Сконструированный пептид, направленный на белок c-FLIP и индуцирующий апоптоз Российский патент 2024 года по МПК C07K14/00 A61K38/00 A61P35/00 

Изобретение относится к области биомедицины, в частности к ряду химических соединений, предназначенных для терапии онкозаболеваний. Изобретение представляет собой пептид, образующий гомодимер, состоящий из четырех повторяющихся гептадных повторов и способный эффективно связываться с DED1-доменом белка Cellular FLICE-like inhibitory protein (далее - c-FLIP), что способствует индукции внешнего пути апоптоза. Изобретение включает аминокислотную последовательность пептида c-FLIP связывающий пептид, (далее - ФЛП). В следующем аспекте изобретение включает пептид ФЛП в комбинации с цитокином семейства факторов некроза опухоли TNF-related apoptosis-inducing ligand (далее - TRAIL). Сконструированный методами компьютерного структурного моделирования пептид, являющийся центральным компонентом изобретения, может потенциально применяться для терапии онкологических заболеваний, ассоциированных с увеличенной экспрессией белка c-FLIP. Разработанный пептид расширяет спектр терапевтических средств для лечения онкозаболеваний средствами, обладающими новым механизмом действия по сравнению с существующими лекарствами, и может быть использован при разработке эффективных методов лечения рака печени и перспективных инновационных стратегий персонализированной медицины.

Рак печени является третьей по значимости причиной смерти от рака в мире по статистике. Доминирующим типом первичного рака печени (порядка 90% случаев) является гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК).

Нарушения регуляции активации апоптоза (запрограммированной гибели клеток) являются одной из ключевых особенностей, свойственной большинству раковых клеток, что определяет фармакологическую индукцию апоптоза как важную стратегию терапии рака. Апоптоз может быть вызван двумя основными сигнальными путями: внутренним (митохондриальным), индуцируемым при дефиците факторов роста, окислительном стрессе или повреждении ДНК; и внешним, инициируемыми лигандами и клеточными рецепторами семейства Tumor necrosis factor (TNF), которые называют рецепторами смерти (death receptor, DR).

В настоящее время большинство исследований посвящены фармакологическим воздействиям на внутренний (митохондриальный) путь апоптоза, в то время как внешний путь, индуцируемый посредством клеточных рецепторов смерти, остается вне поля внимания. В частности, это связано со сложной структурой молекулярных процессов данного пути и отсутствием до недавнего времени расшифровки пространственных структур белков и их комплексов, ключевых участников молекулярной платформы, участвующей в регуляции и передаче сигнала.

Основным регулятором внешнего пути является клеточный FLICE-ингибирующий белок (cellular FLICE inhibitory protein, c-FLIP) - важный фактор устойчивости к цитокинам и химиотерапии [Safa AR. Roles of c-FLIP in Apoptosis, Necroptosis, and Autophagy. J Carcinog Mutagen. 2013; Suppl 6:003]. c-FLIP характеризуется увеличенной экспрессией в гепатоцеллюлярной карциноме.

Компьютерный дизайн химических соединений, способных целевым образом регулировать внешний сигнальный путь индукции апоптоза, представляет перспективный подход для создания новых эффективных средств терапии рака печени и других онкологических заболеваний. Участок белка c-FLIP, находящийся на DED1 домене, имеет важную функциональную роль [Kim KH, Seong BL. Pro-apoptotic function of HBV X protein is mediated by interaction with c-FLIP and enhancement of death-inducing signal. EMBO J. 2003 May 1;22(9): 2104-16.]. Разработка низкомолекулярных соединений и пептидов, способных связываться с этим участком, может применяться для подавления связывания c-FLIP с проапоптическими белками, и как следствие, увеличения клеточной гибели, необходимой для борьбы с раком.

Прототипом настоящего изобретения является малое химическое соединение FLIPin, показавшее способность увеличивать активность каспазы-8 за счет аллостерической стабилизации ее активного сайта, и таким образом, стимулировать индукцию внешнего пути апоптоза. Структура этого соединения была разработана впервые в мире на основе компьютерного дизайна [Hillert LK, Ivanisenko NV, Busse D, Espe J, König C, Peltek SE, Kolchanov NA, Ivanisenko VA, Lavrik IN. Dissecting DISC regulation via pharmacological targeting of caspase-8/c-FLIPL heterodimer. Cell Death Differ. 2020 Jul;27(7): 2117-2130.].

Настоящее изобретение относится к области биомедицины и может быть применимо как терапевтический агент в лечении онкологических заболеваний. Суть настоящего изобретения состоит в том, что с использованием методов компьютерного структурного моделирования были получены последовательности пептидов, способных связываться с определенным сайтом белка c-FLIP, и таким образом увеличивать скорость клеточной гибели. Предложена новая последовательность пептида, обладающая индуцирующим действием на процесс программируемой клеточной смерти: SEQ 1 RRRRRRRRGGEIAALKQENAALKQEIAQLQAAYHQLFQEYTNHIKEG (Фиг. 1). В другом аспекте изобретение включает комбинацию пептида ФЛП с цитокином TRAIL.

Последовательность пептида была сконструирована с использованием комплекса методов, включающих моделирование пептида, имеющего структуру сверхзакрученных спиралей с помощью Multicoil2 [Trigg J, Gutwin K, Keating AE, Berger B. Multicoil2: predicting coiled coils and their oligomerization states from sequence in the twilight zone. PLoS One. 2011;6(8):e23519], оценок физико-химической комплементарности аминокислотных остатков пептида с аминокислотными остатками DED1-домена c-FLIP в предполагаемом сайте савязывания, и предсказания пространственной структуры комплекса, состоящего из DED1-домена c-FLIP и пептида, выполненного с использованием AlphaFold [Jumper J, Evans R, Pritzel A, et al. Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. Nature. 2021 Aug;596(7873): 583-589.].

Согласно дизайну, пептид ФЛП является гомодимером и способен одновременно связываться с двумя субъединицами белка c-FLIP. Согласно дизайну, полученный пептид способен образовывать взаимодействия с аминоксилотными остатками V52, M74, H82, V5 в домене DED1 белка c-FLIP. Для увеличения проницаемости через клеточную мембрану были добавлены R8 в начале последовательности пептидов. Модель молекулярного комплекса пептида ФЛП с DED1 доменом белка c-FLIP показана на Фиг. 2. В качестве контрольного пептида, использовалась последовательность случайно перемешанного пептида ФЛП, аминокислотная последовательность которого включала аминокислотные остатки пептида ФЛП, порядок которых был переставлен случайным образом, с добавлением R8 в начале последовательности SEQ 2: RRRRRRRRGGFAQKHEAEAKLTNQEAQAQYLILAEAKYILEIHQNGQ.

Функциональная роль пептида ФЛП была подтверждена экспериментально. Для этого проводился анализ способности данного пептида увеличивать скорость программируемой клеточной гибели в комбинации с лигандом TRAIL. Как можно видеть из Фиг. 3, комбинация ФЛП/TRAIL оказывается эффективней, чем TRAIL поодиночке. Проведенная серия экспериментов показала, что пептид ФЛП обладает цитотоксической активностью в комбинации с TRAIL и способен увеличивать скорость программируемой клеточной гибели в клетках гепатоцеллюлярной карциномы HepG2.

На Фиг. 1 представлена предсказанная пространственная структура димера пептида ФЛП с последовательностью SEQ 1: RRRRRRRRGGEIAALKQENAALKQEIAQLQAAYHQLFQEYTNHIKEG. Основная цепь пептида показана с использованием ленточной модели. Аминокислотные остатки, участвующие во взаимодействиях между субъединицами в димере, показаны с использованием шариковой модели.

На Фиг. 2 представлена модель пространственной структуры пептида ФЛП (центральная часть рисунка) и его связи с death effector domain 1 (далее - DED1) доменом белка c-FLIP (слева и справа от пептида), представленная с использованием ленточной модели. Аминокислотные остатки пептида ФЛП и DED1 домена белка c-FLIP, участвующие во взаимодействиях между ФЛП и DED1 доменом белка c-FLIP, показаны с использованием спичечной модели.

На Фиг. 3 представлена оценка апоптозной активности пептида ФЛП in vitro. Белые столбцы - клеточная линия HepG2 с добавлением DMSO (слева), ФЛП (по центру) либо контрольного пептида (справа). Черные столбцы - клеточная линия HepG2 с DMSO+TRAIL (слева), ФЛП+TRAIL (по центру), контрольный пептид + TRAIL (справа). Контрольный пептид был получен как комбинация аминокислот ФЛП в случайном порядке.

Пример 1

Функциональный эффект пептида ФЛП на процесс апоптоза был подтвержден экспериментально. Для этого производился анализ выживаемости клеток линии гепатоцеллюлярной карциномы HepG2 с помощью теста на цитотоксичность. Способность пептида ФЛП увеличивать скорость апоптоза оценивалась относительно DMSO и контрольного пептида SEQ 2: (RRRRRRRRGGFAQKHEAEAKLTNQEAQAQYLILAEAKYILEIHQNGQ).

1,2 × 10⁴ клеток линии HepG2 были посажены в 96-луночный планшет и инкубированы в 50 мкл питательной среды DMEM-F12 в течение одних суток. Затем клетки обрабатывали в течение 6 часов следующими реагентами: (1) DMSO и комбинация DMSO/TRAIL, (2) пептид ФЛП в концентрации 10 мг/мкл и комбинация ФЛП/TRAIL, (3) контрольный пептид в концентрации 10 мг/мкл и комбинация контрольный пептид/TRAIL. Концентрации лиганда TRAIL в экспериментальных образцах составляли 100 нг/мкл. Для определения цитотоксичности с помощью LDH-теста были отобраны по 2 мкл клеточной суспензии и добавлены к 198 мкл буфера (200 mM tris, 10% glycerol, 1% BSA). 50 мкл данной суспензии смешивали с 50 мкл буфера с люминесцентнo-меченым субстратом для определения уровня выделения LDH (Promega).

Далее для каждого из образцов в репликах анализировали уровень сигнала люминисценции с использованием микропланшетного считывателя Infinite M200pro (Tecan, Switzerland). Значения интенсивности люминесценции в клетках обработанных лигандом, пептидом или их комбинацией были нормализованы по отношению к контрольным клеткам, необработанных данными реагентами. Одна относительная единица (о.е.) соответствует относительному уровню активности обработанных клеток по сравнению с уровнем активности контрольных необработанных клеток.

Диаграмма, описывающая относительные уровни цитотоксичности проапоптотических агентов для клеток HepG2, изображена на Фиг. 3. Как можно видеть из Фиг. 3, комбинация ФЛП/TRAIL проявляла наиболее выраженный уровень цитотоксичности по сравнению с комбинацией TRAIL и контрольного пептида, а также с комбинацией DMSO/TRAIL. В частности, обработка клеток комбинацией ФЛП/TRAIL превысила уровень цитотоксичности комбинаций DMSO/TRAIL и контрольный пептид/TRAIL на 3 о.е. и на 4 о.е., соответственно.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="FLP and Control

peptides.xml" softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.3.0"

productionDate="2023-10-17">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>1</ApplicationNumberText>

<FilingDate></FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное

бюджетное научное учреждение «Федеральный исследовательский центр

Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской

академии наук» (ИЦиГ СО РАН)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Institute of Cytology and Genetics, Siberian

Branch of Russian Academy of Sciences</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Идентификация фармакологических

мишеней и разработка потенциальных лекарств для терапии рака

печени</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>1</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>47</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..47</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>RRRRRRRRGGEIAALKQENAALKQEIAQLQAAYHQLFQEYTNHIKEG</

INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>47</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..47</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>RRRRRRRRGGFAQKHEAEAKLTNQEAQAQYLILAEAKYILEIHQNGQ</

INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен сконструированный пептид, включающий последовательность SEQ ID No.1, образующий гомодимер, способный эффективно связываться с DED1-доменом белка c-FLIP. Сконструированный пептид способствует индукции апоптоза и может быть использован при разработке эффективных методов лечения рака. 3 ил., 1 пр.

Сконструированный пептид, направленный на белок c-FLIP и индуцирующий апоптоз, эффективно взаимодействующий с DED1 домена белка c-FLIP, являющийся димером и включающий последовательность SEQ ID No.1.