360 365

Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro

370 375 380

Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys

385 390 395 400

Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp

405 410 415

Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe

420 425 430

<210> 177

<211> 431

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 177

Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp

1 5 10 15

Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp

20 25 30

Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly

35 40 45

Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr

50 55 60

Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys

65 70 75 80

Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe

85 90 95

Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu

100 105 110

Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys

115 120 125

Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu Ser Leu

130 135 140

Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys

145 150 155 160

Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn

165 170 175

His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr

180 185 190

Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg

195 200 205

Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro

210 215 220

Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr

225 230 235 240

Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp

245 250 255

Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr

260 265 270

Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe

275 280 285

Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Ser

290 295 300

Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Met Asp Thr Met Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala

325 330 335

Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg

340 345 350

Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe

355 360 365

Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro

370 375 380

Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys

385 390 395 400

Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp

405 410 415

Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe

420 425 430

<210> 178

<211> 431

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 178

Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp

1 5 10 15

Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp

20 25 30

Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly

35 40 45

Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr

50 55 60

Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys

65 70 75 80

Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe

85 90 95

Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu

100 105 110

Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys

115 120 125

Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu Ser Leu

130 135 140

Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys

145 150 155 160

Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn

165 170 175

His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr

180 185 190

Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg

195 200 205

Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro

210 215 220

Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr

225 230 235 240

Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp

245 250 255

Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr

260 265 270

Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe

275 280 285

Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Ser

290 295 300

Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Glu Ala Ile Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala

325 330 335

Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg

340 345 350

Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe

355 360 365

Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro

370 375 380

Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys

385 390 395 400

Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp

405 410 415

Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe

420 425 430

<210> 179

<211> 431

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 179

Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp

1 5 10 15

Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp

20 25 30

Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly

35 40 45

Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr

50 55 60

Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys

65 70 75 80

Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe

85 90 95

Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu

100 105 110

Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys

115 120 125

Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu Ser Leu

130 135 140

Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys

145 150 155 160

Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn

165 170 175

His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr

180 185 190

Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg

195 200 205

Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro

210 215 220

Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr

225 230 235 240

Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp

245 250 255

Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr

260 265 270

Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe

275 280 285

Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Ser

290 295 300

Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Met Asp Thr Thr Leu Met Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala

325 330 335

Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg

340 345 350

Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe

355 360 365

Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro

370 375 380

Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys

385 390 395 400

Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp

405 410 415

Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe

420 425 430

<210> 180

<211> 431

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 180

Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp

1 5 10 15

Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp

20 25 30

Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Asn Gly

35 40 45

Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr

50 55 60

Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys

65 70 75 80

Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe

85 90 95

Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu

100 105 110

Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys

115 120 125

Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu Ser Leu

130 135 140

Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys

145 150 155 160

Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn

165 170 175

His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr

180 185 190

Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg

195 200 205

Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro

210 215 220

Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr

225 230 235 240

Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp

245 250 255

Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr

260 265 270

Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe

275 280 285

Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Ser

290 295 300

Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala

325 330 335

Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg

340 345 350

Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe

355 360 365

Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro

370 375 380

Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys

385 390 395 400

Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp

405 410 415

Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe

420 425 430

<210> 181

<211> 431

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 181

Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp

1 5 10 15

Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp

20 25 30

Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly

35 40 45

Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr

50 55 60

Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys

65 70 75 80

Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe

85 90 95

Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu

100 105 110

Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys

115 120 125

Lys Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu Ser Leu

130 135 140

Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys

145 150 155 160

Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn

165 170 175

His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr

180 185 190

Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg

195 200 205

Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro

210 215 220

Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr

225 230 235 240

Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp

245 250 255

Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr

260 265 270

Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe

275 280 285

Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Ser

290 295 300

Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala

325 330 335

Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg

340 345 350

Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe

355 360 365

Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro

370 375 380

Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys

385 390 395 400

Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp

405 410 415

Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe

420 425 430

<210> 182

<211> 431

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 182

Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp

1 5 10 15

Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp

20 25 30

Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly

35 40 45

Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr

50 55 60

Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys

65 70 75 80

Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe

85 90 95

Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu

100 105 110

Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys

115 120 125

Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu Ser Leu

130 135 140

Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys

145 150 155 160

Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn

165 170 175

His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr

180 185 190

Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg

195 200 205

Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro

210 215 220

Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr

225 230 235 240

Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp

245 250 255

Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr

260 265 270

Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe

275 280 285

Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Ser

290 295 300

Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Glu Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala

325 330 335

Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg

340 345 350

Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe

355 360 365

Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro

370 375 380

Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys

385 390 395 400

Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp

405 410 415

Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe

420 425 430

<210> 183

<211> 431

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 183

Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp

1 5 10 15

Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp

20 25 30

Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly

35 40 45

Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr

50 55 60

Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys

65 70 75 80

Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe

85 90 95

Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu

100 105 110

Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys

115 120 125

Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu Ser Leu

130 135 140

Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys

145 150 155 160

Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn

165 170 175

His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr

180 185 190

Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg

195 200 205

Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro

210 215 220

Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr

225 230 235 240

Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp

245 250 255

Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr

260 265 270

Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe

275 280 285

Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Ser

290 295 300

Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Gln Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala

325 330 335

Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg

340 345 350

Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe

355 360 365

Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro

370 375 380

Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys

385 390 395 400

Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp

405 410 415

Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe

420 425 430

<210> 184

<211> 431

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 184

Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp

1 5 10 15

Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp

20 25 30

Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly

35 40 45

Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr

50 55 60

Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys

65 70 75 80

Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe

85 90 95

Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu

100 105 110

Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys

115 120 125

Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu Ser Leu

130 135 140

Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys

145 150 155 160

Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn

165 170 175

His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr

180 185 190

Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg

195 200 205

Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro

210 215 220

Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr

225 230 235 240

Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp

245 250 255

Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr

260 265 270

Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe

275 280 285

Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Ser

290 295 300

Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ser Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala

325 330 335

Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg

340 345 350

Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe

355 360 365

Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro

370 375 380

Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys

385 390 395 400

Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp

405 410 415

Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe

420 425 430

<210> 185

<211> 431

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 185

Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp

1 5 10 15

Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp

20 25 30

Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly

35 40 45

Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr

50 55 60

Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys

65 70 75 80

Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe

85 90 95

Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu

100 105 110

Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys

115 120 125

Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu Ser Leu

130 135 140

Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys

145 150 155 160

Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn

165 170 175

His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr

180 185 190

Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg

195 200 205

Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro

210 215 220

Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr

225 230 235 240

Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp

245 250 255

Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr

260 265 270

Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe

275 280 285

Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Ser

290 295 300

Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Val Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala

325 330 335

Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg

340 345 350

Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe

355 360 365

Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro

370 375 380

Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys

385 390 395 400

Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp

405 410 415

Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe

420 425 430

<210> 186

<211> 431

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 186

Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp

1 5 10 15

Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp

20 25 30

Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly

35 40 45

Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr

50 55 60

Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys

65 70 75 80

Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe

85 90 95

Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu

100 105 110

Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys

115 120 125

Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu Ser Leu

130 135 140

Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys

145 150 155 160

Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn

165 170 175

His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr

180 185 190

Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg

195 200 205

Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro

210 215 220

Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr

225 230 235 240

Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp

245 250 255

Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr

260 265 270

Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe

275 280 285

Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Ser

290 295 300

Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ala Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala

325 330 335

Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg

340 345 350

Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe

355 360 365

Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro

370 375 380

Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys

385 390 395 400

Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp

405 410 415

Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe

420 425 430

<210> 187

<211> 431

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 187

Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp

1 5 10 15

Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp

20 25 30

Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly

35 40 45

Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr

50 55 60

Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys

65 70 75 80

Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe

85 90 95

Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu

100 105 110

Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys

115 120 125

Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu Ser Leu

130 135 140

Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys

145 150 155 160

Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn

165 170 175

His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr

180 185 190

Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg

195 200 205

Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro

210 215 220

Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr

225 230 235 240

Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp

245 250 255

Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr

260 265 270

Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe

275 280 285

Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Ser

290 295 300

Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Asn Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala

325 330 335

Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg

340 345 350

Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe

355 360 365

Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro

370 375 380

Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys

385 390 395 400

Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp

405 410 415

Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe

420 425 430

<210> 188

<211> 431

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 188

Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp

1 5 10 15

Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp

20 25 30

Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly

35 40 45

Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr

50 55 60

Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys

65 70 75 80

Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe

85 90 95

Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu

100 105 110

Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys

115 120 125

Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu Ser Leu

130 135 140

Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys

145 150 155 160

Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn

165 170 175

His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr

180 185 190

Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg

195 200 205

Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro

210 215 220

Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr

225 230 235 240

Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp

245 250 255

Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr

260 265 270

Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe

275 280 285

Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Ser

290 295 300

Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Thr Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala

325 330 335

Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg

340 345 350

Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe

355 360 365

Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro

370 375 380

Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys

385 390 395 400

Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp

405 410 415

Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe

420 425 430

<210> 189

<211> 431

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 189

Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp

1 5 10 15

Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp

20 25 30

Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly

35 40 45

Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr

50 55 60

Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys

65 70 75 80

Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe

85 90 95

Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu

100 105 110

Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys

115 120 125

Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu Ser Leu

130 135 140

Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys

145 150 155 160

Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn

165 170 175

His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr

180 185 190

Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg

195 200 205

Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro

210 215 220

Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr

225 230 235 240

Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp

245 250 255

Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr

260 265 270

Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe

275 280 285

Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Ser

290 295 300

Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Met Tyr

305 310 315 320

Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala

325 330 335

Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg

340 345 350

Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe

355 360 365

Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro

370 375 380

Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys

385 390 395 400

Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp

405 410 415

Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe

420 425 430

<210> 190

<211> 431

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 190

Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp

1 5 10 15

Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp

20 25 30

Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly

35 40 45

Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr

50 55 60

Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys

65 70 75 80

Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe

85 90 95

Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu

100 105 110

Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys

115 120 125

Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu Ser Leu

130 135 140

Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys

145 150 155 160

Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn

165 170 175

His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr

180 185 190

Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg

195 200 205

Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro

210 215 220

Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr

225 230 235 240

Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp

245 250 255

Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr

260 265 270

Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe

275 280 285

Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Ser

290 295 300

Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Phe Tyr

305 310 315 320

Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala

325 330 335

Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg

340 345 350

Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe

355 360 365

Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro

370 375 380

Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys

385 390 395 400

Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp

405 410 415

Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe

420 425 430

<210> 191

<211> 431

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 191

Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp

1 5 10 15

Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp

20 25 30

Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly

35 40 45

Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr

50 55 60

Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys

65 70 75 80

Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe

85 90 95

Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu

100 105 110

Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys

115 120 125

Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu Ser Leu

130 135 140

Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys

145 150 155 160

Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn

165 170 175

His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr

180 185 190

Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg

195 200 205

Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro

210 215 220

Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr

225 230 235 240

Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp

245 250 255

Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr

260 265 270

Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe

275 280 285

Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Ser

290 295 300

Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Ile Tyr

305 310 315 320

Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala

325 330 335

Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg

340 345 350

Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe

355 360 365

Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro

370 375 380

Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys

385 390 395 400

Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp

405 410 415

Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe

420 425 430

<210> 192

<211> 431

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 192

Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp

1 5 10 15

Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp

20 25 30

Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly

35 40 45

Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr

50 55 60

Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys

65 70 75 80

Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe

85 90 95

Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu

100 105 110

Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys

115 120 125

Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu Ser Leu

130 135 140

Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys

145 150 155 160

Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn

165 170 175

His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr

180 185 190

Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg

195 200 205

Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro

210 215 220

Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr

225 230 235 240

Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp

245 250 255

Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr

260 265 270

Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe

275 280 285

Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Ser

290 295 300

Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Leu Tyr

305 310 315 320

Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala

325 330 335

Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg

340 345 350

Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe

355 360 365

Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro

370 375 380

Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys

385 390 395 400

Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp

405 410 415

Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe

420 425 430

<210> 193

<211> 431

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 193

Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp

1 5 10 15

Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp

20 25 30

Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly

35 40 45

Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr

50 55 60

Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys

65 70 75 80

Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe

85 90 95

Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu

100 105 110

Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys

115 120 125

Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu Ser Leu

130 135 140

Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys

145 150 155 160

Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn

165 170 175

His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr

180 185 190

Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg

195 200 205

Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro

210 215 220

Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr

225 230 235 240

Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp

245 250 255

Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr

260 265 270

Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe

275 280 285

Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Ser

290 295 300

Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Gln Tyr

305 310 315 320

Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala

325 330 335

Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg

340 345 350

Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe

355 360 365

Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro

370 375 380

Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys

385 390 395 400

Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp

405 410 415

Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe

420 425 430

<210> 194

<211> 431

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 194

Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp

1 5 10 15

Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp

20 25 30

Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly

35 40 45

Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr

50 55 60

Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys

65 70 75 80

Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe

85 90 95

Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu

100 105 110

Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys

115 120 125

Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu Ser Leu

130 135 140

Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys

145 150 155 160

Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn

165 170 175

His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr

180 185 190

Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg

195 200 205

Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro

210 215 220

Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr

225 230 235 240

Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp

245 250 255

Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr

260 265 270

Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe

275 280 285

Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Ser

290 295 300

Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Val Tyr

305 310 315 320

Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala

325 330 335

Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg

340 345 350

Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe

355 360 365

Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro

370 375 380

Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys

385 390 395 400

Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp

405 410 415

Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe

420 425 430

<210> 195

<211> 431

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 195

Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp

1 5 10 15

Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp

20 25 30

Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly

35 40 45

Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr

50 55 60

Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys

65 70 75 80

Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe

85 90 95

Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu

100 105 110

Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys

115 120 125

Lys Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu Ser Leu

130 135 140

Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys

145 150 155 160

Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn

165 170 175

His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr

180 185 190

Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg

195 200 205

Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro

210 215 220

Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr

225 230 235 240

Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp

245 250 255

Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr

260 265 270

Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe

275 280 285

Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Ser

290 295 300

Trp Val Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Met Asp Thr Met Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala

325 330 335

Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg

340 345 350

Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe

355 360 365

Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro

370 375 380

Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys

385 390 395 400

Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp

405 410 415

Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe

420 425 430

<210> 196

<211> 431

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 196

Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp

1 5 10 15

Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp

20 25 30

Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly

35 40 45

Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr

50 55 60

Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys

65 70 75 80

Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe

85 90 95

Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu

100 105 110

Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys

115 120 125

Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu Ser Leu

130 135 140

Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys

145 150 155 160

Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn

165 170 175

His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr

180 185 190

Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg

195 200 205

Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro

210 215 220

Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr

225 230 235 240

Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp

245 250 255

Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr

260 265 270

Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe

275 280 285

Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gln Ser

290 295 300

Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala

325 330 335

Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg

340 345 350

Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe

355 360 365